CN114981306A - 多特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多特异性抗体，其包括至少一个以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的结构域，和至少一个特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的结构域，和药物组合物及其使用方法。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞以及生产所述多特异性抗体的方法。

Description

多特异性抗体
技术领域
本发明涉及一种多特异性抗体，其包括至少一个以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的结构域，至少一个特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的结构域，和任选地，至少一个特异性结合免疫细胞抗原的结构域。此外，本发明涉及用于所述多特异性抗体的特异性结构域，及其药物组合物和使用方法。本发明还涉及编码所述多特异性抗体或其特异性结构域的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞以及生产所述多特异性抗体或其特异性结构域的方法。
背景技术
尽管在治疗方面取得了相当大的进展，但癌症仍然是一个尚未得到满足的主要医疗需求。近年来，随着各种分子类型的免疫疗法的出现，在癌症治疗中取得了一些最实质性的进展，包括但不限于：单克隆抗体(mAb)、双特异性抗体(bsAb)、重组蛋白和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法。这种疗法通过以下方式诱导抗肿瘤免疫：a)主动将免疫效应细胞导向肿瘤驻留细胞和/或b)刺激免疫效应细胞和/或c)解除肿瘤介导的免疫抑制。这些免疫疗法通常利用肿瘤驻留细胞(例如，恶性细胞、肿瘤脉管系统细胞、基质细胞、免疫细胞等)的特异性抗原的过表达(与肿瘤外位点相比)，将它们的药理活性靶向肿瘤。在这些抗原中，肿瘤相关抗原(TAA)包含恶性细胞选择性过表达的细胞表面蛋白。通过以高亲和力结合TAA，免疫疗法可以在一定程度上将其免疫调节活性限制在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间的免疫突触。
一类常见的TAA结合免疫疗法是mAb，其通过调理肿瘤细胞并通过表达Fcγ受体(FcγR)的细胞(主要是自然杀伤(NK)细胞)触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来引发抗肿瘤免疫。其他TAA结合免疫疗法利用细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来诱导恶性细胞的靶向清除，例如CAR-T细胞以及同时与T细胞抗原CD3结合的bsAb(TAA/CD3 bsAb)。虽然TAA-(再)导向的CTL的治疗效用已经得到临床验证，但是当肿瘤介导的免疫抑制损害了CTL的活化/刺激时，这种效用可能受到限制。即使在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)丰富的肿瘤中(即“炎症”或“热”肿瘤)，肿瘤免疫逃逸也可以通过多种方式诱导，例如通过免疫检查点配体/受体(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4)的表达以及调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的募集。
免疫检查点是免疫系统的调节器，并参与自身耐受或癌症中的免疫抑制等过程。
PD-L1(CD274，B7-H1)是40kDa的I型跨膜蛋白。PD-L1是PD-1的表面糖蛋白配体，PD-1是由活化的T细胞和B细胞表达的关键免疫检查点受体，并介导免疫抑制。PD-L1与慢性感染、妊娠、组织同种异体移植、自身免疫性疾病和癌症期间的免疫系统反应的抑制有关。在抗原呈递细胞和人类癌细胞，例如头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、和脑瘤、甲状腺、胸腺、食道、肺、乳腺、胃肠道、结肠直肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺皮质、膀胱、尿路上皮、卵巢和皮肤上，都发现了PD-L1(Katsuya Y等人,Lung Cancer.88(2):154–159(2015)；Nakanishi J等人,Cancer Immunol Immunother.56(8):1173–1182(2007)；Nomi T等人,Clin CancerRes.13(7):2151–2157(2007)；Fay AP等人,J Immunother Cancer.3:3(2015)；Strome SE等人,Cancer Res.63(19):6501–6505(2003)；Jacobs JF等人Neuro Oncol.11(4):394–402(2009)；Wilmotte R等人Neuroreport.16(10):1081–1085(2005))。PD-L1在正常组织中很少表达，但在肿瘤部位可诱导表达(Dong H等人,Nat Med.8(8):793–800(2002)；Wang等人,Onco Targets Ther.9:5023–5039(2016))。PD-L1通过与PD-1结合而下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等人,2000；Latchman等人,2001)。由PD-L1激活的PD-1可能为肿瘤的发展和生长提供免疫耐受的环境。PD-L1还通过与另一种受体B7.1(B7-1，CD80)相互作用来负调节T细胞功能。
