KR20230018397A - 다중 특이적 항체 - Google Patents

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비티 채터지
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Abstract

본 발명은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개와, CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개를 포함하는 다중 특이적 항체에 관한 것인데, 상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 20 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합한다. 본 발명은 추가로 상기 다중 특이적 항체를 암호화하는 핵산 서열(들), 상기 핵산 서열(들)을 포함하는 벡터(들), 상기 핵산 서열(들) 또는 상기 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포(들), 그리고상기 다중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 상기 다중 특이적 항체를 포함하는 약학 조성물과, 이의 사용 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

다중 특이적 항체
본 발명은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개와, CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개를 포함하는 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 20 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 다중 특이적 항체를 암호화하는 핵산 서열(들), 상기 핵산 서열(들)을 포함하는 벡터(들), 상기 핵산 서열(들) 또는 상기 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포(들), 그리고 상기 다중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다. 또한 본 발명은 상기 다중 특이적 항체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
암 치료에 있어 상당한 발전이 있었음에도 불구, 암은 여전히 상당한 미충족 의료 수요를 제기하고 있다. 최근 몇 년간 암 치료에 있어 이루어진 발전중 가장 괄목할만한 발전 몇 가지가 다양한 분자군의 면역치료법, 예컨대 모노클로날 항체(mAb), 이중특이적 항체(bsAb), 재조합 단백질 및 키메라 항원 수용체-T 세포(CAR-T 세포) 치료제(이에 한정되는 것은 아님) 도래와 함께 달성되었다. 이러한 치료제는, a) 면역효과기 세포를 종양 상주 세포에 능동적으로 유도하고/유도하거나 b) 면역효과기 세포를 자극하고/자극하거나 c) 종양 매개 면역 억제를 완화함으로써 항종양 면역성을 유도한다. 이러한 면역치료제는 보통 (종양외 위치에 비하여) 종양 상주 세포(예컨대 악성 세포, 종양 혈관의 세포, 기질 세포, 면역 세포 등)에 의한 특이 항원의 과발현을 이용하고, 이 면역치료제의 약리학적 활성을 종양에 표적화한다. 이러한 항원들 중 종양 연관 항원(TAA)은 악성 세포에 의해 선택적으로 과발현되는 세포 표면 단백질을 포함한다. 면역치료제는 TAA와의 고친화성 결합을 통해 이 면역치료제의 면역조정 활성을, 종양 세포와 면역효과기 세포 사이 면역학적 시냅스로 어느 정도 제한할 수 있다.
TAA 결합 면역치료제의 통상적 군은 종양 세포를 옵소닌화하고, Fcγ 수용체(FcγR)-발현 세포, 주로 자연 살해(NK) 세포에 의해 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 촉발함으로써 항종양 면역성을 유도하는 mAb이다. T 세포 항원 CD3을 동시에 점유하는 기타 TAA 결합 면역치료제, 예컨대 CAR-T 세포뿐 아니라 bsAb(TAA/CD3 bsAb)는 세포독성 T 림프구(CTL)에 영향을 미쳐 악성 세포의 표적화된 고갈을 유도한다.
TAA (재)유도 CTL 및 종래 TAA/CD3 bsAb의 치료적 유용성은 임상적으로 인증되었지만, 용량 제한 독성(DLT)은 종종 최고 유효 용량(MED)만큼의 투여를 방해하거나 치료의 불연속성을 초래하고, 이로 말미암아 효능은 제한될 수밖에 없다.
DLT의 이유 한 가지는, 종래 TAA/CD3 bsAb가 또한, 아마도 항CD3 도메인의 과다한 활성으로 말미암아, 통상적으로 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 연관되어 있기 때문일 것이다. 면역치료제의 종양외 활성은 건강한 조직에서 전염증 사이토카인의 분비를 초래하고, 이는 원치않는 안전성 프로필을 초래할 수 있다. 더욱이, TAA/CD3 bsAb는 TAA 과발현 세포를 강력하게 고갈시키는 반면, 이 TAA/CD3 bsAb는 이러한 세포(즉 종양 반응성 T 세포)가, 종양 항원(들)을 인지하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는지 여부에 상관없이 CTL을 보충 및 자극함으로써 TAA 과발현 세포를 고갈시킨다. 그러므로 TAA/CD3 bsAb는 숙주의 원산 항종양 면역성을 자극하거나 재활성화하기보다는 다소 무차별적으로 CTL을 자극하는 관계로, 잠재적으로 안전성을 위협한다.
이러한 DLT가 일어나는 정확한 경로는 다양할 수 있지만, 면역치료법 관련 독성이 발생할 위험은, 통상 약리학적 활성의 종양 국소화를 강화함으로써 최소화될 수 있거나 없어질 수 있다.
암세포상에 거의 독점적으로 발현되는 TAA, 예컨대 암태아 종양 항원은 클린 TAA(clean TAA)라 지칭된다. 정상의 비암세포상에도 또한 발현되는(통상적으로 암세포상에서에 비해 더 낮은 수준으로 발현되는) TAA는 논클린 TAA(non-clean TAA)라 간주된다. TAA/CD3 bsAb 접근법의 매우 큰 역가로 말미암아 논클린 TAA는 TAA를 또한 발현하는 비종양 세포를 손상시키므로 이 논클린 TAA는 걸림돌이 된다. 메소텔린(MSLN)은 논클린 TAA의 일례인데; 이는 낮은 수준으로라도 종양 세포상에서 발현될 뿐더러 기타 다양한 조직에서도 발현된다. 그러므로 어떤 치료제가 논클린 TAA를 표적화할 때, TAA/CD3 bsAb 접근법의 종양 조직에 대한 선택성을 개선하고 종양을 벗어난 효과(off tumor effect)/표적 조준 효과(on target effect)를 최소화하는 신규 치료제가 필요하다. 이는 구체적으로 MSLN/CD3 bsAb 접근법에 적용된다.
메소텔린(MSLN)은 MSLN+ 고형암, 예컨대 중피종을 치료하기 위해 표적화될 수 있는 종양 연관 항원(TAA)으로서 제안되어 왔다. 기타 다수 유형의 암, 예컨대 난소암 및 췌장암의 임의의 형태뿐 아니라, 3중 음성 유방암도 또한 MSLN+이다. 중피종에 대한 현재의 치료 표준은 종양 절제술, 화학치료법 및 방사선치료법뿐 아니라, 일시적 처방인 수단, 예컨대 유체 감소 및 통증 관리를 포함한다. 계속 생장하는 종양에 대한 면역치료법은 PD-1/PD-L1 차단제, 예컨대 펨브롤리주맙 및 니볼루맙, 또는 항CTLA4 항체, 예컨대 면역계를 자극하는 이필리무맙뿐 아니라, VEGF 억제제, 예컨대 혈관의 혈관신생을 차단하는 베바시주맙을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 치료제는 임상상 성공을 거두었지만, 그와 동시에 전신 부작용 발생 위험이 더 크다는 위험도 안고 있다. 따라서, MSLN을 표적화하는 특정 접근법에 대한 필요도 존재한다.
항체 기반 약물과 CAR-T 세포를 포함하는 소수의 상이한 접근법을 통해 MSLN을 표적화하는 것에 대한 실현가능성을 평가하기 위해 다수의 전임상 및 조기 임상 연구가 수행된 바 있거나 수행되고 있다. 항체 기반 약물은, MSLN 발현 세포를 화학요법제, 예컨대 페메트렉시드 및 시스플라틴과 함께 표적화하거나 PE38과 커플링되어 표적화하는 항MSLN 단편 SS1P 면역독소; 아마툭시맙, 즉 ADCC를 유도하는 키메라 모노클로날 항체; 종양 생장을 억제하는 항체 약물 접합체, 예컨대 아네투맙 라브탄신(BAY 94-9343: 항MSLN + 튜불린 억제제 DM4) 또는 DMOT4039A(항MSLN + 항유사분열 모노메틸 오리스타틴 E)를 포함한다. 반감기가 개선된 HPN536, 즉 다중 특이적 점유체(항MSLN + 항CD3 + 항알부민)는 시험관내 및 생체내 MSLN 발현 표적을 사멸하기 위해 T 세포를 재유도하는 것으로 보이고, 사이노몰거스 원숭이에 의해 잘 관용되는 것으로 보인다. 몇몇 항MSLN 키메라 항원 수용체(CAR)-T 치료제 몇 가지, 예컨대 자살 유전자(suicide gene)로 조작된 일시적 mRNA-형질감염 CAR-T(RNA CART메소) 및 CAR-T(iCasp9m28z)가 또한 잘 관용되어 왔다. 고형 종양을 치료하는 것과 연관되어 난제임을 보여주는, 대부분의 항MSLN 치료제에 대한 반응은 여태까지 보통이었다.
항MSLN 치료제법에 있어서 이러한 문제는 MSLN이 암환자 혈청에 확산되어 들어간다는 사실(그러므로 이 MSLN은 가용성 메소텔린 관련 단백질(SMRP)이라 지칭됨)에 의해 더욱 복잡해진다. MSLN과의 친화성이 큰 항체는 또한 이 항체의 활성과 유의미하게 대응작용하는 SMRP와도 강력하게 결합하여, 암세포에 대한 유효 용량을 감소시킨다.
그러므로 종양에 효과적으로 국소화하여 SMRP 존재하에 T 세포 반응을 촉진할 수 있는 신규 분자가 필요하다.
결합 도메인 적어도 3개를 가지되, 이 3개중 2개는 메소텔린과 특이적으로 결합하고(MSLN-BD) 나머지 1개는 CD3과 특이적으로 결합하는(CD3-BD) 다중 특이적 항체로서, 이 MSLN-BD 2개의 결합 친화성이 균형이 잘 잡힌 범위에 있는 다중 특이적 항체는 이론상 안전성 및 효능과 관련하여 전술된 한계점 다수를 해결해줄 수 있었다. 이러한 다중 특이적 항체는 이론상 높은 종양 국소화 및 개선된 선택성을 유도할 수 있으며, 이는 다양한 암에 더욱 안전하고 효과적인 치료법을 제공한다. 추가로 이러한 분자는 환자의 반응을 증각시키기 위해 추가 면역치료제들을 공동투여할 필요성을 한층더 제한할 것이고, 그로 말미암아 개발의 용이성이 지원되고, 치료 비용이 최소화될 것이다. 그러나 치료적 용도의 다중 특이적 항체 투여는 이 항체의 분자 아키텍처, 구성 항원 결합 도메인 특성, 생산가능성 및/또는 좋지않은 생물물리학적 특성과 관련된 문제로 말미암아 복잡해졌다. 요약하면, 종양 세포로의 국소화 증가를 보이고, 효과적인 T 세포 활성화를 관용 독성학적 프로필에 따라 유도하며, 약제 개발에 적합하도록 만드는 생물물리학적 특성을 가지는 신규의 다중 특이적 항체가 명백히 필요한 실정이다.
뿐 아니라, MSLN 및/또는 CD3에 특이적인 항체 다수가 이미 존재한다는 사실에도 불구, 이러한 다중 특이적 항체의 복잡하고 구체적인 필요조건에는 맞춤 특성을 가지는 신규 항체 도메인을 개발할 것이 요구된다.
그러므로 암을 앓고있는 환자의 다양한 치료적 선택권에도 불구, 효과적이고 안전한 치료적 제제가 필요한 실정이고, 이 제제가 더욱 표적화된 방식으로 우선 사용될 필요는 여전하다. 면역 조정 바이올로직스(biologics)는 작용 방식으로 말미암아 암 치료에 있어 전도유망한 접근법을 제공하지만, 전반적인 면역자극과 이 면역조정이 병리학적 유관 세포 및 부위에 대해 그 어떠한 제한도 없음은 다수의 부작용과 유의미한 독성을 유발하고, 이는 잠재적으로 환자의 유병률 및 사망율 증가를 초래할 수 있다. 그러므로 본 발명의 목적은 증식성 질환, 구체적으로 암 치료를 개선하는 의약을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 증식성 질환, 구체적으로 암 치료를 개선하는 의약을 제공하는 것이다. 구체적으로 목표 효능이 증가함으로써, 독성학적 프로필이 개선되는 의약을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
제1 양태에서, 본 발명은
a) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체에 관한 것으로서,
상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 20 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제2 양태에서, 본 발명은 특이적 MSLN 결합 도메인에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 특이적 MSLN 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개를 포함하는 벡터 또는 벡터 2개에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 벡터 2개를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 특이적 결합 도메인을 제조하기 위한 방법으로서, (i) 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 2개를 제공하고, 상기 핵산 서열 또는 핵산 서열들 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시켜, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양하여, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제8 양태에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암,염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 다중 특이적 항체로서, 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하는 단일 사슬 단백질인 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암,염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 다중 특이적 항체로서, 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하는 이종이량체 단백질인 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암, 염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하고 상기 정의된 본 발명의 단일 사슬 다중 특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제11 양태에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암, 염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하는 상기 정의된 본 발명의 이종이량체 다중 특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명의 양태들, 유리한 특징들 및 바람직한 구현예들은 이하 항목들에 요약되어 있으며, 이 항목들은 각각 단독으로 또는 조합되어 본 발명의 과제를 해결하는데 추가로 기여한다:
1.
a) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 20 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체.
2. 항목 1의 다중 특이적 항체로서, 유세포분석법에 의해 확정되는 바에 따르면 MSLN 발현수준이 MeT-5A 세포(ATCC CRL-9444)보다 6배 ~ 8배 더 큰 표적 세포를 사멸하기 위한 상기 다중 특이적 항체의 EC50이, T 세포 구동 세포독성 검정에서 상기 표적 세포에 대해 확정되는 바에 의하면 적어도 200 ng/ml, 구체적으로 적어도 300 ng/ml, 구체적으로 적어도 400 ng/ml, 구체적으로 적어도 500 ng/ml의 가용성 메소텔린이 존재할 때 25배 초과하여 증가하지 않는 다중 특이적 항체.
3. 항목 1의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 유세포분석법에 의해 확정되는 바에 따르면 MSLN 발현수준이 MeT-5A 세포(ATCC CRL-9444)보다 6배 ~ 8배 더 큰 표적 세포를 사멸할 수 있고, 이 때 EC50은 T 세포 구동 세포독성 검정에서 상기 표적 세포 및 상기 MeT-5A 세포에 대해 확정되는 바에 따르면 상기 MeT-5A 세포를 사멸하기 위한 EC50보다 적어도 10배, 구체적으로 적어도 20배, 구체적으로 적어도 25배 더 작은 다중 특이적 항체.
4. 항목 1 내지 3중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 15 nM 범위, 구체적으로 0.6 nM ~ 10 nM 범위, 구체적으로 0.7 nM ~ 5 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체.
5.
a) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개
를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.1 nM ~ 5 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체.
6. 항목 5의 다중 특이적 항체로서, 유세포분석법에 의해 확정되는 바에 따르면 MSLN 발현수준이 MeT-5A 세포(ATCC CRL-9444)보다 6배 ~ 8배 더 큰 표적 세포를 사멸하기 위한 상기 다중 특이적 항체의 EC50이, T 세포 구동 세포독성 검정에서 상기 표적 세포에 대해 확정되는 바에 의하면 적어도 200 ng/ml, 구체적으로 적어도 300 ng/ml, 구체적으로 적어도 400 ng/ml, 구체적으로 적어도 500 ng/ml의 가용성 메소텔린이 존재할 때 50배 초과하여 증가하지 않는 다중 특이적 항체.
7. 항목 5 또는 6중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.1 nM ~ 3 nM 범위, 구체적으로 0.15 nM ~ 2 nM 범위, 구체적으로 0.2 nM ~ 1 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체.
8. 상기 항목들 중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD 각각은 인간 메소텔린과 특이적으로 결합하는 다중 특이적 항체.
9. 상기 항목들 중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD 각각은 MSLN의 영역 I, 영역 II 및/또는 영역 III, 바람직하게 MSLN의 영역 I 및/또는 영역 II, 구체적으로 MSLN의 영역 I과 결합하는 다중 특이적 항체.
10. 항목 1 내지 9중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, MSLN-BD 2개는 MSLN상 동일한 에피토프와 결합하는 다중 특이적 항체.
11. 항목 1 내지 4 및 8 내지 10중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD는
(i) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 및
(ii) VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 및
(iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 구체적으로 Vκ1 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4 및 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4, 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 132 또는 139에 따른 Vλ FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 다중 특이적 항체.
12. 항목 1 내지 4 및 8 내지 11중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD는
a.1) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.1) 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.1) 아미노산 서열 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.1) 아미노산 서열 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.2) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.2) 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.2) 아미노산 서열 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.2) 아미노산 서열 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.3) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.3) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.3) 아미노산 서열 서열 번호 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.3) 아미노산 서열 서열 번호 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.4) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.4) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.4) 아미노산 서열 서열 번호 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.4) 아미노산 서열 서열 번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.5) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.5) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.5) 아미노산 서열 서열 번호 20과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.5) 아미노산 서열 서열 번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.6) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.6) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.6) 아미노산 서열 서열 번호 22와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.6) 아미노산 서열 서열 번호 24와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.7) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.7) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.7) 아미노산 서열 서열 번호 23과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.7) 아미노산 서열 서열 번호 24와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하는 다중 특이적 항체.
13. 항목 5 내지 10중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD는
(i) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 28, 29 및 30의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 및
(ii) VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 및
(iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 구체적으로 Vκ1 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4 및 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4, 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 132 또는 139에 따른 Vλ FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 다중 특이적 항체.
14. 항목 5 내지 10 및 13중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD는
a.1) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.1) 서열 번호 28, 29 및 30의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.1) 아미노산 서열 서열 번호 31과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.1) 아미노산 서열 서열 번호 33과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.2) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.2) 서열 번호 28, 29 및 30의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.2) 아미노산 서열 서열 번호 32와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.2) 아미노산 서열 서열 번호 33과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.3) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.3) 서열 번호 28, 29 및 30의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.3) 아미노산 서열 서열 번호 34와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.3) 아미노산 서열 서열 번호 36과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하거나; 또는
a.4) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
b.4) 서열 번호 28, 29 및 30의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
c.4) 아미노산 서열 서열 번호 35와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
d.4) 아미노산 서열 서열 번호 36과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
을 포함하는 다중 특이적 항체.
15. 항목 11 내지 14중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 VH 도메인은 C51 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하고, 상기 VL 도메인은 C141 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하는 다중 특이적 항체.
16. 항목 8 내지 15중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 MSLN-BD 각각은 마카카 파스큘라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스) MSLN과 교차 반응성을 보이고, 특히 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 0.2 nM ~ 75 nM 범위, 구체적으로 0.3 nM ~ 60 nM 범위, 구체적으로 0.4 nM ~ 50 nM 범위, 구체적으로 0.5 nM ~ 40 nM 범위의 1가 KD로 사이노몰거스 MSLN과 결합하는 다중 특이적 항체.
17. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 CD3ε과 결합하는 다중 특이적 항체.
18. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 CD3-BD 1개 또는 2개, 구체적으로 CD3-BD 1개를 포함하는 다중 특이적 항체.
19. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는 SPR에 의해 측정될 때 50 nM 미만, 구체적으로 0.5 nM ~ 50 nM, 구체적으로 1 nM ~ 40 nM, 구체적으로 2 nM ~ 30 nM의 1가 KD로 CD3ε과 결합하는 다중 특이적 항체.
20. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는
(i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 45, 46 및 47의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각, 및
(ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 48, 49 및 50의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
21. 항목 20의 다중 특이적 항체로서, 상기 CD3-BD는
(i) 서열 번호 51, 140, 141 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과,
(ii) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 다중 특이적 항체.
22. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 인간 혈청 알부민 결합 도메인(hSA-BD) 적어도 1개, 구체적으로 hSA-BD 1개를 추가로 포함하는 다중 특이적 항체.
23. 항목 22의 다중 특이적 항체로서, 상기 hSA-BD는
(i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 53, 54 및 55의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
(ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 56, 57 및 58의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하거나; 또는
(i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
(ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 66, 67 및 68의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하거나; 또는
(i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
(ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 66, 67 및 68의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
24. 항목 22 또는 23의 다중 특이적 항체로서, 상기 hSA-BD는
(i) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(ii) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(iv) 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(v) 서열 번호 79 또는 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 80 또는 144의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(vi) 서열 번호 81 또는 145의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 82 또는 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 다중 특이적 항체.
25. 항목 24의 다중 특이적 항체로서, 상기 VH 도메인은 C51 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하고, 상기 VL 도메인은 C141 아미노산 잔기(AHo 번호매김)를 포함하는 다중 특이적 항체.
26. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 결합 도메인은 Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb 및 STAB로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 다중 특이적 항체.
27. 항목 26의 다중 특이적 항체로서, 상기 결합 도메인 각각은
(a) VL 도메인 및 VH 도메인의 동족 쌍(Fv 단편); 또는
(b) 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인의 동족 쌍(scFv 단편)
으로부터 독립적으로 선택되는 다중 특이적 항체.
28. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), Fab-Fv2, 트리아바디, scDb-scFv, 테트라바디, 디-다이아바디, CODV, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-Fv2, 또는 이종이량체 Fc 도메인 이외 이종이량체화 도메인의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 CODV, 그리고 MATCH로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 가지는 다중 특이적 항체.
29. 항목 1 내지 28중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 CH1 영역 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는 다중 특이적 항체.
30. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 scDb-scFv, 트리바디, MATCH이고, 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 MATCH 또는 트리바디 포맷을 가지며, 더욱 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 MATCH 포맷을 가지며, 더욱 구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 MATCH3 또는 MATCH4인 다중 특이적 항체.
31. 항목 1 내지 30의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 단일 사슬 단백질인 다중 특이적 항체.
