JP2024501811A - Ｉｌ－４ｒ及びｉｌ－３１に対する特異性を有する多重特異性抗体 - Google Patents

Ｉｌ－４ｒ及びｉｌ－３１に対する特異性を有する多重特異性抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）と、ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）とを含む多重特異性抗体に関し、ここで前記多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含む。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸に、前記核酸を含むベクターに、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞に、及び前記多重特異性抗体を産生する方法に関する。さらに本発明は、前記多重特異性抗体を含む医薬組成物及びその使用方法に関する。

Description

本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）と、ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）とを含む多重特異性抗体であって、免疫グロブリンＦｃ領域を含む前記多重特異性抗体に関する。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記多重特異性抗体を産生する方法に関する。さらに、本発明は、前記多重特異性抗体を含む医薬組成物、及びその使用方法に関する。
インターロイキン－４受容体ＩＬ－４Ｒα（本明細書ではＩＬ－４Ｒ又はＩＬ４Ｒとも呼ばれる）は、Ｉ型受容体である。これは、共通サイトカイン受容体のガンマ鎖（γｃ）との直接相互作用により、又はＩＩ型受容体、特にＩＩ型受容体ＩＬ－１３Ｒα１と受容体複合体を形成することにより、インターロイキン４（ＩＬ－４）に結合する。このＩＬ－４Ｒ／ＩＬ－１３Ｒα１受容体複合体は、インターロイキン４（ＩＬ－４）並びにインターロイキン１３（ＩＬ－１３）に結合して、Ｂ細胞におけるＩｇＥ抗体産生を調節する。ＩＬ－４ＲへのＩＬ－４の結合はマクロファージを活性化し、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）の分化を促進し、Ｔｈ２による炎症を引き起こすことがさらに知られている。ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３がＩＬ－４Ｒα／γｃ及び／又はＩＬ－４Ｒ／ＩＬ－１３Ｒα１に結合すると、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）１、ＪＡＫ２、シグナル伝達物質、及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、及びＳＴＡＴダイマー化が活性化され、これにより、特定の遺伝子の転写が誘導される。
ＩＬ－４Ｒシグナル伝達は、多くのヒト疾患、例えばアトピー性皮膚炎、結節性痒疹、鼻ポリープ症、慢性蕁麻疹、喘息、慢性閉塞性肺疾患などの炎症性疾患や自己免疫疾患と関連していることが示されている。
サイトカインＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３又はＩＬ－４Ｒに結合することによってＩＬ４Ｒ媒介シグナル伝達を低減又は遮断するいくつかのモノクローナル抗体が、そのような疾患の治療に関する先行技術に記載されている。例えば、Regeneron Pharmaceuticals と Sanofi Genzymeによって開発されたデュピルマブ（dupilumab）（Dupixent（登録商標））は、ＩＬ－４Ｒに結合してこれに拮抗し、中等度から重度のアトピー性皮膚炎の治療及び鼻ポリープ症を伴う慢性副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）の治療に承認されている。また、これは成人及び青年の持続性喘息の治療についても評価されている。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、強い掻痒（例えば重度のかゆみ）及び鱗状で乾燥した湿疹性病変を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患である。重度の疾患は、重大な心理的問題、顕著な睡眠不足、生活の質の低下などにより、非常に困難な状態に陥り、高い社会経済的コストをもたらす可能性がある。ＡＤは多くの場合、５歳未満の小児期に始まり、成人期まで持続する場合がある。
ＡＤの病態生理学は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介感作、免疫系、及び環境因子の間の複雑な相互作用により影響される。主要な皮膚欠陥は、ＩｇＥ媒介感作を引き起こす免疫障害となる場合があり、遺伝的突然変異と局所炎症の両方の結果である上皮バリア機能不全を伴う可能性がある。
ＡＤの典型的な治療法には、局所ローション及び保湿剤、局所コルチコステロイド軟膏、クリーム、又は注射が含まれる。しかし、ほとんどの治療選択肢は、一時的で不完全な症状の軽減しか提供しない。さらに、中等度から重度のＡＤ患者の多くは、局所コルチコステロイドやカルシニューリン阻害剤による治療に抵抗性を示す。従って、ＩＬ４Ｒ機能に拮抗するモノクローナル抗ＩＬ４Ｒ抗体などのＡＤの治療及び／又は予防のための、より標的化された治療法が開発されている。
例えば、国際公開第２０１４／０３９４６１号は、アトピー性皮膚炎の治療に使用するための抗ＩＬ４Ｒ拮抗抗体を記載している。
さらに、既に上述したように、抗ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体デュピルマブ（Dupixent（登録商標））は、２０１７年に中等度から重度のアトピー性皮膚炎について、そして２０１８年に喘息について米国食品医薬品局から承認を受けた。
ただし、抗ＩＬ－４Ｒ療法には重大な限界がある。例えば、対象となるアトピー性疾患におけるそれらの有効性は多くの場合限定的であり、応答率は低から中程度であることがよくある。さらに、抗ＩＬ－４Ｒ療法はかゆみに直接対処するものではない。しかし、かゆみは、皮膚に関連する炎症性疾患や自己免疫疾患、例えばＡＤの場合などの一般的な症状である。かゆみを伴う掻き傷は、一般に炎症を促進し、疾患に関連した症状を悪化させる。従って、中等度から重度のアトピー性皮膚炎やその他のかゆみを引き起こす炎症性疾患や自己免疫疾患を抱えている患者のための、さらなる治療選択肢が決定的に必要とされている。
さらに詳しくは、前記アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患において、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１３を介するシグナル伝達活性をより効率的に低減又は排除することができるが、さらにこれらの疾患に伴うかゆみ症状（掻痒）にも対処できる、新規かつ改良された治療用抗体に対する明らかな必要性がある。
前記治療用抗体は、用量制限副作用を低レベルに保つために、高い効力と許容できる安全性プロフィールを有していなければならない。これは、典型的には前記治療用抗体の長期適用を必要とする慢性疾患の治療の場合に特に重要である。さらに、前記治療用抗体は、開発可能性及び高収率での生産性を促進するために、高い安定性などの優れた生物物理学的特性を有することが望ましい。特に、皮下注射用途の高濃度製剤の調製を可能にするために、これらは高濃度で良好な保存安定性を有していなければならない。皮下注射は非常に望ましく、患者が自分で薬を適用できるようにするために必要な前提条件である。
本発明の目的は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患の治療を改善するための薬剤を提供すること、特に、中等度から重度のアトピー性皮膚炎などの掻痒を引き起こす炎症性疾患及び自己免疫疾患の新規で優れた治療法を提供することである。さらに詳しくは、本発明の目的は、前記疾患におけるＩＬ－４及びＩＬ－１３媒介活性を効率的に低減又は除去することができ、またこれらの病気に関連しているかゆみ症状にも対処することができる、新規かつ改良された治療用抗体を提供することである。本発明のさらなる目的は、前記新規かつ改良された治療用抗体が、皮下注射による適用を可能にする１００ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度で高い安定性を示すことである。
驚くべきことに本発明者らは、１つ又は２つのＩＬ－４Ｒ拮抗結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）及び１つ又は２つのＩＬ－３１中和結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）を含む多重特異性抗体が、ＩＬ－４／ＩＬ－１３並びにＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を非常に効率的な方法で同時に遮断でき、これが、ＩＬ－４／ＩＬ－１３関連の症状並びにかゆみ関連のＩＬ－３１活性の同時軽減を可能にすることを発見した。
さらに驚くべきことに本発明者らは、多くの異なる抗体フォーマットの試験を通じて、前記抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１多重特異性抗体が、機能的Ｆｃ領域、特に機能的Ｆｃ領域を含むＩｇＧ領域を含む場合、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断することができ、かつ非常に有利な生物物理学的特性、特に優れた安定性を備えており、これが、１００ｍｇ／ｍｌをはるかに超える抗体濃度でも保存安定のある製剤の調製を可能にすることを見いだした。所望の組み合わせ特性、すなわち所望の高い阻害効力と同時に所望の高い保存安定性を示さなかった試験されたフォーマットは、特に、ＭＡＴＣＨ３、ｓｃＭＡＴＣＨ３、（ｓｃＦｖ）２Ｆｃ（ｓｃＦｖ）２、及びモリソンＩｇＧ１（サイレンス化）であった。これらの多重特異性抗体フォーマットは集中的に試験された。試験されたＭＡＴＣＨ３及びｓｃＭＡＴＣＨ３ベースの多重特異性抗体は良好な安定性を示したが、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１媒介シグナル伝達の阻害には有効性がなかった。試験された（ｓｃＦｖ）２Ｆｃ（ｓｃＦｖ）２ベースの多重特異性抗体は、改善された阻害効力を示したが、１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度で長期間保存した場合、中程度の安定性しかなかった。一方、試験したサイレンス化ＩｇＧ１モリソンベースの多重特異性抗体は高濃度で優れた保存安定性を示したが、所望の阻害効力に完全には到達しなかった。所望の阻害効力のためには、機能的なＦｃ領域、特に機能的なＩｇＧ領域が必要であると結論づけられた。
従って、第１の態様において、本発明は、以下を含む多重特異性抗体に関する：
ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及び
ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）、
ここで、多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域、特にＩｇＧ領域を含む。
第２の態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸に関する。
第３の態様において、本発明は、本発明の前記核酸又は前記２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクターに関する。
第４の態様において、本発明は、本発明の前記ベクター又は前記２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞に関する。
第５の態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体を産生する方法であって、（ｉ）本発明の核酸もしくは２つの核酸、又は本発明のベクターもしくは２つのベクターを提供し、前記核酸もしくは前記２つの核酸、又は前記ベクターもしくは複数のベクターを発現させ、及び発現系から前記多重特異性抗体を収集する工程、又は（ｉｉ）本発明の１つの宿主細胞もしくは複数の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞もしくは前記複数のベクターを培養し、及び細胞培養物から前記多重特異性抗体を収集する工程を含む、上記方法に関する。
第６の態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
第７の態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の多重特異性抗体に関する。
第８の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患、特に炎症性疾患、及び自己免疫性疾患の治療に使用するための本発明の多重特異性抗体に関する。
第９の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療方法であって、本発明の多重特異性抗体をそれを必要とする患者に提供する工程を含む上記方法に関する。
以下の項目に要約される本発明の態様、有利な特徴、及び好ましい実施態様は、それぞれ単独で又は組み合わせて、本発明の目的の解決にさらに貢献する。
１．ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、特に２つの同一のＩＬ４Ｒ－ＢＤ、及び
ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）、特に２つの同一のＩＬ３１－ＢＤを含む多重特異性抗体であって、
免疫グロブリンＦｃ領域、特に機能的Ｆｃ領域を含む、上記多重特異性抗体。
２．項目１に記載の多重特異性抗体であって、ここで、
－ 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１のＨＣＤＲ１配列、
配列番号２のＨＣＤＲ２配列、
配列番号３のＨＣＤＲ３配列、
配列番号７のＬＣＤＲ１配列、
配列番号８のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号９のＬＣＤＲ３配列を含み；並びに
－ 前記ＩＬ３１－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１２のＨＣＤＲ１配列、
配列番号１３のＨＣＤＲ２配列、
配列番号１４のＨＣＤＲ３配列、
配列番号１７又は１８のＬＣＤＲ１配列、
配列番号１９のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号２０のＬＣＤＲ３配列を含む、上記多重特異性抗体。
３．前記多重特異性抗体のフォーマットが、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）２融合体（ＡＤＡＰＴＩＲ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、DART（商標）、及びTRIDENT（商標）から選択される、項目１又は２に記載の多重特異性抗体。
４．ＩｇＧ領域を含む、項目１又は２に記載の多重特異性抗体。
５．前記多重特異性抗体のフォーマットが、２価二重特異性ＩｇＧフォーマット、３価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び４価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択される、項目４に記載の多重特異性抗体であって、
特に、ここで前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、例えばＣＯＤＶ－ＩｇＧ、モリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖と軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、及びＴｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）から選択され、
より詳しくは、ここで前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ、及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から、さらにより詳しくはＤＶＤ－Ｉｇ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）、又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される、上記多重特異性抗体。
６．前記多重特異性抗体のフォーマットがモリソンフォーマットから選択される、項目５に記載の多重特異性抗体。
７．２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む、項目１～６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
８．２つのＩＬ３１－ＢＤを含む、項目１～７のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
９．ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及び
ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）を含む、項目１に記載の多重特異性抗体であって、
ここで、前記多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含み、特にここで、前記多重特異性抗体のフォーマットはモリソンフォーマットから選択され、
及び、ここで
－ 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１のＨＣＤＲ１配列、
配列番号２のＨＣＤＲ２配列、
配列番号３のＨＣＤＲ３配列、
配列番号７のＬＣＤＲ１配列、
配列番号８のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号９のＬＣＤＲ３配列を含み、並びに
－ 前記ＩＬ３１－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１２のＨＣＤＲ１配列、
配列番号１３のＨＣＤＲ２配列、
配列番号１４のＨＣＤＲ３配列、
配列番号１７又は１８のＬＣＤＲ１配列、
配列番号１９のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号２０のＬＣＤＲ３配列を含む、上記多重特異性抗体。
１０．ＩＬ４Ｒの拮抗剤として作用する、項目１～９のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
１１．ＩＬ４ＲへのＩＬ４及びＩＬ１３の結合を遮断する、項目１０に記載の多重特異性抗体。
１２．インターロイキン３１受容体アルファ（ＩＬ－３１ＲＡ）／オンコスタチンＭ受容体（ＯＳＭＲ）複合体（ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲ複合体）へのＩＬ－３１の結合を遮断する、項目１～１１のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
１３．ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液中で調製した場合、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、特に少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する、項目１～１２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
１４．項目１～１２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液中で調製した場合、ＳＥクロマトグラフィーで測定すると、１００ｍｇ／ｍｌ以上、特に１００～２００ｍｇ／ｍｌ、特に１００～１５０ｍｇ／ｍｌに濃縮することができ、モノマー含有量の損失が２％未満、特に１％未満である、上記多重特異性抗体。
１５．項目１～１２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液中で調製された場合、１００ｍｇ以上、特に１００～１５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、少なくとも９５％、特に少なくとも９７％のモノマー含有量を有する、上記多重特異性抗体。
１６．項目１から１２に記載の多重特異性抗体であって、前記多重特異性抗体の開始濃度が１００ｍｇ／ｍｌである場合、特に、前記多重特異性抗体がｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液中で調製される場合、４℃で４週間保存した後、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満である、上記の多重特異性抗体。
１７．項目１～１６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、１μｇ／ｍｌの多重特異性抗体の存在下で、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３１で処理されたＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＣＣＬ２分泌量が、未処理のＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＣＣＬ２分泌量と比較すると、減少しているか又は１．００～１．５０倍、特に１．００～１．４倍、特に１．００～１．３０倍、特に１．００～１．２０倍だけ増加するのみである、上記多重特異性抗体。
１８．免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４、特にＩｇＧ４から選択される、項目１～１７のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
１９．ＩＬ４Ｒ－ＢＤがＦａｂアーム内に位置し、ＩＬ３１－ＢＤがモリソンフォーマットのｓｃＦｖ部分に位置する、項目６に記載の多重特異性抗体。
２０．多重特異性抗体のフォーマットが、モリソン－Ｌ及びモリソン－Ｈフォーマットから選択され、特にフォーマットがモリソン－Ｈフォーマットである、項目６及び１９のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２１．項目１～２０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－４Ｒに、０．１～２００ｐＭの１価の解離定数（ＫＤ）、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）（Marmoset）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｇ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、４℃で４週間保存した後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、及び／又は
ｉ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、５回の凍結融解サイクル後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、好ましくは２％未満であり、及び特に、前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される、上記多重特異性抗体。
２２．前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を含み、特にＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を含む、項目１～２１のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２３．前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下を含む、項目１～２２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
（ｉ）フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、並びにフレームワークＦＲ４を含むＶＬドメインであって、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、Ｖκサブタイプ、特にＶκ１及びＶκ３サブタイプから選択され、特にＶκ１サブタイプであり、並びに前記フレームワーク領域ＦＲ４は、Ｖκ ＦＲ４及びＶλ ＦＲ４から選択され、特に、配列番号２６～配列番号３３から選択されるＶλ ＦＲ４配列と少なくとも７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４であり、より詳しくは配列番号２６～配列番号３３から選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号２６又は配列番号３３によるＶλ ＦＲ４である、上記ドメイン。
２４．項目１～２３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
ａ）配列番号４、５、及び６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＨ配列と、
ｂ）配列番号１０及び１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＬ配列とを含む、上記多重特異性抗体。
２５．前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
ａ）配列番号４、５、及び６から選択されるＶＨ配列と、
ｂ）配列番号１０及び１１から選択されるＶＬ配列とを含む、項目１～２４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２６．前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
ａ）配列番号４のＶＨ配列と配列番号１１のＶＬ配列；又は
ｂ）配列番号５のＶＨ配列と配列番号１０のＶＬ配列；又は
ｃ）配列番号６のＶＨ配列と配列番号１０のＶＬ配列を含む、項目１～２５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２７．項目１～２６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、前記ＩＬ３１－ＢＤが：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－３１に、５ｎＭ以下の１価の解離定数（ＫＤ）、特に５ｐＭ～５ｎＭの、特に５ｐＭ～２ｎＭの、特に５～１０００ｐＭの１価の解離定数（ＫＤ）で結合し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ－３１と交差反応性であり、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－３１に、５ｎＭ以下の１価ＫＤ、特に５ｐＭ～５ｎＭ、特に５ｐＭ～２ｎＭ、特に５～１０００ｐＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｃ．ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を、Ｐａｔｈ Ｈｕｎｔｅｒ ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂダイマー化アッセイで測定すると、０．１～３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～２０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｄ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－３１のヒトＩＬ－３１Ｒへの結合を、０．１～２０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．２～６ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で遮断し、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットでにあり、
ｅ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、示差走査蛍光法により測定すると、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも６５℃、好ましくは少なくとも６７℃、より好ましくは少なくとも６９℃であり、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｆ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で少なくとも４週間保存した後、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｇ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、３回の凍結融解サイクル後のモノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、及び／又は
ｉ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃又は４０℃で４週間保存した後のタンパク質含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される、上記多重特異性抗体。
２８．前記ＩＬ３１－ＢＤが、ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を含み、特にＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を含む、項目１～２７のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
２９．前記ＩＬ３１－ＢＤが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、以下を含む、項目２８に記載の多重特異性抗体：
（ｉ）フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、並びにフレームワークＦＲ４を含むＶＬドメインであって、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、Ｖκサブタイプ、特にＶκ１及びＶκ３サブタイプから選択され、特にＶκ１サブタイプであり、並びに前記フレームワーク領域ＦＲ４は、Ｖκ ＦＲ４及びＶλ ＦＲ４から選択され、特に、配列番号２６～配列番号３３から選択されるＶλ ＦＲ４配列と少なくとも７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より詳しくは配列番号２６～配列番号３３から選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号２６又は配列番号３３によるＶλ ＦＲ４である、上記ドメイン。