PD-L1/PD-1相互作用的抑制能够提供有效的抗肿瘤活性。许多破坏PD-1信号传导的抗体已进入临床开发阶段。这些抗体属于以下两个主要类别：靶向PD-1的抗体(纳武单抗(nivolumab)，Bristol-Myers Squibb；派姆单抗(pembrolizumab)，Merck，WhitehouseStation，NJ；匹地利珠单抗(pidilizumab)，CureTech，Yavne，Israel)和靶向PD-L1的抗体(MPDL3280A，Genentech，South San Francisco，CA；MEDI4736，MedImmune/AstraZeneca；BMS-936559，Bristol-Myers Squibb；MSB0010718C，EMD Serono，Rockland，MA)(参见Postow MA等人,J Clin Oncol.Jun 10；33(17):1974-82(2015))。靶向PD-L1与靶向PD-1相比可能导致不同的生物学效应。PD-1抗体可防止PD-1与它的两个配体PD-L1和PD-L2相互作用。尽管PD-1与PDL2相互作用的影响仍然未知，但PD-L1抗体不会阻止PD-1与PDL2相互作用。然而，PD-L1抗体不仅会阻止PD-L1与PD-1的相互作用，还会阻止与B7-1的相互作用(Butte MJ等人,Immunity 27:111-122,(2007))，这被认为会对T细胞产生负信号。阻断PD-L1已显示出了有前景的早期数据，目前正在测试四种临床抗PD-L1 mAb：阿替利珠单抗(atezolizumab)和MEDI4736(均为人IgG1的Fc空变体)、MSB001078C(IgG1)和BMS-936559(IgG4)(Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。
新兴的治疗经常将TAA靶向免疫疗法与一种或多种靶向免疫检查点途径的额外免疫疗法相结合，以进一步缓解或克服肿瘤介导的免疫抑制。阻断免疫抑制性抗原的单克隆抗体，如阻断CTLA-4(如伊匹单抗(ipiliumumab))、PD-1(如纳武单抗、派姆单抗)和PD-L1(如阿维单抗(avelumab)、阿替利珠单抗)，在表现出各种肿瘤组织学的患者中引起了令人印象深刻的应答率。免疫检查点调节剂和TAA结合免疫疗法联合治疗的初步结果令人鼓舞。例如，HER2靶向mAb曲妥珠单抗(trastuzumab)(
Figure BDA0003720714700000031
Genentech)目前正在与纳武单抗(
Figure BDA0003720714700000032
Bristol-Myers Squibb)以及纳武单抗和伊匹单抗(
Figure BDA0003720714700000033
Bristol-Myers Squibb)联合进行临床评估(II期)，国家临床试验(NCT)03409848。同样，CD19/CD3bsAb blinatumomab(
Figure BDA0003720714700000041
Amgen)目前正在与派姆单抗(
Figure BDA0003720714700000042
Merck)联合进行临床评估(I/II期)，并作为三联免疫治疗组合的一部分，与纳武单抗和伊匹单抗进行I期试验，分别是NCT 03512405和NCT02879695。
此外，已经评估了靶向免疫检查点和T细胞共刺激受体的组合。在ID-8卵巢腺癌模型中，抗PD-L1和抗CD137抗体的组合提高了总体存活率并增强了T细胞效应子功能(Duraiswamy J,等人,Cancer Res 73:6900–6912(2013))。乌瑞芦单抗(urelumab)(抗CD137)与纳武单抗(抗PD-1)的组合在实体瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤中的测试正处于I/II期试验(NCT02253992)，而PF-05082566(抗CD137)与派姆单抗(抗PD-1)在实体瘤患者中的测试正处于Ib期试验(NCT02179918)(Chester C.,等人,Cancer Immunol ImmunotherOct；65(10):1243-8(2016))。
最近，已经在体外评估了结合PD-L1和CD137的多价和多特异性融合多肽对T细胞活化和增殖的影响。使用实现未成熟DC和供体匹配的T细胞的自体体外共培养系统，已证明，与单特异性PD-L1 sd-Ab-Fc融合蛋白、CD137 sdAb-Fc融合蛋白、两者的组合、抗PD-L1抗体阿替利珠单抗、抗CD137抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)或抗PD-L1抗体派姆单抗(prembrolizumab)及其组合相比，INBRX-105(一种具有两个PD-L1结合结构域、两个CD137结合结构域和一个Fc区的多特异性多价多肽)在诱导IFN-γ产生、诱导INFγ或介导CD8+ T细胞增殖和活化方面表现更优异(WO 2017/123650)。另外，WO 2016/149201公开了针对PD-L1的某些抗体，并提出生成进一步包含T细胞参与抗体(T-cell engagingantibody)的双特异性抗体构建体，其中CD137包含在20多种潜在T细胞靶标的非排他性列表中。
虽然免疫疗法组合已证明了其通过相加或协同活性增强抗肿瘤反应的潜力，但其受到两个一直存在的限制的困扰：1)由于在各种患者组群中调整多组分疗法的剂量的复杂性导致的临床开发困难，以及2)依赖于两种或多种单独的组分疗法制造工艺，伴随着高商品销售成本(COGS)和治疗定价的影响。当联合疗法中包含的免疫疗法数量增加时，这些限制甚至更加严重。此外，即使对于仅包括单一免疫疗法的治疗方案，剂量限制性毒性(DLT)也经常妨碍以最大有效剂量(MED)给药或导致治疗中断，从而导致有限的疗效。不幸的是，与它们的抗肿瘤活性相似，联合疗法中各组分免疫疗法引起的药物相关毒性也往往是相加的或协同的。
因此，尽管通过抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用提供了有前景的机会，但上述应用经常导致由抗PD-L1抗体与非靶细胞上表达的PD-L1的结合引起的毒性(综述见Wang等人，Cancer J.24(2018)36-40)。
