CN117043185A

CN117043185A - 对ror1和cd3具有特异性的多特异性抗体

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Publication number: CN117043185A
Application number: CN202280023785.7A
Authority: CN
Inventors: 比蒂·查特吉; 丹尼尔·斯内尔; 亚历山大·西莫南; 迪·贡德; 克里斯蒂安·赫斯; 斯特凡·沃穆思; 马蒂亚斯·布洛克; 朱莉娅·蒂茨; 玛丽亚·约翰逊; 法比奥·马里奥·斯皮加
Original assignee: Numa Therapeutic Co ltd
Current assignee: Numa Therapeutic Co ltd
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2022-02-02
Publication date: 2023-11-10

Abstract

本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合ROR1的胞外结构域的结合结构域(ROR1‑BD)，和一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3‑BD)，其中，所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，以及生产所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。

Description

对ROR1和CD3具有特异性的多特异性抗体

技术领域

本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合ROR1的胞外结构域的结合结构域(ROR1-BD)，和一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)，其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，以及生产所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。

背景技术

酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1是受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族的成员。ROR1受体的胞外结构域由三个不同的结构域组成：膜远端免疫球蛋白样结构域、中间的Frizzled结构域和近膜端Kringle结构域。ROR1是胚胎发生过程中所需的一种胎儿抗原。ROR1纯合子敲除的小鼠在围产期会因呼吸功能障碍而死亡(Borcherding et al 2014)。ROR1在正常成人组织中的表达仅限于脂肪组织、胰腺和肺部的某些细胞以及中间B细胞亚群(Baskar et al 2008；Hudecek et al 2010；Bicocca et al.,2012)。然而，它在一些血液肿瘤和实体瘤以及癌症干细胞亚群中也有表达。此外，多项研究表明，ROR1在癌症进展和转移过程中发挥着重要作用(参见例如Cui et al.,2013)。因此，ROR1是一种有吸引力的肿瘤特异性治疗靶点。

ROR1是一种细胞表面蛋白，通过与其配体(认为是Wnt5a和NKX1-2)的结合来介导信号。已证明Wnt5a与ROR1的胞外部分的Frizzled结构域结合，并在转染细胞中调节正常细胞系和肺肿瘤细胞系的NF-κB活化和增殖。研究表明，NKX1-2与ROR1的结合通过激酶依赖性和激酶非依赖性机制在肺癌细胞系的存活中发挥作用。

分化簇3(CD3)是在某些T细胞表面上表达的I型跨膜蛋白，是T细胞活化所必需的。它参与T细胞受体(TCR)复合物，并与该复合物的其他结构域相互作用。在哺乳动物中，CD3有三条不同的链(γ、δ和ε)，以及一条ζ2(CD247)链或一条ζ/η链。CD3链和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。研究表明，抗CD3的抗体，如抗CD3ε的抗体，能诱导T细胞上CD3的聚集，从而导致T细胞活化。

现有技术中已经描述了一些针对ROR1和CD3的双特异性抗体。

例如，WO2017/127499(A1)公开了双特异性抗ROR1xCD3抗体，即分子，其特异性结合ROR1的胞外结构域的Ig样结构域、Frizzled结构域或Kringle结构域。分子对表达ROR1的改良SK-MES-1细胞的T细胞定向杀伤作用的EC₅₀值范围为0.2至17nM，最大杀伤率范围通常在20％至40％。改进的双特异性抗ROR1xCD3/>分子RORxCD3D1和ROR1xCD3 D2对表达ROR1的癌细胞MAVER-1、JeKo-1和Z-138的T细胞定向杀伤的EC₅₀值范围为0.2至1nM，最大杀伤率通常低于50％。

WO2017/142928(A1)公开了抗ROR1xCD3双特异性二抗体，由两个交联并二硫化物稳定的Fv结合域组成，对两种靶抗原具有特异性，并与免疫球蛋白Fc区相连(形式)。还公开了这几种DART抗体针对不同的表达ROR1的癌细胞系的T细胞定向细胞毒性试验。杀死这些癌细胞的EC₅₀值范围通常在10至100pM，最大杀伤率为10％至40％，但也有例外。不过，只有一个实施例的最大杀伤率略高于60％。对于最佳DART抗体DART-D，报告的EC₅₀值范围为1.3至56pM。

WO2019/008379(A1)公开了抗ROR1xCD3双特异性BiTE，即由两个scFv片段通过短接头连接组成的双特异性抗体。所示例的最佳BiTE是克隆F，它在浓度为0.01微克/毫升时对ROR1阳性B-1643和B-7神经母细胞瘤细胞具有显著的细胞毒性。

WO2020/237173(A1)公开了抗ROR1xCD3双特异性抗体，其具有五种不同的基于IgG的双特异性构型。制备了这些基于IgG的双特异性抗体中的20种，并分析了它们的内化及其诱导T细胞介导的杀伤各种表达ROR1的癌细胞的能力。尽管速度不同，但所有20种构建体都被内化。这20种构建体对所述表达ROR1的癌细胞的T细胞介导的杀伤的EC₅₀值范围通常在几pM至50pM，最大杀伤率为10％至50％。仅有一例报道最大杀伤率超过60％。

WO2014/167022(A1)和后续专利申请WO2016/055592(A1)公开了双特异性抗体，其包含一个特异性结合人CD3ε的Fab片段，和一个或两个特异性结合人ROR1的胞外结构域的里另外Fab片段，其中所述双特异性抗体在基于细胞的试验中表现出低内化速度。举例说明了一些双特异性抗体构建体，它们对ROR1是单价或双价，且包含免疫球蛋白Fc区，并对它们进行了内化实验。内化实验结果表明，与相应的ROR1单价抗体构建体相比，ROR1双价抗体构建体在原代B-CLL细胞中的内化速度更快。用这些双特异性抗体对表达ROR1的RPMI8226MM靶细胞进行的T细胞定向细胞毒性测试表明，在抗体浓度为100pM时，最大靶细胞裂解率为30％至40％。WO2016/055592(A1)进一步公开了使用改良的ROR1双价抗体Mab2-TCBcv进行的T细胞定向细胞毒性测试，针对表达不同ROR1水平的几种靶细胞进行了测试。数据显示，Mab2-TCBcv对表达中等水平ROR1的Colo-704和OVCAR-5卵巢癌细胞的最大靶细胞裂解率为20％至50％，对表达低水平ROR1的SKOV3卵巢癌细胞的最大靶细胞裂解率为20％。

从上述参考文献中可以明显看出，现有技术中的抗ROR1xCD3抗体通常对表达低水平ROR1的癌细胞的效力明显降低。此外，在针对许多表达ROR1的癌细胞，特别是针对低表达ROR1的癌细胞的细胞毒性试验中，这些现有技术的抗体的最大杀伤百分比通常较低，通常远低于50％，这表明它们的作用模式并不理想。

因此，显然需要新型和改进的抗ROR1xCD3治疗抗体。

所述治疗抗体应对高表达ROR1的癌细胞和低表达ROR1的癌细胞均具有高效力。此外，它们对这些癌细胞应具有合理的最大杀伤百分比，例如40％或更高。同时，它们应具有可耐受的安全性，将剂量限制性副作用控制在较低水平。此外，所述治疗抗体最好具有优异的生物物理特性，例如高稳定性，以便于开发和高产量生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物，改善对表达ROR1的癌症的治疗。特别是，本发明的目的是提供新型和改进的治疗抗体，这种抗体也能有效地消灭表达低水平ROR1的癌细胞。本发明的另一个目的是鉴定抗ROR1xCD3抗体，这种抗体具有改进的作用模式，即在细胞毒性试验中对表达ROR1的癌细胞具有高的最大杀伤百分比。所述新型和改进的治疗抗体应进一步表现出可耐受的安全性，即，不应通过与CD3的非特异性结合导致T细胞的全身活化而影响健康细胞或产生剂量限制性毒性。

本发明者现在发现，包含如本文所定义的一个或两个特异性靶向ROR1的结合域(ROR1-BD)和一个特异性靶向CD3的结合域(CD3-BD)，特别是以特定序列特征为特征的结合域的多特异性抗体，在杀死高水平至低水平表达ROR1的癌细胞方面表现出令人惊讶的高效力。此外，令人惊奇地发现，在针对高水平至低水平表达ROR1的癌细胞的T细胞定向细胞毒性试验中，包含如本文所定义的一个ROR1-BD的所述多特异性抗体通常表现出60％或更高的最大杀伤力。

因此，第一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：

a)一个或两个特异性结合ROR1的胞外结构域的结合结构域(ROR1-BD)；和

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中

-所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区；

-所述ROR1-BD彼此独立地包含一组CDR序列，其选自由以下组成的一组：

SEQ ID NO:1的HCDR1序列，

SEQ ID NO:2的HCDR2序列，

SEQ ID NO:3的HCDR3序列，

SEQ ID NO:4的LCDR1序列，

SEQ ID NO:5的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:6的LCDR3序列；

和/或由以下组成的一组：

SEQ ID NO:13或14的HCDR1序列，

SEQ ID NO:15的HCDR2序列，

SEQ ID NO:16的HCDR3序列，

SEQ ID NO:17的LCDR1序列，

SEQ ID NO:18的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:19的LCDR3序列；

-所述CD3-BD包含一组CDR序列，由以下组成：

SEQ ID NO:30的HCDR1序列，

SEQ ID NO:31的HCDR2序列，

SEQ ID NO:32的HCDR3序列，

SEQ ID NO:33的LCDR1序列，

SEQ ID NO:34的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:35的LCDR3序列。

第二方面，本发明涉及特异性ROR1结合结构域。

第三方面，本发明涉及一种核酸或两种核酸，其编码本发明的所述多特异性抗体或特异性ROR1结合结构域。

第四方面，本发明涉及一种载体或两种载体，其包含本发明的所述一种核酸或所述两种核酸。

第五方面，本发明涉及一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含本发明的所述一种载体或所述两种载体。

第六方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体的方法，包括(i)提供本发明的一种核酸或两种核酸，或本发明的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达系统中收集所述多特异性抗体或所述特异性结合结构域，或(ii)提供本发明的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述特异性结合结构域。

第七方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的所述多特异性抗体和药学上可接受的载体。

第八方面，本发明涉及本发明的多特异性抗体，其用作药物。

第九方面，本发明涉及本发明的多特异性抗体，其用于治疗疾病，更特别是选自癌症，特别是表达ROR1的癌症的人类疾病。

第十方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，特别是人类疾病，更特别是选自癌症的人类疾病，包括以下步骤：向有需要的患者施用本发明的多特异性抗体。

分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：

1.一种多特异性抗体，其包含：

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中

SEQ ID NO:1的HCDR1序列，

SEQ ID NO:2的HCDR2序列，

SEQ ID NO:3的HCDR3序列，

SEQ ID NO:4的LCDR1序列，

SEQ ID NO:5的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:6的LCDR3序列；

和/或由以下组成的一组：

SEQ ID NO:13或14的HCDR1序列，

SEQ ID NO:15的HCDR2序列，

SEQ ID NO:16的HCDR3序列，

SEQ ID NO:17的LCDR1序列，

SEQ ID NO:18的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:19的LCDR3序列；

-所述CD3-BD包含一组CDR序列，由以下组成：

SEQ ID NO:30的HCDR1序列，

SEQ ID NO:31的HCDR2序列，

SEQ ID NO:32的HCDR3序列，

SEQ ID NO:33的LCDR1序列，

SEQ ID NO:34的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:35的LCDR3序列。

2.根据项目1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中

SEQ ID NO:1的HCDR1序列，

SEQ ID NO:2的HCDR2序列，

SEQ ID NO:3的HCDR3序列，

SEQ ID NO:4的LCDR1序列，

SEQ ID NO:5的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:6的LCDR3序列；

或由以下组成的一组：

SEQ ID NO:13或14的HCDR1序列，

SEQ ID NO:15的HCDR2序列，

SEQ ID NO:16的HCDR3序列，

SEQ ID NO:17的LCDR1序列，

SEQ ID NO:18的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:19的LCDR3序列；

-所述CD3-BD包含一组CDR序列，由以下组成：

SEQ ID NO:30的HCDR1序列，

SEQ ID NO:31的HCDR2序列，

SEQ ID NO:32的HCDR3序列，

SEQ ID NO:33的LCDR1序列，

SEQ ID NO:34的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:35的LCDR3序列。

3.根据项目1或2所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体具有下列特征1)至3)中的一种或多种：

1)所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区；

2)所述多特异性抗体不包含CH1和/或CL区；

3)所述多特异性抗体是人源化的，特别地，所述多特异性抗体是人源化的并且包含兔来源的CDR。

4.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD与ROR1的Ig样结构域结合和/或不阻断Wnt5α与ROR1的结合。

5.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中在所述多特异性抗体包含两个ROR1-BD的情况下，所述两个ROR1-BD包含两组不同的CDR，即一个ROR1-BD包含SEQ IDNO:1至6的CDR，另一个ROR1-BD包含SEQ ID NO:13/14至19的CDR，或者所述两个ROR1-BD包含相同的CDR组，即两个ROR1-BD包含SEQ ID NO:1至6的CDR或SEQ ID NO:13/14至19的CDR，特别是所述两个ROR1-BD包含相同的CDR组。

6.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是三特异性的。

7.根据项目6所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含一个特异性结合人血清白蛋白的结合结构域(hSA-BD)。

8.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是三特异性且三价的或三特异性且四价的。

9.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：串联三-scFv(三体)；三抗体(triabody)；scDb-scFv；与异二聚Fc结构域以外的异二聚化结构域的N和/或C末端融合的串联三-scFv或scDb-scFv；和MATCH。

10.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自scDb-scFv、scMATCH3、MATCH3和MATCH4。

11.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中当为scFv形式时，所述一个或两个ROR1-BD中的每一个：

a.结合人ROR1的细胞外结构域，单价解离常数(K_D)为1pM至2nM，特别是K_D为1pM至1nM，特别是1至500pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；

b.结合表达人ROR1的MDA-MB-231细胞，EC₅₀为5pM至10nM，特别是EC₅₀为5pM至5nM，特别是EC₅₀为5pM至4nM，特别是EC₅₀为5pM至3nM；

c.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(T_m)为至少58℃，特别是至少59℃，特别是至少60℃，特别是至少61℃，特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mMNaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；

d.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存四周后，所述scFv的单体含量损失小于3％，特别是小于2％，特别是小于1％；和/或

e.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃储存四周后，单体含量损失小于10％；和/或

f.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃或40℃下储存四周后，所述scFv的蛋白质含量损失小于1％。

12.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含VH1a、VH1b、VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4。

13.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD还具有以下特征1)和2)中的一个或两个：

1)VL结构域，包括框架区FR1、FR2和FR3，它们选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是Vκ1亚型，以及框架FR4，所述框架FR4选自VλFR4，特别是VλFR4，所述VλFR4包含与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中的任意一个具有至少70、80、90％同一性的氨基酸序列，更特别地，VλFR4选自SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中的任意一个，特别是根据SEQ ID NO:76或83的VλFR4；

2)VH结构域，包括VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4的，特别是为VH3亚型；其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)、氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)。

14.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:7和10的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:9和12的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同，

或

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:20、23、26和28的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:22、25、27和29的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同，或

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:8和11的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

或

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:21和24的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:22和25的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

15.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:7、20和26的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:9、22和27的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；

或

1)VH序列，其与选自SEQ ID NO:8、11和24的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

2)VL序列，其与选自SEQ ID NO:9、12和25的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

16.根据项目1至14中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)VH序列，其选自SEQ ID NO:7和10，

b)VL序列，其选自SEQ ID NO:9和12；

或

a)VH序列，其选自SEQ ID NO:20、23、26和28，

b)VL序列，其选自SEQ ID NO:22、25、27和29；

或

a)VH序列，其选自SEQ ID NO:8、11和14，

b)VL序列，其选自SEQ ID NO:9、12和25。

17.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

b)SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

c)SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:22的VL；或

d)SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

e)SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

f)SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

g)SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:22的VL序列；或

h)SEQ ID NO:24的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

i)SEQ ID NO:26的VH序列和SEQ ID NO:27的VL序列；或

j)SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:29的VL序列；

特别是，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

b)SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

c)SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:25的VL；或

d)SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

e)SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

f)SEQ ID NO:24的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列。

18.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD与CD3ε结合。

19.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中当为scFv形式时，所述CD3-BD:

a)结合人CD3ε，解离常数(K_D)小于50nM，特别是K_D为0.1至50nM，特别是0.1至30nM，特别是0.1至15nM，特别是0.1至10nM，如通过SPR测量的；

b)结合食蟹猴CD3，K_D小于50nM，特别是K_D为0.1至50nM，特别是0.1至30nM，特别是0.1至15nM，特别是0.1至10nM，如通过SPR测量的；且

c)通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定，熔化温度(T_m)为至少60℃，特别是至少65℃，更特别是至少67℃的熔化温度。

20.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD包含：VH1a、VH1b、VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4。

21.根据项目18至20所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD具有下列特征1)和2)中的一种或两种：

2)VH结构域，包含VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4的，特别是为VH3亚型；其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)；氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)。

22.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD包含：

a)VH序列，其与选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；和

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

23.根据项目22所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD包含：

a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列，和

b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。

24.根据项目22或23所述的多特异性抗体，其中所述VH序列包含C51氨基酸残基(AHo编号)，且所述VL序列包含C141氨基酸残基(AHo编号)。

25.根据项目7所述的多特异性抗体，其中所述hSA-BD包含

(i)分别为SEQ ID NO:39、40和41的HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列，和人VH框架序列FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4的，特别是为VH3亚型；其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4任选地具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)；氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)；和

(ii)分别为SEQ ID NO:42、43和44的LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列，和人抗体VL框架序列FR1、FR2和FR3，其选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是为Vκ1亚型，以及人抗体VL框架FR4序列，其为VλFR4序列，特别是选自SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中任一个的VλFR4序列，特别是根据SEQ ID NO:76或83的VλFR4序列；

或

(i)分别为SEQ ID NO:49、50和51的HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列，和人VH框架序列FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4的，特别是为VH3亚型；其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4任选地具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)；氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)；和

(ii)分别为SEQ ID NO:52、53和54的LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列，和人抗体VL框架序列FR1、FR2和FR3，其选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是为Vκ1亚型，以及人抗体VL框架FR4序列，其为VλFR4序列，特别是选自SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中任一个的VλFR4序列，特别是根据SEQ ID NO:76或83的VλFR4序列；

或

(i)分别为SEQ ID NO:59、60和61的HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列，和人VH框架序列FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4的，特别是为VH3亚型，其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4任选地具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)；氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)；和

(ii)分别为SEQ ID NO:62、63和74的LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列，和人抗体VL框架序列FR1、FR2和FR3，其选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是为Vκ1亚型，以及人抗体VL框架FR4序列，其为VλFR4序列，特别是选自SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中任一个的VλFR4序列，特别是根据SEQ ID NO:76或83的VλFR4序列。

26.根据项目7或25所述的多特异性抗体，其中所述hSA-BD包含

(i)VH结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列；或者

(ii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者

(iii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者

(iv)VH结构域，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；或者

(v)VH结构域，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列；或者

(vi)VH结构域，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列；或者

(vii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；或者

(viii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列。

27.根据项目7或25所述的多特异性抗体，其中所述hSA-BD包含:

(i)VH结构域，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者

(ii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；或者

(iii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；或者

(iv)VH结构域，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列。

28.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述结合结构域独立地选自由以下组成的组：Fab、F(ab)₂、Fv、scFv、dsFv、和scAb，特别是选自由以下组成的组：Fv、scFv和dsFv。