３０．前記ＩＬ３１－ＢＤが以下を含む、項目１～２９のいずれか１つに記載の多重特異性抗体：
ａ）配列番号１５及び１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＨ配列；及び
ｂ）配列番号２１及び２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＬ配列。
３１．前記ＩＬ３１－ＢＤが以下を含む、項目１～３０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体：
ａ）配列番号１５及び１６から選択されるＶＨ配列、特に配列番号１６のＶＨ配列；及び
ｂ）配列番号２１及び２２から選択されるＶＬ配列、特に配列番号２１のＶＬ配列。
３２．前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤの少なくとも１つ及び／又は前記ＩＬ３１－ＢＤの少なくとも１つが、親ウサギ抗体に由来するＣＤＲ領域を含む、項目１～３１のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３３．少なくとも１つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び少なくとも１つのＩＬ３１－ＢＤが、それらのそれぞれの抗原に同時に結合することができる、項目１～３２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
３４．項目１～３３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体であって、前記多重特異性抗体が、
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、１０００ｐＭ以下の１価の解離定数（ＫＤ）、特に１～１０００ｐＭ、特に１～７００ｐＭ、特に１～５００ｐＭのＫＤでヒトＩＬ－４Ｒに結合し、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－４Ｒに、５０ｎＭ未満、特に２０ｎＭ未満の１価ＫＤ、特に１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭ、特に１～１０００ｐＭ、特に１～５００ｐＭの１価ＫＤで結合し、
ｃ．ＳＰＲで測定すると、ヒトＩＬ－３１に、５ｎＭ未満の１価ＫＤで、特に５ｐＭ～５ｎＭ、特に５ｐＭ～２ｎＭ、特に５ｐＭ～１０００ｐＭの１価ＫＤで結合し、
ｄ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ－３１と交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－３１に、特に２０ｎＭ以下の１価ＫＤで、特に５ｐＭ～２０ｎＭ、特に５ｐＭ～１０ｎＭで、特に５ｐＭ～５ｎＭの１価ＫＤで結合し、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．２ｐＭ～２００ｐＭのＩＣ５０で、特に０．２ｐＭ～１００ｐＭのＩＣ５０で、特に０．２ｐＭ～５０ｐＭのＩＣ５０で中和し、
ｆ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．２ｐＭ～２００ｐＭのＩＣ５０で、特に０．２ｐＭ～１００ｐＭのＩＣ５０で、特に０．２ｐＭ～５０ｐＭのＩＣ５０で中和し、
ｇ．ヒト全血アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４及びヒトＩＬ－１３によって誘導される胸腺活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）分泌を、１０ｐＭ～２ｎＭのＩＣ５０で、特に１０ｐＭ～１ｎＭのＩＣ５０で遮断し、
ｈ．ヒトＩＬ－４Ｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０で、特に０．０１～７ｎＭのＥＣ５０で、特に０．０１～５ｎＭのＥＣ５０で結合し、
ｉ．カニクイザルＩＬ－４Ｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０、特に０．０１～７ｎＭのＥＣ５０で、特に０．０１～５ｎＭのＥＣ５０で結合し、
ｊ．Ｐａｔｈ Ｈｕｎｔｅｒ ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂダイマー化アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を、５ｐＭ～２ｎＭのＩＣ５０で、特に５ｐＭ～１ｎＭのＩＣ５０で、特に５～７００ｐＭのＩＣ５０で遮断し、
ｋ．Ｐａｔｈ Ｈｕｎｔｅｒ ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂダイマー化アッセイで測定すると、カニクイザルＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を、０．０５～２０ｎＭのＩＣ５０で、特に０．０５～１０ｎＭのＩＣ５０で、特に０．０５～５ｎＭのＩＣ５０で遮断し、
ｌ．示差走査蛍光法により測定される、少なくとも６０℃の、好ましくは少なくとも６３℃の、より好ましくは少なくとも６６℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に、前記多重特異性抗体はｐＨ７．０の２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で調製され、及び／又は、
ｍ．４週間保存した後、前記多重特異性抗体の開始濃度が１００ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に前記多重特異性抗体は、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液中で調製される。
３５．以下の重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列を有するモリソン抗体から選択される、項目１～３４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体：
－ 配列番号３８のＨＣ配列及び配列番号３７のＬＣ配列、
－ 配列番号４０のＨＣ配列及び配列番号３９のＬＣ配列、
－ 配列番号４２のＨＣ配列及び配列番号４１のＬＣ配列、
－ 配列番号４４のＨＣ配列及び配列番号４３のＬＣ配列、
－ 配列番号４６のＨＣ配列及び配列番号４５のＬＣ配列、
－ 配列番号４８のＨＣ配列及び配列番号４７のＬＣ配列、及び
－ 配列番号５０のＨＣ配列及び配列番号４９のＬＣ配列。
３６．項目１～３５のいずれか１つの多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸。
３７．項目３６の核酸又は２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。
３８．項目３７のベクター又は２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。
３９．項目１～３５のいずれか１つの多重特異性抗体を産生する方法であって、
（ｉ）項目３６の核酸もしくは２つの核酸、又は項目３７のベクターもしくは２つのベクターを提供し、前記核酸もしくは複数の核酸又は前記ベクターもしくは複数のベクターを発現させ、及び発現系から前記多重特異性抗体を収集すること、又は（ｉｉ）項目３８に記載の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞もしくは複数の宿主細胞を培養し、及び細胞培養物から前記多重特異性抗体を収集することを含む、上記方法。
４０．項目１～３５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
４１．医薬として使用するための、項目１～３５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
４２．疾患、特にヒト疾患、より詳細にはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための、項目１～３５のいずれか１つの多重特異性抗体。
４３．項目４２に記載の疾患の治療に使用するための項目１～３５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体であって、ここで前記疾患が、掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こす炎症性疾患及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から選択される、上記多重特異性抗体。
４４．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目４２又は４３に記載の多重特異性抗体。
４５．疾患、特にヒトの疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の治療方法であって、項目１～３５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む上記方法。
４６．前記疾患が、掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こす炎症性疾患及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から選択される、項目４５に記載の方法。
４７．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目４５又は４６に記載の方法。
４８．疾患、より詳しくはアレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、掻痒を引き起こす自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の治療方法であって、
それを必要とする患者に、
１．ａ）前記項目１～２６及び３２～３５のいずれかに定義されているＩＬ４Ｒ－ＢＤと、
ｂ）Ｆｃ領域、特にＩｇＧ領域、特にＩｇＧ４領域を含む第１の抗体と
２．前述の項目１～２０及び２７～３５のいずれかに定義されている、ＩＬ３１－ＢＤを含む第２の抗体とを、投与する工程を含む、上記方法。
４９．前記第１の抗体及び前記第２の抗体の有効用量レベルが、それを必要とする患者の血漿中で同時に到達するように投与が行われる、項目４８に記載の方法。
５０．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に、前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目４８又は４９に記載の方法。
５１．以下を含むキット
１．ａ）前記項目１～２６及び３２～３５のいずれかに定義されているＩＬ４Ｒ－ＢＤと、
ｂ）Ｆｃ領域、特にＩｇＧ領域、特にＩｇＧ４領域を、含む第１の抗体；及び
２．前述の項目１～２０及び２７～３５のいずれかに定義されている、ＩＬ３１－ＢＤを含む第２の抗体。
５２．前記医薬組成物が、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療薬である、項目４０に記載の医薬組成物。
５３．前記疾患が、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択され、特に、前記疾患がアトピー性皮膚炎である、項目５２に記載の医薬組成物。
図１は、デュピルマブとＢＭＳ－９８１１６４の組み合わせと比較した、ＢＥＡＳ－２ＢアッセイにおけるＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害するモリソン－Ｈ分子ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９の効力を示す。ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は、デュピルマブとＢＭＳ－９８１１６４の組み合わせと比較した場合、ＩＬ４Ｒ及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害する同様の効力を示す（Ａ）。デュピルマブ又はＢＭＳ－９８１１６４単独の添加によるＩＬ－４Ｒ又はＩＬ－３１単独の個別の遮断は、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達の組み合わせ遮断よりも効果が低い（Ｂ）。
図２は、ＩｇＧ４のモリソン－Ｈフォーマット（左）及びモリソン－Ｌフォーマット（右）の概略図を記載したサブドメイン命名法とともに示す。Ｆｖドメイン（薄灰色）を接続するリンカー配列は、異なる繰り返しの（Ｇ４Ｓ）モジュール（定常領域とｓｃＦｖドメインの間に２つのモジュール、及びＶＬ２とＶＨ２の間に４つのモジュール）で構成される。
図３は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるＳｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおけるＩＬ－４ＲのヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達（Ａ）及びヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達（Ｂ）を遮断する、最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９の効力を示す。分析された分子の効力はデュピルマブと比較される。
図４は、競合ＥＬＩＳＡによって評価された、ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する、最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８（Ａ）及びＰＲＯ１８９９（Ｂ）の効力を示す。
図５は、モリソン抗体ＰＲＯ２１９８のヒトＩＬ－４Ｒ／ヒトＩＬ－３１及びカニクイザルＩＬ－４Ｒ／カニクイザルＩＬ－３１への同時結合を示す。上：実験計画の概略図。下：ヒトＩＬ－４Ｒ／ヒトＩＬ－３１（濃い灰色）及びカニクイザルＩＬ－４Ｒ／カニクイザルＩＬ－３１（薄い灰色）へのＰＲＯ２１９８の同時結合を示すセンサーグラム。
図６は、モリソン－Ｈ（ＭｏｒｒＨ）及びモリソン－Ｌ（ＭｏｒｒＬ）分子ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７、並びに陰性対照分子ＰＲＯ２０７７の、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のヒトＩＬ－４Ｒ（Ａ）及びカニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｂ）への結合を示す。すべての分子はヒトＩＬ－４Ｒ（Ａ）に結合した。対照分子ＰＲＯ２０７７については、カニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｂ）への結合は観察されなかった。ヒト及びカニクイザルのＩＬ－４Ｒ発現構築物のＮ末端に融合されたＶ５タグ（Ｖ５タグ）を標的とする抗体を、血漿膜結合の陽性対照として使用した。
図７は、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達及びヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を中和するモリソンＨ（ＭｏｒｒＨ）及びモリソン－Ｌ（ＭｏｒｒＬ）抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の効力を示す。モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体によるＩＬ－４Ｒ遮断の効力は、ＩＬ４誘導性シグナル伝達（Ａ及びＣ）及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達（Ｂ及びＤ）の両方においてデュピルマブに匹敵する。図５Ａから５Ｄに示されるＩＣ５０値は、単一点測定値を表す。
図８は、アッセイ培地中に過剰のＩＬ－３１がある場合とない場合の、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＩＬ４誘導性シグナル伝達を中和するモリソン－Ｈ（ＭｏｒｒＨ）抗体ＰＲＯ２１９８（Ａ）及びＰＲＯ２１９９（Ｂ）の効力を示す。過剰なＩＬ－３１の存在下で効力の損失は観察されない。図６Ａ及び６Ｂに示されるＩＣ５０値は、単一点測定値を表す。
図９は、アッセイ培地中に過剰のＩＬ－４Ｒ細胞外ドメインがある場合とない場合のＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化において、ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を中和するモリソン－Ｈ（ＭｏｒｒＨ）及びモリソン－Ｌ（ＭｏｒｒＬ）抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の効力を示す。モリソン抗体は、ＢＭＳ－９８１１６４（Ａ及びＢ）と比較して、同様の効力でＩＬ－３１とＩＬ－３１ＲＡとの相互作用を遮断した。過剰なＩＬ－４Ｒの存在下で効力の損失は確認されなかった（Ｃ及びＤ）。
図１０は、ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイにおいて、カニクイザルＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を中和するモリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９の効力を示す。抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は、カニクイザルＩＬ－３１とＩＬ－３１ＲＡとの相互作用を遮断することができた。
図１１は、モリソン－Ｈ分子ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９、並びにＩＬ－３１ｓｃＦｖ結合ドメインを欠く対応する抗ＩＬ－４Ｒ ＩｇＧ４分子ＰＲＯ２２０９及びＰＲＯ２２１０の、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－４とＩＬ－１３誘導性ＣＤ２３発現とを遮断する能力を示す。ＰＲＯ２１９８とＰＲＯ２１９９は、デュピルマブと比較した場合、ヒト単球（Ａ）、ナイーブＢ細胞（Ｂ）、及びメモリーＢ細胞（Ｃ）におけるＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性のＣＤ２３アップレギュレーションを、同様の効力で阻害する。ＰＲＯ２２０９とＰＲＯ２２１０は、デュピルマブと比較した場合、同等の阻害を示す。
図１２は、還元条件及び非還元条件下でのＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析を示す。
図１３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるクリッピングの分析を示す。１番目のレーン：マーカー－２番目：ｐＨ３．５、ｔ０－３番目：ｐＨ３．５、ｔ１０ｄ－４番目：ｐＨ５、ｔ０－５番目：ｐＨ５、ｔ１０ｄ－６番目：ｐＨ７、ｔ０ｄ－７番目：ｐＨ７、ｔ１０ｄ－８番目：ｐＨ８．５、ｔ０－９番目：ｐＨ８．５、ｔ１０ｄ。＊おそらく、ＨＣダイマーの不完全な還元。＃おそらく、ＬＣの不完全な還元。
発明の詳細な説明
既知の治療用抗ＩＬ－４Ｒ抗体は、多くの場合、患者における有効性が欠如しており、応答が低～中程度であるという問題がある。これらはまた、特に皮膚関連の炎症性疾患や自己免疫疾患によく見られる症状であるかゆみにも直接は対処していない。従って、医療分野では、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患、特に中等度から重度のアトピー性皮膚炎などの掻痒症を引き起こす炎症性疾患及び自己免疫疾患に対して、より高い有効性を有し、同時に疾患に関連したかゆみを強力に軽減することができる改良された抗ＩＬ－４Ｒ抗体ベースの治療薬が必要とされている。
本発明は、ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及びＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）を含む多重特異性抗体を提供し、ここで、前記多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含む。本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４／ＩＬ－１３誘導性シグナル伝達及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を非常に効率的な方法で同時に遮断することができる。
本発明者らは、免疫グロブリンＦｃ領域が、生細胞上のＩＬ－４Ｒへの本発明の多重特異性抗体の結合を増強する追加のＦｃγＲ相互作用を提供し、それによってＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断するそれらの効力を高めると考えている。ヒトＰＢＭＣアッセイにおけるさまざまな抗体フォーマットの分析により、Ｆｃ領域とＦｃガンマ受容体ＩＩ型（ＦｃγＲＩＩ）との相互作用が、観察された効力の増加にとって特に重要であると考えられることがさらに示されている。従って、本発明の文脈において、「機能的Ｆｃ領域」という用語は、その天然の機能の範囲内でＦｃγＲ、特にＦｃγＲＩＩと相互作用することができるＦｃ領域を指す。
本発明者らの最良の知識によれば、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達経路とＩＬ－３１シグナル伝達経路の両方を同時に遮断することは、先行技術においてまだ報告されておらず、ましてや単一の分子による前記経路の高効率な同時遮断については言うまでもない。
インターロイキン３１（ＩＬ－３１）は、病原体に対する細胞性免疫の誘発に役立つ炎症性サイトカインである。ＩＬ－３１はＴｈ２細胞によって優先的に産生される。ＩＬ－３１は、免疫細胞及び上皮細胞で発現される、インターロイキン３１受容体α（ＩＬ－３１ＲＡ又はＩＬ３１ＲＡ）とオンコスタチンＭ受容体β（ＯＳＭＲβ）を含むヘテロダイマー受容体複合体（ＩＬ－３１Ｒ又はＩＬ３１Ｒ）を介してシグナルを送る。ＩＬ－３１がこの受容体複合体に結合すると、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路が活性化され、さらにさまざまなＭＡＰＫ経路（ＥＲＫ、ｐ３８、及びＪＮＫ）も活性化される。
ＩＬ－３１はさまざまな慢性炎症性疾患に関与している。例えば、マウスにおけるＩＬ－３１の過剰発現は皮膚炎様症状を引き起こすことがわかっている。Dillon, et al, Nature Immunol. 5:752-760, (2004)を参照。さらに、ＡＤなどの多くの慢性炎症性疾患では、ＩＬ－３１が患者の皮膚内の神経線維の活性化を媒介し、その結果、攻撃的なかゆみ表現型を生じさせ、患者が掻くとこれらの疾患の症状が悪化する。例えば、Oetjen et al., Cell, 171: 217-228 (2017)を参照。ひっかき傷は皮膚バリアの破壊を引き起こし、微生物病原体の皮膚への侵入を引き起こし、その部位での炎症をさらに促進する可能性がある。
また、ＩＬ－３１は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性腸疾患、悪性腫瘍、及び骨粗鬆症に関与していることがわかっている。Bagci et al., J Allergy Clin Immunol, 141(3):858-866 (2018)を参照。
例えば抗ＩＬ－３１ＲＡ抗体ネモリズマブなどの抗ＩＬ－３１ＲＡ抗体によるＩＬ－３１／ＩＬ－３１ＲＡシグナル伝達の遮断は、ＡＤに罹患している患者のかゆみを軽減するのに効果的であることが臨床的に証明されている。Ruzicka et al., N Engl J Med, 376:2092-2093 (2017)を参照。
さらに、ＩＬ－３１中和抗体ＢＭＳ－９８１１６４は、慢性掻痒性皮膚症状の治療に効果的な標的療法を提供するために開発された。Lewis et al, J Eur Acad of Dermatol Venereol, 31(1):142-150 (2017)を参照。
細胞表面上の２つの異なるタイプの受容体を標的とする場合に起こり得る細胞間の架橋の可能性を回避するために、ＩＬ－４Ｒを標的とすること（第１の特異性）以外に、細胞結合ＩＬ－３１ＲＡではなくＩＬ－３１を標的とすること（第２の特異性）が決定された。
上述したように、本発明の多重特異性抗体は、非常に効率的な方法で、ＩＬ－４／ＩＬ－１３誘導性シグナル伝達及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を同時に遮断することができる。例えば、本発明の多重特異性抗体の２つの代表例であるＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は、１μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ－４Ｒ媒介性及びＩＬ－３１媒介性を組み合わせたＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＣＣＬ２分泌を減少させることができる。ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞は、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３１で、抗ＩＬ－４Ｒ抗体デュピルマブと抗ＩＬ－３１抗体ＢＭＳ－９８１１６４の等量の１：１混合物と比較して、少なくとも同程度に処理されている（図１Ｂ）。
ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）及び小型誘導性サイトカインＡ２とも呼ばれ、ＣＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＣＬ２は、組織損傷又は感染によって生じた炎症部位に、単球、メモリーＴ細胞、及び樹状細胞を動員する。ＣＣＬ２は、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症などの単球浸潤を特徴とするいくつかの疾患の発症に関与していると考えられている（Xia et al, Expert Opinion on Therapeutic Patents., 2009, 19 (3): 295-303）。
本発明の多重特異性抗体のいくつか、例えばＰＲＯ２１９８は、前記ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＩＬ－４ＲとＩＬ－３１との組合わせが媒介するＣＣＬ２分泌を、デュピルマブ及びＢＭＳ９８１１６４のそのような１：１混合物の等量よりも強力に、ほぼ未処理のＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のレベルまで減少させることができる（図１Ｂ）。
本明細書で使用される「ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞」又は「ＢＥＡＳ－２Ｂ」という用語は、ヒト気管支上皮由来の不死化非腫瘍性上皮細胞株の細胞を指す。この細胞株は、アデノウイルス１２－ＳＶ４０ハイブリッドウイルスによるトランスフェクション及びその後の連続的細胞継代による不死化を介して樹立された。Reddel et al., Cancer Res., 48(7):1904-1909 (1988) を参照。ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞は、肺関連疾患の細胞及び分子機構の研究や、肺関連毒性研究のインビトロ細胞モデルとして広く使用されている。
さらに、本発明の抗ＩＬ－４Ｒ×ＩＬ－３１多重特異性抗体は、非常に有利な生物物理学的特性、特に１００ｍｇ／ｍｌをはるかに超える抗体濃度で優れた調製及び保存安定性を示す。例えば、本発明の代表的な多重特異性抗体であるＰＲＯ２１９８のタンパク質含有量並びにモノマー含有量の損失は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度で４℃で４ヶ月保存した場合、１％未満である。
従って、本発明の多重特異性抗体は、従来の治療法に比べて明確な治療上の利点を提供する。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
「含む（comprising）」及び「含む（including）」という用語は、本明細書では、他に明記されない限り、無制限かつ非限定的な意味で使用される。従って、このような後者の実施態様に関して、用語「含む」は、より狭い用語「からなる」を含む。
本発明の説明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）における「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、及び同様の言及は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を含み、それらの混合物も含む。化合物、塩などに複数形が使用される場合、これは単一の化合物、塩なども意味するものとみなされる。
１つの態様において、本発明は、以下を含む多重特異性抗体に関する：
ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及び
ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）、
ここで、多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含む。