此类DLT产生的确切途径可有所不同，但通常可通过增强药理学活性的肿瘤定位来最小化或消除免疫疗法相关毒性的风险。免疫疗法的肿瘤外活性导致健康组织中促炎细胞因子的分泌，这可导致不良的安全性。利用需要结合TAA的T细胞参与bsAb(T cell-engaging bsAb)来引发免疫调节活性是限制这种细胞因子释放到肿瘤驻留细胞和T细胞之间的溶细胞/免疫突触的有前途的策略。然而，常规的TAA/CD3 bsAb通常也与毒性相关，例如细胞因子释放综合征(CRS)，推测是由于抗CD3结构域的过度活性。此外，尽管TAA/CD3bsAb能有效地耗尽TAA过表达细胞，但它们是通过募集和刺激CTL来做到这一点的，无论这些细胞是否表达识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCR)(即肿瘤反应性T细胞)。因此，TAA/CD3bsAb不是刺激或重新激活宿主的天然抗肿瘤免疫，而是不加选择地刺激CTL，潜在地造成安全风险并导致抗癌免疫记忆形成不足。
除CD3外，T细胞共刺激受体(例如，4-1BB、OX40、ICOS、GITR)目前正作为癌症中T细胞治疗刺激的靶标进行临床评估。通过这种靶点进行的抗肿瘤T细胞刺激的一个公认的优点是它们在TCR信号传导时瞬时表达。因此，它们的表达在炎症TME中倾向于选择性增强，特别是在肿瘤反应性T细胞上，其TCR由于与恶性细胞和抗原呈递细胞(APC)表达的主要组织相容性复合物(MHC)的大量相互作用而受到持续刺激。因此，与CD3靶向方法相比，用例如mAb和bsAb靶向共刺激受体应更选择性地刺激和扩增预先存在的抗肿瘤T细胞，从而潜在地使这种生物制剂更安全且其效果更持久。
在共刺激受体中，4-1BB(CD137，TNF-受体超家族9，TNFRSF9)因其表达谱及其作为抗肿瘤免疫的多能调节子的作用而显得特别有前途(Bartkowiak and Curran 2015；Yonezawa et al.2015)。4-1BB是一种可诱导的T细胞共刺激受体。其表达是激活依赖性的，并且涵盖了广泛的免疫细胞子集，包括活化的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK和NKT细胞、Tregs、树突细胞(DC)(包括滤泡DC)、刺激后的肥大细胞、分化髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(Wang等人,Immunol Rev.229(1):192-215(2009))和活化的B细胞(Zhang等人,J Immunol.184(2):787-795(2010))。另外，还在肿瘤脉管系统(Broil K等人,Am J Clin Pathol.115(4):543-549(2001)；Seaman等人,Cancer Cell 11(6):539-554(2007))和动脉粥样硬化内皮细胞(Olofsson等人,Circulation 117(10):1292 1301(2008))上证明了4-1BB表达。
4-1BB共同刺激T细胞以执行效应子功能，例如根除已建立的肿瘤、扩大原发性CD8+ T细胞应答和增加抗原特异性CD8+ T细胞的记忆库。小鼠体内功效研究表明，4-1BB激动性mAb作为单一疗法和联合方案的一部分给药时，在多种肿瘤模型中导致抗肿瘤保护性T细胞记忆反应和肿瘤消退。此外，目前临床上有两种4-1BB激动性单克隆抗体：乌瑞芦单抗(Bristol-Myers Squibb)，其是一种完全人源化的IgG4 mAb，和乌托鲁单抗(PF-05082566，Pfizer)，其是一种全人IgG2 mAb(Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(101243-8(2016))。尽管利用4-1BB激动性mAb是一种非常有前途的治疗策略，但迄今为止收集的临床数据表明，基于mAb的4-1BB刺激方法会导致疗效和安全性之间的权衡。也就是说，高活性的4-1BB激动性mAb引发削弱治疗效果的DLT，而低活性的4-1BB激动性mAb耐受性良好，但似乎不是非常有效，包括在其预测的MED。
高活性的4-1BB激动性mAb会导致免疫系统和器官功能的改变，增加毒性风险。据报道，在幼稚小鼠和荷瘤小鼠中高剂量的这种mAb可诱导T细胞向肝细胞浸润以及天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶升高，这符合肝脏炎症(Niu L等人J Immunol 178(7):4194–4213(2007)；Dubrot J等人,Int J Cancer 128(1):105–118(2011))。4-1BB激动性mAb的人类治疗用途的初步临床研究还证明了肝酶的升高和肝炎发病率的增加(Sznol M.等人,J ClinOncol 26(115S):3007(2008)；Ascierto PA等人,Semin Oncol 37(5):508–516(2010)；Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。在先前治疗过的III/IV期黑色素瘤的Bristol-Myers Squibb(BMS)II期抗CD137研究(国家临床试验(NCT)00612664)中，观察到了潜在的致命性肝炎。该研究及其他一些研究(NCT00803374、NCT00309023、NCT00461110、NCT00351325)因不良事件而终止(Chester C.等人,CancerImmunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。此类不良事件很可能是由于T细胞的全身过度刺激所致。