29.根据项目28所述的多特异性抗体，其中每个所述结合结构域独立地选自：

a)VL结构域和VH结构域的同源对(Fv片段)；或者

b)由寡肽或多肽接头连接的VL结构域和VH结构域的同源对(scFv片段)。

30.根据项目1至29中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：

a)一个ROR1-BD；

b)一个CD3-BD；和

c)一个hSA-BD。

31.根据项目30所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是单链蛋白质，其中，所述单链蛋白质包含由以下组成的氨基酸序列：

(i)第一VL结构域，

(ii)第一多肽接头，

(iii)第一VH结构域，

(iv)第二多肽接头，

(v)第二VL结构域，

(vi)第三多肽接头，以及

(vii)第二VH结构域，

以所述的顺序一个接一个地排列，

其中所述第一VL结构域与所述第二VH结构域缔合形成第一结合结构域，且所述第二VL结构域与所述第一VH结构域缔合形成第二结合结构域，

并且其中所述单链蛋白质还包含

(viii)第三结合结构域，其由通过第四多肽接头连接的第三VL结构域和第三VH结构域形成，其中所述第三结合结构域在C-末端或N-末端通过第五多肽接头与所述氨基酸序列融合，

其中所述三个结合结构域具有以下特异性：

a)一个结合结构域特异性结合人ROR1(ROR1-BD)；

b)另一个结合结构域特异性结合人CD3(CD3-BD)；且，

c)剩余的结合结构域特异性结合hSA(hSA-BD)。

32.根据项目31所述的多特异性抗体，

其中所述三个结合结构域具有以下特异性：

a)第一和第二结合结构域中的一个特异性结合人血清白蛋白(hSA-BD)；

b)第一和第二结合结构域中的另一个特异性结合人CD3(CD3-BD)；和

c)第三结合结构域特异性结合ROR1(ROR1-BD)；

特别地，所述三个结合结构域具有以下特异性：

a)第一结合结构域特异性结合人血清白蛋白(hSA-BD)；

b)第二结合结构域特异性结合人CD3(CD3-BD)；且

c)第三结合结构域特异性结合ROR1(ROR1-BD)。

33.根据项目30所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白包含第一和第二单链蛋白，其中，所述第一单链蛋白包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列由以下组成(从N末端至C末端)：

(ia)第一VL结构域，

(iia)第一多肽接头，以及

(iiia)第二VL结构域，并且

其中所述第二单链蛋白包含第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列由以下组成(从N末端至C末端)：

(ib)第一VH结构域，

(iib)第二多肽接头，以及

(iiib)第二VH结构域，并且

其中所述第一VL结构域与所述第一或所述第二VH结构域缔合形成第一结合结构域，且所述第二VL结构域与所述VH结构域中的另一个缔合形成第二结合结构域，

并且，其中所述第一和所述第二单链蛋白中的至少一个还包含

(iv)第三结合结构域，其由通过第三多肽接头连接的第三VL结构域和第三VH结构域形成，其中所述第三结合结构域通过第四多肽接头与所述第一或所述第二氨基酸序列融合，

其中所述三个结合结构域具有以下特异性：

a)一个结合结构域特异性结合人CD3(CD3-BD)；

b)另一个结合结构域特异性结合人ROR1(ROR1-BD)；且，

c)剩余的结合结构域特异性结合人血清白蛋白(hSA-BD)。

34.根据项目30至33中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体：

a.结合人ROR1的细胞外结构域，单价解离常数(K_D)小于5nM，特别是单价K_D为1pM至5nM，特别是K_D为1pM至1nM，特别是1至500pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；

b.结合人CD3ε，(单价)K_D小于20nM，特别是单价K_D为0.1至20nM，特别是0.1至15nM，特别是0.1至10nM，如SPR所测量的；

c.与食蟹猴CD3ε交叉反应，特别是与食蟹猴CD3ε结合的单价K_D为30nM或更低，特别是单价K_D为0.1至30nM，特别是为0.1至20nM，如通过SPR所测量的；

d.结合表达人ROR1的MDA-MB-231细胞，EC₅₀为0.01至50nM，特别是EC₅₀为0.01至30nM，特别是EC₅₀为0.01至20nM，特别是EC₅₀为0.01至10nM，特别是EC₅₀为0.01至5nM；

e.杀死表达人ROR1的MDA-MB-231靶细胞的EC₅₀小于5nM,特别是1pM至5nM,特别是1pM至2nM,特别是1pM至1nM，如在针对所述靶细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所测定的；

f.通过差示扫描荧光分析法测定的熔化温度(T_m)为至少55℃、优选至少58℃、更优选至少60℃，特别是其中所述抗原结合片段是在pH 6.5的含300mM D(+)-蔗糖的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；

g.当所述scFv的起始浓度为1mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.5的具有300mM D(+)-蔗糖的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存四周后，所述scFv的单体含量损失小于1％，例如小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％；和/或

h.当所述scFv的起始浓度为1mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.5的具有300mM D(+)-蔗糖的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃储存四周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％。

35.根据项目30、31、33和34中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体选自由SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、107和108定义的抗体。

36.根据项目1至29中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：

A)两个ROR1-BD；

b)一个CD3-BD；和

c)一个hSA-BD。

37.根据项目36所述的多特异性抗体，其中所述两个ROR1-BD结合ROR1胞外结构域上的相同表位或ROR1胞外结构域上的不同表位，特别是ROR1胞外结构域上的相同表位。

38.根据项目36或37所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白包含第一和第二单链蛋白，

其中，所述第一单链蛋白包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列由以下组成(从N末端至C末端)：

(ia)第一VL结构域，

(iia)第一多肽接头，以及

(iiia)第二VL结构域，并且

(ib)第一VH结构域，

(iib)第二多肽接头，以及

(iiib)第二VH结构域，并且

(v)第四结合结构域，其由通过第五多肽接头连接的第四VL结构域和第四VH结构域形成，其中所述第四结合结构域通过第六多肽接头与所述第一或所述第二氨基酸序列融合，

其中所述四个结合结构域具有以下特异性：

a)一个结合结构域特异性结合人CD3(CD3-BD)；

b)另外两个结合结构域特异性结合人ROR1(ROR1-BD)；且，

c)剩余的结合结构域特异性结合人血清白蛋白(hSA-BD)。

39.根据项目38所述的多特异性抗体，其中所述第三结合结构域与所述第一或第二氨基酸序列融合，并且所述第四结合结构域与所述两个氨基酸序列中的另一个融合。

40.根据项目38或39所述的多特异性抗体，其中所述四个结合结构域具有以下特异性：

a)第一结合结构域特异性结合人CD3(CD3-BD)；

b)第二结合结构域特异性结合人血清白蛋白(hSA-BD)；且

c)第三和第四结合结构域特异性结合ROR1(ROR1-BD)。

41.根据项目36至40中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体：

a.结合人ROR1的细胞外结构域，单价解离常数(K_D)小于10nM，特别是单价K_D为10pM至5nM，特别是K_D为10pM至7nM，特别是10pM至5nM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；

b.结合人CD3ε，单价K_D小于20nM，特别是单价K_D为0.1至20nM，特别是0.1至15nM，特别是0.1至10nM，如SPR所测量的；

d.结合表达人ROR1的MDA-MB-231，EC₅₀为0.01至10nM，特别是EC₅₀为0.01至10nM，特别是EC₅₀为0.01至5nM，特别是EC₅₀为0.01至3nM，特别是EC₅₀为0.01至2nM；

e.杀死表达人ROR1的MDA-MB-231靶细胞的EC₅₀小于500pM，特别是0.1pM至500pM，特别是0.1pM至200pM，特别是0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如在针对所述靶细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所测定的；

f.杀死表达人ROR1的JEKO-1靶细胞的EC₅₀小于20pM，特别是0.01pM至20pM，特别是0.01pM至10pM，特别是0.01至5pM，特别是0.01至3pM，如在针对所述靶细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所测定的；

g.杀死表达人ROR1的SKOV-3靶细胞的EC₅₀小于1000pM，特别是0.1pM至1000pM，特别是0.1pM至500pM，特别是0.1至200pM，特别是0.1至100pM，如在针对所述靶细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所测定的；

h.通过差示扫描荧光分析法测定的熔化温度(T_m)为至少53℃、优选至少55℃、更优选至少58℃，特别是其中所述抗原结合片段配制在pH 6.5的含300mM蔗糖的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；

i.当所述多特异性抗体的起始浓度为1mg/ml时，并且特别地，其中将所述多特异性抗体配制在pH 6.5的具有300mM D(+)-蔗糖的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中时，在4℃储存两周后，单体含量损失小于1％，特别是小于0.5％；和/或

j.当所述多特异性抗体的起始浓度为1mg/ml时，并且特别地，其中将所述多特异性抗体配制在pH 6.5的具有300mM D(+)-蔗糖的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中时，在40℃储存至少四周后，单体含量损失小于5％。

42.根据项目36至41中任一项所述的多特异性抗体，其中

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:95组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:96组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:97组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:98组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:99组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:100组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:101组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:102组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:103组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:104组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:105组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:106组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:109组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:110组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:111组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:112组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:113组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:114组成；或者

所述第一单链蛋白质包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:115组成，并且

所述第二单链蛋白质包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，更特别地，由氨基酸序列SEQ ID NO:116组成。

43.根据项目32和38至41中任一项所述的多特异性抗体，其中除了所述第一和第二VL和VH结构域之外，所述异源二聚体蛋白质不包含第一和第二蛋白质相互作用结构域的同源对，其中所述第一蛋白质相互作用结构域包含在所述第一单链蛋白质中，并且其中所述第二蛋白质相互作用结构域包含在所述第二单链蛋白质中。

44.根据项目43中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单链蛋白和所述第二单链蛋白以平行方向异源二聚化，即，所述第一VL结构域与所述第一VH结构域缔合，并且所述第二VL结构域与所述第二VH结构域缔合。

45.根据项目43中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单链蛋白和所述第二单链蛋白以反平行方向异源二聚化，即，所述第一VL结构域与所述第二VH结构域缔合，并且所述第二VL结构域与所述第一VH结构域缔合。

46.根据项目30至45中任一项所述的多特异性抗体，其中包含在所述单链蛋白或异源二聚体蛋白中的任何结合结构域是免疫球蛋白可变结构域，排列在所述第一和第二单链蛋白中，并且通常通过接头连接。

47.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中，至少一个所述抗体可变结构域包含源自亲本兔抗体的CDR区域。

48.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，在多特异性抗体中存在两个ROR1-BD的情况下，ROR1-BD中的至少一个和CD3-BD能够同时结合它们各自的抗原，或者在多特异性抗体中存在两个ROR1-BD的情况下，ROR1-BD和CD3-BD都能够同时结合它们各自的抗原。

49.项目1、4和11至17中任一项所定义的ROR1-BD。

50、一种多特异性抗体，其包含：

a)项目49中定义的一个或两个ROR1-BD；

b)至少一个结合结构域，其特异性结合不同于ROR1的靶标。

51.一种核酸或两种核酸，其编码项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体或项目49所述的ROR1-BD。

52.一种载体或两种载体，其包含项目51的所述一种核酸或所述两种核酸。

53.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含项目52的所述一种载体或所述两种载体。

54.一种生产项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体，或项目49所述的ROR1-BD的方法，包括(i)提供项目51的一种核酸或两种核酸，或项目52的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或所述两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达体系中收集所述多特异性抗体或所述ROR1-BD，或(ii)提供项目53的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述ROR1-BD。

55.一种药物组合物其包含项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。

56.项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体，其用作药物。

57.根据项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症的人类疾病。

58.项目1至48和50中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗根据项目57的疾病，其中所述疾病是表达ROR1的癌症。

59.根据项目58所述的多特异性抗体，其中所述表达ROR1的癌症选自慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、里克特综合征(Richter’s syndrome，RS)、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤和肾癌。

60.一种治疗疾病的方法，特别是人类疾病，更特别是选自癌症的人类疾病，包括以下步骤：向有需要的患者施用项目1至48中任一项所述的多特异性抗体。

61.根据项目60所述的方法，其中所述疾病是表达ROR1的癌症。

62.根据项目61所述的方法，其中所述表达ROR1的癌症选自慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、里克特综合征、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤和肾癌。

附图说明

图1显示了通过流式细胞术检测，抗ROR1 scFv PRO2060(A、B)和PRO2062对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1和对ROR1阴性的MCF-7细胞的代表性浓度-反应曲线。证明了PRO2060和PRO2062与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合(A、C)，而没有观察到与ROR1阴性MCF-7细胞结合(B、D)。与参考Fab片段PRO2213相比，PRO2060的EC₅₀结合低约三倍，PRO2062的EC₅₀结合高约三倍。图中的数据点代表两次技术重复的平均值。

图2显示了通过流式细胞术检测，优化的抗ROR1 scFv PRO2271(A、B)以及PRO2291和PRO2292(C、D)对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1和对ROR1阴性的MCF-7细胞的浓度-反应曲线。所有scFv均证明与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合(A、C)，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞结合(B、D)。与PRO2062相比，优化的PRO2271的EC₅₀结合低约两倍。与PRO2060和PRO2062相比，PRO2060和PRO2062的变体PRO2291和PRO2292(包括用于稳定的VL-VH结构域间二硫键)显示出相似的EC₅₀结合。图中的数据点代表两次技术重复的平均值。

图3显示了三特异性scMATCH3形式的示意图。

图4显示了通过流式细胞术检测，抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子PRO2286、PRO2287(A、B)和PRO2257(C、D)对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1和对ROR1阴性的MCF-7细胞的浓度-反应曲线。所有三个scMATCH3分子均证明与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合(A、C)，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞结合(B、D)。PRO2213被包括作为参考抗ROR1抗体。图中的数据点代表两次技术重复的平均值。

图5显示了通过流式细胞术检测，抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子PRO2507、PRO2508、PRO2509、PRO2510和PRO2668对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1和对ROR1阴性的MCF-7细胞的浓度-反应曲线。所有scMATCH3分子均证明与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合(A、B、C)，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞结合(D)。PRO2510的优化变体PRO2668经证明与MDA-MB-231细胞结合(E)，而没有发现与ROR1阴性的MCF-7细胞结合(F)。PRO2213被包括作为参考抗ROR1抗体。图中的数据点代表两次技术重复的平均值。

图6显示了MDA-MB-231和MCF7细胞的ROR1表达和结合位点定量。(A)通过对所示肿瘤细胞进行ROR1抗体染色，然后通过流式细胞术测定ROR1表达水平。蓝色直方图表示ROR1表达，红色表示对照。(B)使用Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG试剂盒量化ROR1表面水平。数字表示在细胞表面上计算的结合位点数量。

图7显示了靶向ROR1的scMATCH3分子所介导的细胞毒性和CD8T细胞活化。(A)将PBMC与MDA-MB-231细胞(上图)或MCF7细胞(下图)以10:1的效应物与靶细胞比共培养40小时。对照组包括单独的靶细胞(自发裂解)，以及在实验开始或结束时用1％Triton处理的靶细胞。(B)CD8T细胞活化和(C)CD4T细胞活化，如CD69+细胞频率所示，来自(A)所描述的数据集。显示了三个实验中的一个代表性实验。

图8显示了靶向ROR1的scMATCH3分子所介导的细胞毒性和CD8T细胞活化。(A)将PBMC与MDA-MB-231细胞(上图)或MCF7细胞(下图)以10:1的效应物与靶细胞比共培养40小时。对照组包括单独的靶细胞(自发裂解)，以及在实验开始或结束时用1％Triton处理的靶细胞。(B)CD8T细胞活化和(C)CD4T细胞活化，如CD69+细胞频率所示，来自(A)所描述的数据集。显示了两个实验中的一个实验。

图9显示了MATCH4形式的示意图。

图10显示了通过流式细胞术检测，二价抗ROR1 MATCH4分子PRO2589、PRO2590、PRO2591和PRO2592对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1(A、B)、对JIMT-1细胞上表达的人ROR1(C、D)和对ROR1阴性的MCF-7细胞(E)的浓度-反应曲线。所有MATCH4分子均证明与ROR1阳性MDA-MB-231细胞(A、B)和ROR1阳性JIMT-1细胞(C、D)结合，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞结合(E)。PRO2590的优化变体PRO2670经证明与MDA-MB-231细胞结合(F)，而没有发现与ROR1阴性的MCF-7细胞结合(G)。Fab片段PRO2213被包括作为参考抗ROR1抗体。图中的数据点代表两次技术重复的平均值。

图11显示了通过对所示肿瘤细胞进行ROR1抗体染色，然后进行流式细胞术测定的ROR1表面表达水平。蓝色直方图表示ROR1表达，红色表示阴性对照。

图12显示了由感兴趣的scMATCH3和MATCH4分子在几个ROR1表达细胞系中介导的细胞毒性。将Pan-T细胞与MDA-MB-231细胞(A，左上)、JIMT-1细胞(A，左下)、SKOV-3细胞(A，右下)或Jeko-1细胞(A，右上)以10:1的效应物与靶细胞比例共培养40小时。对照组包括单独的靶细胞(自发裂解)，以及在实验开始或结束时用1％Triton处理的靶细胞。MATCH4分子是PRO2589、PRO2590、PRO2591和PRO2592，并且这些曲线通过结构域进行颜色编码；scMATCH3分子是PRO2507、PRO2510和PRO2557。显示了四个实验中的一个实验。MCF7用作参考细胞(B)，即ROR1阴性细胞，并如A所述进行处理。误差线代表技术重复之间的差异。

图13显示了感兴趣的MATCH分子在几个ROR1表达细胞系中介导的T细胞活化。将Pan-T细胞与MDA-MB-231细胞(A)、JIMT-1(B)或SKOV-3(C)细胞以10:1的效应物与靶细胞比例共培养40小时。对上清液进行LDH释放分析，并用流式细胞术分析细胞中是否存在活化的T细胞，如CD69表达细胞的频率所示。上图对应的是CD8 T细胞，下图对应的是CD4 T细胞。MATCH4分子是PRO2589、PRO2590、PRO2591和PRO2592，并且这些曲线通过结构域进行颜色编码；scMATCH3分子是PRO2507、PRO2510和PRO2557。显示了3个实验(SKOV-3)或4个实验(MDA-MB-231、JIMT-1)中的一个实验。误差线代表技术重复之间的差异。

图14显示了在21个人血清样品中，PRO2668(A)、PRO2669(B)、PRO2510(C)和PRO2589(D)的原有ADA的吸收水平，其通过实施例10中描述的基于ELISA的原有ADA结合试验来确定。使用加标和未加标血清样品进行测量(确认试验设置)。进一步显示了所述分子(E)的加标人血清样品的吸光度水平的相应降低(抑制(％))。

图15显示了靶向ROR1的scMATCH3和scMATCH4分子所介导的细胞毒性和CD8T细胞活化。将Pan-T细胞与MDA-MB-231细胞(A，上图)或JIMT-1细胞(A，下图)以10:1的效应物与靶细胞比共培养40小时。对照组包括单独的靶细胞(自发裂解)，以及在实验开始或结束时用1％Triton处理的靶细胞。CD8T细胞活化，如CD8+CD69+细胞频率所示(B)，来自A所描述的数据集。显示了至少两个独立实验中的一个代表性实验。

图16通过示例性实体瘤细胞系的T细胞介导的耗竭，显示了PRO2668介导的细胞毒性(A)。图示了来自不同实体肿瘤细胞系的EC₅₀值对ROR1受体密度的依赖性的图(B)。通过T细胞介导的血液肿瘤细胞系耗竭的细胞毒性(C)。将肿瘤细胞系与T细胞共培养40小时，使用相对于对照组的乳酸脱氢酶释放来评估细胞毒性。细胞表面上ROR1受体的平均数以及细胞毒性的平均EC₅₀值显示在插图中。

