CN110691789A - 新型抗cd3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对人CD3特别是对CD3ε结构域特异的新型抗体。

Description

新型抗CD3抗体
技术领域
本发明涉及对人CD3，特别是对CD3ε结构域特异的新型抗体。
背景技术
本发明涉及结合了高亲和力和高效力的新型抗CD3抗体，特别是针对CD3ε结构域的抗体，特别是具有改进的特异性和交叉反应性属性的新型抗体。
T细胞受体或TCR是在T淋巴细胞(或T细胞)表面上发现的分子，其负责识别与抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR和抗原之间的结合具有相对较低的亲和力。当TCR与抗原和MHC结合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、特化辅助分子以及激活或释放的转录因子介导的生化事件激活。
TCR与如CD3的其他分子相关联，CD3在哺乳动物中具有三个不同的链(γ、δ和ε)，并且具有δ2(CD247)链或δ/ε链。这些辅助分子具有跨膜区域，并且对于将信号从TCR传播到细胞中至关重要；TCR的胞质尾非常短，因此不太可能参与信号传导。CD3和δ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
CD3ε是在某些T细胞表面表达的I型跨膜蛋白。它参与T细胞受体(TCR)复合物并与该复合物的其他结构域相互作用。这些相互作用伴侣之一是CD3γ，其以1：1的化学计量比与CD3ε结合(De la Hera等人,J.Exp.Med.1991；173:7-17)。据信，TCR与抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC-肽复合物的结合以及T细胞沿APC的随后运动导致TCR复合物的一定旋转，这导致CD3ε和CD3γ彼此错位，这对于有效的TCR信号传导以及因此T细胞的激活是必需的。已证明针对CD3ε的某些抗体可诱导TCR信号传导，而其他抗体则不能。TCR激活抗体通常与CD3ε上暴露的表位结合，而一些非刺激性抗体已被证明与CD3ε和CD3γ之间的界面结合，或同时与CD3ε和CD3γ结合，因此可能会干扰CD3ε和CD3γ的相对位移(Kim等人,JBC.2009；284:31028-31037)。
公认的是，肽-MHC复合物以低亲和力和快速解离速率(off-rate)结合TCR(Matsui等人,Science.1991；254:1788-1791；Weber等人,Nature.1992；356:793-796)。已经表明，这种低亲和力有助于通过重复结合和解离使一些肽-MHC复合物连续触发许多TCR(Valitutti等人,Nature.1995；375:148-151)。这种连续触发对于维持一段时间内的信号传递至关重要，其允许T细胞最终达到激活阈值(Valitutti等人,Immunol.Today.1997；18:299-304；Lanzavecchia等人,Cell.1999；96:1-4)。这一发现得到了以下观点的支持：与肽-MHC复合物相比，高亲和力的抗CD3抗体不能有效地刺激T细胞，因为它们以1：1的化学计量比触发了TCR(Viola等人,Science 1996；273:104-106)，这表明低亲和力抗体可能会更有效地通过TCR信号传递刺激T细胞，因为它们具有反复分离和重新结合CD3ε的能力。事实上，在抗CD3ε抗体TR66的三种衍生物(它们都以不同的亲和力结合)的直接比较中，当与具有较高或较低亲和力的衍生物相比时，具有中等亲和力的野生型TR66在T细胞激活中显示出最佳功效(Bortoletto等人,J.Immuno.2002；32:3102-3107)。因此，与TR66的KD相近的KD对刺激T细胞是理想的。已经通过使用表面等离子体共振(SPR)技术以及通过流式细胞术确定了TR66的亲和力，产生的平衡解离常数分别为2.6x10-7 M(Moore等人,Blood.2011；117:4542-4551)和1.0x10-7 M(Amann等人,Cancer Res.2008；68:143-151)。为此，建议使用亲和力小于10-8M的抗CD3抗体(US 7,112,324)，以及已发表的用于人治疗用途的T细胞刺激性抗体，其以在相同范围内的与人CD3ε的亲和力结合。因此，根据一系列TCR触发的理论，并与已发表的抗CD3ε抗体结果相一致，亲和力明显优于已发表的那些的单克隆抗体预计不会对T细胞产生更强的刺激作用，相反，预计会是较弱的激活剂。
通过用T细胞制剂免疫动物并随后通过所谓的杂交瘤程序分离单克隆抗体，已经产生了一些发表的针对CD3ε的抗体。这种方法的缺点是，一方面，针对动物中外源(人)T细胞的各种抗原的非选择性免疫应答，另一方面，杂交瘤程序效率低下，从而降低了鉴定具有T细胞刺激活性的单克隆抗体的可能性，也因为这些激动性抗体可能代表了整个抗CD3ε抗体中的少数。用跨越目标表位的线性肽进行免疫可提高免疫反应的选择性，但是，可能会导致抗体无法识别天然全长CD3ε或可能产生非最佳的TCR刺激。
为了用其他I型跨膜蛋白免疫动物，使用纯化的细胞外结构域(ECD)特别有用。但是，CD3ε的纯化ECD倾向于聚集，并且与天然蛋白质相比，聚集体的结构可能发生了变化。此外，此方法可以优先导致抗体结合至CD3ε和CD3γ之间的界面。相反，通过柔性肽接头连接的作为单链蛋白生产的CD3ε和CD3γ的复合物可以纯化为单体部分和其天然构象(Kim等人,JMB.2000；302:899-916)。但是，用这种CD3ε/γ单链蛋白免疫动物可能会导致抗体同时结合CD3ε和CD3γ，这将导致拮抗作用。
过去已经开发了几种针对人CD3ε的抗体。
单克隆抗体SP34是与非人灵长类动物CD3交叉反应的鼠类抗体，并且还能够在人和非人灵长类动物PBMC上诱导细胞增殖(Pessano等人,The T3/T cell receptorcomplex:antigenic distinction between the two 20kD T3(T3 and T3)subunits.EMBOJ 4(1985)337–344)。
都转让给Micromet(现在为Amgen Research(慕尼黑))的WO 2007/042261和WO2008/119567分别公开了针对CD3ε中的表位FSEXE和QDGNE的交叉反应性连接体(binder)。在一些反对者针对已授予的欧洲专利EP 2 155 783(基于WO 2008/119567的区域阶段)提出的异议程序中，提出SP34也与表位QDGNE结合。
WO 2014/191113公开了针对CD3εN末端新型表位的交叉反应性连接体，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合至关重要的残基，并且其中所述表位还包含氨基酸残基E6作为结合中涉及的残基。可以证明这些抗体具有高亲和力和高效力。然而，尽管在WO2014/191113中还可以证明，本申请中公开的抗体在体外与来自非人灵长类动物的CD3有交叉反应，但在细胞环境中不能证明与食蟹猴CD3有交叉反应性。因此，就包含抗CD3抗体的药物产品的临床前开发而言，这些抗体的用途相当有限。
因此，仍然存在很大的未满足的需求来开发新型CD3结合分子特别是新型抗CD3抗体，其具有所需的亲和力和效力属性，但是还可以与其他物种特别是与非人灵长类动物(例如食蟹猴)在体外和细胞环境中均发生交叉反应。
发明内容
本发明解决了以上需求，并提供了对人CD3特异的新型抗体，特别是对CD3ε结构域特异的抗体。迄今为止，现有技术还没有实现或建议本发明提供的解决方案，即CD3结合分子，特别是通过兔的肽免疫并筛选亲和力成熟的记忆B细胞获得的抗CD3抗体，并且特别是具有所需的交叉反应性属性的CD3结合分子，特别是抗CD3抗体，特别是对CD3ε结构域特异的抗体。本发明的新型CD3抗体在体外和细胞内均具有所需的亲和力和效力属性，并且与其他物种，特别是与非人灵长类动物(例如食蟹猴)具有交叉反应。另外，本发明的抗体具有良好的生物物理性质，例如质量、稳定性或溶解性，其例如，由单体形式的抗体的百分比和通过差示扫描荧光法(DSF)确定的热解折叠来定义。
因此，在第一方面，本发明涉及对人CD3特异的抗体或其功能性片段，其包含：
可变轻链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，并且每个LCDR表示轻链互补决定区，并且其中所述LCDR共同与取自根据SEQ ID NO：4的VL序列的相应LCDR具有至少90％的序列同一性；
和
可变重链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，并且每个HCDR表示重链互补决定区，并且其中所述HCDR共同与取自根据SEQ ID NO：8的VH序列的相应HCDR具有至少90％的序列同一性。
在第二方面，本发明涉及包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的抗体或其功能性片段或本发明的多特异性多肽的药物组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第四方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或其功能性片段，或本发明的多特异性多肽。
在第五方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其功能性片段的核酸序列或核酸序列的集合。
在第六方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的载体或载体的集合。
在第七方面，本发明涉及宿主细胞，特别是表达宿主细胞，其包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合。
在第八方面，本发明涉及用于生产本发明的抗体或其功能性片段的方法，其包含表达本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合，或本发明的宿主细胞，特别是表达宿主细胞的步骤。
在第九方面，本发明涉及产生多特异性构建体的方法，其包含在一个或多个步骤中将编码根据本发明的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸序列克隆到多特异性构建体中的步骤，所述多特异性构建体包含编码至少第二结合结构域或其片段的核酸序列并任选地包含编码一个或多个另外的结合结构域或其片段的核酸序列。
附图说明
图1显示了在4℃和10mg/mL的浓度下通过SE-HPLC在最初(d0)以及在28天存储时间内测定的每个样品的单体含量。
图2显示了使用人PBMC由PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)诱导的T细胞介导的靶细胞耗竭。左图显示靶表达细胞的细胞裂解，而右图显示靶阴性细胞的细胞裂解。在图的下方描述了在靶表达细胞存在的情况下分子的半数最大效应浓度(EC50)的数值。
图3显示了通过FC测定法确定的分子PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)的T细胞激活。左图显示在靶表达细胞存在的情况下的激活，而右图显示在靶阴性细胞存在的情况下的激活。
图4显示了使用人PBMC由PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)诱导的T细胞介导的靶细胞耗竭。左图显示靶表达细胞的细胞裂解，而右图显示靶阴性细胞的细胞裂解。在图的下方描述了在靶表达细胞存在的情况下分子的半数最大效应浓度(EC50)的数值。
图5显示了通过FC测定法确定的分子PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)的T细胞激活。左图显示在靶表达细胞存在的情况下的激活，而右图显示在靶阴性细胞存在的情况下的激活。
图6显示了通过NFAT报道基因测定法确定的分子PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)的T细胞激活。左图显示在靶表达细胞存在的情况下的激活，而右图显示在靶阴性细胞存在的情况下的激活。在图的下方描述了在靶表达细胞存在的情况下分子的半数最大效应浓度(EC50)的数值。
图7显示了使用食蟹猴PBMC由PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PR0389(IL23RxCD31st gen Numab)诱导的T细胞介导的靶细胞耗竭。左图显示靶表达细胞的细胞裂解，而右图显示靶阴性细胞的细胞裂解。在图的下方描述了在靶表达细胞存在的情况下分子的半数最大效应浓度(EC50)的数值。
图8显示了在16小时后(A)和40小时后(B)使用人PBMC由PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PR0956(HER2xCD3I2C Amgen)诱导的T细胞介导的靶细胞耗竭。左图显示靶表达细胞的细胞裂解，而右图显示靶阴性细胞的细胞裂解。在图的下方描述了在靶表达细胞存在的情况下分子的半数最大效应浓度(EC50)的数值。
图9显示了在16小时后(A)和40小时后(B)通过FC测定确定的分子PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PR0956(HER2xCD3I2C Amgen)的T细胞激活。左图显示在靶表达细胞存在的情况下的激活，而右图显示在靶阴性细胞存在的情况下的激活。
具体实施方式
本公开涉及对人CD3特异的新型抗体，特别是对CD3ε结构域特异的抗体。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”和“包括(including)”在本文中以其开放式和非限制性的含义使用。关于这样的后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由……组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一(a)”和“一个(an)”以及“该(the)”和类似的附图标记应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当复数形式用于化合物、盐等时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
在第一方面，本发明涉及对人CD3特异的抗体或其功能性片段，其包含：(a)可变轻链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，并且每个LCDR表示轻链互补决定区，并且其中所述LCDR共同与取自根据SEQ ID NO：4的VL序列的相应LCDR具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性；和(b)可变重链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，并且每个HCDR表示重链互补决定区，并且其中所述HCDR共同与取自根据SEQ ID NO：8的VH序列的相应HCDR具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性。
