KR20230166075A - Ror1 및 cd3에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체 - Google Patents

Ror1 및 cd3에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개와, CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개를 포함하되, 면역글로불린 Fc 영역은 포함하지 않는 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 다중 특이적 항체를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터(들), 상기 핵산 또는 상기 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포(들), 그리고 상기 다중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기 다중 특이적 항체를 포함하는 약학 조성물과, 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

ROR1 및 CD3에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체
본 발명은 ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인 (ROR1-BD) 1개 또는 2개와, CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개를 포함하되, 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지 않는 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 다중 특이적 항체를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터(들), 상기 핵산 또는 상기 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포(들), 그리고 상기 다중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 다중 특이적 항체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
티로신-단백질 키나아제 경막 수용체 ROR1은 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체(Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor; ROR) 과의 일원이다. ROR1 수용체의 세포외 도메인은 변별적 도메인 3개, 즉 막 원위 면역글로불린 유사 도메인, 개입 곱슬 도메인(intervening Frizzled domain) 및 막 근위 크링글 도메인(membrane-proximal Kringle domain)으로 이루어져 있다. ROR1은 배발생 동안 필요한 암 태아 항원이다. ROR1 동형접합성 녹아웃(knockout)이 발생한 마우스는 호흡 기능장애로 말미암아 출산전후에 폐사한다(Borcherding et al 2014). 정상 성체 조직일 경우 ROR1 발현은 지방 조직, 췌장내 및 폐내 임의의 세포뿐 아니라, 중간 B세포 하위세트에 한정된다(Baskar et al 2008; Hudecek et al 2010; Bicocca et al., 2012). 그러나, 이는 다수의 혈액암 및 고형암뿐 아니라 암 줄기세포 하위세트에서도 발현된다. 게다가 몇몇 연구는, ROR1이 암의 진행과 전이에 중요한 역할을 함을 입증하였다(예컨대 문헌(Cui et al., 2013)을 참조한다). 그러므로 ROR1은 종양 특이적 치료에 매력적인 표적이다.
ROR1은 Wnt5a 및 NKX1-2일 것으로 생각되는 자체의 리간드와의 결합을 통해 신호를 매개하는 세포 표면 단백질이다. Wnt5a는 ROR1의 세포외 부분에서 곱슬 도메인과 결합하고, 형질감염된 세포에서는 NF-kB의 활성화와, 정상 세포주 및 폐종양 세포주의 증식을 조정하는 것으로 보였다. NKX1-2와 ROR1의 결합은 키나아제 의존 기작 및 키나아제 독립 기작 둘 다를 통해 폐암 세포주의 생존에 어떤 역할을 하는 것으로 보였다.
분화 클러스터 3(CD3)은 T 세포 활성화에 필요한 임의의 T 세포 표면에 발현되는 I형 경막 단백질이다. 이는 T 세포 수용체(TCR) 복합체 형성에 참여하고, 이 복합체의 다른 도메인들과 상호작용한다. 포유동물에서, CD3은 3개의 변별적 사슬(γ, δ 및 ε, 그리고 ζ2(CD247) 사슬 또는 ζ/η 사슬 중 어느 하나를 가진다. CD3-사슬 및 ζ-사슬은 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체라 공지된 것을 형성한다. CD3에 대한 항체, 예컨대 CD3ε에 대한 항체는 T 세포상 CD3 클러스터형성을 유도하여, T 세포 활성화를 초래하는 것으로 보인다.
ROR1 및 CD3을 표적화하는 몇몇 2중 특이적 항체는 선행 기술에 기재된 바 있다.
예를 들어 WO 2017/127499(A1)에는, ROR1 세포외 도메인의 크링글 도메인, 곱슬 도메인 또는 Ig 유사 도메인중 어느 하나와 특이적으로 결합하는 2중 특이적 항 ROR1xCD3 항체, 즉 DuoBody® 분자가 개시되어 있다. DuoBody® 분자는, ROR1 발현 변형 SK-MES-1 세포의 T 세포 유도성 사멸에 대해 0.2 nM ~ 17 nM 범위의 EC50값을 보이되, 최대 사멸률은 통상적으로 20% ~ 40% 범위이다. 개선된 2중 특이적 항 ROR1xCD3 DuoBody® 분자 RORxCD3 D1 및 ROR1xCD3 D2는, ROR1 발현 암세포 MAVER-1, JeKo-1 및 Z-138의 T 세포 유도성 사멸에 대해 0.2 nM ~ 1 nM 범위의 EC50값을 보이되, 최대 사멸률은 통상적으로 50% 이하이다.
WO 2017/142928(A1)에는 2개의 표적 항원에 대한 특이성을 가지는 2개의 가교 및 이황화 안정화 Fv 결합 도메인으로 이루어져 있으며, 면역글로불린 Fc 영역과 연결된 항 ROR1xCD3 2중 특이적 다이아바디(DART®포맷)가 개시되어 있다. 상이한 ROR1 발현 암 세포주들에 대한 항체로서, 이러한 DART 항체 몇 가지에 대한 T 세포 유도 세포독성 시험이 추가로 개시되어 있다. 이러한 암세포 사멸에 대한 EC50 값은, 통상적으로 10 pM ~ 100 pM의 범위이되, 최대 사멸률은 통상적으로 10% ~ 40%이지만, 몇 가지 예외가 있다. 그러나, 최대 사멸률이 60%보다 약간 더 높은 예는 단지 1가지만이 확인되었다. 최선의 DART 항체 DART-D의 경우 EC50 값은 1.3 pM ~ 56 pM 범위인 것으로 보고되었다.
WO 2019/008379(A1)에는 항 ROR1xCD3 2중 특이적 BiTE, 즉 짧은 링커를 통해 연결된 scFv 단편 2개로 이루어진 2중 특이적 항체가 개시되어 있다. 예시된 최선의 BiTE로서는, 농도가 0.01 마이크로그램/ml일 때 ROR1-양성 B-1643 및 B-7 신경모세포종 세포의 유의미한 세포독성을 보이는 클론 F가 있다.
WO 2020/237173(A1)에는 상이한 2중 특이적 IgG 기반 구성 5가지를 가지는 항 ROR1xCD3 2중 특이적 항체가 개시되어 있다. 이 IgG 기반 2중 특이적 항체들 중 20가지가 제조되었으며, 이것들이 다양한 ROR1 발현 암세포의 T 세포 매개 사멸을 유도하는 능력 및 내부화에 대해 분석되었다. 20가지 구조체 모두는 상이한 속도에서일지라도 내부화되었다. 20가지 구조체는 상기 ROR1 발현 암세포의 T 세포 매개 사멸에 대해, 통상 낮은 수준의 pM ~ 50 pM 범위의 EC50 값을 보이되, 최대 사멸률은 10% ~ 50%였다. 최대 사멸률이 60%를 초과하는 단 하나의 예가 보고되었다.
WO 2014/167022(A1) 및 후속 특허출원 WO 2016/055592(A1)에는, 인간 CD3와 특이적으로 결합하는 Fab 단편 1개와, 인간 ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 추가의 Fab 단편 1개 또는 2개를 포함하되, 세포 기반 검정에서 낮은 속도의 내부화를 보이는 2중 특이적 항체가 개시되어 있다. ROR1에 대해 1가 또는 2가이고, 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 2중 특이적 항체 구조체가 예시되었으며, 이는 내부화 실험의 대상이었다. 내부화 실험의 결과는, ROR1에 대해 2가인 항체 구조체가 ROR1에 대해 1가인 대응 항체 구조체보다 더 빠른 내부화 속도를 원발성 B-CLL 세포에서 보였음을 나타낸다. ROR1 발현 RPMI8226 MM 표적 세포에 대한 2중 특이적 항체가 사용되는 T 세포 유도 세포독성 시험은, 항체 농도 100 pM 일 때 최대 표적 세포 용해율이 30% ~ 40%임을 입증하였다. WO 2016/055592(A1)에는 ROR1에 대해 2가로서, 개선된 항체 Mab2-TCBcv가 사용되는 T 세포 유도 세포독성 시험(ROR1을 상이한 수준으로 발현하는 몇몇 표적 세포에 대해 시험)가 추가로 개시되어 있다. 데이터는, Mab2-TCBcv가, ROR1을 중간 정도의 수준으로 발현하는 Colo-704 및 OVCAR-5 난소암 세포에 대해서는 20% ~ 50%의 최대 표적 세포 용해율을 보이고, ROR1을 낮은 수준으로 발현하는 SKOV-3 난소암 세포에 대해서는 20%의 최대 표적 세포 용해율을 보임을 나타낸다.
상기 참조문헌에서 알 수 있는 바와 같이, 선행 기술인 항 ROR1xCD3 항체는 종종 ROR1을 낮은 수준으로 발현하는 암세포에 대해 유의미하게 감소한 역가를 보인다. 이외에도, 이러한 선행 기술 항체는 다수의 ROR1 발현 암세포에 대한 세포독성 검정, 구체적으로 ROR1 저발현 암세포에 대한 세포독성 검정에서, 통상 낮은%의 최대 사멸률(종종 50%보다 훨씬 낮음)을 보이는데, 이는 이 선행 기술 항체의 작용 모드가 이상적이지 않음을 나타낸다.
그러므로 신규하고 개선된 항 ROR1xCD3 치료 항체가 명백히 필요한 실정이다.
상기 치료 항체는 ROR1 고발현 암세포뿐 아니라 ROR1을 낮은 수준으로 발현하는 암세포에 대해 역가가 높아야 한다. 더욱이 이 치료 항체는 이와 같은 암세포에 대해 합리적인 최대 사멸률%(예컨대 40% 이상)를 보여야 한다. 이와 동시에 치료 항체는 용량 제한 부작용을 낮은 수준으로 유지하는데 관용 가능한 안전 프로필을 보여야 한다. 뿐 아니라, 상기 치료 항체는 고수율로의 생산가능성과 개발가능성을 가속화하기 위해 월등한 생물물리학적 특성, 예컨대 큰 안정성을 가질 것이 요망된다.
ROR1을 발현하는 암의 치료를 개선하기 위한 의약품을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 구체적으로 ROR1을 낮은 수준으로 발현하는 암세포를 효과적으로 제거할 수 있는 신규하고 개선된 치료 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 작용 모드가 개선된, 즉 ROR1 발현 암세포에 대한 세포독성 검정에서 높은 최대 사멸률%를 보이는 항 ROR1xCD3 항체를 동정하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다. 상기 신규하고 개선된 치료 항체는 또한 관용 가능한 안전 프로필을 보여야 하는데, 즉 건강한 세포에 영향을 미치지 않아야 하거나, 또는 CD3와의 비특이적 결합을 통한 T 세포의 전신 활성화에 의해서 용량 제한 독성을 일으키지 않아야 한다.
본 발명자들은, 본원에 정의된 바와 같은 ROR1을 특이적으로 표적화하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개와, CD3을 특이적으로 표적화하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개, 구체적으로 특정의 서열 특징에 의해 특성규명되는 결합 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체가, ROR1을 높은 수준 ~ 낮은 수준으로 발현하는 암세포를 사멸하는데 있어 놀랍게도 큰 역가를 보임을 발견하였다. 뿐 아니라, 놀랍게도 본원에 정의된 바와 같은 ROR1-BD 1개를 포함하는 상기 다중 특이적 항체는, 통상 최대 사멸률 60%를 보이고, ROR1을 높은 수준 ~ 낮은 수준으로 발현하는 암세포에 대한 T 세포 유도 세포독성 검정에서 더 높은 최대 사멸률을 보임이 확인되었다.
그러므로 제1 양태에서, 본 발명은
a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
- 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지 않고;
- 상기 ROR1-BD는 서로 독립적으로
서열 번호 1의 HCDR1 서열,
서열 번호 2의 HCDR2 서열,
서열 번호 3의 HCDR3 서열,
서열 번호 4의 LCDR1 서열,
서열 번호 5의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 6의 LCDR3 서열로 이루어진 세트; 및/또는
서열 번호 13 또는 14의 HCDR1 서열,
서열 번호 15의 HCDR2 서열,
서열 번호 16의 HCDR3 서열,
서열 번호 17의 LCDR1 서열,
서열 번호 18의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 19의 LCDR3 서열
로 이루어진 세트로부터 선택되는 CDR 서열 세트를 포함하고,
- 상기 CD3-BD는
서열 번호 30의 HCDR1 서열,
서열 번호 31의 HCDR2 서열,
서열 번호 32의 HCDR3 서열,
서열 번호 33의 LCDR1 서열,
서열 번호 34의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 35의 LCDR3 서열
로 이루어진 CDR 서열 세트를 포함하는,
다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제2 양태에 있어, 본 발명은 특이적 ROR1-결합 도메인에 관한 것이다.
제3 양태에 있어, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 특이적 ROR1-결합 도메인을 암호화하는 하나의 핵산 또는 2개의 핵산에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나의 핵산 또는 2개의 핵산을 포함하는, 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명의 한 벡터 또는 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법으로서, (i) 본 발명의 하나의 핵산 또는 2개의 핵산, 또는 본 발명의 하나의 벡터 또는 2개의 벡터를 제공한 다음, 상기 핵산 또는 핵산들, 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시킨 후, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공한 다음, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양한 후, 세포 배양액으로부터 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 수집하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제8 양태에서, 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한 본 발명의 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 질환, 더욱 구체적으로 암, 구체적으로 ROR1을 발현하는 암으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체를, 이러한 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이하 항목들로서 요약된 본 발명의 양태, 유리한 특징 및 바람직한 구현예는 각각 단독으로, 또는 조합되어 본 발명의 과제를 해결하는데 추가로 기여한다:
1. a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
- 상기 ROR1-BD는 서로 독립적으로
서열 번호 1의 HCDR1 서열,
서열 번호 2의 HCDR2 서열,
서열 번호 3의 HCDR3 서열,
서열 번호 4의 LCDR1 서열,
서열 번호 5의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 6의 LCDR3 서열로 이루어진 세트; 및/또는
서열 번호 13 또는 14의 HCDR1 서열,
서열 번호 15의 HCDR2 서열,
서열 번호 16의 HCDR3 서열,
서열 번호 17의 LCDR1 서열,
서열 번호 18의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 19의 LCDR3 서열
로 이루어진 세트로부터 선택되는 CDR 서열 세트를 포함하고,
- 상기 CD3-BD는
서열 번호 30의 HCDR1 서열,
서열 번호 31의 HCDR2 서열,
서열 번호 32의 HCDR3 서열,
서열 번호 33의 LCDR1 서열,
서열 번호 34의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 35의 LCDR3 서열
로 이루어진 CDR 서열 세트를 포함하는,
다중 특이적 항체.
2. 항목 1의 다중 특이적 항체로서, 이 다중 특이적 항체는
a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
를 포함하고,
- 상기 ROR1-BD는 서로 독립적으로
서열 번호 1의 HCDR1 서열,
서열 번호 2의 HCDR2 서열,
서열 번호 3의 HCDR3 서열,
서열 번호 4의 LCDR1 서열,
서열 번호 5의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 6의 LCDR3 서열로 이루어진 세트; 또는
서열 번호 13 또는 14의 HCDR1 서열,
서열 번호 15의 HCDR2 서열,
서열 번호 16의 HCDR3 서열,
서열 번호 17의 LCDR1 서열,
서열 번호 18의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 19의 LCDR3 서열
로 이루어진 세트로부터 선택되는 CDR 서열 세트를 포함하고,
- 상기 CD3-BD는
서열 번호 30의 HCDR1 서열,
서열 번호 31의 HCDR2 서열,
서열 번호 32의 HCDR3 서열,
서열 번호 33의 LCDR1 서열,
서열 번호 34의 LCDR2 서열, 및
서열 번호 35의 LCDR3 서열
로 이루어진 CDR 서열 세트를 포함하는, 다중 특이적 항체.
3. 항목 1 또는 항목 2의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 이하 특징 1) ~ 3), 즉
1) 상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지 않음;
2) 상기 다중 특이적 항체는 CH1 및/또는 CL 영역을 포함하지 않음;
3) 상기 다중 특이적 항체는 인간화된 것으로서, 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 인간화되었고, 토끼 유래 CDR을 포함함
중 1가지 이상을 가지는, 다중 특이적 항체.
4. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는 ROR1의 Ig 유사 도메인과 결합하고/결합하거나 Wnt5α와 ROR1의 결합을 차단하지 않는 다중 특이적 항체.
5. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체가 ROR1-BD 2개를 포함하는 경우, 상기 ROR1-BD 2개는 상이한 CDR 세트 2개를 포함하거나, 즉 ROR1-BD 1개가 서열 번호 1 ~ 6의 CDR을 포함하고, 또 다른 ROR1-BD 1개는 서열 번호 13/14 ~ 19의 CDR을 포함하거나, 또는 상기 ROR1-BD 2개는 동일한 CDR 세트를 포함하거나, 즉 ROR1-BD 둘 다중 어느 하나는 서열 번호 1 ~ 6의 CDR 또는 서열 번호 13/14 ~ 19의 CDR을 포함하고, 구체적으로 상기 ROR1-BD 2개는 동일한 CDR 세트를 포함하는, 다중 특이적 항체.
6. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 다중 특이적 항체는 3중 특이적인, 다중 특이적 항체.
7. 항목 6의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(hSA-BD) 1개를 포함하는, 다중 특이적 항체.
8. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 다중 특이적 항체는 3중 특이적 및 3가이거나, 또는 3중 특이적 및 4가인, 다중 특이적 항체.
9. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체의 포맷은 탠덤 트리-scFv(트리플바디; triplebody); 트리아바디; scDb-scFv; 이종이량체 Fc 도메인 이외의 이종이량체화 도메인의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 scDb-scFv 또는 탠덤 트리-scFv; 및 MATCH로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중 특이적 항체.
10. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체의 포맷은 scDb-scFv, scMATCH3, MATCH3 및 MATCH4로부터 선택되는 다중 특이적 항체.
11. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개 각각은 scFv 포맷일 때
a. 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면 1 pM ~ 2 nM의 1가 해리상수(KD), 구체적으로 1 pM ~ 1　nM, 구체적으로 1 pM ~ 500 pM의 KD로 인간 ROR1의 세포외 도메인과 결합하고;
b. 5　pM ~ 10　nM의 EC50, 구체적으로 5　pM ~ 5　nM의 EC50, 구체적으로 5　pM ~ 4　nM의 EC50, 구체적으로 5　pM ~ 3　nM의 EC50으로 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포와 결합하고;
c. 시차주사형광도측정법(DSF)에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 58℃, 구체적으로 적어도 59℃, 구체적으로 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 61℃이고[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨];
d. 상기 scFv 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주 동안 4℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 3% 미만, 구체적으로 2% 미만, 구체적으로 1% 미만이고/미만이거나[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨];
e. 상기 scFv 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주 동안 40℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 10% 미만이고/미만이거나[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨];
f. 상기 scFv의 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 후의 단백질 함량 감소율이 1% 미만인[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨], 다중 특이적 항체.
12. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는 VH1a, VH1b, VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4를 포함하는 다중 특이적 항체.
13. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는 하기 특징 1) 및 2), 즉
1) Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되고, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 틀 영역 FR1, FR2 및 FR3와, Vλ FR4로부터 선택되거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4인 틀 FR4를 포함하는 VL 도메인;
2) VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되고, 구체적으로 VH3 아형의 것인 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 VH 도메인이되, 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가지는 VH 도메인
중 하나 또는 둘 다를 추가로 가지는 다중 특이적 항체.
14. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
a) 서열 번호 7 및 10으로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 9 및 12로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열;
또는
a) 서열 번호 20, 23, 26 및 28로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 22, 25, 27 및 29로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열; 또는
a) 서열 번호 8 및 11로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 9 및 12로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열; 또는
a) 서열 번호 21 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 22 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열
을 포함하는 다중 특이적 항체.
15. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
a) 서열 번호 7, 20 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 9, 22 및 27로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열; 또는
a) 서열 번호 8, 11 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 9, 12 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
16. 항목 1 내지 항목 14중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
a) 서열 번호 7 및 10으로부터 선택되는 VH 서열,
b) 서열 번호 9 및 12로부터 선택되는 VL 서열; 또는
a) 서열 번호 20, 23, 26 및 28로부터 선택되는 VH 서열,
b) 서열 번호 22, 25, 27 및 29로부터 선택되는 VL 서열; 또는
a) 서열 번호 8, 11 및 14로부터 선택되는 VH 서열,
b) 서열 번호 9, 12 및 25로부터 선택되는 VL 서열
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
17. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
a) 서열 번호 7의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
b) 서열 번호 10의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
c) 서열 번호 20의 VH 서열 및 서열 번호 22의 VL 서열; 또는
d) 서열 번호 23의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
e) 서열 번호 8의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
f) 서열 번호 11의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
g) 서열 번호 21의 VH 서열 및 서열 번호 22의 VL 서열; 또는
h) 서열 번호 24의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
i) 서열 번호 26의 VH 서열 및 서열 번호 27의 VL 서열; 또는
j) 서열 번호 28의 VH 서열 및 서열 번호 29의 VL 서열
을 포함하고, 구체적으로 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
a) 서열 번호 7의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
b) 서열 번호 10의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
c) 서열 번호 23의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
d) 서열 번호 8의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
e) 서열 번호 11의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
f) 서열 번호 24의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
18. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 CD3ε과 결합하는, 다중 특이적 항체.
19. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 scFv 포맷일 때
a) SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 50　nM 미만의 해리상수(KD), 구체적으로 0.1 nM ~ 50　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 30 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 KD로 인간 CD3ε과 결합하고;
b) SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 50　nM 미만의 KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 50　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 30 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 KD로 마카카 파스큘라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스(Cynomolgus)) CD3과 결합하고;
c) 시차주사형광도측정법(DSF)에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 65℃, 더욱 구체적으로 적어도 67℃인, 다중 특이적 항체.
20. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 VH1a, VH1b, VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
21. 항목 18 ~ 20의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 이하 특징 1) 및 2), 즉
1) Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되고, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 틀 영역 FR1, FR2 및 FR3와, Vλ FR4로부터 선택되거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4인 틀 FR4를 포함하는 VL 도메인;
2) VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되고, 구체적으로 VH3 아형의 것인 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 VH 도메인이되, 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가지는 VH 도메인
중 하나 또는 둘 다를 가지는, 다중 특이적 항체.
22. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는
a) 서열 번호 36 또는 37로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
b) 서열 번호 38로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
23. 항목 22의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는
a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
b) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
24. 항목 22 또는 23의 다중 특이적 항체로서, 상기 VH 서열은 C51 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하고, 상기 VL 서열은 C141 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하는, 다중 특이적 항체.
25. 항목 7의 다중 특이적 항체로서, 상기 hSA-BD는
(i) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되거나, 구체적으로 VH3 아형의 것인 인간 VH 틀 서열 FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함하되; 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 선택적으로 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가지고;
(ii) 서열 번호 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각과, Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되거나, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 인간 항체 VL 틀 서열 FR1, FR2 및 FR3, 그리고 Vλ FR4 서열이거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4 서열, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4 서열인 인간 항체 VL 틀 FR4 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열 번호 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되거나, 구체적으로 VH3 아형의 것인 인간 VH 틀 서열 FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함하되; 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 선택적으로 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가지고;
(ii) 서열 번호 52, 53 및 54의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각과, Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되거나, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 인간 항체 VL 틀 서열 FR1, FR2 및 FR3, 그리고 Vλ FR4 서열이거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4 서열, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4 서열인 인간 항체 VL 틀 FR4 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열 번호 59, 60 및 61의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되거나, 구체적으로 VH3 아형의 것인 인간 VH 틀 서열 FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함하되; 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 선택적으로 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가지고;
(ii) 서열 번호 62, 63 및 74의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각과, Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되거나, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 인간 항체 VL 틀 서열 FR1, FR2 및 FR3, 그리고 Vλ FR4 서열이거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4 서열, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4 서열인 인간 항체 VL 틀 FR4 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
26. 항목 7 또는 25의 다중 특이적 항체로서, 상기 hSA-BD는
(i) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(ii) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iii) 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iv) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(v) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(vi) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(vii) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(viii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
27. 항목 7 또는 25의 다중 특이적 항체로서, 상기 hSA-BD는
(i) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(ii) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iii) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iv) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 다중 특이적 항체.
28. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 결합 도메인은 Fab, F(ab)2, Fv, scFv, dsFv 및 scAb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 구체적으로 Fv, scFv, 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 다중 특이적 항체.
29. 항목 28의 다중 특이적 항체로서, 상기 결합 도메인 각각은
a) VL 도메인 및 VH 도메인의 동족 쌍(Fv 단편); 또는
b) 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인의 동족 쌍(scFv 단편)
으로부터 독립적으로 선택되는, 다중 특이적 항체.
30. 항목 1 내지 29중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서,
a) ROR1-BD 1개;
b) CD3-BD 1개; 및
c) hSA-BD 1개
를 포함하는, 다중 특이적 항체.
31. 항목 30의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 단일 사슬 단백질이고, 상기 단일 사슬 단백질은
(i) 제1 VL 도메인,
(ii) 제1 폴리펩티드 링커,
(iii) 제1 VH 도메인,
(iv) 제2폴리펩티드 링커,
(v) 제2 VL 도메인
(vi) 제3 폴리펩티드 링커, 및
(vii) 제2 VH 도메인
이 진술된 순서로 나란히 배열되어 이루어진 아미노산 서열을 포함하되,
상기 제1 VL 도메인은 상기 VH 도메인과 결합하여 제1 결합 도메인을 형성하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하여 제2 결합 도메인을 형성하고,
상기 단일 사슬 단백질은
(viii) 제4 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인에 의해 형성되되, 제5 폴리펩티드 링커를 통해 C 말단 또는 N 말단에서 상기 아미노산 서열과 융합되는 제3 결합 도메인
을 추가로 포함하며,
상기 결합 도메인 3개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 ROR1과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개;
b) CD3과 특이적으로 결합하는 또 다른 결합 도메인(CD3-BD); 및
c) hSA와 특이적으로 결합하는 나머지 결합 도메인(hSA-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
32. 항목 31의 다중 특이적 항체로서, 결합 도메인 3개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인(hSA-BD)중 1개;
b) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인(CD3-BD) 중 다른 1개; 및
c) ROR1과 특이적으로 결합하는 제3 결합 도메인(ROR1-BD)을 가지고;
구체적으로 결합 도메인 3개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인(hSA-BD);
b) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인(CD3-BD); 및
c) ROR1과 특이적으로 결합하는 제3 결합 도메인(ROR1-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
33. 항목 30의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 제1 단일 사슬 단백질과 제2 단일 사슬 단백질을 포함하는 이종이량체 단백질이되,
상기 제1 단일 사슬 단백질은 N 말단으로부터 C 말단 방향으로
(ia) 제1 VL 도메인
(iia) 제1 폴리펩티드 링커, 및
(iiia) 제2 VL 도메인
으로 이루어진 제1 아미노산 서열을 포함하고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 N 말단으로부터 C 말단 방향으로
(ib) 제1 VH 도메인,
(iib) 제2 폴리펩티드 링커, 및
(iiib) 제2 VH 도메인
으로 이루어진 제2 아미노산 서열을 포함하며,
상기 제1 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인 또는 상기 제2 VH 도메인중 어느 하나와 결합하여 제1 결합 도메인을 형성하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 VH 도메인 또 다른 하나와 결합하여 제2 결합 도메인을 형성하고,
상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질중 적어도 1개는
(iv) 제3 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인에 의해 형성되되, 제4 폴리펩티드 링커를 통해 상기 제1 아미노산 서열 또는 상기 제2 아미노산 서열과 융합되는 제3 결합 도메인
을 추가로 포함하며,
상기 결합 도메인 3개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개;
b) ROR1과 특이적으로 결합하는 또다른 결합 도메인(ROR1-BD); 및
c) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 나머지 결합 도메인(hSA-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
34. 항목 30 내지 33중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는
a. 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면 5 nM 미만의 1가 해리상수(KD), 구체적으로 1 pM ~ 5　nM의 1가 KD, 구체적으로 1 pM ~ 1　nM, 구체적으로 1 pM ~ 500 pM의 KD로 인간 ROR1의 세포외 도메인과 결합하고;
b. SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 20 nM 미만의 (1가) KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 20　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 1가 KD로 인간 CD3ε과 결합하고;
c. 마카카 파시큘라리스(사이노몰거스) CD3ε과 교차 반응성으로서, 구체적으로 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 30　nM 이하의 1가 KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 30　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 20 nM의 1가 KD로 사이노몰거스 CD3ε과 결합하고/결합하거나;
d. 0.01 nM ~ 50 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 30 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 20 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 10 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 5 nM의 EC50으로 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포와 결합하거나;
e. 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면, 상기 표적 세포 사멸에 대한 EC50이 5　nM 미만, 구체적으로 1 pM ~ 5 nM, 구체적으로 1　pM ~ 2　nM, 구체적으로 1 pM ~ 1 nM이거나;
f. 시차주사형광도측정법에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 55℃, 바람직하게 적어도 58℃, 더욱 바람직하게 적어도 60℃이거나[단 구체적으로 상기 항원 결합 단편은 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)임];
g. 상기 scFv 출발 농도가 1　mg/ml일 때, 4주 동안 4℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 1% 미만, 예컨대 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만이고/미만이거나[단 구체적으로 상기 scFv는 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중에 제제화됨]; 및/또는
h. scFv 출발 농도가 1　mg/ml일 때, 4주 동안 40℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 예컨대 4% 미만[단 구체적으로 상기 scFv는 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중에 제제화됨]인, 다중 특이적 항체.
