TW202241966A - 對於介白素－４受體及介白素－３１具特異性之多特異性抗體 - Google Patents

對於介白素－４受體及介白素－３１具特異性之多特異性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202241966A
TW202241966A TW110148468A TW110148468A TW202241966A TW 202241966 A TW202241966 A TW 202241966A TW 110148468 A TW110148468 A TW 110148468A TW 110148468 A TW110148468 A TW 110148468A TW 202241966 A TW202241966 A TW 202241966A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
multispecific antibody
sequence
morrison
scfv
Prior art date
Application number
TW110148468A
Other languages
English (en)
Inventor
朱莉婭 蒂茨
媞 岡蒂
瑪麗亞 約翰遜
史丹分 渥木
亞力克斯 西蒙尼
克利先 賀斯
白石紀子
荒川善夫
三宅良英
Original Assignee
瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 filed Critical 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司
Publication of TW202241966A publication Critical patent/TW202241966A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本發明是有關於一種多特異性抗體，多特異性抗體包含一個或兩個特異性結合於IL-4R的IL-4R結合域(IL4R-BD)，以及一個或兩個特異性結合於IL-31的結合域(IL31-BD)，其中多特異性抗體包含免疫球蛋白Fc區。本發明更有關於編碼多特異性抗體的核酸、包含核酸的載體、包含核酸或載體的宿主細胞，以及產生多特異性抗體的方法。 此外，本發是明有關於包含多特異性抗體的醫藥組合物及其使用方法。

Description

對於介白素-4受體及介白素-31具特異性之多特異性抗體
本發明是有關於一種多特異性抗體，多特異性抗體包含一個或兩個特異性結合介白素-4受體(IL-4R)的結合域(IL4R-BD)和一個或兩個特異性結合介白素-31(IL-31)的結合域(IL31-BD)，其中多特異性抗體包含免疫球蛋白Fc區。本發明還有關編碼所述多特異性抗體的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或所述載體的宿主細胞，以及產生所述多特異性抗體的方法。 此外，本發明有關於包含所述多特異性抗體的醫藥組合物及其使用方法。
介白素-4受體(interleukin-4 receptor, IL-4Rα，本文也稱為IL-4R或IL4R)，是I型受體。介白素-4受體通過與常見的細胞激素受體 γ 鏈 (γ c) 直接相互作用或通過與 II 型受體(例如特別是與 II 型受體 IL-13Rα1 )形成受體複合物來結合介白素 4 (IL-4)。這種 IL-4R/IL-13Rα1 受體複合物可以結合介白素 4 (IL-4) 和介白素 13 (IL-13) 以調節 B 細胞中 IgE 抗體的產生。進一步已知 IL-4 與 IL-4R 結合可活化巨噬細胞並促進第 2 型輔助 T 細胞（type 2 helper T-cell, Th2 cell）的分化，從而導致 Th2 驅動的發炎。IL-4 和/或 IL-13 與 IL-4Rα/γ c和/或 IL-4R/IL-13Rα1 結合導致詹納斯激酶1(Janus kinase 1, JAK1)、JAK2的活化，訊號轉導子與轉錄激活子1(signal transducer and activator of transcription 1, STAT1)、STAT3、STAT6 和 STAT 二聚化，進而誘導特定基因的轉錄。
IL-4R訊號已顯示與許多人類疾病相關，例如發炎和自體免疫疾病，包括異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、結節性癢疹(prurigo nodularis)、鼻息肉症(nasal polyposis)、慢性蕁麻疹(chronic urticaria)、氣喘(asthma)和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)。
在先前技術中已經描述通過結合細胞激素IL-4和/或IL-13或結合IL-4R來減少或阻斷IL4R介導的訊息傳遞(IL4R-mediated signaling)的幾種單株抗體，用於治療這些疾病。例如，再生元製藥(Regeneron Pharmaceuticals)和賽諾菲健贊(Sanofi Genzyme)開發的能與IL-4R結合並拮抗的杜普魯單抗(dupilumab)(Dupixent®)已被批准用於治療中重度異位性皮膚炎和用於治療伴有鼻息肉的慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyposis, CRSwNP)。它還被評估用於治療成人和青少年的持續性氣喘。
異位性皮膚炎(AD)是一種慢性皮膚發炎性皮膚病，其特徵在於強烈的瘙癢症(intense pruritus)(例如，嚴重的瘙癢)以及鱗狀和乾燥的濕疹損傷(eczematous lesion)。由於嚴重的心理問題、嚴重的睡眠不足和生活品質受損，嚴重的疾病可能會導致嚴重的殘疾，從而導致高昂的社會經濟成本。異位性皮膚炎通常始於 5 歲之前的兒童時期，並可能持續到成年。
異位性皮膚炎的病理生理學受免疫球蛋白E(IgE)介導的致敏、免疫系統和環境因素之間的複雜相互作用的影響。原發性皮膚缺陷可能是導致IgE介導的致敏的免疫紊亂，以及由基因突變和局部發炎共同導致的上皮屏障功能障礙。
異位性皮膚炎的典型治療包括局部乳液(topical lotion)和保濕劑、局部皮質類固醇軟膏(topical corticosteroid ointment)、乳膏(cream)或注射劑。然而，大多數治療方案只能提供暫時的、不完全的症狀緩解。此外，許多中度至重度異位性皮膚炎患者對局部皮質類固醇或鈣調磷酸酶抑製劑(calcineurin inhibitor)的治療產生抗藥性。因此，已經開發了用於治療和/或預防異位性皮膚炎的更有針對性的療法，例如拮抗IL4R功能的單株抗IL4R抗體。
例如，WO 2014/039461 描述了用於治療異位性皮炎的抗 IL4R 拮抗抗體。
此外，如上所述，抗 IL-4R 單株抗體 dupilumab (Dupixent®) 分別在 2017 年和 2018 年獲得美國食品和藥物管理局(United States Food and Drug Administration)用於中度至重度異位性皮炎和氣喘的批准。
然而，抗IL-4R療法具有顯著的局限性。例如，它們在感興趣的異位性疾病中的功效通常是有限的，並且反應率通常是低到中等的。此外，抗 IL-4R 療法不能直接解決瘙癢問題。然而，瘙癢是皮膚相關發炎和自體免疫疾病的常見症狀，例如在異位性皮膚炎的情況下。與瘙癢相關的搔抓(scratching)通常會促進發炎和疾病相關症狀的惡化。因此，對於患有中度至重度異位性皮膚炎和其他造成瘙癢的發炎和自體免疫疾病的患者，迫切需要額外的治療選擇。
更具體地，明確需要能夠更有效地降低或消除所述過敏性、發炎性和自體免疫疾病中的IL-4和/或IL-13介導的傳訊活性的新穎和改進的治療性抗體，而且解決與這些疾病相關的瘙癢症狀(瘙癢症)。
所述治療性抗體應具有高效力以及可耐受的安全特性以將劑量限制性副作用保持在低水平。 這在治療通常需要長期應用所述治療性抗體的慢性疾病的情況下尤其重要。此外，希望所述治療性抗體具有優異的生物物理特性，例如高穩定性，以促進高產量的可開發性和可生產性。 特別是，它們應在高濃度下具有良好的儲存穩定性，以允許製備用於皮下注射應用的高濃度製劑。皮下注射是高度期望的，也是使患者能夠自己應用藥物的必要先決條件。
本發明的一目的是提供一種藥物以改善對過敏性、發炎性和自體免疫性疾病的治療，特別是為引起瘙癢的發炎性和自體免疫性疾病(例如中度至重度異位性皮膚炎)提供一種新的、優越的治療方式。更具體地，本發明的一目的是提供能夠有效降低或消除所述疾病中IL-4和IL-13介導的活性並且還能夠解決有關這些疾病的瘙癢症狀的新型和改進的治療性抗體。本發明的另一目的是所述新的和改進的治療性抗體在高於100mg/ml的蛋白質濃度下表現出高穩定性，以允許它們通過皮下注射應用。
本發明人現已驚奇地發現，包含一個或兩個 IL-4R 拮抗結合域 (IL4R-BDs)和一個或兩個IL-31中和結合域(IL31-BDs)的多特異性抗體可以同時阻斷IL-4/IL-13和IL-31以高效方式誘導的訊息傳遞，這允許同時減少IL-4/IL-13相關症狀以及瘙癢相關的IL-31活性。
本發明人通過測試許多不同的抗體形式進一步出人意料地發現，當所述抗IL-4R x IL-31多特異性抗體包含功能性Fc區(特別是包含功能性Fc區的IgG區)時，可以更好地阻斷IL-4和IL-13誘導的訊息傳遞，並具有非常有利的生物物理特性(特別是出色的穩定性)，這允許製備抗體濃度遠高於100 mg/ml的儲存穩定的製劑。未表現出所需組合屬性的測試形式(即期望的高抑制效力和同時期望的高儲存穩定性)特別是MATCH3、scMATCH3、(scFv)2Fc(scFv) 2和Morrison IgG1(靜默的)。對這些多特異性抗體形式進行了深入研究。測試的基於 MATCH3和scMATCH3的多特異性抗體表現出良好的穩定性，但在抑制IL-4R和IL-31介導的訊息傳遞方面缺乏功效。測試的基於 (scFv) 2Fc(scFv) 2的多特異性抗體顯示出改進的抑制效力，但在以高於 100 mg/ml的濃度儲存較長時間時僅適度穩定。另一方面，測試的基於 靜默IgG1 Morrison的多特異性抗體在高濃度下表現出優異的儲存穩定性，但並未完全達到所需的抑制效力。得出的結論是，功能性 Fc 區(特別是功能性IgG區)對於所需的抑制效力是必需的。
因此，在第一方面，本發明涉及多特異性抗體，其包含： a) 特異性結合IL-4R的一個或兩個IL-4R結合域(IL4R-BD)，和 b) 特異性結合IL-31的一個或兩個IL-31結合域(IL31-BD)， 其中多特異性抗體包含免疫球蛋白Fc區，特別是IgG區。
在第二方面，本發明涉及編碼本發明的多特異性抗體的一種核酸或兩種核酸。
在第三方面，本發明涉及包含本發明的一種核酸或兩種核酸的一種載體或兩種載體。
在第四方面，本發明涉及包含本發明的載體或兩種載體的一宿主細胞或多種宿主細胞。
在第五方面，本發明涉及生產本發明的多特異性抗體的方法，包括(i)提供本發明的核酸或兩種核酸，或本發明的載體或兩種載體，表達所述核酸或所述兩種核酸，或所述一種載體或多種載體，並從表達系統收集多特異性抗體，或(ii)提供本發明的一種或多種宿主細胞，培養所述一種或多種宿主細胞；從細胞培養物中收集所述多特異性抗體。
在第六方面，本發明涉及一種醫藥組合物，其包含本發明的多特異性抗體和藥學上可接受的載體。
在第七方面，本發明涉及用作藥物的本發明的多特異性抗體。
在第八方面，本發明涉及本發明的多特異性抗體，其用於治療疾病，特別是人類疾病，更特別是選自過敏性、發炎性和自體免疫性疾病的人類疾病，特別是選自發炎性和自體免疫性疾病。
在第九方面，本發明涉及一種用於治療疾病(特別是人類疾病，更特別是選自過敏性、發炎性和自體免疫性疾病，特別是發炎性和自體免疫性疾病的人類疾病)的方法，包括將本發明的多特異性抗體施用於有需要的患者的步驟。
本發明的各個方面、有利特徵和優選實施例分別單獨或組合地總結在以下各項中，進一步有助於解決本發明的目的：
1. 一種多特異性抗體，包括： a) 特異性結合IL-4R的一或兩個IL-4R結合域(IL4R-BD)，特別是兩個相同的 IL4R-BD，和 b) 特異性結合IL-31的一或兩個IL-31結合域(IL31-BD)，特別是兩個相同的IL31-BD， 其中多特異性抗體包含免疫球蛋白Fc區，特別是功能性Fc區。
2. 如第1項所述的多特異性抗體，其中 -每個所述IL4R-BD包含 SEQ ID NO: 1的HCDR1序列， SEQ ID NO: 2的HCDR2序列， SEQ ID NO: 3的HCDR3序列， SEQ ID NO: 7的LCDR1序列， SEQ ID NO: 8的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 9的LCDR3序列；和 -每個所述IL31-BD包含 SEQ ID NO: 12的HCDR1序列， SEQ ID NO: 13的 HCDR2序列， SEQ ID NO: 14的 HCDR3序列， SEQ ID NO: 17或18的LCDR1序列， SEQ ID NO: 19的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 20的LCDR3序列。
3.如第1或2項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體的形式選自(scFv) 2-Fc-(scFv) 2融合體(ADAPTIR)；DVD-Ig； DART TM和TRIDENT TM。
4.如第1或2項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體包含IgG區。
5.如第4項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體的形式選自二價雙特異性IgG形式、三價雙特異性IgG形式和四價雙特異性IgG形式； 特別是其中所述多特異性抗體的形式選自基於KiH的IgG； DVD-Ig；IgG-scFv融合體（例如CODV-IgG、Morrison(IgG CH3-scFv融合體 (Morrison-H)或IgG CL-scFv融合體 (Morrison-L))）、bsAb(與輕鏈C端連接的scFv)、Bs1Ab(與輕鏈 N 端相連的scFv)、Bs2Ab(與重鏈 N 端相連的scFv)、Bs3Ab (與重鏈C端相連的scFv)、Ts1Ab(與重鏈和輕鏈的N端皆相連的scFv)和Ts2Ab(與重鏈C端相連的dsscFv）； 更特別地，其中所述多特異性抗體的形式選自基於KiH的IgG； DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison（IgG CH3-scFv融合 (Morrison-H)或IgG CL-scFv融合(Morrison-L)），甚至更特別地來自DVD-Ig和Morrison（IgG CH3-scFv融合(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合(Morrison-L)）。
6.如第5項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體的形式選自Morrison形式。
7.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體包含兩個IL4R-BD。
8.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體包含兩個IL31-BD。
9. 如第1項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體包括： a) 特異性結合IL-4R的兩個IL-4R結合域(IL4R-BD)，和 b) 特異性結合IL-31的兩個IL-31結合域(IL31-BD)， 其中所述多特異性抗體包含IgG區，特別是其中所述多特異性抗體的形式選自Morrison形式； 並且其中 -每個所述IL4R-BD包含 SEQ ID NO: 1的HCDR1序列， SEQ ID NO: 2的HCDR2序列， SEQ ID NO: 3的HCDR3序列， SEQ ID NO: 7 的 LCDR1序列， SEQ ID NO: 8 的 LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 9 的 LCDR3序列；和 -每個所述IL31-BD包含 SEQ ID NO: 12的HCDR1序列， SEQ ID NO: 13的HCDR2序列， SEQ ID NO: 14的HCDR3序列， SEQ ID NO: 17或18的LCDR1序列， SEQ ID NO: 19的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 20的LCDR3序列。
10.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體作為IL4R的拮抗劑。
11.如第10項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體阻斷IL4和IL13與IL4R的結合。
12.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體阻斷IL-31與白介素31受體α(interleukin 31 receptor alpha, IL-31RA)/抑癌素M受體(oncostatin M receptor, OSMR)複合物(IL-31RA/OSMR complex)的結合。
13. 如項目1至12中任一項所述的多特異性抗體，其中當在pH 5.5的20mM醋酸鹽(acetate)緩衝液中配製時，所述多特異性抗體具有至少100 mg/ml(特別是至少120 mg/ml)的溶解度。
14. 如項目1至12中任一項所述的多特異性抗體，其中當在pH 5.5的20 mM醋酸鹽緩衝液中配製時，所述多特異性抗體可濃縮至100 mg/ml和更高，特別是至100 mg/ml~200 mg/ml，尤其是100 mg/ml~150 mg/ml，通過SE層析法測定，單體含量的損失少於2%，特別是少於1%。
15. 如項目 1 至 12 中任一項的多特異性抗體，其中當在pH 5.5的20 mM乙酸鹽緩衝液中配製時，所述多特異性抗體在濃度為100 mg/ml和更高(特別是在100 mg/ml~150 mg/ml範圍內的濃度)時的單體含量至少95%，特別是至少97%。
16. 如項目1至12所述的多特異性抗體，其中當所述多特異性抗體的起始濃度為 100 mg/ml 時，所述多特異性抗體在4°C儲存4週後單體含量的損失小於5%(例如，小於 4%、小於 3%、小於 2%、優選小於 1%)，特別是其中所述多特異性抗體在pH 5.5的20 mM醋酸鹽緩衝液中配製。
17. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中當相較於未處理的BEAS-2B細胞的CCL2分泌量時，在存在1 μg/ml所述多特異性抗體的情況下，經1 ng/ml IL-4和10 ng/ml IL-31處理的BEAS-2B細胞的CCL2分泌量為減少或僅增加1.00至1.50的因子(factor)，特別是1.00至1.4的因子，特別是1.00至1.30的因子，特別是1.00至1.20的因子。
18.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述免疫球蛋白Fc區選自IgG亞類，特別是選自IgG亞類IgG1和IgG4，特別是選自IgG4。
19.如第6項所述的多特異性抗體，其中IL4R-BD位於Fab臂中，並且IL31-BD位於Morrison形式的scFv部分。
20. 如項目6和19中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體的形式選自Morrison-L和Morrison-H形式，特別是其中所述形式是Morrison-H形式。
21.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD： a. 如通過表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)測量的，以0.1 pM至200 pM的單價解離常數(K D)(特別是0.1 pM至100 pM，特別是0.1至50pM的K D)結合人類IL-4R，特別是其中所述IL4R-BD為scFv格式； b. 如通過SPR測量的，以1 pM至5 nM(特別是 1 pM 至 3 nM，特別是 1 pM 至 2 nM)單價K D與食蟹猴(Macaca fascicularis , Cynomolgus) IL4R具有交叉反應(特別是與食蟹猴IL-4R結合)，特別是其中所述IL4R-BD是scFv形式； c. 如通過SPR測量的，以1 pM至5 nM(特別是 1 pM 至 3 nM，特別是 1 pM 至 2 nM)單價K D與狨猿(Callithrix jacchus, Marmoset) IL4R具有交叉反應(特別是與狨猿IL-4R結合)，特別是其中所述IL4R-BD是scFv形式； d. 如在HEK-藍(HEK-Blue)細胞中的stat6報導基因測定中測量的的，以IC 50為0.01 ng/ml至5 ng/ml(特別是IC 50為0.01 ng/ml至3 ng/ml，特別是IC 50為0.01 ng/ml至1.5 ng/ml)中和人類IL-4誘導的訊息傳遞，其中所述IL4R-BD是scFv形式； e. 如在HEK-Blue細胞中的stat6報導基因測定中測量的，以IC 50為0.01 ng/ml至10 ng/ml(特別是IC 50為0.01至5 ng/ml，特別是 IC 50為0.01 ng/ml至2.5 ng/ml)中和人類IL-13誘導的訊息傳遞，其中所述IL4R-BD是scFv形式； F. 如在競爭ELISA中所測量的，以IC 50為0.01 ng/ml至10 ng/ml(特別是IC 50為0.01 ng/ml至5 ng/ml，特別是IC 50為 0.01 ng/ml 至 2 ng/ml)抑制人類IL-4與人類IL-4R的結合，其中所述IL4R-BD是scFv形式； g. 當為scFv形式時，通過差異性掃描熒光法(differential scanning fluorimetry, DSF)測定所確認的熔化溫度(melting temperature, Tm)是至少63°C(特別是至少65°C，特別是至少67°C，特別是至少69°C，特別是至少70°C，特別是至少71°C，特別是至少72°C)，特別是其中所述scFv在pH 6.4的150 mM NaCl的50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； h. 當為scFv形式且當所述scFv的起始濃度為 10 mg/ml 時，在4°C下儲存4週後，單體含量的損失小於 5%，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM 磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製；及/或 i. 當為 scFv格式且當所述scFv的起始濃度為 10 mg/ml 時，在5次凍融循環(freeze-thawing cycle)後，單體含量的損失小於5%(例如，小於 4 %、小於 3 %、優選小於 2 %)，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM 磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製。
22.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD包含VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4。
23.如項目23中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD在scFv形式時包含 (i) VL結構域，其包含VL框架， VL框架包含框架區FR1、FR2和 FR3以及框架FR4，框架區FR1、FR2和 FR3選自 Vκ亞型(特別是選自Vκ1和Vκ3亞型，特別是Vκ1亞型)，框架 FR4選自Vκ FR4和Vλ FR4，特別是包含與選自SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 33的Vλ FR4序列具有至少70%、80%、90%同一性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別是Vλ FR4選自 SEQ ID NO:26至SEQ ID NO: 33，特別是根據SEQ ID NO: 26或33的Vλ FR4。
24. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD包含 a) 與選自SEQ ID NO: 4、5 和 6的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%同一性的VH序列；和 b) 與選自SEQ ID NO: 10和11的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列。
25. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD包含 a) 選自SEQ ID NO:4、5和6的VH序列， b) 選自SEQ ID NO:10和11的VL序列。
26. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD包含 a) SEQ ID NO: 4的VH序列和SEQ ID NO: 11的VL序列；或者 b) SEQ ID NO: 5的VH序列和SEQ ID NO: 10的VL序列；或者 c) SEQ ID NO: 6的VH序列和SEQ ID NO: 10的VL序列。
27. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL31-BD： a. 如通過表面電漿共振(SPR)所測量的，以5 nM或更小的單價解離常數(K D)(特別是以5 pM至5 nM，特別是5 pM至2 nM，特別是5 pM至1000 pM的單價K D)結合人類IL-31，特別是其中所述IL31-BDs在scFv中； b. 如通過表面電漿共振(SPR)所測量的，以單價KD為5 nM 或更小(特別是以5 pM 至 5 nM，特別是5 pM至2 nM，特別是5 pM至1000 pM的單價KD)與食蟹猴(Cynomolgus) IL-31具有交叉反應，特別是與食蟹猴IL-31結合，，通過 SPR 測量，特別是其中所述IL31-BD在scFv中； c. 如在Path Hunter的IL-31RA/OSMRb二聚化測定中所測量的，以IC 50為0.1 ng/ml至30 ng/ml(特別是IC 50為0.1 ng/ml至20 ng/ml，特別是IC 50為0.1 ng/ml至10 ng/ml)抑制人類IL-31誘導的訊息傳遞，其中所述IL31-BD是scFv形式； d. 如在競爭ELISA中所測量的，以IC 50為0.1 ng/ml至 20 ng/ml(特別是 IC 50為0.1 ng/ml至10 ng/ml，特別是IC 50為0.2 ng/ml至6 ng/ml)阻斷人類IL-31與人類IL-31R的結合，其中所述IL31-BD是scFv形式； e.當為scFv形式時，藉由差異性掃描熒光法測定熔化溫度(Tm)是至少65°C、優選至少67°C、更優選至少69°C的，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM 磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； f. 當為scFv形式且所述scFv的起始濃度為 10 mg/ml 時，在 4°C下儲存至少4週後單體含量損失小於5%(例如小於 4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； g. 當為scFv形式且當所述scFv的起始濃度為10 mg/ml時，在40°C下儲存4週後，單體含量損失小於5%(例如小於4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； h. 當為scFv形式且當所述scFv的起始濃度為10 mg/ml時，在3次凍融循環後，單體含量損失小於 5%(例如小於4%、小於3%、小於2%、優選小於 1%)，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製；和/或 i. 當為scFv形式且當所述scFv的起始濃度為10 mg/ml時，在4°C或40°C下儲存4週後，蛋白質含量損失小於 5%(例如，小於4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，特別是其中所述scFv是以pH 6.4的150 mM NaCl在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製。
28.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL31-BD包含VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4。
29. 如第28項所述的多特異性抗體，其中所述IL31- BD為scFv形式時包含 (i) VL 結構域，VL 結構域包含VL框架，VL框架包含框架區FR1、FR2和FR3以及框架 FR4，FR1、FR2和FR3框架區選自Vκ亞型(特別是Vκ1和Vκ3亞型，特別是Vκ1亞型)，框架FR4選自Vκ FR4和Vλ FR4，特別是包含與選自於SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 33的Vλ FR4序列具有至少70%、80%、90%同一性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別是選自於 SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO:33的Vλ FR4，特別是根據SEQ ID NO: 26或33的Vλ FR4。
30. 前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL31-BD包含 a) 與選自SEQ ID NO: 15和16的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98 %或 99% 同一性的 VH 序列；和 b)與選自SEQ ID NO：21和22的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列。
31. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL31-BD包含 a) 選自SEQ ID NO: 15和16的VH序列，特別是SEQ ID NO: 16 的VH 序列；和 b) 選自SEQ ID NO: 21和22的VL序列，特別是 SEQ ID NO: 21的VL序列。
32.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述IL4R-BD中的至少其一和/或所述IL31-BD中的至少其一包含源自親代兔抗體的CDR區。
33.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中至少一IL4R-BD和至少一IL31-BD能夠同時結合它們各自的抗原。
34. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體： a. 如通過表面電漿共振(SPR)所測量的，以1000 pM或更小的單價解離常數(K D)( 特別是 1 pM至1000 pM，特別是1 pM至700 pM，特別是1 pM至500 pM 的 K D)結合人類IL-4R; b. 如通過SPR所測量的，以單價K D小於50 nM(特別是小於 20 nM，特別是單價K D為1 pM 至 5 nM，特別是1 pM至2 nM，特別是1 pM至1000 pM，特別是1 pM至500 pM)與食蟹猴 (Cynomolgus) IL4R有交叉反應，特別是與食蟹猴 IL-4R 結合； c. 如通過SPR所測量的，以小於5 nM的單價K D(特別是5 pM至5 nM，特別是5 pM至2 nM，特別是5 pM至1000 pM的單價K D)結合人類IL-31； d. 通過SPR所測量的，以單價K D為20 nM或更小(特別是單價K D為5 pM至20 nM，特別是5 pM至10 nM，特別是5 pM至5 nM)與食蟹猴(Cynomolgus) IL-31具有交叉反應，特別是與食蟹猴IL-31 結合； e. 如在HEK-藍細胞中stat-6報導基因測定中所測量的，以IC 50為 0.2 pM至200 pM(特別是IC50為0.2 pM至100 pM，特別是IC 50為0.2 pM 至 50 pM)中和人類IL-4誘導的訊息傳遞； f. 如在HEK-藍細胞中stat-6報導基因測定中所測量的，以IC 50為 0.2 pM至200 pM(特別是IC 50為0.2 pM至100 pM，特別是IC 50為0.2 pM至50 pM)中和人類IL-13誘導的訊息傳遞； g. 如在人類全血測定中所測量的，以IC50為10 pM至2 nM(特別是IC50為10 pM至1 nM)阻斷人類IL-4和人類IL-13誘導的胸腺活化調節的趨化因子(thymus activation regulated chemokine, TARC) 分泌； h. 以EC 50為0.01 nM至10 nM(特別是EC 50為0.01 nM至7 nM，特別是EC 50為0.01 nM至 5 nM)與表達人類IL-4R的HEK293T細胞結合； i. 以EC 50為0.01 nM至10 nM(特別是EC 50為0.01 nM至7 nM，特別是EC 50為0.01 nM至 5 nM)與表達食蟹猴IL-4R的HEK293T細胞結合； j. 如在Path Hunter IL-31RA/OSMRb二聚化測定中所測量的，以IC50為5 pM至2 nM(特別是IC50為5 pM至1 nM，特別是IC50為5 至700 pM)阻斷人類IL-31誘導的訊息傳遞； k. 如在Path Hunter IL-31RA/OSMRb二聚化測定中所測量的，以IC 50為0.05 nM至20 nM(特別是IC 50為0.05 nM至10 nM，特別是 IC 50為0.05 nM至5 nM)阻斷食蟹猴IL-31誘導的訊息傳遞； l. 如通過差異性掃描熒光法所測定的，熔化溫度(Tm)是至少60°C、優選至少63°C、更優選至少66°C，特別是其中所述多特異性抗體是以pH 7.0在20 mM MES的緩衝液中配製；和/或 m. 當所述多特異性抗體的起始濃度為100 mg/ml時，儲存4週後，單體含量的損失小於 5%(例如小於4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，特別是其中所述多特異性抗體配製在pH 5.5的20 mM 醋酸鹽緩衝液中配製。
