CN116848134A - 对il-4r和il-31具有特异性的多特异性抗体 - Google Patents

对il-4r和il-31具有特异性的多特异性抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合IL‑4R的结合结构域(IL4R‑BD)，和一个或两个特异性结合IL‑31的结合结构域(IL31‑BD)，其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，以及生产所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。

Description

对IL-4R和IL-31具有特异性的多特异性抗体
技术领域
本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，以及生产所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。
背景技术
白细胞介素-4受体IL-4Rα，本文也称为IL-4R或IL4R，是一种I型受体。它在与普通细胞因子受体γ链(γc)直接相互作用后或通过与II型受体，如特别是与II型受体IL-13Rα1形成受体复合物来结合白介素4(IL-4)。这种IL-4R/IL-13Rα1受体复合物可以结合白细胞介素4(IL-4)以及白细胞介素13(IL-13)来调节B细胞中IgE抗体的产生。还已知，IL-4与IL-4R结合可激活巨噬细胞并促进2型辅助T细胞(Th2细胞)的分化，从而导致Th2驱动的炎症。IL-4和/或IL-13与IL-4Rα/γc和/或IL-4R/IL-13Rα1结合，导致Janus激酶(JAK)1、JAK2、信号转导和转录激活因子(STAT)1、STAT3、STAT6的激活和STAT二聚化，进而诱导特定基因的转录。
IL-4R信号传导已被证明与一些人类疾病有关，如炎症性和自身免疫性疾病，包括特应性皮炎、结节性皮肤病、鼻息肉、慢性荨麻疹、哮喘和慢性阻塞性肺病。
现有技术中已经描述了多种单克隆抗体，它们通过结合细胞因子IL-4和/或IL-13或与IL-4R结合来减少或阻断IL4R介导的信号传导，用于治疗此类疾病。例如，RegeneronPharmaceuticals和Sanofi Genzyme开发的度普利尤单抗(dupilumab)其结合并拮抗IL-4R，已批准用于治疗中度至重度特应性皮炎和治疗慢性鼻炎与鼻息肉病(CRSwNP)。它还被进一步评估用于治疗成人和青少年的持续性哮喘。
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，其特点是强烈的瘙痒(例如，严重的瘙痒)和鳞屑性和干燥的湿疹性皮损。严重的疾病可因重大的心理问题、严重的睡眠损失和生活质量的损害而造成极大的残疾，导致高社会经济成本。AD常在5岁前的儿童期开始，可能持续到成年。
AD的病理生理学受免疫球蛋白E(IgE)介导的致敏、免疫系统和环境因素之间复杂的相互作用影响。原发性皮肤缺损可能是一种免疫紊乱，导致IgE介导的过敏反应，并伴有上皮屏障功能障碍，这是基因突变和局部炎症的结果。
AD的典型治疗方法包括外用洗剂和保湿剂、外用皮质类固醇软膏、药膏或注射剂。然而，大多数治疗方案只能暂时、不完全地缓解症状。此外，许多中重度AD患者会对外用皮质类固醇激素或钙调磷酸酶抑制剂产生抗药性。因此，治疗和/或预防AD的更具针对性的疗法应运而生，如拮抗IL4R功能的单克隆抗IL4R抗体。
例如，WO 2014/039461描述了用于治疗特应性皮炎的抗IL4R拮抗性抗体。
此外，如上所述，抗IL-4R单克隆抗体度普利尤单抗在2017年获得了美国食品药品监督管理局的批准用于中度至重度特应性皮炎，在2018年获得批准用于哮喘。
然而，抗IL-4R疗法具有显著的局限性。例如，它们对目标特应性疾病的功效通常是有限的，并且应答率通常较低至中等。此外，抗IL-4R疗法不能直接解决瘙痒问题。然而，瘙痒是皮肤相关炎症和自身免疫性疾病的常见症状，例如AD。与瘙痒相关的抓挠通常会促进炎症和疾病相关症状的恶化。因此，中重度特应性皮炎和其他致痒炎症及自身免疫性疾病患者亟需更多的治疗方案。
更具体地说，显然需要新型和改良的治疗性抗体，其能够更有效地减少或消除上述过敏性、炎症性和自身免疫性疾病中IL-4和/或IL-13介导的信号活动，同时还能解决与这些疾病相关的瘙痒症状(瘙痒)。
上述治疗性抗体应具有高效力和可耐受的安全性，以将剂量限制性副作用保持在较低水平。这一点对于治疗慢性疾病尤为重要，因为慢性疾病通常需要长期使用所述治疗性抗体。此外，所述治疗性抗体最好具有优异的生物物理特性，例如高稳定性，以便于开发和高产量生产。特别是，它们在高浓度下应具有良好的储存稳定性，以便制备用于皮下注射的高浓度制剂。皮下注射是非常理想的，也是病人能够自行用药的必要前提。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改善过敏性、炎性和自身免疫性疾病的治疗的药物，特别是为引起瘙痒的炎性和自身免疫性疾病，如中度至重度特应性皮炎，提供一种新的、更优越的治疗方式。更具体地，本发明的一个目的是提供新型的改进的治疗性抗体，其能够有效降低或消除所述疾病中IL-4和IL-13介导的活性，并且还能够解决与这些疾病相关的瘙痒症状。本发明的另一个目的是，所述新型的改进的治疗性抗体在蛋白浓度超过100mg/ml时表现出高稳定性，以使其能够通过皮下注射应用。
本发明人现已惊奇地发现，包含一个或两个IL-4R拮抗结合结构域(IL4R-BD)和一个或两个IL-31中和结合结构域(IL31-BD)的多特异性抗体能够以高效的方式同时阻断IL-4-/IL-13以及IL-31诱导的信号传导，这允许同时降低IL-4/IL-13相关的症状以及瘙痒相关的IL-31活性。
本发明人通过测试许多不同的抗体形式进一步惊奇地发现，当包含功能性Fc区，特别是包含功能性Fc区的IgG区时，所述抗IL-4R×IL-31多特异性抗体可以更好地阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导，并且具有非常有利的生物物理性质，特别是突出的稳定性，这允许制备抗体浓度远高于100mg/ml的储存稳定制剂。未表现出期望的组合特性，即期望的高抑制效力和同时期望的高储存稳定性的测试形式尤其是MATCH3、scMATCH3、(scFv)2Fc(scFv)2和Morrison IgG1(静默的)。对这些多特异性抗体形式进行了深入研究。所测试的基于MATCH3和scMATCH3的多特异性抗体表现出良好的稳定性，但在抑制IL-4R和IL-31介导的信号传导方面缺乏效力。所测试的基于(scFv)2Fc(scFv)2的多特异性抗体显示出提高的抑制效力，但当以高于100mg/ml的浓度储存较长时间时，仅具有中等程度的稳定性。另一方面，所测试的基于Morrison的静默IgG1多特异性抗体在高浓度下表现出优异的储存稳定性，但没有完全达到期望的抑制效力。结论是功能性Fc区，特别是功能性IgG区对于期望的抑制效力是必需的。
因此，第一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和
b)一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，
其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区，特别是IgG区。
第二方面，本发明涉及一种核酸或两种核酸，其编码本发明的多特异性抗体。
第三方面，本发明涉及一种载体或两种载体，其包含本发明的所述一种核酸或所述两种核酸。
第四方面，本发明涉及一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含本发明的所述一种载体或所述两种载体。
第五方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体的方法，包括(i)提供本发明的一种核酸或两种核酸，或本发明的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或所述两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达体系中收集所述多特异性抗体，或(ii)提供本发明的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体。
第六方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
第七方面，本发明涉及用作药物的本发明的多特异性抗体。
第八方面，本发明涉及本发明的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病。
第九方面，本发明涉及一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病的方法，包括以下步骤：向有需要的患者施用本发明的多特异性抗体。
分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：
1.一种多特异性抗体，其包含：
a)一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，特别是两个相同的IL4R-BD，和
b)一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，特别是两个相同的IL31-BD，
其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区，特别是功能性Fc区。
2.项目1所述的多特异性抗体，其中
-每个所述IL4R-BD包含
SEQ ID NO:1的HCDR1序列，
SEQ ID NO:2的HCDR2序列，
SEQ ID NO:3的HCDR3序列，
SEQ ID NO:7的LCDR1序列，
SEQ ID NO:8的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:9的LCDR3序列，且
-每个所述IL31-BD包含
SEQ ID NO:12的HCDR1序列，
SEQ ID NO:13的HCDR2序列，
SEQ ID NO:14的HCDR3序列，
SEQ ID NO:17或18的LCDR1序列，
SEQ ID NO:19的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:20的LCDR3序列。
3.项目1或2所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自：(scFv)2-Fc-(scFv)2融合体(ADAPTIR)；DVD-Ig；DARTTM和TRIDENTTM。
4.项目1或2所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含IgG区。
5.项目4所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自二价双特异性IgG形式、三价双特异性IgG形式和四价双特异性IgG形式；
特别地，其中所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG；DVD-Ig；IgG-scFv融合体，例如CODV-IgG、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison L))、bsAb(scFv连接到轻链的C末端)、Bs1Ab(scFv连接到轻链的N末端)、Bs2Ab(scFv连接到重链的N末端)、Bs3Ab(scFv连接到重链的C末端)、Ts1Ab(scFv连接到重链和轻链的N末端)和Ts2Ab(dsscFv连接到重链的C末端)；
更特别地，其中所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))，甚至更特别地选自DVD-Ig和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))。
6.项目5所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自Morrison形式。
7.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含两个IL4R-BD。
8.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含两个IL31-BD。
9.根据项1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：
a)两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和
b)两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，
其中所述多特异性抗体包含IgG区，特别地，其中所述多特异性抗体的形式选自Morrison形式；
且其中
-每个所述IL4R-BD包含
SEQ ID NO:1的HCDR1序列，
SEQ ID NO:2的HCDR2序列，
SEQ ID NO:3的HCDR3序列，
SEQ ID NO:7的LCDR1序列，
SEQ ID NO:8的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:9的LCDR3序列，且
-每个所述IL31-BD包含
SEQ ID NO:12的HCDR1序列，
SEQ ID NO:13的HCDR2序列，
SEQ ID NO:14的HCDR3序列，
SEQ ID NO:17或18的LCDR1序列，
SEQ ID NO:19的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:20的LCDR3序列。
10.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体充当IL4R的拮抗剂。
11.根据项10所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体阻断IL4和IL13与IL4R的结合。
12.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体阻断IL-31与白细胞介素31受体α(IL-31RA)/制瘤素M受体(OSMR)复合物(IL-31RA/OSMR复合物)的结合。
13.项目1至12中任一项所述的多特异性抗体，其中当在pH 5.5的20mM乙酸盐缓冲液中配制时，所述多特异性抗体具有至少100mg/ml，特别是至少120mg/ml的溶解度。
14.项目1至12中任一项所述的多特异性抗体，其中当在pH 5.5的20mM乙酸盐缓冲液中配制时，所述多特异性抗体可浓缩至100mg/ml及以上，特别是100-200mg/ml，特别是100-150mg/ml，单体含量损失小于2％，特别是小于1％，如通过SE-色谱法所测定的。
15.项目1至12中任一项所述的多特异性抗体，其中当配制在pH 5.5的20mM乙酸盐缓冲液中时，所述多特异性抗体在100mg/ml及以上的浓度时，特别是在100-150mg/ml范围的浓度时，具有至少95％，特别是至少97％的单体含量。
16.项目1至12所述的多特异性抗体，其中当所述多特异性抗体的起始浓度为100mg/ml时，在4℃储存四周后，所述多特异性抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，特别是其中所述多特异性抗体在pH 5.5的20mM乙酸盐缓冲液中配制。
17.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中与未处理的BEAS-2B细胞的CCL2分泌量相比，在1μg/ml所述多特异性抗体存在下，用1ng/ml IL-4和10ng/ml IL-31处理的BEAS-2B细胞的CCL2分泌量减少或仅增加1.00至1.50倍，特别是1.00至1.4倍，特别是1.00至1.30倍，特别是1.00至1.20倍。
18.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫球蛋白Fc区选自IgG亚类，特别是IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
19.项目6所述的多特异性抗体，其中IL4R-BD位于Fab臂中，并且IL31-BD位于Morrison形式的scFv部分中。
20.项目6和19中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自Morrison-L和Morrison-H形式，特别是其中所述形式是Morrison-H形式。
21.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
b.与食蟹猴(Macaca fascicularis(Cynomolgus))IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合，KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
c.与普通狨猴(Callithrix jacchus)IL-4R交叉反应，特别是与普通狨猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
d.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的，其中所述IL4R-BD是scFv形式；
e.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的，其中所述IL4R-BD是scFv形式；
f.抑制人IL-4与人IL-4R的结合，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2ng/ml，如在竞争性ELISA中所测量的，其中所述IL4R-BD是scFv形式；
g.当为scFv形式时，通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％；和/或
i.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在5次冻融循环后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，优选小于2％。
22.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD包括VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4。
23.项目23中任一项所述的多特异性抗体，其中当处于scFv-形式时，所述IL4R-BD包含
(i)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包括框架区FR1、FR2和FR3，它们选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是Vκ1亚型，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33的VλFR4序列具有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，更特别地，选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33的VλFR4，特别是根据SEQ ID NO:26或33的VλFR4。
24.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD包含
a)与选自SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和
b)与选自SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列。
25.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD包括
a)选自SEQ ID NO:4、5和6的VH序列，
b)选自SEQ ID NO:10和11的VL序列。
26.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD包括
a)SEQ ID NO:4的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列；或
b)SEQ ID NO:5的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列；或
c)SEQ ID NO:6的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列。
27.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL31-BD：
a.结合人IL-31，单价解离常数(KD)为5nM或更低，特别是单价KD为5pM至5nM，特别是为5pM至2nM，特别是为5至1000pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述IL31-BD是在scFv中；
b.与食蟹猴IL-31交叉反应，特别是与食蟹猴IL-31结合的单价KD为5nM或更低，特别是单价KD为5pM至5nM，特别是为5pM至2nM，特别是为5至1000pM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL31-BD是在scFv中；
c.抑制人IL-31诱导的信号传导，IC50为0.1至30ng/ml，特别是IC50为0.1至20ng/ml，特别是IC50为0.1至10ng/ml，如在Path HunterIL-31RA/OSMRb二聚化试验中测量的，其中所述IL31-BD为scFv形式；
d.阻断人IL-31与人IL-31R的结合，IC50为0.1至20ng/ml，特别是IC50为0.1至10ng/ml，特别是IC50为0.2至6ng/ml，如在竞争ELISA中测量的，其中所述IL31-BD为scFv形式；
e.当为scFv形式时，通过差示扫描荧光分析法测定的熔化温度(Tm)为至少65℃、优选至少67℃、更优选至少69℃，特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
f.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在4℃储存至少4周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
g.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在40℃储存四周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在3次冻融循环后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％；和/或
i.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在4℃或40℃储存4周后，蛋白质含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中。
28.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL31-BD包含VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4。
29.根据项28所述的多特异性抗体，其中当处于scFv-形式时，所述IL31-BD包含