35. 항목 30, 31, 33 및 34중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 서열 번호 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 107 및 108에 의해 정의되는 항체로부터 선택되는, 다중 특이적 항체.
36. 항목 1 내지 29중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는
a) ROR1-BD 2개;
b) CD3-BD 1개; 및
c) hSA-BD 1개
를 포함하는, 다중 특이적 항체.
37. 항목 36의 다중 특이적 항체로서, ROR1-BD 2개는 ROR1의 세포외 도메인상 동일한 에피토프 또는 ROR1의 세포외 도메인상 상이한 에피토프, 구체적으로 ROR1의 세포외 도메인상 동일한 에피토프와 결합하는, 다중 특이적 항체.
38. 항목 36 또는 37의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 제1 단일 사슬 단백질 및 제2 단일 사슬 단백질을 포함하는 이종이량체 단백질이고, 상기 제1 단일 사슬 단백질은 N 말단으로부터 C 말단 방향으로
(ia) 제1 VL 도메인
(iia) 제1 폴리펩티드 링커, 및
(iiia) 제2 VL 도메인
으로 이루어진 제1 아미노산 서열을 포함하고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 N 말단으로부터 C 말단 방향으로
(ib) 제1 VH 도메인,
(iib) 제2 폴리펩티드 링커, 및
(iiib) 제2 VH 도메인
으로 이루어진 제2 아미노산 서열을 포함하며,
상기 제1 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인 또는 상기 제2 VH 도메인중 어느 하나와 결합하여 제1 결합 도메인을 형성하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 VH 도메인 또 다른 하나와 결합하여 제2 결합 도메인을 형성하고,
상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질중 적어도 1개는
(iv) 제3 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인에 의해 형성되되, 제4 폴리펩티드 링커를 통해 상기 제1 아미노산 서열 또는 상기 제2 아미노산 서열과 융합되는 제3 결합 도메인
을 추가로 포함하며,
상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질중 적어도 1개는
(v) 제5 폴리펩티드 링커를 통해 연결되는 제4 VL 도메인 및 제4 VH 도메인에 의해 형성되되, 제6 폴리펩티드 링커를 통해 상기 제1 아미노산 서열 또는 상기 제2 아미노산 서열과 융합되는 제4 결합 도메인
을 추가로 포함하고,
결합 도메인 4개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개;
b) ROR1과 특이적으로 결합하는 또다른 결합 도메인(ROR1-BD) 2개; 및
c) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 나머지 결합 도메인(hSA-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
39. 항목 38의 다중 특이적 항체로서, 제3 결합 도메인은 제1 아미노산 서열 또는 제2 아미노산 서열중 1개와 융합되고, 제4 결합 도메인은 상기 아미노산 서열 2개중 다른 하나와 융합되는, 다중 특이적 항체.
40. 항목 38 또는 항목 39의 다중 특이적 항체로서, 결합 도메인 4개는 이하의 특이성, 즉
a) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인(CD3-BD);
b) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인(hSA-BD); 및
c) ROR1과 특이적으로 결합하는 제3 결합 도메인 및 제4 결합 도메인
을 가지는, 다중 특이적 항체.
41. 항목 36 내지 항목 40 중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는
a. 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면 10 nM 미만의 1가 해리상수(KD), 구체적으로 10 pM ~ 5　nM의 1가 KD, 구체적으로 10 pM ~ 7　nM, 구체적으로 10 pM ~ 5　nM의 KD로 인간 ROR1의 세포외 도메인과 결합하고;
b. SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 20 nM 미만의 1가 KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 20　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 1가 KD로 인간 CD3ε과 결합하고;
c. 마카카 파시큘라리스(사이노몰거스) CD3ε과 교차 반응성으로서, 구체적으로 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 30　nM 이하의 1가 KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 30　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 20 nM의 1가 KD로 사이노몰거스 CD3ε과 결합하고;
d. 0.01 nM ~ 10 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 10 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 5 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 3 nM의 EC50, 구체적으로 0.01 nM ~ 2 nM의 EC50으로 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231과 결합하거나;
e. 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면, 상기 표적 세포 사멸에 대한 EC50이 500　pM 미만, 구체적으로 0.1 pM ~ 500 pM, 구체적으로 0.1 pM ~ 200 pM, 구체적으로 0.1 pM ~ 100 pM, 구체적으로 0.1 pM ~ 50 pM이고;
f. 인간 ROR1 발현 JEKO-1 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면, 상기 표적 세포 사멸에 대한 EC50이 20　pM 미만, 구체적으로 0.01 pM ~ 20 pM, 구체적으로 0.01　pM ~ 10 pM, 구체적으로 0.01 pM ~ 5 pM, 구체적으로 0.01 pM ~ 3 pM이고;
g. 인간 ROR1 발현 SKOV-3 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면, 상기 표적 세포 사멸에 대한 EC50이 1000　pM 미만, 구체적으로 0.1 pM ~ 1000 pM, 구체적으로 0.1　pM ~ 500 pM, 구체적으로 0.1 pM ~ 200 pM, 구체적으로 0.1 pM ~ 100 pM이고;
h. 시차주사형광도측정법에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 53℃, 바람직하게 적어도 55℃, 더욱 바람직하게 적어도 58℃이거나[단 구체적으로 상기 항원 결합 단편은 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중에 제제화됨];
i. 상기 다중 특이적 항체 출발 농도가 1　mg/ml일 때, 2주 동안 4℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 1% 미만, 예컨대 0.5% 미만[단 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중에 제제화됨]; 및/또는
j. 상기 다중 특이적 항체의 출발 농도가 1　mg/ml일 때, 적어도 4주 동안 40℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 5% 미만[단 구체적으로 다중 특이적 항체는 300 mM D(+)-수크로스를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중에 제제화됨]인, 다중 특이적 항체.
42. 항목 36 내지 항목 41중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서,
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 95로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 96으로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 97로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 98로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 99로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 100으로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 101로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 102로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 103으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 104로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 105로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 106으로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 109로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 110으로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 111로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 112로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 113으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 114로 이루어져 있거나; 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 115로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 구체적으로 아미노산 서열 서열 번호 116으로 이루어져 있는, 다중 특이적 항체.
43. 항목 32 및 항목 38 내지 항목 41중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 이종이량체 단백질은 상기 제1 VL 및 VH 도메인 및 상기 제2 VL 및 VH 도메인 이외의 제1 단백질성 상호작용 도메인 및 제2 단백질성 상호작용 도메인의 동족 쌍을 포함하지 않고, 상기 제1 단백질성 상호작용 도메인은 상기 제1 단일 사슬 단백질에 포함되고, 상기 제2 단백질성 상호작용 도메인은 상기 제2 단일 사슬 단백질에 포함되는, 다중 특이적 항체.
44. 항목 43의 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질은 평행한 방향으로 이종이량체화되는, 즉 상기 제1 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제2 VH 도메인과 결합하는, 다중 특이적 항체.
45. 항목 43의 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질은 역평행 방향으로 이종이량체화되는, 즉 상기 제1 VL 도메인은 상기 제2 VH 도메인과 결합하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하는, 다중 특이적 항체.
46. 항목 30 내지 항목 45중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 단일 사슬 단백질 또는 이종이량체 단백질에 포함된 임의의 결합 도메인은 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 제2 단일 사슬 단백질에 배열되어 있고, 통상적으로 링커를 통해 연결되는 면역글로불린 가변 도메인인, 다중 특이적 항체.
47. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체 가변 도메인 적어도 1개는 부모 토끼 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는, 다중 특이적 항체.
48. 상기 항목들중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, ROR1-BD, 또는 ROR1-BD 2개가 다중 특이적 항체에 존재하는 경우에는 ROR1-BD 및 CD3-BD중 적어도 1개는 자체의 각각의 항원과 동시에 결합할 수 있거나, 또는 ROR1-BD 2개가 다중 특이적 항체에 존재하는 경우에는 ROR1-BD 둘 다 및 CD3-BD는 자체의 각각의 항원과 동시에 결합할 수 있는, 다중 특이적 항체.
49. 항목 1, 항목 4 및 항목 11 ~ 항목 17중 임의의 것 1개에 정의된 바와 같은 ROR1-BD.
50.
a) 항목 49에 정의된 바와 같은 ROR1-BD 1개 또는 2개;
b) ROR1과 상이한 표적과 특이적으로 결합하는 결합 도메인 적어도 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체.
51. 항목 1 내지 항목 48 및 항목 50중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체 또는 항목 49의 ROR1-BD를 암호화하는 하나의 핵산 또는 2개의 핵산.
52. 항목 51의 하나의 핵산 또는 2개의 핵산을 포함하는 하나의 벡터 또는 2개의 벡터.
53. 항목 52의 하나의 벡터 또는 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들.
54. 항목 1 내지 항목 48중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체 또는 항목 49의 ROR1-BD를 제조하기 위한 방법으로서, (i) 항목 51의 하나의 핵산 또는 2개의 핵산, 또는 항목 52의 한 벡터 또는 2개의 벡터를 제공한 다음, 상기 핵산 또는 핵산들, 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시킨 후, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 항목 53에 의한 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공한 다음, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양한 후, 세포 배양액으로부터 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 ROR1-BD를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
55. 항목 1 내지 항목 48 및 항목 50중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
56. 의약품으로서 사용하기 위한 항목 1 내지 항목 48 및 항목 50중 임의의 것의 다중 특이적 항체.
57. 질환, 구체적으로 인간 질환, 더욱 구체적으로 암으로부터 선택되는 인간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항목 1 내지 항목 48 및 항목 50중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체.
58. 항목 57에 의한 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항목 1 내지 항목 48 및 항목 50중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체로서, 상기 질환은 ROR1 발현 암인 다중 특이적 항체.
59. 항목 58의 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1 발현 암은 만성림프구성백혈병/소림프구림프종(CLL/SLL), 급성골수성백혈병(AML), 급성림프아구성백혈병(ALL), 맨틀세포림프종(MCL), 모양세포백혈병, 소포림프종(FL), 변연부림프종(MZL), 확산성거대B세포림프종(DLBCL), 비호지킨림프종(NHL), 리히터증후군(RS), 폐암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 유방암, 난소암, 교모세포종, 고환암, 자궁암, 부신암, 흑색종, 신경모세포종, 육종 및 신암으로부터 선택되는 다중 특이적 항체.
60. 질환, 구체적으로 인간 질환, 더욱 구체적으로 암으로부터 선택되는 인간 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 항목 1 내지 항목 48중 임의의 것 1개의 다중 특이적 항체를, 이러한 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
61. 항목 60의 방법으로서, 상기 질환은 ROR1 발현 암인 방법.
62. 항목 61의 방법으로서, 상기 ROR1 발현 암은 만성림프구성백혈병/소림프구림프종(CLL/SLL), 급성골수성백혈병(AML), 급성림프아구성백혈병(ALL), 맨틀세포림프종(MCL), 모양세포백혈병, 소포림프종(FL), 변연부림프종(MZL), 확산성거대B세포림프종(DLBCL), 비호지킨림프종(NHL), 리히터증후군(RS), 폐암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 유방암, 난소암, 교모세포종, 고환암, 자궁암, 부신암, 흑색종, 신경모세포종, 육종 및 신암으로부터 선택되는 방법.
도 1은 MDA-MB-231 세포상에서 발현되는 인간 ROR1, 그리고 ROR1 음성 MCF-7 세포에 대한 항 ROR1 scFv PRO2060(A, B) 및 PRO2062의 대표적인 농도-반응 곡선(유세포분석)을 보여준다. PRO2060 및 PRO2062는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면(A, C), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 관찰되지 않았다(B, D). 참조기준 Fab 단편 PRO2213과는 비교되게, PRO2060은 약 3배 더 작은 EC50 결합을 보였으며, PRO2062은 약 3배 더 큰 EC50 결합을 보였다. 도면의 데이터 점들은 기술상 2회 중복실험결과의 평균을 나타낸다.
도 2는 MDA-MB-231 세포상에서 발현되는 인간 ROR1, 그리고 ROR1 음성 MCF-7 세포에 대한, 최적화 항 ROR1 scFv PRO2271(A, B)뿐 아니라 PRO2291 및 PRO2292(C, D)의 농도-반응 곡선(유세포분석)을 보여준다. scFv 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면(A, C), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 관찰되지 않았다(B, D). PRO2062와는 비교되게, 최적화된 PRO2271은 약 2배 더 작은 EC50 결합을 보였다. 안정화를 위한 VL - VH 도메인간 이황화 결합을 포함하는 PRO2060 및 PRO2062의 변이체, PRO2291 및 PRO2292는 PRO2060 및 PRO2062와 비교되었을 때 유사한 EC50 결합을 보였다. 도면의 데이터 점들은 기술상 2회 중복실험결과의 평균을 나타낸다.
도 3은 3중 특이적 scMATCH3 포맷을 나타내는 도해를 보여준다.
도 4는 MDA-MB-231 세포상에 발현되는 인간 ROR1, 그리고 ROR1 음성 MCF-7 세포에 대한 항 ROR1xhSAxCD3 scMATCH3 분자 PRO2286, PRO2287(A, B) 및 PRO2257(C, D)의 농도-반응 곡선(유세포분석)을 보여준다. 3개의 scMATCH3 분자 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면(A, C), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 관찰되지 않았다(B, D). PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 포함되었다. 도면의 데이터 점들은 기술상 2회 중복실험결과의 평균을 나타낸다.
도 5는 MDA-MB-231 세포상에 발현되는 인간 ROR1 및 ROR1 음성 MCF-7 세포에 대한 항 ROR1xhSAxCD3 scMATCH3 분자 PRO2507, PRO2508, PRO2509, PRO2510 및 PRO2668의 농도-반응 곡선(유세포분석)을 보여준다. scMATCH3 분자 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면 (A, B, C), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 관찰되지 않았다(D). PRO2510의 최적화된 변이체, PRO2668은 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면(E), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 관찰되지 않았다(F). PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 포함되었다. 도면의 데이터 점들은 기술상 2회 중복실험결과의 평균을 나타낸다.
도 6은 MDA-MB-231 세포 및 MCF7 세포의 ROR1 발현 및 결합 부위 정량화 결과를 보여준다. (A) ROR1 발현 수준은 명시된 종양 세포의 ROR1 항체 염색후 유세포분석에 의해 확정되었다. 파란색 히스토그램은 ROR1 발현을 나타내는 반면, 대조군은 빨간색으로 명시되어 있다. (B) ROR1 표면 수준은 Quantum Simply Cellular 항 마우스 IgG 키트를 사용하여 정량되었다. 숫자는 세포 표면상에서 산정된 결합 부위의 수를 나타낸다.
도 7은 ROR1-표적화 scMATCH3 분자에 의하여 매개되는 세포독성 및 CD8 T 세포 활성화를 보여준다. (A) PBMC는 효과기 대 표적 비 10:1로 40시간 동안 MDA-MB-231 세포(상단) 또는 MCF7 세포(하단)중 어느 하나와 함께 공동배양되었다. 대조군은 표적 세포만을 단독으로 포함하였을 뿐 아니라(자발적 용해), 실험 개시시 또는 실험 막바지에 1% Triton으로 처리된 표적 세포도 포함하였다. (A)에 도시된 데이터 세트로부터 CD69+ 세포의 출현빈도로 보인 바와 같은 CD8 T 세포 활성화(B) 및 CD4 T 세포 활성화(C). 3회중 대표적으로 1회의 실험을 보였다.
도 8은 ROR1 표적화 scMATCH3 분자에 의해 매개된 세포독성 및 CD8 T 세포 활성화를 보여준다. (A) PBMC는 효과기 대 표적 비 10:1로 40시간 동안 MDA-MB-231 세포(상단) 또는 MCF7 세포(하단)중 어느 하나와 함께 공동배양되었다. 대조군은 표적 세포만을 단독으로 포함하였을 뿐 아니라(자발적 용해), 실험 개시시 또는 실험 막바지에 1% Triton으로 처리된 표적 세포도 포함하였다. (A)에 도시된 데이터 세트로부터 CD69+ 세포의 출현빈도로 보인 바와 같은 CD8 T 세포 활성화(B) 및 CD4 T 세포 활성화(C). 2회중 1회의 실험을 보였다.
도 9는 MATCH4 포맷을 나타내는 도해를 보여준다.
도 10은 MDA-MB-231 세포상에 발현되는 인간 ROR1(A, B), JIMT-1 세포상에 발현되는 인간 ROR1(C, D), 및 ROR1 음성 MCF-7 세포(E)에 대한 2가 항 ROR1 MATCH4 분자 PRO2589, PRO2590, PRO2591 및 PRO2592의 농도-반응 곡선(유세포분석)을 보여준다. MATCH4 분자 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포(A, B) 및 ROR1 양성 JIMT-1 세포(C, D)와 결합함을 보였던 반면, ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 확인되지 않았다(E). PRO2590의 최적화된 변이체 PRO2670은 MDA-MB-231 세포와 결합함을 보였던 반면(F), ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 확인되지 않았다(G). Fab 단편 PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 포함되었다. 도면의 데이터 점들은 기술상 2회 중복실험결과의 평균을 나타낸다.
도 11은 명시된 종양 세포의 ROR1 항체 염색후 유세포분석에 의해 확정된 ROR1 표면 발현 수준을 보인다. 파란색 히스토그램은 ROR1 발현을 나타내는 반면, 음성 대조군은 빨간색으로 표시되었다.
도 12는 관심 분자들 scMATCH3 및 MATCH4에 의해 매개되는, 몇몇 ROR1 발현 세포주에 대한 세포독성을 보여준다. pan-T 세포는, 효과기 대 표적 비 10:1로 40시간 동안 MDA-MB-231 세포(A, 좌측 상단), JIMT-1 세포(A, 좌측 하단), SKOV-3 세포(A, 우측 하단) 또는 Jeko-1 세포(A, 우측 상단)와 공동배양되었다. 대조군은 표적 세포만을 단독으로 포함하였을 뿐 아니라(자발적 용해), 실험 개시시 또는 실험 막바지에 1% Triton으로 처리된 표적 세포도 포함하였다. MATCH4 분자는 PRO2589, PRO2590, PRO2591 및 PRO2592였으며, 곡선은 도메인에 의해 유색 코딩되었고; scMATCH3 분자는 PRO2507, PRO2510 및 PRO2557이었다. 4회의 실험중 1회를 보였다. MCF7은 참조기준 세포, 즉 ROR1 음성 세포로 사용되었고(B), A에 대해 기재된 바와 같이 처리되었다. 오차 막대는 기술상 중복실험간 변차를 나타낸다.
도 13은 관심 MATCH 분자에 의해 매개된, 몇몇 ROR1 발현 세포주에 대한 T 세포 활성화를 보여준다. pan-T 세포는, 효과기 대 표적 비 10:1로 40시간 동안 MDA-MB-231 세포(A), JIMT-1 세포(B) 또는 SKOV-3 세포(C)와 공동배양되었다. 상청액을 대상으로 LDH 방출에 대해 분석하였으며, 세포를 대상으로는 활성화된 T 세포가 존재하는지에 대해 유세포분석법으로 분석하였다(CD69 발현 세포의 출현빈도로 확인됨). 상단 그래프는 CD8 T 세포에 대한 것에 해당하는 한편, 하단 그래프는 CD4 T 세포에 대한 것에 해당한다. MATCH4 분자는 PRO2589, PRO2590, PRO2591 및 PRO2592였으며, 곡선은 도메인에 의해 유색 코딩되었고; scMATCH3 분자는 PRO2507, PRO2510, 및 PRO2557이었다. 3회의 실험중 1회(SKOV-3에 대한 결과) 또는 4회의 실험중 1회(MDA-MB-231, JIMT-1에 대한 결과)를 보였다. 오차 막대는 기술상 중복실험간 변차를 나타낸다.
도 14는 21개의 인간 혈청 시료중 기존 ADA의 PRO2668(A), PRO2669(B), PRO2510(C) 및 PRO2589(D)에 대한 흡광도 수준을 보여준다(실시예 10에 기재된 ELISA 기반 기존 ADA 결합 검정에 의해 확정). 측정은, 스파이킹된 혈청 시료 및 스파이킹되지 않은 혈청 시료로 수행되었다(확인 검정 셋업). 상기 분자의 인간 혈청 시료로서, 스파이킹된 시료에 있어 대응하는 흡광도 수준의 감소(억제율(%))를 추가로 보였다(E).
도 15는 ROR1 표적화 scMATCH3 및 scMATCH4 분자에 의해 매개된, 세포독성 및 CD8 T 세포 활성화를 보인다. pan-T 세포는, 효과기 대 표적 비 10:1로 40시간 동안 MDA-MB-231 세포(A 상단) 또는 JIMT-1 세포(A 하단)와 공동배양되었다. 대조군은 표적 세포만을 단독으로 포함하였을 뿐 아니라(자발적 용해), 실험 개시시 또는 실험 막바지에 1% Triton으로 처리된 표적 세포도 포함하였다. CD8 T 세포 활성화는 A에 도시된 데이터 세트로부터 CD8+CD69+ 세포 출현빈도로 보인 바와 같다. 적어도 2회의 독립 실험중 대표적 실험 1회로 보였다.
도 16은 예시적 고형 종양 세포주의 T 세포 매개 고갈에 의한 PRO2668 매개 세포독성을 보인다(A). ROR1 수용체 밀도에 의존적인 상이한 고형 종양 세포주의 EC50 값을 보여주는 그래프(B). 혈액 종양 세포주의 T 세포 매개 고갈에 의한 세포독성(C). 종양 세포주는 40시간 동안 T 세포와 함께 공동배양되었으며, 세포독성은 젖산염 탈수소효소 방출을 이용하여 대조군의 세포독성을 기준으로 평가되었다. 세포 표면상 ROR1 수용체의 평균 수뿐 아니라, 세포독성에 대한 평균 EC50 값은 그래프 삽도에 보였다.
도 17은 6일차에, 고형 종양 표적 세포로서 MDA-MB-231 또는 JIMT-1가 이용되었을 때의 PRO2668 매개 CD8 활성화 및 증식을 보여준다(A). 3일차에, Z-138(혈액 종양 표적 세포)에 의해 매개된 CD8 활성화 및 증식(B). 표적 및 CellTrace 바이올렛으로 표지된 건강한 T 세포는 E:T 비 5:1로 공동배양되었다. 증식중인 세포의 출현빈도는 CellTrace 바이올렛 희석으로 대조군 출현빈도를 기준으로 확정되었다. 활성화된 세포는 CD25 표지화에 의해 동정되었다. 2회의 실험중 대표적인 실험 1회가 도시되었다.
도 18은 CLL 세포 및 능동적으로 분열중인 Jeko-1 세포의 히스토그램(A)을 보여준다. CLL 세포 시료는 증식하지 않는다. 5-에틸-2'-데옥시우리딘(EdU) 통합은, CLL 환자 PBMC(연회색 히스토그램)와 비교되게, 능동적으로 분열중인 Jeko-1 종양 세포주를 대상으로 평가되었다(진한 회색 히스토그램). EdU 통합은 세포가 분열되었음을 나타낸다. ROR1 표면 발현 및 정량 결과는 CLL 환자 PBMC에 대해 보였다(흰색 히스토그램, 음성 대조군(검정색) 기준)(B). CLL 환자 종양 세포에 대해 게이팅(gating)된 PRO2668의 결합(C). CLL 환자 유래 PBMC는 E:T 비 5:1로 40시간 동안 동종이계의 건강한 T 세포와 공동배양되었다. 비사멸률(specific killing)(D)은, 치료시 Annexin V 및 생/사 염료 양성 CLL 세포의 비에 의해 확정되었다. D 유래 T 세포는 활성화 마커 CD69에 대해 염색되었다(E). D 유래 상청액은 혈구계산 비드 어레이 기반 멀티플렉스 시스템이 사용되어 사이토카인 방출에 대해 평가되었다(F). 도시된 데이터는 4개/4회의 독립된 공여개체/실험중 1개/1회의 독립된 공여개체/실험의 데이터이다.
도 19는 scMATCH3 PRO2668 분자 및 scMATCH4 PRO2670 분자가 상이한 용량으로 존재할 때 종방향 종양 생장 억제(중앙값)를 보여준다. 면역약화된 마우스에 Jeko-1 세포가 피하 이식된 다음, 3일 후에는 PBMC가 생착되었다. 종양 부피가 80 mm3 ~ 100 mm3에 도달하였을 때, 동물은 랜덤으로 나누어지고, 투여가 개시되었다. 투여는 5일마다 이루어졌다. 종방향 데이터는 혼합 효과 모델(a mixed effects model)이 사용된 다음, Tukey 다중 비교 검정이 수행되어 분석되었다. ns: 유의미하지 않음; **p≤0.01; * p≤0.05; 실험 막바지에서의 대조군 IgG(팔리비주맙) 기준.
다수의 혈액암 및 고형암은 ROR1을 발현하는데, 이 점은 ROR1 발현암을 암치료에 매력적인 표적으로 만든다. 그러나 지금까지 개발된 현존 2중 특이적 항 ROR1xCD3 치료 항체는, 일반적으로 이러한 암 유형에 대해 예상된 효능 폭을 가지지 않는다. 구체적으로 이러한 치료 2중 특이적 항 ROR1xCD3 항체는 종종 ROR1을 낮은 수준으로 발현하는 암세포에 대해 중간정도의 역가를 가진다. 그 외에 이러한 선행 기술 항체는, 통상 다수의 ROR1 발현 암세포에 대한 세포독성 검정에서 낮은%(종종 50% 훨씬 이하)의 최대 사멸률을 보이는데, 이는 항체의 작용 방식이 이상적이지 않음을 나타낸다. 그러므로 의료 분야에는 ROR1을 중간 수준에서 낮은 수준으로 발현하는 암을 비롯하여 광범위한 ROR1 발현 암을 해결하기 위한 효능이 더 큰, 개선된 항 ROR1xCD3 기반 치료제가 필요한 실정이다.
본 발명은 ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개와, CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개를 포함하되, ROR1-BD 및 CD3-BD의 CDR 영역은 상기 나열된 정의를 가지는 다중 특이적 항체를 제공한다. 본 발명의 다중 특이적 항체는, ROR1을 높은 수준으로 발현하는 암세포뿐 아니라, ROR1을 단지 낮은 수준으로 발현하는 암세포를 강력하게 사멸할 수 있다. 본 발명의 다중 특이적 항체 몇 가지, 예컨대 PRO2589 및 PRO2591은 ROR1 고발현 JEKO-1 세포 사멸에 대해 pM 이하의 EC50을 보이고, 이러한 다중 특이적 항체 몇 가지, 예컨대 PRO2589 및 PRO2590은 ROR1 저발현 SKOV-3 난소암 세포 사멸에 대해 50 pM 이하의 EC50을 보인다(상기 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확인됨)(예컨대 도 12 및 도 15 참조).
더욱이, 본원에 정의된 바와 같은 ROR1-BD 1개를 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체는, 상이한 ROR1 발현 암세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면 상기 암세포에 대해 최대 사멸률을 70% 이상으로 보인다. 예를 들어 PRO2510은 ROR1을 높은 수준에서 낮은 수준으로 발현하는 MDA-MB-231 암세포, JEKO-1 암세포, JIMT-1 암세포 및 SKOV-3 암세포에 대해 최대 사멸률을 약 80%로 보인다(예컨대 도 12 및 도 15).
더욱이 본 발명의 항 ROR1 x CD3 다중 특이적 항체는 매우 유리한 생물물리학적 특성, 구체적으로 월등한 저장 안정성을 보인다.
그러므로 본 발명의 다중 특이적 항체는 종래의 치료제와는 변별적인 치료 이점을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
"~를 포함하는(comprising)" 및 "~를 포함하는(including)"과 같은 용어들은, 달리 명시되지 않는 한 본원에서 자체에 제약을 두지 않고 비제한적 의미로 사용된다. 이처럼 비제한적 의미로 사용되는 것과 관련하였을 때, "를 포함하는(comprising)"이란 용어는 이보다 더 협소한 범위를 나타내는 용어 "~로 이루어진(consisting of)"을 포함한다.
본 발명을 기술하는 내용(특히 하기 특허청구의 범위의 청구항들의 내용) 중 "하나의" 및 "한" 및 "본", 그리고 이와 유사한 용어는, 본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수의 것과 복수의 것 둘 다를 아우르는 것으로 해석되어야 할 것이다. 예를 들어 "하나의 세포"란 용어는, 세포들의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다. 복수의 형태가 화합물 및 염 등에 대해 사용되는 경우, 이는 단일 화합물 또는 염 등을 의미하기도 한다.