35.如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其選自具有以下重鏈(heavy chain, HC)和輕鏈(light chain, LC)序列的Morrison抗體： - SEQ ID NO: 38的HC序列和SEQ ID NO: 37的LC序列； - SEQ ID NO: 40的HC序列和SEQ ID NO: 39的LC序列； - SEQ ID NO: 42的HC序列和SEQ ID NO: 41的LC序列； - SEQ ID NO: 44的HC序列和SEQ ID NO: 43的LC 序列； - SEQ ID NO: 46的HC序列和SEQ ID NO: 45的LC序列； - SEQ ID NO: 48的HC序列和SEQ ID NO: 47的LC序列；和 - SEQ ID NO: 50的HC序列和SEQ ID NO: 49的LC序列。
36.一種或兩種核酸，編碼項目1至35中任一項所述的多特異性抗體。
37.一種或兩種載體，包含如第36項所述的核酸或兩種核酸。
38.一種或多種宿主細胞，包含如第37項所述的載體或兩種載體。
39. 一種用於產生如第1至35之任一項所述之多特異性抗體的方法，包括(i)提供如第36項所述的核酸或兩種核酸，或如第37項所述的載體或兩種載體，表達所述核酸或兩種核酸，或表達所述載體或兩種載體，並從表達系統收集多特異性抗體，或(ii)提供如第38項所述的宿主細胞或多種宿主細胞，培養所述宿主細胞或多種宿主細胞；及從細胞培養物中收集所述多特異性抗體。
40.一種醫藥組合物，包含如第1至35項中任一項所述的多特異性抗體和藥學上可接受的載體。
41.如第1至35中任一項所述的多特異性抗體是用作藥物。
42.如第1至35項中任一項所述的多特異性抗體，用於治療疾病，特別是人類疾病，更特別是選自過敏、發炎性和自體免疫性疾病，特別是發炎性和自體免疫性疾病的人類疾病。
43. 如第1至35項中任一項所述的多特異性抗體，用於治療如第42項所述的疾病，其中所述疾病選自引起瘙癢的過敏性疾病、引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病，尤其是引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病。
44.如第42或43項所述的多特異性抗體，其中所述疾病選自異位性皮膚炎、急性過敏性接觸性皮膚炎、慢性自發性蕁麻疹(chronic spontaneous urticarial)、大疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid)、斑禿(alopecia areata)、皮肌炎(dermatomyositis)、結節性癢疹(prurigo nodularis)、牛皮癬和異位性氣喘，特別是其中所述疾病是異位性皮膚炎。
45. 一種用於治療疾病(特別是人類疾病，更特別是選自過敏性、發炎性和自體免疫性疾病，特別是發炎性和自體免疫性疾病的人類疾病)的方法，包括施用如第1至35項之任一項所述的多特異性抗體的步驟給有需要的患者。
46. 如第45項所述的方法，其中所述疾病選自引起瘙癢的過敏性疾病、引起瘙癢的發炎疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病，特別是引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病。
47.如第45或46項所述的方法，其中所述疾病選自異位性皮膚炎、急性異位性接觸性皮炎、慢性自發性蕁麻疹、大疱性類天疱瘡、斑禿、皮肌炎、結節性癢疹、牛皮癬和異位性氣喘；特別是其中所述疾病是異位性皮膚炎。
48. 一種治療疾病(更特別是選自過敏、發炎和自身體免疫疾病的人類疾病；特別是來自引起瘙癢的過敏性疾病、引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病)的方法； 所述方法包括向有需要的患者給藥的步驟 1. 第一抗體，包括 a) IL4R-BD，如前述第1至26和32至35項中任一項所定義，和 b) Fc區，特別是IgG區，特別是IgG4區；和 2. 包含如前述第1至20和27至35項中任一項所定義的IL31-BD的第二抗體。
49. 如第48項所述的方法，其中進行給藥使得在有需要的患者的血漿中同時達到所述第一抗體和所述第二抗體的有效劑量水平。
50.如第48或49項所述的方法，其中所述疾病選自異位性皮膚炎、急性異位性接觸性皮炎、慢性自發性蕁麻疹、大疱性類天疱瘡、斑禿、皮肌炎、結節性癢疹、牛皮癬和異位性氣喘；特別是其中所述疾病是異位性皮膚炎。
51. 一種試劑盒(kit)，包括 1. 第一抗體，包括 a) IL4R-BD，如前述第1至26和32至35項中任一項所定義，和 b) Fc區，特別是IgG區，特別是IgG4區；和 2. 第二抗體，包含如前述第1至20和27至35項中任一項所定義的IL31-BD。
52.如第40項所述的醫藥組合物，其中所述醫藥組合物是用於選自過敏、發炎和自體免疫疾病的人類疾病的治療劑。
53. 如第52項所述的醫藥組合物，其中所述疾病選自異位性皮膚炎、急性異位性接觸性皮炎、慢性自發性蕁麻疹、大疱性類天疱瘡、斑禿、皮肌炎、結節性癢疹、牛皮癬和異位性氣喘；特別是其中所述疾病是異位性皮膚炎。
已知的治療性抗-IL-4R抗體通常在患者中缺乏功效和低至中等的反應率。它們也沒有直接解決瘙癢，搔癢是一種常見的症狀，尤其是在與皮膚相關的發炎和自體免疫疾病中。因此，醫學領域中需要改進的是基於抗IL-4R抗體的療法，其對過敏、發炎和自體免疫疾病，特別是對引起瘙癢的發炎和自體免疫疾病(例如中度至重度異位性皮膚炎)具有更高的功效，同時能夠有效地減少與疾病相關的瘙癢。
本發明提供了多特異性抗體，其包含一個或兩個特異性結合IL-4R的結合域(IL4R-BD)和一個或兩個特異性結合IL-31的結合域(IL31-BD)，其中多特異性抗體包含免疫球蛋白Fc區。本發明的多特異性抗體可以以高效方式同時阻斷IL-4/IL-13以及IL-31誘導的訊息傳遞。
本發明人相信免疫球蛋白Fc區提供額外的FcγR交互作用，此交互作用增強本發明的多特異性抗體與活細胞上的IL-4R的結合，從而增加它們阻斷IL-4R介導傳訊的效力。在人類PBMC測定中對不同抗體形式的分析進一步表明，Fc區與Fc γ受體II型(FcγRII) 的相互作用似乎對觀察到的效力增加特別重要。因此，在本發明的上下文中，術語「功能性Fc區」是指能夠在其天然功能範圍內與FcγR(特別是FcγRII)相互作用的Fc區。
根據發明人的最佳知識，現有技術中尚未報導同時阻斷IL-4R傳訊路徑和IL-31傳訊路徑，更不用說藉由單個分子高效同時阻斷所述路徑。
介白素31(Interleukin 31, IL-31)是一種發炎性細胞激素，有助於觸發針對病原體的細胞介導免疫。IL-31優先由Th2細胞產生。 IL-31 通過異二聚體受體複合物（IL-31R 或 IL31R）發送信號，該複合物包含在免疫細胞和上皮細胞中表達的介白素-31受體α（IL-31RA或IL31RA）和制瘤素M受體β(oncostatin M receptor β, OSMR β)。IL-31與該受體複合物的結合導致JAK/STAT和PI3K/AKT 訊號傳導路徑的活化，並且還活化不同的MAPK路徑(ERK、p38 和 JNK)。
IL-31涉及多種慢性發炎性疾病。例如，已發現小鼠中 IL-31 過表達導致類皮膚炎症狀，參見Dillon等人的文獻（Nature Immunol.  5:752-760, (2004)）。此外，在許多慢性發炎性疾病中，例如在AD 中，IL-31 介導患者皮膚內神經纖維的活化，導致侵襲性瘙癢表型，這會在患者抓癢時加劇這些疾病的症狀，參見例如Oetjen 等人的文獻（Cell, 171：217-228, (2017)）。抓癢會導致皮膚屏障破壞，微生物病原體進入皮膚並進一步促進該部位的發炎。
此外，已發現 IL-31 與過敏性氣喘、過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、發炎性腸病(inflammatory bowel disease)、惡性腫瘤和骨質疏鬆症(osteoporosis)有關，參見 Bagci 等人的文獻（J Allergy Clin Immunol, 141 (3):858-866 (2018)）。
通過抗-IL-31RA抗體阻斷IL-31/IL-31RA訊息傳遞(例如通過抗-IL-31RA抗體nemolizumab)臨床證明在減少患有AD的患者中的瘙癢方面是有效的，參見Ruzicka等人的文獻（N Engl J Med, 376:2092-2093 (2017)）。
此外，IL-31中和抗體 BMS-981164被開發以提供用於治療慢性瘙癢性皮膚病的有效標靶治療，參見 Lewis 等人的文獻（J Eur Acad of Dermatol Venereol, 31(1):142-150 (2017)）。
除了靶向IL-4R(第一特異性)，決定靶向IL-31(第二特異性)而不是細胞結合的IL-31RA，以避免細胞之間任何潛在的交叉連接(cross linkage)，這在同時靶向細胞表面存在兩種不同類型的受體(例如 IL-4R 和 IL-31RA)時很可能發生。
如上所述，本發明的多特異性抗體可以以非常有效的方式同時阻斷IL-4-/IL-13-以及IL-31誘導的訊號傳遞。例如，在1μg/ml的濃度下，PRO2198和PRO2199(本發明的多特異性抗體的兩個代表性範例)能夠減少BEAS-2B細胞之IL-4R-和IL-31-介導的聯合CCL2分泌(BEAS-2B細胞已使用 1 ng/ml IL-4 和 10 ng/ml IL-31處理)，與等量的抗IL-4R抗體dupilumab和抗IL-31抗體BMS-981164的1:1混合物相比，至少達到相似的程度(第1B圖)。
趨化激素(chemokine) C-C模體配體2(C-C motif ligand 2, CCL2)，也稱為單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP1)和小誘導型細胞激素A2，是屬於CC趨化激素家族的小細胞激素。 CCL2將單核細胞、記憶T細胞和樹突狀細胞募集到由組織損傷或感染產生的發炎部位。CCL2 與幾種以單核細胞浸潤為特徵的疾病的發病機制有關，例如psoriasis (psoriasis)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)和動脈粥樣硬化(atherosclerosis)（Xia 等人，Expert Opinion on Therapeutic Patents., 2009, 19 (3): 295-303）。
本發明的一些多特異性抗體(例如PRO2198) 能夠降低所述BEAS-2B細胞的IL-4R和IL-31 介導的 CCL2 聯合分泌，比等量的 dupilumab 和 BMS 981164 的這種1:1混合物更強，幾乎達到未處理BEAS-2B細胞的水平(第1B圖)。
如本文所用，術語「BEAS-2B細胞」或「BEAS-2B」是指來自人類支氣管上皮的永生化非致瘤上皮細胞系(immortalized non-tumorigenic epithelial cell line)的細胞。該細胞系已通過用腺病毒 12-SV40 雜合病毒(hybrid virus)轉染和隨後通過連續細胞傳代永生化建立，參見 Reddel等人的文獻（Cancer Res., 48(7):1904-1909 (1988)）。BEAS-2B 細胞已被廣泛用於研究肺相關疾病的細胞和分子機制，並作為肺相關毒理學研究的體外細胞模型(in vitro cell model)。
此外，本發明的抗IL-4R x IL-31多特異性抗體表現出非常有利的生物物理性質，特別是在遠高於100 mg/ml的抗體濃度下具有出色的製劑和儲存穩定性。例如，本發明的代表性多特異性抗體PRO2198的蛋白質含量以及單體含量的損失在20 mM醋酸鹽緩衝液 (pH 5.5)中以高於100mg/ml的濃度儲存在4°C達4個月時是小於1%。
因此，本發明的多特異性抗體提供了優於常規療法的獨特治療優勢。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域之通常知識者通常理解的相同含義。
除非另有說明，否則術語「包括」和「包含」在本文中以其開放式和非限制性意義使用。對於此類後面的實施例，術語「包括」因此包括更狹義的術語「由…所組成」。
在描述本發明的上下文中（特別是在以下權利要求的上下文中）的術語「一」和「一個」和「該」以及類似的參考將被解釋為涵蓋單數和複數，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾。例如，術語「一細胞」包括多個細胞，包括其之混合物。當複數形式用於化合物、鹽等及類似物，這也意味著單一化合物、鹽及類似物。
在一方面，本發明是有關於一種多特異性抗體，多特異性抗體包括： a) 特異性結合 IL-4R的一個或兩個結合域(IL4R-BD)，和 b) 特異性結合 IL-31的一個或兩個結合域(IL31-BD)， 其中多特異性抗體包括免疫球蛋白Fc區。
如本文所用，術語「抗體」及類似物包括完整抗體(whole antibody)或其單鏈；及其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其單鏈；以及包含抗體CDR、VH區或VL區的分子(包括但不限於多特異性抗體)。天然存在的「完整抗體」是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(heavy chain, H chain)和兩條輕鏈(light chain, L chain)的醣蛋白(glycoprotein)。每條重鏈包含重鏈可變區(heavy chain variable region,本文縮寫為VH)和重鏈恆定區(heavy chain constant region)。重鏈恆定區包含3個結構域 CH1、CH2 和 CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(light chain variable region, 本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區(light chain constant region)。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。 VH 和VL 區可以進一步細分為高變異區域(regions of hypervariability)，稱為互補決定區(complementarity determining region, CDR)，兩側是更保守的區域，稱為框架區(framework region, FR)。每個VH和VL由3個CDR和4個FR組成，從胺基端(amino-terminus)到羧基端(carboxy-terminus)按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞（例如效應細胞(effector cell)）和經典補體系統(classical complement system)的第一組分(first component, Clq)。
如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc區」或「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區，即重鏈恆定區的CH2和CH3結構域。術語「Fc區」包括天然序列Fc區和變異Fc區(variant Fc region)，即經工程改造以表現出某些所需特性的 Fc 區，例如改變的 Fc 受體結合功能和/或減少或抑制的Fab臂交換。這種工程化 Fc 區的一個例子是結進孔 (knob-into-hole, KiH) 技術，參見例如 Ridgway 等人的文獻（Protein Eng. 9:617-21 (1996)）和 Spiess 等人的文獻（J Biol Chem. 288 (37):26583-93 (2013)）。天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3 和 IgG4。「Fc受體」或「FcR」描述了與抗體的Fc區結合的受體。特別地，FcR是天然序列人類FcR，其結合IgG抗體(γ受體)並且包括FcγRI、FcyRII和FcγRIII子類的受體，包括對偶基因變異體(allelic variant)和這些受體的可變剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)和FcγRI IB(「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，主要在其細胞質結構域中不同。活化受體 FcγRIIA 在其細胞質結構域中包含免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)。抑制受體 FcγRIIB在其細胞質結構域中包含免疫受體酪胺酸的抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM)，（參見M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234 (1997)）。FcR綜述 於 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9：457-92 (1991)；Capet 等人的文獻（Immunomethods 4：25-34 (1994)）；和 de Haas 等人的文獻（J. Lab. Clin. Med. 126：330-41 (1995)）。其他的 FcR，包括將來要鑑定的那些，都包含在本文中的術語「FcR」中。術語「Fc 受體」或「FcR」還包括新生兒受體 FcRn，它負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 和 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。 測量與 FcRn 結合的方法是已知的（參見，例如，Ghetie 和Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997)；Ghetie 等人，Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997)；Hinton 等人，J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004);WO 2004/92219 (Hinton等人)）。可於例如轉基因小鼠或轉染表達人類FcRn的人類細胞株、或賦予具有變異Fc區的多肽之靈長類中分析於體內與人類FcRn的結合及人類FcRn高度親和結合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072 (Presta)中描述抗體變異改善或減弱與FcRs的結合。亦見於例如Shields et al.,J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001)。
在特定實施例中，本發明的多特異性抗體中包含的免疫球蛋白Fc區選自IgG子類的Fc區，特別是IgG子類IgGl和IgG4的Fc區，特別是IgG4的Fc區。
在特定實施例中，本發明的多特異性抗體包含IgG區。
如本文所用，術語「IgG區」是指免疫球蛋白G的重鏈和輕鏈，即如上所定義的Fc區，和由VL、VH、CL和CH1結構域所組成的Fab區。術語「IgG區」包括天然序列IgG 區，例如人類IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4，以及顯示某些所需特性的工程化IgG區，例如上文定義的特性Fc區。如本文所用，術語「功能性IgG區」是指包含功能性Fc區的IgG區。
在特定實施例中，本發明的多特異性抗體包含IgG區，其中IgG區選自IgG子類IgGl和IgG4，特別是選自IgG4。
如本文所用，術語「結合域」、「其抗原結合片段」、抗體的「抗原結合部分」等是指完整抗體的一個或多個片段，其保留特異性結合於給定抗原(例如，IL4R、IL-31)的能力。抗體的抗原結合功能可以通過完整抗體的片段來執行。具體而言，在本發明的多特異性抗體的情況下，本文所用的術語「結合域」、「其抗原結合片段」、「抗原結合部分」等是指：Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結構域所組成的單價片段；F(ab) 2片段，即包含兩個在鉸鏈區(hinge region)通過雙硫鍵連接的Fab片段的二價片段；Fv片段:由抗體單臂的VL和VH結構域所組成；二硫化物穩定的Fv片段 (dsFv)；和單鏈Fv片段(scFV)。優選地，本發明抗體的結合域彼此獨立地選自Fab片段、Fv片段、dsFv片段和單鏈Fv片段(scFv)。在特定實施例中，本發明抗體的結合域彼此獨立地選自Fab片段和單鏈Fv片段(scFv)。在其他特定實施例中，scFv片段的VL和VH結構域通過結構域間的雙硫鍵來穩定，特別是所述VH結構域在位置51(AHo編號)包含單個半胱胺酸殘基並且所述VL結構域在位置141(AHo編號)包含單個半胱胺酸殘基。
術語「互補決定區」(“CDR”)是指胺基酸序列，其邊界使用許多眾所周知的方案中的任一種來確定，包括由Kabat等人描述的方案（ (1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 編號方案); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia” 編號方案); ImMunoGenTics (IMGT) numbering (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)) (“IMGT” 編號方案);及Honegger & Plückthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670中描述的編號方案 (“AHo” 編號)。例如，對於經典格式，在 Kabat 下，重鏈可變域 (VH) 中的 CDR胺基酸殘基編號為31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2) 和 95-102 (HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在 Chothia 下，VH 中的CDR胺基酸編號為26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2) 和 95-102 (HCDR3)； VL中的胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通過結合 Kabat 和 Chothia 的 CDR 定義，CDR由人類VH中的胺基酸殘基 26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2) 和 95-102 (HCDR3) 和人類 VL 中的胺基酸殘基 24-34 LCDR1)、50-56 (LCDR2) 和 89-97 (LCDR3)所 組成。在 IMGT 下，VH 中的 CDR 胺基酸殘基編號約為 26-35 (HCDR1)、51-57 (HCDR2) 和 93-102 (HCDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號約為 27-32 ( LCDR1)、50-52 (LCDR2) 和 89-97 (LCDR3)(根據“Kabat”編號)。在 IMGT 下，可以使用程序 IMGT/DomainGap Align 確定抗體的CDR。
在本發明的上下文中，使用 Honegger & Plückthun  建議的編號系統(“AHo”)（Honegger & Plückthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670），除非另有特別說明。具體而言，以下殘基根據 AHo 編號方案定義為 CDR： LCDR1（也稱為 CDR-L1）：L24-L42； LCDR2（也稱為CDR-L2）：L58-L72； LCDR3（也稱為CDR-L3）：L107-L138； HCDR1（也稱為CDR-H1）：H27-H42； HCDR2（也稱為CDR-H2）：H57-H76； HCDR3（也稱為 CDR-H3）：H108-H138。為了清楚起見，根據 Honegger 和 Plückthun 的編號系統考慮了在不同 VH 和 VL 亞家族中(特別是在 CDR 中)天然抗體中發現的長度多樣性，並提供序列中的間隙(gap)。因此，在給定的抗體可變結構域中，通常並非所有位置 1 至 149 都將被胺基酸殘基佔據。
如本文所用，術語「結合特異性」是指個體抗體與一種抗原決定位(antigenic determinant)而不是與不同抗原決定位反應的能力。如本文所用，術語「特異性結合」或「對…具特異性」是指可測量和可重複的相互作用，例如標靶和抗體之間的結合，其決定標靶在異質群體分子(包括生物分子)的存在下的存在。例如，與標靶(其可以是表位)特異性結合的抗體是比與其他標靶結合時具更高的親和力(affinity)、強結合性(avidity)、更容易和/或更長的持續時間結合該標靶的抗體。在其最一般的形式中（並且當沒有提及定義的參考時），「特異性結合」是指抗體區分感興趣的標靶和不相關分子的能力，例如根據本領域已知的方法的特異性測定來確定。此類方法包括但不限於西方墨點法(Western blot)、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、化學發光試劑(ECL)、免疫放射量測定(IRMA)、表面電漿共振（Surface plasmon resonance, SPR）測試和肽掃描(peptide scan)。例如，可以進行標準ELISA測定。可以通過標準顯色進行評分（例如，具辣根過氧化物(horseradish peroxide)的二抗和具過氧化氫的四甲基聯苯胺(tetramethyl benzidine)）。某些孔(well)中的反應由光密度評分，例如在 450 nm。典型的背景（= 陰性反應）可能約為 0.1 OD；典型的陽性反應可能約為1 OD。這意味著正分數和負分數之間的比率可以是 10 倍或更高。在另一個例子中，可以進行SPR測定，其中背景和信號之間的至少10倍(特別是至少100倍)的差異表示特異性結合。通常，結合特異性的測定不是通過使用單個參考分子，而是通過使用一組大約三到五個不相關的分子，例如奶粉、轉鐵蛋白(transferrin)或類似物來進行。
適當地，本發明的抗體是分離的抗體。如本文所用，術語「分離的抗體」是指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體（例如，特異性結合IL-4R和IL-31的分離的抗體實質上不含特異性結合IL-4R 和 IL-31 以外的抗原的抗體）。此外，分離的抗體可以實質上不含其他細胞物質和/或化學物質。
適當地，本發明的抗體是單株抗體(monoclonal antibody)。如本文所用，術語「單株抗體」是指具有基本上相同的胺基酸序列或源自相同遺傳來源的抗體。單株抗體顯示出對一特定表位的結合特異性和親和力，或對多個特定表位的結合特異性和親和力。
本發明的抗體包括但不限於嵌合抗體、人類抗體和人源化抗體。
如本文所用，術語「嵌合抗體」(或其抗原結合片段)是指抗體分子(或其抗原結合片段)，其中(a)恆定區或其部分是改變、替換或交換，以使抗原結合位點（可變區）與不同或改變的類別、效應物功能(effector function)和/或種類的恆定區相連； (b)可變區或其一部分被改變、替換或交換為具有不同或改變的抗原特異性的可變區。例如，可以通過用來自人類免疫球蛋白的恆定區替換其恆定區來修飾小鼠抗體。由於用人類恆定區替代，嵌合抗體可以保留其辨識抗原的特異性，同時與原始小鼠抗體相比在人類中具有降低的抗原性(antigenicity)。
如本文所用，術語「人源化」抗體（或其抗原結合片段）是指保留非人類抗體的反應性同時在人類中免疫原性較低(less immunogenic)的抗體（或其抗原結合片段）。例如，這可以通過保留非人類 CDR 區並用人類對應物（即恆定區以及可變區的框架部分）替換抗體的剩餘部分來實現。額外的框架區修飾可以在人類框架序列內以及在源自另一個哺乳動物物種的生殖系列(germline)的CDR序列內進行。本發明的人源化抗體可以包括不由人類序列編碼的胺基酸殘基（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變(mutagenesis)或通過體內體細胞突變引入的突變，或促進穩定性或製造的保守取代）。請參見，例如，Morrison等人的文獻(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984)；Morrison與 Oi的文獻(Adv. Immunol., 44:65-92, 1988)； Verhoeyen等人的文獻(Science, 239: 1534-1536, 1988)；Padlan的文獻(Molec. Immun., 28:489-498, 1991)；和 Padlan的文獻(Molec. Immun., 31: 169-217, 1994)。人類工程技術的其他例子包括但不限於美國專利第 5,766,886 號中揭示的 Xoma 技術。
如本文所用，術語「重組人源化抗體」包括通過重組方式製備、表達、產生或分離的所有人類抗體，例如從轉化以表達人源化抗體的宿主細胞中分離的抗體，例如，來自轉染瘤(transfectoma)，以及通過任何其他方式製備、表達、產生或分離的抗體，這些方式包括將人類免疫球蛋白基因的全部或部分序列剪接成其他DNA序列。
優選地，本發明的多特異性抗體是人源化的。更優選地，本發明的多特異性抗體是人源化的並且包含源自於兔子的CDR。
如本文所用，術語「多特異性抗體」是指結合至少兩個或更多個不同標靶(例如，IL-4R和IL-31)上的兩個或更多個不同表位的抗體。優選地，本發明的多特異性抗體是雙特異性的。如本文所用，術語「雙特異性抗體」是指結合兩個不同標靶(例如IL-4R和IL-31)上的至少兩個不同表位的抗體。
術語「表位」是指能夠特異性結合抗體的蛋白質決定位。表位通常由分子的化學活性表面群組分子(例如胺基酸或糖側鏈)所組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。「構形」表位和「線性」表位的區別在於，在變性溶劑的存在下會失去與前者的結合，但不會失去與後者的結合。
如本文所用，術語「構形表位(conformational epitope)」是指當多肽鏈折疊形成天然蛋白質時抗原的胺基酸殘基在表面上聚集在一起。
術語「線性表位(linear epitope)」是指一種表位，其中蛋白質和相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質的一級胺基酸序列線性發生(連續的)。
如本文所用，術語「辨識」是指發現其構形表位並與其相互作用(例如，結合)的抗體抗原結合片段。
如本文所用，術語「強結合性(avidity)」是指抗體-抗原複合物的整體穩定性或強度的訊息量測。它受三個主要因素控制：抗體表位親和力；抗原和抗體的化合價(valency)；以及相互作用部分的結構佈置。最終，這些因素定義抗體的特異性，即特定抗體與精確抗原表位結合的可能性。
適當地，本發明的多特異性抗體包含一種或兩種IL4R-BD。特別地，本發明的多特異性抗體包含兩個IL4R-BD。
術語「IL-4R」特別是指具有 UniProt ID 號 P24394 的人類 IL-4R。合適地，本發明的IL4R-BD靶向IL-4R，特別是人類IL- 4R。特別地，本發明的多特異性抗體包含一種或兩種靶向人類和食蟹猴(Cynomolgus, Macaca fascicularis)IL-4R的IL4R-BD。更特別地，本發明的多特異性抗體包含一種或兩種靶向人類、食蟹猴(Macaca fascicularis)和狨猿(Marmoset, Callithrix jacchus)IL-4R的IL4R-BD。
適當地，IL4R-BDs的特徵在於以下參數中的一個或多個： a. 如通過表面電漿共振(SPR)測量的，以0.1至200pM的單價解離常數(monovalent dissociation constant, K D)(特別是0.1至100pM，特別是0.1至50pM的K D)結合人類IL-4R，特別是其中所述IL4R-BD 採用 scFv 格式； b. 與食蟹猴IL4R 有交叉反應，如通過SPR測量的，特別是以單價 K D為 1 pM 至 5 nM(特別是 1 pM 至 3 nM，特別是 1 pM 至 2 nM)與食蟹猴 IL-4R 結合，特別是其中所述IL4R-BDs是scFv形式； c. 與狨猿IL4R 有交叉反應，如通過SPR測量的，特別是以單價 K D為 1 pM 至 5 nM(特別是 1 pM 至 3 nM，特別是 1 pM 至 2 nM)與狨猿 IL-4R 結合，特別是其中所述IL4R-BD是scFv形式； d. 如在HEK-藍細胞(HEK-Blue cell)中stat6報導基因測定(stat6 reporter gene assay)中所測量的，以IC 50為0.01至5 ng/ml(特別是 IC 50為 0.01 至 3 ng/ml，特別是 IC 50為0.01至1.5 ng/ml)中和人類 IL-4 誘導的訊息傳遞，其中所述IL4R-BD是scFv形式； e. 如在HEK-藍細胞中stat6 報導基因測定中所測量的，以IC 50為 0.01 至 10 ng/ml(特別是 IC 50為 0.01 至 5 ng/ml，特別是 IC 50為 0.01 至 2.5 ng/ml)中和人類 IL-13 誘導的訊息傳遞，其中所述IL4R-BD是scFv形式；和/或 f. 如在競爭ELISA(competition ELISA)中所測量的，以IC 50為0.01至10 ng/ml(特別是 IC 50為 0.01 至 5 ng/ml，特別是 IC 50為0.01至2 ng/ml)，抑制人類IL-4與人類IL-4R的結合，其中所述IL4R-BD是scFv形式。