图17显示了以MDA-MB-231或JIMT-1为实体瘤靶细胞，第6天时PRO2668介导的CD8活化和增殖(A)。以Z-138为血液肿瘤靶细胞，在第3天介导的CD8激活和增殖(B)。靶细胞和CellTrace紫标记的健康T细胞以5:1的E:T比例共培养。相对于对照组，通过CellTrace紫稀释液来测定增殖细胞的频率。活化细胞通过CD25标记确定。图中展示了两个实验中的一个代表性实验。

图18显示了CLL细胞和活跃分裂的Jeko-1细胞的直方图(A)。CLL细胞样本不增殖。与CLL患者PBMC(浅灰色直方图)相比，评估了活跃分裂的Jeko-1肿瘤细胞系(深灰色直方图)的5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入情况。EdU的掺入表明细胞正在分裂。显示了CLL患者PBMC的ROR1的表面表达和定量(白色直方图，相对于黑色阴性对照)(B)。所圈门的PRO2668与CLL患者肿瘤细胞的结合(C)。将CLL患者的PBMC与同种异体健康T细胞以5:1的E:T比例共培养40小时。通过处理后Annexin V和活/死染料阳性CLL细胞的比例来确定特异性杀伤(D)。对来自D的T细胞进行活化标记物CD69染色(E)。使用基于细胞计数珠阵列的多重系统来评估来自D的上清液的细胞因子释放(F)。描述的数据是四个独立供体/实验中的一个。

图19显示了不同剂量的scMATCH3 PRO2668和scMATCH4 PRO2670分子存在时的纵向肿瘤生长抑制(中位数)。给免疫力低下的小鼠皮下注射Jeko-1细胞，3天后移植PBMC。在肿瘤体积达到80-100mm³后，对动物进行随机分组并开始给药。每五天给药一次。采用混合效应模型分析纵向数据，然后进行Tukey's多重比较检验。ns：不显著；**P≤0.01；*P≤0.05；相对于实验结束时的对照IgG(帕利珠单抗)。

具体实施方式

大量血液和实体癌表达ROR1，这使得表达ROR1的癌症成为癌症治疗的有吸引力的靶标。然而，迄今开发的现有双特异性抗ROR1xCD3治疗抗体通常不具有针对这些癌症类型的预期功效范围。特别是，这些治疗性双特异性抗ROR1xCD3抗体通常对表达低水平ROR1的癌细胞具有中等效力。此外，在针对许多表达ROR1的癌细胞的细胞毒性试验中，这些现有技术的抗体的最大杀伤百分比通常较低，通常远低于50％，这表明它们的作用模式并不理想。因此，在医学领域中需要改进的基于抗ROR1xCD3的疗法，其具有更高的功效来治疗广泛的表达ROR1的癌症，包括以中等至低水平表达ROR1的癌症。

本发明提供了多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合ROR1的胞外结构域的结合结构域(ROR1-BD)，和一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)，其中ROR1-BD和CD3-BD的CDR区具有上文列出的定义。本发明的多特异性抗体能够有效杀死高水平表达ROR1的癌细胞以及仅低水平表达ROR1的癌细胞。本发明的一些多特异性抗体，例如PRO2589和PRO2591，在杀死高表达ROR1的JEKO-1细胞时的EC₅₀为亚pM级，且这些多特异性抗体中的一些，例如PRO2589和PRO2590，在杀死低表达ROR1的SKOV-3卵巢癌细胞时的EC₅₀低于50pM，如在针对所述靶细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所测定的(例如，图12和15)。

此外，包含一个如本文所定义的ROR1-BD的本发明的多特异性抗体对不同ROR1表达癌细胞的最大杀伤率为70％及以上，如在针对所述癌细胞的T细胞驱动的细胞毒性试验中所确定的。例如，PRO2510对表达高至低水平ROR1的MDA-MB-231癌细胞、JEKO-1癌细胞、JIMT-1癌细胞和SKOV-3癌细胞的最大杀伤率为约80％(例如，图12和15)。

此外，本发明的抗ROR1 x CD3多特异性抗体表现出非常有利的生物物理特性，特别是优异的储存稳定性。

因此，本发明的多特异性抗体提供了优于常规疗法的独特治疗优势。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的语境中(特别是在以下权利要求的语境中)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。

一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中所述ROR1-BD和所述CD3-BD包含如上定义的CDR序列。

在另一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中所述ROR1-BD和所述CD3-BD包含如上定义的CDR序列；

并且其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。

如本文所用，术语“抗体”等包括：完全抗体或其单链；及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，两侧是更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

本文所用的术语“免疫球蛋白Fc区”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，即重链恒定区的CH2和CH3结构域。术语“Fc区”包括天然序列Fc区和变体Fc区，即经工程改造而表现出某些所需特性的Fc区，例如改变的Fc受体结合功能和/或减少或受抑制的Fab臂交换。这种工程化Fc区的一个实例是knob-into-hole(KiH)技术(例如见Ridgway etal.,Protein Eng.9:617-21(1996)和Spiess et al.,J Biol Chem.288(37):26583-93(2013))。天然序列Fc区包括人lgG1、lgG2(lgG2A、IgG2B)、lgG3和lgG4。“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。特别地，FcR是人FcR的天然序列，其结合IgG抗体，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.5:203-234(1997))。FcR的概述见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capet et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”包括其他FcR，包括将来将要鉴定的FcR。术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie and Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie et al.,NatureBiotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.TJI(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al)。可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。还参见，例如，Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。

如本文所用，术语抗体的“结合结构域”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完全抗体的一个或多个片段，其保留了与给定的抗原(例如，ROR1、CD3、hSA)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。具体来说，就本发明的多特异性抗体而言，本文所使用的术语"结合域"、"其抗原结合片段"、"抗原结合部分"以及类似术语是指Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；二硫稳定的Fv片段(dsFv)；单链Fv片段(scFV)和scAb，即由抗体单臂的VL、VH和CL结构域组成的单链。优选地，本发明的抗体的结合结构域彼此独立地选自Fv片段、scFv片段和单链Fv片段(scFv)。在特定的实施方案中，本发明的抗体的结合结构域彼此独立地选自单链Fv片段(scFv)。在其他特定实施方案中，scFv片段的VL和VH结构域通过结构域间的二硫键稳定，特别是所述VH序列在51位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基，并且所述VL序列在141位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基。

在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体不包含CH1和/或CL区域。在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体既不包含免疫球蛋白Fc区也不包含CH1和CL区。

术语“互补决定区”(“CDR”)是指使用许多著名方案中的任何一种确定边界的氨基酸序列，这些著名方案包括以下描述的那些：Kabat et al.(1991),“Sequences ofProteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)numbering(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))(“IMGT”编号方案)；和Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号)中描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。

在本发明的语境中，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。具体地，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中，特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。

如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力(affinity)更大、亲合力(avidity)更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及规定标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，特别是至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。

合适地，本发明的抗体也是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合ROR1和CD3的分离的抗体基本上不含特异性结合除ROR1和CD3以外的抗原的抗体，或者特异性结合ROR1、CD3和hSA的分离的抗体基本上不含特异性结合除ROR1、CD3和hSA以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

合适地，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的抗体。单克隆抗体对某个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。

本发明的抗体包括但不限于嵌合的、人的和人源化的抗体。

如本文所用，术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)是指一种抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比对人类的抗原性降低。

如本文所用，术语“人抗体”(或其抗原结合片段)旨在包括具有可变区的抗体(及其抗原结合片段)，其中框架区和CDR区均源自人源序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自这种人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式。本发明的人类抗体及其抗原结合片段可包含非由人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol,227:381(1992)；Marks et al.,J.Mol.Biol,222:581(1991))。Cole et al,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boemer et al.,J.Immunol,147(l):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已经被修饰，以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用，例如，免疫的xenomice(关于XENOMOUSE^TM技术，参见例如US 6,075,181和US 6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的信息，还参见例如Li et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。

如本文所用，术语“人源化”抗体(或其抗原结合片段)是指保留了非人抗体的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体(或其抗原结合片段)。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及源自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison andOi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。

如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如从转化为表达人源化抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)中分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体。

优选地，本发明的多特异性抗体是人源化的。更优选的是，本发明的多特异性抗体是人源化的，并包括兔衍生的CDR。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，ROR1和CD3)上的两个或更多个不同表位结合的抗体。术语“多特异性抗体”包括双特异性、三特异性、四特异性、五特异性和六特异性。优选地，本发明的多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体，特别是三特异性抗体。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与至少两个不同靶标(例如，ROR1和CD3)上的两个不同表位结合的抗体。如本文所用，术语“三特异性抗体”是指与至少三个不同靶标(例如，ROR1、CD3和hSA)上的三个不同表位结合的抗体。

术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“构象”表位和“线性”表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。

如本文所用，术语“构象表位”是指，当多肽链折叠形成天然蛋白时，在表面上聚集在一起的抗原氨基酸残基。

术语“线性表位”是指一种表位，其中蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生(连续)。

如本文所用，术语“识别”是指发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)的抗体其抗原结合片段。

如本文所用，术语“亲合力”是指抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的信息量度。它受三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的价态；以及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素定义了抗体的特异性，即特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。

本发明的多特异性抗体包含一个或两个ROR1-BD。

术语“ROR1”特别指UniProt ID号Q01973的人ROR1。合适地，本发明的ROR1-BD靶向人ROR1，特别是ROR1的胞外结构域(ECD)，其序列如表6所示(SEQ ID NO:117)。在特定实施方案中，ROR1-BD结合ROR1的Ig样结构域。ROR1的Ig样结构域由SEQ ID NO:117的残基42至147定义，与UniProt ID号Q01973一致。在其他具体实施方案中，ROR1-BD不阻断Wnt5α与ROR1的结合。

适当地，当为scFv形式时，ROR1-BD的特征在于一个或多个以下参数：

b.结合表达人ROR1的MDA-MB-231细胞，EC₅₀为5pM至10nM，特别是EC₅₀为5pM至5nM，特别是EC₅₀为5pM至4nM，特别是EC₅₀为5pM至3nM。

本文所用的术语“MDA-MB-231细胞”是指表达ROR1的乳腺癌细胞系。MDA-MB-231细胞是商业上可获得的，并用作乳腺癌(腺癌)的模型细胞系。

如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。

“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原，或者更具体地，抗原上的表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体片段和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。

本文所用的术语“K_assoc”、“K_a”或“K_on”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“K_dis”、“K_d”或“K_off”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“K_D”是指解离常数，其由K_d与K_a之比(即K_d/K_a)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“K_D”或“K_D值”或“KD”或“KD值”通过使用表面等离子体共振测定法来测量。

通过表面等离子体共振(SPR)测量来确定与重组人ROR1的亲和力，如段落和(scFv)中所述；和与(多特异性分子)。对重组人CD3、重组食蟹猴CD3和重组狨猴CD3的亲和力通过表面等离子体共振(SPR)测量来确定，如段落(scFv)；和(多特异性分子)中所述。对重组人血清白蛋白(hSA)、食蟹猴血清白蛋白(cSA)和小鼠血清白蛋白(mSA)的亲和力通过表面等离子体共振(SPR)测量来确定，如段落(scFv)；和(多特异性分子)中所述。

在一些实施方案中，本发明的ROR1-BD或本发明多特异性抗体中存在的ROR1-BD不阻断Wnt5α与ROR1的结合。

合适地，本发明的多特异性抗体的ROR1-BD，当为scFv形式时，特征还在于一个或多个以下参数：

对于大多数测量，使用nano DSF(Prometheus NT.48,NaonTemper)方法来确定scFv和多特异性抗体的热力学性质，例如在段落和(scFv)以及段落和[261](多特异性形式)中所述。在CD3-BD(scFv)的情况下，使用DSF方法，如Egan,et al.,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen,et al.,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221中所述。在该方法中，scFv构建体的热解折叠的转变中点是通过差示扫描荧光法使用荧光染料Orange确定的(参见Wong&Raleigh,Protein Science 25(2016)1834-1840)。在pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中的样品以50μg/ml的最终蛋白质浓度制备，并且含有5x/>Orange的终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约2h。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算T_m。报告的T_m是三个测量值的平均值。

单体含量的损失由SE-HPLC色谱图的曲线下面积计算确定。SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如美国药典(USP)第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V₀)和总渗透体积(V_T)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC系统(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行，该系统配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在4-6℃。对于scFv样品的分析，使用Shodex KW403-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989202)，标准缓冲盐水流动相(50mM磷酸钠pH 6.5，300mM氯化钠)，推荐流速为0.35ml/min。每次注射的目标样品加载量为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V₀至V_T的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。

合适地，本发明的多特异性抗体的ROR1-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明的多特异性抗体的ROR1-BD包括但不限于人源化ROR1-BD，其序列列于表1。

另外，本发明的多特异性抗体包含一个CD3-BD。在特定的实施方案中，所述CD3-BD结合CD3ε。特别地，本发明的多特异性抗体包含一个靶向人和食蟹猴CD3ε的CD3BD。

适当地，当为scFv形式时，本发明中使用的CD3-BD的特征在于一个或多个以下参数：

合适地，本发明的多特异性抗体的CD3-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明的多特异性抗体的CD3-BD包括但不限于人源化CD3-BD，其序列列于表2。

为了在相同或更低分子量下，增加特异性/功能性的数量，使用包含抗体片段的抗体是有利的，例如Fv和Fab片段以及其他抗体片段。这些较小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性，并且与完整的免疫球蛋白分子相比，还表现出改善的组织渗透性和药代动力学特性。尽管相对于完整的免疫球蛋白，此类片段似乎显示出许多优势，但它们还受到血清清除率高的困扰，因为它们缺少在体内具有长半衰期的Fc结构域(Medasan et al.,1997,J.Immunol.158:2211-2217)。具有较低分子量的分子能更有效地穿透靶标组织(例如实体癌)，因此有希望在相同或较低剂量下改善功效。

发明人现已发现，向本发明的多特异性抗体中添加人血清白蛋白结合结构域(hSA-BD)不会干扰其它结合结构域结合其各自靶标的能力。这一发现是令人惊讶的，因为不能先验地预期在复杂的多靶、多细胞体内情况下，所有三个或四个结合结构域保持功能而不在空间上的或以其他方式相互抑制。

术语“hSA”特别是指具有UniProt ID号P02768的人血清白蛋白。人血清白蛋白(hSA)是人血清中66.4kDa的丰富蛋白(占总蛋白的50％)，由585个氨基酸组成(Sugio,Protein Eng,Vol.12,1999,439-446)。多功能hSA蛋白与其结构相关联，该结构允许结合并运输许多代谢物，例如脂肪酸、金属离子、胆红素和某些药物(Fanali,Molecular Aspectsof Medicine,Vol.33,2012,209-290)。血清中的hSA浓度约为3.5-5g/dl。白蛋白结合抗体及其片段可用于例如延长与其缀合的药物或蛋白质的体内血清半衰期。

在一些实施方案中，hSA-BD源自单克隆抗体或抗体片段。

本发明的多特异性抗体中包含的合适的hSA-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明多特异性抗体中包含的hSA-BD包括但不限于其序列列于表3中的人源化hSA结合结构域。

在具体实施方案中，本发明多特异性抗体中包含的hSA-BD特异性结合hSA和食蟹猴血清白蛋白(cSA)。

在其它具体实施方案中，本发明多特异性抗体中包含的hSA-BD特异性结合hSA、cSA和小鼠血清白蛋白(mSA)。在这些具体实施方案中，当为scFv形式时，本发明多特异性抗体中包含的hSA-BD的特征在于一个或多个下列参数:

a)结合人血清白蛋白(hSA)，解离常数(K_D)为0.1至10nM，特别是0.1至5nM，通过SPR在pH 5.5和pH 7.4测量；

b)结合食蟹猴血清白蛋白(cSA)，解离常数(K_D)为0.1至10nM，特别是0.1至5nM，通过SPR在pH 5.5和pH 7.4测量；且

c)结合小鼠血清白蛋白(mSA)，解离常数(K_D)为0.1至20nM，特别是0.1至10nM，通过SPR在pH 5.5和pH 7.4测量。

用于本发明的多特异性抗体的其他合适的hSA-BD包含或源自选自由以下组成的组的抗体：(i)结合血清白蛋白的多肽(参见，例如，Smith et al.,2001,BioconjugateChem.12:750-756；EP0486525；US 6,267,964；WO 2004/001064；WO 2002/076489；和WO2001/45746)；(ii)Holt et al.,Protein Engineering,Design&Selection,vol 21,5,pp283-288、WO 2004/003019、WO 2008/096158、WO 2005/118642、WO 2006/0591056和WO2011/006915中描述的抗血清白蛋白结合单可变结构域；(iii)WO 2009/040562、WO 2010/035012和WO 2011/086091中描述的抗血清白蛋白抗体。

在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含:(i)一个ROR1-BD；(ii)一个CD3-BD；和(iii)一个hSA-BD，即这些具体实施方案的多特异性抗体对于所有三个ROR1、CD3和hSA特异性都是单价的。

在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含:(i)两个ROR1-BD；(ii)一个CD3-BD；和(iii)一个hSA-BD，即这些具体实施方案的多特异性抗体对于ROR1特异性是二价的，对于CD3和hSA特异性是一价的。

术语“多价抗体”是指具有不止一个价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，由于存在一个以上拷贝的相应抗原结合部分，单个结合分子可以结合靶分子上的一个以上结合位点和/或结合一个以上靶分子。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体、六价抗体等。

如本文所用，术语“单价抗体”是指与单个靶分子，更具体地说，是与靶分子上的单个表位结合的抗体。此外，本文使用的术语“结合结构域”或“单价结合结构域”是指结合靶分子上单个表位的结合结构域。

在本发明的多特异性抗体包含两个ROR1-BD的情况下，所述两个ROR1-BD结合ROR1的胞外结构域上的相同表位或不同表位。优选地，所述两个ROR1-BD结合ROR1的胞外结构域上的相同表位。

如本文所用，术语“相同表位”是指蛋白质上能够特异性结合一种以上抗体的单个蛋白质决定簇，其中该单个蛋白质决定簇是相同的，即由以下组成：相同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有相同的三维结构特征，以及对每种所述抗体的相同电荷特征。术语“不同的表位”，在本文中与特定的蛋白质靶标结合使用时，是指蛋白质上的单个蛋白质决定簇，每个能够与不同的抗体特异性结合，其中这些单个蛋白质决定簇对于不同的抗体来说是不相同的，即由以下组成：不同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有不同三维结构特征以及不同电荷特征的分子。这些不同的表位可以是重叠的或非重叠的。

在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和二价的。

在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和三价的。

在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体是三特异性和三价的。

在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体是三特异性和四价的。

本发明中使用的其他可变结构域包括已突变、但仍在CDR区中与表1、2和3中描述的序列中描述的CDR区具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明中使用的其他可变结构域包括突变氨基酸序列，其中当与表1、2和3中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个。

合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域的VH结构域属于或选自人抗体VH家族。在优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体的一个或两个ROR1-BD、CD3-BD和hSA-BD(如果存在)的VH结构域属于VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3或VH4。在一个具体实施方案中，所述VH结构域属于VH构架亚型VH3或VH4，特别是VH构架亚型VH3。

在本发明的上下文中，术语“属于VHx构架亚型(或VκX/Vλ构架亚型)”或“选自VHx构架亚型(或VκX/Vλ构架亚型)”是指VH/VL构架序列FR1至FR4(本文也称为VH/VL构架区FR1至FR4)与所述人抗体VHx或VκX/Vλ构架亚型显示最高程度的同源性。

VH1a、VH1b、VH3和VH4序列的实例，以及其他VHx序列的其他实例在Knappik etal.,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中或WO 2019/057787给出。属于VH3家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:71表示，属于VH1a、VH1b或VH4框架亚型的VH结构域的具体实例由SEQID NO:72、73和74表示(表4，框架区以非粗体标记)。特别地，框架区FR1至FR4取自SEQ IDNO:71，属于VH3家族(表4，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH3家族的VH是一种VH，其包含与SEQ ID NO:71的FR1至FR4具有至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％序列同一性的FR1至FR4。VH3和VH4序列的其他实例，以及其他VHx序列的其他实例可以在Knappik et al.,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中或WO 2019/057787中找到。