일 양태에서, 본 발명은
a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD와 상기 CD3-BD는 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
또다른 양태에서, 본 발명은
a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서, 상기 ROR1-BD와 상기 CD3-BD는 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 포함하고, 이 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지 않는 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 등의 용어는 전항체 또는 이의 단일 사슬; 및 임의의 항원 결합 단편(즉 "항원 결합부") 또는 이의 단일 사슬; 및 항체 CDR, VH 영역들 또는 VL 영역들을 포함하는 분자(예컨대 다중 특이적 항체(이에 한정되는 것은 아님))를 포함한다. 자연 발생 "전항체"는 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄가 이황화 결합에 의해 상호 연결되어 포함되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성되어 있다. VH 영역 및 VL 영역은 추가로, 틀 영역(FR)이라 칭하여지는 더욱 잘 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하여지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 CDR 3개와 FR 4개로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포(예컨대 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린 Fc 영역" 또는 "영역"이란 용어는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역, 즉 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인을 정의하는데 사용된다. "Fc 영역"이란 용어는 원산 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역, 즉 임의의 원하는 특성, 예컨대 변경된 Fc 수용체 결합 기능 및/또는 감소 또는 억제된 Fab 팔(arm) 교환을 보이도록 조작된 Fc 영역을 포함한다. 이처럼 조작된 Fc 영역의 예로서는 납-인투-홀(Knob-into-Hole; KiH) 기술이 있다[예컨대 문헌(Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21(1996) 및 Spiess et al., J Biol Chem. 288(37):26583-93(2013))을 참조한다]. 원산 서열 Fc 영역은 인간 lgG1, lgG2(lgG2A, IgG2B), lgG3 및 lgG4를 포함한다. "Fc 수용체" 또는 "FcR"이란, 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기술한다. 구체적으로 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)와 결합하고, 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 이러한 수용체의 형태, 주로 자체의 세포질 도메인에 차이가 나되 유사한 아미노산 서열을 가지는 FcγRII 수용체, 예컨대 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하여 FcγRI, FcyRII 및 FcγRIII 하위군 수용체를 포함하는 원산 서열 인간 FcR이다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 자체의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif; ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 자체의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif; ITIM)를 함유한다[문헌(M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234(1997))을 참조한다]. FcR에 관하여는 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92(1991); Capet et al, Immunomethods 4: 25-34(1994); 및 de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41(1995)]을 참조한다. 미래에 동정될 것들을 포함하여 기타 FcR은 본원의 "FcR"이라는 용어에 포함된다. "Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어는 또한 모체의 IgG를 태아로 운반하는 역할을 하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다[Guyer et al, J. Immunol. 117: 587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249(1994)]. FcRn과의 결합을 측정하는 방법이 공지되어 있다[예컨대 문헌(Ghetie and Ward, Immunol. Today 18:(12): 592-8(1997); Ghetie et al, Nature Biotechnology 15(7): 637-40(1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. TJI(8): 6213-6(2004); WO 2004/92219(Hinton et al))을 참조한다]. 생체내 FcRn과의 결합과, 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청중 반감기는, 예컨대 인간 FcRn을 발현하는 유전자이식 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주, 또는 변이 Fc 영역을 가지는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2004/42072(Presta)에는 FcR과의 결합이 개선되었거나 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 예컨대 문헌[Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)]도 또한 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 항체의 "결합 도메인" "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부"등의 용어는, 주어진 항원(예컨대 ROR1, CD3, hSA)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 비변형 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 비변형 항체의 단편에 의해 발휘될 수 있다. 특히 본 발명의 다중 특이적 항체의 경우, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 도메인" "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부"등의 용어는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 경첩 영역에 이황화 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; 항체 단일 팔의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 이황화 안정화 Fv 단편(dsFv); 단일 사슬 Fv 단편(scFv) 및 scAb, 즉 항체 단일 팔의 VL, VH 및 CL 도메인들로 이루어진 단일 사슬 항체를 지칭한다. 바람직하게 본 발명의 항체의 결합 도메인들은 Fv 단편, scFv 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로부터 서로 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체의 결합 도메인들은 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로부터 서로 독립적으로 선택된다. 기타 특정 구현예에서, scFv 단편의 VL 도메인 및 VH 도메인은 도메인간 이황화 결합에 의해 안정화되고, 구체적으로 상기 VH 서열은 51번 위치(AHo 번호매김)에 1개의 시스테인 잔기를 포함하고, 상기 VL 도메인은 141번 위치(AHo 번호매김)에 1개의 시스테인 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CH1 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역도, CH1 영역 및 CL 영역도 포함하지 않는다.
"상보성 결정 영역"("CDR"이란 용어는, Kabat외 다수에 의해 기술된 체계(1991)("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)("Kabat" 번호매김 체계), Al-Lazikani외 다수에 의해 기술된 체계(1997)(JMB 273, 927-948)("Chothia"번호매김 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호매김 체계(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P외 다수(Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT"번호매김 체계) 및 문헌[Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670]에 기술된 번호매김 체계("AHo"번호매김 체계)를 비롯한 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것이 사용되어 경계가 결정되는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어 고전적인 포맷의 경우 Kabat 체계하에서 중쇄 가변 도메인(VH) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 31번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2), 그리고 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Chothia 체계하에서 VH 중의 CDR 아미노산은 26번 ~ 32번(HCDR1), 52번 ~ 56번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; VL 중의 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Kabat 체계 및 Chothia 체계 둘 다에 의한 CDR 정의들을 조합하였을 때, 인간 VH 중의 CDR은 26번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어지고, 인간 VL 중의 CDR은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어진다. IMGT 체계 하에서 VH 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26번 ~ 35번(HCDR1), 51번 ~ 57번(HCDR2) 및 93번 ~ 102번(HCDR3)으로 번호가 매겨지고, VL 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27번 ~ 32번(LCDR1), 50번 ~ 52번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)으로 번호가 매겨진다("Kabat"체계에 따른 번호매김). IMGT 체계 하에 항체의 CDR들은 IMGT/DomainGap Align이라는 프로그램이 사용되어 결정될 수 있다.
본 발명의 내용에서는 특별히 달리 언급되지 않는 한, Honegger 및 Pluckthun에 의해 제안된 번호매김 체계("AHo"가 사용된다(Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670). 구체적으로 하기 잔기들이 AHo 번호매김 체계에 따라 CDR로서 정의된다: LCDR1(CDR-L1라고도 지칭됨): L24 ~ L42; LCDR2(CDR-L2라고도 지칭됨): L58 ~ L72; LCDR3(CDR-L3라고도 지칭됨): L107 ~ L138; HCDR1(CDR-H1라고도 지칭됨): H27 ~ H42; HCDR2(CDR-H2라고도 지칭됨): H57 ~ H76; HCDR3(CDR-H3라고도 지칭됨): H108 ~ H138. 명료함을 도모하기 위해, Honegger 및 Pluckthun에 따른 번호매김 체계는 자연 발생 항체의 상이한 VH 및 VL 하위 과, 구체적으로 CDR에서 발견되는 길이의 다양성을 고려하고, 서열들에 갭을 제공한다. 그러므로 주어진 항체에서 보통 1번 ~ 149번 위치 모두인 것은 아닌 가변 도메인은 아미노산 잔기에 의해 점유될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합 특이성"이란 용어는, 개별 항체가 하나의 항원 결정기와 반응하되, 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 "~와 특이적으로 결합하다" 또는 "~에 특이적인"이란 용어는, 측정 가능하거나 재현 가능한 상호작용, 예컨대 생물학적 분자를 비롯한 분자의 이종 모집단이 존재할 때 표적이 존재함을 나타내는, 표적과 항체 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어 표적(에피토프일 수 있음)과 특이적으로 결합하는 항체는, 더욱 높은 친화도, 결합활성으로 더욱 용이하게, 그리고/또는 다른 표적과 결합하는 기간 보다 더 오랜 기간 해당 표적과 결합하는 항체이다. 이것이 가장 일반적인 형태를 가질 때(그리고 한정된 참조기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"이란, 항체가, 예를 들어 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 확정되는 바와 같이, 관심 표적과 무관 분자를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 이러한 방법으로서는 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR(표면플라스몬공명법) 검사 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 점수매김(scoring)은 표준 발색법(예컨대 서양고추냉이 과산화물과 2차 항체, 그리고 테트라메틸벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 임의의 웰 내에서의 반응은, 예컨대 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수가 매겨진다. 통상의 백그라운드(= 음성 반응)는 약 0.1 OD일 수 있고, 통상의 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이는, 양의 점수와 음의 점수 사이의 비가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 추가의 예에서, SPR 검정이 수행될 수 있는데, 이 때 백그라운드와 신호 간 적어도 10배, 구체적으로 적어도 100배 차이가 있음은 특이적 결합이 이루어졌음을 나타낸다. 통상적으로 결합 특이성의 확정은 단일 참조기준 분자가 사용되어 수행되는 것이 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 분자, 예컨대 분유 또는 트랜스페린 등으로 이루어진 세트가 사용되어 수행된다.
적합하게 본 발명의 항체는 단리 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리 항체"란 용어는 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체로부터 실질적으로 분리되어 있는 항체를 지칭한다(예컨대 ROR1 및 CD3과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 실질적으로 ROR1 및 CD3 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있거나, 예컨대 ROR1, CD3 및 hSA와 특이적으로 결합하는 단리 항체는 ROR1, CD3 및 hSA 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있음). 게다가 단리 항체는 기타 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 분리되어 있을 수 있다.
적합하게 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체"란 용어는, 아미노산 서열이 동일한 유전자 공급원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 이러한 공급원으로부터 유래하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 특정의 에피토프 하나에 결합 특이성 및 친화도 하나를 보이거나, 특이 에피토프들에 결합 특이성들 및 친화도들을 보인다.
본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항체"(또는 이의 항원 결합 단편)란 용어는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교체되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 군의 불변 영역, 상이하거나 변경된 효과기 기능을 보이는 불변 영역 및/또는 상이한 종들의 불변 영역과 결합되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 가지는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교체된 항체 분자(또는 이의 항원 결합 단편)을 지칭한다. 예를 들어 마우스 항체는 자체의 불변 영역을 인간 면역글로불린 유래 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로 치환됨으로 말미암아, 키메라 항체는 항원을 인지함에 있어서 자체의 특이성을 보유할 수 있는 동시에, 인간에서의 항원성은 원래 마우스 항체와 비교되었을 때 감소한다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간 항체"(또는 이의 항원 결합 단편)란 용어는, 틀 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원 서열로부터 유래하는 가변 영역을 가지는 항체(및 이의 항원 결합 단편)를 포함하도록 의도된다. 뿐 아니라, 만일 항체가 불변 영역을 함유하면, 이 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예컨대 인간 생식계열 서열 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 것으로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 시험관내 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이발생 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체에 관한 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특별히 배제한다. 인간 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 파아지 전시 라이브러리를 이용하여 제조될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381(1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581(1991)). 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해서도 또한 이용 가능한 방법은 문헌[Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boemer et al, J. Immunol, 147(l):86-95(1991)]에 기재되어 있다. 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74(2001)]도 또한 참조한다. 인간 항체는, 항원 공격에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되되 그 내부 좌위는 무용지물이 된 유전자 이식 동물, 예컨대 면역화 제노마우스(xenomouse)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다[예컨대 XENOMOUSETM 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 동 제6,150,584호를 참조한다]. 또한, 예를 들어 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 제조된 인간 항체에 관한 문헌[Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)]도 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 비인간 항체의 반응성을 보유하되, 인간에서의 면역원성은 작은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다. 이는, 예를 들어 비인간 CDR 영역들은 유지시키면서, 항체의 잔여 부분들은 인간에 있어 대응 부분(즉 불변 영역과, 가변 영역의 틀 부분)으로 치환하여 달성될 수 있다. 추가의 틀 영역 변형은 인간 틀 서열 내에서뿐만 아니라 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래하는 CDR 서열 내에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 시험관내 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성을 촉진하거나 제조를 용이하게 만들기 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994]을 참조한다. 인간 공학 기술의 다른 예로서는 미국 특허 제5,766,886호에 개시된 Xoma 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합 인간화 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체 모두, 예컨대 인간화 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체; 그리고 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
바람직하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간화된 항체이다. 더욱 바람직하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간화 항체로서, 토끼 유래 CDR을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "다중 특이적 항체"란 용어는, 적어도 2개 이상의 상이한 표적 상에 존재하는 상이한 에피토프(예컨대 ROR1 및 CD3) 2개 이상과 결합하는 항체를 지칭한다. "다중 특이적 항체"란 용어는 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적, 5중 특이적 및 6중 특이적 항체를 포함한다. 바람직하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 2중 특이적 항체 또는 3중 특이적 항체, 구체적으로 3중 특이적 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "2중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 2개에 존재하는 상이한 에피토프(예컨대 ROR1 및 CD3) 적어도 2개와 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "3중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 3개에 존재하는 상이한 에피토프 적어도 3개(예컨대 ROR1, CD3 및 hSA)와 결합하는 항체를 지칭한다.
"에피토프"란 용어는, 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질로 된 결정기를 의미한다. 에피토프는, 보통 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 화학 활성 표면 군락(grouping)으로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라, 특이적 하전 특징을 가진다. "입체형" 및 "선형" 에피토프는, 변성 용매가 존재할 때 결합능을 상실하는지(입체형 에피토프), 아니면 상실하지 않는지(선형 에피토프)에 따라 구별된다.
본원에 사용된 바와 같은 "입체형 에피토프"란 용어는, 폴리펩티드 사슬이 폴딩(folding)되어 원산 단백질을 형성할 때 표면상에 모아지는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"선형 에피토프"란 용어는, 단백질 및 상호작용 분자(예컨대 항체)간 상호작용 지점 모두가 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 직선으로 존재하는(연속적인) 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "~를 인지하다"라는 용어는, 항체 및 이의 항원 결합 단편이 자체의 입체적 에피토프를 발견하여 상호작용(예컨대 결합)하는 경우를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합활성"이란 용어는, 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 세기에 대한 정보를 알려주는 척도를 지칭한다. 이는, 3가지 주요 요인, 즉 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 결합가(valency); 그리고 상호작용 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 궁극적으로 이 요인들은 항체의 특이성, 다시 말해서 특정 항체가 정확한 항원 에피토프와 결합할 가능성을 규정한다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 ROR1-BD 1개 또는 2개를 포함한다.
"ROR1"이란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q01973인 인간 ROR1을 지칭한다. 적합하게 본 발명의 ROR1-BD는 그 서열이 표 6에 제시된(서열 번호 117) 인간 ROR1, 구체적으로 ROR1의 세포외 도메인(ECD)을 표적화한다. 특정 구현예에서, ROR1-BD는 ROR1의 Ig 유사 도메인과 결합한다. ROR1의 Ig 유사 도메인은 UniProt 식별 번호 Q01973에 따른 서열 번호 117의 42번 ~ 147번 잔기에 의해 규정된다. 다른 특정 구현예에서, ROR1-BD는 Wnt5α와 ROR1의 결합을 차단하지 않는다.
적합하게 ROR1-BD는 scFv 포맷일 때, 이하 매개변수들 중 1개 이상에 의해 특징지어진다:
a. 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면 1 pM ~ 2 nM의 1가 해리상수(KD), 구체적으로 1 pM ~ 1　nM, 구체적으로 1 pM ~ 500 pM의 KD로 인간 ROR1의 세포외 도메인과 결합함;
b. 5　pM ~ 10　nM의 EC50, 구체적으로 5 pM ~ 5 nM의 EC50, 구체적으로 5 pM ~ 4　nM의 EC50, 구체적으로 5 pM ~ 3 nM의 EC50으로 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포와 결합함.
본원에 사용된 바와 같은 "MDA-MB-231 세포"란 용어는, ROR1을 발현하는 유방암 세포주를 지칭한다. MDA-MB-231 세포는 시판되고 있으며, 유방암(선암종)에 대한 모델 세포주로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "친화도"란 용어는, 단일 항원 부위에서의 항체 및 항원간 상호작용 세기를 지칭한다. 각각의 항원성 부위내에서 항체 "팔"의 가변 영역은 약한 비공유성 외력을 통해 다수의 부위에서 항원과 상호작용하고; 그 상호작용이 클수록 친화도도 더 높다.
"결합 친화도"란, 일반적으로 분자(예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예컨대 항원, 더욱 구체적으로 항원상 에피토프)간 비 공유 상호작용을 모두 합하였을 때의 세기를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도", "~에 결합한다", "~에 결합하다" 또는 "~에 결합하는"이란, 고유의 결합 친화도가 결합 쌍의 일원들(예컨대 항체 단편과 항원)간 1:1 상호작용을 반영하는 경우를 지칭한다. 분자 X의, 이의 파트너인 Y에 대한 친화도는, 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있다. 저친화도 항체는, 일반적으로 항원과 천천히 결합하고, 쉽게 항원과 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는, 일반적으로 항원과 더 빨리 결합하고, 결합된 채 더 오래 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 방법 다수가 당 분야에 공지되어 있는데, 이 방법들 중 임의의 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도, 즉 결합 세기를 측정하기 위한 방법으로서, 특정의 예시적 및 모범적 구현예가 이하에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "K결합", "Ka" 또는 "Kon"이란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 결합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 "K해리", “Kd”또는 "Koff"란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 일 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 "KD"란 용어는, Kd 대 Ka의 비(즉 Kd/Ka)로부터 구하여진 해리 상수를 지칭하도록 의도되고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값" 또는 "KD" 또는 "KD 값"은 표면플라스몬공명 검정을 이용하여 측정된다.
재조합 인간 ROR1에 대한 친화도는 [0176] 및 [0192] 문단(scFv); 및 [0219] 및 [0242] ~ [0244] 문단(다중 특이적 분자)에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정법에 의해 확정되었다. 재조합 인간 CD3 및 재조합 사이노몰거스 CD3 및 재조합 마모셋(Marmoset) CD3에 대한 친화도는 [0208] 문단(scFv); 및 [0221] 및 [0247] 문단(다중 특이적 분자)에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정법에 의해 확정되었다. 재조합 인간 혈청 알부민(hSA), 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민(cSA) 및 마우스 혈청 알부민(mSA)에 대한 친화도는 [0213] 문단(scFv); 및 [0223] 및 [0249] 문단(다중 특이적 분자)에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정법에 의해 확정되었다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 ROR1-BD 또는 본 발명의 다중 특이적 항체에 존재하는 ROR1-BD는 Wnt5α와 ROR1의 결합을 차단하지 않는다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 ROR1-BD는 scFv 포맷일 때 이하 매개변수들 중 1개 이상에 의해 추가로 특징지어진다:
c. 시차주사형광도측정법(DSF)에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 58℃, 구체적으로 적어도 59℃, 구체적으로 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 61℃임[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM의 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨];
d. 상기 scFv 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주 동안 4℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 3% 미만, 구체적으로 2% 미만, 구체적으로 1% 미만임[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨];
e. 상기 scFv 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주 동안 40℃에서 저장된 후의 단량체 함량 감소율이 10% 미만임[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨]; 및/또는
f. 상기 scFv의 출발 농도가 10　mg/ml일 때, 4주동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 후의 단백질 함량 감소율이 1% 미만임[단 구체적으로 상기 scFv는 150 mM NaCl를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4)중에 제제화됨].
측정법 대부분에 있어 나노 DSF(Prometheus NT.48, NaonTemper) 방법은, 예컨대 [0197] 및 [0206] 문단(scFv) 및 [0234] 및 [261] 문단(다중 특이적 포맷)에 기재된 바와 같이 scFv 및 다중 특이적 항체의 열동력학적 특성을 확정하기 위해 사용되었다. CD3-BD(scFv)의 경우, DSF 방법은 문헌[Egan, et al., MAbs, 9(1)(2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9)(2007) 2212-2221]에 기재된 바와 같이 사용되었다. 이 방법에서 scFv 구조체의 열 언폴딩 과도기의 중간점은 형광 염료 SYPRO® 오렌지를 사용하여 시차주사형광도측정법에 의해 확정된다[문헌(Wong & Raleigh, Protein Science 25(2016) 1834-1840) 참조]. 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4) 중 시료는 최종 단백질 농도 50 μg/ml이고, 최종 농도의 5x SYPRO® 오렌지를 함유하도록 제조되었다(최종 부피 100 μl). 제조된 시료 25 마이크로리터가 백색 벽으로 둘러싸인 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가된다. 이 검정은 열 순환기로서 사용되는 qPCR 기계에서 수행되고, 소프트웨어상 사용자지정염료교정루틴을 이용하여 형광 발광이 검출되었다. 시험 시료를 담고있는 PCR 평판을 대상으로 그 온도를 25℃에서 96℃로 상승시켰다(1℃씩 상승시켰으며, 온도를 상승시킬 때마다 30초간의 휴지기를 둠). 총 검정시간은 약 2시간이었다. 산술적2차도함수법을 이용하는 소프트웨어 GraphPad Prism으로 Tm을 추산하여, 곡선의 변곡점을 추정하였다. 보고된 Tm은 3회 측정의 평균치이다.
단량체 함량 감소율은 SE-HPLC 크로마토그램의 곡선하면적 산정으로 확정된다. SE-HPLC는 고체 정지상 및 액체 이동상을 기반으로 한 분리 기술로서, US 약전(USP) 챕터 621에 개략적으로 기재되어 있다. 이 방법은, 소수성 정지상과 수성 이동상을 이용하여 분자의 크기와 형상을 기반으로 분자를 분리한다. 분자의 분리는 특정 컬럼의 허공 부피(V0) 및 총 투과 부피(VT) 사이에서 이루어진다. SE-HPLC에 의한 측정은, 자동화 시료 주입기 및 UV 검출기(검출 파장 280 nm로 설정)가 장착된 Chromaster HPLC 시스템(Hitachi High-Technologies Corporation)상에서 수행된다. 장비는 획득된 크로마토그램 분석도 또한 지원하는 소프트웨어 EZChrom Elite(Agilent Technologies, 버전 3.3.2 SP2)에 의해 제어된다. 단백질 시료는 원심분리에 의해 청징화되고, 자동시료수집기내 4℃ ~ 6℃의 온도로 유지되다가 주입된다. scFv 시료 분석을 위해, 컬럼 Shodex KW403-4F(Showa Denko Inc., #F6989202)가 사용되는데, 이 때 표준화 완충 염수 이동상(50 mM 인산나트륨 pH 6.5, 300 mM 염화나트륨)은 권장 유량 0.35 ml/분으로 흐른다. 매회 주입당 표적 시료 로딩량은 5 μg이었다. 시료는 280 nm 파장에서 UV 검출기에 의해 검출되고, 데이터는 적합한 소프트웨어 스위트에 의해 기록된다. 획득된 크로마토그램은 V0 ~ VT 범위에서 분석되고, 이로써 10분 이후의 용리 시간에 보이는 피크와 연관된 매트릭스는 배제된다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 ROR1-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 다중 특이적 항체의 ROR1-BD는 그 서열이 표 1에 나열된 인간화 ROR1-BD를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가로 본 발명의 다중 특이적 항체는 CD3-BD 1개를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 CD3-BD는 CD3ε과 결합한다. 구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 및 사이노몰거스(마카카 파스큘라리스) CD3ε을 표적화하는 CD3-BD 1개를 포함한다.
적합하게 본 발명에 사용된 CD3-BD는 scFv 포맷일 때, 이하 매개변수들중 1개 이상에 의해 특징지어진다:
a) SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 50　nM 미만의 해리상수(KD), 구체적으로 0.1 nM ~ 50　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 30 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 KD로 인간 CD3ε과 결합함;
b) SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 50　nM 미만의 KD, 구체적으로 0.1 nM ~ 50　nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 30 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 15 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10 nM의 KD로 마카카 파스큘라리스(사이노몰거스) CD3과 결합함; 및
c) 시차주사형광도측정법에 의해 확정되는 용융 온도(Tm)가 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 65℃, 더욱 구체적으로 적어도 67℃임.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 CD3-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 다중 특이적 항체의 CD3-BD는 그 서열이 표 2에 나열된 인간화 CD3-BD를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
동일하거나 더 작은 분자량에서 특이성/기능성 수치를 증가시키기 위해서는 항체 단편, 예컨대 Fv 단편 및 Fab 단편 및 기타 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하는 것이 유리하다. 이와 같이 더 작은 분자는 전항체의 항원 결합 활성을 보유할뿐더러, 전체 면역글로불린 분자와 비교되었을 때 개선된 조직 침투성과 약동학적 특성을 보일 수 있다. 이러한 단편은 전체 면역글로불린에 비해 다수의 이점을 보이는 것으로 나타난 반면에, 생체내 반감기를 늘리는 Fc 도메인이 결여되어 있는 관계로 혈청으로부터의 소멸 속도가 증가한다는 단점을 가진다(Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217). 분자량이 더 작은 분자는 더 효율적으로 표적 조직(예컨대 고형 암)에 침투하므로, 동일하거나 더 작은 용량일 때 개선된 효능이 보장된다.
발명자들은, 인간 혈청 알부민 결합 도메인(hSA-BD)이 본 발명의 다중 특이적 항체에 부가되면, 기타 결합 도메인이 각각의 자체 표적과 결합하는 능력은 방해되지 않음을 발견하였다. 복합 다중 표적, 다세포 생체내 환경에서 결합 도메인 3개 또는 4개 모두는 서로를 입체적으로 억제하거나, 달리는 억제하지 않고 기능을 유지하며 유지된다는 사실은 예전에는 예상되지 못했던 것이었던 바, 이러한 발견은 놀라운 발견이었다.
"hSA"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 P02768의 인간 혈청 알부민을 지칭한다. 인간 혈청 알부민(hSA)은 인간의 혈청중에 풍부한(총 단백질의 50%) 66.4 kDa의 단백질로서, 585개의 아미노산으로 구성되어 있다(Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). 다기능 hSA 단백질은 다수의 대사물질, 예컨대 지방산, 금속 이온, 빌리루빈 및 몇몇 약물과 결합한 채, 이의 운반을 허용하는 자체의 구조와 결합한다(Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). 혈청중 hSA의 농도는 약 3.5 g/dL ~ 5 g/dL이다. 알부민 결합 항체 및 이의 단편은, 예를 들어 이에 접합된 단백질 또는 약물의 생체내 혈청중 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, hSA-BD는 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.
본 발명의 다중 특이적 항체에 포함된, 적합한 hSA-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 다중 특이적 항체에 포함된 hSA-BD는 그 서열이 표 3에 나열된 인간화 hSA-결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 포함된 hSA-BD는 hSA 및 사이노몰거스 혈청 알부민(cSA)과 특이적으로 결합한다.
또 다른 특정의 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 포함된 hSA-BD는 hSA, cSA 및 마우스 혈청 알부민(mSA)과 특이적으로 결합한다. 이러한 특정의 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 포함된 hSA-BD는 scFv 포맷일 때, 이하 매개변수들중 1개 이상에 의해 특징지어진다:
a) pH 5.5 및 pH 7.4에서 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 0.1 nM ~ 10 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 5　nM의 해리 상수(KD)로 인간 혈청 알부민(hSA)과 결합함;
b) pH 5.5 및 pH 7.4에서 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 0.1 nM ~ 10 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 5　nM의 해리 상수(KD)로 마카카 파스큘라리스(사이노몰거스) 혈청 알부민(cSA)과 결합함; 및
c) pH 5.5 및 pH 7.4에서 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 0.1 nM ~ 20 nM, 구체적으로 0.1 nM ~ 10　nM의 해리 상수(KD)로 마우스 혈청 알부민(mSA)과 결합함.
본 발명의 다중 특이적 항체에 사용되기 적합한 또 다른 hSA-BD는 (i) 혈청 알부민과 결합하는 폴리펩티드(예컨대 문헌(Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756; EP 0 486 525; 미국특허 제6,267,964호; WO 2004/001064; WO 2002/076489; 및 WO 2001/45746) 참조); (ii) 문헌(Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288, WO 2004/003019, WO 2008/096158, WO 2005/118642, WO 2006/0591056 및 WO 2011/006915)에 기재된 항혈청 알부민 결합 단일 가변 도메인; (iii) WO 2009/040562, WO 2010/035012 및 WO 2011/086091에 기재된 항혈청 알부민 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 도메인을 포함하거나, 이로부터 유래한다
특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 (i) ROR1-BD 1개; (ii) CD3-BD 1개; 및 (iii) hSA-BD 1개를 포함하는데, 즉 이러한 특정 구현예의 다중 특이적 항체는 ROR1, CD3 및 hSA 특이성 3개 모두에 대해 1가이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 (i) ROR1-BD 2개; (ii) CD3-BD 1개; 및 (iii) hSA-BD 1개를 포함하는데, 즉 이러한 특정 구현예의 다중 특이적 항체는 ROR1 특이성에 대해서는 2가이고, CD3 특이성 및 hSA 특이성 둘 다에 대해서는 1가이다.