类似于TAA/CD3 bsAb，TAA/4-1BB bsAb经设计以在肿瘤常驻细胞与免疫效应细胞之间的免疫突触的背景下选择性地激动4-1BB，从而防止与肿瘤外T细胞刺激相关的毒性。例如，由Aptevo Therapeutics和Alligator Biosciences(WO2017182672 A1)共同开发的5T4/4-1BB bsAb(APV-527)被设计成通过锚定到5T4(一种由多种实体肿瘤表达的TAA)来引发T细胞的靶向共刺激。APV-527临床前数据表明，在5T4存在下有条件地刺激4-1BB有效地实现了肿瘤定位T细胞共刺激，导致TME中T细胞活化的显著增强，并抑制5T4+肿瘤模型中的肿瘤生长。这种相同的肿瘤定位策略可以利用多种临床验证的TAA，对这些TAA来说，靶向治疗已经被证明是有效和安全的。
HER2已被确立为可有效且安全地靶向以治疗HER2+癌症的TAA。批准用于HER2+肿瘤患者的最著名的HER2靶向治疗是mAb曲妥珠单抗(
Figure BDA0003720714700000071
Genentech)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(
Figure BDA0003720714700000072
Genentech)。虽然曲妥珠单抗和帕妥珠单抗在一定程度上通过调理HER2+细胞和触发ADCC而起作用，但这两种抗体在阻止促增殖HER2信号传导的方式上是不同的。在曲妥珠单抗的情况下，与其表位的结合阻止HER2同源二聚化，从而抑制HER2信号传导。然而，在一部分患者中，HER3的代偿性过表达和HER2/HER3异二聚体的形成导致信号增强，使这些患者对曲妥珠单抗治疗难以控制。相比之下，帕妥珠单抗与表位结合，阻止HER2/HER3异二聚化，同样抑制促增殖信号传导。由于这种作用机制(MoA)的互补性，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗具有协同作用，它们的组合已被批准用于治疗HER2+乳腺癌。
虽然联合抑制HER2信号传导和ADCC介导的HER2+细胞耗竭对许多患者有效，但许多其他患者表现出的HER2+肿瘤表型对常规抗体治疗反应非常微弱。在某些情况下，这是因为特定的HER2+肿瘤不依赖HER2信号进行增殖，使得曲妥珠单抗/帕妥珠单抗的主要MoA无效。这产生了一种假说，即比ADCC更有效的靶向细胞毒性方法可能具有相当大的益处。随着ADC曲妥珠单抗-emtansine(
Figure BDA0003720714700000081
Genentech)的上市批准，这一概念的验证有所显现。同样，多家公司目前正在开发HER2/CD3 bsAb，以刺激重定向的T细胞以诱导有效的靶向细胞毒性。此外，在一些对HER2靶向mAb表现出原发性或继发性无反应性的患者中，HER2+肿瘤表型包括主动抑制抗肿瘤免疫反应的配体/受体(例如PD-L1)的表达增强。可以预见的是，这导致了HER2靶向mAb与免疫检查点调节性mAb的结合，并在临床上取得了一些成功。几乎只在癌细胞上表达的TAA，如癌胚瘤抗原，被称为纯净TAA(clean TAA)。也在正常的非癌细胞上表达——通常与癌细胞相比水平较低——的TAA是非纯净TAA。由于TAA/CD3 bsAb方法的非常高的效力，非纯净TAA是一个挑战，因为它们导致也表达TAA的非肿瘤细胞的消耗。一个众所周知的非纯净TAA的实例是HER2，它不仅在肿瘤细胞上表达，而且以较低的水平在各种其他组织中表达。因此，需要提高TAA/CD3 bsAb方法对肿瘤组织的选择性的新疗法。
也有先例使用HER2作为靶点，通过双特异性分子进行肿瘤定位4-1BB刺激。PierisPharmaceuticals已经开始进行临床试验，以评估HER2/4-1BB双特异性融合蛋白(PRS-343)(NCT03330561)。PRS-343包含融合到二价4-1BB-结合anticalin的曲妥珠单抗的IgG4变体。临床前和临床证据支持：1)PD-(L)1阻断和4-1BB刺激的潜在益处，2)联合HER2靶向免疫疗法和PD-(L)1阻断免疫疗法的益处，和3)曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的协同作用，表明在单一治疗中联合这种HER2/4-1BB双特异性分子和两种额外免疫疗法的潜在益处。事实上，PRS-343目前也正在与PD-L1阻断mAb阿替利珠单抗(
Figure BDA0003720714700000091
Genentech)联合进行临床评估(NCT03650348)。
如前所述，组合疗法的一个不可避免的缺点，尤其是随着组分疗法数量的增加，是其临床开发可能非常复杂，因此非常昂贵。开发多种制造工艺的要求进一步增加了开发成本并增加了COGS。在单个分子中包含两种以上的特异性(例如，三或四特异性抗体)理论上可以解决许多前述关于安全性、功效和成本的限制。靶向TAA的三/四特异性分子理论上能够引发多种免疫检查点通路的高度肿瘤定位和协同抗肿瘤调节，这可以为多种癌症提供更安全和更有效的治疗。此外，这种分子将进一步限制联合施用额外免疫疗法以增强患者反应的需要，支持开发的简易性并使治疗成本最小化。然而，由于其分子结构、其组分抗原结合结构域的性质和/或不良的生物物理性质的问题，用于治疗用途的三/四特异性抗体的实施已经变得复杂。因此，仍然明确需要新的三/四特异性抗体，其引发肿瘤定位的协同免疫调节，并具有使其适合于药物开发的生物物理性质。
此外，尽管已经存在许多对肿瘤相关免疫检查点抗原、TAA和/或T细胞共刺激受体具有特异性的抗体，但此类三特异性或四特异性抗体的复杂和特异性要求需要开发具有定制特性的新型抗体结构域。
因此，尽管对于患有癌症的患者有许多治疗选择，但是仍然需要有效和安全的治疗剂，并且需要以更有针对性的方式优先使用它们。免疫调节生物制剂由于其作用方式而为癌症的治疗提供了有前途的方法，但是，整体免疫刺激以及这种免疫调节对病理相关细胞和部位没有任何限制，会导致许多副作用和明显的毒性，这有可能导致患者的发病率和死亡率增加。因此，本发明的目的是提供一种药物，以改善对增生性疾病，特别是癌症的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物，以改善对增生性疾病，特别是癌症的治疗。本发明解决了对仅靶向疾病相关细胞的免疫肿瘤学的精确治疗的需求。