本明細書で使用される「抗体」などの用語は、抗体全体又はその１本鎖；及び任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又はその単鎖；及び抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、又はＶＬ領域を含む分子（特に限定されるものではないが、多重特異性抗体を含む）を含む。天然に存在する「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に隣接した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化できる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本明細書中で使用される「免疫グロブリンＦｃ領域」又は「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域、すなわち重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを定義するために使用される。「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域、すなわち、特定の所望の特性を示すように工学操作されたＦｃ領域、例えば改変されたＦｃ受容体結合機能及び／又は低減又は抑制されたＦａｂアーム交換などを含む。このような工学操作されたＦｃ領域の例は、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術である（例えば、Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21 (1996) and Spiess et al., J Biol Chem. 288(37):26583-93 (2013)Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21 (1996) and Spiess et al., J Biol Chem. 288(37):26583-93 (2013)を参照）。天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。特に、ＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲであり、これはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体のアレルバリアント及び選択的スプライス形態を含む）、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含むＦｃγＲＩＩ受容体を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capet et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)で概説されている。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語には、胎児への母親のＩｇＧの輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)．ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); 国際公開第２００４／９２２１９ 号(Hinton et al)）。インビボでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばトランスジェニックマウス、又はヒトＦｃＲｎを発現するトランスフェクトされたヒト細胞株、又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類でアッセイすることができる。国際公開第２００４／４２０７２号（Presta）は、ＦｃＲへの結合を改善又は減少させる抗体バリアントを記載している。例えば、Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 参照。
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧサブクラスのＦｃ領域から、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＦｃ領域から、特にＩｇＧ４のＦｃ領域から選択される。
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含む。
本明細書で使用される「ＩｇＧ領域」という用語は、免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖、すなわち上記で定義したＦｃ領域、並びにＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ領域を指す。「ＩｇＧ領域」という用語は、天然配列ＩｇＧ領域、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、並びに、例えばＦｃ領域について上記で定義した特性などの特定の所望の特性を示す工学作成されたＩｇＧ領域を含む。本明細書で使用される「機能的ＩｇＧ領域」という用語は、機能的Ｆｃ領域を含むＩｇＧ領域を指す。
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含み、ここで、前記ＩｇＧ領域はＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４から、特にＩｇＧ４から選択される。
本明細書で使用される抗体の「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、特定の抗原（例えば、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ－３１）に対して特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１つ又はそれ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片によって行われる。具体的には、本発明の多重特異性抗体の場合、本明細書で使用される「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片；Ｆ（ａｂ）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片；抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；及び１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）を指す。好ましくは、本発明の抗体の結合ドメインは、互いに独立して、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖ断片、及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。特定の実施態様において、本発明の抗体の結合ドメインは、互いに独立して、Ｆａｂ断片及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。他の特定の実施態様において、ｓｃＦｖ断片のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定化され、特に、前記ＶＨドメインは、位置５１（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは、位置１４１（ＡＨｏ番号付け）に単一のシステイン残基を含む。
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 番号付けスキーム)； Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia” 番号付けスキーム); ImMunoGenTics (IMGT) 番号付け (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)) (“IMGT” 番号付けスキーム)；及びHonegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (“AHo” 番号付け)によって記載されたスキームを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定される境界を有するアミノ酸配列を指す。例えば、古典的なフォーマットの場合、Kabatでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Chothiaでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのアミノ酸残基は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。KabatとChothiaの両方のＣＤＲ定義を組み合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）で構成される。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、約２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）、及び９３～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は、約２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）（「Kabat」に基づく番号付け）と番号付けされている。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲは、プログラム IMGT/DomainGapAlign を使用してを決定することができる。
本発明の文脈では、他に明記されない限り、Honegger&Pluckthunによって提案された番号付けシステム（「ＡＨｏ」）が使用される（Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670）。特に、以下の残基は、ＡＨｏ番号付けスキームに従ってＣＤＲとして定義される：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４～Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８～Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７～Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７～Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７～Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８～Ｈ１３８。明確にするために、Honegger & Pluckthunによる番号付けシステムでは、異なるＶＨサブファミリーとＶＬサブファミリーの両方、特にＣＤＲにある天然に存在する抗体に見られる長さの多様性が考慮されており、配列中のギャップが提供されている。従って、特定の抗体可変ドメインでは、通常１位～１４９位までの必ずしもすべてがアミノ酸残基によって占められるわけではない。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、個々の抗体が１つの抗原決定基と反応するが、異なる抗原決定基とは反応しない能力を指す。本明細書で使用される「に特異的に結合する」又は「に特異的である」という用語は、標的と抗体との結合などの測定可能でかつ再現可能な相互作用を指し、これは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下での標的の存在を決定するものである。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で、この標的に結合する抗体である。最も一般的なフォーマットでは（定義された参照が言及されていない場合）、「特異的結合」とは、例えば当技術分野で公知の特異性アッセイ方法に従って測定される、目的の標的と無関係の分子とを区別する抗体の能力を指す。このような方法には、特に限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験、及びペプチドスキャンが含まれる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。スコア付けは、標準的な発色（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼを用いた２次抗体、及び過酸化水素を用いたテトラメチルベンジジン）によって実施することができる。特定のウェル内の反応は、例えば４５０ｎｍでの光学密度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は約０．１ＯＤである。典型的な陽性反応は約１ＯＤである。これは、正のスコアと負のスコアの比率が１０倍以上になる可能性があることを意味する。さらなる例では、バックグラウンドとシグナルとの少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍の差が特異的結合を示すＳＰＲアッセイを実施することができる。通常、結合特異性の決定は、単一の参照分子ではなく、粉乳、トランスフェリンなどの約３～５個の無関係な分子のセットを使用して実施される。
適切には、本発明の抗体は単離された抗体である。本明細書で使用される「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１に特異的に結合する単離抗体は、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない可能性がある。
適切には、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有する抗体、又は同じ遺伝子源に由来する抗体を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する結合特異性及び親和性、又は特定のエピトープに対する結合特異性及び親和性を示す。
本発明の抗体には、特に限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体が含まれる。
本明細書で使用される「キメラ抗体」（又はその抗原結合断片）という用語は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるか又は改変されたクラス、エフェクター機能、及び／又は種の定常領域に連結されるように、定常領域又はその一部が改変、置換、又は交換されており、又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる又は改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、又は交換されている、抗体分子（又はその抗原結合断片）を指す。例えばマウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンの定常領域で置き換えることによって修飾することができる。ヒト定常領域による置換のために、キメラ抗体は、抗原を認識する特異性を保持することができる一方、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が低下している。
本明細書で使用される「ヒト化」抗体（又はその抗原結合断片）という用語は、非ヒト抗体の反応性を保持するが、ヒトにおける免疫原性が低い抗体（又はその抗原結合断片）を指す。これは、例えば非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をヒト対応物（すなわち、定常領域、並びに可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることによって達成できる。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で、並びに別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で行うことができる。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異、あるいは安定性もしくは製造を促進するための保存的置換によって導入された突然変異）を含み得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 及び Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照。人間工学技術の他の例としては、特に限定されるものではないが、米国特許第５，７６６，８８６号に開示されているＸｏｍａ技術が挙げられる。
本明細書で使用される「組換えヒト化抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたすべてのヒト抗体、例えば、ヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から単離された抗体、及びヒト免疫グロブリン遺伝子、配列のすべて又は一部を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含むその他の手段によって調製、発現、作成、又は単離された抗体を含む。
好ましくは、本発明の多重特異性抗体はヒト化されている。より好ましくは、本発明の多重特異性抗体はヒト化されており、ウサギ由来のＣＤＲを含む。
本明細書で使用される「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つ又はそれ以上の異なる標的（例えばＩＬ－４ＲとＩＬ－３１）上の２つ又はそれ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。好ましくは、本発明の多重特異性抗体は二重特異性である。本明細書で使用される「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる標的（例えば、ＩＬ－４ＲとＩＬ－３１）上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループで構成され、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。「立体構造」エピトープと「線状」エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、ポリペプチド鎖が折りたたまれて天然タンパク質を形成するときに、表面で集合する抗原のアミノ酸残基を指す。
「線状エピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用分子（抗体など）とのすべての相互作用点がタンパク質の１次アミノ酸配列に沿って直線的に（連続的に）存在するエピトープを指す。
本明細書で使用される「認識する」という用語は、その立体構造エピトープを見つけてそれと相互作用する（例えば、結合する）抗体抗原結合断片を指す。
本明細書で使用される「結合力」という用語は、抗体－抗原複合体の全体的な安定性又は強度の有益な尺度を指す。それは３つの主要な要因（抗体エピトープ親和性、抗原と抗体の両方の価数、及び相互作用する部分の構造的配置）によって制御される。最終的に、これらの要因は、抗体の特異性、すなわち特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合する可能性を定義する。
適切には、本発明の多重特異性抗体は、１つ又は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む。特に、本発明の多重特異性抗体は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む。
「ＩＬ－４Ｒ」という用語は、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２４３９４を有するヒトＩＬ－４Ｒを指す。適切には本発明のＩＬ４Ｒ－ＢＤはＩＬ－４Ｒ、特にヒトＩＬ－４Ｒを標的とする。特に本発明の多重特異性抗体は、ヒト及びカニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ－４Ｒを標的とする１つ又は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む。より詳しくは、本発明の多重特異性抗体は、ヒト、カニクイザル（Macaca fascicularis）、及びマーモセット（Callithrix jacchus）ＩＬ－４Ｒを標的とする１つ又は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む。
適切にはＩＬ４Ｒ－ＢＤは、以下のパラメータのうちの１つ又はそれ以上によって特徴付けられる：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－４Ｒに、０．１～２００ｐＭ、特に０．１～１００ｐＭ、特に０．１～５０ｐＭのＫＤの１価の解離定数（ＫＤ）で結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｃ．マーモセット（Callithrix jacchus）（Marmoset）ＩＬ－４Ｒと交差反応性であり、特に、ＳＰＲで測定すると、マーモセットＩＬ－４Ｒに、１ｐＭ～５ｎＭ、特に１ｐＭ～３ｎＭ、特に１ｐＭ～２ｎＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｄ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－４誘導性シグナル伝達を、０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～１．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｅ．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイで測定すると、ヒトＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｆ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－４のヒトＩＬ－４Ｒへの結合を、０．０１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で、特に０．０１～２ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、ここで前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットである。
本明細書で使用される「ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞」又は「ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ」という用語は、ＮＦ－κＢ転写因子によって誘導されるプロモーターの制御下で、最適化された分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子でトランスフェクトされかつ安定して発現される、市販のヒト胎児性腎細胞を指す。培地中に放出されたＳＥＡＰタンパク質のレベルは、通常、ＮＦ－κＢ活性化の尺度として使用される。
本明細書で使用される「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との相互作用の強さを指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力を介して多くの部位で抗原と相互作用する。相互作用が多ければ多いほど、親和性は強くなる。
「結合親和性」は、一般に分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原、又はより詳しくは抗原上のエピトープ又は抗原）との非共有結合性相互作用の総和の強さを指す。他に明記されない限り、本明細書で使用される「結合親和性」、「に結合する（bind to）」、「に結合する（binds to）」、又は「に結合する（binding to）」は、結合対のメンバー（例えば、抗体断片と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原との結合が遅く、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原とより速く結合し、結合状態が長く続く傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。結合親和性、すなわち結合強度を測定するための具体的な例示的な実施態様を以下に記載する。
本明細書中で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」又は「Ｋｏｎ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しており、一方、本明細書中で使用される「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｏｆｆ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。１つの実施態様において、本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）数で表される解離定数を指すことを意図している。本発明による「ＫＤ」又は「ＫＤ値」又は「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、１つの実施態様において、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。
組換えヒトＩＬ－４Ｒ、組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ、及び組換えマーモセットＩＬ－４Ｒに対する親和性は、段落[０１８７]及び[０１８８]（ｓｃＦｖ）及び[０２６５]（多重特異性分子）に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって測定される。組換えヒトＩＬ－３１、組換えカニクイザルＩＬ－３１、及び組換えマーモセットＩＬ－３１に対する親和性は、段落[０２０９]（ｓｃＦｖ）及び[０２６７]（多重特異性分子）に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定値によって決定される。
適切には、本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ４Ｒの拮抗剤として作用する。言い換えれば、本発明の多重特異性抗体のＩＬ４Ｒ－ＢＤは、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達の阻害剤である。本明細書で使用される「遮断剤」又は「阻害剤」又は「拮抗剤」という用語は、結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低下させる抗体又はその結合ドメインを指す。本発明の多重特異性抗体のＩＬ－４Ｒ－ＢＤはＩＬ－４Ｒに結合し、それによってＩＬ－４のＩＬ－４Ｒへの結合、特にＩＬ－４及びＩＬ－１３の両方のＩＬ－４Ｒへの結合を遮断し、これによりＩＬ－４Ｒ機能が低下する。
適切には、本発明の多重特異性抗体のＩＬ４Ｒ－ＢＤは、以下のパラメーターのうちの１つ又はそれ以上によってさらに特性解析される：
ｇ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）で測定すると、少なくとも６３℃の、特に少なくとも６５℃の、特に少なくとも６７℃の、特に少なくとも６９℃の、特に少なくとも７０℃の、特に少なくとも７１℃の、特に少なくとも７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、４℃で４週間保存した後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が５％未満であり、及び特に、特に前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、及び／又は
ｉ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、５回の凍結融解サイクル後、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、好ましくは２％未満であり、及び特に、前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
ＤＳＦは既に記載されている（Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）。ｓｃＦｖ構築物の熱アンフォールディングの遷移の中点は、蛍光色素SYPRO（登録商標）オレンジを使用する示差走査蛍光法によって決定される（Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840を参照）。リン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ６．４）中の試料は、最終タンパク質濃度５０μｇ／ｍｌで調製され、総量１００μｌ中に最終濃度５ｘSYPRO（登録商標）オレンジが含まれる。調製した試料２５μlを、白壁のＡＢ遺伝子ＰＣＲプレートに三重で加える。このアッセイは、サーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲマシンで実施され、ソフトウェアのカスタム色素較正ルーチンを使用して蛍光発光が検出される。試験試料を含むＰＣＲプレートを２５℃から９６℃まで１℃ずつ昇温し、各温度上昇後に３０秒の一時停止を行う。総アッセイ時間は約２時間である。Ｔｍは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍによって、曲線の変曲点を計算する数学的２次導関数法を使用して計算される。報告されるＴｍは３回の測定の平均である。
モノマー含有量の損失は、ＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下面積計算によって決定される。ＳＥ－ＨＰＬＣは、米国薬局方（ＵＳＰ）、第６２１章に概要が記載されている固体固定相と液体移動相に基づく分離技術である。この方法は、疎水性固定相と水性移動相を利用して、分子のサイズと形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムの空隙容積（Ｖ０）と総浸透容積（ＶＴ）の間で起きる。ＳＥ－ＨＰＬＣによる測定は、自動試料注入と２８０ｎｍの検出波長に設定されたＵＶ検出器とを備えたChromaster ＨＰＬＣシステム（Hitachi High-Technologies Corporation）で行われる。この装置は、結果のクロマトグラムの分析もサポートするソフトウェアEZChrom Elite（Agilent Technologies、バージョン３．３．２ＳＰ２）によって制御される。タンパク質試料は遠心分離によって清澄にされ、オートサンプラー内で４～６℃の温度に保たれた後、注入される。ｓｃＦｖ試料の分析には、カラムShodex KW403-4F（Showa Denko Inc.、＃Ｆ６９８９２０２）を標準化緩衝化生理食塩水移動相（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム）を用いて推奨流量０．３５ｍｌ／分で使用される。１注入あたりの標的試料の量は５μｇである。試料は２８０ｎｍの波長でＵＶ検出器によって検出され、データは適切なソフトウェアスイートによって記録される。得られたクロマトグラムは、Ｖ０～ＶＴの範囲で分析され、それにより、溶出時間が１０分を超えるマトリックス関連ピークが除外される。
適切には、本発明の多重特異性抗体のＩＬ４Ｒ－ＢＤは、本開示で提供される結合ドメインである。本発明の多重特異性抗体のＩＬ４Ｒ－ＢＤには、特に限定されるものではないが、その配列が表１に列挙されているヒト化ＩＬ４Ｒ－ＢＤが含まれる。
適切には、本発明の多重特異性抗体は、１つ又は２つのＩＬ３１－ＢＤを含む。特に、本発明の多重特異性抗体は、２つのＩＬ３１－ＢＤを含む。
「ＩＬ－３１」又は「ＩＬ３１」という用語は、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＥＢＣ２を有するヒトＩＬ－３１を指す。適切には、本発明の多重特異性抗体のＩＬ３１－ＢＤは、ＩＬ－３１、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＥＢＣ２で示されるヒトＩＬ３１を標的とする。特に、本発明の多重特異性抗体は、ヒト及びカニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＬ－３１を標的とする１つ又は２つのＩＬ３１－ＢＤを含む。