在本发明的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，其被定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA、IgY或IgD类(或其任何亚类)的蛋白，并且包括所有常规已知的抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(H)链和两个轻链(L)链的糖蛋白。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可被进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，间以称为框架区(FW)的更保守的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FW组成，它们以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且术语“功能性片段”或“功能性抗体片段”或“抗原结合片段”是指包含至少抗原结合结构域(例如，完整抗体的可变区部分)的抗体片段，其足以赋予功能性抗体片段对靶标(例如抗原的抗原决定簇)的识别和特异性结合。功能性抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域)和由例如双价片段的抗体片段形成的多特异性分子，所述双价片段,包含两个或多个例如，通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段，或两个或更多个，例如两个连接的抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。在一个实施方案中，本发明的功能片段是scFv。抗体片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双功能抗体(diabodies)、三功能抗体(triabodies)、四功能抗体(tetrabodies)、v-NAR和双-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以基于例如纤连蛋白III型(Fn3)的多肽将抗体片段接枝到支架中(参见美国专利号6,703,199其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。抗体的“抗原结合区”或“抗原结合结构域”通常存在于抗体的一个或多个高变区，即CDR1、CDR2和/或CDR3区中；然而，可变的“框架”区也可以例如通过为CDR提供骨架而在抗原结合中起重要作用。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。如本文所用，术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
“互补决定区”(“CDR”)是具有使用多种众所周知的方案中的任一种所确定的边界的氨基酸序列，所述方案包括Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)and ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典格式，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基被编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸被编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR2)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基被编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基被编号为大约27-32(LCDR2)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。根据IMGT，抗体的CDR可以使用程序IMGT/DomainGap Align来确定。
在本发明的上下文中，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun建议的编号系统(“AHo编号”)(Honegger&Plückthun，J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族中特别是在CDR中的长度多样性，并提供了序列中的缺口(gaps)。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常不会是所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
优选地，“抗原结合区”包括可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4至138和可变重(VH)链的5至138(在每种情况下根据Honegger&Plückthun编号)，更优选VL的氨基酸残基3至144和VH的4至144，并且特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸位置1至149和VH的1至149)。框架区和CDR在表1所示的序列中表示。在本发明中使用的免疫球蛋白的优选类别是IgG本发明的功能性片段包括F(ab')2片段、Fab片段、Fv和scFv的结构域。F(ab')2或Fab可以被工程化以最小化或完全去除在CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用。本发明的抗体或其功能性片段可以是双或多官能构建体的一部分，如在第[0076]至[0111]段中进一步描述的。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“序列同一性”或“序列同一性百分比”。如本文所用，术语“序列同一性”是通过计算两个多肽序列之间相同的氨基酸残基的最大数目来确定的，其中可以考虑空位(gaps)和/或插入以便允许最大程度的序列重叠。例如，两个完全相同的100mer多肽具有100％的序列同一性。当它们相差单个突变时，或当一个多肽含有一个氨基酸缺失时，序列同一性为99％(99个位置相同)。换句话说，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来计算的，确定相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基在两个序列中均出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)，然后将结果乘以100得出序列同一性的百分比。术语“序列相似性”是当比较两个序列时两个序列之间的相似性程度。在必要或需要时，可以进行序列的最佳比对以进行比较,例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443-53(1970))，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48(1988))，通过这些算法的计算机实现(例如，威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过目视检查。(一般参见Ausubel等人(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley and Sons,New York(1999))。除非本文另有说明，否则本文所指的序列相似性程度是通过使用Dayhoff PAM矩阵来确定的(M.O.Dayhoff,R.Schwartz,B.C.Orcutt:A model of Evolutionary Changein Proteins,345-352页；in:Atlas of protein sequence and structure,NationalBiomedical Research Foundation,1979)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，其例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。本文中可互换地使用术语“多肽”和“降解蛋白”来指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，否则特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体结合位点与一种抗原决定簇而不与不同抗原决定簇反应的能力。如本文所用，当结合分子能够在这样的靶生物分子和一个或多个标准分子之间进行区分时，“结合分子”是“特异于靶标的/对靶标特异的”、“特异性地识别”或“特异性地结合”靶标(例如人CD3)，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的性质。以其最一般的形式(并且当没有提及定义的参考文献时)，“特异性结合”是指结合分子区分目标靶生物分子与无关的生物分子之间的能力，如例如根据本领域已知的特异性检测方法所确定的。这样的方法包括但不限于Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。评分可以通过标准颜色开发(例如，具有辣根过氧化物和四甲基联苯胺与过氧化氢的二级抗体)进行。在某些孔中的反应由光密度(例如，在450nm处)评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性得分之间的比率可以是10倍或更高。在另一个实施例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间的至少10倍，优选至少100倍的差异表示特异性结合。通常，结合特异性的确定不是通过使用单一的标准生物分子，而是一组约三到五种不相关的生物分子(例如奶粉、转铁蛋白等)来进行的。本发明的抗体或其功能性片段对人CD3，优选对人CD3ε具有结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段对人CD3和对非黑猩猩灵长类动物CD3具有结合特异性。对本领域技术人员显而易见的是，具有如本文所定义的跨物种特异性的本发明的抗体或其功能片段也可以与例如黑猩猩CD3结合，这不脱离本发明的范围。另一方面，显然仅与人CD3结合而不与非黑猩猩灵长类CD3结合的本发明的抗体或其功能片段被排除在本发明的范围之外。这比照适用于仅与非黑猩猩灵长类动物CD3结合但不与人CD3结合的结合域，例如，单克隆抗体FN-18的那些。
如本文所用，“非黑猩猩灵长类动物”或“非黑猩猩灵长类动物(non-chimpprimate)”或其语法变体是指除黑猩猩以外的任何灵长类动物，即除这样的动物以外的，所述动物属于黑猩猩属(genus Pan)，包括物种倭黑猩猩(Pan paniscus)和黑猩猩(Pantroglodytes)，也被称为类人猿(Anthropopithecus troglodytes)或猩猩(Simiasatyrus)。“灵长类动物(primates)”、“灵长类动物物种”，“灵长类动物(primates)”或其语法变体表示真兽下纲(eutherian)哺乳动物的一个目，其被划分为前猿(prosimians)和类人猿(anthropoids)两个亚目的并且包括人、猿、猴和狐猴。具体地，本文所用的“灵长类动物”包括原猴(Strepsirrhini)亚目(非眼镜猴原猴(non-tarsier prosimians))，其包括狐猴(Lemuriformes)下目(其自身包括总科鼠狐猴科(Cheirogaleoidea)和狐猴科(Lemuroidea))、猴型下目(Chiromyiformes)(其自身包括指猴科(Daubentoniidae))和懒猴型下目(Lorisiformes)(其自身包括懒猴科(Lorisidae)和丛婴猴科(Galagidae))。如本文所用，“灵长目动物”还包括简鼻亚目(Haplorrhini)，其包括眼镜猴型下目(Tarsiiformes)(其本身包括眼鏡猴科(Tarsiidae))、类人猿下目(Simiiformes)(其自身包括阔鼻小目(Platyrrhini)或新世界猴，以及狭鼻小目(Catarrhini)，其包括猴科(Cercopithecidea)或旧世界猴)。最优选的是食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(也被称为食蟹猴(Cynomolgus monkey)，因此在实施例中称为“食蟹猴(Cynomolgus)”)。合适地，本发明的抗体或其功能性片段对人CD3和食蟹猴CD3具有结合特异性。
此外，取决于上下文，术语“特异性结合”也可以指结合分子区分靶生物分子和一个或多个密切相关的生物分子的能力，所述生物分子用作标准点，例如来自不同物种的CD3分子，例如鼠CD3。此外，“特异性结合”可涉及结合分子区分其靶抗原的不同部分的能力，所述靶抗原的不同部分例如靶生物分子的不同结构域、区域或表位(特别是CD3ε结构域)，或靶生物分子的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基段。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段对人CD3ε具有结合特异性。
术语“CD3”是指表达为T细胞受体的一部分，并且具有现有技术中通常赋予它的含义的分子。在人中，它包括单个或独立组合的CD3亚基CD3ε、CD3δ和CD3γ。本文所指的非黑猩猩灵长类动物CD3抗原是，例如，食蟹猕猴CD3和普通猕猴(Macaca mulatto)CD3。在食蟹猕猴中，它包括CD3εFN-18阴性和CD3εFN-18阳性、CD3γ和CD3δ。在普通猕猴中，它包括CD3ε、CD3γ和CD3δ。
优选地，如本文所用，所述CD3具体涉及CD3ε。术语“人CD3ε”具体是指具有GenBank登录号NM_000733、UniProt ID号P07766的人CD3ε或其变体，其在本文中以SEQ ID NO：19再现。GenBank登录号AB073994中指出了食蟹猕猴的CD3ε“FN-18阴性”(即由于上述的多态性而未被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)。GenBank登录号AB073993中指出了食蟹猕猴的CD3ε“FN-18阳性”(即被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)。
GenBank登录号NM 000073中指出了人CD3γ。GenBank登录号NM 000732中指出了人CD3δ。GenBank登录号AB073992中指出了食蟹猕猴的CD3γ。GenBank登录号AB073991中指出了食蟹猕猴的CD3δ。
合适地，本发明的抗体或其功能片段靶向人和食蟹猴(食蟹猕猴)CD3ε。
合适地，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指与来自或衍生自相同遗传来源的氨基酸序列基本相同的抗体。单克隆抗体组合物显示对某个特定表位的结合特异性和亲和力，或对多个特定表位的结合特异性和亲和力。
在本发明的上下文中，术语“表位”是指靶生物分子与结合分子之间特异性结合所需的给定的靶生物分子的部分。表位可以是连续的，即由存在于靶生物分子中的相邻结构元件形成，或者是不连续的，即由在靶生物分子的一级序列中(例如在作为标靶的蛋白质的氨基酸序列中)的不同位置处的结构元件形成，但在靶生物分子例如在体液中采用的三维结构中紧密接近。
本发明的抗体包括但不限于嵌合的、人的和人源化的抗体。
术语“嵌合抗体”(或其功能片段)是这样的抗体分子(或其功能片段)，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至具有不同或改变类别、效应子功能和/或种类的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，其例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；(b)可变区或其一部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替换其恒定区来修饰。由于被人恒定区取代，嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比，其在人体内具有降低的抗原性。