在一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包括以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的至少第一结构域，和特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二结构域。
本发明还涉及一种多特异性抗体，其包括以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的至少第一结构域，特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二结构域，和特异性结合免疫细胞抗原的至少第三结构域，特别是其中所述免疫细胞抗原存在于T细胞或NK细胞上。
更具体地，本发明涉及一种多特异性抗体，其中与PD-L1特异性结合的所述第一结构域包含SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
本发明还涉及一种组合，其包括(i)本发明的多特异性抗体和(ii)第二化合物，其选自(iia)针对TAA的抗体，特别是针对HER2的抗体，特别是其中该抗体是曲妥珠单抗，(iib)免疫检查点抗原的调节剂，特别是其中所述免疫检查点抗原不是肿瘤相关免疫检查点抗原，和/或特别是其中所述免疫检查点抗原存在于T细胞或NK细胞上，和(iic)血管生成调节剂。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了用作药物的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。
另一方面，本发明提供了用于治疗有此需要的受试者的癌症的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。
一方面，本发明提供了本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物在治疗有此需要的受试者的癌症的用途。
一方面，本发明提供了本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物在制备用于治疗有此需要的受试者的癌症的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。
另一方面，本发明提供了一种核酸，其包括编码本发明的多特异性抗体的核苷酸序列。另一方面，本发明提供了包含所述核酸的载体。另一方面，本发明提供了包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了一种生产本发明的多特异性抗体或其结合结构域或其片段的方法，该方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明的多特异性抗体或其结合结构域或其片段的核酸或载体。
分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：
1.一种多特异性抗体，其包括
(a)特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的第一结构域，其中在每种情况下，当以scFv形式(单价亲和力)通过SPR测量时，所述第一结构域结合所述肿瘤相关免疫检查点抗原的解离常数(KD)大于50nM，特别是解离常数(KD)在50nM和1μM之间，特别是大于100nM，特别是解离常数(KD)在100nM和900nM之间，特别是大于200nM，特别是解离常数(KD)在200nM和800nM之间，特别是大于300nM，特别是解离常数(KD)在300nM和700nM之间，特别是大于400nM，特别是解离常数(KD)在400nM和600nM之间，特别是大于450nM，特别是解离常数(KD)在450nM和550nM之间，特别是大于475nM，特别是解离常数(KD)在475nM和525nM之间，特别是解离常数(KD)为约500nM，和
(b)特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结构域。
2.根据项目1所述的多特异性抗体，其中当以scFv形式(单价亲和力)通过SPR测量时，所述第二结构域结合所述TAA的解离常数(KD)小于50nM，特别是小于20nM，特别是小于10nM，特别是小于5nM，特别是小于2nM，特别是小于1nM，特别是小于0.5nM。
3.根据项目1或项目2所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关免疫检查点抗原和所述TAA均存在于同一肿瘤细胞上。
4.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关免疫检查点抗原选自由以下组成的组：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD276(B7-H3)和VTCN1(B7-H4)。
5.根据项目4所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关免疫检查点抗原是PD-L1。
6.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结构域是所述肿瘤相关免疫检查点抗原的抑制剂。
7.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述TAA不是PD-L1。
