CN116888151A - 结合il-4r的抗体可变结构域 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性结合IL‑4R的抗体可变结构域，涉及包含一个或两个所述抗体可变结构域和至少一个特异性结合不同于IL‑4R的靶标的其它结合结构域的多特异性抗体。本发明进一步涉及编码所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的一种核酸或两种核酸、包含所述一种核酸或所述两种核酸的载体、包含所述一种核酸或所述两种核酸或所述载体的宿主细胞，以及产生所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，涉及包含一个或两个所述抗体可变结构域和至少一个特异性结合不同于IL-4R的靶标的其它结合结构域的多特异性抗体。本发明进一步涉及编码所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的一种核酸或两种核酸、包含所述一种核酸或所述两种核酸的载体、包含所述一种核酸或所述两种核酸或所述载体的宿主细胞，以及产生所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。
背景技术
白细胞介素-4受体IL-4Rα，本文也称为IL-4R或IL4R，是一种I型受体。它在与普通细胞因子受体γ链(γc)直接相互作用后或通过与II型受体，如特别是与II型受体IL-13Rα1形成受体复合物来结合白介素4(IL-4)。这种IL-4R/IL-13Rα1受体复合物可以结合白细胞介素4(IL-4)以及白细胞介素13(IL-13)来调节B细胞中IgE抗体的产生。还已知，IL-4与IL-4R结合可激活巨噬细胞并促进2型辅助T细胞(Th2细胞)的分化，从而导致Th2驱动的炎症。IL-4和/或IL-13与IL-4Rα/γc和/或IL-4R/IL-13Rα1结合，导致Janus激酶(JAK)1、JAK2、信号转导和转录激活因子(STAT)1、STAT3、STAT6的激活和STAT二聚化，进而诱导特定基因的转录。
IL-4R信号传导已被证明与一些人类疾病有关，如炎症性和自身免疫性疾病，包括特应性皮炎、结节性皮肤病、鼻息肉、慢性荨麻疹、哮喘和慢性阻塞性肺病。
现有技术中已经描述了几种单克隆抗体，它们通过结合细胞因子IL-4和/或IL-13或与IL-4R结合来减少或阻断IL4R介导的信号传导，用于治疗此类疾病。
例如，Regeneron Pharmaceuticals和Sanofi Genzyme开发的度普利尤单抗(dupilumab)通过与IL-4R的α亚基结合来拮抗IL-4R，已于2017年获得美国食品和药物管理局批准用于中度至重度特应性皮炎和治疗慢性鼻炎与鼻息肉病(CRSwNP)。它还被进一步评估用于治疗成人和青少年的持续性哮喘。2018年，度普利尤单抗还获得了美国食品和药物管理局对哮喘的批准。
此外，WO 2014/039461描述了用于治疗特应性皮炎的抗IL4R拮抗性抗体。
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，其特点是强烈的瘙痒(即严重的瘙痒)和鳞屑性和干燥的湿疹性皮损。严重的疾病可因重大的心理问题、严重的睡眠损失和生活质量的损害而造成极大的残疾，导致高社会经济成本。AD常在5岁前的儿童期开始，可能持续到成年。
AD的病理生理学受免疫球蛋白E(IgE)介导的致敏、免疫系统和环境因素之间复杂的相互作用影响。原发性皮肤缺损可能是一种免疫紊乱，导致IgE介导的过敏反应，并伴有上皮屏障功能障碍，这是基因突变和局部炎症的结果。
然而，上述抗IL-4R疗法具有显著的局限性。对于许多过敏性、炎性和自身免疫性疾病，甚至对于那些与IL-4R信号传导不平衡相关的疾病，它们的功效通常是有限的和/或应答率是低到中等的。目前可用的抗IL-4R疗法的这种次优表现的一种解释可能是IL-4R信号传导不平衡不是这些疾病的唯一原因。因此，为了提高这些疗法的应答率和/或疗效，还必须解决其他信号通路。除此之外，这些类型的疾病中的许多与同样应当治疗的破坏性症状有关，例如瘙痒。抗IL-4R疗法不能直接解决瘙痒问题。然而，瘙痒是皮肤相关炎症和自身免疫性疾病的常见症状，例如AD。与瘙痒相关的抓挠通常会促进炎症和疾病相关症状的恶化。因此，对于患有此类过敏性、炎性和自身免疫性疾病的患者，迫切需要额外的基于IL-4R的治疗选择。
更具体而言，希望手头有一种稳定且有效的抗IL-4R抗体构件，可以很容易地并入多特异性抗体格式中，另外还能干扰其他信号通路。所述抗IL-4R构件应该具有抑制IL-4和/或IL-13介导的信号传导的高效力。此外，所述构件应该具有优异的生物物理性质，例如特别是高稳定性，以便于它们有效地并入到适于药物开发的多特异性抗体中。
具体而言，所述抗IL-4R构件，即抗体结合结构域，应表现出以下最低特征：
-它应该以200pM或更小的单价解离常数(KD)与人IL-4R结合，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
-它应该与食蟹猴(Cynomolgus)IL-4R交叉反应，特别是它应该以5nM或更小的单价KD与食蟹猴IL-4R结合，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
-它应该具有63℃或更高的熔化温度(Tm)，通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定，特别是当配制在pH 6.4的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液和150mMNaCl中时。
此外，期望所述抗IL-4R构件有能力中和人IL-4诱导的信号传导，以5ng/ml或更低的IC50，并有能力中和人IL-13诱导的信号传导，以10ng/ml或更低的IC50，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的。下文项目7列出了进一步的理想特征。
尽管在现有技术中已知如何鉴定满足一个或两个上述标准的抗IL-4R抗体可变结构域的策略，但鉴定满足所有这些标准(更不用说下文项目7中提及的大多数或所有标准)的此类抗体可变结构域具有挑战性，且结果不可预测。
发明内容
本发明的一个目的是提供新的抗体可变结构域，其特异性结合IL-4R，能够有效降低或消除IL-4和IL-13介导的活性，同时高度稳定，从而可以容易地掺入到多特异性抗体形式中。
本发明人现已惊奇地发现，基于单克隆兔抗体克隆44-34-C10的scFv能够以高亲和力结合人IL-4R以及食蟹猴IL-4R，并有效地阻断IL-4R信号传导，同时表现出优异的稳定性。该抗体克隆是来自广泛免疫活动的已被鉴定为以高亲和力结合IL-4R的有限数量的单克隆兔抗体克隆之一。具体而言，衍生自克隆44-34-C10的scFv以较低pM范围的解离常数(KD)与人IL-4R结合，并以远低于1nM的KD与食蟹猴IL-4R结合，可中和IL-4和IL-13诱导的信号传导，IC50分别低于1.5ng/ml和低于2.5ng/ml，具有63℃或更高的熔化温度(Tm)，由DSF测定，并可在4℃以10mg/ml的浓度储存4周，蛋白质含量和单体含量没有显著损失。这是特别令人惊讶的，因为从其它克隆产生的scFv没有一个表现出良好的药理学活性同时又具有高稳定性。对这些scFv的药理学活性的优化几乎完全导致了稳定性的恶化，反之亦是如此。
因此，基于克隆44-34-C10的scFv代表了合适的构建模块，其可以容易地掺入多特异性抗体形式，例如Morrison中。
因此，在第一方面，本发明涉及一种特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，其包含：
a)VH链，其具有选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的序列，和
b)VL链，其具有选自SEQ ID NO:14、15、16、17和18的序列。
在第二方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)如本文所定义的一个或两个抗体可变结构域；
b)至少一个结合结构域，其特异性结合不同于IL-4R的靶标。
第三方面，本发明涉及一种核酸或两种核酸，其编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体。
第四方面，本发明涉及一种载体或两种载体，其包含本发明的所述核酸或所述两种核酸。
第五方面，本发明涉及一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含本发明的所述载体或所述两种载体。
在第六个方面，本发明涉及一种生产本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的方法，包括(i)提供本发明的一种核酸或两种核酸，或本发明的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或所述两种核酸，或所述一种载体或两种载体，并从表达体系中收集所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体，或(ii)提供本发明的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体。
第七方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体和药学上可接受的载体。
在第八方面，本发明涉及本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体，其用作药物。
第九方面，本发明涉及本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病。
第十方面，本发明涉及一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病的方法，包括以下步骤：向有需要的患者施用本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体。
分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：
1.一种特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，其包含:
a)可变重链(VH)，
其中所述可变重链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW指定一个重链框架区，每个HCDR指定一个重链互补决定区，并且其中
所述HCDR1具有SEQ ID NO:1的序列；
所述HCDR2具有SEQ ID NO:2的序列；且
所述HCDR3具有SEQ ID NO:3的序列；
b)可变轻链(VL)，
其中所述可变轻链从N末端到C末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW指定一个轻链框架区，每个LCDR指定一个轻链互补决定区，并且其中
所述LCDR1具有SEQ ID NO:10的序列；
所述LCDR2具有选自SEQ ID NO:11或12的序列；且
所述LCDR3具有SEQ ID NO:13的序列。
2.根据项目1所述的抗体可变结构域，其中所述可变重链是VH3链，且/或其中所述可变轻链是Vκ1轻链。
3.根据项目1所述的抗体可变结构域，其中
-所述可变重链是VH3链，
-LFW1、LFW2和LFW3是Vκ1轻链亚型，并且
-LFW4具有选自SEQ ID NO:22至29的人Vλ序列。
4.根据前述项目中任一项所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域选自Fab、Fv、scFv、dsFv和scAB，优选选自Fab、Fv、scFv和dsFv，特别是Fab、scFv和dsFv。
5.根据前述项目中任一项所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域包含：
a)VH链，其具有与选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的任一氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列；和
b)VL链，其具有与选自SEQ ID NO:14、15、16、17和18的任一氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。
6.根据项目1至5中任一项所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域阻断IL4和IL13与IL4R的结合。
7.根据项目1至5中任一项所述的抗体可变结构域，其中当处于scFv形式时，所述抗体可变结构域表现出下列特征中a.至f.中的至少两种：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
c.与普通狨(Callithrix jacchus)IL-4R交叉反应，特别是与普通狨IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
d.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的；
e.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
f.抑制人IL-4与人IL-4R的结合，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2ng/ml，如在竞争性ELISA中所测量的；
并且其中当处于scFv形式时，所述抗体可变结构域进一步表现出下列特征中的至少一种：
g.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％。
i.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃储存四周后，蛋白质含量损失小于5％，特别是小于4％，特别是小于3％，特别是小于2％，特别是小于1％。
j.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在5次冻融循环后，单体含量损失小于2％，特别是小于1％。
8.根据项目7所述的抗体可变结构域，其中当处于scFv形式时，所述抗体可变结构域至少表现出特征a、b和g。
9.根据项目7所述的抗体可变结构域，其中当处于scFv形式时，所述抗体可变结构域至少表现出特征a.、b.、d.、e.、g.和h.，特别是至少特征a.、b.、d.、e.、f.、g.、h.和i.。
10.根据项目7所述的抗体可变结构域，其中当处于scFv形式时，所述抗体可变结构域表现出a至j的所有特征。
11.根据前述项目中任一项所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域包含：
a)VH链，其具有选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的序列，和
b)VL链，其具有选自SEQ ID NO:14、15、16、17和18的序列。
12.根据前述项目中任一项所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域包含：
a)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:14的序列；或者
b)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:17的序列；或者
c)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:18的序列；或者
d)VH链，其具有SEQ ID NO:5的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:15的序列；或者
e)VH链，其具有SEQ ID NO:6的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:16的序列；或者
f)VH链，其具有SEQ ID NO:7的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:14的序列；或者
g)VH链，其具有SEQ ID NO:8的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:18的序列；或者
h)VH链，其具有SEQ ID NO:9的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:14的序列。