"다가 항체"란 용어는, 가 수가 1을 초과하는 단일 결합 분자를 지칭하는데, 여기서 "가 수"는 표적 분자상 에피토프와 결합하는 항원 결합기의 수로서 기술된다. 그러므로 단일 결합 분자는 표적 분자상 1개를 초과하는 결합 부위 및/또는 1개를 초과하는 표적 분자와 결합할 수 있는데, 그 이유는 1개를 초과하는 대응 항원 결합기 복사체가 존재하기 때문이다. 다가 항체의 예로서는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 5가 항체 및 6가 항체 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "1가 항체"란 용어는, 단일 표적 분자, 더욱 구체적으로 표적 분자상 단일 에피토프와 결합하는 항체를 지칭한다. 또한 본원에 사용된 바와 같은 "결합 도메인" 또는 "1가 결합 도메인"이란 용어는, 표적 분자상 단일 에피토프와 결합하는 결합 도메인을 지칭한다
본 발명의 다중 특이적 항체가 ROR1-BD를 2개 포함하는 경우, 상기 ROR1-BD 2개는 ROR1의 세포외 도메인상 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프중 어느 하나와 결합한다. 바람직하게 ROR1-BD 2개는 ROR1의 세포외 도메인상 동일 에피토프와 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 "동일 에피토프"란 용어는, 1개를 초과하는 항체와 특이적으로 결합할 수 있는, 단백질상 개별 단백질 결정기를 지칭하는데, 단 이러한 개별 단백질 결정기는 동일한데, 즉 동일한 3차원의 구조적 특징뿐 아니라 상기 항체 각각에 대해 동일한 하전 특징을 가지는 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 동일한 화학 활성 표면 군락으로 이루어진다. 본원에서 특이적 단백질 표적과 연관되어 사용된 바와 같은 "상이한 에피토프"란 용어는, 단백질상 개별 단백질 결정기를 지칭하되, 단 이러한 개별 단백질 결정기 각각은 상이한 항체와 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 개별 단백질 결정기는 상이한 항체에 대해 동일하지 않은데, 즉 상이한 3차원의 구조적 특징뿐 아니라 상이한 하전 특징을 가지는 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 동일하지 않은 화학 활성 표면 군락으로 이루어진다. 이러한 상이한 에피토프는 중첩성일 수 있거나 중첩성이 아닐 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 2중 특이적이면서 2가이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 2중 특이적이면서 3가이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 3중 특이적이면서 3가이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 3중 특이적이면서 4가이다.
본 발명에 사용된 기타 가변 도메인은, 돌연변이되었되, CDR 영역이, 표 1, 표 2 및 표 3에 기재된 서열에 서사된 CDR 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 기타 가변 도메인은 CDR 영역중 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하 또는 5개 이하의 아미노산이, 표 1, 표 2 및 표 3에 기재된 서열에 서사된 CDR 영역의 아미노산과 비교되었을 때 돌연변이된, 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인중 VH 도메인은 인간 항체 VH과에 속하거나 이로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체의 1개 또는 2개의 ROR1-BD, CD3-BD, 그리고 존재한다면 hSA-BD의 VH 도메인은, VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 또는 VH4에 속한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 VH 도메인은 VH 틀 아형 VH3 또는 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3에 속한다.
본 발명의 내용중, "VHx 틀 아형(또는 VκX/Vλ 틀 아형)에 속하는" 또는 "VHx 틀 아형(또는 VκX/Vλ 틀 아형)으로부터 선택되는"이란 용어는, VH/VL 틀 서열 FR1 ~ FR4(본원에서는 VH/VL 틀 영역 FR1 ~ FR4라고도 지칭됨)가 상기 인간 항체 VHx 또는 VκX/Vλ 틀 아형에 대해 최고의 상동성 정도를 보임을 의미한다.
VH1a, VH1b, VH3 및 VH4 서열의 예와, 기타 VHx 서열의 예는 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86] 또는 WO 2019/057787에 제시되어 있다. VH3과에 속하는 VH 도메인의 구체 예는 서열 번호 71에 의해 표시되고, VH1a, VH1b 또는 VH4 틀 아형에 속하는 VH 도메인의 구체 예는 서열 번호 72, 73 및 74에 의해 표시된다(표 4에서 틀 영역은 굵지 않은 글씨체로 표시됨). 구체적으로 틀 영역 FR1 ~ FR4는 VH3과에 속하는 서열 번호 71로부터 취하여진다(표 4에서 굵지 않은 글씨체로 표시된 영역). 적합하게, 본원에 사용된 바와 같은 VH3과에 속하는 VH는 서열 번호 71의 FR1 ~ FR4에 대해 적어도 85%, 구체적으로 적어도 90%, 더욱 구체적으로 적어도 95%의 서열 동일성을 보이는 FR1 ~ FR4를 포함하는 VH이다. VH3 및 VH4 서열의 대안적 예와, 기타 VHx 서열들의 예는, 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86] 또는 WO 2019/057787에서 확인될 수 있다.
적합하게 본 발명에 사용된 결합 도메인의 VL 도메인은 Vκ틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 틀, 구체적으로 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함한다. 상기 결합 도메인이 scFv 포맷인 경우, 상기 결합 도메인은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 틀, 구체적으로 Vκ 틀 FR1 ~ FR3, 및 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함한다.
적합한 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3뿐 아니라, 예시적 Vλ FR4가 서열 번호 75에 제시되어 있다(표 4에서 틀 영역은 굵지 않은 글씨체로 표시됨). Vκ서열의 대안적 예와 Vκ2, Vκ3 또는 Vκ4 서열의 예는 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86]에서 확인될 수 있다. 적합한 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3는 서열 번호 75로부터 취하여졌으며, FR1 ~ FR3에 대응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함한다(표 4에서 틀 영역은 굵지 않은 글씨체로 표시됨). 구체적으로 도메인간 이황화 결합을 형성하기 위해 제2 단일 시스테인이 대응하는 VH 사슬, 구체적으로 VH의 51번 위치(AHo 번호매김)에 존재하는 경우, 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 76 ~ 서열 번호 82와, 단일 시스테인 잔기를 포함하는 서열 번호 83에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인중 VL 도메인은 scFv 포맷일 때, 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4를 포함한다.
구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3에 나열된 VH 도메인을 포함한다. 적합하게 본 발명에 사용된 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하는데, 단 틀 서열(즉 CDR 서열이 아닌 서열)내 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된(단 돌연변이의 다양한 비제한적 예로서는 부가, 치환 또는 결실이 있음) VH 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하는데, 단 틀 서열(즉 CDR 서열이 아닌 서열)내 7개 이하의 아미노산, 구체적으로 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산, 구체적으로 1개 이하의 아미노산이 돌연변이된(단 돌연변이의 다양한 비제한적 예로서는 부가, 치환 또는 결실이 있음) VH 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 기타 결합 도메인은 돌연변이되었으되, VH 영역 아미노산이 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 기재된 대응 서열로 서사된 VH 영역 아미노산, 예컨대 적어도 5번 ~ 140번 위치(AHo 번호매김), 구체적으로 표 1, 표 2 및 표 3에 보인 서열들 중 1개의 적어도 3번 ~ 145번 위치, 더욱 구체적으로 적어도 2번 ~ 147번 위치를 포함하는 VH 도메인 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산을 포함하는데, 단 이러한 VH 도메인은 상기 항목 11 및 항목 19에 정의된 기능상의 특징을 보인다.
특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체중 1개 또는 2개의 ROR1-BD, CD3-BD, 그리고 존재한다면 hSA-BD는 상기 정의된 바와 같은 VH 도메인을 포함하는데, 여기서 상기 VH 도메인의 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 이하와 같은 치환(AHo 번호매김)을 가진다: 12번 아미노산 위치 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치 트레오닌(T); 및 144번 아미노산 위치 글루타민(Q). 상기 VH 도메인은 본원에서 "변이체 VH 도메인" 또는 "변형된 VH 도메인" 또는 "개선된 VH 도메인"이라 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 상기 VH 도메인을 포함하는 결합 도메인은 본원에서 "변이체 결합 도메인" 또는 "변형된 결합 도메인" 또는 "개선된 결합 도메인"이라 지칭될 수 있다. 이러한 변이체 VH 도메인의 구체적 예로서는 서열 번호 8, 11, 21, 24, 37, 66 및 69의 VH 도메인이 있다.
본 발명자들은 상기 변형된 ROR1-BD, CD3-BD 및 hSA-BD가 scFv 포맷일 때, 상기 결합 도메인의 VH 틀 영역에 상기 명시된 치환을 포함하지 않는 버전과 비교되었을 때 유의미하게 감소한 면역원성을 보임을 발견하였다. 더욱 구체적으로 상기 변형된 ROR1-BD, CD3-BD 및 hSA-BD는 scFv 포맷일 때 인간 혈청중 기존 항 약물 항체(ADA)에 대해 감소한 결합을 보이는데, 구체적으로 실시예 10에 정의된 바와 같은 기존 ADA 결합 검정에서 확정되는 바에 따르면, VH 틀 영역에 상기 명시된 치환을 포함하지 않는 버전과 비교되었을 때 기존 ADA에 대해 감소한 결합능을 보인다.
구체적으로 본 발명자들은 상기 변형된 ROR1-BD, CD3-BD 및 hSA-BD를 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체는, 상기 변형된 결합 도메인을 포함하지 않는 본 발명의 다중 특이적 항체 버전과 비교되었을 때 유의미하게 감소한 면역원성을 보임을 발견하였다. 더욱 구체적으로 상기 변형된 ROR1-BD, CD3-BD 및 hSA-BD를 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체는, 인간 혈청중에 존재하는 기존 항 약물 항체(ADA)에 대해 감소한 결합능을 보이는데, 구체적으로 기존 ADA 결합 검정에서 확정되는 바에 따르면, 구체적으로 실시예 10에 정의된 바와 같은 기존 ADA 결합 검정에서 확정되는 바에 따르면, 상기 변형된 결합 도메인을 포함하지 않는 본 발명의 다중 특이적 항체 버전과 비교되었을 때 기존 ADA에 대해 감소한 결합능을 보인다.
면역원성, 즉 환자의 체내에서 치료 단백질이 항체 반응을 유도하는 경향은, 예컨대 건강하고 치료를 받지 않은 인간 개체의 혈청중에 이미 존재하는 항 약물 항체(ADA)(본원에서는 "기존 ADA"라 지칭됨)에 의해 인지되는 치료 단백질 자체의 능력에 의해 예측될 수 있다.
그러므로 본 발명을 위해 본원에 사용된 바와 같은 "면역원성"이란 용어는, 치료 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편 또는 항체 결합 도메인이 인간 혈청 시료중 기존 ADA에 의해 인지되는, 이 치료 단백질의 능력을 지칭한다. 이론에 국한되고자 하지 않을 때, 치료적 처치가 이루어질 때 기존 ADA 결합뿐 아니라 ADA 형성의 유도는 치료 단백질상 B 세포 에피토프 및/또는 T 세포 에피토프의 출현과 연계되어 있는 것으로 생각된다. 이러한 면역원성 정도는 ELISA 검정에 의해 확정될 수 있고, 미지의 치료 단백질을 인지하는(즉 결합하는) 기존 ADA 및/또는 치료적 처치가 이루어질 때 생성된 ADA를 측정가능한 양만큼 함유하는 인간 혈청 시료중%로서, 시험된 인간 혈청중 ADA 총 수를 기준으로 한 ADA의 인간 혈청 시료중%(양성 혈청 시료중%)에 의해 표현될 수 있다. 치료 단백질과, 자체의 면역원성을 감소시키기 위한 목적으로 변형된 대응 치료 단백질 간 면역원성의 감소는, 변형된 치료 단백질에 대한 양성 혈청 시료중%를, 원래 치료 단백질에 대한 양성 혈청 시료중%와 비교함으로써 측정될 수 있다. 양성 혈청 시료중 변형된 치료 단백질이 더 낮은 수로 존재하거나 더 낮은%로 존재함은 그 면역원성이, 원래 치료 단백질의 면역원성과 비교되었을 때 감소하였음을 나타낸다.
ELISA 신호가 임의의 역치수준을 초월할 때, 혈청 시료는 측정가능한 양만큼의 기존 ADA를 함유하는 것으로 판단된다. 이 역치수준은 본원에서 스크리닝 컷 포인트(Screening Cut-Point; SCP)라 지칭된다. SCP는 이하 정의된 바와 같이 산정될 수 있거나, 또는 시험된 혈청에 대해 획득된 최대 ELISA 신호에 상대적인 임의의 값으로 설정될 수 있다(예컨대 시험된 혈청에 대해 획득된 최대 ELISA 신호의 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%). 바람직하게 SCP는 이하에 정의된 바와 같이 산정된다.
구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 나열된 VL 도메인을 포함한다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하는데, 단 틀 서열(즉 CDR 서열이 아닌 서열)내 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된(단 돌연변이의 다양한 비제한적 예로서는 부가, 치환 또는 결실이 있음) VL 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하는데, 단 틀 서열(즉 CDR 서열이 아닌 서열)내 약 10개 이하의 아미노산, 구체적으로 7개 이하의 아미노산, 구체적으로 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산, 구체적으로 1개 이하의 아미노산은 돌연변이된(단 돌연변이의 다양한 비제한적 예로서는 부가, 치환 또는 결실이 있음) VL 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 기타 결합 도메인은 돌연변이되었으되, VL 영역 아미노산이 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 기재된 대응 서열로 서사된 VL 영역 아미노산, 예컨대 적어도 5번 ~ 140번 위치(AHo 번호매김), 구체적으로 표 1, 표 2 및 표 3중 1개에 보인 서열들 중 1개의 적어도 3번 ~ 145번 위치, 더욱 구체적으로 적어도 2번 ~ 147번 위치를 포함하는 VL 도메인 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산을 포함하되, 단 이러한 VL 도메인은 상기 항목 11 및 항목 19에 정의된 기능상의 특징을 보인다
본 발명의 내용에 있어 "본 발명에 사용된 결합 도메인"이란 용어는, 보통 말하는(즉 다중 특이적이라는 내용과는 독립되게) 결합 도메인, 구체적으로 다중 특이적 구조체에 포함된 결합 도메인, 예컨대 2중 특이적, 3중 특이적 또는 4중 특이적 구조체에 포함된 결합 도메인중 1개에 관한 것이다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 Fab, F(ab)2, Fv, scFv, dsFv 및 scAb로 이루어진 군; 구체적으로 Fv, scFv 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택된다. 구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 scFv이다.
적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 작동 가능하도록 결합되어 있다. 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 자체의 각각의 항원 또는 수용체와 동시에 결합할 수 있다. 이와 관련하여 사용된 바와 같은 "동시에"란 용어는, ROR1-BD 및 CD3-BD중 적어도 1개와 이의 각각의 항원과의 동시 결합을 지칭하거나, 또는 2개의 ROR1-BD가 다중 특이적 항체에 존재하는 경우, "동시에"란 용어는, ROR1-BD 둘 다, 그리고 CD3-BD와, 이의 각각의 항원과의 동시 결합을 지칭한다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 ROR1-BD 1개 또는 2개, CD3-BD 1개, 그리고 선택적으로 hSA-BD 1개를 포함하되, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개, 상기 CD3-BD 및 상기 선택적 hSA-BD는 작동 가능하도록 서로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같은 "~와 작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 각각의 분자가 기능적 활성을 보유하는 방식으로 2개의 분자(예컨대 폴리펩티드, 도메인, 결합 도메인)가 결합되는 것을 나타낸다. 2개의 분자는, 그것들이 직접적으로 결합되어 있거나, 아니면 (예컨대 링커, 기, 기에 대한 링커를 통해) 간접적으로 결합되어 있거나 간에 "작동 가능하도록 결합된" 것일 수 있다. "링커"란 용어는, 선택적으로 본 발명에 사용된 항체 단편 또는 결합 도메인 사이에 위치하는 펩티드 또는 기타 기를 지칭한다. 분자들을 함께 공유 결합하기 위해 다수의 전략이 사용될 수 있다. 이러한 전략으로서는 단백질 또는 단백질 도메인의 N 말단 및 C 말단간 폴리펩티드 결합, 이황화 결합을 통한 결합 및 화학적 가교 시약을 통한 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 구현예의 일 양태에서, 링커는 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 펩티드 결합이다. 2개의 폴리펩티드 사슬이 연결될 특정의 경우에 적합한 링커를 선택하는 것은, 다양한 매개변수, 예컨대 두 폴리펩티드 사슬의 성질(예컨대 이 두 사슬이 자연적으로 올리고머화되는지 여부), 공지되어 있다면 연결될 N 말단 및 C 말단 사이의 거리 및/또는 단백분해와 산화에 대한 링커의 안정성(이에 한정되는 것은 아님)에 달려있다. 더욱이 링커는 가요성(flexibility)을 제공하는 아미노산 잔기들을 함유할 수 있다.
본 발명의 내용중 "폴리펩티드 링커"란 용어는, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기들의 사슬로 이루어진 링커로서, 각각이 한쪽 말단에 부착된 두 도메인을 연결해주는 링커를 지칭한다. 폴리펩티드 링커의 길이는 두 분자가 서로에 대해 올바른 입체형태를 이루어, 원하는 활성을 보유하게 만드는 방식으로 두 분자를 연결하는데 적당해야 한다. 구체적인 구현예에서, 폴리펩티드 링커는 2개 내지 30개 아미노산 잔기(예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 아미노산 잔기)로 이루어진 연속 사슬을 가진다. 뿐 아니라, 폴리펩티드 링커에 포함되도록 선택된 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 활성을 유의미하게 방해하지 않는 특성을 보여야 한다. 그러므로 링커 펩티드는 대체로 폴리펩티드 활성과 부합하지 않거나, 내부 폴딩을 방해하거나, 또는 수용체 단량체 도메인들의 결합을 심각하게 방해할 단량체중 1개 이상의 아미노산 잔기와 결합을 형성하거나 기타 상호작용이 진행되도록 만드는 전하를 보여서는 안 된다. 구체적인 구현예들에서, 폴리펩티드 링커는 구조화되지 않은 폴리펩티드이다. 유용한 링커는 글리신-세린, 즉 GS 링커를 포함한다. "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커란, 당 업자에 의해 이해될 바와 같이, 글리신과 세린이 일렬로 늘어선 중합체[예를 들어 (Gly-Ser)n, (GSGGS)n(서열 번호 118), (GGGGS)n(서열 번호 119) 및 (GGGS)n(서열 번호 120)을 포함하되, 여기서 n은 1 이상의 정수임], 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커, 예컨대 쉐이커 칼륨 채널(shaker potassium channel)용 테더(tether), 그리고 기타 매우 다양한 가요성 링커를 의미한다. 글리신과 세린을 포함하는 올리고펩티드는 비교적 구조화되지 않았으므로, 글리신-세린 중합체가 바람직하고, 따라서 구성성분들간 중성 테더로서 사용될 수 있다. 두 번째로, 세린은 친수성으로서, 구형 글리신 사슬일 수 있었던 것을 용해할 수 있다. 세 번째, 유사한 사슬이 재조합 단백질, 예컨대 단일 사슬 항체의 서브유닛들을 연결하는데 유효한 것으로 보였다.
구현예들의 군에 있어, 다중 특이적 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 포맷으로서, 적어도 3중 특이적이고, 면역글로불린 Fc 영역(들) 및 CH1 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는 포맷으로부터 선택되는 포맷을 가진다. 이는, 비제한적 예로서, 탠덤 트리-scFv(트리플바디), 트리아바디, scDb-scFv; 이종이량체 Fc 도메인 이외의 이종이량체화 도메인의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 탠덤 트리-scFv 또는 scDb-scFv; 그리고 MATCH(WO 2016/0202457; Egan T. et al., MABS 9(2017) 68-84에 기재됨)를 기반으로 한 포맷을 포함한다. 구체적으로 다중 특이적 항체의 포맷은 scDb-scFv, scMATCH3, MATCH3 및 MATCH4로부터 선택된다.
"scDB"또는 "단일 사슬 다이아바디"란 용어는, 항원 결합 부위 2개를 가지는 항체 단편으로서, 동일한 폴리펩티드 사슬에 VL과 연결된 VH(VH-VL)를 포함하는 단편을 지칭한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이에 쌍형성을 허용할 수 없는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 단일 사슬 다이아바디는 2가 또는 2중 특이적일 수 있으며, 바람직하게는 2중 특이적일 수 있다. 단일 사슬 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디는 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
2중 특이적 scDb, 구체적으로 2중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예들에서, 링커 L1 및/또는 L3은 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 또는 2개를 포함한다[(GGGGS)n(서열 번호 121), 단 식 중, n=1(서열 번호 85) 또는 2(서열 번호 86)이고, 특히 n=1임].
중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예에서, 상기 링커 L2는 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 이상을 포함한다[(GGGGS)n(서열 번호 122), 단 식 중, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 특히 n=4(서열 번호 84)임].
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 ROR1-BD 1개, CD3-BD 1개 및 hSA-BD 1개를 포함하고, scDb-scFv 또는 scMATCH3 포맷을 가지는 단일 사슬 단백질이다. "scDb-scFv"란 용어는, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이 가요성 Gly-Ser 링커에 의해 단일 사슬 다이아바디(scDb)에 융합된 항체 포맷을 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 가요성 Gly-Ser 링커는 2개 ~ 40개의 아미노산, 예컨대 2개 ~ 35개, 2개 ~ 30개, 2개 ~ 25개, 2개 ~ 20개, 2개 ~ 15개, 2개 ~ 10개의 아미노산, 특히 10개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예에서, 상기 링커는 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 이상을 포함한다[(GGGGS)n(서열 번호 122), 단 식 중, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 특히 n=2(서열 번호 86)임]. 구체적으로 본 구현예의 단일 사슬 다중 특이적 항체는 scMATCH3 포맷을 가진다.
본 발명의 scMATCH3 다중 특이적 항체의 구체적이되 비제한적인 예로서는, 그 서열이 표 5에 나열된 PRO2286, PRO2287, PRO22507, PRO2508, PRO2509, PRO2510, PRO2557, PRO2596, PRO2667 및 PRO2668이 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 ROR1-BD 2개, CD3-BD 1개 및 hSA-BD 1개를 포함하고, 문헌[WO 2016/0202457; Egan T., et al., MABS 9(2017) 68-84]에 기재된 MATCH4 포맷인 이종이량체 단백질이다.
본 발명의 이종이량체 MATCH4 다중 특이적 항체의 구체적이되 비제한적인 예로서는, 그 서열이 표 5에 나열된 PRO2589, PRO2590, PRO2591, PRO2592, PRO2658, PRO2659, PRO2669 및 PRO2670이 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제작 방법이 사용되어 제조될 수 있다(예컨대 2중 특이적 구조체의 제조에 관한 문헌(Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74(2007) 3-14); 2중 특이적 다이아바디 및 탠덤 scFv에 관한 문헌(Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907(2012)713-727); 그리고 WO 99/57150을 참조한다). 2중 특이적 구조체의 제조에 적합한 방법의 특정 예로서는, 무엇보다도 Genmab 기술(문헌(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(2013) 5145-5150) 참조) 및 Merus 기술(문헌(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106(2010) 741-750) 참조)을 추가로 포함한다.
이러한 방법은, 통상적으로 공지의 분자 클로닝 기술을 사용하여 모노클로날 항체와, 상이한 모노클로날 항체 2개 이상의 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 또는 일부의 조합을 형성하여, 2중 특이적 구조체 또는 다중 특이적 구조체를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다중 특이적 항체는, 당 분야에 공지된 방법을 시용하여 구성적 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 2중 특이적 분자의 각각의 결합 특이성은 별도로 생성된 후 서로간에 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 공유 접합을 위한 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예로서는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세트산염(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산염(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산염(설포-SMCC)을 포함한다[예를 들어 문헌(Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)을 참조한다]. 기타 방법으로서는 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 문헌[Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375]에 기술된 방법을 포함한다. 접합제는 SATA 및 설포-SMCC인데, 이것들 둘 다는 Pierce Chemical Co.(Rockford, Ill.)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이는 중쇄 2개의 C 말단 경첩 영역의 설프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 구체적 구현예에서, 경첩 영역은 접합 전 홀수 개(예컨대 1개)의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로 2개 이상의 결합 특이성은 동일 벡터에서 암호화되어, 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 2중 특이적 분자가 mAb X Fab, mAb X scFv, mAb X dsFv 또는 mAb X Fv 융합 단백질일 때 특히 유용하다. 다중 특이적 항체 및 분자를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
다중 특이적 항체와 이의 특이적 표적의 결합은, 예를 들어 효소결합면역흡착검정(ELISA), 방사성면역검정(REA), FACS 분석, 바이오검정(예컨대 생장 억제) 또는 웨스턴블럿검정(Western Blot assay)에 의해 확인될 수 있다. 이 검정들 각각은, 일반적으로 관심 복합체에 특이적인, 표지화된 시약(예컨대 항체)을 사용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 확인한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 암호화하는 하나의 핵산 또는 2개의 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다.
"핵산"이란 용어는 본원에서 "폴리뉴클레오티드(들)"란 용어와 호환되어 사용되고 있으며, 1개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이것들의 중합체(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태)를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하는데, 이것들은 합성, 자연발생 및 비 자연발생되는 것이고, 참조기준 핵산의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조기준 뉴클레오티드의 대사 방식과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예들로서는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 암묵적으로 (예컨대 축퇴성 코돈 치환으로 인한) 자체의 보존적 변형 변이체와 상보성 서열을 포함할뿐만 아니라, 명백하게 명시된 서열을 포함하기도 한다. 특히 이하에 상세히 기술된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택 코돈(또는 모든 코돈)의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
본 발명은 전술된 바와 같은 다중 특이적 항체의 분절 또는 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 폴리펩티드가 적당한 발현 벡터로부터 발현될 때, 이 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD의 항원 결합능을 보일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 암호화하는 기존 서열(예컨대 이하 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신규 고체상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학 합성은 당 분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol.68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth.Enzymol.68: 109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra.Lett., 22: 1859, 1981]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예컨대 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods 및 Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포도 또한 제공된다.
"벡터"란 용어는, 그와 결합된 다른 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 가지 유형으로서는 "플라스미드"가 있는데, 이는 내부에 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형으로서는 바이러스 벡터가 있는데, 이는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 안에 들어가 결찰될 수 있다. 임의의 벡터는 이 벡터가 도입되는 숙주 세포내에서 자율 복제가 가능하다(예컨대 세균 복제 기원을 가지는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터(예컨대 비 에피좀 포유동물 벡터)가 숙주 세포에 도입될 때, 이 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.
게다가 임의의 벡터는 이것과 작동 가능하도록 결합된 유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태를 가진다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드"와 "벡터"는 호환되어 사용될 수 있는데, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나 본 발명은 이처럼 동일한 기능을 보이는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하도록 의도된다. 이러한 구체적인 맥락에서, "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA) 분절간 기능상 관계를 지칭한다. 통상적으로 이는, 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능상 관계를 지칭한다. 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열은, 만일 이것이 적당한 숙주 세포 또는 기타 발현계에 있는 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조정한다면, 암호화 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 것이다. 일반적으로 전사된 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 대해 물리적으로 연속적인데, 즉 이 프로모터 전사 조절 서열은 시스 작동성(cis-acting)이다. 그러나 몇몇 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는, 이것의 전사 향상 대상인 암호화 서열에 물리적으로 연속적이어야 한다거나, 가까이에 위치하여야 한다거나 할 필요가 없다.