适当地，本发明中使用的结合域的VL域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4。在所述结合域为scFv形式的情况下，所述结合域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VλFR4。

合适的Vκ1框架FR1至FR3以及示例性的VλFR4在SEQ ID NO:75中给出(表4，框架区以非粗体标记)。Vκ1序列的其他实例，以及Vκ2、Vκ3或Vκ4序列的其他实例可以在Knappiket al.,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。合适的Vκ1框架FR1至FR3包含与对应于FR1至FR3并选自SEQ ID NO:75的氨基酸序列(表4，框架区以非粗体标记)具有至少85、90、95％同一性的氨基酸序列。合适的VλFR4如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83中所述，包含单个半胱氨酸残基，特别是在如下情形下：其中第二个单个半胱氨酸存在于相应的VH链中，特别是VH的51位(AHo编号)，用于形成结构域间二硫键。在一个实施方案中，当为scFv形式时，本发明的多特异性抗体的结合域的VL结构包括VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQID NO:76至SEQ ID NO:83中任意的氨基酸序列，特别是与SEQ ID NO:76或83具有至少85、90、95％同一性的氨基酸序列。

特别地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包括表1、2和3中所列的VH结构域。合适地，本发明中使用的结合结构域包含表1、2和3之一中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过10个。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1、2和3之一中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过7个，特别是不超过5、4、3或2个，特别是不超过1个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VH区中与表1、2和3之一中描述的相应序列中描述的VH区具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1、2和3所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位，特别是至少2至147位的VH结构域，前提是该VH结构域表现出上文项目11和19中定义的功能特征。

在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体的一个或两个ROR1-BD、CD3-BD和hSA-BD(如果存在)包含如上定义的VH结构域，其中所述VH结构域的框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)、氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)。所述VH结构域在本文中可被称为“变体VH结构域”或“修饰的VH结构域”或“改进的VH结构域”。同样，包含所述VH结构域的结合结构域在本文中可被称为“变体结合结构域”或“修饰的结合结构域”或“改进的结合结构域”。这种变体VH结构域的具体实例是SEQ ID NO:8、11、21、24、37、66和69的VH结构域。

发明人已经发现，与在VH构架区中不包含上述取代的所述结合结构域的版本相比时，所述经修饰的ROR1-、CD3-和hSA-BD，当为scFv形式时，免疫原性显著降低。更具体地，与在VH构架区中不包含上述取代的所述结合结构域的版本相比时，所述修饰的ROR1-、CD3-和hSA-BD，当为scFv形式时，与人血清中存在的原有抗药物抗体(ADA)的结合减少，特别是与原有ADA的结合减少，如在原有ADA结合测定中所测定的，特别是如在实施例10中所定义的原有ADA结合测定中所测定的。

具体而言，本发明人已发现，与不包含所述经修饰的结合结构域的本发明多特异性抗体版本相比，包含所述经修饰的ROR1-、CD3-和hSA-BD的本发明多特异性抗体的免疫原性显著降低。更具体地，与不包含所述经修饰的结合结构域的本发明多特异性抗体版本相比，包含所述经修饰的ROR1-、CD3-和hSA-BD的本发明多特异性抗体与人血清中存在的原有抗药物抗体(ADA)的结合减少，特别是与原有ADA的结合减少，如在原有ADA结合测定中所测定的，特别是如在实施例10中所定义的原有ADA结合测定中所测定的。

免疫原性，即治疗性蛋白质在患者体内诱导抗体反应的趋势，可例如通过其被已存在于健康和未治疗个体的人血清中的抗药物抗体(ADA)识别的能力来预测，已存在于健康和未治疗个体的人血清中的抗药物抗体(ADA)本文称为“原有ADA”。

因此，出于本发明的目的，本文所用术语“免疫原性”是指治疗性蛋白质(例如抗体、抗体片段或抗体结合结构域)被人血清样品中原有ADA识别的能力。不希望受理论的束缚，相信，在治疗过程中原有ADA结合以及ADA形成的诱导与治疗性蛋白质上B细胞和/或T细胞表位的出现有关。这种免疫原性的程度可以通过ELISA试验来确定，并且可以通过人血清样品(该人血清样品含有可测量量的原有ADA和/或在治疗性处理过程中形成的ADA，所述ADA识别(即结合)所讨论的治疗性蛋白质)相对于测试的人血清总数的百分比(阳性血清样品的百分比)来表示。通过比较阳性血清样品相对于修饰的治疗性蛋白质的百分比和阳性血清样品相对于原始治疗性蛋白质的百分比，可以测量治疗性蛋白质和为了降低其免疫原性而被修饰的相应治疗性蛋白质之间的免疫原性降低。经修饰的治疗性蛋白质的阳性血清样品的数量或百分比较低表明相对于原始治疗性蛋白质的免疫原性降低。

当ELISA信号超过特定阈值时，认为血清样品含有可测量量的原有ADA。该阈值在本文中也被称为筛选分界点(SCP)。SCP可按下文定义计算，或设定为相对于测试血清获得的最大ELISA信号的任意值(例如，测试血清获得的最大ELISA信号的30％、25％、20％、15％、10％或5％)。优选地，SCP按下文定义计算。

特别地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包括表1、2和3之一中所列的VL结构域。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1、2和3之一中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1、2和3之一中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个，特别是不超过7个，特别是不超过5、4、3、2个，特别是不超过1个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VL区中与表1、2和3中描述的序列中描述的VL区具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1、2和3所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位，特别是至少2至147位的VL结构域，前提是该VL结构域表现出上文项目11和19中定义的功能特征。

在本发明的语境中，术语“本发明中使用的结合结构域”涉及结合结构域本身，即独立于多特异性语境，还特别涉及包含在多特异性构建体中的结合结构域，例如包含在双特异性、三特异性或四特异性构建体中的结合结构域之一。

合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域彼此独立地选自由以下组成的组：Fab、F(ab)₂、Fv、scFv、dsFv、和scAb；特别是选自由以下组成的组：Fv、scFv和dsFv。特别地，本发明的多特异性抗体的结合结构域是scFv。

合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域可操作地连接。本发明的多特异性抗体的结合结构域能够同时结合它们各自的抗原或受体。在此使用的术语“同时”是指ROR1-BD中的至少一个和CD3-BD同时与其各自的抗原结合，或者，在多特异性抗体中存在两个ROR1-BD的情况下，术语“同时”是指两个ROR1-BD和CD3-BD同时与其各自的抗原结合。

本发明的多特异性抗体包含一个或两个ROR1-BD、一个CD3-BD和任选的一个hSA-BD，其中所述一个或两个ROR1-BD、所述CD3-BD和所述任选的hSA-BD彼此可操作地连接。

本文使用的术语“可操作地连接”表示两个分子(例如，多肽、结构域、结合结构域)以每个分子保留功能活性的方式连接。无论两个分子是直接连接还是间接连接(例如，通过接头，通过部分，通过接头连接到部分)，它们都可以是“可操作地连接”。术语“接头”是指任选地位于本发明中使用的结合结构域或抗体片段之间的肽或其他部分。可以使用多种策略将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-末端和C-末端之间的多肽连接，通过二硫键的连接，以及通过化学交联剂的连接。在该实施方案的一方面，接头是通过重组技术或肽合成产生的肽键。对于要连接两条多肽链的特定情况，选择合适的接头取决于各种参数，包括但不限于两条多肽链的性质(例如，它们是否天然寡聚)、要连接的N-末端和C-末端之间的距离(如果知道)和/或接头对蛋白水解和氧化的稳定性。此外，接头可以包含提供柔韧性的氨基酸残基。

在本发明的语境中，术语“多肽接头”是指连接两个结构域的通过肽键连接的由氨基酸残基链组成的接头，每个结构域与接头的一端连接。多肽接头的长度应足以连接两个分子，以使它们彼此之间具有正确的构象，从而保持所需的活性。在特定的实施方案中，多肽接头具有2至30个氨基酸残基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基)的连续链。此外，选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应表现出不会显著干扰多肽活性的特性。因此，整体上接头肽不应表现出与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一种或多种单体中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重阻碍受体单体结构域的结合。在特定的实施方案中，多肽接头是非结构化的多肽。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸或GS接头。如本领域技术人员将理解的，“Gly-Ser”或“GS”接头是指串联的甘氨酸和丝氨酸的聚合物(包括例如(Gly-Ser)_n、(GSGGS)_n[SEQ ID NO:118]、(GGGGS)_n[SEQ ID NO:119]和(GGGS)_n[SEQ ID NO:120]其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头，例如用于shaker钾离子通道的系链，以及多种其他柔性肽接头。甘氨酸-丝氨酸聚合物是优选的，因为包含这些氨基酸的寡肽是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链。其次，丝氨酸是亲水的，因此能够溶解可能是球状甘氨酸链的物质。第三，已显示相似的链可有效连接重组蛋白(如单链抗体)的亚基。

在一组实施方案中，多特异性抗体的形式选自本领域已知的任何合适形式，该形式至少是三特异性的，并且不包含免疫球蛋白Fc区和CH1和/或CL区。作为非限制性实例，这包括基于以下的形式：串联三-scFv(三体(triplebody))、三抗体(triabody)、scDb-scFv；与异二聚Fc结构域以外的异二聚化结构域的N-和/或C-末端融合的串联三-scFv或scDb-scFv，以及MATCH(描述于WO 2016/0202457；Egan T.et al.,MABS 9(2017)68-84)。具体地，多特异性抗体的形式选自scDb-scFv、scMATCH3、MATCH3和MATCH4。

术语“scDB”或“单链双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用接头，该接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生两个抗原结合位点。单链双抗体可以是二价的或双特异性的，优选双特异性的。单链双抗体在例如下文中有更详细描述：EP 404097,WO 93/01161,Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003),和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体描述于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别是包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，它们通过接头L1、L2和L3以以下顺序连接VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。

接头L1特别是2-10个氨基酸，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽，并且接头L3特别是1-10个氨基酸，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽。在特定实施方案中，接头L1和/或L3包含一个或两个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)_n[SEQ ID NO:121]，其中n＝1[SEQ ID NO:85]或2[SEQ ID NO:86]，特别是n＝1。

中间接头L2特别是10-40个氨基酸，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)_n[SEQ ID NO:122]，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，特别是n＝4[SEQ ID NO:84]。

在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体包含一个ROR1-BD、一个CD3-BD和一个hSA-BD，并且是单链蛋白，其具有scDb-scFv或scMATCH3形式。术语“scDb-scFv”是指抗体形式，其中单链Fv(scFv)片段通过柔性Gly-Ser接头与单链双抗体(scDb)融合。在一个实施方案中，所述柔性Gly-Ser接头是2-40个氨基酸，例如2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10个氨基酸，特别是10个氨基酸氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)_n[SEQ ID NO:122]，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，特别是n＝2[SEQ ID NO:86]。特别地，该实施方案的单链多特异性抗体为scMATCH3形式。

本发明的scMATCH3多特异性抗体的具体但非限制性实例是PRO2286、PRO2287、PRO22507、PRO2508、PRO2509、PRO2510、PRO2557、PRO2596、PRO2667和PRO2668，其序列列于表5中。

在另一个实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两个ROR1-BD、一个CD3-BD和一个hSA-BD，并且是WO 2016/0202457；Egan T.,et al.,MABS 9(2017)68-84中描述的MATCH4形式的异二聚体蛋白。

本发明的异二聚体MATCH4多特异性抗体的具体但非限制性实例是PRO2589、PRO2590、PRO2591、PRO2592、PRO2658、PRO2659、PRO2669和PRO2670，其序列列于表5中。

本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijnet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif etal.,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。

这些方法通常涉及单克隆抗体的产生，以及使用已知的分子克隆技术，将两种或多种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或者其片段或部分组合，以得到双特异性或多特异性构建体。

可以使用本领域已知的方法通过将组成结合特异性缀合来制备本发明的多特异性抗体。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A et al.,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennan et al.,1985Science 229:81-83,和Glennie et al.,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,Ill.,USA)获得。

当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，例如一个。

或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x Fab、mAb x scFv、mAb x dsFv或mAb x Fv融合蛋白时，这种方法特别有用。制备多特异性抗体和分子的方法，例如在以下文献中有所描述US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US 5,091,513；US 5,476,786；US5,013,653；US 5,258,498；和US 5,482,858。

多特异性抗体与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。

在另一方面，本发明提供了一种核酸或两种核酸，其编码本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)。可以对此类核酸进行优化以在哺乳动物细胞中表达。

术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，即在所述序列中，一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。

本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述多特异性抗体的区段或结构域，如ROR1-BD。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出本发明多特异性抗体或ROR1-BD的抗原结合能力。

多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如本发明的ROR1-BD)的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Naranget al.,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和US 4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Innis et al.(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila et al.,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert et al.,PCRMethods and Applications 1:17,1991。

本发明还提供了表达载体和宿主细胞，用于生产本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)。术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。

载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在该具体背景下，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。

可以使用各种表达载体来表达编码多特异性抗体链或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington et al.,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达IL-4R结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,USA)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent et al.，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld et al.,Cell 68:143,1992。

表达载体的选择取决于要在其中表达所述载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码多特异性抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止插入序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达多特异性抗体链或片段还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner et al.,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。

要使用的载体通常编码多特异性抗体轻链和重链可变结构域。在某些情况下，它们也编码恒定区或其部分。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区是人的。

术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

用于携带和表达本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。也可以采用其他微生物，如酵母，来表达本发明的多特异性抗体。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。

在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen,et al.,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。

引入包含目的多核苷酸的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(通常见于Green,M.R.,and Sambrook,J.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子-核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88/223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域(例如ROR1-BD)的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1至2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术使增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如ROR1-BD)的方法，其中所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如ROR1-BD)的核酸或载体，由此表达本公开的所述多特异性抗体或其抗原结合片段(例如ROR1-BD)。

在一方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的方法，所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的核酸。特别地，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的方法，该方法包括(i)提供编码本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的一种核酸或两种核酸，或编码本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或两种核酸或所述一种载体或两种载体，并从表达系统中收集所述多特异性抗体或所述ROR1-BD，或者(ii)提供表达编码本发明的多特异性抗体或ROR1-BD的一种核酸或两种核酸的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述或ROR1-BD。

另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指不干扰抗体结构的介质或稀释剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

某些这样的载体能够将药物组合物配制成例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液和锭剂，用于受试者的口服摄入。某些这样的载体能够将药物组合物配制成用于注射、输注或局部施用。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)，特别是用于肌肉内或皮下施用。取决于施用途径，活性化合物(即本发明的多特异性抗体)可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。

本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的本发明的多特异性抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的多特异性抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。

本发明的多特异性抗体通常多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中本发明的多特异性抗体的血液水平所指示的。或者，本发明的多特异性抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。

一方面，本发明涉及用作药物的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。在合适的实施方案中，本发明提供了多特异性抗体或药物组合物，其用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症，更特别是表达ROR1的癌症。

另一方面，本发明提供了药物组合物，其用于生产用于治疗增生性疾病，特别是癌症，更特别是表达ROR1的癌症的药物。

另一方面，本发明涉及多特异性抗体或药物组合物用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症，更特别是表达ROR1的癌症中的用途。

另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。在合适的实施方案中，本发明涉及治疗受试者的增生性疾病，特别是癌症，更特别是表达ROR1的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。

术语“受试者”包括人类和非人类动物。

术语“动物”包括所有脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。

术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。

在一个实施方案中，增生性疾病是癌症。术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体(例如扩散或循环的)肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。本文使用的术语“癌症”是指广泛的肿瘤，包括所有实体和血液恶性肿瘤。特别地，癌症是表达ROR1的癌症。

表达ROR1的癌症的非限制性实例是：淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、里克特综合征、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤和肾癌。

本发明的多特异性抗体或药物组合物抑制实体肿瘤的生长，但也抑制液体肿瘤的生长。本发明的多特异性抗体或药物组合物还适合于预防患有癌症的受试者中的肿瘤的转移扩散和微转移瘤(micro metastases)的生长或发展。

序列列表(残基根据AHo编号方案来指定，CDR根据Numab CDR定义来定义，除非另有说明)

表1.本发明的ROR1结合结构域的实例(如有修饰，以粗体显示；CDR残基以粗体和斜体字母显示)。

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表2.本发明中使用的CD3结合结构域的实例(如有修饰，以粗体显示；CDR残基以粗体和斜体字母显示)。

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表3.本发明中使用的人血清白蛋白(hSA)结合结构域的实例(如有修饰，以粗体显示；CDR残基以粗体和斜体字母显示)。

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表4.与本发明有关的其他序列。

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表5.本发明的多特异性抗体的实例(修饰和接头以粗体显示)。

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表6.人ROR1的胞外结构域的序列(残基30-407)，包括N-末端信号肽(残基1-29)，根据UniProtKB-Q01973(胞外部分以斜体字母显示；Ig样结构域的残基，即残基42-147，以粗体和斜体显示)。

在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表6)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。

应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的语境中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的语境中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用的方式并入本文。

下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。

实施例

实施例1：抗ROR1分子的生成和检测：

项目目标

该项目的目标是生成特异性结合人ROR1胞外结构域的人源化单克隆抗体片段。另一个目标是鉴定足够有效且稳定，可以整合到多特异性抗体形式中的抗ROR1抗体片段。

1.1.免疫

用人ROR1胞外结构域(ECD)免疫九只兔子。六只兔子按照Numab公司的标准方案进行免疫，包括在70天内注射四次抗原，另外三只兔子按照延长方案进行免疫，包括与标准方案相同的初始方案，在方案结束前四天(在第112天)注射最后一次抗原。

1.2.分选和命中(hit)鉴定

使用ROR1胞外结构域，通过FACS对源自按照Numab的标准免疫方案免疫的六只兔子的3740个单个B细胞进行分选。培养单个B细胞，并在四周内收集含有分泌的感兴趣抗体的B细胞上清液。在这3740个分选的B细胞中，993个克隆通过ELISA显示与重组人ROR1结合。然后检测了阳性克隆与ROR1表达细胞的结合能力，627个克隆显示与表达高ROR1水平的癌细胞(MDA-MB-231)结合，其中99个克隆显示与人ROR1 ECD的亲和力低于800pM。检索了这些克隆的重链和轻链序列，并选择了SPR测定结合亲和力最佳的15个ROR1结合克隆生产作为重组兔IgG。

1.3.重组兔IgG的制备

在选择克隆进行命中鉴定后，将兔抗体克隆、表达并纯化以进一步表征。相应的轻链和重链可变结构域的克隆需要将DNA片段体外连接到合适的哺乳动物表达载体(pFUSE,Invivogen)中。将兔抗体重链和轻链的表达载体转染至哺乳动物悬浮细胞系(CHO-S)中，以进行瞬时异源表达(50ml规格,Mirus CHOgro表达试剂盒)。随后，对分泌的兔IgG进行亲和纯化(Protein A亲和纯化)，缓冲液交换为PBS pH 7.4，最终产品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，数据未显示)、280nm的UV吸光度和尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)进行分析，以验证身份、含量和纯度。在15个选择的兔IgG中，成功生产了13个。

1.4.重组兔IgG(rIgG)的命中确认

通过CELISA评估了成功制备的13种rIgG与ROR1表达细胞的结合亲和力，并通过SPR评估了与重组ROR1的结合亲和力。此外，通过评估兔IgG与三种嵌合ROR1/ROR2变体的结合情况，确定了rIgG在ROR1上的结合区域。