如本文所用，“人源化”抗体(或其功能性片段)是保留非人抗体的反应性而同时在人体中具有较低免疫原性的抗体(或其功能性片段)。例如，这可以通过保留非人CDR区并用其人对应物(即恒定区和可变区的框架部分)替换抗体的其余部分来实现。可以在人框架序列以及衍生自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变，或通过保守取代以促进稳定性或制造而引入的突变)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。抗体工程技术的其他实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的本发明的所有人源化抗体，例如从动物(例如小鼠)分离的抗体；使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的、组合的人抗体文库中分离的抗体，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)。但是，此类抗体可以进行体外诱变(或，当使用针对人IgG序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH(抗体重链可变区)和VL(抗体轻链可变区)的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不会天然存在于人抗体种系中。
合适地，本发明的抗体或功能性片段是人工或分离的抗体或其功能性片段。如本文所用，术语“人工抗体”是指抗体或其功能性片段，其凭借其起源或操作：(i)作为表达载体的一部分的表达产物存在于宿主细胞中，或(ii)与不同于其天然连接的蛋白质或其它化学部分连接，或(iii)非天然存在。如本文所用，术语“分离的抗体”是指在宿主细胞中表达并通过凝胶色谱法从相关蛋白中纯化出的抗体。术语“分离的抗体”还指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合人CD3的分离的抗体是基本上不含特异性结合除了人CD3之外的抗原的抗体)。然而，特异地结合人CD3的分离的抗体可以对其它抗原具有交叉反应性，所述其它抗原例如来自其它物种(例如，非人灵长类动物和/或啮齿动物CD3)的CD3分子。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。
在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体或其功能性片段，其包含(a)如SEQ IDNO：1所示的LCDR1；(b)如SEQ ID NO：2所示的LCDR2；(c)如SEQ ID NO：3所示的LCDR3；(d)如SEQ ID NO：5所示的HCDR1；(e)如SEQ ID NO：6所示的HCDR2；和(f)如SEQ ID NO：7所示的HCDR3。
本发明的抗体或其功能性片段包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。在本发明的上下文中，术语“VH”(“可变重链”)、“Vκ”和“Vλ”是指根据序列同一性和同源性进行分组的抗体重链和轻链序列的家族。用于确定序列同源性的方法，例如通过使用同源性搜索矩阵，例如BLOSUM(Henikoff,S.&Henikoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)10915-10919)，以及用于根据同源性的序列分组的方法是本领域普通技术人员众所周知的。对于VH、Vκ和Vλ，可以确定出不同的亚家族，例如，如在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中所示，其中将VH分组为VH1A、VH1B和VH2-VH6、将Vκ分组为Vκ1-Vκ4以及将Vλ分组为Vλ1-Vλ3。在体内，抗体Vκ链、Vλ链和VH链分别是种系κ链V和J片段、种系λ链V和J片段以及重链V、D和J片段随机重排的结果。给定抗体可变链所属的亚家族由相应的V片段确定，并且具体地由框架区FW1-FW3确定。因此，仅由特定组的框架区HFW1至HFW3在本申请中表征的任意VH序列可以与任意HFW4序列组合，例如取自重链种系J段之一的HFW4序列，或取自重排的VH序列的HFW4序列。在具体的实施方案中，所述HFW4序列是WGQGTLVTVSS。
适当地，本发明提供特异地结合CD3(例如人CD3蛋白，特别是人CD3ε)的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包含VH4或VH3结构域，优选VH3结构域。
合适地，本发明提供了特异地结合CD3(例如人CD3蛋白，特别是人CD3ε)的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能片段包含(i)Vκ框架FW1、FW2和FW3，特别是Vκ1或Vκ3构架，优选Vκ1构架FW1至FW3，和(ii)框架FW4，其选自VκFW4，特别是Vκ1FW4、Vκ3FW4和VλFW4。合适的Vκ1FW1至FW3与取自根据SEQ ID NO：4的Vκ1序列的相应框架区具有至少60％、70％、80％、90％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性。合适的Vκ1FW4与取自根据SEQID NO：4的Vκ1序列的相应FW4具有至少60％、70％、80％、90％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性。合适地，Vκ1FW4是取自根据SEQ ID NO：4的Vκ1序列的FW4。合适的VλFW4如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示。在一个实施方案中，本发明提供了特异地结合CD3(例如人CD3蛋白，特别是人CD3ε)的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包含VλFW4，其包含与选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18的任一个，优选与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％的同一性的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述可变轻链是Vκ1轻链和/或所述可变重链是VH3链。在另一个具体的实施方案中，所述可变轻链是嵌合轻链，其包含Vκ框架区I-III和V框架区IV。在一个实施方案中，轻链是嵌合轻链，其包含：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2和3的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)人Vκ框架区域FW1至FW3，尤其是人Vκ1框架区域FW1至FW3；
(iii)FW4，其选自(a)FW4的人Vλ种系序列，特别是选自SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18的Vλ种系序列，优选SEQ ID NO：17；和(b)基于Vλ的序列，其与FW4的最接近的人Vλ种系序列相比，具有一个或两个突变，特别是一个突变，所述FW4包含选自SEQ ID NO：17和SEQID NO：18，优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，和/或，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
合适地，本发明涉及对人CD3，特别是人CD3ε特异的抗体或其功能性片段，其包含可变轻链，其中所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其中所述可变轻链包含在轻链氨基酸位置54处(AHo编号)的精氨酸(R)或赖氨酸(K)，优选精氨酸(R)。在另一个实施方案中，所述可变轻链还包含在轻链氨基酸位置50处(AHo编号)的谷氨酰胺(Q)和/或在轻链氨基酸位置51处(AHo编号)的丝氨酸(S)，以及任选地，在轻链氨基酸位置44处(AHo编号)的苯丙氨酸(F)或在轻链氨基酸位置88处(AHo编号)的谷氨酰胺(Q)或在轻链氨基酸位置88处(AHo编号)的组氨酸(H)。在一个具体的实施方案中，本发明涉及对人CD3，特别是人CD3ε特异的抗体或其功能性片段，其包含可变轻链，其中所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其中所述可变轻链包含在轻链氨基酸位置54处(AHo编号)的精氨酸(R)、在轻链氨基酸位置50处(AHo编号)的谷氨酰胺(Q)、在轻链氨基酸位置51处(AHo编号)的丝氨酸(S)和在轻链氨基酸位置44处(AHo编号)的苯丙氨酸(F)。
在另一个具体的实施方案中，本发明涉及对人CD3，特别是人CD3ε特异的抗体或其功能性片段，其包含可变轻链，其中所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其中所述可变轻链包含在轻链氨基酸位置54处(AHo编号)的精氨酸(R)和在轻链氨基酸位置44处(AHo编号)的苯丙氨酸(F)。
合适地，在一个具体的实施方案中，本发明涉及对人CD3，特别是人CD3ε特异的抗体或其功能性片段，其包含可变重链，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其中所述可变重链包含选自下列的至少一个例如，至少两个，优选至少三个氨基酸，所述列表由以下氨基酸组成：在重链氨基酸位置53处(AHo编号)的丙氨酸(A)、在重链氨基酸位置103处(AHo编号)的苏氨酸(T)，和在重链氨基酸位置105处(AHo编号)的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，所述可变重链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，并且其包含在重链氨基酸位置53处(AHo编号)的丙氨酸(A)，在重链氨基酸位置103处(AHo编号)的苏氨酸(T)和在重链氨基酸位置105处(AHo编号)的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，其包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其保守修饰的变体，所述可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸的序列或其保守修饰的变体。
术语“保守修饰的变体”或“保守变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。关于特定的核酸序列、保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，则是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定丙氨酸的位置，密码子可以改变为所描述的相应密码子的任一个，而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都隐含在每个所述序列中。
对于多肽序列、“保守修饰的变体”或“保守变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，其导致用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。此类保守修饰的变体是补充而不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八个组含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Protein(1984))。在一个实施方案中，术语“保守性序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段包含可变轻链以及可变重链，所述可变轻链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其功能片段选自：IgG抗体、Fab和scFv片段。合适地，本发明的抗体或其功能片段是scFv抗体片段。“单链Fv”或“scFv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成用于靶标结合的所需结构(参见，例如，Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburgand Moore eds.,Springer-Verlag,New York,1994,pp.269-315)。
合适地，本发明的抗体或其功能性片段是scFv。在具体的实施方案中，所述功能片段是包含根据SEQ ID NO：15的接头的scFv形式。合适地，本发明的抗体或其功能性片段是scFv，其包含选自由SEQ ID NO：4、8、29、30、32、33、35、36、37、38、39、40、41和42所组成的列表的至少一个氨基酸序列。合适地，本发明的抗体或其功能性片段是scFv，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：29、30、32、33、35、36、37、38、39、40、41和42。
如本文所用,术语“亲和力”是指单个结合位点或分子(例如抗体或其功能性片段)与其结合伴侣(例如抗原)之间的总非共价相互作用之和的强度。除非另外指出，如本文所用，术语“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间的1：1相互作用(例如，单个抗体结合结构域与其抗原的相互作用)的内在结合亲和力。亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，其包括本文所述的那些。
在合适的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段可具有的与人CD3和/或食蟹猴CD3的KD可以在0.1至100nM、0.1至90nM、0.1至80nM、0.1至70nM、0.1至60nM、0.5至50nM、0.5至40nM、0.5至30nM、0.5至20nM、0.5至10nM、0.5至9nM、0.5至8nM、0.5至7nM、0.5至6nM、0.5至5nM之间，特别是如通过表面等离子体共振所测量的。在合适的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段可具有的与人CD3和/或食蟹猴CD3的KD小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约55nM、小于约40nM、小于约45nM、小于约40nM、小于约35nM、小于约30nM、小于约25nM、小于20nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约9nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于2nM、小于1nM，特别是如通过表面等离子体共振所测量的。合适地，本发明的抗体或其功能片段对人CD3和/或食蟹猕猴CD3的KD小于10nM，优选小于6nM，特别是如表面等离子共振所测量的。