본 다중 특이적 항체 사슬(들) 또는 이의 단편 또는 이의 결합 단편, 예컨대 ROR1-BD를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서는 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터 및 비 바이러스 발현 벡터 둘 다가 포유동물 숙주 세포 내에서 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 비 바이러스 벡터 및 계로서는 통상 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트를 가지는 플라스미드, 에피좀 벡터, 그리고 인간 인공 염색체를 포함한다(예컨대 문헌(Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997)을 참조한다). 예를 들어 포유동물(예컨대 인간) 세포에서 IL-4R 결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비 바이러스 벡터로서는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C(Invitrogen, San Diego, Calif.), MPS V 벡터와, 기타 단백질을 발현시키기 위한 것으로서 당 분야에 공지된 다수의 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터로서는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 한 벡터, SV40, 인간유두종바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스를 기반으로 한 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus; SFV)를 포함한다. 문헌[Brent et al., 상동; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되도록 의도된 숙주 세포에 의존적이다. 통상적으로 발현 벡터는 다중 특이적 항체 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 결합된 프로모터와 기타 조절 서열(예컨대 인핸서)을 함유한다. 일 구현예에서, 유도성 프로모터는, 유도 조건하에 있을 때를 제외하고, 삽입된 서열의 발현을 막기 위해 사용된다. 유도성 프로모터로서는, 예컨대 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양액은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 관용되는 암호화 서열 모집단에 대한 편향(biasing) 없이 비유도성 조건하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 더하여 기타 조절 요소들도 또한 다중 특이적 항체 사슬 또는 단편의 효율적인 발현에 필요할 수 있거나, 이에 요망될 수 있다. 이러한 요소는 통상 ATG 개시 코돈 및 인접 리보좀 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 뿐만 아니라 발현 효율은 세포계에서 사용되기 적당한 인핸서를 포함시킴으로써 향상될 수 있다[예를 들어 문헌(Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; 및 Bittner et al., Meth.Enzymol. 153:516, 1987)을 참조한다]. 예를 들어 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유동물 숙주 세포 내에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
사용될 벡터는, 통상적으로 다중 특이적 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들을 암호화한다. 임의의 경우, 백터는 또한 불변 영역 또는 그 일부를 암호화한다. 이러한 벡터는 가변 영역을, 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현시키고, 이로써 비변형 항체 및 이의 항원 결합 단편 생성의 유도를 허용한다. 통상적으로 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
"재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는, 내부에 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정의 대상 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손까지라도 지칭하도록 의도됨이 이해될 것이다. 돌연변이 또는 환경의 영향 중 어느 하나로 말미암은 임의의 변형은 후세대에서 일어날 수 있으므로, 이러한 자손은 실상 부모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어의 범위 안에는 여전히 포함된다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 보유하면서 이를 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 중 어느 하나일 수 있다. 이.콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝과 발현에 유용한 원핵생물 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 기타 미생물 숙주로서는 간균류, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 기타 장내세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵생물 숙주에 있어, 통상 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열(예컨대 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터가 제조될 수도 있다. 더욱이 널리 공지된 여러 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터계, 트립토판(trp) 프로모터계, 베타-락타마아제 프로모터계 또는 파아지 람다로부터 유래하는 프로모터계 임의의 수만큼이 존재할 것이다. 프로모터는 통상 선택적으로 작동인자 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사와 번역을 개시 및 종결하기 위한 리보좀 결합 부위 서열 등을 가진다. 기타 미생물, 예컨대 효모는 또한 본 발명의 다중 특이적 항체를 발현하기 위해 사용될 수도 있다. 곤충 세포는 또한 바큘로바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 발현 및 생산하는데 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어 이 포유동물 숙주 세포는 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 중 어느 하나일 수 있다. 이 포유동물 숙주 세포는 임의의 정상 유한증식성 동물 세포 또는 인간 세포, 또는 정상이거나 비정상인 무한증식성 동물 세포 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어 비변형 면역글로불린을 분비할 수 있는 숙주 세포주로서 적합한 것 다수(예컨대 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마)가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현시키기 위해 포유동물 조직 세포 배양액을 사용하는 것은, 일반적으로 문헌, 예컨대 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서[예를 들어 문헌(Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) 참조], 그리고 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 그리고 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는, 보통 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형 특이적, 단계 특이적 및/또는 변조 가능한 것이거나, 조절 가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터로서는, 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(major late promoter), 덱사메타손 유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPS V 프로모터, 테트라사이클린 유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 즉시 초기(immediate-early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 그리고 당 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라서 달라진다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 보통 원핵생물 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 기타 세포성 숙주에 사용될 수 있다[일반적으로 문헌(Green, M. R., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012))을 참조한다]. 기타 방법으로서는, 예컨대 전기천공법, 인산칼슘 처리, 리포좀 매개 형질전환법, 주입법 및 미세주입법, 탄도 방법(ballistic method), 바이로좀(virosome), 면역리포좀, 다가 양이온:핵산 접합체, 나출 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에의 융합(Elliot & O'Hare, Cell 88:223, 1997), 제제에 의해 향상되는 DNA 흡수, 그리고 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 종종 요망될 것이다. 예를 들어 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인, 예컨대 ROR1-BD를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터 도입후 세포는 선택적 배지에 대해 스위칭(switching)되기 전, 농축 배지 중에서 1일 ~ 2일 동안 생장하도록 허용될 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것으로서, 이 마커의 존재는 도입된 서열을 선택 배지에서 성공적으로 발현하는 세포의 생장을 허용한다. 내성으로서, 안정적으로 형질감염된 세포는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 ROR1-BD를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 경우 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 ROR1-BD를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써, 본 발명의 상기 다중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 ROR1-BD가 발현되도록 만드는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 제조하기 위한 방법으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 암호화하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 제조하는 방법으로서, (i) 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 2개의 핵산 서열, 또는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 암호화하는 하나의 벡터 또는 2개의 벡터를 제공하고, 상기 핵산 또는 핵산들 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시켜, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 ROR1-BD를 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 발현하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양하여, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 ROR1-BD를 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 항체의 구조를 망가뜨리지 않는 매질 또는 희석제를 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 향상 또는 안정화하거나, 조성물의 제조를 촉진한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서는 생리학적으로 양립 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
이러한 담체들중 임의의 것은 약학 조성물이, 예컨대 대상체에 의한 경구 섭취용 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 및 로진즈로서 제형화될 수 있도록 만든다. 이러한 담체들중 임의의 것은 약학 조성물이 주사, 주입 또는 국소 투여용으로 제형화될 수 있도록 만든다. 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 달라진다. 투여는 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하로 수행될 수 있거나, 표적 부위에 가까운 부위에서 투여가 이루어질 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 (예컨대 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여, 특히 근육내 또는 피하 투여에 적합하여야 할 것이다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 본 발명의 다중 특이적 항체가 재료로 코팅되어 그 내부에 들어갈 수 있고, 이로써 활성 화합물은, 이 화합물을 비활성화할 수 있는 산의 작용 및 기타 자연 조건으로부터 보호될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 널리 공지되어 있고, 당 분야에서 일상적으로 행하여지는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 약학 조성물은, 바람직하게 GMP 조건 하에서 제조된다. 통상적으로 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효 용량 또는 유효 용량만큼이 본 발명의 약학 조성물에 사용된다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 당 업자들에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제제화된다. 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예컨대 치료 반응)이 제공되도록 조정된다. 예를 들어 단일 볼루스 투여가 수행될 수 있거나, 수 회 분할 용량만큼이 경시적으로 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 응급도에 의해 알려지는 바와 비례하여 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일성을 도모하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위형이란, 치료될 대상체에 맞춘, 단위 투여형과 같이 물리적으로 별개인 단위들을 지칭하는데; 이 경우 각각의 단위에는 원하는 치료 효과가 발휘되도록 추산된 소정량만큼의 활성 화합물이, 필요한 약학 담체와 함께 담겨있다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성을 미치지 않고 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분 양만큼을 수득하기 위해 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예컨대 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료중인 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강상태 및 지금까지의 병력, 그리고 이와 유사한 인자들에 의존적이다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 보통 다수의 때에 투여된다. 단일 투여들간 간격은 1주일, 1개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자에 있어 본 발명의 다중 특이적 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 알려지는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 대안적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 적은 투여 횟수가 요구되는 경우 지연 방출 제제로서 투여될 수 있다. 투여량과 투여횟수는 환자에 있어 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 키메라 항체 및 비 인간 항체의 반감기보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량과 투여 횟수는 치료가 예방적인 것인지 또는 치료적인 것인지에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 적용의 경우, 비교적 적은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격을 두고 오랜 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자들은 자신의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받기도 한다. 치료적 적용의 경우, 비교적 많은 투여량이 비교적 짧은 간격을 두고 투여되는데, 이는 종종 질환의 진행이 느려지거나 종결될 때까지 이루어져야 하고, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 이루어져야 한다. 그 다음, 환자는 예방적 투여계획에 따라 투여받을 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다. 적합한 구현예에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암, 더욱 구체적으로 ROR1 발현 암 치료가 필요한 대상체에서 그의 치료에 사용하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암, 더욱 구체적으로 ROR1 발현 암을 치료하기 위한 의약을 제작할 때 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암, 더욱 구체적으로 ROR1 발현 암 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 적합한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 증식성 질환, 구체적으로 암, 더욱 구체적으로 ROR1 발현 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
"대상체"란 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다.
"동물"이란 용어는 모든 척추동물, 예컨대 비인간 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 명시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어들은 본원에서 호환되어 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는 것", "치료하다", "치료된" 등과 같은 용어는, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 이 효과는 어떤 질환 및/또는 해당 질환으로 인할 수 있는 부작용을 부분적으로나 완전히 치유하거나, 해당 질환의 진행을 지연시킨다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유동물, 예컨대 인간에서 어떤 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하며, (a) 해당 질환을 억제하는 것, 예컨대 이 질환의 발달을 중단시키는 것; 그리고 (b) 해당 질환을 완화시키는 것, 즉 이 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효 양"이란 용어들은, 어떤 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 기타 대상체에 투여될 때 해당 질환의 이와 같은 치료를 달성하기 충분한, 어떤 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제, 질환 및 이의 중증도, 치료받을 대상체의 나이, 체중 등에 따라서 달라질 것이다.
일 구현예에서, 증식성 질환은 암이다. "암"이란 용어는 비정상 세포의 급속하고 제어가 불가능한 생장으로 특징지어지는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로, 또는 혈류 및 림프계를 통해서 몸의 다른 부분으로 퍼져나갈 수 있다. "종양" 및 "암"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되고 있는데, 예컨대 상기 두 용어는 고형 및 액체형, 예컨대 확산성(diffuse) 또는 순환성(circulating) 종양을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "암" 또는 "종양"이란 용어는 전악성일뿐만 아니라, 악성인 암과 종양을 포함한다. "암"이란 용어는, 모든 고형암 및 혈액암을 포함한 광범위한 종양을 의미하도록 본원에 사용된다. 구체적으로 암은 ROR1 발현 암이다.
ROR1 발현 암의 비제한적 예로서는 림프구성백혈병/소림프구림프종(CLL/SLL), 급성골수성백혈병(AML), 급성림프아구성백혈병(ALL), 맨틀세포림프종(MCL), 모양세포백혈병, 소포림프종(FL), 변연부림프종(MZL), 확산성거대B세포림프종(DLBCL), 리히터증후군(RS), 폐암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 유방암, 난소암, 교모세포종, 고환암, 자궁암, 부신암, 흑색종, 신경모세포종, 육종 및 신암이 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 약학조성물은 고형 종양뿐 아니라 액체형 종양의 생장을 억제한다. 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 조성물은 또한 암이 발병한 대상체에서 종양의 전이적 확산 및 생장 또는 미세전이 발달을 예방하는데 적합하다.
서열 목록(돌연변이는 AHo 번호매김 체계에 따라 지명되었고; CDR은 달리 명시되지 않은 한 Numab CDR 정의에 따라 정의됨)
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
본 출원의 텍스트 전체에 걸쳐, 본 명세서의 텍스트(예컨대 표 1 ~ 6)와 서열 서열 목록 사이에 불일치가 있는 경우, 명세서의 텍스트가 우선한다.
명확함을 구현하기 위해 별도의 구현예들의 내용에 기술된 본 발명의 임의의 특징들은 또한 하나의 구현예와 조합하여 제공될 수 있음이 이해된다. 거꾸로 말하면, 간략함을 도모하기 위하여 하나의 구현예의 내용에 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 제공될 수 있거나 임의의 적합한 하위 조합을 통해 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 구현예들의 모든 조합들은, 특히 본 발명에 포함되고, 마치 각각의 조합과 모든 조합들이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다. 더욱이 다양한 구현예 및 이를 이루는 요소의 모든 하위 조합도 또한 본 발명에 의해 특별히 포함되고, 마치 각각의 하위 조합과 모든 하위 조합이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예들이 이루는 범위에 제한되지 않을 것이다. 실제로 본원에 기술된 변형 이외의 본 발명의 다양한 변형은 전술된 발명의 설명을 통해 당 업자들에게 명료해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허 청구의 범위 안에 속하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 간행물, 시험 방법, 문헌 및 기타 자료들은 각각의 특허법하에서 허용될 수 있는 정도로 본원에 참조로 인용되어 있다.
하기 실시예들은 전술된 본 발명을 설명하는 것이지, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 당 업자에게 공지되어 있는, 보통 말하는 그런 시험 모델로서 기타의 것도 또한 청구된 발명의 유리한 효과를 확정할 수 있다.
실시예
실시예 1: 항 ROR1 분자의 제조 및 시험:
본 프로젝트의 목적
본 프로젝트의 목적은, 인간 ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체 단편을 제조하기 위한 것이었다. 추가의 목적은 다중 특이적 항체 포맷으로 통합되기에 충분히 안정적이고 강력한 항 RROR1 항체 단편을 동정하기 위한 것이었다.
1.1 면역화
토끼 9마리가 인간 ROR1 세포외 도메인(ECD)으로 면역화되었다. 토끼 6마리는 Numab의 표준 프로토콜(70일의 기간에 걸쳐 항원 4회 주입으로 이루어짐)에 따라 면역화되었으며, 추가로 토끼 3마리는 연장된 프로토콜(표준 프로토콜과 동일한 초기 스케쥴과, 프로토콜 막바지, 즉 112일차로부터 4일 전에 진행되는 최종 항원 주입으로 이루어짐)에 따라 면역화되었다.
1.2. 분류 및 히트 동정
Numab의 표준 면역화 프로토콜에 따라 면역화된 토끼 6마리로부터 유래한 단일 B 세포 3,740개는, ROR1 세포외 도메인을 사용하는 FACS에 의해 분류되었다. 단일 B 세포는 배양되었으며, 분비된 관심 항체를 함유하는 B 세포 상청액은 4주의 기간에 걸쳐 수집되었다. 분류된 B 세포 3,740개중 클론 993개는 재조합 인간 ROR1과 결합함을 보였다(ELISA에 의한 분석). 이후 양성 클론은 이것이 ROR1 발현 세포와 결합하는 능력에 대해 시험되었으며, 클론 627개는 ROR1을 높은 수준으로 발현하는 암세포와 결합함을 보였는데(MDA-MB-231), 이 클론들 중 99개는 인간 ROR1 ECD에 대한 친화도를 800 pM 이하로 보였다. 이러한 클론의 중쇄 및 경쇄 서열이 회수되었으며, SPR에 의해 측정되었을 때 결합 친화도가 가장 큰 ROR1 결합 클론 15개는 재조합 토끼 IgG로서 생산될 것으로 선택되었다.
1.3 재조합 토끼 IgG의 제작
히트 확인(hit confirmation)을 위한 클론 선택 후, 추가의 특성규명을 위해 토끼 항체가 클로닝, 발현 및 정제되었다. 대응 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 클로닝은 적합한 포유동물 발현 벡터(pFUSE, Invivogen)로의 시험관내 DNA 단편 결찰을 수반하였다. 토끼 항체 중쇄 및 경쇄용 발현 벡터는 형질감염을 통해 포유동물 현탁 세포주(CHO-S)에 도입되었고, 이로써 일시적 이종 발현(50 ml 규모, Mirus CHOgro 발현 키트)이 도모되었다. 이후, 분비된 토끼 IgG는 친화도에 따라 정제되었으며(단백질 A 친화도 정제), 완충제는 PBS(pH 7.4)로 교환되었고, 최종 생성물은 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE, 데이터는 보이지 않음), 280 nm에서의 UV 흡광도 및 크기별 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 분석되었으며, 그 결과 동일성, 함량 및 순도가 인증되었다. 선택된 토끼 IgG 15개중 13개가 성공적으로 생산되었다.
1.4. 재조합 토끼 IgG(rIgG)의 히트 확인
연속으로 생산된 rIgG 13개는, 이것의 ROR1 발현 세포와의 결합 친화도(CELISA) 및 재조합 ROR1과의 결합 친화도(SPR)에 대해 평가되었다. 뿐 아니라, ROR1상 rIgG의 결합 영역은 토끼 IgG와 키메라 ROR1/ROR2 변이체 3개의 결합을 평가함으로써 규정되었다.
ROR1 발현 세포와의 결합(CELISA에 의한 분석)
ROR1 발현 세포와의 결합은 MDA-MB-231 세포(ATCC, cat. HTB-26, 인간 ROR1을 높은 수준으로 발현하는 인간 유방 선암종 세포) 및 MCF-7(ATCC, cat. HTB-22, 인간 ROR1을 발현하지 않는 인간 유방암 세포)을 사용하여 평가되었다. 세포 40,000개는 편평 바닥 조직 배양액 처리 96웰 평판에 분배되었다. 그 다음 날, 평판은 웰당 450 μl 세척 완충제(PBS, 0.2% BSA)로 범람 방식으로 3회 세척되었는데, 일련의 희석 시점마다 시험된 각각의 토끼 IgG뿐 아니라 참조기준 항 ROR1 항체 PRO1842(특허 출원 US 2017/0306018 A1에 개시된 바와 같은 서열 번호 129 및 130의 VH-/VL-서열을 포함하는 인간 IgG 항체) 50 μl가 첨가되었고, 가만히 진탕이 이루어지는 가운데 평판은 실온(RT)에서 1.5시간 항온처리되었다. 세척 완충제 450 μl로 3회 세척이 수행된 후, HRP 커플링 염소 항 토끼 IgG 또는 토끼 항 인간 IgG 항체 50 μl가 각각의 웰에 첨가되었다. RT에서 1시간 동안 경사각도조절 믹서(nutating mixer)상 항온처리가 수행된 후, 평판은 웰당 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었고, 이후 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00) 50 μl가 첨가되었다. 전개 10분 후, 웰당 1M HCl 50 μl가 첨가됨으로써 효소 반응이 중단되었으며, 평판은 참조기준 파장으로서 690 nm 파장이 이용되어 450 nm에서 판독되었다. PRO1842의 제조합체 생산을 위해, Gene Universal(Newark DE, United States)로부터 포유동물 발현 플라스미드(pcDNA3.1, 숙주: CHO-S)가 주문되었다. PRO1842의 발현 및 정제는 상기 섹션 1.3에 기재된 바와 유사한 방식으로 수행되었고, 의도되는 용도에 충분한 재료 및 순도(SE-HPLC 분석에 따르면 단량체 함량 98% 초과)가 수득되었다.
클론 11개는, ROR1 발현 세포와 결합함을 보였고, 이러한 클론들중 8개는 참조기준 항체 PRO1842의 EC50와 유사하거나 더 우수한 EC50으로 ROR1과 결합하였다(표 6 참조).
결합 친화도(SPR에 의한 분석)
토끼 IgG와 재조합 인간 ROR1 단백질(His Tag, Acro Biosystems)의 결합 역학(친화도 포함)은 Mass2 디바이스(Sierra 센서, Bruker)상에서 SPR 분석에 의해 확정되었다. 토끼 IgG 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(HCA 센서칩; Sierra 센서, Bruker)에 공유 부동화된 항 토끼 IgG 항체(염소 항토끼 IgG-Fc, Bethyl)를 통해 특정 스팟(spot)에 포획되었고, 재조합 인간 ROR1 단백질의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 매회 피분석물 주입 주기 이후, 센서칩상 모든 스팟이 재생되었고(글리신-HCl, pH 1.5), 이후 신규 토끼 IgG는 재포획되었다. 인간 ROR1에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)에 희석되어 0.176 nM ~ 90 nM 범위 사이에서 10가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka)와, 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델(Langmuir binding model)을 이용하여 Sierra 센서 분석 소프트웨어(Sierra 분석기, Sierra 센서, Bruker)로 산정되었고, 피트의 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
재조합 ROR1에 대한 친화도는 11개의 토끼 IgG에 대해 확정되었다. 클론 1개에 대해서는 결합이 관찰되지 않았고, 최고 결합 친화도 측정치는 1.06 nM이었다. 결과는 표 7에 요약되었다. 참조기준 항 ROR1 항체 PRO1776(국제특허출원공보 WO 2014/031174에 개시된 바와 같은 서열 번호 5 및 7의 VH-/VL-서열을 포함하는 인간 IgG4 항체)은 또한 유사한 셋업으로 측정되었다. PRO1776의 재조합체 생산을 위해 포유동물 발현 플라스미드(pcDNA3.1, 숙주: CHO-S)가 Gene Universal(Newark DE, United States)로부터 주문되었다. PRO1776의 발현 및 정제는 상기 섹션 1.3에 기재된 바와 유사한 방식으로 수행되었고, 의도된 용도에 충분한 재료 및 순도(단량체 함량 98% 초과, SE-HPLC 분석)가 수득되었다.
ROR1상 토끼 IgG(rIgG) 결합 영역의 동정
ROR1상 rIgG의 결합 영역을 규정하기 위해, 키메라 ROR1/ROR2 변이체 3개로 일시 형질감염된 HEK293T 세포와의 결합 정도는 CELISA에 의해 평가되었다. ROR1/ROR2 변이체는, ROR1의 도메인 3개(즉 ROR1의 Ig 유사 도메인(영역 1), ROR1의 곱슬 도메인(영역 2) 및 ROR1의 크링글 도메인(영역 3)) 각각을, ROR2의 대응 영역들로 교환함으로써 제조되었다. 잠재적 ROR2 결합제를 배제하기 위해 ROR2와의 결합은 우선 ELISA에 의해 평가되었고; 이 검정이 사용되었을 때 ROR2 결합제는 동정되지 않았다.
그 다음, 평판은 편평 바닥 폴리 D 리신 처리 96웰 평판의 웰당 25,000개 세포로 코팅되었다. 그 다음 날, 세포는 대응 구조체로 형질감염되었고, 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리되었다. 24시간 후, 세포는 세척 완충제(PBS, 0.2% BSA) 450 μl로 세척되었고, 시료가 첨가되었으며(10 μg/ml rIgG), 가만히 진탕이 이루어지고 있는 가운데 RT에서 1.5시간 동안 항온처리되었다. 세척 완충제 450 μl로 3회 세척이 이루어진 후, HRP 커플링 염소 항 토끼 IgG 항체 50 μl가 각각의 웰에 첨가되었다. RT에서 1시간 동안 경사각도조절 믹서상 항온처리가 수행된 후, 평판은 웰당 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었고, 이후 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00) 50 μl가 첨가되었다. 10분 후, 웰당 1M HCl 50 μl이 첨가되어 효소 반응 진행이 중단되었으며, 평판은 참조기준 파장으로서 690 nm 파장이 이용되어 450 nm에서 판독되었다. rIgG의 결합 수준은 토끼 IgG와 wt ROR의 결합 수준에 상대적으로 산정되었다. wt ROR1 단백질과 rIgG의 결합 수준과 비교되었을 때, 특정 변이체와 rIgG의 명백한 결합 수준 감소는, 각각의 ROR2 서열에 의해 치환된 인간 ROR1 분절내 rIgG 에피토프가 국소화되었음을 나타낼 것이다.
명백하게 규정된 결합 영역이 토끼 IgG 12개에 대해 동정되었다. rIgG 9개는 영역 1(ROR1의 Ig 유사 도메인)과 결합하였고, 항체 3개는 영역 2(ROR1의 곱슬 도메인)와 결합하였다. rIgG는 영역 3(ROR1의 크링글 도메인)과는 결합하지 않았다. 결과는 표 7에 요약되어 있다.
[표 7]
클론 8개는 참조기준 항 ROR1 항체 PRO1842보다 더 우수하거나 거의 동일한 결합 친화도를 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포에 대해 보였다. 이러한 클론 8개중 최선의 클론 7개는, Numab 틀상 인간화 단일 사슬 Fv의 2가지 버전으로서 발현되는 것으로 선택되었다.
1.5. scFv 생성
scFv 생성
서열 인간화의 목적은, 본 발명의 관심 분자에 대한 면역원성 발생 위험을 감소시키고, 항체 가변 도메인(Fv 단편)을 안정화하여, 다중 특이적 포맷 조립에 대한 빌딩 블록(building block)으로서 사용될 수 있도록 만드는 것이다. 그러므로 인간화는 공여개체(토끼) 상보성 결정 영역(CDR) 서열로부터 유래한 중요 잔기를, 인간 수여 틀에 옮겨 기능에 유의미한 영향을 미치지 않고 인간적합성(humanness)을 증가시키고, 안정성을 개선하는 과정을 포함한다.
선두 ROR1 scFv 도메인 생성을 위하여, 토끼 모노클로날 항체 클론 7개가 표 7에 보인 바와 같이 선택되었다. 이러한 클론의 인간화는 토끼 CDR을, Numab 소유의 인간 가변 도메인 수여 스캐폴드들중 하나에 옮기는 과정을 포함하였다. 이 과정에서 CDR 영역 6개의 아미노산 서열은 Numab CDR 정의가 이용되어 특성규명되었고(표 8), Numab 소유의 매우 안정적인, 전체가 인간의 것인 VH3/Vk1-람다-캡핑 수여 틀에 그래프팅(grafting)되었는데; 이 구조체는 "CDR 그래프트"로 공지되어 있다.
[표 8]
토끼 CDR의 인간 수여 틀로의 배타적 생착은, 가장 기본적인 그래프팅 전략으로서, 본원에서는 "CDR 그래프팅"이라 지칭된다. CDR 그래프팅 이외에, 추가의 그래프팅 변이체는 토끼 틀 잔기의 한정된 패턴을 함유하도록 디자인되었다(본원에서는 "전체 그래프트"라 지칭됨). 이러한 그래프팅 변이체에 관한 상세한 사항은 이하와 같다:
CDR 그래프팅: 토끼 CDR의 Numab 수여 틀로의 생착(Numab CDR 정의 이용). 공여 틀 잔기의 역 돌연변이는 일어나지 않음.
전체 그래프트: 공여 Fv 코어 잔기, 공여 VL/VH 계면 잔기뿐 아니라, 항원과잠재적으로 상호작용하는 공여 틀 잔기를 함유하는, 최대 그래프트.
표 9는 ROR1 인간화 도메인의 CDR 및 전체 그래프트를 요약하고 있다. 인간틀에 생착된 토끼 틀 잔기는 VL 도메인 및 VH 도메인에 대해 별도로 나열되어 있다(AHo 번호매김 이용).
인간화 scFv 구조체의 포유동물 발현 플라스미드(pcDNA3.1, 숙주: CHO-S)는 1　mg 규모로 Gene Universal로부터 주문되었다. 플라스미드는 이하에 기재된 바와 같이 CHO-S 세포의 일시 형질감염을 위해 사용되었다.
scFv 제작
CHO-S 세포에서 CHOgro 일시 형질감염 키트(Mirus)를 사용하여 포유동물 scFv 구조체 발현이 수행되었다. 37℃에서 최장 7일 동안 발현이 진행된 후(또는 세포 생존률이 70% 미만으로 도달하였을 때) 배양액은 원심분리 후 여과됨으로써 수집되었다. 청징화된 배양 상청액으로부터 단백질 L 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질이 정제되었다. 클론 55-06-E06 유래 scFv를 제외하고, 모든 분자는 SE-HPLC 분석에 의해 평가되는 바에 따르면 포획후 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획을 보였다. 모든 분자는 투석에 의해 150　mM NaCl(pH 6.4) 포함 50　mM 인산염-시트르산염 완충제에 대해 직접 재완충되었다. 클론 55-42-E05(PRO2065)의 CDR 그래프트는 낮은 발현 역가를 보였던 관계로, 추후 이용될 수 없었다. 제작된 재료의 품질 제어를 위해, 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 적용되었다. 인간화 항 ROR1 scFv 분자의 제작은 표 10에 요약되어 있다.
scFv 1개는 발현될 수 없었으므로(55-42-E05-sc01/PRO2065), scFv 14개중 13개만이 후속 약동학적 특성규명의 대상이 되었다.
[표 9]
[표 10]
1.6. scFv 특성규명
ROR1 발현 MDA-MB-231 세포에 대한 세포 결합(유세포분석에 의한 분석)
MDA-MB-231 세포(ATCC, cat. HTB-26, 인간 ROR1을 높은 수준으로 발현하는 인간 유방 선암종 세포) 및 MCF-7(ATCC, cat. HTB-22, 인간 ROR1을 발현하지 않는 인간 유방암 세포)가 수확된 다음, 세포 수가 확정되었다. 세포 현탁액은 400 x g에서 5분 동안 원심분리되었으며, PBS-EB(1x DPBS, 2% FCS H.I., 2 mM EDTA)에 희석된 세포 현탁액(50,000개 세포) 100 μl는 미결합 96웰 평판의 지정된 웰에 첨가되었다. PBS-EB에 의한 세척 단계가 3회 진행된 후, 세포는 원심분리되었고, 세척 완충제는 흡인되었다. scFv 및 참조기준 항 ROR1 Fab 단편 PRO2213(특허출원 US 2017/0306018 A1에 개시된 바와 같은 서열 번호 129 및 130의 VH-/VL-서열을 포함하는 인간 Fab 단편)의 3배 연속 희석액(출발 농도 39 nM(scFv) 또는 63 nM(PRO2213))이 제조된 다음, 세포와 함께 평판에 첨가되었다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리가 진행된 후, 평판은 PBS-EB 100 μl가 사용되어 3회 세척되었다. scFv와 함께 항온처리된 세포는 Numab 틀 특이적 검출 항체(PRO2268, 토끼 IgG) 100 μl 로 제현탁되었고, 4℃에서 30분 동안 항온처리되었다. 세척 단계 후, APC로 표지화된 항 토끼 IgG 항체(농도 2 μg/ml)가 첨가됨으로써 궁극적으로 PRO2268이 검출되었으며, 이는 4℃에서 1시간 동안 항온처리되었다. 참조기준 Fab 단편 PRO2213과 함께 항온처리된 세포는 염소 항 인간 F(ab')2 Alexa Fluor 647-접합 항체(Jackson Immuno Research, cat. 109-606-097) 100 μl으로 재현탁된 후(농도 2.8 μg/ml), 4℃에서 1시간 동안 항온처리되었다. 그 다음, 세포는 웰당 PBS-EB 100 μl가 사용되어 다시 3회 세척되었다. 세포 펠릿은 50 μl PBS-EB으로 재현탁되었으며, NovoCyte 2060 유세포분석 디바이스로 분석되었다. 각각의 시료에 대해 APC 채널의 형광 세기가 기록되었으며, 형광 세기(MFI)의 기하학적 평균이 산정되었다. 데이터가 단일 참조(single-referencing)되었고(오로지 검출 시약과만 항온처리된 세포를 대상으로 파악되는 형광 세기에 대해 공제되었고), 후속 농도-반응 곡선은 4-PL 피트(GraphPad Prism 소프트웨어)가 사용되어 피팅되었다. PRO2213은 인간 IgG PRO1842의 파페인 분해를 통해 제조되었다. PRO2213은 의도된 용도에 충분한 양과 순도(단량체 함량 98% 초과, SE-HPLC 분석)로 제조될 수 있었다.