(i)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包括框架区FR1、FR2和FR3，它们选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是Vκ1亚型，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33的VλFR4序列具有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，更特别地，选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33的VλFR4，特别是根据SEQ ID NO:26或33的VλFR4。
30.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL31-BD包含
a)与选自SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和
b)与选自SEQ ID NO:21和22的氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列。
31.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL31-BD包含
a)选自SEQ ID NO:15和16的VH序列，特别是SEQ ID NO:16的VH序列；和
b)选自SEQ ID NO:21和22的VL序列，特别是SEQ ID NO:21的VL序列。
32.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD中的至少一个和/或所述IL31-BD中的至少一个包含来自亲本兔抗体的CDR区。
33.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中至少一个IL4R-BD和至少一个IL31-BD能够同时结合它们各自的抗原。
34.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为1000pM或更低，特别是KD为1至1000pM，特别是为1至700pM，特别是为1至500pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是结合食蟹猴IL-4R，单价KD为小于50nM，特别是小于20nM，特别是单价KD为1pM至5nM，特别是为1pM至2nM，特别是为1至1000pM，特别是为1至500pM，如通过SPR所测量的；
c.结合人IL-31，单价KD小于5nM，特别是单价KD为5pM至5nM，特别是5pM至2nM，特别是5pM至1000pM，如SPR所测量的；
d.与食蟹猴IL-31交叉反应，特别是与食蟹猴IL-31结合的单价KD为20nM或更低，特别是单价KD为5pM至20nM，特别是为5pM至10nM，特别是为5pM至5nM，如通过SPR所测量的；
e.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.2pM至200pM，特别是IC50为0.2pM至100pM，特别是IC50为0.2pM至50pM，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
f.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.2pM至200pM，特别是IC50为0.2pM至100pM，特别是IC50为0.2pM至50pM，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
g.阻断人IL-4和人IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)的分泌，IC50为10pM至2nM，特别是IC50为10pM至1nM，如在人全血试验中所测量的；
h.与表达人IL-4R的HEK293T细胞结合，EC50为0.01至10nM，特别是EC50为0.01至7nM，特别是EC50为0.01至5nM；
i.与表达食蟹猴IL-4R的HEK293T细胞结合，EC50为0.01至10nM，特别是EC50为0.01至7nM，特别是EC50为0.01至5nM；
j.阻断人IL-31诱导的信号传导，IC50为5pM至2nM，特别是IC50为5pM至1nM，特别是IC50为5至700pM，如在Path Hunter IL-31RA/OSMRb二聚化试验中测量的；
k.阻断食蟹猴IL-31诱导的信号传导，IC50为0.05至20nM，特别是IC50为0.05至10nM，特别是IC50为0.05至5nM，如在Path HunterIL-31RA/OSMRb二聚化试验中测量的；
l.通过差示扫描荧光法测定，解链温度(Tm)为至少60℃，优选至少63℃，更优选至少66℃，特别是其中将所述多特异性抗体配制在pH 7.0的20mM MES缓冲液中；和/或
m.当所述多特异性抗体的起始浓度为100mg/ml时，储存四周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，特别是其中所述多特异性抗体在pH5.5的20mM乙酸盐缓冲液中配制。
35.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其选自具有以下重链(HC)和轻链(LC)序列的Morrison抗体:
-SEQ ID NO:38的HC序列和SEQ ID NO:37的LC序列；
-SEQ ID NO:40的HC序列和SEQ ID NO:39的LC序列；
-SEQ ID NO:42的HC序列和SEQ ID NO:41的LC序列；
-SEQ ID NO:44的HC序列和SEQ ID NO:43的LC序列；
-SEQ ID NO:46的HC序列和SEQ ID NO:45的LC序列；
-SEQ ID NO:48的HC序列和SEQ ID NO:47的LC序列；和
-SEQ ID NO:50的HC序列和SEQ ID NO:49的LC序列。
36.一种核酸或两种核酸，其编码项目1至35中任一项所述的多特异性抗体。
37.一种载体或两种载体，其包含项目36的所述一种核酸或两种核酸。
38.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含项目37的所述一种载体或所述两种载体。
39.一种生产项目1至35中任一项所述的多特异性抗体的方法，包括(i)提供项目36的一种核酸或两种核酸，或项目37的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达体系中收集所述多特异性抗体，或(ii)提供项目38的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体。
40.一种药物组合物其包含项目1至35中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
41.项目1至35中任一项所述的多特异性抗体，其用作药物。
42.项目1至35中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病。
43.项目42的用于治疗疾病的项目1至35中任一项所述的多特异性抗体，其中所述疾病选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病，特别是引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病。
44.项目42或43所述的多特异性抗体，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
45.一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病的方法，包括以下步骤：向有需要的患者施用项目1至35中任一项所述的多特异性抗体。
46.项目45所述的方法，其中所述疾病选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病，特别是引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病。
47.项目45或46所述的方法，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
48.一种治疗疾病的方法，更具体地说是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病的人类疾病；特别是选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病；
所述方法包括对有需要的患者施用：
1.第一抗体，其包含：
a)如前述项目1至26和32至35中任一项所定义的IL4R-BD，和
b)Fc区，特别是IgG区，特别是IgG4区；和
2.第二抗体，其包含如前述项目1至20和27至35中任一项所定义的IL31-BD。
49.项目48所述的方法，其中进行施用，使得所述第一抗体和所述第二抗体在有需要的患者的血浆中同时达到有效剂量水平。
50.项目48或49所述的方法，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
51.一种试剂盒，其包含：
1.第一抗体，其包含：
a)如前述项目1至26和32至35中任一项所定义的IL4R-BD，和
b)Fc区，特别是IgG区，特别是IgG4区；和
2.第二抗体，其包含如前述项目1至20和27至35中任一项所定义的IL31-BD。
52.项目40所述的药物组合物，其中所述药物组合物是用于人类疾病的治疗剂，所述人类疾病选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病。
53.项目52所述的药物组合物，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
附图说明
图1显示了与dupilumab和BMS-981164的组合相比，Morrison-H分子PRO2198和PRO2199在BEAS-2B试验中抑制IL-4R和IL-31诱导的信号传导的效力。与dupilumab和BMS-981164的组合相比，PRO2198和PRO2199显示出相似的抑制IL-4R和IL-31诱导的信号传导的能力(A)。通过单独添加dupilumab或BMS-981164单独阻断IL-4R或IL-31没有联合阻断IL-4R和IL-31诱导的信号传导有效(B)。
图2显示了IgG4 Morrison-H形式(左)和Morrison-L形式(右)的示意图，标记了子结构域命名。连接Fv结构域(浅灰色)的接头序列由不同重复的(G4S)模块组成(恒定区和scFv结构域之间的两个模块和VL2和VH2之间的4个模块)。
图3显示了在HEK-Blue细胞中在stat-6报告基因试验中，优化的抗IL-4RscFvPRO1898和PRO1899阻断人IL-4诱导的信号传导(A)和人IL-13诱导的信号传导(B)的效力。所分析的分子的效力与dupilumab进行比较。
图4显示了优化的抗IL-4R scFv PRO1898(A)和PRO1899(B)抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的效力，通过竞争性ELISA评估。
图5显示Morrison抗体PRO2198与人IL-4R/人IL-31和食蟹猴IL-4R/食蟹猴IL-31的伴随结合。上图：实验设计的示意图；下图：显示PRO2198与人IL-4R/人IL-31(深灰色)和食蟹猴IL-4R/食蟹猴IL-31(浅灰色)伴随结合的传感图。
图6显示了在转染的HEK293T细胞上Morrison-H(MorrH)和Morrison-L(MorrH)分子PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207以及阴性对照分子PRO2077与人IL-4R(A)和食蟹猴IL-4R(B)的结合。所有分子均与人IL-4R结合(A)。没有观察到对照分子PRO2077与食蟹猴IL-4R的结合(B)。在人和食蟹猴IL-4R表达构建体的N末端融合了V5标签，使用靶向V5标签(V5标签)的抗体作为质膜结合的阳性对照。
图7显示了在stat-6报告基因试验中，Morrison-H(MorrH)和Morrison-L(MorrL)抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207中和人IL-4和人IL-13诱导的信号传导的效力。对于IL-4诱导的信号传导(A和C)和IL-13诱导的信号传导(B和D)，Morrison-H和Morrison-L抗体阻断IL-4R的效力与dupilumab相当。图5A至5D中描绘的IC50值代表单点测量。
图8显示了在stat-6报告基因试验中，在试验介质中有或没有过量IL-31的情况下，Morrison-H(MorrH)抗体PRO2198(A)和PRO2199(B)中和人IL-4诱导的信号传导的效力。在过量的IL-31存在下没有观察到效力损失。图6A和6B中描绘的IC50值代表单点测量。
图9显示了在IL-31RA/OSMR二聚化试验中，在试验介质中有或没有过量IL-4R胞外结构域的情况下，Morrison-H(MorrH)和Morrison-L(MorrL)抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207中和人IL-31诱导的信号传导的效力。Morrison抗体阻断了IL-31和IL-31RA之间的相互作用，与BMS-981164相比具有相似的效力(A和B)。在过量的IL-4R存在的情况下，没有测定效力损失(C和D)。
图10显示了在IL-31RA/OSMR二聚化试验中，Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199中和食蟹猴IL-31诱导的信号传导的效力。抗体PRO2198和PRO2199能够阻断食蟹猴IL-31和IL-31RA之间的相互作用。
图11显示了Morrison-H分子PRO2198和PRO2199以及相应的抗IL-4RIgG4分子PRO2209和PRO2210(没有IL-31scFv结合结构域)阻断人PBMC中IL-4和IL-13诱导的CD23表达的效力。PRO2198和PRO2199抑制人单核细胞(A)、幼稚B细胞(B)和记忆B细胞(C)中IL-4和IL-13诱导的CD23上调，与dupilumab相比，具有相似的效力。PRO2209和PRO2210显示出与dupilumab相比相同的抑制作用。
图12显示了在还原和非还原条件下PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207的SDS-Page分析。
图13显示了通过SDS-PAGE进行的剪切分析。1st泳道:Marker–2nd:pH 3.5,t0–3rd:pH 3.5,t10d–4th:pH 5,t0–5th:pH 5,t10d–6th:pH 7,t0d–7th:pH 7,t10d–8th:pH 8.5,t0–9th:pH 8.5,t10d。*推测，HC二聚体还原不完全。#推测，LC二聚体还原不完全。
具体实施方式
已知的治疗性抗IL-4R抗体通常缺乏疗效，并且对患者的反应率低至中等。它们也不能直接解决瘙痒，瘙痒是一种常见的症状，尤其是在与皮肤相关的炎症和自身免疫疾病中。因此，在医学领域中需要改进的基于抗IL-4R抗体的治疗方法，其对于过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是对于引起瘙痒的炎性和自身免疫性疾病，例如中度至重度特应性皮炎，具有更高的疗效，同时能够有效地减轻与疾病相关的瘙痒。
本发明提供多特异性抗体，其包含：一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。本发明的多特异性抗体可以以高效的方式同时阻断IL-4/IL-13以及IL-31诱导的信号传导。
发明人认为，免疫球蛋白Fc区提供了额外的FcyR相互作用，增强了本发明的多特异性抗体与活细胞上IL-4R的结合，从而增加了它们阻断IL-4R介导的信号传导的能力。在人类PBMC试验中对不同抗体形式的分析进一步表明，Fc区与Fcγ受体II型(FcγRII)的相互作用似乎对观察到的效力增加特别重要。因此，在本发明的上下文中，术语“功能性Fc区”是指在其天然功能范围内，能够与FcyR相互作用，特别是与FcγRII相互作用的Fc区。
根据本发明人的最佳知识，在现有技术中尚未报道同时阻断IL-4R信号传导途径和IL-31信号传导途径，更不用说通过单一分子高效地同时阻断所述途径。
白细胞介素31(IL-31)是一种炎症细胞因子，有助于触发针对病原体的细胞介导免疫。IL-31优先由Th2细胞产生。IL-31通过异二聚体受体复合物(IL-31R或IL31R)发送信号，该复合物包含在免疫和上皮细胞中表达的白细胞介素31受体α(IL-31RA或IL31RA)和制瘤素M受体β(OSMRβ)。IL-31与这种受体复合物的结合导致JAK/STAT和PI3K/AKT信号转导通路的激活，并激活不同的MAPK通路(ERK、p38和JNK)。
IL-31与各种慢性炎症疾病有关。例如，已经发现小鼠中的IL-31过表达导致皮炎样症状，参见Dillon,et al,Nature Immunol.5:752-760,(2004)。此外，在许多慢性炎性疾病中，例如在AD中，IL-31介导患者皮肤内神经纤维的激活，导致侵袭性瘙痒表型，其在患者搔抓时加剧这些疾病的症状，参见例如Oetjen et al.,Cell,171:217–228(2017)。抓挠会导致皮肤屏障破坏，微生物病原体进入皮肤，并进一步促进该部位的炎症。
此外，已发现IL-31与过敏性哮喘、过敏性鼻炎、炎性肠病、恶性肿瘤和骨质疏松症有关，参见Bagci et al.,J Allergy Clin Immunol,141(3):858-866(2018)。
通过抗IL31RA抗体，例如通过抗IL-31RA抗体nemolizumab，阻断IL-31/IL-31RA信号传导，在临床上被证明可有效减轻AD患者的瘙痒，参见Ruzicka et al.,N Engl J Med,376:2092-2093(2017)。
此外，开发了IL-31中和抗体BMS-981164以提供用于治疗慢性瘙痒性皮肤病的有效靶向疗法，参见Lewis et al,J Eur Acad of Dermatol Venereol,31(1):142-150(2017)。
除了靶向IL-4R(第一特异性)之外，决定靶向IL-31(第二特异性)而不是细胞结合的IL-31RA，以避免细胞之间任何潜在的交联，当同时靶向细胞表面上两种不同类型的受体(例如IL-4R和IL-31RA)时，这种交联很可能发生。
如上所述，本发明的多特异性抗体能够以非常有效的方式同时阻断IL-4/IL-13以及IL-31诱导的信号传导。例如，在1μg/ml的浓度下，本发明多特异性抗体的两个代表性实例PRO2198和PRO2199能够减少经1ng/ml IL-4和10ng/ml IL-31处理的BEAS-2B细胞的IL-4R和IL-3介导的CCL2的联合分泌，与抗IL-4R抗体dupilumab和抗IL-31抗体BMS-981164的等量1:1混合物相比，它们至少有类似的效果(图1B)。
趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)，也称为单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和小诱导型细胞因子A2，是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL2将单核细胞、记忆T细胞和树突细胞募集到由组织损伤或感染产生的炎症部位。CCL2与一些以单核细胞浸润为特征的疾病的病因有关，如银屑病、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化(Xia et al,Expert Opinion onTherapeutic Patents.,2009,19(3):295–303)。
本发明的一些多特异性抗体，如PRO2198，能够减少所述BEAS-2B细胞IL-4R和IL-31介导的CCL2的联合分泌，比等量的这种1:1的dupilumab和BMS-981164混合物更强，几乎达到未经处理的BEAS-2B细胞的水平(图1B)。
本文所用术语“BEAS-2B细胞”或BEAS-2B”是指来自人支气管上皮的无限增殖化非致瘤上皮细胞系的细胞。该细胞系是通过用腺病毒12-SV40杂合病毒转染并随后通过连续细胞传代使其永生化而建立的，参见Reddel et al.,Cancer Res.,48(7):1904-1909(1988)。BEAS-2B细胞已广泛用于研究肺相关疾病的细胞和分子机制，并作为肺相关毒理学研究的体外细胞模型。
此外，本发明的抗IL-4R×IL-31多特异性抗体表现出非常有利的生物物理性质，特别是在抗体浓度远高于100mg/ml时具有出色的制剂和储存稳定性。例如，当在20mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中以高于100mg/ml的浓度在4℃储存4个月时，本发明的代表性多特异性抗体PRO2198的蛋白质含量以及单体含量的损失小于1％。
因此，本发明的多特异性抗体提供了优于常规疗法的独特治疗优势。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的语境中(特别是在以下权利要求的语境中)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和
b)一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，
其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。
如本文所用，术语“抗体”等包括：完全抗体或其单链；及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，两侧是更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文所用的术语"免疫球蛋白Fc区"或"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，即重链恒定区的CH2和CH3结构域。术语“Fc区”包括天然序列Fc区和变体Fc区，即经工程改造而表现出某些所需特性的Fc区，例如改变的Fc受体结合功能和/或减少或受抑制的Fab臂交换。这种工程化Fc区的一个实例是knob-into-hole(KiH)技术(例如见Ridgway etal.,Protein Eng.9:617-21(1996)和Spiess et al.,J Biol Chem.288(37):26583-93(2013))。天然序列Fc区包括人lgG1、lgG2(lgG2A、IgG2B)、lgG3和lgG4。“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。特别地，FcR是人FcR的天然序列，其结合IgG抗体，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.5:203-234(1997))。FcR的概述见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capet et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”包括其他FcR，包括将来将要鉴定的FcR。术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn的结合的方法是已知的，参见，例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人,NatureBiotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.TJI(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。还参见，例如，Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在具体实施方案中，包含在本发明多特异性抗体中的免疫球蛋白Fc区选自IgG亚类的Fc区，特别是IgG亚类IgG1和IgG4的Fc区，特别是IgG4的Fc区。