適切には、本発明で使用されるＩＬ３１－ＢＤは、以下のパラメータのうちの１つ又はそれ以上によって特性解析される：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定すると、ヒトＩＬ－３１に、５ｎＭ以下の１価の解離定数（ＫＤ）、特に５ｐＭ～５ｎＭの、特に５ｐＭ～２ｎＭの、特に５～１０００ｐＭの１価の解離定数（ＫＤ）で結合し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｂ．カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus）ＩＬ－３１と交差反応性であり、ＳＰＲで測定すると、カニクイザルＩＬ－３１に、５ｎＭ以下の１価ＫＤ、特に５ｐＭ～５ｎＭ、特に５ｐＭ～２ｎＭ、特に５～１０００ｐＭの１価ＫＤで結合し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｃ．ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を、Ｐａｔｈ Ｈｕｎｔｅｒ ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂダイマー化アッセイで測定すると、０．１～３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～２０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害し、特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、
ｄ．競合ＥＬＩＳＡで測定すると、ヒトＩＬ－３１のヒトＩＬ－３１Ｒへの結合を、０．１～２０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．１～１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０、特に０．２～６ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で遮断し、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤはｓｃＦｖフォーマットである。
適切には、本発明の多重特異性抗体のＩＬ３１－ＢＤは、以下のパラメータのうちの１つ又はそれ以上によってさらに特性解析される：
ｅ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、示差走査蛍光法により測定すると、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも６５℃、好ましくは少なくとも６７℃、より好ましくは少なくとも６９℃であり、特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｆ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃で少なくとも４週間保存した後、モノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｇ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４０℃で４週間保存した後のモノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、
ｈ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、３回の凍結融解サイクル後のモノマー含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製され、及び／又は
ｉ．ｓｃＦｖフォーマットである場合、前記ｓｃＦｖの開始濃度が１０ｍｇ／ｍｌである場合、４℃又は４０℃で４週間保存した後のタンパク質含有量の損失が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満であり、及び特に、ここで前記ｓｃＦｖは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液中で調製される。
適切には、本発明の多重特異性抗体のＩＬ３１－ＢＤは、本開示で提供される結合ドメインである。本発明の多重特異性抗体のＩＬ３１－ＢＤは、特に限定されるものではないが、その配列が表２に列挙されているヒト化ＩＬ３１－ＢＤを含む。
「多価抗体」という用語は、複数の価数を有する単一の結合分子を指し、「価数」は、標的分子上のエピトープに結合する抗原結合部分の数として記載される。従って、単一の結合分子は、対応する抗原結合部分の複数のコピーの存在により、標的分子上の複数の結合部位及び／又は複数の標的分子に結合することができる。多価抗体の例としては、特に限定されるものではないが、２価抗体、３価抗体、４価抗体、５価抗体、６価抗体などが挙げられる。
本明細書で使用される「１価抗体」という用語は、単一の標的分子、より詳しくは標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体を指す。また、本明細書で使用される「結合ドメイン」又は「１価の結合ドメイン」という用語は、標的分子上の単一のエピトープに結合する結合ドメインを指す。
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、１つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び１つのＩＬ－３１－ＢＤを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１の両方の特異性に関して１価である。
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、１つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び２つのＩＬ－３１－ＢＤを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については１価であり、ＩＬ－３１特異性については２価である。
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び１つのＩＬ－３１－ＢＤを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については２価であり、ＩＬ－３１特異性については１価である。
好ましい実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び２つのＩＬ－３１－ＢＤを含み、すなわち本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ特異性については２価であり、ＩＬ－３１特異性については２価である。
本発明の多重特異性抗体が２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む場合、前記２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤは、ＩＬ－４Ｒ標的分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合する。好ましくは、２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤは、ＩＬ－４Ｒ標的分子上の同じエピトープに結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体は、２つの同一のＩＬ４Ｒ－ＢＤを含む。
本発明の多重特異性抗体が２つのＩＬ３１－ＢＤを含む場合、前記２つのＩＬ３１－ＢＤは、ＩＬ－３１標的分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合する。好ましくは、２つのＩＬ３１－ＢＤは、ＩＬ－３１標的分子上の同じエピトープに結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体は、２つの同一のＩＬ３１－ＢＤを含む。
本明細書で使用される「同じエピトープ」という用語は、複数の抗体に特異的に結合することができるタンパク質上の個々のタンパク質決定基を指し、ここで、その個々のタンパク質決定基は同一であり、すなわち前記抗体のそれぞれについて同一の３次元構造特性並びに同一の電荷特性を有するアミノ酸又は糖側鎖のような分子の、同一の化学的に活性な表面グループからなる。特定のタンパク質標的に関連して本明細書で使用される「異なるエピトープ」という用語は、それぞれが異なる抗体に特異的に結合することができるタンパク質上の個々のタンパク質決定基を指し、ここでこれらの個々のタンパク質決定基は、異なる抗体に対して同一ではなく、すなわち異なる３次元構造特性並びに異なる電荷特性を有するアミノ酸又は糖側鎖のような分子の、同一でない化学的に活性な表面グループから構成される。これらの異なるエピトープは、重複している場合もあれば、重複していない場合もある。
特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び２価である。
さらに特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び３価である。
好ましくは、本発明の多重特異性抗体は二重特異性及び４価であり、すなわちＩＬ－４Ｒ特異性については２価、及びＩＬ－３１特異性については２価である。
特定の態様において、本発明は、以下を含む多重特異性抗体に関する：
ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及び
ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）、
ここで
－ 前記多重特異性抗体はＩｇＧ領域を含み；
－ 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１のＨＣＤＲ１配列、
配列番号２のＨＣＤＲ２配列、
配列番号３のＨＣＤＲ３配列、
配列番号７のＬＣＤＲ１配列、
配列番号８のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号９のＬＣＤＲ３配列を含み；及び
－ 前記ＩＬ３１－ＢＤのそれぞれは、
配列番号１２のＨＣＤＲ１配列、
配列番号１３のＨＣＤＲ２配列、
配列番号１４のＨＣＤＲ３配列、
配列番号１７又は１８のＬＣＤＲ１配列、
配列番号１９のＬＣＤＲ２配列、及び
配列番号２０のＬＣＤＲ３配列を含む。
本発明で使用される他の可変ドメインは、変異しているが、ＣＤＲ領域において、表１及び表２に記載の配列に示されるＣＤＲ領域と、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明で使用される他の可変ドメインは、変異アミノ酸配列を含み、ここで、表１及び２に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と比較すると、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸は、ＣＤＲ領域内で変異している。
適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインのＶＨドメインは、ＶＨ３又はＶＨ４ファミリーに属する。１つの実施態様において、本発明で使用される結合ドメインは、ＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインを含む。本発明の文脈において、「ＶＨｘファミリー（又はＶＬｘファミリー）に属する」という用語は、フレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ３が前記ＶＨｘファミリー（又はそれぞれＶＬｘファミリー）に対して最も高い相同性を示すことを意味する。ＶＨ及びＶＬファミリーの例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86、又は国際公開第２０１９／０５７７８７号に記載されている。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨドメインの具体例は配列番号２３で示され、ＶＨ４ファミリーに属するＶＨドメインの具体例は配列番号２４に示される。特に、配列番号２３からのフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３は、ＶＨ３ファミリーに属する（表３、非太字でマークされた領域）。適切には、本明細書で使用されるＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号２３のＦＲ１～ＦＲ３と、少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より詳しくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１～ＦＲ３を含むＶＨである。ＶＨ３及びＶＨ４配列の代替例、及び他のＶＨｘ配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86、又は国際公開第２０１９／０５７７８７号に見いだされる。
適切には、本発明で使用される結合ドメインのＶＬドメインは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、特にＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３、及びＶκ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。前記結合ドメインがｓｃＦｖフォーマットである場合、前記結合ドメインは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、特にＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３、及びＶκ ＦＲ４及びＶλ ＦＲ４、特にＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。
適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３並びに例示的なＶλ ＦＲ４を配列番号２５に示す（表３、ＦＲ領域は非太字でマークされている）。Ｖκ１配列の代替例、及びＶκ２、Ｖκ３、又はＶκ４配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86中に見いだされる。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１～ＦＲ３は、ＦＲ１～ＦＲ３に対応し配列番号２５から得られるアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む（表３、ＦＲ領域は非太字でマークされている）。適切なＶλ ＦＲ４は配列番号２６～配列番号３２に記載され、及び特に、ドメイン間ジスルフィド結合の形成のために、第２の単一システインが、対応するＶＨ鎖の特にＶＨの５１位（ＡＨｏ番号付け）に存在する場合、単一のシステイン残基を含む配列番号３３に記載される。１つの実施態様において、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインのＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合、配列番号２６～配列番号３３のいずれか、特に配列番号２６又は３３のいずれかから選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。
本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、表１及び２に列挙されるＶＨドメインを含む。適切には、本発明で使用される結合ドメインは、表１及び２の１つに列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）内の２０個以下のアミノ酸配列は変異している（ここで、変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は欠失である）。適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、表１及び表２の１つに列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）内の１５個以下、特に１０個以下、特に５個以下のアミノ酸は、変異している（ここで、変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は欠失である）。本発明で使用される他の結合ドメインは、変異しているが、ＶＨ領域において、表１及び２の１つに記載される対応する配列に示されるＶＨ領域［表１及び２に示される配列の１つの少なくとも位置５～１４０（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも位置３～１４５を含むＶＨドメインを含む］と、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。
特に、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、表１及び表２の１つに列挙されるＶＬドメインを含む。適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、表１及び２の１つに列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）中の約２０個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は変異である）。適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、表１及び２の１つに列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（すなわち、ＣＤＲ配列ではない配列）内の約１５個以下のアミノ酸、特に１０個以下のアミノ酸、特に５個以下のアミノ酸酸は変異している（ここで、突然変異とは、様々な非限定的な例として、付加、置換、又は欠失である）。本発明で使用される他の結合ドメインには、変異しているが、ＶＬ領域において、表１及び２の１つに記載される配列に示されるＶＬ領域［表１及び２に示される配列の１つの少なくとも位置５～１４０（ＡＨｏ番号付け）、特に少なくとも位置３～１４５を含むＶＬドメインを含む］と、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。
本発明の文脈において、「本発明で使用される結合ドメイン」という用語は、結合ドメインそれ自体、すなわち多重特異性の状況から独立した結合ドメイン、及び、特に多重特異性構築物、例えば二重特異性、三重特異性、又は四重特異性構築物、に含まれる結合ドメインの１つに関する。
適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。
適切には、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは作動可能に連結されている。本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、それぞれの抗原又は受容体に同時に結合することができる。この関連で使用される「同時に」という用語は、少なくとも１つのＩＬ４Ｒ－ＢＤと少なくとも１つのＩＬ３１－ＢＤの同時結合を指す。
本発明の多重特異性抗体は、１つ又は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び１つ又は２つのＩＬ３１－ＢＤを含み、ここで、前記１つ又は２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤと前記１つ又は２つのＩＬ３１－ＢＤは互いに作動可能に連結されている。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つの分子（例えば、ポリペプチド、ドメイン、結合ドメイン）が、各分子が機能的活性を保持する方法で結合されていることを示す。２つの分子は、それらが直接的でも間接的でも（例えば、リンカーを介して、部分を介して、部分へのリンカーを介して）「機能的に結合」することができる。「リンカー」という用語は、本発明で使用される結合ドメイン間又は抗体断片間に任意選択的に位置するペプチド又は他の部分を指す。分子を共有結合させるために、多くの戦略が使用することができる。これらには、特に限定されるものではないが、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端とのポリペプチド結合、ジスルフィド結合を介する結合、及び化学架橋試薬を介する結合が含まれる。この実施態様の１つの態様において、リンカーは、組換え技術又はペプチド合成によって生成されるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特定の場合に適したリンカーの選択は、特に限定されるものではないが、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、自然にオリゴマー化するかどうか）、既知の場合は接続されるＮ末端とＣ末端との距離、及び／又はタンパク質分解及び酸化に対するリンカーの安定性を含むさまざまなパラメーターに依存する。さらにリンカーは、柔軟性を提供するアミノ酸残基を含んでいてもよい。
本発明の文脈において、「ポリペプチドリンカー」という用語は、それぞれがリンカーの一端に結合している２つのドメインを接続しているペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーを指す。ポリペプチドリンカーは、２つの分子が相互に正しい立体構造をとり、所望の活性を保持するような方法で２つの分子を結合するのに十分な長さを有していなければならない。特定の実施態様において、ポリペプチドリンカーは、２～３０個のアミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸残基）の連続した鎖を有する。さらに、ポリペプチドリンカーに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を著しく妨げない特性を示さなければならない。従って、リンカーペプチドは全体として、ポリペプチドの活性と矛盾する電荷を示したり、内部折り畳みを妨げたり、又は受容体モノマードメインの結合をひどく妨げるような１つ以上のモノマーのアミノ酸残基と結合や他の相互作用を形成したりしてはならない。特定の実施態様において、ポリペプチドリンカーは非構造化ポリペプチドである。有用なリンカーには、グリシン－セリン、又はＧＳリンカーが含まれる。「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーは、連続したグリシンとセリンのポリマー（例えば、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含み、ここで、ｎは１以上の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当業者に理解されている他の柔軟なリンカー（例えば、シェーカーカリウムチャネル用のテザー、及び他の多種多様な柔軟なリンカー）を意味する。グリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸を含むオリゴペプチドが比較的構造化されていないため、従って成分間の中性のテザーとして機能する可能性があるため、好ましい。第２に、セリンは親水性であるため、球状のグリシン鎖である可能性のあるものを可溶化することができる。第３に、同様の鎖は、単鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを結合するのに効果的であることが示されている。
実施態様の１つの群では、本発明の多重特異性抗体は、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）２融合体（ＡＤＡＰＴＩＲ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＤＡＲＴ（商標）、及びＴＲＩＤＥＮＴ（商標）から選択されるフォーマットである。「ＤＡＲＴ（商標）」という用語は、MacroGenicsによって開発された抗体フォーマットを指し、これは、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドと、Ｆｃ領域の１つの重鎖のＮ末端に、又はＦｃ領域の両方のＮ末端に、融合された１つ又は２つの二重特異性Ｆｖ結合ドメインとを含む。「ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）」という用語は、MacroGenicsによって開発された抗体フォーマットを指し、これは、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチド、１つの二重特異性Ｆｖ結合ドメイン、及び１つのＦａｂ断片を含む。二重特異性Ｆｖ結合ドメインとＦａｂ断片の両方が、Ｆｃ領域ポリペプチドの２つの重鎖のそれぞれのＮ末端に融合されている。
別の実施態様の群では、本発明の多重特異性抗体のフォーマットは、２価二重特異性ＩｇＧフォーマット、３価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び４価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択される。特に、前記多重特異性抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースのＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術によって調製された二重特異性ＩｇＧ）（MAbs.2017Feb/Mar;9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307）；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、例えばＣＯＤＶ－ＩｇＧ、モリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）、又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖と軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、及びＴｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）から選択される。より詳しくは、前記多重特異性抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースのＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ、及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））、さらに詳しくはＤＶＤ－Ｉｇとモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）、又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される。
本発明の特定の実施態様において、前記多重特異性抗体のフォーマットはモリソンフォーマット、すなわちモリソン－Ｌフォーマット及びモリソン－Ｈフォーマットから選択される。本発明で使用されるモリソン－Ｌ及びモリソン－Ｈフォーマットは、ＩｇＧＦｃ領域、特にＩｇＧ４Ｆｃ領域を有する４価の二重特異性分子フォーマットである。２つの非常に安定なｓｃＦｖ結合ドメイン（軽鎖は、Ｖλ ＦＲ４（λｃａｐ）と組み合わせてＶκ ＦＲ１～ＦＲ３を含む、ここではλｃａｐ ｓｃＦｖとも呼ばれる）は、リンカーＬ１を介して、重鎖（モリソン－Ｈ）又は軽鎖（モリソン－Ｌ）Ｃ末端に融合される（図２を参照）。
リンカーＬ１は、２～３０アミノ酸、より詳しくは５～２５アミノ酸、最も詳しくは１０～２０アミノ酸のペプチドである。特定の実施態様において、前記リンカーＬ１は、１つ又はそれ以上の単位の４つのグリシンアミノ酸残基と１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝１、２、３、４、又は５、特にｎ＝２である。
本発明の特別な実施態様において、多重特異性抗体は、上で定義したモリソン－Ｌフォーマットを有する。本発明の別の特別な実施態様において、多重特異性抗体は、上で定義したモリソン－Ｈフォーマットを有する。
本発明の多重特異性抗体のｓｃＦｖドメインは、リンカーＬ２によって接続された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含む。
リンカーＬ２は、１０～４０アミノ酸、より詳しくは１５～３０アミノ酸、最も詳しくは２０～２５アミノ酸のペプチドである。特定の実施態様において、前記リンカーＬ２は、４つのグリシンアミノ酸残基と１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、又は８、特にｎ＝４である）との１つ又はそれ以上の単位を含む。
本発明の多重特異性抗体の具体的であるが非限定的な例は、モリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２２０６、ＰＲＯ２２０７、ＰＲＯ２２０８、及びモリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２００、ＰＲＯ２２０１であり、その配列を表４に列挙する。
本発明の多重特異性抗体は、当技術分野で公知の任意の便利な抗体製造法を使用して産生することができる（二重特異性構築物の産生に関しては、例えば Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14；二重特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖに関しては、Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727 及び国際公開第ＷＯ９９／５７１５０号を参照されたい）。二重特異性構築物の適切な調製方法の具体例としてはさらに、特に、Ｇｅｎｍａｂ技術（Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150を参照）及びＭｅｒｕｓ技術（de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750を参照）が含まれる。機能性抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の産生方法も当技術分野で公知である（例えば、Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134、及びSuresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228を参照）。