세포 표면 인간 ROR1에 대한 겉보기 결합 친화도가 평가되었고, scFv 4개는 인간 ROR1 발현 세포와의 결합에 대해, 참조기준 Fab 단편 PRO2213보다 3배 이하로 더 낮은 EC50을 보였다. scFv 2개는 인간 ROR1을 발현하는 세포와의 결합을 보이지 않았다(표 11). 비특이적 결합에 대해 시험하기 위해, scFv 모두는 유세포분석을 통해 인간 ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합에 대해 시험되었으며, 시험된 그 어떤 scFv도 MCF-7 세포와의 결합을 보이지 않았다. 항 ROR1 scFv인 PRO2060 및 PRO2062의 경우, 원형질막 기반 인간 ROR1에 대한 겉보기 결합 친화도는 3회 및 2회의 독립된 유세포분석 실험에서 각각 평가되었다. 이 실험에서 구하여진, PRO2060 및 PRO2062에 대한 평균 EC50 값 및 평균 상대 EC50 값도 또한 표 11에 보였다. scFv 둘 다는, 인간 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포에 대해 특이적인 결합을 보였던 반면, ROR1 음성 MCF-7 세포와는 결합하지 않는 것으로 확인되었다(도 1 참조). PRO2060은, 참조기준 Fab 단편인 PRO2213과 비교되었을 때, 대략적으로 3배 더 낮은 겉보기 결합 친화도를 보였던 반면, PRO2062는 대략적으로 3배 더 높은 겉보기 결합 친화도를 보였다.
[표 11]
PRO2060 및 PRO2062는 각각 3회 및 2회의 독립된 실험에서 측정되었으며, 평균 EC50, 평균 상대적 EC50, 평균 상대적 최대 결합의 값이 산정되었다. PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 사용되었다.
결합 친화도(SPR에 의한 분석)
재조합 인간 ROR1 단백질(Fc-Tag, Acro Biosystems)에 대한 scFv의 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상에서 SPR 분석에 의해 확정되었다. 재조합 인간 ROR1 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었고, 각각의 scFv의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었으며(글리신, pH 2.0), 신규 농도의 scFv가 주입되었다. 인간 ROR1에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)중에 희석되어 0.005 nM ~ 30 nM 범위에서 9가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 이용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 곡선 피팅의 품질에 대한 척도 Chi2 및 U값을 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
scFv 13개 모두는, 이것들의 ROR1 발현 세포 및 재조합 hROR1에 대한 결합 친화도에 대해 평가되었다. 데이터는 상관되었으며, 표 12에 제시되었다.
hROR1에 대한 친화도는 scFv 8개에 대해 확정되었다. 친화도는 160 nM ~ 0.098 nM의 범위였다. scFv 3개는, Fab 단편 참조기준 PRO2213보다 더 우수한 친화도를 보였다. scFv 3개에 있어 친화도는 기술상의 이유로 말미암아 확정될 수 없었으며, scFv 2개에 대해서는 결합이 관찰되지 않았다(표 12).
[표 12]
(SPR 및 세포 결합 분석에 의하였을때) 결합을 보이지 않은 도메인 또는 정확히 규정될 수 없는 데이터는 추가의 분석에서 배제되었다. SPR에 의하면 인간 ROR1 발현 세포에 대해 최고의 결합을 보일뿐 아니라 재조합 인간 ROR1 ECD에 최고의 친화도를 보이는 상이한 클론 3개로부터 유래한 scFv 4개는 추가의 생물물리학적 특성규명을 위해 선택되었다. 이러한 도메인은 PRO2060, PRO2062, PRO2059 및 PRO2066을 포함하였다.
사이노몰거스 원숭이 ROR1은 인간 ROR1과 100% 동일하였으므로, 이러한 도메인의 종간 결합(cross-species binding)을 보이기 위해 추가의 결합 평가는 필요하지 않았다.
1.7. scFv 도메인의 생물물리학적 특성규명(보관 안정성 및 DSF)
보관 안정성
인간화 scFv를 대상으로 4주간의 안정성 연구가 수행되었는데, 이 때 scFv는 수성 완충제(50　mM NaCiP, 150　mM NaCl, pH 6.4)중에 10　mg/ml로 제제화되었고, 80℃ 미만, 4℃ 및 40℃의 온도에서 28일 동안 저장되었다. 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정중 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 13은 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었다. 그러나, 실험 개시 당일의 시료중 단백질 농도에 상대적인, 임의의 시료중 단백질 농도에는 눈에 띄는 변화가 관찰되지 않았으므로, 데이터는 보이지 않았다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하기 위해 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. 결과는 표 13에 보였다.
PRO2059 및 PRO2060(클론 55-38-D07의 유도체)은 우수한 안정성 프로필을 보였는데, 이 때 시험된 모든 온도에서는 단지 미약한 단량체 감소만이 있었을뿐, 분자 4개의 열 안정성은 전반적으로 최고였다. PRO2062(클론 55-39-G02의 유도체)는 40℃에서의 단량체 감소 정도 및 열 안정성과 관련하여 PRO2059 및 PRO2060보다 열등하였다. PRO2066(클론 55-42-E05의 유도체)은 4℃ 및 40℃에서 상당한 단량체 감소율을 보였으므로, (Tm 70.6℃일 때, 자체의 허용 가능한 열 안정성에도 불구) 본 연구에서 최소한으로 안정적인 분자로서 간주될 수 있었다.
요약하면, PRO2060 및 PRO2062는 선두 도메인으로서 간주되어 사용되었다. 이 도메인은, 약동학적 특징 및 생물물리학적 특징의 조합을 기반으로 또 다른 도메인과 비교되어 선택되었다. 분자 둘 다는 ROR1 ECD 영역 1의 상이한 에피토프들과 결합하였는데, 이로써 추가적인 후보분자 다양성이 허용되었다. 선두 도메인들은 다음 섹션에 개괄적으로 기재된 바와 같이, T 세포 점수 및 안정성을 개선하기 위해 단백질 조작에 의한 최적화에 사용되었다.
1.8. 최적화된 단일 사슬 도메인의 생성
PRO2062는 상당히 높고, 컴퓨터시뮬레이션에 의해 산정된 T 세포 점수를 보였는데(1,662), 이는 인간에 도입될 때 면역 반응 자극 가능성이 높음을 나타낸다. T 세포 점수를 감소시키기 위해, CDR중 1개(CDR1H)가 변형되었다. 토끼안에서, CDR1H의 하나의 절반은 더욱 보존적이었던 반면, 나머지 절반은 더욱 가변적이었다. 기타 통상의 모든 CDR 정의(IMGT, Chothia 및 Honegger)와는 대조적으로, Kabat CDR 정의는 CDR1H의 가변적인 나머지 절반만을 포함하였다. 결합을 파괴할 위험을 최소화하기 위해, 보존된 CDR1H 부분에 돌연변이 2가지가 도입되었는데, 그 이유는 가변적 CDR1H 부분이 항원과의 상호작용에 더욱 중요할 수 있기 때문이다. 또다른 클론으로부터 유래한 CDR1H 서열은, 동일한 프로젝트로부터 유래한 서열을 분석함으로써, T 세포 점수를 낮추고, 보존된 CDR1H 부분 아미노산 2개가 단지 상이한 것으로 동정될 수 있었다. 더욱이, 이 CDR1H 서열은 PRO2062 가변 CDR1H 서열과 유사하였는데, 이는 보존된 CDR1H 부분의 돌연변이 2개(L27I 및 S28D)가 단백질 구조와 잘 부합될 수 있었음을 나타낸다. 뿐만 아니라, 컴퓨터시뮬레이션에 의한 돌연변이유발은, 돌연변이 2개가 탈안정화되지 않았음을 보여주었다. T 세포 감소 돌연변이에 더하여, 소위 공여 중쇄의 외측 루프가 그래프팅되었는데, 그 이유는 이것이 CDR3H의 올바른 위치선정에 중요하고, CDR1H에서의 변형에 대한 보상으로서 사용될 수 있었기 때문이다. 요약하면, FW3H의 분절(AHo 잔기 82 ~ 87)은 KTST에 의해 치환되었던 반면(R82K, D83T, N84S, N87T(틀 내 S85 및 K86은 결실됨)), AHo89는 Val에서 Leu으로 변경되었고(VH3 공통), AHo90은 Tyr에서 Asp로 변경되었다(공여개체). CDR1H 및 외측 루프에 T 세포 점수 감소 돌연변이(T cell score reducing mutation)가 발생한 PRO2271의 획득 T 세포 점수는 1,160점이 되었다. PRO2271의 T 세포 점수 감소 돌연변이 및 외측 루프와 동일한 T 세포 점수 감소 돌연변이 및 외측 루프를 가지되, 공여 잔기는 PRO2271의 공여 잔기보다 더 적은 추가의 변이체 1개(PRO2272, 55-39-G02-sc04)가 생성되었다. PRO2292, 즉 AHo 141VL-51VH 사이에 이황화결합을 가지는 PRO2062는 비교적 높은 T 세포 점수 값(1,662)을 보였다.
[표 13]
PRO2060은 T 세포 점수 949였으므로, T 세포 점수 최적화는 필요하지 않았다. PRO2291, 즉 AHo 141VL-51VH 사이에 이황화결합을 가지는 PRO2060은 PRO2060의 T 세포 점수 값과 동일한 T 세포 점수 값(949)을 보였다. 최적화된 변이체는 표 14에 요약되어 있다.
[표 14]
1.9. 최적화된 단일 사슬 도메인의 특성규명
최적화된 scFv와 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포의 세포 결합(유세포분석에 의한 분석)
최적화된 scFv와 인간 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포의 원형질막 결합이 전술된 바와 같이 유세포분석법에 의해 분석되었다. 요약하면, 항 ROR1 클론 55-39-G02의 최적화된 scFv(PRO2271, PRO2292) 및 클론 55-38-D07의 최적화된 scFv(PRO2291), 그리고 참조기준 Fab 단편 PRO2213의 5배 연속 희석액(출발 농도 40 nM)이 제조된 다음, 세포와 함께 평판에 첨가되었다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리가 진행된 후, 평판은 세척되었고, 특이적인 검출용 항체와 함께 항온처리되었다. APC 채널의 형광 세기는 NovoCyte 2060 유세포분석기가 사용되어 각각의 시료에 대해 기록되었고, 형광 세기 MFI의 기하학적 평균이 산정되었다.
최적화된 scFv PRO2271, PRO2291 및 PRO2292와 원형질막 인간 ROR1의 겉보기 결합 친화도는 유세포분석 실험에서 평가되었다. 이러한 실험에서 수득된 EC50, 상대적 EC50, 그리고 상대적 최대 결합의 값에 대한 산정치는 표 15에 보였다. 도 2에 보인 바와 같이, scFv 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와의 결합을 보였던 반면, ROR1 음성 MCF-7 세포와는 결합하지 않은 것으로 확인되었다. PRO2271, 즉 T 세포 점수 최적화 및 외측 루프 그래프팅이 이루어진 PRO2062의 변이체는, 원래의 scFv PRO2062와 비교되었을 때 대략 2배 더 낮은 겉보기 결합 친화도를 보였다. 안정화를 위한 VL-VH 도메인간 이황화 결합을 포함하는 PRO2060 및 PRO2062의 변이체 PRO2291 및 PRO2292는 부모 scFv PRO2060 및 PRO2062와 거의 동일한 겉보기 결합 친화도를 보였다.
[표 15]
결합 친화도(SPR에 의한 분석)
재조합 인간 ROR1 단백질(Fc-Tag, Acro Biosystems)과, 최적화된 scFv PRO2071, PRO2291 및 PRO2292의 결합 역학(친화도 포함)은, 섹션 1.6에 기재된 바와 같이 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다.
인간 ROR1에 대한 친화도는 최적화되지 않은 버전(비교예)의 친화도와 함께 확정되었다. SPR 분석 결과는 표 16에 요약되어 있다.
[표 16]
1.10. scFv 도메인의 생물물리학적 특성규명(보관 안정성 및 DSF)
인간화 scFv의 최적화된 변이체를 대상으로 4주간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 scFv는 수성 완충제(50 mM NaCiP, 150 mM NaCl, pH 6.4)중에 제제화되었으며(10 mg/ml), -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃의 온도에서 4주 동안 저장되었다. 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정중 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 17은 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었다. 그러나, 실험 개시 당일의 시료에 상대적으로, 임의의 시료에는 눈에 띄는 변화가 관찰되지 않았으므로, 데이터는 보이지 않았다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하기 위해 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. 결과는 표 17에 보였다.
클론 55-39-G02(PRO2271)의 최적화된 유도체는 PRO2062의 안정성과 유사한 안정성을 보였다. VL-VH 이황화결합을 포함하는 클론 55-38-D07 및 55-39-G02의 유도체(PRO2291 및 PRO2292) 둘 다는, 이황화결합을 가지지 않는 이의 대응항체(PRO2060 및 PRO2062)와 비교되었을 때 개선된 안정성을 보였으며, 전체적으로 가장 안정한 scFv 도메인으로서 간주될 수 있었다.
실시예 2: 항 CD3 분자의 생성 및 시험:
항 CD3 토끼 IgG 클론 28-21-D09의 동정, 선택 및 인간화뿐 아니라, 이에 대응하는 인간화 항 CD3 scFv 28-21-D09-sc04(PRO726)의 생산 및 특성규명은, 본원에 참고문헌으로서 첨부된 특허출원공보 WO　2018/224441에 기재된 바와 같이 수행되었다. 항 CD3 scFv PRO726의 특성규명은 이하에 간단히 요약되었다.
2.1. 항 CD3 scFv 28-21-D09-sc04(PRO726)의 특성규명
결합 친화도 및 종간 교차 반응성(FS)
선택된 결합 도메인 28-21-D09-sc04(PRO726)와 재조합 인간 CD3 입실론 세포외 도메인 단백질(hCD3εHis-Tag, SinoBiological)의 결합 역학(친화도 포함)은, T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상에서의 SPR 분석에 의해 확정되었다. 재조합 hCD3ε 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었으며, PRO726의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널은 재생되었고(글리신, pH 2.0), 신규 농도의 PRO726이 주입되었다.
[표 17]
[표 18]
hCD3ε에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)에 1:2로 희석되어 0.7 nM ~ 90 nM 범위 사이에 8가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd1) 및 결합 속도 상수(ka1)와, 제2의 반응 상수(ka2 및 kd2), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 2상태 결합 모델을 이용하는 Biacore 결합 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
재조합 사이노몰거스 원숭이 CD3εεHis-Tag; SinoBiological)에 대한 결합 역학은 상기 hCD3ε에 대해 언급된 바와 같이 측정되었는데, 다만 hCD3ε 대신 cCD3ε이 사용되었다는 점에 차이를 두었다. 결과는 표 18에 요약되어 있다.
생물물리학적 특성규명
인간화된 CD3-결합 도메인을 대상으로 4주간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 scFv는 수성 완충제(50 mM NaCiP, 150 mM NaCl, pH 6.4)중에 10 mg/ml로 제제화되었으며, -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃의 온도에서 4주 동안 저장되었다. 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정 내내 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 19는 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었다. 그러나, 실험 개시 당일 d0의 시료중 단백질 함량에 상대적인, 임의의 시료중 단백질 함량에 눈에 띄는 감소가 관찰되지 않았으므로, 데이터는 보이지 않았다.
시차주사형광도측정법(DSF) 측정으로부터 수득된 열 언폴딩 데이터는 표 19에 보였다. 결과의 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)는 볼츠만 방정식에 데이터를 피팅함으로써 확정되었다.
[표 19]
실시예 3: 항 hSA 분자의 생성 및 시험
인간화된 항 hSA 결합 도메인 19-01-H04-sc03(PRO0325) 및 23-13-A01-sc03(PRO0459)의 동정, 선택, 인간화뿐 아니라 생산 및 특성규명은 본원에 참고문헌으로서 인용된 특허출원 EP　19　206　959.9에 기재된 바와 같이 수행되었다. 인간화된 항 hSA 결합 도메인19-04-A10-sc02(PRO2155)의 동정, 선택, 인간화뿐 아니라 생산 및 특성규명은 특허출원 EP　19　206　959.9에 기재된 절차와 유사하게 수행되었다. 항 CD3 scFv PRO2155의 특성규명은 이하에 간단히 개괄적으로 기재되어 있다.
3.1. 항 hSA scFv 19-04-A10-sc02(PRO2155)의 특성규명
결합 친화도 및 종간 교차 반응성
선택된 도메인 19-04-A10-sc02와 인간 혈청 알부민(hSA, Sigma-Aldrich A3782)의 결합 역학(친화도 포함)은 pH 7.4 및 pH 5.5 둘 다에서 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. hSA 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩, Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었으며, 각각의 scFv 분자 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서 칩상 모든 유동 채널은 재생되었고(글리신, pH 2.0), 신규 농도의 scFv 분자가 주입되었다. hSA에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정법이 사용되어 측정되었는데, 이 때 유관 전개 완충제(PBS 0.05% Tween-20, 또는 PBS 0.05% Tween-20, pH 5.5)중에 0.044 nM로부터 45　nM까지 11가지 농도로 희석(1:2)이 이루어졌다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는, 1:1 랑뮈르 결합 모델이 사용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었으며, 피트 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
선택된 scFv의 결합 역학은 또한, 전술된 바와 같이, 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민(cSA, Molecular Innovations CYSA) 및 마우스 혈청 알부민(mSA, Sigma-Aldrich A3559)에 대해 확정되었는데, 다만 hSA 대신에 cSA 또는 mSA가 사용되었다는 점에 차이를 두었다. pH 5.5 및 pH 7.4에서 hSA, mSA 및 cSA에 대한 결합 역학은 표 20에 요약되어 있다.
[표 20]
생물물리학적 특성규명
HSA-도메인 19-04-A10-sc02(PRO2155) 및 19-04-A10-sc06(VL-VH 이황화결합을 가지는 sc02 도메인, VL-T141C/VH-G51C, AHo 번호매김; PRO2317)을 대상으로 4주간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 scFv는 수성 완충제(50 mM NaCiP, 150 mM NaCl, pH 6.4)중에 제제화되었으며(10 mg/ml), -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃의 온도에서 4주 동안 저장되었다. 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정 내내 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 21은 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었다. 실험 개시 당일의 시료중 단백질 용량에 상대적인, 임의의 시료중 단백질 용량에는 눈에 띄는 변화가 관찰되지 않았으므로, 데이터는 보이지 않았다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하기 위해 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. DSF 결과는 표 21에 보였다.
[표 21]
실시예 4: scMATCH3 항 ROR1xCD3xhSA 다중 특이적 항체의 생성 및 제조
HSA-, CD3- 및 ROR1-결합 도메인은 3중 특이적 scMATCH3 포맷으로 합하여졌다. scMATCH3 포맷은, 도 3에 도시된 바와 같이, 상이한 길이의 GS-링커에 의해 연결된 가변적 도메인들로만 이루어졌다. 이 포맷에서 전체적으로 기능성인 3중 특이적 분자로 조립되는, 분할 가변 도메인들은 단일 펩티드 사슬(sc)상에 위치한다. scFv 도메인에서와 유사하게, VL/VH 이황화 결합은 개별 도메인들의 안정화를 위해 통합될 수 있다. scMATCH3 분자는 포유동물 세포에서 재조합에 의해 발현될 수 있으며, 종래의 친화성 크로마토그래피 단계가 이의 정제를 위해 사용될 수 있었다.
포유동물 scMATCH3 구조체의 발현은 CHOgro 일시 형질감염 키트(Mirus)가 사용되어 CHO-S 세포내에서 수행되었다. 배양액은 37℃에서 5일 ~ 7일 동안 발현이 이루어진 후(세포 생존률이 70% 미만으로 도달되었을 때) 원심 분리 및 여과에 의해 수집되었다. 단백질은 청징화된 배양 상청액으로부터 300 mM 수크로스를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중 단백질 L 친화성 크로마토그래피 이후 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제되었다. SEC 분획의 단량체 함량은 SE-HPLC 분석에 의해 평가되었고, 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획들이 풀링(pooling)되었다. 제작된 재료의 품질 제어를 위해, 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 수행되었다. 분자 도메인 조성과 scMATCH3 분자의 제작에 관한 요약은 표 22에 보였다.
변형되었거나 개선된 ROR1-, CD3- 및 hSA-결합 도메인을 포함하는 scMATCH3 분자 PRO2667 및 RPO2668은 Evitria AG 소유의 포유동물 발현계가 사용되어 Evitria AG(Schlieren, Switzerland)에서 1　l 규모로 제조되었다. 단백질은 청징화된 배양 상청액으로부터 300 mM 수크로스를 포함하는 50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중 단백질 L(CaptoL, Cytiva) 친화성 크로마토그래피 이후 SEC에 의해 정제되었다. SEC 분획들의 단량체 함량은 SE-HPLC 분석에 의해 평가되었고, 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획들이 풀링되었다. 제작된 재료의 품질 제어를 위해, 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 수행되었다. 이러한 scMATCH3 분자들의 제작에 관한 요약은 표 23에 보였다. 분자의 열 안정성은 Prometheus NT.48 디바이스(NanoTemper)가 사용되는 nDSF에 의해 평가되었다.
[표 22]
[표 23]
실시예 5: scMATCH3 분자의 약동학적 특성규명
5.1. 결합 친화도(SPR에 의한 분석)
표적 3개, 즉 인간 ROR1(hROR1), 인간 CD3εCD3ε및 hSA에 대한 다중 특이적 scMATCH3 분자 9개의 결합 역학은 SPR에 의해 시험되었다.
hROR1에 대한 결합 친화도(SPR 분석)
재조합 인간 ROR1 단백질(Fc-Tag, Acro Biosystems)에 대한 scMATCH3 분자 9개의 결합 역학(친화도 포함)은 섹션 1.6에 기재된 바와 같이 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 재조합 인간 ROR1 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었고, 각각의 MATCH3 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었으며(글리신, pH 2.0 및 3 M MgCl2), 신규 농도의 MATCH3 분자가 주입되었다. 인간 ROR1에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)중에 1:2로 희석되어 0.088 nM ~ 45 nM 범위에서 9가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 이용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 곡선 피팅의 품질에 대한 척도 Chi2 및 U값을 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hROR1에 대한 결합 역학은 친화도가 1.6 nM ~ 0.12 nM 범위인 scMATCH3 9개에 대해 확정되었다(표 24). 시험된 scMATCH3 분자 모두에 대한 hROR1 친화도는 각각의 부모 scFv에 대한 hROR1 친화도와 유사하였다.
[표 24]
hCD3ε에 대한 결합 친화도(SPR 분석)
재조합 인간 CD3 엡실론 세포외 도메인 단백질(hCD3εHis-Tag, SinoBiological)에 대한, 선택된 scMATCH3 분자 9개의 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 재조합 hCD3ε 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었고, 각각의 MATCH3 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었으며(글리신, pH 2.0 및 3 M MgCl2), 신규 농도의 MATCH3 분자가 주입되었다. hCD3ε에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)중에 1:2 희석되어 0.088 nM ~ 45 nM 범위에서 9가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 제2의 반응 상수(ka2 및 kd2), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 2상태 결합 모델이 이용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hCD3ε에 대한 결합 역학은 친화도가 9.4 nM ~ 1.5 nM 범위인 scMATCH3 9개에 대해 확정되었다(표 25). 시험된 MATCH3 분자 모두에 대한 hCD3ε 친화도는 부모 scFv 28-21-D09-sc04에 대한 hCD3ε 친화도와 유사하였다.
[표 25]
hSA에 대한 결합 친화도(SPR 분석)
인간 혈청 알부민(hSA, Sigma-Aldrich)에 대한, 선택된 scMATCH3 분자 7개의 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. hSA 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었고, 각각의 MATCH3 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다(Exp. ND032-0033). 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었으며(글리신, pH 2.0), 신규 농도의 MATCH3 분자가 주입되었다. hSA에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 유관 완충제(PBS, 0.05% Tween-20, pH 5.5)중에 1:2로 희석되어 0.352 nM ~ 180 nM 범위에서 10가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 이용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 곡선 피팅 품질에 대한 척도인 상대적 Chi2 및 U값을 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hSA에 대한 결합 역학은 MATCH3 분자 7개에 대해 확정되었다(표 26). 시험된 MATCH3 분자 모두에 대한 hSA의 pH 5.5에서의 친화도는 MATCH3 분자의 전신 반감기를 연장시키기에 충분한 것으로 생각되었다.
[표 26]
5.2. scMATCH3 분자와 인간 ROR1의 세포 결합(유세포분석에 의한 분석)
항 ROR1 scMATCH3 분자와 ROR 발현 MDA-MB-231 세포의 세포 결합은 섹션 1.6에 기재된 바와 같이 유세포분석으로 수행되었다. 요약하면, scMATCH3 분자들(출발 농도 40 nM; PRO2286, PRO2287 또는 출발 농도 120 nM; PRO2507, PRO2508, PRO2509, PRO2510, PRO2557)뿐 아니라, 참조기준 Fab 단편 PRO2213(출발 농도 40 nM 또는 120 nM)의 일련의 5배 희석물을 제조한 다음, 세포와 함께 평판에 첨가되었다. 인간 혈청 알부민(hSA) 1 mg/ml 존재하에 4℃에서 1시간 동안 항온처리된 후, 평판은 세척되었고, 특이적 검출 항체와 함께 항온처리되었다. APC 채널의 형광 세기는 NovoCyte 2060 유세포분석기가 사용되어 각각의 시료에 대해 기록되었고, 형광 세기 MFI의 기하학적 평균이 산정되었다.
항 ROR1xhSAxCD3 scMATCH3 분자와 원형질막 인간 ROR1의 결합은 유세포분석에 의해 평가되었다. 이 실험에서 수득된 EC50, 상대적 EC50뿐 아니라, 상대적 최대 결합의 값에 대한 산정치는 표 27에 보였다. 도 4에 보인 바와 같이, scMATCH3 분자 PRO2286 및 PRO2287은 둘 다 동일한 항 ROR1-BD 55-39-G02-sc02을 보유하였지만 항 hSA-BD는 상이하였는데, 이는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와는 결합하였던 반면, ROR1 음성 MDA-MB-231 세포와는 결합하지 않는 것이 확인되었음을 나타낸다. 부모 scFv PRO2062(항 ROR1 도메인 55-39-G02-sc02)의 상대적 EC50 값과는 비교되게, scMATCH3 분자 둘 다는 약 5배 더 작은 EC50 결합을 보였다(PRO2286의 상대적 EC50 = 0.63, PRO2287의 상대적 EC50 = 0.47; PRO2062의 평균 상대적 EC50 = 2.77). 이처럼 scMATCH3 분자의 감소된 EC50 결합은 SCMATCH3 분자에 결합된 hSA에 의해 유발되는 입체 장애로 말미암는 것으로 추정된다. 이러한 점에서 항 ROR1 도메인 55-39-G02-sc02(PRO2509) 또는 이의 최적화된 변이체(PRO2510: 55-39-G02-sc05, PRO2557: 55-39-G02-sc06)중 어느 하나를 보유하는 기타 scMATCH3 분자는 각각의 scFv와 비교되었을 때 5배 ~ 10배 감소한 EC50 결합을 보였다. 상세히 말하면, PRO2509, PRO2510 및 PRO2557의 상대적 EC50 값은 각각 0.53(대응 scFv, PRO2062에 대해서 2.77), 0.3(PRO2292에 대해서 2.61) 및 0.21이었다.
