DE3853515T2

DE3853515T2 - Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.

Info

Publication number: DE3853515T2
Application number: DE3853515T
Authority: DE
Inventors: James Huston; Hermann Oppermann
Original assignee: Creative Biomolecules Inc
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1995-08-17
Anticipated expiration: 2008-05-20
Also published as: ATE120761T1; ATE243754T1; DE3856559D1; US6207804B1; DE3853515D1; EP0318554A1; EP0318554B1; EP0623679B1; CA1341415C; EP0318554A4; AU1804988A; EP0623679A1; AU8579991A; WO1988009344A1; DE3856559T2; EP0318554B2; CA1341614C; DE3853515T3; JPH02500329A; US5476786A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Stoffzusammensetzungen, die im folgenden zielgesteuerte multifunktionelle Proteine genannt werden, welche beispielsweise in spezifischen Bindungsassays, zur Affinitätsreinigung, zur Biokatalyse, zur Zielsteuerung von Arzneistoffen, zur Scintigraphie, zur immunologischen Behandlung von verschiedenen onkogenen und infektiösen Erkrankungen und in anderem Zusammenhang verwendbar sind. Konkreter betrifft die Erfindung biosynthetische Proteine, die von rekombinierter DNA in Form einer einzelnen Polypeptidkette mit mehreren Regionen exprimiert werden, von denen eine eine Struktur aufweist, die einer Antikörperbindungsstelle ähnelt und eine Affinität für eine vorgewählte antigene Determinante hat, während die andere eine andere Funktion hat und biologisch aktiv sein kann, zur Bindung an Ionen ausgelegt ist oder zur Erleichterung der Immobilisierung des Proteins ausgelegt ist. Die Erfindung betrifft auch die Bindungsproteine an sich und Verfahren zu ihrem Aufbau.
Es gibt fünf Klassen menschlicher Antikörper. Jede weist die gleiche Grundstruktur (vgl. Figur 1) auf, oder ein Vielfaches davon, die aus zwei identischen Polypeptiden, die schwere (H) Ketten (Molekulargewicht etwa 50000 d) genannt werden, und zwei Identischen leichten (L) Ketten (Molekulargewicht etwa 25000 d) besteht. Jede dieser fünf Antikörperklassen weist einen ähnlichen Satz leichte Ketten und einen unterschiedlichen Satz schwere Ketten auf. Eine leichte Kette ist aus einer variablen und einer konstanten Domäne zusammengesetzt, während eine schwere Kette aus einer variablen und drei oder mehr konstanten Domänen zusammengesetzt ist. Die kombinierten variablen Domänen einer gepaarten leichten und schweren Kette sind als die Fv-Region oder einfach "Fv" bekannt. Die Fv bestimmt die Spezifität des Immunglobulins, die konstanten Regionen haben andere Funktionen.
Aminosäuresequenzdaten weisen darauf hin, daß jede variable Domäne drei hypervariable Regionen oder Schleifen aufweist, die manchmal komplementaritätsbestimmende Regionen oder "CDRs" genannt werden und von vier verhältnismäßig konservierten Strukturregionen oder "FRs" flankiert werden (Kabat et al., Secuences of Proteins of Immunological Interest [U.S. Department of Health und Human Services, 3. Aufl., 1983, 4. Aufl. 198"]). Es wird angenommen, daß die hypervariablen Regionen für die Bindungsspezifität der individuellen Antikörper verantwortlich sind und die Verschiedenartigkeit der Bindung von Antikörpern als einer Proteinklasse begründen.
Monoklonale Antikörper werden sowohl als diagnostische als auch als therapeutische Mittel verwendet. Sie werden routinemäßig nach eingeführten Verfahren durch Hybridome produziert, die durch Fusion von Maus-Lymphoidzellen mit einer geeigneten Maus-Myelomzellinie erzeugt werden.
Die Literatur enthält eine Vielzahl von Verweisen auf das Konzept der Zielsteuerung von bioaktiven Substanzen wie Arzneistoffen, Toxinen und Enzymen zu bestimmten Stellen im Körper, um maligne Zellen zu zerstören oder zu lokalisieren oder um eine lokalisierte Arzneistoff- oder Enzymwirkung hervorzurufen. Es ist vorgeschlagen worden, diese Wirkung durch die Konjugation der bioaktiven Substanz an monoklonaler Antikörper zu erzielen (vgl. z.B. Vogel, Immunoconjugates. Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer, 1987, N.Y., Oxford University Press; und Ghose et al. (1978), J. Natl. Cancer Inst. 61:657-676). Nichtmenschliche Antikörper rufen jedoch eine Immunantwort hervor, wenn sie Menschen injiziert werden. Menschliche monoklonale Antikörper können dieses Problem mildern, sind aber mit Zellfusionstechniken schwierig herzustellen, weil, abgesehen von anderen Problemen, menschliche Hybridome ziemlich unstabil sind und die Entnahme von immunisierten Milzzellen aus dem Menschen nicht durchführbar ist.
Chimäre Antikörper, die aus menschlichen und nichtmenschlichen Aminosäuresequenzen zusammengesetzt sind, haben möglicherweise einen höheren therapeutischen Wert, weil sie wahrscheinlich weniger zirkulierende menschliche Antikörper gegen die nichtmenschlichen Immunglobulinsequenzen hervorrufen. Folglich sind Hybridantikörpermoleküle vorgeschlagen worden, die aus Aminosäuresequenzen verschiedener Säuger bestehen. Die bisher konstruierten chimären Antikörper weisen variable Regionen von einem Säuger und konstante Regionen vom Menschen oder einem anderen Säuger auf (Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:5851-6855; Neuberger et al. (1984), Nature 312:604-608; Sahagan et al. (1986), J. Immunol. 137:1066-1074; EP-A-0 125 023, Genentech; EP-A-0 171 496, Research Development Corporation of Japan; EP-A-0 173 494, Standford; WO-A-9 601 533, Celltech Limited).
Es ist berichtet worden, daß die Bindungsfunktion in den variablen Domänen des Antikörpermoleküls lokalisiert ist, die sich am aminoterminalen Ende sowohl der schweren als auch der leichten Ketten befinden. Die variablen Regionen bleiben sogar nach proteolytischer Abspaltung vom nativen Antikörpermolekül nichtkovalent miteinander verbunden (als VHVL-Dimere, die als Fv-Regionen bezeichnet werden) und behalten ihre Fähigkeit zur Antigenerkennung und -bindung zum großen Teil bei (vgl. beispielsweise Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1972) 69:2659-2662; Hochman et al. (1973), Biochem. 12:1130-1135, und (1976), Biochem. 15:2706-2710; Sharon und Givol (1976), Biochem. 15:1591-1594; Rosenblatt und Haber (1978), Biochem. 17:3877-3882; Ehrlich et al. (1980), Biochem. 19:4091-40996). In US 4 642 334 und der entsprechenden veröffentlichten Patentschrift EP 088 994 sind Verfahren zur Herstellung von zweikettigen Fvs, die praktisch ohne konstante Region sind, unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken offenbart. Biotechnology, Bd. 4, Nr. 12, 1986, S. 1041-1043 gibt keine ausführbare Offenbarung eines einkettigen Antikörpers, der alleine vorliegt oder an ein Antikrebsmittel gebunden ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein einkettiges multifunktionelles biosynthetisches Protein bereitgestellt, das durch ein durch DNA-Rekombinationstechniken erhaltenes Einzelgen exprimiert wird, wobei das Protein aufweist:
eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle, die an eine vorgewählte antigene Determinante binden kann und eine Aminosauresequenz aufweist, die homolog zu der Sequenz einer variablen Region eines Immunglobulinmoleküls ist, das die vorgewählte antigene Determinante binden kann,
eine erste biofunktionelle Domäne, die ein Polypeptid aufweist, das unter Effektorproteinen mit einer für biologische Aktivität in Säugern geeigneten Konformation, Aminosäuresequenzen, die ein Ion maskieren können, und Aminosäuresequenzen, die selektiv an einen festen Träger binden können, ausgewählt ist und
einen ersten Polypeptidlinker, der zwischen der Bindungsstelle und der ersten biofunktionellen Domäne angeordnet ist, wobei der Polypeptidlinker mehrere hydrophile, peptidgebundene Aminosäuren aufweist und ein Polypeptid definiert, welches das C-terminale Ende der Bindungsstelle und das N-terminale Ende der ersten biofunktionellen Domäne oder das N-terminale Ende der Bindungsstelle und das C- terminale Ende der ersten biofunktionellen Domäne verbindet, wodurch das Bindungsprotein eine zum Binden geeignete Konformation annimmt und die erste biofunktionelle Domäne eine für die biologische Aktivität, Maskierung eines Ions oder selektive Bindung eines festen Trägers geeignete Konformation annimmt.
Die Bindungsstelle kann mindestens zwei Bindungsdomänen aufweisen, die durch einen zweiten Polypeptidlinker peptidgebunden sind, der zwischen den Domänen angeordnet ist, wobei der zweite Polypeptidlinker mehrere hydrophile, peptidgebundene Aminosäuren aufweist und ein Polypeptid mit einer ausreichenden Länge zur Überbrückung des Abstandes zwischen dem C-terminalen Ende einer der Bindungsdomänen und dem N-terminalen Ende der anderen der Bindungsdomänen definiert, wenn das Bindungsprotein eine zur Bindung geeignete Konformation einnimmt, wenn es in wäßrige Lösung gebracht wird.
Die Aminosäuresequenz jeder der Bindungsdomänen kann einen Satz von CDRs (komplementaritätsbestimmenden Regionen) aufweisen, die zwischen einem Satz von FRs (Strukturregionen) angeordnet sind, welche jeweils entsprechend homolog zu CDRs und FRs einer variablen Region eines Immunglobulinmoleküls sind, das die vorgewählte antigene Determinante binden kann.
Mindestens eine der Bindungsdomänen kann einen Satz von CDRs, die zu den CDRS eines ersten Immunglobulins homolog sind, und einen Satz von FRs, die zu den FRs eines zweiten, unterschiedlichen Immunglobulins homolog sind, aufweisen.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein einkettiges Polypeptid bereitgestellt, das aufweist:
zwei Polypeptiddomänen, die zusammen eine Bindungsstelle für ein vorgewähltes Antigen definieren und über einen Polypeptidlinker mit dem C-Terminus der einen an den N- Terminus der anderen gebunden sind, wobei die Aminosäuresequenz jeder der Polypeptiddomänen eine variable Region eines Immunglobulins nachahmt und mindestens eine der Domänen aufweist:
einen Satz CDR-Aminosäuresequenzen, die zusammen eine Erkennungsstelle für das vorgewählte Antigen definieren, wobei es sich bei den CDR-Sequenzen um nichtmenschliche Sequenzen handelt,
einen Satz FR-Aminosäuresequenzenl die an den Satz CDR- Sequenzen gebunden sind, wobei die FR-Aminosäuresequenzen zu aus einem menschlichen Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind,
wobei die gebundenen Sätze CDR- und FR-Aminosäuresequenzen zusammen eine chimäre Bindungsdomäne definieren, die in wäßriger Lösung eine zur immunologischen Bindung mit dem vorgewählten Antigen geeignete Tertiärstruktur annimmt.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein einkettiges Polypeptid bereitgestellt, das aufweist:
zwei Polypeptiddomänen, die eine Bindungsstelle für ein vorgewähltes Antigen definieren und durch einen Polypeptidlinker verbunden sind, der den Abstand zwischen dem C-Terminus der einen und dem N-Terminus der anderen überbrückt wobei die Aminosäuresequenz mindestens einer der Polypeptiddomänen eine rekombinierte variable Region enthält, die aufweist:
einen Satz CDR-Aminosäuresequenzen, die zusammen eine Erkennungsstelle für das vorgewählte Antigen definieren, wobei die CDR-Sequenzen zu aus einem ersten Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind,
einen Satz FR-Aminosäuresequenzen, die an den Satz CDR- Sequenzen gebunden sind, wobei die FR-Aminosäuresequenzen zu aus einem zweiten Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind,
wobei die gebundenen Sätze CDR- und FR-Aminosäuresequenzen zusammen ein chimäres Einzelkettenbindungspolypeptid mit variabler Region definieren, das in wäßriger Lösung eine zur immunologischen Bindung mit dem vorgewählten Antigen geeignete Tertiärstruktur annimmt.
Vorzugsweise sind die FRs des Bindungsproteins zu mindestens einem Teil der FRs eines menschlichen Immunglobulins homolog, der Linker überbrückt mindestens etwa 40 Å, ein Polypeptidspacer ist in dem multifunktionellen Protein zwischen der Bindungsstelle und dem zweiten Polypeptid enthalten, und das Bindungsprotein hat eine Affinität für die vorgewählte antigene Determinante, die nicht mehr als zwei Größenordnungen niedriger als die Bindungsaffinität des Immunglobulinmoleküls ist, das als Matrize für die CDR- Regionen des Bindungsproteins verwendet wurde. Die bevorzugten Linker und Spacer sind cysteinfrei. Der Linker weist vorzugsweise Aminosäuren mit nichtreaktiven Seitengruppen auf, z.B. Alanin und Glycin. Die Linker und die Spacer können hergestellt werden, indem mehrere aufeinanderfolgende Kopien einer Aminosäuresequenz, z.B. (Gly&sub4; Ser)&sub3;, kombiniert werden. Die Erfindung stellt auch DNAs bereit, die diese Proteine kodieren, und Wirtszellen, die diese DNAs beherbergen und exprimieren können.
Mit der Bezeichnung biosynthetische Antikörperbindungsstelle oder BABS sind hier synthetische Proteine gemeint, die von DNA exprimiert werden, die durch Rekombinationstechniken erhalten wurde. Die BABS enthalten biosynthetisch hergestellte Aminosäuresequenzen, die Polypeptide definieren, welche so gestaltet sind, daß sie an ein vorgewähltes antigenes Material binden. Die Struktur dieser synthetischen Polypeptide unterscheidet sich von der von natürlich vorkommenden Antikörpern, Fragmenten davon, z.B. Fv, oder bekannten synthetischen Polypeptiden oder "chimären Antikörpern" insofern, als die Regionen der BABS, die für die Spezifität und Affinität der Bindung verantwortlich sind (analog den variablen Regionen nativer Antikörper) durch Peptidbindungen verbunden sind, die von einer einzelnen DNA exprimiert werden, und selber chimär sein können, z.B. Aminosäuresequenzen aufweisen können, die zu Teilen von mindestens zwei verschiedenen Antikörpermolekülen homolog sind. Die BABS der Erfindung sind biosynthetisch in dem Sinn, daß sie in einer Wirtszelle synthetisiert werden, die dazu gebracht wurde, eine synthetische DNA zu exprimieren, d.h. eine rekombinierte DNA, die durch Ligation einer Vielzahl chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt wurde, oder durch Ligation von DNA- Fragmenten, die aus dem Genom eines Hybridoms, eines reifen B-Zell-Klons oder aus einer cDNA-Bibliothek derartiger natürlicher Quellen stammen. Die Proteine der Erfindung werden zu Recht als "Bindungsstellen" charakterisiert, weil diese synthetischen Moleküle so ausgestaltet sind, daß sie eine spezifische Affinität für eine vorgewählte antigene Determinante haben. Die Polypeptide der Erfindung weisen Strukturen auf, die den Regionen von nativen Antikörpern, welche für die Antigenerkennung verantwortlich sind, nachgebildet sind.
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von neuen multifunktionellen Proteinen, die ein oder mehrere Effektorproteine und eine oder mehrere biosynthetische Antikörperbindungsstellen aufweisen, und die Bereitstellung von DNA-Sequenzen, welche diese Proteine kodieren. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines verallgemeinerten Verfahrens zur Herstellung von biosynthetischen Antikörperbindungsstellen-Polypeptiden mit jeder beliebigen gewünschten Spezifität.

