JPH09503759A

JPH09503759A - 抗体のリターゲッティング

Info

Publication number: JPH09503759A
Application number: JP7509628A
Authority: JP
Inventors: ポールウィンター，グレゴリー; フィリップホリガー，カスパー
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 1997-04-15
Also published as: CA2169620A1; ES2126145T3; ATE173740T1; US6589527B1; DE69414870T2; AU680685B2; DE69414870D1; EP0720624B1; EP0720624A1; AU7621494A; DK0720624T3

Abstract

(57)【要約】抗体を、それが正常な環境のもとでは機能特異性をもたない標的に対してリターゲッティングさせる。標的に対する結合特異性及び抗−抗体結合特異性を有する多価結合性物質を利用する。この結合性物質はイムノグロブリン抗原結合性部位を含んで成ってよく、そして「ダイアボディー」であってよい。結合した抗体に依存して、エフェクター機能、例えば補体、ADCC及び免疫ブロッキングのその標的に対する作用が補強される。in vivo及びin vitro用途、例えば腫瘍細胞の溶解及び赤血球の凝集を例示する。

Description

【発明の詳細な説明】抗体のリターゲッティング本発明は、正常な環境のもとではそれに対する機能特異性を有さない部位又は抗原に対する抗体のリターゲッティング（retargetting：再標的設定）に関する。２つの特異性（一方は標的部位に対する特異性、他方は抗体分子の一部に対して結合できる特異性）を有する抗原特異的結合性物質を採用する方法を述べる。このようにして、抗原標的に対する特異性を有さない抗体は、この抗原特異的結合性物質を介してこの抗原に近づけることができる。この原理は、循環系の中の抗体が、身体内の疾患部位、例えば腫瘍、又はウィルス、細菌もしくは寄生虫感染部位、又はそれらの組合せに対してリターゲッティングするのに好都合である。この原理は自己免疫疾患又は過敏反応により代表される不適切な免疫応答を阻止するのにも適用されうる。リターゲッティングは慣用の二価抗体、例えば化学的もしくはハイブリドバイブドーマより作られたものにより、又は新規の二価抗体フラグメント、ダイアボディー（diabodies）（P．Holligerら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 90 6444-6448，1993及びPCT/GB93/02492）を用いて達成できうる。抗体は脊椎動物の免疫系の特異的な武装において重要な役割を果たすため、Ｂ −リンパ球により作成される。これは莫大な種類の抗原構造に結合するその総合的な能力に由来し、個々の抗体分子はその同系抗原に対して精密に特異的に結合可能である。抗体集団のバルクは血液及び間隙流体の中で豊富であることが見い出されており、マイナーなタイプは腸内腔の如くの粘膜の表層に位置している。外来生物又は腫瘍細胞に対して結合した抗体は、それを、免疫系のうちの抗体がコードするエフェクター機能による崩壊のための目標にする。崩壊は補体カスケードによって、又は抗体依存性細胞媒介式細胞障害（ADCC）のいづれかによって及ぼされうる。ADCCは、例えばマクロファージ、好酸球、Ｋ細胞のみならず、好塩基球及びマスト細胞上のそのFcレセプターに対する抗体のFc領域の結合を通じて媒介される。Fcレセプターとの相互作用は細胞溶解のみならず、食作用及び免疫浄化も媒介する。Igアイソタイプは、それが補強する（recruiti ng）エフェクター機能のスペクトルにおいて著しく相違し合う。この免疫系は自然検査を司り、そしてそのホスト、いわゆる「自己抗原」に対する特異性を有する抗体の産生を阻止するようにバランスをとる。しばしば、この系は破綻し、自己免疫疾患の原因となる。自己寛容が、なぜ免疫系が腫瘍及びその他の悪性疾患を破壊しないかの一の理由であり、なぜならこれらの疾患はホストの異常に増殖する細胞に由来するからである。身体の外部で製造した抗体を用い、医療行偽において抗体を利用することが可能であることが証明された。Ｂ−リンパ球の不死化のための技術は、科学及び人間の健康管理における商業的利用性の分野のためのモノクローナル抗体の製造を可能にした（Clinical Applications of Monoclonal Antibodies，E．S．Lennox ，Ed．British Medical Bulletin 1984．Churchill-Livingstone）。更に、抗体の遺伝子及び物理構造の理解は、分子生物学技術の利用、特にファージ・ディスプレー技術の利用を介する免疫系の外部での製造を可能にした(WO 92/01047；WO 92/20791；WO 93/06213；WO 93/11236；WO 93/19172；WO 94/13804)。構造上最も単純な抗体(IgG)はジスルフィド結合によって相互に連結した４本のポリペプチド鎖を含んで成る。その軽鎖はカッパー（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の形態で存在している。各鎖は定常領域（Ｃ）と可変領域（Ｖ）とを有する。各鎖は一式のドメインへと一体化している。軽鎖は２本のドメインを有し、一方はＣ−領域（CL）に、そして他方はＶ− 領域（VL）に相当する。重鎖は４本のドメインを有し、一本はＶ−領域ドメイン（VH）であり、そして３本はＣ−領域ドメイン、即ちCH１，CH２及びCH３である。塩基性IgG抗体はＹ型である；その２本のアーム（Ｙの先端；それぞれ「Fab」領域に属している）は互いと結合し合っているVH及びVLドメインを含む。このＶ −領域のペアーが抗体同志で異なり合い（アミノ酸配列のバリエーションに基づく）、且つ一緒になって抗原の認識を司り、そして抗原結合性部位(ABS)を担う部分である。より詳しくは、各Ｖ−領域（重鎖であろうと軽鎖であろうと）は４つのフレームワーク領域（FR）によって分断された３つの相補性決定領域(CDR) より成る。これらのCDRは可変領域のうちの最も可変的な部分であり、そしてそれらは重要な結合機能を担う。このCDR領域は組換、突然変異及び選別を包括する複雑な工程を介して数多くの潜在的な生殖細胞配列から誘導される。抗原に結合する機能は完全抗体のフラグメントにより司られうることが示された。例示的な結合性フラグメントは（ｉ）VL，VH，CL及びCH１ドメインより成る Fabフラグメント；（ii）VH及びCH１ドメインより成るFdフラグメント；（iii）一本鎖抗体のVL及びVHドメインより成るFvフラグメント；（iv）VHドメインより成るdAbフラグメント（Ward，E．S．ら、Nature 341，544-546(1989)）；（ｖ）単離されたCDR領域；（vi）Ｆ（ab′）２フラグメント、即ち、２本の連結されたFabフラグメントを含んで成る二価フラグメント（vii）二価の一本鎖Fv二量体（PCT/US92/09965）、並びに（viii）ダイアボディー、即ち、遺伝子融合により構築された二価フラグメント(P．Holligerら、前掲；WO 94/13804)である。ダイアボディーは以降に更に説明する。二価フラグメントが本発明に特によく適する。Ｖ−ドメイン（及びＶ−ドメイン含有フラグメント）は抗原との相互作用のほとんどを司り、Ｃ−ドメインはエフェクター機能を補強する。補強されたエフェクター機能のタイプはＣ−ドメインのクラスにより主として支配されている（アイソタイプ；M. Bruggemannら、J．Exp．Med．166 1351 1987；L．Riechmannら、Nature 332 323 1988；J．Greenwoodら、Eur．J．Immunol．23 1098-11041993 ）、このようにして、病原体と戦うように進化した抗体はその病原体上に結合し、そしてこのようにして侵略体を破壊することを狙いとする適切な免疫応答を開始させる。例えば、IgG1（γ１）アイソタイプのＣ−ドメインは細胞表層において補体カスケートを誘引し、溶解をもたらすことにより、又はADCCを介する特定の食作用細胞及びキラー細胞上にＣ−ドメインレセプター（Fcレセプター）を結合させることを通じて細胞を殺すことができうる。他方、IgG4アイソタイプ（γ ４）の抗体は反応を活発にブロッキングするようである。本願において、このブロッキングは特定の標的に対して補強されることのできるエフェクター機能と考えられる。補体及びFcレセプターにとっての結合部位はCH２ドメインに位置し、種々のアイソタイプのCH₂ドメイン間の配列のバリエーションは補体及びFcレセプターとの相互作用の様々な強さをもたらす。IgEを除くアイソタイプの全ては、Ｃ−ドメインが適正にグリコシル化されていることを要する。