在具体的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段的特征在于以下参数中的一个或多个：
(i)结合人CD3的KD值小于40nM，特别是小于10nM，更特别是小于6nM，特别是如通过表面等离子体共振所测量的；更特别地，如通过实施例2.1中所示的方法所测定的；
(ii)结合食蟹猴CD3的KD值小于20nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，特别是如通过表面等离子体共振所测量得；更特别地，如通过实施例2.1中所示的方法所测定的；和
(iii)当以scFv(单链可变片段形式)抗体形式表达时，如前所述通过差示扫描荧光法(DSF)测定(Egan等人,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen,等人,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)，尤其是在将样品在pH范围为3.5至7.5且含有0.15-0.25M NaCl，特别是0.15M NaCl的五种柠檬酸磷酸盐缓冲液中稀释时，其热解折叠温度(Tm)的平均中点至少超过60℃，特别地，至少65℃，更特别地，至少68℃。scFv构建体的热解折叠的转变中点是使用荧光染料Orange通过差示扫描荧光法确定的(参见Wong&Raleigh，ProteinScience 25(2016)1834-1840)。通过掺入在相关缓冲液中制备的储备赋形剂，制备相关赋形剂条件下的样品，使最终蛋白质浓度为50μgml-1。对于缓冲液探索实验，将样品在具有不同pH值(pH 3.4、4.4、5.4、6.4和7.2)的含有最终浓度为Orange的最终scFv缓冲液中稀释至总体积100μl。将scFv DSF标准与未知样品一起作为内部对照进行测量。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板置于以1℃的增量递增的25℃到96℃的温度斜坡，每次温度递增后停顿30秒。总测定时间为约两个小时。使用计算曲线的拐点的数学二阶导数方法通过GraphPad Prism软件计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。在一个具体的实施方案中，如实施例2.2中所述进行Tm的测定，其中将样品在含有0.25M NaCl的pH值为6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中稀释。
在一个方面，本发明涉及多特异性分子，例如双特异性分子、三特异性分子、四特异性、五特异性、六特异性分子或多价分子，例如二价、三价、四价、五价、六价分子，其包含本发明的抗体或其功能性片段。在一个具体的实施方案中，多特异性分子是多特异性多肽。在一个具体的实施方案中，多价分子是多价多肽。
如本文所用，术语“双特异性抗体”或“双特异性多肽”是指结合两个不同表位，特别是两个不同靶标上的两个不同表位的抗体。如本文所用，术语“三特异性抗体”或“三特异性多肽”是指结合三个不同表位，特别是三个不同靶标上的三个不同表位的抗体。
本发明的抗体或其功能片段可以被衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)以产生结合至至少两个结合位点和/或不同的靶分子的多特异性分子(例如多特异性多肽)。实际上，本发明的抗体可以被衍生或连接至多于一个其他功能性分子以产生结合至多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子(例如，多特异性多肽)。为了产生本发明的多特异性分子，可以将本发明的抗体功能性地连接(例如，通过化学偶联，遗传融合，非共价结合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，其例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生多特异性分子。
在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个与不同于CD3的靶标结合的结合结构域。
如本文所用，术语抗体的“结合结构域”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”或“功能性片段”等是指完整抗体的一个或多个片段，所述抗体保留与特定抗原(例如CD3、IL23R、HER2、HSA)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体的结合结构域选自由以下组成的组：Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab’)2片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；由VH和CHI结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature 341:544-546)；分离的互补决定区(CDR)、dsFv、scAb、STAB、单结构域抗体(sdAb或dAb)、单结构域重链抗体和单域轻链抗体、VHH、VNAR，基于来自鲨鱼的VNAR结构的单结构域抗体，以及基于其他支架的结合结构域，其包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、模拟抗体(anticalins)、纤连蛋白以及被构建到抗体的恒定区中的结合位点(例如f-star技术)。合适地，本发明的结合结构域是单链Fv片段(scFv)或单抗体可变结构域。在一个优选的实施方案中，本发明的结合结构域是单链Fv片段(scFv)。
合适地，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个，优选一个肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个、优选一个IL23R结合结构域。
白介素(IL)-23是一种异源二聚体细胞因子，其由两个蛋白质亚单位组成，所述亚单位因其近似的分子量被而称为p40和p19。p40蛋白在IL-12和IL-23之间共享，而p19蛋白亚单位是IL-23特有的。IL-23通过两链受体复合物发出信号，该复合物由与p40结合的IL-12受体beta-1(IL-12Rβ1)链和赋予IL-23特异的细胞内信号传导的独特的IL-23受体链(IL23R)组成。术语“IL23R”特别是指具有UniProt ID号Q5VWK5的人IL23R。
在一些实施方案中，IL23R结合结构域衍生自单克隆抗体或抗体片段。
合适的IL23R结合结构域对人IL23R特异并且包括：可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链从N末端到C末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示一个轻链框架区，每个LCDR表示一个轻链互补决定区，并且其中所述LCDR共同与取自根据SEQ ID NO：11的VL序列的相应LCDR具有至少90％的序列同一性；其中所述可变重链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示一个重链框架区，并且每个HCDR表示一个重链互补决定区，并且其中所述HCDR共同与取自根据SEQ ID NO：12的VH序列的相应HCDR具有至少90％的序列同一性。合适地，本发明的IL23R结合结构域包含(i)如取自根据SEQ ID NO：11的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3，和(ii)如在取自根据SEQ ID NO：12的VH序列的相应的CDR区中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。
在一个实施方案中，所述IL23R结合结构域的可变轻链与根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或，所述IL23R结合结构域的可变重链与根据SEQID NO：12的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，本发明的IL23R结合结构域包含：(i)与根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变轻链，其中所述可变轻链包含如取自根据SEQ ID NO：11的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或(ii)与根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变重链，其中所述可变重链包含如取自根据SEQ ID NO：12的VH序列的相应的CDR区域所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。在一个具体的实施方案中，所述IL23R结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其保守修饰的变体，和/或所述IL23R结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其保守修饰的变体。在一个更加具体的实施方案中，所述IL23R结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列，和/或所述IL23R结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述IL23R结合结构域是包含根据SEQ ID NO：15的接头的scFv形式。
在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个IL23R结合结构域，并且其中所述多特异性多肽包含与氨基酸序列SEQID NO：26具有至少60％、70％、80％、90％的同一性的氨基酸序列，优选地，其中所述多特异性多肽包含根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个、优选一个HER2结合结构域。
术语“HER2”特别是指具有UniProt ID号Q5VWK5的人HER2。
在一些实施方案中，HER2结合结构域衍生自单克隆抗体或抗体片段。
合适的HER2结合结构域特异于人HER2并且包括：可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链从N末端到C末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示一个轻链框架区，每个LCDR表示一个轻链互补决定区，并且其中所述LCDR共同与取自根据SEQ ID NO：20的VL序列的相应LCDR具有至少90％的序列同一性；其中所述可变重链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示一个重链框架区，并且每个HCDR表示一个重链互补决定区，并且其中所述HCDR共同与取自根据SEQ ID NO：21的VH序列的相应HCDR具有至少90％的序列同一性。合适地，本发明的HER2结合结构域包含(i)如取自根据SEQ ID NO：20的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3，和(ii)如在取自根据SEQ ID NO：21的VH序列的相应的CDR区中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。
在一个实施方案中，所述HER2结合结构域的可变轻链与根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或，所述HER2结合结构域的可变重链与根据SEQ IDNO：21的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，本发明的HER2结合结构域包含：(i)与根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变轻链，其中所述可变轻链包含如取自根据SEQ ID NO：20的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或(ii)与根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变重链，其中所述可变重链包含如取自根据SEQ ID NO：21的VH序列的相应的CDR区域所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。在一个具体的实施方案中，所述HER2结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列或其保守修饰的变体，和/或所述HER2结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其保守修饰的变体。在一个更加具体的实施方案中，所述HER2结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列，和/或所述HER2结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述HER2结合结构域是包含根据SEQ ID NO：15的接头的scFv形式。
在一个具体的实施方案中，本发明的HER2结合结构域是曲妥珠单抗或其功能性片段。在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，和(b)至少一个HER2结合结构域，并且其中所述多特异性多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：27具有至少60％、70％、80％、90％的同一性的氨基酸序列，优选地，其中所述多特异性多肽包含根据SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性多肽可以包含对人血清白蛋白具有特异性的另一个结合结构域。在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段、(b)至少一个、优选一个IL23R结合结构域和(c)至少一个、优选一个HSA结合结构域。在一个实施方案中，本发明的多特异性多肽包含：(a)本发明的抗体或其功能性片段，(b)至少一个、优选一个HER2结合结构域和(c)至少一个、优选一个HSA结合结构域。
术语“HSA”特别是指具有UniProt ID号P02768的人血清白蛋白或其变体。人血清白蛋白(HSA)是人血清中66.4kDa的丰富蛋白质(占总蛋白质的50％)，其由585个氨基酸组成(Sugio，Protein Eng，Vol.12，1999，439-446)。多功能HSA蛋白与其允许结合和运输许多代谢产物的结构相关，这些代谢产物例如脂肪酸、金属离子、胆红素和某些药物(Fanali，Molecular Aspects of Medicine，Vol.33,2012,209-290)。血清中的HSA浓度约为3.5-5g/dL。结合白蛋白的抗体及其片段可以用于例如延长与其结合的药物或蛋白质的体内血清半衰期。
在一些实施方案中，HSA结合结构域衍生自单克隆抗体或抗体片段。
用于本发明的多特异性多肽的合适的HSA结合结构域是本公开中提供的结合结构域。本发明的HSA结合结构域包括但不限于表1中所列的人源化单克隆抗体。