13.根据前述项目中任一项所述的抗体可变结构域，其是scFv抗体，具有选自SEQID NO:33至39的序列。
14.一种多特异性抗体，其包含：
a)项目1至13中任一项所定义的一个或两个抗体可变结构域；
b)至少一个结合结构域，其特异性结合不同于IL-4R的靶标。
15.根据项目14所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。
16.根据项目15所述的多特异性抗体，其中多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、圆形二聚体scDb(CD-scDb)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)、Fab-Fv2、三体(triabody)、scDb-scFv、四体(tetrabody)、二-二体、串联-二-scFv和MATCH。
17.根据项目15所述的多特异性抗体，其中所述抗体不包含CH1和/或CL区。
18.根据项目17所述的多特异性抗体，其中所述抗体是scDb-scFv、三体、四体或MATCH形式，特别是其中所述多特异性抗体是MATCH或scDb-scFv形式，更特别是其中所述多特异性抗体是MATCH形式，更特别是MATCH3或MATCH4形式。
19.根据项目14所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。
20.根据项目19所述的多特异性抗体，其中所述免疫球蛋白Fc区选自IgG亚类，特别是IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
21.根据项20所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的格式选自二价双特异性IgG格式、三价双特异性IgG格式和四价双特异性IgG格式；
更特别地，其中所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))，甚至更特别地选自DVD-Ig和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))。
22.根据项21所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的格式选自Morrison-H和Morrison-L格式。
23.根据项目14至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：项目1至13中任一项所定义的两个抗体可变结构域，和特异性结合不同于IL-4R的第二靶标的两个结合结构域。
24.一种核酸或两种核酸，其编码项目1至13中任一项的抗体可变结构域或项目14至23中任一项的多特异性抗体。
25.一种载体或两种载体，其包含项目24的所述一种核酸或所述两种核酸。
26.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含项目25的所述一种载体或所述两种载体。
27.一种生产项目1至13中任一项的抗体变域或项目14至23的多特异性抗体的方法，包括(i)提供项目24的一种核酸或两种核酸，或项目25的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸或所述两种核酸，或所述一种载体或所述两种载体，并从表达体系中收集所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体，或(ii)提供项目26的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细胞；以及从细胞培养物中收集所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体。
28.一种药物组合物，其包含项目1至13中任一项的抗体可变结构域或项目14至23中任一项的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
29.项目1至13中任一项的抗体可变结构域或项目14至23中任一项的多特异性抗体，其用作药物
30.项目1至13的抗体可变结构域或项目14至23中任一项的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病。
31.根据项目30使用的抗体可变结构域或多特异性抗体，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
32.一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病的方法，包括以下步骤：向有需要的患者施用项目1至13的抗体可变结构域、项目14至23中任一项的多特异性抗体。
33.根据项目32所述的方法，其中所述疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘；特别是其中所述疾病是特应性皮炎。
附图说明
图1显示了在stat-6报告基因试验中，最佳排序的scFv中和IL-4诱导的信号传导的效力。与度普利尤单抗相比，最佳排序的scFv(A)PRO1515(44-32-F04sc01)和PRO1517(44-34-C10 sc01)、(B)PRO1524(44-03-A03-sc04)、(C)PRO1535(44-34-C10 sc04)和(D)PRO1552(44-18-C11-sc08)显示的IC50值与度普利尤单抗中和IL-4诱导的信号传导相当。
图2显示了在stat-6报告基因试验中，最佳排序的scFv中和IL-13诱导的信号传导的效力。与度普利尤单抗相比，最佳排序的scFv(A)PRO1515(44-32-F04 sc01)和PRO1517(44-34-C10 sc01)、(B)PRO1524(44-03-A03-sc04)、(C)PRO1535(44-34-C10 sc04)和(D)PRO1552(44-18-C11-sc08)显示的IC50值与度普利尤单抗中和IL-13诱导的信号传导相当。
图3显示了在HEK-Blue细胞中在stat-6报告基因试验中，优化的抗IL-4RscFvPRO1898和PRO1899阻断人IL-4诱导的信号传导(A)和人IL-13诱导的信号传导(B)的效力。所分析的分子的效力与度普利尤单抗进行比较。
图4显示了scFv(A)PRO1515、(B)PRO1533、(C)PRO1517和PRO1535和(D)PRO1538抑制IL-4和IL-4R之间相互作用的效力。PRO1515(44-32-F04 sc01)、PRO1517(44-34-C10sc01)、PRO1533(44-32-F04 sc04)和PRO1535(44-34-C10sc04)显示的IC50值与度普利尤单抗相当。
图5显示了优化的抗IL-4R scFv PRO1898(A)和PRO1899(B)抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的效力，通过竞争性ELISA评估。
具体实施方式
已知的治疗性抗IL-4R抗体往往因缺乏疗效和对过敏性、炎性和自身免疫性疾病患者的低至中度反应率而受到限制，甚至在这些疾病与IL-4R信号不平衡有关的情况下也是如此。这些疗法也不能直接解决通常与这些疾病有关的破坏性症状，例如瘙痒。因此，对于患有上述过敏性、炎性和自身免疫性疾病的患者来说，迫切需要有更多基于IL-4R的治疗方案。
本发明提供了新的抗IL-4R抗体可变结构，包括特定的VL和VH链。所述可变结构域是基于单克隆兔抗体克隆44-34-C10的。该克隆是从有限数量的单克隆兔抗体中挑选出来的，这些单克隆兔抗体在广泛的免疫活动中被发现以高亲和力结合IL-4R。衍生自所述单克隆兔抗体克隆44-34-C10的scFv以较低pM范围的解离常数(KD)与人IL-4R结合，并以远低于1nM的KD与食蟹猴IL-4R结合，可中和IL-4和IL-13诱导的信号传导，IC50分别低于1.5ng/ml和低于2.5ng/ml，具有63℃或更高的熔化温度(Tm)，由DSF测定，并可在4℃以10mg/ml的浓度储存4周，蛋白质含量和单体含量没有显著损失。
就本发明人所知，现有技术中不存在具有这种优势特性的抗IL-4R抗体可变结构域。
本发明的抗体可变结构域可以成功地并入到另外针对IL-31的多特异性抗体格式中。这些抗IL-4R x IL-31的多特异性抗体能够以高亲和力与IL-4R结合，并有效地抑制IL-4R介导的信号传导，同时表现出非常有利的生物物理特性，特别是在抗体浓度远高于100mg/ml时具有出色的制剂和储存稳定性。这表明，本发明的抗体可变结构域在并入到多特异性抗体格式中时也提供有利的生物和生物物理特性。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
一方面，本发明涉及一种特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，其包含：
a)VH链，其具有选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的序列，和
b)VL链，其具有选自SEQ ID NO:14、15、16、17和18的序列。
如本文所用，术语“抗体”等包括：完全抗体或其单链；及其任何抗原结合可变结构域(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，两侧是更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文所用的术语"抗体可变结构域"是指一个完整的抗体的一个或多个部分，它们具有与特定抗原(如IL-4R)特异性结合的能力。这可以是完整抗体的任何抗原结合片段(即"抗原结合部分")或其单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子。具体来说，就本发明的多特异性抗体而言，本文所用的术语"抗体可变结构域"是指Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段(Fv)；二硫稳定的Fv片段(dsFv)；单链Fv片段(scFv)；以及具有额外轻链恒定结构域(CL)融合的单链Fv片段(scAB)。优选地，本发明的抗体可变结构域选自Fab片段、Fv片段、二硫稳定的Fv片段(dsFv)和scFv片段。更优选地，本发明的抗体可变结构域选自Fab片段、二硫稳定的Fv片段(dsFv)和scFv片段。在特定的实施方案中，本发明的抗体可变结构域是Fab片段。在其他特定的实施方案中，本发明的抗体可变结构域是单链Fv片段(scFv)。在其他特定实施方案中，scFv片段的VL和VH结构域通过结构域间的二硫键稳定，特别是所述VH结构域在51位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基，并且所述VL结构域在141位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基。
术语“互补决定区”(“CDR”)是指使用许多著名方案中的任何一种确定边界的氨基酸序列，这些著名方案包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteinsof Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)；以及Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号方案)描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。
在本发明的背景下，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。具体地，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中，特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力(affinity)更大、亲合力(avidity)更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及规定标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，特别是至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。
在另一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)如本文所定义的一个或两个抗体可变结构域；
b)至少一个结合结构域，其特异性结合不同于IL-4R的靶标，特别是其中所述至少一个结合结构域是hSA-BD和/或IL31-BD。
在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。
在这些特定的实施方案中，多特异性抗体的形式优选选自由以下组成的组：串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、圆形二聚体scDb(CD-scDb)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)、Fab-Fv2、三体、scDb-scFv、四体、二-二体(di-diabody)、串联-二-scFv和MATCH(描述于WO 2016/0202457；Egan T.,et al.,MABS 9(2017)68-84)。特别是，本发明的多特异性抗体是MATCH格式。更特别地，本发明的多特异性抗体是MATCH3或MATCH4格式。
本文所用的术语"免疫球蛋白Fc区"或"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，即重链恒定区的CH2和CH3结构域。术语“Fc区”包括天然序列Fc区和变体Fc区，即经工程改造而表现出某些所需特性的Fc区，例如改变的Fc受体结合功能和/或减少或受抑制的Fab臂交换。这种工程化Fc区的一个实例是knob-into-hole(KiH)技术(例如见Ridgway etal.,Protein Eng.9:617-21(1996)和Spiess et al.,J Biol Chem.288(37):26583-93(2013)).天然序列Fc区包括人lgG1、lgG2(lgG2A、IgG2B)、lgG3和lgG4。“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。特别地，FcR是人FcR的天然序列，其结合IgG抗体，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.5:203-234(1997))。FcR的概述见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capet et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”包括其他FcR，包括将来将要鉴定的FcR。术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn的结合的方法是已知的，参见，例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人,NatureBiotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.TJI(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。还参见，例如，Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在其他具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区。
在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含IgG区。
本文使用的术语“IgG区域”是指免疫球蛋白G的重链和轻链，即如上定义的Fc区，以及由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab区。术语“IgG区”包括天然序列的IgG区，如人lgG1、lgG2(lgG2A、IgG2B)、lgG3和lgG4，以及工程改造的IgG区，其表现出某些期望的特性，例如上文针对Fc区定义的特性。
在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体包括IgG区域，其中IgG区域选自IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