如本文所用，術語「HEK-藍細胞」或「HEK-藍」是指可商業上獲得的人類胚胎腎細胞，其在由 NF-κB 轉錄因子誘導的啟動子的控制之下，被優化的分泌胚胎鹼性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP)報導基因轉染並穩定表達。釋放到培養基中的 SEAP 蛋白水平通常用作衡量NF-κB 活化的指標。
如本文所用，術語「親和力」是指抗體和抗原在單個抗原位點處相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」的可變區通過微弱的非共價力與多個位點的抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。
「結合親和力」通常是指分子(例如抗體)的單個結合位點與其結合夥伴(例如抗原或更具體地，抗原表位)。除非另有說明，如本文所用，「結合親和力」、「結合至」、「與…結合」或「結合於」是指反映結合對(例如，抗體片段和抗原)成員之間1:1相互作用的內在結合親和力。）。分子 X 對於其夥伴 Y 的親和力通常可以用解離常數 (K D) 表示。可通過本領域已知的常用方法測量親和力，包括本文所述的那些內容。低親和力抗體通常與抗原結合較慢且易於解離，而高親和力抗體通常與抗原結合較快且結合時間較長。測量結合親和力的多種方法在本領域中是已知的，其中任何一種都可以用於本發明。用於測量結合親和力的具體說明性和示例性實施例即如下所述的結合強度。
如本文所用，術語” K assoc”,“K a”或“K on”旨在指特定抗體-抗原相互作用的結合率(association rate)，而術語“K dis”,“K d”或“K off”，如本文所用，意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。在一個實施例中，如本文所用，術語“K D”旨在指解離常數，其由K d與K a的比率(即K d/K a)獲得並表示為莫耳濃度(M)。根據本發明的“K D”或「K D值」或“KD”或「KD值」在一個實施例中通過使用表面電漿共振測定法測量。
如段落[0243]和[0246](scFv)和[0403](多特異性分子)中所述，對重組人類IL-4R、重組食蟹猴IL-4R和重組狨猿IL-4R的親和力通過表面電漿共振(SPR)測量確定。如段落[0286](scFv)和[0409](多特異性分子)中所述，對重組人類IL-31、重組食蟹猴IL-31和重組狨猿IL-31的親和力通過表面電漿共振(SPR)測量確定。
適當地，本發明的多特異性抗體充當IL4R的拮抗劑。換言之，本發明的多特異性抗體的IL4R-BD是IL-4R訊號傳遞的抑製劑。如本文所用，術語「阻斷劑」或「抑製劑」或「拮抗劑」是指抑製或降低其結合的抗原的生物學活性的抗體或其結合域。本發明的多特異性抗體的 IL4R-BDs 與 IL-4R 結合，從而阻斷IL-4與IL4R的結合，尤其是 IL-4 和 IL-13 與 IL-4R 的結合，這導致IL-4R 功能降低。
適當地，本發明的多特異性抗體的 IL4R-BD的特徵進一步在於以下參數中的一個或多個： g.   當為scFv形式時，具有通過差異性掃描熒光法(differential scanning fluorimetry, DSF)測定的至少63°C(特別是至少65°C，特別是至少67°C，特別是至少69°C，特別是至少70°C，特別是至少71°C，特別是至少72°C)，特別是其中所述scFv在pH 6.4以150 mM 氯化鈉(NaCl)在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液(phosphate citrate buffer)中配製； h.   當為 scFv 形式時，單體含量的損失在 4°C下儲存4週後小於5%，當所述scFv的起始濃度為 10 mg/ml 時，特別是其中所述 scFv在pH 6.4以150 mM 氯化鈉(NaCl)在 50 mM 磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製；和/或 i.    當為 scFv 格式時，在 5 次凍融循環後，單體含量的損失小於5%，(例如小於4%、小於3%、優選小於2%)，當所述 scFv 的起始濃度為10 mg/ml 時，特別是其中所述 scFv 在 pH 6.4以150 mM氯化鈉(NaCl)在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製。
DSF 早先描述過（Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84 ; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）。 scFv 構建體(construct)熱解開(thermal unfolding)的過渡中點通過使用熒光染料SYPRO® Orange 的差異性掃描熒光法測定(參見 Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840）。在pH 6.4 的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中製備樣品，最終蛋白質濃度為 50 µg/ml，並包含總體積 100 µl中的5x SYPRO® Orange的最終濃度。將 25 微升製備好的樣品以三重複添加到白壁AB基因PCR盤(white-walled AB gene PCR plate)中。該測定在用作熱循環儀的 qPCR 機器中進行，並使用軟體的自定義染料校準程序檢測熒光發射。包含測試樣品的 PCR 盤以 1°C 的升溫及每次升溫後暫停 30 秒的程序從 25°C 升溫至 96°C。總測定時間約為 2 小時。由軟體GraphPad Prism使用數學二次微分法(mathematical second derivative method)計算曲線的拐點(inflection point)來計算Tm。報告的 Tm 是三個測量值的平均值。
單體含量的損失由SE-HPLC色譜圖的曲線下面積計算確定。SE-HPLC是一種基於固體固定相和液體流動相的分離技術，如美國藥典(US Pharmacopeia, USP) 第621章所述。該方法利用疏水固定相和水性流動相根據分子的大小和形狀分離分子。分子的分離發生在特定管柱的空隙體積(void volume, V 0) 和總滲透體積(total permeation volume, V T) 之間。 SE-HPLC的測量在配備自動樣品注入和設置為280nm檢測波長的UV檢測器的Chromaster HPLC系統（日立先端科技股份有限公司(Hitachi High-Technologies Corporation)）上進行。該設備由軟體 EZChrom Elite（安捷倫科技(Agilent Technologies)，版本 3.3.2 SP2）控制，該軟體還支持分析結果色譜圖。蛋白質樣品通過離心清除並在注射前在自動進樣器中保持在 4-6°C 的溫度下。對於 scFv 樣品的分析，使用 Shodex KW403-4F 色譜柱(Showa Denko Inc.，#F6989202)和標準緩衝鹽水流動相(50 mM 磷酸鈉，pH 6.5，300 mM 氯化鈉），推薦流速為0.35 毫升/分鐘。每次注射的目標上樣量為 5 µg。樣品由波長為 280 nm的UV檢測器檢測，數據由合適的軟體套件記錄。得到的色譜圖在V0到VT的範圍內進行分析，從而排除了洗脫時間(elution time)大於10 分鐘的基質相關峰。
適當地，本發明的多特異性抗體的IL4R-BD是本揭露內容中提供的結合域。本發明多特異性抗體的IL4R-BDs包括但不限於列於表1的人源化IL4R-BD序列。
適當地，本發明的多特異性抗體包含一種或兩種IL31-BD。特別地，本發明的多特異性抗體包含兩個IL31-BD。
術語“IL-31”或“IL31”特別是指具有 UniProt ID 號 Q6EBC2 的人類 IL-31。合適地，本發明的多特異性抗體的IL31-BD靶向IL-31(特別是人類IL31)，如UniProt ID號Q6EBC2所示。特別地，本發明的多特異性抗體包含靶向人類和食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-31的一種或兩種IL31 BD。
適宜地，用於本發明的 IL31-BD的特徵在於以下參數中的一個或多個： a.   如通過表面電漿共振測量的，以 5 nM 或更小的單價解離常數 (K D) 結合人類 IL-31(特別是單價 K D為 5 pM 至 5 nM，特別是 5 pM 至 2 nM，特別是 5 至 1000 pM)，特別是其中所述IL31-BD在scFv中； b.   如通過表面電漿共振測量的，與食蟹猴 (Cynomolgus) IL-31 有交叉反應，特別是以單價 K D為5 nM或更小(特別是單價 K D為 5 pM 至 5 nM，特別是5 pM 至 2 nM，特別是 5 至 1000 pM)與食蟹猴 IL-31 結合，特別是其中所述IL31-BDs在scFv 中； c.   如在Path Hunter中IL-31RA/OSMRb二聚化測定所測量的，以IC 50為 0.1 至 30 ng/ml(特別是 IC 50為0.1 至 20 ng/ml，特別是 IC 50為 0.1 至 10 ng/ml)抑制人類 IL-31 誘導的訊息傳遞，其中所述IL31-BD是scFv形式；和/或 d.   如在競爭ELISA中所測量的，以IC 50為0.1 至 20 ng/ml(特別是 IC 50為 0.1 至 10 ng/ml，特別是 IC 50為 0.1 至 6 ng/ml)阻斷人類IL-31與人類IL-31R的結合，其中所述IL31-BD是scFv形式。
適當地，本發明的多特異性抗體的IL31-BD的特徵進一步在於以下參數中的一個或多個： e.   當為scFv形式時，具有通過差異性掃描熒光法測定的至少65°C(優選至少67°C、更優選至少69°C的熔化溫度(Tm)，特別是其中所述scFv在pH 6.4以150 mM 氯化鈉在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； f.    當為 scFv 形式時，單體含量在 4°C 下儲存 4 週後損失小於 5%(例如小於 4%、小於 3%、小於 2%、優選小於 1%)，當所述 scFv 的起始濃度為 10 mg/ml 時，特別是其中所述 scFv 在pH 6.4以150 mM 氯化鈉在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； g.   當為 scFv 形式時，單體含量在40°C 儲存4週後損失小於5%(例如小於 4%、小於 3%、小於 2%、優選小於 1%)，當所述 scFv 的起始濃度為 10 mg/ml 時，特別是其中所述 scFv 在 pH 6.4以150 mM 氯化鈉在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製； h.   當為scFv形式時，單體含量在3次凍融循環後損失小於5%(例如小於4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，當所述 scFv 的起始濃度為 10 mg/ml時，特別是其中所述 scFv在 pH 6.4以150 mM 氯化鈉在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製；和/或 i.    當為 scFv 形式時，在4°C或40°C下儲存4週後，蛋白質含量損失小於 5%(例如小於4%、小於3%、小於2%、優選小於1%)，當所述 scFv 的起始濃度為10 mg/ml時，特別是其中所述 scFv 在 pH 6.4以150 mM 氯化鈉在50 mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中配製。
適當地，本發明的多特異性抗體的IL31-BD是本揭露內容中提供的結合域。本發明多特異性抗體的IL31-BDs包括但不限於序列列於表2的人源化IL31-BD。
術語「多價抗體」是指具有多於一個化合價(valency)的單一結合分子，其中「化合價」被描述為與標靶分子上的表位結合的抗原結合部分(antigen-binding moiety)的數量。因此，由於存在多於一個拷貝的相應抗原結合部分，單個結合分子可以結合一標靶分子上的多於一個結合位點和/或多於一個靶分子。多價抗體的範例包括但不限於二價抗體、三價抗體、四價抗體、五價抗體、六價抗體和類似物。
如本文所用，術語「單價抗體」是指結合單個標靶分子的抗體，更具體地是結合標靶分子上的單個表位的抗體。此外，如本文所用，術語「結合域」或「單價結合域」是指與標靶分子上的單個表位結合的結合域。
在特定實施例，本發明的多特異性抗體包含一IL4R-BD和一IL-31-BD，即本發明的多特異性抗體對於IL-4R和IL-31特異性都是單價的。
在進一步的具體實施例中，本發明的多特異性抗體包含一IL4R-BD和2個IL-31-BD，即本發明的多特異性抗體對於IL-4R特異性是單價的，對於IL-31特異性是二價的。
在進一步的具體實施例中，本發明的多特異性抗體包含2個IL4R-BD和一IL-31-BD，即本發明的多特異性抗體對於IL-4R特異性是二價的，對於IL-31特異性是單價的。
在優選的實施例中，本發明的多特異性抗體包含2個IL4R-BD和2個IL-31-BD，即本發明的多特異性抗體對於IL-4R特異性是二價的，對於IL-31特異性是二價的。
在本發明的多特異性抗體包含2個IL4R-BD的情況下，所述2個IL4R-BD結合IL-4R標靶分子上的相同表位或不同表位。優選地，2個IL4R-BD結合IL-4R標靶分子上的相同表位。適當地，本發明的多特異性抗體包含2個相同的IL4R-BD。
在本發明的多特異性抗體包含2個IL31-BD的情況下，所述2個IL31-BD結合IL-31標靶分子上的相同表位或不同表位。優選地，2個IL31-BD結合IL-31標靶分子上的相同表位。適當地，本發明的多特異性抗體包含2個相同的IL31-BD。
如本文所用，術語「相同表位」是指能夠特異性結合於大於一個抗體的蛋白質上個別的蛋白質決定位，其中該個別的蛋白質決定位是相同的，即由相同的化學活性表面基團的分子(例如胺基酸或糖側鏈)所組成，具有相同的三維結構特徵，以及每種所述抗體的相同電荷特徵。如本文所用的與特定蛋白質標靶有關的術語「不同表位」是指蛋白質上個別的蛋白質決定位，每個都能夠特異性結合不同的抗體，其中這些個別的蛋白質決定位對於不同的抗體是不相同的，即由不同的化學活性表面基團的分子(例如胺基酸或糖側鏈)所組成，具有不同的三維結構特徵，以及不同的電荷特徵。這些不同的表位可以重疊或不重疊。
在特定實施例中，本發明的多特異性抗體是雙特異性和二價的。
在進一步的具體實施例中，本發明的多特異性抗體是雙特異性和三價的。
優選地，本發明的多特異性抗體是雙特異性和四價的，即IL-4R特異性為二價，IL-31特異性為二價。
在一特定方面，本發明有關於一種多特異性抗體，多特異性抗體包括： a) 特異性結合 IL-4R的2個結合域(IL4R-BD)，和 b) 特異性結合 IL-31的2個結合域(IL31-BD)， 其中 -所述多特異性抗體包括IgG區域； -每個所述IL4R-BD包括 SEQ ID NO: 1的HCDR1序列， SEQ ID NO: 2的HCDR2序列， SEQ ID NO: 3的HCDR3序列， SEQ ID NO: 7 的LCDR1序列， SEQ ID NO: 8 的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 9 的LCDR3序列；以及 -每個所述IL31-BD包括 SEQ ID NO: 12 的HCDR1序列， SEQ ID NO: 13的HCDR2序列， SEQ ID NO: 14 的HCDR3序列， SEQ ID NO: 17或18的LCDR1序列， SEQ ID NO: 19的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 20的LCDR3序列。
本發明中使用的其他可變結構域包括已經突變的胺基酸序列，但在CDR區中與表1和2中描述的序列中的所述CDR區具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性(identity)。 本發明使用的其他可變結構域包括突變胺基酸序列，其中當與表1和表2中描述的序列中所述的CDR區域進行比較時，在CDR區中已突變的胺基酸不超過1、2、3、4或5個。
適當地，本發明的多特異性抗體的結合域的VH結構域屬於VH3或VH4家族。在一實施例中，本發明中使用的結合域包括屬於VH3家族的VH結構域。在本發明的上下文中，術語「屬於VHx家族(或VLx家族)」是指框架序列FR1至FR3與所述VHx家族(或分別為VLx家族)顯示出最高程度的同源性(homology)。VH 和 VL 家族的範例可參Knappik等人的文獻(J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86)，或 WO 2019/057787 。屬於VH3家族的VH結構域的具體範例由SEQ ID NO: 23表示，屬於VH4家族的VH結構域的具體範例由SEQ ID NO: 24表示。具體而言，取自SEQ ID NO：23的框架區FR1至FR3屬於VH3家族(表3，非粗體標記的區域)。合適地，如本文所用，屬於 VH3 家族的 VH 是包括 FR1 至 FR3 的 VH（與 SEQ ID NO: 23的FR1 至 FR3具有至少85%(特別是至少90%，更特別是至少95%)的序列同一性）。VH3 和 VH4 序列的替代範例，以及其他 VHx 序列的範例，可以在 Knappik 等人的文獻（J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86）或在 WO 2019/057787 中發現。
適當地，本發明中使用的結合域的 VL 結構域包括：Vκ 框架 FR1、FR2和FR3以及框架FR4，Vκ 框架 FR1、FR2和FR3特別是Vκ1 或Vκ3框架，特別是Vκ1框架 FR1 至 FR3，框架FR4選自Vκ FR4。在所述結合域是scFv形式的情況下，所述結合域包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3以及框架FR4，Vκ框架FR1、FR2和FR3特別是Vκ1或Vκ3框架，特別是Vκ1框架FR1至FR3，框架FR4選自Vκ FR4和Vλ FR4，特別是 Vλ FR4。
合適的 Vκ1 框架 FR1 至 FR3 以及示例性 Vλ FR4 列於 SEQ ID NO: 25 (表 3，FR 區以非粗體標記)。 Vκ1 序列的替代示例，以及 Vκ2、Vκ3 或 Vκ4 序列的示例，可以在 Knappik 等人的文獻（J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86）中發現。合適的 Vκ1 框架 FR1 至 FR3 包含與對應於 FR1 至 FR3 的胺基酸序列具有至少 70%、80%、90% 同一性並取自 SEQ ID NO: 25 的胺基酸序列(表 3，FR 區以非粗體標記)。合適的 Vλ FR4 列舉於 SEQ ID NO: 26 至 SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 33 中，包含單個半胱胺酸殘基(cysteine residue)，特別是在相應的 VH 鏈中存在第2個單個半胱胺酸的情況下，特別是在 VH 的第 51 位(AHo 編號)中，用於形成域間二硫鍵。在一實施例中，本發明的多特異性抗體的結合域的VL結構域，當為scFv形式時，包含Vλ FR4，Vλ FR4包含與選自於SEQ ID NO: 26 至 SEQ ID NO: 33(特別是 SEQ ID NO: 26 或 33)的胺基酸序列具有至少70%、80%、90%同一性的胺基酸序列。
本發明的多特異性抗體的結合域包括表1和2中列出的VH結構域。合適地，本發明使用的結合域包括表1和2之一中列出的VH胺基酸序列，其中在框架序列(即，不是CDR序列的序列)中不超過20個胺基酸已被突變(其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、取代或刪除)。適當地，本發明的多特異性抗體的結合域包括表1和2之一中列出的VH胺基酸序列，其中在框架序列(即，不是CDR序列的序列)中不超過15個胺基酸(特別是不超過10個胺基酸，特別是不超過5個胺基酸)已經突變(其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、替換或刪除)。本發明中使用的其他結合域包括已突變的胺基酸，但在 VH 區與在表1和2之一中描述的相應序列中描述的VH區（包括包含表1和2中所示序列之一的至少位置5至140(AHo編號)(特別是至少位置3至145)的VH結構域）具有至少80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或 99%的同一性。
特別地，本發明的多特異性抗體的結合域包含表1和2之一中列出的VL結構域。適當地，本發明的多特異性抗體的結合域包含表1和2中列出的VL胺基酸序列表1和2中的一個，其中框架序列(即不是 CDR 序列的序列)中不超過約20個胺基酸已被突變(其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、取代或刪除)。適當地，本發明的多特異性抗體的結合結構域包含表1和2之一中列出的VL胺基酸序列，其中在構架序列(即，不是CDR序列的序列)中不超過約15個胺基酸(特別是不超過10個胺基酸，特別是不超過5個胺基酸)已經突變(其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、取代或刪除)。本發明中使用的其他結合域包括已突變的胺基酸，但在VL區與表1和表2中描述的序列中所述的VL區（包括包含表 1 和表 2 中所示序列之一的至少位置 5至140(AHo 編號)(特別是至少位置 3 至 145)的 VL 結構域）具有至少80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或 99%的同一性。
在本發明的上下文中，術語「用於本發明的結合域」是有關於結合域本身，即獨立於多特異性的上下文，並且特別地，是有關於包含在多特異性構建體(construct)(例如包含在雙特異性、三特異性或四特異性構建體中的結合域的其中之一)。
適當地，本發明的多特異性抗體的結合域選自：Fab、Fv、dsFv和scFv。
適當地，本發明的多特異性抗體的結合域是可操作地連接的。本發明的多特異性抗體的結合結構域能夠同時結合它們各自的抗原或受體。在此連接中使用的術語「同時」是指IL4R-BD中的至少其一和IL31-BD中的至少其一同時結合。
本發明的多特異性抗體包含一個或兩個IL4R-BD和一個或兩個IL31-BD，其中所述一個或兩個IL4R-BD和所述一個或兩個IL31-BD可操作地相互連接。
如本文所用，術語「可操作地連接」表示兩個分子(例如，多肽、結構域、結合域)以每個分子保留功能活性的方式連接。無論它們是直接連接還是間接連接（例如，通過連接子(linker)、通過部分(moiety)、通過連接子與部分連接），兩個分子可以「可操作地連接」。術語「連接子」是指任選地位於本發明中使用的結合域或抗體片段之間的肽或其他部分。一些策略可用於將分子共價連接在一起。這些包括但不限於蛋白質或蛋白質結構域的N-和C-末端之間的多肽鍵、通過二硫鍵的連接和通過化學交聯劑的連接。在此實施例的一方面中，連接子是通過重組技術或肽合成產生的肽鍵。為連接兩條多肽鏈的特定情況選擇合適的連接子取決於各種參數，包括但不限於兩條多肽鏈的性質（例如，它們是否自然寡聚(naturally oligomerize)）、N-端和C-端之間的距離(如果已知)、和/或連接子對蛋白水解和氧化的穩定性。此外，連接子可以包含提供彈性的胺基酸殘基。
在本發明的上下文中，術語「多肽連接子」是指由通過肽鍵連接的胺基酸殘基鏈所組成的連接子，所述肽鍵連接兩個結構域，每個結構域連接至連接子的一端。多肽連接子的長度應足以以彼此之間呈現正確的構形的方式連接兩個分子，從而保持所需的活性。在特定實施例中，多肽連接子具有 2 至 30 個胺基酸殘基（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸殘基）。此外，選擇用於包含在多肽連接子中的胺基酸殘基應該表現出不會顯著干擾多肽活性的特性。因此，肽連接子總體上不應顯示出與多肽活性不一致的電荷，或乾擾內部折疊，或與一個或多個單體中的胺基酸殘基形成鍵或其他相互作用，這將嚴重阻斷受體單體結構域的結合。在特定實施例中，多肽連接子是非結構化多肽。有用的連接子包括甘胺酸-絲胺酸連接子(glycine-serine linker 或GS連接子)。 “Gly-Ser”或“GS”連接子是指甘胺酸和絲胺酸串聯的聚合物（包括，例如，(Gly-Ser)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n 和 (GGGS)n，其中 n是至少一的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物(glycine-alanine polymer)、丙胺酸-絲胺酸聚合物(alanine-serine polymer)和其他柔性連接子(flexible linker)，例如用於沙克爾鉀通道(shaker potassium channel)的系鏈(tether)，以及大量其他柔性連接子，如本領域技術人員所理解的。由於包含這些胺基酸的寡肽是相對非結構化的，甘胺酸-絲胺酸聚合物是優選的，因此可能能夠充當組分之間的中性系鏈。其次，絲胺酸是親水的，因此能夠溶解可能是球狀甘胺酸鏈的物質。第三，類似的鏈已被證明可有效連接重組蛋白的亞單位(subunit)，例如單鏈抗體。
在一組實施例中，本發明的多特異性抗體是選自(scFv)2-Fc-(scFv)2融合(ADAPTIR)、DVD-Ig、DART TM和 TRIDENT TM的形式。術語“DART TM”是指由MacroGenics開發的抗體形式，其包含免疫球蛋白 Fc 區多肽和融合於Fc區的一重鏈的 N 端或融合於Fc區的多個重鏈的兩個 N 端的一個或兩個雙特異性Fv結合域。術語“TRIDENT TM”是指由MacroGenics 開發的抗體形式，其包含一免疫球蛋白 Fc 區多肽、一雙特異性 Fv 結合域和一Fab片段。雙特異性 Fv 結合域和 Fab 片段都融合於Fc區多肽的兩條重鏈的各自N 端。
在另一組實施方案中，本發明的多特異性抗體的形式選自二價雙特異性IgG形式、三價雙特異性IgG形式和四價雙特異性IgG形式。具體地，所述多特異性抗體的形式選自基於KiH的IgG（例如DuoBodies(通過Duobody技術製備的雙特異性IgG)）（MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212.doi:10.1080/ 19420862.2016.1268307）、 DVD-Ig; IgG-scFv 融合體（例如 CODV-IgG、Morrison(IgG CH 3-scFv 融合體 (Morrison-H) 或 IgG CL-scFv 融合體 (Morrison-L))）、bsAb(與輕鏈 C 端連接的 scFv)、Bs1Ab (與輕鏈 N 端連接的scFv)、Bs2Ab (與重鏈 N 端連接的scFv)、Bs3Ab (與重鏈 C 端連接的scFv)、Ts1Ab (與重鏈和輕鏈兩者的N 端連接讀scFv)和 Ts2Ab(與重鏈 C 端連接的 dsscFv)。更具體地，所述多特異性抗體的形式選自基於 KiH 的 IgG(例如 DuoBodies)、 DVD-Ig、CODV-IgG和Morrison（IgG CH3-scFv 融合體(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合體(Morrison-L)），甚至更特別地來自 DVD-Ig 和 Morrison （IgG CH3-scFv 融合體(Morrison-H)或IgG CL-scFv融合體(Morrison-L)）。
在本發明的特定實施例中，所述多特異性抗體的形式選自Morrison形式，即Morrison-L和Morrison-H 形式。本發明中使用的Morrison-L和Morrison-H形式是帶有IgG Fc區(特別是IgG4 Fc區)的四價和雙特異性分子形式。兩個高度穩定的scFv結合域，其中輕鏈包含Vκ　FR1至FR3與Vλ FR4 (λ-cap)，本文也稱為 λ-cap scFv，通過連接子L1融合於重鏈(Morrison-H)或輕鏈(Morrison-L)的C端(請參照第2圖)。
連接子L1是2~30個胺基酸(更特別是5~25個胺基酸，最特別是10~20個胺基酸)的肽。在特定實施例中，所述連接子L1包含4個(4)甘胺酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基的一或多個單元 (GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5，特別是n=2。
在本發明的一特定實施例中，多特異性抗體具有如上定義的Morrison-L形式。在本發明的另一具體實施例中，多特異性抗體具有如上定義的Morrison-H形式。
本發明的多特異性抗體的scFv結構域包含通過連接子L2連接的可變重鏈結構域(variable heavy chain domain, VH)和可變輕鏈結構域(variable light chain domain, VL)。
連接子L2是10~40個胺基酸(更特別是15~30個胺基酸，最特別是20~25個胺基酸)的肽。在特定實施例中，所述連接子L2包含4個(4)甘胺酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基的一或多個單元 (GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6， 7或8，特別是n=4。
本發明的多特異性抗體的具體但非限制性範例是Morrison-L抗體PRO2206、PRO2207、PRO2208和Morrison-H抗體PRO2198、PRO2199、PRO2200、PRO2201，其序列列於表4中。
本發明的多特異性抗體可以使用本領域已知的任何方便的抗體製造方法來產生（參見，例如，Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14，關於雙特異性構建體的生產(with regard to the production of bispecific constructs)；Hornig, N. & Färber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727 和 WO 99/57150 關於雙特異性雙抗體和串聯 scFv(with regard to bispecific diabodies and tandem scFvs)）。用於製備雙特異性構建體的合適方法的具體實例還包括，除其他外，Genmab（參見 Labrijn 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150）和 Merus（參見 de Kruif等人，Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750) 技術。用於產生包含功能性抗體 Fc 部分的雙特異性抗體的方法也是本領域已知的（參見，例如，Zhu 等人，Cancer Lett. 86 (1994) 127-134)；和 Suresh 等人，Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228）。
這些方法通常涉及單株抗體的產生，例如通過將骨髓瘤細胞(myeloma)與來自已使用融合瘤技術用所需抗原免疫的小鼠的脾細胞融合(參見，例如，Yokoyama等人， Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006)或通過重組抗體工程（全套選殖(repertoire cloning)或噬菌體顯示(phage display)/酵母顯示(yeast display)）（參見，例如，Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1- 8)，以及使用已知的分子選殖技術組合2種或大於2種不同單株抗體的抗原結合域或其片段或部分以產生雙特異性或多特異性構建體。
本發明的多特異性抗體可以通過使用本領域已知的方法接合(conjugate)組分結合特異性來製備。例如，雙特異性分子的每種結合特異性可以單獨產生，然後彼此接合。當結合特異性是蛋白質或肽時，多種偶聯劑或交聯劑可用於共價接合。交聯劑的實例包括蛋白 A、碳二亞胺(carbodiimide)、N-琥珀醯亞胺基-5-乙醯硫代乙酸酯 (N-succinimidyl-5-acetyl-thioacetate, SATA)、5,5'-二硫代雙 (2 硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis (2 nitrobenzoic acid), DTNB）、鄰苯二馬來醯亞胺 (o-phenylenedimaleimide, oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP）和琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯（sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohex-1-carboxylate, sulfo-SMCC）(參見例如，Karpovsky 等人，1984 J. Exp. Med. 160: 1686；Liu, M A 等人，1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括描述於下列文獻的方法：Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan 等人, 1985 Science 229:81-83, 和 Glennie等人, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375。接合劑是 SATA 和sulfo-SMCC，兩者都可從 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) 獲得。
當結合特異性是抗體時，它們可以通過兩條重鏈的C端鉸鏈區的硫氫基鍵合來接合。在一個具體實施例中，鉸鏈區在接合之前被修飾以包含奇數個硫氫基殘基，例如一個。