8.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述TAA选自由以下组成的组：EGFRvlll、5T4、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、IL4RA、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、IL-13RA2、ROR1、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、CLEC12A、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu(HER2)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、Ephrin B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、CD33、CD123、CD133、CD135、TEM7R、FAP、Legumain、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧酸酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4；GPC3、CDH3、B7H3；FGFR1、SSTR2、CECAM6、GA733和gp120。
9.根据项目8所述的多特异性抗体，其中所述TAA选自HER2和间皮素，特别是HER2。
10.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，还包含特异性结合免疫细胞抗原的第三结构域，特别是其中所述免疫细胞抗原存在于T细胞或NK细胞上。
11.根据项目10所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域特异性结合免疫细胞抗原，所述免疫细胞抗原是所述免疫细胞的刺激或共刺激分子。
12.根据项目11所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是激动剂，且所述免疫细胞抗原是刺激性免疫细胞抗原。
13.根据项目12所述的多特异性抗体，其中所述刺激性免疫细胞抗原选自由以下组成的组：CD3和CD16。
14.根据项目13所述的多特异性抗体，其中所述刺激性免疫细胞抗原是CD3，特别是CD3ε。
15.根据项目11所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是激动剂，且所述免疫细胞抗原是共刺激性免疫细胞抗原。
16.根据项目15所述的多特异性抗体，其中所述共刺激性免疫细胞抗原选自由以下组成的组：CD137、CD28、ICOS、HVEM、CD27、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、2B4、TIM1、TIM2和CD226。
17.根据项目16所述的多特异性抗体，其中所述刺激性免疫细胞抗原是CD137。
18.根据项目17所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域在CD137的胞外结构域的远端部分中所包含的表位处特异性结合CD137，特别是在富含半胱氨酸的结构域CRD1和/或CRD2内，更特别是在SEQ ID NO:153的氨基酸残基24-86内，条件是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
19.根据项目11所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是抑制剂，且所述免疫检查点抗原是抑制性免疫细胞抗原。
20.根据项目19所述的多特异性抗体，其中所述抑制性免疫细胞抗原选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、PD-1、淋巴细胞激活基因3、及T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3、BTLA、TIM3、TIGIT、CD160、LAG3、LAIR1、B7-1、及B7-H1。
21.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，还包括特异性结合人血清白蛋白(HSA)的结构域。
22.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述结构域能够同时结合它们各自的抗原。
23.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述结构域独立地选自由以下组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB、单结构域抗体(sdAb或dAb)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、VHH、和基于来自鲨鱼的VNAR结构的单结构域抗体。
24.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)或双体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD，MATCH和DuoBodies。
25.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体不包含免疫球蛋白Fc区多肽，且任选地，不包含CH1和/或CL区。
26.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含CH1和/或CL区，并且任选地包含免疫球蛋白Fc区多肽。
27.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体对于每种特异性是单价的。
28.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体是scDb-scFv、三体、DVD-三体、MATCH，特别是其中所述多特异性抗体是MATCH或三体形式，更特别是其中所述多特异性抗体是MATCH形式，更特别是其中所述多特异性抗体是MATCH3或MATCH4。
29.根据项目5至28中任一项所述的多特异性抗体，其中：