Kurze Figurenbeschreibung

Die vorgenannten und weitere Aufgaben der Erfindung, ihre verschiedenen Merkmale sowie die Erfindung selber werden anhand der folgenden Beschreibung in Zusammenschau mit den Zeichnungen klarer.
Figur 1A ist eine schematische Darstellung eines intakten IgG-Antikörpermoleküls, das zwei leichte Ketten, die jeweils aus einer variablen und einer konstanten Domäne bestehen, und zwei schweren Ketten, die jeweils aus einer variablen und drei konstanten Domänen bestehen, enthält. Figur 1B ist eine schematische Darstellung der Struktur von Fv-Proteinen (und der DNA, die diese kodiert), welche die VH- und VL-Domänen veranschaulicht, die jeweils vier Struktur (FR)-Regionen und drei komplementaritätsbestimmende (CDR)-Regionen aufweisen. Die Grenzen der CDRs sind angegeben, und zwar beispielsweise für den monoklonalen Antikörper 26-10, einen gut bekannten und charakterisierten monoklonalen Mausantikörper, der für Digoxin spezifisch ist
Die Figuren 2A-2E sind schematische Darstellungen einiger erfindungsgemäß konstruierter Reagenzklassen, die jeweils eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle aufweisen.
Figur 3 offenbart fünf Aminosäuresequenzen (schwere Ketten) im Einbuchstabenkode, die vertikal aufgereiht sind, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern. Sequenz 1 ist die bekannte native VH-Sequenz des monoklonalen Maus-Antikörpers glp-4 (Anti-Lysozym). Sequenz 2 ist die bekannte native VH-Sequenz des monoklonalen Maus-Antikörpers 26-10 (Anti-Digoxin). Sequenz 3 ist eine BABS, welche die FRs der 26-10-VH und die CDRs der glp-4-VH aufweist. Die CDRs sind in Kleinbuchstaben angegeben, und die Restriktionsstellen in der DNA, die zur Herstellung der chimären Sequenz 3 verwendet wurden, sind ebenfalls angegeben. Sequenz 4 ist die bekannte native VH-Sequenz des menschlichen Myelom-Antikörpers NEWM. Sequenz 5 ist eine BABS, welche die FRs der NEWM-VH und die CDRs der glp-4-VH aufweist, d.h. eine "humanisierte" Bindungsstelle mit einer menschlichen Struktur, aber einer Affinität für Lysozym wie Maus-glp-4 veranschaulicht.
Die Figuren 4A-4F stellen synthetische Nukleinsäuresequenzen und kodierte Aminosäuresequenzen dar, nämlich (4A) der variablen Domäne der schweren Kette des monoklonalen Maus-Anti-Diogoxin-Antikörpers 26-10, (4B) der variablen Domäne der leichten Kette des monoklonalen Maus- Anti-Diogoxin-Antikörpers 26-10, (4C) einer variablen Domäne der schweren Kette einer BABS, die CDRs von glp-4 und FRs von 26-10 aufweist, (4D) einer variablen Region der leichten Kette der gleichen BABS, (4E) einer variablen Region der schweren Kette einer BABS, die CDRs von glp-4 und FRs von NEWM aufweist und (4F) einer variablen Region der leichten Kette, die CDRs von glp-4 und FRs von NEWM aufweist. Die FRs, CDRs und Restriktionsstellen für den Endonuklease-Abbau, von denen die meisten während der Konstruktion der DNA eingeführt wurden, sind dargestellt.
Figur 5 stellt die Nukleinsäure und die kodierte Aminosäuresequenz einer Wirts-DNA (VH) dar, die konstruiert wurde, um die Insertion der gewählten CDRs zu erleichtern. Die DNA wurde so konstruiert, daß sie nur einmal vorkommende Restriktionsstellen mit 6 Basen besitzt, welche die CDRs direkt flankieren, so daß verhältnismäßig kleine Oligonukleotide, die Teile von CDRs definieren, ohne weiteres insertiert werden können, und andere Stellen aufweist, um die Manipulation der DNA zur Optimierung der Bindungseigenschaften eines gegebenen Konstrukts zu erleichtern. Die Strukturregionen des Moleküls entsprechen den Maus-FRs (Figur 4A).
Die Figuren 6A und 6B stellen multifunktionelle Proteine (und die sie kodierende DNA) dar, die eine Einzelketten- BABS mit der Spezifität des monoklonalen Maus-Antikörpers 26-10 aufweisen, die durch einen Spacer an das FB-Fragment von Protein A gebunden ist, welche hier als Leader fusioniert ist und eine Bindungsstelle für Fc bildet. Der Spacer weist die 11 C-terminalen Aminosäuren von FB auf, an die sich Asp-Pro (eine Spaltungsstelle für verdünnte Säure) anschließt. Die Einzelketten-BABS weist Sequenzen auf, welche die VH und VL (6A) und die VL und VH (6B) des monoklonalen Maus-Antikörpers 26-10 nachahmen. Die VL in Konstruktion 6A ist am Rest 4 verändert, und zwar ersetzt Valin das in der 26-10-Elternsequenz vorhandene Methionin. Diese Konstrukte enthalten sowohl Bindungsstellen für Fc als auch für Digoxin. Ihre Struktur kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
(6A) FB-Asp-Pro-VH-(Gly&sub4;-Ser)&sub3;-VL,
und
(6B) FB-Asp-Pro-VL-(Gly&sub4;-Ser)&sub3;-VH,
wobei (Gly&sub4;-Ser)&sub3; ein Polypeptidlinker ist.
In den Figuren 4A-4E und 6A und 6B beginnt die Aminosäuresequenz des Expressionsprodukts nach den GAATTC- Sequenzen, die eine EcoRI-Spleißstelle kodieren, welche in den Zeichnungen als Glu-Phe translatiert wird.
Figur 7A ist eine graphische Darstellung der maximalen Zählimpulse von gebundenem radiojodiertem Digoxin in Prozent gegen die Konzentration des an die Platte adsorbierten Bindungsproteins, in der die Bindung von nativem 26-10 (Kurve 1) und die der Konstrukte von Figur 6A und Figur 2B, die unter Anwendung von zwei verschiedenen Verfahren renaturiert wurden, verglichen werden (Kurven 2 und 3). Figur 7B ist eine graphische Darstellung, welche die Bifunktionalität der FB-(26-10)-BABS demonstriert, die an Mikrotiterplatten durch die spezifische Bindung der Bindungsstelle an die Digoxin-BSA-Schicht auf der Platte haftet. Figur 7B zeigt die Inhibition der ¹²&sup5;J-Kaninchen-IgG-Bindung an die FB-Domäne der FB-BABS durch die Zugabe von IgG, Protein A, FB, Maus-IgG2a und Maus-IgG1 in Prozent.
Figur 8 ist eine schematische Darstellung eines Modells einer zusammengesetzten DNA-Sequenz, die ein multifunktionelles biosynthetisches Protein kodiert, das ein Leaderpeptid (das zur Unterstützung der Expression verwendet und danach abgespalten wird), eine Bindungsstelle, einen Spacer und ein Effektormolekül, das in Form einer Trailersequenz gebunden ist, aufweist.
Die Figuren 9A-9E sind Beispiele für synthetische Nukleinsäuresequenzen und entsprechende kodierte Aminosäuresequenzen von Bindungsstellen mit unterschiedlichen Spezifitäten: (A) FRs von NEWM und CDRs von 26-10 mit der Digoxin-Spezifität des monoklonalen Maus-Antikörpers 26-10, (B) FRs von 26-10 und CDRs von G-loop-4 (glp-4) mit Lysozym-Spezifität, (C) FRs und CDRs von MOPC-315 mit Dinitrophenol(DNF)-Spezifität; (D) FRs und CDRs eines monoklonalen Anti-CEA-Antikörpers; (E) FRs in der VH und VL und CDR&sub1; und CDR&sub3; in der VH und CDR&sub1;, CDR&sub2; und CDR&sub3; in der VL eines monoklonalen Anti-CEA-Antikörpers; wobei es sich bei der CDR&sub2; in der VH um eine CDR&sub2;-Konsensussequenz handelt, die in den meisten Immunglobulin-VH-Regionen gefunden wird.
Figur 10A ist eine schematische Darstellung der DNA- und Aminosäuresequenz eines Leaderpeptid(MLE)-Proteins mit entsprechender DNA-Sequenz und einigen Hauptrestriktionsstellen. Figur 10B zeigt die Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Expression der MLE-BABS (26-10) verwendet wurde. Während der Konstruktion des Gens wurden die Fusionspartner an der EcoR1-Stelle verbunden, die als Teil der Leadersequenz gezeigt ist. Das an der nur einmal vorkommenden SspI- und PstI-Stelle geöffnete pBR322-Plasmid wurde in einer 3-teiligen Ligation mit einem SspI-EcoRI- Fragment, das den trp-Promotor und den MLE-Leader enthält, und mit einem EcoRI-PstI-Fragment, welches das BABS-Gen trägt, kombiniert. Der sich ergebende Expressionsvektor verleiht positiven Transformanten Tetracyclin-Resistenz.
Figur 11 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel (15 %) der (26-10)- BABS bei fortschreitender Reinigung. Bahn 0 zeigt Standards mit niedrigem Molekulargewicht, Bahn 1 ist das MLE-BABS- Fusionsprotein, Bahn 2 ist ein saurer Abbau dieses Materials, Bahn 3 ist das auf DE-52 chromatographierte gepoolte Protein, die Bahnen 4 und 5 sind der gleiche Ouabain-Sepharose der einkettigen BABS, mit dem Unterschied, daß das Protein von Bahn 4 reduziert ist und das Protein von Bahn 5 unreduziert ist.
Figur 12 zeigt Inhibitionskurven für 26-10-BABS- und 26-10- Fab-Spezies und gibt die relativen Affinitäten des Antikörperfragments für die angegebenen Herzglycoside an.
Die Figuren 13A und 13B sind graphische Darstellungen von Digoxin-Bindungskurven. (A) zeigt die 26-10-BABS-Bindungsisotherme und das Sips-Diagramm (Nebenabbildung), und (B) zeigt die 26-10-Fab-Bindungsisotherme und das Sips-Diagramm (Nebenabbildung).
Figur 14 stellt eine Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz einer modifizierten FB-Dimer-Leadersequenz mit verschiedenen Restriktionsstellen dar.
Die Figuren 15A-15H stellen Nukleinsäuresequenzen und entsprechende Aminosäuresequenzen von biosynthetischen multifunktionellen Proteinen dar, die eine Einzelketten- BABS und verschiedene biologisch aktive über eine Spacersequenz gebundene Proteintrailer enthalten. Ferner sind verschiedene Endonuklease-Abbaustellen angegeben. Bei den Trailersequenzen handelt es sich um (A) den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), (B) Streptavidin, (C) den Tumor- Nekrosefaktor (TNF), (D) Calmodulin, (E) den aus Blutplättchen stammenden Beta-Wachstumsfaktor (PDGF-beta), (F) Ricin und (G) Interleukin-2 und (H) ein FB-FB-Dimer.