Ｖ−領域と一定のＣ領域アイソタイプとの結合を介して、適切な免疫応答はその抗体が抗原に結合したときに誘引されうる。このタイプの免疫応答はこのアイソタイプにより支配されるため、人工の抗体には、腫瘍細胞を破壊する等のように、治療的に利用するため、適当な定常領域を施してよい(Hale，ら、Lancet ii，1394-1399(1988))。天然のエフェクター機能の補強を必要とする状況において抗体を利用するなら、抗体（IgEアイソタイプを除く）はそのタンパク質がグリコシル化されるために真核細胞の中で製造されねばならない。残念ながら、グリコシル化のタイプ及び程度は真核細胞のタイプ及び培養条件により変わり（Borys，M．C.ら、Biotec hnology 11，720-725(1993)）、そしてこのことは循環系の中でのその寿命を著しく短くする、及びエフェクター機能の補強に有害な影響を及ぼしてしまう。不適切にグリコシル化された抗体は免疫原性となりうるという更なる危険性があり、治療時間を制約する。適正にグリコシル化された定常領域の必要性から逃げる一の方法は、少なくとも２種類の抗原結合性部位を含んで成る抗体を製造することにある。これらは二価抗体として知られ、そして様々な方法で製造されうる（Holliger，P．and Win ter G．Current Opinion Biotechnol．4，446-449(1993)）。ここでも腫瘍の殺傷を例として、一の抗原結合性部位は腫瘍マーカーに対して特異的であり、一方、他方はエフェクター細胞タイプ上にある抗原に対して特異的であってよい。Ｔ −細胞の共通レセプターCD３に対する特異性の組込まれた二価抗体は腫瘍の増殖を阻止する(Titus，J．A.ら、J．Immunol．138，4018-4022(1987))及びリンパ腫を治療する(BrissinckJ．ら、J．Immunol．174，4019-4026(1991))ことが示されている。これにより、Fc領域とエフェクター細胞との相互作用は抗原結合性部位の一つとエフェクターとの直接的な相互作用に置き換えられる。癌胎児性抗原（ CEA；ヒト腫瘍細胞マーカー）及びCD16（ヒトＴリンパ球上）に対して特異的なダイアボディーは、末梢血液リンパ球の付加に基づくヒト腫瘍細胞の溶解を媒介することが示されている(WO 94/138 04)。本出願人は、抗体分子のＣ−領域とエフェクターとの間での直接的な相互作用は免疫系の制約された活性化しかもたらさないこと、及び一定の標的に対する免疫応答をはるかに高い程度にまで活性化する（又は事実上封じてしまう）ことが好都合であろうことを認定した。本出願人は更に、かかる変調は天然の抗体を、それが必然的に特異性をもっていない部位又は標的に対して特異性を向け直すことによって達し得ることを認定した。本出願人は更にこの原理は２以上の特異性を有する結合性物質の利用を通じて実施することができうることを認定した。数多くの例の一つは二価抗体であり、これは別の抗体の特異性を含んでいる。腫瘍細胞及び例えばIgG1定常領域に対する特異性を有する抗体は腫瘍にin situで結合し、そして循環系の中にあるIgG1抗体を蓄積させ、これによりIgG1特異性エフェクター機能が腫瘍部位において奏される。個体の血清中の抗体はその者にとって天然であり、それ故補体又はADCCを活性化するうえで機能的であろう。間接的な補強の原理は、いくつかの主たる理由のため、エフェクター細胞との直接的な相互作用よりも優れている。第一に、免疫系における抗体ネットワークの存在についての証拠があり、それにおいては天然の抗−抗体の特異性は標的部位に複合化した抗体の上及びまわりの抗体の分岐した塊を構築する（A．S．Perelson Immunol．Rev．110 5-36 1989 ；抗体のネットワークはN．J．Calvanico Dermatol．Clin．11 379-389 1993に記載されている）。このことは、数個の抗体分子を標的に結合させる作用を増幅することを担うものと考えられ、これにより弱い特異的結合能がそれとつり合わないほどに強いエフェクター応答を誘引しうる。このことは、エフェクター細胞に対する直接的な結合又は補体の誘引とは対照的であり、なぜならその状況においては結合能は剰法的ではなく、化学理論量的であるからである（最大で一抗原当り一抗体）。この設定が有利である第二の理由は血清半減期の制御に関係する。適切にグリコシル化された抗体はかなり信頼できる血清浄化率を有し、その代謝回転率はアイソタイプの違いにより相違する。例えば、IgG1は21日程度の血清半減期を有し、他方、IgG3及びIgEは１〜２日ほどで代謝回転する。治療効果の期間は投与した二価抗体、例えばダイアボディーの半減期によって調節されうる。その半減期は標的とする抗体及び抗原に対する結合親和力（及び反応速度）並びに抗体標的の血清濃度に依存しがちである。第三に、この手法は部位特異的免疫抑制において利用できうる。ある種の抗体、例えばIgG4はエピトープをブロッキングすることによって免疫応答を活発に阻止する。事実、一部の寄生虫は免疫攻撃から逃れるためにこの特性を発揮することで知られ（A．Gapronら、Mem．Inst．Oswaldo Cru2 87 Suppl．5 1-9 1992）、それらの抗原は適正な特異性をもつが殺傷を誘導できないＣ−領域アイソタイプをもつ抗体の産生を誘導する。この原理は、本発明の範囲において、リウマチ様関節炎及び筋無力症の如くの自己免疫疾患の緩和等の用途にまで広げることができる。この場合、二価抗体は標的エピトープ及び例えばIgG4に対する特異性を有する。しかしながら、患者は、そのイムノグロブリンIgG4がエフェクター機能を補強する能力についてスクリーニングにかけられる必要がある場合があり、なぜならこれを成し遂げるためのその能力は個体間で異なるようであるからである（Greenwoodら、前掲）。第四に、in vivoで、個体の天然のアイソタイプは補強されるため、個体の及び治療抗体のアロタイプのマッチングについての必要性はない。当業者にとって、この原理を実用化するための数多くの方法があることが明らかであろう。例えば、抗体以外の天然又は遺伝子操作にかけた結合性物質を本明細書記載の多価物質に組込んでよい。その例にはレクチン、Fc−結合性タンパク質、例えばプロテインＡ又はプロテインＧ、レセプター、例えばFcレセプター、及び補体系由来の成分が挙げられる。小分子、例えばペプチド、核酸、又は天然、半合成もしくは合成化学品も使用できうる。以上は、治療、診断及び科学研究において利用するための本明細書記載の多価物質を作り上げるために任意の順序、回数及び組合せで利用できうる。しかしながら、抗体又はそのフラグメントの利用が好ましい。特に好ましいのは抗体フラグメント、例えば以下に説明する理由のため、Fc領域を欠く(Fab)₂及びダイアボディーである。また、何らかのことわりのない限り、本明細書において（そして一般に当業界において）用いられている語「抗体」は合成及び天然の両方の抗体フラグメント、即ちイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る分子を含むものと理解されるべきである。好適な態様において、本明細書記載の多価物質は適当な抗体アイソタイプに結合できる二価抗体である。「ダイアボディー」がこの目的のために極めて好都合であることがあり、なぜならそれらは簡単に構築でき、そしてＥ．コリ(E．coli )の中で発現されるからである。適切な結合特異性を有するダイアボディーはライブラリー由来のファージディスプレー(WO 94/13804)を用いて容易に選別できうる。例えばもしダイアボディーの一方のアームをイムノグロブリン軽鎖に対して特異的な定常的なものとする場合、ライブラリーを作り、他方のアームを可変的にし、そして適切な特異性の抗体を選択できる。抗体をリターゲッティングするためにあらゆるタイプの二価抗体分子を使用することができるが、完全抗体よりも(Fab)₂、scFv二量体又はダイアボディーを利用することの方が好ましい。完全抗体におけるFcの存在は非特異的な部位、特に Fcレセプターに対する特異性に由来するin vivoでの複雑さをもたらしうる。ダイアボディーはFcを使うことなく、可変性ドメインのみを用いて構築でき、この潜在的な問題は回避される。in vitroにおいて、二価完全抗体とは異なる二価ダイアボディーの作製の簡単さは、それを選り抜きの抗体とする。本発明の一の観点は標的に対する抗体媒介式エフェクター機能を補強する方法を提供し、この方法は抗−抗体結合特異性及び標的に対する結合特異性を有する多価結合性物質を採用する。これを図１に示す。標的及び抗体に対する多価結合性物質の結合能は、標的に対する抗体媒介式エフェクター機能を補強する。この結合性物質は抗体及び標的に結合し、そこでそれは抗体のエフェクター機能を媒介する。一般に、このエフェクター機能は結合抗体の天然の一機能である（例えば前述の如く、ADCC、補体固定又はブロッキング）。この抗体は、一体化したエフェクター機能の補強のための任意のアイソタイプ、例えばIgG1，IgG2，IgG3， IgG4，IgM，IgA，IgD，IgEであってよい。