如本文所用，术语抗体的“结合结构域”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完全抗体的一个或多个部分，其具有与给定的抗原特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。具体来说，就本发明的多特异性抗体而言，本文所使用的术语"结合结构域"、"其抗原结合片段"、"抗原结合部分"以及类似术语是指Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；二硫稳定的Fv片段(dsFv)；和单链Fv片段(scFv)。优选地，本发明的多特异性抗体的结合结构域彼此独立地选自Fab片段、Fv片段、scFv片段和单链Fv片段(scFv)。在特定的实施方案中，本发明的抗体的结合结构域彼此独立地选自Fab片段和单链Fv片段(scFv)。在其他特定实施方案中，scFv片段的VL和VH结构域通过结构域间的二硫键稳定，特别是所述VH结构域在51位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基，并且所述VL结构域在141位(AHo编号)包含单个半胱氨酸残基。
合适地，本发明的抗体可变结构域是分离的可变结构域。同样地，本发明的多特异性抗体也是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的可变结构域”或“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他可变结构域或抗体的可变结构域或抗体(例如，特异性结合IL-4R的分离的抗体可变结构域基本上不含特异性结合除IL-4R以外的抗原的抗体可变结构域)。此外，分离的可变结构域或分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
适当地，本发明的抗体可变结构域和多特异性抗体是单克隆抗体可变结构域和抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体可变结构域”或“单克隆抗体”是指氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的可变结构域或抗体。单克隆可变结构域或抗体对某个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。
本发明的抗体可变结构域和多特异性抗体包括但不限于嵌合体、人类和人源化抗体可变结构域和抗体。
本文所用术语“嵌合抗体”或“嵌合抗体可变结构域”指抗体分子或抗体可变结构域，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比对人类的抗原性降低。
如本文所用，术语“人抗体”或“人抗体可变结构域”旨在包括抗体或抗体可变结构域，其可变区中的框架区和CDR区均源自人源序列。此外，如果抗体或抗体可变结构域包含恒定区，则恒定区也源自这种人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式。本发明的人类抗体和抗体可变结构域可包含非由人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人类抗体或抗体可变结构域的该定义特别排除了包含结合非人类抗原的残基的人源化抗体或抗体可变结构域。可以使用本领域已知的各种技术来生产人类抗体和抗体可变结构域，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol,227:381(1992)；Marks等人,J.Mol.Biol,222:581(1991))。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体和人单克隆抗体可变结构域。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体和人抗体可变结构域，该转基因动物已经被修饰，以响应抗原攻击而产生此类抗体和人抗体可变结构域，但其内源基因座已被禁用，例如，免疫的xenomice(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的信息，还参见例如Li et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
本文所使用的术语"人源化"抗体或"人源化"抗体可变结构域是指保留了非人抗体或抗体可变结构域的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体或抗体可变结构域。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体或抗体可变结构域的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及源自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体和抗体可变结构域可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”或“重组人源化抗体可变结构域”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体和人类抗体可变结构域，例如从经转化以表达人源化抗体或人源化抗体可变结构域的宿主细胞中分离的抗体和抗体可变结构域，例如从转染瘤(transfectoma)，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体和抗体可变结构域。
优选地，本发明的抗体可变结构域和多特异性抗体是人源化的。更优选的是，本发明的抗体可变结构域和多特异性抗体是人源化的，并包括兔衍生的CDR。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，IL-4R and IL-31)上的两个或更多个不同表位结合的抗体。优选地，本发明的多特异性抗体是双特异性的。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与至少两个不同靶标(例如，IL-4R andIL-31)上的两个不同表位结合的抗体。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“构象”表位和“线性”表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
如本文所用，术语“构象表位”是指，当多肽链折叠形成天然蛋白时，在表面上聚集在一起的抗原氨基酸残基。
术语“线性表位”是指一种表位，其中蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生(连续)。
如本文所用，术语“识别”是指抗体或抗体可变结构域发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)。
合适地，本发明的多特异性抗体包括如本文所定义的一个或两个特异性结合IL-4R的抗体可变结构域。特别地，本发明的多特异性抗体包括如本文所定义的两个特异性结合IL-4R的抗体可变结构域。
术语"IL-4R"特别是指UniProt ID号为P24394的人类IL-4R。本发明的抗体可变区靶向人IL-4R。特别地，本发明的抗体可变结构域靶向人和食蟹猴IL-4R。更具体地，本发明的抗体可变结构域靶向人、食蟹猴和狨猴IL-4R。
当为scFv形式时，本发明的抗体可变结构域的特征在于以下参数：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；且
c.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH
6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中。
在具体的实施方案中，当为scFv形式时，本发明的抗体可变结构域的特征在于以下参数：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
c.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的；
d.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
e.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；且
f.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％。
在更具体的实施方案中，当为scFv形式时，本发明的抗体可变结构域的特征在于以下参数：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
c.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的；
d.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
e.抑制人IL-4与人IL-4R的结合，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2ng/ml，如在竞争性ELISA中所测量的；
f.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
g.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％；且
h.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃储存四周后，蛋白质含量损失小于5％，特别是小于4％，特别是小于3％，特别是小于2％，特别是小于1％。
在更具体的实施方案中，当为scFv形式时，本发明的抗体可变结构域的特征在于以下参数：
a.结合人IL-4R，单价解离常数(KD)为0.1至200pM，特别地KD为0.1至100pM，特别是0.1至50pM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的；
b.与食蟹猴IL4R交叉反应，特别是与食蟹猴IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
c.与普通狨(Callithrix jacchus)IL-4R交叉反应，特别是与普通狨IL-4R结合的KD为1pM至5nM，特别是1pM至3nM，特别是1pM至2nM，如通过SPR所测量的；
d.中和人IL-4诱导的信号传导，IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至3ng/ml，特别是IC50为0.01至1.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat6报告基因试验中所测量的；
e.中和人IL-13诱导的信号传导，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2.5ng/ml，如在HEK蓝细胞中的stat-6报告基因试验中所测量的；
f.抑制人IL-4与人IL-4R的结合，IC50为0.01至10ng/ml，特别是IC50为0.01至5ng/ml，特别是IC50为0.01至2ng/ml，如在竞争性ELISA中所测量的；
g.通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少63℃，特别是至少65℃，特别是至少67℃，特别是至少69℃，特别是至少70℃，特别是至少71℃，特别是至少72℃，特别是其中所述scFv配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃储存四周后，单体含量损失小于5％；
i.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃储存四周后，蛋白质含量损失小于5％，特别是小于4％，特别是小于3％，特别是小于2％，特别是小于1％；且
j.当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述scFv配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在5次冻融循环后，单体含量损失小于2％，特别是小于1％。
如本文所用，术语“HEK蓝细胞”或“HEK蓝”是指商业上可获得的人胚胎肾细胞，其被转染并稳定表达优化的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，该基因受NF-κB转录因子诱导的启动子控制。释放到培养基中的SEAP蛋白水平通常被用作NF-κB活化的量度。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体或抗体可变结构域与抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体可变结构域或抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。
“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体或抗体可变结构域的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原，或者更具体地，抗原上的表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体可变结构域和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体和抗体可变结构域通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
本文所用的术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”或“KD”或“KD值”通过使用表面等离子体共振测定法来测量。
如第[0194]和[0196]段(scFv)和[0235]段(多特异性分子)所述，通过表面等离子体共振(SPR)测量确定对重组人IL-4R、重组食蟹猴IL-4R和重组狨猴IL-4R的亲和力。
本发明的抗体可变结构域作为IL-4R的拮抗剂。换句话说，本发明的抗体可变结构域是IL-4R信号传导的抑制剂。如本文所用，术语“阻断剂”或“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制或降低与其结合的抗原的生物活性的抗体或抗体可变结构域。本发明的抗体可变结构域与IL-4R结合，从而阻断IL-4与IL-4R的结合，特别是阻断IL-4和IL-13与IL-4R的结合，从而导致IL-4R功能降低。
DSF已在前面进行了描述(Egan等人,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen等人,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)。scFv构建体的热解折叠的转变中点是通过差示扫描荧光法使用荧光染料Orange确定的(参见Wong&Raleigh,ProteinScience 25(2016)1834-1840)。在pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中的样品以50μg/ml的最终蛋白质浓度制备，并且含有5x/>Orange的终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约2h。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。
单体含量的损失由SE-HPLC色谱图的曲线下面积计算确定。SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如美国药典(USP)第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V0)和总渗透体积(VT)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC系统(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行，该系统配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在4-6℃。对于scFv样品的分析，使用Shodex KW403-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989202)，标准缓冲盐水流动相(50mM磷酸钠pH 6.5，300mM氯化钠)，推荐流速为0.35ml/min。每次注射的目标样品加载量为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V0至VT的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。