在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含IgG区。
文使用的术语“IgG区域”是指免疫球蛋白G的重链和轻链，即如上定义的Fc区，以及由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab区。术语“IgG区”包括天然序列的IgG区，如人lgG1、lgG2(lgG2A、IgG2B)、lgG3和lgG4，以及工程改造的IgG区，其表现出某些期望的特性，例如上文针对Fc区定义的特性。本文所用的术语“功能性IgG区”是指包含功能性Fc区的IgG区。
在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体包括IgG区域，其中IgG区域选自IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
如本文所用，术语抗体的“结合结构域”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完全抗体的一个或多个片段，其保留了与给定的抗原(例如，IL4R、IL-31)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。具体来说，就本发明的多特异性抗体而言，本文所使用的术语"结合域"、"其抗原结合片段"、"抗原结合部分"以及类似术语是指Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；二硫稳定的Fv片段(dsFv)；和单链Fv片段(scFV)。优选地，本发明的抗体的结合结构域彼此独立地选自Fab片段、Fv片段、dsFv片段和单链Fv片段(scFv)。在特定的实施方案中，本发明的抗体的结合结构域彼此独立地选自Fab片段和单链Fv片段(scFv)。在其他特定实施方案中，scFv片段的VL和VH结构域通过结构域间的二硫键稳定，特别是所述VH结构域在51位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基，并且所述VL结构域在141位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基。
术语“互补决定区”(“CDR”)是指使用许多著名方案中的任何一种确定边界的氨基酸序列，这些著名方案包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteinsof Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)，以及Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号方案)描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。
在本发明的语境中，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。具体地，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中，特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力(affinity)更大、亲合力(avidity)更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及规定标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，特别是至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。
合适地，本发明的抗体也是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，仅特异性结合IL-4R和IL-31的分离的抗体基本上不含特异性结合除IL-4R和IL-31以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。合适地，本发明的抗体是单克隆抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的抗体。单克隆抗体对某个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。
本发明的抗体包括但不限于嵌合的、人的和人源化的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)是指一种抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比对人类的抗原性降低。
如本文所用，术语“人源化”抗体(或其抗原结合片段)是指保留了非人抗体的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体(或其抗原结合片段)。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及源自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如从转化为表达人源化抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)中分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体。
优选地，本发明的多特异性抗体是人源化的。更优选的是，本发明的多特异性抗体是人源化的，并包括兔衍生的CDR。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，IL-4R和IL-31)上的两个或更多个不同表位结合的抗体。优选地，本发明的多特异性抗体是双特异性的。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与至少两个不同靶标(例如，IL-4R和IL-31)上的两个不同表位结合的抗体。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“构象”表位和“线性”表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
如本文所用，术语“构象表位”是指，当多肽链折叠形成天然蛋白时，在表面上聚集在一起的抗原氨基酸残基。
术语“线性表位”是指一种表位，其中蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生(连续)。
如本文所用，术语“识别”是指发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)的抗体其抗原结合片段。
如本文所用，术语“亲合力”是指抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的信息量度。它受三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的价态；以及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素定义了抗体的特异性，即特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。
合适地，本发明的多特异性抗体包含一个或两个IL4R-BD。特别地，本发明的多特异性抗体包含两个IL4R-BD。
术语"IL-4R"特别是指UniProt ID号为P24394的人类IL-4R。合适地，本发明的IL4R-BD靶向IL-4R，特别是人IL-4R。特别地，本发明的多特异性抗体包含一个或两个靶向人和食蟹猴IL-4R的IL4R-BD。更具体地，本发明的多特异性抗体包含一个或两个靶向人、食蟹猴和普通狨猴IL-4R的IL4R-BD。
合适地，IL4R-BD的特征在于一个或多个以下参数：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合，KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
c.与普通狨猴IL-4R交叉反应，特别是与普通狨猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
d.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
e.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式；
f.抑制人IL-4与人IL-4R的结合，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2ng/ml，如在竞争性ELISA中所测量的，特别是其中所述IL4R-BD是scFv形式。
如本文所用，术语“HEK蓝细胞”或“HEK蓝”是指商业上可获得的人胚胎肾细胞，其被转染并稳定表达优化的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，该基因受NF-κB转录因子诱导的启动子控制。释放到培养基中的SEAP蛋白水平通常被用作NF-κB活化的量度。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。
“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原，或者更具体地，抗原上的表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体片段和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
本文所用的术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”或“KD”或“KD值”通过使用表面等离子体共振测定法来测量。
如第[0187]和[0188]段(scFv)和[0265]段(多特异性分子)所述，通过表面等离子体共振(SPR)测量确定对重组人IL-4R、重组食蟹猴IL-4R和重组普通狨猴IL-4R的亲和力。如第[0209]段(scFv)和[0267]段(多特异性分子)所述，通过表面等离子体共振(SPR)测量确定对重组人IL-31、重组食蟹猴IL-31和重组普通狨猴IL-31的亲和力。
合适地，本发明的多特异性抗体充当IL4R的拮抗剂。换句话说，本发明的多特异性抗体的IL4R-BD是IL-4R信号传导的抑制剂。如本文所用，术语“阻断剂”或“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制或降低与其结合的抗原的生物活性的抗体或其结合结构域。本发明的多特异性抗体的IL4R-BD与IL-4R结合，从而阻断IL-4与IL4R的结合，特别是阻断IL-4和IL-13与IL-4R的结合，从而导致IL-4R功能降低。
合适地，本发明的多特异性抗体的IL4R-BD的特征还在于一个或多个以下参数：
g.当为scFv形式时，通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％；且
i.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在5次冻融循环后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，优选小于2％。
DSF已在前面进行了描述(Egan等人,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen等人,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)。scFv构建体的热解折叠的转变中点是通过差示扫描荧光法使用荧光染料Orange确定的(参见Wong&Raleigh,ProteinScience 25(2016)1834-1840)。在pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中的样品以50μg/ml的最终蛋白质浓度制备，并且含有5x />Orange的终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约2h。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。
单体含量的损失由SE-HPLC色谱图的曲线下面积计算确定。SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如美国药典(USP)第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V0)和总渗透体积(VT)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC系统(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行，该系统配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在4-6℃。对于scFv样品的分析，使用Shodex KW403-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989202)，标准缓冲盐水流动相(50mM磷酸钠pH 6.5，300mM氯化钠)，推荐流速为0.35ml/min。每次注射的目标样品加载量为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V0至VT的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。
合适地，本发明的多特异性抗体的IL4R-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明的多特异性抗体的IL4R-BD包括但不限于人源化IL4R-BD，其序列列于表1。
合适地，本发明的多特异性抗体包含一个或两个IL31-BD。特别地，本发明的多特异性抗体包含两个IL31-BD。
术语“IL-31”或“IL31”特别是指UniProt ID号为Q6EBC2的人类IL-31。合适地，本发明的多特异性抗体的IL31-BD靶向IL-31，特别是人IL31，如UniProt ID号Q6EBC2所示。特别地，本发明的多特异性抗体包含一个或两个靶向人和食蟹猴IL-31的IL31-BD。
合适地，本发明中使用的IL31-BD的特征在于一个或多个以下参数：
a.结合人IL-31，单价解离常数(KD)为5nM或更低，特别是单价KD为5pM至5nM，特别是为5pM至2nM，特别是为5至1000pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述IL31-BD是在scFv中；
b.与食蟹猴IL-31交叉反应，特别是与食蟹猴IL-31结合的单价KD为20nM或更低，特别是单价KD为5nM或更低，特别是单价KD为5pM至5nM，特别是为5pM至2nM，特别是为5至1000pM，如通过SPR所测量的，特别是其中所述IL31-BD是在scFv中；
c.抑制人IL-31诱导的信号传导，IC50为0.1至30ng/ml，特别是IC50为0.1至20ng/ml，特别是IC50为0.1至10ng/ml，如在Path HunterIL-31RA/OSMRb二聚化试验中测量的，其中所述IL31-BD为scFv形式；和/或
d.阻断人IL-31与人IL-31R的结合，IC50为0.1至20ng/ml，特别是IC50为0.1至10ng/ml，特别是IC50为0.1至6ng/ml，如在竞争ELISA中测量的，其中所述IL31-BD为scFv形式。
合适地，本发明的多特异性抗体的IL31-BD的特征还在于一个或多个以下参数：
e.当为scFv形式时，通过差示扫描荧光分析法测定的熔化温度(Tm)为至少65℃、优选至少67℃、更优选至少69℃，特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
f.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在4℃下储存四周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
g.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在40℃下储存四周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在3次冻融循环后，单体含量损失小于5％,e.g.小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％；和/或
i.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在4℃或40℃下储存4周后，蛋白质含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述scFv配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中。
合适地，本发明的多特异性抗体的IL31-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明的多特异性抗体的IL31-BD包括但不限于人源化IL31-BD，其序列列于表2。
术语“多价抗体”是指具有不止一个价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，由于存在一个以上拷贝的相应抗原结合部分，单个结合分子可以结合靶分子上的一个以上结合位点和/或结合一个以上靶分子。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体、六价抗体等。
如本文所用，术语“单价抗体”是指与单个靶分子，更具体地说，是与靶分子上的单个表位结合的抗体。此外，本文使用的术语“结合结构域”或“单价结合结构域”是指结合靶分子上单个表位的结合结构域。
在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含一个IL4R-BD和一个IL-31-BD，即本发明的多特异性抗体对于IL-4R和IL-31特异性都是单价的。
在其他具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含一个IL4R-BD和两个IL-31-BD，即本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是单价的，对于IL-31特异性是二价的。
在其他具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两个IL4R-BD和一个IL-31-BD，即本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是二价的，对于IL-31特异性是一价的。
在优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两个IL4R-BD和两个IL-31-BD，即本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是二价的，对于IL-31特异性是二价的。
在本发明的多特异性抗体包含两个IL4R-BD的情况下，所述两个IL4R-BD结合IL-4R靶分子上的相同表位或不同表位。优选地，两个IL4R-BD结合IL-4R靶分子上的相同表位。合适地，本发明的多特异性抗体包含两个相同的IL4R-BD。
在本发明的多特异性抗体包含两个IL31-BD的情况下，所述两个IL31-BD结合IL-31靶分子上的相同表位或不同表位。优选地，两个IL31-BD结合IL-31靶分子上的相同表位。合适地，本发明的多特异性抗体包含两个相同的IL31-BD。
如本文所用，术语“相同表位”是指蛋白质上能够特异性结合一种以上抗体的单个蛋白质决定簇，其中该单个蛋白质决定簇是相同的，即由以下组成：相同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有相同的三维结构特征，以及对每种所述抗体的相同电荷特征。术语“不同的表位”，在本文中与特定的蛋白质靶标结合使用时，是指蛋白质上的单个蛋白质决定簇，每个能够与不同的抗体特异性结合，其中这些单个蛋白质决定簇对于不同的抗体来说是不相同的，即由以下组成：不同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有不同三维结构特征以及不同电荷特征的分子。这些不同的表位可以是重叠的或非重叠的。
在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和二价的。
在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和三价的。
优选地，本发明的多特异性抗体是双特异性和四价的，即对于IL-4R特异性是二价的，且对于IL-31特异性是二价的。
在一个具体方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和
b)两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，
其中
-所述多特异性抗体包含IgG区；
-每个所述IL4R-BD包含
SEQ ID NO:1的HCDR1序列，
SEQ ID NO:2的HCDR2序列，
SEQ ID NO:3的HCDR3序列，
SEQ ID NO:7的LCDR1序列，
SEQ ID NO:8的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:9的LCDR3序列，且
-每个所述IL31-BD包含
SEQ ID NO:12的HCDR1序列，
SEQ ID NO:13的HCDR2序列，
SEQ ID NO:14的HCDR3序列，
SEQ ID NO:17或18的LCDR1序列，
SEQ ID NO:19的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:20的LCDR3序列。
本发明中使用的其他可变结构域包括已突变、但仍在CDR区中与表1和2中描述的序列中描述的CDR区具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明中使用的其他可变结构域包括突变氨基酸序列，其中当与表1和2中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个。
合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域的VH结构域属于VH3或VH4家族。在一个实施方案中，本发明中使用的结合结构域包含属于VH3家族的VH结构域。在本发明的语境中，术语“属于VHx家族(或VLx家族)”是指框架序列FR1至FR3与所述VHx家族(或分别VLx家族)显示最高程度的同源性。VH和VL家族的实例在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86或在WO 2019/057787中给出。属于VH3家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:23表示，属于VH4家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:24表示。特别是，取自SEQ ID NO:23的框架区FR1至FR3属于VH3家族(表3，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH3家族的VH是一种VH，其包含与SEQ ID NO:23的FR1至FR3具有至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％序列同一性的FR1至FR3。VH3和VH4序列的其他实例，以及其他VHx序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57/-86中或WO 2019/057787中找到。