Beschreibung

Die Erfindung wird zunächst in breitester Form beschrieben und im folgenden dann detaillierter.
Es ist eine Klasse neuer biosynthetischer bi- oder multifunktioneller Proteine entworfen und konstruiert worden, die biosynthetische Antikörperbindungsstellen, d.h. "BABS", oder biosynthetische Polypeptide, die eine Struktur vorgeben, welche selektiv Antigene erkennt und vorzugsweise Antigene bindet, und ein oder mehrere peptidgebundene zusätzliche Protein- oder Polypeptidregionen, die zum Erhalt einer vorgewählten Eigenschaft konstruiert wurden, enthalten. Beispiele für die zweite Region sind Aminosäuresequenzen, die zur Maskierung von Ionen konstruiert sind, wodurch das Protein als Scintigraphiemittel verwendet werden kann, und Sequenzen, die zur Erleichterung der Immobilisierung des Proteins für die Affinitätschromatographie und für Festphasenimmunoassays konstruiert sind. Ein weiteres Beispiel für die zweite Region ist ein bioaktives Effektormolekül, d.h. ein Protein mit einer für eine biologische Aktivität geeigneten Konformation, beispielsweise ein Enzym, Toxin, Rezeptor, eine Bindungsstellel ein Wachstumsfaktor, Zelldifferenzierungsfaktor, Lymphokin, Cytokin, Hormon oder Antimetabolit. Die Erfindung betrifft synthetische multifunktionelle Proteine, welche diese Regionen peptidgebunden an eine oder mehrere biosynthetische Antikörperbindungsstellen aufweisen, synthetische einzelkettige Proteine, die zur Bindung von vorgewählten antigenen Determinanten mit hoher Affinität und Spezifität konstruiert sind, Konstruktionen, die Mehrfachbindungsstellen enthalten, die miteinander verbunden sind, um eine Mehrfachantigenbindung und hohe Nettoaffinität und Spezifität zu ergeben, mit Rekombinationstechniken hergestellte DNA, die diese Proteine kodiert, diese DNAs beherbergende Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und DNAs.
Die Erfindung macht die Herstellung von einzelkettigen Bindungsstellen mit einer Affinität und Spezifität für eine vorbestimmte antigene Determinante durch Rekombination erforderlich. Diese Technologie wurde entwickelt und wird hier offenbart. Aufgrund dieser Offenbarung kann der Fachmann auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik, der Konstruktion von Proteinen und der Proteinchemie derartige Stellen herstellen, die hohe Bindungskonstanten (mindestens 10&sup6;, vorzugsweise 10&sup8; M&supmin;¹) und ausgezeichnete Spezifität aufweisen, wenn sie in Lösung gebracht werden.
Die Konstruktion der BABS beruht auf der Beobachtung, daß drei Unterregionen der variablen Domäne jeder der schweren und leichten Ketten des nativen Immunglobulinmoleküls für die Antigenerkennung und -bindung verantwortlich sind. Jede dieser Unterregionen, hier "komplementaritätsbestimmende Regionen" oder CDRs genannt, besteht aus einer der hypervariablen Regionen oder Schleifen und aus ausgewählten Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, die sich in den Strukturregionen oder FRs befinden, welche die bestimmte hypervariable Region flankieren. Es wurde nun gefunden, daß FRs von diversen Spezies in der Lage sind, CDRs von diversen anderen Spezies in der richtigen Konformation zu halten, so daß sich in einem biosynthetischen Protein wirkliche immunchemische Bindungseigenschaften ergeben. Ferner wurde gefunden, daß biosynthetische Domänen, welche die Struktur der beiden Ketten einer Immunglobulinbindungsstelle nachahmen, durch einen Polypeptidlinker verbunden sein können, während ihre gemeinsamen Bindungseigenschaften nahezu erreicht, beibehalten und häufig verbessert werden.
Die Bindungsstellenregion des multifunktionellen Proteins weist mindestens eine, und vorzugsweise zwei Domänen auf, die jeweils eine Aminosäuresequenz haben, die zu Teilen der CDRs der variablen Domäne einer leichten oder schweren Immunglobulinkette homolog ist, und eine andere Sequenz, die zu den FRs der variablen Domäne der gleichen oder einer zweiten, unterschiedlichen leichten oder schweren Immunglobulinkette homolog ist. Die Bindungsstellenkonstruktion mit zwei Domänen weist auch eine Polypeptidverbindung der Domänen auf. Die so konstruierten Polypeptide binden ein bestimmtes vorgewähltes Antigen, das durch die CDRs festgelegt wird, die durch die FRs und den Linker in der richtigen Konformation gehalten werden. Bevorzugte Strukturen weisen menschliche FRs auf, d.h. ahmen die Aminosäuresequenz mindestens eines Teils der Strukturregionen eines menschlichen Immunglobulins nach, und besitzen verbundene Domänen, welche zusammen eine Struktur darstellen, die eine zweikettige VH-VL- oder VL-VH-Immunglobulinbindungsstelle nachahmt. Die CDR-Regionen eines Säuger-Immunglobulins, beispielsweise der Maus, der Ratte oder menschlichen Ursprungs, sind bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die biosynthetische Antikörperbindungsstelle FRs auf, die zu einem Teil der FRs eines menschlichen Immunglobulins homolog sind, und CDRs, die zu CDRs eines Mausoder Ratten-Immunglobulins homolog sind. Dieser Typ eines chimären Polypeptids zeigt die spezifische Antigenbindung des Maus- oder Ratten-Immunglobulins, während seine menschliche Struktur die menschlichen Immunreaktionen minimiert. Außerdem kann das chimäre Polypeptid andere Aminosäuresequenzen aufweisen. Beispielsweise kann es eine Sequenz aufweisen, die homolog zu einem Teil der konstanten Domäne eines Immunglobulins ist, aber vorzugsweise ist es frei von konstanten Regionen (bei denen es sich nicht um FRs handelt).
Bei der/den Bindungsstellenregion(en) der chimären Proteine handelt es sich daher um einzelkettige Kompositpolypeptide, die eine Struktur aufweisen, welche sich in Lösung wie eine Antikörperbindungsstelle verhält. Das einzelkettige Kompositpolypeptid mit zwei Domänen hat eine Struktur, die den VH- und VL-Tandemdomänen nachgebildet ist, wobei aber der Carboxyterminus der einen durch eine verbindende Aminosäuresequenz mit dem Aminoterminus der anderen verbunden ist. Die verbindende Aminosäuresequenz kann selber antigen oder biologisch aktiv sein oder auch nicht. Sie überbrückt vorzugsweise einen Abstand von mindestens etwa 40 Å, d.h. weist mindestens etwa 14 Aminosäuren auf, und sie weist Reste auf, die zusammen eine hydrophile, verhältnismäßig unstrukturierte Region darstellen. Verbindende Aminosäuresequenzen mit geringer oder ohne Sekundärstruktur funktionieren gut. Gegebenenfalls kann eine oder ein Paar nur einmal vorhandener Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, die durch ein ortsspezifisches Spaltungsmittel erkennbar sind, in dem Linker enthalten sein. Dadurch ist es möglich, die VH- und VL-ähnlichen Domänen nach der Expression voneinander zu trennen oder den Linker nach der Rückfaltung der Bindungsstelle auszuschneiden.
Entweder das amino- oder das carboxyterminale Ende (oder beide Enden) dieser chimären einkettigen Bindungsstellen ist an eine Aminosäuresequenz gebunden, die selber bioaktiv ist oder eine andere Funktion hat, so daß ein bifunktionelles oder multifunktionelles Protein gebildet wird. Beispielsweise kann die synthetische Bindungsstelle eine Leader- und/oder Trailersequenz aufweisen, die ein Polypeptid definiert, das enzymatische Aktivität hat, unabhängige Affinität für ein Antigen aufweist, das sich von dem Antigen unterscheidet, gegen das die Bingungsstelle gerichtet ist, oder andere Funktionen hat, beispielsweise eine geeignete Bindungsstelle für ein radioaktives Ion ergibt oder einen Rest, der zur chemischen Bindung an einen festen Träger ausgelegt ist. Dieser fusionierte funktionell unabhängige Proteinabschnitt sollte von fusionierten Leadern unterschieden werden, die einfach zu Erhöhung der Expression in prokaryontischen Wirtszellen oder Hefen verwendet werden. Die multifunktionellen Proteine sollten auch von den im Stand der Technik offenbarten "Konjugaten" unterschieden werden, welche Antikörper aufweisen, die nach der Expression chemisch an einen zweiten Rest gebunden werden.
Häufig ist eine Reihe von Aminosäuren als "Spacer" zwischen den aktiven Regionen des multifunktionellen Proteins eingeschoben. Die Verwendung eines derartigen Spacers kann die unabhängige Rückfaltung der Regionen des Proteins fördern.
Der Spacer kann auch eine spezifische Aminosäuresequenz aufweisen, die durch eine Endopeptidase erkannt wird, welche sich beispielsweise im Inneren einer Zielzelle (die beispielsweise ein Oberflächenprotein aufweist, das von der Bindungsstelle erkannt wird) befindet, so daß das bioaktive Effektorprotein abgespalten und am Zielort freigesetzt wird. Das zweite funktionelle Protein ist vorzugsweise in Form einer Trailersequenz vorhanden, weil Trailer weniger dazu neigen, das Bindungsverhalten der BABS zu stören.
Die therapeutische Anwendung derartiger "sich selbst ins Ziel steuernder" bioaktiver Proteine bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber Konjugaten von Immunglobulinfragmenten oder kompletten Antikörpermolekülen: sie sind stabil, weniger immunogen und haben ein niedrigeres Molekulargewicht, sie können Körpergewebe zur Scintigraphie oder zur Arzneistoff-Freisetzung rascher penetrieren, weil sie eine geringere Größe haben, und sie können die Clearance von Zielisotopen oder -arzneistoffen beschleunigen. Außerdem ist aufgrund der hier offenbarten Konstruktion derartiger Strukturen auf der DNA-Ebene die einfache Auswahl von Bioeigenschaften und Spezifitäten und eine praktisch unbeschränkte Kombination von Bindungsstellen und bioaktiven Proteinen möglich, die jeweils, wie hier offenbart, verfeinert werden können, um unabhängig die Aktivität jeder Region des synthetischen Proteins zu optimieren. Die synhetischen Proteine können in Prokaryonten wie E. coli exprimiert werden und sind daher billiger herzustellen als Immunglobuline oder Fragmente davon, welche die Expression in kultivierten Tierzellinien erforderlich machen.
Die Erfindung stellt somit eine Familie rekornbinierter Proteine bereit, die von einem einzelnen DNA-Stück exprimiert werden, und die alle in der Lage sind, spezifisch eine vorbestimmte antigene Determinante zu binden. Die bevorzugten Proteinspezies weisen eine zweite Domäne auf, die unabhängig von der Bindungsregion funktioniert. Unter diesem Aspekt stellt die Erfindung eine Reihe von "sich selbst ins Ziel steuernden" Proteinen bereit, die eine bioaktive Funktion haben und diese Funktion an einem Ort ausüben, der durch die Spezifität der Bindungsstelle bestimmt wird. Sie stellt außerdem biosynthetische Bindungsproteine bereit, an die Polypeptide gebunden sind, die zur Bindung an Immobilisierungsmatrizen geeignet sind, welche zur Affinitätschromatographie oder in Festphasenimmunoassay-Anwendungen verwendet werden können, oder die zur Bindung von Ionen geeignet sind, beispielsweise radioaktiven Ionen, die zur Scintigraphie in vivo verwendet werden können.
Die erfolgreiche Konstruktion und Herstellung der Proteine der Erfindung ist davon abhängig, daß biosynthetische Bindungsstellen hergestellt werden können, und zwar am bevorzugtesten Stellen, die zwei Domänen aufweisen, welche die variablen Immunglobulin-Domänen nachahmen und durch einen Linker verbunden sind.
Es ist gut bekannt, daß Fv, das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist, aus einem Dimer der variablen Domäne einer schweren und einer leichten Kette besteht, die nicht kovalent verbunden sind (Fig. 1A). Wegen dieser Konfiguration wechselwirken die drei komplementaritätsbestimmenden Regionen jeder variablen Domäne unter Bildung einer Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers. Die sechs komplementaritätsbestimmenden Regionen (vgl. Figur 1B) verleihen zusammen dem Antikörper die Bindungsspezifität für das Antigen. Die FRs, welche die CDRs flankieren, weisen eine Tertiärstruktur auf, die in den nativen Immunglobulinen von so verschiedenen Spezies wie dem Menschen und der Maus im wesentlichen konserviert ist. Diese FRs dienen dazu, die CDRs in ihrer geeigneten Orientierung zu halten. Die konstanten Domänen werden für die Bindungsfunktion nicht benötigt, können aber die Stabilisierung der VH-VL-Wechselwirkung unterstützen. Sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, die nur drei für ein Antigen spezifische CDRs aufweist) hat die Fähigkeit zur Erkennung und Bindung eines Antigens, obwohl die Affinität geringer ist als bei einer vollständigen Bindungsstelle (Painter et al. (1972), Biochem. 11:1327-1337)
Diese Kenntnis der Struktur von Immunglobulinproteinen wurde nun ausgenutzt, um multifunktionelle Fusionsproteine zu entwickeln, die biosynthetische Antikörperbindungsstellen und eine oder mehrere andere Domänen aufweisen.
Diese biosynthetischen Proteine haben in der Region, die dem Protein die Bindungseigenschaften verleiht, eine Struktur, die der Fv-Region eines natürlichen Antikörpers analog ist. Sie weist mindestens eine, und vorzugsweise zwei Domänen auf, die aus Aminosäuren bestehen, welche durch einen Linker verbundene VH- und VL-ähnliche Polypeptidabschnitte definieren, die zusammen die tertiäre Molekülstruktur bilden, die für die Affinität und Spezifität verantwortlich ist. Jede Domäne weist einen Satz von Aminosäuresequenzen auf, die zu Immunglobulin-CDRs analog sind und durch einen Satz von Sequenzen, die zu den Strukturregionen (FRs) eines Fv-Fragments eines natürlichen Antikörpers analog sind, in der geeigneten Konformation gehalten werden.
Der Begriff CDR bezieht sich hier auf Aminosäuresequenzen, die gemeinsam die Bindungsaffinität und -spezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulinbindungsstelle definieren, oder auf ein synthetisches Polypeptid, das diese Funktion nachahmt. Die CDRs sind üblicherweise nicht völlig zu den hypervariablen Regionen natürlicher Fvs homolog, sondern können auch bestimmte Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen enthalten, welche die hypervariable Region flankieren und bisher als Struktur angesehen wurden, die nicht direkt für die Komplementarität bestimmend ist. Der Begriff FR bezieht sich hier auf Aminosäuresequenzen, die CDRs flankieren oder dazwischen liegen.
Die CDR- und FR-Polypeptidabschnitte werden auf der Grundlage einer Sequenzanalyse der Fv-Region von bereits existierenden Antikörpern oder diese kodierender DNA konstruiert. In einer Ausführungsform sind die Aminosäuresequenzen, welche die FR-Regionen der BABS bilden, den FR- Sequenzen eines ersten bereits existierenden Antikörpers, beispielsweise ein menschliches IgG, analog. Die Aminosäuresequenzen, welche die CDR-Regionen bilden, sind den Sequenzen eines zweiten, davon verschiedenen, bereits existierenden Antikörpers analog, beispielsweise den CDRs eines Maus-IgG. Alternativ können die CDRs und FRs eines einzelnen, bereits existierenden Antikörpers aus beispielsweise einem unstabilen oder schwer zu kultivierenden Hybridom vollständig kopiert werden.
Die Ausführung der Erfindung ermöglicht die Konstruktion und Biosynthese von verschiedenen Reagenzien, die alle durch eine Region mit einer Affinität für eine vorgewählte antigene Determinante gekennzeichnet sind. Die Bindungsstelle und die anderen Regionen des biosynthetischen Proteins werden unter Berücksichtigung der konkreten geplanten Verwendung des Proteines konstruiert. Wenn daher das Reagenz zur intravaskulären Anwendung in Säugern bestimmt ist, können die FR-Regionen Aminosäuren aufweisen, die mindestens zum Teil den Aminosäuren der Strukturregion des nativen Antikörpers der Säugerspezies ähneln oder damit identisch sind. Andererseits können die Aminosäuren, welche die CDRs darstellen, einem Teil der Aminosäuren der hypervariablen Region (und bestimmten flankierenden Aminosäuren) eines Antikörpers mit bekannter Affinität und Spezifität, z.B. ein monoklonaler Maus- oder Ratten- Antikörpers, analog sein.
Andere Abschnitte der Proteinstruktur des nativen Immunoglobulins, z.B. CH und CL, müssen nicht vorliegen und sind gewöhnlich in den biosynthetischen Proteinen absichtlich nicht vorgesehen. Die Proteine der Erfindung weisen jedoch gewöhnlich ein zusätzliches Polypeptid oder Proteinregionen auf, das/die eine bioaktive Region definieren, z.B. ein Toxin oder Enzym, oder eine Stelle, an die ein Toxin oder eine durch Fernmessung nachweisbare Substanz gebunden werden kann.
Die Erfindung stellt somit intakte biosynthetische Antikörperbindungsstellen bereit, die VH-VL-Dimeren analog sind und entweder nichtkovalent verbunden, durch Disulfidbrücken verbunden oder vorzugsweise durch eine Polypeptidsequenz unter Bildung eines VH-VL-Komposits oder VL-VH-Polypeptids verbunden sind, das von der konstanten Region des Antikörpers praktisch frei ist. Die Erfindung stellt außerdem Proteine bereit, die einer unabhängigen VH- oder VL-Domäne oder Dimeren davon analog sind. Jedes dieser Proteine kann in einer Form bereitgestellt werden, in der sie beispielsweise an Aminosäuren gebunden sind, die einem bioaktiven Molekül wie einem Hormon oder Toxin analog oder homolog sind.
Die funktionell voneinander unabhängigen Regionen des Proteins sind durch einen Spacer verbunden, der sich aus einer kurzen Aminosäuresequenz zusammensetzt und dessen Funktion darin besteht, die funktionellen Regionen zu trennen, so daß sie unabhängig voneinander ihre aktive Tertiärkonformation annehmen können. Der Spacer kann aus einer Aminosäuresequenz bestehen, die sich am Ende eines funktionellen Proteins befindet, wobei die Sequenz für dessen Funktion selber nicht benötigt wird, oder es kann sich um spezifische Sequenzen handeln, die auf der DNA- Ebene in das Protein eingebaut wurden.
Der Spacer kann im allgemeinen zwischen 5 und 25 Reste aufweisen. Seine optimale Länge kann durch die Verwendung von Konstruktionen mit verschiedenen Spacerlängen, die sich beispielsweise durch Einheiten aus 5 Aminosäuren unterscheiden, ermittelt werden. Die konkreten Aminosäuren in dem Spacer können variieren. Cysteine sollte vermieden werden. Hydrophile Aminosäuren sind bevorzugt. Die Spacersequenz kann die Sequenz einer Gelenkregion eines Immunglobulins nachahmen. Sie kann auch so konstruiert sein, daß sie eine Struktur annimmt, beispielsweise eine helikale Struktur. In den Spacer, der die der variablen Region ähnlichen Sequenzen von anderen Seitensequenzen trennt, können proteolytische Spaltungsstellen eingebaut werden, um die Abspaltung der intakten BABS von anderem Protein zu erleichtern, oder um das bioaktive Protein in vivo freizusetzen.
Die Figuren 2A-2E veranschaulichen 5 Beispiele für Proteinstrukturen nach der Erfindung, die gemäß der hier offenbarten Lehre hergestellt werden können. Sie sind alle durch ein biosynthetisches Polypeptid gekennzeichnet, das eine Bindungsstelle 3 definiert, die CDRs und FRs, welche häufig von verschiedenen Immunglobulinen stammen, enthaltende Aminosäuresequenzen aufweist, oder Sequenzen, die zu einem Teil der CDRs und FRs unterschiedlicher Immunglobuline homolog sind. Figur 2A zeigt ein einkettiges Konstrukt, das eine Polypeptiddomäne 10 mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die der variablen Region einer schweren Immunglobulinkette analog ist und über ihr Carboxyende an einen Polypeptidlinker 12 gebunden ist, der wiederum an eine Polypeptiddomäne 14 mit einer Aminosäuresequenz gebunden ist, welche der variablen Region einer leichten Immunglobulinkette analog ist. Selbstverständlich können die leichte und die schwere Kettendomäne in umgekehrter Reihenfolge vorliegen. Alternativ kann die Bindungsstelle zwei im wesentlichen homologe Aminosäuresequenzen aufweisen, die beide der variablen Region einer schweren oder leichten Immunglobulinkette analog sind.
Der Linker 12 sollte lang genug sein (z.B. etwa 15 Aminosäuren oder etwa 40 Å), das die Ketten 10 und 14 ihre richtige Konformation annehmen können. Der Linker 12 kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche homolog zu einer Sequenz ist, die von der Spezies, in die sie eingeführt wird, als "selbst" erkannt wird, wenn die Verwendung als Arzneistoff beabsichtigt ist. Beispielsweise kann der Linker eine Aminosäuresequenz aufweisen, die einer Gelenkregion eines Immunglobulins nachgebildet ist. Der Linker weist vorzugsweise hydrophile Aminosäuresequenzen auf. Er kann auch ein bioaktives Polypeptid wie ein Zelltoxin aufweisen, das durch die Bindungsstelle zielgesteuert werden soll, oder einen Abschnitt, der leicht durch ein radioaktives Reagenz markiert wird, das beispielsweise zu einem Tumor, der ein von der Bindungsstelle erkennbares Epitop aufweist, befördert werden soll. Der Linker kann außerdem eine oder zwei eingebaute Spaltungsstellen enthalten, d.h. eine Aminosäure oder Aminosäuresequenz, die von einem im folgenden beschriebenen ortsspezifischen Spaltungsmittel angegriffen werden kann. Diese Strategie erlaubt die Trennung der VH- und VL-ähnlichen Domänen nach der Expression oder das Ausschneiden des Linkers nach der Faltung, während die Bindungsstellenstruktur nichtkovalent verbunden bleibt. Die Aminosäuren des Linkers sind vorzugsweise unter solchen mit verhältnismäßig kleinen, nichtreaktiven Seitenketten ausgewählt. Alanin, Serin und Glycin sind bevorzugt.
Im allgemeinen spielen bei der Konstruktion des Linkers ähnliche Überlegungen eine Rolle wie bei der Konstruktion des Spacers, mit dem Unterschied, daß die Bindungseigenschaften der verbundenen Domänen stark verringert sind, wenn die Linkersequenz kürzer als etwa 20 Å ist, d.h. weniger als etwa 10 Reste aufweist. Zwischen dem N-Terminus einer nativen variablen Region und dem C-Terminus ihrer Schwesterkette können Linker verwendet werden, die länger als ungefähr 40 Å sind, wodurch aber ebenfalls möglicherweise die Bindungseigenschaften der BABS verringert werden. Linker, die zwischen 12 und 18 Reste aufweisen, sind bevorzugt. Die bevorzugte Länge in konkreten Konstrukten kann ermittelt werden, indem die Länge des Linkers zuerst mit Einheiten aus 5 Resten variiert wird und dann mit Einheiten aus 1 - 4 Resten, nachdem das beste Vielfache der pentameren Ausgangseinheiten ermittelt wurde.
Um multifunktionelle Proteine des in den Figuren 2B-2E veranschaulichten Typs herzustellen, können weitere Proteine oder Polypeptide an den Amino- oder Carboxyterminus der Bindungsstelle oder an beide gebunden werden.
Beispielsweise weist in Figur 2B eine helikal gewundene Polypeptidstruktur 16 ein Protein-A-Fragment (FB) auf, das über einen Spacer 18 an das aminoterminale Ende einer VHähnlichen Domäne 10 gebunden ist. Figur 2C veranschaulicht ein bifunktionelles Protein mit einem Effektorpolypeptid 20, das über einen Spacer 22 an den Carboxyterminus des Polypeptids 14 des bindenden Proteinabschnitts 2 gebunden ist. Dieses Effektorpolypeptid 20 kann beispielsweise aus einem Toxin, einem Arzneistoff, einem Bindungsprotein, einem Enzym oder Enzymfragment, einer Bindungsstelle für ein Scintigraphiemittel (z.B. um ein radioaktives Ion wie Indium zu komplexieren) oder einer Stelle zur selektiven Bindung an eine Immobilisierungsmatrix, so daß die BABS zur Affinitätschromatographie oder in einem Festphasenbindungsassay verwendet werden kann, bestehen. Dieser Effektor kann alternativ an den Aminoterminus des Polypeptids 10 gebunden sein, obwohl Trailer bevorzugt sind. Figur 2D zeigt ein trifunktionelles Protein, das ein verbundenes BABS-Paar 2 mit einer weiteren unterschiedlichen Proteindomäne 20, die an den N-Terminus des ersten Bindungsproteinabschnitts gebunden ist, aufweist. Die Verwendung von mehreren BABS in einem einzigen Protein gestattet die Herstellung von Konstrukten mit sehr hoher selektiver Affinität für Multiepitopstellen, wie beispielsweise Zelloberflächenproteine.
Die funktionell unabhängigen Domänen sind durch einen Spacer 18 verbunden (Figuren 2B und 2D), der kovalent den C-Terminus des Proteins 16 oder 20 an den N-Terminus der ersten Domäne 10 des Bindungsproteinabschnitts 2 bindet, oder durch einen Spacer 22, der den C-Terminus der zweiten Bindungsdomäne 14 an den N-Terminus eines weiteren Proteins bindet (Fig. 2C und 2D). Bei dem Spacer kann es sich um eine Aminosäuresequenz handeln, die zur Linkersequenz 12 analog ist, oder er kann andere Formen annehmen. Wie oben erwähnt, besteht die Hauptfunktion des Spacers darin, die aktiven Proteinregionen zu trennen, um ihre unabhängige Bioaktivität zu fördern und jeder Region zu ermöglichen, ihre bioaktive Konformation unabhängig von Störungen durch ihre benachbarte Struktur anzunehmen.
Figur 2E zeigt einen weiteren Reagenztyp, der eine BABS mit nur einem Satz von drei CDRs aufweist, die z.B. einer variablen Region einer schweren Kette analog ist, und einen Teil der Affinität für das Antigen behält. An das Carboxyende des Polypeptids 10 oder 14, das die FR und CDR-Sequenzen aufweist, welche die Bindungsstelle 3 bilden, ist durch den Spacer 22 wie oben beschrieben das Effektorpolypeptid 20 gebunden.
Nach dem Vorerwähnten ist klar, daß die Erfindung eine große Familie Reagenzien zur Verfügung stellt, die Proteine enthalten, in denen mindestens ein Teil eine Bindungsstelle definiert, die der variablen Region eines Immunglobulins nachgebildet ist. Es ist klar, daß die Beschaffenheit der Proteinfragmente, die an die BABS gebunden und für Reagenzien nach der Erfindung verwendet werden, praktisch keinen Beschränkungen unterliegt, denn das wesentliche der Erfindung ist die Bereitstellung von Bindungsstellen, und zwar entweder alleine oder an andere Proteine gebunden, die für jedes beliebige gewünschte Antigen spezifisch sind.
Die klinische Verabreichung von eine BABS aufweisenden multifunktionellen Proteinen, oder einer BABS alleine, hat eine Anzahl von Vorteilen gegenüber der Verwendung von intakten natürlichen oder chimären Antikörpermolekülen, Fragmenten davon und Konjugaten, die derartige Antikörper an einen zweiten bioaktiven Rest chemisch gebunden aufweisen. Die hier beschriebenen multifunktionellen Proteine haben weniger Spaltungsstellen für zirkulierende proteolytische Enzyme, ihre funktionellen Domänen sind durch Peptidbindungen an Polypeptidlinker- oder -spacersequenzen gebunden, und die Proteine sind daher stabiler. Aufgrund ihrer geringeren Größe und effizienten Konstruktion können die hier beschriebenen multifunktionellen Proteine ihr Zielgewebe rascher erreichen und werden schneller aus dem Körper ausgeschieden. Sie haben ferner verringerte Immunogenwirksamkeit. Außerdem erleichtert ihre Konstruktion die Kupplung an andere Reste zur Zielsteuerung von Arzneistoffen und zur Scintigraphie. Eine derartige Kupplung kann nach der Expression der BABS chemisch vorgenommen werden, und zwar an einer Bindungsstelle für das Kupplungsprodukt, die auf der DNA-Ebene in das Protein eingebaut wurde. Aktive Effektorproteine mit toxischer, enzymatischer, bindender, modulierender, zelldifferenzierender, hormoneller oder anderer Bioaktivität werden von einer einzelnen DNA als Leader- und/oder Trailersequenz exprimiert, die über Peptidbindungen an die BABS gebunden ist.