适当地，本发明的抗体可变结构域是本发明公开中提供的结合结构域。它们衍生自兔抗体克隆44-34-C10，包括但不限于人源化抗体可变结构域，其序列列于表1。
术语“多价抗体”是指具有不止一个价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，由于存在一个以上拷贝的相应抗原结合部分，单个结合分子可以结合靶分子上的一个以上结合位点和/或结合一个以上靶分子。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体、六价抗体等。
如本文所用，术语“单价抗体”是指与单个靶分子，更具体地说，是与靶分子上的单个表位结合的抗体。此外，如本文所用，术语“结合结构域”或“单价结合结构域”是指与靶分子上的单个表位结合的结合结构域。
在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含一个如本文所定义的特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，和一个结合结构域，该结合结构域结合不同于IL-4R的靶标，即，本发明的多特异性抗体对于IL-4R和该不同于IL-4R的靶标都是单价的。
在其他具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含一个如本文所定义的特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，和两个结合结构域，这两个结合结构域具有相同的结合特异性并特异性结合不同于IL-4R的靶标，即，本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是单价的，而对于该不同于IL-4R的靶标是二价的。
在其他具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两个如本文所定义的特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，和一个结合结构域，该结合结构域结合不同于IL-4R的靶标，即，本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是二价的，对于该不同于IL-4R的靶标是一价的。
在优选的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两个如本文所定义的特异性结合IL-4R的抗体可变结构域，和两个结合结构域，这两个结合结构域具有相同的结合特异性并特异性结合不同于IL-4R的靶标，即，本发明的多特异性抗体对于IL-4R特异性是二价的，且对于该不同于IL-4R的靶标是二价的。
在本发明的多特异性抗体包含两个结合结构域，且它们具有相同的结合特异性并特异性结合不同于IL-4R的靶标的情况下，所述两个结合结构域结合靶标分子上的相同表位或不同表位。优选地，两个结合结构域结合靶标分子上的相同表位。
如本文所用，术语“相同表位”是指蛋白质上能够特异性结合一种以上抗体的单个蛋白质决定簇，其中该单个蛋白质决定簇是相同的，即由以下组成：相同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有相同的三维结构特征，以及对每种所述抗体的相同电荷特征。
术语“不同的表位”，在本文中与特定的蛋白质靶标结合使用时，是指蛋白质上的单个蛋白质决定簇，每个能够与不同的抗体特异性结合，其中这些单个蛋白质决定簇对于不同的抗体来说是不相同的，即由以下组成：不同化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链，它们具有不同三维结构特征以及不同电荷特征的分子。这些不同的表位可以是重叠的或非重叠的。
在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和二价的。
在进一步的具体实施方案中，本发明的多特异性抗体是双特异性和三价的。
优选的是，本发明的多特异性抗体是双特异性和四价的，即对IL-4R是二价的，且对不同于IL-4R的目标是二价的。
在一个具体方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：
a)两个如本文所定义的抗体可变结构域；
b)两个结合结构域，它们具有相同的结合特异性，并特异性地结合不同于IL-4R的靶标，特别是其中所述结合结构域是HSA-BD或IL4R-BD，
其中所述多特异性抗体包含IgG区。
本发明中使用的其他可变结构域包括已突变、但仍在CDR区中与表1中描述的序列中描述的CDR区具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，条件是这些其他可变结构域表现出第[0070]节的功能特征，以及可选的第[0071]至[0073]节的附加功能。本发明中使用的其他可变结构域包括突变氨基酸序列，其中当与表1中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个，条件是这些其他可变结构域表现出第[0070]节的功能特征，以及可选的第[0071]至[0073]节的附加功能。
合适地，本发明的结合结构域的VH结构域属于VH3或VH4家族。在一个实施方案中，本发明中使用的结合结构域包含属于VH3家族的VH结构域。在本发明的语境中，术语“属于VHx家族(或VLx家族)”是指框架序列FR1至FR3与所述VHx家族(或VLx)显示最高程度的同源性。VH和VL家族的实例在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86或在WO 2019/057787中给出。属于VH3家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:19表示，属于VH4家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:20表示。特别是，取自SEQ ID NO:19的框架区FR1至FR3属于VH3家族(表2，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH3家族的VH是一种VH，其包含与SEQ ID NO:19的FR1至FR3具有至少90％，更特别是至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％序列同一性的FR1至FR3。VH3和VH4序列的其他实例，以及其他VHx序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57/-86中或WO 2019/057787中找到。
适当地，本发明中使用的结合结构域的VL域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4。在所述结合结构域为scFv形式的情况下，所述结合结构域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，特别是Vκ1框架FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4、和VλFR4，特别是VλFR4。
合适的Vκ1框架FR1至FR3以及示例性的VλFR4在SEQ ID NO:21中给出(表2，FR区域以非粗体标记)。Vκ1序列的其他实例，以及Vκ2、Vκ3或Vκ4序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。合适的Vκ1框架FR1至FR3包含与对应于FR1至FR3并选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列(表2，FR区以非粗体标记)具有至少80、90、95％同一性的氨基酸序列。合适的VλFR4如SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29中所述，包含单个半胱氨酸残基，特别是在如下情形下：其中第二个单个半胱氨酸存在于相应的VH链中，特别是VH的51位(AHo编号)，用于形成结构域间二硫键。在一个实施方案中，当处于scFv形式时，本发明的结合结构域的VL结构包括VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO:22至SEQID NO:29中任意的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:22或29具有至少80、90、95％同一性的氨基酸序列。
本发明的抗体可变结构域包括表1中所列的VH结构域。适当地，本发明的抗体可变结构域包括表1所列的VH氨基酸序列，其中框架序列(即不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过5个，特别是不超过4个，尤其是不超过3个，特别是不超过2个，尤其是不超过1个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VH区中与表1中描述的相应序列中描述的VH区具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位的VH结构域，条件是这些其他可变结构域表现出第[0070]节的功能特征，以及可选的第[0071]至[0073]节的附加功能。
特别是，本发明的抗体可变结构域包括表1中所列的VL结构域。适当地，本发明的抗体可变结构域包括表1所列的VL氨基酸序列，其中框架序列(即不是CDR序列的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过5个，特别是不超过4个，尤其是不超过3个，特别是不超过2个，尤其是不超过1个。本发明中使用的其他结合结构域包括已突变、但仍在VL区中与表1中描述的序列中描述的VL区具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，包括包含表1所示序列之一的至少5至140位(AHo编号)，特别是至少3至145位的VL结构域，条件是这些其他可变结构域表现出第[0070]节的功能特征，以及可选的第[0071]至[0073]节的附加功能。
本发明的抗体可变结构域的具体但非限制性的实例是scFv PRO1517、PRO1535、PRO1747、PRO1896、PRO1897、PRO1898和PRO1899，其序列列于表3。
适当地，本发明的多特异性抗体的至少一个结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fv、dsFv和scFv。
包含在本发明多特异性抗体中的抗体可变结构域和结合结构域能够同时结合它们各自的抗原或受体。这里所说的"同时"是指至少一个与IL-4R特异性结合的抗体可变结构域和至少一个对不同于IL-4R的靶标具有特异性的结合结构域的同时结合。
合适地，包含在本发明多特异性抗体中的抗体可变结构域和结合结构域可操作地连接。
本文使用的术语“可操作地连接”表示两个分子(例如，多肽、结构域、结合结构域)以每个分子保留功能活性的方式连接。无论两个分子是直接连接还是间接连接(例如，通过接头，通过部分，通过接头连接到部分)，它们都可以是“可操作地连接”。术语“接头”是指任选地位于本发明中使用的结合结构域或抗体可变结构域之间的肽或其他部分。可以使用多种策略将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-末端和C-末端之间的多肽连接，通过二硫键的连接，以及通过化学交联剂的连接。在该实施方案的一方面，接头是通过重组技术或肽合成产生的肽键。对于要连接两条多肽链的特定情况，选择合适的接头取决于各种参数，包括但不限于两条多肽链的性质(例如，它们是否天然寡聚)、要连接的N-末端和C-末端之间的距离(如果知道)和/或接头对蛋白水解和氧化的稳定性。此外，接头可以包含提供柔韧性的氨基酸残基。
在本发明的语境中，术语“多肽接头”是指连接两个结构域的通过肽键连接的由氨基酸残基链组成的接头，每个结构域与接头的一端连接。多肽接头的长度应足以连接两个分子，以使它们彼此之间具有正确的构象，从而保持所需的活性。在特定的实施方案中，多肽接头具有2至30个氨基酸残基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基)的连续链。此外，选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应表现出不会显著干扰多肽活性的特性。因此，整体上接头肽不应表现出与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一种或多种单体中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重阻碍受体单体结构域的结合。在特定的实施方案中，多肽接头是非结构化的多肽。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸或GS接头。如本领域技术人员将理解的，“Gly-Ser”或“GS”接头是指串联的甘氨酸和丝氨酸的聚合物(包括例如(Gly-Ser)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头，例如用于shaker钾离子通道的系链，以及多种其他柔性肽接头。甘氨酸-丝氨酸聚合物是优选的，因为包含这些氨基酸的寡肽是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链。其次，丝氨酸是亲水的，因此能够溶解可能是球状甘氨酸链的物质。第三，已显示相似的链可有效连接重组蛋白(如单链抗体)的亚基。
在一组实施方案中，本发明的多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区，并且是选自以下的形式：(scFv)2-Fc-(scFv)2融合体(ADAPTIR)；DVD-Ig；DARTTM和TRIDENTTM。术语"DARTTM"是指由MacroGenics公司开发的一种抗体形式，它包括一个免疫球蛋白Fc区多肽和一个或两个双特异性Fv结合结构域与Fc区一个重链的N端或Fc区两个重链的N端相融合。术语"TRIDENTTM"是指由MacroGenics公司开发的一种抗体形式，它包括一个免疫球蛋白Fc区多肽、一个双特异性Fv结合结构域和一个Fab片段。双特异性Fv结合结构域和Fab片段都与Fc区多肽的两条重链的各自N端融合。
在另一组实施方案中，本发明的多特异性抗体的格式选自二价双特异性IgG格式、三价双特异性IgG格式和四价双特异性IgG格式。特别是，所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG，例如DuoBodies(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)；DVD-Ig；IgG-scFv融合体，例如CODV-IgG、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison H)或IgG CL-scFv融合体(MorrisonL))、bsAb(scFv连接到轻链的C末端)、Bs1Ab(scFv连接到轻链的N末端)、Bs2Ab(scFv连接到重链的N末端)、Bs3Ab(scFv连接到重链的C末端)、Ts1Ab(scFv连接到重链和轻链的N末端)和Ts2Ab(dsscFv连接到重链的C末端)。更特别地，所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG，如DuoBodies；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgGCL-scFv融合体(Morrison-L))，甚至更特别地选自DVD-Ig和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison-L))。
在本发明的特定实施方案中，所述多特异性抗体的格式选自Morrison格式，即Morrison-L和Morrison-H格式。本发明中使用的Morrison-L和Morrison-H格式是带有IgGFc区，特别是IgG4 Fc区的四价和双特异性分子格式。两个高度稳定的scFv结合结构域，其中轻链包含Vk FR1至FR3，结合VλFR4(λ帽)，本文也称为λ帽scFv，通过接头L1融合到重链(Morrison-H)或轻链(Morrison-L)C末端。