好ましくは、この結合性物質の抗−抗体結合特異性は、１又は複数種のアイソタイプの抗体の定常領域に対する特異性である。アイソタイプ特異性の抗−抗体結合特異性の利用は補強するエフェクター機能の選択を可能にする。ヒトIgG1，IgG3及びIgMは補体の固定化のために極めて有用であり、そしてIgG 1及びIgG3はADCCのために極めて有用である。そして、多価結合性物質はアイソタイプの定常領域に対する結合特異性を有するであろう。IgM分子は凝集アッセイにおいて極めて有用である。IgG4は抗体のブロッキングに最適なアイソタイプであり、なぜならこれは一般に抗体依存性細胞障害能又は補体を補強しないからである。ある場合においては、毒素応答を阻止するほどに補体を活性化することのできないアイソタイプを使用することが有用でありうる。食作用の補強にとって、IgG1は極めて適当でありうる。マスト細胞はIgE抗体を介して補強されうる。このことは、それが癌細胞を殺傷するのに有用なものとするが、しかしその他の用途は制約されうる(WO 92/11031)。軽鎖に対する特異性は、補体又はADCCを活性化するもの等の抗体アイソタイプのスペクトルの補強を可能にする。抗−イディオタイプ特異性を利用できうる。幅広く見い出されているイディオタイプに対する特異性、例えば慣用されているDP-47V遺伝子生殖細胞系により供されうるものに対する特異性を、そのイディオタイプが成熟抗体においても未だ認識可能である任意の抗体を補強するために用いることができる。特異的な抗体のイディオタイプに対する特異性は、凝集アッセイにそのイディオタイプを表示している抗体を用いることによって有用である。例えばダイアボディーを利用するのに、細胞表層マーカー及び抗体のイディオタイプに特異的なダイアボディー分子は、一個の細胞をこの抗体に橋渡しするであろう。第二ダイアボディー分子は、この抗体の上の別の抗原結合性部位及び第二細胞に結合でき、それ故それらを橋渡しするであろう。IgM分子はこれのために特に適し、なぜならそれらは１分子当り10個の抗原結合性部位を有するからである。多価結合性物質は二価であってよい。それは二価の抗体又は抗体フラグメントであってよい（前述）。好ましくは、それは「ダイアボディー」、即ち、ポリペプチドの多量体（例えば二量体）であり、ここで各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインと、イムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、その２つのドメインは連結しているが、会合して抗原結合性部位を形成することはない。この連結は−１から約10個のアミノ酸（例えば５個）のペプチドリンカーを介しうる。これらのポリペプチドは多量体へと会合し、ここでは一のポリペプチドの第一ドメインは別のポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成する。本発明において利用するための「ダイアボディー」についての更なる情報及び形態の可能性についてはWO 94/13804を参照のこと。また、scFv二量体も好ましく、それにおいては各ポリペプチドは重鎖及び軽鎖可変領域結合性領域を含んで成り、それらは分子内会合して抗原結合性部位を形成でき（ダイアボディーとは反する）、なぜなら各ポリペプチド内の２つのドメインを連結するペプチドリンカーは十分に長いからである。更に(Fab )₂も好ましい。本発明に係る方法はin vitro又はin vivoで実施してよく、それは抗体媒介式エフェクター機能の補強が有利又は有利のようである個体の症状の処置の方法であってよい。個体への投与は任意の標準的な技術を利用してよく、技術の選定及び投与量の選定、投与の頻度等の基準は当業者に公知である。抗体の投与は例えばHaleら、Lancet ii，1394-1399（1988），Simmonsら、Circulation，89，596- 603（1994）及びRiethmullerら、Lancet，343，1177-1183（1994）に記載されている。 in vitroにおいては、患者から取り出した標的細胞／組織を処置するための抗体エフェクター機能を補強するのに、多価結合性物質、例えば二価抗体、例えばダイアボディーを抗体のリターゲッティングにおいて利用できうる。例えば、白血病を患う患者由来の骨髄を取り出し、そしてその細胞をex vivoで、腫瘍細胞に特異的なマーカー及びイムノグロブリンIgG1定常領域に対して特異的な二価ダイアボディーとIgG1抗体及び補体とで処理してよい。すると腫瘍細胞は特異的に溶解し、そして残っている完全細胞を採取し、次いで患者に戻してよい。他方、ADCCを利用してよく、結合性物質（例えばダイアボディー）をIgG1及びキラー細胞調製物と一緒に骨髄細胞に加えて腫瘍細胞を溶解させ、次いで残留細胞を患者に戻す。同様に、例えば補体溶解を利用するなら、エフェクター機能の補強を、血液の如くのサンプルに存在している腫瘍特異的抗原の如くの特定のマーカーを発現する多種の細胞の診断アッセイにおいて利用することができる。溶解度は存在している細胞数を反映するであろう。抗−IgM結合性物質（例えばダイアボディー）及びIgMを利用するなら、増強した補体溶解力は、非常に少ない数の細胞表層マーカーしか発現しない腫瘍細胞の検出感度を高めるであろう。エフェクター機能の媒介は本発明を実施する条件に従って行える又は可能でありうる。例えば、in vitro媒介はエフェクター系の必須成分（例えば補体）を培地に加えることにより起こりうる。しかしながら、血清中では、例えばin vitro 又はin vivoのいづれにおいても、エフェクター機能の必須成分は全て当初から存在していることがあり、標的及び抗体に対する多価結合性物質の結合に基づいてエフェクター機能が発揮される。本発明の更なる観点は標的に対する抗体媒介式エフェクター機能の補強における多価結合性物質の利用を提供し、この結合性物質は抗−抗体結合特異性及び標的に対する結合特異性を有する。本発明により供される任意の方法においてこの多価結合性物質を使用できうる。その用途は、抗体媒介式エフェクター機能が有利又は有利のようである症状の処置等のためのその補強用医薬品の製造でありうる（上記参照）。開示した多価結合性物質を含んで成る薬理組成物及びかかる組成物の利用も本発明により提供する。かかる薬理組成物は任意の薬理学的に許容される賦形剤を含んで成りうる。本発明の別の観点は、多価（例えば二価）結合性物質、例えば抗−抗体結合特異性（及び標的に対する結合特異性）を有する「ダイアボディー」（開示の通り）を提供する。かかる多価結合性物質は、抗−抗体結合特異性を有する結合性部位及び標的に対する結合特異性を有する結合性部位を有し、そしてポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメイン及びイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインを含んで成り、その結合性部位はこの多量体における一のポリペプチドの第一ドメインとこの多量体における別のポリペプチドの第二ドメインとの会合により形成されている。ダイアボディーにおいて、各ポリペプチドの第一ドメインはそのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない。かかる多量体を含んで成る組成物、例えば薬理学的に許容される賦形剤を含みうる薬理組成物も本発明により提供される。このダイアボディーはポリペプチドダイマーであってよい。上記に開示した方法及び組成物における用途に加えて、かかる多価結合性物質は本発明の更なる観点、即ち、一体化したエフェクター機能を伴って又は伴わないで、特異性のない標的に対して抗体をターゲッティングさせる又は補強する一般的な方法に有用である。例えば、多価（例えば二価）ダイアボディーを凝集アッセイに利用してよい。多価結合性物質、例えば適当なダイアボディー（例えば二価の）は細胞、細菌又はウィルスの凝集のため、多価相互作用させることを介し、赤血球の凝集診断アッセイにおいて、例えば血液型を決定するために使用できうる。抗体分子に対して特異的な一本のアームを有するダイアボディーは、図２に示す通り、細胞を組合させ合うための様々な方式において利用できうる。例えば、ダイアボディー又はその他の多価結合性物質であって細胞表層抗原に特異的な一本のアーム及びIgMに対して特異的な別のアームを有するものを利用できうる。IgMの多価の性質は、２以上のダイアボディー分子がIgM分子に結合し、それ故異なる血球を架橋することを意味する。このIgMは追加試薬として加えることができ、又は試験した血液サンプルの中に存在するIgMを凝集を促進するために利用することが可能でありうる。一方のアームは細胞表層抗原に特異的であってよく、そして他方は抗体分子において一般に見い出せるイディオタイプ、例えばDP-47 VH遺伝子（ヒト抗体において一般に利用されている遺伝子セグメント）（Tomlinsonら、J．Mol．Biol．