32. 항목 31의 다중 특이적 항체로서, 상기 단일 사슬 단백질은
(i) 제1 VL 도메인,
(ii) 제1 폴리펩티드 링커,
(iii) 제1 VH 도메인,
(iv) 제2 폴리펩티드 링커,
(v) 제2 VL 도메인,
(vi) 제3 폴리펩티드 링커, 그리고
(vii) 제2 VH 도메인
이, 진술된 순서로 나란히 배열되어 이루어진 아미노산 서열을 포함하되,
상기 제1 VL 도메인은 상기 제2 VH 도메인과 결합하여 제1 결합 도메인을 형성하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하여 제2 결합 도메인을 형성하며,
상기 단일 사슬 단백질은
(viii) 제4 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 제3 VL 도메인과 제3 VH 도메인에 의해 형성되되, 제5 폴리펩티드 링커를 통해 상기 아미노산 서열 C 말단 또는 N 말단에 융합된 제3 결합 도메인
을 추가로 포함하고,
상기 결합 도메인 3개는 이하의 특이성들, 즉
(i) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인(CD3-BD) 및
(ii) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 제2 및 제3 결합 도메인(MSLN-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
33. 항목 32의 다중 특이적 항체로서, 상기 단일 사슬 단백질은 제6 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제4 VL 도메인 및 제4 VH 도메인에 의해 형성된 hSA-BD를 추가로 포함하고, 상기 hSA-BD는 제7 폴리펩티드 링커를 통해 C 말단 또는 N 말단에서 상기 아미노산 서열에 융합되는 다중 특이적 항체.
34. 항목 1 내지 30의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 제1 및 제2 단일 사슬 단백질을 포함하는 이종이량체 단백질이고, 상기 제1 단일 사슬 단백질은 (N 말단 → C 말단 방향으로)
(ia) 제1 VL 도메인,
(iia) 제1 폴리펩티드 링커 및
(iiia) 제2 VL 도메인
으로 이루어진 제1 아미노산 서열을 포함하고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 (N 말단 → C 말단 방향으로)
(ib) 제1 VH 도메인,
(iib) 제2 폴리펩티드 링커 및
(iiib) 제2 VH 도메인
으로 이루어진 제2 아미노산 서열을 포함하되,
상기 제1 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인 또는 상기 제2 VH 도메인중 어느 하나와 결합하여 제1 결합 도메인을 형성하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 VH 도메인의 또 다른 것과 결합하여 제2 결합 도메인을 형성하고,
상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질중 적어도 1개는
(iv) 제3 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인에 의해 형성되되, 제4 폴리펩티드 링커를 통해 상기 제1 아미노산서열 또는 상기 제2 아미노산 서열에 융합되는 제3 결합 도메인
을 추가로 포함하며,
선택적으로 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질중 적어도 1개는
(v) 제5 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 제4 VL 도메인 및 제4 VH 도메인에 의해 형성되되, 제6 폴리펩티드 링커를 통해 상기 제1 아미노산 서열 또는 상기 제2 아미노산 서열에 융합되는 제4 결합 도메인을 추가로 포함하고,
상기 결합 도메인 3개, 또는 선택적으로 4개는 이하의 특이성들, 즉
a) 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 1개,
b) 선택적 제4 결합 도메인이 존재할 때, 메소텔린과 특이적으로 결합하는 또다른 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개, 그리고
c) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 나머지 결합 도메인(hSA-BD)
을 가지는, 다중 특이적 항체.
35. 항목 34의 다중 특이적 항체로서, 선택적인 제4 도메인이 존재하고, 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인중 1개는 CD3-BD이고, 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인중 또 다른 1개는 hSA-BD인 다중 특이적 항체.
36. 항목 34 또는 35의 다중 특이적 항체로서, 선택적 제4 도메인이 존재하고, 제3 결합 도메인은 제1 아미노산 서열 또는 제2 아미노산 서열중 어느 하나에 융합되고, 제4 결합 도메인은 상기 아미노산 서열 2개중 1개에 융합된 다중 특이적 항체.
37. 항목 34 내지 36중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 이종이량체 단백질에 포함된 임의의 결합 도메인은 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 제2 단일 사슬 단백질내 배열된 면역글로불린 가변 도메인들로 배타적으로 이루어져 있는 다중 특이적 항체.
38. 항목 34 내지 37중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 이종이량체 단백질은 상기 제1 및 제2 VL 및 VH 도메인 이외에 제1 및 제2 단백질성 상호작용 도메인 동족 쌍을 포함하지 않고, 상기 제1 단백질성 상호작용 도메인은 상기 제1 단일 사슬 단백질에 포함되어 있으며, 상기 제2 단백질성 상호작용 도메인은 상기 제2 단일 사슬 단백질에 포함되어 있는 다중 특이적 항체.
39. 항목 34 내지 38중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질은 평행의 방향으로 이종이량체화되는(즉 상기 제1 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제2 VH 도메인과 결합하는) 다중 특이적 항체.
40. 항목 34 내지 38중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 단일 사슬 단백질 및 상기 제2 단일 사슬 단백질은 역평행의 방향으로 이종이량체화되는(즉 상기 제1 VL 도메인은 상기 제2 VH 도메인과 결합하고, 상기 제2 VL 도메인은 상기 제1 VH 도메인과 결합하는) 다중 특이적 항체.
41. 항목 34 내지 40중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서,
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 83으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 84의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 84로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 85로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 86의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 86로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 87의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 87로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 88의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 88로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 89의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 89로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 90으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 91의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 91로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 92의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 92로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 93의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 93으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 94의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 94로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 95의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 95로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 96의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 96으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 97의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 97로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 98의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 98로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 99의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 99로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 100의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 100으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 101의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 101로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 102로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 103의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 103으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 104의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 104로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 105의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 105로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 106으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 107의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 107로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 108의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 108로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 109의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 109로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 110의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 110으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 111의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 111로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 112의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 112로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 113으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 114로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 115로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 116의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 116으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 117의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 117로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 118의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 118로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 119의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 119로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 120의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 120으로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 121의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 121로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 122의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 122로 이루어져 있거나, 또는
상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 123의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 123으로 이루어져 있고,
상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 124의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 124로 이루어져 있는 다중 특이적 항체.
42. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체 가변 도메인들중 적어도 1개는 부모 토끼 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는 다중 특이적 항체.
43. 상기 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, MSLN-BD 및 CD3-BD중 적어도 1개는 이의 각각의 항원과 동시에 결합할 수 있고, 구체적으로 MSLN-BD 및 CD3-BD 둘 다는 이의 각각의 항원과 동시에 결합할 수 있는 다중 특이적 항체.
44. 항목 11 내지 15중 어느 하나에 정의된 바와 같은 MSLN-결합 도메인.
45. 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체와 항목 44의 MSLN-결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개.
46. 항목 45의 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개를 포함하는 벡터 또는 벡터 2개.
47. 항목 46의 벡터 또는 벡터 2개를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들.
48. 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 44의 MSLN-결합 도메인을 제조하기 위한 방법으로서, (i) 항목 45의 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개, 또는 항목 46의 벡터 또는 벡터 2개를 제공하고, 상기 핵산 서열 또는 핵산 서열들, 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시킨 다음, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 MSLN-결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 항목 47에 의한 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양한 다음, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 MSLN-결합 도메인을 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함하는 방법.
49. 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
50. 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암, 염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체.
51. 항목 50에 의한 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 질환은 암, 구체적으로 중피종, 췌장암 및 난소암으로부터 선택되는 암인 다중 특이적 항체.
52. 항목 1 내지 43중 어느 하나의 다중 특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암, 염증성 질환 및 자가면역성 질환으로부터 선택되는 인간의 질환을 치료하기 위한 방법.
53. 항목 52의 방법으로서, 상기 질환은 암, 구체적으로 중피종, 췌장암 및 난소암으로부터 선택되는 암인 방법.
도 1은 항MSLN scFv PRO1783, PRO1922, PRO1925, PRO2306, PRO2309 및 참조기준 항체인 아마툭시맙과, 인간 MSLN을 높은 수준으로 발현하는 H226 세포주 유래 세포의 원형질막의 결합을 보여준다. PRO1783, PRO1922, PRO1925, PRO2306, PRO2309 및 아마툭시맙과, H226 세포주의 결합은 경쟁 ELISA("cELISA")에서 시험되었다. HRP 커플링된 단백질 L 및 HRP 커플링된 항인간 IgG 항체는 cELISA에서 H226 세포주와 결합하는 PRO1783, PRO1922, PRO1925, PRO2306, PRO2309 및 아마툭시맙 각각을 검출하는데 사용되었다. 광학 밀도(OD450nm-690nm)는 항체 농도(nM)의 함수로서 표현되어 있다. 값이 증가하는 농도들만이 피팅(fitting)되었음에 주목한다. PRO1783의 EC50값은 참조기준 항체인 아마툭시맙에 대해 확인되는 EC50값보다 대략 6배 더 컸다. PRO1925, PRO2306, PRO2309의 EC50값은 PRO1783의 EC50값 범위와 동일한 범위였던 반면, PRO1922의 EC50값은 아마툭시맙의 EC50값과 유사하였다.
도 2는 항MSLN scFv PRO1783 및 참조기준 항체인 아마툭시맙과, 사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 CHO 세포주 유래 세포의 원형질막의 결합을 보여준다. PRO1783 및 아마툭시맙과, 사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 CHO 세포주의 원형질막상 결합은 cELISA에서 시험되었다. PRO1783 및 아마툭시맙의 결합은 HRP 커플링된 단백질 L 및 HRP 커플링된 항인간 IgG 항체 각각에 의해 검출되었다. 광학 밀도(OD450nm-690nm)는 항체 농도(nM)의 함수로서 표현되어 있다. 아마툭시맙뿐 아니라 PRO1783은 사이노몰거스 원숭이 MSLN과의 결합을 보였다.
도 3은 항MSLN scFv인 PRO1783, PRO1922 및 PRO1925에 의한 인간 MSLN/MUC16 상호작용의 차단을 보여준다. PRO1783, PRO1922, PRO1925와, 아마툭시맙이 인간 MSLN/MUC16 상호작용을 차단하는 역가는 cELISA에서 시험되었다. 광학 밀도(OD450nm-690nm)는 항체 농도(nM)의 함수로서 표현되어 있다. PRO1783의 IC50은 0.5 nM이었던 반면, 참조기준 항체 아마툭시맙은 MSLN/MUC16 상호작용을 더욱 강력하게 중화하였다(IC50 = 0.014 nM). PRO1925의 IC50은 PRO1783의 IC50과 유사하였던 반면, PRO1922의 IC50은 아마툭시맙의 IC50과 더 유사하였다.
도 4는 hMSLN/mMSLN의 키메라 변이체를 보여준다. 진한 회색으로 강조표시된 도메인은 대응 마우스 서열에 의해 대체된 인간 MSLN 서열 분절이다. 분절 VI은 원형질막과 가장 가까운 MSLN 세포외 도메인의 C 말단 일부에 대응한다. 분절 I 및 II는 MSLN의 영역 I에 대응하고; 분절 III 및 IV는 MSLN의 영역 II에 대응하고; 분절 V 및 VI은 MSLN의 영역 III에 대응한다.
도 5는 상이한 MATCH 포맷을 보여준다. (좌) 각각의 사슬상 분열된 이종이량체 형성 가변 도메인들이 상보성 MATCH 사슬상 이의 동족 가변 도메인으로서 N 말단 → C 말단의 역순으로 조직되는, 역평행 MATCH4 포맷의 아키텍처. (우) 분열된 가변 도메인들이 3중 특이적 분자로 조립되는 단일 펩티드 사슬상에 위치하는 scMATCH3 포맷의 예시적 아키텍처. 대안적 배열, 예컨대 VL2-VL1-VH1-VH2-scFv도 또한 scMATCH3 포맷 개념의 범위에 속한다. 도메인들을 연결하는데 사용되었던 Gly-Ser 링커는 선으로 표시되어 있다. 표 17은, 생산된 상이한 분자에 포함된 도메인들 및 이 도메인들(도메인 1 ~ 4)의 분자내 위치지정을 제시하고 있다. 도메인 번호매김은 특허청구의 범위 청구항들에 정의된 바와 같이 결합 도메인 번호매김과 상관되어 있지는 않다.
도 6은 인간 혈청 알부민 존재하에 CD8+ T 세포 활성화에 대한 PRO2000 및 PRO1872의 세포독성 활성 및 효과를 보여준다. (A) MSLN 고발현 암세포(H226 세포)의 비사멸(specific killing). 메소텔린을 높은 수준으로 발현하는 암세포에 대해서, PRO2000의 표적 세포 사멸 역가 관측치는 PRO1872의 표적 세포 사멸 역가 관측치보다 75배 더 컸다. (B) MSLN 저발현 중피세포(MeT-5A 세포)의 비사멸. 메소텔린을 낮은 수준으로 발현하는 건강한 중피조직 유래 세포(MeT-5A; ATCC CRL-9444)에 대해서, 1가 메소텔린 결합 단백질 PRO1872이 가장 큰 사멸 역가를 보였다. (C) MSLN 고발현 암세포(H226 세포) 존재하에서의 CD8+ T 세포 활성화, 그리고 (D) MSLN 저발현 중피세포(MeT-5A 세포) 존재하에서의 CD8+ T 세포 활성화. CD8+ T 세포 활성화에 대해 유사한 데이터가 관찰되었다. 공여개체 #1의 PBMC가 사용되었다. 표적 세포와 CD8+ T 세포는 이것들과 각각의 분자와의 항온처리가 개시된 지 40시간 후 유세포분석법에 의해 분석되었으며, 데이터는 S자형 4PL 피팅(GraphPad Prism)이 사용되어 피팅되었다.
도 7은 인간 혈청 알부민 존재하에 CD8+ T 세포 활성화에 대한 PRO2000 및PRO1872의 세포독성 활성과 효과를 보여준다. (A) MSLN 저발현 암세포(H292 세포)의 비사멸. 메소텔린을 낮은 수준으로 발현하는 암세포에 대해서, PRO1872의 표적 세포 사멸 역가 관측치는 PRO2000의 표적 세포 사멸 역가 관측치보다 7배 더 컸다. (B) MSLN 중간수준 발현 암세포(HPAC 세포)의 비사멸. 메소텔린을 중간수준으로 발현하는 암세포에 대해서, 1가 및 2가 메소텔린 결합제인 PRO1872 및 PRO2000 둘 다는 유사한 사멸 역가를 보였다. (C) MSLN 저발현 암세포(H292 세포) 존재하에서의 CD8+ T 세포 활성화, 그리고 (D) MSLN 중간수준 발현 암세포(HPAC 세포) 존재하에서의 CD8+ T 세포 활성화. 유사한 데이터가 CD8+ T 세포 활성화에 대해 관찰되었는데, 단 PRO2000은 HPAC 세포 존재하에서 PRO1872보다 명백히 더 강력하였다(4배 더 강력하였다). 공여개체 #1 유래 PBMC가 사용되었다. 표적 세포와 CD8+ T 세포는 이것들과 각각의 분자와의 항온처리가 개시된 지 40시간 후 유세포분석법에 의해 분석되었으며, 데이터는 S자형 4PL 피팅(GraphPad Prism)이 사용되어 피팅되었다.
도 8은 sMSLN 부재 또는 존재하에 CD8+ T 세포 활성화에 대한 PRO2000 및 PRO1872의 세포독성 활성 및 효과를 보여준다. (A ~ C) H226 표적 세포에 대한 PRO2000 및 PRO1872의 세포독성 활성. sMSLN 부재하에서의 H226 세포의 비사멸(A), 50 ng/ml sMSLN 존재하에서의 H226 세포의 비사멸(B) 또는 500 ng/ml sMSLN 존재하에서의 H226 세포의 비사멸(C). PRO2000은 PRO1872에 비해 그 사멸 역가가이 sMSLN 농도 증가에 영향을 덜 받았다(D ~ F). 대응하는 조건에서 CD8+ T 세포 활성화에 대해 유사한 데이터가 관찰되었다. sMSLN은 존재하지 않고 H226 세포가 존재할 때의 CD8+ T 세포 활성화(D), 50 ng/ml sMLSN이 존재할 때의 CD8+ T 세포 활성화(E), 또는 500 ng/ml sMLSN이 존재할 때의 CD8+ T 세포 활성화(F). 공여개체 #2 유래 PBMC가 사용되었다. 표적 세포와 CD8+ T 세포는 이것들과 각각의 분자와의 항온처리가 개시된 지 40시간 후 유세포분석법에 의해 분석되었으며, 데이터는 S자형 4PL 피팅(GraphPad Prism)이 사용되어 피팅되었다.
도 9는 sMSLN 부재 또는 100 ng/ml sMSLN 부재 또는 존재하에서의 PRO2000, PRO2100 및 PRO1872의 세포독성 활성을 보여주는데: 즉 sMSLN 부재하에서의 H226 세포의 비사멸(A) 또는 100 ng/ml sMSLN 존재하에서의 H226 세포의 비사멸(B); sMSLN 부재하에서의 Met-5A 세포(ATCC CRL-9444)의 비사멸(C) 또는 100 ng/ml sMSLN 존재하에서의 Met-5A 세포의 비사멸을 보여준다(D). 공여개체 #3 유래 PBMC가 사용되었다. 표적 세포는 이 세포와 각각의 분자의 항온처리가 개시된 지 40시간 후 유세포분석법에 의해 분석되었으며, 데이터는 S자형 4PL 피팅(GraphPad Prism)이 사용되어 피팅되었다.
도 10은 MSLN 고발현 암세포(H226 세포), MSLN 중간수준 발현 암세포(OVCAR-3 세포) 및 MSLN 저발현 암세포(Met-5A 세포)에 대한 PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660의 세포독성 활성을 보여준다. 팔리비주맙은 음성 대조군("대조군")으로 사용되었다.
도 11은 PRO2562, PRO2566, PRO2567, PRO2660과, 1가의 참조기준 항체인 PRO1872의 H226 세포 비사멸을 위한 EC50값(A), OVCAR3 세포의 비사멸을 위한 EC50값(B, 좌측), 그리고 Met-5A 세포의 비사멸을 위한 EC50값(B, 우측)을 요약하여 보여준다.
도 12는 sMSLN 부재하에서 또는 50 ng/ml sMSLN 또는 500　ng/ml sMSLN 존재하에서 H226 세포에 대한 PRO2562, PRO2566, PRO2567, PRO2660의 세포독성 활성과 1가 참조기준 항체인 PRO1872의 세포독성 활성을 보여준다.
도 13은 sMSLN 부재하에서 또는 50 ng/ml sMSLN 또는 500　ng/ml sMSLN 존재하에서 PRO2562, PRO2566, PRO2567, PRO2660의 H226 세포 비사멸을 위한 EC50값과 1가 참조기준 항체인 PRO1872의 EC50값을 요약하여 보여준다.
도 14는 MATCH 분자와, 메소텔린을 상이한 세포 표면 수준으로 발현하는 표적 세포의 결합을 보여준다. 메소텔린 고발현 H226 세포와 PRO2000, PRO2100 및 PRO1872의 결합(A), 메소텔린 중간수준 발현 HPAC 세포와 PRO2000, PRO2100 및 PRO1872의 결합(C), 메소텔린 저발현 H292 암세포와 PRO2000, PRO2100 및 PRO1872의 결합(B), 그리고 메소텔린 저발현 중피세포 MeT-5A(ATCC CRL-9444)와 PRO2000, PRO2100 및 PRO1872의 결합(D), 그리고 메소텔린 고발현 H226 세포와 PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660의 결합(E), 메소텔린 중간수준 발현 OVCAR-3 세포와 PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660의 결합(F), 그리고 메소텔린 저발현 중피세포 MeT-5A(ATCC CRL-9444)와 PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660의 결합(G)은 유세포분석법에 의해 평가되었고, 데이터는 S자형 4PL 피팅(GraphPad Prism)이 사용되어 피팅되었다.
도 15는 분자 PRO2000(biMSLN.CD3) 처리가 대조군 조건에 비하여 H292 이종이식편 모델의 종양 생장 억제를 달성함을 보여준다. (A) biMSLN.CD3 처리가 수행되었을 때 또는 수행되지 않았을 때 종양 생장의 종단 분석(longitudinal analysis). 라인들은 중앙값을 나타낸다. 동물에는 1 x 107개 H292 종양 세포 및 1 x 107개 PBMC가 피하 공동이식되었고, 처리는 5일차에 정맥내 경로로 수행되었으며, 실험의 막바지에 이르기까지 5일마다 반복 수행되었다. (B) 40일차 데이터는 산포도로서 보였다. 각각의 점은 동물 1마리에 해당하는 것이며, 데이터는 평균 및 표준편차와 함께 보였다. 2원 반복측정 ANOVA(two-way repeated measures ANOVA) 이후, 터키 다중 비교 검정이 수행되었으며, 데이터 세트 각각의 유의성은 팔리비주맙 대조군 처리시(Ctrl, 하단 라인) 또는 미처리시(상단 라인)와 비교하여 도시되었다. ns = 유의미하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01, ***, p < 0.001. 회색의 스파크 라인은 y축상 0을 나타낸다.
도 16은 분자 PRO2000(biMSLN.CD3) 처리가 대조군 조건에 비하여 인간 췌장암(HPAC) 이종이식편 모델의 종양 생장 억제를 달성함을 보여준다. (A) PRO2000(biMSLN.CD3) 농도가 증가하며 존재할 때의 종양 생장에 대한 종단 분석. 라인들은 중앙값을 나타낸다. 동물에는 1 x 107개 HPAC 종양 세포 및 2.5 x 106개 PBMC가 피하 공동이식되었고, 처리는 5일차에 정맥내 경로로 수행되었으며, 실험의 막바지에 이르기까지 5일마다 반복 수행되었다. (B) PRO2000(biMSLN.CD3) 농도가 증가하며 존재할 때의 종양 생장에 대한 대응 종단 분석과, 비교예인 PRO1872(MSLN.CD3) 농도가 증가하며 존재할 때의 종양 생장에 대한 대응 종단 분석. 라인들은 중앙값을 나타낸다. 팔리비주맙은 음성 대조군으로 사용되었다. *, p < 0.05; ****, p < 0.0001; *****, p < 0.00001. (C) (B)에 보인 그래프의 세부항목으로서, 경시적 최저 용량만을 나타낸다.
공지의 MSLN/CD3 bsAb 기반 면역치료제는 통상 용량 제한 독성과 생체내 효능이 제한된다는 약점을 가진다. 그러므로 현재 이용되고 있는 접근법보다 용량 제한 독성이 더 작거나 없고, 효능이 더 큰 신규 MSLN/CD3 bsAb 기반 면역치료제가 의료 분야에 필요하다.