これらの方法は典型的には、例えばハイブリドーマ技術を使用して、骨髄腫細胞を所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合させる（例えば、Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006を参照）ことによる、又は組換え抗体工学（レパートリークローニング又はファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えば、Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8を参照）による、モノクローナル抗体の生成と、２種以上の異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメイン又は断片又はその一部を組み合わせて、公知の分子クローニング技術を使用して二重特異性又は多重特異性構築物を得ることを含む。
本発明の多重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素の結合特異性を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に生成し、次に互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有結合にはさまざまなカップリング剤又は架橋剤を使用することができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－５－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法には、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 及び Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375 に記載されたものが含まれる。結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, Ill, USA) から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、これらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合することができる。具体的な実施態様において、ヒンジ領域は、奇数、例えば１つのスルフヒドリル残基を含むように修飾された後、結合される。
あるいは、２つ以上の結合特異性を同じベクター内にコード化して、同じ宿主細胞内で発現及び構築することができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂｘ Ｆａｂ、ｍＡｂｘｓｃＦｖ、ｍＡｂｘｄｓＦｖ、又はｍＡｂｘＦｖ融合タンパク質である場合に特に有用である。多重特異性抗体及び分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許５，４５５，０３０号；米国特許４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許５，０９１，５１３号；米国特許５，４７６，７８６号；米国特許５，０１３，６５３号；米国５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
多重特異性抗体のこれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を提供する。このような核酸は、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。
本明細書中で使用される「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、１本鎖又は２本鎖型の１つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は結合を含む核酸を包含し、これらは、合成、天然、及び非天然であり、参照核酸と比較した場合に同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。このような類似体の例には、特に限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルリン酸、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。他に明示されない限り、特定の核酸はまた、その保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）及び相補配列を有する核酸、並びに明示的に示された配列を有する核酸も暗示的に包含する。具体的には、以下に詳述するように、縮重コドン置換は、１つ又はそれ以上の選択された（又はすべての）コドンの３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される核酸を生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 及び Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
本発明は、上記の多重特異性抗体のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドは、本発明の多重特異性抗体の抗原結合能力を示すことができる。
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、又は本発明の多重特異性抗体又はその断片もしくは結合ドメインをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のＰＣＲ突然変異誘発によって生成することができる。核酸の直接化学合成は、当該分野で公知の方法、例えば、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90 のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979 のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859, 1981 のジエチルホスホルアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法によって達成され得る。ＰＣＲによりポリヌクレオチド配列に変異を導入する方法は、例えば PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 及び Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991 に記載されたように実施することができる。
また、本発明では、本発明の多重特異性抗体又はその断片もしくはその結合ドメインを産生するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。
「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すことを意図している。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結される環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここで追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結される場合がある。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることがよくある。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用される場合がある。しかし本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。この特定の文脈において、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。通常、それは転写調節配列と転写された配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、すなわちそれらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接していたり、近接して配置されている必要はない。
多重特異性抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、様々な発現ベクターを使用することができる。ウイルスベースの発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳類宿主細胞内で抗体を産生することができる。非ウイルスベクター及びシステムには、プラスミド、典型的にはタンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソームベクター、及びヒト人工染色体が含まれる（例えば、Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997を参照）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞における多重特異性抗体鎖をコードするポリヌクレオチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ、Ｂ、及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、Ｂ、及びＣ（Invitrogen, San Diego, CA, USA）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現するための当技術分野で公知の他の多数のベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が含まれる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; and Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992を参照。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される予定の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、多重特異性抗体鎖又は断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター及び他の調節配列（例えばエンハンサー）を含む。１つの実施態様において、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下を除いて、挿入配列の発現を防止する。誘導性プロモーターには、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、又は熱ショックプロモーターが含まれる。形質転換された生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞によりよく許容されるコード配列について集団に偏りを与えることなく、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、多重特異性抗体鎖又は断片の効率的な発現には他の調節要素も必要又は望ましい場合がある。これらの要素には通常、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又はその他の配列が含まれる。さらに、発現効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; and Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987 を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を上昇させることができる。
使用されるベクターは、典型的には、定常領域又はその一部を含む多重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードする。このようなベクターは、可変領域を定常領域との融合タンパク質として発現させることを可能にし、それによってインタクト抗体及びその抗原結合断片の産生をもたらす。通常、そのような定常領域はヒトのものである。
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫をも指すことを意図していることを理解されたい。突然変異又は環境の影響により、後続の世代で特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本発明の多重特異性抗体を保有及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な原核宿主の１つである。使用に適した他の微生物宿主には、枯草菌などの桿菌、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ菌、セラチア菌、及び様々なシュードモナス種が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製開始点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、任意の数の様々な周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、又はラムダファージ由来のプロモーター系が存在するであろう。プロモーターは典型的には、任意選択的にオペレーター配列とともに、発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、本発明の多重特異性抗体を発現するために使用することができる。昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用することもできる。
１つの実施態様において、本発明の多重特異性抗体を発現及び産生するために、哺乳動物宿主細胞が使用される。例えばこれらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株のいずれかであり得る。これらには、任意の正常な死すべき細胞、又は正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒトの細胞が含まれる。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株が開発されており、これには、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞、及びハイブリドーマが含まれる。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養物の使用は、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で概説されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照）、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含み得る。これらの発現ベクターには、通常、哺乳動物の遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが含まれている。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能もしくは制御可能であり得る。有用なプロモーターには、特に限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野で公知のプロモーター－エンハンサーの組み合わせが含まれる。
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用される場合がある（一般に、Green, M. R., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012) を参照）。他の方法には、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン－核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）への融合、薬剤により増強されたＤＮＡの取り込み、及びエクスビボ形質導入が含まれる。組換えタンパク質を長期にわたって高収率で生産するには、多くの場合、安定した発現が望まれる。例えば、本発明の多重特異性抗体を安定して発現する細胞株は、ウイルス複製開始点又は内在性発現要素及び選択マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地で１～２日間増殖させた後、選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在により、選択培地中で導入された配列をうまく発現する細胞の増殖が可能になる。耐性があり、安定してトランスフェクトされた細胞は、細胞の種類に適した組織培養技術を使用して増殖させ得る。従って、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を産生する方法を提供し、ここで前記方法は、本発明の抗体又は抗原結合断片をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含み、それにより、本開示の前記抗体又はその断片が発現される。
１つの態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体を産生する方法に関し、この方法は、本発明の多重特異性抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養する工程を含む。特に本発明は、本発明の多重特異性抗体を産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明の多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸、又は本発明の多重特異性抗体をコードする１つのベクター又は２つのベクターを提供し、前記１つ若しくは複数の核酸又は前記１つ若しくは複数のベクターを発現させ、及び前記多重特異性抗体又は前記結合ドメインを発現系から収集する工程、又は（ｉｉ）本発明の多重特異性抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を発現する１つの宿主細胞もしくは複数の宿主細胞を提供し、前記１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞を培養し、及び前記細胞培養物から前記多重特異性抗体又は前記結合ドメインを収集する工程を含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。「医薬的に許容し得る担体」とは、抗体の構造を妨げない媒体又は希釈剤を意味する。医薬的に許容し得る担体は、組成物を増強又は安定化し、又は組成物の調製を容易にする。医薬的に許容し得る担体には、生理学的に適合する、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
このような担体のいくつかは、医薬組成物を、例えば、被験体による経口摂取用の錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及びトローチとして製剤化することを可能にする。このような担体のいくつかは、医薬組成物を注射、注入、又は局所投与用に製剤化することを可能にする。例えば、医薬的に許容し得る担体は、滅菌水溶液であり得る。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。投与経路及び／又は投与方法は、所望の結果に応じて変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であってもよく、あるいは標的部位の近傍に投与されてもよい。特定の実施態様において、投与は筋肉内、又は皮下、特に皮下である。医薬的に許容し得る担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）、特に筋肉内又は皮下投与に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の多重特異性抗体は、化合物を不活性化し得る酸の作用及び他の自然条件から化合物を保護する材料でコーティングされ得る。
本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られ日常的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 及び Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、本発明の多重特異性抗体の治療有効用量又は有効用量が、本発明の医薬組成物に使用される。本発明の多重特異性抗体は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容し得る剤形に調製される。投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で調製することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位剤形とは、治療される被験体に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位には、必要な医薬担体と組み合わせて、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物が含まれる。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対して所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るために、変更することができる。選択される用量レベルは、様々な薬物動態学的因子、例えば使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、及び／又は材料、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態と過去の病歴、及び同様の要因に依存する。
本発明の多重特異性抗体は、通常、複数回投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月、又は毎年にすることができる。患者における本発明の多重特異性抗体の血中レベルの測定によって示されるように、間隔は不規則でもよい。あるいは、本発明の多重特異性抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与頻度は少なくなる。投与量と投与頻度は、患者における抗体の半減期に応じて異なる。一般にヒト化抗体は、キメラ抗体や非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与量と投与頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なる。予防的用途では、比較的低用量が比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。患者の中には生涯治療を受け続ける人もいる。治療用途では、疾患の進行が軽減又は停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量の投与が必要となる場合がある。その後、患者に予防療法を施すことができる。
１つの態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物に関する。適切な実施態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患、特に炎症性疾患と自己免疫疾患から選択される疾患の治療に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患、特に炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療用の薬剤の製造に使用するための医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患を治療するための、特に、治療を必要とする被験体における炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療するための、多重特異性抗体又は医薬組成物の使用に関する。
別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体を被験体に投与することを含む、被験体を治療する方法に関する。適切な実施態様において、本発明は、被験体におけるアレルギー性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患の治療方法、特に炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法であって、治療有効量の本発明の多重特異性抗体を被験体に投与することを含む方法に関する。
「被験体」という用語には、ヒト及びヒト以外の動物が含まれる。
「動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト哺乳動物、及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類が含まれる。他に明記されない限り、「患者」又は「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される「治療（treatment）」、「治療している（treating）」、「治療する（treat）」、「治療された（treated）」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患及び／又は疾患に起因する副作用の部分的又は完全な治癒、又は疾患の進行の遅延という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、以下を含む：（ａ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を阻止する、及び（ｂ）疾患を軽減する、すなわち疾患を退行させる。
「治療有効量」又は「有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の被験体に投与された場合、そのような疾患の治療に影響を与えるのに十分な薬剤の量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、並びに治療を受ける被験体の年齢、体重などによって異なる。
１つの実施態様において、アレルギー疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患は、掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こす炎症性疾患及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から選択される。「掻痒」及び「かゆみ」という用語は、本明細書では同義的に使用され、掻きたいという欲求又は反射を引き起こす感覚を指す。アトピー性皮膚炎、皮膚真菌症、乾癬、蕁麻疹などのかゆみを引き起こす慢性皮膚疾患の場合、掻きむしることは特に問題となる可能性があり、これは、永続的なかゆみの刺激により、患者は患部の皮膚領域を絶えず及び／又は過剰に掻くことになり、皮損の怪我や皮膚表面のさらなる悪化につながるためである。
本明細書で使用される「アレルギー疾患」又は「アレルギー」という用語は、環境中の通常は無害な物質に対する免疫系の過敏性によって引き起こされる多数の状態を指す。
本明細書で使用される「炎症性疾患」という用語は、膨大な数の炎症性障害、すなわち、慢性炎症として知られる長期にわたる炎症を特徴とする炎症性異常を指すことが多い。「炎症」という用語は、病原体、損傷した細胞、又は刺激物などの有害な刺激に対する身体組織の複雑な生物学的応答を指す。これは、免疫細胞、血管、分子メディエーターが関与する防御応答である。定期的な炎症反応は、細胞傷害の最初の原因を除去し、最初の傷害や炎症過程で損傷した壊死細胞や組織を除去し、そして組織修復を開始するために身体にとって不可欠であるが、炎症性疾患は一般に、有害な刺激がなくても炎症が続くことを特徴とする。
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、機能している体の部分に対する異常な免疫応答から生じる状態を指す。それは自己免疫、すなわち自己反応性免疫応答（例えば、自己抗体、自己反応性Ｔ細胞）の存在の結果であり、それに起因する損傷又は病状の有無にかかわらず、通常は特定の器官に限定されるか、さまざまな場所の特定の組織が関与する。
特定の実施態様において、掻痒症を引き起こす炎症性疾患又は自己免疫疾患は、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から、特にアトピー性皮膚炎から選択される。
別の態様において、アレルギー性、炎症性、及び自己免疫性疾患は、アトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性自然発生性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から、特にアトピー性皮膚炎から選択される。
別の実施態様において、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、慢性非ヒスタミン関連蕁麻疹、抗ヒスタミン非応答性肥満細胞症、慢性単純苔癬、脂漏性皮膚炎、乾皮症、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、及び潰瘍性大腸炎から選択される。
別の実施態様において、本発明は、帯状疱疹後神経痛、帯状疱疹後かゆみ、感覚異常痛、多発性硬化症、及び腕橈骨掻痒症から選択される神経障害性掻痒症である疾患の治療に使用するための、本明細書で定義される多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
別の実施態様において、本発明は、かゆみを伴う全身性疾患の治療のための抗掻痒剤に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供し、前記疾患は、胆汁うっ滞、慢性腎臓病、ホジキン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫及び慢性かゆみを伴う他のリンパ腫又は白血病、真性赤血球増加症、甲状腺機能亢進症、慢性節足動物後かゆみ（Ｉｄ反応）、妊娠誘発性慢性かゆみ（例えばＰＵＰＰＰ）、好酸球性膿疱性毛包炎、薬物過敏反応、高齢者の慢性掻痒症又は乾燥性皮膚かゆみ（局所的、全身性）、及び火傷後の瘢痕部分のかゆみ（火傷後かゆみ）、遺伝性又は母斑性慢性かゆみ（例えば、ネザートン症候群、ダリエ病（モルバス・ダリエ）、ヘイリー・ヘイリー病、炎症性線状疣状表皮母斑（ＩＬＶＥＮ）、家族性原発性皮膚アミロイドーシス、オルムステッド症候群）、水原性掻痒症、グラスファイバー皮膚炎、粘液性慢性かゆみ、化学療法誘発性かゆみ、及びＨＩＶから選択される。
配列表（ＡＨｏ番号付けスキームに従って指定された変異；他に明記されない限り、ＮｕｍａｂＣＤＲ定義に従って定義されたＣＤＲ）
本出願の本文全体を通して、明細書の本文（例えば、表１～４）と配列表との間に矛盾がある場合には、明細書の本文が優先するものとする。