a.所述第一结构域结合人PD-L1的解离常数(KD)为100nM至1000nM，例如，100nM至900nM，150nM至850nM，200nM至800nM，250nM至750nM，300nM至700nM，优选350nM至650nM，更优选400nM至600nM，特别是通过SPR测定；
b.当为scFv形式时，所述第一结构域不结合表达PD-L1的细胞，特别是通过流式细胞术测定，特别是其中所述scFv的浓度低于100μg/ml；
c.当为scFv形式时，所述第一结构域，
(i)不中和PD-L1与PD-1的结合，特别是通过NFAT报告基因分析测定，或
(ii)中和PD-L1与PD-1的结合，效力相对于阿维鲁单抗的效力(相对效力)，通过NFAT报道基因测定法测定，小于0.001，优选小于0.0005，并且其中所述相对效力是阿维鲁单抗的IC50值(以ng/ml为单位，在NFAT报告基因测定法中所测量的)与所述scFv的IC50值(以ng/ml为单位，在NFAT报告基因测定法中所测量的)的比例；
30.根据项目5至29中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体
(i)在存在TAA-/PD-L1+细胞的情况下，具有阻断PD-L1和PD-1之间相互作用的能力，效力相对于阿维鲁单抗的效力(相对效力)，通过流式细胞术测定法测定，小于0.001，优选小于0.0005，并且其中所述相对效力是阿维鲁单抗的IC50值(以ng/ml为单位，在流式细胞术测定中所测量的)与所述多特异性抗体的IC50值(以ng/ml为单位，在流式细胞术测定中所测量的)的比例；且
(ii)在存在TAA+/PD-L1+细胞的情况下，具有阻断PD-L1和PD-1之间相互作用的能力，效力相对于阿维鲁单抗的效力(相对效力)，通过流式细胞术测定法测定，大于0.01，优选大于0.05，更优选大于0.1，并且其中所述相对效力是阿维鲁单抗的IC50值(以ng/ml为单位，在流式细胞术测定中所测量的)与所述多特异性抗体的IC50值(以ng/ml为单位，在流式细胞术测定中所测量的)的比例。
31.根据项目5至30中任一项所述的多特异性抗体，其中：
a.当为scFv形式时，所述第一结构域的解链温度(Tm)，通过差示扫描荧光法测定，为至少65℃，优选至少70℃，特别是其中将所述scFv配制在pH6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中；
b.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，在4个连续的冻融循环后，所述第一结构域的单体含量损失小于3％，优选小于1％，特别是其中将所述scFv配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中；且
c.当为scFv形式时，当所述scFv的起始浓度为10mg/ml时，并且特别是其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存至少两周，特别是至少四周后，所述第一结构域的单体含量损失小于10％，例如小于9％，小于8％，小于7％，小于6％，优选小于5％。
32.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中每个结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a.所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，且
b.所述VL依次包含三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
33.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中特异性结合所述肿瘤相关免疫检查点抗原的所述第一结构域，和/或特异性结合所述TAA的所述第二结构域，和，任选地，特异性结合免疫细胞抗原的所述第三结构域，和任选地，特异性结合人血清白蛋白(HSA)的另一结构域包含轻链可变区(VL)，且其中所述VL包括Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4，和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO:145至SEQ ID NO:152中任一个的氨基酸序列具有至少80，特别是至少90百分比同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选如SEQ IDNO:145至SEQ ID NO:152中任一个所示的VλFR4，优选如SEQ ID NO:145、146或152所示的VλFR4，更优选如SEQ ID NO:146或152所示的VλFR4。
34.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结构域包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和为SEQ ID NO:5、6和7的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述CDR序列中的一个或多个任选地包含一个或两个突变，特别是突变为丙氨酸残基，更特别是其中：(i)所述LCDR3包括Q108A(根据AHo编号)，(ii)所述LCDR3包括G109A(根据AHo编号)，或者(iii)所述LCDR3包括(III)Q108A和G109A(根据AHo编号)，和/或(iv)所述HCDR3包括Y112A(根据AHo编号)。
35.根据项目34所述的多特异性抗体，其中所述第一结构域包含分别为SEQ IDNO:1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和为SEQ ID NO:5、6和9的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