PRO2510의 최적화된 변이체인 PRO2668이, 동일한 실험 셋업이 이용되는 유세포분석을 통해 측정되었다. 이 실험에서, 유사한 결합 역가뿐 아니라, 상대적 최대 결합의 값에 의해 나타나는 바에 따르면 PRO2668은 PRO2510과 거의 동일하게 MDA-MB-231 세포와의 결합을 보였다. 이러한 항 ROR1xhSAxCD3 scMATCH3 분자들의 용량-반응 곡선은 도 4 및 도 5에서 확인될 수 있다. 항 ROR1 도메인 55-38-D07-sc02(PRO2507) 및 55-38-D07-sc06(PRO2508)으로 구축된 scMATCH3 분자와 관련하여, 이 분자들의 EC50 결합은 분자들의 각각의 scFv와 비교되었을 때에도 또한 감소하는 것으로 확인되었다. 상세히 말하면, PRO2507 및 PRO2508의 상대적 EC50 값은 각각 0.03(대응 scFv, PRO2060에 대해서는 0.33) 및 0.04(PRO2291에 대해서는 0.27)였다. 이러한 항 ROR1xhSAxCD3 scMATCH3 분자들의 농도-반응 곡선은 도 5에서 확인될 수 있다.
요약하면, scMATCH3 분자 모두는 인간 ROR1 발현 세포에 대해 특이적 결합을 보였고, 항 ROR1 클론 55-38-D07로 구축된 일련의 분자와 비교되었을 때 항 ROR1 클론 55-39-G02를 보유하는 분자에 대해서는 더 큰 EC50 결합이 확인되었다. 아마도, scMATCH3 분자에 결합된 hSA에 의해 유발되는 입체 장애로 말미암아, scMATCH3 분자에 대해서는 이의 대응 scFv에 대해서와 비교되었을 때 5배 ~ 10배 더 적은 결합이 확인되었다. 세포 결합 데이터의 결과는 표 27에 요약되어 있다. EC50, 상대적 EC50뿐 아니라, 상대적 최대 결합의 값에 대한 산정치를 보여주고 있다. Fab 단편 PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 사용되었다.
[표 27]
실시예 6: 역가의 평가: scMATCH3 분자에 의해 매개되는 표적 세포 세포독성 및 T 세포 활성화
이 scMATCH3 분자의 종양 세포 사멸 및 CD8 T 세포 활성화 촉진 능력을 이해하기 위해, 본 발명자들은 일련의 세포독성 검정을 수행함으로써 본 발명의 선도 후보항체들간 역가 및 T 세포 활성화 프로필을 비교하였다.
우선, 몇몇 세포주상 ROR1의 발현 수준이, 표면상 상대적 수용체 수준 정량과 함께 시험되었다(도 6). 세포는 4℃에서 20분 동안 순차적으로 Zombie NIR 생/사 APC-Cy7(Biolegend, 1:500)와 함께 항온처리되었고, 이후에는 세척 단계가 진행되었으며, 그 다음 4℃에서 20분 동안 항 ROR1 PE(Biolegend, 1:25)와 함께 항온처리되었고, 세척 단계가 진행되었으며, Novocyte 유세포분석기(ACEA)상에서 획득 과정이 진행되었다. 도 6a는 MDA-MB-231 세포 및 MCF7 세포상 표면 ROR1 발현을 보여준다. 수용체 수준은 제조자의 지침에 따라 Quantum Simply Cellular 항 마우스 IgG 키트(Bangs Laboratories)가 사용되어 정량되었다. 비드 및 세포는 Attune NxT 유세포분석기(ThermoFisher)상에서 획득되었고, 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 수행되었다. ROR1의 상대적 표면 수준은 MDA-MB-231 세포에서가 MCF7 세포에서와 비교되었을 때 더 높았다. MCF7 세포상 ROR1의 표면 수준은 건강한 성인 조직에서의 ROR1 표면 수준과 비교 가능하게도 매우 낮은 것으로 간주되었다. 그러므로 MCF7 세포는 음성 대조군으로 사용되었다(도 6b).
이 검정은, 제작자의 지침에 따라 밀도 구배를 조성하기 위해 Lymphoprep(StemCell Technologies)이 담긴 SepMate 튜브가 사용되어 버피코트(buffy coat)로부터 단리된 말초혈액단핵구(PBMC)가 사용되어 수행되었다.
단리된 PBMC는 40시간 동안 관심 ROR1 양성 및 음성 종양 세포와 함께 효과기 대 표적 비 10:1로 공동배양되었다. 공동배양 후, 사멸하는 세포로부터 젖산염 탈수소효소(LDH)가 방출되는지에 대하여 시험하기 위해 Roche사 제품 세포독성 검출 키트가 사용되어 상청액 100 μl가 흡인되었다. 나머지 상청액은 하류 멀티플렉스 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 동결되었다. 특이적 T 세포 활성화를 유세포분석으로 분석하기 위해, 세포는 이하 시약들 또는 항체들(모두 Biolegend사 제품)로 표지화되었다: 고정가능 생/사 Aqua, 항 인간 CD4 APC-Cy7(클론 OKT4), 항인간 CD11c PE-Cy7(클론 Bu15), 항 인간 CD8 PerCP-Cy5.5(클론 SK1) 및 항 인간 CD69 PE(클론 FN50). 세포는 유세포분석기(Attune, ThermoFisher Scientific)상에서 획득되었고, FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 CD69가 상향조절되었는지(CD4 및 CD8 T 세포 활성화 둘 다에 대한 척도)에 대해 분석되었다.
시험된 scMATCH3 분자 모두는 ROR1 양성 세포, 예컨대 MDA-MB-231 세포의 비사멸을 초래하였으며, ROR1 음성 세포주 MCF7에 대해서는 최소의 활성 ~ 비활성이 관찰되었다(도 7a). scMATCH3 분자 PRO2507 및 PRO2508 유래 PRO2060은, PRO2062 유래 분자 PRO2509 및 PRO2510과 비교되었을 때 약간 더 작은 역가를 보였는데, 이는 PRO2062에 대해 더 큰 친화도가 관찰되었던 점과 일치하였다. CD8 및 CD4 T 세포 활성화는 세포독성 데이터로 매우 긴밀하게 추적되었다(도 7b 및 도 7c).
도메인이 PRO2062로부터 유래되었고, 면역원성을 감소시키기 위해 T 세포 점수가 최적화된 scMATCH3 분자 PRO2557은 또한 ROR1 양성 세포의 비사멸도 매개하였다(도 8a). 또 다른 scMATCH3 분자와 매우 유사하게, CD8 T 세포 활성화 및 CD4 T 세포 활성화는 관찰된 세포독성과 상관되었다(각각 도 8b 및 도 8c). 표 28은 실험들에 있어서 scMATCH3 분자의 MDA-MB-231 세포 비사멸에 대해 수득된 평균 EC50 값들을 요약한 것이다.
[표 28]
실시예 7: scMATCH3 분자의 생물물리학적 특성규명
scMATCH3 분자를 대상으로 4주간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 이 분자는 수성 완충제중에 제제화되었고(50 mM NaCiP, 300 mM 수크로스, pH 6.5)(1 mg/ml), -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃에서 4주 동안 저장되었다. 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정 내내 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 29는 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었으며, 표 30에 보였다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하는 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. 나노 DSF 언폴딩 중간시점 온도(Tm) 결과는 표 29의 마지막 컬럼에 보였다.
[표 29]
[표 30]
55-38-D07 유래 항 ROR1 도메인을 함유하는 분자들(PRO2507 및 PRO2508) 및 55-39-G02 유래 항 ROR1 도메인을 함유하는 분자들(PRO2509 및 PRO2510)은 농도 1　mg/ml일 때 28일간의 연구 과정 내내 매우 유사한 단량체 안정성을 보였다. SE-HPLC/UV 측정전 d28/-80℃로 수행된 바에 따르면, 온도 -80℃ 및 4℃에서뿐 아니라, 동결-해동 반복 수행시(5회) 단량체 함량에 눈에 띄는 변화는 없었다.
실험개시당일(d0) 및 28일차(d28) 시료를 대상으로 하는 SDS-PAGE 분석은, 연구 실험개시당일(d0)에 분자들의 산정된 분자량에 대응하는 주요 밴드 이외에, 모든 (감소한) 시료중 저분자량(LMW) 종이 존재함을 규명하였다. 저분자량 종이 출현하는 이유는 아주 명확하지는 않지만, 분자 제작에 적용되는 포괄적이면서 최적화되지 않은 발현 및 정제 조건 또는 불리한 SDS-PAGE 시료 제조 조건과 관련이 있을 수 있다. d28 시료와 d0 시료가 비교되었을 때, 일반적으로 4℃ 및 40℃ 시료중 LWM 종의 눈에 띄는 증가는 시간이 경과할지라도 검출될 수 없었다. 가속화된 조건(40℃)하에 28일 동안 항온처리된 모든 시료에 있어, LMW 종의 분율은 명백히 증가하였는데, 이는 scMATCH3 분자의 단편화는 시간 의존적임과 아울러 온도 의존적임을 나타낸다. 모든 분자는 유사하게 유리한 안정성 프로필을 보였으므로, 가속화된 안정성 데이터를 기반으로 한 분자의 선택해제(deselection)는 상정되지 않는다.
nDSF에 의해 평가되는 바에 의하면 PRO2509 및 PRO2510은 PRO2507 및 PRO2508보다 열 안정성에 대해 약간 더 우수한 것으로 보였는데, 그 이유는 이 분자들의 언폴딩 개시 온도(T개시)가 55-39-G02 유래 ROR1 도메인을 함유하는 분자들의 경우 상당히 더 높았기 때문이다.
실시예 8: MATCH4 항 ROR1xCD3xhSA 다중 특이적 항체의 생성 및 제조
scMATCH3 분자로부터 유래한 ROR1-결합 도메인은 MATCH4 분자 포맷에 통합되었는데, 그 결과 ROR1-결합 도메인 2개가 사용됨에 따른 역가가 한층더 향상되었다. 이는, 종래의 전장 항체의 2가 표적화와 유사한 2가 표적화를 초래할 것이되, 단 T 세포 표적화(CD3 도메인) 및 반감기 연장(hSA 도메인)이라는 추가 이점도 또한 달성될 것이다.
MATCH4는 Numab사에 의해 개발된 포맷으로서, 단지 상이한 길이의 GS-링커들(매칭되는 도메인쌍들만의 특이적 쌍형성을 허용함)에 의해 연결된 가변 도메인들만으로 이루어진 포맷이다. MATCH4 포맷은 포유동물 세포로부터 재조합에 의해 발현될 수 있다. 정제를 위하여, 종래의 친화성 크로마토그래피 단계가 이용될 수 있었다. ND032 MATCH4 분자의 아키텍처(architecture)는 도 9에 도시되어 있다. 이 포맷은 이량체 서브유닛들(단 각각의 서브유닛은 탠덤으로 위치하는 VL 도메인 2개 또는 VH 도메인 2개중 어느 하나를 보유함)이 분할 가변 도메인 2개의 쌍의 코어로 이루어져, 단백질 사슬 2개의 이종이량체화를 구동해야 할 것을 요구하였다. 각각의 MATCH4 사슬상 이량체 형성 탠덤 가변 도메인은 자체의 대응 사슬로서 역평행 N 말단-C 말단 방향으로 조직되었다. 두 사슬은 포유동물 세포에서 전체가 기능성인 4중 특이적 분자로 공동발현되었다. 가변 도메인들 사이의 통상의 Gly-Ser 링커는 이 가변 도메인을 연결하는데 사용되었다. 또한 역평행 MATCH4 포맷은 도 9에 도시된 바와 같은 코어 도메인들중 1개에 이황화 가교가 도입되는 것을 받아들일 수 있었다. 추가의 VL/VH 이황화 결합은 개별 도메인들의 안정화를 위해 함유될 수 있었다.
포유동물 MATCH4 구조체의 발현은 Evitria AG(Schlieren, Switzerland)사 소유의 포유동물 발현계가 이용되어 1　l 규모로 수행되었다. 단백질은 단백질 L 친화성 크로마토그래피 후, 50　mM 인산염-시트르산염 완충제(300　mM 수크로스 포함, pH 6.5)중 SEC에 의해, 청징화된 배양 상청액으로부터 정제되었다. SEC 분획들중 단량체 함량은 SE-HPLC 분석으로 평가되었고, 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획들이 풀링되었다. 제작된 재료의 품질 제어를 위해, 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 수행되었다. MATCH4 분자의 분자 조성 및 제작에 관한 요약은 표 31에 보였다. 변형 또는 개선된 ROR1-, CD3- 및 hSA 결합 도메인을 포함하는 MATCH4 분자 PRO2669 및 RPO2670의 제작에 관한 요약은 표 32에 보였다.
[표 31]
[표 32]
실시예 9: MATCH4 분자의 약동학적 특성규명
9.1. 결합 친화도(SPR 분석)
다중 특이적 MATCH4 분자 4개와, 표적 3개, 즉 hROR1, hCD3ε및 hSA의 결합 역학은 SPR에 의해 시험되었다.
hROR1에 대한 결합 친화도(SPR에 의한 분석)
제조합 인간 ROR1 단백질에 대한 sMATCH4 분자 4개의 결합활성 존재시 및 부재시 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다(상이한 검정 디자인 2가지).
결합활성 부재시 결합 친화도는, 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 부동화된 자체소유 항 틀 토끼 IgG(rIgG21-57-20-B11)를 사용하여 해당 표면에 MATCH4 분자를 포획함으로써 확정되었다. 인간 ROR1(Peprotech 160-054) 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 매회 포획-피분석물 주입 주기 이후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었고(3 M MgCl2), MATCH4 분자는 상이한 농도의 인간 ROR1에 따라 다시 포획되었다. 인간 ROR1에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 사용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)중 1:2로 희석되어 0.088 nM ~ 90 nM 범위에서 10가지였다.
결합활성 존재시 결합은 섹션 1.6에 기재된 절차와 유사하게 확정되었다. 재조합 인간 ROR1 분자(Fc-Tag, Acro Biosystems RO1-H5250)는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었으며, 각각의 MATCH4 분자 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 매회 피분석물 주입 주기 이후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었고(글리신, pH 2.0 및 3 M MgCl2), 신규 농도의 MATCH4 분자가 주입되었다. 인간 ROR1에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 사용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)중 1:2로 희석되어 0.088 nM ~ 45 nM 범위에서 9가지였다.
두 검정에 있어 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는, 1:1 랑뮈르 결합 모델이 이용되어 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은, 곡선 피팅의 품질에 대한 척도인 Chi2 및 U값을 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hROR1에 대한 결합 역학은 5　nM ~ 1.2 nM 범위의 친화도로 MATCH4 4개에 대해 확정되었다. 결합활성이 존재할 때의 hROR1 친화도는 MATCH4 분자 4개를 대상으로 확정되었고, 136 pM ~ 22 pM의 범위였다. SPR 결과는 표 33에 요약되었다.
hCD3ε에 대한 결합 친화도(SPR에 의한 분석)
인간 CD3 엡실론 세포외 도메인 단백질(hCD3εHis-Tag, SinoBiological)에 대한 MATCH4 분자 4개의 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 재조합 hCD3ε 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었거, 각각의 MATCH4 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 매회 피분석물 주입 주기 이후, 센서칩상 모든 유동 채널은 재생되었고(글리신, pH 2.0 및 3 M MgCl2), 신규 농도의 MATCH4 분자가 주입되었다. hCD3ε에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(HEPES 완충 염수, 0.05% Tween-20, pH 7.5; Bioconcept)에 1:2로 희석되어 0.088 nM ~ 45 nM 범위에서 9가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd1) 및 결합 속도 상수(ka1)와, 제2의 반응 상수(ka2 및 kd2), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 2상태 결합 모델을 이용하는 Biacore 결합 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hCD3ε에 대한 결합 역학은 친화도 6.3 nM ~ 4.7 nM 범위인 MATCH4 4개에 대해 확정되었다(표 34). 시험된 모든 MATCH4 분자에 대한 hCD3ε 친화도는, 부모 scFv 28-21-D09-sc04에 대한 hCD3ε 친화도와 유사하였다.
hSA에 대한 결합 친화도(SPR에 의한 분석)
인간 혈청 알부민(hSA; Sigma-Aldrich A3782)에 대한 MATCH4 분자 4개의 결합 역학(친화도 포함)은 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 인간 혈청 알부민 분자는 카복시메틸화 황산덱스트란(CM5 센서칩; Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었고, 각각의 MATCH4 분자의 일련의 적정물은 피분석물로서 주입되었다. 각각의 피분석물 주입 주기 후, 센서칩상 모든 유동 채널이 재생되었으며(글리신 펄스, pH 1.5 및 3 M MgCl2), 신규 농도의 MATCH4 분자가 주입되었다. hSA에 대한 결합 역학은 다주기 역학 검정이 이용되어 측정되었는데, 이 때 피분석물 농도는 전개 완충제(PBS-P+ pH 5.5, PBS to pH 5.5 with HCl, 0.05 % Tween20)중에 1:2로 희석되어 0.18 nM ~ 90 nM 범위에서 10가지였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 이용되는 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore 평가 소프트웨어 버전 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 곡선 피팅의 품질에 대한 척도 Chi2 및 U값을 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 R최대에 대해 정규화되어 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
hSA에 대한 결합 역학은 친화도는 6.7 nM ~ 5.5 nM의 범위인 MATCH4 4개에 대해 확정되었다(표 35). 시험된 모든 MATCH4 분자에 대한 hSA 친화도는 부모 scFv 19-04-A10-sc02.에 대한 hSA 친화도와 유사하였다.
9.2. MATCH4 분자와 인간 ROR1의 세포 결합(유세포분석에 의한 분석)
항 ROR1 MATCH4 분자(PRO2589, PRO2590, PRO2591, PRO2592, 및 PRO2658)와 ROR1 발현 MDA-MB-231 세포의 세포 결합은 전술된 바와 같이 유세포분석에 의해 수행되었다. 요약하면, MATCH4 분자(출발 농도 120 nM)뿐 아니라, 참조기준 Fab 단편 PRO2213(출발 농도 120 nM)의 일련의 5배 희석액이 제조된 후, 세포와 함께 평판에 첨가되었다. 4℃에서 1시간 동안 인간 혈청 알부민(hSA) 1 mg/ml 존재하에 항온처리가 수행된 후, 평판이 세척되었고, 특이적 검출 항체와 함께 항온처리되었다. APC 채널의 형광 세기는 NovoCyte 2060 유세포분석기가 사용되어 각각의 시료에 대해 기록되었고, 형광 세기 MFI의 기하학적 평균이 산정되었다.
MATCH4 분자와 원형질막 기반 인간 ROR1의 결합은 유세포분석에 의해 평가되었다. 이러한 실험에서 수득된 EC50, 상대적 EC50뿐 아니라, 상대적 최대 결합의 값에 대한 산정치는 표 36에 보였다. Fab 단편 PRO2213은 참조기준 항 ROR1 항체로서 사용되었다. MATCH4 분자 모두는 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포와의 결합을 보였던 반면, ROR1 음성 MCF-7 세포와의 결합은 확인되지 않았다(도 10 참조). ROR1 클론 55-38-D07을 보유하는 MATCH4 분자(PRO2589 및 PRO2590)의 EC50 결합은, 대응 scMATCH3 분자들의 EC50 값과 비교되었을 때, 10 팩터(factor)만큼 증가하였다. 예를 들어 PRO2589의 상대적 EC50은 0.45였는데, 이는 scMATCH3 PRO2507의 상대적 EC50(0.03)보다 약 10배 더 크다. 마찬가지로 ROR1 클론 55-39-G02를 보유하는 MATCH4 분자(PRO2591 및 PRO2592)의 EC50 결합은 5 팩터만큼 증가하였다(PRO2592의 상대적 EC50 및 PRO2557의 상대적 EC50과 비교). 결합의 증가는 결합활성 효과를 초래하는 MATCH4 분자의 2가 성질으로 말미암는 것으로 생각된다. MATCH4 분자들 가운데, PRO2591(ROR1 도메인: 55-39-G02-sc03)은 최대의 EC50 결합을 보였는데, 이는 참조기준 Fab 단편 PRO2213의 EC50 결합보다 대략 2.5배 더 크다. PRO2590의 최적화된 변이체 PRO2670은 유세포분석을 통해 동일한 실험 셋업이 사용되어 측정되었다. 이 실험에서 본 발명자들은 PRO2670이 PRO2670의 역가와 거의 동일한 역가(이는 상대적 EC50 값이 유사한 점에 의해 나타남)로 MDA-MB-231 세포와 결합함을 확인하였다.
요약하면, MATCH4 분자 모두는 인간 ROR1 발현 세포에 대해 특이적 결합을 보였고, 항 ROR1 클론 55-39-G02를 보유하는 분자는 항 ROR1 클론 55-38-D07로 구축된 일련의 분자와 비교되었을 때 더 큰 결합을 보이는 것으로 확인되었다. 이는 아마도 결합활성 효과로 말미암을 것인데, 이로써 2가 MATCH4 분자 모두는 이의 대응 1가 scMATCH3 분자와 비교되었을 때 증가한 EC50 결합을 보였다.
[표 33]
[표 34]
[표 35]
[표 36]
9.3. MATCH4 분자에 의해 매개된 T 세포 활성화 및 표적 세포 세포독성
본 발명의 선두 후보항체들의 역가와 T 세포 활성화 프로필을 비교함으로써, MATCH4 분자가 종양 세포 사멸 및 CD8 T 세포 활성화를 촉진하는 능력을 이해하기 위해 일련의 세포독성 검정이 수행되었다.
우선, 몇몇 세포주상 ROR1 발현 수준이 동시에 시험되었다. 요약하면, 세포는 4℃에서 20분 동안 Zombie NIR 생/사 APC-Cy7(Biolegend, 1:500)와 함께 항온처리되었고, 이후 세척 단계가 진행된 다음, 4℃에서 20분 동안 항 ROR1 PE(Biolegend, 1:25)와 함께 항온처리되었으며, 이후 세척 단계가 진행된 다음, Attune 유세포분석기(Thermofisher Scientific)상에서 획득이 진행되었다. MDA-MB-231 세포, Jeko-1 세포, JIMT-1 세포, SKOV-3 세포 및 MCF7 세포를 대상으로 측정된 표면 ROR1 발현은 도 11에 보였다. MDA-MB-231 세포 및 Jeko-1 세포에서 최고 ROR1 수준이 확인되었다. JIMT-1 세포 및 SKOV-3 세포는 낮은 ROR1 발현 수준을 보였고, MCF7 세포는 매우 낮은 ROR1 발현 수준을 보였다. 그러므로 MCF7 세포는 ROR1에 대해 음성 대조군으로서 사용되었다.
버피코트로부터 단리된 말초혈액단핵구(PBMC)로부터 단리된 Pan-T 세포가 사용되어 세포독성 검정이 수행되었다. PBMC는 밀도 구배를 조성하기 위해 제작자의 지침에 따라 Lymphoprep(StemCell Technologies)이 담긴 SepMate 튜브가 사용되어 단리되었다. PBMC 단리 후, Pan-T 세포는 제작자의 지침에 따라 Pan-T 단리 키트(Miltenyi사)가 사용되어 단리되었다.
단리된 Pan-T 세포는 40시간 동안 관심 ROR1 양성 및 음성 종양 세포와 함께 효과기 대 표적 비 10:1로 공동배양되었다. 공동배양 후, 사멸하는 세포로부터 방출된 젖산염 탈수소효소(LDH)를 시험하기 위해 세포독성 검출 키트(Roche사)가 사용되어 상청액 100　μl가 흡인되었다. 나머지 상청액은 하류 멀티프렉스 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 동결되었다. 나머지 세포는 이하 시약 또는 항체(모두 Biolegend사 제품)로 표지화되었다: 고정가능 생/사 Aqua, 항 인간 CD4 APC-Cy7(클론 OKT4), 항 인간 CD11c PE-Cy7(클론 Bu15), 항 인간 CD8 PerCP-Cy5.5(클론 SK1) 및 항 인간 CD69 PE(클론 FN50). 세포는 유세포분석기(Attune, ThermoFisher Scientific)를 통해 획득되었으며, CD4 및 CD8 T 세포 활성화 둘 다에 대한 척도로서 CD69의 상향조절은 FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 분석되었다.
시험된 MATCH4 분자 모두는 고 ROR1 양성 세포, 예컨대 MDA-MB-231 및 Jeko-1의 비사멸을 초래하였고(도 12a 참조), ROR1 음성 세포 MCF7에서 최소 활성 ~ 비활성이 관찰되었다(도 12b 참조). MATCH4 분자의 EC50 값은 대응하는 scMATCH3(PRO2589 및 PRO2590 vs PRO2507, PRO2591 및 PRO2592 vs. PRO2557/PRO2510)의 EC50 값보다 월등하였다. 그러나 ROR1 저발현 세포, 즉 JIMT-1 및 SKOV-3(도 12a 하단)에 있어서, PRO2589 및 PRO2590(PRO2060 유래 ROR1 도메인)은 PRO2591 및 PRO2592(ROR1 도메인 PRO2271)와 비교되었을 때 EC50 값이 약간 더 컸던 것으로 보인다. PRO2060 유래 MATCH4 분자는 또한 scMATCH3 분자 PRO2507과 비교되었을 때 ROR1 저발현 세포에 대해 약간 더 큰 EC50 값을 보이는 것으로 보였던 한편, 이러한 차이는 PRO2271 유래 MATCH4 및 scMATCH3 분자와 비교되었을 때 존재하였던 것으로 보이지 않았다. 흥미롭게도 ROR1이 낮은 수준으로 발현되는 세포의 경우 MATCH4 분자는 scMATCH3 분자와 비교되었을 때 전반적으로 더 낮은 최대 사멸률을 보이는 것으로 보인다(도 12a 하단). 세포독성 결과는 표 37에 요약되어 있다.
더욱이 CD69 발현 세포의 출현빈도 증가를 통해 측정되는 바와 같이 T 세포 활성화가 검토되었다. CD8 기반 T 세포 활성화(도 13 상단) 및 CD4 기반 T 세포 활성화(도 13 하단)는 세포독성 데이터로 매우 긴밀하게 추적되었다. 활성화된 CD8 T 세포 및 CD4 T 세포의 최고 출현빈도는 MDA-MB-231 세포에서 보였는데, 이 세포는 또한 ROR1도 최고 수준으로 발현하였다(도 13a). PRO2060 기반 MATCH4 분자는 PRO2271 기반 MATCH4 분자와 비교되었을 때 EC50 값이 더 작았다. 그러나 T 세포 모집단은, MATCH4 분자를 처리하였을 때와 비교되게, scMATCH3 분자를 처리하여 관찰하였을 때, 활성화된 세포의 출현빈도가 전반적으로 더 높았다. 결과는 표 38 및 표 39에 요약되어 있다.
MATCH4 분자 활성의 가장 큰 차이는 ROR 저발현 세포, 즉 SKOV-3 세포 및 JIMT-1 세포에 있는 것으로 보였다. 환자들간, 그리고 종양 적응증에 대해 ROR1 발현 수준의 예상 비균질성으로 말미암아, ROR1 발현 수준이 더 낮은 종양을 효과적으로 표적화하는 것이 유리할 것이다. 이러한 데이터를 기반으로 하였을 때, PRO2592는 가장 낮은 역가(세포독성 및 T 세포 활성화)뿐 아니라 가장 작은 최대 값을 가지는 것으로 보였다.
9.4. 선도 MATCH4 분자의 생물물리학적 특성규명
보관 안정성 및 용융 온도
MATCH4 분자를 대상으로 14일간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 이 분자는 수성 완충제(300　mM 수크로스 포함 50　mM 인산염-시트르산염 완충제, pH　6.5)에 1　mg/ml로 제제화된 후, -80℃ 미만, 　4℃ 및 40℃에서 14일 동안 저장되었다. 이 제제중 단량체 및 올리고머의 분율은 연구 과정 내내 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 40은 실험당일 단량체 함량%와 단량체 함량 감소%를 요약한 것이다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었고, 표 41에 보였다. 열 안정성은, 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하는 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. Tm 결과는 표 40에 보였다.
MATCH4 분자 4개는 모두 월등한 안정성 프로필을 보였고, 14일 동안의 항온처리후 상당한 단량체 함량 감소 또는 단백질 함량 감소를 보이지 않았다. 14일차/-80℃ 시료로 수행된 후 SE-HPLC/UV 측정이 이루어졌을 때와 같이, -80℃ 및 4℃의 온도에서뿐 아니라, 반복된(5회) 동결-해동시에도 단량체 함량에 눈에 띄는 변화는 없었다.
실시예 10: 기존 ADA 결합 검정
10.1. 일반적 검정 절차:
직접 검정 포맷이 사용되어 인간 혈청중 기존 항 약물 항체를 검출하는 방법이 Numab에 의해 개발되었다.