或者，2個或大於2個結合特異性可以在相同的載體中編碼並在相同的宿主細胞中表達和組裝。當雙特異性分子是 mAb x Fab、mAb x scFv、mAb x dsFv或mAb x Fv 融合蛋白時，此方法特別有用。製備多特異性抗體和分子的方法描述於例如US 5,260,203；US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; 和US 5,482,858。
多特異性抗體與其特異性靶標的結合可以通過例如酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定(REA)、FACS分析、生物測定(例如生長抑制)或西方墨點法測定來確認。這些測定中的每一種通常通過使用對感興趣的複合物特異的標記試劑(例如抗體)來檢測特別感興趣的蛋白質-抗體複合物的存在。
在另一方面，本發明提供了編碼本發明多特異性抗體的一核酸或2個核酸。此類核酸可針對在哺乳動物細胞中的表達進行優化。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，是指單股或雙股形式的一或多個去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。此術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵結(linkage)的核酸，它們是合成的、天然存在的和非天然存在的，與參考核酸相比具有相似的結合特性，並且以相似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯(phosphorothioate)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、甲基膦酸酯(methyl phosphonate)、手性-甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphorate)、2-O-甲基核糖核苷酸（2-O-methyl ribonucleotide）、肽-核酸（peptide-nucleic acid, PNA）。除非另有說明，特定的核酸序列也隱含地包括其保守修飾的變體（例如，簡併密碼子(degenerate codon)取代）和互補序列，以及明確指出的序列。具體而言，如下文詳述，簡併密碼子取代可通過產生序列來實現，其中一個或多個選定的（或所有）密碼子的第3個位置被混合鹼基和/或次黃嘌呤核苷殘基（deoxyinosine residue）取代（Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081，1991；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608，1985；和Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
本發明提供了基本上純化的核酸分子，其編碼包含上述多特異性抗體的區段或結構域的多肽。當從合適的表達載體表達時，由這些核酸分子編碼的多肽能夠表現出本發明的多特異性抗體的抗原結合能力。
多核苷酸序列可以通過從生（de novo）固相DNA合成或通過PCR誘變編碼本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的現有序列（例如，如下列實施例中描述的序列）產生多核酸序列。直接化學合成核酸可以通過本領域已知的方法完成，例如Narang等人（1979, Meth. Enzymol. 68:90）的磷酸三酯方法（phosphotriester method）、Brown等人（Meth. Enzymol. 68:109, 1979）的磷酸二酯方法、Beaucage 等人（Tetra. Lett., 22:1859, 1981）的二乙基亞磷醯胺方法（diethylphosphoramidite method）、和美國專利第4,458,066號的固體支持方法（solid support method）。通過聚合酶連鎖反應（PCR）將突變引入多核苷酸序列可以如下列文獻所述進行操作，例如，H. A. Erlich編輯的聚合酶連鎖反應技術：DNA放大擴增的原理和應用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification）（H. A. Erlich(Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992）、Innis等人編輯的聚合酶連鎖反應操作手冊：方法和應用指南（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）（Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990）、Mattila等人的文獻（Nucleic Acids Res. 19:967, 1991）、和Eckert等人的聚合酶連鎖反應的方法及應用（PCR Methods and Applications 1:17, 1991）。
本發明還提供用於產生本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的表達載體和宿主細胞。
術語「載體（vector）」旨在指能夠運輸與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是「質體（plasmid）」，它指的是環狀雙股DNA環，環中可以連接額外的DNA片段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體(episomal mammalian vector)）。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。
此外，某些載體能夠指導與它們有效連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為「重組表達載體」（或簡稱為「表達載體」）。一般而言，可用於重組DNA技術的表達載體通常是質體形式。在本說明書中，因為質體是最常用的載體形式，「質體」和「載體」可以互換使用。然而，本發明旨在包括這些其他形式的表達載體，例如病毒載體（例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒），它們具有同等功能。在特定上下文中，術語「可操作地連接」是指2個或多個多核苷酸（例如，DNA）區段之間的功能關係。典型上，它是指轉錄調控序列（transcriptional regulatory sequence）與轉錄序列（transcribed sequence）的功能關係。例如，如果啟動子或增強子序列在合適的宿主細胞或其他表達系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則啟動子或增強子序列與編碼序列可操作地連接。通常，與轉錄序列有效連接的啟動子轉錄調控序列與轉錄序列物理上連續，即，它們是順式作用的（cis-acting）。然而，一些轉錄調控序列（例如增強子）不需要物理上連續或位於它們增強轉錄的編碼序列附近。
可以使用各種表達載體來表達編碼多特異性抗體鏈或結合片段的多核苷酸。基於病毒的和非病毒的表達載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包括質體、附加型載體（通常具有用於表達蛋白質或RNA的表達匣(expression cassette)）和人類人工染色體（請參見，例如Harrington等人，Nat Genet. 15:345, 1997）。例如，用於在哺乳動物（例如人類）細胞中表達編碼多特異性抗體鏈的多核苷酸的非病毒載體包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B 和 C，（Invitrogen, San Diego, Calif.)、MPS V載體和本領域已知的用於表達其他蛋白質的許多其他載體。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體、基於SV40的載體、乳突狀瘤病毒（papilloma virus）、HBP艾司坦-巴爾病毒（HBP　Epstein Barr virus）、牛痘病毒載體（vaccinia virus vector）和森林病毒（Semliki Forest　virus, SFV）。請參見下列文獻，Brent等人的文獻（同上）、史密斯的文獻（Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995）和Rosenfeld等人的文獻（Cell 68:143, 1992）。
表達載體的選擇取決於要在其中表達載體的預期宿主細胞。通常，表達載體包含與編碼多特異性抗體鏈或片段的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列（例如增強子）。在一實施例中，使用誘導型啟動子來阻止插入序列的表達，但在誘導條件下除外。誘導型啟動子包括（例如）阿拉伯糖、乳糖操縱子（lacZ）、金屬硫蛋白啟動子（metallothionein promoter）或熱休克啟動子（heat shock promoter）。轉型生物體（transformed organism）的培養可以在非誘導條件下擴增，而不會偏向於編碼序列的群體，其表達產物更容易被宿主細胞耐受。除了啟動子之外，多特異性抗體鏈或片段的有效表達也可能需要或想要其他調控元件。這些元件通常包括ATG起始密碼子和相鄰的核醣體結合位點或其他序列。此外，表達效率可以通過包含適合所用細胞系統的增強子來增強（參見，例如，Scharf等人，Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；和Bittner等人，Meth. Enzymol., 153:516, 1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可用於增加哺乳動物宿主細胞中的表達。
要使用的載體通常編碼多特異性抗體輕鏈和重鏈，包括恆定區或其部分。 此類載體允許可變區作為與恆定區的融合蛋白表達，從而導致產生完整抗體及其抗原結合片段。通常，這種恆定區是人類的。
術語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）是指已引入重組表達載體的細胞。應當理解，這些術語不僅是指特定的受試細胞，而且是指這種細胞的後代。由於某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，因此此類後代實際上可能與母細胞不同，但仍包括在本文所用術語「宿主細胞」的範圍內。
用於攜帶和表達本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的宿主細胞可以是原核的或真核的。大腸桿菌是一種可用於選殖和表達本發明多核苷酸的原核宿主。適用的其他微生物宿主包括桿菌（例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)）和其他腸桿菌科（enterobacteriaceae）（例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)），和各種假單胞菌屬（Pseudomonas）的物種。在這些原核宿主中，還可以製作表達載體，其通常包含與宿主細胞相容的表達控制序列（例如，複製起點）。此外，將存在任意數量的多種眾所周知的啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自λ噬菌體的啟動子系統。啟動子通常控製表達，任選地帶有操縱子序列，並具有核醣體結合位點序列等，用於啟動和完成轉錄和轉譯。其他微生物（例如酵母）也可用於表達本發明的多特異性抗體。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。
在一個實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表達和產生本發明的多特異性抗體。例如，它們可以是表達內源免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或帶有外源表達載體的哺乳動物細胞系。這些包括任何正常會死的或正常或異常的永生動物或人類細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉型的B細胞和融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物表達多肽的用途一般討論於例如是Winnacker的文獻中（FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987）。哺乳動物宿主細胞的表達載體可以包括表達控制序列（例如複製起點、啟動子和增強子）（請參見，例如，Queen等人，Immunol. Rev. 89:49-68, 1986)，以及必要的處理訊息位點（例如核醣體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止子序列）。這些表達載體通常含有來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調整的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子（dexamethasone-inducible MMTV promoter）、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPS V啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（例如人類立即早期CMV啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。
用於引入包含感興趣的多核苷酸序列的表達載體的方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主（一般參見Green, M. R., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）。其他方法包括，例如，電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體媒介的轉型、注射和顯微注射、生物彈衝擊法(ballistic method)、病毒顆粒、免疫脂質體、聚陽離子核酸共軛物、裸DNA、人造病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合（Elliot及O'Hare,Cell 88:223, 199788:223,1997）、DNA之藥劑增強吸收及體外轉導。對於長期高產量產生重組蛋白而言，通常需要穩定表現。舉例而言，可以使用本發明的表達載體（包含病毒複製起點或內源性表達元件和選擇標記基因）製備穩定表達本發明的多特異性抗體的細胞系。引入載體之後，可使細胞於富營養培養基中生長1~2天，隨後將其轉至選擇性培養基。可選擇標記之目的為賦予針對選擇之抗性且其存在允許成功表現所引入序列的細胞在選擇性培養基中生長。穩定轉染之抗性細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。本發明因此提供了產生本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，其中所述方法包括培養包含編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的核酸或載體的宿主細胞的步驟，由此表達本揭露的所述抗體或其片段。
在一方面，本發明涉及一種產生本發明的多特異性抗體的方法，該方法包括培養表達編碼本發明多特異性抗體的核酸的宿主細胞的步驟。具體而言，本發明是有關於產生本發明的多特異性抗體的方法，該方法包括(i)提供編碼本發明的多特異性抗體的一核酸序列或2個核酸序列、或編碼本發明的多特異性抗體的一載體或2個載體，表達該核酸序列或核些酸序列、或該載體或該些載體，並收集所述多特異性抗體或來自表達系統的結合域，或(ii)提供表達編碼本發明的多特異性抗體的1或2個核酸的一宿主細胞或多個宿主細胞，培養該宿主細胞或該些宿主細胞；及從細胞培養物中收集多特異性抗體或結合域。
在另一方面，本發明有關於包含本發明的多特異性抗體和藥學上可接受的載體（pharmaceutically acceptable carrier）的醫藥組合物。「藥學上可接受的載體」是指是指不干擾抗體結構的介質或稀釋劑。藥學上可接受的載體增強或穩定組合物，或促進組合物的製備。藥學上可接受的載體包括生理相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑及類似物。
某些這樣的載體能夠使醫藥組合物配製成例如片劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液(slurry)、懸浮液和口含錠以供受試者口服。 某些這樣的載體能夠配製用於注射、輸注或局部給藥的醫藥組合物。 例如，藥學上可接受的載體可以是無菌水溶液。
本發明的醫藥組合物可以通過本領域已知的多種方法給藥。給藥途徑和/或給藥方式取決於所需的結果。給藥可以是靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下給藥，或在目標位點附近給藥。在特定實施例中，給藥方式是肌肉內或皮下給藥，特別是皮下給藥。藥學上可接受的載體應該適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮給藥（例如，通過注射或輸注），特別是肌肉內或皮下給藥。根據給藥途徑，活性化合物（即本發明的多特異性抗體）可以用一種材料包覆以保護化合物免受酸作用和其他可能使化合物失活的自然條件。
本發明的醫藥組合物可以根據本領域已知和常規實踐的方法製備。請參照，例如下列文獻：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。醫藥組合物優選在GMP條件下製造。通常，在本發明的醫藥組合物中使用治療有效劑量（therapeutically effective dose）或有效劑量（efficacious dose）的本發明多特異性抗體。通過本領域技術人員已知的常規方法將本發明的多特異性抗體配製成藥學上可接受的劑型。調整劑量方案以提供最佳的所需反應（例如治療反應）。例如，可以施用單次推注，可以隨著時間的推移施用幾個分開的劑量，或者可以根據治療情況的緊急情況按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配製腸胃外組合物以易於給藥和劑量均勻是特別有利的。如本文所用的劑量單位形式是指適合作為待治療受試者的單位劑量的物理離散單位；每個單元含有預定量的活性化合物（經計算可產生所需的治療效果以及所需的藥物載體）。
本發明的醫藥組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得有效實現特定患者所需治療反應的活性成分的量、組合物和給藥方式，而不會對患者有毒性。選擇的劑量水平取決於多種藥物動力學因素，包括所使用的本發明特定組合物的活性、給藥途徑、給藥時間、所使用的特定化合物的排泄速率、治療的持續時間、與所使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和既往病史及類似因素。
本發明的多特異性抗體通常在多次施用的情況。單次劑量之間的間隔可以是每週、每月或每年。間隔也可以是不規則的，如通過測量患者體內本發明的多特異性抗體的血液水平所指示的。或者，本發明的多特異性抗體可以作為持續釋放製劑（sustained release formulation），在這種情況下需要較少的給藥頻率。劑量和頻率取決於患者體內抗體的半衰期。一般來說，人類化抗體的半衰期比嵌合抗體和非人類抗體長。給藥的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性而變化。在預防性應用中，在很長一段時間內以相對不頻繁的間隔施用相對低的劑量。一些患者在他們的餘生中繼續接受治療。在治療應用中，有時需要在相對較短的間隔內使用相對高的劑量，直到疾病的進展減緩或終止，優選的，直到患者表現出疾病症狀的部分或完全改善。此後，可以向患者施用預防方案。
在一方面，本發明有關於用作藥物的本發明的多特異性抗體或本發明的醫藥組合物。在合適的實施例中，本發明提供用於治療選自於過敏、發炎和自體免疫性疾病（特別是選自於發炎和自體免疫性疾病）之一疾病的多特異性抗體或醫藥組合物。
在另一方面，本發明提供用於製備治療過敏、發炎或自體免疫性疾病（特別是發炎或自體免疫性疾病）的醫藥組合物的多特異性抗體或醫藥組合物。
在另一方面，本發明有關於多特異性抗體或醫藥組合物在用於治療有需要的受試者的過敏、發炎或自體免疫性疾病（特別是治療發炎或自體免疫性疾病）的用途。
在另一方面，本發明有關於治療受試者的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明的多特異性抗體。在合適的實施例中，本發明有關於治療受試者的過敏、發炎或自體免疫性疾病（特別是治療發炎或自體免疫性疾病）的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明的多特異性抗體。
術語「受試者」包括人類和非人類的動物。
術語「動物」包括所有脊椎動物，例如非人類哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬蟲類。 除非另有說明，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「治療」、「治療中」、「進行治療」、「被治療」及類似術語是指獲得期望的藥理學和/或生理學效果。就部分或完全治癒疾病和/或歸因於疾病或延遲疾病進展的副作用而言，效果可以是治療性的。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物疾病的任何治療，例如，在人類中，包括：(a)抑制疾病，亦即，阻止其發展；(b)緩解疾病，亦即，導致疾病消退。
術語「治療有效量（therapeutically effective amount）」或「有效量（efficacious amount）」是指當向哺乳動物或其他受試者施用以治療疾病時足以影響對疾病的此類治療的藥劑的量。「治療有效量」將根據要治療的受試者的藥劑、疾病及其嚴重程度和年齡、體重等而變化。
在一實施例中，過敏性疾病、發炎性疾病和自體免疫性疾病選自引起瘙癢的過敏性疾病、引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病，特別是選自引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病。此處作為同義詞使用的術語「瘙癢」和「癢」是指引起撓癢(scartch)的慾望或反射的感覺。撓癢可能會帶來問題，特別是在引起瘙癢的慢性皮膚病的情況下，例如異位性皮膚炎、皮膚真菌病、牛皮癬或蕁麻疹，因為持續性瘙癢會刺激患者不斷和/或過度撓癢受影響的皮膚區域，這通常會導致皮膚損傷和皮膚表面的進一步惡化。
如本文所用，術語「過敏性疾病」或「過敏」是指由免疫系統對環境中通常無害的物質的高敏感反應引起的大量病症。
如本文所用，術語「發炎性疾病」是指大量發炎性病症，即發炎性異常，通常以長期發炎為特徵，稱為慢性發炎。術語「發炎」是指身體組織對有害刺激（例如病原體、受損細胞或刺激物）的複雜生物反應。它是一種涉及免疫細胞、血管和分子介質的保護性反應。雖然定期的發炎反應對於身體消除細胞損傷的最初原因、清除因原始損傷和發炎過程而受損的壞死細胞和組織以及啟動組織修復是必不可少的，但發炎性疾病的特徵通常是在不存在有害刺激的情況下持續性發炎。
如本文所用，術語「自體免疫性疾病」是指由對功能性身體部位的異常免疫反應引起的病症。這是自體免疫的結果，即存在自身反應性免疫反應（例如，自身抗體、自身反應性 T 細胞），具有或沒有由此引起的損傷或病理，通常僅限於某些器官或涉及不同位置的特定組織。
在具體的實施例中，引起瘙癢的發炎性或自體免疫性疾病選自異位性皮膚炎、急性過敏性接觸性皮膚炎、慢性自發性蕁麻疹、大疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid)、斑禿(alopecia areata)、皮肌炎(dermatomyositis)、結節性癢疹(prurigo nodularis)、牛皮癬和異位性氣喘，特別是異位性皮膚炎。
在另一方面，過敏性、發炎性和自體免疫性疾病選自異位性皮膚炎、急性異位性接觸性皮炎、慢性自發性蕁麻疹、大疱性類天疱瘡、斑禿、皮肌炎、結節性癢疹、牛皮癬和異位性氣喘，特別是異位性皮膚炎。
在另一實施例中，過敏性、發炎性和自體免疫性疾病選自過敏性氣喘、過敏性鼻炎、發炎性氣道疾病、復發性氣道阻塞、氣道高反應性、慢性阻塞性肺病、克隆氏病(Crohn disease)、慢性非組胺相關性蕁麻疹、抗組胺藥-無反應性肥胖細胞增多症(antihistamine-unresponsive mastocytosis)、慢性單純性苔蘚(lichen simplex chronicus)、脂溢性皮膚炎(seborrhoeic dermatitis)、乾皮病(xeroderma)、疱疹性皮膚炎(Dermatitis herpetiformis)、扁平苔蘚(lichen planus)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)。
在另一個實施例中，本發明提供如本文定義的多特異性抗體或醫藥組合物，用於治療疾病，所述疾病是選自疱疹後神經痛(post-herpetic neuralgia)、疱疹後瘙癢、感覺異常痛(notalgia paresthetica)、多發性硬化症和肱橈側瘙癢(brachioradial pruritus)。
在另一個實施例中，本發明提供多特異性抗體或醫藥組合物用於止癢劑中用於治療具有瘙癢的全身性疾病，所述疾病選自膽汁淤積(Cholestasis)、慢性腎病、霍奇金病(Hodgkin's disease)、皮膚T -細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)和其他與慢性瘙癢相關的淋巴瘤或白血病、真性紅細胞增多症(polycythemia vera)、甲狀腺機能亢進、慢性節肢動物後瘙癢（chronic post-arthropod itch (Id反應)）、妊娠引起的慢性瘙癢（例如PUPPP）、嗜伊紅球性膿疱性毛囊炎(eosinophilic pustular folliculitis)、藥物高度敏感反應、老年人慢性瘙癢症或乾性皮膚瘙癢（局部、全身）、燒傷後傷疤部分瘙癢（燒傷後瘙癢）、遺傳性或痣樣慢性瘙癢(genetic or nevoid chronic itch)（例如 Netherton 氏症候群、Darier氏病(Morbus Darier)、Hailey-Hailey氏病、發炎性線性表皮疣性痣 (inflammatory linear verrucous epidermal nevus, ILVEN)、家族性原發性皮膚澱粉樣變性症(familial primary cutaneous amyloidosis)、Olmsted氏症候群)、水源性瘙癢、玻璃纖維皮膚炎、黏膜慢性瘙癢(mucous chronic itch)，化療引起的瘙癢和愛滋病毒(HIV)。
序列表（根據 AHo 編號方案表示的突變；根據 Numab CDR 定義所定義出的 CDR，除非另有說明）
表1：本發明中使用的IL-4R結合域的範例（CDR殘基以粗體和斜體字母顯示）
SEQ ID 編號 Ab 區 序列  
44-34-C10
SEQ ID NO: 1   HCDR1(H27-H42; AHo 編號) GFSSSSAHYMC  
SEQ ID NO: 2   HCDR2(H57-H76; AHo編號) CIYAGSRGSTYYASWAKG  
SEQ ID NO: 3   HCDR3(H108-H138; AHo編號) RAAFVNRGVSWIWPYYFSL  
SEQ ID NO: 4 VH(44-34-C10-sc07/44-34-C10-sc08)   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSSSSAHYMC WVRQAPGKGLEWIG CIYAGSRGSTYYASWAKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RAAFVNRGVSWIWPYYFSL WGQGTLVTVSS  
SEQ ID NO: 5 VH(44-34-C10-sc09) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAAS GFSSSSAHYMC WVRQAPGKGLEWIG CIYAGSRGSTYYASWAKG RFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYYCA RAAFVNRGVSWIWPYYFSL WGQGTQVTVSS  
SEQ ID NO: 6 VH(44-34-C10-sc09) 突變 R12L, T103V, Q144L EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSSSSAHYMC WVRQAPGKGLEWIG CIYAGSRGSTYYASWAKG RFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RAAFVNRGVSWIWPYYFSL WGQGTLVTVSS  
SEQ ID NO: 7   LCDR1(L24-L42; AHo 編號) QASEDIESYLA  
SEQ ID NO: 8   LCDR2(L58-L72; AHo編號) (呈現於44-34-C10-sc06, 44-34-C10-sc08 和 44-34-C10-sc09)   RASTLAY  
SEQ ID NO: 9   LCDR3(L107-L138; AHo 編號)   LGSSYSTGSNI  
SEQ ID NO: 10 VL(44-34-C10-sc06/44-34-C10-sc09) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASEDIESYLA WYQQKPGKAPKLLIY RASTLAY GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LGSSYSTGSNI  
SEQ ID NO: 11 VL(44-34-C10-sc08) DIQMTQSPSSLSARVGDRVTITC QASEDIESYLA WYQQKPGKAPKLLIY RASTLAY GVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYC LGSSYSTGSNI  
表2：本發明中使用的IL-31結合域的範例（CDR殘基以粗體和斜體字母顯示）
SEQ ID 編號 Ab 區 序列  
50-09-D07
SEQ ID NO: 12 HCDR1(H27-H42; AHo編號) GFSFSANYWIC  
SEQ ID NO: 13 HCDR2(H57-H76; AHo編號) (呈現於 50-09-D07-sc04, 50-09-D07-sc05和 50-09-D07-sc07) CIYIGSRADTYYAPWAKG  
SEQ ID NO: 14 HCDR3(H108-H138; AHo編號) RFSSGIYDLDRFFL  
SEQ ID NO: 15 VH(50-09-D07-sc03/50-09-D07-sc07) QSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSANYWIC WVRQAPGKGLEWIV CIYIGSRADTYYAPWAKG RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCA RFSSGIYDLDRFFL WGQGTLVTVSS  
SEQ ID NO: 16 VH(50-09-D07-sc04) QSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAAS GFSFSANYWIC WVRQAPGKGLEWIV CIYIGSRADTYYAPWAKG RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCA RFSSGIYDLDRFFL WGQGTQVTVSS  
SEQ ID NO: 17 LCDR1(L24-L42; AHo編號) QASQSIDSWLA  
SEQ ID NO: 18 LCDR1(L24-L42; AHo編號) QASQSIESWLA  
SEQ ID NO: 19 LCDR2(L58-L72; AHo編號) QASKLAS  
SEQ ID NO: 20 LCDR3(L107-L138; AHo編號) QTYYGGGHIGWG  
SEQ ID NO: 21 VL(50-09-D07-sc03 to sc06) AFQLTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQSIDSWLA WYQQKPGKPPKLLIY QASKLAS GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC QTYYGGGHIGWG  
SEQ ID NO: 22 VL(50-09-D07-sc07) AFQLTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQSIESWLA WYQQKPGKPPKLLIY QASKLAS GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC QTYYGGGHIGWG  
表3：相關於本發明的其他序列
SEQ ID 編號 Ab 區 序列