본 발명은 메소텔린 결합 도메인(MSLN-BD) 2개와, CD3에 대한 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개의 조합을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 MSLN에 대한 MSLN-BD의 결합 친화성은, MSLN 고발현 표적 세포상 효율적 국소화가 허용되는 반면, 건강한 MSLN 저발현 중피세포는 영향을 훨씬 덜 받도록 조정된다. 균형이 잘 잡힌 MSLN 결합 친화성 및 CD3 결합 친화성과 아울러, 잘 규정되어 있고 컴팩트하되, 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드는 존재하지 않는 다중 도메인 항체 아키텍처에 내포된 MSLN-BD 2개가 존재함으로 말미암아, 이러한 다중 특이적 항체는 종양을 벗어나는 부작용은 작게 보이면서 표적 조준 역가는 크게 보인다. 전통적 IgG 아키텍처를 기반으로 하는 2가 다중 특이적 항체에 대해 달성될 수 없는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 컴팩트한 2가 디자인뿐 아니라, 이의 잘 조정된 MSLN 결합 친화성 및 CD3 결합 친화성은 원하는 선택성과 효능 프로필을 달성하는데 결정적인 특징이다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 고도의 항원 밀도 의존적 방식으로 결합활성효과(avidity effect)를 이용하여 MSLN-BD 2개를 통해 표적 세포와 결합할 수 있다. 동시에, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CD3-BD를 통한 CD3과의 결합에 의해 T 세포 활성화와 종양 세포 사멸을 유도할 수 있다. 효율적인 종양 국소화를 달성하는 MSLN 고발현 세포에 대한 본 발명의 다중 특이적 항체의 향상된 선택성으로 말미암아, 이 항체는 T 세포의 비특이적 활성화에 의해 유발되는 용량 제한 독성을 발생시키지 않고 치료를 가능하게 한다.
뿐 아니라, 놀랍게도 MSLN 고발현 표적 세포의 사멸 역가는 환자 혈청중에서종종 관찰되는 가용성 메소텔린이 높은 수준으로 존재할 때 거의 감소되지 않음이 발견되었다. 더욱이 (a) MSLN 결합 도메인 2개와, (b) CD3-BD 적어도 1개를 포함하고, 상기 정의된 디자인 및 항원 결합 친화성을 가지는 본 발명의 다중 특이적 항체는 실시예와 첨부 도면에 보인 바와 같은 추가의 유리한 특성들을 보였다. 게다가 반감기 연장 항hSA 도메인의 선택적 첨가는 편리한 투여를 가능하게 할 뿐더러, 분자를 종양 미세환경에 전달하는 것을 촉진해야 하기도 한다.
그러므로 본 발명의 다중 특이적 항체는 종래의 조성물과 치료제에 비하여 치료상의 변별적 이점을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당 업자들에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
"~를 포함하는(comprising)" 및 "~를 포함하는(including)"과 같은 용어들은, 달리 명시되지 않는 한 본원에서 자체에 제약을 두지 않고 비제한적 의미로 사용된다. 이처럼 비제한적 의미로 사용되는 것과 관련하였을 때, "~를 포함하는(comprising)"이란 용어는 이보다 더 협소한 범위를 나타내는 용어 "~로 이루어진(consisting of)"을 포함한다.
본 발명을 기술하는 내용(특히 하기 특허청구의 범위의 청구항들의 내용) 중 "하나의" 및 "한" 및 "본", 그리고 이와 유사한 용어는, 본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수의 것과 복수의 것 둘 다를 아우르는 것으로 해석되어야 할 것이다. 예를 들어 "하나의 세포"란 용어는, 세포들의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다. 복수의 형태가 화합물 및 염 등에 대해 사용되는 경우, 이는 단일 화합물 또는 염 등을 의미하기도 한다.
일 양태에서, 본 발명은
a) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개; 및
b) CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개
를 포함하되, 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드는 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면 0.1 nM ~ 20 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 등의 용어는 전항체 또는 이의 단일 사슬; 및 임의의 항원 결합 단편(즉 "항원 결합부") 또는 이의 단일 사슬; 및 항체 CDR, VH 영역들 또는 VL 영역들을 포함하는 분자(예컨대 다중 특이적 항체(이에 한정되는 것은 아님))를 포함한다. 자연 발생 "전항체"는 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄가 이황화 결합에 의해 상호 연결되어 포함되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성되어 있다. VH 영역 및 VL 영역은 추가로, 틀 영역(FR)이라 칭하여지는 더욱 잘 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하여지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 CDR 3개와 FR 4개로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포(예컨대 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린 Fc 영역"이란 용어는, 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 항체의 "결합 도메인", "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부"등의 용어는, 주어진 항원(예컨대 MSLN, CD3, hSA)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 비변형 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 비변형 항체의 단편에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 경첩 영역에 이황화물 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체 단일 팔의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 단리 상보성 결정 영역(CDR), 단일 사슬 Fv, dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조 기반 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드 기반 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 f-star 기술(F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM))(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합하게 본 발명의 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 단편(scFv) 또는 단일 항체 가변 도메인이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편의 가변 도메인 2개는 Fv 단편 또는 scFv 단편에서와 같이 도메인간 이황화 결합에 의해 안정화되는데, 구체적으로 상기 VH 도메인은 51번 위치(Aho 번호매김)에 단일 사스테인 잔기를 포함하고, 상기 VL 도메인은 141번 위치(Aho 번호매김)에 단일 사스테인 잔기를 포함한다.
"상보성 결정 영역"("CDR"이란 용어는, Kabat외 다수에 의해 기술된 체계(1991)("Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)("Kabat" 번호매김 체계), Al-Lazikani외 다수에 의해 기술된 체계(1997)(JMB 273, 927-948)("Chothia" 번호매김 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호매김 체계(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P외 다수(Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" 번호매김 체계) 및 문헌[Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670]에 기술된 번호매김 체계("AHo" 번호매김 체계)를 비롯한 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것이 사용되어 경계가 결정되는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어 고전적인 포맷의 경우 Kabat 체계하에서 중쇄 가변 도메인(VH) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 31번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2), 그리고 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Chothia 체계하에서 VH 중의 CDR 아미노산은 26번 ~ 32번(HCDR1), 52번 ~ 56번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; VL 중의 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Kabat 체계 및 Chothia 체계 둘 다에 의한 CDR 정의들을 조합하였을 때, 인간 VH 중의 CDR은 26번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어지고, 인간 VL 중의 CDR은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어진다. IMGT 체계 하에서 VH 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26번 ~ 35번(HCDR1), 51번 ~ 57번(HCDR2) 및 93번 ~ 102번(HCDR3)으로 번호가 매겨지고, VL 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27번 ~ 32번(LCDR1), 50번 ~ 52번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)으로 번호가 매겨진다("Kabat" 체계에 따른 번호매김). IMGT 체계 하에 항체의 CDR들은 IMGT/DomainGap Align이라는 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 달리 특별히 언급되지 않은 한, Honegger & Pluckthun에 의해 제안된 번호매김 시스템("AHo")이 사용된다(Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(2001) 657-670). 구체적으로 하기 잔기들이 AHo 번호매김 체계에 따라 CDR로서 정의된다: LCDR1(CDR-L1라고도 지칭됨): L24 ~ L42; LCDR2(CDR-L2라고도 지칭됨): L58 ~ L72; LCDR3(CDR-L3라고도 지칭됨): L107 ~ L138; HCDR1(CDR-H1라고도 지칭됨): H27-H42; HCDR2(CDR-H2라고도 지칭됨): H57 ~ H76; HCDR3(CDR-H3라고도 지칭됨): H108-H138. 명료함을 도모하기 위해, Honegger 및 Pluckthun에 따른 번호매김 체계는 자연 발생 항체의 상이한 VH 및 VL 하위 과, 구체적으로 CDR에서 발견되는 길이의 다양성을 고려하고, 서열들에 갭을 제공한다. 그러므로 주어진 항체에서 보통 1번 ~ 149번 위치 모두인 것은 아닌 위치는 아미노산 잔기들에 의해 점유될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합 특이성"이란 용어는, 개별 항체가 하나의 항원 결정기와 반응하되, 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 "~와 특이적으로 결합하다" 또는 "~에 특이적인"이란 용어는 측정 가능하고 재현 가능한 상호작용, 예컨대 생물학적 분자를 비롯한 분자의 이종 집단이 존재할 때 표적이 존재함을 나타내는, 표적과 항체 사이의 결합이 일어남을 지칭한다. 예를 들어 표적(에피토프일 수 있음)과 특이적으로 결합하는 항체는, 더욱 큰 친화성, 결합활성으로 더욱 용이하게, 그리고/또는 다른 표적과 결합하는 기간 보다 더 오랜 기간 해당 표적과 결합하는 항체이다. 이것이 가장 일반적인 형태를 가질 때(그리고 한정된 참조기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"이란, 항체가, 예를 들어 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 확정되는 바와 같이, 관심 표적과 무관 분자를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 이러한 검정 방법으로서는 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR(표면플라스몬공명법) 검사 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 점수매김(scoring)은 표준 발색법(예컨대 서양고추냉이 과산화물과 2차 항체, 그리고 테트라메틸벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 임의의 웰 내에서의 반응은, 예컨대 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수가 매겨진다. 통상의 백그라운드(= 음성 반응)는 약 0.1 OD일 수 있고, 통상의 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이는, 양의 점수와 음의 점수 사이의 비가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 추가의 예에서, SPR 검정이 수행될 수 있는데, 이때 백그라운드와 신호 간 적어도 10배, 구체적으로는 적어도 100배 차이가 있음은 특이적 결합이 이루어졌음을 나타낸다. 통상적으로 결합 특이성의 확정은 단일 참조기준 분자를 사용하여 수행되는 것이 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 분자, 예컨대 분유 또는 트랜스페린 등으로 이루어진 세트를 사용하여 수행된다.
적합하게 본 발명의 항체는 단리 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리 항체"란 용어는 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체로부터 실질적으로 분리되어 있는 항체를 지칭한다(예컨대 MSLN 및 CD3과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 실질적으로 MSLN 및 CD3 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있으며, MSLN, CD3 및 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 MSLN, CD3 및 인간 혈청 알부민 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리됨). 게다가 단리 항체는 기타 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 분리되어 있을 수 있다.
적합하게 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 아미노산 서열이 동일한 유전자 공급원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 이러한 공급원으로부터 유래하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정의 에피토프 하나에 결합 특이성 및 친화성 하나를 보이거나, 특정의 에피토프들에 결합 특이성들 및 친화성들을 보인다.
본 발명의 항체는 키메라, 인간 및 인간화 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"키메라 항체"(또는 이의 항원 결합 단편)이란 용어는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교체되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 군의 불변 영역, 상이하거나 변경된 효과기 기능을 보이는 불변 영역 및/또는 상이한 종들의 불변 영역과 결합되거나, 또는 키메라 항체에 새로운 특성들을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 생장 인자, 약물 등과 결합되었거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 가지는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교체된 항체 분자(또는 이의 항원 결합 단편)이다. 예를 들어 마우스 항체는 자체의 불변 영역을 인간 면역글로불린 유래 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로 치환됨으로 말미암아, 키메라 항체는 항원을 인지함에 있어서 특이성을 보유할 수 있는 동시에, 인간에서의 항원성은 원래 마우스 항체와 비교되었을 때 감소한다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간 항체"(또는 이의 항원 결합 단편)란 용어는, 틀 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원 서열로부터 유래하는 가변 영역을 가지는 항체(및 이의 항원 결합 단편)를 포함하도록 의도된다. 뿐 아니라, 만일 항체가 불변 영역을 함유하면, 이 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예컨대 인간 생식계열 서열 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 것으로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이발생 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체에 관한 이러한 정의는 비 인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 파아지 전시 라이브러리를 이용하여 제조될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381(1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581(1991)). 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해서도 또한 이용 가능한 방법은 문헌[Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boemer et al, J. Immunol, 147(l):86-95(1991)]에 기재되어 있다. 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74(2001)]도 또한 참조한다. 인간 항체는, 항원 공격에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되되 그 내부 좌위는 무용지물이 된 유전자가 이식된 동물, 예컨대 면역화 제노마우스(xenomouse)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다[예컨대 XENOMOUSETM기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 동 제6,150,584호를 참조한다]. 또한, 예를 들어 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 제조된 인간 항체에 관한 문헌[Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)]도 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 비인간 항체의 반응성을 보유하되, 인간에서의 면역원성은 작은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다. 이는, 예를 들어 비인간 CDR 영역들은 유지시키면서, 항체의 나머지 부분들은 인간에 있어 대응 부분(즉 불변 영역과, 가변 영역의 틀 부분)으로 치환하여 달성될 수 있다. 추가의 틀 영역 변형은 인간 틀 서열뿐만 아니라 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래하는 CDR 서열 내에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 시험관내 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성을 촉진하거나 제조를 용이하게 만들기 위한 보존적 치환에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994]을 참조한다. 인간 공학 기술의 다른 예로서는 미국 특허 제5,766,886호에 개시된 Xoma 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합 인간화 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체 모두, 예컨대 인간화 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체; 그리고 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
적합하게, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된 것이다. 적합하게, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된 것으로서, 토끼 유래 CDR을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "다중 특이적 항체"란 용어는, 적어도 2개 이상의 상이한 표적(예컨대 MSLN 및 CD3)상에 존재하는 상이한 에피토프 2개 이상과 결합하는 항체를 지칭한다. "다중 특이적 항체"란 용어는 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적, 5중 특이적 및 6중 특이적 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "2중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 2개(예컨대 MSLN 및 CD3)에 존재하는 상이한 에피토프 2개와 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "3중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 3개(예컨대 MSLN, CD3 및 hSA)에 존재하는 상이한 에피토프 3개와 결합하는 항체를 지칭한다.
"에피토프"란 용어는, 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질로 된 결정기를 의미한다. 에피토프는, 보통 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 화학 활성 표면 군 형성(grouping)으로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라, 특이적 하전 특징을 가진다. "입체형" 및 "선형" 에피토프는, 변성 용매가 존재할 때 결합능을 상실하는지(입체형 에피토프), 아니면 상실하지 않는지(선형 에피토프)에 따라 구별된다.
본원에 사용된 바와 같은 "입체형 에피토프"란 용어는, 폴리펩티드 사슬이 폴딩(folding)되어 원산 단백질을 형성할 때 표면상에 모아지는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "선형 에피토프"란 용어는, 단백질 및 상호작용 분자(예컨대 항체)간 상호작용 지점 모두가 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 직선으로 존재하는(연속적인) 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "~를 인지하다"라는 용어는, 항체 및 이의 항원 결합 단편이 자체의 입체형 에피토프를 발견하여 상호작용(예컨대 결합)하는 경우를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "친화성"이란 용어는, 항체 및 항원간 단일 항원 부위에서의 상호작용 세기를 지칭한다. 각각의 항원성 부위내에서 항체 "팔"의 가변 영역은 약한 비공유성 외력을 통해 다양한 부위에서 항원과 상호작용하고; 그 상호작용이 클수록 친화성도 더 크다.
"결합 친화성"이란, 일반적으로 분자(예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예컨대 항원)간 비 공유 상호작용을 모두 합하였을 때의 세기를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성", "~와 결합한다", "~와 결합하다" 또는 "~와 결합하는"이란, 고유의 결합 친화성이 결합 쌍의 일원들(예컨대 항체 단편과 항원)간 1:1 상호작용을 반영하는 경우를 지칭한다. 분자 X의, 이의 파트너인 Y에 대한 친화성은, 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화성은 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있다. 저친화성 항체는, 일반적으로 항원과 천천히 결합하고, 쉽게 항원과 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는, 일반적으로 항원과 더 빨리 결합하고, 결합된 채 더 오래 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 방법 다수가 당 분야에 공지되어 있는데, 이 방법들 중 임의의 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화성, 즉 결합 세기를 측정하기 위한 방법으로서, 특정의 예시적 및 모범적 구현예가 이하에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "K결합", "Ka" 또는 "Kon"이란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 결합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 "K해리", "Kd" 또는 "Koff"란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 일 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 "KD"란 용어는, Kd 대 Ka의 비(즉 Kd/Ka)로부터 구하여진 해리 상수를 지칭하도록 의도되고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값" 또는 "KD" 또는 "KD값"은 표면플라스몬공명 검정을 이용하여 측정된다. 재조합 인간 메소텔린(인간 MSLN) 및 재조합 사이노몰거스 MSLN(사이노몰거스 MSLN)에 대한 친화성은 '실시예 1의 첫 단락'에 기재된 바와 같이 표면플라스몬공명(SPR) 측정에 의해 확정되었다. 재조합 인간 CD3에 대한 친화성은 실시예 4의 "SPR에 있어 인간 CD3ε에 대한 친화성" 첫 단락'에 기재된 바와 같이 SPR에 의해 측정되었다.
적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체는 MSLN 특이성에 대해 2가이다.
적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CD3 특이성에 대해 1가, 2가 또는 다가이다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CD3 특이성에 대해 2가이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CD3 특이성에 대해 1가이다.
"다가 항체"란 용어는, 가 수가 1을 초과하는 단일 결합 분자를 지칭하는데, 여기서 "가 수"는 동일한 표적 분자상 에피토프와 결합하는 항원 결합기의 수로서 기술된다. 그러므로 단일 결합 분자는 표적 분자상 1개를 초과하는 결합 부위와 결합할 수 있다. 다가 항체의 예로서는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체 및 5가 항체 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "1가 항체"란 용어는, 표적 분자상 단일 에피토프, 예컨대 CD3과 결합하는 항체를 지칭한다. 또한 본원에 사용된 바와 같은 "결합 도메인" 또는 "1가 결합 도메인"이란 용어는, 표적 분자상 단일 에피토프, 예컨대 CD3과 결합하는 결합 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "2가 항체"란 용어는, 2개의 동일한 표적 분자, 예컨대 MSLN 표적 분자상 에피토프 2개와 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명의 다중 특이적 항체의 MSLN-BD 2개는 MSLN의 세포외 일부의 임의의 영역, 예컨대 MSLN의 영역 I, 영역 II 및/또는 영역 III과 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 다중 특이적 항체의 MSLN-BD 2개는 MSLN의 영역 I 및/또는 영역 II, 구체적으로 MSLN의 영역 I과 결합한다. 영역 I은 MSLN이 부착되는 세포 표면으로부터 가장 원거리에 있는, MSLN의 일부이다.
본 발명의 다중 특이적 항체의 MSLN-BD 2개는 MSLN 표적 분자상 동일 에피토프 또는 상이한 에피토프중 어느 하나와 결합한다. 바람직하게 본 발명의 다중 특이적 항체의 MSLN-BD 2개는 MSLN 표적 분자상 동일 에피토프와 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 "동일 에피토프"란 용어는, 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 동일 단백질상 개별 단백질 결정기를 지칭하는데, 단 이러한 개별 단백질 결정기는 동일한데, 즉 동일한 3차원의 구조적 특징뿐 아니라 동일한 하전 특징을 가지는 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 동일한 화학 활성 표면 군 형성으로 이루어진다. 본원에서 특이적 단백질 표적과 연관되어 사용된 바와 같은 "상이한 에피토프"란 용어는, 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 동일 단백질상 개별 단백질 결정기를 지칭하는데, 단 이러한 개별 단백질 결정기는 동일하지 않은데, 즉 상이한 3차원의 구조적 특징뿐 아니라 상이한 하전 특징을 가지는 아미노산과 같은 분자 또는 당 측쇄의 동일하지 않은 화학 활성 표면 군 형성으로 이루어진다. 이러한 상이한 에피토프는 중첩성이거나 중첩성이 아니다.
본 발명의 발명자들은 현재 놀랍게도, 예컨대 3중 특이적 분자(biMSLN고 KDxCD3xhSA) PRO2000, PRO2562, PRO2565, PRO2566 및 PRO2567이, 유세포분석법에 의해 확정되는 바에 따르면 MSLN 발현 수준이 건강한 MeT-5A 세포(ATCC CRL-9444)의 MSLN 발현 수준보다 대략적으로 7배 더 큰 표적 세포를, 큰 효율과, 상기 표적 세포 및 상기 MeT-5A 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정에서 확정되는 바에 따르면 상기 MeT-5A 세포를 사멸하기 위한 EC50보다 적어도 25배 더 작은 EC50으로 사멸할 수 있음을 발견하였다(예컨대 표 31 참조). 그러므로 PRO2000, PRO2562, PRO2566 및 PRO2567은 MSLN 고발현 표적 세포에 대해 매우 큰 사멸 역가를 보이지만, 이것들의 건강한 세포에 대한 사멸 역가는 훨씬 더 작은데, 이는 PRO2000, PRO2562, PRO2566 및 PRO2567이 사용되는 치료에 대한 잠재적으로 넓은 치료 윈도우(therapeutic window)를 보여준다. 이와는 대조적으로, 상기 MSLN 고발현 표적 세포 및 상기 건강한 Met-5A 세포를 사멸하기 위한 PRO2000, PRO2562, PRO2566 및 PRO2567의 MSLN-BD의 결합 친화성(KD)보다 5배를 초과하여 더 큰 결합 친화성(KD)을 가지는 것으로서, MSLN-BD 1개를 포함하는 3중 특이적 참조기준 분자 PRO1872(MSLN저KDxCD3xhSA)의 역가는 유의미하게 상이하지 않다. 이러한 발견은 암환자 치료에 있어 본 발명의 다중 특이적 항체 사용에 대한 치료적 윈도우가 유의미하게 넓어졌음을 나타낸다. 또한 본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 3중 특이적 분자 PRO2000, PRO2562, PRO2565, PRO2566 및 PRO2567(biMSLN고 KDxCD3xhSA)의 EC50값, 즉 유세포분석법에 의해 확정되는 바에 따르면 MSLN 발현 수준이 건강한 MeT-5A 세포(ATCC CRL-9444)의 MSLN 발현 수준보다 대략적으로 7배 더 큰, 표적 세포를 사멸하기 위한 EC50값이, 상기 표적 세포에 대한 T 세포 구동 세포독성 검정법에서 확정되는 바에 따르면 50 ng/ml 가용성 메소텔린(sMSLN)이 존재할 때에는 6배를 초과하여 증가하지 않았고, 500 ng/ml 가용성 메소텔린(sMSLN)이 존재할 때에는 40배 이하만큼 증가하지 않았음을 발견하였다. 다른 한편으로, 3중 특이적 참조기준 분자 PRO1872(MSLN저　KDxCD3xhSA)의 상기 표적 세포를 사멸하기 위한 EC50값은 50 ng/ml sMSLN이 존재할 때는 거의 8배, 그리고 500 ng/ml sMSLN이 존재할 때는 75배를 초과하여 증가하였다. 그러므로 3중 특이적 분자 PRO2000, PRO2562, PRO2566 및 PRO2567의 MSLN 고발현 표적 세포에 대한 큰 사멸 역가는 sMSLN의 높은 농도에 의해 단지 미약하게 영향을 받는다. 다른 한편, 3중 특이적 분자 PRO2000, PRO2562, PRO2566 및 PRO2567의 건강한 세포에 대한 사멸 역가는 고농도의 sMSLN이 존재할 때 한층 더 감소하는데(데이터는 보이지 않음), 이는 임상에 있어 이러한 분자들의 치료적 윈도우가 sMSLN의 존재에 의해 더 넓어졌음을 나타낸다. 이는 중요한 발견인데, 그 이유는 가용성 메소텔린 관련 단백질(SMRP)의 혈장중 높은 수준이 환자에서 종종 관찰되기 때문이다. 본 발명자들은 PRO2000의 CD8+ T 세포 활성화 역가에 대해서도 유사하게 유리한 결과를 수득하였다. 이러한 발견은, 복잡한 다중 표적, 다중 세포 상황에서 입체적으로 또는 다른 방식으로 서로를 억제하지 않고 4개의 결합 도메인 모두가 그 기능을 유지한다고 선험적으로 기대할 수 없기 때문에 더욱더 놀라운 것이다.