合适的HSA结合结构域特异于人HSA并且包含：可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链与根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，本发明的HSA结合结构域包含：(i)与根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变轻链，其中所述可变轻链包含如取自根据SEQ ID NO：22的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或(ii)与根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变重链，其中所述可变重链包含如取自根据SEQ ID NO：23的VH序列的相应的CDR区域所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。在一个更加具体的实施方案中，所述HSA结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列，和/或所述HSA结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列。另一合适的HSA结合结构域特异于人HSA并且包含：可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链与根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，本发明的HSA结合结构域包含：(i)与根据SEQ IDNO：24的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变轻链，其中所述可变轻链包含如取自根据SEQ ID NO：24的VL序列的相应的CDR区域所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或(ii)与根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的可变重链，其中所述可变重链包含如取自根据SEQ ID NO：25的VH序列的相应的CDR区域所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3。在一个具体的实施方案中，所述HSA结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列或其保守修饰的变体，和/或所述HSA结合结构域的可变重链包含根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列或其保守修饰的变体。在一个更加具体的实施方案中，所述HSA结合结构域的可变轻链包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和/或所述HSA结合结构域的可变重链包含根据SEQID NO：25的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述HSA结合结构域是包含根据SEQ ID NO：15的接头的scFv形式。
合适地，本发明的多特异性多肽是选自本领域已知的任何合适的多特异性(例如双特异性)形式的抗体形式，其包括但不限于基于下列的形式：单链双功能抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)，双特异性T细胞接合子(BiTE；串联di-scFv)、串联tri-scFv、三抗体(Fab-(scFv)2)或双抗体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgGCH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三功能抗体(triabody)、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微小抗体、四功能抗体(tetrabody)、scFv-Fc-scFv融合体、二双功能抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体，例如bsAb(连接至轻链C末端的scFv)、Bs1Ab(连接至轻链N末端的scFv)、Bs2Ab(连接至重链N末端的scFv)、Bs3Ab(连接至重链C末端的scFv)、Ts1Ab(连接至重链和轻链的N末端的scFv)、Ts2Ab(连接至重链的C末端的dsscFv)和Knob-into-Hole抗体(KiHs)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)、MATCH(描述于WO2016/0202457；EganT.等人，mAbs 9(2017)68-84)和DuoBodies(由Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)。特别适合用于本文的是单链双功能抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb，或scDb-scFv，特别是三特异性单体scDb-scFv。
术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用太短的以至于不允许在同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对以产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是双价的或双特异性的。双抗体在例如EP404097、WO1993/01161、Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中有更完整的描述。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别地包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，其通过接头L1、L2和L3连接以以下顺序连接：VHA-L1-VLb-L2-VLA、VHA-L1-VL2-L2-VLA、VLA-L1-VL2-L2-LB-L3-L3–VHA、VHb-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，并且VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。
接头L1特别是2-10个氨基酸的肽，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸，并且接头L3特别是1-10个氨基酸的肽，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸。在具体的实施方案中，L1和L3均为GGGGS(SEQ ID NO：16)。中间接头L2特别是10-40个氨基酸的肽，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸。在具体的实施方案中，L2为(GGGGS)4(SEQID NO：15)。
在本发明的一个实施方案中，包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽是WO 2016/0202457中描述的MATCH形式的多特异性和/或多价抗体；Egan T.,等人,mAbs 9(2017)68-84。
本发明的双特异性、双价、多特异性和/或多价构建体可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来生产。(关于双特异性构建体的产生，参见例如Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv Hornig,N.&
Figure BDA0002299451000000311
-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727,和WO 99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括，尤其是，Genmab(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)和Merus(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。产生包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,Methods Enzymol.121(1986)210-228)。
这些方法通常涉及单克隆抗体的产生，例如通过使用杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与已用所需抗原免疫的小鼠脾细胞融合(参见，例如,Yokoyama等人,Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2,Unit 2.5,2006)，或通过重组抗体工程技术(库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如，Chames&Baty,FEMS Microbiol.Letters189(2000)1-8)，以及两种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或其片段或部分的组合以使用已知的分子克隆技术得到双特异性构建体。
在具体的实施方案中，所述多特异性多肽还包含一种或多种多肽接头。
在具体的实施方案中，所述多特异性多肽是单体多肽，特别地，单体多肽，其中根据本发明的抗体或其功能片段是通过接头连接到第二结合结构域的scFv抗体片段，特别地，其中所述第二结合结构域是第二scFv抗体片段。
在具体的实施方案中，所述多特异性多肽是二聚体多肽，特别地，二聚体多肽，其中两个多肽的结合是由所述多特异性多肽中包含的抗体片段的互补VL和VH结构域的结合引起的。在具体的这类实施方案中，所述多特异性多肽是根据WO 2016/202457的教导的多特异性抗体构建体。在具体的其他实施方案中，所述多特异性多肽是单链双功能抗体构建体(scDb)。在具体的其他实施方案中，所述多特异性多肽是Fab-(scFv)n构建体(n是选自1、2、3或4的整数)，其采用由VL-CL和VH-CH1组成的Fab片段的异二聚体组装，其中任一恒定域形成骨架，其中通过柔性接头将一个或多个scFv片段连接至该支架。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的抗体或其功能性片段或本发明的多特异性多肽的药物组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医疗判断范围内，适用于与人或动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，符合合理的收益/风险比。
根据本发明的药物组合物可以进一步常规地包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、补充免疫增强剂(例如佐剂和细胞因子)以及任选地其他治疗剂。所述组合物还可包含抗氧化剂和/或防腐剂。作为抗氧化剂，可以提及硫醇衍生物(例如硫代甘油、半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、胱氨酸、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽)、生育酚、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、亚硫酸盐(例如硫酸钠、亚硫酸氢钠、丙酮亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、甲醛次硫酸钠、硫代硫酸钠)和去甲二氢愈创木酸。合适的防腐剂可以是例如苯酚、氯丁醇、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和氯化十六烷吡啶。
在本文提供的具体实施方案中，所述抗体或其功能片段可通过重组方式分离、制备、表达或产生，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、与重组的组合抗体文库分离的抗体，或通过任何其他方式制备，表达，产生或分离的抗体，所述其他方式涉及例如通过合成产生，编码人免疫球蛋白序列的DNA序列的基因工程，或将编码人免疫球蛋白的序列(例如人免疫球蛋白基因序列)剪接至其他这样的序列。
因此，在第四方面，本发明涉及编码本发明抗体或其功能性片段的核酸序列或核酸序列的集合。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与标准核酸相似的结合特性，并且以类似于标准核苷酸的方式被代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，如下所述，简并的密码子替代可以通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
在第五方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的载体或载体的集合。术语“载体”或“表达载体”是指多核苷酸，最常见的是DNA质粒，其包含编码本发明的抗体或其片段的核苷酸序列以在宿主细胞中，优选在哺乳动物细胞中重组表达。载体可能会或可能不会在细胞中复制。一旦获得了编码本文描述的抗体的可变重链和/或可变轻链或其片段的多核苷酸，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术来生产用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建包含抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
可以通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体或其片段。因此，本发明涉及宿主细胞，特别是表达宿主细胞，其包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合。在某些实施方案中，宿主细胞包含载体，该载体包含编码本发明抗体或其片段的可变重链和可变轻链两者的多核苷酸。在具体的实施方案中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含编码所述抗体的可变重链或其片段的多核苷酸，第二载体包含编码所述抗体的可变轻链或其片段的多核苷酸。在其他实施方案中，第一宿主细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码所述抗体的可变重链或其片段的多核苷酸，第二宿主细胞包含第二载体，所述第二载体包含编码所述抗体的可变轻链或其功能片段的多核苷酸。
人源化兔抗体或啮齿动物抗体的方法是本领域普通技术人员众所周知的(参见，例如，Borras,J Biol Chem.2010Mar 19；285(12):9054-66；Rader等人,The FASEBJournal,express article 10.1096/fj.02-0281fje,published online October 18,2002；Yu等人(2010)A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody InhibitsAngiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models.PLoS ONE 5(2):e9072.doi:10.1371/journal.pone.0009072)。兔或啮齿类动物的免疫可以用例如蛋白质的目的抗原本身来进行，或者在肽或蛋白质抗原的情况下，可以通过用编码目的肽或蛋白质的核酸(例如质粒)对兔的DNA免疫来进行。