2 27 776-798(1992)）の要素に特異的な抗体に対して特異的である。このイディオタイプをもつIgM分子が極めて有用であろう。凝集アッセイにおいて利用するためには一方のアームはIgM以外のアイソタイプに対して特異的であってよいが、このような他の抗体は小さいため、それらは細胞凝集の効率が低いことがある。本発明の任意の態様において、この標的は例えば細菌、ウィルス、菌類、原虫の任意の抗原、又は細胞（癌細胞）の表層上の抗原であってよく、これらの抗原を表示する標的（例えば細菌、ウィルス、寄生虫又は腫瘍細胞）に対する天然抗体コード化エフェクター機能の補強を、その抗原に対する結合特異性及び抗−抗体結合特異性を有する多価結合性物質を介して可能とする。本発明の更なる観点は当業者に明らかであろう。以下の実施例は本明細書は開示の原理をどのようにして実施に移すことができるかを例示する。当業者は本明細書に開示の発明を逸脱することなく改良及び変更を容易に施すことができうることを理解しているであろう。本明細書に挙げる文献は全て引用することで本明細書に組入れる。図１は、IgG1又はIgMの如くの抗体を細胞表層マーカーに向け直させ、補体を誘引するための二価ダイアボディーの利用を示す。図２は、血液細胞抗原及び２以上の同一のエピトープを有するIgMの如くの抗体に対して特異的な二価ダイアボディーを用いる赤血球の凝集を示す。１個のダイアボディー分子が血液細胞抗原及びIgM分子に結合している。第二ダイアボディー分子がこのIgM分子に結合し、そして第二血液細胞上の抗原に結合し、それ故血液細胞を架橋及び凝集させている。実施例１：二価抗−２−フェニルオキサゾール−５−オン、抗−マウスラムダ軽鎖ダイアボディーの調製及び特性決定０アミノ酸リンカーを有する２−フェニル−５−オキサゾロン及びマウスの１軽鎖に対して特異的な二価ダイアボディーをコードするクローンを、ハイブリドーマNQ11に由来する２−フェニル−５−オキサゾロンに特異的な抗体をコードするDNA(抗−２−フェニルオキサゾール−５−オン；C. Berekら、Nature 316 412 -418，1985；P．Holligerら前掲)及びマウスのラムダ軽鎖に特異的なハイブリドーマLS136由来のDNAから、WO 94/13804のexample １に本質的に記載の方法論を利用して調製した。マウスのラムダ軽鎖に特異的な二価ダイアボディーは中間段階として調製した。 LS136はマウス抗体の１軽鎖に特異的なネズミハイブリドーマである。これはファージミドベクターpUC119SfiNotmycの中で５残基のリンカーをV H-GGGGS-VLの配向で利用して、ダイアボディーフォーマットでクローニングした。そのリンカー配列を、プライマー（VkCbaLink5BstEII）及びVKの５′末端を増幅するのに用いたプライマー４（表１）の中に組込んだ。プライマー４はVKの５ ′末端にSacＩ制限部位も導入する。BstEIIのための制限部位をプライマーVkCba Link5BstEII及びプライマー４のリンカー配列の５′側に、そして更にVH1-FOR-2 （E．S．Ward，D．Gussow，A．D．Griffiths，P．T．Jones and G．Winter，Nat ure 341，544-546 1989）の３′末端に組込んだ。これは、VH及びリンカー−VL フラグメントが３方向ライゲーション反応において発現ベクターpUC119SfiNotmy cの中にクローニングされるようにする。 RNAをLS136ハイブリドーマ細胞から抽出し、そしてcDNAを調製するのに用いた。LS136 VH及びVLドメインDNAを、プライマーペアーVH3AbaとVH1FOR-2及びVkCba Link5BstEIIとVK4FOR(T．Clackson，H．R．Hoogenboom，A．D．Griffiths and G ．Winter，Nature 352，624-628，1991)のそれぞれを用い、標準の条件を利用してcDNAからPCRにより増幅させ、そしてVH3AbaSfiとVH1for-２（VH用）及びプライマー４（P．Holligerら、前掲）とVK4foNot（VK用）を用いて再増幅させた。V HのPCR反応生成物を制限酵素SfiＩ及びBstEIIで消化し、そしてVK PCR反応生成物を制限酵素NotＩ及びBstEIIで消化した。VH及びVLドメインDNAをSfiＩ/NotＩ消化したpUC119SfiNotmycの中に３：３：１（VH：VL：pUC119SfiNotmyc又はpCan tab6）のモル比で同時にライゲーションし、そして得られるライゲーション混合物をＥ．コリTG１細胞を形質転換するのに用いた。VH及びVLドメインDNAもSfiＩ /NotＩ消化したpCANTAB6ベクターの中に同じようにしてライゲーションし、そしてＥ．コリHB2151細胞に形質転換させた。ベクターpUC119SfiNotmycにおける組換体のためにプライマーLMB 2及びLMB3を、又はベクターpCANTAB6における組換体のためにはLMB3及びfdSeqを用い、適正サイズのインサートについて組換体をスクリーニングした。L136ダイアボディーの発現可溶性ダイアボディーはpUC119SfiNotmycクローンを37℃で増殖させることにより発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、IPTGを１mMのIPTGの最終濃度にまで加えることにより誘導し、そして22℃で３時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そして細胞ペレットを100μｌの氷冷PBS/１mMのEDTAの中に再懸濁し、そして氷の上に60分放置した。その細胞懸濁物を遠心し（1000ｇで10分）、そしてダイアボディー含有上清液を下記のELISAに用いた。 50μｌのペリプラズマ上清液及び50μｌの３％のBSA/PBSを、マウスIgMλ又はマウスIgG2ａλ（両方ともSigmaから）（PBS中10μｇml^-1）でコートされ、３％のBSA/PBSでブロッキングされたELISAウェルに加えた。標準のELISAプロトコールを(H．R．Hoogenboomら、Nucl．Acids Res．19，4133-4137 1991)、モノクローナル抗体9E10、並びに西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲートされた抗マウスIgG（IgMλ用）、ビオチニル化抗マウスκ鎖、及びペルオキシダーゼ−ビオチン−ストレプトアビジン複合体（両方ともAmersham）（IgG2ａλ１用）によるmyc−タグの検出を利用して行った。10分後のELISA測定値は1.0より高かった。二価ダイアボディー LS136／NQ11／５及び二価ダイアボディーLS136／NQ11／０の構築２種類の抗体特異性体LS136（抗−マウスλ抗体軽鎖）及びNQ11（抗−phOx）を、そのVH及びVLを５アミノ酸リンカ−VH-GGGGS-VLによって、又はＯリンカーで直接VH−−VLの配向においてファージミドpUC119SfiN otmycの中で融合させることによって二価ダイアボディーフォーマットに組立てた。このリンカー配列は、VKの５′末端を増幅するのに用いるプライマー４及び３（表１）の中に、並びにVHの３′末端を増幅するのに用いるプライマー７及び６（表１）の中に組込んだ。BstEIIの制限部位をプライマー３のリンカー配列の５′に組込み、そしてSacＩの制限部位をプライマー６のリンカー配列の５′に組込んだ。これは集成したVH−リンカー及びリンカー−VLフラグメントが３方向ライゲーション反応において、発現ベクターpUC19LS136／５BstEII／SacＩの中にクローニングされるようにするであろう。二価ダイアボディーLS136／NQ11／５（５アミノ酸リンカー）の構築鋳型としてfd-DOG-1の中にクローニングしたscFvNQ11を用い、VHNQ11をプライマー２及び７（表１）で増幅し、VKNQ11をプライマー１及び４で増幅した。VH P CR反応の生成物を制限酵素AscＩ及びSacＩで消化し、そしてVL PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136／５（上記参照）のベクターフラグメントをBstEII/SacＩで切り、そしてVH及びVLドメインのDNAを３：３：１（VH：LV：pUC119-LS136／５）のモル比でそれに同時にライゲーションした。得られるライゲーション混合物をＥ．コリのTG１細胞を形質転換するのに用いた。組換体を、組換体のコロニーのPCR増幅のためのプライマーLMB2及びL MB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。二価ダイアボディーLS136／NQ11／０（ゼロアミノ酸リンカー）の構築鋳型としてfdDOG-１にクローニングしたscFvNQ11を用いてVHNQ11 をプライマー２及び６（表１）で増幅し、VKNQ11をプライマー１及び３で増幅した。