본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 MSLN-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 메소텔린-BD는 그 서열이 표 1에 나열된 인간화 MSLN-결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 CD3-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 CD3-BD는 그 서열이 표 3에 나열된 인간화 CD3-결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체는 상이한 특이성 2개(MSLN 및 CD3)를 가진다. 적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체는 MSLN에 대해 2가인 2중 특이적 항체이다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 추가의 특이성을 포함할 수 있거나(3중 특이적 항체) 또는 특이성들을 포함할 수 있다(4중 특이적 또는 5중 특이적 또는 6중 특이적 항체). 일 구현예에서, 다중 특이적 항체는 2중 특이적이다(MSLN 및 CD3). 또 다른 구현예에서, 다중 특이적 항체는 3중 특이적이다(MSLN, CD3 및 hSA).
적합하게, 본 발명의 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
동일하거나 더 작은 분자량일 때, 특이성/기능성 수치를 증가시키기 위해서는 항체 단편, 예컨대 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 기타 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하는 것이 유리하다. 이와 같이 더 작은 분자는 전항체의 항원 결합 활성을 보유할뿐더러, 전체 면역글로불린 분자에 비하여 개선된 조직 침투성과 약동학적 특성을 보일 수 있다. 이러한 단편은 전체 면역글로불린에 비해 다수의 이점을 보이는 것으로 나타난 반면에, 생체내 반감기를 늘리는 Fc 도메인이 결여되어 있는 관계로 혈청으로부터의 소멸 속도가 증가한다는 단점을 가진다(Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217). 분자량이 더 작은 분자는 더 효율적으로 표적 조직(예컨대 고형 암)에 침투하므로, 동일하거나 더 작은 용량일 때 개선된 효능을 보장한다.
놀랍게도 본 발명자들은 인간 혈청 알부민 결합 도메인(hSA-BD)이 본 발명의 다중 특이적 항체에 첨가될 경우 기타 결합 도메인이 각각의 자체 표적과 결합하는 능력은 방해받지 않음을 확인하였다. 이러한 발견은, 복잡한 다중 표적, 다중 세포 생체 내 상황에서 입체적으로 또는 다른 방식으로 서로를 억제하지 않고 4개의 결합 도메인 모두가 그 기능을 유지한다고 선험적으로 기대할 수 없기 때문에 놀라운 것이다.
적합하게, 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민에 대한 특이성을 가지는 추가의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 다중 특이적 항체는 (i) MSLN-BD 2개; (ii) CD3-BD 적어도 1개; 및 (iii) hSA-BD 적어도 1개를 포함한다.
"hSA"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 P02768의 인간 혈청 알부민을 지칭한다. 인간 혈청 알부민(hSA)은 인간의 혈청중에 풍부한(총 단백질의 50%) 66.4 kDa의 단백질로서, 585개의 아미노산으로 구성되어 있다(Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). 다기능성 hSA 단백질은 다수의 대사물질, 예컨대 지방산, 금속 이온, 빌리루빈 및 몇몇 약물의 결합 및 운반을 허용하였던 자체의 구조와 연관되어 있다(Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). 혈청중 hSA의 농도는 약 3.5 g/dL ~ 5 g/dL이다. 알부민 결합 항체 및 이의 단편은, 예를 들어 이에 접합된 단백질 또는 약물의 생체내 혈청중 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, hSA-BD는 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.
본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 hSA-BD는 본 발명에 제공된 결합 도메인이다. 본 발명의 hSA-BD는 그 서열이 표 4에 나열된 인간화 hSA-결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로 본 발명의 hSA-BD는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 또 다른 hSA-BD는 (i) 혈청 알부민과 결합하는 폴리펩티드(예컨대 문헌(Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756; EP0486525; US6267964; WO 2004/001064; WO 2002/076489; 및 WO 2001/45746) 참조); (ii) 문헌(Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288, WO 2004/003019, WO 2008/096158, WO 2005/118642, WO 2006/0591056 및 WO 2011/006915)에 기재된 항 혈청 알부민 결합 단일 가변 도메인; (iii) WO 2009/040562, WO 2010/035012 및 WO 2011/086091에 기재된 항 혈청 알부민 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 포함하거나, 이로부터 유래한다.
본 발명의 기타 가변 도메인은 돌연변이되었으되, 그 CDR 영역이 표 1, 3 및 4에 제시된 서열에 서사된 CDR 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 CDR 영역을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 기타 가변 도메인은, 표 1, 3 및 4에 제시된 서열에 서사된 CDR 영역과 비교되었을 때, CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
적합하게 본 발명의 결합 도메인의 VH 도메인은 VH3과 또는 VH4과에 속한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 VH3과에 속하는 VH 도메인을 포함한다. 본 발명의 맥락중 "VHx과(또는 VLx과)에 속하는"이란 용어는, 틀 서열 FR1 ~ FR3이 상기 VHx과(또는 VLx과 각각)에 대해 가장 높은 상동도를 보임을 의미한다. VH과 및 VL과의 예는 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86, 또는 WO 2019/057787]에 제시되어 있다. VH3과에 속하는 VH 도메인의 구체예는 서열 번호 129에 의해 표시되고, VH4과에 속하는 VH 도메인의 구체예는 서열 번호 130에 의해 표시된다. 구체적으로 서열 번호 129로부터 취하여진 틀 영역 FR1 ~ FR3은 VH3과에 속한다(표 7 참조, 해당 영역은 보통의 글씨체로 표시). 적합하게 본원에 사용된 바와 같은 VH3과에 속하는 VH는 서열 번호 129의 FR1 ~ FR3에 대해 적어도 85%, 구체적으로는 적어도 90%, 더욱 구체적으로는 적어도 95%의 서열 동일성을 보이는 FR1 ~ FR3을 포함하는 VH이다. VH3 서열의 대안적 예와, VH4 서열의 대안적 예는 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86 또는 WO 2019/057787]에서 확인할 수 있다. 적합하게 본 발명의 hSA-BD는 Vκ틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 틀, 구체적으로 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4 및 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4, 구체적으로 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함한다. 적합한 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3뿐 아니라, 예시적 VλFR4가 서열 번호 131에 제시되어 있다(표 7 참조, FR 영역은 보통의 글씨체로 표시). Vκ1 서열의 대안적 예와, Vκ2, Vκ3 또는 Vκ4 서열의 대안적 예는 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296(2000) 57-86]에서 살펴볼 수 있다. 적합한 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3은 서열 번호 131로부터 취하여진 FR1 ~ FR3(표 7 참조, FR 영역은 보통의 글씨체로 표시)에 대응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 132 ~ 서열 번호 138과, 구체적으로는 제2 단일 시스테인이 대응 VH 사슬, 구체적으로는 VH의 51번 위치(AHo 번호매김)에 존재하는 경우에 도메인간 이황화 결합을 형성하기 위해 단일 시스테인 잔기를 포함하는 서열 번호 139에 제시되어 있는 바와 같다. 일 구현예에서, 본 발명의 VL 도메인은 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 132 또는 139에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 보이는 Vλ FR4를 포함한다.
본 발명의 결합 도메인들은 표 1, 3 및 4에 나열된 VH 도메인을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 결합 도메인은 표 1, 3 및 4에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 20개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다(단 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임). 적합하게, 본 발명의 결합 도메인은 표 1, 3 및 4중 하나에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 15개 이하의 아미노산, 구체적으로 10개 이하의 아미노산, 구체적으로 5개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다(단 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명의 기타 결합 도메인은 돌연변이되되, 표 1, 3 및 4중 하나에 나열된 대응 서열들에 서사된 VH 영역, 예컨대 적어도 5번 ~ 140번 위치(AHo 번호매김), 구체적으로 표 1, 3 및 4에 보인 서열들중 1개의 적어도 3번 145번 위치를 포함하는 VH 도메인을 포함한 VH 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 VH 영역내 아미노산을 포함한다.
구체적으로 본 발명의 결합 도메인은 표 1, 3 및 4중 1개에 나열된 VL 도메인을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 결합 도메인은 표 1, 3 및 4중 1개에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 20개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다(단 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임). 적합하게, 본 발명의 결합 도메인은 표 1, 3 및 4중 하나에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 15개 이하의 아미노산, 구체적으로 10개 이하의 아미노산, 구체적으로 5개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다(단 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명의 기타 결합 도메인은 돌연변이되되, 표 1, 3 및 4에 나열된 대응 서열들에 서사된 VL 영역, 예컨대 적어도 5번 ~ 140번 위치(AHo 번호매김), 구체적으로 표 1, 3 및 4에 보인 서열들중 1개의 적어도 3번 145번 위치를 포함하는 VL 도메인을 포함한 VL 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 VL 영역내 아미노산을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "본 발명의 결합 도메인"이란 용어는, 결합 도메인, 즉 다중 특이적 맥락과 독립적인 결합 도메인과, 구체적으로 다중 특이적 구조체에 포함된 결합 도메인, 예컨대 2중 특이적, 3중 특이적 또는 4중 특이적 구조체에 포함된 결합 도메인중 하나 둘 다에 관한 것이다.
적합하게 본 발명의 결합 도메인은 Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb 및 STAB로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합하게 본 발명의 결합 도메인은 scFv 항체 단편이다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 임의의 적합한 포맷을 가질 수 있다.
적합하게 다중 특이적 항체의 결합 도메인들은 작동 가능하도록 결합된다. 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인들은 자체의 항원들 또는 수용체들 각각과 동시에 결합할 수 있다. 이와 연관되어 사용되는 바와 같이 "동시에"란 용어는, MSLN-BD 및 CD3-BD중 적어도 1개의 동시 결합을 지칭한다. 특정 경우, 예컨대 세포 표면상 MSLN이 고밀도로 존재하는 표적 세포의 경우, 결합 도메인 3개는 동시에 결합하는 것이 가능할 수 있는데, 즉 MSLN-BD 및 CD3-BD 둘 다는 동시에 결합하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 MSLN-BD 2개와 CD3-BD 적어도 1개를 포함하는데, 상기 MSLN-BD 및 상기 CD3-BD는 서로 작동 가능하도록 결합된다.
본원에 사용된 바와 같은 "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 2개의 분자(예컨대 폴리펩티드, 도메인, 결합 도메인)가 결합되어, 각각이 기능상 활성을 보유하는 경우를 나타낸다. 2개의 분자는, 그것들이 직접적으로 결합되어 있거나, 아니면 (예컨대 링커, 기, 기에 대한 링커를 통해) 간접적으로 결합되어 있거나 간에 "작동 가능하도록 결합된" 것일 수 있다. "링커"란 용어는, 선택적으로 본 발명의 항체 단편 또는 결합 도메인 사이에 위치하는 펩티드 또는 기타 기를 지칭한다. 분자들을 함께 공유 결합하기 위해 다수의 전략이 사용될 수 있다. 이러한 전략으로서는 단백질 또는 단백질 도메인의 N-말단 및 C-말단간 폴리펩티드 결합, 이황화 결합을 통한 결합 및 화학적 가교 시약을 통한 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 구현예의 일 양태에서, 링커는 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 펩티드 결합이다. 2개의 폴리펩티드 사슬이 연결될 특정의 경우에 적합한 링커를 선택하는 것은, 다양한 매개변수, 예컨대 두 폴리펩티드 사슬의 성질(예컨대 이 두 사슬이 자연적으로 올리고머화된 것인지 여부), 공지되어 있다면 연결될 N 말단 및 C 말단 사이의 거리 및/또는 단백분해와 산화에 대한 링커의 안정성(이에 한정되는 것은 아님)에 달려있다. 더욱이 링커는 가요성(flexibility)을 제공하는 아미노산 잔기들을 함유할 수 있다.
본 발명의 맥락중 "폴리펩티드 링커"란 용어는, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기들의 사슬로 이루어진 링커로서, 각각 링커의 한쪽 말단에 부착된 두 도메인을 연결해주는 링커를 지칭한다. 폴리펩티드 링커의 길이는 두 분자가 서로에 대해 올바른 입체형태를 이루어, 원하는 활성을 보유하게 만드는 방식으로 두 분자를 연결하는데 적당해야 한다. 구체적인 구현예에서, 폴리펩티드 링커는 2개 내지 30개 아미노산 잔기(예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 아미노산 잔기)로 이루어진 연속 사슬을 가진다. 뿐 아니라, 폴리펩티드 링커에 포함되도록 선택된 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 활성을 유의미하게 방해하지 않는 특성을 보여야 한다. 그러므로 링커 펩티드는 대체로 폴리펩티드 활성과 양립 불가능하거나, 내부 폴딩을 방해하거나, 또는 수용체 단량체 도메인들의 결합을 심각하게 방해할, 단량체중 1개 이상의 아미노산 잔기와 결합을 형성하거나 기타 상호작용이 진행되도록 만드는 전하를 보여서는 안 된다. 구체적인 구현예들에서, 폴리펩티드 링커는 구조화되지 않은 폴리펩티드이다. 유용한 링커는 글리신-세린, 즉 GS 링커를 포함한다. "Gly-Ser"또는 "GS" 링커란, 당 업자에 의해 이해될 바와 같이, 글리신과 세린이 일렬로 늘어선 중합체[예를 들어 (Gly-Ser)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하되, 여기서 n은 적어도 1인 정수임], 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커, 예컨대 쉐이커 칼륨 채널(shaker potassium channel)용 테더(tether), 그리고 기타 매우 다양한 가요성 링커를 의미한다. 글리신과 세린은 둘 다 비교적 구조화되지 않았으므로 글리신-세린 중합체가 바람직하고, 따라서 구성성분들간 중성 테더로서 사용될 수 있다. 두 번째로, 세린은 친수성으로서, 구형 글리신 사슬일 수 있었던 것을 용해할 수 있다. 세 번째, 유사한 사슬이 재조합 단백질, 예컨대 단일 사슬 항체의 서브유닛들을 연결하는데 유효한 것으로 보였다.
적합하게, 다중 특이적 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 다중 특이적(예컨대 적어도 2중 특이적) 포맷으로부터 선택된 포맷으로서, 면역글로불린 Fc 영역(들)을 포함하지 않는 포맷, 비제한적 예를 들자면 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), Fab-Fv2, 트리아바디, scDb-scFv, 테트라바디, 디-다이아바디, CODV, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-Fv2, 또는 이종이량체 Fc 도메인을 제외한 이종이량체화 도메인의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 CODV, 그리고 MATCH(WO 2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84에 기재됨) 및 듀오바디(Duobody 기술에 의해 제조된 2중 특이적 IgG)(MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307)를 기반으로 한 포맷을 가진다. 특히 적합한 다중 특이적 항체는 단일 사슬 다이아바디(scDb)-scFv 또는 MATCH이다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 CH1 영역 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 scDb-scFv, 트리아바디 및 트리바디로 이루어진 목록으로부터 선택된 포맷을 가진다. scDb-scFv은 본원에 사용되기에 특히 적합하고, 구체적으로 상기 MSLN-BD 및 상기 CD3-BD중 1개는 scDb 형태를 가지고, 제2 MSLN-BD는 상기 scDb에 작동 가능하도록 결합된 scFv이다.
"다이아바디"란 용어는 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 내 VL과 결합된 VH(VH-VL)를 포함한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이의 쌍 형성을 허용하지 않는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 다이아바디는 2가 또는 2중 특이적일 수 있다. 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
2중 특이적 scDb, 구체적으로 2중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예들에서, 링커 L1 및/또는 L3은 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 또는 2개를 포함한다[(GGGGS)n, 단 식 중, n=1 또는 2, 구체적으로 n=1임].
중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예에서, 상기 링커 L2는 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 이상을 포함한다[(GGGGS)n, 단 식 중, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 구체적으로 n=4임].
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 scDb-scFv이다. "scDb-scFv"란 용어는, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이 가요성 Gly-Ser 링커에 의해 단일 사슬 다이아바디(scDb)에 융합된 항체 포맷을 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 가요성 Gly-Ser 링커는 2개 ~ 40개의 아미노산, 예컨대 2개 ~ 35개, 2개 ~ 30개, 2개 ~ 25개, 2개 ~ 20개, 2개 ~ 15개, 2개 ~ 10개의 아미노산, 구체적으로 10개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특정 구현예에서, 상기 링커는 4개(4)의 글리신 아미노산 잔기와, 1개(1)의 세린 아미노산 잔기의 단위 1개 이상을 포함한다[(GGGGS)n, 단 식 중, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 바람직하게 n=2임].
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 문헌[WO 2016/0202457; Egan T., et al., MABS 9(2017) 68-84]에 기재된 MATCH 포맷을 가진다. 구체적으로 이 구현예에서 본 발명의 다중 특이적 항체는 MATCH3 포맷 또는 MATCH4 포맷을 가진다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제작 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다[예컨대 2중 특이적 구조체 제조에 관한 문헌(Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74(2007) 3-14; Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907(2012)713-727)과, 2중 특이적 다이아바디 및 탠덤 scFv에 관한 WO 99/57150을 참조한다]. 본 발명의 2중 특이적 구조체를 제조하기 적합한 방법에 관한 특정 예는 여러가지 중에서 Genmab 기술(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(2013) 5145-5150) 참조) 및 Merus 기술(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106(2010) 741-750) 참조)을 추가로 포함한다. 기능성 항체 Fc부를 포함하는 2중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법도 또한 당 분야에 공지되어 있다(예컨대 문헌(Zhu et al., Cancer Lett. 86(1994) 127-134); 및 문헌(Suresh et al., Methods Enzymol. 121(1986) 210-228) 참조).
이러한 방법은, 통상적으로 공지된 분자 클로닝 기술을 사용하여 2중 특이적 또는 다중 특이적 구조체를 제조하기 위해, 예컨대 하이브리도마 기술을 사용하여, 원하는 항원으로 면역화된 마우스 유래 비장세포와 골수종 세포를 융합하거나(예컨대 문헌(Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006) 참조), 재조합 항체 조작(레파토리 클로닝 또는 파아지 전시/효모 전시)(예컨대 문헌(Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189(2000) 1-8) 참조), 그리고 2개 이상의 상이한 모노클로날 항체의 항원 결합 도메인 또는 단편 또는 일부를 조합함으로써 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다.
본 발명의 다중 특이적 분자는 당 분야에 공지된 방법을 시용하여 구성적 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 2중 특이적 분자의 각각의 결합 특이성은 별도로 생성된 후 서로간에 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 공유 접합을 위한 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예로서는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세트산염(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산염(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산염(설포-SMCC)을 포함한다[예를 들어 문헌(Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)을 참조한다]. 기타 방법으로서는 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 문헌[Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375]에 기술된 방법을 포함한다. 접합제는 SATA 및 설포-SMCC인데, 이것들 둘 다는 Pierce Chemical Co.(Rockford, Ill.)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이는 중쇄 2개의 C 말단 경첩 영역의 설프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 구체적 구현예에서, 경첩 영역은 접합 전 홀수 개(예컨대 1개)의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로 2개 이상의 결합 특이성은 동일 벡터에서 암호화되어, 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 2중 특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F(ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질일 때 특히 유용하다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 1개의 단일 사슬 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 결합 결정기 2개를 포함하는 단일 사슬 다중 특이적 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 단일 사슬 분자 적어도 2개를 포함할 수 있다. 다중 특이적 항체 및 분자를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기술되어 있다.
다중 특이적 항체와 이의 특이적 표적의 결합은, 예를 들어 효소결합면역흡착검정(ELISA), 방사성면역검정(REA), FACS 분석, 바이오검정(예컨대 생장 억제) 또는 웨스턴블럿검정(Western Blot assay)에 의해 확인될 수 있다. 이 검정들 각각은, 일반적으로 관심 복합체에 특이적인, 표지화된 시약(예컨대 항체)을 사용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 확인한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다.
"핵산"이란 용어는 본원에서 "폴리뉴클레오티드(들)"란 용어와 호환되어 사용되고 있으며, 1개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이것들의 중합체(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태)를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하는데, 이것들은 합성, 자연발생 및 비 자연발생되는 것이고, 참조기준 핵산의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조기준 뉴클레오티드의 대사 방식과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예들로서는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 암묵적으로 (예컨대 축퇴성 코돈 치환으로 인한) 자체의 보존적 변형 변이체와 상보성 서열을 포함할뿐만 아니라, 명백하게 명시된 서열을 포함하기도 한다. 특히 이하에 상세히 기술된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택 코돈(또는 모든 코돈)의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
본 발명은 전술된 다중 특이적 항체의 분절 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는, 실질적으로 정제도니 핵산 분자를 제공한다. 폴리펩티드가 적당한 발현 벡터로부터 발현될 때, 이와 같은 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 본 발명의 다중 특이적 항체의 항원 결합능 또는 항원 결합능들을 보일 수 있다.
보통은 표 1, 3 및 4에 제시된 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인중 CDR 영역 3개 모두와 CDR 영역 적어도 1개를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 제공된다. 코드의 축퇴성으로 말미암아, 다양한 핵산 서열은 면역글로불린 아미노산 서열 각각을 암호화할 것이다.
폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 기존 서열(예컨대 이하 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신규 고체상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학 합성은 당 분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol.68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth.Enzymol.68: 109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra.Lett., 22: 1859, 1981]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예컨대 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods 및 Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포도 또한 본 발명에 제공된다.
"벡터"란 용어는, 그와 결합된 다른 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 가지 유형으로서는 "플라스미드"가 있는데, 이는 내부에 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형으로서는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 안에 들어가 결찰될 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 임의의 벡터는 이 벡터가 도입되는 숙주 세포내에서 자율 복제가 가능하다(예컨대 세균 복제 기원을 가지는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터(예컨대 비 에피좀 포유동물 벡터)가 숙주 세포에 도입될 때, 이 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.
게다가 임의의 벡터는 작동 가능하도록 결합된 유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태를 가진다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드"와 "벡터"는 호환되어 사용될 수 있는데, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나 본 발명은 이처럼 동일한 기능을 보이는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하도록 의도된다. 이러한 구체적인 맥락에서, "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA) 분절간 기능상 관계를 지칭한다. 통상적으로 이는, 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능상 관계를 지칭한다. 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열은, 만일 이것이 적당한 숙주 세포 또는 기타 발현계에 있는 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조정한다면, 암호화 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 것이다. 일반적으로 전사된 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 대해 물리적으로 연속적인데, 즉 이 프로모터 전사 조절 서열은 시스 작동성(cis-acting)이다. 그러나 몇몇 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는, 이것의 전사 향상 대상인 암호화 서열에 물리적으로 연속적이어야 한다거나, 가까이에 위치하여야 한다거나 할 필요가 없다.
본 다중 특이적 항체 사슬 또는 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서는 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터 및 비 바이러스 발현 벡터 둘 다가 포유동물 숙주 세포 내에서 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 비 바이러스 벡터 및 계로서는 통상 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트를 가지는 플라스미드, 에피좀 벡터, 그리고 인간 인공 염색체를 포함한다(예컨대 문헌(Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997)을 참조한다). 예를 들어 포유동물(예컨대 인간) 세포에서 MSLN 결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비 바이러스 벡터로서는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C(Invitrogen, San Diego, Calif.), MPS V 벡터와, 기타 단백질을 발현시키기 위한 것으로서 당 분야에 공지된 다수의 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터로서는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 한 벡터, SV40, 인간유두종바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스를 기반으로 한 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus; SFV)를 포함한다. 문헌[Brent et al., 상동; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되도록 의도된 숙주 세포에 의존적이다. 통상적으로 발현 벡터는 다중 특이적 항체 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 결합된 프로모터와 기타 조절 서열(예컨대 인핸서)을 함유한다. 일 구현예에서, 유도성 프로모터는, 유도 조건하에 있을 때를 제외하고, 삽입된 서열의 발현을 막기 위해 사용된다. 유도성 프로모터로서는, 예컨대 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양액은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 관용되는 암호화 서열 모집단에 대한 편향(biasing) 없이 비유도성 조건하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 더하여 기타 조절 요소들도 또한 다중 특이적 항체 사슬 또는 단편의 효율적인 발현에 필요할 수 있거나, 이에 요망될 수 있다. 이러한 요소는 통상 ATG 개시 코돈 및 인접 리보좀 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 뿐만 아니라 발현 효율은 세포계에서 사용되기 적당한 인핸서를 포함시킴으로써 향상될 수 있다[예를 들어 문헌(Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; 및 Bittner et al., Meth.Enzymol. 153:516, 1987)을 참조한다]. 예를 들어 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유동물 숙주 세포 내에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 분비 신호 서열 위치를 제공하여, 삽입된 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 가지는 융합 단백질을 생성할 수도 있다. 더 빈번하게, 삽입된 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인 서열은 벡터에 포함되기 전 신호 서열과 결합한다. 다중 특이적 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 결합 도메인을 암호화하는 서열을 수용하는데 사용될 벡터는 또한 종종 이의 불변 영역 또는 일부를 암호화하기도 한다.
"재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는, 내부에 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정의 대상 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손까지라도 지칭하도록 의도됨이 이해될 것이다. 돌연변이 또는 환경의 영향 중 어느 하나로 말미암은 임의의 변형은 후세대에서 일어날 수 있으므로, 이러한 자손은 실상 부모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어의 범위 안에는 여전히 포함된다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 보유하면서 이를 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 중 어느 하나일 수 있다. 이.콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝과 발현에 유용한 원핵생물 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 기타 미생물 숙주로서는 간균류, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 기타 장내세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵생물 숙주에 있어, 통상 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열(예컨대 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터가 제조될 수도 있다. 더욱이 널리 공지된 여러 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터계, 트립토판(trp) 프로모터계, 베타-락타마아제 프로모터계 또는 파아지 람다로부터 유래하는 프로모터계 임의의 수만큼이 존재할 것이다. 프로모터는 통상 선택적으로 작동인자 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사와 번역을 개시 및 종결하기 위한 리보좀 결합 부위 서열 등을 가진다. 본 발명의 MSLN 결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 기타 미생물, 예컨대 효모도 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 함께 곤충 세포도 또한 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 발현 및 생산하는데 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어 이 포유동물 숙주 세포는 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 중 어느 하나일 수 있다. 이 포유동물 숙주 세포는 임의의 정상 유한증식성 동물 세포 또는 인간 세포, 또는 정상이거나 비정상인 무한증식성 동물 세포 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어 비변형 면역글로불린을 분비할 수 있는 숙주 세포주로서 적합한 것 다수(예컨대 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마)가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현시키기 위해 포유동물 조직 세포 배양액을 사용하는 것은, 일반적으로 문헌, 예컨대 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서[예를 들어 문헌(Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) 참조], 그리고 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 그리고 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는, 보통 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형 특이적, 단계 특이적 및/또는 변조 가능한 것이거나, 조절 가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터로서는, 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(major late promoter), 덱사메타손 유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPS V 프로모터, 테트라사이클린 유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 즉시 초기(immediate-early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 그리고 당 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라서 달라진다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 보통 원핵생물 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 기타 세포성 숙주에 사용될 수 있다[일반적으로 문헌(Sambrook, et al. 상동)을 참조한다]. 기타 방법으로서는, 예컨대 전기천공법, 인산칼슘 처리, 리포좀 매개 형질전환법, 주입법 및 미세주입법, 탄도 방법(ballistic method), 바이로좀(virosome), 면역리포좀, 다가 양이온:핵산 접합체, 나출 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에의 융합(Elliot & O'Hare, Cell 88:223, 1997), 제제에 의해 향상되는 DNA 흡수, 그리고 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 종종 요망될 것이다. 예를 들어 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 도메인을 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터 도입후 세포는 선택적 배지에 대해 스위칭(switching)되기 전, 농축 배지 중에서 1일 ~ 2일 동안 생장하도록 허용될 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것으로서, 이 마커의 존재는 도입된 서열을 선택 배지에서 성공적으로 발현하는 세포의 생장을 허용한다. 내성으로서, 안정적으로 형질감염된 세포는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 경우 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써, 본 발명의 상기 항체 또는 이의 단편이 발현되도록 만드는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체, 이의 결합 도메인 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, (i) 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개, 또는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 벡터 또는 벡터 2개를 제공하고, 상기 핵산 서열 또는 핵산 서열들 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시켜, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 발현하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양하여, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 결합 도메인을 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 향상 또는 안정화하거나, 조성물의 제조를 촉진한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서는 생리학적으로 양립 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 달라진다. 투여는 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하로 수행될 수 있거나, 표적 부위에 가까운 부위에서 투여가 이루어질 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 (예컨대 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하여야 할 것이다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 본 발명의 다중 특이적 항체가 재료로 코팅되어 그 내부에 들어갈 수 있고, 이로써 화합물은, 이 화합물을 비활성화할 수 있는 산의 작용 및 기타 자연 조건으로부터 보호될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 널리 공지되어 있고, 당 분야에서 일상적으로 행하여지는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 약학 조성물은, 바람직하게 GMP 조건 하에서 제조된다. 통상적으로 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효 용량 또는 유효 용량만큼이 본 발명의 약학 조성물에 사용된다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 당 업자들에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제제화된다. 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예컨대 치료 반응)이 제공되도록 조정된다. 예를 들어 단일 볼루스 투여가 수행될 수 있거나, 수 회 분할 용량만큼이 경시적으로 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 응급도에 의해 알려지는 바와 비례하여 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일성을 도모하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위형이란, 치료될 대상체에 맞춘, 단위 투여형과 같이 물리적으로 별개인 단위들을 지칭하는데; 이 경우 각각의 단위에는 원하는 치료 효과가 발휘되도록 추산된 소정량만큼의 활성 화합물이, 필요한 약학 담체와 함께 담겨있다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성을 미치지 않고 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분 양만큼을 수득하기 위해 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예컨대 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료중인 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강상태 및 지금까지의 병력, 그리고 이와 유사한 인자들에 의존적이다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 보통 다수의 때에 투여된다. 단일 투여들간 간격은 1주일, 1개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자에 있어 본 발명의 다중 특이적 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 알려지는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 대안적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 적은 투여 횟수가 요구되는 경우 지연 방출 제제로서 투여될 수 있다. 투여량과 투여횟수는 환자에 있어 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 키메라 항체 및 비 인간 항체의 반감기보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량과 투여 횟수는 치료가 예방적인 것인지 또는 치료적인 것인지에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 적용의 경우, 비교적 적은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격을 두고 오랜 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자들은 자신의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받기도 한다. 치료적 적용의 경우, 비교적 많은 투여량이 비교적 짧은 간격을 두고 투여되는데, 이는 종종 질환의 진행이 느려지거나 종결될 때까지 이루어져야 하고, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 이루어져야 한다. 그 다음, 환자는 예방적 투여계획에 따라 투여받을 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다. 적합한 구현예에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암 치료가 필요한 대상체에서 그의 치료에 사용하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암을 치료하기 위한 의약을 제작할 때 사용하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하기 위한 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 증식성 질환, 구체적으로 암 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하기 위한 의약을 제작할 때 다중 특이적 항체 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 적합한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 증식성 질환, 구체적으로 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
"대상체"란 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 명시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어들은 본원에서 호환되어 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는 것", "치료하다", "치료된" 등과 같은 용어는, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 이 효과는 어떤 질환 및/또는 해당 질환으로 인할 수 있는 부작용을 부분적으로나 완전히 치유하거나, 해당 질환의 진행을 지연시킨다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유동물, 예컨대 인간에서 어떤 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하며, (a) 해당 질환을 억제하는 것, 예컨대 이 질환의 발달을 중단시키는 것; 그리고 (b) 해당 질환을 완화시키는 것, 즉 이 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효 양"이란 용어들은, 어떤 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 기타 대상체에 투여될 때 해당 질환의 이와 같은 치료를 달성하기 충분한, 어떤 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제, 질환 및 이의 중증도, 치료받을 대상체의 나이, 체중 등에 따라서 달라질 것이다.
일 구현예에서, 증식성 질환은 암이다. "암"이란 용어는 비정상 세포의 급속하고 제어가 불가능한 생장으로 특징지어지는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로, 또는 혈류 및 림프계를 통해서 몸의 다른 부분으로 퍼져나갈 수 있다. "종양" 및 "암"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되고 있는데, 예컨대 상기 두 용어는 고형 및 액체형, 예컨대 확산성(diffuse) 또는 순환성(circulating) 종양을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "암" 또는 "종양"이란 용어는 전악성뿐만 아니라, 악성인 암과 종양을 포함한다. "암"이란 용어는, 모든 고형암 및 혈액암을 포함한 광범위한 종양을 의미하도록 본원에 사용된다. 이러한 종양의 예로서는 양성 또는 구체적으로 악성 종양, 고형 종양, 뇌암, 신장암, 간암, 부신암, 방광암, 유방암, 위암(예컨대 위 종양), 식도암, 난소암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암(예컨대 비소세포폐암 및 소세포폐암), 질암, 갑상선암, 흑색종(예컨대 절제불가 또는 전이 흑색종), 신세포암종, 육종, 교모세포종, 다발성골수종 또는 위장관암, 구체적으로 결장암종 또는 결장직장선암종, 두경부 종양, 자궁내막암, 코든증후군(Cowden syndrome), 레르미트-뒤클로병(Lhermitte-Duclos disease), 반나얀-조나나 증후군(Bannayan-Zonana syndrome), 전립선 비대증, 신생물, 구체적으로 상피 신생물, 바람직하게 유암종 또는 편평세포암종, 만성림프구성백혈병, 만성골수성백혈병(예컨대 필라델피아 염색체 양성 만성 골수성백혈병), 급성 림프아구성백혈병(예컨대 필라델피아 염색체 양성 급성 림프아구성백혈병), 비호지킨림프종, 형질세포골수종, 호지킨림프종, 백혈병 및 이의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 암은 중피종, 췌장암 및 난소암으로부터 선택되는 암이다.
본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 조성물은 고형 종양뿐 아니라 액체형 종양의 생장을 억제한다. 추가의 구현예에서, 증식성 질환은 고형 종양이다. "고형 종양"이란 용어는, 특히 유방암, 난소암, 결장암, 직장암, 전립선암, 위암(구체적으로 위의 암), 자궁경부암, 폐암(예컨대 비소세포폐암 및 소세포폐암) 및 두경부 종양을 의미한다. 추가로, 종양의 유형과 사용된 특정 조합에 따라서, 종양 부피의 감소가 달성될 수 있다. 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 조성물은 또한 암이 발병한 대상체에서 종양의 전이적 확산 및 생장 또는 미세전이 발달을 예방하는데 적합하다.
서열 목록(돌연변이는 AHo 번호매김 체계에 따라 지명되었고, CDR은 Numab CDR 정의에 따라 정의됨)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
본 출원의 텍스트 전체에 걸쳐, 본 명세서의 텍스트(예컨대 표 1 ~ 7)와 서열 서열 목록 사이에 불일치가 있는 경우, 명세서의 텍스트가 우선한다.
명확함을 구현하기 위해 별도의 구현예들의 내용에 기술된 본 발명의 임의의 특징들은 또한 하나의 구현예와 조합하여 제공될 수 있다. 거꾸로 말하면, 간략함을 도모하기 위하여 하나의 구현예의 내용에 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 제공될 수 있거나 임의의 적합한 하위 조합을 통해 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 구현예들의 모든 조합들은, 특히 본 발명에 포함되고, 마치 각각의 조합과 모든 조합들이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다. 더욱이 다양한 구현예 및 이를 이루는 요소의 모든 하위 조합도 또한 본 발명에 의해 특별히 포함되고, 마치 각각의 하위 조합과 모든 하위 조합이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예들이 이루는 범위에 제한되지 않을 것이다. 실제로 본원에 기술된 변형 이외의 본 발명의 다양한 변형은 전술된 발명의 설명을 통해 당 업자들에게 명료해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허 청구의 범위 안에 속하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 간행물, 시험 방법, 문헌 및 기타 자료들은 각각의 특허법하에서 허용될 수 있는 정도로 본원에 참조로 인용되어 있다.
하기 실시예들은 전술된 본 발명을 설명하는 것이지, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 당 업자에게 공지되어 있는, 보통 말하는 그런 시험 모델로서 기타의 것도 또한 청구된 발명의 유리한 효과를 확정할 수 있다.
실시예
실시예 1: 항MSLN 분자의 제조 및 약동학적 특성규명:
제1 단계에서, MSLN에 대한 결합 친화성이 중 ~ 약인 항MSLN 항체 단편이 동정되어야 했다. 항MSLN 항체 단편은 다중 특이적 항체 포맷, 구체적으로 MATCH3 및 MATCH4 항체 포맷으로 사용되기 적합해야 했다.
본 발명의 항MSLN 결합 도메인의 동정, 선택 및 제조
본 발명의 인간화 scFv 항 MSLN 결합 도메인의 동정, 선택, 인간화 및 제조는, 본원에 참고문헌으로 포함된 특허출원 PCT/EP2018/064630에 기재된 scFv 항 CD3 결합 도메인의 동정, 선택, 인간화 및 제조와 유사하게 수행되었다.
원하는 특성, 구체적으로 원하는 친화성을 가지는 것으로서 동정된 모노클로날 항체 몇 개로부터 이하 절차에 따라 scF 분자가 제조되었다.
인간화 및 발현 :
토끼 항체는 λ-캡핑된 Vk1/VH3 Fv 스캐폴드상 CDR 그래프팅과, 특이적 토끼 틀 잔기의 선택적 그래프팅에 의해 인간화되었다. 각각의 scFv는 N-말단-VL-펩티드 링커-VH-C-말단 방향(펩티드 링커:(G4S)4)으로 디자인되었다.
재조합 아미노산 서열은 신규 합성되었고, scFv 구조체의 발현은 CHOgro 일시 형질감염 키트(Mirus)가 사용되어 CHO-S 세포에서 수행되었다. 배양액은 37℃에서 5일 ~ 7일간 발현 후(세포 생존률(cell viability) < 70%) 원심분리에 의해 수집되었고, 단백질은 투명한 배양 상청액으로부터 단백질 L 또는 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 필요에 따라 이후에 Superdex S200 컬럼이 사용되는 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 폴리싱 단계(polishing step)가 수행되었다.
품질 제어:
제작된 재료의 품질 제어를 위해 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 사용되었다.
SE-HPLC
SE-HPLC 분석 시료는 ShodexTM(Showa Denko, Cat. #: 554-1740) KW402.5-4F 컬럼(scFv 분석용) 또는 ShodexTM(Showa Denko, Cat. #: 554-1741) KW403-4F 컬럼(MATCH 단백질 분석)중 어느 하나에 통과되었는데, 이때 전개 완충제(ShodexTM KW402.5-4F: 250 mM NaCl, 50 mM NaOAc(Cat. #: A 1045), pH 6.0; ShodexTM KW403-4F: 35 mM NaH2PO4(Cat. #: A 3905), 15 mM Na2HPO4(Cat. #: A1372), 300 mM NaCl, pH 6.0)가 사용되었고, 그 유속은 0.35 mL/분이었다. 용리된 단백질은 λ = 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출되었다.
SDS-PAGE
단백질 동일성 및 분해는 SDS-PAGE 분석, 즉 MiniPROTEAN TGXTM 예비성형 겔(Bio-Rad Laboratories, Cat. #: 4569036)상에 변성 단백질을 로딩한 다음, 전기영동된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색함으로써 평가되었다. 분자량 표준: BioRad PrecisionTM Plus(Cat. #: 161-03/04).
제조된 scFv 분자의 제작 데이터는 표 8에 요약하였다.
항메소텔린 scFv 항체 PRO1783, PRO1925, PRO2306, PRO2309(저친화성) 및 PRO1922의 약동학적 특성규명
인간화 항메소텔린 scFv 항체 PRO1783은 자체의 1차 약동학적 특성, 예컨대 재조합 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN에 대한 친화성 및 결합 역학의 확정(SPR 측정), 인간 및 사이노콜거스 원숭이 MSLN 발현 세포주에 대한 원형질막 결합 평가(cELISA), 그리고 MSLN/MUC16 차단 평가(cELISA) 결과에 대해 평가되었다. 또한, 인간화 항MSLN scFv인 PRO1922, PRO1925, PRO2306 및 PRO2309는 자체의 1차 약동학적 특성, 예컨대 재조합 인간 MSLN에 대한 결합 역학 및 친화성 평가(cELISA), 인간 MSLN 발현 세포주에 대한 원형질막 결합 평가(cELISA), 그리고 MSLN/MUC16의 차단 평가(cELISA)(PRO1922 및 PRO1925)의 결과들에 대해 평가되었다. 결과들은 표 9 ~ 13에 요약되었다.
SPR에서 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN에 대한 친화성
재조합 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN에 대한 scFv PRO1783(모노클로날 항체 54-01-G02 유래)의 친화성은 T200 디바이스(Biacore, GE Healthcare)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 이 실험에서 재조합 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN(각각 Peprotech 및 Sino Biological로부터 구매)은 표준 아민 커플링 방법이 사용되어 CM5 센서 칩상 상이한 플로우 셀(flow cell)에 부동화되었다. 그 다음, scFv 항체 PRO1783은 90 nM ~ 0.12 nM 범위의 농도로 5분 동안 플로우 셀에 주입되었으며, 단백질의 해리는 12분 동안 진행되도록 허용되었다. 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 평형 해리 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델(Langmuir binding model)이 사용되어 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)로 산정되었다. scFv PRO1922 및 scFv PRO1925의 친화성은 전술된 바와 같되, 15 nM ~ 0.12 nM의 농도 범위가 적용되어 SPR에 의해 평가되었다. scFv PRO2306 및 PRO2309의 친화성은 전술된 바와 같되, 90 nM ~ 0.35 nM의 농도 범위가 적용되어 SPR에 의해 평가되었다.
표 9에 보인 바와 같이, PRO1783은 SPR에 따르면 재조합 인간 MSLN에 낮은 나노몰 범위(KD = 2.91　nM)의 친화성으로 결합되었다. PRO1922, PRO1925, PRO2306 및 PRO2309는 SPR에 따르면 재조합 인간 MSLN과 높은 나노몰 이하 범위의 친화성으로 결합하였다. SPR 측정은 또한 PRO1783이 재조합 사이노몰거스 원숭이 MSLN과 감소한 친화성(KD = 30.06 nM, 표 10)으로 결합하였음을 입증하였다.
MSLN 발현 세포주와의 결합(cELISA에 의한 분석)
인간 MSLN을 고수준 발현하는 세포(H226 세포주)와의 결합
항MSLN scFv 항체 PRO1783과, 원형질막상 MSLN의 결합이 H226 암세포상에서 cELISA에 의해 평가되었다. 요약하면, MSLN을 발현하는 20,000개의 NCI-H226 세포 또는 HEK293T(MSLN 음성)가 편평 바닥 조직 배양액 처리 96웰 평판에 분배되었다. 그 다음날, 평판은 웰당 세척 완충제(PBS, 0.2 % BSA) 450 μl 범람 모드로 3회 세척되었는데, 매 시점마다 PRO1783 및 항MSLN 참조기준 항체 아마툭시맙의 일련의 희석액 50 μl씩이 첨가되었고, 평판은 실온(RT)에서 1.5시간 동안 가만히 진탕되며 항온처리되었다. 세척 완충제 450 μl로 3회 세척된 후 HRP 커플링된 단백질 L 또는 HRP 커플링된 항인간 IgG 항체 50 μl가 각각의 웰에 첨가되었다. 축회전 믹서(nutating mixer)상 1시간 동안 항온처리(RT)된 후, 평판은 웰당 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었으며, 이후 여기에 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL) 50 μl가 첨가되었다. 10분 동안 진행된 후, 웰당 1 M HCl 50 μl가 첨가되어 효소 반응이 중지되었으며, 평판은 참조기준 파장 690 nm가 적용되며 450 nm에서 판독되었다.