适当地，本发明中使用的结合域的VL域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4。在所述结合域为scFv形式的情况下，所述结合域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4、和VλFR4，特别是VλFR4。
合适的Vκ1框架FR1至FR3以及示例性的VλFR4在SEQ ID NO:25中给出(表3，FR区域以非粗体标记)。Vκ1序列的其他实例，以及Vκ2、Vκ3或Vκ4序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。合适的Vκ1框架FR1至FR3包含与对应于FR1至FR3并选自SEQ ID NO:25的氨基酸序列(表3，FR区以非粗体标记)具有至少70、80、90％同一性的氨基酸序列。合适的VλFR4如SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中所述，包含单个半胱氨酸残基，特别是在如下情形下：其中第二个单个半胱氨酸存在于相应的VH链中，特别是VH的51位(AHo编号)，用于形成结构域间二硫键。在一个实施方案中，当处于scFv形式时，本发明的多特异性抗体的结合域的VL结构包括VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ IDNO:26至SEQ ID NO:33中任意的氨基酸序列，特别是与SEQ ID NO:26或33具有至少70、80、90％同一性的氨基酸序列。
本发明的多特异性抗体的结合结构域包括表1和2中所列的VH结构域。合适地，本发明中使用的结合结构域包含表1和2之一中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过20个。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1和2之一中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过15个，特别是不超过10个，特别是不超过5个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VH区中与表1和2中的一个中描述的相应序列中描述的VH区具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1和2所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位的VH结构域。
特别地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包括表1和2之一中所列的VL结构域。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1和2之一中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域包含表1和2之一中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(即，不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过15个，特别是不超过10个，特别是不超过5个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VL区中与表1和2中描述的序列中描述的VL区具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1和2所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位的VL结构域。
在本发明的语境中，术语“本发明中使用的结合结构域”涉及结合结构域本身，即独立于多特异性语境，还特别涉及包含在多特异性构建体中的结合结构域，例如包含在双特异性、三特异性或四特异性构建体中的结合结构域之一。
适当地，本发明的多特异性抗体的结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fv、dsFv和scFv。
合适地，本发明的多特异性抗体的结合结构域可操作地连接。本发明的多特异性抗体的结合结构域能够同时结合它们各自的抗原或受体。本文中使用的术语“同时”是指IL4R-BD中的至少一个与IL31-BD中的至少一个的同时结合。
本发明的多特异性抗体包含一个或两个IL4R-BD和一个或两个IL31-BD，其中所述一个或两个IL4R-BD和所述一个或两个IL31-BD彼此可操作地连接。
本文使用的术语“可操作地连接”表示两个分子(例如，多肽、结构域、结合结构域)以每个分子保留功能活性的方式连接。无论两个分子是直接连接还是间接连接(例如，通过接头，通过部分，通过接头连接到部分)，它们都可以是“可操作地连接”。术语“接头”是指任选地位于本发明中使用的结合结构域或抗体片段之间的肽或其他部分。可以使用多种策略将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-末端和C-末端之间的多肽连接，通过二硫键的连接，以及通过化学交联剂的连接。在该实施方案的一方面，接头是通过重组技术或肽合成产生的肽键。对于要连接两条多肽链的特定情况，选择合适的接头取决于各种参数，包括但不限于两条多肽链的性质(例如，它们是否天然寡聚)、要连接的N-末端和C-末端之间的距离(如果知道)和/或接头对蛋白水解和氧化的稳定性。此外，接头可以包含提供柔韧性的氨基酸残基。
在本发明的语境中，术语“多肽接头”是指连接两个结构域的通过肽键连接的由氨基酸残基链组成的接头，每个结构域与接头的一端连接。多肽接头的长度应足以连接两个分子，以使它们彼此之间具有正确的构象，从而保持所需的活性。在特定的实施方案中，多肽接头具有2至30个氨基酸残基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基)的连续链。此外，选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应表现出不会显著干扰多肽活性的特性。因此，整体上接头肽不应表现出与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一种或多种单体中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重阻碍受体单体结构域的结合。在特定的实施方案中，多肽接头是非结构化的多肽。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸或GS接头。如本领域技术人员将理解的，“Gly-Ser”或“GS”接头是指串联的甘氨酸和丝氨酸的聚合物(包括例如(Gly-Ser)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头，例如用于shaker钾离子通道的系链，以及多种其他柔性肽接头。甘氨酸-丝氨酸聚合物是优选的，因为包含这些氨基酸的寡肽是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链。其次，丝氨酸是亲水的，因此能够溶解可能是球状甘氨酸链的物质。第三，已显示相似的链可有效连接重组蛋白(如单链抗体)的亚基。
在一组实施方案中，本发明的多特异性抗体是选自以下的形式：(scFv)2-Fc-(scFv)2融合体(ADAPTIR)；DVD-Ig；DARTTM和TRIDENTTM。术语"DARTTM"是指由MacroGenics公司开发的一种抗体形式，它包括一个免疫球蛋白Fc区多肽和一个或两个双特异性Fv结合域与Fc区一个重链的N端或Fc区两个重链的N端相融合。术语"TRIDENTTM"是指由MacroGenics公司开发的一种抗体形式，它包括一个免疫球蛋白Fc区多肽、一个双特异性Fv结合域和一个Fab片段。双特异性Fv结合域和Fab片段都与Fc区多肽的两条重链的各自N端融合。
在另一组实施方案中，本发明的多特异性抗体的形式选自二价双特异性IgG形式、三价双特异性IgG形式和四价双特异性IgG形式。特别地，所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG，例如DuoBodies(由Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)；DVD-Ig；IgG-scFv融合体，例如CODV-IgG、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison H)或IgG CL-scFv融合体(MorrisonL))、bsAb(scFv连接到轻链的C末端)、Bs1Ab(scFv连接到轻链的N末端)、Bs2Ab(scFv连接到重链的N末端)、Bs3Ab(scFv连接到重链的C末端)、Ts1Ab(scFv连接到重链和轻链的N末端)和Ts2Ab(dsscFv连接到重链的C末端)。更特别地，所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG，如DuoBodies；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgGCL-scFv融合体(Morrison-L))，甚至更特别地选自DVD-Ig和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))。
在本发明的特定实施方案中，所述多特异性抗体的形式选自Morrison形式，即Morrison-L和Morrison-H形式。本发明中使用的Morrison-L和Morrison-H形式是带有IgGFc区，特别是IgG4 Fc区的四价和双特异性分子形式。两个高度稳定的scFv结合结构域，其中轻链包含VκFR1至FR3，结合VλFR4(λ加帽)，本文也称为λ加帽scFv，通过接头L1融合到重链(Morrison-H)或轻链(Morrison-L)C末端(见图2)。
接头L1是2-30个氨基酸，更特别是5-25个氨基酸，最特别是10-20个氨基酸的肽。在特定实施方案中，所述接头L1包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5，特别是n＝2。
在本发明的一个具体实施方案中，多特异性抗体具有如上定义的Morrison-L形式。在本发明的另一个具体实施方案中，多特异性抗体具有如上定义的Morrison-H形式。
本发明的多特异性抗体的scFv结构域包含一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链结构域(VL)，通过连接体L2连接。
接头L2是10-40个氨基酸，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，特别是n＝4。
本发明的多特异性抗体的具体但非限制性的实施例是Morrison-L抗体PRO2206、PRO2207、PRO2208和Morrison-H抗体PRO2198、PRO2199、PRO2200、PRO2201，其序列列于表4。
本发明的多特异性抗体可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于生产包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,MethodsEnzymol.121(1986)210-228)。
这些方法通常涉及单克隆抗体的产生，例如通过将骨髓瘤细胞与小鼠的脾细胞融合，该小鼠已经用杂交瘤技术用所需抗原免疫(参见，例如，Yokoyama等人,Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2,Unit 2.5,2006)或通过重组抗体工程技术(库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如，Chames&Baty,FEMS Microbiol.Letters 189(2000)1-8)，以及使用已知的分子克隆技术，将两种或多种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或者其片段或部分组合，以得到双特异性或多特异性构建体。
可以使用本领域已知的方法通过将组成结合特异性缀合来制备本发明的多特异性抗体。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.NO.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,Ill,USA)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，例如一个。
或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x Fab、mAb x scFv、mAb x dsFv或mAb x Fv融合蛋白时，这种方法特别有用。制备多特异性抗体和分子的方法，例如在以下文献中有所描述US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US 5,091,513；US 5,476,786；US5,013,653；US 5,258,498；和US 5,482,858。
多特异性抗体与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
另一方面，本发明提供了一种核酸或两种核酸，其编码本发明的多特异性抗体。可以对此类核酸进行优化以在哺乳动物细胞中表达。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，当与参照核酸相比时，具有相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则具体核酸还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和具有互补序列的核酸，以及具有该明确指出的序列的核酸。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成核酸来实现，其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述多特异性抗体的区段或结构域。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出本发明多特异性抗体的抗原结合能力。
多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Narang等人,1979,Meth.EnzyMol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.EnzyMol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和US 4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles和Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods和Applications,Innis等人(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods和Applications 1:17,1991。
本发明还提供了表达载体和宿主细胞，用于生产本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域。
术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在该具体背景下，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。
可以使用各种表达载体来表达编码多特异性抗体链的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达编码多特异性抗体链的多核苷酸的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,CA,USA)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.MicroBiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于要在其中表达所述载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码多特异性抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止插入序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达多特异性抗体链或片段还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
要使用的载体通常编码多特异性抗体轻链和重链，包括恒定区域或其部分。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区是人的。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
携带和表达本发明的多特异性抗体的宿主细胞可以是原核生物或真核生物。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。也可以采用其他微生物，如酵母，来表达本发明的多特异性抗体。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。
在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的多特异性抗体。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入包含目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(通常见于Green,M.R.,and Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(FourthEdition),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子-核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88/223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达本发明的多特异性抗体的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1至2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术使增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包括编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸或载体，由此表达本公开的所述抗体或其片段。
在一方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明的多特异性抗体的核酸。特别地，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体的方法，该方法包括(i)提供编码本发明的多特异性抗体的一种核酸或两种核酸，或编码本发明的多特异性抗体的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或两种核酸或所述一种载体或两种载体，并从表达系统中收集所述多特异性抗体或所述结合结构域，或者(ii)提供表达编码本发明的多特异性抗体的一种核酸或两种核酸的一种宿主细胞或两种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述两种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述结合结构域。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指不干扰抗体结构的介质或稀释剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
某些这样的载体能够将药物组合物配制成例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液和锭剂，用于受试者的口服摄入。某些这样的载体能够将药物组合物配制成用于注射、输注或局部施用。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。在特定的实施方案中，施用是肌肉注射，或皮下注射，特别是皮下注射。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)，特别是用于肌肉内或皮下施用。取决于施用途径，活性化合物(即本发明的多特异性抗体)可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。
本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained和Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的本发明的多特异性抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的多特异性抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。
本发明的多特异性抗体通常多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中本发明的多特异性抗体的血液水平所指示的。或者，本发明的多特异性抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。
一方面，本发明涉及用作药物的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。在合适的实施方案中，本发明提供了多特异性抗体或药物组合物，其用于治疗选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎性和自身免疫性疾病的疾病。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其用于制备用于治疗过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是炎性或自身免疫性疾病的药物。
另一方面，本发明涉及多特异性抗体或药物组合物用于治疗治疗有需要的受试者的过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是用于治疗炎性或自身免疫性疾病的用途。
另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。在合适的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗受试者的过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是用于治疗炎性或自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。
术语“动物”包括所有脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病，特别是引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病。术语“瘙痒”和“痒”在本文中作为同义词使用，是指引起搔抓欲望或反射的感觉。特别是在引起瘙痒的慢性皮肤病如特应性皮炎、皮肤真菌病、银屑病或荨麻疹的情况下，抓挠可能会有问题，因为永久的瘙痒刺激患者不断地和/或过度地抓挠受影响的皮肤区域，这通常会导致皮肤损伤和皮肤表面的进一步恶化。