SEQ ID NO: 23 VH3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSANYYPC WVRQAPGKGLEWIG CIYGGSSDITYDANWTK GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RSAWYSGWGGDL WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24 VH4 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS GFSFSNSYWIC WIRQPPGKGLEWIG CTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA RHPSDAVYGYANNL WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 25 Vkappa1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQSINNVLA WYQQKPGKAPKLLIY RASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QSSYGNYGD FGTGTKVTVLG
SEQ ID NO: 26 Vλ生殖系列基FR4 (Sk17) FGTGTKVTVLG
SEQ ID NO: 27 Vλ生殖系列基 FR4 (Sk12) FGGGTKLTVLG
SEQ ID NO: 28 Vλ 生殖系列基 FR4 FGGGTQLIILG
SEQ ID NO: 29 Vλ 生殖系列基 FR4 FGEGTELTVLG
SEQ ID NO: 30 Vλ 生殖系列基 FR4 FGSGTKVTVLG
SEQ ID NO: 31 Vλ 生殖系列基 FR4 FGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 32 Vλ 生殖系列基 FR4 FGGGTQLTALG
SEQ ID NO: 33 Vλ 生殖系列基 FR4_G141C FGCGTKVTVLG
SEQ ID NO: 34 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 35 連接子 GGGGS
SEQ ID NO: 36 連接子 GGGGSGGGGS
表4：本發明中所使用的多特異性抗體的範例(連接子以粗體字顯示)
SEQ ID 編號 Ab 形式  序列
PRO2198
SEQ ID NO: 37 Morrison-H, LC DIQMTQSPSSLSARVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 38 Morrison-H, HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG GGGGSGGGGSAFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSS
PRO2199
SEQ ID NO: 39 Morrison-H, LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 40 Morrison-H, HC EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG GGGGSGGGGSAFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSS
PRO2200
SEQ ID NO: 41 Morrison-H, LC AFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 42 Morrison-H, HC QSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG GGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSARVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTLVTVSS
PRO2201
SEQ ID NO: 43 Morrison-H, LC AFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 44 Morrison-H, HC QSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG GGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTQVTVSS
PRO2206
SEQ ID NO: 45 Morrison-L, LC DIQMTQSPSSLSARVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSAFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 46 Morrison-L, HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
PRO2207
SEQ ID NO: 47 Morrison-L, LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSAFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 48 Morrison-L, HC EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
PRO2208
SEQ ID NO: 49 Morrison-L, LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIESYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSSYSTGSNIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSAFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIDSWLAWYQQKPGKPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQTYYGGGHIGWGFGTGTKVTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYWICWVRQAPGKGLEWIVCIYIGSRADTYYAPWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARFSSGIYDLDRFFLWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 50 Morrison-L, HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSSSSAHYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSRGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAFVNRGVSWIWPYYFSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
在本申請的全文中，如果說明書內文(例如表1至表4)與序列表之間存在差異，應以說明書內文為準。
應當理解，為了清楚起見，在單獨實施例的上下文中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合地提供。相反，為了簡潔起見，在單個實施例的上下文中描述的本發明的各種特徵也可以單獨提供或以任何合適的子組合提供。與本發明有關的實施例的所有組合都被本發明特別地包含並在本文中揭示，就好像每個組合都被單獨和明確地揭示一樣。此外，各種實施例及其元素的所有子組合也被本發明特別包含並在本文中揭示，就好像每個這樣的子組合在本文中單獨且明確地揭示一樣。
本發明的範圍不受本文描述的特定實施例的限制。實際上，除了本文所述的那些之外，本發明的各種修改對於本領域技術人員而言從前面的描述將變得顯而易見。此類修改旨在落入所附權利要求的範圍內。
在各自專利法的可能範圍內，本文引用的所有專利、申請、出版物、測試方法、文獻和其他材料均通過引用併入本文。
以下實施例說明了上述本發明，但並不旨在以任何方式限制本發明的範圍。本領域技術人員已知的其他測試模型也可以確定所請發明的有益效果。
範例
範例1：抗IL-4R分子的產生和測試：
專案目標
此專案的目標是產生特異性結合並中和人類IL-4R的生物學效應的人源化單株抗體片段。另一個目標是確認足夠有效和穩定的抗 IL-4R 抗體片段，以納入多特異性抗體形式。
1.1 包括在本發明的多特異性抗體中的抗IL-4R結合域的產生、選擇、人源化和生產
如平行專利申請EP20216928.0中所述進行抗IL-4R兔抗體的產生、合適植株的篩選和選擇以及人源化抗IL 4R結合域的人源化和生產，其通過引用併入本文。基於其生物物理和功能特性，確認和選擇了足夠有效和穩定以併入多特異性抗體形式的抗 IL-4R 結合域。
1.2. 合適的抗IL-4R結合域的表徵
為了進一步描表徵適的抗IL-4R結合域，進行了以下分析。
1.2.1. 製造用於表徵的合適的抗 IL-4R 結合域（scFv 形式）
使用CHOgro瞬時轉染試劑盒(Mirus)在CHO-S細胞中進行哺乳動物構建體的表達。在 37°C 表達 5-7 天后（當達到細胞存活率 ＜70%）通過離心和過濾收集培養物。通過蛋白質 L 親和層析法(Protein L affinity chromatography)從澄清的培養上清液中純化蛋白質。由於所有分子都顯示出至少一親和層析部分且捕穫後單體含量＞95% (如通過 SE-HPLC 分析所評估的)，沒有分子需要通過粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography)進行精製(polish)。通過透析將樣品重新緩衝至最終緩衝液(50 mM 磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液和150 mM NaCl，pH 6.4)。對於製造材料的品質控制，應用了SE-HPLC、UV 280和 SDS-PAGE 等標準分析方法。源自被認為適合併入多特異性抗體形式的4個植株的8個scFv分子的製造特徵總結在表 6 中。植株44-18-C11(PRO1510) 的 CDR 移植(sc01)和完全移植(sc04) 的製造特徵及其變異體(PRO1549-PRO1554)總結在表7中。
表6：8 個選定植株的scFv製造。sc01：CDR 移植，sc04：全移植
蛋白質 ID 描述 表達體積 [ml] 親和層析純化後的產量 [mg] 最終產量 [mg] 力價 (Titer) [mg/l] 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] 純度 SDS-PAGE T m[°C] T onset[°C]
PRO1506 44-03-A03-sc01 200 14.6 11.7 58 99.0 識別確認 62.8 56.7
PRO1524 44-03-A03-sc04 100 6.5 5.0 50 99.0 識別確認 59.6 54.0
PRO1510 44-18-C11-sc01 200 12.5 10.0 50 98.0 識別確認 71.5 64.0
PRO1528 44-18-C11-sc04 100 5.7 4.7 47 99.0 識別確認 59.1 52.3
PRO1517 44-34-C10-sc01 50 1.5 0.3 7 97.6 識別確認 63.7 57.0
PRO1535 44-34-C10-sc04 100 7.3 4.6 46 99.1 識別確認 67.9 62.7
PRO1520 44-39-B07-sc01 100 9.5 3.1 31 98.2 識別確認 70.2 64.0
PRO1538 44-39-B07-sc04 100 8.4 2.2 22 95.0 識別確認 68.3 63.7
表7：植株44-18-C11的所有移植變異體的scFv製造。 sc01：CDR 移植，sc04：全移植
蛋白質 ID 描述 表達體積 [ml] 親和層析純化後的產量 [mg] 最終產量 [mg] 力價 [mg/l] 純度 SE-HPLC [% 單體 ] 純度 SDS-PAGE T m[°C] T onset[°C]
PRO1510 44-18-C11-sc01 200 12.5 10.0 50 98.0 識別確認 71.5 64.0
PRO1528 44-18-C11-sc04 100 5.7 4.7 47 99.0 識別確認 59.1 52.3
PRO1549 44-18-C11-sc05 100 8.1 6.8 68 99.0 識別確認 66.9 61.0
PRO1550 44-18-C11-sc06 100 8.0 9.0 90 99.0 識別確認 69.8 62.0
PRO1551 44-18-C11-sc07 100 8.1 6.8 68 98.0 識別確認 68.1 62.7
PRO1552 44-18-C11-sc08 100 6.8 5.5 55 98.0 識別確認 55.6 47.0
PRO1553 44-18-C11-sc09 100 7.5 6.7 67 99.0 識別確認 62.8 56.0
PRO1554 44-18-C11-sc10 100 8.8 6.9 69 99.0 識別確認 69.5 61.3
1.2.2. 合適的抗 IL-4R 結合域(scFvs 形式)的藥效學表徵
被評估為合適的scFvs抗體被表徵為主要藥效學特性。
對人類IL-4R的親和力
14個人源化scFv(源自4個兔單株抗體)對人類 IL-4R的親和力通過 T200裝置(Biacore, GE Healthcare)上的SPR分析確定。通過與羧甲基化葡聚醣(carboxylmethylated dextran)表面偶聯的抗人類IgG-Fc捕獲人類IL-4R-Fc，並將scFv作為分析物注射。在每個分析物注射循環之後，感測晶片被再生並捕獲新的抗原。使用劑量反應多循環動力學測定法(dose response multi-cycle kinetic assay)測量scFv，其中稀釋於電泳緩衝液中的7個分析物濃度範圍為0.12至90 nM。使用 1:1 結合模型擬合獲得的感應圖(sensorgram)。結果顯示在表8中。從表8可以看出，基於植株44-34-C10的scFv抗體可變結構域表現出對人類IL-4R的最佳整體結合親和力。
表8：scFv 對人類IL-4R的親和力。sc01：CDR移植； sc04：完全移植。
蛋白質 ID scFv 對人類 IL-4R 的親和力
  Clone ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1506 44-03-A03 -sc01 2.17E+06 1.49E-04 6.89E-11
PRO1524 44-03-A03-sc04 1.13E+06 3.40E-05 3.00E-11
PRO1510 44-18-C11 -sc01 1.67E+06 9.58E-04 5.75E-10
PRO1528 44-18-C11-sc04 3.83E+06 2.07E-04 5.39E-11
PRO1549 44-18-C11-sc05 1.63E+06 1.11E-03 6.77E-10
PRO1550 44-18-C11-sc06 1.55E+06 1.32E-03 8.52E-10
PRO1551 44-18-C11-sc07 1.84E+06 1.05E-03 5.70E-10
PRO1552 44-18-C11-sc08 8.41E+06 3.54E-04 4.21E-11
PRO1553 44-18-C11-sc09 4.24E+06 2.24E-04 5.27E-11
PRO1554 44-18-C11-sc10 2.03E+06 1.09E-03 5.37E-10
PRO1517 44-34-C10 -sc01 3.55E+06 1.95E-05 5.50E-12
PRO1535 44-34-C10-sc04 2.72E+06 5.42E-05 1.99E-11
PRO1520 44-39-B07 -sc01 6.18E+05 1.18E-02 1.91E-08
PRO1538 44-39-B07-sc04 1.67E+06 2.29E-04 1.37E-10
對食蟹猴、狨猿和小鼠IL-4R的親和力
使用與分析人類IL-4R親和力相同的設置測量與食蟹猴IL-4R的交叉反應性，不同之處在於捕獲食蟹猴IL-4R-Fc而不是人類IL-4R-Fc。由於只有狨猿 IL-4R 的細胞外結構域 (extracellular domain, ECD) 可用，為了確定狨猿IL-4R的親和力，使用直接設置。狨猿ECD直接固定在感測晶片上，並注入一系列滴定的scFv作為分析物。為了比較食蟹猴和狨猿IL-4R獲得的KD值，還使用直接設置確定了對食蟹猴IL-4R ECD的親和力。
只有少數scFv與食蟹猴IL-4R ECD結合。與直接設置中的一個scFv相比，3個scFv在捕獲設置中顯示出交叉反應性，這意味著在直接設置中不再可測量2個scFv的結合。這很可能是直接設置中確定的較低KD值的結果。差異是由於啟動率(on-rate)較慢，可能是由於易接近性(accessibility)較低。所有scFv的關閉率(off-rate)相當。
此外，確認與狨猿IL-4-R ECD的交叉反應性。結果總結在表9中。
評估scFvs PRO1517、PRO1535和PRO1538與小鼠IL-4R的結合，但它們都沒有顯示出交叉反應性。
HEK-藍細胞中的 Stat-6報導基因測定(阻斷人類 IL-4和IL-13誘導的信號傳導）
HEK-藍測定測試了人源化scFv通過IL-4R抑制IL-4-和IL-13誘導的訊息傳遞的能力。每孔50,000 個細胞接種在 96 孔盤中。在存在 0.02 ng/ml IL-4或0.3 ng/ml IL-13 的情況下，將 scFv 和對照抗體 dupilumab 的系列稀釋液添加到盤中。在 37°C 和 5% CO 2下培養 24 小時後，將上清液轉移到新盤上，並使用Quanti-藍基質(Quanti-Blue substrate)對分泌的胚胎鹼性磷酸酶進行定量。
在此HEK-藍測定中分析scFv阻斷IL-4R介導的訊號傳遞的能力。將分析分子的效力與dupilumab進行比較。所有效力數據總結在表 10 中。相對 IC 50值以dupilumab和scFv的質量單位 (ng/ml) 計算。8個scFv高效阻斷IL-4和IL-13誘導的訊息傳遞。基於植株 44-34-C10和PRO1552的scFv顯示出最佳的整體阻斷效力。 PRO1517、PRO1524、PRO1535、PRO1538和PRO1552可以阻斷 IL-4 和IL-13誘導的訊息傳遞，其效力類似於dupilumab。
競爭性ELISA(抑制hIL-4與hIL-4R結合)
使用競爭性ELISA進一步確定人源化scFv的效力。每種 scFv 抑制人類IL-4和人類IL-4R之間相互作用的效力通過 ELISA 使用與EP20216928.0中描述的相同程序進行評估。類似地，對於stat-6 報導基因測定，每個板上的各個 IC 50值都根據參考分子dupilumab的 IC 50進行校準。
7個scFv以良好至高效抑制人類IL-4和人類IL-4R之間的相互作用。基於植株44-34-C10和PRO1552的scFv顯示出最佳的整體阻斷效力。PRO1517和PRO1552 的阻斷效力與dupilumab相似。另一方面，PRO1538僅表現出中度抑制。5個scFv分子沒有顯示出抑製作用。
用於可開發性評估的scFv的藥理學表徵和分子選擇的總結
源自4個不同B細胞植株的14個scFv的藥理學表徵為選擇用於擴展生物物理表徵的分子提供了基礎。5個分子，即 PRO1517、PRO1535、PRO1524、PRO1506和PRO1538，基於它們在 stat-6報導基因分析中以及在 IL-4/IL-4R 阻斷 ELISA 中於中和IL-4和IL-13誘導的訊息傳遞方面的整體更好性能，被選擇用於進一步擴展表徵。所有7個分子均顯示出優於500 pM的親和力。除了對食蟹猴 IL-4R 的親和力非常低或沒有結合的3個分子之外，與人類IL-4R相比，對食蟹猴IL-4R的親和力低4至20倍。特別是，基於植株44-18-C11的scFv(即 PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554未顯示與食蟹猴IL-4R的結合。通常，與人類IL-4R相比，這些scFv對狨猿IL-4R的親和力也較低。作為這些親和力研究的結果，基於植株44-18-C11的scFv(即 PRO1510、PRO1528和PRO1549至PRO1554)由於對食蟹猴IL-4R缺乏交叉反應性而被排除在進一步評估之外，即使 PRO1552 顯示出非常好的抑制效力。出於同樣的原因，PRO1520 也被排除在外。然而，不排除基於相同植株44-39-B07的PRO1538，儘管它對食蟹猴IL-4R的結合親和力較弱。
1.2.3. 合適的抗IL-4R結合域(scFv形式)的生物物理表徵
穩定性測量材料的製造
PRO1517和PRO1538使用與上述相同的製造程序以稍大的規模(0.25 l表達體積)再次生產，以產生足夠的材料用於穩定性評估。對於選擇用於穩定性評估的其他蛋白質，先前生產的材料的量足以進行穩定性評估。樣品在純化後在pH 6.4以150 mM NaCl於50 mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中配製(50 mM NaCiP, pH 6.4)。純化和透析後，使用具有5截流分子量(MWCO)的離心濃縮管將蛋白質樣品濃縮至≥10 mg/ml，因為這是進行儲存穩定性評估所需的濃度。
濃縮至10 mg/ml時的單體損失介於0和12%之間，具體取決於分子，如表 11 所示。PRO1506和PRO1524的單體含量降至 95% 以下，這是進入儲存穩定性評估的分子的臨界值，並且，因此，有理由將它們排除在研究之外。然而，由於材料已經準備好並且一切都為研究設置好了，這些分子的穩定性與其餘分子一起評估，這些分子在濃縮後表現出單體含量＞95%。基於植株44-34-C10的scFv(即 PRO1517和PRO1535以及PRO1538)在濃縮時幾乎沒有單體含量的損失。
儲存穩定性研究
對人源化scFv進行穩定性研究，例如為期4週的穩定性研究，其中將scFv配製在 10 mg/ml 的水性緩衝液(50 mM NaCiP、150 mM NaCl、pH 6.4)中並在＜ -80°C、4°C和40°C5中儲存4週。至少，在一週、兩週和每次研究結束時，通過整合SE-HPLC波峰面積來評估製劑中單體和低聚物的部分。記錄大多數分子的額外時間點。表 12 比較了研究的第 14 天(d14)和在第28天(d28)獲得的終點測量值。
表9：scFv對食蟹猴和狨猿IL-4R的親和力。sc01：CDR移植；sc04：全移植；sc05-sc10：其他移植變異體
蛋白質 ID scFv 對食蟹猴 IL-4R 捕獲設置的親和力 對食蟹猴 IL-4R 直接設置的親和力 對狨猿 IL-4R 直接設置的親和力
  Clone ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M) k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M) k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1506 44-03-A03 -sc01 NB NB NB NB NB NB 3.78E+06 7.45E-04 1.97E-10
PRO1524 44-03-A03-sc04 1.37E+09 8.07E+01 5.89E-08 NB NB NB 2.27E+06 2.06E-04 9.09E-11
PRO1510 44-18-C11 -sc01 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1528 44-18-C11-sc04 NB NB NB NB NB NB 6.43E+06 4.39E-03 6.83E-10
PRO1549 44-18-C11-sc05 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1550 44-18-C11-sc06 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1551 44-18-C11-sc07 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1552 44-18-C11-sc08 NB NB NB NB NB NB 1.57E+07 1.28E-03 8.16E-11
PRO1553 44-18-C11-sc09 NB NB NB NB NB NB 6.64E+06 5.38E-03 8.09E-10
PRO1554 44-18-C11-sc10 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1517 44-34-C10 -sc01 1.92E+06 1.82E-04 9.46E-11 5.94E+05 4.04E-04 6.81E-10 2.67E+06 1.05E-03 3.92E-10
PRO1535 44-34-C10-sc04 1.60E+06 2.64E-04 1.65E-10 6.34E+05 2.38E-04 3.76E-10 3.23E+06 2.54E-03 7.87E-10
PRO1520 44-39-B07 -sc01 NB NB NB NA NA NA NA NA NA
PRO1538 44-39-B07-sc04 5.29E+04 8.06E-04 1.52E-08 NB NB NB 1.02E+06 1.83E-04 1.80E-10
NA: 未分析;  NB:沒有結合
表10：scFv 在 stat-6 報導基因測定中中和 IL-4和IL-13誘導的訊息傳遞的效力。 sc01：CDR 移植；sc04：全移植；sc05-sc10：其他移植變異體。
蛋白質 ID scFv   報導基因測定中 hIL-4 誘導的訊息傳遞的中和   報導基因測定中 hIL-13 誘導的訊息傳遞的中和
  植株 ID   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*
PRO1506 44-03-A03-sc01   0.93 0.78   2.06 0.98
PRO1524 44-03-A03-sc04   0.95 0.80   1.81 1.05
PRO1510 44-18-C11-sc01   無抑制 n/a   無抑制 n/a
PRO1528 44-18-C11-sc04   1.49 0.28   2.29 0.59
PRO1549 44-18-C11-sc05   無抑制 n/a   無抑制 n/a
PRO1550 44-18-C11-sc06   無抑制 n/a   無抑制 n/a
PRO1551 44-18-C11-sc07   無抑制 n/a   無抑制 n/a
PRO1552 44-18-C11-sc08   0.43 1.30   1.02 1.41
PRO1553 44-18-C11-sc09   1.19 0.47   6.05 0.24
PRO1554 44-18-C11-sc10   無抑制 n/a   無抑制 n/a
PRO1517 44-34-C10-sc01   1.44 0.39   1.83 0.57
PRO1535 44-34-C10-sc04   1.15 1.02   2.30 0.99
PRO1520 44-39-B07-sc01   NA NA   NA NA
PRO1538 44-39-B07-sc04   0.64 1.83   1.69 1.35
NA: 未分析 
* IC 50, dupilumab/IC 50, 測試樣品
n/a: 相對IC 50未計算(無抑制或 IC 50未確認)
表11：濃縮至10 mg/ml時的單體損失百分比(% monomer loss) (SE-HPLC)。sc01：CDR移植，sc04：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 初始單體含量 [%] 濃縮至 10mg/ml 後的單體含量 [%] 濃縮至 10 mg/ml 時的損失百分比
PRO1506 44-03-A03 -sc01 99.0 92.5 6.6
PRO1517 44-34-C10 -sc01 97.6 97.4 0.2
PRO1524 44-03-A03-sc04 99.0 87.3 11.8
PRO1535 44-34-C10-sc04 99.1 99.0 0.1
PRO1538 44-39-B07-sc04 95.0 98.2 -3.4
從表12可以看出，基於植株44-34-C10的scFv(即PRO1517和PRO1535)在4°C下表現出良好的儲存穩定性。在 4°C 下儲存 28天後(d28)單體含量的損失小於5%。PRO1538 也表現出至少 14 天之良好的儲存穩定性。然而，在任何溫度下，沒有一個穩定的分子顯示出相當大的蛋白質含量損失。
凍融穩定性(Freeze-thaw stability)
除了上述儲存穩定性研究之外，還評估了性能最佳的scFv分子在凍融(F/T)循環方面的相容性(膠體穩定性)。由於在早期開發階段，藥物物質通常冷凍儲存，製劑和填充/完成製程將需要一些冷凍和解凍操作。
對於F/T穩定性評估，應用與儲存穩定性研究相同的分析方法(SE-HPLC、SDS-PAGE)和參數（單體含量百分比(% monomer content)和單體損失百分比(% monomer loss)）來監測分子的品質達5個F/T循環。表13說明了5個F/T循環中單體含量損失百分比的過程。由於沒有進行專門的凍融研究，因此顯示了使用-80°C儲存穩定性研究樣本獲得的凍融數據(在28天內獲得的)。由於某些蛋白質只能記錄4個時間點，因此這些蛋白質也只進行了4個 F/T 循環。
表 12：在10 mg/ml和-80°C、4°C 和 40°C 的溫度下的28天儲存穩定性研究。sc01：CDR移植，sc04：全移植。(NA:未分析)
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 溫度 [°C] 單體含量 [%] 單體變化百分比 (%) 蛋白質濃度 [mg/ml]   蛋白質含量變化百分比 (%)
d0 d14 d28 d14 d28 d0 d14 d28 d14 d28
PRO1506 44-03-A03-sc01 -80 92.5 91.9 94.1 -0.6 1.7 10.1 9.8 NA -3.0 NA
4 92.5 92.3 92.2 -0.3 -0.3 10.1 9.4 NA -6.7 NA
40 92.5 91.7 92.1 -0.9 -0.5 10.1 9.7 10.3 -3.7 2.0
  -80 97.4 97.1 96.8 -0.4 -0.7 10.0 9.9 10.9 -1.5 8.4
PRO1517 44-34-C10-sc01 4 97.4 96.4 95.2 -1.1 -2.3 10.0 7.9 11.9 -21.7 18.8
40 97.4 87.2 86.6 -10.5 -11.2 10.0 10.2 10.7 2.0 6.9
  -80 87.3 88.7 88.9 1.6 1.8 10.5 10.3 9.6 -1.9 -8.1
PRO1524 44-03-A03-sc04 4 87.3 89.2 88.2 2.2 1.0 10.5 10.2 9.6 -2.4 -8.8
40 87.3 88.4 88.4 1.2 1.3 10.5 11.4 13.5 8.4 28.5
  -80 99.0 98.5 98.1 -0.5 -0.9 10.5 10.9 9.6 3.3 -9.1
PRO1535 44-34-C10-sc04 4 99.0 96.9 95.0 -2.1 -4.1 10.5 10.4 7.8 -1.4 -25.6
40 99.0 90.3 88.6 -8.8 -10.5 10.5 10.8 10.8 2.6 3.1
  -80 98.2 97.8 NA -0.3 NA 10.4 10.5 NA 0.6 NA
PRO1538 44-39-B07-sc04 4 98.2 96.0 NA -2.2 NA 10.4 10.2 NA -2.0 NA
40 98.2 88.3 NA -10.0 NA 10.4 12.0 NA 15.2 NA
表13：重複凍融後的F/T 穩定性-以 % 表示的單體含量和單體變化百分比。sc01：CDR移植，sc04：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 單體含量 [%] 單體變化百分比 (%)
    F/T 0 F/T 1 F/T 2 F/T 3 F/T 4 F/T 5 F/T 1 F/T 2 F/T 3 F/T 4 F/T 5
PRO1506 44-03-A03-sc01 92.51 92.4 92.6 91.9 94.1 NA* -0.1 0.1 -0.6 1.7 NA*
PRO1517 44-34-C10-sc01 97.44 97.7 97.7 97.1 96.9 96.8 0.2 0.3 -0.4 -0.6 -0.7
PRO1524 44-03-A03-sc04 87.31 85.5 85.6 88.7 88.9 NA* -2.1 -2.0 1.6 1.8 NA*
PRO1535 44-34-C10-sc04 98.98 99.0 98.8 98.5 98.1 NA* 0.0 -0.2 -0.5 -0.9 NA*
PRO1538 44-39-B07-sc04 98.17 98.2 98.2 97.8 97.8 NA* 0.0 0.0 -0.3 -0.4 NA*
*不適用，因為只能測量4 個時間點
表14：選定結構域的 DSF。 sc01：CDR 移植，sc04：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] T m[°C] T onset[°C]
PRO1506 44-03-A03-sc01 99.0 62.8 56.7
PRO1517 44-34-C10-sc01 97.6 63.7 57.0
PRO1524 44-03-A03-sc04 99.0 59.6 54.0
PRO1535 44-34-C10-sc04 99.1 67.9 62.7
PRO1538 44-39-B07-sc04 95.0 68.3 63.7
熱展開(Thermal unfolding)
使用差異性掃描熒光法(DSF)對5個選擇的scFv構建體進行熱展開測量。通過將數據擬合到波茲曼方程式(Boltzmann equation)來確定在最大訊號 (T onset10%) 值的 10% 處計算得到的熱展開中點 (T m) 和展開起始溫度。表 14 總結了由 DSF測量的計算熔化溫度。從表 14 可以推斷，基於植株 44-34-C10的 scFv表現出高於 63°C 的高熔化溫度。此外，PRO1538 顯示出高熔化溫度。