VH PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びSacＩで消化し、そしてVL PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びBstE IIで消化した。ダイアボディーLS136／５（前述参照）のベクターフラグメントをBstEII/SacＩで切り、そしてVH及びVLドメインのDNAを３：３：１（VH：VL：pUC119-LS136／５）のモル比でそれに同時にライゲーションした。得られるライゲーション混合物をＥ．コリTG１細胞を形質転換するために用いた。組換体を、組換体のコロニーのPCR増幅のためのプライマーL MB2及びLMB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。二価ダイアボディーLS136／NQ11／５及び二価ダイアボディーLS136／NQ11／０の発現可溶性ダイアボディーを37℃での増殖により発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、IPTGを１m MのIPTG最終濃度となるまで加え、そして22℃で３時間増殖させることによって誘導した。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そしてその細胞ペレットを100 μｌの氷冷PBS/１mMのEDTAの中に再懸濁し、そして氷の上に60分放置した。その細胞懸濁物を遠心し（1000ｇで10分）、そしてダイアボディー含有上清液をλ軽鎖については上記の通り、又はphOxについてはWO 94/13804のexample １に記載の通りにしてELISAに用いた。1.0より大きいELISAシグナルが10min後に得られた。実施例２：二価抗−ニワトリの卵のリゾチーム、抗−マウスラムダ軽鎖ダイアボディーの調製及び特性決定、並びに補体溶解の実例ニワトリの卵のリゾチーム(HEL)及びマウスのλ軽鎖に対して特異的な二価ダイアボディーと５及び０アミノ酸リンカーとをコードするクローンを、抗−HEL 抗体 HyHEL10由来のＶ遺伝子（T．B．La voie，W．B．Drohan and S．J．Smith-Gill J．Immunol．148 503-513 1992；Sa ndra Smith-Gillの贈呈品）から誘導したニワトリの卵のリゾチーム(HEL)に対する一本鎖Fv抗体フラグメントをコードするDNA及びマウスのラムダ軽鎖に特異的なハイブリドーマLS136由来のDNAから、実施例１及びP．Holligerら（1993前掲）に本質的に記載の方法論を利用して調製した。実施例１に本質的に記載のマウスラムダ軽鎖に特異的な二価ダイアボディーを中間段階として利用した。このダイアボディーのVH及びVLドメインをコードするDNAをWO 94/13804のexam ple １にまさに記載の通りにして調製し、そして消化した。VH及びVLドメインDN AをSfiＩ／Not消化したpCANTAB5-E(Pharmacia)の中に３：３：１のモル比で同時にライゲーションし、そして得られるライゲーション混合物をＥ．コリHB2151細胞に形質転換するのに用いた。組換体をプライマーfdSeq及びLMB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。L136ダイアボディーの発現可溶性ダイアボディーを37℃で増殖させることにより発現させた。２mlの２YT ／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、IP TGを１mMのIPTGの最終濃度にまで加えることにより誘導し、そして22℃で３時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そして細胞ペレットを100μ ｌの氷冷PBS/１mMのEDTAの中に再懸濁し、そして氷の上に60分放置した。その細胞懸濁物を遠心し（1000ｇで10分）、そしてダイアボディー含有上清液を下記の ELISAに用いた。 50μｌのペリプラズマ上清液及び50μｌの３％のBSA/PBSを、マウスIgMλ又はマウスIgG2ａλ（両方ともSigmaから）（PBS中10μｇml^-1）でコートされ、３％のBSA/PBSでブロッキングされたEL ISAウェルに加えた。標準のELISAプロトコールを(H．R．Hoogenboomら、Nucl．A cids Res．19，4133-4137 1991)、HRPにコンジュゲートしたモノクローナル抗− Ｅダク抗体によるＥ−ダク検出を利用した。10分後のELISA測定値は1.0より高かった。二価ダイアボディーLS136／NyHEL10／５及び二価ダイアボディーLS136／NyHEL10 ／０の構築２種類の抗体特異性体LS136（抗−マウスλ抗体軽鎖）及びNyHEL10(抗−リゾチーム)を、そのVH及びVLドメインを５アミノ酸リンカーVH-GGGGS-VLによって、又はＯリンカーで直接VH−−VLの配向においてファージミドベクターpCANTAB5-E (Pharmacia)の中で融合させることによって二価ダイアボディーフォーマットに組立てた。このリンカー配列は、VKの５′末端を増幅するのに用いるプライマー４及び３（表１）の中に、並びにVHの３′末端を増幅するのに用いるプライマー７及び６（表１）の中に組込んだ。BstEIIの制限部位をプライマ１３及び４のリンカー配列の５′に組込み、そしてSacＩの制限部位をプライマー６及び７のリンカー配列の５′に組込んだ。これは集成したVH−リンカー及びリンカー−VLフラグメントが３方向ライゲーション反応において、発現ベクターpCANTAB5-E LS1 36／５BstEII／SacＩの中にクローニングされるようにするであろう。二価ダイアボディーLS136／NyHEL10／５（５アミノ酸リンカー）の構築鋳型としてpUC119の中にクローニングしたscFvHEL10を用い、VHHyHEL10をプライマー２及び７（表１）で増幅し、VkHyHEL10をプライマー１及び４で増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscＩ及びSacＩで消化し、そしてVL PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びBstE IIで消化した。ダイアボディーLS136／５（上記参照）のベクターフラグメントをBstEII/SacＩで切り、そしてVH及びVLドメインのDNAを３：３：１（VH：LV：pCANTAB5-E LS136／５）のモル比でそれに同時にライゲーションした。得られるライゲーション混合物をＥ．コリHB2151細胞を形質転換するのに用いた。組換体を、組換体のコロニーのPCR増幅のためのプライマーfdSeq 及びLMB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。二価ダイアボディーLS136／HyHEL10／０（ゼロアミノ酸リンカー）の構築鋳型としてpUC1119にクローニングしたscFvHyHEL10を用いてVHHyHEL10をプライマー２及び６（表１）で増幅し、VkHyHEL10をプライマー１及び３で増幅した。VH PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びSacＩで消化し、そしてVL PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136／５（前述参照）のベクターフラグメントをBstEII/SacＩで切り、そしてVH及びVLドメインのDN Aを３：３：１（VH：VL：ppCANTAB5-E-LS136/５）のモル比でそれに同時にライゲーションした。得られるライゲーション混合物をＥ．コリHB2151細胞を形質転換するために用いた。組換体を、組換体のコロニーのPCR増幅のためのプライマーfdSeq及びLMB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。二価ダイアボディーLS136／HyHEL10／５及び二価ダイアボディーLS136／HyHEL10 ／０の発現可溶性ダイアボディーを37℃での増殖により発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、IPTGを１m MのIPTG最終濃度となるまで加えることによって誘導し、そして22℃で３時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そしてその細胞ペレットを100 μｌの氷冷PBS/１mMのEDTAの中に再懸濁し、そして氷の上に60分放置した。その細胞懸濁物を遠心し（1000ｇで10分）、そしてダイアボディー含有上清液をλ軽鎖については上記の通り、又はニワトリの卵のリゾチームについてはP．Hollige rら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 906444-6448)に記載の通りにしてELISAに用いた。