在第六方面，本发明涉及宿主细胞，特别是表达宿主细胞，其包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合。
术语“宿主细胞”是指已将表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
在第七方面，本发明涉及用于生产本发明的抗体或其功能性片段的方法，其包含表达本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合，或本发明的宿主细胞，特别是表达宿主细胞的步骤。
在第八方面，本发明涉及产生多特异性构建体的方法，其包含在一个或多个步骤中将编码根据本发明的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸序列克隆到多特异性构建体中的步骤，所述多特异性构建体包含编码至少第二结合结构域或其片段的核酸序列和任选地，编码一个或多个另外的结合结构域或其片段的核酸序列。
在第八方面的具体实施方案中，所述第二结合结构域是第二抗体或其功能性片段。
在具体的实施方案中，存在所述任选的另外的结合结构域中的至少一种，特别是其中所述另外的结合结构域是第三抗体或其功能性片段。
在另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物。
在另一方面，本发明涉及用于药物制造的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物。
在一个方面，本发明涉及在有此需要的受试者中用于治疗癌症、炎性和/或自身免疫性疾病的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物。
在另一方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物在有需要的受试者中治疗癌症、炎性和/或自身免疫性疾病的用途。
在另一方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物在药物制造中的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗癌症、炎性和/或自身免疫性疾病。
在一个方面，本发明涉及在有此需要的受试者中治疗癌症、炎性和/或自身免疫性疾病的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽，或本发明的组合物。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物(例如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡))、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理作用。就部分或完全治愈疾病和/或对疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；(c)减轻疾病，即使疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以实现对疾病的这种治疗的药剂的量。“治疗有效量”将根据待治疗的受试者的药剂、疾病和其严重程度以及年龄、体重等而变化。
炎性和/或自身免疫性疾病可能是类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、系统性红斑狼疮、青少年糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和多发性硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和缺血再灌注损伤。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用，例如，两个术语均涵盖固体和液体，例如扩散或循环的肿瘤。如本文所用，术语“癌”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
待治疗的癌症包括但不限于结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、胰腺癌、B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，其包括成人T细胞淋巴瘤白血病(ATLL)、急性骨髓淋巴瘤(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、小儿急性淋巴母细胞淋巴瘤(B-ALL)、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、T/自然杀伤细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。在具体的实施方案中，所述癌症选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，其例如成人T细胞淋巴瘤白血病(ATLL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、T/自然杀伤细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。
实施例
以下实施例说明了本发明而不限制其范围。
实施例1：选择和人源化
为了产生CD3ε结合结构域的主要候选物(Lead Candidate)，选择了六个兔单克隆抗体克隆。
所选克隆的人源化包括将兔CDR转移到如WO 2014/206561中所述的Vκ1/VH3类型的scFv受体框架上。在该过程中，在供体序列(兔mAb)上鉴定了六个CDR区的氨基酸序列，并将其接枝到受体支架序列中。为了选择，scFv以VL-接头-VH排列构建。一个实施例是蛋白链的N末端至C末端的SEQ ID NO：4、15和8的组合。
最终构建体中还包含了来自兔供体在某些框架位置的其他氨基酸，这些氨基酸可能会影响CDR的定位并因此影响抗原结合(Borras等人,2010；J.Biol.Chem.,285:9054-9066)。表2示出了对克隆28-21-D09所做的更改(根据AHo编号)。这些构建体的表征数据的比较表明了与单独的CDR接枝相比的显著的优势。
一旦前述章节中所述的经计算机模拟的构建体设计完成，就合成相应的基因并构建细菌表达载体。在DNA水平上确定表达构建体的序列，并根据通用表达和纯化方案制备构建体。
蛋白质的异源表达在大肠杆菌中作为不溶性包涵体进行。用成倍增长的起始培养物接种表达培养物。使用可商购的富培养基在轨道摇床中的摇瓶中进行培养。使细胞生长至规定的OD600为2并通过用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)过夜表达诱导。发酵结束时，通过离心收集细胞，并通过超声处理匀浆。此时，通过细胞裂解物的SDS-PAGE分析确定不同构建体的表达水平。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，该离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解在变性缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0、6M Gdn-HCl、2mM EDTA)中，并通过可扩展的重折叠方案将scFv进行重折叠，从而生成毫克量的天然折叠的单体scFv。采用标准化方案纯化scFv，包括以下步骤。重折叠后的产物通过使用Capto L琼脂糖(GE Healthcare)的亲和色谱法捕获，得到纯化的scFv。使用HiLoad Superdex75色谱柱(GE Healthcare)，通过抛光尺寸排阻色谱法进一步纯化在初始测试中符合亲和力和效力标准的主要候选物。纯化方案后，将蛋白质配制成缓冲盐溶液并进行表征。
实施例2：人源化scFv的表征
2.1对人和食蟹猴CD3ε的亲和力
使用T200设备(Biacore，General Electric)通过SPR测量来确定人源化scFv对人和食蟹猴CD3ε的亲和力。使用胺偶联化学方法将CD3ε直接偶联至CM5传感器芯片(Biacore，General Electric)。在执行再生搜寻和表面性能测试以找到最佳测定条件后，测量scFv剂量响应，并将获得的结合曲线进行双标准(空标准通道和零分析物进样)并使用1：1Langmuir模型拟合以恢复动力学参数。该测定在pH 7.4的1X PBS-Tween缓冲液中进行。
SPR实验显示了将来自兔供体IgG的结构残基添加到人源化序列上的效果(参见表3)。仅包含兔CDR的构建体28-21-D09-sc03没有表现出与靶标的可检测结合。在VL的54位处含有精氨酸或赖氨酸的所有克隆均表现出与靶标的某些结合。基于SPR数据，选择来自构建体28-21-D09-sc04的结构域用于scDb形式的进一步体外表征。
2.2热解折叠
基本上如Niesen所述(Niesen等人,Nat Protoc.2(2007)2212-21)，通过差示扫描荧光法(DSF)确定被测构建物热解折叠的转变中点。DSF分析是在qPCR机(例如MX3005p，Agilent Technologies)中进行的。将样品在含有最终浓度为5x SYPRO orange的缓冲液(柠檬酸磷酸盐pH 6.4、0.25M NaCl)中稀释，总体积为25μL。在缓冲液探索实验中，确定了解折叠温度的pH依赖性，并观察了所有构建体的可比较的pH特性。一式三份测量样品，并设定25-96℃的温度梯度。采集荧光信号，并用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)分析原始数据。
如上所述，通过DSF分析所有功能性人源化scFv构建体的热解折叠。虽然所有构建体均显示出高于60℃的解折叠中点(参见表4)，但似乎没有高构象稳定性和高亲和力的相关性(与表3相比)。
2.3储存稳定性
通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)确定每个样品的初始单体含量(d0)。使样品与运行缓冲液(250mM NaCl、50mM NaOAc、pH 6.0)以0.35mL/min的流速通过ShodexTM(Showa Denko)KW402.5-4F色谱柱。通过在280nm处的吸光度检测洗脱的蛋白质。为了计算单体蛋白质的百分比，将在单体保留时间达到峰值的曲线下面积除以不属于样品基质的曲线下总面积。将样品储存在4℃，并在28天的时间内以10mg/mL的浓度重复分析(图1)。
实施例3：单链双功能抗体(scDb)形式的生成
为了表征CD3的功能性结构域，将选定的结构域掺入单链双功能抗体形式，以测试可能诱导T细胞激活和靶细胞耗竭的结构域。
所选择的CD3结构域与IL23R结合结构域(抗IL23R克隆14-11-D07，参见SEQ IDNO：11和12；PRO624，参见SEQ ID NO：26)或HER2结合结构域(曲妥珠单抗，参见SEQ ID NO：20和21；PRO957，参见SEQ ID NO：27)一起被掺入单链双功能抗体形式。除了来自克隆28-21-D09的VL和VH结构域外，还测试了其他两种已发布的CD3结合体(binder)的VL和VH结构域(抗CD3克隆09-24-H09-sc10：参见WO 2014/191113和SEQ ID NOs：9和10；抗CD3克隆I2C：参见US 2010/0150918和SEQ ID NO：13和14)。
如前所述进行单链双功能抗体(scDb)形式的构建体(Holliger等人,“Diabodies”:small bivalent and bispecific antibody fragments.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,6444–6448)。简而言之，以VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA的方式排列表1中列出的可变域(参见表5)，其中L1和L3是短G4S接头(SEQ ID NO：16)并且L2是长(G4S)4接头(SEQ ID NO：15)。
将核苷酸序列重新合成，并克隆到基于pET26b(+)骨架(Novagen)的合适的大肠杆菌载体中。将表达构建体转化到大肠杆菌菌株BL12(DE3)(Novagen)中，并将细胞作为初始培养物在2YT培养基中培养(Sambrook,J.,等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual)。接种表达培养物并在摇瓶中于37℃和200rpm下孵育。一旦达到OD600为1，则通过添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达。过夜表达后，通过以4000g的离心收集细胞。为了制备包涵体，将细胞沉淀在IB重悬缓冲液中重悬(50mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、5mMEDTA、0.5％Triton X-100)。在细胞浆液中添加1mM DTT、0.1mg/mL溶菌酶、10mM亮抑酶肽(Leupeptin)、100μM PMSF和1μM胃酶抑素(Pepstatin)。在冰上冷却的同时，通过3轮超声均质化来裂解细胞。随后加入0.01mg/mL DNAse，并将匀浆在室温下孵育20分钟。通过在15000g和4℃下离心将包涵体(IBs)沉淀。将IB重悬于IB重悬缓冲液中，并在再次离心之前通过超声处理使其均质化。用IB重悬缓冲液总共至少进行了3个洗涤步骤，随后用IB洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、5mM EDTA)洗涤2次，得到最终的IBs。
为了使蛋白质重折叠，将分离的IB以5毫升每g的湿IB的比例重悬于增溶缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0、6M Gdn-HCl、2mM EDTA)中。将溶解物在室温下孵育30分钟，直到加入终浓度为20mM的DTT，然后继续孵育30分钟。增溶完成后，通过在21500g和4℃下离心10分钟来澄清溶液。在重折叠缓冲液(通常为：100mM Tris-HCl pH 8.0、5.0M尿素、5mM半胱氨酸、1mM胱氨酸)中通过最终蛋白浓度为0.3g/L的增溶蛋白的快速稀释进行重折叠。将重折叠反应常规孵育至少14小时。通过在8500g和4℃下离心10分钟来澄清所得的蛋白质溶液。通过Capto L树脂(GE Healthcare)上的亲和层析纯化重折叠的蛋白质。分离的单体部分通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE以分析纯度并通过UV/Vis光谱以分析蛋白质含量。通过透析将缓冲液交换成天然缓冲液(50mM柠檬酸-磷酸盐pH 6.4、200mM NaCl)。将蛋白质浓度调整至稳定性分析的预期值。
实施例4：单链双功能抗体(scDb)构建体的功能性表征
4.1通过NFAT报告基因检测法激活T细胞