接头L1是2-30个氨基酸，更特别是5-25个氨基酸，最特别是10-20个氨基酸的肽。在特定实施方案中，所述接头L1包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1,2,3,4or 5，特别是n＝2。
在本发明的一个具体实施方案中，多特异性抗体具有如上定义的Morrison-L格式。在本发明的另一个具体实施方案中，多特异性抗体具有如上定义的Morrison-H格式。
在本发明的多特异性抗体中包含的抗体可变结构域是scFv片段形式的情况下，这些scFv片段包括一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链结构域(VL)，通过连接体L2连接。
接头L2是10-40个氨基酸，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，特别是n＝4。
本发明的多特异性抗体的具体但非限制性的实例，其中包含的抗体可变结构域是Fab片段，是Morrison-H抗体PRO2198、PRO2199，其序列列于表4。
本发明的抗体可变结构域和多特异性抗体可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于生产包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,Methods Enzymol.121(1986)210-228)。
这些方法通常涉及单克隆抗体或单克隆抗体可变结构域的产生，例如通过将骨髓瘤细胞与小鼠的脾细胞融合，该小鼠已经用杂交瘤技术用所需抗原免疫(参见，例如，Yokoyama等人,Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2,Unit 2.5,2006)或通过重组抗体工程技术(库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如，Chames&Baty,FEMS Microbiol.Letters189(2000)1-8)，以及使用已知的分子克隆技术，将两种或多种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或者其片段或部分组合，以得到双特异性或多特异性构建体。
可以使用本领域已知的方法通过将组成结合特异性缀合来制备本发明的多特异性抗体。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.NO.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,Ill,USA)获得。
或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x Fab、mAb x scFv、mAb x dsFv或mAb x Fv融合蛋白时，这种方法特别有用。制备多特异性抗体和分子的方法，例如在以下文献中有所描述US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US 5,091,513；US 5,476,786；US5,013,653；US 5,258,498；和US 5,482,858。
抗体可变结构域和多特异性抗体与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
另一方面，本发明提供了一种核酸或两种核酸，其编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体。可以对此类核酸进行优化以在哺乳动物细胞中表达。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，即在所述序列中，一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer等人,Nucleic AcidRes.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述抗体可变结构域或多特异性抗体的区段或结构域。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出本发明多特异性抗体的抗原结合能力。
多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码本发明的多特异性抗体或其可变结构域或其结合结构域的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Narang等人,1979,Meth.EnzyMol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.EnzyMol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和US 4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles和Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:AGuide to Methods和Applications,Innis等人(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods和Applications 1:17,1991。
本发明还提供了用于生产本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的表达载体和宿主细胞。
术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在该具体背景下，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。
可以采用各种表达载体来表达编码抗体可变结构或多特异性抗体链的多核苷酸。基于病毒的和非病毒的表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体或抗体可变结构。非病毒载体和系统包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达IL-4R结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,CA,USA)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP EpsteinBarr virus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.MicroBiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell68:143,1992。
表达载体的选择取决于要在其中表达所述载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码多特异性抗体链或可变结构域的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止插入序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达多特异性抗体链或可变结构域还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
要使用的载体通常编码抗体可变结构域或多特异性抗体轻链和重链，包括恒定区域或其部分，如果存在的话。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗体可变结构域。通常，这样的恒定区是人的。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
携带和表达本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的宿主细胞可以是原核生物或真核生物。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。也可以采用其他微生物，如酵母，来表达本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。
在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROM GENES TOCLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入包含目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(通常见于Green,M.R.,and Sambrook,J.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版),ColdSpring Harbor Laboratory Press(2012))。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子-核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88/223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1至2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术使增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的核酸或载体，由此表达本公开的所述抗体可变结构域或所述多特异性抗体。
在一方面，本发明涉及一种生产本发明的抗体可变结构域多特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的核酸。特别地，本发明涉及一种生产本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的方法，该方法包括(i)提供编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的一种或两种核酸，或编码本发明的抗体可变结构域或多特异性抗体的一种或两种载体，表达所述一种或多种核酸，或所述一种或多种载体，以及从表达系统中收集所述抗体可变结构域或多特异性抗体，或(ii)提供表达编码本发明抗体可变结构域或多特异性抗体的一种核酸或两种核酸的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或所述多种宿主细；以及从细胞培养物中收集所述抗体可变结构结构域或所述多特异性抗体。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指不干扰抗体结构的介质或稀释剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
某些这样的载体能够将药物组合物配制成例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液和锭剂，用于受试者的口服摄入。某些这样的载体能够将药物组合物配制成用于注射、输注或局部施用。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。在特定的实施方案中，施用是肌肉注射，或皮下注射，特别是皮下注射。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)，特别是用于肌肉内或皮下施用。取决于施用途径，活性化合物(即本发明的多特异性抗体)可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。
本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained和Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的本发明的多特异性抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的多特异性抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。
本发明的多特异性抗体通常多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中本发明的多特异性抗体的血液水平所指示的。或者，本发明的多特异性抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。
一方面，本发明涉及用作药物的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。在合适的实施方案中，本发明提供了多特异性抗体或药物组合物，其用于治疗选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎性和自身免疫性疾病的疾病。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其用于制备用于治疗过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是炎性或自身免疫性疾病的药物。
在另一个方面，本发明涉及多特异性抗体或药物组合物用于治疗治疗有需要的受试者的过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是用于治疗炎性或自身免疫性疾病的用途。
另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。在合适的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗受试者的过敏性、炎性或自身免疫性疾病，特别是用于治疗炎性或自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。
术语“动物”包括所有脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病，特别是引起瘙痒的炎性疾病和引起瘙痒的自身免疫性疾病。术语“瘙痒”和“痒”在本文中作为同义词使用，是指引起搔抓欲望或反射的感觉。特别是在引起瘙痒的慢性皮肤病如特应性皮炎、皮肤真菌病、银屑病或荨麻疹的情况下，抓挠可能会有问题，因为永久的瘙痒刺激患者不断地和/或过度地抓挠受影响的皮肤区域，这通常会导致皮肤损伤和皮肤表面的进一步恶化。
本文使用的术语“过敏性疾病”或“过敏”是指由免疫系统对环境中通常无害的物质的超敏反应引起的大量病症。
本文使用的术语“炎性疾病”是指大量的炎性疾病，即炎性异常，其通常以长期炎症为特征，称为慢性炎症。术语“炎症”是指身体组织对有害刺激(如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应。这是一种涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性反应。虽然常规的炎症反应对于机体消除细胞损伤的最初原因、清除因最初损伤和炎症过程而受损的坏死细胞和组织以及启动组织修复是必不可少的，但炎症性疾病的特征通常是在没有有害刺激的情况下持续发炎。
本文使用的术语“自身免疫性疾病”是指由对功能性身体部位的异常免疫反应引起的疾病。它是自身免疫的结果，即自身反应性免疫反应(如自身抗体、自身反应性T细胞)的存在，具有或不具有由其引起的损伤或病理，通常局限于某些器官或涉及不同部位的特定组织。
在特定的实施方案中，导致瘙痒症的炎性或自身免疫性疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘，特别是特应性皮炎。
另一方面，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自特应性皮炎、急性过敏性接触性皮炎、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、斑秃、皮肌炎、结节性痒疹、银屑病和特应性哮喘，特别是特应性皮炎。