1.0より大きいELISAシグナルが10min後に得られた。精製及び補体溶解アッセイのためのLS136／NyHEL10／５ダイアボディーの発現可溶性ダイアボディーを37℃での増殖により発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞をIPTGを１mM のIPTG濃度にまで加えることにより誘導し、そして22℃で24時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そして細胞ペレットを再懸濁し、次いで上清液を0.16μｍのフィルターで濾過し、そして交流濾過（フィルターのカッオフ値 10KD）により濃縮した。その濃縮物をHEL-Sepharoseアフィニティーカラムで精製した。そのカラムを10カラム容量のPBS，５カラム容量の0.5ＭのNaCl／0.1mM のトリス、pH8.5で洗い、そしてタンパク質を100mMのトリエチルアミンにより氷冷の１ＭのトリスpH7.5の中に溶出させ、そしてPBS／0.2mMのEDTAに対して徹底的に透析した。補体溶解アッセイ LS136／NyHEL10／５ダイアボディーが抗体をリターゲッティングする能力及びそのエフェクター機能を、補体溶解アッセイを利用して決定した。リゾチームコートした赤血球の調製ヒト赤血球(RBC)をこの技術に利用した。赤血球からバッフィーコートを取り除いて廃棄したら、それらを洗い、遠心し、そしてPBSで４回再懸した（その際、名時上清液を廃棄した）。この洗浄段階の前に別の血液集団の細胞が混ざり合わないことが重要である。この最終洗浄及び遠心の後、充密となったRBCにタンパク質を、RBCとコート用タンパク質溶液 (PBS中の10mg／mlのリゾチーム)及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAC；PBS中100mg／ml）とを１：４：１（ｖ／ｖ）の比で混合することによって、コートした。この混合物を回転式プラットホーム上で４℃で1.5時間回転させ、その後RBCを遠心し、そして上清液を取り除いて廃棄した。次に、その細胞を約10mlのPBSの中で５回洗い（更なる溶血がなくなるまで）、次いですぐに利用できるように最終容量10mlのPBSの中に再懸濁した。補体溶解アッセイ 10mg／mlのHELでコートした赤血球を補体固定用希釈液（Oxoid，Basingstoke ）で３回洗い、そして１％の懸濁物50μｌを96穴マイクロタイタープレートのウェルに加えた。精製したダイアボディーLS136／NyHEL10／５（１mg／ml〜10ng／ ml；50μｌ）希釈物を加え、そして室温で20分インキュベートした。その細胞を 2000rpmで５分遠心し、そして上清液を廃棄した。その細胞を、このアッセイにおける抗原（ミエローマMOPC 104E）に特異的でないラムダ軽鎖(IgMλ)をもつイムノグロブリン希釈物の中に再懸濁し、そして室温で20分インキュベーションした。その細胞を再び2000rpmで５分の遠心によりペレット化し、そしてその上清液を廃棄した。ここで細胞ペレットを補体固定用希釈液で１回洗い、そしてその細胞を再びペレットにし、そして１／20に希釈したギニアピッグ補体（ギニアピッグ血清から、赤血球の凝血を経て調製）に再懸濁し、そして37℃で30分インキュベートした。細胞塊を4000rpmで５分の遠心によりペレット化し、そしてその上清液を別のマイクロタイタープレートに移し、そして405nmの吸収を測定した。溶解度はLS136／HYHEL10／５ダイアボディー及びミエローマMOPC 1O4E IgMλ の両方の希釈率に比例することが見い出された。50μｇ／mlのIgMλと10ng／ml のダイアボディーとの組合せは、HELコート化赤血球の50％の最大溶解をもたらすことが見い出された。非コート化もしくはphOx-BSAコート化赤血球を用いたとき、又はダイアボディーもしくはIgMλのいづれかを省いたとき、溶解は認められなかった（バックグランド溶解を除き）。似たような結果が、再標的IgG2aλに対するダイアボディー及び全血由来の抗体の能力を補体溶解アッセイを利用して決定したときに得られた。50ng／mlのLS 136／HyHEL10／５ダイアボディー及びこのアッセイにおける抗原（ミエローマHO PC−１）（100μｇ／ml）に対して特異的でないラムダ軽鎖を有するイムノグロブリンIgG2a(IgG2aλ)を利用して同じ標準アッセイを行った。ダイアボディーはこの場合、効率的な補体誘導式溶血を誘導することが認められた。補体アッセイを、単に抗原コート化赤血球、ダイアボディー及びIgMλを、補体固定用希釈液の中で１／５に希釈した150μｌの容量のギニアピッグ補体と混合することによっても行った。ここでも効率的な溶血が、37℃で30分のインキュベーション後に観察された。ダイアボディー抜きで設定したこのアッセイは若干のバックグランド溶血をもたらした。従って我々は、このダイアボディーは、細胞表層上に抗原を有する抗体に対して、その抗原に特異的でない抗体の抗体エフェクター機能をリターゲッティングさせるのに有効であると考えた。実施例３：抗−CEA、抗−マウスラムダ軽鎖ダイアボディーの調製及び特性決定、並びに腫瘍細胞の補体媒介式溶解の実例癌胎児抗原(CEA)及びマウスのλ軽鎖に対して特異的な二価ダイアボディーと５アミノ酸リンカーとをコードするクローンを、腫瘍特異性抗原の癌胎児抗原(CEA)に結合するネズミ抗−CEA 抗体MFE2３に由来する可変領域をコードするDNA及びマウスのラムダ軽鎖に特異的なハイブリドーマLS136由来のDNA から、実施例１及びP．Holligerら（1993前掲）に本質的に記載の方法論を利用して調製した。実施例１及び２に記載のマウスラムダ軽鎖に特異的な二価ダイアボディーを構築の中間段階として利用した。二価ダイアボディーLS136／MFE23／５の構築２種類の抗体特異性体LS136(抗−マウスλ抗体軽鎖)及びMFE23(抗−CEA)を、そのVH及びVLドメインを５アミノ酸リンカーVH-GGGGS-VLによって、ベクターpCA NTAB5-E(Pharmacia)の中で融合させることによって二価ダイアボディーフォーマットに組立てた。このリンカー配列は、VKの５′末端を増幅するのに用いるプライマー４の中に、及びVHの３′末端を増幅するのに用いるプライマー７の中に組込んだ。BstEIIの制限部位をプライマー４のリンカー配列の５′に組込み、そしてSacＩの制限部位をプライマー７のリンカー配列の５′に組込んだ。これは集成したVH−リンカー及びリンカー−VLフラグメントが３方向ライゲーション反応において、発現ベクターpCANTAB5-E LS136／５BstEII／SacＩの中にクローニングされるようにするであろう。 PCT/GB93/02492に記載のMFE23抗CEA scFvクローンをまずVLドメインの中の内在BstEII部位を除くためにオリゴヌクレオチドCEA23−BstE（表１）及びSculpto rキット（Amersham International）を用いるin vitro突然変異誘発によって突然変異させた。鋳型として突然変異させてMFE23抗−CEA scFvを用い、５アミノ酸リンカーダイアボディーLS136／MFE23／５のために、VHMFE23をプライマー２及び７（表１）で増幅させ、そしてVKMF23をプライマー１及び４で増幅させた。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscＩ及びSacＩで消化し、そして VL PCR反応生成物を制限酵素AscＩ及びBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136 ／５（上記参照）をコードするベクターpCANTAB-5E DNAをBstEII/SacＩで切り、そしてVH及びVLドメインのDNAを３：３：１（VH：LV：pCANTAB5-E LS136／５）のモル比でそれに同時にライゲーションした。得られるライゲーション混合物をＥ．コリHB2151細胞を形質転換するのに用いた。組換体を、組換体のコロニーの PCR増幅のためのプライマーfdSeq及びLMB3を用いて適正サイズのインサートについてスクリーニングした。このダイアボディーをコードするSfiI-NotＩフラグメントを発現のためにベクターpUC119 SfiNot-hismycの中にサブクローニングした。二価ダイアボディーLS136／MFE23／５の発現可溶性ダイアボディーを37℃での増殖により発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、IPTGを１m MのIPTG最終濃度となるまで加えることによって誘導し、そして22℃で３時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そしてその細胞ペレットを100 μｌの氷冷PBS/１mMのEDTAの中に再懸濁し、そして氷の上に60分放置した。