PRO1783과, MSLN을 높은 수준으로 발현하는 H226 세포주의 원형질막상 결합을 평가하는 실험 결과는 표 11에 보였다. PRO1783과 H226 세포주의 결합에 대한 EC50은 농도 1.44 nM에서 확인되었는데, 이 EC50은 참조기준 항체 아마툭시맙에 대해 얻어진 값(상대적 EC50값, 표 11)에 비하여 대략 6배 더 떨어지는 것으로 확인되었다. PRO1925, PRO2306 및 PRO2309와, H226 세포의 결합에 대한 EC50값은 PRO1783와 H226 세포의 결합에 대한 EC50값과 거의 동일한 것으로 확인되었다. PRO1922와 H226 세포의 결합에 대한 EC50값은 아미툭시맙과 H226 세포의 결합에 대한 EC50값과 거의 동일한 것으로 확인되었다. 메소텔린 음성 HEK293T 세포가 cELISA에서 시험되었을 때, 이 세포와 아마툭시맙, PRO1783, PRO1922, PRO1925, PRO2306 및 PRO2309의 결합은 검출되지 않았다(데이터는 보이지 않음). H226 세포주가 사용되는 cELISA에서 PRO1783, PRO1922, PRO1925, PRO2306, PRO2309 및 아마툭시맙의 농도-반응 곡선은 도 1에 제시되어 있다.
사이노몰거스 원숭이 MSLN 발현 세포(CHO 재조합 세포주)와의 결합
항MSLN scFv 항체 PRO1783의 사이노몰거스 원숭이 MSLN과의 교차반응성은 사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 재조합 CHO 세포주가 사용되어 cELISA에서 시험되었다. 사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 CHO 세포 또는 CHO-K1 세포(사이노몰거스 원숭이 MSLN 음성) 20,000개가 편평바닥 조직 배양 처리 96웰 평판에 분배되었다. 그 다음 날, 평판이 세척된 다음, PRO1783 및 항MSLN 참조기준 항체 아마툭시맙의 일련의 희석물은 H226 세포주가 사용되는 cELISA 프로토콜에 기재된 바와 같이 첨가되었다. 가만히 진탕되며 RT에서 1.5시간 항온처리된 후, 평판은 다시 세척되었고, PRO1783 및 아마툭시맙 각각의 결합을 검출하기 위해, HRP 커플링된 단백질 L 또는 HRP 커플링된 항인간 IgG 항체가 첨가되었다. 축회전 믹서상 1시간 동안 항온처리(RT)된 후, 평판은 세척되었고, 각각의 웰에는 TMB가 첨가되었다. 10분간 전개된 후, 웰당 1 M HCl 50 μl를 첨가함으로써 효소 반응은 중지되었고, 평판은 참조기준 파장 690 nm가 적용되며 450 nm에서 판독되었다.
사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 CHO 세포주가 사용되는 cELISA의 결과는 표 12에 보였다. 원형질막 사이노몰거스 원숭이 MSLN과의 결합에 대한 PRO1783의 EC50은 12 nM의 농도로 확인되었는데, 이 EC50은 참조기준 항체인 아마툭시맙의 EC50보다 명백히 더 떨어졌다(상대적 EC50 = 0.03). 한편, 원형질막 인간 MSLN과 PRO1783의 결합과 비교되었을 때, 이 PRO1783의 최대 결합 농도의 절반은 명백히 증가하였는데, 이는 재조합 사이노몰거스 원숭이 MSLN 단백질에 대한 PRO1783의 친화성이 감소하였음을 입증하는 SPR 분석 결과와 일치하였다. 사이노몰거스 원숭이 MSLN을 발현하는 CHO 세포주가 사용되는 cELISA에서 PRO1783 및 아미툭시맙의 농도-반응 곡선은 도 2에 제시되어 있다. CHO-K1 야생형 세포가 cELISA에서 시험되었을 때, 아마툭시맙과 PRO1783의 결합은 검출되지 않았다(데이터는 보이지 않음).
MSLN/MUC16 상호작용의 중화(경쟁 ELISA에 의한 분석)
항MSLN scFv 항체 PRO1783, PRO1922 및 PRO1925가 MSLN/MUC16 상호작용을 차단하는 역가는 경쟁 ELISA에서 평가되었다. ELISA 평판은, 1　μg/ml MUC16을 함유하는 PBS 50 μl를 4℃에서 밤새도록 첨가함으로써 코팅되었다. 그 다음날, 평판은 범람 방식으로 웰당 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었으며, 차단 완충제 300　μl는 RT에서 1시간 동안 축회전 믹서상에서 각각의 웰에 첨가되었다. 그 다음, 바이오틴화 MSLN은 최종 농도 1　ng/ml에 이르도록 차단 완충제중에 희석되었다. 이후, PRO1783, PRO1922, PRO1925 및 아마툭시맙은 바이오틴화 MSLN 함유 차단 완충제중에 적정되었으며, 축회전 믹서상 RT에서 1시간 동안 항온처리되었다. ELISA 평판은 웰당 세척 완충제 450　μl로 범람 방식으로 3회 세척되었고, 적정 곡선상 각각의 농도의 PRO1783, PRO1922, PRO1925 및 아마툭시맙 50　μl씩이 ELISA 평판에 2회 모사 첨가되었다. 평판은 가만히 진탕되며 RT에서 1.5시간 동안 항온처리되었다. 웰당 세척 완충제 450 μl로 세척이 3회 수행된 후, 10 ng/ml 스트렙타비딘-폴리HRP40 50 μl가 ELISA 평판의 각각의 웰에 첨가되었다. RT에서 1시간 동안 항온처리가 수행된 후, 평판은 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었으며, TMB 50 μl가 첨가된 후 5분 ~ 10분 동안 전개되었다. 마지막으로 효소 반응은 1M HCl 50 μl가 첨가되어 중지되었고, 평판은 참조기준 파장 690 nm가 적용되며 450 nm에서 판독되었다.
경쟁 ELISA의 결과는 표 13에 보였다. PRO1783에 의해 인간 MSLN/MUC16 상호작용을 차단하기 위한 IC50은 농도 0.5 nM일 때 확인되었는데, 이 IC50은 상대적 IC50값에 의해 보인 바와 같은 참조기준 항체 아마툭시맙 IC50에 못미치는 값이다. 그러므로 PRO1783은 인간 MSLN/MUC16 상호작용을 중화하기 위한 역가가 참조기준 항체 아마툭시맙보다 더 떨어졌다. PRO1922 및 PRO1925는 PRO1783의 IC50값보다 유의미하게 더 낮은 IC50값으로 인간 MSLN/MUC16 상호작용을 차단할 수 있었다. 경쟁 ELISA에 있어 PRO1783, PRO1922, PRO1925 및 아마툭시맙의 농도-반응 곡선은 도 3에 보였다.
참조기준 항MSLN 분자 PRO1795의 제조 및 약동학적 특성규명:
MSLN에 대한 결합 친화성이 큰 항MSLN 결합 도메인 PRO1795가 참조기준 결합 도메인으로서 사용되었다.
인간화 참조기준 항MSLN 결합 도메인 PRO1795의 동정, 선택, 인간화 및 제조는, 본 발명의 항MSLN 결합 도메인 및 본원에 기재된 항CD3 분자의 동정, 선택, 인간화 및 제조와 유사하게 수행되었다.
또한, PRO1795는 자체의 1차 약동학적 특성, 예컨대 재조합 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN과의 결합 역학 및 친화성 확정(SPR), 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MSLN 발현 세포주와 원형질막상 결합 평가(cELISA), 그리고 MSLN/MUC16의 차단 평가(cELISA) 결과들에 대해 평가되었다. 결과는 표 9 ~ 13에 요약되어 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
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항MSLN 토끼 IgG 클론 54-01-G02(저친화성 항MSLN scFv 도메인 PRO1783의 선조 클론)의 에피토프 맵핑:
인간/마우스 MSLN 변이체와의 결합(cELISA에 의한 분석)
선택된 항MSLN 토끼 IgG의 결합 영역을 정밀하게 규정하기 위해, MSLN의 세포외 도메인(ECD)의 (V5 태깅된) 인간/마우스 변이체 7개로 일시 형질감염된 HEK293T 세포와의 결합 수준이 cELISA에 의해 평가되었다(도 4). 평판은, 편평 바닥 폴리-D 리신 처리 96웰 평판 웰당 25,000개의 세포로 코팅되었다. 다음날, 세포는 대응 구조체로 형질감염되었고, 37℃, 5 % CO2에서 항온처리되었다. 24시간 후, 세포는 세척 완충제(PBS, 0.2 % BSA) 450 μl로 세척되었고, 시료는 가만히 진탕되며 실온(RT)에서 1.5시간 동안 첨가되었다(250　ng/ml rIgG 또는 항V5 태그 항체 일련의 희석액). 세척 완충제 450 μl로 3회 세척을 수행한 후, HRP 커플링된 염소 및 토끼 IgG 항체 50 μl가 각각의 웰에 첨가되었다. 축회전 믹서상 RT에서 1시간 동안 항온처리된 후, 평판은 웰당 세척 완충제 450 μl로 3회 세척되었고, 이후에는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00) 50 μl가 첨가되었다. 10분 동안 전개가 이루어진 후, 웰당 1 M HCl 50 μl가 첨가되어 효소 반응은 중지되었고, 평판은 참조기준 파장 690 nm가 적용되며 450 nm에서 판독되었다. 항V5 항체의 결합을 기준으로 한 결합 수준이 산정되었다. 참조기준 항체(항V5 태그)와 비교되었을 때 rIgG의 특이적 변이체에 대한 결합 수준의 명백한 감소는, 각각의 마우스 서열에 의해 치환된 인간 MSLN의 분절내에 rIgG 에피토프가 국소화되었음을 나타낼 것이다.
항MSLN 토끼 IgG 클론 54-01-G02(저친화성 항MSLN scFv 도메인 PRO1783의 선조 클론)가 cELISA에서 시험될 때, 키메라 인간/마우스 변이체 V1(인간 MSLN중 ECD의 가장 원거리 영역)과의 결합 감소(V5 참조기준 항체의 결합에 비하여 65% 감소, 표 14)가 관찰되었던 반면, 54-01-G02와 기타 변이체 모두의 결합은 90%를 초과하였다. 이러한 데이터는, 인간 MSLN의 V1 영역이 54-01-G02 결합에 중요한 영역을 나타냄을 암시한다. 그러나 V1 영역이 부재할 때조차도 54-01-G02는 여전히 인간 MSLN과 실질적으로 결합할 수 있으므로, 인간 MSLN중 ECD의 기타 영역들도 또한 54-01-G02 결합에 연루되어 있다(표 14). 토끼 IgG 5422-H03(고친화성 항MSLN scFv 도메인 PRO1795의 선조 클론)에 관하여, 인간 MSLN중 ECD의 키메라 인간/마우스 변이체가 사용되는 cELISA에서 결합 영역은 동정될 수 없었다(데이터는 보이지 않음).
Figure pct00025
실시예 2: 항CD3 분자의 제조 및 시험
인간화 항CD3 결합 도메인 28-21-D09 sc04의 동정, 선택, 인간화뿐 아니라 제조 및 특성규명은 본원에 참조문헌으로 포함된 특허출원 PCT/EP2018/064630에 기재된 바와 같이 수행되었다.
실시예 3: 항hSA 분자의 제조 및 시험:
인간화 항hSA 결합 도메인 19-01-H04-sc03 및 23-13-A01-sc03의 동정, 선택, 인간화뿐 아니라 제조 및 특성규명은, 본원에 참고문헌으로서 포함된 특허출원 EP19206959.9에 기재된 바와 같이 수행되었다. 인간화 항hSA 결합 도메인 19-04-A10-sc02(PRO2155)의 동정, 선택, 인간화뿐 아니라 제조 및 특성규명은 특허출원 EP19206959.9에 기재된 절차와 유사하게 수행되었다. 항 hSA scFv PRO2155의 특성규명은 이하에 간단히 요약되어 있다.
항 hSA scFv 19-04-A10-sc02(PRO2155)의 특성규명
결합 친화성 및 종간 교차반응성
선택된 도메인 19-04-A10-sc02과 인간 혈청 알부민(hSA, Sigma-Aldrich A3782)의 결합 역학(친화성 포함)은 pH 7.4 및 pH 5.5에서 T200 디바이스(Biacore, Cytiva)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. hSA 분자는 카복시메틸화 덱스트란 표면(CM5 센서칩, Biacore, Cytiva)에 공유 부동화되었으며, scFv 분자 각각의 일련의 적정물이 피분석물로서 주입되었다. 매 피분석물 주입 사이클 이후 센서칩상 모든 유동 채널은 재생되었고(글리신 pH 2.0), 새로운 농도의 scFv 분자가 주입되었다. hSA의 결합 역학은 다중 사이클 역학 검정이 사용되어 측정되었는데, 이때 유관 전개 완충제(PBS 0.05 % Tween-20, 또는 PBS 0.05 % Tween-20, pH 5.5) 중 (1:2) 희석된 0.044 nM ~ 45　nM 사이 7가지 농도가 적용되었다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka)와, 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 사용되어 Biacore 분석 소프트웨어(Biacore Evaluation software Version 3.2, Cytiva)로 산정되었고, 피트의 품질은 상대적 Chi2를 기반으로 모니터링되었다. 결합 수준은 이론상 Rmax에 대해 정규화가 달성된 최대 안정성 결합으로서 산정되었다.
선택된 scFv의 결합 역학도 또한 hSA 대신 cSA 또는 mSA가 사용되었다는 점을 제외하고 전술된 바와 같이 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민(cSA, Molecular Innovations CYSA) 및 마우스 혈청 알부민(mSA, Sigma-Aldrich A3559)에 대해 확정되었다. pH 5.5 및 pH 7.4에서 hSA, mSA 및 cSA에 대한 결합 역학은 표 15에 요약되어 있다.
Figure pct00026
생물물리학적 특성규명
HSA-도메인 19-04-A10-sc02(PRO2155) 및 19-04-A10-sc06(sc02 도메인, VL-VH 이황화결합, VL-T141C/VH-G51C, AHo 번호매김; PRO2317)을 대상으로 4주간의 안정성 연구가 수행되었는데, 이때 scFv는 수성 완충제(50 mM NaCiP, 150 mM NaCl, pH 6.4)중에 10 mg/ml으로 제제화되었으며, 4주 동안 -80℃, 4℃ 및 40℃의 온도에 보관되었다. 제제중 단량체 및 올리고머 분율은 연구 과정에 걸쳐 상이한 시점의 SE-HPLC 피크 면적을 적분하여 평가되었다. 표 16은, d0에서의 단량체 함량(%) 및 단량체 소실율(%)에 상대적인 단량체 함량(%) 및 단량체 소실율(%)을 요약하였다. 단백질 농도 변화는 연구 과정에 걸쳐 280 nm에서의 UV-Vis 측정에 의해 모니터링되었다. D0에서의 단백질 함량에 상대적인 단백질 함량 감소 결과로서 눈에 띄는 결과는 관찰되지 않았으므로, 데이터는 보이지 않았다. 열 안정성은 언폴딩(unfolding) 개시 시점(T개시) 및 언폴딩 중간점(Tm)을 확정하는 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. DSF 결과는 표 16에 보였다.
Figure pct00027
실시예 4: 본 발명의 다중 특이적 구조체(biMSLN 저친화성 x CD3 x hSA 구조체)의 제조 및 약동학적 특성규명:
분자 아키텍처
MATCH는 매칭되는 도메인 쌍들만의 특이적 쌍형성을 허용하는 상이한 링커에 의해 연결된, 가변 도메인들만으로 이루어진 것으로서, Numab에 의해 발명된 포맷이다(Egan TJ et al., "Novel multi-specific heterodimeric antibody format allowing modular assembly of variable domain fragments." MABS 9(2017) 68-84). 이 포맷은 최적의 협동성(cooperativity)을 도모하기 위한 항원 결합 도메인의 상이한 조합을 편리하게 스크리닝하는데 특히 매우 적합하다. MATCH는 포유동물 세포로부터 재조합에 의해 발현될 수 있다. 정제를 위해 종래의 친화성 크로마토그래피 단계가 사용될 수 있었다.
MATCH 분자의 아키텍처는 도 5에 도시되어 있다. MATCH4 포맷은 각각이, 탠덤 배치된 VL 도메인 2개 또는 VH 도메인 2개를 보유함으로 말미암아, 단백질 사슬 2개의 이종이량체화가 구동되도록 만드는, 이량체 서브유닛이 분할 가변 도메인쌍 2개의 코어로 이루어질 것을 필요로 한다. 각각의 MATCH4 사슬상 이량체 형성 탠덤 가변 도메인은 자체의 대응관계 사슬로서 역평행 N 말단-C 말단 방향으로 조직된다. 두 사슬은 포유동물 세포에서 완전 기능성인 4중 특이적 분자로 공동발현된다. 가변 도메인들간 전통적인 Gly-Ser 링커는 도 5에 도시된 바와 같이 이 가변 도메인들을 연결하는데 사용되었다. 통상적으로 상이한 링커 길이가 MATCH 분자에 이용되었다(표 5의 MATCH 분자 서열목록 참조). 또한, 역평행 MATCH4 포맷은 도 5에 도시된 바와 같이 코어 도메인들중 1개에 이황화 결합이 도입되는데 순응적이었다. 대응하는 MATCH3 포맷(보이지 않음)은, MATCH4의 경우에서와 같이 scFv 결합 도메인 2개 대신에 오로지 1개의 scFv 결합 도메인이 분할 가변 도메인 쌍 2개의 코어에 부착된다는 점을 제외하고는 유사하게 구축 및 조직되었다.
MATCH4 포맷 및 MATCH3 포맷과 유사하게 scMATCH3 포맷은 오로지 도 5(우측)에 도시된 바와 같이 상이한 링커로 연결된 가변 도메인들만으로 이루어져 있다. 그러나, 이러한 포맷에서 완전히 기능성인 3중 특이적 분자로 조립되는 분할 가변 도메인은 도 5(우측)에 보인 바와 같이 단일 펩티드 사슬(sc)상에 위치한다. MATCH4 포맷 및 MATCH3 포맷뿐 아니라, scMATCH3 분자는 포유동물 세포에서 재조합에 의해 발현될 수 있으므로, 이의 정제를 도모하기 위해 종래의 친화성 크로마토그래피 단계가 사용될 수 있다.
λ-캡핑된 Fv 스캐폴드로 인간화된 2개 ~ 3개의 토끼 항체, 본 발명에 의한 역평행 4중 특이적 MATCH4 분자뿐 아니라, 단지 1개의 고친화성 MSLN-BD를 가지는 참조기준 3중 특이적 scMATCH3 분자의 조합은 표 17에 요약된 바와 같이 디자인되었다.
제작
MATCH 구조체의 발현은 CHOgro 일시적 형질감염 키트(Mirus)가 사용되어 CHO-S 세포에서 수행되었다. 배양액은 37℃에서 5일 ~ 7일간 발현이 이루어진 후(세포 생존률 < 70%) 원심분리에 의해 수집되었고, 단백질은 투명한 배양 상청액으로부터 단백질 L 또는 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 이후에는 필요에 따라 300　mM 수크로스와 50　mM 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.5)중 Superdex S200 컬럼이 사용되는 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 폴리싱 단계가 진행되었다. SEC 분획의 단량체 함량은 SE-HPLC 분석에 의해 평가되었으며, 단량체 함량이 95%를 초과하는 분획들은 풀링(pooling)되었다. 제작된 재료의 품질 제어를 위해 표준적 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, UV280 및 SDS-PAGE가 사용되었다.
제조된 분자의 제작에 관한 세부사항은 표 18에 요약되어 있다.
다중 특이적 항체의 약동학적 특성규명
이하 섹션에는 인간 MSLN에 대해 1가 또는 2가인 예시적 다중 특이적 분자, 인간 CD3ε에 대해 1가인 예시적 다중 특이적 분자, 그리고 인간 혈청 알부민(hSA)에 대해 1가인 예시적 다중 특이적 분자의 특성규명이 기재되어 있다. 2가 항MSLN 항체 PRO2000, PRO2100, PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660(즉 biMSLNxCD3xhSA)와, 1가 항MSLN 항체 PRO1872(즉 MSLN저 KDxCD3xhSA)는 재조합 인간 MSLN 및 인간 CD3ε과 이 항체들의 결합 역학 및 친화성을 평가하기 위해 SPR에서 시험되었다.
SPR에 있어 인간 MSLN에 대한 친화성
다중 특이적 항MSLN 항체의 재조합 인간 MSLN에 대한 친화성은 T200 디바이스(Biacore, GE Healthcare)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 이 실험에서 재조합 인간 MSLN(Peprotech로부터 구매)은 전술된 바와 같이 CM5 센서 칩상에 부동화되었다. 다중 특이적 항체는 플로우 셀에 주입되었으며, 결합 역학뿐 아니라 평형 해리 상수(KD)는 전술된 바와 같이 산정되었다.
결합활성 부재하 다중 특이적 항MSLN 항체의 재조합 인간 MSLN에 대한 친화성은 T200 디바이스(Biacore, GE Healthcare)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 이 실험에서 당사 소유인 항 틀 토끼 IgG(PRO2679)는 전술된 바와 같이 CM5 센서 칩상에 부동화되었다. 다중 특이적 항체는 20초간의 주입에 의해 각각의 플로우 셀에 포획되었다. 그 다음, 재조합 인간 MSLN(Peprotech로부터 구매)은 플로우 셀에 주입되었으며, 결합 역학뿐 아니라 평형 해리 상수(KD)는 전술된 바와 같이 산정되었다.