Konstruktion und Herstellung

Die Proteine der Erfindung werden auf der DNA-Ebene konstruiert. Die chimären oder synthetischen DNAs werden dann in einem geeigneten Wirtssystem exprimiert, und die exprirnierten Proteine werden gesammelt und erforderlichenfalls renaturiert. Die bevorzugte allgemeine Struktur der die Proteine kodierenden DNA ist in Figur 8 angegeben. Wie dort veranschaulicht, kodiert sie eine optimale Leadersequenz, die zur Förderung der Expression in Prokaryouten verwendet wird, und zwar mit einer eingebauten Spaltstelle, die von einem ortsspezifischen Spaltmittel, wie beispielsweise einer Endopeptidase erkannt werden kann, das nach der Expression zur Entfernung des Leaders verwendet wird. Daran schließen sich eine DNA, die eine CDRs und FRs aufweisende VH-ähnliche Domäne kodiert, ein Linker, eine VL-ähnliche Domäne, die wiederum CDRs und FRs aufweist, ein Spacer und ein Effektorprotein an. Nach der Expression, der Faltung und der Abspaltung des Leaders ergibt sich ein bifunktionelles Protein mit einer Bindungsregion, deren Spezifität durch die CDRs bestimmt wird, und einer über Peptidbindungen gebundenen funktionell unabhängigen Effektorregion.
Die Konstruktion der BABS der Erfindung hängt davon ab, ob die Sequenz der Aminosäuren in der variablen Region der betreffenden monoklonalen Antikörper ermittelt werden kann, oder die der sie kodierenden DNA. Die Hybridom-Technologie ermöglicht die Produktion von Zellinien, die Antikörper gegen praktisch jede gewünschte Substanz, die eine Immunantwort erzeugt, sezernieren. Die RNA, welche die leichten und schweren Ketten des Immunglobulins kodiert, ist dann aus dem Cytoplasma des Hybridoms erhältlich. Das 5'-Ende der mRNA kann verwendet werden, um cDNA zur anschließenden Sequenzierung zu präparieren, oder die Aminosäuresequenz der hypervariablen und flankierenden Strukturregionen kann durch Aminosäuresequenzierung der V-Region-Fragmente der H- und L-Ketten ermittelt werden. Eine derartige Sequenzanalyse wird mittlerweile routinemäßig durchgeführt. Diese Kenntnis in Verbindung mit Beobachtungen und Folgerungen aus der verallgemeinerten Struktur der Fvs von Immunglobulinen erlaubt die Konstruktion von synthetischen Genen, die FR- und CDR-Sequenzen kodieren, welche voraussichtlich das Antigen binden werden. Diese synthetischen Gene werden dann unter Anwendung bekannter Techniken oder unter Anwendung der im folgenden offenbarten Technik hergestellt, in einen geeigneten Wirt insertiert und exprimiert, und das exprirnierte Protein wird gereinigt. In Abhängigkeit von der Wirtszelle können Renaturierungstechniken erforderlich sein, um die richtige Konformation zu erhalten Die verschiedenen Proteine werden dann auf das Bindungsvermögen untersucht, und solche mit geeigneter Affinität werden ausgewählt, um sie in ein Reagenz des oben beschriebenen Typs einzuführen. Falls erforderlich, können zur Optimierung der Bindung Punktsubstitutionen in der DNA vorgenommen werden, nämlich unter Anwendung der üblichen Kassettenmutagenese oder anderer Verfahren der Proteintechnik, beispielsweise wie im folgenden offenbart.
Die Herstellung der Proteine der Erfindung ist außerdem von der Kenntnis der Aminosäuresequenz (oder der entsprechenden DNA- oder RNA-Sequenz) von bioaktiven Proteinen wie Enzymen, Toxinen, Wachstumsfaktoren, Zelldifferenzierungsfaktoren, Rezeptoren, Antimetaboliten, Hormonen oder verschiedenen Cytokinen oder Lymphokinen abhängig. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und über Computerdatenbanken verfügbar.
Die DNA-Sequenzen der Bindungsstelle und der zweiten Proteindomäne werden unter Anwendung üblicher Techniken fusioniert, oder aus synthetisierten Oligonukleotiden zusammengesetzt, und dann unter Anwendung entsprechender üblicher Techniken exprimiert.
Die Verfahren zur Manipulierung, Amplifizierung und Rekombination von DNA, welche die betreffenden Aminosäuresequenzen kodiert, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden deshalb hier nicht im Detail beschrieben. Verfahren zur Identifizierung und Isolation von Genen, welche die betreffenden Antikörper kodieren, sind gut untersucht und in der Patent- und der übrigen Literatur beschrieben. Im allgemeinen sind die Verfahren damit verbunden, daß genetisches Material selektiert wird, das dem genetischen Code entsprechend Aminosäuren kodiert, welche die betreffenden Proteine einschließlich der betreffenden CDRs und FRs definieren.
Daher kann die Konstruktion von DNAs, welche die hier offenbarten Proteine kodieren, unter Anwendung bekannter Techniken vorgenommen werden, die mit der Ver-/Anwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen, die unter Erhalt von stumpfen Enden oder kohäsiven Enden sequenzspezifische Schnitte in DNA machen, DNA-Ligasen, Techniken zur enzymatischen Hinzufügung von klebrigen Enden an DNA mit stumpfen Enden, der Konstruktion von synthetischen DNAs durch Zusammensetzen von Oligonukleotiden mit geringer oder mittlerer Länge, cDNA-Synthesetechniken und synthetischen Sonden zur Isolation von Genen für Immunglobuline oder andere bioaktive Proteine verbunden sind. Ebenfalls bekannt und verfügbar sind verschiedene Promotorsequenzen und andere regulatorische DNA-Sequenzen, die zur Erzielung der Expression verwendet werden, sowie verschiedene Typen von Wirtszellen. Zur Durchführung der Erfindung sind übliche Transfektionstechniken und entsprechende übliche Techniken zur Klonierung und Subklonierung von DNA anwendbar und dem Fachmann bekannt. Es können verschiedene Vektor-Typen verwendet werden, beispielsweise Plasmide und Viren, einschließlich Tierviren und Bakteriophagen. Die Vektoren können verschiedene Markergene enthalten, welche einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare phänotypische Eigenschaft verleihen, die dazu verwendet werden kann, festzustellen, welcher Klon aus einer Klonfamilie die rekombinierte DNA des Vektors erfolgreich aufgenommen hat.
Ein Verfahren zum Erhalt von DNA, welche die hier offenbarten Proteine kodiert, ist das Zusammensetzen von synthetischen Oligonukleotiden, die in einem üblichen, automatisierten Polynukleotidsynthesizer hergestellt und anschließend mit geeigneten Ligasen ligasiert werden. Beispielsweise können sich überlappende, komplementäre DNA- Fragmente mit 15 Basen halbmanuell unter Anwendung der Phosphoramiditchemie synthetisiert werden, wobei die Endabschnitte unphosphoryliert bleiben, um während der Ligasierung die Polymerisation zu verhindern. Ein Ende der synthetischen DNA behält ein "klebriges Ende", das der Angriffsstelle einer bestimmtem Restriktionsendonuklease entspricht, und das andere Ende behält ein Ende, das der Angriffsstelle einer anderen Restriktionsendonuklease entspricht. Dieser Ansatz kann alternativ vollständig automatisiert werden. Die das Protein kodierende DNA kann durch Synthese längerer einsträngiger Fragmente (z.B. 50 - 100 Nukleotide lang), beispielsweise in einem Biosearch-Oligonukleotidsynthesizer, und anschließende Ligasierung der Fragmente synthetisiert werden.
Bei einem Verfahren zur Herstellung der BABS der Erfindung wird eine synthetische DNA hergestellt, die ein Polypeptid kodiert, das beispielsweise menschliche FRs und dazwischenliegende "Dummy"-CDRs oder Aminosäuren, die keine andere Funktion haben, als geeignet festgelegte, nur einmal vorkommende Restriktionsstellen zu definieren, enthält. Diese synthetische DNA wird dann durch DNA-Substitution verändert, indem durch Restriktion und Ligation synthetische Oligonukleotide insertiert werden, die CDRs kodieren, welche eine gewünschte Bindungsspezifität an der richtigen Stelle zwischen den FRs vorgeben. Dieser Ansatz erleichtert die empirische Verbesserung der Bindungseigenschaften der BABS.
Diese Technik ist davon abhängig, daß eine DNA, deren Struktur der eines Gens einer variablen Domäne entspricht, an spezifischen Stellen, die CDRs kodierende Nukleotidsequenzen flankieren, gespalten werden kann. Diese Restriktionsstellen werden in einigen Fällen im nativen Gen vorgefunden. Alternativ können nichtnative Restriktionsstellen in die Nukleotidsequenz eingebaut werden, was zu einem synthetischen Gen führt, das eine andere Nukleotidsequenz als das native Gen hat, aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes aber die gleichen Aminosäuren der variablen Region kodiert. Die sich durch Endonuklease-Abbau ergebenden Fragmente, welche FR-codierende Sequenzen aufweisen, werden dann an nichtnative CDR-kodierende Sequenzen ligasiert, um ein synthetisches Gen für eine variable Domäne mit veränderter Antigen-Bindungsspezifität herzustellen. Dann können zusätzliche Nukleotidsequenzen, die beispielsweise Aminosäuren einer konstanten Region oder eines bioaktiven Moleküls kodieren, zur Bildung eines bifunktionellen Proteins an die Gensequenzen gebunden werden.
Die Expression dieser synthetischen DNAs kann sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Systemen durch Transfektion mit einem geeigneten Vektor erfolgen. In E. coli und anderen mikrobiellen Wirten können die synthetischen Gene als Fusionsprotein, das anschließend gespalten wird, exprimiert werden. Die Expression in Eukaryonten kann durch die Transfektion von DNA-Sequenzen, die Aminosäuren der CDR- und FR-Region und Aminosäuren, welche eine zweite Funktion definieren, kodiert, in ein Myelom oder in einen anderen Zellinientyp erreicht werden. Mit Hilfe dieser Strategie können intakte Hybrid-Antikörpermoleküle mit hybriden Fv-Regionen und verschiedenen bioaktiven Proteinen sowie einer biosynthetischen Bindungsstelle hergestellt werden. Im Falle eines in Bakterien exprimierten Fusionsproteins können die isolierten Fusionen anschließend proteolytisch gespalten werden, um die freie BABS zu erhalten, die dann unter Erhalt einer intakten biosynthetischen Hybrid-Antikörperbindungsstelle renaturiert werden kann.
Bisher war es nicht möglich, die schwere und die leichte Kettenregion zur Trennung der variablen und konstanten Regionen eines Immunglobulins zu spalten, um ein intaktes Fv herzustellen, von speziellen Fällen ohne wirtschaftlichen Nutzen abaesehen. Nach einem Verfahren zur Herstellung von BABS nach der Erfindung werden jedoch die DNAs, welche die schweren und leichten Ketten eines Immunglobulins kodieren, rekonstruiert, wobei gegebenenfalls dessen Spezifität verändert oder dessen FRs humanisiert werden, und es wird eine Spaltstelle und "Gelenkregion" zwischen den variablen und konstanten Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten eingeführt Derartige chimäre Antikörper können in Transfektomen oder dgl. hergestellt und anschließend unter Verwendung einer vorgewählten Endopeptidase gespalten werden.
Bei der Gelenkregion handelt es sich um eine Sequenz von Aminosäuren, die dazu dient, die wirksame Spaltung durch ein vorgewähltes Spaltungsmittel an einer vorgewählten, eingebauten Spaltungsstelle zu fördern. Sie so gestaltet, daß die Spaltung vorzugsweise an der Spaltungsstelle gefördert wird, wenn das Polypeptid mit dem Spaltungsmittel in einem geeigneten Milieu behandelt wird.
Die Gelenkregion kann viele verschiedene Formen annehmen. Ihre Konstruktion ist mit der Auswahl von Aminosäureresten (und einem diese kodierenden DNA-Fragment) verbunden, die der Region des Fusionsproteins an der Spaltungsstelle eine geeignete Polarität, Ladungsverteilung und Stereochemie verleihen, so daß in der wäßrigen Umgebung, in der die Spaltung stattfindet, die Spaltungsstelle, anderen möglichen Spaltstellen, die in dem Polypeptid vorhanden sein können, bevorzugt, wirksam der Einwirkung des Spaltungsmittels ausgesetzt wird und/oder die Kinetik der Spaltungsreaktion verbessert wird. In speziellen Fällen werden die Aminosäuren des Gelenks aufgrund ihrer bekannten Eigenschaften ausgewählt und zur Sequenz zusammengesetzt, und die fusionierte Polypeptidsequenz wird dann exprimiert, geprüft und zur Verbesserung verändert.
Die Gelenkregion ist cysteinfrei. Deshalb kann die Spaltungsreaktion unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen das Protein seine Tertiärkonformation annimmt und durch intramolekulare Disulfidbrücken in dieser Konformation gehalten werden kann. Es wurde gefunden, daß unter diesen Bedingungen der Zugang der Protease zu möglichen Spaltungsstellen, die sich in dem Zielprotein befinden können, behindert ist. Die Gelenkregion kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die einen oder mehrere Prolinreste enthält. Dadurch ist die Bildung eines praktisch ungefalteten Molekülabschnitts möglich. Asparaginsäure-, Glutaminsaure-, Arginin-, Lysin-, Serin- und Threoninreste maximieren ionische Wechselwirkungen und können in Mengen und/oder in einer Sequenz vorhanden sein, die den Rest, der das Gelenk aufweist, wasserlöslich macht.
Die Spaltungsstelle befindet sich vorzugsweise unmittelbar in Nachbarschaft zu den Fv-Polypeptidketten und weist eine Aminosäure oder eine Sequenz von Aminosäuren auf, die sich nicht in der Aminosäurestruktur der Ketten in dem Fv findet. Die Spaltungsstelle ist vorzugsweise zur eindeutigen oder bevorzugten Spaltung durch ein speziell ausgewähltes Mittel konstruiert. Endopeptidasen sind bevorzugt, obwohl auch nichtenzymatische (chemische) Spaltungsmittel verwendet werden können. Viele verwendbare Spaltungsmittel, beispielsweise Bromcyan, verdünnte Säuren, Trypsin, Staphylococcus-aureus-V-8-Protease, nach Prolin spaltende Enzyme, der Blutgerinnungsfaktor Xa, Enterokinasen und Renin, erkennen und spalten bestimmte Spaltungsstellen bevorzugt oder ausschließlich. Ein üblicherweise bevorzugtes Spaltungsmittel ist die V-8-Protease. Die üblicherweise bevorzugte Spaltungsstelle ist ein Glu-Rest. Andere verwendbare Enzyme erkennen mehrere Reste als Spaltungsstellen, z.B. der Faktor Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) oder die Enterokinase (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Diese selektive Spaltung kann im Prinzip auch bei der Konstruktion der Linkerund Spacersequenzen der multifunktionellen Konstrukte der Erfindung angewendet werden, wenn ein ausschneidbarer Linker oder selektiv spaltbarer Linker oder Spacer erwünscht sind.