在另一个实施方案中，过敏性、炎性和自身免疫性疾病选自过敏性哮喘、过敏性鼻炎、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、慢性非组胺相关性荨麻疹、抗组胺药无反应性肥大细胞增多症、慢性单纯性苔藓、脂溢性皮炎、干皮病、疱疹样皮炎、扁平苔藓和溃疡性结肠炎。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病的如本文所定义的多特异性抗体或药物组合物，所述疾病为神经性瘙痒症，选自疱疹后神经痛、疱疹后瘙痒、感觉异常性腰痛、多发性硬化和肱桡动脉瘙痒症。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗伴有瘙痒的全身性疾病的止痒剂中的多特异性抗体或药物组合物，所述疾病选自胆汁淤积、慢性肾病、霍奇金病、皮肤T细胞淋巴瘤和与慢性瘙痒相关的其他淋巴瘤或白血病、真性红细胞增多症、甲状腺机能亢进症、慢性关节病后瘙痒(Id反应)、妊娠诱发的慢性瘙痒(如PUPPP)、嗜酸性脓疱性毛囊炎、药物过敏反应、老年人慢性瘙痒或干性皮肤瘙痒(局部、全身)、和烧伤后疤痕部位瘙痒(烧伤后瘙痒)、遗传性或痣样慢性瘙痒(如内瑟顿综合征、达里耶氏病(Morbus Darier)、海利-海利氏病、炎性线状疣状表皮痣(ILVEN)、家族性原发性皮肤淀粉样变性、Olmsted综合征)、水源性瘙痒、玻璃纤维皮炎、粘液慢性瘙痒、化疗诱发的瘙痒和HIV。
序列列表(根据AHo编号方案而指定的突变，根据Numab CDR定义而定义的CDR，除非另有说明)
表1.本发明中使用的IL-4R结合结构域的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
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表2.与本发明相关的其他序列。
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表3.本发明的scFv抗体可变结构域的实例(接头以粗体显示)
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表4.本发明的多特异性抗体的实例(接头以粗体显示)
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在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表4)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。
应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用的方式并入本文。
下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实施例
实施例1：抗IL-4R分子的生产和检测：
项目目标
该项目的目标是产生与人IL-4R特异性结合并中和其生物效应的人源化单克隆抗体可变结构域。另一个目标是确定足够有效且稳定，可以整合到多特异性抗体形式中的抗IL-4R抗体可变结构域。
1.1免疫
为了获得针对人IL-4R的最佳免疫反应，对总共6只兔子采用了两种不同的免疫方案。兔子用重组生产并纯化的IL-4R(Sino Biological,Cat.No.10402-H08H)进行免疫。在免疫之前，制造商对重组人IL-4R的质量进行了分析，1)通过SDS-page从而分析其纯度，2)通过功能性ELISA测量其与IL-4结合的能力从而分析其生物活性。第一组三只兔子(方案1)在70天内接受4次注射，每次200μg。第二组三只兔子(方案2)在112天内接受了5次注射，每次200μg。在免疫过程中，通过确定多克隆血清抗体依旧能够与抗原产生可检测的结合的每只兔的血清的最大稀释度(滴度)，来定性评估针对抗原的体液免疫应答的强度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估针对固定化抗原(重组人IL-4R)的血清抗体滴度。用纯化的人IL-4R免疫的六只兔子都表现出高滴度，EC5高达3×107。
1.2.分选
在进行命中鉴定(hit identification)程序之前，在有R-Phycoerythrin(RPE)标记的IL-4R的情况下，用蛋白G珠进行了基于流式细胞仪的分选程序，这可以具体检测和分离高亲和力IL-4R结合的B细胞。在这次分选活动中，共分析了来自四只兔子的1.05x 107个淋巴细胞。其中，共分离出3520个表达IL-4R特异性抗体(IgG)的B细胞，并作为单个克隆单独培养了3至4周。
1.3.命中鉴定
总论
对于命中鉴定，进行了直接ELISA筛选，以评估与人和小鼠IL-4R的结合，而对食蟹猴IL-4R的结合则仅通过SPR进行评估。在直接ELISA中发现了483个克隆与人IL-4R结合，164个克隆与小鼠IL-4R有交叉反应。
通过ELISA评估与人IL-4R的结合
对于命中鉴定，即鉴定产生与IL-4R结合的抗体的B细胞克隆，通过ELISA法对上述3520个B细胞克隆的细胞培养上清液进行筛选，确定是否存在与人IL-4R结合的抗体。由于高通量培养的规模不允许纯化单个兔抗体，所以这个初级命中鉴定是用细胞培养上清液中的非纯化抗体进行的。使用细胞上清液可以对大量的抗体进行排序。所用的ELISA方法评估了与重组人IL-4R结合的兔IgG的"数量"，但是它并没有提供任何关于抗体的亲和力或浓度的信息。在该试验中，来自483个B细胞克隆的上清液产生了高于背景的信号。
确定与人IL-4R的结合亲和力
在次级命中鉴定中，通过表面等离子体共振(SPR)确定了483个在初级筛选中被认定为阳性的单克隆兔抗体与人IL-4R的结合亲和力信息。
对于这些通过SPR进行的亲和力筛选，使用标准胺偶联程序将对兔IgG的Fc区特异性的抗体固定在传感器芯片(SPR-2Affinity Sensor,High Capacity Amine,SierraSensors)上。B细胞上清液中的兔单克隆抗体被固定的抗兔IgG抗体捕获。B细胞上清液中的IgG最低浓度要求足以进行捕获。捕获单克隆抗体后，将人IL-4R ECD(细胞外结构域)以90nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离5分钟。使用1:1Langmuir结合模型，用MASS-2分析软件(Analyzer,Sierra Sensors)计算表观解离常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)。
对于475种抗IL-4R抗体，可以测量其与人类IL-4R的结合亲和力。它们显示的解离常数(KD)范围从低于2.07x 10-12M到2.95x 10-8M。32％的被分析的抗体的KD低于0.5nM，17％显示的亲和力高于度普利尤单抗。
在stat-6报告基因细胞实验和竞争ELISA中测定人IL-4R的中和作用
对于所有483种人IL-4R结合上清液，进一步分析了它们在基于细胞的stat-6报告基因试验中中和IL-4R的生物活性的潜力，以及在竞争ELISA中阻断人IL-4与人IL-4R的相互作用的潜力。
为此，开发了一项使用HEK-Blue细胞的基于细胞的stat-6依赖性报告基因试验和受体配体竞争性ELISA，并使之适用于B细胞上清液。基于细胞的试验可以评估IL-4和IL-13诱导的信号传导的阻断情况，而在竞争性ELISA中，只评估IL-4和IL-4R的相互作用。由于试验可以用B细胞上清液作为基质进行，并且足够敏感和精确，所以两种试验方法都被用于筛选。将B细胞上清液中存在的小鼠IL-13用市售的抗小鼠IL-13抗体阻断，以保证在基于细胞的试验中，信号传导仅由人IL-13诱导。用单孔分析法检测每个B细胞上清液的抑制活性(没有进行剂量反应)。因此，观察到的抑制程度不仅取决于IgG的特性，而且还取决于B细胞上清液中兔IgG的浓度。
483个克隆中，有122个克隆阻断了人IL-4R和人IL-4的相互作用，阻断率超过90％，178个克隆的抑制率超过80％。在HEK-Blue试验中，基于>30％抑制率这一阈值，分别有119和132个克隆抑制了IL-4和IL-13诱导的信号传导，86个克隆同时抑制了IL-4和IL-13诱导的信号传导。
物种交叉反应(通过SPR测定与食蟹猴和小鼠IL-4R的结合)
通过SPR分析了初步筛选中鉴定的所有483个命中物与食蟹猴和小鼠IL-4R的物种交叉反应性。使用MASS-2SPR装置(Sierra Sensors)通过表面等离子体共振(SPR)确定结合亲和力，与上文中描述的人IL-4R的结合亲和力相似，不同的是使用90nM的食蟹猴或小鼠IL-4R而不是人IL-4R。
423个(87.5％)和266个(55％)克隆分别显示与食蟹猴和小鼠IL-4R的结合。与直接ELISA相比，SPR发现的小鼠IL-4R交叉反应性克隆的数量较高(266对164)是由于在ELISA中使用了更严格的截止值。抗食蟹猴IL-4R抗体显示的平衡解离常数(KD)范围为1.14x 10-12M至9.36x 10-6M。所有分析的抗体中有11％的KD低于500pM。抗小鼠IL-4R抗体的KD值范围为1.63x 10-11M至4.57x 10-5M，总体亲和力相当低。总体而言，物种的KD值之间没有良好的相关性，只有约20个命中显示对人和食蟹猴IL-4R的高亲和力。
1.4.命中选择和命中确认
命中选择和RT-PCR
作为命中物确认、基因序列分析和随后兔抗体人源化的先决条件，需要检索编码兔抗体可变区的遗传信息。这通过将各信使RNA逆转录(RT)成互补DNA(cDNA)，然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA来完成。主要是基于对人IL-4R的亲和力低于500pM及stat-6报告基因试验中的中和活性来选择进行RT-PCR的B细胞克隆。作为另外的标准，考虑与食蟹猴IL-4R的交叉反应性。
选择并鉴定了94组兔CDR，对应于94个独立的克隆。将所有94个测序的克隆的兔CDR序列聚类到一个系统发育树中。基于CDR区域，75个序列是非冗余的，26个序列含有游离半胱氨酸(被认为是发育的倾向)。排除所有具有相同序列和差异少于4个氨基酸的序列的克隆。对人IL-4R的亲和力在400和500pM之间并且对食蟹猴IL-4R的亲和力低(KD>3nM)的2个克隆也被从选择中去除，同时包括了另外8个具有游离半胱氨酸的克隆。具有游离半胱氨酸的克隆在重组后易于聚集，但是考虑到它们对食蟹猴IL-4R的高亲和力，这些克隆在该阶段没有被丢弃。结果，总共选择了60个克隆用于表达重组IgG。
单克隆抗体的克隆和制造
在选择克隆进行命中鉴定后，将兔抗体克隆、表达并纯化以进一步表征。相应的轻链和重链可变结构域的克隆需要将DNA片段体外连接到合适的哺乳动物表达载体中。将兔抗体重链和轻链的表达载体转染至哺乳动物悬浮细胞系中，以进行瞬时异源表达。随后，对分泌的兔IgG进行亲和纯化，最终产品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、280nm的UV吸光度和尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)进行分析，以验证身份、含量和纯度。60个克隆中的58个可以被克隆，并以中等至非常好的滴度(2-36μg蛋白/ml)制造，单体含量高(95.9至99.6％)。
1.5.单克隆抗体的药理学表征
对人、猕猴、狨猴和小鼠IL-4R的亲和力
通过SPR(MASS-2)分析确定了58个纯化的单克隆兔抗体与人IL-4R的结合动力学。通过与羧基甲基化的葡聚糖表面耦合的抗兔IgG捕获各IgG，并测量分析物剂量反应。除了两个具有纳摩尔亲和力的IgG外，所有抗体都证实了与人IL-4R具有高亲和力结合，KD值从皮摩尔到亚皮摩尔亲和力。57种靶结合抗体中的4种表现出亚皮摩尔KD值。
如上所述类似地确定了与食蟹猴和狨猴IL-4R的结合动力学。绒猴IL-4RECD由Sino Biological按需制造，因为它在商业上不可获得。58个IgG中分别有44个和48个与食蟹猴和狨猴IL-4R结合。35种IgG对两种猴都有交叉反应。与人和食蟹猴IL-4R相比，狨猴IL-4R具有更高的总亲和力。
使用直接ELISA代替SPR评估了与小鼠IL-4R的结合。没有任何一种IgG显示出强烈的结合力，而且由于大多数曲线没有达到最大信号(曲线顶部未定义)，所以没有确定EC50值。
HEK蓝细胞中的Stat-6报告基因试验(阻断人IL-4和IL-13诱导的信号传导)
此外，在使用HEK蓝细胞的stat-6报告基因试验中，评估了58种兔单克隆抗体对IL-4和IL-13通过IL-4R诱导的信号传导的作用。对所有抗体的系列稀释液分析了它们中和由0.02ng/ml IL-4或0.3ng/ml IL-13诱导的信号传导的效力(IC50)，并与度普利尤单抗的效力进行了比较。为了比较来自不同试验板的IgG，使用了相对IC50值。将IgG的IC50值针对每个试验板上的参考分子度普利尤单抗进行校准，从而确定了这些值(相对IC50：IC50,度普利尤单抗/IC50,测试抗体)。
IgG抑制IL-4和IL-13诱导的信号传导，其效力高于度普利尤单抗或降低不超过5倍。就阻断IL-4诱导的信号传导而言，7种IgG显示出较好的效力，4种IgG同时阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导比度普利尤单抗更有效。
竞争性ELISA(抑制hIL-4与hIL-4R的结合)
通过竞争性ELISA评估人IL-4与人IL-4R结合的抑制。为此，将IL-4包被在ELISA板上。将生物素化的IL-4R与兔单克隆抗体预孵育，并将混合物加入ELISA板中，使其与固定的IL-4结合。然后使用链霉亲和素-HRP检测结合的生物素化的IL-4R。
考虑到试验中使用的生物素化IL-4R的浓度低，竞争性ELISA的灵敏度足以根据效力区分兔抗体。与度普利尤单抗相比，12种兔抗体更有效地抑制人IL-4和人IL-4R之间的相互作用，25种抗体表现出类似的效力或IC50值不低于2.5倍。对于6种抗体，由于缺乏抑制或由于相互作用的阻断不完全，没有测定相对IC50。
选择用于生产人源化scFv的兔IgG
基于58种已表征的兔单克隆抗体的药效学性质，选择表现最佳的克隆用于人源化和先导候选物生产。选择克隆的标准是i)在HEK蓝试验中完全阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导，ii)对人IL-4R具有高亲和力，iii)在竞争ELISA中中和人IL-4R与人IL-4的相互作用，iv)通过SPR测定与食蟹猴和/或狨猴IL-4R具有交叉反应性，和v)序列多样性。除了这些标准之外，对所有58个克隆的一级序列进行筛选，以确定互补决定区(CDR)中是否存在不成对的半胱氨酸。不成对的半胱氨酸的鉴定不包括在CDR-H1和CDR-H2中常见的半胱氨酸对，其在兔的种系库中编码并被认为形成二硫键。
由于大多数兔IgG的亲和力接近或超过仪器的检测极限，因此小心处理SPR获得的数据。因此，在选择用于人源化的兔抗体时，焦点集中在stat-6报告基因试验上。选择在stat-6报告基因试验中显示较高效力的抗体或中和IL-4和IL-13诱导的信号的效力低不超过3.3倍的抗体进行人源化。总共选择了18个有希望的克隆进行重组和人源化。
1.6.scFv的人源化
为了生产先导候选物，选择了18个兔单克隆抗体克隆。这些克隆的人源化包括将兔CDR转移到一种Numab专有的人可变结构域受体支架上。在此过程中，使用Numab CDR定义(表5)鉴定了六个CDR区的氨基酸序列，并将其移植到Numab专有的高度稳定的完全人类Vk1/VH3λ加帽受体框架中，产生了称为“CDR移植体”的构建体。
表5:Numab CDR定义
将兔CDR专门移植到人类受体框架上是最基本的移植策略。然而，有时特定的CDR集需要特定兔框架残基的突变，以保留它们的全部功能。因此，除了“CDR移植体”之外，还设计了含有确定模式的兔构架残基的其他移植变体。
设计了人源化scFv构建体，并从GeneUniversal(前通用生物系统公司)以哺乳动物(CHO-S,pcDNA3.1)表达载体以1mg规模订购。如下所述，质粒用于CHO-S细胞的瞬时转染。
1.7人源化scFv的制造
使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达。在37℃下表达5-7天(当细胞活力<70％时)后，通过离心然后过滤收获培养物。通过蛋白质L亲和层析从澄清的培养上清液中纯化蛋白质。分子均不需要通过尺寸排阻色谱进行精制，因为根据SE-HPLC分析评估，所有分子均至少有一个亲和色谱馏分在捕获后单体含量大于95％。通过透析将样品重新缓冲至最终缓冲液(50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，含150mMNaCl，pH 6.4)。对于制造材料的质量控制，应用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。表6中总结了10种scFv分子的制造特征，这些分子来自被认为适合并入到多特异性抗体形式的5个克隆。克隆44-18-C11(PRO1510)及其变体(PRO1549-PRO1554)的CDR移植体(sc01)和全移植体(sc04)的制造特征总结在表7中。
表6:5个选定克隆的scFv制备。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