本文使用的术语“过敏性疾病”或“过敏”是指由免疫系统对环境中通常无害的物质的超敏反应引起的大量病症。
本文使用的术语“炎性疾病”是指大量的炎性疾病，即炎性异常，其通常以长期炎症为特征，称为慢性炎症。术语“炎症”是指身体组织对有害刺激(如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应。这是一种涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性反应。虽然常规的炎症反应对于机体消除细胞损伤的最初原因、清除因最初损伤和炎症过程而受损的坏死细胞和组织以及启动组织修复是必不可少的，但炎症性疾病的特征通常是在没有有害刺激的情况下持续发炎。
本文使用的术语“自身免疫性疾病”是指由对功能性身体部位的异常免疫反应引起的疾病。它是自身免疫的结果，即自身反应性免疫反应(如自身抗体、自身反应性T细胞)的存在，具有或不具有由其引起的损伤或病理，通常局限于某些器官或涉及不同部位的特定组织。
在特定的实施方案中，导致瘙痒症的炎性或自身免疫性疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘，特别是特应性皮炎。
另一方面，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘，特别是特应性皮炎。
在另一个实施方案中，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自过敏性哮喘、过敏性鼻炎、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、慢性非组胺相关性荨麻疹、抗组胺药无反应性肥大细胞增多症、慢性单纯性苔藓、脂溢性皮炎、干皮病、疱疹样皮炎、扁平苔藓和溃疡性结肠炎。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病的如本文所定义的多特异性抗体或药物组合物，所述疾病为神经性瘙痒症，选自疱疹后神经痛、疱疹后瘙痒、感觉异常性腰痛、多发性硬化和肱桡动脉瘙痒症。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗伴有瘙痒的全身性疾病的止痒剂中的多特异性抗体或药物组合物，所述疾病选自胆汁淤积、慢性肾病、霍奇金病、皮肤T细胞淋巴瘤和与慢性瘙痒相关的其他淋巴瘤或白血病、真性红细胞增多症、甲状腺机能亢进症、慢性关节病后瘙痒(Id反应)、妊娠诱发的慢性瘙痒(如PUPPP)、嗜酸性脓疱性毛囊炎、药物过敏反应、老年人慢性瘙痒或干性皮肤瘙痒(局部、全身)、和烧伤后疤痕部位瘙痒(烧伤后瘙痒)、遗传性或痣样慢性瘙痒(如内瑟顿综合征、达里耶氏病(Morbus Darier)、海利-海利氏病、炎性线状疣状表皮痣(ILVEN)、家族性原发性皮肤淀粉样变性、Olmsted综合征)、水源性瘙痒、玻璃纤维皮炎、粘液慢性瘙痒、化疗诱发的瘙痒和HIV。
序列列表(根据AHo编号方案而指定的突变，根据Numab CDR定义而定义的CDR，除非另有说明)
表1.本发明中使用的IL-4R结合结构域的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
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表2.本发明中使用的IL-31结合结构域的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
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表3.与本发明有关的其他序列。
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表4.本发明中使用的多特异性抗体的实例(接头以粗体显示)。
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在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表4)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。
应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的语境中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的语境中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用的方式并入本文。
下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实施例
实施例1：抗IL-4R分子的生成和检测：
项目目标
该项目的目标是生成与人IL-4R特异性结合并中和其生物效应的人源化单克隆抗体片段。另一个目标是鉴定足够有效且稳定，可以整合到多特异性抗体形式中的抗IL-4R抗体片段。
1.1.本发明的多特异性抗体中包含的抗IL-4R结合结构域的生成、选择、人源化和生产
抗IL-4R兔抗体的生成、合适克隆的筛选和选择以及人源化抗IL-4R结合结构域的人源化和生产如平行专利申请EP20216928.0中所述进行，该专利申请通过引用并入本文。基于其生物物理和功能特性，鉴定和选择了足够有效且稳定的抗IL-4R结合结构域，用于整合到多特异性抗体形式中。
1.2.合适的抗IL-4R结合结构域的表征
为了进一步表征合适的抗IL-4R结合结构域，进行了以下分析。
1.2.1.用于表征的合适的抗IL-4R结合结构域(scFv形式)的制备
使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达。在37℃表达5-7天(当细胞活力<70％时)后，通过离心然后过滤收获培养物。通过蛋白质L亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白质。分子均不需要通过尺寸排阻色谱进行精制，因为根据SE-HPLC分析评估，所有分子均至少有一个亲和色谱馏分在捕获后单体含量大于95％。通过透析将样品重新缓冲至最终缓冲液(50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，含150mMNaCl，pH 6.4)。对于制备材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。表6中总结了8种scFv分子的制备特征，这些分子来自被认为适合整合到多特异性抗体形式中的四个克隆。克隆44-18-C11(PRO1510)及其变体(PRO1549-PRO1554)的CDR移植体(sc01)和全移植体(sc04)的制备特征总结在表7中。
表6:8个选定克隆的scFv制备。Sc01:CDR-移植体,sc04:全移植体
表7:克隆44-18-C11的所有移植变体的scFv制备。Sc01:CDR-移植体,sc04:全移植体
1.2.2.合适的抗IL-4R结合结构域(scFv形式)的药物动力学表征
对被评估为合适的scFv抗体的主要药物动力学特性进行表征。
对人IL-4R的亲和力
在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析测定了14个人源化scFv(源自4个兔子单克隆抗体)对人IL-4R的亲和力。通过与羧基甲基化葡聚糖表面偶联的抗人IgG-Fc捕获人IL-4R-Fc，并将scFv作为分析物注入。在每个分析物注入循环后，将传感器芯片再生并捕获新抗原。使用剂量响应多循环动力学分析法测量scFv，在运行缓冲液中稀释7种分析物浓度，范围为0.12至90nM。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。结果示于表8中。从表8中可以看出，基于克隆44-34-C10的scFv抗体可变结构域表现出对人IL-4R的最佳总体结合亲和力。
表8:scFv对人IL-4R的亲和力。sc01：CDR移植体；sc04：全移植体。
对食蟹猴、普通狨猴和小鼠IL-4R的亲和力
使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量了对食蟹猴IL-4R的交叉反应性，不同之处在于捕获的是食蟹猴IL-4R-Fc而不是人IL-4R-Fc。为了确定对普通狨猴IL-4R的亲和力，使用了直接设置，因为只有普通狨猴IL-4R的胞外结构域(ECD)可用。将绒猴ECD直接固定在传感器芯片上，并注射滴定系列的scFv作为分析物。为了比较食蟹猴和普通狨猴IL-4R的KD值，还使用直接设置测定了对食蟹猴IL-4R ECD的亲和力。
只有少数scFv与食蟹猴IL-4R ECD结合。与直接设置中的一个scFv相比，在捕获设置中有三个scFv显示出交叉反应性，这意味着在直接设置中有两个scFv的结合不再可测量。这很可能是直接设置中测定的KD值较低的原因。这种差异是由于结合率(on-rate)较低，可能是由于可及性较低。所有scFv的解离率(off-rate)是相当的。
此外，还测定了与普通狨猴IL-4-R ECD的交叉反应性。结果总结在表9中。
还评估了scFv PRO1517、PRO1535和PRO1538与小鼠IL-4R的结合，但它们均未显示交叉反应性。
在HEK蓝细胞中进行Stat-6报告基因试验(阻断人IL-4和IL-13诱导的信号传导)
HEK蓝试验测试了人源化scFv抑制IL-4和IL-13通过IL-4R诱导的信号传导的能力。每孔50,000个细胞接种在96孔板中。在存在0.02ng/ml IL-4或0.3ng/ml IL-13的情况下，将scFv和对照抗体度普利尤单抗的系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2孵育24小时后，将上清液转移到新的平板上，使用Quanti-Blue底物对分泌的胚胎碱性磷酸酶进行定量。
在该HEK蓝试验中分析了scFv阻断IL-4R介导的信号传导的能力。将所分析的分子的效力与dupilumab进行比较。表10总结了所有效力数据。以dupilumab和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。8种scFv高效阻断了IL-4和IL-13诱导的信号传导。基于克隆44-34-C10的scFv以及PRO1552显示出最好的总体阻断效力。PRO1517、PRO1524、PRO1535、PRO1538和PRO1552可以阻断IL-4-和IL-13-诱导的信号传导，其效力类似于度普利尤单抗。
竞争性ELISA(抑制hIL-4与hIL-4R的结合)
使用竞争性ELISA进一步测定了人源化scFv的效力。通过ELISA使用与EP20216928.0中相同的方法评估了每种scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的效力。类似地，对于stat-6报告基因试验，将每个平板上的单个IC50值对照参考分子dupilumab的IC50进行校准。
7个scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间的相互作用，具有良好至高的效力。基于克隆44-34-C10的scFv以及PRO1552显示出最好的总体阻断效力。PRO1517和PRO1552的阻断效力与度普利尤单抗相似。另一方面，PRO1538仅显示中等抑制。五个scFv分子没有表现出抑制作用。
scFv的药理学表征和用于可开发性评估的分子选择的概述
源自4个不同B细胞克隆的14个scFv的药理学表征为选择分子进行扩展生物物理表征提供了基础。基于它们在stat-6报告基因试验和IL-4/IL-4R阻断ELISA中，在中和IL-4和IL-13诱导的信号传导方面的总体更好的表现，选择了5种分子，即PRO1517、PRO1535、PRO1524、PRO1506和PRO1538用于进一步扩展表征。所有七个分子都显示出比500pM更好的亲和力。与人IL-4R相比，对食蟹猴IL-4R的亲和力低4至20倍，除了三个分子对食蟹猴IL-4R的亲和力非常低或没有结合。特别地，基于克隆44-18-C11的scFv，即PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554，没有显示出与食蟹猴IL-4R的结合。通常，与人IL-4R相比，这些scFv对普通狨猴IL-4R的亲和力也较低。作为这些亲和力研究的结果，基于克隆44-18-C11的scFv，即PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554，由于它们缺乏与食蟹猴IL-4R的交叉反应性，被排除在进一步的评价之外，尽管PRO1552显示出非常好的抑制效力。出于同样的原因，PRO1520也被排除在外。然而，没有排除基于相同克隆44-39-B07的PRO1538，尽管其对食蟹猴IL-4R的结合亲和力较弱。
1.2.3.合适的抗IL-4R结合结构域(scFv形式)的生物物理表征
用于稳定性测量的材料的制备
使用如上所述的相同制备工艺以稍大的规模(0.25L表达体积)再次生产PRO1517和PRO1538，以生成足够用于稳定性评估的材料。对于选择用于稳定性评估的其他蛋白质，以前生产的材料的量足以进行稳定性评估。纯化后，将样品配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(50mM NaCiP，pH 6.4)中。纯化和透析后，使用5MWCO离心浓缩管将蛋白质样品浓缩至≥10mg/ml，因为这是进行储存稳定性评估所需的浓度。
浓缩至10mg/ml时的单体损失在0和12％之间，取决于分子不同，如表11所示。PRO1506和PRO1524的单体含量降至95％以下，这是进入储存稳定性评估的分子的临界值，因此也是将它们排除在研究之外的原因。然而，由于材料已经制备好，并且为研究做好了一切准备，因此与浓缩后单体含量>95％的其余分子一起，对这些分子的稳定性进行了评估。基于克隆44-34-C10的scFv，即PRO1517和PRO1535，以及PRO1538在浓缩时实际上没有显示单体含量的损失。
储存稳定性研究
对人源化的scFv进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存四周。至少在每次研究的一周、两周和完成后，通过SE-HPLC峰面积的积分来评估制剂中单体和低聚物的分数。对于大部分分子，记录了另外的时间点。表12比较了研究的第14天(d14)和第28天(d28)得出的终点测量值。
表9:scFv对食蟹猴和普通狨猴IL-4R的亲和力。sc01:CDR移植体；sc04:全移植体；sc05-sc10:其他移植变体
/>
/>
表10:stat-6报告基因试验中，scFv中和IL-4和IL-13诱导的信号传导的效力。sc01:CDR移植体；sc04:全移植体；sc05-sc10:其他移植变体
/>
NA:未分析
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品
n/a:未计算相对IC50(无抑制或IC50未测定)
表11:浓缩至10mg/ml时的单体损失％(SE-HPLC)。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
如表12所示，基于克隆44-34-C10的scFv，即PRO1517和PRO1535，在4℃显示出良好的储存稳定性。在4℃储存d28后单体含量损失小于5％。PRO1538也显示出良好的储存稳定性，至少持续14d。然而，没有一种稳定的分子在任何温度下表现出蛋白质含量的显著损失。
冻融稳定性
除上述存储稳定性研究外，还针对冷冻-融化(F/T)循环评估了性能最高的scFv分子的相容性(胶体稳定性)。由于在开发的早期阶段，原料药通常冷冻储存，制剂和灌装/成品加工将需要一些冷冻和解冻操作。
为了进行F/T稳定性评估，采用与存储稳定性研究相同的分析方法(SE-HPLC,SDS-PAGE)和参数(单体含量％和单体损失％)来监测分子随着五个F/T循环的质量。表13说明了随着五个F/T循环的单体含量损失％。由于没有进行专门的冻融研究，所以显示了用-80℃样品的储存稳定性研究时获得的冻融数据，该数据是在28天内获得的。因为对于一些蛋白质只能记录四个时间点，所以对于这些蛋白质也只能进行四次F/T循环。
表12:在10mg/ml和-80℃、4℃和40℃温度下的28d储存稳定性研究。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
/>
NA:未分析
表13:F/T稳定性——重复冻融后的单体含量％和％单体变化。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
/>
*不适用，因为只能测量4个时间点
表14:选定结构域的DSF。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
热解折叠
使用差示扫描荧光测定法(DSF)进行了五种所选择的scFv构建体的热解折叠测量。通过将数据拟合到波尔兹曼方程，测定了得出的热解折叠中点(Tm)和在最大信号的10％处计算的解折叠起始温度(Tonset 10％)值。表14总结了通过DSF测得的熔融温度。从表14中可以推断出，基于克隆44-34-C10的scFv表现出高于63℃的高熔化温度。PRO1538也表现出高熔化温度。
实施例2：抗IL31分子的生成和检测：
项目目标
该项目的目标是生成与人IL-31特异性结合并中和其生物效应的人源化单克隆抗体片段。另一个目标是鉴定足够有效且稳定，可以整合到多特异性抗体形式中的抗IL-31抗体片段。
2.1.本发明的多特异性抗体中包含的抗IL-31结合结构域的生成、选择、人源化和生产
抗IL-31兔抗体的生成、合适克隆的筛选和选择以及人源化抗IL-31结合结构域的人源化和生产如平行专利申请EP20216938.9中所述进行，该专利申请通过引用并入本文。基于其生物物理和功能特性，鉴定和选择了足够有效和稳定的抗IL-31结合结构域，用于整合到多特异性抗体形式中。克隆50-09-D07被鉴定为具有总体最佳的生物物理和功能特性。
2.2.合适的抗IL-31结合结构域的表征
为了进一步表征合适的抗IL-31结合结构域，进行了以下分析。
2.2.1.用于表征的合适的抗IL-31结合结构域(scFv形式)的制备
在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达，如上文第1.2.1节所述。来源于一个克隆，即克隆50-09-D07的两个scFv sc01和sc03构建体(分别为PRO1632和PRO1643)的制备总结在表15中。
2.2.2.合适的抗IL-31结合结构域(scFv形式)的药物动力学特征
对被评估为合适的scFv抗体即PRO1632和PRO1643的主要药物动力学特性进行表征。
对人和食蟹猴IL-31的亲和力
在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析测定了两个人源化scFv对人和食蟹猴IL-31的亲和力。食蟹猴IL-31由Sino Biological按需制备，因为它在商业上不可获得。通过与羧基甲基化葡聚糖表面偶联的抗His标签抗体捕获人和食蟹猴IL-31-His，并将scFv作为分析物注入。在每个分析物注入循环后，将传感器芯片再生并捕获新抗原。使用剂量响应多循环动力学测定法测量scFv，在高通量模式下，在运行缓冲液中稀释两种浓度(30和10nM)。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。如表16所示，对于两种人源化scFv均证实了与人IL-31的结合。
IL-31RA/OSMR二聚化试验(阻断人IL-31诱导的信号传导)
使用IL-31RA/OSMR二聚化试验，测试人源化scFv抑制IL-31通过IL-31RA/OSMR异二聚体诱导的信号传导的能力。每孔10,000个细胞接种在96孔板中。第二天，在10ng/mlIL-31存在下，将scFv和对照抗体BMS-981164的系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2孵育6小时后，加入检测溶液，将板再孵育1小时，并测量发光。
在细胞分析中测试了这两种scFv。如上所述，将所分析的分子的效力与BMS-981164进行比较。
以BMS-981164和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。表17总结了效力数据。
表17:IL-31RA/OSMR二聚化试验中，scFv中和IL-31R和IL-31诱导的信号传导的效力。sc01：CDR移植体；sc03：全移植体。
*:IC50,BMS-981164/IC50,测试样品
表15:2个选定克隆的scFv制备。Sc01:CDR移植体,sc03:全移植体
*°仅检测到目标蛋白质
表16:scFv对人IL-31的亲和力。sc01：CDR移植体；sc03：全移植体。
*PRO1643的KD测定了两次。在第一次SPR分析中，通过筛选模式测定了第一个KD(KD1)。
**在第二次SPR分析中，使用完全滴定模式测定了第二个KD(KD 2)。
竞争性ELISA(抑制hIL-31与hIL-31RA的结合)
使用竞争性ELISA进一步测定了两个人源化scFv的效力。通过ELISA使用与EP20216938.9中相同的方法评估了每种scFv抑制人IL-31和人IL-31RA之间相互作用的效力。与IL-31RA/OSMR二聚化试验相比，将每个平板上的单个IC50值对照参考分子BMS-981164的IC50进行校准。全移植物scFv抑制人IL-31和人IL-31RA之间的相互作用，具有与BMS-981164相比相似的效力。表18总结了效力数据。
表18:scFv抑制IL-31和IL-31R之间相互作用的效力。sc01：CDR移植体；sc03：全移植体。
*:IC50,BMS-981164/IC50,测试样品
scFv的药理学表征和用于详细生物物理评价的分子选择的概述
这两种scFv的药理学表征为选择用于详细生物物理评价的分子提供了基础。基于这些结果，选择PRO1643进行详细的生物物理评估，因为其整体性能更好。
2.2.3合适的抗IL-31结合结构域(scFv形式)的生物物理表征
稳定性材料的制备
使用如上所述的相同制备工艺以稍大的规模(0.25L表达体积)再次生产PRO1643，以产生足够用于稳定性评估的材料。将样品配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(50mM NaCiP，pH 6.4)中。纯化和透析后，用5MWCO离心浓缩管将蛋白质浓缩至>10mg/ml。
浓缩至10mg/ml时的单体损失为0.1％，如表19所示。
表19:浓缩至10mg/ml时的单体损失％(SE-HPLC)。Sc03：全移植体
储存稳定性研究
对PRO1643进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(最终缓冲液，50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存四周。通过研究的不同时间点的SE-HPLC峰面积的积分，评估了制剂中单体和低聚物的分数。此外，在不同时间点通过UV280测量测定了蛋白质浓度。表20比较了研究的第14天和第28天得出的终点测量值。
PRO1643在4℃和研究的第28天没有显示出显著的单体含量损失。PRO1643在任何温度下都没有表现出显著的蛋白质含量损失。
冻融稳定性
除上述存储稳定性研究外，还针对冷冻-融化(F/T)循环评估了PRO1643的相容性(胶体稳定性)。
为了进行F/T稳定性评估，采用与存储稳定性研究相同的分析方法(SE-HPLC,UV-Vis)和参数(单体含量％和单体损失％)来监测分子随着3个F/T循环的稳定性。表21说明了随着三个F/T循环的单体含量(％)的进程和单体含量损失％。由于没有进行专门的冻融研究，所以下表显示了用-80℃样品的储存稳定性研究时获得的冻融数据，该数据是在28天内获得的。由于每个样本只能记录三个时间点，冻融稳定性数据只能用于三个F/T循环。
热解折叠