Konstruktion synthetischer VH- und VL-Nachahmungen

Die FRs der schweren und leichten Kette des monoklonalen Maus-Anti-Digoxin-Antikörpers 26-10 (Figuren 4A und 4B) wurden mit den CDRs der schweren Kette (Figur 3, Sequenz 1) und der leichten Kette des monoklonalen Maus-Anti-Lysozym- Antikörpers glp-4 durch die gleichen DNAs kodiert, um VH- (Figur 4C) und VL (Figur 4D)-Regionen herzustellen, die zusammen eine für Lysozym spezifische biosynthetische Antikörperbindungsstelle definieren. Die Maus-CDRs sowohl der schweren als auch der leichten Ketten des monoklonalen Antikörpers glp-4 wurden mit den FRs der schweren und leichten Ketten des menschlichen Myelom-Antikörpers NEWM (Figuren 4E und 4F) durch die gleichen DNAs kodiert. Die sich ergebende chimäre Interspezies-Antikörperbindungsdomäne hat wegen der menschlichen FRs beim Menschen eine verringerte Immunogenwirksamkeit und wegen ihren Maus-CDRs Lysozymspezifität.
Es wurde eine synthetische DNA konstruiert, um CDR-Insertionen in die FR einer menschlichen schweren Kette zu erleichtern und um die empirische Verbesserung der sich ergebenden chimären Aminosäuresequenz zu erleichtern. Diese DNA ist in Figur 5 dargestellt.
Ferner wurde ein synthetisches bifunktionelles Protein mit FE-Bindungsstelle auf der DNA-Ebene konstruiert, exprimiert, gereinigt und renaturiert, und es wurde gezeigt, daß es spezifisch ein vorgewählten Antigen (Digoxin) und Fc bindet. Die genaue Primärstruktur dieser Konstruktion ist in Figur 6 gezeigt, und seine Tertiärstruktur ist in Figur 2B schematisch dargestellt.
Die Einzelheiten dieser und anderer Versuche und weitere Konstruktionsprinzipien, auf denen die Erfindung beruht, sind im folgenden angegeben.

Genkonstruktion und Expression

Unter der Voraussetzung, daß die DNA-Sequenzen der variablen Regionen bekannt sind, können synthetische VL- und VH- Gene konstruiert werden, die native oder nahezu native FR- und CDR-Aminosäuresequenzen eines Antikörpermoleküls kodieren, welche jeweils durch nur einmal vorkommende Restriktionsstellen, die sich so nah wie möglich an den FR-CDR- und CDR-FR-Grenzen befinden, getrennt sind. Alternativ können Gene konstruiert werden, die native FR-Sequenzen kodieren, welche den FRs eines Antikörpermoleküls einer ausgewählten Spezies ähneln oder die damit identisch sind und jeweils durch "Dummy"-CDR-Sequenzen getrennt sind, die strategisch angeordnete Restriktionsstellen enthalten. Diese DNAs dienen als Startmaterialien zur Herstellung von BABS, weil die nativen oder "Dummy"-CDR-Sequenzen ausgeschnitten und durch Sequenzen ersetzt werden können, welche die eine ausgewählte Bindungsstelle definierenden CDR- Aminosäuren kodieren. Alternativ können native oder nahezu native FR-Sequenzen eines ersten Antikörpermoleküls und CDR-Sequenzen eines zweiten Antikörpermoleküls konstruiert und direkt synthetisiert werden. Beliebige der oben beschriebenen VH- und VL-Sequenzen können über eine Aminosäurekette oder einen Linker, die/der den C-Terminus der einen Kette mit dem N-Terminus der anderen verbindet, direkt miteinander verbunden werden.
Nach der Synthese können diese Gene mit oder ohne zusätzliche DNA-Sequenzen, die beispielsweise eine konstante Antikörperregion, ein Enzym oder Toxin, oder ein Leaderpeptid, das die Sekretion oder intrazelluläre Stabilität eines Fusionspolypeptids fördert, kodieren, kloniert werden. Die Gene können dann direkt in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden, oder sie können vor der Expression durch den Austausch von FR-, CDR- oder "Dummy"-CDR-Sequenzen gegen neue Sequenzen umkonstruiert werden. Diese Manipulation wird durch das Vorliegen der Restriktionsstellen, die an den FR-CDR- und CDR-FR-Grenzen in das Gen eingebaut wurden, erleichtert.
Figur 3 veranschaulicht das allgemeine Verfahren zur Konstruktion einer chimären VH; weitere Einzelheiten beispielhaf ter Konstruktionen auf der DNA-Ebene sind in den Figuren 4A-4F gezeigt. Figur 3, Zeilen 1 und 2, zeigt die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der schweren Ketten der monoklonalen Maus-Antikörper glp-4 (Anti-Lysozym) und 26-10 (Anti-Digoxin) einschließlich der vier FR- und drei CDR-Sequenzen jeder Kette. Zeile 3 zeigt die Sequenz einer chimären VH, die 26-10-FRs und glp-4-CDRs aufweist. Wie dargestellt, ist das Hybridprotein von Zeile 3 mit dem nativen Protein von Zeile 2 identisch, mit dem Unterschied, daß 1) die Sequenz TFTNYYIHWLK die Sequenz IFTDFYMNWVR ersetzt 2) EWIGWIYPGNGNTKYNENFKG DYIGYISPYSGVTGYNQKFKG ersetzt 3) RYTHYYF GSSGNKWAM ersetzt und 4) A V als sechste Aminosäure hinter CDR-2 ersetzt. Diese Veränderungen bewirken die Anderung der Spezifität der 26-10-VH, so daß die Spezifität von glp-4 nachgeahmt wird. Der Austausch einer einzelnen Aminosäure, nämlich Ala gegen Val, in der relativ konservierten Strukturregion von 26-10 ist ein Beispiel für den Austausch einer Aminosäure außerhalb der hypervariablen Region, um die Spezifität durch CDR-Austausch zu ändern. Unterhalb von Sequenz 3 in Figur 3 sind die Restriktionsstellen in der die chimäre VH kodierenden DNA (vgl. Figuren 4A-4F), die an den CDR-FR-Grenzen angeordnet sind, gezeigt.
Die Zeilen 4 und 5 von Figur 3 stellen ein weiteres Konstrukt dar. Zeile 4 stellt die VH des menschlichen Antikörpers NEWM in voller Länge dar. Dieser menschliche Antikörper kann durch den in Zeile 5 gezeigten CDR- Austausch lysozymspezifisch gemacht werden. So ersetzt beispielsweise der Abschnitt TFTNYYIHWLK von glp-4 TFSNDYYTWVR von NEWM, und dessen anderen CDRs werden wie gezeigt ausgetauscht. Dies ergibt eine VH, die eine menschliche Struktur mit die Spezifität bestimmenden Maus-Sequenzen aufweist.
In Anbetracht dieser Offenbarung kann der Fachmann durch Sequenzierung eines beliebigen Antikörpers, oder indem er die Sequenz der Literatur entnimmt, eine BABS mit jeder gewünschten Spezifität, die jede gewünschte Strukturregion aufweist, herstellen. Diagramme wie Figur 3, in denen Aminosäuresequenzen verglichen werden, sind nützlich, weil sie darauf schließen lassen, welche konkreten Aminosäuren ausgetauscht werden sollten, um die gewünschte Komplementarität festzulegen. Die Bindung der exprimierten Sequenzen kann geprüft und durch Austausch von ausgewählten Aminosäuren in den relativ konservierten Regionen verbessert werden, und zwar aufgrund beobachteter Tendenzen der Aminosäuresequenzdaten und/oder Computermodellierungstechniken.
Da die Aminosäuresequenzen auf der DNA-Ebene bestimmt werden und die Manipulation von DNA leicht vorgenommen werden kann, ist es möglich die VH- und VL-Konstruktion sehr flexibel zu gestalten.
Beispielsweise wurde die DNA-Sequenz für die Maus-26-10-VH und -VL, welche spezifische Restriktionsstellen enthält, die jede der drei CDRs flankieren, mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Computerprogramms, das eine kombinierte Suche nach reversen Translations- und Restriktionsstellen durchführt, ("RV.exe" von Compugene Inc.) konstruiert. Die bekannten Aminosäuresequenzen der 26-10-VH- und -VL- Polypeptide wurden eingegeben, und alle möglichen DNA-Sequenzen, welche diese Peptide kodieren, und alle möglichen Restriktionsstellen wurden durch das Programm analysiert. Das Programm kann außerdem DNA-Sequenzen auswählen, die das Peptid nur unter Verwendung von Codons kodieren, die von E. coli bevorzugt werden, wenn dieses Bakterium der gewählte Wirtsorganismus für die Expression ist. Die Figuren 4A und 4B zeigen ein Beispiel für die Programmausgabe. Die Nukleinsäuresequenzen des synthetischen Gens und die entsprechenden Aminosäuren sind angegeben. Außerdem sind die Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen angegeben. Die CDRs dieser synthetischen Gene sind unterstrichen.
Die DNA-Sequenzen für die synthetische 26-10-VH und -VL sind so konstruiert, daß eine oder beide Restriktionsstellen, die jede der drei CDRs flankieren, nur einmal vorkommen. Eine Stelle mit 6 Basen (wie die, die von Bsm I oder BspM I erkannt wird) ist bevorzugt, wenn aber eine Stelle mit sechs Basen nicht möglich ist, werden Stellen mit vier oder fünf Basen verwendet. Diese Stellen werden, wenn sie nicht bereits nur einmal vorkommen, in dem Gen zu einzigen gemacht, indem die an anderen Stellen in dem Gen auftretenden eliminiert werden, ohne die erforderlichen Aminosäuresequenzen zu verändern. Bevorzugte Spaltungsstellen sind solche, die nach der Spaltung Fragmente mit klebrigen Enden ergeben, die sich gerade außerhalb der Grenze der CDR in der Struktur befinden. Diese idealen Stellen sind jedoch nur gelegentlich möglich, weil die FR-CDR- Grenze nicht absolut ist, und weil es möglich ist, daß die Aminosäuresequenz der FR eine Restriktionsstelle nicht gestattet. In diesen Fällen werden flankierende Stellen in der FR ausgewählt, die von der vorhergesagten Grenze weiter entfernt sind.
Figur 5 offenbart die Nukleotid- und entsprechende Aminosäuresequenz (im Standard-Einbuchstadenkode angegeben) einer synthetischen DNA, die ein Hauptstrukturgen mit der allgemeinen Struktur:
R&sub1;-FR&sub1;-X&sub1;-FR&sub2;-X&sub2;-FR&sub3;-X&sub3;-FR&sub4;-R&sub2;
aufweist, in der R&sub1; und R&sub2; restriktionsverdaute Enden darstellen, die in einen Vektor ligasiert werden sollen, und X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; DNA-Sequenzen sind, deren Funktion die Bereitstellung von zweckmäßigen Restriktionsstellen für die CDR-Insertion ist. Diese spezielle DNA weist Maus-FR- Sequenzen und nur einmal vorkommende Restriktionsstellen mit 6 Basen in Nachbarschaft zu den FR-Grenzen auf, so daß die Nukleotidsequenzen, welche die CDRs eines gewünschten monoklonalen Antikörpers kodieren, ohne weiteres insertiert werden können. Die Restriktionsendonuklease-Abbaustellen sind mit ihren Abkürzungen bezeichnet, die Enzyme der Wahl für den CDR-Austausch sind unterstrichen. Der Abbau des Gens mit den folgenden Restriktionsendonukleasen führt zu 3 - und 5 -Enden, die ohne weiteres mit nativen oder synthetischen CDRs der gewünschten Spezifität basengepaart und ligasiert werden können: KpnI und BstXI werden zur Ligation von CDR&sub1; verwendet, XbaI und DraI für CDR&sub2; und BssHII und ClaI für CDR&sub3;.

Oligonukleotidsynthese

Die wie oben beschrieben konstruierten synthetischen Gene und DNA-Fragmente werden vorzugsweise hergestellt, indem chemisch synthetisierte Oligonukleotide zusammengesetzt werden. 15-100mer-Oligonukleotide können mit einem DNA- Synthesizer Biosearch Modell 8600 synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Tris-Borat-EDTA- Puffer (TBE) gereinigt werden. Die DNA wird dann aus dem Gel elektroeluiert. Überlappende Oligomere können mit T4- Polynukleotidkinase phosphoryliert und zu größeren Blöcken ligasiert werden, die dann ebenfalls durch PAGE gereinigt werden können.

Klonierung von synthetischen Oligonukleotiden

Die Blöcke oder die Paare längerer Oligonukleotide können unter Verwendung eines geeigneten Klonierungsvektors, z.B. pUC, in E. coli kloniert werden. Zunächst kann dieser Vektor durch Einzelstrangmutagenese verändert werden, um restliche veränderte Stellen mit sechs Basen zu eliminieren. Beispielsweise kann eine VH synthetisiert und in Form von fünf Hauptblöcken in pUC kloniert werden, welche die folgenden Restriktionsstellen umfassen: 1. EcoRI bis zur ersten NarI-Stelle, 2. erste NarI bis XbaI, 3. Mbal bis Sall, 4. Sall bis NcoI, 5. NcoI bis BamHI. Diese klonierten Fragmente können dann isoliert und in mehreren Drei-Fragment-Ligations- und -klonierschritten zusammengesetzt und zum Plasmid pUC8 kloniert werden. Die durch PAGE ausgewählten gewünschten Ligasierung werden dann beispielsweise zur Transformation des E.-coli-Stamms JM83 verwendet und dann nach Standardverfahren auf LB-Platten mit Ampicillin + Xgal ausplattiert. Die Gensequenz kann nach der Klonierung durch Überhelix-Sequenzierung oder nach Subklonierung in M13 nach dem Didesoxy-Verfahren von Sanger bestätigt werden.