通过CELISA评估与ROR1表达细胞的结合

使用MDA-MB-231细胞(ATCC，货号HTB-26，表达高水平人ROR1的人乳腺癌细胞)和MCF-7(ATCC，货号HTB-22，不表达人ROR1的人乳腺癌细胞)与ROR1表达细胞的结合。将40000个细胞分装到平底的组织培养液处理的96孔板中。第二天，在溢流模式下用每孔450μl缓冲液(PBS，0.2％BSA)洗板三次，加入50μl的各测试兔IgG以及参考抗ROR1抗体PRO1842(人IgG抗体，包含专利申请US2017/0306018 A1中公开的SEQ-ID NO:129和130的VH-/VL-序列)的系列稀释液的各点，将板在室温(RT)下轻轻搅拌下孵育1.5小时。用450μl洗涤缓冲液洗涤三次后，向各孔中加入50μl HRP偶联山羊抗兔IgG或兔抗人IgG抗体。在室温下于章动混合器上孵育1h后，用每孔450μl的洗涤缓冲液将板洗涤3次，然后加入50μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，KPL,货号53-00-00)。显影10分钟后，通过每孔加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并在450nm读板，以690nm为参照波长。为了重组生产PRO1842，向Gene Universal公司(Newark DE，美国)订购了哺乳动物表达质粒(pcDNA3.1，宿主：CHO-S)。PRO1842的表达和纯化与上文1.3节所述的方法类似，并获得了足够的材料和纯度(SE-HPLC法测定单体含量大于98％)以满足预期用途。

有11个克隆显示与ROR1表达细胞结合，其中八个克隆与ROR1结合的EC₅₀值与参考抗体PRO1842相似或更好(见表6)。

通过SPR测定结合亲和力

在Mass2装置(Sierra sensors,Bruker)上，通过SPR分析确定了兔IgG与重组人ROR1蛋白(His Tag,Acro Biosystems)的结合动力学(包括亲和力)。通过共价固定在羧甲基葡聚糖表面(HCA传感器芯片；Sierra传感器，Bruker)的抗兔IgG抗体(山羊抗兔IgG-Fc，Bethyl)在特定点上捕获兔IgG分子，并注入重组人ROR1蛋白的滴定系列作为分析物。每个分析物注射周期结束后，对传感器芯片上的每个点进行再生(甘氨酸-盐酸，pH1.5)，然后重新捕获新的兔IgG。使用多循环动力学试验测量了与人ROR1的结合动力学，使用十种分析物浓度，范围从0.176到90nM，稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Sierra传感器分析软件(Sierra分析仪,Sierra传感器,Bruker)计算表观解离常数(k_d)和缔合速率常数(k_a)以及表观解离平衡常数(K_D)，根据相对Chi2监测拟合质量。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了11种兔IgG与重组ROR1的亲和力。一个克隆未观察到结合，测得的最佳结合亲和力为1.06nM。结果总结在表7中。参考抗ROR1抗体PRO1776(人IgG4抗体，包含专利申请WO 2014/031174中公开的SEQ-ID NOs:5和7的VH-VL序列)也在类似的装置下进行了测定。为了重组生产PRO1776，向Gene Universal公司(Newark DE，美国)订购了哺乳动物表达质粒(pcDNA3.1，宿主：CHO-S)。PRO1776的表达和纯化与上文1.3节所述的方法类似，并获得了足够的材料和纯度(SE-HPLC法测定单体含量大于98％)以满足预期用途。

鉴定ROR1上的兔IgG(rIgG)结合区域

为了确定rIgG在ROR1上的结合区域，通过CELISA评估了与瞬时转染了三种嵌合ROR1/ROR2变体的HEK293T细胞的结合程度。ROR1/ROR2变体是通过将ROR1的三个结构域，即ROR1的Ig样结构域(区域1)、ROR1的Frizzled结构域(区域2)和ROR1的Kringle结构域(区域3)，分别与ROR2的相应区域互换而产生的。为了排除潜在的ROR2结合体，首先用ELISA方法评估了与ROR2的结合情况；使用这种方法没有发现ROR2结合体。

然后在平底聚D赖氨酸处理的96孔板上每孔涂覆25000个细胞。第二天，用相应的构建体转染细胞，并在37℃、5％CO₂下孵育。24小时后，用450μl冲洗缓冲液(PBS，0.2％BSA)冲洗细胞，然后加入样品(10μg/ml rIgG)，在温和搅拌下于RT孵育1.5小时。用450μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每个孔中加入50μl的HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体。在室温下于章动混合器上孵育1h后，用每孔450μl的洗涤缓冲液将板洗涤3次，然后加入50μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，KPL,货号53-00-00)。显影10分钟后，通过每孔加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并在450nm读板，以690nm为参照波长。相对于兔IgG与wt ROR1的结合，计算rIgG的结合水平。与wt ROR1蛋白相比，rIgG与特定变体的结合水平明显降低，则表明rIgG表位位于被相应ROR2序列取代的人ROR1的片段内。

12种兔IgG的结合区域被明确界定。九种rIgG与区域1(ROR1的Ig样结构域)结合，三种抗体与区域2(ROR1的Frizzled结构域)结合。没有rIgG与区域3(ROR1的Kringle结构域)结合。结果总结在表7中。

表7：通过SPR和CELISA分析15种兔IgG的结合的特性

NA：不适用

NB：无结合

PRO1776：参考抗体(人IgG4抗体，包含专利申请WO2014/031174中公开的SEQ-IDNOs:5和7的VH-VL序列)

PRO1842：参考抗体(人IgG抗体，包含专利申请US2017/0306018 A1中公开的SEQ-ID NOs:129和130的VH-VL序列)

八个克隆与表达ROR1的MDA-MB-231细胞的结合亲和力优于或相当于参考抗ROR1抗体PRO1842。从这八个克隆中选出七个最佳克隆，在Numab框架上表达为两个版本的人源化单链Fv。

1.5.scFv生成

scFv生成

序列人源化的目的是降低我们感兴趣的分子的免疫原性风险，并稳定抗体可变结构域(Fv片段)，使其能够用作构建块(building block)来组装多特异性形式。因此，人源化涉及将来自供体(兔)互补决定区(CDR)序列的重要残基转移到人源受体框架上，以增加人源化程度和提高稳定性，同时又不对功能性产生重大影响。

如表7所示，为了生成先导ROR1 scFv结构域，选择了七个兔单克隆抗体克隆。这些克隆的人源化包括将兔CDR转移到一种Numab专有的人可变结构域受体支架上。在此过程中，使用Numab CDR定义(表8)表征了六个CDR区的氨基酸序列，并将其移植到Numab专有的高度稳定的完全人类VH3/Vk1-λ-加帽受体框架上；这些构建体被称为“CDR移植物”。

表8：相对于AHo(Honegger)和Kabat编号的Numab CDR定义

仅将兔CDR移植到人类受体框架上是最基本的移植策略，在此称为“CDR移植物”。除了CDR移植物外，还设计了一种额外的抑制变体，其中包含兔框架残基的确定模式(defined patterns)，在此称为"全移植体"。这些移植变体的详情如下：

CDR移植体：使用Numab的CDR定义，将兔CDR移植到Numab的受体框架上。不对供体框架残基进行反向突变。

全移植体：最大移植体，包含供体Fv核心残基、供体VL/VH界面残基以及可能与抗原相互作用的供体框架残基。

表9总结了ROR1人源化结构域的CDR移植体和全移植体。针对VL和VH结构域，分别列出了移植到人框架上的兔框架残基(使用AHo编号)。

人源化scFv构建的哺乳动物表达质粒(pcDNA3.1，宿主：CHO-S)以1mg的规格向GeneUniversal订购。如下所述，质粒用于CHO-S细胞的瞬时转染。

scFv制备

使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物scFv构建体的表达。在37℃下表达最多7天后(或当细胞活力<70％时)，通过离心收获培养物，然后过滤。通过蛋白质L亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白质。除了克隆55-06-E06衍生的scFv之外，通过SE-HPLC分析评估，所有分子在捕获后都表现出单体含量>95％的级分。通过透析将所有分子直接重新缓冲到pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中。克隆55-42-E05(PRO2065)的CDR-移植体表现出低表达滴度，因此不能被进一步利用。对于制备材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。表10总结了人源化抗ROR1 scFv分子的制备。

由于一个scFv无法表达(55-42-E05-sc01/PRO2065)，14种scFv中只有13种进行了后续药效学表征。

表9：ROR1人源化结构域的CDR移植体和全移植体概述；针对VL和VH结构域，分别列出了供体框架反向突变。

表10：来自7个选定的兔克隆的人源化CDR移植体和全移植体的scFv制备

1.6.scFv表征

通过流式细胞术评估与表达ROR1的MDA-MB-231细胞的细胞结合

收获MDA-MB-231细胞(ATCC，货号HTB-26，高水平表达人ROR1的人乳腺癌细胞)和MCF-7(ATCC，货号HTB-22，不表达人ROR1的人乳腺癌细胞)，并测定细胞数量。将细胞悬液以400x g离心5分钟，然后向非结合96孔板中的指定孔中添加100μl在PBS-EB(1x DPBS,2％FCS H.I.,2mM EDTA)中稀释的细胞悬液(50,000个细胞)。用PBS-EB洗涤三步后，离心细胞，吸出洗涤缓冲液。制备scFv和参照抗ROR1 Fab片段PRO2213(包含专利申请US2017/0306018A1中公开的SEQ ID NO:129和130的VH-/VL序列的人Fab片段)的3倍系列稀释液，起始溶度为39nM(scFv)或63nM(PRO2213)，然后加入到含有细胞的平板中。在4℃孵育1小时后，用100μl PBS-EB将平板洗涤三次。将与scFv孵育的细胞用100μl Numab的框架特异性检测抗体(PRO2268，兔IgG)重悬，并在4℃孵育30分钟。在洗涤步骤后，随后通过加入浓度为2μg/ml的APC标记的抗兔IgG抗体，并在4℃孵育1小时，来检测PRO2268。用浓度为2.8μg/ml的100μl山羊抗人F(ab’)2Alexa Fluor 647缀合的抗体(Jackson Immuno Research,货号109-606-097)重悬与参考Fab片段PRO2213一起孵育的细胞，并在4℃孵育1小时。接下来，将细胞再次用每孔100μl的PBS-EB洗涤3次。将细胞沉淀用50μl PBS-EB重悬，并用NovoCyte2060流式细胞仪进行分析。记录每个样品的APC通道的荧光强度，并计算荧光强度的几何平均值(MFI)。数据是单参照的(减去在仅用检测试剂孵育的细胞上发现的荧光强度)，随后的浓度-反应曲线使用4-PL拟合(GraphPad Prism软件)进行拟合。PRO2213是用木瓜蛋白酶消化人IgG PRO1842制成的。PRO2213的产量和纯度(SE-HPLC测定单体含量>98％)足以满足预期用途。

评估了对细胞表面人ROR1的表观结合亲和力，四种scFv显示与表达人ROR1的细胞结合的EC₅₀比参考Fab片段PRO2213低不超过三倍。两种scFv显示不与表达人ROR1的细胞结合(表11)。为了检测非特异性结合，在流式细胞术中检测了所有scFv与人ROR1阴性MCF-7细胞的结合，所测试的scFv均没有显示出与MCF-7细胞的结合。对于抗ROR1 scFv PRO2060和PRO2062，分别在三个和两个独立的流式细胞术实验中评估了对基于质膜的人ROR1的表观结合亲和力。在这些实验中获得的PRO2060和PRO2062的平均EC₅₀和平均相对EC₅₀值也显示在表11中。这两种scFv都表现出与人ROR1阳性MDA-MB-231细胞的特异性结合，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞的结合(见图1)。与参考Fab片段PRO2213相比，PRO2060的表观结合亲和力低约三倍，而PRO2062的表观结合亲和力高约三倍。

表11:通过流式细胞术检测，抗ROR1 scFv对MDA-MB-231细胞上表达的基于质膜的人ROR1的表观结合亲和力。

分别在三个和两个独立实验中测定了PRO2060和PRO2062，并计算了平均EC₅₀、平均相对EC₅₀和平均相对最大结合值。PRO2213用作参考抗ROR1抗体。

通过SPR测定结合亲和力

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了scFv与重组人ROR1蛋白(Fc-Tag，Acro Biosystems)的结合动力学(包括亲和力)。将重组人ROR1分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种scFv的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸pH 2.0)，并注射新浓度的scFv。使用多循环动力学试验测量了与人ROR1的结合动力学，使用九种分析物浓度，范围从0.005到30nM，稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluationsoftware Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

评估了所有13种scFv与ROR1表达细胞和重组hROR1的结合亲和力。数据相互关联并显示在表12中。

测定了八个scFv对hROR1的亲和力。亲和力范围从160nM到0.098nM。三种scFv显示出比Fab片段参照PRO2213更好的亲和力。由于技术原因，三种scFv的亲和力无法确定，两种scFv没有观察到结合(表12)。

表12:所选scFv对hROR1的亲和力测量总结。

那些显示无结合(SPR和细胞结合)或不确定数据的结构域被排除在进一步分析之外。选择了来源于三个不同克隆的四个scFv用于进一步的生物物理表征，通过SPR，这四个scFv显示与人ROR1表达细胞具有最佳结合并与重组人ROR1ECD具有最高亲和力。这些结构域包括PRO2060、PRO2062、PRO2059和PRO2066。

因为食蟹猴ROR1与人ROR1 100％相同，所以不需要进一步的结合评估来显示这些结构域的跨物种结合。

1.7.scFv结构域的生物物理表征(储存稳定性和DSF)

储存稳定性

对人源化scFv进行了为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<80℃、4℃和40℃的温度储存28天。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表13总结了单体含量百分比和相对于第0天的单体损失百分比。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化。然而，由于没有观察到任何样品相对于第0天的蛋白质浓度的显著变化，因此未显示数据。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。结果示于表13中。

PRO2059和PRO2060(克隆55-38-D07的衍生物)显示出良好的稳定性，在所有测试温度下仅有少量单体损失，并且四种分子的总体热稳定性最好。就40℃时单体损失的程度和热稳定性而言，PRO2062(克隆55-39-G02的衍生物)劣于PRO2059和PRO2060。PRO2066(克隆55-42-E05的衍生物)在4℃和40℃时表现出相当大的单体损失，因此可被视为本研究中最不稳定的分子(尽管其T_m为70.6℃，热稳定性可接受)。

总之，PRO2060和PRO2062被作为先导结构域。基于药效学和生物物理特征的组合，从其他结构域中选择这些结构域。这两种分子都与ROR1 ECD区1的不同表位结合，允许额外的候选多样性。通过蛋白质工程对这些先导结构域进行优化，以提高T细胞评分和稳定性，如下一节所述。

1.8.优化的单链结构域的生成

PRO2062具有相对较高的计算机计算的T细胞得分(1662)，这表明将其引入人体后更有可能激发免疫反应。为了降低T细胞得分，对其中一个CDR(CDR1H)进行了修饰。在兔子体内，CDR1H的前半部分更为保守，而后半部分则更为多变。与所有其他常见的CDR定义(IMGT、Chothia和Honegger)相反，Kabat CDR定义只包括CDR1H的可变第二半部分。为了将破坏结合的风险降到最低，在保守CDR1H部分引入了两个突变，因为可变CDR1H部分对于与抗原的相互作用可能更为重要。通过分析来自同一项目的序列，可以从另一个克隆中鉴定一个降低T细胞得分的CDR1H序列，它与保守CDR1H部分仅有两个氨基酸的差异。此外，该CDR1H序列与PRO2062可变CDR1H序列相似，表明保守CDR1H部分中的两个突变(L27I和S28D)可以很好地适应蛋白质结构。此外，计算机诱变表明这两个突变不会破坏稳定性。除了T细胞降低突变外，还移植了供体重链的所谓外环，因为这对于CDR3H的正确定位非常重要，可以作为CDR1H中修饰的补偿。简而言之，FW3H中的一段(AHo残基82-87)被KTST(R82K、D83T、N84S、N87T(框架中的S85和K86被删除))取代，AHo89从Val变为Leu(VH3一致)，AHo90从Tyr变为Asp(供体)。在CDR1H和外环发生T细胞得分降低突变后，PRO2271的T细胞得分为1160分。创造了另外一个变体(PRO2272，55-39-G02-sc04)与PRO2271具有相同的T细胞得分降低突变和外环，但供体残基比PRO2271少。PRO2292，即在AHo 141VL-51VH之间有二硫化物的PRO2062，其T细胞得分值相对较高(1662)。

表13：CDR和全移植物在10mg/mL及-80℃、4℃和40℃温度进行的28天储存稳定性研究以及DSF热稳定性。

NA：未测量，ND：无法确定

PRO2060的T细胞得分为949，因此不需要对T细胞得分进行优化。PRO2291，即在AHo141VL-51VH之间具有二硫化物的PRO2060，具有与PRO2060相同的T细胞得分949。表14总结了优化的变体。

表14：PRO2062和PRO2060变体概述

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1.9.优化的单链结构域的表征

通过流式细胞术分析优化的scFv与表达ROR1的MDA-MB-231细胞的细胞结合

如上所述，通过流式细胞术进行优化的scFv与表达人ROR1的MDA-MB-231细胞的质膜结合。简言之，制备抗ROR1克隆55-39-G02(PRO2271、PRO2292)和克隆55-38-D07(PRO2291)的优化scFv以及参考Fab片段PRO2213的5倍序列稀释液，起始浓度为40nM，然后将其添加到装有细胞的平板中。在4℃孵育1小时后，清洗平板并用特异性检测抗体孵育。使用NovoCyte 2060流式细胞仪记录每个样本的APC通道的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均数。

在流式细胞术实验中评估了优化的scFv PRO2271、PRO2291和PRO2292与质膜人ROR1的表观结合亲和力。表15列出了这些实验中计算得出的EC₅₀、相对EC₅₀和相对最大结合值。如图2所示，所有的scFv都表现出与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合，而没有发现与ROR1阴性的MCF-7细胞结合。当与原始scFv PRO2062相比时，PRO2271(PRO2062的变体，进行T细胞得分优化和外环移植)的表观结合亲和力低大约两倍。PRO2291和PRO2292(PRO2060和PRO2062的变体，包括用于稳定的VL-VH结构域间二硫键)的表观结合亲和力与亲代scFvPRO2060和PRO2062的表观结合亲和力相当。

表15：通过流式细胞术检测，优化的抗ROR1 scFv PRO2271、PRO2291和PRO2292对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1的表观结合亲和力。PRO2213用作参考抗ROR1抗体。

通过SPR测定结合亲和力

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了优化的scFv PRO2071,PRO2291和PRO2292与重组人ROR1蛋白(Fc-Tag，Acro Biosystems)的结合动力学(包括亲和力)，如1.6节所述。

测定与人ROR1蛋白的亲和力，同时测定未优化形式，作为对比。表16总结了SPR分析的结果。

表16:优化的scFv与非优化的(在同一实验中)相比，对hROR1的亲和力测量的总结。

1.10.scFv结构域的生物物理表征(储存稳定性和DSF)

对人源化ScFv的优化变体进行了为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃的温度储存四周。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表17总结了单体含量(％)和相对于d0的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化。由于未观察到任何样本相对于d0有明显的差异，因此未显示数据。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。结果示于表17中。

克隆55-39-G02(PRO2271)的优化衍生物表现出与PRO2062相似的稳定性。与不具有二硫化物的对应物(PRO2060和PRO2062)相比，克隆55-38-D07和55-39-G02的具有VL-VH二硫化物的衍生物(PRO2291和PRO2292)都表现出改善的稳定性，并且可以被认为是总体上最稳定的scFv结构域。

实施例2：抗CD3分子的生成和检测：

抗CD3兔IgG克隆28-21-D09的鉴定、选择和人源化以及相应的人源化抗CD3 scFv28-21-D09-sc04(PRO726)的生产和表征如专利申请WO 2018/224441中所述进行，该专利申请通过引用并入本文。下文简要概述了抗CD3 scFv PRO726的表征。