範例2：抗IL31分子的產生和測試：
專案目標
本專案的目標是產生特異性結合並中和人類IL-31的生物學效應的人源化單株抗體片段。另一個目標是確認足夠有效和穩定的抗 IL-31 抗體片段，以納入多特異性抗體形式。
2.1. 包括在本發明的多特異性抗體中的抗IL-31結合域的產生、選擇、人源化和生產
如平行專利申請 EP20216938.9 中所述，進行抗 IL-31 兔抗體的產生、合適植株的篩選和選擇，以及人源化抗 IL 31 結合域的人源化和生產，其通過引用併入本文。基於其生物物理和功能特性，確認和選擇了足夠有效和穩定以併入多特異性抗體形式的抗 IL-31結合域。植株 50-09-D07被確認具有整體最佳的生物物理和功能特性。
2.2.合適的抗IL-31結合域的表徵
為了進一步表徵合適的抗IL-31結合域，進行了以下分析。
2.2.1. 製造用於表徵的合適的抗IL-31 結合域(scFv 格式)
哺乳動物構建體的表達在CHO-S細胞中進行，如上文1.2.1部分所述。製造源自一植株的2個scFv sc01和sc03構建體(分別為 PRO1632 和 PRO1643)(即植株50-09-D07)，總結在表 15 中。
2.2.2. 合適的抗 IL-31結合域(scFv形式)的藥效學表徵
被評估為合適的scFv抗體(即PRO1632和PRO1643) 的特徵在於主要藥效學特性。
對人類和食蟹猴 IL-31的親和力
2個人源化scFv對人類和食蟹猴 IL-31的親和力通過 T200裝置(Biacore, GE Healthcare)上的 SPR 分析確定。由於尚無商業供應，食蟹猴 IL-31是由北京義翹神州科技有限公司(Sino Biological)按需求生產的。人類和食蟹猴IL-31-His通過與羧甲基化葡聚醣表面偶聯的抗 His 標籤抗體捕獲，並將 scFv作為分析物注射。在每個分析物注射循環之後，感測晶片被再生並捕獲新的抗原。使用劑量反應多循環動力學測定以高通量模式(high-throughput mode)測量 scFv，其中兩種濃度(30和10 nM)在電泳緩衝液中稀釋。使用 1:1 結合模型擬合獲得的感應圖。
如表 16 所示，兩種人源化 scFv 與人類IL-31的結合均得到證實。
IL-31RA/OSMR二聚化測定(阻斷人類IL-31誘導的訊息傳遞)
IL-31RA/OSMR二聚化測定用於測試人源化scFv通過IL-31RA/OSMR異二聚體抑制IL-31誘導的訊息傳遞的能力。每孔10,000個細胞接種在 96 孔盤中。次日，在存在10 ng/ml IL-31的情況下，將 scFv 和對照抗體BMS-981164的系列稀釋液添加到盤中。在 37°C 和 5% CO 2下培養 6 小時後，加入檢測溶液，將盤再培養1小時並測量發光。
在細胞測定中測試了2個scFv。如上所述，將分析分子的效力與 BMS-981164進行比較。
以BMS-981164和scFv的質量單位 (ng/ml) 計算相對 IC 50值。效力數據總結在表 17 中。
表17：scFv在IL-31RA/OSMR二聚化測定中中和 IL-31R和 IL-31誘導的訊息傳遞效力。 sc01：CDR 移植；sc03：完全移植。
蛋白質 ID scFv   在 IL-31RA/OSMR 二聚化測定中中和 hIL-31 誘導的訊息傳遞
  Clone ID   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*
PRO1632 50-09-D07-sc01   53.29 0.20
PRO1643 50-09-D07-sc03   11.14 1.16
*: IC 50, BMS-981164/IC 50, 測試樣品
表15：2 個選定植株的scFv製造。sc01：CDR 移植，sc03：全移植。
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 表達體積 [ml] 親和層析純化後的產量 [mg] 親和層析純化後的產量 / 升 [mg/l] 最終產量 [mg] 力價 [mg/l] 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] 純度 SDS-PAGE
PRO1632 50-09-D07-sc01 30 5.8 193 0.7 23 96.4 識別確認°*
PRO1643 50-09-D07-sc03 30 0.7 23 0.2 7 90.4 識別確認°*
*°僅偵測有興趣的蛋白質
表 16：scFv 對人類 IL-31的親和力。sc01：CDR移植；sc03：完全移植。
蛋白質 ID scFv 對人類 IL-31 的親和力 對食蟹猴 IL-31 的親和力
  植株 ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M) k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1632 50-09-D07-sc01 1.02E+06 1.26E-03 1.24E-09 1.52E+06 3.06E-03 2.01E-09
PRO1643* 50-09-D07-sc03 8.84E+05 4.47E-04 5.05E-10 7.61E+05 4.44E-04 5.83E-10
PRO1643** 50-09-D07-sc03 8.20E+05 5.16E-04 6.30E-10 7.64E+05 4.26E-04 5.57E-10
*  PRO1643的KD已確認兩次。在第一次SPR分析中通過篩選模式確認第一個KD(KD 1)。 ** 第二個KD(KD 2)已在第二個SPR分析中使用全滴定模式(full titration mode)確認。
競爭性 ELISA(抑制 hIL-31 與 hIL-31RA 結合)
使用競爭性 ELISA 進一步確定2個人源化 scFv 的效力。 每個scFv抑制人類 IL-31和人類IL-31RA 之間相互作用的效力通過 ELISA使用與 EP20216938.9中描述的相同程序進行評估。與IL-31RA/OSMR 二聚化測定相比，每個盤上的各個 IC 50值都根據參考分子BMS-981164的 IC 50進行校準。與BMS-981164 相比，完全移植 scFv以相似的效力抑制人類 IL-31和人類IL-31RA之間的相互作用。效力數據總結在表18中。
表 18：scFv抑制 IL-31和IL-31R之間相互作用的效力。 sc01：CDR 移植；sc03：完全移植。
蛋白質 ID scFv   IL-31/IL-31RA ELISA 中的效力
  植株ID   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*
PRO1632 50-09-D07-sc01   22.91 0.41
PRO1643 50-09-D07-sc03   4.58 2.04
*: IC 50, BMS-981164/IC 50, 測試樣品      
用於詳細生物物理評估的scFv的藥理學表徵和分子選擇總結
2個scFv的藥理學表徵為選擇分子以進行詳細的生物物理評估提供了基礎。基於這些結果，PRO1643 因其整體更好的性能被選中進行詳細的生物物理評估。
2.2.3 合適的抗IL-31結合域(scFv形式)的生物物理表徵
製造穩定材料
PRO1643使用與上述相同的製造程序以稍大的規模(0.25 l 表達體積)再次生產，以產生足夠的材料用於穩定性評估。樣品在pH 6.4以150 mM NaCl 於50 mM 磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中配製(50 mM NaCiP，pH 6.4)。在純化和透析後，使用具有 5MWCO 的離心濃縮管將蛋白質濃縮至 ＞10 mg/ml。
如表19 所示，在濃縮至10 mg/ml時單體損失為 0.1%。
表19：濃縮至10 mg/ml時的單體損失百分比 (SE-HPLC)。 Sc03：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 起始蛋白質含量 [%] 濃縮至 10mg/ml 後的單體含量 [%] 濃縮至 10 mg/ml 時的損失百分比
PRO1643 50-09-D07-sc03 98.3 98.2 0.1
儲存穩定性研究
對 PRO1643 進行穩定性研究，例如為期 4 週的穩定性研究，其中將 scFv 配製在10 mg/ml的水性緩衝液(最終緩衝液，50 mM NaCiP，150 mM NaCl，pH 6.4)中，並在 ＜ -80°C、4°C 和 40°C 下儲存 4 週。通過整合研究不同時間點的SE-HPLC波峰面積來評估製劑中單體和低聚物的部分。此外，通過UV 280測量在不同時間點確定蛋白質濃度。表 20 比較了研究的第 14 天(d14)和第 28 天(d28)獲得的終點測量值。
PRO1643 在 4°C 和研究的第 28 天顯示單體含量沒有顯著損失。 PRO1643在任何溫度下都沒有明顯的蛋白質含量損失。
凍融穩定性
除了上述儲存穩定性研究之外，還評估了 PRO1643 在凍融 (F/T) 循環(膠體穩定性)方面的相容性。
對於 F/T 穩定性評估，應用與儲存穩定性研究相同的分析方法 (SE-HPLC、UV-Vis) 和參數 (單體含量百分比和 百分比單體損失) 來監測3個 F/T 循環的分子。表21說明了3個 F/T 循環中以百分比表示單體含量和單體含量損失百分比的過程。由於未進行專門的凍融研究，因此在 28 天內採集的 -80°C 儲存穩定性研究樣品獲得的凍融數據如下表所示。由於每個樣品只能記錄3個時間點，因此凍融穩定性數據僅適用於3個 F/T 循環。
熱展開
PRO1643的熱展開測量已經使用差異性掃描熒光法(DSF)進行。已通過將數據擬合到波茲曼方程式來確定在最大訊號(T onset10%) 值的 10% 處計算得到的熱展開中點 (T m) 和展開起始溫度。表 22 總結了由 DSF 測量的計算出的熔化溫度。
範例3：針對多特異性形式的抗IL-4R分子的選擇和優化：
3.1. 關於選擇抗 IL-4R 結構域的一般說明
首先選擇抗IL-4R 結構域 PRO1517 (44-34-C10-sc01) 和 PRO1535 (44-34-C10-sc04)，因為它們表現出非常好的藥效學特性和可接受的良好穩定性。還選擇了 PRO1538 (44-39-B07-sc04)，儘管它具有可改進的藥理特性，因為它顯示出最佳穩定性。 PRO1517 (44-34-C10-sc01) 進行了穩定性優化，PRO1538 (44-39-B07-sc04) 進行了 pI 平衡優化，如下列3.2所示。
在最終多特異性抗體中應用的抗-IL-4R結合域顯示出對食蟹猴和狨猿的獨佔交叉反應性(exclusive cross-reactivity)。
3.2.抗IL-4R 結構域的優化
進一步優化抗 IL-4R結構域 PRO1538 (44-39-B07-sc03)和PRO1517 (44-34-C10-sc01) 以組裝成多特異性形式。
表20：在 10 mg/ml 和 -80°C、4°C 和 40°C 的溫度下的 28 天儲存穩定性研究。 Sc03：全移植。
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 溫度 [°C] 單體含量 [%] 單體變化百分比 蛋白質濃度 [mg/ml] 蛋白質含量變化百分比
d0 d14 d28 d14 d28 d0 d14 d28 d14 d28
    -80 98.2 98.3 99.2 0.1 1.0 10.6 12.4 12.1 23.2 20.4
PRO1643 50-09-D07-sc03 4 98.2 98.2 99.0 -0.1 0.7 10.6 11.9 10.3 18.4 2.6
40 98.2 97.2 97.8 -1.0 -0.4 10.6 12.1 13.0 20.6 29.1
表21：F/T 穩定性—重複凍融後單體含量的百分比和單體變化百分比。 Sc03：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 單體含量 [%] 單體變化百分比
    F/T 0 F/T 1 F/T 2 F/T 3 F/T 1 F/T 2 F/T 3
PRO1643 50-09-D07-sc03 98.2 98.2 98.3 99.2 -0.1 0.1 1.0
表22：選定 scFv結構域的DSF測量。Sc03：全移植
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] T m[°C] T onset10% [°C]
PRO1643 50-09-D07-sc03 90.4* 69.5 64.3
*用於測量的單體含量為 90.4 % 的初始材料
優化抗 IL-4R 結構域 44-39-B07-sc04 (PRO1538)
PRO1538 (44-39-B07-sc03) 在 VL和VH之間具有 pI 不平衡 (pI VL=8.2和pI VH= 5.0)。 pI 的不平衡與高黏度相關，可能對穩定性產生負面影響。因此，設計了這種分子的2個新變異體。這些變異體如下所述。簡而言之，已經詳細分析VH 中的所有殘基，旨在設計具有消除 pI 不平衡且不損害結合親和力且不引入關鍵序列責任(critical sequence liability)(化學和轉譯後修飾)、T 細胞表位等的分子。
設計了2個變異體，其總結在表23中。
然而，PRO1538 (44-39-B07-sc03) 的這些變異體並未顯示出所需的穩定性的改善。由於 PRO1538在抑制 IL-4和IL-13 誘導的訊息傳遞方面的效力明顯較低，並且在阻斷 IL-4 與 IL-4R 相互作用方面的效力比 PRO1517 低 10 倍以上，因此 PRO1538 及其變異體被被排除在進一步考慮之外，努力集中在 RPO1517 (44- 34-C10-sc01) 的改進上。
表 23：44-39-B07-sc03 的優化變異體
蛋白質 ID 構建體 優化目標 突變 VL 突變 VH
PRO2097 44-39-B07-sc05 pI 平衡 I2V, A51P, P75S, G82R, F89Y V2E, A25R, R82S, Y105F, T143R
PRO2098 44-39-B07-sc06 pI平衡 I2V, A51P, P75S, G82R, F89Y V2E, A24R, R82S, Y105F, T143R
優化抗 IL-4R 結構域 44-34-C10-sc01(PRO1517)
PRO1517 (44-34-C10-sc01) 是一種具有良好結合特性的抗 IL-4R scFv。 在生物物理表徵期間，scFv PRO1517表現出良好但仍可改進的溶解度。 努力進一步提高PRO1517的溶解度、長期穩定性和濃度行為。 因此，設計了這種分子的4個新變異體。 這些變異體如下所述。 簡而言之，已經詳細分析了 CDR 或前 VH-CH 界面中的疏水片(hydrophobic patch)，並減少了 pI 不平衡，旨在設計具有去除疏水片的分子，同時不影響結合親和力並且不引入關鍵序列責任(化學和轉譯後修飾)，T細胞表位等。
設計了4個變異體，總結在表24中。
表 24：44-34-C10-sc01 的優化變異體
蛋白質 ID 構建體 優化目標 突變 VL 突變 VH
PRO1896 44-34-C10-sc06 Solubility, stability   L12R, V103T, L144Q
PRO1897 44-34-C10-sc07 Solubility, stability Y72S  
PRO1898 44-34-C10-sc08 Solubility, stability S14R, T87R  
PRO1899 44-34-C10-sc09 Solubility, stability, affinity   L12R, V103T, L144Q + RDNSKN changed to KASST (AHo 82-87)
3.3 優化的抗 IL-4R 結合域(scFv 形式)的生物物理表徵
儲存穩定性研究
PRO1897、PRO1898 和 PRO1899 經受如上文第 1.2.3 節所述的儲存穩定性研究。結果總結在表25中。
從表25可以看出，scFvs PRO1897、PRO1898 和 PRO1899 表現出優異的儲存穩定性。在 4°C 下儲存 28 天後單體含量的損失小於 5%。此外，這些分子中沒有一個在任何溫度下顯示出蛋白質含量的顯著損失。
熱展開
PRO1897、PRO1898 和 PRO1899 的熱穩定性通過使用 NanoTemper 的奈米動態掃描熒光法 (nano dynamic scanning fluorimetry, nDSF) 進行分析，允許確定展開的開始 (T onset)、展開的中點 (T m1) 和散射開始溫度。二重複/三重複測量的 Tm1 和 Tonset 結果總結在表 26 中。從表 26 可以推斷，PRO1897、PRO1898 和 PRO1899 表現出高熔化溫度。
表25：在10mg/ml和-80°C、4°C和40°C的溫度下的28天儲存和F/T穩定性研究。
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 溫度 [°C] 單體含量 [%] 單體變化百分比 蛋白質濃度 [mg/ml] 蛋白質含量變化百分比
d0 d1 d28 d1 d28 d0 d1 d28 d1 d28
PRO1897 44-34-C10-sc07 -80 97.7 97.7* NA -0.1* NA 10.2 10.5* NA 2.2* NA
4 97.7 98 97 -0.1 -0.3 10.2 10 11 0.3 3.6
40 97.7 95 87 -2.6 -10.8 10.2 11 13 2.6 30.0
PRO1898 44-34-C10-sc08 -80 97.4 97.3* NA -0.1* NA 10.2 10.4* NA 1.8* NA
4 97.4 97 96 -0.1 -1.1 10.2 10 10 -0.3 -1.7
40 97.4 93 86 -4.4 -11.8 10.2 10 11 -1.7 9.7
    -80 98.1 98.0* NA 0.0* NA 10.5 10.7* NA 1.9* NA
PRO1899 44-34-C10-sc09 4 98.1 98 98 -0.1 0.0 10.5 10 11 -0.2 1.8
    40 98.1 97 84 -0.6 -14.3 10.5 11 13 2.9 28.8
NA: 未分析; *測量之前進行5重複F/T循環
表26：優化結構域的nDSF
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] T m1[°C] T onset[°C]
PRO1897 44-34-C10-sc07 98.0 70.4 65.7
PRO1898 44-34-C10-sc08 98.0 76.0 67.0
PRO1899 44-34-C10-sc09 98.7 71.3 64.9
3.4. 優化的抗 IL-4R 結合結構域(scFv形式)的藥效學表徵
對人類 IL-4R 的親和力
優化的抗IL-4R scFvs PRO1898 和 PRO1899 對人類IL-4R的親和力通過T200設備(Biacore, GE Healthcare)上的 SPR 分析確定，如上文第 1.2.2 節所述。 使用劑量反應多循環動力學測定法測量scFv，其中7個分析物濃度範圍為 0.12 至 90 nM，稀釋在電泳緩衝液中。 使用 1:1 結合模型擬合獲得的感應圖。
如表27 中所示，對於所有優化的 scFv，都證實了與人類 IL-4R和食蟹猴IL-4R的結合。
表27：優化的抗IL-4R scFv對人類IL-4R的親和力。
蛋白質 ID scFv 對人類 IL-4R 的親和力
植株ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1898 44-34-C10-sc08   2.15E+06 1.70E-05 7.91E-12
PRO1899 44-34-C10-sc09   2.95E+06 2.04E-05 6.92E-12
對食蟹猴 IL-4R 的親和力
使用與分析人類IL-4R親和力相同的設置測量優化的抗 IL-4R scFvs PRO1898和PRO1899 對食蟹猴IL-4R的親和力，如上文第 1.2.2 節所述，區別在於捕獲食蟹猴 IL-4R-Fc而不是人類IL-4R-Fc。 該分析的結果總結在表 28 中。
表28：優化的抗IL-4R scFv對食蟹猴IL-4R的親和力。
蛋白質 ID scFv 對食蟹猴 IL-4R 捕獲設置的親和力
植株ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1898 44-34-C10-sc08 1.20E+06 1.09E-04 9.08E-11
PRO1899 44-34-C10-sc09 1.1E+07 1.4E-04 1.2E-11
HEK-藍細胞中的 Stat-6報導基因測定(阻斷人類 IL-4 和 IL-13誘導的訊息傳遞)
如上文第 1.2.2 節所述，在HEK-藍測定中分析優化的抗 IL-4R scFvs PRO1898 和 PRO1899 的阻斷IL-4R介導的訊息傳遞的能力。 將分析分子的效力與 dupilumab 進行比較。所有效力數據總結在表29中。相對IC 50值以dupilumab和scFv的質量單位(ng/ml)計算。 優化的 scFv阻斷IL-4和 IL-13誘導的訊息傳遞，具有與 dupilumab 相似的高效力(參見第3圖)。
表29：scFvs PRO1898 和 PRO1899 在 stat-6 報導基因測定中中和 IL-4 和 IL-13 誘導的訊息傳遞的效力。
蛋白質 ID scFv   在報導基因測定中中和 hIL-4 誘導的訊息傳遞   在報導基因測定中中和 hIL-13 誘導的訊息傳遞
  植株ID   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*
Dupilumab NA   1.15 1.00   1.00 1.00
PRO1898 44-34-C10-sc08   1.00 1.15   1.15 0.87
PRO1899 44-34-C10-sc09   0.71 1.61   0.56 1.80
* IC 50, dupilumab/IC 50, 測試樣品 NA: 不適用
競爭性 ELISA(抑制 hIL-4 與 hIL-4R 結合)
使用競爭性 ELISA 確認優化的抗 IL-4R scFv PRO1898 和 PRO1899 scFv 的效力。 如第 1.2.2 節所述，通過 ELISA 評估每種 scFv 抑制人類IL-4和人類IL-4R之間相互作用的效力。類似地，對於 stat-6 報導基因測定，每個盤上的各個 IC 50值都根據參考分子dupilumab 的 IC 50進行校準。
競爭性ELISA分析的結果總結在表30中。PRO1898 和 PRO1899 的阻斷效力類似於dupilumab (參見第4圖)。
表30：scFvs PRO1898和PRO1899在競爭ELISA測定中抑制hIL-4-IL-4R相互作用的效力。
蛋白質 ID  scFv  hIL-4-IL-4R 競爭 ELISA 中的抑制 
   植株 ID IC 50 [ng/ml]  rel. IC 50* 
Dupilumab NA 6.78 1.00
PRO1898 44-34-C10-sc08 3.41 1.95
Dupilumab NA 6.18 1.00
PRO1899 44-34-C10-sc09 2.98 2.07
* IC 50, dupilumab/IC 50, 測試樣品; NA: 不適用
範例4：針對多特異性形式的抗IL31分子的選擇和優化：
4.1. 關於抗IL-31結構域選擇的一般說明
首先選擇抗 IL-31 結構域 PRO1643 (50-09-D07-sc03) 用於進一步開發，因為它表現出所需的藥效學特性以及優異的穩定性。然而，抗 IL-31 結合域 PRO1643 (50-09-D07-sc03) 的溶解度進一步提高，如下面的 4.2 所示。
在最終的多特異性抗體中應用的抗IL-31結合域確實與食蟹猴IL-31發生交叉反應。
4.2.抗IL-31 結構域的優化
進一步優化抗 IL-31結構域 PRO1643(50-09-D07-sc03) 以組裝成多特異性形式。
優化抗 IL-31結構域 50-09-D07-sc03
PRO1643 (50-09-D07-sc03) 是一種非常穩定的抗 IL-31 scFv，然而，仍然努力改進它的溶解度、長期穩定性和濃度行為。因此，設計了這種分子的新變異體。這些變異體如下所述。簡而言之，已經詳細分析了CDR或前VH-CH界面中的疏水性片，旨在設計去除疏水性片的分子，同時不影響結合親和力，也不會引入關鍵序列責任(化學和轉譯後修飾)，T 細胞表位等
設計了4個變體，總結在表 31 中。
表31：50-09-D07-sc03 的優化變體
蛋白質 ID 構建體 優化目標 突變 VL 突變 VH
PRO1900 50-09-D07-sc04 溶解度，穩定度 - L12R, V103T, L144Q
PRO1901 50-09-D07-sc05 溶解度，穩定度 - L12S, V103T, L144Q
PRO1902 50-09-D07-sc06 溶解度，穩定度 - Y59S
PRO1903 50-09-D07-sc07 溶解度，穩定 序列責任(DS) D32E -
4.3.優化的抗 IL-31結合域(scFv形式)的生物物理表徵
儲存穩定性研究
PRO1900、PRO1901、PRO1902 和 PRO1903經受如上文第 1.2.3節所述的儲存穩定性研究。除了最後一次讀數是在第 14天和 F/T 以及 -80°C下的穩定性沒有評估。結果總結在表32中。
如表 32 中總結的，scFvs PRO1900、PRO1901、PRO1902 和 PRO1903 表現出優異的儲存穩定性。在 4°C 下儲存 14 天後單體含量的損失小於 0.2%，在 40°C 下儲存 14 天後單體含量小於 3%。此外，在任何溫度和數據點，這些分子都沒有顯示出大量蛋白質含量的損失。
熱展開
PRO1900、PRO1901、PRO1902 和 PRO1903 的熱穩定性通過使用NanoTemper的奈米動態掃描熒光法 (nDSF) 進行分析，允許確定展開的開始 (T onset)、展開的中點 (T m1) 和散射起始溫度。二重複/三重複測量的 T m1和T onset結果總結在表 33 中。從表 33 可以推斷，PRO1900、PRO1901、PRO1902和PRO1903 表現出高熔化溫度。
4.4.優化的抗 IL-31 結合域(scFv形式)的藥效學表徵
對人類IL-31的親和力
PRO1643和優化的抗IL-31 scFv對人類IL-31的親和力通過在T200裝置(Biacore，GE Healthcare)上的SPR分析確定，如上文第2.2.2節所述。使用劑量反應多循環動力學測定以高通量模式測量scFv，並以兩種濃度(30 和 10 nM)在電泳緩衝液中稀釋。使用1:1結合模型擬合獲得的感應圖。
如表 34 中所示，對於所有優化的 scFv，都證實了與人類 IL-31和食蟹猴 IL-31的結合。
Path Hunter IL-31RA/OSMR 二聚化測定(阻斷人類 IL-31誘導的訊息傳遞)
通過使用 IL-31RA/OSMR 二聚化測定，測試 PRO1643 和優化的scFv抑制通過 IL-31RA/OSMR異二聚體的IL-31誘導的訊息傳遞的能力。如上所述進行測定。將分析分子的效力與 BMS-981164 進行比較。
以 BMS-981164和scFv的質量單位(ng/ml) 計算相對 IC 50值。效力數據總結在表 35 中。從表 35可以看出，PRO1643 以及優化的變體 PRO1900、PRO1901 和 PRO1903 可以有效地中和IL-31誘導的訊息傳遞。在變異體 PRO1902 中引入的用於優化溶解度和穩定性的突變顯然會破壞抑制IL-31誘導的訊息傳遞的能力。
表32：10 mg/ml 在 4°C 和 40°C 溫度下的 14 天儲存穩定性研究。
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 溫度 [°C] 單體含量 [%] 單體變化百分比 蛋白質含量 [mg/ml] 蛋白質含量變化百分比
d0 d1 d14 d1 d14 d0 d1 d14 d1 d14
PRO1900 50-09-D07-sc04 4 99.8 NA 99.8 NA 0.0 9.8 NA 10.0 NA 2.6
40 99.8 99.3 98.9 -0.5 -0.9 9.8 10.1 10.1 3.4 3.5
PRO1901 50-09-D07-sc05 4 97.0 NA 97.0 NA -0.0 10.5 NA 10.9 NA 3.6
40 97.0 96.9 96.3* -0.1 -0.7* 10.5 10.1 10.9* -3.7 4.0*
PRO1902 50-09-D07-sc06 4 98.5 NA 98.4 NA 0.0 9.3 NA 9.4 NA 0.9
40 98.5 97.2 95.8 -1.3 -2.7 9.3 9.3 9.4 0.7 1.4
PRO1903 50-09-D07-sc07 4 98.7 NA 98.7 NA -0.1 9.6 NA 10.1 NA 4.5
40 98.7 98.2 97.7 -0.5 -1.1 9.6 9.8 9.9 1.2 2.3
*前7天樣品在 25°C 而不是 40°C 下培養 NA: 為分析
表34：scFv 對人類和食蟹猴 IL-31的親和力。 sc03：完全移植，sc04 至 sc07：其他移植變異體
蛋白質 ID scFv 對人類 IL-31 的親和力 對食蟹猴 IL-31 的親和力
  Clone ID k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M) k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO1643 50-09-D07-sc03 5.79E+05 6.53E-04 1.13E-09 5.01E+05 5.87E-04 1.17E-09
PRO1900 50-09-D07-sc04 6.61E+05 5.99E-04 9.07E-10 5.54E+05 5.94E-04 1.07E-09
PRO1901 50-09-D07-sc05 5.91E+05 5.65E-04 9.56E-10 5.01E+05 5.69E-04 1.14E-09
PRO1902 50-09-D07-sc06 8.52E+05 2.46E-03 2.89E-09 7.31E+05 2.47E-03 3.38E-09
PRO1903 50-09-D07-sc07 5.24E+05 6.38E-04 1.22E-09 4.34E+05 6.05E-04 1.39E-09
表 33：優化的抗 IL-31結合域的 nDSF(scFv形式)。
蛋白質 ID 植株 ID (scFv) 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ] T m1[°C] T onset[°C]
PRO1900 50-09-D07-sc04 99.8 70.7 60.5
PRO1901 50-09-D07-sc05 97.7 69.0 52.3
PRO1902 50-09-D07-sc06 98.3 73.8 62.5
PRO1903 50-09-D07-sc07 98.9 71.1 55.6
表35：scFv在IL-31RA/OSMR二聚化測定中中和IL-31R-和IL-31-誘導的訊息傳遞的效力。 sc03：全移植，sc04 到 sc07：其他移植變異體
蛋白質 ID scFv   在 IL-31RA/OSMR 二聚化測定中中和 hIL-31 誘導的訊息傳遞
Clone ID   IC 50[ng/ml] rel. IC 50*
PRO1643 50-09-D07-sc03   8.078 0.85
PRO1900 50-09-D07-sc04   8.209 0.73
PRO1901 50-09-D07-sc05   8.071 0.78
PRO1902 50-09-D07-sc06   371.3 0.03
PRO1903 50-09-D07-sc07   7.982 1.49
*: IC 50, BMS-981164/IC 50, 測試樣品
範例5：基於Morrison-H IgG1-Fc-靜默的抗IL-4RxIL-31雙特異性抗體
5.1. Morrison-H 設計
Morrison 形式（也稱為 IgG-(scFv)2 形式）是一種二價和基於雙特異性IgG 的分子形式，包含一個 Fc 區和2個scFv結構域，這2個結構域通過連接子與重鏈（通常稱為 Morrison-H 形式(參見第2A圖)）的 C 端，或者通過連接子融合到輕鏈（通常稱為Morrison-L 格式(參見第2B圖)）的C 端。
在第一系列的抗IL-4R x IL-31雙特異性抗體中，選擇 Morrison-H 形式，其中 Fc 區源自於已被雙突變靜默的 IgG子類IgGl Leu234Ala和Leu235Ala，通常也稱為「LALA突變」。2個高度穩定的λ加帽scFvs結構域融合到重鏈C端。
總共設計了19個具有上述 Morrison-H 形式的雙特異性抗體，除了一個分子外，它們在 Fab 臂上帶有抗 IL-4R 結構域。組合了源自 5 個植株的 13 個不同的抗IL-4R結構域和源自2個植株的3個抗 IL-31結構域。這些雙特異性 Morrison-H 抗體中有9個表現出良好的藥理學特性。這些 Morrison-H 抗體總結在表 36 中。
表36：Morrison-H 分子結構概述
PRO ID Fab- 臂結構域 恆量 scFv- 結構域 連接子
PRO1929 44-34-C10-sc01 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc03 (G 4S) 4
PRO1930 44-18-C11-sc08 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc03 (G 4S) 4
PRO1982 44-18-C11-sc08 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc03 (G 4S) 2
PRO2077 44-18-C11-sc14 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
PRO2078 44-18-C11-sc18 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