その細胞懸濁物を遠心し（1000ｇで10分）、そしてダイアボディー含有上清液をλ軽鎖については実施例１及び２に記載の通り、又はCEAについてはA．D．Griffiths ら（EMBO J．12 725-734，1993）に記載の通りにしてELISAに用いた。1.0より大きいELISAシグナルが10min後に得られた。精製及び補体溶解アッセイのためのLS136／MFE23／５ダイアボディーの発現可溶性ダイアボディーを37℃での増殖により発現させた。２mlの２YT／0.1％のグルコース／100μｇml^-1のアンピシリン中の対数増殖期の細胞をIPTGを１mMのIPTG濃度にまで加えることにより誘導し、そして22 ℃で24時間増殖させた。その細胞を遠心し（1000ｇで10分）、そして細胞ペレットを再懸濁し、次いで上清液を0.16μｍのフィルターで濾過し、そして交流濾過（フィルターのカッオフ値10KD）により濃縮した。その濃縮物をニッケル−NTA アガロースゲル(Qiagen cat．no．30210)を用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）により、その製造者の仕様書に従って精製し、そして PBS／EDTAに対して徹底的に透析した。補完溶解アッセイ LS136／MFE23／５ダイアボディーが抗体を再標的とする能力及びそのエフェクター機能をクロム（⁵¹Cr）放出を利用する補完溶解アッセイを利用して決定した。２×10⁶のLS 174T標的細胞（ATCC CL 188、米国特許第 4,288,236号）を脱着させた後、10％の胎児牛血清を含むRPMI 1640培地で洗った。細胞の遠心後、そのペレットを⁵¹Cr(200μCi)で37℃で１時間ラベルした。RPMI 1640培地で２回洗った後、その標的細胞（アッセイ当り5000細胞）を培養ウェルに小分けした。精製したダイアボディーLS136／MFE23／５（１mg／ml〜10ng／ml；50μｌ）希釈物を加え、そして室温で20分インキュベートした。その細胞を2000rpmで５分遠心し、そして上清液を廃棄した。その細胞を、このアッセイにおける抗原（ミエローマMOPC 104E）に特異的でないラムダ軽鎖(IgMλ)を有するイムノグロブリンIgM希釈物の中に再懸濁し、そして室温で20分インキュベーションした。その細胞を再び2000rpmで５分の遠心によりペレット化し、そしてその上清液を廃棄した。ここで細胞ペレットを補体固定用希釈液で１回洗い、そしてその細胞を再びペレットにし、そして１／20に希釈したギニアピッグ補体（ギニアピッグ血清から、赤血球の凝血を経て調製）に再懸濁し、そして37℃で30分インキュベートした。細胞塊を4000rp mで５分の遠心によりペレット化し、そしてその上清液を別のマイクロタイタープレートに移した。その細胞を遠心し、そして上清液の半分(100μｌ)を集め、そしてクロム放出をガンマーカウンターで決定した。サンプリングはトリプリケートで行い、そして比溶解率は以下の通りに計算した： 100×（平均サンプル放出量−自発放出量）／（最大放出量−自発放出量）自発放出量はアッセイ培地のみの中の標的細胞から測定し、そして最大放出量はＩＭのHCl中の対応の数の標的細胞の溶解後に測定した。溶解度はLS136／MFE23／５ダイアボディー及びミエローマMOPC 104E IgMλの両方の希釈率に比例する(titrate)することがわかった。ダイアボディーもしくはIgMλのいづれを省いても、又は腫瘍細胞の代わりにphOx-BSAコート化赤血球コントロールを用いても、溶解は認められなかった（バックグランド溶解を除き）。実施例４：CEA及びマウスラムダ軽鎖に特異的なダイアボディーによって誘導された抗体依存性細胞媒介式細胞障害による腫瘍細胞の溶解 ADCCは抗体Fc領域のFcレセプターへの結合によってもたらされる天然抗体がコードするエフェクター機能である。抗体によりコートされた細胞は一連の単核細胞による溶解を介して殺傷される。単核細胞をFicoll勾配によりBalb／ｃマウスの脾臓から単離し、そしてRPMI（ Russel Park Memorial Institute）／10％の胎児牛血清(FCS)の中で、マイトジェン抗−CD３抗体により予備処理した組織培養フラスコ（例えばPBS中の50μｇ／mlの2C11で24時間予備処理し、そして未結合抗体を除去するためにPBSで４回洗浄）において37℃で３日間増殖させた。次いでそれらを未処理のフラスコに移し、RPMI／５％のFCS及び10単位／mlの組換インターロイキン２（IL−２）の中で37℃で３〜７日間繁殖させた。２×10⁶のLS 174T標的細胞（ATCC CL 188、米国特許第4,288,236号）を脱着後回収し、そして10％の胎児牛血清を含むRPMI 1640培地で洗った。細胞の遠心後、そのペレットを⁵¹Cr(200μCi)で37℃で１時間ラベルした。RPMI 1640培地で２回洗った後、標的細胞（アッセイ当り5000細胞）を培養ウェルに小分けした。精製したダイアボディーLS136／MFE23／５の希釈物（１mg／mlから10ng／ml； 50μｌ）を加え、そして室温で20分インキュベートした。その細胞を2000rpmで５分の遠心によりペレット化し、そして上清液を廃棄した。細胞をこのアッセイにおける抗原（Myeloma3C52′CL）に対して特異的でないラムダ軽鎖を有するイムノグロブリンIgG1（IgG1λ）（抗−４−ヒドロキシ−３−フェニルアセチル(N IP)）の希釈物の中に再懸濁し、そして室温で20分インキュベートした。その細胞を再び2000rpmで５分の遠心によりペレットにし、そして上清液を廃棄した。Ｋ−細胞を洗ってIL−２を除去し、次いで50：１〜10：１のエフェクター：標的(Ｋ−細胞：LS 174T)の比となるように加え、そして37℃で４ｈインキュベートした。その細胞を遠心し、そして上清液の半分(100μｌ)を集め、そしてクロム（⁵¹Cr）放出をガンマーカウンターで決定した。各サンプリングはトリプリケートで行い、そして比溶解率は以下の通りに計算した： 100×（平均サンプル放出量−自発放出量）／（最大放出量−自発放出量）自発放出量はアッセイ培地のみの中の標的細胞から測定し、そして最大放出量は１ＭのHClの中での対応の数の標的細胞の溶解後に測定した。溶解度はLS136／MFE23／５ダイアボディー及びミエローマ3C52′CL IgG1λの両方の希釈率に比例することが見い出された。ダイアボディーもしくは IgG1λのいづれか抜きでは、又は腫瘍細胞の代わりにphOx-BSAコート化赤血球を用いると、溶解は認められなかった（バックグランド溶解を除き）。従って、このダイアボディーは、IgG1λ抗体により誘導されるADCC活性を、このダイアボディーの一方のアームが特異的となっている抗原をコードする腫瘍細胞に向けさせることができる。実施例５：回転代謝溶解を媒介させるための抗体のin vivoリターゲッティング二価ダイアボディーLS136／MFE23／５はヌードマウスの異種移植したCEA⁺アデノ癌腫LS174Tの処置に有用である。ヌードマウスはＴ細胞を欠き、そして異種外植したヒト腫瘍の増殖を可能にする。しかしながら、それらは正常なＢ細胞及び正常な血清Igレベルを有し、そしてそれらは正常なＴ非依性免疫応答、例えば一定の抗体応答を示す。 in vivo用途のため、ダイアボディーを実施例３に記載の通りに発現及び精製し、そしてエンドトキシン(LPS)を除くために更にPharmacia Superdex７（商標）16／60で精製した。 Balb／ｃヌードマウスに有意義な数のLS174T腫瘍細胞（例えば5000個）を１日目に注射し（例えばｉ．ｖ．）、そしてその後リン酸緩衝食塩水(PBS)中の所望量のダイアボディー（例えば100μｇ）の一回又は数回のｉ．ｖ．注射で処置した。この設定において、血清Igはダイアボディーに対して過剰であり、その結果 Igの大半は一個のダイアボディーにしか複合しないであろう。別のプロトコールにおいては、複数個のダイアボディーを血清Igの任意の物質と複合させ、標的抗原に対する高い所望の結合性の利点を得る。これは注射前に血清Igとインキュベートしておくことにより達し得る。マウスからの好適な量の血清を取り出した後（例えば100μｌ；幼若なBalb／ｃマウスの総血清Igλ濃度は＜１mg／mlである）、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の所望量のダイアボディー（例えば100μｇ）を加え、in vitroで混合し、そしてその血清とダイアボディーとをインキュベーションし、ダイアボディーを血清Igに結合させ、次いでマウスに再注入する。二価LS136／MFE23／５ダイアボディーは、総血清Igの＜５％を占めるIgをもつ λ軽鎖を標的とする。しかしながら、血清IgλのレベルはＴ−細胞非依存性応答を誘引する一定の抗原、例えばデキストランによる感作によって大幅に増強される。処置法（上記）の効率は、Igλレベルがダイアボディーの投与前に何らかの方法で増強されている場合、向上しうる。