2.1.抗CD3 scFv 28-21-D09-sc04(PRO726)的表征

结合亲和力和物种交叉反应性(FS)

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了所选定的结合结构域28-21-D09-sc04(PRO726)与重组人CD3ε胞外结构域蛋白(hCD3ε；His-Tag,SinoBiological)的结合动力学(包括亲和力)。将重组hCD3ε分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射PRO726的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸pH 2.0)，并注射新浓度的PRO726。

表17：优化的scFv结构域在10mg/mL及-80℃、4℃和40℃温度进行的28天储存稳定性研究以及DSF热稳定性。

NA：未测量，ND：无法确定

表18:所选scFv PRO726(结构域28-21D09-sc04)对hCD3ε和cCD3ε的亲和力测量总结。

使用多循环动力学试验测量与hCD3ε结合动力学，使用8种分析物浓度，范围从0.7到90nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用双态结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离常数(k_d1)和缔合速率常数(k_a1)、第二反应常数(k_a2和k_d2)以及表观解离平衡常数(K_D)，根据相对Chi2监测拟合质量。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

如上文针对hCD3ε所述测量与重组食蟹猴CD3ε(cCD3ε；His-Tag；SinoBiological)的结合动力学，除了使用cCD3ε代替hCD3ε。结果总结于表18中。

生物物理表征

对人源化的CD3结合结构域进行为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃的温度储存四周。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表19总结了单体含量(％)和相对于d0的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化。相对于d0，没有观察到任何样品的蛋白质含量的显著损失，数据未显示。

从差示扫描荧光测定法(DSF)测量获得的热解折叠数据如表19所示。通过将数据拟合到玻尔兹曼方程，测定了得出的热解折叠中点(T_m)和解折叠的起始温度(T_onset)。

表19：28-21-D09-sc04结构域的四周稳定性研究。

NA：未测量

实施例3：抗hSA分子的生产和检测：

人源化抗hSA结合结构域19-01-H04-sc03(PRO0325)和23-13-A01-sc03(PRO0459)的鉴定、选择、人源化以及生产和表征如专利申请EP 19 206 959.9中所述进行，该专利申请通过援引并入本文。人源化抗hSA结合结构域19-04-A10-sc02(PRO2155)的鉴定、选择、人源化以及生产和表征如专利申请EP 19 206 959.9中所述进行。下文简要概述了抗CD3scFv PRO2155的表征。

3.1.抗hSA scFv 19-04-A10-sc02(PRO2155)的表征

结合亲和力和物种交叉反应性

在pH 7.4和pH 5.5条件下，在T200设备(Biacore，Cytiva)上通过SPR分析测定了选定结构域19-04-A10-sc02与人血清白蛋白(hSA,Sigma-Aldrich A3782)的结合动力学(包括亲和力)。将hSA分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片,Biacore,Cytiva)，并注射每种scFv分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸pH 2.0)，并注射新浓度的scFv分子。使用多循环动力学分析法测定了与hSA的结合动力学，使用11种浓度，从0.044至45nM(1:2)稀释在相关运行缓冲液(PBS 0.05％Tween-20，或PBS 0.05％Tween-20，pH 5.5)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离常数(k_d)和缔合速率常数(k_a)以及表观解离平衡常数(K_D)，根据相对Chi2监测拟合质量。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

如上所述，还测定了选定scFv对食蟹猴血清白蛋白(cSA,Molecular InnovationsCYSA)和小鼠血清白蛋白(mSA,Sigma-Aldrich A3559)的结合动力学，不同之处在于使用cSA或mSA代替hSA。表20总结了在pH 5.5和pH 7.4下对hSA、mSA和cSA的结合动力学。

表20：血清白蛋白结合性scFv分子PRO2155(结构域19-04-A10-sc02)对hSA、cSA和mSA的亲和力测量总结。

*双相结合通过1:1的整体校正进行校正，导致最大反应较低

生物物理表征

HSA-结构域19-04-A10-sc02(PRO2155)和19-04-A10-sc06(sc02结构域含VL-VH二硫化物，VL-T141C/VH-G51C，AHo编号；PRO2317)进行了为期四周的稳定性研究，其中将scFv配制在10mg/ml的水性缓冲液(50mM NaCiP,150mM NaCl,pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃温度下储存四周。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表21总结了单体含量(％)和相对于d0的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化。由于未观察到任何样本相对于d0有明显的蛋白质含量损失，因此未显示数据。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。DSF结果示于表21。

表21：19-04-A10-sc02和19-04-A10-sc06抗hSA结构域的四周稳定性研究。

NA：未测量

实施例4：scMATCH3抗ROR1xCD3xhSA多特异性抗体的生成和生产

将HSA-、CD3-和ROR1-结合结构域以三特异性scMATCH3形式组合。scMATCH3形式仅由不同长度的GS-接头连接的可变结构域组成，如图3所示。在这种形式中，相互分开的可变结构域位于单个肽链(sc)上，其组装成全功能三特异性分子。与scFv结构域相似，可并入VL/VH二硫键以稳定单个结构域。scMATCH3分子可以在哺乳动物细胞中重组表达，并且可以使用常规的亲和层析步骤来纯化它们。

使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物scMATCH3构建体的表达。在37℃表达5-7天(当细胞活力<70％时)后，通过离心然后过滤收获培养物。通过蛋白L亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白，随后在pH 6.5的含300mM蔗糖的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中进行尺寸排阻色谱(SEC)。通过SE-HPLC分析评估SEC组分的单体含量，并混合单体含量>95％的组分。对于制备材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。scMATCH3分子的分子结构域组成和制备概述如表22所示。

scMATCH3分子PRO2667和RPO2668包含修饰或改进的ROR1-、CD3-和hSA-结合结构域，在Evitria AG(Schlieren，瑞士)使用其专有的哺乳动物表达系统以1l规模生产。通过蛋白L(CaptoL，Cytiva)亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白，随后在pH 6.5的含300mM蔗糖的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中进行SEC。通过SE-HPLC分析评估SEC组分的单体含量，并混合单体含量>95％的组分。对于制备材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。这些scMATCH3分子的制备总结示于表23中。使用PrometheusNT.48装置(NanoTemper)通过nDSF评估分子的热稳定性。

表22：scMATCH3分子结构、最终滴度和通过SE-HPLC测定的单体纯度。

表23：scMATCH3分子PRO2667和RPO2668的制备

实施例5：scMATCH3分子的药效学特征

5.1.通过SPR测定结合亲和力

通过SPR测试了九个多特异性scMATCH3分子与3个靶标人ROR1(hROR1)、人CD3ε(hCD3ε)和hSA的结合动力学。

通过SPR测定对hROR1的亲和力

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了九个scMATCH3分子与重组人ROR1蛋白(Fc-Tag，Acro Biosystems)的结合动力学(包括亲和力)，如1.6节所述。将重组人ROR1分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH3分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸，pH 2.0，和3M MgCl₂)，并注射新浓度的MATCH3分子。使用多循环动力学试验测量了与人ROR1的结合动力学，使用九种分析物浓度，范围从0.088到45nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了九个scMATCH3与hROR1的结合动力学，亲和力范围为1.6nM至0.12nM(表24)。所有测试的scMATCH3分子的hROR1亲和力均与各自的亲本scFv相似。

表24：scMATCH3分子对hROR1的亲和力测量总结。

通过SPR测定对hCD3ε的亲和力

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了九种选定的scMATCH3分子与重组人CD3ε胞外结构域蛋白(hCD3ε；His-Tag,SinoBiological)的结合动力学(包括亲和力)。将重组hCD3ε分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH3分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸，pH 2.0，和3M MgCl₂)，并注射新浓度的MATCH3分子。使用多循环动力学试验测量与hCD3ε结合动力学，使用九种分析物浓度，范围从0.088到45nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用双态结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离常数(k_d1)和缔合速率常数(k_a1)、第二反应常数(k_a2和k_d2)以及表观解离平衡常数(K_D)，根据相对Chi2监测拟合质量。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了9个MATCH3对hCD3ε的结合动力学，亲和力范围为9.4nM至1.5nM(表25)。所有测试的MATCH3分子的hCD3ε亲和力均与亲本scFv 28-21-D09-sc04相似。

表25：所选MATCH3分子对hCD3ε的亲和力测量总结。

通过SPR测定对hSA的亲和力

在T200设备(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析测定了七个选定的scMATCH3分子与人血清白蛋白(hSA,Sigma-Aldrich)的结合动力学(包括亲和力)。将hSA分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片,Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH3分子的滴定系列作为分析物(Exp.ND032-0033)。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸pH 2.0)，并注射新浓度的MATCH3分子。使用多循环动力学试验测量了与hSA的结合动力学，使用十种分析物浓度，范围为0.352至180nM，1:2稀释在相关的运行缓冲液(PBS，0.05％吐温-20，pH 5.5)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于相对Chi2和U-值监测拟合的质量，其中相对Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了七个MATCH3分子与hSA的结合动力学(表26)。所有测试的MATCH3分子在pH5.5的hSA亲和力均被认为足以延长MATCH3分子的全身半衰期。

表26：所选MATCH3分子对hSA的亲和力测量总结。

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5.2.流式细胞术分析scMATCH3分子与人ROR1的细胞结合

如1.6节所述，通过流式细胞术分析抗ROR1 scMATCH3分子与表达ROR1的MDA-MB-231细胞的细胞结合。简而言之，制备scMATCH3分子(起始浓度为40nM(PRO2286、PRO2287)或120nM(PRO2507、PRO2508、PRO2509、PRO2510、PRO2557))以及参考Fab片段PRO2213(起始浓度为40nM或120nM)的5倍系列稀释液，然后加入到含有细胞的平板中。在1mg/ml人血清白蛋白(hSA)存在下于4℃孵育1小时后，清洗平板并用特异性检测抗体孵育。使用NovoCyte2060流式细胞仪记录每个样本的APC通道的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均数。

通过流式细胞术评估抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子与质膜人ROR1的结合。表27列出了这些实验中计算得出的EC₅₀、相对EC₅₀和相对最大结合值。如图4所示，scMATCH3分子PRO2286和PRO2287，两种分子都含有相同的抗ROR1-BD 55-39-G02-sc02，但不同的抗hSA-BD，显示出与ROR1阳性的MDA-MB-231细胞结合，而没有发现与ROR1阴性的MCF-7细胞结合。与亲代scFv PRO2062(抗ROR1结构域55-39-G02-sc02)的相对EC₅₀值相比，两种scMATCH3分子都显示出约低五倍的EC₅₀结合(PRO2286的相对EC₅₀＝0.63，PRO2287的相对EC₅₀＝0.47；PRO2062的平均相对EC₅₀＝2.77)。据推测，scMATCH3分子的这种EC₅₀结合降低是由于hSA与scMATCH3分子结合引起的空间位阻。沿着这条线，含有抗ROR1结构域55-39-G02-sc02(PRO2509)或其优化变体(PRO2510：55-39-G02-sc05，PRO2557：55-39-G02-sc06)的其他scMATCH3分子显示，与它们各自的scFv相比，EC₅₀结合降低了五到十倍。详细地说，PRO2509、PRO2510和PRO2557的相对EC₅₀值分别为0.53(相应的scFv，PRO2062为2.77)、0.3(PRO2292为2.61)和0.21。

使用相同的实验设置在流式细胞仪中测量了PRO2510的优化变体PRO2668。在该实验中，PRO2668对MDA-MB-231细胞的结合与PRO2510相当，如类似的结合效力以及相对最大结合值所示。这些抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子的剂量反应曲线可见于图4和图5。关于用抗ROR1结构域55-38-D07-sc02(PRO2507)和55-38-D07-sc06(PRO2508)构建的scMATCH3分子，发现与它们各自的scFv相比，它们的EC₅₀结合也降低了。详细地说，PRO2507和PRO2508的相对EC₅₀值分别为0.03(相应的scFv，PRO2060为0.33)和0.04(PRO2291为0.27)。这些抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子的浓度-反应曲线可见于图5。

总之，所有scMATCH3分子都显示出与人ROR1表达细胞的特异性结合，而且与用抗ROR1克隆55-38-D07构建的系列分子相比，含有抗ROR1克隆55-39-G02的分子的EC₅₀结合更高。可能是由于hSA与scMATCH3分子结合引起的空间位阻，scMATCH3分子与其相应的scFv相比，结合低五到十倍。细胞结合数据的结果总结在表27中。显示了计算的EC₅₀、相对EC₅₀以及相对最大结合值。Fab片段PRO2213用作参考抗ROR1抗体。

表27：通过流式细胞术检测，抗ROR1xhSAxCD3 scMATCH3分子PRO2286、PRO2287、PRO2507、PRO2508、PRO2509、PRO2510、PRO2557和PRO2668对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1的结合。

实施例6：效力评估：由scMATCH3分子介导的靶细胞细胞毒性和T细胞活化

为了了解这些scMATCH3分子促进肿瘤细胞杀伤和CD8 T细胞活化的能力，我们进行了一系列细胞毒性试验，以比较我们的先导候选物之间的效力和T细胞活化特征。

首先，测试了几种细胞系上ROR1的表达水平，以及表面上相对受体水平的定量(图6)。细胞依次与Zombie NIR活/死APC-Cy7(Biolegend，1:500)在4℃孵育20分钟，接着进行洗涤步骤，然后与抗ROR1 PE(Biolegend，1:25)在4℃孵育20分钟，接着洗涤并在Novocyte流式细胞仪(ACEA)上采集。图6A显示了MDA-MB-231和MCF7细胞表面ROR1的表达。使用Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG试剂盒(Bangs Laboratories)按照制造商的说明对受体水平进行定量。用Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)采集珠子和细胞，并用FlowJo软件(BD)分析数据。与MCF7细胞相比，在MDA-MB-231细胞上ROR1的相对表面水平更高。MCF7细胞上ROR1的表面水平被认为非常低，与人类健康的成人组织相当。MCF7细胞因此被用作阴性对照(图6B)。

按照生产商的说明，使用带有Lymphoprep的SepMate管(StemCell Technologies公司)从血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞(PBMC)，建立密度梯度，从而进行这些检测。

将分离的PBMC与感兴趣的ROR1阳性和阴性肿瘤细胞以10:1的效应物与靶标比例共培养40小时。共培养结束后，吸取100μl上清液，使用罗氏公司生产的细胞毒性检测试剂盒检测死亡细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)。剩余的上清液在-80℃冷冻，用于下游多重细胞因子分析。用以下试剂或抗体(均来自Biolegend)标记细胞，用于特异性T细胞活化的流式细胞术分析：可固定的活/死Aqua、抗人CD4 APC-Cy7(克隆OKT4)、抗人CD11c PE-Cy7(克隆Bu15)、抗人CD8 PerCP-Cy5.5(克隆SK1)和抗人CD69 PE(克隆FN50)。在流式细胞仪(Attune,ThermoFisher Scientific)上采集细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析CD69的上调，作为CD4和CD8 T细胞活化的量度。

所有测试的scMATCH3分子均导致对ROR1阳性细胞如MDA-MB-231的特异性杀伤，并且在ROR1阴性细胞系MCF7上观察到最低至无活性(图7A)。与来源于PRO2062的分子PRO2509和PRO2510相比，来源于PRO2060的scMATCH3分子PRO2507和PRO2508的效力稍差，这与观察到的对于PRO2062的较高亲和力一致。CD8和CD4 T细胞活化与细胞毒性数据非常接近(图7B和7C)。

scMATCH3分子PRO2557，其结构域衍生自PRO2062，并且T细胞评分被优化以降低免疫原性，它也介导对ROR1阳性细胞的特异性杀伤(图8A)。与其他scMATCH3分子非常相似，CD8和CD4 T细胞活化与观察到的细胞毒性相关(分别见图8B和图8C)。表28总结了实验中获得的scMATCH3分子特异性杀伤MDA-MB-231细胞的平均EC₅₀值。

表28：用PBMC进行的scMATCH3研究的关键细胞毒性数据总结

实施例7：生物物理表征scMATCH3分子

对scMATCH3分子进行了为期四周的稳定性研究，其中将分子以1mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，300mM蔗糖，pH 6.5)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存四周。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表29总结了单体含量(％)和相对于d0的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化，并示于表30中。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。纳米DSF解折叠中点(T_m)结果显示在表29的最后一列中。

表29：浓度为1mg/ml的scMATCH3稳定性评估，单体含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

NA：未测量

表30：浓度为1mg/ml的scMATCH3稳定性评估，蛋白质含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

NA：未测量

含有55-38-D07衍生的抗ROR1结构域的分子(PRO2507和PRO2508)和含有55-39-G02衍生的抗ROR1结构域的分子(PRO2509和PRO2510)在1mg/ml的浓度下在28d的过程中表现出非常相似的单体稳定性。在-80℃和4℃的温度以及重复冻融(5x)后(在SE-HPLC/UV测量前对第28天/-80℃样本进行)，单体含量没有明显变化。

第0天(d0)和第28天(d28)样品的SDS-PAGE分析显示，除了对应于分子的计算分子量的主带之外，在研究的d0，在所有(还原的)样品中存在低分子量(LMW)物质。它们出现的原因并不完全清楚，然而可能与用于分子制备的一般的、非优化的表达和纯化条件或不利的SDS-PAGE样品制备条件有关。当将d28样品与d0样品比较时，通常在4℃和40℃样品中没有检测到LWM物质随时间显著增加。在加速条件(40℃)下孵育28天的所有样品中，LMW物质的比例明显增加，表明scMATCH3分子的时间和温度依赖性断裂。由于所有分子都表现出类似的良好稳定性，因此不考虑根据加速稳定性数据对分子进行筛选。

就通过nDSF评估的热稳定性而言，PRO2509和PRO2510似乎略好于PRO2507和PRO2508，因为对于含有55-39-G02衍生的ROR1结构域的分子，它们的解折叠开始(T_onset)显著更高。

实施例8：MATCH4抗ROR1xCD3xhSA多特异性抗体的生成和生产

将来自scMATCH3分子的ROR1结合结构域整合到MATCH4分子形式中，以通过使用两个ROR1结合结构域来进一步增强效力。这将导致类似于常规全长抗体的二价靶向，但具有T细胞靶向(CD3结构域)和半衰期延长(hSA结构域)的额外益处。

MATCH4是由Numab开发的形式，其仅由通过不同长度的GS-接头连接的可变结构域组成，仅允许匹配结构域对的特定配对。MATCH4形式可在哺乳动物细胞中重组表达。对于纯化，可以使用常规的亲和层析步骤。ND032 MATCH4分子的结构如图9所示。该形式要求二聚体亚单位由2个相互分开的可变结构域对的核心组成，每个各自的亚单位具有串联定位的2个VL结构域或2个VH结构域，从而驱动两条蛋白质链的异二聚化。各自的MATCH4链上形成二聚体的串联可变结构域以与其对应链反向平行的N-端-C-端方向组织。这两条链在哺乳动物细胞中共同表达为具有完全功能的四特异性分子。在可变结构域之间使用传统Gly-Ser接头将它们连接。此外，如图9所示，反向平行MATCH4形式适合于在核心结构域之一中引入二硫键。为了稳定单个结构域，还可能包含额外的VL/VH二硫键。

在Evitria AG公司(Schlieren,Switzerland)使用其专有的哺乳动物表达系统以1l的规模进行哺乳动物MATCH4构建体的表达。通过蛋白L亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白，随后在pH 6.5的含300mM蔗糖的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中进行SEC。通过SE-HPLC分析评估SEC组分的单体含量，并混合单体含量>95％的组分。对于制备材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。MATCH4分子的分子组成和制备概述如表31所示。