PRO1973 44-39-B07-sc04 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
PRO2079 44-39-B07-sc05 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
PRO2080 44-39-B07-sc06 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
PRO1977 44-03-A03-sc04 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 (G 4S) 2
5.2. Morrison-H分子生產
使用瞬時 CHOgro表達系統(Mirus)在FreeStyle CHO-S細胞中進行多特異性構建體的表達。有興趣的基因針對哺乳動物表達進行了優化，合成並選殖到標準 pcDNA3.1載體中。表達培養物在 37°C 下使用搖瓶分批培養 6 至 7 天（細胞生存力 ＜ 70 %）。除了PRO1982、PRO2078和PRO2080在整個表達期間保持在37°C之外，表37中列出的所有分子在表達1天後將表達溫度降低至32°C。通過離心自細胞分離培養上清液，然後進行 0.22 µm 無菌過濾。通過蛋白L或A親和層析從澄清的培養物上清液中捕獲目標蛋白，然後進行粒徑篩析層析法精製步驟(如果捕穫後已經沒有可用 SE-HPLC評估的具有合適單體含量的部分)。對於製造材料的品質控制，使用了SE-HPLC、SDS-PAGE和UV 280等標準分析方法。
表37 顯示了這些分子的生產概況。在 SEC 精製步驟(SEC polishing step)後，所有分子的最終單體含量 ＞ 98%。
表37：Morrison-H 分子的生產概覽
蛋白質 ID 形式 Fab- 臂結構域 scFv- 結構域 捕獲後表達力價 [mg/l] 最終力價 [mg/l] 純度 SE-HPLC [ 單體百分比 ]
PRO1929 Morrison-H 44-34-C10-sc01 50-09-D07-sc03 33.2 19.4 99.2
PRO1930 Morrison-H 44-18-C11-sc08 50-09-D07-sc03 16.9 7.4 98.4
PRO1982 Morrison-H 44-18-C11-sc08 50-09-D07-sc03 22.9 14.2 98.2
PRO2077 Morrison-H 44-18-C11-sc14 50-09-D07-sc04 19.1 11.6 99.4
PRO2078 Morrison-H 44-18-C11-sc18 50-09-D07-sc04 18.6 9.7 98.9
PRO1973 Morrison-H 44-39-B07-sc04 50-09-D07-sc04 37.2 18* 98.1
PRO2079 Morrison-H 44-39-B07-sc05 50-09-D07-sc04 43.1 19.6 99.4
PRO2080 Morrison-H 44-39-B07-sc06 50-09-D07-sc04 34.4 16.3 99.2
PRO1977 Morrison-H 44-03-A03-sc04 50-09-D07-sc04 21.8 11.8* 98.5
*計算/外推值，因為並非所有材料都用於精製步驟
5.3.生物物理和藥理學表徵
9個多特異性分子(即PRO1929、PRO1930、PRO1982 及其改進的變異體 PRO2077 和 PRO2078； PRO1973及其改進的變異體 PRO2079 和PRO2080；和 PRO1977)被選擇用於進一步表徵。
對9個分子進行擴展的生物物理表徵(extended biophysical characterization)以確定製程和配方發展的適用性。這些分子的特點是通過一系列方法來評估熔化和聚集溫度、濃度超過 150 g/l 時的溶解度、在 4° 和 25°C 下 2 週後單體含量的損失、流體動力學半徑和電荷變異體以及蛋白質修剪(clipping) 的增加。溶解度也通過 PEG 篩選進行評估。對於 PRO1929，測定了單體含量的損失和流體動力學半徑的增加。
基於這些結果，PRO2077、PRO2080、PRO1977、PRO1929 是最好的構建體。它們分別具有抗 IL-4R結構域44-18-C11-sc14、44-39-09-sc06、44-03-A04-sc03和44-34-C10-sc01以及抗 IL-31結構域50-09-D07-sc04。所有分子均達到150 g/l的預期目標濃度。就在4°C和25°C儲存期間的單體穩定性而言，PRO1929和PRO2080具有最佳特性。在化學穩定性和製程發展方面，PRO2077 和 PRO2080 表現出良好的 pH 穩定性和低電荷變異體複雜性。
從藥理學的角度來看，與dupilumab相比，PRO2077顯示出2 倍的阻斷IL-4和IL-13誘導的訊息傳遞的效力。該分子中的抗 IL-4R 結構域不與食蟹猴IL-4R 發生交叉反應。 PRO2080、PRO1977 和 PRO1929 阻斷 IL-4R訊息傳遞的效力比 dupilumab 低約2至3倍。基於強結合性的結合，PRO2080 和 PRO1977 似乎顯示出與食蟹猴 IL 4R 的交叉反應性。 PRO1929 的一個變異體可以作為替代物。當與 PRO2080和PRO1977相比時，PRO1929 對食蟹猴IL-4R表現出強烈的交叉反應性，並具有相似的抑制 IL-4R訊息傳遞的效力。所有分子均能有效阻斷IL-31誘導的訊息傳遞，並且與食蟹猴 IL-31 具有交叉反應性。此外，所有分子對兩個人類靶標都表現出皮莫耳(picomolar)親和力。
範例6：基於Morrison-H和Morrison-L IgG4的抗IL-4R x IL-31雙特異性抗體
6.1. Morrison形式設計
在第二系列抗 IL-4R x IL-31雙特異性抗體中，選擇了 Morrison-H 和 Morrison-L 形式，其中 Fc 區來源於IgG 子類 IgG4。2個高度穩定的λ加帽scFvs結構域融合到重鏈 (Morrison-H) 或輕鏈 (Morrison-L) 的 C 端。
基於食蟹猴交叉反應性、優異的效力和優異的生物物理性質，優先考慮包括PRO1929家族的IL-4R和IL-31結構域的構建體。
PRO1929家族IL-4R結合劑的2個變異體包括在上述分子的重新格式化中，它們是44-34-C10-sc08和44-34-C10-sc09。所有構建體都包含相同的IL-31結合域，且這是50-09-D07-sc04。
總共設計了7個 IgG4-(scFv)2 分子，4個 Morrison-H 分子和3個 Morrison-L 分子。如表38 (Morrison-H) 和表 39 (Morrison-L) 中所示，將源自一個植株的2個不同抗 IL-4R結構域和一抗 IL-31結構域組合。
表38：IgG4 Morrison-H 構建體
PRO ID Fab- 臂結構域 恆量 scFv- 結構域
PRO2198 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04
PRO2199 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04
PRO2200 50-09-D07-sc04 IgG4 (S228P) 44-34-C10-sc08
PRO2201 50-09-D07-sc04 IgG4 (S228P) 44-34-C10-sc09
表 39：IgG4 Morrison-L 構建體
PRO ID Fab- 臂結構域 恆量 scFv- 結構域
PRO2206 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07_sc04
PRO2207 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07_sc04
PRO2208 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07_sc04
6.2.通過 SPR 評估結合親和力和特異性
對人類和食蟹猴 IL-4R 的親和力
雙特異性 Morrison-H (PRO2198, PRO2199) 和 Morrison-L (PRO2206, PRO2207) 分子與重組人類 IL-4R 蛋白 (具His Tag的ECD, Sino Biological) 的結合動力學(包括親和力)為通過 T200 設備（Biacore，Cytiva）上的 SPR 分析確定。在這個 SPR 實驗中，Morrison分子通過共價固定到羧甲基化葡聚醣表面(CM5感測晶片；Biacore，Cytiva)的抗人類IgG-Fc抗體（人類抗體捕獲試劑盒(Human Antibody Capture Kit)；Biacore，Cytiva）和一系列滴定的人類IL-4R ECD作為分析物注入。在每個分析物注射循環之後，再生感測晶片(MgCl 2)，隨後重新捕獲新的Morrison抗體。使用多循環動力學測定法 (multi-cycle kinetic assay) 測量與人類 IL-4R 的結合動力學，在電泳緩衝液(HEPES 緩衝鹽水，0.05% Tween-20，pH 7.5)中稀釋 0.175 至 45 nM 的9個分析物濃度。表觀解離 (k d) 和締合 (k a) 速率常數和表觀解離平衡常數 (K D) 使用 Biacore 分析軟體(Biacore 評估軟體版本 3.2，Cytiva)使用一對一的Langmuir 結合模型和品質計算基於 Chi2 和 U 值監測擬合，這是曲線擬合品質的測量。結合水平計算為標準化為理論 Rmax 所達到的最大穩定性結合。使用與分析人類 IL-4R 動力學相同的設置測量與食蟹猴 IL-4R 的交叉反應性，不同之處在於使用重組食蟹猴 IL-4R(帶有 His-tag 的 ECD，Acro Biosystems)蛋白作為分析物代替人類 IL-4R。
如表40所示，Morrison-H 和 Morrison-L 抗體證明了與人類 IL-4R 的高親和力結合。計算的 K D值在 291 pM 至 48 pM 範圍內非常相似，Morrison-H 抗體 PRO2198 與人 類IL-4R 結合的親和力為 291±136 pM。受試分子對食蟹猴 IL-4R 的動力學親和力也相似(209 至 11 pM)，對 PRO2198 Morrison-H 抗體測得的親和力為 144±49 pM，因此證明了所有分子對 IL-4R 的交叉反應性食蟹猴起源。
對人類和食蟹猴 IL-31 的親和力
雙特異性 Morrison-H (PRO2198, PRO2199) 和 Morrison-L (PRO2206, PRO2207) 分子與重組人類 IL-31 蛋白(Peprotech)的結合動力學(包括親和力)通過 SPR 分析在T200 設備(Biacore，Cytiva)上確認。在這個 SPR實驗中，Morrison 抗體被注射到固定有人類重組IL-4R 蛋白(帶有Fc Tag 的ECD，R&D Systems)的羧甲基化葡聚醣表面(CM5感測晶片；Biacore，Cytiva)上，並注射了一系列滴定的人類 IL-31作為分析物。使用單循環動力學測定法測量對人類 IL 31 的親和力，注射5個連續分析物濃度，在電泳緩衝液(HEPES 緩衝鹽水，0.05% Tween-20，pH 7.5)中稀釋，濃度範圍為 0.05 至 30 nM，無需在分析物注入後再生感測晶片的表面。動力學和表觀解離平衡常數(KD)的計算以及曲線擬合品質的測量如上文對 IL-4R 所述進行。結合水平計算為標準化至理論 Rmax所達到的最大穩定性結合。使用與分析人類IL-31親和力相同的設置測量與食蟹猴 IL-31的交叉反應性，不同之處在於使用重組食蟹猴 IL-31(帶有 His Tag 的 ECD，Sino Biological)蛋白作為分析物代替人類 IL-31。
用於測量與重組 IL-31 的結合動力學的 SPR 設置的先決條件是通過固定的人類 IL-4R 捕獲 Morrison-H 和 Morrison-L 抗體。所有先前測試的 Morrison 抗體都顯示出與固定的人類 IL-4R 的穩定結合，因此該設置被證明是有效的。使用這種 SPR 設置的邏輯依據是保證捕獲的 Morrison 分子的均勻取向，同時最大限度地減少 IL-31 結合位點的空間位阻。
在顯示出通過重組人類 IL-4R蛋白穩定捕獲Morrison抗體後，注射 IL-31 作為分析物並計算 IL-31 與捕獲的Morrison分子結合的動力學。如表 41 所示，所有測試的 Morrison-H 和 Morrison-L 分子以相似的親和力(分別為 152 至 52 pM 和 169 至 103 pM)與人類 IL-31和食蟹猴 IL-31結合。 PRO2198 Morrison-H 抗體與人類 IL-31 結合，計算的 K D為 52±18 pM，與重組食蟹猴 IL-31 蛋白的結合親和力為 10±1 pM，因此證實了良好的交叉反應性。
與人類IL-4R和IL-31以及與食蟹猴 IL-4R和IL-31的伴隨結合(concomitant binding)
通過在T200裝置 (Biacore, Cytiva)上的 SPR 分析評估 Morrison-H 和 Morrison-L 抗體的伴隨結合。如上所述，由於抗體的同質分子方向以及最小IL-31 結合位點的空間位阻，Morrison抗體與 IL-31(人類和食蟹猴)的結合在通過 IL-4R 相互作用捕獲到感測晶片表面時最好測量。因此，通過將 Morrison 抗體注射到固定有人類重組 IL-4R 蛋白 (Fc Tag , R&D Systems) 在羧甲基化葡聚醣表面(CM5 感測晶片；Biacore，Cytiva)之上，然後注射單一高濃度(45 nM)人類IL-31作為分析物，來評估受試的Morrison對於人類IL-4R和人類IL-31兩者的伴隨結合。 PRO2199、PRO2206 和 PRO2207 的伴隨結合在如上所述的人類 IL-31的動力學測量期間通過使用來自以 45 nM 注射人類IL-31的結合水平進行評估。除了使用固定在感測晶片表面上的重組食蟹猴 IL-4R(帶有 His-tag 的 ECD，Acro Biosystems)和使用重組食蟹猴IL-31 (帶有 His-tag 的 ECD, Sino Biological)蛋白作為分析物之外，與人類IL-4R和人類IL-31類似地測量PRO2198與食蟹猴IL-4R和食蟹猴IL-31的伴隨結合。
對於所有測試的 Morrison 抗體(即PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207)藉由SPR證明與人類 IL-4R和人類IL-31的伴隨結合，如第5圖中PRO2198的示例所示。對於PRO2198，還顯示了與食蟹猴 IL-4R和食蟹猴 IL-31的伴隨結合(參見第5圖)。
表40：Morrison抗體與人類IL-4R和食蟹猴IL-4R的結合動力學
蛋白質 ID Fab 臂 scFv 結構域 藉由 SPR 測量的親和力
  植株ID 植株ID 抗原 k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 人類IL-4R 3.52E+05 1.01E-04 2.91E-10
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 人類IL-4R 2.93E+05 5.76E-05 1.97E-10
PRO2206 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 人類IL-4R 4.09E+05 1.95E-05 4.77E-11
PRO2207 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 人類IL-4R 2.44E+05 4.61E-05 1.89E-10
             
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-4R 3.70E+05 4.90E-05 1.44E-10
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 食蟹猴 IL-4R 9.80E+05 3.44E-05 3.51E-11
PRO2206 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-4R 1.16E+05 2.42E-05 2.09E-10
PRO2207 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-4R 2.53E+06 2.77E-05 1.10E-11
表 41：Morrison 抗體與人類IL-31和食蟹猴 IL-31的結合動力學
蛋白質 ID Fab 臂 scFv 結構域 藉由 SPR 測量的親和力
  植株ID 植株ID 抗原 k a(M -1s -1) k d(s -1) K D(M)
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 人類IL-31 2.75E+05 1.60E-05 5.20E-11
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 人類IL-31 2.51E+05 1.75E-05 6.97E-11
PRO2206 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 人類IL-31 2.20E+05 2.36E-05 1.07E-10
PRO2207 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 人類IL-31 1.63E+05 2.47E-05 1.52E-10
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-31 9.92E+04 ＜ 1.00E-05 1.03E-10
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-31 8.10E+04 ＜ 1.00E-05 1.23E-10
PRO2206 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-31 5.93E+04 ＜ 1.00E-05 1.69E-10
PRO2207 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 食蟹猴IL-31 6.09E+04 ＜ 1.00E-05 1.64E-10
6.3.與人類或食蟹猴 IL-4R表達細胞 (FACS) 結合
為了測試 Morrison-H 和 Morrison-L 抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207 與人類或食蟹猴 IL-4R表達HEK293T細胞的結合，使用 Lipofectamine3000以人類和食蟹猴 IL-4R 質體和模擬質體(mock plasmid)轉染HEK293T細胞。與融合到人類和食蟹猴 IL-4R表達構建體的 N 端的靶向 V5 標籤的抗體的結合將證實兩種靶標的成功表達，因此用作質膜結合的陽性對照。 Morrison H分子PRO2077用作食蟹猴 IL-4R 結合的陰性對照，因為該分子未顯示出與食蟹猴 IL-4R 的任何交叉反應性(參見第 5.3 節)。
將每孔50,000個轉染的HEK293T細胞接種在 96 孔板中。 Morrison-H和Morrison-L抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207以及與食蟹猴IL-4R不發生交叉反應的對照分子PRO2077的5倍系列稀釋液以 5,000至0.32 ng/ml的濃度添加到盤上並在4°C 的振盪器上培養 60 分鐘。去除上清液並添加檢測試劑用於流式細胞術分析。計算單細胞APC熒光強度的幾何平均值(geometric mean)。
所有效力數據總結在表 42 中。來自重複分析的平均相對 IC 50值以pM表示。Morrison-H和Morrison-L抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207在轉染的HEK293T細胞上與人類和食蟹猴IL-4R有效結合(參見第6圖 )。
6.4.抑制人類IL-4和IL-13訊息傳遞的效力評估(HEK-Blue™ IL-4/IL-13細胞stat-6報導基因測定)
HEK-藍測定已用於測試 Morrison-H 和Morrison-L抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207通過 IL-4R抑制IL 4和IL-13誘導的訊息傳遞的能力。 4R。每孔50,000個細胞接種在 96 孔盤中。在存在 0.05 ng/ml IL-4 或 0.3 ng/ml IL-13的情況下，將濃度範圍為100至0.002 ng/ml的 Morrison分子和參考抗體dupilumab的三倍系列稀釋液添加到盤中。在 37°C 和 5% CO 2下培養 24 小時後，將上清液轉移到新盤上，並使用Quanti-Blue基質對分泌的胚胎鹼性磷酸酶進行定量。還測試Morrison-H 和Morrison-L 抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207在測定培養基中用過量的 IL-31(10 nM) 制 IL-4誘導的訊息傳遞。
所有效力數據總結在表 43(IL-4/IL-4R 抑制)和表44(IL 13/IL-4R抑制)中。來自重複分析的平均相對 IC 50值也以 pM 表示。 Morrison-H和Morrison-L抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207有效阻斷IL-4(或IL-13)與 IL-4R之間的相互作用，具有與 dupilumab相當的效力(請參見第7圖)。當IL-31與 Morrison-H 分子的抗 IL-31 結構域結合時，有效的IL-4R阻斷得以維持(參見第8圖)。
6.5. 抑制人類IL-31誘導的受體二聚化的效力評估（PathHunter® eXpress IL31RA/OSMRb 測定）
PathHunter IL-31RA/OSMRb 二聚化測定
在 IL-31RA/OSMR 二聚化測定中，Morrison-H 和 Morrison-L 抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207通過IL-31RA/OSMR異二聚體抑制IL-31誘導的訊息傳遞的能力進行了評估。每孔10,000個細胞接種在 96孔盤中。第二天，在存在10 ng/ml IL-31的情況下，將濃度範圍為1,000 至0.2 ng/ml的分子和對照抗體BMS-981164的3倍系列稀釋液添加到盤中。在 37°C 和 5% CO 2下培養6小時後，加入檢測溶液，將盤再培養1小時並測量發光。還用測定培養基中過量的 IL-4R (50 nM)測試所有抗體對 IL-31 誘導的訊息傳遞的抑制。
抑制人類IL-31
在表 45 中，顯示所有效力數據的總結。重複分析的平均相對IC 50值以pM表示。與BMS-981164相比，所有Morrison-H和Morrison-L抗體均以相似的效力抑制IL-31誘導的訊息傳遞。當抗 IL-4R結構域與IL-4R結合時，IL-31與IL-31R相互作用的有效阻斷得以維持(見第9圖)。
抑制食蟹猴IL-31
為了評估對食蟹猴IL-31誘導的訊息傳遞的抑制，如上所述使用IL-31RA/OSMR二聚化測定，不同之處在於使用10 ng/ml食蟹猴 IL-31 而不是10 ng/ml人類IL-31，並且僅測試Morrison-H抗體 PRO2198 和 PRO2199的抑製作用。PRO2198和PRO2199均有效阻斷食蟹猴IL-31和人類 IL-31RA之間的相互作用(見第10圖)。
6.6.同時抑制人類IL-4和IL-31訊息傳遞的效力評估(BEAS-2B 測定；CCL2)
為了評估 Morrison-H 抗體 PRO2198 和 PRO2199 同時抑制 IL-4和IL-31誘導的訊息傳遞的效力，使用BEAS-2B(人類支氣管上皮) 細胞的基於細胞的測定係以用於讀取的三明治ELISA(Sandwich ELISA)實施。在該測定中，兩種訊息傳遞的阻斷導致BEAS-2B細胞分泌CCL2減少。
將每孔25,000 個細胞接種在 100 μl 生長培養基中的 96 孔盤中，並在 37°C 和 5% CO 2下培養過夜。第二天，洗滌細胞並加入1 ng/ml IL-4 和10 ng/ml IL-31，以及連續稀釋的dupilumab和BMS-981164或Morrison-H抗體PRO2198或PRO2199的組合。然後將細胞培養24小時，收集上清液，並通過改編自商業試劑盒的夾心三明治ELISA測量分泌的CCL-2的濃度。
BEAS-2B測定是允許評估IL-4和IL-31的組合抑制的唯一可用測定。與 dupilumab和BMS-981164的組合相比，PRO2198和PRO2199都能夠以相似的效力同時阻斷IL-4和IL-31訊息傳遞。它們達到與參考分子組合相當的抑制水平(參見第1圖)。
6.7.抑制人類IL-4誘導的人類PBMC亞群上的CD23上調(upregulation)的效力評估
人類PBMC用於評估IL-4誘導的單核細胞以及天然(naïve)和記憶B細胞中CD23的上調。根據改編的Leucosep方案，使用具有集成多孔屏障和梯度密度離心的Leucosep管從新鮮全血中分離人類PBMC。
將每孔400,000個PBMC接種在100 ml測定培養基中的 96 孔盤中。在存在 2 ng/ml IL-4 的情況下，Morrison-H抗體PRO2198和PRO2199、參考抗IL-4R IgG4抗體 PRO2209和PRO2210(其沒有連接抗IL-31 scFv結構域)和參考抗體 dupilumab的三倍系列稀釋是以濃度範圍 10,000至0.169 ng/ml添加到盤中。在 37°C 和 5% CO 2下培養48小時後，使用小鼠抗人類CD19-PE、小鼠抗人類CD14-PerCP/Cy5.5、小鼠抗人類CD14-PerCP/Cy5.5 和小鼠抗人 CD23-APC 染料對PBMC進行染色以進行流式細胞術分析。在 FACS分析之後，圈選的(gated)CD23單核細胞、CD23天然 B細胞和CD23記憶B細胞的幾何平均值用於計算。使用GraphPad Prism軟體應用四參數邏輯 (four-parameter logistic, 4PL)曲線擬合來計算抑製曲線的 IC 50值。
PBMC測定數據總結在表46中。不同捐血者獲得的IC 50值以皮莫耳顯示。與 dupilumab 相比，Morrison-H 抗體PRO2198和PRO2199以及參考IgG4抗體PRO2209和PRO2210在抑制IL-4誘導的單核細胞、天然和記憶 B細胞中CD23上調方面顯示出相似的效力。當被格式化為未連接抗IL-31結構域的IgG4分子時，與 dupilumab 相比，這些分子以相同的效力阻斷IL-4誘導的訊息傳遞(參見第11圖)。因此，添加抗IL-31結構域對IL-4抑制效力幾乎沒有影響。
6.8.抑制人類全血中人類IL-4誘導的TARC產生的效力評估
為了確定抑制IL-4誘導的胸腺活化調節的趨化因子 (TARC，也稱為 CCL17)分泌的效力，使用基於商業 ELISA作為讀數的全血測定。兩種訊息傳遞路徑的阻斷導致全血中TARC水平降低。
將收集在含有抗凝劑 EDTA的無菌管中的全人類週邊血用於測定。將每孔160 µl的64,800至1.10 pM的dupilumab、PRO2198或PRO2199 連續稀釋液添加到具有1 ng/ml IL-4或1 ng/ml IL-13的圓底孔的 96孔盤中。在每孔加入40 µl全血後，將盤在37°C和5% CO 2下培養24小時。第二天，將盤以1,000 g離心10 分鐘，收集上清液並在 -20°C下冷凍。然後使用來自R&D systems的人類TARC/CCL17 DuoSet ELISA試劑盒分析上清液，並確定 TARC水平。
用來自三個不同供體的血液對IL-4誘導的TARC分泌進行 TARC測定。 PRO2198和PRO2199中和人類全血中IL-4誘導的TARC，其效力與dupilumab相當，即IC 50值小於500 pM。
範例 7：生物物理表徵
對Morrison-H 和Morrison-L抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207進行一些生物物理表徵程序。研究了以下生物物理特性： 1.識別(identity)確認 2. 多 pH 壓力研究 a.     化學穩定性和電荷異質性 b.熱穩定性 3. 高濃度可行性(High concentration feasibility, HCF)研究
7.1. 識別確認：
質量測定
通過使用ESI-MS的完整質量分析來分析質量。所有測試的 Morrison-H 和 Morrison-L 抗體(即PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207) 顯示了輕鏈和重鏈的預期質量。此外，重鏈顯示出預期的糖基化。每種 Morrison 抗體的測定質量顯示在表47中。
表42：在轉染的HEK293T細胞上與人類和食蟹猴IL-4R的血漿膜結合。
        人類 IL-4R 食蟹猴 IL-4R
        EC 50 rel. IC 50 EC 50 rel. IC 50
PRO ID Fab- 臂結構域 恆量 scFv- 結構域 [nM] rel. EC 50(EC 50V5 抗體 / EC 50 樣品 ) [nM] rel. EC 50(EC 50V5 抗體 / EC 50 樣品 )
PRO2198 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 1.11 3.31 0.97 21.56
PRO2199 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 0.85 4.33 1.78 11.73
PRO2206 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 0.83 4.46 0.90 23.18
PRO2207 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 0.60 6.15 0.65 32.22
PRO2077 44-18-C11-sc14 kappa/IgG1 (靜默) 50-09-D07-sc04 0.60 6.18 沒有結合 沒有結合
表 43：在測定培養基中沒有和有IL-31的情況下之Morrison-H 和Morrison-L抗體在stat-6報導基因分析中中和人類IL-4誘導的訊息傳遞的效力。 N=重複分析的次數。
平均 IC 50 平均 rel. IC 50 有和沒有 IL-31 過量之保留的 IC 50(n=1)
PRO ID Fab- 臂結構域 scFv- 結構域 [pM] [IC 50dupilumab/ IC 50 樣品 ] [IC 50, 沒有 IL-31/IC 50, 有 IL-31] ng/ml 數值
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 23.9** 0.42 0.71
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 11.5** 0.72 1.25
PRO2206* 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 11.8 0.45 未測量
PRO2207* 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 9.4 0.52 未測量
* IC 50或相對IC 50(單次分析)/NA:不適用 ** 平均值
表44：在stat-6報導基因測定中Morrison-H和Morrison-L分子中和人類IL-13誘導的訊息傳遞的效力。N=重複分析的次數。
平均 IC 50 平均 rel. IC 50
PRO ID Fab- 臂結構域 scFv- 結構域 [pM] [IC 50dupilumab/ IC 50 樣品 ]
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 22.1** 0.42
PRO2199* 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 11.3 0.69
PRO2206* 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 29.5 0.26
PRO2207* 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 12.6 0.62
* IC 50或相對IC 50(單次分析)/NA: 不適用 **平均值
表45：Morrison-H和Morrison-L分子在IL-31RA/OSMR二聚化測定中中和人IL-31誘導的信號傳導的效力，培養基中沒有和有IL-4R。N=重複分析的次數。
      平均 IC 50 平均 rel. IC 50 有和沒有 IL-4R 過量之保留的 IC 50(n=1)
PRO ID Fab- 臂結構域 scFv- 結構域 [pM] [IC 50BMS-981164/ IC 50sample] [IC 50, 沒有 IL-4R/IC 50, 有 IL-4R] ng/ml 數值
PRO2198 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 198 0.70 1.02
PRO2199 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 142 0.61 0.90
PRO2206* 44-34-C10-sc08 50-09-D07-sc04 230 0.65 未測量
PRO2207* 44-34-C10-sc09 50-09-D07-sc04 215 0.55 未測量
* IC 50或相對IC 50(單次分析)/NA: 不適用
表46：Morrison抗體中和人類PBMC上IL-4誘導的CD23表達的能力
          單核細胞   天然 B 細胞 記憶 B 細胞
PRO ID Fab- 臂結構域 恆量 scFv- 結構域 捐血者 IC 50[pM] [IC 50 dupilumab/ IC 50 樣品 ] IC 50[pM] [IC 50 dupilumab/ IC 50 樣品 ] IC 50[pM] [IC 50 Dupilumab/ IC 50 sample]