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表7:克隆44-18-C11的所有移植变体的scFv制备。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体,sc05至sc10:其他移植变体
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1.8.合适的抗IL-4R结合结构域(scFv格式)的药效学特征
对被评估为合适的人源化scFv抗体的主要药效学特性进行表征。
对人IL-4R的亲和力
在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析确定了16个人源化scFv(源自5个兔子单克隆抗体)对人IL-4R的亲和力。通过与羧基甲基化的葡聚糖表面耦合的抗人IgG-Fc捕获人IL-4R-Fc，并将scFv作为分析物注入。在每个分析物注入循环后，将传感器芯片再生并捕获新抗原。使用剂量响应多循环动力学分析法测量scFv，在运行缓冲液中稀释7种分析物浓度，范围为0.12至90nM。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。结果总结在表8中。
表8:scFv对人IL-4R的亲和力。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体,sc05至sc10:其他移植变体
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从表8中可以看出，基于克隆44-34-C10的scFv抗体可变结构域表现出对人IL-4R的最佳总体结合亲和力，紧随其后的是基于克隆44-32-F04的scFv抗体可变结构域。
对食蟹猴、狨猴和小鼠IL-4R的亲和力
使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量了对食蟹猴IL-4R的交叉反应性，不同之处在于捕获的是食蟹猴IL-4R-Fc而不是人IL-4R-Fc。为了确定对狨猴IL-4R的亲和力，使用了直接设置，因为只有狨猴IL-4R的胞外结构域(ECD)可用。将绒猴ECD直接固定在传感器芯片上，并注射滴定系列的scFv作为分析物。为了比较食蟹猴和狨猴IL-4R的KD值，还使用直接设置确定了食蟹猴IL-4R ECD的亲和力。
只有少数scFv与食蟹猴IL-4R结合。与直接设置中的两个scFv相比，在捕获设置中有四个scFv显示出交叉反应性，这意味着在直接设置中两个scFv的结合不再是可测量的。这很可能是直接设置中确定的KD值较低的结果。这种差异是由于结合率(on-rate)较低，可能是由于可及性较低。所有scFv的解离率(off-rate)是相当的。此外，还测定了与狨猴IL-4R ECD的交叉反应性。结果总结在表9中。从表9中可以看出，基于克隆44-34-C10和44-32-F04的scFv抗体可变结构域对食蟹猴IL-4R ECD和狨猴IL-4R ECD表现出优异的交叉反应性。
还评估了scFv PRO1517、PRO1535和PRO1538与小鼠IL-4R的结合，但它们均未显示交叉反应性。
在HEK蓝细胞中进行Stat-6报告基因分析(阻断人IL-4和IL-13诱导的信号传导)
HEK蓝试验测试了人源化scFv抑制IL-4和IL-13通过IL-4R诱导的信号传导的能力。将每孔50,000个细胞接种在96孔板中。在存在0.02ng/ml IL-4或0.3ng/ml IL-13的情况下，将scFv和对照抗体度普利尤单抗的系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，将上清液转移到新的平板上，使用Quanti-Blue底物对分泌的胚胎碱性磷酸酶进行定量。
在该HEK蓝试验中分析了scFv阻断IL-4R介导的信号传导的能力。将所分析的分子的效力与度普利尤单抗进行比较。表10总结了所有效力数据。图1和图2分别显示了PRO1515、PRO1517、PRO1524、PRO1535和PRO1552阻断IL-4诱导的信号传导和IL-13诱导的信号传导的代表性剂量反应曲线。以度普利尤单抗和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。10种scFv高效阻断了IL-4和IL-13诱导的信号传导。基于克隆44-34-C10和44-32-F04的scFv以及PRO1552显示出最好的总体阻断效力。PRO1515、PRO1517、PRO1524、PRO1533、PRO1535、PRO1538和PRO1552可以阻断IL-4-和IL-13-诱导的信号传导，其效力类似于度普利尤单抗。
竞争性ELISA(抑制hIL-4与hIL-4R的结合)
使用竞争性ELISA进一步测定了人源化scFv的效力。通过ELISA使用与上述相同的方法评估了每种scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的效力。类似地，对于stat-6报告基因试验，将每个平板上的单个IC50值对照参考分子度普利尤单抗的IC50进行校准。
表11总结了阻断数据。图4显示了PRO1515、PRO1517、PRO1533、PRO1535和PRO1538的代表性剂量反应曲线。六个scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间的相互作用，具有良好-高的效力。基于克隆44-34-C10和44-32-F04的scFv以及PRO1552显示出最好的总体阻断效力。PRO1515、PRO1517和PRO1552的阻断效力与度普利尤单抗相似。另一方面，PRO1538仅显示中等抑制。五个scFv分子没有表现出抑制作用。
scFv的药理学表征和用于可开发性评估的分子选择的概述
源自五种不同B细胞克隆的16种scFv的药理学表征为选择分子进行扩展生物物理表征提供了基础。基于它们在stat-6报告基因试验和IL-4/IL-4R阻断ELISA中，在中和IL-4-和IL-13-诱导的信号传导方面的总体更好的表现，选择了七种分子，即PRO1515、PRO1517、PRO1533、PRO1535、PRO1524、PRO1506和PRO1538用于进一步扩展表征。所有七个分子都显示出比500pM更好的亲和力。与人IL-4R相比，对食蟹猴IL-4R的亲和力低4-20倍，除了三个分子，它们对食蟹猴IL-4R的亲和力非常低或没有结合。特别地，基于克隆44-18-C11的scFv，即PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554，没有显示出与食蟹猴IL-4R的结合。通常，与人IL-4R相比，这些scFv对狨猴IL-4R的亲和力也较低。
作为亲和力研究的结果，基于克隆44-18-C11的scFv，即PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554，由于它们缺乏与食蟹猴IL-4R的交叉反应性，被排除在进一步的评价之外，尽管PRO1552显示出非常好的抑制效力。出于同样的原因，PRO1520也被排除在外。然而，不排除基于相同克隆44-39-B07的PRO1538，尽管其对食蟹猴IL-4R的结合亲和力较弱。
表9:scFv对食蟹猴和狨猴IL-4R的亲和力。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体,sc05至sc10:其他移植变体
/>
NA:未分析；NB:无结合
表10:stat-6报告基因分析中，scFv中和IL-4和IL-13诱导的信号传导的效力。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体,sc05至sc10:其他移植变体
/>
/>
NA:未分析
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品
n/a:未计算相对IC50(无抑制或IC50未测定)
表11:scFv抑制IL-4R和IL-4之间相互作用的效力。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体,sc05至sc10:其他移植变体
/>
*:IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品
n/a:未计算相对IC50(无抑制或IC50未测定)
1.9.合适的抗IL-4R结合结构域(scFv格式)的生物物理表征
稳定性测量材料的制备
使用如上所述的相同制造工艺以稍大的规模(0.25L表达体积)再次生产PRO1515、PRO1517和PRO1538，以产生足够用于稳定性评估的材料。对于选择用于稳定性评估的其他蛋白质，以前生产的材料量足以进行稳定性评估。纯化后，将配制样品在pH 6.4的含150mMNaCl的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(50mM NaCiP，pH 6.4)中。纯化和透析后，使用5MWCO离心浓缩管将蛋白质样品浓缩至≥10mg/ml，因为这是进行储存稳定性评估所需的浓度。
浓缩至10mg/ml时的单体损失在0和12％之间，取决于分子，如表12所示。PRO1506、PRO1515、PRO1524和PRO1533的单体含量降至95％以下，这是进入储存稳定性评估的分子的临界值，因此也是将其排除在研究之外的原因。然而，由于材料已经制备好，并且为研究做好了一切准备，因此与浓缩后单体含量>95％的其余分子一起，对这些分子的稳定性进行了评估。基于克隆44-34-C10的scFv，即PRO1517和PRO1535，以及PRO1538在浓缩时实际上没有显示单体含量的损失。
表12:浓缩至10mg/ml时的单体损失％(SE-HPLC)。Sc01:CDR-移植体,sc04:全移植体
储存稳定性研究
对人源化的scFv进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存四周。至少在每次研究的一周、两周和完成后，通过SE-HPLC峰面积的积分来评估制剂中单体和低聚物的比例。对于大部分分子，记录了另外的时间点。表13比较了研究d14(第14天)和d28(第28天)得出的终点测量值。
如表13所示，基于克隆44-34-C10的scFv，即PRO1517和PRO1535，在4℃显示出良好的储存稳定性。在4℃储存d28后单体含量损失小于5％。PRO1538也显示出良好的储存稳定性，至少持续14d。另一方面，PRO1515在4℃储存时，单体含量损失超过10％，这是将其排除在外的明确原因。然而，没有一种稳定的分子在任何温度下显示出蛋白质含量的显著损失。
冻融稳定性
除上述存储稳定性研究外，还针对冷冻-融化(F/T)循环评估了性能最高的scFv分子的相容性(胶体稳定性)。由于在开发的早期阶段，原料药通常冷冻储存，制剂和灌装/成品加工将需要一些冷冻和解冻操作。
为了进行F/T稳定性评估，采用与存储稳定性研究相同的分析方法(SE-HPLC,SDS-PAGE)和参数(单体含量％和单体损失％)来监测分子随着五个F/T循环的质量。表14说明了随着五个F/T循环的单体含量损失％。由于没有进行专门的冻融研究，所以显示了用-80℃样品的储存稳定性研究时获得的冻融数据，该数据是在28天内获得的。因为对于一些蛋白质只能记录四个时间点，所以对于这些蛋白质也只能进行四次F/T循环。从表14中可以看出，除了PRO1515和PRO1533，其他测试的scFv都没有显示出单体含量的显著损失。
热解折叠
使用差示扫描荧光测定法(DSF)进行了五种所选择的scFv构建体的热解折叠测量。通过将数据拟合到波尔兹曼方程，确定了得出的热解折叠中点(Tm)和在最大信号的10％处计算的解折叠起始温度(Tonset 10％)值。表15总结了DSF测量的计算熔化温度。从表15中可以推断出，基于克隆44-34-C10的scFv表现出高于63℃的高熔化温度，PRO1538也表现出高熔化温度。
表13:在10mg/ml和-80℃、4℃和40℃温度下的28d储存稳定性研究。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
/>
/>
NA:未分析
表14:F/T稳定性——重复冻融后的单体含量％和％单体变化。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
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*不适用，因为只能测量4个时间点
表15:选定结构域的DSF。Sc01:CDR移植体,sc04:全移植体
实施例2：选择和优化抗IL-4R分子的多特异性形式：
2.1.关于选择抗IL-4R结构域进行优化的概述
首先选择抗IL-4R结构域PRO1517(44-34-C10-sc01)和PRO1535(44-34-C10-sc04)，因为它们表现出非常好的药效学性质和可接受的良好稳定性。也选择了PRO1538(44-39-B07-sc04)，尽管它具有可改善的药理学特性，因为它表现出最佳的稳定性。对PRO1517(44-34-C10-sc01)进行了稳定性优化，对PRO1538(44-39-B07-sc04)进行了pI平衡优化，如下文2.2所示。
在最终多特异性抗体中应用的抗IL-4R结合结构域显示出对食蟹猴和狨猴的排他性交叉反应性。
2.2.抗IL-4R结构域的优化
进一步优化了抗IL-4R结构域PRO1538(44-39-B07-sc03)和PRO1517(44-34-C10-sc01)以装配成多特异性形式。
抗IL-4R结构域44-39-B07-sc04(PRO1538)的优化
PRO1538(44-39-B07-sc03)在VL和VH之间具有pI不平衡(pIVL＝8.2和pIVH＝5.0)。pI的不平衡与高粘度相关，并可能对稳定性产生负面影响。因此，设计了这种分子的两种新变体。这些变体描述如下。简而言之，已经详细分析了VH中的所有残基，目的是设计出消除pI不平衡，而不损害结合亲和力，并且不引入关键序列责任(化学和翻译后修饰)、T细胞表位等的分子。
设计了两种变体，总结在表16中。
表16:44-39-B07-sc03的优化变体
然而，PRO1538(44-39-B07-sc03)的这些变体并没有显示出期望的稳定性改善。由于PRO1538在抑制IL-4和IL-13诱导的信号传导方面的效力明显较弱，并且在阻断IL-4与IL-4R的相互作用方面的效力比PRO1517低10倍以上，因此PRO1538及其变体被排除在进一步考虑之外，并将工作集中于RPO1517(44-34-C10-sc01)的改进。
抗IL-4R结构域44-34-C10-sc01(PRO1517)的优化
PRO1517(44-34-C10-sc01)是具有有利结合特性的抗IL-4R scFv。在生物物理表征过程中，scFv PRO1517表现出良好但仍可改善的溶解性。努力进一步改善PRO1517的溶解性、长期稳定性和浓度特性。因此，设计了该分子的四种新变体。这些变体描述如下。简而言之，已经详细分析了CDR或前者VH-CH界面中的疏水区域，并且降低了pI失衡，目的是设计出消除了疏水区域，而不损害结合亲和力，并且不引入关键序列责任(化学和翻译后修饰)、T细胞表位等的分子。
设计了四种变体，总结在表17中。
表17:44-34-C10-sc01的优化变体
2.3.优化的抗IL-4R结合结构域(scFv格式)的生物物理表征
储存稳定性研究
如上文1.9节所述，对PRO1897、PRO1898和PRO1899进行了储存稳定性研究。结果总结在表18中。
从表19可以看出，scFv PRO1898和PRO1899表现出优异的储存稳定性。在4℃储存d28后单体含量损失小于5％。此外，这些分子在任何温度下都没有表现出蛋白质含量的显著损失。
热解折叠
使用NanoTemper通过纳米动态扫描荧光测定法(nDSF)分析了PRO1897、PRO1898和PRO1899的热稳定性，允许确定解折叠起始(Tonset)、解折叠中点(Tm1)和散射起始温度。表19总结了两次/三次测量的Tm1和Tonset结果。从表19可以推断，PRO1897、PRO1898和PRO1899显示出高的熔化温度。
2.4.优化的抗IL-4R结合结构域(scFv格式)的药效学特征
对人IL-4R的亲和力
在T200装置(Biacore，GE Healthcare)上，通过SPR分析测定了优化的抗IL-4RscFv PRO1898和PRO1899对人IL-4R的亲和力，如上文第1.5或1.8节所述。使用剂量响应多循环动力学分析法测量scFv，在运行缓冲液中稀释7种分析物浓度，范围为0.12至90nM。使用1:1结合模型对获得的传感器图进行拟合。
如表20所示，所有优化的scFv都证实了与人IL-4R和食蟹猴IL-4R的结合。
表18:在10mg/ml和-80℃、4℃和40℃温度下的28d储存和F/T稳定性研究。
NA:未分析；*测量前进行五次重复的F/T循环
表19:优化的结构域的nDSF。
表20:优化的抗IL-4R scFv对人IL-4R的亲和力。
对食蟹猴IL-4R的亲和力