表32示出了MATCH4分子PRO2669和RPO2670的制备概况，它们包含经过修饰或改进的ROR1、CD3和hSA结合结构域。

表31：MATCH4分子结构、最终滴度和通过SE-HPLC测定的单体纯度。

*已经进行了两次尺寸排阻色谱(SEC)精制操作，其中材料未被合并，具有较高单体含量的材料用于进一步分子表征

表32：MATCH4分子PRO2669和RPO2670的制备

实施例9：MATCH4分子的药效学特征

9.1.通过SPR测定结合亲和力

通过SPR测试了四个多特异性MATCH4分子与三个靶标hROR1、hCD3ε和hSA的结合动力学。

通过SPR测定对hROR1的亲和力

用两种不同的分析设计，在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析，测定四种sMATCH4分子与重组人ROR1蛋白有和无亲合力的结合动力学(包括亲和力)。

使用固定在羧甲基化葡聚糖表面的专有抗框架兔IgG(rIgG21-57-20-B11)来捕获表面上的MATCH4分子(CM5传感器芯片；Biacore，Cytiva)，从而确定其结合亲和力(无亲合力)。注射滴定系列的人ROR1(Peprotech 160-054)分子作为分析物。在每次捕获-分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(3M MgCl₂)，MATCH4分子被再次捕获，随后是不同浓度的人ROR1。使用多循环动力学试验测量了与人ROR1的结合动力学，使用十种分析物浓度，范围从0.088到90nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。

有亲合力的结合的测定方法与第1.6节所述步骤类似。将重组人ROR1分子(Fc-Tag,Acro Biosystems RO1-H5250)共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH4分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸，pH 2.0，和3M MgCl₂)，并注射新浓度的MATCH4分子。使用多循环动力学试验测量了与人ROR1的结合动力学，使用九种分析物浓度，范围从0.088到45nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。

对于两项试验，均使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(BiacoreEvaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了4种MATCH4对hROR1的结合动力学，亲和力范围为5nM至1.2nM。在四个MATCH4分子上测定了具有亲合力的hROR1亲和力，范围从136pM到22pM。表33总结了SPR结果。

通过SPR测定对hCD3ε的亲和力

在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析确定了四种MATCH4分子与重组人CD3ε胞外结构域蛋白(hCD3ε；His-Tag,SinoBiological)的结合动力学(包括亲和力)。将重组hCD3ε分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH4分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸，pH 2.0，和3M MgCl₂)，并注射新浓度的MATCH4分子。使用多循环动力学试验测量与hCD3ε结合动力学，使用九种分析物浓度，范围从0.088到45nM，1:2稀释在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5；Bioconcept)中。使用双态结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离常数(k_d1)和缔合速率常数(k_a1)、第二反应常数(k_a2和k_d2)以及表观解离平衡常数(K_D)，根据相对Chi2监测拟合质量。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了4种MATCH4对hCD3ε的结合动力学，亲和力范围为6.3nM至4.7nM(表34)。所有测试的MATCH4分子的hCD3ε亲和力均与亲本scFv 28-21-D09-sc04相似。

通过SPR测定对hSA的亲和力

在T200设备(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析测定了4个MATCH4分子与人血清白蛋白(hSA；Sigma-Aldrich A3782)的结合动力学(包括亲和力)。将人血清白蛋白分子共价固定在羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore,Cytiva)，并注射每种MATCH4分子的滴定系列作为分析物。在每个分析物注射循环后，将传感器芯片上的每个流动通道再生(甘氨酸pH 1.5和3M MgCl₂的脉冲)，并注射新浓度的MATCH4分子。使用多循环动力学试验测量了与hSA的结合动力学，使用十种分析物浓度，范围为0.18至90nM，1:2稀释在运行缓冲液(PBS-P+pH 5.5,PBS至pH 5.5含HCl,0.05％Tween20)中。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论R_max。

测定了4种MATCH4对hSA的结合动力学，亲和力范围为6.7nM至5.5nM(表35)。所有测试的MATCH4分子的hSA亲和力均与亲本scFv 19-04-A10-sc02相似。

9.2.通过流式细胞术分析MATCH4分子与人类ROR1的细胞结合

如上所述通过流式细胞术进行抗ROR1 MATCH4分子(PRO2589、PRO2590、PRO2591、PRO2592和PRO2658)与表达ROR1的MDA-MB-231细胞的细胞结合。简言之，制备MATCH4分子(起始浓度为120nM)以及参考Fab片段PRO2213(起始浓度为120nM)的5倍序列稀释液，然后将其添加到装有细胞的平板中。在1mg/ml人血清白蛋白(hSA)存在下于4℃孵育1小时后，清洗平板并用特异性检测抗体孵育。使用NovoCyte 2060流式细胞仪记录每个样本的APC通道的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均数。

通过流式细胞术评估MATCH4分子与质膜人ROR1的结合。表36列出了这些实验中计算得出的EC₅₀、相对EC₅₀和相对最大结合值。Fab片段PRO2213被用作参考抗ROR1抗体。所有MATCH4分子均证明与ROR1阳性MDA-MB-231细胞结合，而没有发现与ROR1阴性MCF-7细胞结合(见图10)。与相应的scMATCH3分子的EC₅₀值相比，含有ROR1克隆55-38-D07(PRO2589和PRO2590)的MATCH4分子的EC₅₀结合增加了10倍。例如，PRO2589的相对EC₅₀为0.45，比scMATCH3 PRO2507的相对EC₅₀(0.03)约好十倍。类似地，含有ROR1克隆55-39-G02(PRO2591和PRO2592)的MATCH4分子的EC₅₀结合增加了5倍(比较PRO2592的相对EC₅₀和PRO2557的相对EC₅₀)。结合的增加被认为是由于MATCH4分子的二价性质导致了亲合力效应。在MATCH4分子中，PRO2591(ROR1结构域:55-39-G02-sc03)显示出最好的EC₅₀结合，其比参考Fab片段PRO2213好约2.5倍。使用相同的实验装置在流式细胞仪中测量了PRO2590的优化变体PRO2670。在该实验中，我们发现PRO2670结合MDA-MB-231细胞的能力与PRO2590相当，如相似的相对EC₅₀值所示。

总之，所有MATCH4分子都显示出与人ROR1表达细胞的特异性结合，而且与用抗ROR1克隆55-38-D07构建的系列分子相比，含有抗ROR1克隆55-39-G02的分子的结合更高。与相应的单价scMATCH3分子相比，可能由于亲合力效应，所有二价MATCH4分子的EC₅₀结合力都有所提高。

表33：具有和不具有亲和力的MATCH4分子对hROR1的亲和力测量总结。

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表34：所选MATCH4分子对hCD3ε的亲和力测量总结。

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表35：所选MATCH4分子对hSA的亲和力测量总结。

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表36：通过流式细胞术检测，双价抗ROR1 MATCH4分子PRO2589、PRO2590、PRO2591、PRO2592和PRO2670对MDA-MB-231细胞上表达的人ROR1的结合。

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9.3.MATCH4分子介导的靶细胞毒性和T细胞活化

为了理解MATCH4分子促进肿瘤细胞杀伤和CD8 T细胞活化的能力，进行了一系列细胞毒性试验，以比较我们的先导候选物的效力和T细胞活化特征。

首先，平行测试几个细胞系上ROR1的表达水平。简言之，细胞依次与Zombie NIR活/死APC-Cy7(Biolegend，1:500)在4℃孵育20分钟，接着进行洗涤步骤，然后与抗ROR1 PE(Biolegend，1:25)在4℃孵育20分钟，接着洗涤并在Attune流式细胞仪(ThermofisherScientific)上采集。图11显示了在MDA-MB-231、Jeko-1、JIMT-1、SKOV-3和MCF7细胞上测量的表面ROR1表达。在MDA-MB-231和Jeko-1细胞上发现最高的ROR1水平。JIMT-1和SKOV-3细胞显示ROR1的低表达水平，MCF7细胞显示非常低的ROR1表达水平。MCF7细胞因此被用作ROR1的阴性对照。

使用从血沉棕黄层中分离的外周血单核细胞(PBMC)中分离的Pan-T细胞进行细胞毒性试验。按照生产商的说明，使用带有Lymphoprep的SepMate管(StemCell Technologies公司)分离PBMC，建立密度梯度。PBMC分离后，使用Miltenyi的Pan-T分离试剂盒按照生产商的说明分离Pan-T细胞。

将分离的Pan-T细胞与感兴趣的ROR1阳性和阴性肿瘤细胞以10:1的效应物与靶标比例共培养40小时。共培养结束后，吸取100μl上清液，使用罗氏公司生产的细胞毒性检测试剂盒检测死亡细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)。剩余的上清液在-80℃冷冻，用于下游多重细胞因子分析。用以下试剂或抗体(均来自Biolegend)标记剩余的细胞：可固定的活/死Aqua、抗人CD4 APC-Cy7(克隆OKT4)、抗人CD11c PE-Cy7(克隆Bu15)、抗人CD8 PerCP-Cy5.5(克隆SK1)和抗人CD69 PE(克隆FN50)。在流式细胞仪(Attune,ThermoFisher Scientific)上采集细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析CD69的上调，作为CD4和CD8 T细胞活化的量度。

所有测试的MATCH4分子均导致对高ROR1阳性细胞如MDA-MB-231和Jeko-1的特异性杀伤(见图12A)，并且在ROR1阴性细胞MCF7上观察到最低至无活性(见图12B)。MATCH4分子的EC₅₀值优于相应的scMATCH3(PRO2589和PRO2590 vs PRO2507，PRO2591和PRO2592 vsPRO2557/PRO2510)。然而，对于低表达ROR1的细胞，即JIMT-1和SKOV-3(图12A底部)，与PRO2591和PRO2592(ROR1结构域PRO2271)相比，PRO2589和PRO2590(来源于PRO2060的ROR1结构域)似乎具有稍微更好的EC₅₀值。与scMATCH3分子PRO2507相比，PRO2060衍生的MATCH4分子在低ROR1表达细胞上也表现出稍微更好的EC₅₀值，而当将PRO2271衍生的MATCH4与scMATCH3分子比较时，这种差异似乎不存在。有趣的是，在表达低水平ROR1的细胞上，与scMATCH3分子相比，MATCH4分子似乎表现出整体较低的最大杀伤(图12A底部)。表37总结了细胞毒性结果。

此外，通过增加表达CD69的细胞的频率检测了T细胞活化。基于CD8(图13顶部)和基于CD4(图13底部)的T细胞活化与细胞毒性数据非常接近。用也表达最高水平的ROR1的MDA-MB-231细胞获得了活化的CD8和CD4 T细胞的最高频率(图13A)。与基于PRO2271的MATCH4分子相比，基于PRO2060的MATCH4分子具有较低的EC₅₀值。然而，当检查scMATCH3分子时，与MATCH4分子相比，这些T细胞群体具有总体更高的活化细胞频率。结果总结在表38和39中。

MATCH4分子活性的最大差异似乎存在于低ROR1表达细胞上，即SKOV-3和JIMT-1细胞。由于预期患者之间和肿瘤适应症之间ROR1表达水平的异质性，有效靶向具有较低ROR1表达水平的肿瘤将是有利的。基于这些数据，PRO2592似乎具有最低的效力(细胞毒性和T细胞活化)以及最低的最大值。

9.4.先导MATCH4分子的生物物理表征

储存稳定性和熔融温度

对MATCH4分子进行了为期14天的稳定性研究，其中将分子以1mg/ml配制在水性缓冲液(50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液，含300mM蔗糖，pH 6.5)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存14天。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表40总结了单体含量(％)和相对于第0天的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化，并示于表41中。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。T_m结果示于表40中。

所有四种MATCH4分子都表现出优异的稳定性，并且在14天孵育后没有显示出显著的单体含量损失或蛋白质含量损失。在-80℃和4℃的温度以及重复冻融(5x)后(在SE-HPLC/UV测量前对第14天/-80℃样本进行)，单体含量没有明显变化。

实施例10：原有ADA结合分析

10.1.一般检测程序:

在Numab开发了一种方法，使用直接测定形式检测人血清中原有抗药物抗体。

在室温下，用100ng/ml的测试分子(MATCH3或scFv形式)包被96孔半面积板2小时。用含0.2％吐温和1％BSA的PBS封闭平板1小时。然后以1:20(5％血清)或1:100(1％血清)的稀释度加入单个人血清，未加标(筛选试验)或加标(确认试验)与相应孔中包被的相同分子。加标浓度范围为60至115nM，加标样品预孵育1小时。抗体与包被在板上的分子结合，然后用100ng/ml兔抗人IgG-HRP检测1小时。加入TMB底物作为底物，短暂孵育后，用1M HCl终止酶促反应。在450nm处读取每个孔的光密度。所有步骤都在室温下进行。在每个步骤之间，用450μl洗涤缓冲液洗涤平板三次。除了封闭和洗涤步骤之外，所有测定组分都以25μl/孔的体积加入，并使用重复试样。对于孵育步骤，将ELISA板置于旋转混合器(40rpm)上。

通常，用未加标的人血清进行第一轮测量(筛选试验)。然后计算每个平板的筛选分界点(SCP)。信号低于SCP的未加标样品被称为“筛选阴性”，在确认试验中不予考虑。信号高于SCP的未加标样品被称为“筛选阳性”。

表37：来自MATCH4和选定的scMATCH3分子的用Pan-T细胞进行的关键细胞毒性数据总结

表38：用选定的MATCH4和选定的scMATCH3分子进行的细胞毒性试验的CD8 T细胞活化数据总结

表39：用选定的MATCH4和选定的scMATCH3分子进行的细胞毒性试验的CD4 T细胞活化数据总结

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表40：浓度为1mg/ml的MATCH4稳定性评估，单体含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

^与研究的d0相比，单体含量显著增加，这可能是由于将较高浓缩的初始样品稀释至1mg/ml的研究浓度

NA：未测量，ND：无法确定

表41：浓度为1mg/ml的MATCH4稳定性评估，蛋白质含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

对于这些“筛选阳性”样品中的大多数，使用加标的人血清进行第二轮测量(确认试验)，以确定最初检测到的各血清样品中的抗体结合是否对测试分子具有特异性。加标孔中吸光度信号的降低表明，在初始筛选试验的未加标孔中观察到的信号对包被在板上的分子是特异性的。确认特异性所需的最终抑制百分比(％抑制)或者设定为20-30％，或者以百分比(％CCP)计算确认性临界点。在后一种情况下，只有抑制百分比高于CCP的样品被确认为阳性。％抑制作为未加标血清(筛选试验)获得的初始信号的减少计算如下：％CCP＝初始信号(1-(加标血清/信号未加标血清))*100。

在替代性步骤中，不进行初始筛选分析。取而代之的是，使用确认试验步骤直接分析测试样品。然而，对于数据分析，进行了相同的计算，其至少包括SCP和％CCP的计算。

10.2.筛选分界点(SCP)、归一化因子(NF)和浮动分界点(FCP)的确定/计算

对于每种测试化合物，分析了健康未治疗受试者的40个个体人血清样品。在其他情况下，分析了20份健康的未治疗受试者的个体人血清样品。

筛选分界点(SCP)：

筛选分界点(SCP)是将信号认定为阳性(筛选阳性)的阈值。计算时包括了5％的假阳性血清。

筛选分界点(SCP)计算如下：

SCP＝平均值N+1.645x SDN

其中：

-“平均值N”对应于针对特定测试化合物所测量的所有未加标个体血清的平均信号；

-“SDN”对应于针对特定测试化合物所测量的所有未加标个体血清计算的标准偏差。

归一化因子(NF)：

归一化因子(NF)计算如下：

NF＝SCP-阴性对照平均值

其中：

-“SCP”如上所定义；且

-“阴性对照平均值”对应于每板一式两份(即2个孔)分析的阴性对照(合并的个体人血清，每个板上相同)的平均信号。

在计算归一化因子时，必须考虑至少两个NC样本(即4个孔)。

浮动分界点的计算(FCP)：

在测定SCP和NF后，将每个板的浮动分界点(FCP)用作参考分界点。FCP考虑了每次分析运行的分析可变性，使用微孔板的阴性对照对SCP进行归一化。每次分析运行的FCP计算如下：

FCP＝NF+平均值NC

其中：

-“平均值NC”是指阴性对照样品的平均信号；

-“NF”指的是如上定义的归一化因子。

10.3.改进的多特异性抗体变体的原有ADA结合试验结果

使用上述原有ADA结合试验测量了变体PRO2668和PRO2669，以及作为对比的相应的未修饰的参照PRO2510和PRO2589的的免疫原性。使用20个人血清样品(PRO2589使用19个)在确认试验设置中直接进行测量。

然后通过考虑30％的CCP％进一步分析筛选阳性血清。表42总结了各测试分子的阳性血清样本数。图14显示了PRO2741和参照PRO2660的图：人血清中原有ADA的吸光度水平以及加标人血清的吸光度水平降低(ADA结合抑制)。

表42：PRO2668和PRO2669以及参考PRO2510和PRO2589的％CCP高于30％的阳性血清样品的数量：

实施例11：由scMATCH3和MATCH4变体PRO2667、PRO2668、PRO2669和PRO2670介导的靶细胞毒性和T细胞活化

方法

按照生产商的说明，使用带有Lymphoprep的SepMate管(StemCell Technologies)从血沉棕黄层中分离出人外周血单核细胞(PBMC)，建立密度梯度，从而进行这些检测。按照制造商的说明，使用Miltenyi Biotec的Pan T细胞分离试剂盒从PBMC中分离Pan T细胞。

将分离的Pan-T与感兴趣的ROR1阳性和阴性肿瘤细胞共培养40小时，对于贴壁细胞，效应物与靶标比例为10:1，对于悬浮细胞，效应物与靶标比例为5:1。共培养结束后，吸取100μl上清液，使用罗氏公司生产的细胞毒性检测试剂盒检测死亡细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)。剩余的上清液在-80℃冷冻，用于下游多重细胞因子分析。用以下试剂或抗体(均来自Biolegend)标记细胞，用于特异性T细胞活化的流式细胞术分析：可固定的活/死Aqua、抗人CD4 APC-Cy7(克隆OKT4)、抗人CD11c PE-Cy7(克隆Bu15)、抗人CD8 PerCP-Cy5.5(克隆SK1)和抗人CD69 PE(克隆FN50)。在流式细胞仪(Attune,ThermoFisher Scientific)上采集细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析CD69的上调，作为CD4和CD8 T细胞活化的量度。

结果

使用所有测试的scMATCH3(PRO2667和PRO2668)和MATCH4(PRO2669和PRO2670)分子均导致了对ROR1阳性MDA-MB-231和JIMT-1细胞的特异性杀伤，如图15A所示。MATCH4分子的效力优于scMATCH3分子，然而当使用scMATCH3分子时，在较低ROR1表达的JIMT-1细胞上实现的最大裂解水平更高。当检测CD8 T细胞活化时，获得了类似的结果，如通过CD69表达CD8 T细胞的频率所测量的(图15B)。

实施例12：PRO2668诱导ROR1阳性实体和血液肿瘤细胞系的特异性T细胞介导的裂解的效力

对代表实体瘤(图16A和16B)和血液恶性肿瘤(图16C)的细胞系评估了PRO2668介导的细胞毒性。使用ROR1阳性细胞系作为靶标观察到细胞毒性，而ROR1阴性细胞系HCC1954不被裂解，表明PRO2668的ROR1依赖性(图16A)。随着ROR1密度的增加，特异性裂解的效力总体上提高(图16B)。还观察到对套细胞淋巴瘤细胞系Mino和Z-138的特异性杀伤(图16C)。这些数据表明PRO2668能够介导对一系列表达ROR1的肿瘤细胞系的特异性杀伤。