使用差示扫描荧光测定法(DSF)进行了PRO1643的热解折叠测量。通过将数据拟合到波尔兹曼方程，测定了得出的热解折叠中点(Tm)和在最大信号的10％处计算的解折叠起始温度(Tonset 10％)值。表22总结了通过DSF测得的熔融温度。
实施例3：选择和优化抗IL-4R分子的多特异性形式：
3.1.关于选择抗IL-4R结构域的概述
首先选择抗IL-4R结构域PRO1517(44-34-C10-sc01)和PRO1535(44-34-C10-sc04)，因为它们表现出非常好的药物动力学性质和可接受的良好稳定性。也选择了PRO1538(44-39-B07-sc04)，尽管它具有可以改进的药理学特性，因为它表现出最佳的稳定性。对PRO1517(44-34-C10-sc01)进行了稳定性优化，对PRO1538(44-39-B07-sc04)进行了pI平衡优化，如下文3.2所示。
在最终多特异性抗体中应用的抗IL-4R结合结构域显示出对食蟹猴和普通狨猴的排他性交叉反应性。
3.2.抗IL-4R结构域的优化
进一步优化了抗IL-4R结构域PRO1538(44-39-B07-sc03)和PRO1517(44-34-C10-sc01)以装配成多特异性形式。
表20:在10mg/ml和-80℃、4℃和40℃温度下的28d储存稳定性研究。
Sc03：全移植体
表21:F/T稳定性——重复冻融后的单体含量％和％单体变化。Sc03：全移植体
/>
表22:选定的scFv结构域的DSF测量。Sc03：全移植体
*用于测量的单体含量为90.4％的初始材料
抗IL-4R结构域44-39-B07-sc04(PRO1538)的优化
PRO1538(44-39-B07-sc03)在VL和VH之间具有pI不平衡(pIVL＝8.2和pIVH＝5.0)。pI的不平衡与高粘度相关，并可能对稳定性产生负面影响。因此，设计了这种分子的两种新变体。这些变体描述如下。简而言之，已经详细分析了VH中的所有残基，目的是设计出消除pI不平衡，而不损害结合亲和力，并且不引入关键序列责任(化学和翻译后修饰)、T细胞表位等的分子。
设计了两种变体，总结在表23中。
然而，PRO1538(44-39-B07-sc03)的这些变体并没有显示出期望的稳定性改善。由于PRO1538在抑制IL-4和IL-13诱导的信号传导方面的效力明显较弱，并且在阻断IL-4与IL-4R的相互作用方面的效力比PRO1517低10倍以上，因此PRO1538及其变体被排除在进一步考虑之外，并将工作集中于RPO1517(44-34-C10-sc01)的改进。
表23:44-39-B07-sc03的优化变体
抗IL-4R结构域44-34-C10-sc01(PRO1517)的优化
PRO1517(44-34-C10-sc01)是具有有利结合特性的抗IL-4R scFv。在生物物理表征过程中，scFv PRO1517表现出良好但仍可以改进的溶解性。努力进一步改进PRO1517的溶解性、长期稳定性和浓度特性。因此，设计了该分子的四种新变体。这些变体描述如下。简而言之，已经详细分析了CDR或前者VH-CH界面中的疏水区域，并且降低了pI失衡，目的是设计出消除了疏水区域，而不损害结合亲和力，并且不引入关键序列责任(化学和翻译后修饰)、T细胞表位等的分子。
设计了四种变体，总结在表24中。
表24:44-34-C10-sc01的优化变体
3.3优化的抗IL-4R结合结构域(scFv形式)的生物物理表征
储存稳定性研究
如上文1.2.3节所述，对PRO1897、PRO1898和PRO1899进行了储存稳定性研究。结果总结在表25中。
从表25可以看出，scFv PRO1897、PRO1898和PRO1899表现出优异的储存稳定性。在4℃储存28天后单体含量损失小于5％。此外，这些分子在任何温度下都没有表现出蛋白质含量的显著损失。
热解折叠
使用NanoTemper通过纳米动态扫描荧光测定法(nDSF)分析了PRO1897、PRO1898和PRO1899的热稳定性，允许测定解折叠起始(Tonset)、解折叠中点(Tm1)和散射起始温度。表26总结了两次/三次测量的Tm1和Tonset结果。从表26可以推断，PRO1897、PRO1898和PRO1899显示出高的熔化温度。
表25:在10mg/ml和-80℃、4℃和40℃温度下的28d储存和F/T稳定性研究。
/>
NA:未分析；*测量前进行五次重复的F/T循环
表26:优化的结构域的nDSF。
3.4.优化的抗IL-4R结合结构域(scFv形式)的药物动力学特征
对人IL-4R的亲和力
在T200装置(Biacore，GE Healthcare)上，通过SPR分析测定了优化的抗IL-4RscFv PRO1898和PRO1899对人IL-4R的亲和力，如上文第1.2.2节所述。使用剂量响应多循环动力学分析法测量scFv，在运行缓冲液中稀释7种分析物浓度，范围为0.12至90nM。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。
如表27所示，所有优化的scFv都证实了与人IL-4R和食蟹猴IL-4R的结合。
表27:优化的抗IL-4R scFv对人IL-4R的亲和力。
/>
对食蟹猴IL-4R的亲和力
使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量了优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899对食蟹猴IL-4R的亲和力，不同之处在于捕获的是食蟹猴IL-4R-Fc而不是人IL-4R-Fc，如上文1.2.2节所述。表28总结了这一分析的结果。
表28:优化的抗IL-4R单链抗体对食蟹猴IL-4R的亲和力。
在HEK蓝细胞中进行Stat-6报告基因试验(阻断人IL-4和IL-13诱导的信号传导)
在该HEK蓝试验中分析了优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899阻断IL-4R介导的信号传导的能力，如上文1.2.2节所述。将所分析的分子的效力与dupilumab进行比较。表29总结了所有效力数据。以dupilumab和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。优化的scFv阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导，其效力与dupilumab相似(见图3)。
表29:stat-6报告基因试验中，scFv PRO1898和PRO1899和IL-4和IL-13诱导的信号传导的能力。
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品
NA:不适用
竞争性ELISA(抑制hIL-4与hIL-4R的结合)
使用竞争性ELISA测定了优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899 scFv的效力。如1.2.2节所述，通过ELISA测定了每种scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的能力。类似地，对于stat-6报告基因试验，将每个平板上的单个IC50值对照参考分子dupilumab的IC50进行校准。
表30总结了竞争性ELISA分析的结果。PRO1898和PRO1899的阻断效力与度普利尤单抗相似(见图4)。
表30:在竞争ELISA试验中，scFv PRO1898和PRO1899抑制hIL-4–IL-4R相互作用的效力。
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品；NA:不适用
实施例4：选择和优化抗IL31分子的多特异性形式：
4.1.关于选择抗IL-31结构域的概述
首先选择抗IL-31结构域PRO1643(50-09-D07-sc03)进行进一步开发，因为它表现出所需的药效学特性以及优异的稳定性。然而，抗IL-31结合结构域PRO1643(50-09-D07-sc03)经历了进一步的溶解性改进，如下文4.2所示。
在最终多特异性抗体中应用的抗IL-31结合结构域与食蟹猴IL-31发生交叉反应。
4.2.抗IL-31结构域的优化
进一步优化了抗IL-31结构域PRO1643(50-09-D07-sc03)以装配成多特异性形式。
抗IL-31结构域50-09-D07-sc03的优化
PRO1643(50-09-D07-sc03)是一种非常稳定的抗IL-31scFv，然而，仍在努力改进了其溶解性、长期稳定性和浓度特性。因此，设计了该分子的新变体。这些变体描述如下。简而言之，已经详细分析了CDR或前者VH-CH界面中的疏水区域，目的是设计出消除了疏水区域，而不损害结合亲和力，并且不引入关键序列责任(化学和翻译后修饰)、T细胞表位等的分子。设计了四种变体，总结在表31中。
表31:50-09-D07-sc03的优化变体
4.3.优化的抗IL-31结合结构域(scFv形式)的生物物理表征
储存稳定性研究
如上文1.2.3节所述，对PRO1900、PRO1901、PRO1902和PRO1903进行了储存稳定性研究。除了最后一次读数是在第14天取得的，并且没有评估F/T以及在-80℃的稳定性。结果总结在表32中。
如表32中总结的，scFv PRO1900、PRO1901、PRO1902和PRO1903表现出优异的储存稳定性。在4℃储存14天后单体含量的损失小于0.2％，在40℃储存14天后小于3％。此外，这些分子在任何温度和数据点都没有显示出蛋白质含量的显著损失。
热解折叠
使用NanoTemper通过纳米动态扫描荧光测定法(nDSF)分析了PRO1900、PRO1901、PRO1902和PRO1903的热稳定性，允许测定解折叠起始(Tonset)、解折叠中点(Tm1)和散射起始温度。表33总结了两次/三次测量的Tm1和Tonset结果。从表33可以推断，PRO1900、PRO1901、PRO1902和PRO1903显示出高的熔化温度。
4.4.优化的抗IL-31结合结构域(scFv形式)的药物动力学表征
对人IL-31的亲和力
在T200装置(Biacore，GE Healthcare)上，通过SPR分析测定了PRO1643和优化的抗IL-31scFv对人IL-31的亲和力，如上文第2.2.2节所述。使用剂量响应多循环动力学测定法测量scFv，在高通量模式下，在运行缓冲液中稀释两种浓度(30和10nM)。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。
如表34所示，所有优化的scFv都证实了与人IL-31和食蟹猴IL-31的结合。
Path Hunter IL-31RA/OSMR二聚化分析(阻断人IL-31诱导的信号传导)
使用IL-31RA/OSMR二聚化试验，测试了PRO1643和优化的scFv抑制IL-31通过IL-31RA/OSMR异二聚体诱导的信号传导的能力。如上所述进行分析。将所分析的分子的效力与BMS-981164进行比较。
以BMS-981164和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。表35总结了效力数据。从表35可以看出，PRO1643以及优化的变体PRO1900、PRO1901和PRO1903可以有效地中和IL-31诱导的信号传导。为优化溶解度和稳定性而在变体PRO1902中引入的突变明显导致抑制IL-31诱导的信号传导能力被破坏。
表32:在10mg/ml和4℃和40℃温度下的14d储存稳定性研究。
*样品在25℃而不是40℃孵育7天
NA:未分析
表34:scFv对人和食蟹猴IL-31的亲和力。Sc03：全移植体，sc04至sc07：其他移植变体
表33:优化的抗IL-31结合结构域的nDSF(scFv形式)。
表35:IL-31RA/OSMR二聚化试验中，scFv中和IL-31R和IL-31诱导的信号传导的效力。Sc03：全移植体，sc04至sc07：其他移植变体
*:IC50,BMS-981164/IC50,测试样品
实施例5:基于Morrison-H IgG1-Fc-静默的抗IL-4R×IL-31双特异性抗体
5.1.Morrison-H设计
Morrison形式(也称为IgG-(scFv)2形式)是一种基于IgG的分子的二价双特异性形式，包含一个Fc区和两个scFv结构域，它们或者通过接头融合到重链的C-末端，通常称为Morrison-H形式(见图2A)，或者通过接头融合到轻链的C-末端，通常称为Morrison-L形式(见图2B)。
在第一系列抗IL-4R×IL-31双特异性抗体中，选择了Morrison-H形式，其中Fc区来自IgG亚类IgG1，其已被双突变Leu234Ala和Leu235Ala静默，通常也称为“LALA突变”。两个高度稳定的λ-加帽scFv结构域融合到重链C-末端。
总共设计了19种具有上述Morrison-H形式的双特异性抗体，除一个分子外，均在Fab臂上带有抗IL-4R结构域。组合了来自5个克隆的13个不同的抗IL-4R结构域和来自两个克隆的3个抗IL-31结构域。这些双特异性Morrison-H抗体中的9种表现出良好的药理学特性。这些Morrison-H抗体总结在表36中。
表36:Morrison-H分子结构概述
5.2.Morrison-H分子生产
使用瞬时CHOgro表达系统(Mirus)在FreeStyle CHO-S细胞中进行多特异性构建体的表达。将目的基因优化，以用于哺乳动物表达，合成并克隆到标准pcDNA3.1载体中。使用摇瓶在37℃分批培养表达培养物6至7天(细胞存活力<70％)。除了PRO1982、PRO2078和PRO2080在整个表达期间保持在37℃之外，表37中列出的所有分子在表达1天后，表达温度降低到32℃。通过离心将培养物上清液与细胞分离，随后进行0.22m无菌过滤。通过蛋白L或亲和层析从澄清的培养物上清液中捕获目标蛋白，随后进行尺寸排阻层析精制步骤(在捕获后通过SE-HPLC评估没有合适的单体含量级分可用的情况下)。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、SDS-PAGE和UV280。
表37显示了这些分子的生产概况。在SEC精制步骤后，所有分子最终单体含量>98％。
表37:Morrison-H分子的生产概况
*计算值/外推值，因为并非所有材料都用于精制步骤
5.3.生物物理和药理学表征
九种多特异性分子，即PRO1929、PRO1930、PRO1982及其改良变体PRO2077和PRO2078；PRO1973及其改进变体PRO2079和PRO2080；和PRO1977被选择用于进一步表征。
对这九种分子进行扩展生物物理表征，以确定工艺和制剂开发的适用性。这些分子通过一系列方法进行表征，以评估熔化和聚集温度、浓度超过150g/l时的溶解度、4℃和25℃下2周后单体含量的损失、流体动力学半径的增加和电荷变体以及蛋白质的剪切。溶解性也通过PEG筛选进行了评估。对于PRO1929，测定了单体含量的损失和流体动力学半径的增加。
基于这些结果，PRO2077、PRO2080、PRO1977、PRO1929是最好的构建体。它们分别含有抗IL-4R结构域44-18-C11-sc14、44-39-09-sc06、44-03-A04-sc03和44-34-C10-sc01以及抗IL-31结构域50-09-D07-sc04。所有分子都达到了150g/l的预期目标浓度。就储存在4℃和25℃时的单体稳定性而言，PRO1929和PRO2080具有最好的特性。关于化学稳定性和工艺开发，PRO2077和PRO2080显示出良好的pH稳定性和低电荷变体复杂性。
从药理学角度来看，与dupilumab相比，PRO2077在阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导方面表现出2倍的优势。该分子中的抗IL-4R结构域不与食蟹猴IL-4R交叉反应。PRO2080、PRO1977和PRO1929阻断IL-4R信号的能力比dupilumab低约2-3倍。PRO2080和PRO1977似乎显示出基于亲和力结合的与食蟹猴IL-4R的交叉反应性。PRO1929的变体可以作为替代物。与PRO2080和PRO1977相比，PRO1929表现出对食蟹猴IL-4R的强交叉反应性和类似的抑制IL-4R信号传导的能力。所有分子都有效阻断IL-31诱导的信号传导，并与食蟹猴IL-31交叉反应。此外，所有分子对两种人靶都表现出皮摩尔亲和力。
实施例6：基于Morrison-H和Morrison-L IgG4的抗IL-4R×IL-31双特异性抗体
6.1.Morrison形式设计
在第二系列抗IL-4R×IL-31双特异性抗体中，选择了Morrison-H和Morrison-L形式，其中Fc区来自IgG亚类IgG4。两个高度稳定的λ-加帽scFv结构域融合到重链(Morrison-H)或轻链(Morrison-L)的C-末端。
基于食蟹猴的交叉反应性、优异的效力和优异的生物物理性质，包括PRO1929家族的IL-4R和IL-31结构域的构建体被优先考虑。
PRO1929家族IL-4R结合物的两个变体被包含在上述分子的重转格式中，它们是44-34-C10-sc08和44-34-C10-sc09。相同的IL-31结合结构域被包含在所有构建体中，其是50-09-D07-sc04。
总共设计了7个IgG4-(scFv)2分子，4个Morrison-H和3个Morrison-L分子。如表38(Morrison-H)和表39(Morrison-L)所示，将来自一个克隆的两个不同的抗IL-4R结构域和一个抗IL-31结构域组合。
表38:IgG4 Morrison-H构建体
表39:IgG4 Morrison-L构建体
6.2.通过SPR评估结合亲和力和特异性
对人和食蟹猴IL-4R的亲和力
在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析测定了双特异性Morrison-H(PRO2198、PRO2199)和Morrison-L(PRO2206、PRO2207)分子与重组人IL-4R蛋白(ECD，带His标签，Sino Biological)的结合动力学(包括亲和力)。在该SPR实验中，通过共价固定到羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore，Cytiva)的抗人IgG-Fc抗体(人抗体捕获试剂盒；Biacore，Cytiva)将Morrison分子捕获，并注射滴定系列的人IL-4R ECD作为分析物。在每个分析物注射循环之后，使传感器芯片再生(MgCl2)，随后重新捕获新的Morrison抗体。使用多循环动力学试验测量与人IL-4R的结合动力学，在运行缓冲液中稀释9种分析物浓度(HEPES缓冲盐水，0.05％Tween-20，pH7.5)，范围从0.175到45nM。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version3.2,Cytiva)计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数和表观解离平衡常数(KD)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论Rmax。使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量了对食蟹猴IL-4R的交叉反应性，不同之处在于使用重组食蟹猴IL-4R(ECD带有His-tag，Acro Biosystems)蛋白代替人IL-4R作为分析物。
如表40所示，证明了Morrison-H和Morrison-L抗体与人IL-4R的高亲和力结合。计算的KD值非常相似，范围从291pM到48pM，Morrison-H抗体PRO2198与人IL-4R结合的亲和力为291±136pM。在测试的分子中，对食蟹猴IL-4R的动力学亲和力也是相似的(209至11pM)，对PRO2198 Morrison-H抗体测量的亲和力为144±49pM，因此证明了所有分子对食蟹猴来源的IL-4R的交叉反应性。
对人和食蟹猴IL-31的亲和力
在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析测定了双特异性Morrison-H(PRO2198、PRO2199)和Morrison-L(PRO2206、PRO2207)分子与重组人IL-31蛋白(Peprotech)的结合动力学(包括亲和力)。在这个SPR实验中，将Morrison抗体注射到用人重组IL-4R蛋白(ECD，带Fc标签，R&D Systems)固定的羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore，Cytiva)上，并注射滴定系列的人IL-31作为分析物。使用单循环动力学测定测量对人IL-31的亲和力，注射5个连续的分析物浓度，范围从0.05至30nM，在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％吐温-20，pH 7.5)中稀释，在注射分析物后不再生传感器芯片表面。动力学和表观解离平衡常数(KD)的计算以及曲线拟合质量的测量如上文针对IL-4R所述进行。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论Rmax。使用与分析人IL-31亲和力相同的设置测量了对食蟹猴IL-31的交叉反应性，不同之处在于使用重组食蟹猴IL-31(ECD带有His标签，Sino Biological)蛋白代替人IL-31作为分析物。
用于测量与重组IL-31结合动力学的SPR设置的先决条件是通过固定的人IL-4R捕获Morrison-H和Morrison-L抗体。所有先前测试的Morrison抗体均显示出与固定的人IL-4R的稳定结合，因此该设置被证明是有效的。使用这种SPR设置的基本原理是保证所捕获的Morrison分子的均匀取向，同时最小化IL-31结合位点的空间位阻。
在显示Morrison抗体通过重组人IL-4R蛋白稳定捕获后，注射IL-31作为分析物，并计算IL-31与捕获的Morrison分子结合的动力学。如表41所示，所有测试的Morrison-H和Morrison-L分子以相似的亲和力与人IL-31和食蟹猴IL-31结合(分别为152至52pM和169至103pM)。PRO2198 Morrison-H抗体证明与人IL-31结合，计算的KD为52±18pM，与重组食蟹猴IL-31蛋白结合的亲和力为10±1pM，因此证实了良好的交叉反应性。
与人IL-4R和IL-31以及食蟹猴IL-4R和IL-31伴随结合(concomitant binding)
在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析评估了Morrison-H和Morrison-L抗体的伴随结合。如上所述，由于抗体的均匀分子取向以及IL-31结合位点的最小空间位阻，当Morrison抗体通过IL-4R相互作用被捕获在传感器芯片表面上时，Morrison抗体与IL-31(人和食蟹猴)的结合被最好地测量。因此，通过以下方法评估了所测试的Morrison与人IL-4R和人IL-31两者的伴随结合：在用人重组IL-4R蛋白(Fc标签，R&D Systems)固定的羧甲基化葡聚糖表面注射Morrison抗体(CM5传感器芯片；Biacore，Cytiva)，随后注射单一高浓度(45nM)的人IL-31作为分析物。PRO2199、PRO2206和PRO2207的伴随结合在如上所述的人IL-31的动力学测量过程中，通过使用来自注射45nM的人IL-31的结合水平来评估。类似于人IL-4R和人IL-31，测定了PRO2198与食蟹猴IL-4R和食蟹猴IL-31的伴随结合，除了使用固定在传感器芯片表面的重组食蟹猴IL-4R(ECD，带His标签，Acro Biosystems)并使用重组食蟹猴IL-31(ECD，带His标签，Sino Biological)蛋白作为分析物。
对于所有测试的Morrison抗体，即PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207，通过SPR证实了与人IL-4R和人IL-31的伴随结合，如图5中对PRO2198的示例性显示。对于PRO2198，还显示了与食蟹猴IL-4R和食蟹猴IL-31的伴随结合(见图5)。
表40:Morrison抗体与人IL-4R和食蟹猴IL-4R的结合动力学
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表41:Morrison抗体与人IL-31和食蟹猴IL-31的结合动力学