在NFAT测定中测试了T细胞激活。Jurkat NFAT报告T细胞系在来自IL-2启动子的NFAT(激活T细胞的核因子)响应元件(GloResponseTMNFAT-luc2 Jurkat细胞)的控制下表达荧光素酶报告基因。转录因子NFAT在CD3ε交联时被激活，并诱导许多参与T细胞激活的基因。在该系统中，CD3ε的交联诱导萤光素酶报告基因的表达。表达中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞的转基因IL-23R-(图2至7)或HER2-(图8至9)被用作靶细胞，并且亲本CHO-K1细胞系被用作阴性对照细胞系。将在50μl测定培养基(RPMI 1640，10％FCS)中稀释的25000个活靶细胞在白色平底96孔板中铺板。然后，将25μl在测定培养基中稀释的4倍浓缩的测试蛋白质添加到适当的孔中。最后，将25μl含有50000个Jurkat细胞的测定培养基添加到每个孔中，首先将板在室温下轻轻搅拌孵育10分钟，然后转移到37℃，5％CO2中5小时。为了检测荧光素酶的活性，根据制造商的说明使用了一步荧光素酶测定试剂盒(Amsbio)。简而言之，在孵育时间结束时，将荧光素酶试剂底物与荧光素酶试剂缓冲液混合，并向每个孔中加入50μl，并将板在黑暗中于室温孵育15分钟。用Flexstation III多模式酶标仪(Molecular Devices)读板。
4.2细胞毒素测定(T细胞驱动的靶细胞耗竭)
血细胞分级：
根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基Lymphoprep(StemcellTechnologies)从健康志愿者或健康食蟹猴的新鲜血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)。简而言之，将血液用人PBMC分离缓冲液(PBS、2％FCS、2mM EDTA)或食蟹猴PBMC分离缓冲液(PBS、5％FCS、2mM EDTA)以1：2稀释，并加到含有推荐量的Lymphoprep培养基的Leucosep管中。在室温下将LeucoSep管在800g(人血)或2000g(食蟹猴血)下不间断离心30分钟。然后，收集含有PBMC的细胞层，并用人或食蟹猴PBMCs分离缓冲液洗涤两次，并在室温下使用红细胞裂解缓冲液将红细胞裂解5分钟。然后将分离的人和食蟹猴细胞用其各自的分离缓冲液洗涤一次，并用测定培养基(RPMI-1640，10％FCS)洗涤一次。除去血小板后，将分离的PBMC以每毫升3x106个活细胞的密度重悬于测定培养基中。
基于流式细胞仪的体外细胞毒性测定(FC测定)和CD8+T细胞激活：
对于抗IL23RxCD3ε双特异性构建体，将表达转基因IL-23R的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞用作靶细胞，并将亲本CHO-K1细胞系用作阴性对照细胞系(图2至7)。对于抗HER2x抗CD3ε双特异性构建体，使用表达转基因HER2的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞(图8至9)。将5000个事先用PKH67标记并在75μl测定培养基(RPMI-1640，10％FCS)中稀释的活靶细胞添加到96孔板中。然后，将25μl在测定培养基中稀释的6倍浓缩的测试蛋白质添加到适当的孔中。然后，为了使E：T比率为30：1，将在50μl测定培养基中稀释的150000个活效应细胞(PBMC)添加到每个孔中，并在室温下在章动混合器(nutating mixer)上对板混合，然后在37℃、5％CO2下孵育。16小时后，用胰蛋白酶消化细胞，将其重悬于染色缓冲液(PBS，2％BCS，2mM EDTA)中并转移至非结合板中。
将细胞染色以用于不同标记如CD69、CD8、CD4、CD11c和膜联蛋白-V(Annexin-V)。对于分析，重点是凋亡和死亡的靶细胞以及激活的CD8+T细胞。从而，通过绿色荧光(PKH67)鉴定靶细胞，并通过膜联蛋白-V APC分析其生存能力。通过检测其表面的CD8(抗CD8PerCP-Cy5.5)来鉴定效应细胞(CD8+细胞)。最后，通过定量CD69表达(抗CD69 PE)来检测CD8+T细胞的激活。CD4被用于更好地区分CD8+和CD4+T细胞。CD11c用于标记单核细胞和树突细胞并排除它们。对于每种标记物，除膜联蛋白-V抗体外，在室温下轻轻搅拌孵育30分钟。用染色缓冲液洗涤细胞一次，用膜联蛋白结合缓冲液洗涤一次，并且在搅拌下在室温下将膜联蛋白-V染色进行30分钟。用膜联蛋白-V结合缓冲液洗涤细胞一次，并在Novocyte流式细胞仪上进行流式细胞术分析。
根据以下公式计算特定靶细胞裂解的百分比：
Figure BDA0002299451000000431
激活的CD8+T细胞的百分比与CD69+CD8+T细胞的比例相对应。
结果
T细胞激活特异性的比较
由PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)和PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)介导的靶表达细胞的特异性靶细胞裂解的比较显示出相似的效力，其中EC50分别为5.3和3.3pM(见图2)。对于这两种蛋白质，可达到的最大裂解水平也相同。但是，与抗原阴性细胞联合使用时，在较高的分子浓度会出现差异，其中PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)会导致阴性对照细胞的部分耗竭(图2)。通过流式细胞术(FC)在细胞毒性测定的孔中对效应细胞的激活进行的定量与特异性裂解的结果相符。对于包括靶阳性细胞的情况，还观察到了效应细胞激活的剂量反应。这些结果揭示了效应细胞激活的相似EC50，而PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)显然达到了较低的平台以实现最大响应(见图3)。对于具有靶阴性细胞的孔，非特异性激活的EC50的明显差异区分了这两种分子。即使在没有靶标的情况下，两种分子的较高浓度的施用也会导致激活细胞的增加(图3)。但是，在分子PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)的浓度降低约25倍时观察到了这种效果。因此，这些数据证明，在与使用相同形式和靶结合结构域的PRO460的抗CD3结构域(IL23RxCD3I2C Amgen)的头对头比较中，PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)显示出更特异的T细胞激活。
在使用人PBMC进行的细胞毒性试验中，比较了PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)和PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)中抗CD3结构域的特异性靶细胞耗竭。关于靶阳性细胞的靶细胞耗竭和靶阴性细胞的靶细胞耗竭缺乏，两种scDb显示出几乎相同的性质(参见图4)。通过流式细胞术(FC)在细胞毒性测定的孔中对效应细胞的激活进行的定量与特异性裂解的结果相符。对于包括靶阳性细胞的情况，还观察到了效应细胞激活的剂量反应，其中两种分子均导致相似的反应。在含有靶阴性细胞的情况下，仅在最高测试条件下才能观察到激活的效应细胞的增加(参见图5)。
在一项验证性实验中，使用NFAT报告基因测定检测了分子PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)对T细胞激活的效力。在实验中，证实了在抗原阳性细胞存在下诱导T细胞激活的效力几乎相同(参见图6)。与细胞裂解相比，对于较高的浓度，EC50偏移了约8倍(参见图4)，该数据与来自同一实验的激活数据相符(参见图5)，该激活数据也显示出明显的5倍的较高的EC50。与抗原阴性细胞结合时，两种分子均仅在50nM的最高测试浓度显示超过基线的激活信号增加。
总之，以上结果表明，就诱导靶细胞耗竭和T细胞激活两者的体外效力和特异性而言，掺入PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)的抗CD3结构域表现相同。相比之下，尽管PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)的抗CD3结构域在相同的分子背景下显示出在靶细胞存在下激活T细胞并介导其特异性耗竭的可比较的效力，但PRO460(IL23RxCD3I2C Amgen)也显示出在没有靶细胞的情况下的T细胞的激活增加，其甚至导致靶阴性细胞的细胞裂解。
另外，进行了由PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)介导的HER2靶表达细胞的特异性靶细胞裂解的比较。由PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)介导的HER2表达靶细胞的特异性靶细胞裂解的比较显示，16小时后，PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)的效力大约提高10倍，而40小时后，其效力提高了大约3-4倍(见图8A和8B)。40小时后，两种分子均达到靶细胞特异性裂解的相同水平。通过流式细胞术(FC)在细胞毒性测定的孔中对效应细胞的激活进行的定量与特异性裂解的结果相符。对于包括靶阳性细胞的情况，还观察到了效应细胞激活的剂量反应。这些结果揭示了PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)效应细胞激活的相似的EC50。但是，对于具有靶阴性细胞的孔，非特异性激活的EC50的明显差异区分了PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)和PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)。即使在没有靶标的情况下，两种分子的较高浓度的施用也会导致激活细胞的增加。但是，在分子PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)的浓度降低约25倍时观察到了这种效果(见图9A和9B)。此外，当将抗CD3结构域与抗HER2结合结构域结合测试时，与PRO956(HER2xCD3I2C Amgen)相比，PRO957(HER2xCD32nd gen Numab)对诱导靶细胞耗竭和T细胞激活两者的均表现出优异的效力和特异性。
4.3PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PRO 389(IL23RxCD31st gen Numab)对食蟹猴的交叉反应性
抗CD3ε结合结构域I2C(US 2010/0150918)的一个重要特征是与人和非黑猩猩灵长类动物的跨物种反应性，这在衍生疗法的临床前开发中具有优势。掺入PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)和PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)的抗CD3ε域均在SPR测量中与重组人和食蟹猴CD3ε结合(表3和WO 2014/191113)。然而，掺入PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)中的克隆09-24-H09的结构域的反应性在血浆膜结合的CD3ε的细胞环境中没有得到维持。相反，从存在于PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)中的克隆28-21-D09衍生的结构域在细胞测定中也显示出保守的物种反应性。这些差异特征已通过使用食蟹猴PBMC作为效应细胞的细胞毒素测定进行了表征。
以食蟹猴PBMC进行的细胞毒素测定的数据(见图7)显示，与使用人效应细胞相比，PRO624(IL23RxCD32nd gen Numab)具有诱导特异性靶细胞耗竭的类似功效(参见图4)。另外，在靶阴性细胞的情况下，也没有观察到细胞的非特异性裂解。另一方面，对PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)的分析显示，靶细胞没有被食蟹猴效应细胞耗竭。结构域的进一步表征表明，PRO389(IL23RxCD31st gen Numab)与食蟹猴CD3ε表达细胞不存在细胞结合。
总之，09-24-H09结构域没有对人和非黑猩猩的灵长类动物显示出相关的跨物种反应性，这令人惊讶的发现导致只有结构域28-21-D09同时提供两者，即与现有技术水平相比，特异性方面的优势以及跨物种反应性的所需特征。
Figure BDA0002299451000000481
Figure BDA0002299451000000491
Figure BDA0002299451000000501
Figure BDA0002299451000000511
Figure BDA0002299451000000521
表3：通过SPR测定的人和食蟹猴CD3ε的抗CD3 scFv的亲和力数据
Figure BDA0002299451000000531
表4：各种αCD3scFv构建体的热解折叠数据
Figure BDA0002299451000000541
表5：抗CD3/抗IL23R双功能抗体和抗CD3/抗HER2双功能抗体构建体
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本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，本发明除了本文描述的那些之外的各种修改对于本领域技术人员根据前述描述是显而易见的。这样的修改意图包括在所附权利要求的范围内。
在各自的专利法可能的程度内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用并入本文。
序列表
<110> 努玛治疗有限公司
<120> 新型抗CD3抗体
<130> 114035P877PC
<150> US 62/515,293
<151> 2017-06-05
<150> EP17203832.5
<151> 2017-11-27
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<223> 人工双链抗体序列
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130 135 140
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
180 185 190
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
210 215 220
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser
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Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
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Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser
465 470 475 480
Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
485 490 495
Ser
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<211> 491
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<220>
<223> 人工双链抗体序列
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130 135 140