Prinzip des CDR-Austauschs

Pro VH oder VL können drei CDRs (oder alternativ vier FRs) ausgetauscht werden. In einfachen Fällen kann dies erfolgen, indem das Shuttleplasmid pUC, das die entsprechenden Gene enthält, an den beiden nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen, welche jede CDR oder FR flankieren, geschnitten wird, die ausgeschnittene Sequenz entfernt wird und der Vektor mit einer nativen Nukleinsäuresequenz oder einem synthetischen Oligonukleotid, das die gewünschte CDR oder FR kodiert, ligasiert wird. Dieses dreiteilige Verfahren wäre zum vollständigen CDR-Austausch dreimal und zum vollständigen FR-Austausch viermal zu wiederholen. Alternativ kann ein synthetisches Nukleotid, das zwei aufeinanderfolgende CDRs, die durch die geeignete FR getrennt sind, kodiert, an pUC oder ein anderes Plasmid, das ein Gen enthält, dessen entsprechenden CDRs und FR ausgeschnitten wurden, ligasiert werden. Dieses Verfahren verringert die Anzahl der Schritte, die erforderlich sind, um den CDR- und/oder FR-Austausch durchzuführen.

Expression von Proteinen

Die konstruierten Gene können in geeigneten prokaryontischen Wirtszellen wie verschiedenen E.-coli-Stämmen und in eukaryontischen Wirtszellen wie Chinahamster-Ovarzellen, Maus-Myelomen und menschlichen Myelom/Transfectomzellen exprimiert werden
Wenn beispielsweise das Gen in E. coli exprimiert werden soll, kann es zuerst in einen Expressionsvektor kloniert werden. Dies geschieht dadurch, daß das konstruierte Gen stromabwärts von einer Promotorsequenz wie trp oder tac und eines ein Leaderpeptid kodierenden Gens angeordnet wird. Das sich ergebende exprimierte Fusionsprotein sammelt sich in den lichtbrechenden Körpern im Cytoplasma der Zellen an und kann nach der Zerstörung der Zellen mit einer Frenchpress oder durch Ultraschall gewonnen werden. Die lichtbrechenden Körper werden solubilisiert, und die exprimierten Proteine werden rückgefaltet und mit den bereits für viele andere rekombinante Proteine eingeführten Verfahren gespalten.
Wenn das konstruierte Gen in Myelomzellen, dem üblichen Expressionssystem für Immunglobuline, exprimiert werden soll, wird es zuerst in einen Expressionsvektor insertiert, der beispielsweise den Ig-Promotor, ein Sekretionssignal, Immunglobulin-Enhancer und verschiedene Introns enthält. Dieses Plasmid kann auch Sequenzen enthalten, die vollständig oder zum Teil eine konstante Region kodieren, wodurch es möglich ist, einen kompletten Teil einer schweren oder leichten Kette zu exprimieren. Das Gen wird mit Hilfe der eingeführten Elektroporation oder mit Protoplastenfusionsverfahren durch Transfektion in die Myelomzellen eingeführt. Die so transfizierten Zellen können VL- oder VH-Fragmente, VL2- oder VH2-Homodimere, VL-VH-Heterodimere, einkettige VH-VL- oder VL-VH-Polypeptide, komplette schwere oder leichte Immunglobulinketten oder Teile davon exprimieren, die jeweils wie oben diskutiert, auf verschiedene Art und Weise an eine Proteinregion mit einer anderen Funktion (z.B. Cytotoxizität) gebunden sein können.
Vektoren, die eine V-Region einer schweren Kette (oder V- und C-Regionen) enthalten, können mit analogen Vektoren kotransfiziert werden, die eine V-Region einer leichten Kette (oder V- und C-Regionen) tragen, wodurch die Expression von nichtkolvalent verbundenen Bindungsstellen (oder kompletten Antikörpermolekülen) möglich ist.
In den folgenden Beispielen wird ein konkretes Beispiel für die Herstellung einer einzelkettigen Bindungsstelle offenbart, und zwar zusammen mit den zur Beurteilung ihrer Bindungseigenschaften angewendeten Verfahren. Danach wird ein Proteinkonstrukt mit zwei funktionellen Domänen offenbart. Zuletzt wird eine Reihe weiterer zielgesteuerter Proteine offenbart, welche die Erfindung veranschaulichen.

I. Beispiel für den CDR-Austausch und die Expression

Das in den Figuren 4A und 4B angegebene synthetische Gen, das die Maus-26-10-VH und -VL kodiert, wurde anhand der bekannten Aminosäuresequenz des Proteins mit Hilfe des Softwareprogramms Compugene konstruiert. Diese Gene enthalten, obwohl sie die nativen Aminosäuresequenzen kodieren, auch nichtnative und häufig nur einmal vorkommende Restriktionsstellen, die CDRs kodierende Nukleinsäuresequenzen flankieren, so daß wie oben angemerkt der CDR- Austausch erleichtert ist.
Sowohl die 3'- als auch die 5'-Enden der langen synthetischen Oligomeren wurden so konstruiert, daß sie Restriktionsstellen mit 6 Basen enthalten, die sich in den Genen und in dem pUC-Vektor befinden. Darüber hinaus wurden diejenigen Restriktionsstellen in den synthetischen Genen, die nur zum Zusammenbau, aber nicht zum Klonieren in pUC geeignet sind, durch "Helfer"-Klonierstellen, die mit Stellen in pUC Basenpaarungen eingehen können, verlängert.
Die Klonierung der synthetischen DNA und der spätere Zusammenbau des Gens wird erleichtert, wenn sich entlang des Gens in Abständen nur einmal vorkommende Restriktionsstellen befinden. Dadurch sind durch Kassettenmutagenese an jedem Ort Korrekturen und Modifizierungen möglich. Darunter fallen z.B. Veränderungen in der Nähe der 5'- oder 3'-Enden des Gens, die zur Anpassung an verschiedene Expressionsvektoren erforderlich sind. Beispielsweise befindet sich eine PstI-Stelle in der Nähe des 5'-Endes des VH-Gens. Zwischen dieser Stelle und einer Restriktionsstelle in dem Expressionsplasmid können ohne weiteres synthetische Linker eingefügt werden. Diese Gene wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung eines DNA-Synthesizers Biosearch Modell 8600 durch Zusammensetzen von Oligonukleotiden synthetisiert. Sie wurden zur Transformation von E. coli in den Vektor pUC8 ligasiert.
Durch Abbau mit den folgenden Restriktionsendonukleasepaaren können konkrete CDRs aus dem synthetischen VH-Gen ausgeschnitten werden: HpHI und BstXI für CDR&sub1;, XbaI und DraI für CDR&sub2; und BanII und BanI für CDR&sub3;. Nach der Entfernung einer CDR kann eine andere CDR mit der gewünschten Spezifität an deren Stelle direkt in das durch die Restriktionsendonuklease geöffnete Gen ligasiert werden, wenn die 3'- und 5'-Enden des durch die Restriktionsendonuklease geöffneten Gens und der neuen CDR komplementäre einzelsträngige DNA-Sequenzen enthalten.
In diesem Beispiel wurden die drei CDRs der Maus-26-10-VH und -26-10-VL durch die entsprechenden CDRs von glp-4 ersetzt. Die Nukleinsäuresequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen der chimären VH- und VL-Gene, welche die FRs von 26-10 und CDRs von glp-4 kodieren, sind in den Figuren 4C und 4D gezeigt. Die Positionen der Restriktionsendonuklease-Spaltstellen sind mit ihren Standabkürzungen angegeben. Die CDR-Sequenzen sind wie die Restriktionsendonukleasen der Wahl für den weiteren CDR-Austausch unterstrichen.
Diese Gene wurden in pUC8, ein Shuttleplasmid, kloniert. Um nach dem Klonieren nur einmal vorkommende Restriktionsstellen zu behalten, wurde das VH-ähnliche Gen in die EcoR1- und HindIII- oder BamHI-Stellen des Plasmids gespleißt.
Die Gene können in E. coli direkt exprimiert werden. Alternativ kann dem Gen eine Leadersequenz vorausgehen, und es wird in E. coli in Form eines Fusionsprodukts exprimiert, indem das Fusionsgen in das Wirtsgen gespleißt wird, dessen Expression durch die Wechselwirkung eines Repressors mit dem entsprechend Operator reguliert wird. Das Protein kann durch Aushungern auf Minimalmedium und durch chemische Induktoren induziert werden. Das biosynthetische 26-10-VH- VL-Gen wurde in Form eines derartigen Fusionsproteins hinter dem trp- und tak-Promotor exprimiert. Das betreffende Gentranslationsprodukt kann dann von dem Leader in dem Fusionsprotein beispielsweise durch Bromcyan-Spaltung, Trypsinabbau, Spaltung mit milder Säure und/oder Abbau mit der Protease Faktor Xa abgespalten werden. Daher wurde zu diesem Zweck ein Shuttleplasmid verwendet, welches ein synthetisches Gen enthält, das ein Leaderpeptid mit einer Stelle zum Spalten mit milder Säure kodiert, und in das das synthetische BABS-Gen gespleißt worden war. Außerdem können dem Plasmid synthetische DNA-Sequenzen einverleibt werden, die ein Signalpeptid zur Sekretion des erzeugten Zielproteins in das Periplasma der Wirtszelle kodieren.
Nach der Gewinnung des Genprodukts und gegebenenfalls nach seiner Freisetzung aus einem Fusionspeptid wird seine Aktivität als Antikörperbindungsstelle und seine Spezifität für das glp-4(Lysozym)-Epitop mit eingeführten immunologischen Techniken wie beispielsweise der Affinitätschromatographie und dem Radioimmunoassay ermittelt. Die korrekte Faltung des Proteins unter Erhalt der richtigen dreidimensionalen Konformation der Antikörperbindungsstelle ist Voraussetzung für dessen Aktivität. Dazu kommt es in einem Wirt wie einer Myelomzelle, die Immunglobulin- Proteine natürlich exprimiert, spontan. Alternativ bildet das Protein bei der Expression durch Bakterien Einschlußkörper, die nach der Gewinnung einer speziellen Abfolge von Lösungsmittelbedingungen ausgesetzt werden müssen (z .B. 20fache Verdünnung aus 8M Harnstoff, 0,1 M Tris-HCl, pH 9 in 0,15 M NaCl, 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4 (Hochman et al. (1976), Biochem. 15:2706-2710)), damit es seine korrekte Konformation und somit seine aktive Form annehmen kann.
Die Figuren 4E und 4F zeigen die DNA- und Aminosäuresequenz chimärer VH und VL, die menschliche FRs von NEWM und Maus- CDRs von glp-4 aufweisen. Die CDRs sind wie die Restriktionsstellen der Wahl für den weiteren CDR-Austausch oder zur empirisch bestimmten Verbesserung unterstrichen.
Diese Konstrukte stellen auch Strukturhauptgene dar, die im vorliegenden Fall aus menschlichen Struktursequenzen konstruiert sind. Sie können zur Konstruktion von BABS jeder gewünschten Spezifität durch geeigneten CDR-Austausch verwendet werden.
Unter Anwendung der hier offenbarten Verfahren wurden auch Bindungsstellen mit anderen Spezifitäten konstruiert. Beispiele dafür sind solche mit FRs vom menschlichen NEWM- Antikörper und CDRs von Maus-26-10 (Figur 9A), Maus-26-10- FRs und G-Schleife-CDRs (Figur 9B), FRs und CDRs von Maus- MOPC-315 (Figur 9C), FRs und CDRs vom monoklonalen Antikörper gegen das menschliche carcinoembryonale Antigen (Figur 9D) und FRs und CDRs 1, 2 und 3 der VL und FRs und CDR 1 und 3 der VH des Anti-CEA-Antikörpers, mit CDR 2 von einem Immunglobulin-Konsensgen (Figur 9E).

II. Modellbindungsstelle

Die Digoxin-Bindungsstelle des monoklonalen 26-10-IgG2a,k- Antikörpers wurde von Mudgett-Hunter und Kollegen (nicht veröffentlicht) untersucht. Die 26-10-V-Region-Sequenzen wurden sowohl durch Aminosäuresequenzierung als auch durch DNA-Sequenzierung der mRNA-Transkripte der 26-10-H- und -L- Kette (D. Panka, J.N. & M.N.M., unveröffentlichte Daten) bestimmt. Der 26-10-Antikörper zeigt eine hohe Digoxin- Bindungsaffinität [Ko = 5,4 x 10&sup9; M&supmin;¹] und ein gut definiertes Spezifitätsprofil, wodurch sich eine Grundlage zum Vergleich mit den biosynthetischen Bindungsstellen, die seine Struktur nachahmen, ergibt.

Proteinkonstruktion:

Die kristallographisch ermittelten Atomkoordinaten für die Fab-Fragmente von 26-10 wurden von der Brookhaven-Datenbank erhalten. Die Untersuchung der verfügbaren dreidimensionalen Strukturen von Fv-Regionen in ihren Eltern-Fab- Fragmenten zeigte, daß der euklidische Abstand zwischen dem C-Terminus der VH-Domäne und dem N-Terminus der VL-Domäne etwa 35 Å beträgt. Unter der Berücksichtigung, daß die Länge der Peptideinheit ungefähr 3,8 Å beträgt, wurde ein Linker mit 15 Resten ausgewählt, um diese Lücke zu überbrücken. Der Linker wurde so konstruiert, daß er nur eine geringe Tendenz zur Ausbildung einer Sekundärstruktur zeigt und die Faltung der Domäne nicht stört. Daher wurde die Sequenz (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)&sub3; mit 15 Resten ausgewählt, um den VH-Carboxyterminus und den VL-Aminoterminus zu verbinden.
Bindungsstudien mit einkettigen Bindungsstellen mit weniger oder mehr als 15 Resten demonstrieren die Bedeutung des erforderlichen Abstands, durch den VH von VL getrennt sein muß; beispielsweise führt ein (Gly&sub4;-Ser)&sub1;-Linker nicht zu Bindungsaktivität, und mit den (Gly&sub4;-Ser)&sub5;-Linkern ergibt sich im Vergleich mit der von (Gly&sub4;-Ser)&sub3;-Linkern eine sehr niedrige Aktivität.

Gensynthese:

Die Konstruktion der 744-Basen-Sequenz für das synthetische Bindungsstellen-Gen ergab sich aus der Fv-Proteinsequenz von 26-10 durch Auswahl von Codons, die in E. coli häufig verwendet werden. Das Modell dieses repräsentativen synthetischen Gens ist in der oben diskutierten Figur 8 gezeigt. Die synthetischen Gene, welche den trp-Promotor- Operator, das modifizierte trp-LE-Leaderpeptid (MLE), dessen Sequenz in Figur 10A gezeigt ist, und die VH kodieren, wurden größtenteils wie oben beschrieben hergestellt. Das die VH kodierende Gen wurde aus 46 chemisch synthetisierten Oligonukleotiden zusammengesetzt, die alle 15 Basen lang waren, die terminalen Fragmente (13 bis 19 Basen), welche die kohäsiven Enden zum Klonieren enthielten, ausgenommen. Zwischen 8 und 15 überlappende Oligonukleotide wurden enzymatisch in doppelsträngige DNA ligasiert, an zum Klonieren geeigneten Restriktionsstellen geschnitten (NarI, Xbal, SalI, SacII, SacI), durch PAGE auf 8 %igen Gelen gereinigt und in pUC kloniert, der durch entsprechende Modifizierung zusätzliche Klonierstellen im Polylinker enthielt. Die klonierten Abschnitte wurden schrittweise durch Ligasierung in den pUC-Kloniervektor zu dem die VH nachahmenden kompletten Gen zusammengesetzt.
Das die 26-10-VL nachahmende Gen wurde aus 12 langen synthetischen Polynukleotiden mit einem Größenbereich von 33 bis 88 Basenpaaren, die in automatisierten DNA-Snythesizern (Modell 6500, Biosearch, San Rafael, CA; Modell 380A, Applied Biosystems, Foster City, CA), hergestellt worden waren, zusammengesetzt. Aus Paaren von langen synthetischen Oligonukleotiden, die Restriktionsstellen mit sechs Basen in dem Gen (AatII, BstEII, PpnI, HindIII, BglIII und PstI) umfaßten, wurden fünf individuelle doppelsträngige Abschnitte hergestellt. In einem Fall wurden vier lange überlappende Stränge kombiniert und kloniert. Genfragmente, die durch Restriktionsstellen zum Zusammensetzen verbunden waren, die in dem pUC-Polylinker nicht vorhanden waren, beispielsweise AatII und BstEII, wurden durch EcoRI- und BamHI-Enden flankiert, um die Klonierung zu erleichtern.
Der Linker zwischen der VH und der VL, welcher (Gly-Gly- Gly-Gly-Ser)&sub3; kodiert, wurde mit zwei langen synthetischen Oligonukleotiden, 54 und 62 Basen lang, welche die SacI- und AatII-Stellen umfaßten, wobei sich bei letzterer ein EcoRI-Klonierende anschloß, kloniert. Das vollständige einkettige Bindungsstellen-Gen wurde aus den VH-, VL- und Linkergenen unter Erhalt eines entsprechenden Aspartyl- Prolyl-VH-< Linker> -VL-Konstrukts, das von EcoRI- und PstI- Restriktionsstellen flankiert war, zusammengesetzt.
Der trp-Promotor-Operator wurde von seiner SspI-Stelle ausgehend aus 12 sich überlappenden Oligomeren mit 15 Basen zusammengesetzt und das MLE-Leadergen wurde aus 24 sich überlappenden Oligomeren mit 15 Basen zusammengesetzt. Dies wurde in pUC kloniert und zusammengesetzt wobei die Strategie der durch Klonierstellen flankierten Zusammenbaustellen angewendet wurde. Das endgültige Expressionsplasmid wurde durch eine dreiteilige Ligasierung unter Verwendung der Stellen SspI, EcoRI und PstI (vgl. Figur 10B) in den Vektor pBR322 konstruiert. Die intermediären DNA-Fragmente und zusammengesetzten Gene wurden nach dem Didesoxy-Verfahren sequenziert.