明確にするために、別個の実施態様に関連して説明される本発明のいくつかの特徴は、単一の実施態様において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施態様に関連して説明される本発明の様々な特徴は、個別に、又は任意の適切な部分組合わせで提供することもできる。本発明に係る実施態様のすべての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、あたかもあらゆる組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、様々な実施態様及びその要素のすべての部分組合わせも本発明に具体的に包含され、あたかもそのような部分組合わせのそれぞれが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な変更が、上記の説明から当業者には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
それぞれの特許法に基づいて可能な範囲で、本明細書で引用したすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及びその他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、上述の本発明を説明するものであるが、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者にそれ自体知られている他の試験モデルも、請求された発明の有益な効果を判定することができる。
実施例１：抗ＩＬ－４Ｒ分子の生成と試験：
プロジェクトの目的
このプロジェクトの目標は、ヒトＩＬ－４Ｒに特異的に結合し、その生物学的作用を中和するヒト化モノクローナル抗体断片を生成することであった。さらなる目標は、多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分強力で安定な抗ＩＬ－４Ｒ抗体断片を特定することであった。
１．１．本発明の多重特異性抗体に含まれる抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインの生成、選択、ヒト化、及び産生
抗ＩＬ－４Ｒウサギ抗体の生成、適切なクローンのスクリーニングと選択、及びヒト化とヒト化抗ＩＬ４Ｒ結合ドメインの産生は、参照により本明細書に組み込まれる並行特許出願ＥＰ２０２１６９２８．０に記載されているように実施した。多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分に強力かつ安定な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインが特定され、その生物物理学的及び機能的特性に基づいて選択された。
１．２．適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインの特性解析
適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインをさらに特性解析するために、以下の分析を行った。
１．２．１．特性解析に適した抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインの製造（ｓｃＦｖフォーマット）
哺乳類構築物の発現は、ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Mirus）を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞で実施した。３７℃で発現の５～７日後（細胞生存率が７０％未満に達したとき）、遠心分離とそれに続く濾過によって培養物を採取した。タンパク質を、清澄化された培養上清から、プロテインＬ親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析による評価で、すべての分子が捕捉後のモノマー含有量＞９５％の少なくとも１つの親和性クロマトグラフィー画分を示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによる仕上げを必要とする分子はなかった。試料を透析により最終緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液、ｐＨ６．４）に再緩衝化した。製造された物質の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの標準的分析方法が適用された。多重特異性抗体フォーマットへの組み込みに適していると考えられた４つのクローンに由来する８つのｓｃＦｖ分子の製造特性が表６に要約される。クローン４４－１８－Ｃ１１（ＰＲＯ１５１０）及びそのバリアント（ＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４）のＣＤＲグラフト（ｓｃ０１）及び完全グラフト（ｓｃ０４）の製造特性とそのバリアントが表７に要約される。
１．２．２．適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の薬力学的特性解析
適切であると評価されたｓｃＦｖ抗体は、１次薬力学特性について特性解析された。
ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性
ヒトＩＬ－４Ｒに対する１４のヒト化ｓｃＦｖの親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃを介して捕捉され、ｓｃＦｖが分析物として注入された。各分析物の注入サイクル後にセンサーチップが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いる用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定された。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。結果は表８に示される。表８から分かるように、クローン４４３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ抗体可変ドメインは、ヒトＩＬ－４Ｒに対して最も優れた全体的な結合親和性を示す。
カニクイザル、マーモセットサル、及びマウスＩＬ－４Ｒに対する親和性
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。マーモセットＩＬ－４Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみが利用可能であったため、マーモセットＩＬ－４Ｒに対する親和性を測定するために、直接設定を使用した。マーモセットＥＣＤはセンサーチップ上に直接固定化され、力価測定シリーズのｓｃＦｖが分析物として注入された。カニクイザル及びマーモセットＩＬ－４Ｒについて得られたＫＤ値間の比較を可能にするために、直接設定を使用してカニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに対する親和性も決定された。
ほんのわずかのｓｃＦｖが、カニクイザルＩＬ－４Ｒ ＥＣＤに結合した。直接設定での１つのｓｃＦｖと比較して、３つのｓｃＦｖは捕捉設定で交差反応性を示し、これは、２つのｓｃＦｖの結合が直接設定ではもはや測定できなかったことを意味する。これはおそらく、直接設定で測定されたＫＤ値が低くなった結果であると考えられる。違いはオンレートによるもので、これはおそらくアクセシビリティの低下により、オンレートが遅くなったのであろう。オフレートはすべてのｓｃＦｖで同等であった。
さらに、マーモセットＩＬ－４－Ｒ ＥＣＤに対する交差反応性が測定された。結果は表９に要約される。
マウスＩＬ－４Ｒへの結合は、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３５、及びＰＲＯ１５３８についても評価されたが、いずれも交差反応性を示さなかった。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるＳｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ（ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断）
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイでは、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害するヒト化ｓｃＦｖの能力を試験した。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。ｓｃＦｖ及び対照抗体デュピルマブの連続希釈物を、０．０２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。
ｓｃＦｖは、このＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイで、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断する能力について分析された。分析された分子の効力がデュピルマブと比較された。すべての効力データは表１０に要約される。相対ＩＣ５０値は、デュピルマブ及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。８つのｓｃＦｖが、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を高い効力で遮断した。クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ及びＰＲＯ１５５２は、全体として最高の遮断能力を示した。ＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１５３８、及びＰＲＯ１５５２は、デュピルマブと同様の効力でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断することができた。
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－４ＲへのｈＩＬ－４結合の阻害）
ヒト化ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用してさらに決定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、ＥＰ２０２１６９２８．０に記載されているのと同じ手順を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
７つのｓｃＦｖは、ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒの間の相互作用を良好な効力～高い効力で阻害した。クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ及びＰＲＯ１５５２は、全体として最高の遮断能力を示した。ＰＲＯ１５１７及びＰＲＯ１５５２の遮断能力はデュピルマブと同様であった。一方、ＰＲＯ１５３８は中程度の阻害のみを示した。５つのｓｃＦｖ分子は阻害を示さなかった。
ｓｃＦｖの薬理学的特性解析と開発可能性評価のための分子選択の概要
４つの異なるＢ細胞クローンに由来する１４個のｓｃＦｖの薬理学的特性解析は、拡張された生物物理学的特性解析のための分子選択の基礎を提供した。ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ及びＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒ遮断ＥＬＩＳＡにおける、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の中和に関する全体的に優れた性能に基づいて、さらに拡張された特性解析のために、５つの分子、すなわちＰＲＯ１５１７、ＰＲＯ１５３５、ＰＲＯ１５２４、ＰＲＯ１５０６、及びＰＲＯ１５３８が選択された。７つの分子すべてが５００ｐＭより優れた親和性を示した。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して非常に低い親和性を示すか結合を示さなかった３分子を除いて、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性は、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して４～２０倍低かった。特に、クローン４４－１８－Ｃ１１に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１０、ＰＲＯ１５２８、及びＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４は、カニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合を示さなかった。一般に、マーモセットサルＩＬ－４Ｒに対するこれらのｓｃＦｖの親和性も、ヒトＩＬ－４Ｒと比較して低かった。これらの親和性試験の結果、クローン４４－１８－Ｃ１１に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１０、ＰＲＯ１５２８、及びＰＲＯ１５４９～ＰＲＯ１５５４は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性がないため、さらなる評価から除外されたが、ＰＲＯ１５５２は非常に優れた阻害効力を示した。同じ理由で、ＰＲＯ１５２０も除外された。しかし、同じクローン４４－３９－Ｂ０７に基づくＰＲＯ１５３８は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する結合親和性が弱いにもかかわらず、除外されなかった。
１．２．３．適切な抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の生物物理学的特性解析
安定性測定用材料の製造
ＰＲＯ１５１７及びＰＲＯ１５３８は、安定性評価に十分な材料を生成するために、上記と同じ製造プロセスを使用して、わずかに大きなスケール（発現量０．２５ｌ）で再度生成された。安定性評価のために選択された他のタンパク質については、以前に生成された材料の量が安定性評価を行うのに十分であった。試料は、精製後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｉＰ、ｐＨ６．４）中で調製された。精製と透析後、５ＭＷＣＯの遠心濃縮チューブを使用してタンパク質試料を１０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮したが、これは保存安定性評価を行うための望ましい濃度であるためである。
表１１に示されるように、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮したときのモノマー損失は、分子に応じて０～１２％であった。ＰＲＯ１５０６とＰＲＯ１５２４のモノマー含有量は、保存安定性評価に入る分子の臨界値である９５％を下回り、このため、これらを試験から除外した。しかし材料は既に調製され、試験用にすべてが準備されていたため、これらの分子の安定性を、濃縮後に９５％を超えるモノマー含有量を示した残りの分子と並行して評価した。クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１７とＰＲＯ１５３５、並びにＰＲＯ１５３８は、濃縮しても実質的にモノマー含有量の損失を示さなかった。
保存安定性試験
ヒト化ｓｃＦｖは、４週間の安定性試験などの安定性試験に供され、ここでｓｃＦｖは、水性緩衝液（５０ｍＭＮａＣｉＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）中で１０ｍｇ／ｍｌで調製され、＜－８０℃、４℃、及び４０℃で４週間保存された。少なくとも、調製物中のモノマー及びオリゴマーの割合は、各試験の１週間後、２週間後、及び終了時のＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価された。ほとんどの分子について追加の時点が記録された。表１２は、試験の１４日目（ｄ１４）と２８日目（ｄ２８）に得られたエンドポイント測定値を比較している。
表１２から分かるように、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖ、すなわちＰＲＯ１５１７とＰＲＯ１５３５は、４℃で良好な保存安定性を示した。４℃で２８日間保存した後のモノマー含有量の損失は５％未満であった。また、ＰＲＯ１５３８は少なくとも１４日間は良好な保存安定性を示した。しかし、安定な分子はどれも、どの温度でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
凍結融解安定性
上記の保存安定性試験に加えて、凍結－融解（Ｆ／Ｔ）サイクルに関する最高性能のｓｃＦｖ分子の適合性（コロイド安定性）を評価した。開発の初期段階では、原薬は通常冷凍保存されるため、調製及び充填／仕上げ処理には、ある程度の凍結と融解操作が必要になる。
Ｆ／Ｔ安定性評価では、保存安定性試験と同じ分析方法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びパラメーター（モノマー含有率％とモノマー損失％）を適用して、５回のＦ／Ｔサイクルにわたって分子の品質を追跡した。表１３は、５回のＦ／Ｔサイクルにわたるモノマー含有量損失％の経過を示す。専用の凍結－融解試験は実施されていないため、２８日間にわたって取得された保存安定性試験の－８０℃試料で得られた凍結－融解データが示される。一部のタンパク質では４つの時点しか記録できなかったため、これらのタンパク質ではＦ／Ｔサイクルも４回だけ実施された。
熱アンフォールディング
選択した５つのｓｃＦｖ構築物の熱アンフォールディング測定を、示差走査蛍光法（ＤＳＦ）を使用して実施した。得られた熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で計算されたアンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ １０％）値を、データをボルツマン方程式に当てはめることによって決定した。表１４は、ＤＳＦによって測定された計算された融解温度をまとめたものである。表１４から推測できるように、クローン４４－３４－Ｃ１０に基づくｓｃＦｖは、６３℃を超える高い融解温度を示す。また、ＰＲＯ１５３８も高い融解温度を示した。
実施例２：抗ＩＬ３１分子の生成と試験：
プロジェクトの目的
このプロジェクトの目標は、ヒトＩＬ－３１に特異的に結合し、その生物学的作用を中和するヒト化モノクローナル抗体断片を生成することであった。さらなる目標は、多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分強力で安定な抗ＩＬ－３１抗体断片を特定することであった。
２．１．本発明の多重特異性抗体に含まれる抗ＩＬ－３１結合ドメインの生成、選択、ヒト化、及び産生
抗ＩＬ－３１ウサギ抗体の生成、及び適切なクローンのスクリーニングと選択、並びにヒト化とヒト化抗ＩＬ－３１結合ドメインの産生は、参照により本明細書に組み込まれる並行特許出願ＥＰ２０２１６９３８．９に記載されているように実施した。多重特異性抗体フォーマットに組み込むのに十分強力で安定した抗ＩＬ－３１結合ドメイン抗体が特定され、それらの生物物理学的及び機能的特性に基づいて選択された。クローン５０－０９－Ｄ０７は、全体的に最高の生物物理学的及び機能的特性を有することが特定された。
２．２．適切な抗ＩＬ－３１結合ドメインの特性解析
適切な抗ＩＬ－３１結合ドメインをさらに特性解析するために、以下の分析を行った。
２．２．１．特性解析に適した抗ＩＬ－３１結合ドメインの製造（ｓｃＦｖフォーマット）
哺乳類構築物の発現は、セクション１．２．１で上述したように、ＣＨＯ－Ｓ細胞で実施された。１つのクローン（すなわちクローン５０－０９－Ｄ０７）に由来する２つのｓｃＦｖｃ０１及びｓｃ０３構築物（それぞれＰＲＯ１６３２及びＰＲＯ１６４３）の製造が表１５に要約される。
２．２．２．適切な抗ＩＬ－３１結合ドメインの薬力学特性解析（ｓｃＦｖフォーマット）
適切であると評価されたｓｃＦｖ抗体、すなわちＰＲＯ１６３２及びＰＲＯ１６４３は、１次薬力学特性について特性解析された。
ヒト及びカニクイザルＩＬ－３１に対する親和性
ヒト及びカニクイザルＩＬ－３１に対する２つのヒト化ｓｃＦｖの親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。カニクイザルＩＬ－３１は市販されていなかったため、要求に応じてSino Biologicalによって製造された。ヒト及びカニクイザルのＩＬ－３１－Ｈｉｓは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に結合した抗Ｈｉｓタグ抗体を介して捕捉され、ｓｃＦｖが分析物として注入された。各分析物の注入サイクル後にセンサーチップが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈された２つの濃度（３０及び１０ｎＭ）で高処理能力モードで用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。
表１６に示されるように、両方のヒト化ｓｃＦｖについてヒトＩＬ－３１への結合が確認された。
ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイ（ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達の遮断）
ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイを使用して、ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲヘテロダイマーを介してＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害するヒト化ｓｃＦｖの能力を試験した。ウェルあたり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。翌日、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３１の存在下で、ｓｃＦｖ及び対照抗体ＢＭＳ－９８１１６４の連続希釈物をプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、検出溶液を添加し、プレートをさらに１時間インキュベートし、発光を測定した。
２つのｓｃＦｖを細胞アッセイで試験した。上述したように、分析した分子の効力をＢＭＳ－９８１１６４と比較した。
相対ＩＣ５０値は、ＢＭＳ－９８１１６４及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。効力データは表１７に要約される。
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－３１ＲＡへのｈＩＬ－３１の結合の阻害）
２つのヒト化ｓｃＦｖの効力が、競合ＥＬＩＳＡを使用してさらに測定された。ヒトＩＬ－３１とヒトＩＬ３１ＲＡとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、ＥＰ２０２１６９３８．９に記載されているのと同じ手順を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイと同様に、各プレート上の個々のＩＣ５０値を参照分子ＢＭＳ－９８１１６４のＩＣ５０に対して較正した。完全グラフトｓｃＦｖは、ＢＭＳ－９８１１６４と比較した場合、同様の効力でヒトＩＬ－３１とヒトＩＬ－３１ＲＡ間の相互作用を阻害した。効力データは表１８に要約される。
ｓｃＦｖの薬理学的特性解析と詳細な生物物理学的評価のための分子選択の概要
２つのｓｃＦｖの薬理学的特性解析は、詳細な生物物理学的評価のための分子選択の基礎を提供した。これらの結果に基づいて、全体的に優れた性能を基準にして、詳細な生物物理学的評価のためにＰＲＯ１６４３が選択された。
２．２．３．適切な抗ＩＬ－３１結合ドメインの生物物理学的特性解析（ｓｃＦｖフォーマット）
安定性材料の製造
ＰＲＯ１６４３を、上記と同じ製造プロセスを使用して、わずかに大きなスケール（発現容量０．２５ｌ）で再度製造して、安定性評価に十分な材料を生成した。試料は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｉＰ、ｐＨ６．４）中で調製された。タンパク質は、精製及び透析後、５ＭＷＣＯの遠心濃縮管を使用して＞１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。
表１９に示されるように、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮したときのモノマー損失は０．１％であった。
保存安定性試験
ＰＲＯ１６４３は、４週間の安定性試験などの安定性試験に供され、ここでｓｃＦｖは、水性緩衝液（最終緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｉＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）で１０ｍｇ／ｍｌで調製され、＜－８０℃、４℃、及び４０℃で４週間保存された。調製物中のモノマー及びオリゴマーの割合は、試験のさまざまな時点でＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価された。さらに、タンパク質濃度は、さまざまな時点でのＵＶ２８０測定によって決定された。表２０は、試験の１４日目と、２８日目に得られたエンドポイント測定値を比較している。
ＰＲＯ１６４３は、４℃及び試験２８日目にモノマー含有量の大幅な損失を示さなかった。ＰＲＯ１６４３は、どの温度でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
凍結－融解安定性
上記の保存安定性試験に加えて、凍結－融解（Ｆ／Ｔ）サイクルに関するＰＲＯ１６４３の適合性（コロイド安定性）も評価された。
Ｆ／Ｔ安定性評価では、保存安定性試験と同じ分析方法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ－Ｖｉｓ）及びパラメーター（モノマー含有率％及びモノマー損失％）を適用して、３回のＦ／Ｔサイクルにわたる分子の安定性を追跡した。表２１は、３回のＦ／Ｔサイクルにわたるモノマー含有量（％）及びモノマー含有量損失％の経過を示す。専用の凍結－融解試験は実施されていないため、２８日間にわたって取得された保存安定性試験の－８０℃試料で得られた凍結－融解データが以下の表に示される。試料ごとに３つの時点しか記録できなかったため、凍結－融解安定性データは３回のＦ／Ｔサイクルについてのみ利用できる。
熱アンフォールディング
ＰＲＯ１６４３の熱アンフォールディング測定は、示差走査蛍光法（ＤＳＦ）を使用して実施された。得られた熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナル値の１０％で計算されたアンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ １０％）値を、データをボルツマン方程式に当てはめることによって決定した。表２２は、ＤＳＦによって測定された計算された融解温度をまとめたものである。
実施例３：多重特異性フォーマットのための抗ＩＬ－４Ｒ分子の選択と最適化：
３．１．抗ＩＬ－４Ｒドメインの選択に関する一般的な説明
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）及びＰＲＯ１５３５（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０４）は、非常に良好な薬力学的特性と許容可能～良好な安定性を示すため、最初に選択された。ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）は、改善余地のある薬理学的特性を有したが、最高の安定性を示したため、同様に選択された。以下の３．２に示されるように、ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は安定性の最適化を受け、及びＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４）はｐＩバランスの最適化を受けた。
最終的な多重特異性抗体に適用された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメインは、カニクイザル及びマーモセットサルに対して排他的な交差反応性を示した。
３．２．抗ＩＬ－４Ｒドメインの最適化
抗ＩＬ－４ＲドメインＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）及びＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、多重特異性フォーマットへの組み立てのためにさらに最適化された。
抗ＩＬ－４Ｒドメイン４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０４（ＰＲＯ１５３８）の最適化
ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）は、ＶＬとＶＨの間にｐＩの不均衡がある（ｐＩＶＬ＝８．２及びｐＩＶＨ＝５．０）。ｐＩの不均衡は高粘度と相関しており、安定性に悪影響を与える可能性がある。従って、この分子の２つの新しいバリアントが設計された。これらのバリアントは以下で説明される。簡単に説明すると、ｐＩ不均衡が除去され、結合親和性を損なうことのない、及び重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することのない分子を設計することを目的として、ＶＨのすべての残基が詳細に分析された。
２つのバリアントが設計され、これらは表２３に要約される。
しかしながら、ＰＲＯ１５３８（４４－３９－Ｂ０７－ｓｃ０３）のこれらのバリアントは、望ましい安定性の改善を示さなかった。ＰＲＯ１５３８は、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害する効力が著しく低く、ＩＬ－４とＩＬ－４Ｒの相互作用を遮断する能力がＰＲＯ１５１７よりも１０倍以上低いため、ＰＲＯ１５３８及びそのバリアントはさらなる検討から除外され、ＲＰＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）の改善に努力が集中された。
抗ＩＬ－４Ｒドメイン４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１（ＰＲＯ１５１７）の最適化
ＰＲＯ１５１７（４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１）は、良好な結合特性を備えた抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖである。生物物理学的特性解析中、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１５１７は良好ではあるが、まだ改善余地のある溶解度を示した。溶解度、長期安定性、濃度挙動に関して、ＰＲＯ１５１７をさらに改善する試みが行われた。従って、この分子の４つの新しいバリアントが設計された。これらのバリアントは以下で説明される。簡単に説明すると、ＣＤＲ又は以前のＶＨ－ＣＨ界面中の疎水性パッチが詳細に分析され、結合親和性を損なうことなく、重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することなく、疎水性パッチが除去された分子を設計することを目的として、ｐＩ不均衡が低減されている。