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
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Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
260 265 270
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275 280 285
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<211> 253
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<220>
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<211> 253
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工scFv序列
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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<211> 253
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<213> 人工序列
<220>
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<223> 人工scFv序列
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<211> 253
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工scFv序列
<400> 38
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<210> 39
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<220>
<223> 人工scFv序列
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 40
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工scFv序列
<400> 40
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
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Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
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Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
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225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 41
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工scFv序列
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Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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245 250
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<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工scFv序列
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg
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Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250

Claims (15)

1.一种抗体或其功能性片段，其对人CD3特异，其包括：
(a)可变轻链，
其中所述可变轻链从N末端到C末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，每个LCDR表示轻链互补决定区，其中所述LCDR1如SEQID NO：1所示；所述LCDR2如SEQ ID NO：2所示；以及所述LCDR3如SEQ ID NO：3所示；和
(b)可变重链，
其中所述可变重链从N末端到C末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，每个HCDR表示重链互补决定区，其中所述HCDR1如SEQID NO：5所示；所述HCDR2如SEQ ID NO：6所示；以及所述HCDR3如SEQ ID No：7所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变轻链是Vκ1轻链，和/或其中所述可变重链是VH3链。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变轻链与根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或，其中所述可变重链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变轻链在轻链氨基酸根据AHo编号的位置54处包含精氨酸或赖氨酸，优选精氨酸。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变轻链包含SEQID NO：4的氨基酸序列，并且所述可变重链包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段由以下参数中的一个或多个表征：
(i)与人CD3结合的KD值小于40nM，特别地小于10nM，更特别地小于6nM，特别是如通过表面等离子体共振所测量得；
(ii)与人CD3结合的KD值小于20nM，特别地小于10nM，更特别地小于5nM，特别是如通过表面等离子体共振所测量的；和
(iii)当以scFv抗体形式表达时，尤其是通过差示扫描荧光法测定时，热解折叠温度(Tm)的平均中点超过至少60℃，特别是至少65℃，更特别是至少68℃。
7.一种多特异性多肽，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段或者根据权利要求7所述的多特异性多肽，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.用作药物的根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段或根据权利要求7所述的多特异性多肽或根据权利要求8所述组合物。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段或根据权利要求7所述的多特异性多肽或根据权利要求8所述组合物在制备药物中的用途。
11.核酸序列或核酸序列的集合，其编码根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段。
12.载体或载体的集合，其包含根据权利要求11所述的核酸序列或核酸序列的集合。
13.一种用于生产根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括表达根据权利要求11所述的核酸序列或核酸序列的集合，或根据权利要求12所述的载体或载体的集合的步骤。
14.一种生成多特异性构建体的方法，其包括以下步骤：
(a)在一个或多个步骤中，将编码根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸序列克隆到多特异性构建体中，所述多特异性构建体包含编码至少第二结合结构域或其片段的核酸序列，并任选地包含编码一个或多个另外的结合结构域或其片段的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二结合结构域是第二抗体或其功能性片段。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036326A1 (zh) * 2021-09-13 2023-03-16 江苏先声药业有限公司 抗人cd3抗体及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018224443A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Numab Innovation Ag Hetero-dimeric multi-specific antibody format targeting at least cd3 and hsa
CA3064163A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Numab Therapeutics AG Novel anti-cd3 antibodies
WO2023061419A1 (en) * 2021-10-12 2023-04-20 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Anti-cd3 antibodies with cross-reactivity to human and cynomolgus proteins
WO2023169419A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. Novel anti-cd3 antibodies and uses thereof
CN115286715B (zh) * 2022-05-18 2023-05-23 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗cd3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法
CN116284391B (zh) * 2022-11-16 2023-08-08 艾可泰科(浙江)控股有限公司 使用胰岛干细胞和抗体治疗糖尿病

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016014974A2 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
CN110719918A (zh) * 2017-06-05 2020-01-21 努玛治疗有限公司 靶向至少cd3和hsa的异源二聚体多特异性抗体形式
WO2021239987A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
CN114981306A (zh) * 2019-11-04 2022-08-30 努玛治疗有限公司 多特异性抗体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120034228A1 (en) 2008-10-01 2012-02-09 Micromet Ag CROSS-SPECIES-SPECIFIC PSCAxCD3, CD19xCD3, C-METxCD3, ENDOSIALINxCD3, EPCAMxCD3, IGF-1RxCD3 OR FAPALPHAxCD3 BISPECIFIC SINGLE CHAIN ANTIBODY
JP2014514314A (ja) 2011-04-20 2014-06-19 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２およびｃｄ３に対する二重特異性抗体
BR112016009919A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma
AU2015266077A1 (en) 2014-05-28 2016-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to human and cynomolgus CD3 epsilon
EP2982693A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-10 Affimed Therapeutics AG CD3 binding domain
MA40894A (fr) 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
WO2016184570A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Numab Ag Novel treatment methods based on multifunctional molecules
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
CA3064163A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Numab Therapeutics AG Novel anti-cd3 antibodies
BR112022024161A2 (pt) * 2020-05-29 2023-02-07 Numab Therapeutics AG Anticorpo multiespecífico, sequência de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo multiespecífico e composição farmacêutica

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016014974A2 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
CN110719918A (zh) * 2017-06-05 2020-01-21 努玛治疗有限公司 靶向至少cd3和hsa的异源二聚体多特异性抗体形式
CN114981306A (zh) * 2019-11-04 2022-08-30 努玛治疗有限公司 多特异性抗体
WO2021239987A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICOLA BORTOLETTO1: "Optimizing anti-CD3 affinity for effective T cell targeting against tumor cells" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036326A1 (zh) * 2021-09-13 2023-03-16 江苏先声药业有限公司 抗人cd3抗体及其应用

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