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6.3.与人或食蟹猴IL-4R表达细胞的结合(FACS)
为了测试Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207与表达人或食蟹猴IL-4R的HEK293T细胞的结合，使用Lipofectamine3000用人和食蟹猴IL-4R质粒和模拟质粒转染HEK293T细胞。靶向V5标签(其融合到人和食蟹猴IL-4R表达构建体的N-末端)的抗体的结合，将证实两个靶标的成功表达，并因此用作质膜结合的阳性对照。Morrison-H分子PRO2077用作食蟹猴IL-4R结合的阴性对照，因为该分子未显示出与食蟹猴IL-4R的任何交叉反应性(参见5.3.节)。
将每孔50,000个转染的HEK293T细胞接种在96孔板中。将Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207以及与食蟹猴IL-R无交叉反应的对照分子PRO2077的5倍系列稀释液以5,000至0.32ng/ml的浓度添加到平板中，并在4℃在振荡器上孵育60分钟。去除上清液，并加入检测试剂用于流式细胞术分析。计算单细胞的APC荧光强度的几何平均值。
表42总结了所有效力数据。重复分析的平均相对IC50值以pM表示。Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207有效地与转染的HEK293T细胞上的人和食蟹猴IL-4R结合(见图6)。
6.4.抑制人IL-4和IL-13信号传导的效力评估(HEK蓝TMIL-4/IL-13细胞stat-6报告基因试验)
已经使用HEK蓝试验测试了Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207抑制IL-4和IL-13通过IL-4R诱导的信号传导的能力。每孔50,000个细胞接种在96孔板中。在存在0.05ng/ml IL-4或0.3ng/ml IL-13的情况下，将浓度范围为100至0.002ng/ml的Morrison分子和参照抗体度普利尤单抗的三倍系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，将上清液转移到新的平板上，使用Quanti-Blue底物对分泌的胚胎碱性磷酸酶进行定量。还测试了在试验培养基中存在过量IL-31(10nM)时，Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207对IL-4诱导的信号传导的抑制。
表43(IL-4/IL-4R抑制)和表44(IL-13/IL-4R抑制)总结了所有效力数据。重复分析的平均相对IC50值也以pM表示。Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207有效地阻断了IL-4或IL-13与IL-4R之间的相互作用，效力与度普利尤单抗相当(见图7)。当IL-31与Morrison-H分子的抗IL-31结构域结合时，有效的IL-4R阻断得以维持(见图8)。
6.5.抑制人IL-31诱导的受体二聚化的效力评估(eXpressIL31RA/OSMRb分析)
PathHunter IL-31RA/OSMRb二聚化分析
在IL-31RA/OSMR二聚化试验中，评估了Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207抑制IL-31通过IL-31RA/OSMR异二聚体诱导的信号传导的能力。将每孔10,000个细胞接种在96孔板中。第二天，在10ng/ml IL-31存在下，将浓度范围为1,000至0.2ng/ml的分子和对照抗体BMS-981164的3倍系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2下孵育6小时后，加入检测溶液，将板再孵育1小时，并测量发光。还测试了在试验培养基中存在过量IL-4R(在50nM)时，所有抗体对IL-31诱导的信号传导的抑制。
人IL-31的抑制
在表45中，显示了所有效力数据的汇总。重复分析的平均相对IC50值以pM表示。与BMS-981164相比，所有的Morrison-H和Morrison-L抗体抑制IL-31诱导的信号传导具有相似的效力。当抗IL-4R结构域与IL-4R结合时，IL-31与IL-31R相互作用的有效阻断得以维持(见图9)。
食蟹猴IL-31的抑制
为了评估食蟹猴IL-31诱导的信号传导的抑制，如上所述使用IL-31RA/OSMR二聚化分析，不同之处在于使用10ng/ml食蟹猴IL-31代替10ng/ml人IL-31，并且仅测试Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199的抑制作用。PRO2198和PRO2199都有效地阻断了食蟹猴IL-31和人IL-31RA之间的相互作用(见图10)。
6.6.同时抑制人IL-4和IL-31信号传导的效力评估(BEAS-2B试验；CCL2)
为了评估Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199同时抑制IL-4和IL-31诱导的信号传导的效力，使用BEAS-2B(人支气管上皮)细胞实施了基于细胞的分析，使用夹心ELISA用于读数。在该试验中，两种信号通路的阻断导致BEAS-2B细胞分泌的CCL2减少。
将每孔25,000个细胞接种在96孔板中的100μl生长培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天，洗涤细胞，向1ng/ml IL-4和10ng/ml IL-31中加入dupilumab和BMS-981164的组合或Morrison-H抗体PRO2198或PRO2199的系列稀释液。然后将细胞孵育24小时，收集上清液，并通过从商业试剂盒改编的夹心ELISA来测量分泌的CCL-2的浓度。
BEAS-2B测定法是唯一可用于评估IL-4和IL-31的联合抑制的测定法。与dupilumab和BMS-981164的组合相比，PRO2198和PRO2199均能够同时阻断IL-4和IL-31信号传导，具有相似的效力。它们达到了与参照分子的组合相当的抑制水平(见图1)。
6.7.抑制人PBMC亚群上人IL-4诱导的CD23上调的效力评估
使用人PBMC评估了单核细胞和幼稚及记忆B细胞中IL-4诱导的CD23上调。根据改进的Leucosep方案，使用具有整合的多孔屏障的Leucosep管和梯度密度离心，从新鲜全血中分离人PBMC。
将每孔400,000个PBMC接种在96孔板中的100ml分析培养基中。在存在2ng/ml IL-4的情况下，将Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199、没有连接抗IL-31scFv结构域的参照抗IL-4R IgG4抗体PRO2209和PRO2210以及参照抗体dupilumab的三倍系列稀释液加入平板中，浓度范围为10,000至0.169ng/ml。在37℃和5％CO2下孵育48小时后，使用小鼠抗人CD19-PE、小鼠抗人CD14-PerCP/Cy5.5、小鼠抗人CD14-PerCP/Cy5.5和小鼠抗人CD23-APC染料对PBMC进行染色，用于流式细胞术分析。FACS分析后，使用圈门的CD23单核细胞、CD23幼稚B细胞和CD23记忆B细胞的几何平均值用于计算。使用GraphPad Prism软件，应用四参数逻辑(4PL)曲线拟合来计算抑制曲线的IC50值。
表46总结了PBMC分析数据。不同献血者获得的IC50值以皮摩尔表示。与dupilumab相比，Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199以及参照IgG4抗体PRO2209和PRO2210在抑制单核细胞、幼稚细胞和记忆B细胞中IL-4诱导的CD23上调方面表现出相似的效力。当格式为没有连接抗IL-31结构域的IgG4分子时，与dupilumab相比，该分子以相同的效力阻断IL-4诱导的信号传导(参见图11)。因此，添加抗IL-31结构域对IL-4抑制能力几乎没有影响。
6.8.抑制人全血中人IL-4诱导的TARC产生的效力评估
为了测定抑制IL-4诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC，也称为CCL17)分泌的效力，使用了基于商业ELISA作为读数的全血试验。两种信号通路的阻断导致全血中TARC水平降低。
在含有抗凝血剂EDTA的无菌试管中收集人外周全血，用于该分析。将dupilumab、PRO2198或PRO2199的系列稀释液加入到圆底孔的96孔板中，每孔160μl，范围为64,800至1.10pM，孔中具有1ng/ml IL-4或1ng/ml IL-13。在每孔加入40μl全血后，将平板在37℃下用5％CO2孵育24小时。第二天，将平板以1,000g离心10分钟，收集上清液并在-20℃冷冻。然后使用来自R&DSystems的人TARC/CCL17 DuoSet ELISA试剂盒分析上清液，并测定TARC水平。
对来自三个不同供体的血液进行TARC分析，以检测IL-4诱导的TARC分泌。PRO2198和PRO2199中和人全血中IL-4诱导的TARC，其效力与dupilumab相当，即IC50值小于500pM。
实施例7：生物物理表征
对Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207进行了几种生物物理表征程序。研究了以下生物物理特性:
1.身份确认
2.多pH压力研究
a.化学稳定性和电荷不均匀性
b.耐热性
3.高浓度可行性(HCF)研究
7.1.身份确认:
质量测定
使用ESI-MS通过完整质量分析来分析质量。所有测试的Morrison-H和Morrison-L抗体，即PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207，显示了预期的轻链和重链质量。此外，重链显示出预期的糖基化。表47显示了每种Morrison抗体的测定质量。
表42：与转染的HEK293T细胞上的人和食蟹猴IL-4R细胞质膜结合。
表43:在stat-6报告基因试验中，在试验介质中有和没有IL-31的情况下，Morrison-H和Morrison-L抗体中和人IL-4诱导的信号传导的效力。N＝重复分析的次数。
*IC50或相对IC50(单次分析)/NA:不适用
**平均值
表44：stat-6报告基因试验中，Morrison-H和Morrison-L分子中和人IL-13诱导的信号传导的能力。N＝重复分析的次数。
*IC50或相对IC50(单次分析)/NA:不适用
**平均值
表45：在IL-31RA/OSMR二聚化试验中，在介质中有和没有IL-4R的情况下，Morrison-H和Morrison-L分子中和人IL-31诱导的信号传导的效力。N＝重复分析的次数。
*IC50或相对IC50(单次分析)/NA:不适用
表46：Morrison抗体中和人PBMC上IL-4诱导的CD23表达的能力
*近似值，拟合曲线时应用最高限制
表47：还原条件下发现的每种Morrison抗体的轻链和重链的质量
糖基化模式
更详细地分析了PRO2198和PRO2199的糖基化模式。两种分子显示出相似的糖基化。各个重链的相对糖基化的近似值如表48所示。这两种分子都主要被G0F糖糖基化。还发现了较少量的G1F和G2F。没有观察到重链的非糖基化质量。
表48：重链糖基化的类型和相对丰度
SDS page
在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE额外分析了Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207的身份(参见图12)。
对于Morrison-H分子，在还原和非还原条件下均观察到了预期的条带。在还原条件下观察到了一些HC二聚体，推测是由于链间二硫键的不完全还原。
在Morrison-L分子的情况下，所有预期的条带在还原和非还原条件下均可见，并代表最显著的种类。在还原条件下在37kDa和50kDa之间观察到了额外条带，表明LC或HC在所选条件下没有完全变性或还原。在75kDa和100kDa之间的条带可能来自LC二聚体。在非还原条件下，LC和LC二聚体是可见的。对于IgG分子，已知LC和LC二聚体是可溶的，并且可以使用一般的纯化方法呈现。
7.2.多pH压力研究:
多pH压力研究的目的是检查Morrison-H和Morrison-L抗体PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207的化学和热稳定性。将分子透析到pH为3.5、5、7和8.5的20mM MES/乙酸盐/Hepes缓冲液中。在后三种条件下，样品在40℃孵育10天，以强制化学降解，如氧化和剪切。pH 3.5是导致快速降解和水解的苛刻的应激条件，因此这些样品在25℃孵育10天。通过CEX-HPLC分析电荷变体的形成，通过SDS-PAGE研究剪切。分子以1mg/ml的浓度孵育。通过nDSF(NanoTemper)分析热稳定性，测定解折叠起始(Tonset)、解折叠中点(Tm1)和聚集起始(TScattering)。
电荷变体特征
在随后的DSP开发过程中，高产率的纯化是一项重要措施。用于纯化IgG类分子的主要技术之一是离子交换层析。因此，在离子交换纯化步骤的开发过程中，通过CEX-HPLC显示高目标纯度的IgG抗体可能不太具有挑战性。
所有测试的抗体，即PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207，显示出相当的复杂性(电荷异质性)，其中Morrison-L分子显示出比Morrison-H分子稍小的复杂性。此外，基于IL-4R克隆sc09的分子PRO2199和PRO2207具有稍高的目标纯度。
总之，在一般纯化过程后，所有分子显示出低电荷异质性，没有实质性差异。
电荷变体的形成
在pH 3.5、pH 5、pH 7和pH 8.5的20mM MES/乙酸盐/Hepes缓冲液中孵育后，分析了PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207的电荷变体的形成。特别重要的是在pH 5和pH 7时的化学稳定性，因为这些pH值定义了以后制剂空间的近似极限。表49显示了获得的结果。在pH 5时，所有分子对化学降解都表现出良好的稳定性。pH值越高，化学降解形成酸性变体越多。除了PRO2206在pH 8.5时具有较高的靶标损失之外，所有分子都表现出相似的稳定性。在pH值为3.5时，仅观察到少量的化学降解。
表49：不同pH下电荷变体的形成(#1pH 3.5下的储存温度为25℃)
通过SDS-PAGE分析剪切
使用SDS-PAGE分析对所有蛋白质进行剪切分析(参见图13)。在pH 3.5、pH 5和pH7下，没有观察到任何Morrison抗体的片段化。在pH 8.5时，仅观察到PRO2198和PRO2199的HC的少量片段化。虽然对于Morrison-L分子没有观察到HC剪切，但是它可以被紧密运行的LC覆盖。
总之，所有分子都表现出良好的抗剪切性。
热稳定性
在pH压力研究中，分析了PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207在pH 3.5和pH 8.5之间的热稳定性。确定了热解折叠以及热聚集的起始。在热解折叠过程中，由于分子的多域结构，所有分子都表现出一个以上的转变。为简单起见，仅显示了第一个融化中点。表50总结了结果。
表50:热稳定性
对于所有分子，解折叠起始温度(Tonset)以及第一熔点(Tm1)均在pH 7时最高。pH值变为8.5仅略微降低了热稳定性。向酸性pH方向，热稳定性下降。然而，在pH 5时，所有解折叠起始温度都在55℃以上。在pH 3.5，热稳定性降低到Tonset低于50℃。
仅在pH 7和pH 8.5观察到了热聚集。在酸性pH(pH 3.5和pH 5.0)下，所有Morrison抗体都没有形成更大的聚集体，即使在解折叠状态下也是如此。在中性和碱性pH，聚集起始温度在第一熔点以上，表明了非天然聚集机制。
虽然分子之间的差异不是很大，但PRO2198总体上具有最高的稳定性。这在pH值为3.5时最为突出，与PRO2207相比，Tonset高出5℃。该pH值与病毒灭活步骤的生产过程相关。
7.3.高浓度研究
对于浓缩可行性试验，将PRO2198配制在两种配方缓冲液中：
配方缓冲液F1:20mM乙酸盐，pH 5.5
配方缓冲液F2:20mM柠檬酸盐和50mM NaCl，pH 5.5。
溶解度-蛋白质浓度
PRO2198可浓缩至100mg/ml以上，无沉淀迹象或达到溶解度极限。此外，PRO2198未显示出可检测到的蛋白质浓度降低，即PRO2198在4℃和25℃可充分溶解以达到并保持100mg/ml以上的目标浓度至少四周。
不同温度下的单体稳定性
将PRO2198配制在F1和F2中，并浓缩至>100mg/ml。浓缩样品在4℃、25℃和40℃储存长达4周。在不同的时间点，通过SE-HPLC分析单体含量。结果总结在表51中。
表51:浓度>100mg/ml的PRO2198的单体稳定性
7.4.Morrison-H和Morrison-L抗体的生物物理表征中使用的一般方法
缓冲液交换
通过透析进行缓冲液交换。抗体在Spectra Pro 3透析膜(SpectrumLaboratories)中用至少200倍过量的透析缓冲液透析。
抗体的浓缩
使用截留分子量(MWCO)为10kDa或30kDa的离心浓缩器浓缩抗体。样品在22℃离心5分钟，直到达到目标浓度。在两个步骤之间，将样品重悬。
蛋白质浓度的测定
使用Tecan板读数器和NanoQuant板测定蛋白质样品的浓度。使用缓冲液作为空白，从280nm处测得的吸光度中减去。针对在310nm处测定的可见颗粒引起的散射，对每次测量进行校正。将校正值归一化为1cm的光程长度，并使用相应蛋白质的理论消光系数计算蛋白质浓度。对于浓度高于10mg/ml的蛋白质样品，将样品在相应的缓冲液中稀释至少10倍或稀释至1mg/ml的标称浓度。
SDS-PAGE
在还原条件下进行SDS-PAGE。变性和还原后，将5g样品施加到梯度凝胶(4％-20％)上。分离后，蛋白质条带用考马斯蓝染色，凝胶用纯水脱色。
储存
为了评估蛋白质在不同温度下的稳定性，将样品在4℃、25℃和40℃孵育。在标称温度为4℃的冰箱中在4℃储存。对于在25℃和40℃的储存，将样品分别置于湿度控制在65％rH和75％rH的柜中。
通过nanoDSF分析热解折叠
通过Sypro Orange的荧光强度变化测定了使用热位移分析的热解折叠。染料的荧光对疏水相互作用很敏感。随着蛋白质解折叠，疏水氨基酸暴露于溶剂中，导致SyproOrange的荧光增加。通过将数据拟合到玻尔兹曼方程来确定所得热解折叠(Tm)中点以及在最大信号的10％处计算的起始温度(Tonset是在min.信号+0.1*(max.信号–min.信号))。
通过SE-HPLC测定单体含量
使用在50mM磷酸钠、300mM NaCl、pH 6.5中运行的Shodex KW403-4F柱，通过分析尺寸排阻色谱法测定单体含量。为了分析，注入5g样品并记录280nm处的吸收。样品的质量表示为单体、HMWS和LMWS的相对百分比。
阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)
对于电荷变体的量化，应用了分析阳离子交换色谱法。样品在MAbPacTM SCX-10色谱柱上进行分析。使用从pH 4到pH 10的pH梯度分离电荷变体。为了分析，注入30g样品，在280nm处记录吸收。样品的质量以目标、酸性电荷变体和碱性电荷变体的相对百分比来表示。
质谱
为了鉴定和排除严重的翻译后修饰，测定了Morrison抗体的完整质量。在ESI-MS分析之前，用DTT还原样品，脱盐并在MeOH:2-PrOH:0.2％FA(30:20:50)中分析。在Syn-aptG2-Si质谱仪上进行样品的纳米ESI-MS分析。然后，通过应用最大熵算法MaxEnt1(MaxLynx)，将记录的m/z数据解卷积成质谱，输出质量的分辨率为0.5Da/通道，在0.7Da的半高度采用均匀高斯损伤模型。
序列表
<110> 努玛治疗有限公司(Numab Therapeutics AG)
<120> 对IL-4R和IL-31具有特异性的多特异性抗体
<130> 117032P877PC
<150> EP20216957:9
<151> 2020-12-23
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 1
Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala His Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 2
Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 3
Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Ser Leu
<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp
100 105 110
Pro Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 7
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr Leu Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 8
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 9
Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Ile
1 5 10
<210> 10
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Ile
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Arg Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Ile
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<220>
<223> 人工抗体相关序列
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Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
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<211> 18
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<213> 人工序列
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<223> 人工抗体相关序列
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Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
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Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 15
Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Val Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Pro
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp Leu Asp Arg Phe Phe
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 16
Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Val Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Pro
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp Leu Asp Arg Phe Phe
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 17
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 18
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Glu Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 19
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 20
Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly Gly His Ile Gly Trp Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 21
Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly Gly His
85 90 95
Ile Gly Trp Gly
100
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 22
Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Glu Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly Gly His
85 90 95
Ile Gly Trp Gly
100
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Asp Ala Val Tyr Gly Tyr Ala Asn Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Val
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly
85 90 95
Asp Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
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Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 27
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 29
Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 30
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 31
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 32
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 33
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Arg Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 38
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp
100 105 110
Pro Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
130 135 140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165 170 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195 200 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210 215 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
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Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
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Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
465 470 475 480
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser
485 490 495
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
530 535 540
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly Gly
545 550 555 560
His Ile Gly Trp Gly Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val
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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser
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Phe Ser Ala Asn Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
625 630 635 640
Gly Leu Glu Trp Ile Val Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp Thr
645 650 655
Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
660 665 670
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
675 680 685
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp Leu
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Asp Arg Phe Phe Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 216
<212> PRT
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<220>
<223> 人工抗体相关序列
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
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Ser Asn Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
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165 170 175
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
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His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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195 200 205
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Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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<210> 41
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 41
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
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Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
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Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala His Tyr
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Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 44
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 45
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275 280 285
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Gly His Ile Gly Trp Gly Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg
355 360 365
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
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Ser
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<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195 200 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210 215 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455
<210> 47
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
225 230 235 240
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp
245 250 255
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu
260 265 270
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
290 295 300
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Gly His Ile Gly Trp Gly Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg
355 360 365
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
370 375 380
Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Val Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp
405 410 415
Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp
420 425 430
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
435 440 445
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp
450 455 460
Leu Asp Arg Phe Phe Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
465 470 475 480
Ser
<210> 48
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
130 135 140
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
195 200 205
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450
<210> 49
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Thr Gly
85 90 95
Ser Asn Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Ala Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
225 230 235 240
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp
245 250 255
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu
260 265 270
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
290 295 300
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Gly His Ile Gly Trp Gly Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg
355 360 365
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
370 375 380
Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Val Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Asp
405 410 415
Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp
420 425 430
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
435 440 445
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Asp
450 455 460
Leu Asp Arg Phe Phe Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
465 470 475 480
Ser
<210> 50
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工抗体相关序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Ala Phe Val Asn Arg Gly Val Ser Trp Ile Trp Pro
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
130 135 140
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
195 200 205
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450

Claims (18)

1.一种多特异性抗体，其包含：
a)一个或两个特异性结合IL-4R的结合结构域(IL4R-BD)，和
b)一个或两个特异性结合IL-31的结合结构域(IL31-BD)，
其中
-所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区；
-每个所述IL4R-BD包含
SEQ ID NO:1的HCDR1序列，
SEQ ID NO:2的HCDR2序列，
SEQ ID NO:3的HCDR3序列，
SEQ ID NO:7的LCDR1序列，
SEQ ID NO:8的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:9的LCDR3序列，且
-每个所述IL31-BD包含
SEQ ID NO:12的HCDR1序列，
SEQ ID NO:13的HCDR2序列，
SEQ ID NO:14的HCDR3序列，
SEQ ID NO:17或18的LCDR1序列，
SEQ ID NO:19的LCDR2序列，和
SEQ ID NO:20的LCDR3序列。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫球蛋白Fc区选自IgG亚类，特别是IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
3.根据权利要求2所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自二价双特异性IgG形式、三价双特异性IgG形式和四价双特异性IgG形式；
更特别地，其中所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))，甚至更特别地选自DVD-Ig和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))。
4.根据权利要求3所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自Morrison形式。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含两个IL4R-BD和/或两个IL31-BD。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中IL4R-BD位于Fab臂中，并且IL31-BD位于Morrison形式的scFv部分中。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的多特异性抗体，其中多特异性抗体的形式选自Morrison-L和Morrison-H形式，特别是Morrison-H形式。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD和所述IL31-BD还包含VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；特别是VH3结构域框架序列FR1至FR4。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中当处于scFv形式时，所述IL4R-BD和所述IL31-BD包含
(i)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包括框架区FR1、FR2和FR3，它们选自Vκ亚型，特别是选自Vκ1和Vκ3亚型，特别是Vκ1亚型，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，更特别是选自SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:33中的任一个的VλFR4，特别是根据SEQ ID NO:26或33的VλFR4。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL4R-BD包含
a)与选自SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和
b)与选自SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，
特别地其中所述IL4R-BD包含：
a)SEQ ID NO:4的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列；或
b)SEQ ID NO:5的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列；或
c)SEQ ID NO:6的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述IL31-BD包含
a)与选自SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和
b)与选自SEQ ID NO:21和22的氨基酸序列中的任意一个至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，
特别地，其中所述IL31-BD包含：
a)SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:22的VL序列；或
b)SEQ ID NO:16的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中两个IL4R-BD中的至少一个和两个IL31-BD中的至少一个能够同时结合它们各自的抗原。
13.一种核酸或两种核酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体。
14.一种载体或两种载体，其包含权利要求13所述的一种核酸或所述两种核酸。
15.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含权利要求14所述的一种载体或所述两种载体。
16.一种生产权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体的方法，包括(i)提供权利要求13的一种核酸或两种核酸，或权利要求14的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或所述两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达体系中收集所述多特异性抗体，或(ii)提供权利要求15的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述多特异性抗体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
18.权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗疾病，所述疾病选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病，特别是选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
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