４つのバリアントが設計され、これらは表２４に要約される。
３．３．最適化された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の生物物理学的特性解析
保存安定性試験
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．２．３で上述した保存安定性試験に供された。結果は表２５に要約される。
表２５に示されているように、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は優れた保存安定性を示す。４℃で２８日間保存した後のモノマー含有量の損失は５％未満であった。また、これらの分子はいずれの温度でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
熱アンフォールディング
ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９の熱安定性は、NanoTemperを使用するナノダイナミック走査蛍光分析（ｎＤＳＦ）によって分析され、アンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディングの中点（Ｔｍ１）、及び散乱開始温度を決定することができた。二重／三重測定のＴｍ１及びＴｏｎｓｅｔ結果は表２６に要約される。表２６から推測できるように、ＰＲＯ１８９７、ＰＲＯ１８９８、及びＰＲＯ１８９９は高い融解温度を示す。
３．４．最適化された抗ＩＬ－４Ｒ結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の薬力学的特性解析
ヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性
セクション１．２．２で上述したように、最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のヒトＩＬ－４Ｒに対する親和性を、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した０．１２～９０ｎＭの範囲の７つの分析物濃度を用いて、用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。
表２７に示されるように、すべての最適化されたｓｃＦｖについて、ヒトＩＬ－４Ｒ及びカニクイザルＩＬ－４Ｒへの結合が確認された。
カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９のカニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性を、ヒトＩＬ－４Ｒ親和性の分析と同じ設定を使用して測定したが、セクション１．２．２で前述されたように、ヒトＩＬ－４Ｒ－Ｆｃの代わりにカニクイザルＩＬ－４Ｒ－Ｆｃが捕捉された点が異なる。この分析の結果は表２８に要約される。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞におけるｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ（ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達の遮断）
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９は、セクション１．２．２で前述されたように、ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を遮断する能力について、このＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイで分析された。分析された分子の効力を、デュピルマブと比較した。すべての効力データが表２９に要約される。相対ＩＣ５０値を、デュピルマブ及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算した。最適化されたｓｃＦｖは、デュピルマブと同様の高い効力でＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断した（図３を参照）。
競合ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ－４ＲへのｈＩＬ－４結合の阻害）
最適化された抗ＩＬ－４Ｒ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９ｓｃＦｖの効力は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ヒトＩＬ－４とヒトＩＬ－４Ｒとの相互作用を阻害する各ｓｃＦｖの効力を、セクション１．２．２に記載されているようにＥＬＩＳＡによって評価した。同様に、ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイに対して、各プレート上の個々のＩＣ５０値を、参照分子デュピルマブのＩＣ５０に対して較正した。
競合ＥＬＩＳＡ分析の結果は表３０に要約される。ＰＲＯ１８９８及びＰＲＯ１８９９の遮断効力はデュピルマブと同様であった（図４を参照）。
実施例４：多重特異性フォーマットのための抗ＩＬ３１分子の選択と最適化：
４．１．抗ＩＬ－３１ドメインの選択に関する一般的な説明
抗ＩＬ－３１ドメインＰＲＯ１６４３（５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０３）は、望ましい薬力学特性と優れた安定性を示すため、さらなる開発のために最初に選択された。それにもかかわらず、抗ＩＬ－３１結合ドメインＰＲＯ１６４３（５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０３）は、以下の４．２に示されるように、さらに溶解性が向上した。
最終的な多重特異性抗体に適用された抗ＩＬ－３１結合ドメインは、カニクイザルＩＬ－３１と交差反応する。
４．２．抗ＩＬ－３１ドメインの最適化
抗ＩＬ－３１ドメインＰＲＯ１６４３（５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０３）は、多重特異性フォーマットへの組み立てのためにさらに最適化された。
抗ＩＬ－３１ドメイン５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０３の最適化
ＰＲＯ１６４３（５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０３）は非常に安定な抗ＩＬ－３１ｓｃＦｖであるが、それでも、溶解度、長期安定性、及び濃度挙動の改良が試みられた。従って、この分子の新しいバリアントが設計された。これらのバリアントは以下で説明される。簡単に説明すると、結合親和性を損なうことなく、重大な配列欠陥（化学修飾及び翻訳後修飾）、Ｔ細胞エピトープなどを導入することなく、疎水性パッチが除去された分子を設計することを目的として、ＣＤＲ又は以前のＶＨ－ＣＨ界面の疎水性パッチが詳細に分析されている。
４つのバリアントが設計され、これらは表３１に要約される。
４．３．最適化された抗ＩＬ－３１結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の生物物理学的特性解析
保存安定性試験
ＰＲＯ１９００、ＰＲＯ１９０１、ＰＲＯ１９０２、及びＰＲＯ１９０３は、セクション１．２．３で上述された保存安定性試験に供されたが、最後の読み取りは１４日目に行われ、Ｆ／Ｔ及び－８０℃での安定性は評価されなかった。結果は表３２に要約される。
表３２に要約されるように、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１９００、ＰＲＯ１９０１、ＰＲＯ１９０２、及びＰＲＯ１９０３は、優れた保存安定性を示した。４℃で１４日間保存した後のモノマー含有量の損失は０．２％未満であり、４０℃で１４日間保存した後のモノマー含有量の損失は３％未満であった。また、これらの分子はいずれも、どの温度及びデータ点でもタンパク質含有量の大幅な損失を示さなかった。
熱アンフォールディング
ＰＲＯ１９００、ＰＲＯ１９０１、ＰＲＯ１９０２、及びＰＲＯ１９０３の熱安定性は、NanoTemperを使用したナノ動的走査蛍光分析（ｎＤＳＦ）によって分析され、アンフォールディングの開始（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディングの中点（Ｔｍ１）、及び散乱開始温度を決定することができた。二重／三重測定のＴｍ１及びＴｏｎｓｅｔ結果は表３３に要約される。表３３から推測できるように、ＰＲＯ１９００、ＰＲＯ１９０１、ＰＲＯ１９０２、及びＰＲＯ１９０３は高い融解温度を示した。
４．４．最適化された抗ＩＬ－３１結合ドメイン（ｓｃＦｖフォーマット）の薬力学特性解析
ヒトＩＬ－３１に対する親和性
ＰＲＯ１６４３及び最適化抗ＩＬ－３１ ｓｃＦｖのヒトＩＬ－３１に対する親和性は、セクション２．２．２で上述したように、Ｔ２００装置（Biacore、GEHealthcare）でＳＰＲ分析によって測定した。ｓｃＦｖは、ランニング緩衝液で希釈した２つの濃度（３０及び１０ｎＭ）を用いて、高処理能力モードで、用量応答マルチサイクル動態アッセイを使用して測定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用してフィッティングされた。
表３４に示されるように、すべての最適化されたｓｃＦｖについて、ヒトＩＬ－３１及びカニクイザルＩＬ－３１への結合が確認された。
Ｐａｔｈ Ｈｕｎｔｅｒ ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイ（ヒトＩＬ－３１誘導性シグナル伝達の遮断）
ＰＲＯ１６４３及び最適化されたｓｃＦｖは、ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲヘテロダイマーを介してＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害する能力について、ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイを使用して試験された。アッセイは上記のように実施された。分析された分子の効力をＢＭＳ－９８１１６４と比較した。
相対ＩＣ５０値は、ＢＭＳ－９８１１６４及びｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍｌ）で計算された。効力データは表３５に要約される。表３５に説明されているように、ＰＲＯ１６４３並びに最適化されたバリアントＰＲＯ１９００、ＰＲＯ１９０１、及びＰＲＯ１９０３は、ＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を強力に中和することができた。溶解度と安定性を最適化するためにバリアントＰＲＯ１９０２に導入された変異は、明らかに、ＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害する能力の破壊をもたらした。
実施例５：モリソン－Ｈ ＩｇＧ１－Ｆｃサイレンス化に基づく抗ＩＬ－４ＲｘＩＬ－３１二重特異性抗体
５．１．モリソン－Ｈデザイン
モリソンフォーマット（ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）２フォーマットとも呼ばれる）は、Ｆｃ領域と２つのｓｃＦｖドメインとを含む２価で二重特異性のＩｇＧベースの分子フォーマットであり、リンカーを介して重鎖のＣ末端に融合されている［一般にモリソン－Ｈフォーマットと呼ばれる（図２Ａを参照）］か、又はリンカーを介して軽鎖のＣ末端に融合されている［一般にモリソン－Ｌフォーマットと呼ばれる（図２Ｂを参照）］。
抗ＩＬ－４ＲｘＩＬ－３１二重特異性抗体の最初のシリーズでは、モリソン－Ｈフォーマットが選択され、ここで、Ｆｃ領域は、二重変異Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（一般に「ＬＡＬＡ変異」と呼ばれる）によってサイレンス化されたＩｇＧサブクラスＩｇＧ１に由来する。２つの非常に安定なλキャップ付きｓｃＦｖｓドメインが、重鎖Ｃ末端に融合された。
上記のモリソン－Ｈフォーマットを有する全部で１９個の二重特異性抗体が設計され、これは、１分子を除いてＦａｂアーム上に抗ＩＬ－４Ｒドメインを担持する。５つのクローンに由来する１３の異なる抗ＩＬ－４Ｒドメインと、２つのクローンに由来する３つの抗ＩＬ－３１ドメインとを組み合わせた。これらの二重特異性モリソン－Ｈ抗体のうち９つは良好な薬理学的特性を示した。これらのモリソン－Ｈ抗体は表３６に要約される。
５．２．モリソンＨ－分子の生成
多重特異性構築物の発現は、一過性ＣＨＯｇｒｏ発現システム（Mirus）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ－Ｓ細胞で実施された。目的の遺伝子は哺乳類での発現用に最適化され、合成され、標準的なｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローン化された。発現培養物を、振盪フラスコを使用してバッチで３７℃で６～７日間培養した（細胞生存率＜７０％）。全発現期間にわたって３７℃に保たれたＰＲＯ１９８２、ＰＲＯ２０７８、及びＰＲＯ２０８０を除いて、表３７に列挙されたすべての分子の発現の１日後に、発現温度を３２℃に下げた。遠心分離とその後の０．２２μｍ滅菌濾過により、培養上清を細胞から分離した。標的タンパク質は、プロテインＬ又はＡ親和性クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの仕上げ工程（捕捉後に既に、ＳＥ－ＨＰＬＣによって評価された適切なモノマー含有量を含む画分が利用可能でなかった場合）によって、清澄化した培養上清から捕捉された。製造された材料の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＵＶ２８０などの標準的な分析方法が使用された。
表３７は、これらの分子の生成の概要を示す。すべての分子は、ＳＥＣ仕上げ工程後にモノマー含有量＞９８％で最終仕上げされた。
５．３．生物物理学的及び薬理学的特性解析
９つの多重特異性分子、すなわちＰＲＯ１９２９、ＰＲＯ１９３０、ＰＲＯ１９８２、並びにその改良バリアントＰＲＯ２０７７及びＰＲＯ２０７８；ＰＲＯ１９７３並びにその改良バリアントＰＲＯ２０７９及びＰＲＯ２０８０；並びにＰＲＯ１９７７が、さらなる特性解析のために選択された。
プロセス及び製剤開発に対する適合性を決定するために、前記９つの分子に対して広範な生物物理学的特性解析が行われた。これらの分子は、融解温度と凝集温度、１５０ｇ／ｌを超える濃度での溶解度、４℃と２５℃で２週間後のモノマー含有量の損失、流体力学半径と電荷バリアントの増加、及びタンパク質のクリッピングを評価する一連の方法によって特性解析された。溶解度もＰＥＧスクリーニングによって評価された。ＰＲＯ１９２９では、モノマー含有量の損失と流体力学的半径の増加が決定された。
これらの結果に基づくと、ＰＲＯ２０７７、ＰＲＯ２０８０、ＰＲＯ１９７７、ＰＲＯ１９２９が最良の構築物である。これらは、それぞれ抗ＩＬ－４Ｒドメイン４４－１８－Ｃ１１－ｓｃ１４、４４－３９－０９－ｓｃ０６、４４－０３－Ａ０４－ｓｃ０３、及び４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０１と、抗ＩＬ－３１ドメイン５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０４を保持する。意図した目標濃度１５０ｇ／ｌがすべての分子で達成された。４℃及び２５℃での保存中のモノマーの安定性に関して、ＰＲＯ１９２９及びＰＲＯ２０８０が最も優れたプロフィールを示した。化学的安定性とプロセス開発に関して、ＰＲＯ２０７７とＰＲＯ２０８０が良好なｐＨ安定性と低い電荷バリアントの複雑性を示した。
薬理学的な観点から見ると、ＰＲＯ２０７７はデュピルマブと比較して、ＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を遮断する効力が２倍優れている。この分子の抗ＩＬ－４ＲドメインはカニクイザルＩＬ－４Ｒと交差反応しない。ＰＲＯ２０８０、ＰＲＯ１９７７、及びＰＲＯ１９２９は、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達を阻害する効力がデュピルマブよりも約２～３倍弱い。ＰＲＯ２０８０及びＰＲＯ１９７７は、結合力に基づいてカニクイザルＩＬ４Ｒに対して交差反応性を示すようである。ＰＲＯ１９２９のバリアントは代用物.として機能することができた。ＰＲＯ１９２９は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して強い交差反応性を示し、ＰＲＯ２０８０及びＰＲＯ１９７７と比較して、ＩＬ－４Ｒシグナル伝達を阻害する同様の効力を示す。すべての分子は、ＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を強力に遮断し、カニクイザルＩＬ－３１に対して交差反応性である。さらに、すべての分子は両方のヒト標的に対してピコモルの親和性を示す。
実施例６：モリソン－Ｈ及びモリソン－ＬＩｇＧ４に基づく抗ＩＬ－４ＲｘＩＬ－３１二重特異性抗体
６．１．モリソンフォーマットデザイン
抗ＩＬ－４ＲｘＩＬ－３１二重特異性抗体の第２のシリーズでは、Ｆｃ領域がＩｇＧサブクラスＩｇＧ４に由来するモリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌフォーマットが選択された。２つの非常に安定なλキャップ付きｓｃＦｖドメインが、重鎖（モリソン－Ｈ）又は軽鎖（モリソン－Ｌ）のＣ末端に融合された。
カニクイザルの交差反応性、優れた効力、及び優れた生物物理学的特性に基づいて、ＰＲＯ１９２９ファミリーのＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１ドメインを含む構築物が優先された。
上記の分子の再フォーマット化には、ＰＲＯ１９２９ファミリーＩＬ－４Ｒ結合剤の２つのバリアントが含まれており、これらは４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０８と４４－３４－Ｃ１０－ｓｃ０９であった。同じＩＬ－３１結合ドメインがすべての構築物に含まれており、これは５０－０９－Ｄ０７－ｓｃ０４であった。
全部で７つのＩｇＧ４－（ｓｃＦｖ）２分子、すなわち４つのモリソン－Ｈ分子と３つのモリソン－Ｌ分子が設計された。表３８（モリソン－Ｈ）及び表３９（モリソン－Ｌ）に示されるように、１つのクローンに由来する２つの異なる抗ＩＬ－４Ｒドメイン及び１つの抗ＩＬ－３１ドメインを組み合わせた。
６．２．ＳＰＲによる結合親和性と特異性の評価
ヒト及びカニクイザルＩＬ－４Ｒに対する親和性
二重特異性モリソン－Ｈ（ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９）及びモリソン－Ｌ（ＰＲＯ２２０６、ＰＲＯ２２０７）分子の組換えヒトＩＬ－４Ｒタンパク質（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Sino Biological）への結合動態（親和性を含む）は、Ｔ２００装置（Biacore, Cytiva）でＳＰＲ分析によって測定された。このＳＰＲ実験では、モリソン分子は、カルボキシルメチル化デキストラン表面（ＣＭ５センサーチップ；Biacore, Cytiva）に共有結合的に固定化された抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Human Antibody Capture キット；Biacore, Cytiva）を介して捕捉され、及びヒトＩＬ－４Ｒ ＥＣＤの力価測定シリーズを分析物として注入した。各分析物の注入サイクル後、センサーチップが再生され（ＭｇＣｌ２）、その後新しいモリソン抗体が再捕捉された。ヒトＩＬ－４Ｒへの結合動態は、マルチサイクル動態アッセイで、ランニング緩衝液（ヘペス緩衝化生理食塩水、０．０５％ツイーン－２０、ｐＨ７．５）で希釈した０．１７５～４５ｎＭの範囲の９つの分析物濃度を使用して測定された。見かけの解離定数（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数、及び見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、Biacore解析ソフトウェア（Biacore Evaluation ソフトウェアバージョン３．２、Cytiva）で、１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算され、そして、適合の品質は、曲線フィッティングの品質の尺度であるＣｈｉ２とＵ値に基づいて追跡された。結合レベルは、理論上のＲｍａｘに対して正規化された、達成された最大安定結合として計算された。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する交差反応性は、ヒトＩＬ－４Ｒ動態の分析と同じ設定を使用して測定したが、組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Acro Biosystems）タンパク質をヒトＩＬ－４Ｒの代わりの分析物を使用した点が異なる。
表４０に示されるように、モリソン－Ｈ抗体及びモリソン－Ｌ抗体について、ヒトＩＬ－４Ｒへの高い親和性結合が証明された。計算されたＫＤ値は、２９１ｐＭ～４８ｐＭで非常に類似した範囲であり、モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８は、ヒトＩＬ－４Ｒへの結合に関して２９１±１３６ｐＭの親和性を有した。カニクイザルＩＬ－４Ｒに対する動態親和性も、試験した分子間で類似しており（２０９～１１ｐＭ）、ＰＲＯ２１９８モリソン－Ｈ抗体について測定された親和性は１４４±４９ｐＭであり、従って、カニクイザル起源のＩＬ－４Ｒに対するすべての分子の交差反応性が証明されている。
ヒト及びカニクイザルＩＬ－３１に対する親和性
二重特異性モリソン－Ｈ（ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９）及びモリソン－Ｌ（ＰＲＯ２２０６、ＰＲＯ２２０７）分子の組換えヒトＩＬ－３１タンパク質（Peprotech）への結合動態（親和性を含む）は、Ｔ２００装置（Biacore, Cytiva）でＳＰＲ分析によって決定された。このＳＰＲ実験では、ヒト組換えＩＬ－４Ｒタンパク質（Ｆｃタグ付きＥＣＤ、R&D Systems）で固定化されたカルボキシルメチル化デキストラン表面（ＣＭ５センサーチップ；Biacore, Cytiva）にモリソン抗体を注入し、力価測定シリーズのヒトＩＬ－３１を分析物として注入した。ヒトＩＬ３１に対する親和性を、シングルサイクル動態アッセイを使用して、ランニング緩衝液（ヘペス緩衝化生理食塩水、０．０５％ツイーン－２０、ｐＨ７．５）で希釈した０．０５～３０ｎＭの範囲の５つの連続分析物濃度を注入して測定し、分析物の注入後のセンサーチップ表面の再生を行わなかった。動態及び見かけの解離平衡定数（ＫＤ）の計算、並びに曲線フィッティングの質の測定は、ＩＬ－４Ｒについて上述したように行った。結合レベルは、理論上のＲｍａｘに対して正規化された、達成された最大安定結合として計算された。カニクイザルＩＬ－３１に対する交差反応性は、ヒトＩＬ－３１親和性の分析と同じ設定を使用して測定されたが、ヒトＩＬ－３１の代わりに、分析物として組換えカニクイザルＩＬ－３１（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Sino Biological）タンパク質が使用されたことが異なる。
組換えＩＬ－３１への結合動態を測定するために使用されるＳＰＲ設定の前提条件は、固定化ヒトＩＬ－４Ｒを介するモリソン－Ｈ抗体及びモリソン－Ｌ抗体の捕捉である。以前に試験されたすべてのモリソン抗体は、固定化ヒトＩＬ－４Ｒへの安定した結合を示したため、設定が有効であることが証明された。このＳＰＲ設定を使用する理論的根拠は、ＩＬ－３１結合部位の立体障害を最小限に抑えながら、捕捉されたモリソン分子の均一な配向を保証することである。
組換えヒトＩＬ－４Ｒタンパク質を介するモリソン抗体の安定した捕捉を示した後、ＩＬ－３１を分析物として注入し、捕捉されたモリソン分子へのＩＬ－３１の結合動態を計算した。表４１に示されるように、試験したすべてのモリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ分子は、同様の親和性（それぞれ１５２～５２ｐＭ及び１６９～１０３ｐＭ）でヒトＩＬ－３１及びカニクイザルＩＬ－３１に結合する。ＰＲＯ２１９８モリソン－Ｈ抗体は、５２±１８ｐＭの計算ＫＤでヒトＩＬ－３１に結合し、１０±１ｐＭの結合親和性で組換えカニクイザルＩＬ－３１タンパク質に結合することを示し、従って、良好な交差反応性が確認された。
ヒトＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１並びにカニクイザルＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１への同時結合
モリソン－Ｈ抗体とモリソン－Ｌ抗体についての同時結合を、Ｔ２００装置（Biacore, Cytiva）でＳＰＲ分析によって評価した。上述したように、モリソン抗体のＩＬ－３１（ヒト及びカニクイザルの両方）への結合は、モリソン抗体がＩＬ－４Ｒ相互作用を介してセンサーチップ表面に捕捉されたときに最もよく測定される。これは、抗体の分子配向が均一であり、ＩＬ－３１結合部位の立体障害が最小限であるためである。従って、試験したモリソンのヒトＩＬ－４Ｒ及びヒトＩＬ－３１の両方への同時結合を、ヒト組換えＩＬ－４Ｒタンパク質（Ｆｃタグ、R&D Systems）で固定化されたカルボキシルメチル化デキストラン表面（ＣＭ５センサーチップ；Biacore, Cytiva）上にモリソン抗体を注入し、続いて単一の高濃度（４５ｎＭ）のヒトＩＬ－３１を分析物として注入することによって評価した。ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の同時結合を、上で報告したようにヒトＩＬ－３１の動態測定中に、４５ｎＭのヒトＩＬ－３１の注射からの結合レベルを使用することによって評価した。カニクイザルＩＬ－４Ｒ及びカニクイザルＩＬ－３１の両方に対するＰＲＯ２１９８の同時結合は、センサーチップ表面に固定化された組換えカニクイザルＩＬ－４Ｒ（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Acro Biosystems）及び組換えカニクイザルＩＬ－３１（Ｈｉｓタグ付きＥＣＤ、Sino Biological）タンパク質を分析物として使用したことを除き、ヒトＩＬ－４Ｒ及びヒトＩＬ－３１と同様に測定した。
ヒトＩＬ－４Ｒ及びヒトＩＬ－３１への同時結合は、図５でＰＲＯ２１９８について例示的に示されているように、試験したすべてのモリソン抗体（すなわち、ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７）についてＳＰＲによって証明された。ＰＲＯ２１９８については、カニクイザルＩＬ－４ＲとカニクイザルＩＬ－３１への同時結合も示された（図５を参照）。
６．３．ヒト又はカニクイザルのＩＬ－４Ｒ発現細胞への結合（ＦＡＣＳ）
モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の、ヒト又はカニクイザルＩＬ－４Ｒ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン３０００を使用して、ヒト及びカニクイザルＩＬ－４Ｒプラスミド及びモックプラスミドでトランスフェクトした。ヒト及びカニクイザルのＩＬ－４Ｒ発現構築物のＮ末端に融合されるＶ５タグを標的とする抗体の結合により、両方の標的の発現が成功したこと、従って、血漿膜結合の陽性対照として使用されることが確認されるであろう。モリソンＨ分子ＰＲＯ２０７７は、カニクイザルＩＬ－４Ｒに対して交差反応性を示さなかったため（セクション５．３を参照）、カニクイザルＩＬ－４Ｒ結合の陰性対照として使用した。
ウェルあたり５０，０００個のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種した。モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７、並びにカニクイザルＩＬ４Ｒと交差反応しない対照分子ＰＲＯ２０７７の５倍連続希釈物を、５，０００～０．３２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でプレートに加え、シェーカー上で４℃で６０分間インキュベートした。上清を除去し、フローサイトメトリー分析のために検出試薬を加えた。単一細胞のＡＰＣ蛍光強度の幾何平均を計算した。
すべての力価データが表４２に要約される。繰り返し分析からの平均相対ＩＣ５０値がｐＭで示される。モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のヒト及びカニクイザルＩＬ－４Ｒに効率的に結合した（図６を参照）。
６．４．ヒトＩＬ－４及びＩＬ－１３シグナル伝達を阻害する効力の評価（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞ｓｔａｔ－６レポーター遺伝子アッセイ）
モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７が、ＩＬ－４Ｒを介してＩＬ－４及びＩＬ－１３誘導性シグナル伝達を阻害する能力を試験するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイが使用された。ウェルあたり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。１００～０．００２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のモリソン分子及び参照抗体デュピルマブの３倍連続希釈物を、０．０５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかの存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を新しいプレートに移し、分泌された胎児アルカリホスファターゼをQuanti-Blue基質を使用して定量した。モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７も、アッセイ培地中の過剰なＩＬ－３１（１０ｎＭ）によるＩＬ－４誘導性シグナル伝達の阻害について試験した。
すべての効力データが表４３（ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒ阻害）及び表４４（ＩＬ－１３／ＩＬ－４Ｒ阻害）に要約される。反復分析からの平均相対ＩＣ５０値（ｐＭ）も示される。モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７は、デュピルマブと同等の効力で、ＩＬ－４又はＩＬ－１３とＩＬ４Ｒとの相互作用を効率的に遮断した（図７を参照）。ＩＬ－３１がモリソン－Ｈ分子の抗ＩＬ－３１ドメインに結合された場合、効率的なＩＬ－４Ｒ遮断が維持された（図８を参照）。