強化された抗体特異性は標的抗原に対しては特異的でないことにも注目すべきであり、なぜなら免疫は無関係な抗原により行われたものであるからである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１１月９日【補正内容】請求の範囲１．抗原性標的に対する抗体媒介式エフェクター機能を補強するための方法であって、抗−抗体結合特異性と標的に対する非共有結合特異性とを有する多価結合性物質を抗体及び前記標的に結合させて、この結合した抗体にそのエフェクター機能を媒介させる方法。２．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項１記載の方法。３．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項２記載の方法。４．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る先の請求項のいづれか１項記載の方法。５．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項４記載の方法。６．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項５記載の方法。７．前記標的がヒト細胞である、先の請求項のいづれか１項記載の方法。８．抗原標的に対する抗体媒介式エフェクター機能の補強における多価結合性物質の利用であって、この結合性物質が抗−抗体結合特異性と標的に対する非共有結合特異性とを有する、前記利用。９．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項８記載の利用。 10．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項９記載の利用。 11．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る請求項８〜10のいづれか１項記載の利用。 12．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項11記載の利用。 13．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項12記載の利用。 14．前記標的がヒト細胞である、請求項８〜13のいづれか１項記載の方法。 15．多価結合性物質であって、抗−抗体結合特異性を有する結合性部位と抗原性標的に対する非共有結合特異性を有する結合性部位とを有し、且つポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインをイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、その結合性部位はこの多量体における一のポリペプチドの第一ドメインとこの多量体における別のポリペプチドの第二ドメインとの会合により形成されるものである、前記多価結合性物質。 16．前記ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項15記載の方法。 17．抗体をその抗体が結合特異性を有していない標的に対して結合させる方法であって、請求項15又は16記載の多価結合性物質を抗体及び前記標的に結合させることを含んで成る方法。 18．標的に対する抗体媒介式エフェクター機能の補強のための医薬品の製造における、抗−抗体結合特異性とこの抗原性標的に対する非共有結合特異性とを有する多価結合性物質の利用。 19．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項19記載の利用。 20．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項19記載の利用。 21．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る請求項18 〜20のいづれか１項記載の利用。 22．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項21記載の利用。 23．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項22記載の利用。 24．前記標的がヒト細胞である、請求項18〜23のいづれか１項記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９４１２１６６．２ (32)優先日 1994年６月17日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．標的に対する抗体媒介式エフェクター機能を補強するための方法であって、抗−抗体結合特異性と標的に対する結合特異性とを有する多価結合性物質を抗体及び前記標的に結合させて、この結合した抗体にそのエフェクター機能を媒介させる方法。２．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項１記載の方法。３．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項２記載の方法。４．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る先の請求項のいづれか１項記載の方法。５．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項４記載の方法。６．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項５記載の方法。７．前記標的がヒト細胞である、先の請求項のいづれか１項記載の方法。８．標的に対する抗体媒介式エフェクター機能の補強における多価結合性物質の利用であって、この結合性物質が抗−抗体結合特異性と標的に対する結合特異性とを有する、前記利用。９．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項８記載の利用。 10．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項９記載の利用。 11．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る請求項８〜10のいづれか１項記載の利用。 12．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項11記載の利用。 13．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項12記載の利用。 14．前記標的がヒト細胞である、請求項８〜13のいづれか１項記載の方法。 15．多価結合性物質であって、抗−抗体結合特異性を有する結合性部位と標的に対する結合特異性を有する結合性部位とを有し、且つポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインをイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、その結合性部位はこの多量体における一のポリペプチドの第一ドメインとこの多量体における別のポリペプチドの第二ドメインとの会合により形成されるものである、前記多価結合性物質。 16．前記ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項15記載の方法。 17．抗体をその抗体が結合特異性を有していない標的に対して結合させる方法であって、請求項15又は16記載の多価結合性物質を抗体及び前記標的に結合させることを含んで成る方法。 18．標的に対する抗体媒介式エフェクター機能の補強のための医薬品の製造における、抗−抗体結合特異性と標的に対する結合特異性とを有する多価結合性物質の利用。 19．前記抗−抗体結合特異性がアイソタイプ特異性である、請求項19記載の利用。 20．前記抗−抗体結合特異性が１又は複数種のアイソタイプの定常領域に対する特異性である、請求項19記載の利用。 21．前記結合性物質がイムノグロブリン結合性ドメインを含んで成る請求項18 〜20のいづれか１項記載の利用。 22．前記結合性物質がポリペプチドの多量体を含んで成り、各ポリペプチドはイムノグロブリン重鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第一ドメインとイムノグロブリン軽鎖可変領域の結合性領域を含んで成る第二ドメインとを有し、この多量体内での第一ドメインと第二ドメインとの会合が抗原結合性部位を形成している、請求項21記載の利用。 23．前記各ポリペプチドの第一ドメインが、そのポリペプチドの第二ドメインと会合して抗原結合性部位を形成することができない、請求項22記載の利用。 24．前記標的がヒト細胞である、請求項18〜23のいづれか１項記載の利用。