Expression des Fusionsproteins:

Das einkettige Protein wurde in Form eines Fusionsproteins exprimiert. Das MLE-Leadergen (Figur 10A) stammte von der E.-coli-trp-LE-Sequenz und wurde unter der Kontrolle eines synthetischen trp-Promotors und -Operators exprimiert. Der E.-coli-Stamm JM83 wurde mit dem Expressionsplasmid transformiert, und die Proteinexpression wurde in M9-Minimalmedium bei einer Zelldichte von A&sub6;&sub0;&sub0; = 1 durch Zugabe von Indolacrylsäure (10 µg/ml) induziert. Die Überexpression des Fusionsproteins führte zu seiner Ansammlung in Form von unlöslichen Proteingranula, die aus der Zellpaste gewonnen wurden (Figur 11, Bahn 1).

Spaltung des Fusionsproteins:

Der MLE-Leader wurde durch Säurespaltung der Asp-Pro- Peptidbindung, die an der Verbindungsstelle zwischen den MLE- und Bindungsstellen-Sequenzen eingebaut worden war, von dem Bindungsstellen-Protein entfernt. Die das Fusionsprotein enthaltenden gewaschenen Proteingranula wurden in 6 M Guanidin-HCl + 10 % Essigsäure, pH 2,5 durch 96stündige Inkubation bei 37ºC gespalten. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines 10fachen Überschusses Ethanol mit Inkubation bei -20ºC über Nacht durch Ausfällen beendet, woraufhin zentrifugiert und bis zur weiteren Reinigung (Figur 1, Bahn 2) bei -20ºC gelagert wurde.

Proteinreinigung:

Die durch Säure abgespaltene Bindungsstelle wurde durch Chromatographie an DEAE -Cellulose von den übrigen intakten Fusionsprotein-Spezies abgetrennt. Der aus dem Spaltgemisch erhaltene Niederschlag wurde in 6 M Guanidin- HCl + 0,2 M Tris-HCl, pH 8,2 + 0,1 M 2-Mercaptoethanol gelöst und erschöpfend gegen 6 M Harnstoff + 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,5 + 1 mM EDTA dialysiert. Dann wurde 2-Mercaptoethanol auf eine Endkonzentration von 0,1 M zugegeben, und dann wurde die Lösung 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und auf eine 2,5 x 45 cm Säule mit DEAE-Cellulose (Whatman DE 52), die mit 6 M Harnstoff + 2,5 mM Tris-HCl + 1 mM EDTA, pH 7,5 äquilibriert worden war, aufgegeben. Das intakte Fusionsprotein wurde schwach an die DE52-Säule gebunden, so daß seine Elution im Verhältnis zum Bindungsprotein verzögert wurde. Die ersten Proteinfraktionen, die von der Säule nach der Aufgabe und Waschen mit Harnstoffpuffer eluiert wurden, enthielten das BABS-Protein ohne intaktes Fusionsprotein. Spätere Fraktionen, die mit etwas Fusionsprotein kontaminiert waren, wurden gesammelt und an DE 52 nochmals chromatographiert, und das gewonnene einkettige Bindungsprotein wurde mit anderem gereinigtem Protein zu einem einzigen Pool vereinigt (Figur 11, Bahn 3).

Rückfaltung:

Die Nachahmung der 26-10-Bindungsstelle wurde folgendermaßen rückgefaltet: Der DE-52-Pool, der sich in 6 M Harnstoff + 2,5 mM Tris-HCl + 1 mM EDTA befand, wurde auf pH 8 eingestellt und mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol bei 37ºC 90 min reduziert. Dies wurde mindestens 100fach mit 0,01 M Natriumacetat, pH 5,5 auf eine Konzentration unterhalb 10 µg/ml verdünnt und bei 4ºC 2 Tage gegen Acetatpuffer dialysiert.

Affinitätschromatographie:

Die Reinigung des aktiven Bindungsproteins durch Affinitätschromatographie wurde bei 4ºC auf einer Ouabain-Amin- Sepharose -Säule durchgeführt. Die verdünnte Lösung des rückgefalteten Proteins wurde direkt auf zwei in Reihe geschaltete Säulen aufgegeben, die jeweils 3 ml Harz enthielten, das mit 0,01 M Acetatpuffer, pH 5,5, äquilibriert worden war. Die Säulen wurden einzeln mit einem überschuß des Acetatpuffers gewaschen und dann durch aufeinanderfolgende Zugaben von jeweils 5 ml in dem Acetatpuffer gelösten 1 M NaCl, 20 mM Ouabain und 3 M Kaliumthiocyanat, wobei dazwischen mit Acetatpuffer gewaschen wurde. Da in dem Eluat immer noch digoxinbindende Aktivität vorhanden war, wurde das Eluat gesammelt und durch Ultrafiltration (PM-10-Membran, 200 ml Konzentrator, Amicon) 20-fach konzentriert, wieder auf die Affinitätssäulen aufgebracht und wie beschrieben eluiert. Fraktionen mit signifikanter Absorption bei 280 nm wurden gesammelt und gegen PBSA oder den obigen Acetatpuffer dialysiert. Die Proteinmenge in den DE-52- und Ouabain-Sepharose -Pools wurde nach der Dialyse gegen 0,01 M Acetatpuffer durch Aminosäureanalyse quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Geschätzte Ausbeuten an BABS-Protein während der Reinigung Schritt Naßgew. pro Liter mg Protein Spaltausbeute (%) vor dem Schritt Ausbeute im Verhältnis zum Fusionsprotein Zellpaste Fusionsproteingranula Säurespaltung/DE 52-Pool Ouabain-SepharosePool a Durch Proteinanalyse nach Lowry bestimmt. b Durch Absorptionsmessungen bestimmt. c Durch Aminosäureanalyse bestimmt. d Aus der Menge BABS-Protein berechnet, die im Verhältnis zu der auf das Harz aufgebrachten spezifisch von Ouabain-Sepharose eluiert wurde; die Werte wurden durch Aminosäureanalyse ermittelt. e Prozentuale Ausbeute auf die Molmenge bezogen berechnet.

Sequenzanalyse des Gens und des Proteins:

Das vollständige Gen wurde in beiden Richtungen unter Anwendung des Didesoxy-Verfahrens von Sanger sequenziert, wodurch die richtige Zusammensetzung des Gens bestätigt wurde. Die Proteinsequenz wurde durch Proteinsequenzierung ebenfalls bestätigt. Am intakten Protein (Reste 1 - 40) sowie an zwei CNBr-Hauptfragmenten (Reste 108-129 und 140 - 159) wurde ein automatisierter Edman-Abbau vorgenommen, und zwar mit einem Gasphasensequenzierer Modell 470A, der mit einem On-Line-Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Analysator Modell 120A (Applied Biosystems, Foster City, CA) ausgerüstet war. Das homogene Bindungsprotein, das durch SDS- PAGE fraktioniert und mit Wasser aus den Gelstreifen eluiert worden war, wurde mit einem 20000-fachen überschuß CNBr in 1 %igem Trifluoressigsäure-Acetonitril (1:1) 12 h bei 25ºC (in der Dunkelheit) behandelt. Die sich ergebenden Fragmente wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Immobilonmembran (Millipore, Bedford, MA) übertragen, aus der gefärbte Banden ausgeschnitten und sequenziert wurden.

Bestimmung der Spezifität:

Die Spezifitäten des Anti-Digoxin-26-10-Fab und der BABS wurden mit einem Radioimmunoassay beurteilt. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Maus-Fab-Fragment (ICN- ImmunoBiologicals, Lisle, IL), 10 µg/ml in PBSA, über Nacht bei 4ºC beschichtet. Nachdem die Platten gewaschen und mit 1 %igem Pferdeserum in PBSA blockiert worden waren, wurden Lösungen (50 µl) , die 26-10-Fab oder die BABS in entweder PBSA oder 0,01 M Natriumacetat bei pH 5,5 enthielten, in die Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur 2 - 3 h inkubiert. Nachdem die ungebundenen Antikörperfragrnente aus den Vertiefungen ausgewaschen worden waren, wurden 25 µl einer Konzentrationsreihe Herzglycoside (10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;¹¹ M in PBSA) zugegeben. Die untersuchten Herzglycoside umfaßten Digoxin, Digitoxin, Digoxigenin, Digitoxigenin, Gitoxin, Ouabain und Acetyl-Strophanthidin. Nach der Zugabe von ¹²&sup5;J-Digoxin (25 µl, 50000 cpm, Cambridge Diagnostics, Billerica, MA) in jede Vertiefung, wurden die Platten über Nacht bei 4ºC inkubiert, gewaschen und ausgezählt. Die Inhibitionskurven sind in Figur 12 graphisch dargestellt. Die relativen Affinitäten für jedes Digoxin-Analogon wurden berechnet, indem die Konzentration jedes Analogons bei 50 %iger Inhibition durch die Konzentration von Digoxin (oder Digoxigenin), die 50 %ige Inhibition ergab, dividiert wurde. Für die BABS ergab sich eine Verschiebung der Inhibitonskurven zu niedrigeren Glycosidkonzentrationen als die für das 26-10-Fab beobachteten, weil an die Platte eine BABS gebunden wurde, die weniger aktiv war als das 26-10- Fab. Wenn zu der BABS in 0,01 M Natriumacetat, pH 5,5 0,25 M Harnstoff gegeben wurde, wurde ein aktiveres sFv an die Ziegen-Anti-Maus-Fab-Beschichtung auf der Platte gebunden. Dadurch wurden die BABS-Inhibitonskurven zu höheren Glycosidkonzentrationen verschoben, und zwar näher ur Lage der für das 26-10-Fab hin, obwohl die relativen Lagen der Kurven für das sFv, die in Acetatpuffer alleine erhalten wurden, beibehalten wurden. Die Ergebnisse, ausgedrückt als normierte Konzentration des Inhibitors, die eine 50 %ige Inhibition der ¹²&sup5;J-Digoxin-Bindung ergibt, sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 26-10-Antikörperspezies Glycosid zur Normierung Fab Digoxin Digoxigenin D - Digoxin DG = Digoxigenin DO = Digitoxin DOG = Digitoxigenin A-S = Acetyl-Strophanthidin G - Gitoxin O = Ouabain

Affinitätsbestimmung:

Die Assoziierungskonstanten wurden durch Gleichgewichtsbindungsstudien ermittelt. In Immunpräzipitationsversuchen wurden 100 µl ³H-Digoxin (New England Nuclear, Billerica, MA) in einer Konzentrationsreihe (10&supmin;&sup7; M bis 10&supmin;¹¹ M) zu 100 µl des 26-10-Fab oder der BABS einer festen Konzentration gegeben. Nach 2 - 3 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Protein durch die Zugabe von 100 µl Ziegen-Antiserum gegen das Maus-Fab-Fragment (ICN ImmunoBiologicals), 50 µl der IgG-Fraktion von Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (ICN ImmunoBiologicals) und 50 µl einer 10 %igen Protein-A- Sepharose -Suspension (Sigma) ausgefällt. Nach 2 h bei 4ºC wurden gebundenes und freies Antigen durch Saugfiltration über Glasfaserfilter (Vacuum Filtration Manifold, Millipore, Bedford, MA) voneinander getrennt. Die Filterscheiben wurden dann in 5 ml Scintillationsflüssigkeit mit einem Tri-Carb-Flüssigkeits-Scintillations-Analysator Modell 1500 (Packard, Sterling, VA) ausgezählt. Die Assoziationskonstanten, Ko, wurden aus Scatchard-Analysen der untransformierten Radioliganden-Bindungsdaten unter Anwendung von LIGAND, einem auf der Massenwirkung basierenden Programm zur nichtlinearen Kurvenanpassung, berechnet. Die Ko-Werte wurden auch aus Sips-Diagrammen und Bindungsisothermen berechnet, die in Figur 13A für die BABS und in Figur 13B für das Fab angegeben sind. Für die Bindungsisothermen werden die Daten in Form der Konzentration des gebundenen Digoxins gegen den Logarithmus der Konzentration des ungebundenen Digoxins graphisch dargestellt, und die Dissoziationskonstante wird aus der Ligandenkonzentration bei 50 %iger Sättigung ermittelt. Diese Bindungsdaten werden auch in linearer Form als Sips-Diagramme (Nebenabbildung), welche die gleiche Abszisse wie die Bindungsisotherme haben, bei denen die Ordinate aber den im folgenden definierten log r/(n-r) darstellt, graphisch dargestellt. Die mittlere intrinsische Assoziationskonstante (Ko) wurde mit der modifizierten Sips-Gleichung (39) berechnet: log (r/n-r) = a log C - a log Ko, wobei r der Molzahl gebundenen Digoxins pro Mol Antikörper bei einer C entsprechenden Konzentration ungebundenen Digoxins entspricht, n die Anzahl Mole gebundenen Digoxins bei Sättigung der Antikörperbindungsstelle ist, und a ein Heterogenitätsfaktor ist, der die Verteilung der Assoziationskonstanten um die mittlere intrinsische Assoziationskonstante Ko beschreibt. Die lineare Regressionsanalyse der Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate ergab für die erhaltenen Geraden Korrelationskoeffizienten von 0,96 für die BABS und von 0,99 für das 26-10-Fab. Eine Zusammenfassung der berechneten Assoziationskonstanten ist in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle 3 Assoziationskonstante Ko Methode der Datenanalyse Scatchard-Diagramm Sips-Diagramm Bindungsisotherme

III. Synthese eines multifunktionellen Proteins

Eine die oben beschriebene einkettige Bindungsstelle kodierende Nukleinsäuresequenz wurde mit einer Sequenz fusioniert, die das FB-Fragment von Protein A, das die Funktion einer zweiten aktiven Region hat, als Leader kodiert. Als Spacer wurden die nativen Aminosäuren, welche die letzten 11 Aminosäuren des FB-Fragments darstellen, an die Asp-Pro-Spaltstelle für verdünnte Säure gebunden, verwendet. Die FB-Bindungsdomäne von FB besteht aus den unmittelbar vorangehenden 43 Aminosäuren, die eine helikale Konfiguration nehmen (vgl. Fig. 2B).
Die Genfragmente wurden unter Verwendung eines oben beschriebenen DNA-Synthesizers Biosearch Modell 8600 synthetisiert. Die synthetischen Oligonukleotide wurden gemäß dem oben beschriebenen, eingeführten Protokoll unter Verwendung des in E. coli transfizierten Vektors pUC8 kloniert. Das in Figur 6A angegebene vervollständigte Fusionsgen wird dann in E. coli exprimiert.
Nach der Beschallung wurden die Einschlußkörper durch Zentrifugation gesammelt und in 6 M Guanidin-Hydrochlorid (GuHCl), 0,2 M Tris und 0,1 M 2-Mercaptoethanol (BME), pH 8,2 gelöst. Das Protein wurde denaturiert und über Nacht bei Raumtemperatur in dem Lösungsmittel reduziert. Zur Reinigung des Fusionsproteins von den Einschlußkörpern wurde die Größenausschlußchromatographie angewendet. Eine Sepharose-4B-Säule (1,5 x 80 cm) wurde mit einem Elutionsmittel aus 6 M GuHCl und 0,01 M NaOAc, pH 4,75 betrieben. Die Proteinlösung wurde bei Raumtemperatur in einer Menge von 0,5 - 1,0 ml auf die Säule aufgebracht. Es wurden Fraktionen gesammelt und mit kaltem Ethanol ausgefällt. Diese wurden dann auf SDS-Gelen laufen gelassen, und Fraktionen, die an dem rekombinierten Protein (etwa 34000 D) reich waren, wurden gesammelt. Dies ist ein einfacher erster Schritt zur Reinigung von Einschlußkörperpräparationen, ohne daß es zu einem signifikanten proteolytischen Abbau kommt.
Zur Rückfaltung wurde das Protein gegen 100 ml der gleichen GuHCI-Tris-BME-Lösung dialysiert, und das Dialysat wurde während zwei Tagen 11-fach auf 0,55 M GuHCl, 0,01 M Tris und 0,01 M BME verdünnt. Dann wurden die Dialysebeutel in 0,01 M NaCl überführt, und das Protein wurde erschöpfend dialysiert, bevor die Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem Digoxin durch RIAs bestimmt wurde. Der Rückfaltungsvorgang kann vereinfacht werden, indem zur Verringerung der GuHCl- Konzentration auf 1,1 M rasch mit Wasser verdünnt wird und dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7, 0,03 % NaN&sub3; enthaltend) dialysiert wird, so daß innerhalb von 12 h kein GuHCl mehr vorhanden ist. Die Produkte beider Präparationsverfahren zeigten Bindungsaktivität, nämlich wie in Figur 7A angegeben.