使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899对食蟹猴IL-4R的亲和力，不同之处在于捕获的是食蟹猴IL-4R-Fc而不是人IL-4R-Fc，如上文1.5或1.8节所述。表21总结了这一分析的结果。
表21:优化的抗IL-4R单链抗体对食蟹猴IL-4R的亲和力。
在HEK蓝细胞中进行Stat-6报告基因分析(阻断人IL-4和IL-13诱导的信号传导)
在该HEK蓝分析中分析了优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899阻断IL-4R介导的信号传导的能力，如上文1.5或1.8节所述。将所分析的分子的效力与度普利尤单抗进行比较。表22总结了所有效力数据。以度普利尤单抗和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC50值。优化的scFv阻断IL-4和IL-13诱导的信号传导，其效力与度普利尤单抗相似(见图3)。
表22:stat-6报告基因分析中，scFv PRO1898和PRO1899和IL-4和IL-13诱导的信号传导的效力。
/>
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品
NA:不适用
竞争性ELISA(抑制hIL-4与hIL-4R的结合)
使用竞争性ELISA测定了优化的抗IL-4R scFv PRO1898和PRO1899 scFv的效力。如1.5或1.8节所述，通过ELISA测定了每种scFv抑制人IL-4和人IL-4R之间相互作用的能力。类似地，对于stat-6报告基因试验，将每个平板上的单个IC50值对照参考分子度普利尤单抗的IC50进行校准。
表23总结了竞争性ELISA分析的结果。PRO1898和PRO1899的阻断效力与度普利尤单抗相似(见图5)。
表23:在竞争ELISA试验中，scFv PRO1898和PRO1899抑制hIL-4–IL-4R相互作用的效力。
*IC50,度普利尤单抗/IC50,测试样品；
NA:不适用
实施例3:基于Morrison-H IgG4的抗IL-4R×IL-31双特异性抗体
然后进一步测试当掺入到多特异性抗体形式时，本发明的抗IL-4R抗体可变结构域是否也提供有利的生物和生物物理性质。因此，基于Morrison-H IgG4形式设计了多特异性抗体，包含两个如本文所定义的抗IL-4R抗体可变结构域。对于特异性结合不同于IL-4R的靶标的结合结构域，选择了两个IL-31结合结构域(IL31-BD)。
3.1.Morrison格式设计
设计了一系列具有Morrison-H形式的抗IL-4R×IL-31双特异性抗体，其中Fc区源自IgG亚类IgG4。
由于其与食蟹猴IL-4R的交叉反应性、其在阻断IL-4R介导的信号传导中的优异效力及其优异的生物物理性质，抗IL-4R scFv可变结构域44-34-C10-sc08和44-34-C10-sc09被选择用于Morrison-H构建体的Fab-arm结合结构域。同样，由于其优异的生物学和生物物理学特性，抗IL-31scFv 50-09-D07-sc04被选择用于scFv结构域，融合到Morrison-H抗体重链C末端。
使用与上述抗IL-4R抗体可变结构域相同的方法进行人源化抗IL-31结合结构域50-09-D07-sc04的鉴定、人源化、生产和最终选择。
设计了两种IgG4-(scFv)2Morrison-H分子，即PRO2198和PRO2199，如表24所示(Morrison-H)。
表24:IgG4 Morrison-H构建体
使用瞬时CHOgro表达系统(Mirus)在FreeStyle CHO-S细胞中进行多特异性抗体PRO2198和PRO2199的表达。将目的基因优化，以用于哺乳动物表达，合成并克隆到标准pcDNA3.1载体中。使用摇瓶在37℃分批培养表达培养物6至7天(细胞存活力<70％)。通过离心将培养物上清液与细胞分离，随后进行0.22m无菌过滤。通过蛋白L或亲和层析从澄清的培养物上清液中捕获目标蛋白，随后进行大小排阻层析精制步骤(在捕获后通过SE-HPLC评估没有合适的单体含量级分可用的情况下)。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、SDS-PAGE和UV280。
3.2.对人和食蟹猴IL-4R的亲和力
在T200装置(Biacore，Cytiva)上，通过SPR分析来确定双特异性Morrison-H抗体PRO2198、PRO2199与重组人IL-4R蛋白(ECD，带His标签，Sino Biological)的结合动力学(包括亲和力)。在该SPR实验中，通过共价固定到羧甲基化葡聚糖表面(CM5传感器芯片；Biacore，Cytiva)的抗人IgG-Fc抗体(人抗体捕获试剂盒；Biacore，Cytiva)将Morrison分子捕获，并注射滴定系列的人IL-4R ECD作为分析物。在每个分析物注射循环之后，使传感器芯片再生(MgCl2)，随后重新捕获新的Morrison抗体。使用多循环动力学试验测量与人IL-4R的结合动力学，9种分析物浓度在运行缓冲液(HEPES缓冲盐水，0.05％ Tween-20，pH7.5)中稀释范围从0.175到45nM。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(Biacore Evaluation software Version 3.2,Cytiva)计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数和表观解离平衡常数(KD)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。结合水平计算为达到的最大稳定性结合，归一化为理论Rmax。使用与分析人IL-4R亲和力相同的设置测量了对食蟹猴IL-4R的交叉反应性，不同之处在于使用重组食蟹猴IL-4R(ECD带有His-tag，Acro Biosystems)蛋白代替人IL-4R作为分析物。
如表25所示，证明了Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199与人IL-4R和食蟹猴IL-4R的高亲和力结合。
表25:Morrison抗体与人IL-4R和食蟹猴IL-4R的结合动力学
/>
表26:在stat-6报告基因试验中，在试验介质中有和没有IL-31的情况下，Morrison-H抗体中和人IL-4诱导的信号传导的效力。n＝重复分析的次数。
*IC50或相对IC50(单次分析)
表27:stat-6报告基因分析中，Morrison-H分子中和人IL-13诱导的信号传导的效力。n＝重复分析的次数。
*IC50或相对IC50(单次分析)
3.3.抑制人IL-4和IL-13信号传导的效力评估(HEK蓝IL-4/IL-13细胞stat-6报告基因试验)
HEK蓝试验已用于测试Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199抑制IL-4和IL-13通过IL-4R诱导的信号传导的能力。将每孔50,000个细胞接种在96孔板中。在存在0.05ng/mlIL-4或0.3ng/ml IL-13的情况下，将浓度范围为100至0.002ng/ml的Morrison分子和参照抗体度普利尤单抗的三倍系列稀释液加入平板中。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，将上清液转移到新的平板上，使用Quanti-Blue底物对分泌的胚胎碱性磷酸酶进行定量。还测试了在试验培养基中存在过量IL-31(10nM)时，Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199对IL-4诱导的信号传导的抑制。
表26(IL-4/IL-4R抑制)和表27(IL-13/IL-4R抑制)总结了所有效力数据。重复分析的平均相对IC50值也以pM表示。Morrison-H抗体PRO2198和PRO2199有效地阻断了IL-4或IL-13与IL-4R之间的相互作用，效力与度普利尤单抗相当。
3.4.PRO2198和PRO2199的生物物理表征:
3.4.1.热稳定性
分析了PRO2198和PRO2199在pH 5和pH 8.5之间的热稳定性。确定了热解折叠以及热聚集的起始。在热解折叠过程中，由于分子的多域结构，所有分子都表现出一个以上的转变。为简单起见，仅显示了第一个融化中点。表28总结了结果。
表28:热稳定性
对于所有分子，解折叠起始温度(Tonset)以及第一熔点(Tm1)均在pH 7时最高。pH值变为8.5仅略微降低了热稳定性。向酸性pH方向，热稳定性下降。然而，在pH 5时，所有解折叠起始温度都在55℃以上。
仅在pH 7和pH 8.5观察到了热聚集。在pH 5.0时，两种Morrison抗体都没有形成更大的聚集体，即使在解折叠状态下也是如此。在中性和碱性pH，聚集起始温度在第一熔点以上，表明了非天然聚集机制。
3.4.2.高浓度稳定性研究
对于高浓度稳定性试验，将PRO2198配制在两种配方缓冲液中：
配方缓冲液F1:20mM乙酸盐，pH 5.5
配方缓冲液F2:20mM柠檬酸盐和50mM NaCl，pH 5.5。
溶解度-蛋白质浓度
PRO2198可浓缩至100mg/ml以上，无沉淀迹象或达到溶解度极限。此外，PRO2198未显示出可检测到的蛋白质浓度降低，即PRO2198在4℃和25℃可充分溶解以达到并保持100mg/ml以上的目标浓度至少四周。
不同温度下的单体稳定性
将PRO2198配制在F1和F2中，并浓缩至>100mg/ml。浓缩样品在4℃、25℃和40℃储存长达4周。在不同的时间点，通过SE-HPLC分析单体含量。结果总结在表29中。
表29:浓度>100mg/ml的PRO2198的单体稳定性
3.5.PRO2198和PRO2199的生物物理表征中使用的一般方法
缓冲液交换
通过透析进行缓冲液交换。抗体在Spectra Pro 3透析膜(SpectrumLaboratories)中用至少200倍过量的透析缓冲液透析。
抗体的浓缩
使用截留分子量(MWCO)为10kDa或30kDa的离心浓缩器浓缩抗体。样品在22℃离心5分钟，直到达到目标浓度。在两个步骤之间，将样品重悬。
蛋白质浓度的测定
使用Tecan板读数器和NanoQuant板测定蛋白质样品的浓度。使用缓冲液作为空白，从280nm处测得的吸光度中减去。针对在310nm处测定的可见颗粒引起的散射，对每次测量进行校正。将校正值归一化为1cm的光程长度，并使用相应蛋白质的理论消光系数计算蛋白质浓度。对于浓度高于10mg/ml的蛋白质样品，将样品在相应的缓冲液中稀释至少10倍或稀释至1mg/ml的标称浓度。
储存
为了评估蛋白质在不同温度下的稳定性，将样品在4℃、25℃和40℃孵育。在标称温度为4℃的冰箱中进行4℃储存。对于在25℃和40℃的储存，将样品分别置于湿度控制在65％rH和75％rH的柜中。
动态光散射
使用动态光散射测定溶液中分子和颗粒的扩散系数。它可以计算溶液中分子的流体动力学半径(Rh)，并提供一种灵敏的方法来检测更高级低聚物的形成。
在高浓度稳定性研究中，在目标浓度下测定相对湿度和多分散性。这得到了关于自缔合、低聚以及粘度潜在增加的信息。测量值没有针对缓冲液或样品粘度进行校正，而是使用水的粘度来计算样品的Rh。
通过nanoDSF测定热解折叠
使用TSA的热解折叠通过Sypro Orange的荧光强度变化获得。染料的荧光对疏水相互作用很敏感。随着蛋白质解折叠，疏水氨基酸暴露于溶剂中，导致Sypro Orange的荧光增加。通过将数据拟合到玻尔兹曼方程来确定得到的热解折叠中点(Tm)以及在最大信号的10％处计算的起始温度(Tonset是温度在：min.信号+0.1*(max.信号–min.信号))。
通过SE-HPLC测定单体含量
使用在50mM磷酸钠、300mM NaCl、pH 6.5中运行的Shodex KW403-4F柱，通过分析尺寸排阻色谱法测定单体含量。为了分析，注入5g样品并记录280nm处的吸收。样品的质量表示为单体、HMWS和LMWS的相对百分比。
Claims (16)
1.一种抗体可变结构域，其特异性结合IL-4R，包含:
a)VH链，其具有选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的序列，和
b)VL链，其具有选自SEQ ID NO:14、15、16、17和18的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域包含：
a)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
14的序列；或者
b)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
17的序列；或者
c)VH链，其具有SEQ ID NO:4的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
18的序列；或者
d)VH链，其具有SEQ ID NO:5的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
15的序列；或者
e)VH链，其具有SEQ ID NO:6的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
16的序列；或者
f)VH链，其具有SEQ ID NO:7的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
14的序列；或者
g)VH链，其具有SEQ ID NO:8的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
18的序列；或者
h)VH链，其具有SEQ ID NO:9的序列；和VL链，其具有SEQ ID NO:
14的序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域选自FAB、Fv、scFv和dsFv。
4.根据权利要求3所述的抗体可变结构域，其是scFv抗体，具有选自SEQ ID NO:33至39的序列。
5.一种多特异性抗体，其包含：
a)权利要求1至4中任一项所定义的一个或两个抗体可变结构域；
b)至少一个结合结构域，其特异性结合不同于IL-4R的靶标。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白Fc区。
7.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、圆形二聚体scDb(CD-scDb)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)、Fab-Fv2、三体、scDb-scFv、四体、二-二体、串联-二-scFv和MATCH。
8.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包括免疫球蛋白Fc区，其选自IgG亚类IgG1和IgG4，特别是IgG4。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自基于KiH的IgG；DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison H)或IgG CL-scFv融合体(Morrison L))，特别是Morrison H和Morrison L。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含：权利要求1至4中任一项所定义的两个抗体可变结构域，和特异性结合不同于IL-4R的第二靶标的两个结合结构域。
11.一种核酸或两种核酸，其编码权利要求1至4中任一项的抗体可变结构域或权利要求5至10中任一项的多特异性抗体。
12.一种载体或两种载体，其包含权利要求11的所述一种核酸或所述两种核酸。
13.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含权利要求12的所述一种载体或所述两种载体。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的抗体可变结构域或权利要求5至10中任一项的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
15.权利要求1至4中任一项的抗体可变结构域或权利要求5至10中任一项的多特异性抗体，其用作药物。
16.权利要求1至4中任一项的抗体可变结构域或权利要求5至10中任一项的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自过敏性、炎性和自身免疫性疾病，特别是选自炎症和自身免疫性疾病的人类疾病。
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