实施例13：PRO2668介导ROR1依赖性CD8 T细胞活化和增殖的能力

方法

将分离的健康Pan-T细胞按照制造商的说明用CellTrace Violet标记，并与ROR1阳性肿瘤细胞以效应物与靶标比例为5:1共培养3-6天。在共培养3和/或6天后，用以下试剂或抗体(均来自Biolegend)标记细胞，用于特异性T细胞活化的流式细胞术分析：可固定的活/死Aqua、抗人CD4 APC-Cy7(克隆OKT4)、抗人CD19 PE(克隆HIB19)、抗人CD8 PerCP-Cy5.5(克隆SK1)、抗人CD3 Alexa Fluor 488(克隆OKT3)和抗人CD25 BV650(克隆BC96)。在流式细胞仪(Attune,ThermoFisher Scientific)上采集细胞，并使用FlowJo软件(BD)进行分析。与非分裂细胞(染料稀释)相比，分裂细胞的荧光水平降低。CD25频率的上调被用作CD8T细胞活化的量度。

结果

在与表达ROR1的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和JIMT-1共培养时，观察到CD8 T细胞活化(图17A)。活化的程度似乎与ROR1表达相关，因为ROR1表达越高，观察到活化T细胞的频率越高。当检查分裂细胞(CellTrace Violet荧光减少的细胞)的频率或每微升的分裂细胞计数时，观察到CD8 T细胞增殖响应于两种表达ROR1的细胞系。当使用具有更高ROR1表达的靶时，增殖的程度更高。也观察到了响应于套细胞淋巴瘤细胞系Z-138的CD8 T细胞的活化和增殖(图17B)。这些数据表明表达ROR1的靶标和T细胞与PRO2668的结合导致T细胞活化和增殖。

实施例14：PRO2668介导非有丝分裂、低表达ROR1的原发性人CLL患者样品特异性裂解的能力

方法

使用CLL患者样品(IQBiosciences)和从外周血单核细胞(PBMC)分离的健康人Pan-T细胞进行这些测定。按照生产商的说明，使用带有Lymphoprep的SepMate管(StemCellTechnologies公司)从血沉棕黄层中分离PBMC，建立密度梯度。按照制造商的说明，使用Miltenyi Biotec的Pan T细胞分离试剂盒从PBMC中分离Pan T细胞。

使用Click-It Plus流式细胞术检测试剂盒并按照制造商的说明，通过检查5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入来评估CLL患者样本的分裂能力。与非分裂细胞相比，分裂细胞被阳性标记。使用上文概述的方案评估受体密度，例如9.3节中概述的方案。通过以下操作来评估PRO2668的细胞结合：在人血清白蛋白的存在下滴定增加浓度的PRO2668，随后充分洗涤并用荧光标记的第二试剂(经设计用于检测框架)检测。在流式细胞仪上采集样品，并使用FlowJo进行分析。

将分离的Pan-T与CLL患者样品以5:1的效应物:靶标比例共培养40小时。共培养后，剩余的上清液在-80℃冷冻，用于下游多重细胞因子分析。用以下试剂或抗体(均来自Biolegend)标记细胞，用于流式细胞术分析细胞死亡和特异性T细胞活化：可固定的活/死Aqua、抗人CD4 APC-Cy7(克隆OKT4)、抗人CD3 Alexa Fluor 488(克隆OKT3)、抗人CD8PerCP-Cy5.5(克隆SK1)、和抗人CD69 BV650(克隆FN50)、抗人CD19 BV421(克隆SJ25C1)、Annexin V APC、抗人ROR1 PE(克隆2A2)。在流式细胞仪(Attune,ThermoFisherScientific)上采集细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析CD69的上调，作为CD4和CD8 T细胞活化的量度。死亡的CLL细胞按CD19+Annexin V+L/D+进行圈门。按照制造商的说明，使用LEGENDplex^TM多分析物流式检测试剂盒、Human Essential Immune Response Panel 13-plex评估冷冻上清中细胞因子的释放。

结果

CLL PBMC在外周中缺乏增殖，这为需要活性增殖才能发挥其活性的药物带来了挑战(Hu et al.,Blood Adv.5(2021)3152–3162)。使用EdU掺入法证实了来自外周血的CLL患者样品没有增殖(图18A)。与活跃分裂的Jeko-1细胞系相反，CLL患者样品不分裂。这些样品表达低水平的ROR1(每个细胞8000个受体，图18B)。在这些细胞上观察到ROR1受体的饱和(图18C)。在与健康同种异体Pan-T细胞和CLL患者样品共培养时，观察到特异性裂解(图18D)和伴随的CD8和CD4活化(图18E)。某些细胞因子(IFNg和TNFa)的细胞因子释放是适度的，而其他细胞因子如IL-6则没有观察到(图18F)。这些数据表明PRO2668能够结合并特异性裂解未分裂的CLL患者样品，导致T细胞活化和适度水平的细胞因子释放。

实施例15：PRO2668和PRO2670的体内功效

方法

将冷冻的PBMC在37℃水浴中解冻，离心，重新悬浮在PBS中，并储存在冰上用于接种。JeKo-1肿瘤细胞在37℃在5％CO₂的气氛中用补充有20％胎牛血清的RPMI1640培养基进行体外维持。在指数生长期收获细胞，并在接种肿瘤前用细胞计数器定量。

每个治疗组由五只动物组成。在每只小鼠的右上侧区域皮下接种5×10⁶JeKo-1肿瘤细胞(于0.1ml的PBS中，与基质胶(1:1)混合)，用于肿瘤发展。接种肿瘤后3天，腹腔内植入1×10⁷PBMC。当平均肿瘤大小达到80-100mm³时进行随机分组。

随机分组后开始给药(第0天)，此后每5天给药一次。肿瘤接种后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测过程中，检查动物的肿瘤生长和治疗对行为的任何影响，如活动性、食物和水的消耗、体重增加/减少(随机分组后每周测量两次体重)、眼睛/毛发消光和任何其他异常。详细记录每只动物的死亡率和观察到的临床症状。

在随机分组后，使用卡尺在二维方向上每周测量两次肿瘤体积，并且使用以下公式以mm³表示体积：V＝(L×W×W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长的肿瘤尺寸)，W是肿瘤宽度(垂直于L的最长的肿瘤尺寸)。如果动物体重相对于治疗第一天的体重减少了20％以上，则将其处死；如果肿瘤体积≥3000mm³的个体小鼠(将个体小鼠处死)；或一组平均肿瘤体积≥2000mm³(将同一组所有小鼠处死)。

结果

使用Jeko-1人类异种移植物模型在体内功效研究中测试了PRO2668。皮下植入Jeko-1细胞，并在肿瘤植入后3天施用人PBMC。从图19可以看出，与不相关的蛋白质对照帕利珠单抗相比，给药1mg/kg和0.2mg/kg的PRO2668导致显著的肿瘤生长抑制。对于0.04mg/kg的PRO2668，没有观察到相对于对照的功效差异。观察到1mg/kg剂量的PRO2670具有抗肿瘤功效，而较低剂量的PRO2670相对于对照组没有表现出显著不同的肿瘤体积。虽然两种分子似乎都有效，但PRO2668在0.2mg/kg的较低剂量下也表现出效力。

实施例16：scMATCH3和MATCH4变体PRO2667、PRO2668、PRO2669和PRO2670的生物物理特征

储存稳定性和熔融温度

对MATCH4分子进行了为期28天的稳定性研究，其中将分子以1mg/ml配制在水性缓冲液(50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液，含300mM蔗糖，pH 6.5)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存14天。通过研究过程中不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的组分。表43总结了单体含量(％)和相对于第0天的％单体损失。通过280nm UV-Vis测量监测了蛋白浓度随整个研究过程的变化，并示于表44中。通过nDSF(NanoTemper)分析了热稳定性，测定解折叠开始时间(T_onset)和解折叠中点(T_m)。T_m结果示于表43中。

所有四种MATCH4分子都表现出优异的稳定性，并且在28天孵育后没有显示出显著的单体含量损失或蛋白质含量损失。在SE-HPLC/UV测量之前，在-80℃和4℃的温度下以及在对第28/-80℃的样品进行反复冻融(5x)后，单体含量没有显著变化，在40℃下储存28天后，单体含量仅有少量损失。

表43：浓度为1mg/ml的MATCH4稳定性评估，单体含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

NA：未测量

表44：浓度为1mg/ml的MATCH4稳定性评估，蛋白质含量随时间的变化。

*在测量之前，样品经受5次重复的冷冻/融化循环

NA：未测量

序列表

<110> 努玛治疗有限公司(Numab Therapeutics AG)

<120> 对ROR1和CD3具有特异性的多特异性抗体

<130> 117181P877PC

<150> EP21154786.4

<151> 2021-02-02

<150> PCT/EP2021/087618

<151> 2021-12-23

<160> 122

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 1

Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Ala Val Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 2

Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 3

Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Leu

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 4

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 5

Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 6

Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ile Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 7

Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 8

Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 9

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Ile Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 10

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 10

Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 11

Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr Thr Tyr Phe Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 12

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Ile Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 13

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Asn Ala Met Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 14

Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asn Ala Met Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 15

Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 16

Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe

1 5 10

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 17

Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 18

Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 19

Ala Gly Gly Phe Ser Gly Glu Ile Arg Ala

1 5 10

<210> 20

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 20

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val

85 90 95

Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 21

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val

85 90 95

Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 22

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

85 90 95

Glu Ile Arg Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 23

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 23

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val

85 90 95

Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 24

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val

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Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 25

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

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Glu Ile Arg Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 26

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Leu Asp Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val Arg Gly

85 90 95

Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 27

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

85 90 95

Glu Ile Arg Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 28

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 28

Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Leu Asp Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val Arg Gly

85 90 95

Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 29

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

85 90 95

Glu Ile Arg Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 30

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 31

Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 32

Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile

1 5 10

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 33

Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 34

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 35

Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val

1 5 10

<210> 36

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys

85 90 95

Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val

100 105 110

Leu Gly

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 39

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala Met Gly

1 5 10

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 40

Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 41

Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu

1 5 10

<210> 42

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 42

Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn Asn Gln Leu Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 43

Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser

1 5

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 44

Ala Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 46

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn

20 25 30

Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 47

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn

20 25 30

Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 49

Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys

1 5 10

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 50

Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 51

Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu

1 5 10

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 52

Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala

1 5 10

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 53

Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 54

Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 56

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 56

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg

20 25 30

Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn

85 90 95

Phe Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 58

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg

20 25 30

Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn

85 90 95

Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 59

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 60

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 60

His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 61

Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 62

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 63

Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser

1 5

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 64

Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr

1 5 10

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 67

Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 68

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 70

Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 71

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn

20 25 30

Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn

50 55 60

Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 72

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn

20 25 30

Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 73

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn

20 25 30

Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 74

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Tyr Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln

65 70 75 80

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Asp Ala Val Tyr Gly Tyr Ala Asn Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 75

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Val

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly

85 90 95

Asp Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 76

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 76

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 77

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 78

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 78

Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly

1 5 10

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 79

Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 80

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 81

Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 82

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 82

Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu Gly

1 5 10

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 83

Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 84

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 84

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 85

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 86

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 86

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 87

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<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

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<220>

<223> 基于人工抗体的序列

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<212> PRT

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<223> 基于人工抗体的序列

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<210> 104

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 104

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<210> 105

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 105

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Glu Ile Arg Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

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275 280 285

Asn Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

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Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg

305 310 315 320

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

325 330 335

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly

340 345 350

Ser Ser Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

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Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

275 280 285

Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg

290 295 300

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser

305 310 315 320

Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

325 330 335

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

340 345 350

Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly

355 360 365

Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val

385 390 395 400

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

405 410 415

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met

420 425 430

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly His

435 440 445

Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg

450 455 460

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

465 470 475 480

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly

485 490 495

Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr

500 505 510

Gln Val Thr Val Ser Ser

515

<210> 113

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 113

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Ile Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp

145 150 155 160

Leu Ser Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala

180 185 190

Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Phe Glu Leu Thr Gln

260 265 270

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

275 280 285

Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

290 295 300

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu

305 310 315 320

Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

325 330 335

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

340 345 350

Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly

355 360 365

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln

370 375 380

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

385 390 395 400

Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu

405 410 415

Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

420 425 430

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

435 440 445

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

450 455 460

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala

465 470 475 480

Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

485 490 495

<210> 114

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 114

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

85 90 95

Glu Ile Arg Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln

130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu

145 150 155 160

Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Ile Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

180 185 190

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr

195 200 205

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

210 215 220

Phe Cys Val Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Gln Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu

275 280 285

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

290 295 300

Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser

305 310 315 320

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

325 330 335

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

340 345 350

Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp

355 360 365

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

405 410 415

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

420 425 430

Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala

435 440 445

Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

450 455 460

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

465 470 475 480

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly

485 490 495

Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

500 505 510

<210> 115

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 115

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Ile Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp

145 150 155 160

Leu Ser Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala

180 185 190

Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Leu Tyr Thr

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Phe Glu Leu Thr Gln

260 265 270

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

275 280 285

Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

290 295 300

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu

305 310 315 320

Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

325 330 335

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

340 345 350

Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly

355 360 365

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln

370 375 380

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

385 390 395 400

Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu

405 410 415

Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

420 425 430

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

435 440 445

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

450 455 460

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala

465 470 475 480

Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

485 490 495

<210> 116

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<400> 116

Ala Gln Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Trp Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Val Thr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Gly

85 90 95

Glu Ile Arg Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln

130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu

145 150 155 160

Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Ile Gly Ile Ile Leu Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

180 185 190

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Leu Asp

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

210 215 220

Val Arg Gly Ile Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ser Phe Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly

260 265 270

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser

275 280 285

Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp

290 295 300

Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

325 330 335

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

340 345 350

Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg

385 390 395 400

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

405 410 415

Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

420 425 430

Cys Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr

435 440 445

Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

450 455 460

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

465 470 475 480

Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe

485 490 495

Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

500 505

<210> 117

<211> 406

<212> PRT

<213> 智人

<400> 117

Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Ala Gln Glu Thr

20 25 30

Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile

35 40 45

Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met

50 55 60

Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu His Cys Lys

65 70 75 80

Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys Asn Asp Ala

85 90 95

Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser Thr Ile Tyr

100 105 110

Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp Thr Gly Tyr

115 120 125

Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser Ser Thr Gly

130 135 140

Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser Pro Gly Tyr

145 150 155 160

Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr Arg Gly Ile

165 170 175

Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu

180 185 190

His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala Phe Thr Met

195 200 205

Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln Phe Ala Ile

210 215 220

Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser

225 230 235 240

Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Ile Leu Glu

245 250 255

Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met

260 265 270

Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gln Pro

275 280 285

Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile Pro Met Ala

290 295 300

Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr Gly Val Asp

305 310 315 320

Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln Cys Gln Pro

325 330 335

Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala Leu Arg Phe

340 345 350

Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro Gly Asn Gln

355 360 365

Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe Lys Ser Asp

370 375 380

Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys Glu Lys Asn

385 390 395 400

Lys Met Glu Ile Leu Tyr

405

<210> 118

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<220>

<221> 重复

<222> (1)..(5)

<223> n重复，其中n是至少为1的整数

<400> 118

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 119

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<220>

<221> 重复

<222> (1)..(5)

<223> n重复，其中n是至少为1的整数

<400> 119

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<220>

<221> 重复

<222> (1)..(4)

<223> n重复，其中n是至少为1的整数

<400> 120

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<220>

<221> 重复

<222> (1)..(5)

<223> n重复，其中n是1或2

<400> 121

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 122

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于人工抗体的序列

<220>

<221> 重复

<222> (1)..(5)

<223> n重复，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8

<400> 122

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种多特异性抗体，其包含：

b)一个特异性结合CD3的结合结构域(CD3-BD)；

其中

-所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区；

SEQ ID NO:1的HCDR1序列，

SEQ ID NO:2的HCDR2序列，

SEQ ID NO:3的HCDR3序列，

SEQ ID NO:4的LCDR1序列，

SEQ ID NO:5的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:6的LCDR3序列；

和/或由以下组成的一组：

SEQ ID NO:13或14的HCDR1序列，

SEQ ID NO:15的HCDR2序列，

SEQ ID NO:16的HCDR3序列，

SEQ ID NO:17的LCDR1序列，

SEQ ID NO:18的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:19的LCDR3序列；

-所述CD3-BD包含一组CDR序列，由以下组成：

SEQ ID NO:30的HCDR1序列，

SEQ ID NO:31的HCDR2序列，

SEQ ID NO:32的HCDR3序列，

SEQ ID NO:33的LCDR1序列，

SEQ ID NO:34的LCDR2序列，和

SEQ ID NO:35的LCDR3序列。

2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中在所述多特异性抗体包含两个ROR1-BD的情况下，所述两个ROR1-BD包含相同的CDR组，即两个ROR1-BD包含SEQ ID NO:1至6的CDR或SEQ ID NO:13/14至19的CDR。

3.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中所述抗体还包含一个特异性结合人血清白蛋白的结合结构域(hSA-BD)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体具有下列特征1)至5)中的一种或多种：

1)所述多特异性抗体不包含CH1和/或CL区；

2)所述一个或两个ROR1-BD、所述CDR-BD和所述hSA-BD(如果存在)包含VH1a、VH1b、VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；

特别是VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4；或者

所述一个或两个ROR1-BD、所述CDR-BD和所述hSA-BD(如果存在)包含VH结构域，所述VH结构域包含：VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其选自VH框架亚型，特别是选自VH框架亚型VH1a、VH1b、VH3和VH4，特别是选自VH框架亚型VH3和VH4，特别是为VH3亚型；其中所述VH框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有以下取代(AHo编号)：氨基酸位置12处的精氨酸(R)；氨基酸位置103处的苏氨酸(T)和氨基酸位置144处的谷氨酰胺(Q)；

3)所述一个或两个ROR1-BD、所述CDR-BD和所述hSA-BD(如果存在)包含VL结构域，所述VL结构域包含VL框架区FR1、FR2和FR3，它们选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是Vκ1亚型；以及VL框架FR4，所述VL框架FR4是VλFR4，特别是包含与SEQ ID NO:76至SEQ IDNO:83中的任意一个具有至少70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，更特别地，是选自SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:83中的任意一个的VλFR4，特别是根据SEQ ID NO:76或83的VλFR4；

4)所述多特异性抗体是人源化的，特别地所述多特异性抗体是人源化的并且包含兔来源的CDR；

5)所述多特异性抗体是三特异性的，特别是三特异性且三价的或三特异性且四价的。

5.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体的形式选自scDb-scFv、scMATCH3、MATCH3和MATCH4。

6.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

或

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:22、25、27和29的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同，

或

7.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

b)SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

c)SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:22的VL；或

d)SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

e)SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

f)SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

g)SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:22的VL序列；或

h)SEQ ID NO:24的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

i)SEQ ID NO:26的VH序列和SEQ ID NO:27的VL序列；或

j)SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:29的VL序列；

特别是，其中所述一个或两个ROR1-BD包含：

a)SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

b)SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

c)SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:25的VL；或

d)SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:9的VL序列；或

e)SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列；或

f)SEQ ID NO:24的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述CD3-BD包含：

b)VL序列，其与选自SEQ ID NO:38的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同；

特别是，

a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列，和

b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。

9.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中所述hSA-BD包含

(i)VH结构域，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者

(ii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者

(iii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或者

(iv)VH结构域，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者

(v)VH结构域，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；或者

(vi)VH结构域，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；或者

(vii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；

(viii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；或者

特别是，

(v)VH结构域，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；或者

(viii)VH结构域，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，和VL结构域，

其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。

10.权利要求1、4、6和7中任一项所定义的ROR1-BD。

11.一种核酸或两种核酸，其编码权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体或权利要求10所述的ROR1-BD。

12.一种载体或两种载体，其包含权利要求11所述的一种核酸或所述两种核酸。

13.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含权利要求12所述的一种载体或所述两种载体。

14.一种药物组合物其包含权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。

15.权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述的药物组合物，其用于治疗表达ROR1的癌症，特别是选自以下的表达ROR1的癌症：慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、里克特综合征、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤和肾癌。