96웰 절반 구역 평판(96 well half-area plate)은 시험 분자(MATCH3 또는 scFv 포맷) 100 ng/ml로 2시간 동안 실온에서 코팅되었다. 평판은 1시간 동안 0.2% Tween 및 1% BSA를 함유하는 PBS로 차단되었다. 이후, 개별 인간 혈청은 대응 웰에 코팅된 분자와 동일한 분자로 스파이킹되지 않은 채(스크리닝 검정) 또는 스파이킹된 채(확인 검정) 1:20(5% 혈청) 또는 1:100(1% 혈청)의 희석률로 첨가되었다. 스파이킹 농도는 60 nM ~ 115 nM의 범위였으며, 스파이킹된 시료는 1시간 동안 예비 항온처리되었다. 평판에 코팅된 분자와 결합한 항체는 100 ng/ml 토끼 항 인간 IgG-HRP로 1시간 동안 검출되었다. TMB 기질이 기질로서 첨가되었고, 단시간 항온처리된 후, 1 M HCl로 효소 반응이 중단되었다. 각각의 웰의 광학 밀도는 450 nm에서 판독되었다. 모든 단계는 실온에서 진행되었다. 각각의 단계 사이사이에 평판은 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었다. 차단 단계 및 세척 단계에서를 제외하고, 모든 검정 성분들은 웰당 부피 25 μl씩 첨가되었고, 이 과정을 중복 수행하였다. 항온처리 단계를 위해 ELISA 평판은 회전 믹서(40 rpm)에 놓였다. 일반적으로 측정의 제1 라운드는 스파이킹되지 않은 인간 혈청으로 수행되었다(스크리닝 검정). 그 다음, 각각의 평판에 대해 스크리닝 컷-포인트(Screening Cut-Point; SCP)가 산정되었다. 스파이킹되지 않았고, SCP 이하의 신호를 보이는 시료는 "스크리닝 음성"이라 지칭되었고, 확인 검정에서 고려 대상으로부터 배제되었다. 스파이킹되지 않았고, SCP를 초과하는 신호를 보이는 시료는 "스크리닝 양성"이라 지칭되었다.
[표 37]
[표 38]
[표 39]
[표 40]
[표 41]
이와 같은 "스크리닝 양성" 시료 대부분을 대상으로, 각각의 혈청 시료중 초기에 검출된 항체 결합이 시험 분자에 특이적인지 여부를 확정하기 위해, 측정의 제2 라운드가 스파이킹된 인간 혈청으로 수행되었다(확인 검정). 스파이킹된 웰에서의 흡광도 신호 감소는, 초기 스크리닝 검정의 웰중 스파이킹되지 않은 웰에서 관찰되는 신호가 평판에 코팅된 분자에 특이적임을 나타낸다. 특이성을 확인하기 위해 필요한 억제 퍼센트(억제%)는 20% ~ 30%로 설정되었거나, 또는 확인 컷-포인트는 퍼센트로 산정되었다(CCP%). 후자의 경우, 억제 퍼센트가 CCP를 초과하는 시료들만이 양성으로 확인되었다. 억제%는 스파이킹되지 않은 혈청에 대해 구하여진 초기 신호 감소로서 이하와 같이 산정되었다(스크리닝 검정):% CCP = 초기 신호(1-(스파아킹된 혈청/스파이킹되지 않은 혈청 신호))*100.
대안적 절차에서 초기 스크리닝 검정은 수행되지 않았다. 그 대신, 시험 시료들은 확인 검정 절차가 사용되어 직접 분석되었다. 그러나 데이터 분석을 위해 동일한 산정이 수행되었는데, 이 과정은 적어도 SCP 및 CCP%를 산정하는 과정을 포함하였다.
10.2. 스크리닝 컷-포인트(SCP), 정규화 인자(NF) 및 플로팅 컷-포인트(Floating Cut Point; FCP)의 확정/산정
각각의 시험 화합물에 대해, 건강한 미처리 대상체의 개별 인간 혈청 시료 40개가 분석되었다. 다른 경우에는, 건강한 미처리 대상체의 개별 인간 혈청 시료 20개가 분석되었다.
스크리닝 컷-포인트(SCP)
스크리닝 컷-포인트(SCP)는 신호가 양성으로 간주될 때(양성으로 스크리닝될 때)의 역치값이다. 5% 위양성 혈청이 포함되도록 산정된다.
스크리닝 컷-포인트(SCP)는 이하와 같이 산정된다:
SCP = 평균 N + 1.645 x SDN
[식 중,
- "평균 N"은 특정 시험 화합물에 대해 측정된, 스파이킹되지 않은 모든 개별 혈청으로부터 유래한 평균 신호에 대응하고;
- "SDN"은 특정 시험 화합물에 대해 측정된, 스파이킹되지 않은 모든 개별 혈청으로부터 산정된 표준 편차에 대응함]
정규화 인자(NF):
정규화 인자(NF)는 이하와 같이 산정된다:
NF = SCP - 음성 대조군 평균
[식 중,
- "SCP"는 상기 정의된 바와 같고;
- "음성 대조군 평균"은 평판당 중복 분석된(즉 웰 2개의) 음성 대조군(풀링된 개별 인간 혈청, 각각의 평판간 동일)으로부터 유래하는 평균 신호에 대응함]
적어도 2개의 NC 시료(즉 웰 4개)이 정규화 인자 산정에 고려되어야 한다.
플로팅 컷-포인트(FCP)의 산정:
SCP 및 NF 확정 후, 각각의 평판에 대한 플로팅 컷-포인트(FCP)는 참조기준 컷-포인트로서 사용되었다. FCP는 평판의 음성 대조군으로 SCP를 정규화함으로써 각각의 분석 전개에 대한 분석 가변성을 고려한다. FCP는 이하와 같이 각각의 분석 전개에 대해 산정된다:
FCP = NF + 평균 NC
[식 중,
- "평균 NC"는 음성 대조군 시료의 평균 신호를 지칭하고;
- "NF"는 상기 정의된 바와 같은 정규화 인자를 지칭함]
10.3. 개선된 다중 특이적 항체 변이체에 대한 기존 ADA 결합 검정 결과
변이체 PRO2668 및 PRO2669와, 비교예인 대응 비변형 참조기준 PRO2510 및 PRO2589를 대상으로 한 자체의 면역원 특성이, 전술된 기존 ADA 결합 검정이 이용되어 측정되었다. 측정은 확인 검정 셋업에서 인간 혈청 시료 20개(PRO2589의 경우에는 19개)가 사용되어 직접 수행되었다.
그 다음, CCP%가 30%로 고려되어 스크리닝 양성 혈청이 추가로 분석되었다. 시험된 각각의 분자에 대한 양성 혈청 시료의 수는 표 42에 요약되어 있다. 인간 혈청중 기존 ADA의 흡광도 수준 그래프뿐 아니라, 스파이킹된 인간 혈청의 PRO2741 및 참조기준 PRO2660에 대한 흡광도 수준 감소(ADA 결합 억제) 그래프는 도 14에 보였다.
[표 42]
실시예 11: scMATCH3 및 MATCH4 변이체 PRO2667, PRO2668, PRO2669 및 PRO2670에 의해 매개되는 표적 세포 세포독성 및 T 세포 활성화
방법
본 검정들은 제작자의 지침에 따라 밀도 구배를 조성하기 위해 버피 코트로부터 단리된 인간 말초혈액단핵구(PBMC)와 Lymphoprep(StemCell Technologies)이 담긴 SepMate 튜브가 사용되어 수행되었다. Pan T 세포는 제작자의 지침에 따라 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec사)가 사용되어 PBMC로부터 단리되었다.
단리된 Pan T 세포는 40시간 동안 관심 ROR1 양성 및 음성 종양 세포와 함께 효과기 대 표적 비(부착 세포의 경우 10:1 또는 현탁액중 세포의 경우 5:1)로 공동배양되었다. 공동배양 후, 사멸하는 세포로부터 방출되는 젖산염 탈수소효소(LDH)를 시험하기 위해 세포독성 검출 키트(Roche사)가 사용되어 상청액 100 μl가 흡인되었다. 나머지 상청액은 하류 멀티플렉스 사이토카인 분석을 위해 80℃에서 동결되었다. 세포는 특이적 T 세포 활성화의 유세포분석을 위해 이하 시약 또는 항체(모두 Biolegend사 제품)로 표지화되었다: 고정가능 생/사 Aqua, 항 인간 CD4 APC-Cy7(클론 OKT4), 항 인간 CD11c PE-Cy7(클론 Bu15), 항 인간 CD8 PerCP-Cy5.5(클론 SK1), 및 항 인간 CD69 PE(클론 FN50). 세포는 유세포분석기(Attune, ThermoFisher Scientific)상에서 획득되었고, FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 CD69가 상향조절되었는지(CD4 및 CD8 T 세포 활성화 둘 다에 대한 척도)에 대해 분석되었다.
결과
시험된 scMATCH3(PRO2667 및 PRO2668) 및 MATCH4(PRO2669 및 PRO2670) 분자 모두의 사용은, 도 15a에 보인 바와 같은 ROR1 양성 MDA-MB-231 세포 및 JIMT-1 세포의 비사멸을 초래하였다. MATCH4 분자의 역가는 scMATCH3 분자의 역가보다 월등하였지만, ROR1 저발현 JIMT-1 세포를 대상으로 달성된 최대 용해 수준은 scMATCH3 분자가 사용되었을 때보다 더 높았다. CD69 발현 CD8 T 세포의 출현빈도에 의해 판단되는 바에 따르면, CD8 T 세포 활성화가 관찰되었을 때 유사한 결과들이 수득되었다(도 15b).
실시예 12: PRO2668이, ROR1 양성 고형 암세포주 및 혈액암세포주의 특이적 T 세포 매개 용해를 유도하는 역가
PRO2668에 의해 매개되는 세포독성은, 고형 악성종양을 보이는 세포주(도 16a 및 도 16b) 및 혈액 악성종양(도 16c)을 대상으로 평가되었다. 세포독성은 ROR1 양성 세포주가 표적으로서 사용되어 관찰되었던 반면, ROR1 음성 주 HCC1954는 용해되지 않았는데, 이는 PRO2668의 ROR1 의존성을 나타낸다(도 16a). ROR1 밀도가 증가함에 따라 특이적 용해 역가는 전반적으로 개선되었다(도 16b). 맨틀세포림프종 주 Mino 및 Z-138의 비사멸률도 또한 관찰되었다(도 16c). 이 데이터는, PRO2668이 다양한 ROR1 발현 종양 세포주를 대상으로 비사멸을 매개할 수 있음을 나타낸다.
실시예 13. ROR1 의존적 CD8 T 세포 활성화 및 증식을 매개하는, PRO2668의 역가
방법
단리된 건강한 Pan-T 세포는 제작자의 지침에 따라 CellTrace Violet으로 표지화되었으며, ROR1 양성 종양 세포와 3일 ~ 6일 동안 효과기 대 표적 비 5:1로 공동배양되었다. 공동배양 3일 및/또는 6일 후, 세포는 특이적 T 세포 활성화 유세포분석을 수행하기 위해 이하 시약 또는 항체(모두 Biolegend사 제품)로 표지화되었다: 고정가능한 생/사 Aqua, 항 인간 CD4 APC-Cy7(클론 OKT4), 항 인간 CD19 PE(클론 HIB19), 항 인간 CD8 PerCP-Cy5.5(클론 SK1), 항 인간 CD3 Alexa Fluor 488(클론 OKT3) 및 항 인간 CD25 BV650(클론 BC96). 세포는 유세포분석기(Attune, ThermoFisher Scientific)로 획득되었으며, FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 분석되었다. 분열중인 세포는 분열중이 아닌 세포에 비해 형광도 수준이 감소하였다(염료 희석). CD25 출현빈도 상향조절은 CD8 T 세포 활성화의 척도로서 사용되었다.
결과
ROR1 발현 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 JIMT-1과 공동배양시 CD8 T 세포 활성화가 관찰되었다(도 17a). 활성화된 T 세포의 더 높은 출현빈도는 더 많은 ROR1 발현과 함께 관찰되므로, 활성화 정도는 ROR1 발현과 상관되어 있는 것으로 보였다. 분열중인 세포(CellTrace Violet 형광도가 감소한 세포)의 출현빈도 또는 분열중인 세포의 마이크로리터당 갯수가 관찰되었을 때, CD8 T 세포 증식은 ROR1 발현 세포주 둘 다에 응하여 관찰되었다. 증식의 정도는 ROR1 발현이 더 많이 된 표적이 사용되었을 때 더 컸다. CD8 T 세포 활성화 및 증식도 또한 맨틀세포림프종 주 Z-138에 응하여 관찰되었다(도 17b). 이러한 데이터는, ROR1 발현 표적 및 T 세포와 PRO2668의 생착이 T 세포 활성화 및 증식을 유도함을 나타낸다.
실시예 14: 비유사분열 ROR1 저발현 원발성 인간 CLL 환자 시료의 특이적 용해를 매개하는, PRO2668의 역가
방법
본 검정은, 말초혈액단핵구(PBMC)로부터 단리된 CLL 환자 시료(IQBiosciences) 및 건강한 인간의 Pan-T 세포가 사용되어 수행되었다. PBMC는 밀도 구배를 조성하기 위해 제작자의 지침에 따라 Lymphoprep(StemCell Technologies)이 담긴 SepMate 튜브가 사용되어 버피코트로부터 단리되었다. Pan T 세포는 제작자의 지침에 따라 Miltenyi Biotec사 Pan T 세포 단리 키트가 사용되어 PBMC로부터 단리되었다.
CLL 환자 시료는, Click-It Plus 유세포분석 검정 키트가 사용되어 제작자의 지침에 따라 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 통합 여부를 관찰함으로써 이의 분열 능력에 대해 평가되었다. 분열중인 세포는 분열중이 아닌 세포와는 비교되게 양으로 표지화되었다. 수용체 밀도는 상기 개괄적으로 기재된 프로토콜(예컨대 섹션 9.3에 개괄적으로 기재된 프로토콜)이 사용되어 평가되었다. PRO2668의 세포 결합은, 인간 혈청 알부민 존재하에 증가하는 농도로 PRO2668을 적정한 다음, 광범위한 세척, 그리고 틀을 검출하도록 디자인된 형광 표지화 2차 시약에 의한 검출이 수행됨으로써 평가되었다. 시료는 유세포분석기로 획득되었고, FlowJo가 사용되어 분석되었다.
단리된 Pan-T는 40시간 동안 CLL 환자 시료와 함께 효과기:표적 비 5:1로 공동배양되었다. 공동배양 후, 나머지 상청액은 -80℃에서 하류 멀티플렉스 사이토카인 분석을 위해 동결되었다. 세포는 세포 사멸 및 특이적 T 세포 활성화에 대한 유세포분석을 위해 이하 시약 또는 항체(모두 Biolegend사 제품)로 표지화되었다: 고정가능한 생/사 Aqua, 항 인간 CD4 APC-Cy7(클론 OKT4), 항 인간 CD3 Alexa Fluor 488(클론 OKT3), 항 인간 CD8 PerCP-Cy5.5(클론 SK1), 및 항 인간 CD69 BV650(클론 FN50), 항 인간 CD19 BV421(클론 SJ25C1), Annexin V APC, 항 인간 ROR1 PE(클론 2A2). 세포는 유세포분석기(Attune, ThermoFisher Scientific)로 획득되었으며, CD4 및 CD8 T 세포 활성화 둘 다의 척도인 CD69 상향조절에 대해서는 FlowJo 소프트웨어(BD)가 사용되어 분석되었다. 사멸중인 CLL 세포는 CD19+ Annexin V+ L/D+로서 게이팅되었다. 사이토카인 방출은 제작자의 지침에 따라 LEGENDplexTM Multi-Analyte Flow Assay Kit, Human Essential Immune Response Panel 13-플렉스가 사용되어, 동결된 상청액으로부터 평가되었다.
결과
말초혈액중 CLL PBMC 증식의 미발생은, 약물 활성 발휘에 능동적인 증식을 필요로 하는 약물에 난관이 되었다(Hu et al., Blood Adv. 5(2021) 3152-3162). 말초 혈액 유래 CLL 환자 시료 증식의 미발생은, EdU 통합이 사용되어 확인되었다(도 18a). 능동적으로 분열중인 Jeko-1 세포주와는 대조적으로, CLL 환자 시료는 분열하지 않았다. 이 시료는 ROR1을 낮은 수준으로 발현하였다(세포당 8,000개 수용체, 도 18b). 이 세포에 대해 ROR1 수용체 포화가 관찰되었다(도 18c). 건강한 동종이계 Pan-T 세포 및 CLL 환자 시료와 공동발현시 특이적 용해(도 18d) 및 동반되는 CD8 및 CD4의 활성화가 관찰되었다(도 18e). 몇몇 사이토카인(IFNg 및 TNFa)의 경우 사이토카인 방출은 중간정도였으며, IL-6과 같은 기타 사이토카인의 경우에는 사이토카인 방출이 관찰되지 않았다(도 18f). 이 데이터는 PRO2668이, 분열중이 아닌 CLL 환자 시료와 결합하고, 이를 특이적으로 용해할 수 있어서, T 세포 활성화 및 중간정도 수준의 사이토카인 방출이 초래됨을 나타낸다.
실시예 15: PRO2668 및 PRO2670의 생체내 효능
방법
동결 PBMC가 37℃ 수조에서 해동된 다음, 원심분리되고 나서, PBS중에 재현탁된 후, 얼음에서 접종을 위해 저장되었다. JeKo-1 종양 세포는 20% 소태아혈청이 보충된 RPMI1640 배지와 함께 37º및 5% CO2 대기에서 시험관내 유지되었다. 지수 생장기에 세포가 수득되었고, 세포 계수기가 사용되어 정량된 다음, 종양 접종이 이루어졌다.
각각의 처리군은 동물 5마리로 이루어졌다. 각각의 마우스 우측 옆구리 상단영역에 5 x106개 JeKo-1 종양 세포(Matrigel과 혼합된(1:1) PBS 0.1 ml중)가 피하 접종되었으며, 이로써 종양 발달이 도모되었다. 종양 접종 3일 후 1x107개 PBMC가 복막내 이식되었다. 평균 종양 크기가 80 mm3 ~ 100 mm3에 도달하였을 때, 랜덤화가 수행되었다.
랜덤화시(당일) 투여가 개시되었으며, 투여는 이후로도 5일마다 수행되었다. 종양이 접종된 후, 동물에 종양이 발현되었는지와 동물이 폐사하였는지가 체크되었다. 일상적인 모니터링이 진행되는 도중, 동물을 대상으로 종양 생장에 따른 임의의 현상이 일어나는지, 그리고 행동, 예컨대 이동성, 먹이와 물 섭취, 체중 증가/감소(체중은 랜덤화 이후 매주 2회씩 측정됨), 눈/털의 푸석함 및 기타 임의의 이상증상에 대한 처치의 효과가 체크되었다. 개별 동물에 대한 폐사 및 관찰된 임상 증상은 상세히 기록되었다.
종양 부피는 랜덤화 이후 매주 2회씩 캘리퍼가 사용되어 2차원 치수로 측정되었으며, 부피는 식 V =(L x W x W)/2 [식 중, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 길이)이며, W는 종양 폭(L에 수직방향으로 가장 긴 종양 치수)임]이 이용되어 mm3로 표현되었다. 만일 동물 체중이 처치 첫 날의 체중과 비교되었을 때 20%가 넘게 감소하였거나; 만일 개별 마우스 종양 부피가 3,000 mm3 이상이었으면 해당 동물을 죽였거나; 또는 어떤 군의 평균 종양 부피가 2,000 mm3 이상이었으면, 해당 동물을 죽였다(동일군의 모든 마우스를 죽였다).
결과
PRO2668은 Jeko-1 인간 이종이식편 모델이 사용되는 생체내 효능 연구를 통해 시험되었다. Jeko-1 세포는 피하 이식되었고, 인간 PBMC는 종양 생착 3일후에 투여되었다. 도 19로부터 도출될 수 있는 바와 같이, 1 mg/kg 및 0.2 mg/kg의 PRO2668 투여는 무관한 단백질 대조군 팔리비주맙 투여와 비교되었을 때 유의미한 종양 생장 억제를 달성하였다. PRO2668이 0.04 mg/kg 투여되었을 때는 대조군이 투여되었을 때와 비교되었을 때, 그 효능에 차이가 없음이 관찰되었다. PRO2670이 1 mg/kg 용량으로 투여되었을 때 항 종양 효능이 관찰되었던 반면, 이보다 더 낮은 용량이 투여되었을 때는 대조군이 투여되었을 때와 비교되었을 때 유의미하게 상이한 종양 부피를 보이지 않았다. 두 분자는 유효한 것으로 보였는데, PRO2668은 더 낮은 용량(0.2 mg/kg)으로 투여될 때 그 효능을 보였다.
실시예 16: scMATCH3 및 MATCH4 변이체 PRO2667, PRO2668, PRO2669 및 PRO2670의 생물물리학적 특성규명
보관 안정성 및 용융 온도
MATCH4 분자를 대상으로 28일간의 안정성 연구가 진행되었는데, 이 때 이분자는 수성 완충제(300　mM 수크로스 포함 50　mM 인산염-시트르산염 완충제, pH　6.5)중에 1　mg/ml로 제제화되었고, 14일 동안 -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃에 저장되었다. 제제중 단량체와 올리고머의 분율은 연구 과정 내내 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써 평가되었다. 표 43은 단량체 함량% 및 실험 개시 당일의 단량체 함량%에 상대적인 단량체 감소율%를 요약하고 있다. 단백질 농도 변화는 연구 과정 내내 280　nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었으며, 표 44에 보였다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시) 및 언폴딩 중간시점 온도(Tm)를 확정하는 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. Tm 결과는 표 43에 보였다.
MATCH4 분자 4개 모두는 월등한 안정성 프로필을 보였고, 28일간의 항온처리 후에는 상당한 단량체 함량 감소 또는 단백질 함량 감소를 보이지 않았다. 28일차/-80℃ 시료로 수행된 후 SE-HPLC/UV 측정이 이루어졌을 때와 같이, -80℃ 및 4℃의 온도에서뿐 아니라, 반복된(5회) 동결-해동시에도 단량체 함량에 눈에 띄는 변화는 없었고, 40℃에서 28일 동안 저장되었을 때 단지 미미한 단량체 함량 감소만이 있었다.
[표 43]
[표 44]
SEQUENCE LISTING <110> Numab Therapeutics AG <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES HAVING SPECIFICITY FOR ROR1 AND CD3 <130> 117181P877PC <150> EP21154786.4 <151> 2021-02-02 <150> PCT/EP2021/087618 <151> 2021-12-23 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based sequence <400> 1 Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Ala Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based sequence <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based sequence <400> 3 Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Leu <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based sequence <400> 4 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 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Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based sequence <220> <221> Repeat <222> (1)..(5) <223> n repeats with n being 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 <400> 122 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (15)

  1. a) ROR1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(ROR1-BD) 1개 또는 2개; 및
    b) CD3과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(CD3-BD) 1개
    를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
    - 상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지 않고;
    - 상기 ROR1-BD는 서로 독립적으로
    서열 번호 1의 HCDR1 서열,
    서열 번호 2의 HCDR2 서열,
    서열 번호 3의 HCDR3 서열,
    서열 번호 4의 LCDR1 서열,
    서열 번호 5의 LCDR2 서열, 및
    서열 번호 6의 LCDR3 서열로 이루어진 세트; 및/또는
    서열 번호 13 또는 14의 HCDR1 서열,
    서열 번호 15의 HCDR2 서열,
    서열 번호 16의 HCDR3 서열,
    서열 번호 17의 LCDR1 서열,
    서열 번호 18의 LCDR2 서열, 및
    서열 번호 19의 LCDR3 서열
    로 이루어진 세트로부터 선택되는 CDR 서열 세트를 포함하고,
    - 상기 CD3-BD는
    서열 번호 30의 HCDR1 서열,
    서열 번호 31의 HCDR2 서열,
    서열 번호 32의 HCDR3 서열,
    서열 번호 33의 LCDR1 서열,
    서열 번호 34의 LCDR2 서열, 및
    서열 번호 35의 LCDR3 서열
    로 이루어진 CDR 서열 세트를 포함하는,
    다중 특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다중 특이적 항체가 ROR1-BD 2개를 포함하는 경우, 상기 ROR1-BD 2개는 동일한 CDR 세트를 포함하거나, 즉 ROR1-BD 둘 다중 어느 하나는 서열 번호 1 ~ 6의 CDR 또는 서열 번호 13/14 ~ 19의 CDR을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 결합 도메인(hSA-BD) 1개를 추가로 포함하는, 다중 특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 특이적 항체는 이하 특징 1) ~ 5), 즉
    1) 상기 다중 특이적 항체는 CH1 및/또는 CL 영역을 포함하지 않음;
    2) 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개, 상기 CDR-BD, 그리고 존재한다면 상기 hSA-BD는 VH1a, VH1b, VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4를 포함하거나, 또는
    상기 ROR1-BD 1개 또는 2개, 상기 CDR-BD, 그리고 존재한다면 상기 hSA-BD는 VH 틀 아형, 구체적으로 VH 틀 아형 VH1a, VH1b, VH3 및 VH4, 구체적으로 VH 틀 아형 VH3 및 VH4로부터 선택되고, 구체적으로 VH3 아형의 것인 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 VH 도메인을 포함하되, 상기 VH 틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 이하의 치환(AHo 번호매김), 즉 12번 아미노산 위치에서의 아르기닌(R); 103번 아미노산 위치에서의 트레오닌(T) 및 144번 아미노산 위치에서의 글루타민(Q)을 가짐;
    3) 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개, 상기 CDR-BD, 그리고 존재한다면 상기 hSA-BD는 Vκ 아형, 구체적으로 Vκ1 및 Vκ3 아형으로부터 선택되고, 구체적으로 Vκ1 아형의 것인 VL 틀 영역 FR1, FR2 및 FR3와, Vλ FR4이거나, 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 76 ~ 서열 번호 83중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 76 또는 83에 따른 Vλ FR4인 VL 틀 FR4를 포함하는 VL 도메인을 포함함;
    4) 상기 다중 특이적 항체는 인간화된 것, 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 인간화된 것으로서, 토끼 유래 CDR을 포함함;
    5) 상기 다중 특이적 항체는 3중 특이적, 구체적으로 3중 특이적 및 3가이거나, 또는 3중 특이적 및 4가임
    중 1가지 이상을 가지는, 다중 특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 특이적 항체의 포맷은 scDb-scFv, scMATCH3, MATCH3 및 MATCH4로부터 선택되는, 다중 특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
    a) 서열 번호 7 및 10으로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
    b) 서열 번호 9 및 12로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열;
    또는
    a) 서열 번호 20, 23, 26 및 28로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
    b) 서열 번호 22, 25, 27 및 29로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열; 또는
    a) 서열 번호 8 및 11로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
    b) 서열 번호 9 및 12로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열; 또는
    a) 서열 번호 21 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
    b) 서열 번호 22 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열
    을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
    a) 서열 번호 7의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
    b) 서열 번호 10의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
    c) 서열 번호 20의 VH 서열 및 서열 번호 22의 VL 서열; 또는
    d) 서열 번호 23의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
    e) 서열 번호 8의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
    f) 서열 번호 11의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
    g) 서열 번호 21의 VH 서열 및 서열 번호 22의 VL 서열; 또는
    h) 서열 번호 24의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
    i) 서열 번호 26의 VH 서열 및 서열 번호 27의 VL 서열; 또는
    j) 서열 번호 28의 VH 서열 및 서열 번호 29의 VL 서열
    을 포함하고, 구체적으로 상기 ROR1-BD 1개 또는 2개는
    a) 서열 번호 7의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
    b) 서열 번호 10의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
    c) 서열 번호 23의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열; 또는
    d) 서열 번호 8의 VH 서열 및 서열 번호 9의 VL 서열; 또는
    e) 서열 번호 11의 VH 서열 및 서열 번호 12의 VL 서열; 또는
    f) 서열 번호 24의 VH 서열 및 서열 번호 25의 VL 서열
    을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3-BD는
    a) 서열 번호 36 또는 37로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 서열; 및
    b) 서열 번호 38로부터 선택되는 아미노산 서열중 임의의 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 서열,
    구체적으로
    a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
    b) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  9. 제4항에 있어서, 상기 상기 hSA-BD는
    (i) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (ii) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (iii) 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (iv) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (v) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (vi) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (vii) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (viii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
    구체적으로
    (v) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (vi) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (vii) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (viii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  10. 제1항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ROR1-BD.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체 또는 제10항에 의한 ROR1-BD를 암호화하는 하나의 핵산 또는 2개의 핵산.
  12. 제11항에 의한 하나의 핵산 또는 2개의 핵산을 포함하는 하나의 벡터 또는 2개의 벡터.
  13. 제12항에 의한 하나의 벡터 또는 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  15. ROR1 발현 암, 구체적으로 만성림프구성백혈병/소림프구림프종(CLL/SLL), 급성골수성백혈병(AML), 급성림프아구성백혈병(ALL), 맨틀세포림프종(MCL), 모양세포백혈병, 소포림프종(FL), 변연부림프종(MZL), 비호지킨림프종(NHL), 확산성거대B세포림프종(DLBCL), 리히터증후군(RS), 폐암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 유방암, 난소암, 교모세포종, 고환암, 자궁암, 부신암, 흑색종, 신경모세포종, 육종 및 신암으로부터 선택되는 ROR1 발현 암을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체 또는 제14항에 의한 약학 조성물.
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