Demonstration der Bifunktionalität:

Dieses Protein mit einem FB-Leader und einer fusionierten BABS ist bifunktionell, denn die BABS kann das Antigen binden, und das FB kann die Fc-Regionen von Immunglobulinen binden. Um diese doppelte und gleichzeitige Aktivität zu demonstrieren, wurden mehrere Radioimmunoassays durchgeführt.
Die Eigenschaften der Bindungsstelle wurden mit einer modifizierten Variante des von Mudgett-Hunter et al. (J. Immunol. (1982) 129:1165-1172, Molec. Immunol. (1985) 22:477-488) entwickelten Assays, so daß dieses mit Mikrotiterplatten in Form eines Festphasen-Sandwich-Assays durchgeführt werden konnte, untersucht. Die Bindungsdaten wurden unter Verwendung von Ziegen-Anti-Maus-Fab-Antiseren (gAmFab) als dem primären Antikörper, mit dem die Vertiefungen der Platte am Anfang beschichtet waren, gesammelt. Hierbei handelt es sich um polyklonale Antiseren, die Epitope erkennen, welche sich meistens an Strukturregionen befinden. Als nächstes wurden die betreffenden Proben in die beschichteten Vertiefungen gegeben und mit dem gAmFab, das Spezies bindet, die geeignete antigene Stellen aufweisen, inkubiert. Nach dem Wegwaschen von ungebundenem Protein wurden die Vertiefungen der Einwirkung von ¹²&sup5;J- markierten (radiojodierten) Digoxin-Konjugaten, nämlich entweder ¹²&sup5;J-Dig-BSA oder ¹²&sup5;J-Dig-Lysin, ausgesetzt.
Diese Daten sind in Figur 7A graphisch dargestellt, welche die Ergebnisse eines Verdünnungskurvenexperiments zeigt, bei dem der 26-10-Elternantikörper als Kontrolle vorgesehen war. Die Stellen wurden mit ¹²&sup5;J-Dig-BSA wie oben beschrieben mit einer aus Anfangsstammlösungen hergestellten Verdünnungsreihe, die sowohl langsam rückgefaltete (1) als auch schnell verdünnte/rasch rückgefaltete (2) einkettige Proteine enthielt, untersucht. Die Parallelität aller drei Verdünnungskurven zeigt, daß die gAmFab-Bindungsregionen des BABS-Moleküls denen der Fvs authentischer 26-10-Antikörper praktisch gleicht, d.h., die Oberflächenepitope scheinen für beide Proteine gleich zu sein.
Die Empfindlichkeit dieser Assays ist derart, daß die Bindungsaffinität der Fv für Digoxin mindestens 10&sup6; betragen muß. Experimentelle Daten über die Digoxin-Bindung ergaben Bindungskonstanten im Bereich von 10&sup8; bis 10&sup9; M&supmin;¹. Der 26-10-Elternantikörper hat eine Affinität von 5,4 x 10&sup9; M&supmin;¹. Die Inhibitionsassays zeigen auch die Bindung von ¹²&sup5;J-Dig-Lysin, und diese kann auf zum 26-10-Eltern-Fab weitgehend parallele Weise durch unmarkiertes Digoxin, Digoxigenin, Digitoxin, Digitoxigenin, Gitoxin, Acetyl, Strophanthidin und Ouabain inhibiert werden. Dies zeigt daß die Spezifität des biosynthetischen Proteins mit der des monoklonalen Original-Antikörpers praktisch identisch ist.
Bei einem zweiten Assay-Typ wird Digoxin-BSA zur Beschichtung von Mikrotiterplatten verwendet. Die renaturierte BABS (FB-BABS) wird auf die beschichteten Platten gegeben, so daß nur Moleküle mit einer kompetenten Bindungsstelle an der Platte haften können. Dann wird ¹²&sup5;J-markiertes Kaninchen-IgG (Radioligand) mit der gebundenen FB-BABS auf den Platten gemischt. Die gebundene Radioaktivität reflektiert die Wechselwirkung des IgG mit der FB-Domäne der BABS, und die Spezifität dieser Bindung wird durch ihre Inhibition durch ansteigende Mengen FB, Protein A, Kaninchen-IgG, IgG2a und IgG1 demonstriert, nämlich wie in Figur 7B gezeigt.
Die folgenden Spezies wurden untersucht, um authentische Bindung zu demonstrieren: Unmarkierter monoklonaler Kaninchen-IgG- und -IgG2a-Antikörper (der kompetitiv an die FB-Domäne der BABS bindet) und Protein A und FB (die kompetitiv an den Radioliganden binden). Wie in Figur 7B gezeigt, inhibieren diese Spezies erwartungsgemäß die Radioligandenbindung vollständig. Ein monoklonaler Antikörper der IgG1-Unterklasse bindet erwartungsgemäß schlecht an das FB und inhibiert lediglich etwa 34 % der Radioligandenbindung. Diese Daten zeigen, daß die BABS-Domäne und die FB-Domäne eine voneinander unabhängige Aktivität aufweisen.

IV. Andere Konstruktionen

In den Abbildungen sind andere BABS-haltige Proteine angegeben, die wie oben beschrieben erfindungsgemäß konstruiert wurden und in E. coli und anderen Wirtszellen exprimierbar sind. Diese Proteine können bifunktionell oder multifunktionell sein. Jedes Konstrukt enthält eine einkettige BABS, die über eine Spacersequenz an ein Effektormolekül gebunden ist, das Aminosäuren aufweist, die ein biologisch aktives Effektorprotein wie ein Enzym, einen Rezeptor, ein Toxin oder einen Wachstumsfaktor definieren. Einige Beispiele für derartige, in den Abbildungen angegebene Konstruktionen sind Proteine wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) (Figur 15A), das Streptavidin (Figur 15B), der Tumornekrosefaktor (TNF) (Figur 15C), das Calmodulin (Figur 15D), die Beta-Kette des Blutplättchenwachstumsfaktors (B-PDGF) (15E), Ricin A (15F), Interleukin 2 (15G) und das FB-Dimer (15H). Diese werden jeweils als Trailer verwendet und an eine vorgewählte BABS über einen Spacer (Gly-Ser-Gly) gebunden, der durch eine DNA kodiert wird, die eine BamHI-Restriktionsstelle definiert. An den Spacer können zur empirischen Verbesserung des Konstrukts zusätzliche Aminosäuren angefügt werden, und zwar erforderlichenfalls durch Öffnung der BamHI-Stelle und Insertion eines Oligonukleotids gewünschter Länge mit klebrigen BamHI-Enden. Jedes Gen endet außerdem mit einer PstI-Stelle, um die Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor zu erleichtern.
Die BABS der EGF- und PDGF-Konstrukte kann beispielsweise für Fibrin spezifisch sein, so daß der EGF oder der PDGF zu einer Wunde befördert wird. Die BABS für den TNF oder Ricin A kann für ein Tumorantigen, z.B. CEA, spezifisch sein, um ein zur Krebstherapie nützliches Konstrukt herzustellen. Die Calmodulin-Konstruktion bindet radioaktive Ionen und andere Metallionen. Ihre BABS kann beispielsweise für Fibrin oder ein Tumorantigen spezifisch sein, so daß sie als Scintigraphiemittel zur Lokalisierung eines Thrombus oder Tumors verwendet werden kann. Die Streptavadin-Konstruktion bindet Biotin mit sehr hoher Affinität. Das Biotin kann mit einem durch Fernmessung nachweisbaren Ion für Scintigraphiezwecke markiert sein. Alternativ kann das Biotin an einer Affinitätsmatrix oder einem festen Träger immobilisiert sein. Das BABS-Streptavidinprotein könnte dann zur Affinitätschromatographie oder für einen Festphasenimmunoassay an die Matrix oder den Träger gebunden werden. Das Interleukin-2-Konstrukt könnte beispielsweise an eine BABS gebunden werden, die für ein Oberflächenantigen einer T-Zelle spezifisch ist. Das FB-FB-Dimer bindet an Fc und könnte mit einer BABS durch immobilisiertes Immunglobulin an eine feste Phase gebunden in einem Immunoassay oder Affinitätsreinigungsverfahren verwendet werden.
Figur 14 gibt ein Beispiel für ein multifunktionelles Protein mit einem Effektorabschnitt als Leader. Es weist ein FB-FB-Dimer auf, das über seinen C-Terminus durch ein Asp-Pro-Dipeptid an eine BABS nach Wahl gebunden ist. Es funktioniert auf sehr ähnliche Weise wie die Konstruktion von Fig. 15H. Das Dimer bindet begierig an den Fc-Teil eines Immunglobulins. Dieser Konstruktionstyp kann daher ebenfalls zur Affinitätschromatographie, in einem Festphasenimmunoassay und für therapeutische Zwecke verwendet werden, wenn die Kupplung von Immunglobulinen an ein anderes Epitop gewünscht ist.
Aufgrund der obigen Ausführungen sollte klar sein, daß die Erfindung hinsichtlich der speziellen BABS- und der zu bindenden Effektorproteintypen nicht beschränkt ist. Daher fallen auch andere Ausführungsformen unter die folgenden Ansprüche.

Claims

1. Einzelkettiges multifunktionelles biosynthetisches Protein, das durch ein durch rekombinante DNA-Techniken erhaltenes Einzeigen exprimiert wird, wobei das Protein aufweist:

eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle, die an eine vorgewählte antigene Determinante binden kann und eine Aminosäuresequenz aufweist, die homolog zu der Sequenz einer variablen Region eines Immunglobulinmoleküls ist, das die vorgewählte antigene Determinante binden kann,

eine erste biofunktionelle Domäne, die ein Polypeptid aufweist, das unter Effektorproteinen mit einer für biologische Aktivität in Säugern geeigneten Konformation, Aminosäuresequenzen, die ein Ion maskieren können, und Aminosäuresequenzen, die selektiv an einen festen Träger binden können, ausgewählt ist und

einen ersten Polypeptidlinker, der zwischen der Bindungsstelle und der ersten biofunktionellen Domäne angeordnet ist, wobei der Polypeptidlinker mehrere hydrophile, peptidgebundene Aminosäuren aufweist und ein Polypeptid definiert, welches das C- terminale Ende der Bindungsstelle und das N-terminale Ende der ersten biofunktionellen Domäne oder das N-terminale Ende der Bindungsstelle und das C-terminale Ende der ersten biofunktionellen Domäne verbindet, wodurch das Bindungsprotein eine zum Binden geeignete Konformation annimint und die erste biofunktionelle Domäne eine für die biologische Aktivität, Maskierung eines Ions oder selektive Bindung eines festen Trägers geeignete Konformation annimint.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei die Bindungsstelle mindestens zwei Bindungsdomänen aufweist, die durch einen zweiten Polypeptidlinker peptidgebunden sind, der zwischen den Domänen angeordnet ist, wobei der zweite Polypeptidlinker mehrere hydrophile peptidgebundene Aminosäuren aufweist und ein Polypeptid mit einer ausreichenden Länge zur Überbrückung des Abstandes zwischen dem C-terminalen Ende einer der Bindungsdomänen und dem N-terminalen Ende der anderen der Bindungsdomänen definiert, wenn das Bindungsprotein eine zur Bindung geeignete Konformation einnimmt, wenn es in wäßrige Lösung gebracht wird.

3. Protein nach Anspruch 2, wobei die Aminosäuresequenz jeder der Bindungsdomänen einen Satz von CDRs aufweist, die zwischen einem Satz von FRs angeordnet sind, welche jeweils entsprechend homolog zu CDRs und FRs einer variablen Region eines Immunglobulinmoleküls sind, das die vorgewählte antigene Determinante binden kann.

4. Protein nach Anspruch 2, wobei mindestens eine der Bindungsdomänen einen Satz von CDRs, die zu den CDRs eines ersten Immunglobulins homolog sind, und einen Satz von FRs, die zu den FRs eines zweiten, verschiedenen Immunglobulins homolog sind, aufweist.

5. Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Effektorprotein um ein Enzym, ein Toxin, einen Rezeptor, eine Bindungsstelle, eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle, einen Wachstumsfaktor, einen Zelldifferenzierungsfaktor, ein Lymphokin, ein Cytokin, ein Hormon, einen indirekt nachweisbaren Rest oder einen Antimetaboliten handelt.

6. Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der ein Ion maskierenden Sequenz um Calmodulin, Methallothionein, ein Fragment davon oder um eine Aminosäuresequenz, die zumindest reich an einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin und Arginin ist, handelt.

7. Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der selektiv an einen festen Träger bindenden Polypeptidsequenz um eine positiv oder negativ geladene Aminosäuresequenz, eine cysteinhaltige Aminosäuresequenz, Streptavidin oder ein Fragment von Protein A aus Staphylococcus handelt.

8. Protein nach Anspruch 2, das eine Vielzahl von biosynthetischen Antikörperbindungsstellen aufweist, wobei jede Bindungsstelle zwei der durch einen Polypeptidlinker verbunden Bindungsdomänen aufweist.

9. DNA, die das Protein nach Anspruch 1 codiert.

10. Wirtzelle, welche die DNA nach Anspruch 9 enthält und exprimieren kann.

11. Polypeptideinzelkette, die aufweist:

ein Paar Polypeptiddomänen, die zusammen eine Bindungsstelle für ein vorgewähltes Antigen definieren und über einen Polypeptidlinker mit dem C-Terminus der einen an den N-Terminus der anderen gebunden sind, wobei die Aminosäuresequenz jeder der Polypeptiddomänen eine variable Region eines Immunglobulins nachahmt und mindestens eine der Domänen aufweist:

einen Satz CDR-Aminosäuresequenzen, die zusammen eine Erkennungsstelle für das vorgewählte Antigen definieren, wobei es sich bei den CDR-Sequenzen um nichtmenschliche Sequenzen handelt,

einen Satz FR-Aminosäuresequenzen, die an den Satz CDR-Sequenzen gebunden sind, wobei die FR-Aminosäuresequenzen zu aus einein menschlichen Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind,

wobei die gebundenen Sätze CDR- und FR-Aminosäuresequenzen zusammen eine chimäre Bindungsdomäne definieren, die in wäßriger Lösung eine zur immunologischen Bindung mit dem vorgewählten Antigen geeignete Tertiärstruktur annimmt.

12. Polypeptideinzelkette, die aufweist:

ein Paar Polypeptiddomänen, die eine Bindungsstelle für ein vorgewähltes Antigen definieren und durch einen Polypeptidlinker verbunden sind, der den Abstand zwischen dem C-Terminus der einen und dem N-Terminus der anderen überbrückt, wobei die Aminosäuresequenz mindestens einer der Polypeptdiddomänen eine rekombinierte variable Region enthält, die aufweist:

einen Satz CDR-Aminosäuresequenzen, die zusammen eine Erkennungsstelle für das vorgewählte Antigen definieren, wobei die CDR-Sequenzen zu aus einem ersten Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind,

einen Satz FR-Aminosäuresequenzen, die an den Satz CDR-Sequenzen gebunden sind, wobei die FR-Aminosäuresequenzen zu aus einem zweiten Immunglobulin erhaltenenen Sequenzen homolog sind,

wobei die gebundenen Sätze CDR- und FR-Aminosäuresequenzen zusammen ein chimäres Einzelkettenbindungspolypeptid mit variabler Region definieren, das in wäßriger Lösung eine zur immunologischen Bindung mit dem vorgewählten Antigen geeignete Tertiärstruktur annimmt.

13. Polypeptidkette nach Anspruch 12, wobei die FR-Sequenzen zu aus einem menschlichen Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind und die CDR-Sequenzen zu aus einem Mäuse-Immunglobulin erhaltenen Sequenzen homolog sind.

14. Polypeptidkette nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Paar Polypeptiddomänen an eine biologisch aktive Domäne peptidgebunden ist, und zwar über einen zweiten Polypeptidlinker, der zwischen dem Bindungspolypeptid und der biologisch aktiven Domäne angeordnet ist, wobei der zweite Polypeptidlinker mehrere hydrophile peptidgebundene Aminosäuren aufweist, die zusammen in wäßriger Lösung eine unstrukturierte Polypeptidkonfiguration annehmen, und das C-terminale Ende der Bindungsstelle und das N-terminale Ende der biologisch aktiven Domäne oder das N-terminale Ende der Bindungsstelle und das C-terminale Ende der biologisch aktiven Domäne verbindet, wodurch das Bindungspolypeptid eine zur Bindung geeignete Konformation annimmt und die biologisch aktive Domäne eine für die biologische Aktivität, zur Maskierung eines Ions oder zur selektiven Bindung eines festen Trägers geeignete Konformation annimmt.