６．５．ヒトＩＬ－３１誘導性受容体ダイマー化を阻害する効力の評価（PathHunter（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＩＬ３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂアッセイ）
PathHunter ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲｂダイマー化アッセイ
ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイでは、モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７が、ＩＬ－３１ＲＡ／ＯＳＭＲヘテロダイマーを介して、ＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を阻害する能力を評価した。ウェルあたり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種した。翌日、１０００～０．２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の分子及び対照抗体ＢＭＳ－９８１１６４の３倍連続希釈物を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３１の存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、検出溶液を添加し、プレートをさらに１時間インキュベートし、発光を測定した。すべての抗体は、アッセイ培地中の過剰なＩＬ－４Ｒ（５０ｎＭ）によるＩＬ－３１誘導性シグナル伝達の阻害についても試験された。
ヒトＩＬ－３１の阻害
表４５に、すべての効力データの概要を示す。反復分析から得た平均相対ＩＣ５０値（ｐＭ）を示す。すべてのモリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体は、ＢＭＳ－９８１１６４と比較した場合、ＩＬ－３１誘導性シグナル伝達を同様の効力で阻害した。抗ＩＬ－４ＲドメインがＩＬ－４Ｒに結合された場合、ＩＬ－３１とＩＬ－３１Ｒの相互作用の効率的な遮断は維持された（図９を参照）。
カニクイザルＩＬ－３１の阻害
カニクイザルＩＬ－３１によって誘導されるシグナル伝達の阻害を評価するために、ＩＬ３１ＲＡ／ＯＳＭＲダイマー化アッセイを上記のように使用したが、ただし、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－３１の代わりに１０ｎｇ／ｍｌカニクイザルＩＬ－３１を使用し、モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９のみが阻害について試験された点が異なる。ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は両方とも、カニクイザルＩＬ－３１とヒトＩＬ－３１ＲＡとの相互作用を効率的に遮断した（図１０を参照）。
６．６．ヒトＩＬ－４及びＩＬ－３１シグナル伝達の同時阻害の効力の評価（ＢＥＡＳ－２Ｂアッセイ；ＣＣＬ２）
モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９がＩＬ－４及びＩＬ－３１誘導性シグナル伝達の両方を同時に阻害する能力を評価するために、サンドイッチＥＬＩＳＡで読み取りを行うＢＥＡＳ－２Ｂ（ヒト気管支上皮）細胞を使用する細胞ベースのアッセイを行った。このアッセイでは、両方のシグナル伝達経路の遮断により、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞によるＣＣＬ２分泌が減少する。
ウェル当たり２５，０００個の細胞を９６ウェルプレートの１００μｌ増殖培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３１を、デュピルマブとＢＭＳ－９８１１６４との又はモリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８もしくはＰＲＯ２１９９との組み合わせの連続希釈液とともに加えた。次に、細胞を２４時間インキュベートし、上清を収集し、分泌されたＣＣＬ－２の濃度を、市販のキットを応用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
ＢＥＡＳ－２Ｂアッセイは、ＩＬ－４とＩＬ－３１の複合阻害の評価を可能にする唯一の利用可能なアッセイである。ＰＲＯ２１９８とＰＲＯ２１９９は両方とも、デュピルマブとＢＭＳ－９８１１６４の組み合わせと比較した場合、同様の効力でＩＬ－４及びＩＬ－３１シグナル伝達を同時に遮断することができた。これらは、参照分子の組み合わせに匹敵する阻害レベルに達した（図１を参照）。
６．７．ヒトＰＢＭＣサブセットに対するヒトＩＬ－４誘導性ＣＤ２３アップレギュレーションを阻害する効力の評価
ヒトＰＢＭＣを使用して、単球、ナイーブＢ細胞、及びメモリーＢ細胞におけるＣＤ２３のＩＬ－４誘導性アップレギュレーションを評価した。ヒトＰＢＭＣは、統合された多孔性バリアと密度勾配遠心分離を備えたＬｅｕｃｏｓｅｐチューブを使用して、適合したＬｅｕｃｏｓｅｐプロトコールに従って新鮮な全血から単離された。
ウェルあたり４００，０００個のＰＢＭＣを、１００ｍｌのアッセイ培地中で９６ウェルプレートに接種した。１０，０００～０．１６９ｎｇ／ｍｌのの濃度範囲のモリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９、抗ＩＬ－３１ｓｃＦｖドメインが結合していない参照抗ＩＬ－４Ｒ ＩｇＧ４抗体ＰＲＯ２２０９及びＰＲＯ２２１０、及び参照抗体デュピルマブの３倍連続希釈物を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４の存在下でプレートに添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、マウス抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ、マウス抗ヒトＣＤ１４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、マウス抗ヒトＣＤ１４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、及びマウス抗ヒトＣＤ２３－ＡＰＣ色素を使用するフローサイトメトリー分析のために、ＰＢＭＣを染色した。ＦＡＣＳ分析の後、ゲートされたＣＤ２３単球、ＣＤ２３ナイーブＢ細胞、及びＣＤ２３メモリーＢ細胞の幾何平均を計算に使用した。４パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線フィッティングを適用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して阻害曲線のＩＣ５０値を計算した。
ＰＢＣアッセイデータは表４６に要約される。異なる献血者について得られたＩＣ５０値をピコモルで示す。モリソン－Ｈ抗体ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９並びに参照ＩｇＧ４抗体ＰＲＯ２２０９及びＰＲＯ２２１０は、デュピルマブと比較した場合、単球、ナイーブＢ細胞、及びメモリーＢ細胞におけるＣＤ２３のＩＬ－４誘導性アップレギュレーションを阻害する同様の効力を示した。抗ＩＬ－３１ドメインが結合していないＩｇＧ４分子としてフォーマット化された場合、分子は、デュピルマブと比較して、同じ効力でＩＬ－４誘導性シグナル伝達を遮断した（図１１を参照）。従って、抗ＩＬ－３１ドメインの添加は、ＩＬ－４阻害効力にほとんど影響を与えない。
６．８．ヒト全血におけるヒトＩＬ－４誘導性ＴＡＲＣ産生を阻害する効力の評価
胸腺活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１７とも呼ばれる）のＩＬ－４誘導性分泌を阻害する効力を決定するために、読み取りとして市販のＥＬＩＳＡに基づく全血アッセイを使用した。両方のシグナル伝達経路が遮断されると、全血中のＴＡＲＣレベルが低下する。
抗凝固剤ＥＤＴＡを含む滅菌チューブに採取した全ヒト末梢血をアッセイに使用した。６４，８００～１．１０ｐＭの範囲のデュピルマブ、ＰＲＯ２１９８、又はＰＲＯ２１９９の連続希釈液の１６０μｌ／ウェルを、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１３のいずれかを含む丸底ウェルを有する９６ウェルプレートに添加した。ウェルあたり４０μｌの全血を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。翌日、プレートを１，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集し、－２０℃で凍結した。次に、上清を、R&D SystemsのヒトTARC/CCL17 DuoSet ＥＬＩＳＡキットを使用して分析し、ＴＡＲＣレベルを測定した。
ＴＡＲＣアッセイは、ＩＬ－４に誘導性ＴＡＲＣ分泌について、３人の異なるドナーからの血液を用いて実施した。ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９は、デュピルマブに匹敵する効力、すなわち５００ｐＭ未満のＩＣ５０値で、ヒト全血中のＩＬ－４誘導性ＴＡＲＣを中和した。
実施例７：生物物理学的特性解析
モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７は、いくつかの生物物理学的特性解析手順に供された。以下の生物物理学的特性が調査された。
１．本体の確認
２．多ｐＨストレス試験
ａ．化学的安定性と電荷の不均一性
ｂ．熱安定性
３．高濃度使用可能性（ＨＣＦ）の試験

７．１．本体の確認：
質量測定
質量は、ＥＳＩ－ＭＳを使用するインタクト質量分析によって分析された。試験されたすべてのモリソン－Ｈ抗体及びモリソン－Ｌ抗体、すなわちＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７は、軽鎖と重鎖の予想される質量を示した。さらに、重鎖は予想通りのグリコシル化を示している。各モリソン抗体について決定された質量を表４７に示す。
グリコシル化パターン
ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９を、グリコシル化パターンについてさらに詳細に分析した。両方の分子は同様のグリコシル化を示す。それぞれの重鎖の相対的なグリコシル化の近似値を表４８に示す。両方の分子は主にＧ０Ｆ糖でグリコシル化されている。より少ない量のＧ１Ｆ及びＧ２Ｆも見つかる。重鎖の非グリコシル化塊は観察されなかった。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の本体を、還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによってさらに分析した（図１２を参照）。
モリソン－Ｈ分子の場合、予想されたバンドが還元条件下と非還元条件下の両方で観察された。還元条件下で一部のＨＣダイマーが観察されるのは、おそらく鎖間ジスルフィドの還元が不完全なためである。
モリソン－Ｌ分子の場合、予想されるすべてのバンドが還元条件と非還元条件の両方で見られ、最も顕著な分子種である。３７ｋＤａと５０ｋＤａの間の追加のバンドが還元条件下で観察され、選択された条件下でＬＣ又はＨＣが充分に変性又は還元されていないことを示唆している。７５ｋＤａと１００ｋＤａの間のバンドは、おそらくＬＣダイマーに由来すると考えられる。非還元条件下では、ＬＣ及びＬＣダイマーが見られる。ＩｇＧ分子の場合、ＬＣ及びＬＣダイマーは可溶性であり、一般的な精製プロセスを使用して存在が確認できることが知られている。
７．２．多ｐＨストレス試験：
多ｐＨストレス試験の目的は、モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７の化学的及び熱的安定性を調べることであった。分子を、ｐＨ３．５、５、７、及び８．５の２０ｍＭ ＭＥＳ／酢酸／ヘペス緩衝液中で透析した。後者の３つの条件で、酸化やクリッピングなどの化学的分解を強制するために、試料を４０℃で１０日間インキュベートした。ｐＨ３．５は急速な分解と加水分解を引き起こす過酷なストレス条件であるため、これらの試料は２５℃で１０日間インキュベートされた。電荷バリアントの生成はＣＥＸ－ＨＰＬＣで分析し、クリッピングはＳＤＳ－ＰＡＧＥで調べた。分子は１ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベートされた。熱安定性は、ｎＤＳＦ（NanoTemper）によって分析し、アンフォールディングの開始（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディングの中点（Ｔｍ１）、及び凝集の開始（Ｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）が決定された。
電荷バリアントプロフィール
その後のＤＳＰ開発では、高収率での精製が重要な手段となる。ＩｇＧ様分子を精製するために使用される主な技術の１つは、イオン交換クロマトグラフィーである。従って、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって高い標的純度を示すＩｇＧ抗体は、イオン交換精製工程の開発における困難さが少なくなる可能性がある。
試験されたすべての抗体、すなわちＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７は同等の複雑さ（電荷不均一性）を示し、それによりモリソン－Ｌ分子はモリソン－Ｈ分子よりわずかに小さい複雑さを示した。さらに、ＩＬ４Ｒクローンｓｃ０９に基づく分子ＰＲＯ２１９９及びＰＲＯ２２０７は、わずかに高い標的純度を有した。
要約すると、一般的な精製プロセスの後、すべての分子は実質的な差異なく低い電荷不均一性を示した。
電荷バリアントの生成
ｐＨ３．５、ｐＨ５、ｐＨ７、及びｐＨ８．５の２０ｍＭ ＭＥＳ／酢酸塩／ヘペス緩衝液中でインキュベートした後、ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７について電荷バリアントの生成を分析した。ｐＨ５及びｐＨ７は後の調製スペースのおおよその制限を規定するため、これらのｐＨでの化学的安定性が特に重要である。表４９は得られた結果を示す。ｐＨ５では、すべての分子が化学分解に対して良好な安定性を示した。ｐＨ値が高くなると、酸性バリアントの生成に対する化学的分解が増加する。ＰＲＯ２２０６を除き、すべての分子は同様の安定性を示し、ＰＲＯ２２０６はｐＨ８．５でより高い標的損失を示した。ｐＨ３．５では、少量の化学分解のみが観察された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるクリッピング解析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用して、すべてのタンパク質のクリッピングを分析した（図１３を参照）。ｐＨ３．５、ｐＨ５、及びｐＨ７ではモリソン抗体のいずれについても断片化は観察されなかった。ｐＨ８．５ではＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９のＨＣの断片化がほんのわずか観察された。モリソン－Ｌ分子ではＨＣクリッピングは観察されなかったが、近くを流れるＬＣによってオーバーレイされた可能性がある。
要約すると、すべての分子がクリッピングに対して良好な耐性を示した。
熱安定性
ｐＨストレス試験内で、ＰＲＯ２１９８、ＰＲＯ２１９９、ＰＲＯ２２０６、及びＰＲＯ２２０７を、ｐＨ３．５とｐＨ８．５の間での熱安定性について分析した。熱的アンフォールディングと熱的凝集の開始の両方が測定された。熱的アンフォールディング中、分子のマルチドメイン構造により、すべての分子が複数の遷移を示した。簡単にするために、最初の融解中間点のみを示す。結果は表５０に要約される。
アンフォールディングの開始（Ｔｏｎｓｅｔ）及び最初の融点（Ｔｍ１）は、すべての分子についてｐＨ７で最も高かった。ｐＨ８．５に変更しても、熱安定性はわずかに低下するだけであった。ｐＨが酸性になると、熱安定性が低下した。しかし、ｐＨ５では、アンフォールディングの開始はすべて５５℃超であった。ｐＨ３．５では、熱安定性は５０℃未満のＴｏｎｓｅｔまで低下した。
熱凝集は、ｐＨ７及びｐＨ８．５でのみ観察された。酸性ｐＨ（ｐＨ３．５とｐＨ５．０の両方）では、すべてのモリソン抗体は、折りたたまれていない状態であっても、より大きな凝集体を形成しなかった。中性及び塩基性ｐＨでは、凝集の開始は最初の融点を超えており、非天然の凝集メカニズムを示唆している。
分子間に大きな違いはなかったが、ＰＲＯ２１９８が全体的に最も高い安定性を示した。これはｐＨ３．５で最も顕著であり、ＰＲＯ２２０７と比較してＴｏｎｓｅｔが５℃高くなった。このｐＨは、ウイルス不活化工程の製造プロセスに関連する。
７．３．高濃度試験
濃縮使用可能性試験では、ＰＲＯ２１９８を２つの調製緩衝液で調製した。
調製緩衝液Ｆ１：２０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５；
調製緩衝液Ｆ２：２０ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５。
溶解度－タンパク質濃度
ＰＲＯ２１９８は、沈殿の兆候や溶解度の限界に達することなく、１００ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮できた。さらに、ＰＲＯ２１９８はタンパク質濃度の検出可能な減少を示さず、すなわちＰＲＯ２１９８は、十分に可溶性であり、４℃及び２５℃で少なくとも４週間、１００ｍｇ／ｍｌを超える目標濃度に達し、その濃度を維持した。
さまざまな温度でのモノマーの安定性
ＰＲＯ２１９８をＦ１及びＦ２で調製し、１００ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。濃縮試料は４℃、２５℃、及び４０℃で最長４週間保存された。異なる時点で、モノマー含有量をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析した。結果は表５１に要約される。
７．４．モリソン－Ｈ及びモリソン－Ｌ抗体の生物物理学的特性解析に使用される一般的方法
緩衝液交換
緩衝液交換は透析によって行った。抗体は、少なくとも２００倍過剰の透析緩衝液を用いてSpectra Pro３透析膜（Spectrum Laboratories）中で透析した。
抗体の濃縮
抗体は、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えた遠心濃縮機を使用して濃縮された。試料は、目標濃度に達するまで、２２℃で５分ずつの工程で遠心分離された。工程間で試料は再懸濁される。
タンパク質濃度の決定
タンパク質試料の濃度は、TecanプレートリーダーとNanoQuantプレートを使用して決定された。緩衝液は、２８０ｎｍで測定された吸光度から差し引かれるブランクとして使用された。各測定値は、３１０ｎｍで測定された可視粒子によって引き起こされる散乱について補正された。補正値は１ｃｍの光路長に対して標準化され、対応するタンパク質の理論的吸光係数を使用して、タンパク質濃度が算出された。濃度が１０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質試料の場合、試料を対応する緩衝液で少なくとも１０倍、又は１ｍｇ／ｍｌの公称濃度まで希釈した。
ＳＤＳページ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥは還元条件下で実施した。変性及び還元後、５μｇの試料を勾配ゲル（４％～２０％）に適用した。分離後、タンパク質バンドをクマシーブルーで染色し、ゲルを精製水で脱染した。
保存
さまざまな温度でのタンパク質の安定性を評価するために、試料を４℃、２５℃、及び４０℃でインキュベートした。４℃での保存は、公称温度４℃の冷蔵庫内で実施された。２５℃及び４０℃での保存では、試料をそれぞれ６５％ｒＨ及び７５％ｒＨの湿度に制御されたキャビネットに置いた。
ｎａｎｏＤＳＦによる熱アンフォールディング
熱シフトアッセイを使用した熱アンフォールディングは、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光強度の変化によって決定された。色素の蛍光は疎水性相互作用に対して感受性である。タンパク質がアンフォールディングされると、疎水性アミノ酸が溶媒に曝露され、Ｓｙｐｒｏオレンジの蛍光が増加する。熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）及び最大シグナルの１０％で算出された開始温度（Ｔｏｎｓｅｔは、最小シグナルでの温度＋０．１＊（最大シグナル－最小シグナル））は、データをボルツマン方程式にフィッティングすることによって決定された。
ＳＥ－ＨＰＬＣによるモノマー含有量
モノマー含有量は、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３－４Ｆカラムを使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５を流して、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。分析のために、５μｇの試料を注入し、２８０ｎｍで吸光度を記録した。試料の品質は、モノマーの相対的パーセント、ＨＭＷＳ、及びＬＭＷＳとして示される。
陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）
電荷バリアントの定量には、分析用陽イオン交換クロマトグラフィーが適用された。試料はMAbPac（商標）ＳＣＸ－１０カラムで分析された。電荷バリアントは、ｐＨ４からｐＨ１０までのｐＨ勾配を使用して分離された。分析のために、３０μｇの試料が注入され、２８０ｎｍで吸光度を記録した。試料の品質は、ターゲット、酸性電荷バリアント、及び塩基性電荷バリアントの相対的パーセントとして示される。
質量分析法
重度の翻訳後修飾を特定及び除外するために、モリソン抗体の無傷の質量が決定された。ＥＳＩ－ＭＳ分析の前に試料をＤＴＴで還元し、脱塩し、ＭｅＯＨ：２－ＰｒＯＨ：０．２％ＦＡ（３０：２０：５０）中で分析した。試料のナノＥＳＩ－ＭＳ分析は、Ｓｙｎ－ａｐｔＧ２－Ｓｉ質量分析計で実施された。次に、記録されたｍ／ｚデータは、出力質量０．５Ｄａ／チャネルの分解能を持つ最大エントロピーアルゴリズムＭａｘＥｎｔ１（MaxLynx）、及び０．７Ｄａの半分高さでの均一ガウス損傷モデルを適用することにより、質量スペクトルにデコンボリューションされた。

Claims (18)

  1. 以下の多重特異性抗体であって：
    ａ）ＩＬ－４Ｒに特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ４Ｒ－ＢＤ）、及び
    ｂ）ＩＬ－３１に特異的に結合する１つ又は２つの結合ドメイン（ＩＬ３１－ＢＤ）、
    ここで
    － 多重特異性抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含み、
    － 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤのそれぞれは、
    配列番号１のＨＣＤＲ１配列、
    配列番号２のＨＣＤＲ２配列、
    配列番号３のＨＣＤＲ３配列、
    配列番号７のＬＣＤＲ１配列、
    配列番号８のＬＣＤＲ２配列、及び
    配列番号９のＬＣＤＲ３配列を含み；並びに、
    － 前記ＩＬ３１－ＢＤのそれぞれは、
    配列番号１２のＨＣＤＲ１配列、
    配列番号１３のＨＣＤＲ２配列、
    配列番号１４のＨＣＤＲ３配列、
    配列番号１７又は１８のＬＣＤＲ１配列、
    配列番号１９のＬＣＤＲ２配列、及び
    配列番号２０のＬＣＤＲ３配列を含む、
    多重特異性抗体。
  2. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ４から、特にＩｇＧ４から選択される、請求項１に記載の多重特異性抗体。
  3. 前記多重特異性抗体のフォーマットが、２価二重特異性ＩｇＧフォーマット、３価二重特異性ＩｇＧフォーマット、及び４価二重特異性ＩｇＧフォーマットから選択される、請求項２に記載の多重特異性抗体であって、
    より詳しくは、ここで前記多重特異性抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースのＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ、及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から、さらにより詳しくはＤＶＤ－Ｉｇ及びモリソン（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合体（モリソン－Ｌ））から選択される、請求項２に記載の多重特異性抗体。
  4. 前記多重特異性抗体のフォーマットがモリソンフォーマットから選択される、請求項３に記載の多重特異性抗体。
  5. 前記多重特異性抗体が２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び／又は２つのＩＬ３１－ＢＤを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
  6. 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤがＦａｂアームに位置し、及び前記ＩＬ３１－ＢＤがモリソンフォーマットのｓｃＦｖ部分に位置する、請求項５に記載の多重特異性抗体。
  7. 前記多重特異性抗体のフォーマットが、モリソン－Ｌ及びモリソン－Ｈフォーマットから選択され、特にモリソン－Ｈフォーマットである、請求項４～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
  8. 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び前記ＩＬ３１－ＢＤが、ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を、特にＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４を、さらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
  9. 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤ及び前記ＩＬ３１－ＢＤが、ｓｃＦｖフォーマットである場合、
    （ｉ）フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３、及びフレームワークＦＲ４を含むＶＬドメインであって、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、Ｖκサブタイプから、特にＶκ１及びＶκ３サブタイプから選択され、特にＶκ１サブタイプであり、及び前記フレームワーク領域ＦＲ４は、Ｖκ ＦＲ４及びＶλ ＦＲ４から選択され、特に、配列番号２６～配列番号３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より詳しくは配列番号２６～配列番号３３のいずれかから選択されるＶλ ＦＲ４、特に配列番号２６又は配列番号３３によるＶλ ＦＲ４である、ドメイン、
    を含む、請求項８に記載の多重特異性抗体。
  10. 前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
    ａ）配列番号４、５、及び６から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＨ配列と
    ｂ）配列番号１０及び１１から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＬ配列とを含み、
    特に、ここで、前記ＩＬ４Ｒ－ＢＤが、
    ａ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列、又は
    ｂ）配列番号５のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列、又は
    ｃ）配列番号６のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体であって、前記ＩＬ３１－ＢＤが、
    ａ）配列番号１５及び１６から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＨ配列；と
    ｂ）配列番号２１及び２２から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一のＶＬ配列とを含み、
    特に、ここで前記ＩＬ３１－ＢＤは、
    ａ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列；又は
    ｂ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む、多重特異性抗体。
  12. ２つのＩＬ４Ｒ－ＢＤのうちの少なくとも１つ及び２つのＩＬ３１－ＢＤのうちの少なくとも１つが、それぞれの抗原に同時に結合することができる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードする、１つの核酸又は２つの核酸。
  14. 請求項１３に記載の前記１つの核酸又は２つの核酸を含む、１つ又は２つのベクター。
  15. 請求項１４に記載の前記１つのベクター又は２つのベクターを含む１つ又は複数の宿主細胞。
  16. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を産生する方法であって、
    （ｉ）請求項１３に記載の前記１つの核酸もしくは２つの核酸、又は請求項１４に記載の前記１つのベクターもしくは２つのベクターを提供し、前記１つの核酸もしくは前記２つの核酸、又は前記１つのベクター又は複数のベクターを発現させ、そして前記発現系から前記多重特異性抗体を収集する工程を、又は（ｉｉ）請求項１５に記載の１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞を提供し、前記１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞を培養し、そして前記細胞培養物から前記多重特異性抗体を収集する工程を、含む、方法。
  17. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、医薬的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
  18. アレルギー性疾患、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から、特に掻痒を引き起こすアレルギー疾患、掻痒を引き起こす炎症性疾患、及び掻痒を引き起こす自己免疫疾患から、特にアトピー性皮膚炎、急性アレルギー性接触皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、皮膚筋炎、結節性痒疹、乾癬、及びアトピー性喘息から選択される疾患の治療に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体であって、特に、前記疾患はアトピー性皮膚炎である、多重特異性抗体。
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