PRO2198 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 1 90.37 0.11 1366 0.31 4470 0.14
PRO2199 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 1 69.74 0.15 1099 0.38 2531 0.25
PRO2206 44-34-C10-sc08 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 2 110.5 0.12 1480 0.45 4339 0.13
PRO2207 44-34-C10-sc09 IgG4 (S228P) 50-09-D07-sc04 3 *54.47 0.02 1036 0.12 1580 0.20
*近似值，擬合曲線時應用的頂部限制
表47: 在還原條件下發現的每個 Morrison 抗體的輕鏈和重鏈質量
以 [Da] 表示的質量 PRO2198  PRO2199  PRO2206  PRO2207 
計算的質量 輕鏈(LC) 23582 23458 51028 50904
偵測的質量 23580 23453 51019 50895
計算的質量 重鏈 (HC) 77368.8 77169 49923 49743
偵測的質量 主要物種 78798 (+1429) 78618 (+1429) 51358 (+1435) 51179 (+1436)
評語 HC: 未完全還原和糖基化 LC: 未完全還原 HC: 未完全還原和糖基化 LC: 未完全還原 HC: 未完全還原和糖基化 LC: 未完全還原 HC: 未完全還原和糖基化
糖基化模式
更詳細地分析 PRO2198 和 PRO2199 的糖基化模式。 兩種分子都顯示出相似的糖基化。 各個重鏈的相對糖基化的近似值顯示在表48 中。兩個分子都主要用G0F糖進行糖基化。 還發現了較低量的 G1F和G2F。 沒有觀察到重鏈的非糖基化質量。
表48：重鏈糖基化的類型和相對豐度
糖基化 PRO2198 PRO2199
G0F (+1445 Da) 65% 65%
G1F (+1608 Da) 30% 30%
G2F (+1770 Da) 5% 5%
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS page)
在還原和非還原條件下通過 SDS-PAGE 額外分析了 Morrison-H 和 Morrison-L 抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207 的識別(參見第12圖)。
對於 Morrison-H 分子，在還原和非還原條件下均觀察到預期的條帶。在還原條件下觀察到一些HC二聚體，可能是由於鏈間二硫化物的不完全還原。
在Morrison -L分子的情況下，所有預期的條帶在還原和非還原條件下都是可見的，並且代表最突出的種類。在還原條件下觀察到一個介於37 kDa和50 kDa之間的額外條帶，表明LC或HC在所選條件下沒有完全變性或還原。在75 kDa和100 kDa之間運行的條帶可能源自LC二聚體。在非還原條件下，可以看到 LC 和 LC二聚體。對於 IgG 分子，已知 LC和LC二聚體是可溶的，並且可以使用通用純化過程呈現。
7.2.多 pH 壓力研究：
多pH壓力研究的目的是檢查 Morrison-H和Morrison-L抗體 PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207的化學和熱穩定性。將分子透析到pH為3.5、5、7 和8.5的20 mM MES/醋酸鹽/Hepes緩衝液中。在後三種條件下，樣品在 40°C 下培養10天以強制化學降解，例如氧化和剪切。pH3.5是一種會導致快速降解和水解的苛刻壓力條件，因此這些樣品在25°C下培養10天。通過CEX-HPLC分析電荷變異體的形成，並通過SDS-PAGE研究剪輯(clipping)。分子以1mg/ml的濃度培養。通過 nDSF (NanoTemper) 分析熱穩定性，確定展開的開始 (T onset)、展開的中點 (T m1) 和聚集的開始 (T Scattering)。
電荷變異體輪廓(profile)
在後來的 DSP開發過程中，高產率的純化是一項重要措施。用於純化IgG類分子的主要技術之一是離子交換層析法。因此，在離子交換純化步驟的開發過程中，通過CEX-HPLC 顯示出高目標純度的IgG抗體可能不太具有挑戰性。
所有測試的抗體(即PRO2198、PRO2199、PRO2206 和 PRO2207 )表現出可比的複雜性(電荷異質性)，其中 Morrison-L分子的複雜性略低於Morrison-H分子。此外，基於 IL-4R植株sc09的分子PRO2199和 PRO2207具有略高的目標純度。
總之，所有分子在通用純化過程之後顯示出低電荷異質性，而沒有顯著差異。
電荷變異體的形成
在pH 3.5、pH 5、pH 7 和 pH 8.5的20 mM MES/醋酸鹽/Hepes 緩衝液中培養後，針對PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207分析電荷變異體的形成。特別重要的是在pH 5和pH 7下的化學穩定性，因為這些pH值定義後期配方空間的近似限制。表49顯示獲得的結果。在 pH值為5時，所有分子都表現出良好的化學降解穩定性。對於較高的 pH 值，形成酸性變異體的化學降解增加。除 PRO2206 外，所有分子均表現出相似的穩定性，其在 pH 8.5 時具有較高的靶標損失。在 pH 3.5 時，僅觀察到少量化學降解。
表49：不同pH下電荷變異體的形成( #1在pH 3.5下的儲存溫度為 25°C)
以 [rel. %] 表示的值 PRO2198 PRO2199 PRO2206 PRO2207
t0 76.4 81.4 78.1 84.1
Δ40°C 儲存 10 天後的標靶變化(ΔTarget) #1
pH 3.5 3.1 1.9 1.0 1.3
pH 5.0 1.1 0.2 -1.0 -0.7
pH 7.0 -5.5 -7.2 -6.8 -7.2
pH 8.5 -12.9 -11.8 -22.0 -15.5
藉由SDS-PAGE分析剪輯
使用SDS-PAGE分析來分析所有蛋白質的剪輯(參見第13圖)。 對於任何Morrison抗體，在 pH 3.5、pH 5和pH 7下均未觀察到片段化。在pH 8.5下，僅觀察到 PRO2198和PRO2199的HC很少片段化。雖然沒有觀察到Morrison-L分子的HC剪輯，但它可能被緊密運行的LC覆蓋。
總之，所有分子都顯示出良好的抗剪輯性。
熱穩定性
在pH壓力研究中，分析PRO2198、PRO2199、PRO2206和 PRO2207在pH 3.5和pH 8.5之間的熱穩定性。確定了熱展開以及熱聚集的開始。在熱展開過程中，由於分子的多結構域的結構，所有分子都顯示出不止一次的過度(transition)。 為簡單起見，僅顯示第一個熔點中點。 表 50 總結了結果。
表50：熱穩定性
pH PRO2198 PRO2199 PRO2206 PRO2207
藉由nDSF之熱展開的開始(T onset) [°C]
3.5 45.6 43.4 42.4 40.9
5 55.4 55.1 55.8 56.3
7 60.5 59.3 58.7 57.5
8.5 59.7 58.3 57.0 55.1
藉由nDSF之第一次展開過度的中點(T m1) [°C]
3.5 50.7 50.6 49.7 50.0
5 62.9 62.8 62.1 62.0
7 66.9 66.7 66.2 66.1
8.5 66.5 66.2 65.1 65.1
藉由nDSF之聚集的開始(T scattering) [°C]
3.5 未觀察到聚集
5 未觀察到聚集
7 73.5 71.6 72.2 69.0
8.5 71.4 68.4 68.8 65.2
對於所有分子，展開的開始(T onset)以及第一熔點(T m1)在 pH 7時最高。pH值8.5的變化僅略微降低熱穩定性。接近酸性pH值時，熱穩定性降低。然而，在 pH值為5時，所有展開的起始溫度均高於55°C。在pH值3.5 時，熱穩定性降低至低於50°C 的T onset。
僅在pH 7和pH 8.5下觀察到熱聚集。在酸性 pH 值(pH 3.5和 pH 5.0)下，所有Morrison抗體均未形成較大的聚集體，即使在未折疊狀態下也是如此。在中性和鹼性pH值下，聚集開始高於第一熔點，表明非天然聚集機制。
儘管分子之間的差異並不顯著(substantially)，但PRO2198總體上具有最高的穩定性。這在pH 3.5時最為突出，與PRO2207相比，T onset高 5°C。該 pH 值與病毒去活化步驟的生產過程相關。
7.3.高濃度研究
對於濃度可行性測試，PRO2198 配製在兩種配方緩衝液中： 配方緩衝液F1：20 mM醋酸鹽，pH 5.5； 配方緩衝液F2：20 mM檸檬酸鹽和50 mM氯化鈉(NaCl)，pH 5.5。
溶解度 - 蛋白質濃度
PRO2198可以濃縮到100mg/ml以上，沒有沉澱跡像或達到溶解度極限。此外，PRO2198 沒有顯示出可檢測到的蛋白質濃度降低，即PRO2198具有足夠的可溶性，可在4°C和25°C下達到並保持高於100 mg/ml的目標濃度至少 4 週。
不同溫度下的單體穩定性
PRO2198 配製在F1和F2中並濃縮至＞100 mg/ml。濃縮樣品在4°C、25°C和 40°C下保存長達 4 週。在不同的時間點，通過SE-HPLC分析單體含量。結果總結在表51中。
表51：濃度 ＞100 mg/ml時PRO2198的單體穩定性
儲存溫度 [°C] 時間 [ 週 ] 配方 F1 配方 F2
單體 [rel. %] 單體 [rel. %]
絕對值 (Absolut) 變化量 (Delta) 絕對值 (Absolut) 變化量 (Delta)
N/A 0 99.0 0.0 99.1 0.0
4.0 4 98.1 -0.9 98.3 -0.8
25.0 4 96.1 -2.9 96.2 -2.9
40.0 2 83.1 -15.9 82.0 -17.1
4 72.4 -26.6 70.9 -28.2
7.4.用於Morrison-H和Morrison-L抗體的生物物理表徵的一般方法
緩衝液交換
通過透析進行緩衝液交換。抗體在Spectra Pro 3透析膜 (Spectrum Laboratories)中用至少200倍過量的透析緩衝液進行透析。
濃縮抗體
使用具有10 kDa或30 kDa的截留分子量(MWCO)的離心濃縮器濃縮抗體。樣品在22°C下以 5分鐘的步驟離心，直至達到目標濃度。在步驟之間，樣品被重新懸浮。
蛋白質濃度的測定
使用Tecan盤式分析儀(plate reader)和NanoQuant盤測定蛋白質樣品的濃度。緩衝液用作空白(blank)，從280 nm處測量的吸光度中減去。每次測量都針對在310 nm處測定的可見粒子引起的散射進行校正。將校正值標準化為1 cm的路徑長度，並使用相應蛋白質的理論消光係數計算蛋白質濃度。對於濃度高於10 mg/ml的蛋白質樣品，將樣品在相應的緩衝液中稀釋至少10倍或稀釋至1 mg/ml標稱濃度。
SDS-PAGE
SDS-PAGE在還原條件下進行。變性和還原後，將 5 µg樣品施加於梯度凝膠上(4 %~20 %)。分離後，蛋白質條帶用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色，凝膠用純淨水脫色。
儲存
為了評估蛋白質在不同溫度下的穩定性，將樣品在 4°C、25°C 和 40°C 下培養。在標稱溫度為4°C 的冰箱中進行4°C 的儲存。為了在 25°C和40°C下儲存，樣品被放置在濕度分別控制為65% rH和75% rH的櫃子中。
nanoDSF 的熱展開
使用熱位移測定法的熱展開通過Sypro Orange的熒光強度變化來確定。染料的熒光對疏水相互作用敏感。隨著蛋白質展開，疏水性胺基酸暴露於溶劑中，導致Sypro Orange的熒光增強。由此產生的熱展開中點 (Tm) 以及在最大訊號的10%處計算的起始溫度（Tonset 是以下溫度：最小訊號 + 0.1*(最大訊號 -最小訊號)）是通過擬合數據為波茲曼方程式來確定。
SE-HPLC測定的單體含量
單體含量通過分析性粒徑篩析層析法使用50 mM 磷酸鈉、300 mM NaCl、pH 6.5 中運行的Shodex KW403-4F柱進行測定。為進行分析，注入5 µg樣品並在280 nm處記錄吸收。樣品的質量以單體、HMWS和LMWS 的相對百分比表示。
陽離子交換高效液相色譜 (CEX-HPLC)
對於電荷變異體的量化，應用分析性陽離子交換層析。在 MAbPac™ SCX-10柱上分析樣品。使用從 pH 4到pH 10的pH梯度分離電荷變異體。為了分析，注入30 µg樣品並在 280 nm處記錄吸收。樣品的品質表示為目標、酸性電荷變異體和鹼性電荷變體的相對百分比。
質譜法
為了鑑定和排除嚴重的轉譯後修飾，測定Morrison抗體的完整質量。在ESI-MS分析之前用DTT對樣品進行還原、脫鹽並在 MeOH:2-PrOH:0.2% FA (30:20:50) 中進行分析。樣品的奈米ESI-MS分析在 Syn-apt G2-Si質譜儀上進行。然後通過應用最大熵演算法(maximum entropy algorithm) MaxEnt1 (MaxLynx)將記錄的m/z數據反褶積成質譜，其中輸出質量的解析度(resolution)為0.5 Da/通道和半高為0.7 Da的均勻高斯損傷模型(Uniform Gaussian Damage Model)。
CH:重鏈恆定區 CL:輕鏈恆定區 IgG:免疫球蛋白G VH:可變重鏈結構域 VL:可變輕鏈結構域
第1圖顯示與dupilumab和BMS-981164的組合相比，Morrison-H分子PRO2198和PRO2199在BEAS-2B測定中抑制IL-4R-和IL-31誘導的訊息傳遞的效力。當與dupilumab和BMS-981164的組合相比，PRO2198和PRO2199顯示出相似的抑制IL-4R和 IL-31誘導的訊息傳遞的效力(A)。通過單獨添加dupilumab或 BMS-981164單獨阻斷IL-4R或IL-31的效果低於聯合阻斷IL-4R 和IL-31誘導的訊息傳遞(B)。 第2圖顯示IgG4 Morrison-H形式(左)和Morrison-L形式(右)與標記的子結構域命名法的示意圖；連接Fv結構域(淺灰色)的連接子序列由不同重複的(G 4S)模組所組成(恆定區和scFv結構域之間的兩個模組與VL2和VH2之間的4個模組)。 第3圖顯示優化的抗IL-4R scFvs PRO1898和PRO1899在HEK-藍(HEK-Blue)細胞中Stat-6報導基因測定中的IL-4R阻斷人類IL-4誘導的訊息傳遞(A)和人類IL-13誘導的訊息傳遞(B)的效力。將分析分子的效力與dupilumab進行比較。 第4圖顯示通過競爭性ELISA評估的優化的抗IL-4R scFvs PRO1898(A)和PRO1899(B)抑制人類IL-4和人類IL-4R之間相互作用的效力。 第5圖顯示Morrison抗體PRO2198與人類IL-4R/人類IL-31和食蟹猴IL-4R/食蟹猴IL 31的伴隨結合(concomitant binding)。上圖：實驗設計的示意圖；下圖：顯示 PRO2198 與人類IL-4R/人類IL-31(深灰色)和食蟹猴IL-4R/食蟹猴IL-31(淺灰色)的伴隨結合的感應圖。 第6圖顯示Morrison-H(MorrH)和Morrison-L(MorrH)分子PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207以及陰性對照分子PRO2077在轉染的HEK293T細胞上與人類IL-4R(A)和食蟹猴IL-4R(B)的結合。所有分子與人類IL-4R結合(A)。對於對照分子 PRO2077，未觀察到與食蟹猴 IL-4R 的結合(B)。一種靶向V5標籤(V5 Tag)的抗體與人類和食蟹猴IL-4R表達構建體的N端融合，用作質膜結合的陽性對照。 第7圖顯示在stat-6報導基因測定中Morrison-H(MorrH)和Morrison-L(MorrL)抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207中和人類IL-4和人類IL-13誘導的訊息傳遞的效力。對於IL-4誘導的訊息傳遞(A和C)和IL-13誘導的訊息傳遞(B和D)，Morrison-H和Morrison-L抗體阻斷 IL-4R 的效力與 dupilumab相當。第5A至5D圖中描述的IC 50值代表單點測量值。 第8圖顯示在stat-6報導基因測定中於測定培養基中有或沒有過量IL-31的情況下之Morrison-H(MorrH)抗體PRO2198(A)和PRO2199(B)中和人類IL-4誘導的訊息傳遞的效力。在過量的 IL-31 存在下沒有觀察到效力損失。第6A 和6B圖中描述的IC 50值代表單點測量值。 第9圖顯示在IL-31RA/OSMR二聚化測定中於有或沒有過量測定培養基中的IL-4R胞外結構域的情況下，Morrison-H (MorrH)和Morrison-L(MorrL)抗體PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207中和人類IL-31誘導的訊息傳遞的效力。與 BMS-981164相比，Morrison抗體以相似的效力阻斷 IL-31和IL-31RA之間的相互作用(A和B)。在存在過量IL-4R的情況下，沒有確定效力損失(C和D)。 第10圖顯示在IL-31RA/OSMR二聚化測定中Morrison-H抗體PRO2198和PRO2199中和食蟹猴IL-31誘導的訊息傳遞的效力。抗體PRO2198和PRO2199能夠阻斷食蟹猴IL-31和IL-31RA之間的相互作用。 第11圖顯示缺乏IL-31 scFv結合域的Morrison-H分子PRO2198和PRO2199以及相應的抗IL-4R IgG4分子PRO2209和PRO2210阻斷人類PBMC中IL-4和IL-13誘導的CD23表達的效力。與 dupilumab相比，PRO2198和PRO2199在人類單核細胞(A)、天然(naïve) B細胞(B)和記憶 B 細胞(C)中抑制IL-4和IL-13誘導的 CD23上調(upregulation)，具有相似的效力。與dupilumab相比，PRO2209和PRO2210顯示出相同的抑製作用。 第12圖顯示PRO2198、PRO2199、PRO2206和PRO2207在還原和非還原條件下的SDS-Page分析。 第13圖顯示SDS-PAGE的剪輯(clipping)分析。第1泳道：標記(marker)–第2泳道：pH 3.5，t0–第3泳道：pH 3.5，t10d–第4泳道：pH 5，t0–第5泳道：pH 5，t10d–第6泳道：pH 7，t0d– 第7泳道：pH 7，t10d–第8泳道：pH 8.5，t0–第9泳道：pH 8.5，t10d。 *據推測，HC二聚體的不完全還原。 #大概是LC的不完全還原。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
CH:重鏈恆定區
CL:輕鏈恆定區
IgG:免疫球蛋白G
VH:可變重鏈結構域
VL:可變輕鏈結構域

Claims (18)

  1. 一種多特異性抗體，包括： a)  特異性結合於IL-4R的一或兩個IL-4R結合域(IL4R-BD)，以及 b)  特異性結合於IL-31的一或兩個IL-31結合域(IL31-BD)， 其中 - 該多特異性抗體包括一免疫球蛋白Fc區； - 各該IL-4R結合域包括： SEQ ID NO: 1的HCDR1序列， SEQ ID NO: 2的HCDR2序列， SEQ ID NO: 3的HCDR3序列， SEQ ID NO: 7的LCDR1序列， SEQ ID NO: 8的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 9的LCDR3序列；以及 -    各該IL31結合域包括： SEQ ID NO: 12的HCDR1序列， SEQ ID NO: 13的HCDR2序列， SEQ ID NO: 14的HCDR3序列， SEQ ID NO: 17或18的LCDR1序列， SEQ ID NO: 19的LCDR2序列，和 SEQ ID NO: 20的LCDR3序列。
  2. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該免疫球蛋白Fc區選自於IgG子類，特別是選自於IgG子類IgG1及 IgG4，特別是選自於IgG4。
  3. 如請求項2所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體的形式選自二價雙特異性IgG形式、三價雙特異性IgG形式和四價雙特異性IgG形式； 更特別地，其中該多特異性抗體的形式選自基於KiH的IgG； DVD-Ig；CODV-IgG和Morrison(IgG CH 3-scFv融合 (Morrison-H)或IgG CL-scFv融合(Morrison-L))，甚至更特別地來自DVD-Ig和Morrison (IgG CH 3-scFv融合 (Morrison-H)或IgG CL-scFv融合(Morrison-L))。
  4. 如請求項3所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體的形式選自Morrison形式。
  5. 如前述請求項之任一項所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體包括該兩個IL4R結合域和/或該兩個IL31結合域。
  6. 如請求項5所述之多特異性抗體，其中該些IL4R結合域位於Fab臂中，該些IL31結合域位於該Morrison形式的scFv部分中。
  7. 如請求項4至6之任一項所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體的形式選自Morrison-L形式和Morrison-H形式，特別是Morrison-H形式。
  8. 如前述請求項之任一項所述之多特異性抗體，其中該些IL-4R結合域和該些IL-31結合域更包括VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4。
  9. 如請求項8所述之多特異性抗體，其中該些IL-4R結合域和該些IL31結合域為scFv形式時包括： (i)VL結構域，包括一VL框架，該VL框架包括框架區FR1、FR2和FR3以及框架FR4，該框架區FR1、FR2 和FR3選自Vκ亞型，特別是選自Vκ1和Vκ3亞型，特別是Vκ1亞型，且該框架 FR4選自Vκ FR4和Vλ FR4，特別是包含與選自SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：33的胺基酸序列具有至少70%、80%、90%同一性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別是Vλ FR4選自 SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 33中的任一個，特別是根據 SEQ ID NO: 26或33的Vλ FR4。
  10. 如前述請求項之任一項所述之多特異性抗體，其中該些IL4R結合域包括 a) 與選自SEQ ID NO: 4、5和6的任一胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性的VH序列；及 b) 與選自 SEQ ID NO: 10和11的任一胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性的VL序列， 特別地，其中該IL4R結合域包括 a) SEQ ID NO: 4的VH序列和SEQ ID NO: 11的VL序列；或者 b) SEQ ID NO: 5的VH序列和SEQ ID NO: 10的VL序列；或者 c) SEQ ID NO: 6的VH 序列和SEQ ID NO: 10的VL序列。
  11. 如前述請求項之任一項所述之多特異性抗體，其中該些IL31結合域包括 a) 與選自SEQ ID NO：15 和 16 的任一胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%同一性的VH 序列；和 b)與選自SEQ ID NO：21和22的任一胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列， 特別是其中該IL31結合域包括 a) SEQ ID NO: 15的VH序列和SEQ ID NO: 22的VL序列；或者 b) SEQ ID NO: 16的VH序列和SEQ ID NO: 21的VL序列。
  12. 如前述請求項之任一項所述之多特異性抗體，其中該兩個IL4R結合域中的至少其一和該兩個IL31結合域中的至少其一能夠同時結合於各自的抗原。
  13. 一種或兩種核酸，編碼請求項1至12中任一項所述的多特異性抗體。
  14. 一種或兩種載體，包括如請求項13所述之該一種或兩種核酸。
  15. 一種或多種宿主細胞，包括如請求項14所述的該一種或兩種載體。
  16. 一種用於產生如請求項1至12之任一項所述之多特異性抗體的方法，包括(i)提供如請求項13所述的該一種或兩種核酸，或如請求項14所述的該一種或兩種載體，表達該一種或兩種核酸，或表達該一種或兩種載體，並從表達系統收集該多特異性抗體，或(ii)提供如請求項15所述的該一種或多種宿主細胞，培養該一種或多種宿主細胞；及從細胞培養物中收集該多特異性抗體。
  17. 一種醫藥組合物，包括如請求項1至12之任一項所述之多特異性抗體和藥學上可接受的載體。
  18. 如請求項1至12之任一項所述之多特異性抗體，用於治療選自過敏性疾病、發炎性疾病和自體免疫性疾病的疾病，尤其是選自引起瘙癢的過敏性疾病、引起瘙癢的發炎性疾病和引起瘙癢的自體免疫性疾病的疾病，特別是來自異位性皮膚炎、急性過敏性接觸性皮膚炎、慢性自發性蕁麻疹、大皰性類天皰瘡、斑禿、皮肌炎、結節性癢疹、牛皮癬和異位性氣喘；特別是其中該疾病是異位性皮膚炎。
TW110148468A 2020-12-23 2021-12-23 對於介白素－４受體及介白素－３１具特異性之多特異性抗體 TW202241966A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPEP20216957.9 2020-12-23
EP20216957.9A EP4019547A1 (en) 2020-12-23 2020-12-23 Multispecific antibodies having specificity for il-4r and il-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202241966A true TW202241966A (zh) 2022-11-01

Family

ID=73857084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110148468A TW202241966A (zh) 2020-12-23 2021-12-23 對於介白素－４受體及介白素－３１具特異性之多特異性抗體

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP4019547A1 (zh)
JP (1) JP2024501811A (zh)
KR (1) KR20230125238A (zh)
CN (3) CN116888151A (zh)
AU (1) AU2021405058A1 (zh)
CA (1) CA3205036A1 (zh)
CL (1) CL2023001888A1 (zh)
CO (1) CO2023009615A2 (zh)
CR (1) CR20230309A (zh)
DO (1) DOP2023000130A (zh)
EC (1) ECSP23053070A (zh)
IL (1) IL303174A (zh)
TW (1) TW202241966A (zh)
WO (1) WO2022136669A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL310962A (en) 2021-08-23 2024-04-01 Regeneron Pharma Methods for treating atopic dermatitis by administering an IL-4R antagonist
US20230220089A1 (en) 2021-12-30 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist
US20240034798A1 (en) 2022-07-08 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating eosinophilic esophagitis by administering an il-4r antagonist
WO2024061279A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Biosion Inc. Recombinant bispecific antibodies targeting tslp and il4r

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2006504971A (ja) 2002-11-01 2006-02-09 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・コロラド，ア・ボディー・コーポレイト マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析によるタンパク質アイソフォームの定量的解析
RU2009111884A (ru) * 2006-09-01 2010-10-10 Займоджинетикс, Инк. (Us) Последовательности вариабельных областей моноклональных антител против il-31 и способы использования
PL2892927T3 (pl) 2012-09-07 2018-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby leczenia atopowego zapalenia skóry przez podawanie antagonisty IL-4R
EP3459968A1 (en) 2017-09-20 2019-03-27 Numab Innovation AG Novel stable antibody variable domain framework combinations
CN111494625B (zh) * 2018-12-25 2022-06-21 江苏荃信生物医药股份有限公司 用于治疗il-4和/或il-13介导的信号转导相关的疾病的药物组合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP4019547A1 (en) 2022-06-29
CO2023009615A2 (es) 2023-08-28
WO2022136669A1 (en) 2022-06-30
CN116848134A (zh) 2023-10-03
CA3205036A1 (en) 2022-06-30
EP4267613A1 (en) 2023-11-01
CR20230309A (es) 2023-10-09
DOP2023000130A (es) 2023-09-15
ECSP23053070A (es) 2023-08-31
CN116940596A (zh) 2023-10-24
IL303174A (en) 2023-07-01
KR20230125238A (ko) 2023-08-29
CL2023001888A1 (es) 2023-12-15
CN116888151A (zh) 2023-10-13
AU2021405058A1 (en) 2023-06-29
JP2024501811A (ja) 2024-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP4019547A1 (en) Multispecific antibodies having specificity for il-4r and il-31
JP2020535799A (ja) 新規の安定した抗体の可変領域フレームワークの組み合わせ
US20240043547A1 (en) Antibody variable domains that bind il-31
TW202128753A (zh) 抗tslp抗體及其用途
KR20230166075A (ko) Ror1 및 cd3에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체
EP4019546A1 (en) Antibody variable domains that bind il-31
CN114286827B (zh) 人源化抗il17a抗体及其应用
JP6784775B2 (ja) ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の一価阻害剤
US20200283528A1 (en) Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof
TW202229337A (zh) 犬抗體變異體
EP4019090A1 (en) Antibody variable domains that bind il-4r
US20210395379A1 (en) Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof
EP3689907A1 (en) Antibodies targeting il-17a and methods of use thereof
US20220127350A1 (en) Multispecific antibodies having specificity for tnfa and il-17a, antibodies targeting il-17a, and methods of use thereof
TWI839395B (zh) 靶向cd137的抗體及其使用方法