표 19에 보인 바와 같이, 1가 항MSLN 항체 PRO1872는 SPR에서 재조합 인간 MSLN과 나노몰 이하 범위의 결합 친화성으로 결합하였다(KD = 0.187 nM). 인간 MSLN에 대한 결합 친화성과 유사한 결합 친화성이 대응 항 MSLN scFv 항체 PRO1795에 대하여 확인되었다(KD = 0.321 nM, 도메인 54-22-H03-sc01, 데이터는 보이지 않음). 2가 항MSLN 항체 PRO2000은 낮은 나노몰 범위의 재조합 인간 MSLN에 대한 결합 친화성을 보였는데(KD = 1.06 nM), 이 결합 친화성은 대응 재조합 인간 MSLN에 대한 항MSLN scFv 항체 PRO1783의 결합 친화성보다 월등하다(KD = 2.91 nM, 도메인 54-01-G02-sc01, 표 9). 이 검정에서 PRO2562, PRO2566 및 PRO2567은 인간 MSLN에 대하여 낮은 nM 범위의 KD값(1.39 nM ~ 1.52 nM)으로 매우 유사한 친화성을 보였다.
SPR에서 인간 CD3ε에 대한 친화성
다중 특이적 항MSLN 항체의 재조합 인간 CD3ε에 대한 친화성은 T200 디바이스(Biacore, GE Healthcare)상 SPR 분석에 의해 확정되었다. 이 실험에서 재조합 인간 CD3ε(Sino Biological)은 아민 커플링에 의해 CM5 센서 칩(GE healthcare)상에 부동화되었다. 항MSLN 다중 특이적 항체의 HBS-T+ 완충제(10mM HEPES, 150 mM NaCl 및 0.05 % Tween 20, pH 7.4)중 일련의 희석액은 플로우 셀에 유속 30 μl/분으로 5분 동안 주입되었다. CM5 칩상 CD3ε으로부터의 항체의 해리는 12분 동안 진행되도록 허용되었다. 매 주입 사이클 이후 표면은 10 mM 글리신 HCl(pH 2) 1회 주입으로 재생되었다. 겉보기 해리 속도(kd) 상수 및 결합 속도(ka) 상수와, 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 1:1 랑뮈르 결합 모델이 사용되는 Biacore 분석 소프트웨어(BIAevaluation, GE Healthcare)로 산정되었고, 피트의 품질은 Chi2 및 U-값을 기반으로 모니터링되었는데, 품질은 곡선 피팅의 품질에 대한 척도이다. 1:1 랑뮈르 결합 모델이 사용되는 피팅은 곡선 피팅의 차선 품질을 보였으므로, KD는 2상태 반응 모델이 사용되어 추가로 산정되었다. 이 모델은, 부동화된 리간드와 피분석물의 1:1 결합과, 그 후 복합체를 안정화하는 입체 변화가 일어남을 설명해준다.
표 20에 보인 바와 같이, 항MSLN 항체 PRO1872 및 PRO2000(이 항체 둘 다는 CD3ε에 대해 1가이고, 동일한 항CD3 도메인(28-21-D09-sc04)을 보유함)은 SPR에서 재조합 인간 CD3ε과 나노몰 범위로 유사한 결합 친화성으로 결합하였다(PRO1872, KD = 12.1 nM; PRO2000, KD = 20.0 nM). PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660은 재조합 인간 CD3ε에 대해 약간 더 우수한 친화성을 보였다(KD값 = 2.97 nM ~ 6.45 nM의 낮은 nM 범위).
SPR(pH 5.5)에 있어 인간 혈청 알부민에 대한 친화성
인간 혈청 알부민(hSA, Sigma Aldrich, cat. A3782)에 대한 결합 역학은 T200 디바이스(Biacore, GE Healthcare)상 SPR에 의해 평가되었다. HAS는 센서 칩(CM5 센서 칩, GE healthcare)상에 아민 커플링에 의해 부동화되었다. 항MSLN 다중 특이적 항체의 일련의 희석액(전개 완충제(PBS-Tween20)중 0.7 nM ~ 180 nM 범위로 희석)(pH 5.5)이 플로우 셀에 5분 동안 주입되었다. 해리 시간은 12분으로 설정되었다. 겉보기 해리 속도(kd) 상수 및 결합 속도(ka) 상수와, 겉보기 해리 평형 상수(KD)는 전술된 바와 같이 1:1 랑뮈르 결합 모델이 사용되어 산정되었다.
표 21에 보인 바와 같이, 항MSLN 항체 PRO1872(항hSA 도메인: 23-13-A01-sc02)는 SPR에서 재조합 hSA와 나노몰 이하 범위의 결합 친화성으로 결합하였다(KD = 0.175 nM). PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660은 재조합 hSA에 대해 약간 더 낮은 친화성을 보였다(KD값 = 5.71 nM ~ 8.80 nM의 낮은 nM 범위).
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
예시적 MATCH4 분자의 생물물리학적 특성규명
nDSF에 의한 보관 안정성 및 용융 온도 분석
MATCH4 분자를 대상으로 28일간의 안정성 연구가 수행되었는데, 이 때 이 분자는 수성 완충제(50　mM 인산염-시트르산염 완충제 및 300　mM 수크로스, pH　6.5)중에 1　mg/mL로 제제화되었으며, 28일 동안 -80℃ 미만, 4℃ 및 40℃에 보관되었다. 제제중 단량체 및 올리고머 분율은 연구 과정에 걸쳐 상이한 시점에서의 SE-HPLC 피크 면적들을 적분함으로써 평가되었다. 표 22는 당일 단량체 함량(%) 및 단량체 소실율(%)에 상대적인 단량체 함량(%) 및 단량체 소실율(%)을 요약한 것이다. 단백질 농도 변화는 연구 과정에 걸쳐 280　nm에서의 UV-Vis 측정을 통해 모니터링되었으며, 그 결과는 표 23에 보였다. 열 안정성은 언폴딩 개시 온도(T개시), 언폴딩의 중간지점 온도(Tm) 및 산란 개시 온도를 확정하는 nDSF(NanoTemper)에 의해 분석되었다. 2회/3회 반복 측정에 대한 표준 편차(SD)를 포함한 Tm 결과는 표 24에 보였다.
28일간의 항온처리후 MATCH4 분자 4개 모두는 우수한 안정성 프로필을 보였고, 단지 최소의 단량체 함량 감소 또는 단백질 함량 감소를 보였다. 온도 -80℃ 및 4℃에서뿐 아니라, 동결-해동 반복(5회)시에는, SE-HPLC/UV 측정 전 28일차/-80℃ 시료로 수행되었을 때와 같이, 단량체 함량에 눈에 띄는 변화는 없었다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
실시예 5: 표적 세포주의 세포 표면상 메소텔린 밀도의 확정:
도입
한 가지 목적은 메소텔린 결합에 대해 1가 또는 2가인 다중 특이적 분자가, 세포 표면에 메소텔린을 상이한 수준으로 보이는 세포주를 표적화하는 능력을 비교하기 위한 것이다. 그러므로 원형질막상 메소텔린 발현은 상이한 세포주를 대상으로 정량되었다.
방법
메소텔린을 다양한 수준으로 발현하는 암 세포주 및 건강한 중피조직에서의 항체 결합능(ABC)은 Quantum Simply Cellular 항인간 IgG 키트(Bangs Laboratories)가 사용되어 FC(유세포측정법)에 의해 평가되었다. 요약하면, 항메소텔린 항체(7D9.3, Genentech) 1 mg이, 제작자의 지침에 따라 Lightning-Link Rapid 접합 키트(Expedeon)가 사용되어 Alexa Fluor 488과 접합되었다. 수용체 밀도값은 항체 결합능(ABC)으로서 보고되었다. ABC값은 Quantum Simply Cellular 비드 항인간 IgG(Bangs Laboratories, Inc.)가 사용되어 작성된 표준 곡선으로부터 유래되었다. 이 비드는 각각 비드당 변별적 수만큼의 항인간 IgG 분자와 접합된 미소구 모집단 4개로 이루어져 있다. 제1 단계로서, Alexa Fluor 488 표지화 항메소텔린 항체는 그 농도를 증가시키면서, 결합 부위가 가장 많이 존재하는 비드 모집단에 대해 시험되었으며, 그 결과 포화 항체 농도가 확정되었는데, 이는 제조자의 프로토콜에 의해 기재된 바와 같이 정량중에 사용되었다. 그 다음, 비드와 시험 시료는 제조자의 지침에 따라 대응 포화 농도만큼의 Alexa Fluor 488 표지화 항메소텔린 항체로 염색되었으며, 같은 날 시험 시료의 광전자증배관 튜브 환경과 동일한 환경에서 전개되었다. ABC값을 산정하기 위해 Quantum Simply Cellular 비드 모집단 4개에 대한 기하학적 평균들은 NovoExpress 소프트웨어(ACEA Biosciences)가 사용되어 분석되었다. QuickCal v. 2.3 Excel 스프레드시트 기반 분석 템플릿(Bangs Laboratories, Inc)은 선형회귀에 의해 표준 곡선을 작성하는데 사용되었다. R 제곱값은 통상 0.99 이상이었다. Alexa Fluor 488-항메소텔린 항체 표지화 시료에 대한 ABC값은 표준 곡선으로부터 내삽되었다.
결과
암 세포주 3개(H226, H292 및 HPAC) 및 건강한 중피조직 유래 세포주(MeT-5A;(ATCC® CRL-9444TM); 공급처 ATCC) 1개의 원형질막상 메소텔린 밀도는 Quantum Simply Cellular 비드가 사용되어 확정되었다. 수득된 데이터는 표 25에 제시되어 있다. H226 세포는 최고의 발현 수준을 보여주었는데, 이는 4배 더 낮은 발현율을 보이는 HPAC 세포주에서보다 더 높은 수준이다. H292 세포주 및 MeT-5A 세포주에서는 거의 동일한(H226 세포의 세포 표면에서 관찰되는 발현 수준보다 8배 ~ 10배 더 낮은) 메소텔린 발현 수준이 확인되었다.
Figure pct00037
실시예 6: 세포독성 검정(T 세포 구동 표적 세포 고갈):
도입
biMSLN고 KDxCD3xhSA가 MSLN저 KDxCD3xhSA에 비해 T 세포를 선택적으로 유도하여 메소텔린 발현 세포를 사멸하는 능력을 평가하기 위해, 인간 PBMC 존재하에 자체의 세포 표면에 메소텔린을 상이한 밀도로 발현하는 세포주를 사용하여 세포독성 검정이 수행되었다. 뿐 아니라, 가용성 메소텔린(sMSLN)의 존재가 분자 역가에 미치는 영향력도 또한 이 검정에서 평가되었다. 암세포상 메소텔린 및 CD3ε과 MSLN저　KDxCD3xhSA 3중 특이적 분자의 동시 결합은, T 세포상 CD3ε의 가교를 유도하였고, 이에 따라 T 세포 활성화(CD69 상향조절, 사이토카인 분비) 및 세포독성 과립의 방출을 촉발하여, 궁극적으로 표적 세포 사멸을 초래하는 신호전달 케스케이드를 활성화하였다.
방법
혈구 분획화
제조자의 지침에 따라 림프구 분리 매질 림포프렙(Lymphoprep; Stemcell technologies)이 사용되어 건강한 지원자의 신선한 혈액으로부터 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)가 단리되었다. 이 실험 세트에서 상이한 공여개체들 3개(공여개체 #1, 공여개체 #2 및 공여개체 #3)로부터 유래한 혈액이 사용되었다. 개별 공여개체 혈액의 특성은, 구체적으로 혈액에 포함된 CD8+ T 세포의 양과 반응성면에서 상당한 차이가 있었다. 결과적으로, 이 혈액 유래 CD8+ T 세포 시료들간 사멸 역가는 다양한 범위에서 가변적이었다. 이는 동일한 표적 세포의 존재하에 본원에 개시된 예들에서 동일한 시험 분자로써 관찰되는 바와 상이한 사멸 역가 및 CD8+ T 세포 활성화 역가를 초래하였다.
요약하면, 혈액은 인간 PBMC 단리 완충제(PBS, 2 % FCS, 2　mM EDTA)로 1:2 희석되었으며, 권장량만큼의 Lymphoprep 매질이 담긴 Leucosep 튜브에 적용되었다. LeucoSep 튜브는 30분 동안 RT 및 800　x g에서 쉬지않고 원심분리되었다. 그 다음, PBMC를 함유하는 세포층이 수집되었고, 인간 PBMC 단리 완충제로 2회 세척되었으며, 적혈구는 5분 동안 RT에서 적혈구 용해 완충제가 사용되어 용해되었다. 그 다음, 단리된 인간 세포는 자체의 각각의 단리 완충제로 1회, 검정 매질(RPMI-1640, 10 % FCS)로 1회 세척되었다. 혈소판 제거후 단리된 PBMC는 검정 매질중에 1 ml당 3x106개 생세포의 밀도로 재현탁되었다.
유세포분석법 기반 시험관내 세포독성 검정(FC 검정) 및 CD8+ T 세포 활성화:
암 세포주 3개, 즉 H226 세포(메소텔린 고밀도), HPAC 세포(메소텔린 중밀도) 및 H292 세포(메소텔린 저밀도)뿐 아니라, 건강한 중피조직 유래 MeT-5A 세포주(메소텔린 저밀도)가 표적 세포로 사용되었다. 앞서 PKH67로 표지화되었고, 검정 매질(RPMI-1640, 10 % FCS) 75　μl로 희석된 5,000개의 표적 생세포가 96웰 평판에 첨가되었다. 적용 가능하면, 50 ng/ml, 100 ng/ml 또는 500 ng/ml 가용성 메소텔린을 함유하는 검정 완충제가 사용되었다. 6배 농축된 시험 단백질 25　μl는 검정 매질로 희석되어 적당한 웰들에 첨가되었다. 검정 매질 50　μl에 희석된 150,000개 효과기 생세포(PBMC)는 각각의 웰에 첨가되었으며(E:T 비 30:1), 평판은 RT 및 축회전 믹서상에서 혼합된 후, 37℃ 및 5 % CO2에서 항온처리되었다. 40시간 후 세포는 트립신 처리되어, 염색 완충제(PBS, 2 % BCS, 2　mM EDTA)중에 재현탁되었으며, 미결합 평판에 옮겨졌다.
세포는 상이한 마커, 예컨대 CD69, CD8, CD4, CD11c 및 Annexin-V에 대해 염색되었다. 분석을 위해 초점은 세포자살 및 사멸 표적 세포와 활성화된 CD8+ T 세포에 맞추어졌다. 표적 세포는 녹색 형광(PKH67)에 의해 동정되었고, 이 세포의 생존률은 Annexin-V APC에 의해 분석되었다. 효과기 세포(CD8+ 세포)는 자체의 표면상 CD8을 검출함으로써 동정되었다(항CD8 PerCP-Cy5.5). 마지막으로, CD8+ T 세포의 활성화는 CD69 발현(항CD69 PE)을 정량함으로써 검출되었다. CD4는 CD8+ 및 CD4+ T 세포들간 구별을 위해 사용되었다. CD11c는 단핵구 및 수지상세포를 염색하고, 표적 세포의 게이팅(gating)을 개선하기 위해 사용되었다. Annexin-V를 제외한 모든 마커에 대해, 세포는 가만히 진탕되며 RT에서 30분 동안 항온처리되었다. 세포는 염색 완충제로 1회, 그리고 Annexin 결합 완충제로 1회 세척되었으며, 진탕되며 RT에서 30분 동안 Annexin-V 염색이 수행되었다. 세포는 Annexin-V 결합 완충제로 1회 세척되었고, 유세포분석법은 Novocyte 유세포분석기상에서 수행되었다.
특이적 표적 세포 용해%는 이하 등식에 따라 산정되었다:
Figure pct00038
활성화된 CD8+ T 세포의 %는 CD69+ CD8+ T 세포의 비율에 대응한다.
LDH 방출 기반 세포독성
시토졸로부터의 LDH(젖산염 탈수소효소) 방출은 세포 사멸의 지표이다. 비색 LDH 방출 검정(Roche)은 관심 선도 분자에 의해 매개되는 세포독성을 관찰하도록 설정되었다. 암 세포주 2개, 즉 H226 세포(메소텔린 고밀도) 및 OVCAR-3 세포(메소텔린 중밀도)뿐 아니라, 건강한 중피 조직 유래 MeT-5A 세포주(메소텔린 저밀도)가 표적 세포로 사용되었다. 10,000개의 표적 생세포는 96웰 평판에 첨가되어 밤새도록 부착되도록 만들었다. 그 다음날, 300,000개의 효과기 생세포(PBMC)가 hSA 함유 완충제중 각각의 웰에 첨가되었다(E:T 비 = 30:1). 도면에 명시된 각각의 분자는 50 nM를 시작으로 5배 희석 단계로 첨가되었다. 적용 가능한 경우, 최종 농도 0 ng/mL, 50 ng/mL 및 500 ng/mL의 sMSLN들이 웰에 첨가되었다. 40시간 후, LDH 방출 분석을 위해 상청액이 제거되었으며, 세포는 활성화 마커를 비롯한 T 세포 마커에 대해 염색되었다.
특이적 용해%는 이하와 같이 산정되었다:
1. 모든 OD값으로부터 매질 백그라운드의 평균 OD값을 공제함.
2. 세포 독성%를 ((시료 - 자발적 사멸) / (최대 사멸 - 자발적 사멸)) * 100으로 산정함.
주의: 자발적 사멸: 효과기 + 처리되지 않은(미처리) 표적 세포의 평균 OD값;
주의: 최대 사멸: 1% Triton으로 40시간 동안 처리된 표적 세포의 평균 OD값.
결과
MATCH 분자 PRO2000(MATCH-4: biMSLN고KD x CD3xhSA) 및 PRO1872(scMATCH-3: MSLN저KDxCD3xhSA)의 CD8+ T 세포 활성화에 대한 새포독성 잠재성 및 효과는 유세포분석법 기반 세포독성 검정이 사용되어 평가되었다. 메소텔린 고발현 세포주 H226과, 건강한 조직 유래 메소텔린 저발현 MeT-5A 세포가 사용되었을 때 수득된 데이터는 표 26 및 27에 제시되었으며, MATCH 분자들에 대한 농도-반응 곡선은 도 6에 제시되어 있다. 두 분자는 메소텔린 고발현 H226 세포에 매우 강력하였다. 메소텔린 표적화 2가 PRO2000은 메소텔린 표적화 1가 PRO1872보다 75배 더 강력하였다. 역으로 말하면, 메소텔린을 낮은 수준으로 발현하는 MeT-5A 세포에 대해, 메소텔린 결합 1가 분자 PRO1872는 PRO2000에 비해 16배 더 큰, 표적 세포를 사멸하는 역가를 보였다. 고발현 세포에 대해, PRO2000의 사멸 역가(EC50)는 0.07 pM였고, PRO1872의 사멸 역가(EC50)는 5.31 pM였던 반면, MeT-5A 세포에 대해, PRO2000의 EC50은 144.70 pM였고, PRO1872의 EC50은 8.88 pM이었다. 각각의 조건하에 CD8+ T 세포 활성화에 대해서도 유사한 데이터가 관찰되었다.
더욱이, 메소텔린을 중간수준 및 저수준으로 발현하는 기타 표적 암 세포주 2개, 즉 HPAC 및 H292 세포 각각에 대해 PRO2000 및 PRO1872의 CD8+ T 세포 활성화에 대한 세포독성 활성 및 효과가 시험되었다(표 27 및 도 7). 앞서 관찰된 바와 같이, 메소텔린을 적게 발현하는 세포에 대해 PRO1872는 메소텔린 표적화 2가 분자인 PRO2000보다 더욱 강력하였다. 대조적으로, PRO2000 및 PRO1872는 중간 정도의 메소텔린 밀도를 보이는 HPAC 세포에 대해 유사한 역가를 보였다. HPAC에 대해 PRO2000의 사멸 역가는 40.75 pM이었고, PRO1872의 사멸 역가는 30.26 pM이었던 반면, 메소텔린 저발현 H292 세포에 대해 PRO2000는 652.2 pM의 EC50을, 그리고 PRO1872는 91.03 pM의 EC50을 보였다. 각각의 조건하에서 CD8+ T 세포 활성화에 대해 유사한 데이터가 관찰되었다(단 PRO2000은 HPAC 세포 존재하에 PRO1872보다 4배 더 강력하였음).
몇몇 연구는 암환자에서 수백 ng/ml의 혈청중 가용성 메소텔린 농도를 보고하였다. 그러므로 본 발명자들은 표적 세포를 사멸하는 분자 역가에 대한 가용성 메소텔린 존재의 영향력을 평가하였다.
MATCH 분자들 PRO2000 및 PRO1872의 CD8+ T 세포 활성화에 대한 새포독성 잠재성과 효과는 가용성 메소텔린(sMSLN) 부재하에, 또는 50 ng/ml 또는 500 ng/ml의 가용성 메소텔린(sMSLN) 존재하에 메소텔린 고발현 H226 세포가 사용되어 비교되었다. 수득된 데이터는 표 28 및 29에 제시되었으며, 분자들의 농도-반응 곡선은 도 8에 제시되어 있다. 두 분자의 역가는 용량 의존적 방식으로 가용성 메소텔린에 의해 악영향을 받았다. 메소텔린에 대한 1가 결합 친화성이 PRO1872보다 더 작은 메소텔린 표적화 2가 PRO2000은 500 ng/ml sMSLN이 존재할 때가, sMSLN이 부재할 때 관찰된 사멸 역가에 비하여 17배 감소한 사멸 역가를 보였다. 이와는 대조적으로 메소텔린에 1가이며, 메소텔린에 대하여 더 우수한 1가 친화성을 가지는 분자 PRO1872는 500 ng/ml sMSLN 이 존재할 때가, sMSLN이 부재할 때의 역가에 비하여 106배 더 작은 역가를 보였다. 각각의 조건에서 CD8+ T 세포 활성화에 대해 유사한 데이터가 관찰되었다.
뿐 아니라, PRO2000의 변이체인 PRO2100은, 이 두 분자가 표적 세포를 사멸하기 위한 역가가 동등함을 입증하기 위해 특성규명되었다. PRO2100에 있어서 잠재적 글리코실화 부위는 글리코실화가 방지되도록 돌연변이되었다.
MATCH4 분자인 PRO2000 및 PRO2100의 새포독성 잠재성은 유세포분석법 기반 세포독성 검정법이 사용되어 메소텔린 고발현 H226 세포 및 메소텔린 저발현 중피세포 MeT-5A의 존재하에서 비교되었다. PRO1872도 또한 포함되었다. 수득된 데이터는 표 30에 제시되어 있으며, 농도-반응 곡선은 도 9에 제시되어 있다. 시험된 분자들중 그 어떤 것도 메소텔린 저발현 MeT-5A 세포의 사멸을 보이지 않았다. H226 표적 세포가 존재할 때 PRO2000 및 PRO2100은 sMSLN의 부재하 또는 존재하에 매우 유사한 사멸 역가를 보였다. sMSLN 부재시 역가는 PRO2000의 경우 0.7 pM이었고, PRO2100의 경우 1.54 pM이었다. 100 ng/ml sMSLN가 존재할 때, 역가는 2 팩터(factor)만큼(PRO2100의 경우 3.56 pM), 그리고 5 팩터만큼(PRO2000의 경우 3.45 pM) 변경되었다. 이와는 대조적으로, sMSLN 부재시 메소텔린에 대한 1가 친화성이 더 우수한 분자인 PRO1872는 PRO2100 및 PRO2000보다 그 역가가 각각 10배 및 20배 더 작았다(EC50 PRO1872 = 13.38 pM). 뿐 아니라, PRO1872는 100 ng/ml sMSLN이 존재할 때 그 역가가 10배 더 작았다.
상기 수득된 데이터를 기반으로, 추가의 예시적 MATCH 분자 PRO2567, PRO2566, PRO2562 및 PRO2660(MATCH-4: biMSLN고KD x CD3xhSA)의 새포독성 잠재성은 방법 섹션에 개략적으로 기재된 바와 같이 LDH 방출에 의해 평가되었다. PRO2567, PRO2566 및 PRO2562가 관찰되었을 때, 이 분자들은 PRO2660에 비해 MSLN 고발현 H226 세포에 대해 더 큰 역가를 보였고, 이 PRO2660의 용량 반응 곡선과 유사한 용량 반응 곡선을 나타냈다(도 10). 이 분자들의 OVCAR-3 중간 발현 세포에 대한 역가는 약간 감소하였음이 관찰되었으며, MSLN 저발현 표적으로 Met-5A 세포가 사용될 때 이 분자들의 활성은 추가로 감소하였음이 관찰되었다(도 10). 이 데이터는 도 11 요약도에 요약되어 있는데, 이 도면에는 실험에 걸쳐 EC50값이 주어졌는데, 이에는 참조기준 PRO1872와의 비교도 포함되어 있다. 본 발명자들은 표적으로서 H226 세포가 사용될 때, PRO2567, PRO2566, PRO2562 및 PRO2660의 EC50값은 PRO1872의 EC50값보다 더 낮은 것으로 보였음을 관찰하였다(도 11a). 본 발명자들은 OVCAR-3 세포에 대해 PRO2567, PRO2566 및 PRO2562가 유사한 성향을 보였음을 관찰하였다(도 11b). 평균 Met-5A EC50값 및 평균 H226 EC50값 사이 x배의 차이를 산정함으로써 활성 윈도우가 관찰되었을 때, 본 발명자들은 PRO2567, PRO2566 및 PRO2562의 활성 윈도우가 PRO1872의 활성 윈도우보다 유의미하게 더 컸음을 관찰하였다(표 31 참조).
50 ng/mL 및 500 ng/mL sMSLN 존재하에 선도 분자의 역가와 용량 반응 곡선의 변화가 관찰되었다(도 12). 본 발명자들은, sMSLN이 존재할 때 MATCH4 biMSLN고KD x CD3xhSA 분자가 자체의 역가를 유지하는 것을 관찰하였다. 예를 들어 PRO2566 및 PRO2567은 sMSLN이 존재할 때, 심지어 sMSLN이 고농도로 존재할 때조차도 PRO1872에 비하여 자체의 역가를 유지하였다(0 ng/mL ~ 500 ng/mL에서 역가의 x배 변화: 14.2배 및 23.8배 vs. 78.2배; 표 32 참조). 요약도 도 13에 있어서, EC50 절대값 차이가 도시되어 있다. PRO2566 및 PRO2567의 EC50값은 sMSLN 첨가에 의해 비교적 영향을 받지 않았지만, 1가 PRO1872의 EC50값은 sMSLN 첨가시 비교적 영향을 많이 받았다. PRO2660은 sMSLN에 감수성이 더 큰 것으로 보이지만, PRO1872에 비해서는 감수성이 훨씬 작았다. 이러한 데이터는, sMSLN이 존재할 때 MATCH4 biMSLN고KD x CD3xhSA 포맷은 항종양 역가를 충분히 보유하는 능력이 월등하였음을 입증하였다.
실시예 7: 표적 세포와 MATCH 분자의 결합
도입
메소텔린을 상이한 세포 표면 밀도로 발현하는 표적 세포들(H226, HPAC, H292, OVCAR-3 및 MeT-5A)이 사용되어 수득된 세포독성 데이터를 뒷받침하기 위해, 이러한 세포주들중 적어도 2개와 MATCH 분자의 세포 결합은 유세포분석법으로 평가되었다. 두 분자가 유사한 결합 특성을 가짐을 확인하기 위해, 예시적 MATCH4 분자인 PRO2000, PRO2100, PRO2562, PRO2566, PRO2567 및 PRO2660이 시험되었다. 비교를 위해 scMATCH3 PRO1872도 또한 포함되었다.
방법
100 μl PBS로 세포가 2회 세척되었고, 50,000 pM ~ 0.005 pM 범위의 염색 완충제(PBS, 2% BCS 열 불활성화, 2 mM EDTA)중 PRO1872, PRO2000, PRO2100, PRO2562, PRO2566, PRO2567 또는 PRO2660의 일련의 5배 희석액과 함께 항온처리되었다. 세포는 염색 완충제로 2회 세척되었으며, MATCH4 분자의 결합은 단백질 L-PE(2 μg/ml)에 의해 시각화되었다. 평판들은 RT에서 30분 동안 축회전 믹서상에서 항온처리되었고, 염색 완충제로 2회 세척되었으며, 200 g에서 5분 동안 원심분리된 다음, 최종 부피 50 μl의 염색 완충제중에 재현탁되었다. 웰당 20,000회 이벤트에 대한 PE 신호는 Novocyte 유세포분석 디바이스가 사용되는 유세포분석법으로 분석되었으며, 데이터는 NovoExpress 소프트웨어(ACEA Biosciences)가 사용되어 분석되었다. MATCH 분자의 평균형광세기(MFI)값은, 블랭크(항체가 제로 농도인 것)를 공제함으로써 비특이적 결합에 대해 교정되었다. ΔMFI 데이터는 GraphPad Prism 데이터 분석 소프트웨어(GraphPad Software)가 사용되는 4 모수 로지스틱스 곡선과 피팅하여 분석되었으며, 표적 세포 결합의 50%에 도달하는데 필요한 관심 분자의 농도(EC50)가 산정되었다.
결과
PRO2000, PRO2100 및 PRO1872와, 상이한 세포주의 결합은 유세포분석법으로 평가되었다. 최대 결합의 절반에 도달하였을 때의 농도(EC50)가 관찰되었고, 도달한 최대 결합값(MFI)이 표 33에 제시되었고, 대응 적정 곡선은 도 14(A ~ D)에 제시되어 있다. PRO2000 및 PRO2100은 시험 세포주 모두와의 결합 데이터가 거의 동일하였다. PRO2000 및 PRO2100은 PRO1872에 비하여 3배 더 큰 메소텔린 중간수준 발현 암세포 H226와의 결합을 보였으며, 1.5배 ~ 2배 더 우수한 메소텔린 고발현 암세포 HPAC와의 결합을 보였고, 2배 더 작은 메소텔린 저발현 암세포와의 결합을 보였다. 이러한 데이터는 세포독성 검정에서 수득된 데이터와 상관되었다. 각각의 시험 분자에 대해 관찰된 최대 결합은 세포 표면 메소텔린 발현의 관점에서 세포주의 순위를 확인시켜주었다. 더욱이, MATCH4 분자 PRO2567, PRO2566, PRO2562 및 PRO2660(biMSLNxCD3xhSA)과 상이한 세포주의 세포 결합도 또한 전술된 바와 같이 평가되었다. 최대 결합 절반에 도달하였을 때의 농도(EC50)가 관찰되었고, 도달한 최대 결합값(MFI)이 표 34에 제시되어 있으며, 대응 적정 곡선이 도 14(E ~ G)에 제시되었다. 선도 MATCH4 분자 PRO2567, PRO2566 및 PRO2562는 MSLN 고발현 H226 세포에 대한 EC50 결합(PRO2000 및 PRO2100의 경우와 거의 동일함)을 보여주었다(표 33과 표 34 비교). 본 발명자들은 MATCH4 분자 모두(PRO2567, PRO2566, PRO2562 및 PRO2660)가 MSLN을 중간수준으로 발현하는 OVCAR-3 세포와의 결합에 대해 평가될 때, 이 분자들의 EC50 결합이 감소하였음을 추가로 관찰하였다. (수득된 최대 MFI값에 의해 확인되는) 2가 MATCH4 분자의 EC50 결합 감소는, OVCAR-3 세포상 MSLN 발현 수준이 더 낮아, 결합활성 효과가 결합 세기에 기여하는 바가 감소하기 때문이다. 본 발명자들은, MSLN 저발현 Met-5A 세포와 관련한 최대 MFI값이 H226 세포 및 OVCAR-3 세포와 관련한 최대 MFI값과 비교되었을 때 실질적으로 더 작았으며, EC50값은 H226 세포와의 결합에 대해 수득되었던 EC50값보다 대략 5배 더 작았음을 발견하였다. 본 발명자들은 PRO2000 및 PRO2100에 대해서도 또한 유사한 결과를 수득하였다. Met-5A 세포상 MSLN은 막상 마이크로도메인에 국소적으로 집중되어 존재하고, 이로 말미암아 MATCH4 분자들의 조밀할뿐 아니라, 결합활성으로 구동되는 결합이 달성되며, 그 결과 EC50값은 작아지는 한편, 최대 MFI값은 이 세포상 MSLN의 발현이 전체적으로 적게 이루어지므로 작게 유지될 것이라는 추측이 가능하다.
요약하면, 선도 MATCH4 분자들 PRO2567, PRO2566, PRO2562의 EC50 결합은 PRO2000 및 PRO2100에 대해 수득된 세포 결합 데이터와 거의 동일하였다. 아마도 결합활성 소실로 말미암을 것인 MSLN 중간발현 OVCAR-3 세포에 대한 결합 세기의 감소도 또한 세포독성 실험에서 확인되었는데, 여기서 MSLN 고발현 H226 세포의 사멸 역가와 비교되었을 때 감소한, OVCAR-3 세포의 사멸 역가가 MATCH4 분자들에 대해 확인되었다.
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실시예 8: PRO2000(biMSLN 고　KD xCD3xhSA)에 의한 생체내 종양 생장 억제:
도입
PRO2000(biMSLN고　KD x CD3xhSA)이, 대조군 동물에서에 비해 종양 생장을 효과적으로 제어하는 능력을 확정하기 위하여, 2회의 생체내 메소텔린 발현 세포주 이종이식편 실험이 Charles River Laboratories에서 수행되었다. 1회의 실험에서는 H292 이종이식편 모델의 종양 생장 억제를 검사하였고, 또 다른 실험에서는 HPAC 이종이식편 모델의 종양 생장 억제를 검사하였다.
방법
동물
암컷 NCG 마우스(Charles River Laboratories)가 육종된 다음, 인간화 마우스 작업에 적합한 조건하에 수용되었다. 두 연구를 위한 동물로서는 8주령 ~ 12주령의 동물이 사용되었다.
연구 디자인
처리군 동물(H292군당 5마리 ~ 6마리, HPAC군당 10마리) 옆구리에 1 x 107개 H292 NSCLC 종양 세포 및 1 x 107개 PBMC 또는 1 x 107개 HPAC 종양 세포 및 2.5 x 106개 PBMC가 피하 공동이식되었다. 5일 후, 관심 분자가 동물에 정맥내 투약되었으며, 실험 막바지에 이르기까지 5일마다 추가 투약이 실시되었다. 실험 동안 동물은 종양 생장에 대해(종양을 캘리퍼로 측정), 그리고 체중 감소에 대해 일정 간격을 두고 모니터링되었다. 대조군내 종양의 평균 부피가 800 mm3이 되었을 때 또는 40일차에(이 두 시점중 어떤 시점이 먼저 다가오던지 간에) 동물은 안락사되었다. 동물은, Charles River Laboratories 동물 건강 및 복지 규정에 따라 모니터링 및 안락사되었다.
결과
본 발명자들은 "방법"에 기재된 바와 같이, 종양 생장을 억제함에 있어 PRO2000(biMSLN고　KD x CD3xhSA)의 효능을 PBMC/H292 공동이식 모델을 사용하여 평가하였다. H292 세포는 MSLN을 중간정도의 수준으로 발현하였으며, 비소세포폐암종으로부터 확립되었다. 도 15에 보인 바와 같이, PRO2000은 다중 용량 수준으로 정맥내 투여되었다. 비교예로서, 본 발명자들은 팔리비주맙(항 RSV 항체)을 대조군 IgG 처리 수단으로 사용하였고, PBMC 부재하에 생착된 종양 세포(미처리)를 사용하였다. 본 발명자들은 대조군 조건이 종양의 파생(outgrowth)(연한 회색선, 도 15의 A)을 초래하였음을 관찰하였다. PRO2000(biMSLN.CD3) 분자 처리(1 mg/kg 및 5 mg/kg)(도 15의 A에서 검정 선 및 진한회색 선 각각)는 대조군에 비해 종양 생장 억제를 달성하였다. 본 발명자들은 2원 ANOVA를 사용하여 치료의 유의성을 검사하였고, 이후에는 터키 다중 비교 검정을 수행하였는데; 40일차 데이터는 도 15의 B에 보였고, 여기서 각각의 점은 개별 동물을 나타낸다. 더 많은 용량 2가지(1 mg/kg 및 5 mg/kg)가 처리된 동물에서는 팔리비주맙 처리 동물(대조군) 및 미처리 동물에서에 비해 유의미하게 더 작은 종양 부피가 달성되었다. 최소 용량(0.2 mg/kg)은 차선인 것으로 보였는데, 그 이유는 이러한 비교(즉 1 mg/kg, 5 mg/kg 및 0.2 mg/kg가 처리된 동물들간 종양 부피 감소 비교)가 팔리비주맙 처리 동물에서의 종양 부피 감소에 비하여 유의미하지 않았기 때문이다. 동물의 체중이 실험 내내 비교적 안정적이었던 것으로 보아, 전반적인 동물의 건강상태에는 부작용을 나타내지 않았던 것으로 보였다(데이터는 보이지 않음). 종합해보았을 때 이 데이터는, 다중 특이적 항체 PRO2000(biMSLN고　KD x CD3xhSA)이 생체내 종양 생장 억제 활성을 보이고, 암 면역치료법에 있어 전도유망한 개념적 후보임을 나타낸다.
종양 생장 억제를 촉진함에 있어 PRO2000(biMSLN고　KDxCD3xhSA)의 효능은 "방법"에 기재된 바와 같이 PBMC/HPAC 공동이식 모델이 사용되어 추가로 평가되었다. HPAC 종양 세포는 H292에 비해 MSLN을 더 높은 수준으로 발현하였다. 본 발명자들은 H292 모델과 유사하게 대조군 조건의 파생을 관찰하였으며(도 16, 팔리비주맙), 시험 조건에서의 용량 의존적 종양 생장 억제도 관찰하였다. 본 발명자들은 2원 ANOVA를 사용하여 치료의 유의성을 검사하였고, 이후에는 터키 다중 비교 검정을 수행하였다. 본 발명자들은, 최저 용량의 PRO2000(biMSLN고　KDxCD3xhSA)이 최저 용량의 PRO1872(MSLNxCD3xhSA)(즉 MSLN 표적화 1가 분자)보다 다수의 시점에 걸쳐 유의미한 종양 생장 억제를 달성하였음을 관찰하였다. 이 데이터는, MSLN을 높은 수준으로 발현하는 세포에 대한 PRO2000(biMSLN고KD x CD3xhSA)의 결합활성 기반 활성이, 개선된 효능을 달성하였음을 나타낸다.
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antibody-related sequence <400> 134 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly 1 5 10 <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 135 Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 136 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 137 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 138 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu Gly 1 5 10 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 139 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 140 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Cys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 141 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 141 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 142 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Cys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 143 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 143 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 144 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 144 Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 145 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 145 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 146 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 146 Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <220> <221> Repeat <222> (1)..(5) <223> generic linker (GSGGS)n with n being 1 or larger <400> 147 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <220> <221> Repeat <222> (1)..(5) <223> generic linker (GGGGS)n with n being 1 or larger <400> 148 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <220> <221> Repeat <222> (1)..(4) <223> generic linker (GGGS)n with n being 1 or larger <400> 149 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <400> 150 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial antibody-based or antibody-related sequence <220> <221> Repeat <222> (1)..(5) <223> generic linker (GGGGS)n with n being selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 <400> 151 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (15)

  1. a) 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(MSLN-BD) 2개; 및
    b) CD3과 특이적으로 결합하는 항체 기반 결합 도메인(CD3-BD) 적어도 1개
    를 포함하는 다중 특이적 항체로서,
    상기 다중 특이적 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 상기 MSLN-BD 각각은 SPR에 의해 측정될 때 0.5 nM ~ 20 nM 범위, 구체적으로 때 0.6 nM ~ 10 nM 범위의 1가 해리 상수(KD)로 메소텔린(MSLN)과 결합하는 다중 특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MSLN-BD는
    (i) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 및
    (ii) VH3 또는 VH4 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 구체적으로 VH3 도메인 틀 서열 FR1 ~ FR4; 및
    (iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 구체적으로 Vκ1 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4 및 Vλ FR4로부터 선택되는 틀 FR4, 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 더욱 구체적으로 서열 번호 132 ~ 서열 번호 139중 임의의 것으로부터 선택되는 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 132 또는 139에 따른 Vλ FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 다중 특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MSLN-BD는
    a.1) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.1) 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.1) 아미노산 서열 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.1) 아미노산 서열 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.2) 서열 번호 1, 2(또는 10) 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.2) 서열 번호 4, 5 및 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.2) 아미노산 서열 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.2) 아미노산 서열 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.3) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.3) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.3) 아미노산 서열 서열 번호 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.3) 아미노산 서열 서열 번호 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.4) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.4) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.4) 아미노산 서열 서열 번호 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.4) 아미노산 서열 서열 번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.5) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.5) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.5) 아미노산 서열 서열 번호 20과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.5) 아미노산 서열 서열 번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.6) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.6) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.6) 아미노산 서열 서열 번호 22와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.6) 아미노산 서열 서열 번호 24와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하거나; 또는
    a.7) 서열 번호 11, 12 및 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각,
    b.7) 서열 번호 14, 15 및 16의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각,
    c.7) 아미노산 서열 서열 번호 23과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 그리고
    d.7) 아미노산 서열 서열 번호 24와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열
    을 포함하는 다중 특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3-BD는 CD3ε과 결합하는 다중 특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CD3-BD 1개를 포함하되, 상기 CD3-BD는 SPR에 의해 측정될 때, 0.5 nM ~ 50 nM, 구체적으로 1 nM ~ 40 nM, 구체적으로 2 nM ~ 35 nM의 1가 KD로 CD3ε과 결합하는 다중 특이적 항체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 CD3-BD는
    (i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 45, 46 및 47의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각, 및
    (ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 48, 49 및 50의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하고,
    구체적으로 상기 CD3-BD는
    (i) 서열 번호 51, 140, 141 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    (ii) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 혈청 알부민 결합 도메인(hSA-BD) 적어도 1개, 구체적으로 hSA-BD 1개, 구체적으로 상기 hSA-BD는
    (i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 53, 54 및 55의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
    (ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 56, 57 및 58의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하거나;
    (i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
    (ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 66, 67 및 68의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하거나; 또는
    (i) 인간 항체 VH 틀, 구체적으로 VH3 틀내 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과,
    (ii) 인간 항체 VL 틀내 서열 번호 66, 67 및 68의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하되, 이 VL 틀은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 틀, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4 및 Vλ 틀 4로부터 선택되는 틀 FR4를 포함하고,
    구체적으로 상기 hSA-BD는
    (i) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호 79 또는 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 80 또는 144의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호 81 또는 145의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및
    (ii) 서열 번호 82 또는 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CH1 영역 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는 다중 특이적 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 101로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 102로 이루어져 있거나, 또는
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 109로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 110으로 이루어져 있거나, 또는
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 111로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 112로 이루어져 있거나, 또는
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 119로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 120으로 이루어져 있거나, 또는
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 121로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 122로 이루어져 있거나, 또는
    상기 제1 단일 사슬 단백질은 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 123으로 이루어져 있고,
    상기 제2 단일 사슬 단백질은 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 아미노산 서열 서열 번호 124로 이루어져 있는 다중 특이적 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다중 특이적 항체를 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개.
  11. 제10항에 의한 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개를 포함하는 벡터 또는 벡터 2개.
  12. 제11항의 벡터 또는 벡터 2개를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법으로서, (i) 제10항의 핵산 서열 또는 핵산 서열 2개, 또는 제11항의 벡터 또는 벡터 2개를 제공하고, 상기 핵산 서열 또는 핵산 서열들 또는 상기 벡터 또는 벡터들을 발현시켜, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 발현계로부터 수집하는 단계, 또는 (ii) 제12항의 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양하여, 상기 다중 특이적 항체 또는 상기 특이적 결합 도메인을 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 질환, 구체적으로 인간의 질환, 더욱 구체적으로 암으로부터 선택되는 인간의 질환, 구체적으로 중피종, 췌장암 및 난소암으로부터 선택되는 암, 염증성 질환 및 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것으로서,
    구체적으로 상기 다중 특이적 항체는 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하는 단일 사슬 단백질 또는 결합 도메인을 3개 또는 4개 포함하는 이종이량체 단백질중 어느 하나인, 다중 특이적 항체.
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