36.根据项目34所述的多特异性抗体，其中所述第一结构域包含分别为SEQ IDNO:1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和为SEQ ID NO:5、6和10的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
37.根据项目35或项目36所述的多特异性抗体，其中所述第一结构域包含重链可变区(VH)，并且其中所述VH是VH3或VH4，优选VH4。
38.根据项目35所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含：VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:15至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列。
39.根据项目38所述的多特异性抗体，其包括SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ IDNO:15的VL序列。
40.根据项目36所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含：VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:16至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列。
41.根据项目40所述的多特异性抗体，其包括SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ IDNO:16的VL序列。
42.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二结构域包含(i)分别为SEQ ID NO:17、18、和19的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及为SEQ ID NO:20、21、和22的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，或者特别是，(ii)分别为SEQ ID NO:27、28、和29的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及SEQ ID NO:30、31、和32的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述CDR序列中的一个或多个任选地包含一个或两个突变，特别是突变为丙氨酸残基。
43.根据项目42所述的多特异性抗体，其中所述第二结构域包括VH，所述VH包含氨基酸序列，该氨基酸序列(i)与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少90％，特别是至少95％相同；和VL，所述VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列，特别是其中所述VH包含51位的Cys，并且所述VL包含141位的Cys(AHo编号)，或者，特别是，(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:33至少90％，特别是至少95％相同；和VL，所述VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列，特别是其中所述VH包含51位的Cys，并且所述VL包含141位的Cys(AHo编号)。
44.根据项目43所述的多特异性抗体，其包括(i)SEQ ID NO:24的VH序列和SEQ IDNO:26的VL序列，或(ii)SEQ ID NO:34的VH序列和SEQ ID NO:36的VL序列，特别是SEQ IDNO:34的VH序列和SEQ ID NO:36的VL序列。
45.根据项目10至44中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域(i)针对CD3，特别是其中所述第三结构域包含分别为SEQ ID NO:37、38和39的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和为SEQ ID NO:40、41和42的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，或者(ii)针对CD137，特别是其中所述第三结构域包含分别为SEQ ID NO:71、72和73的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和为SEQ ID NO:74、75和76的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述CDR序列中的一个或多个任选地包含一个或两个突变，特别是突变为丙氨酸残基。
46.根据项目45所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域(i)针对CD3且包含：VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:43至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:44至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列，或(ii)针对CD137且包含：VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:77至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:78至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列。
47.根据项目46所述的多特异性抗体，(i)针对CD3且包括SEQ ID NO:43的VH序列和SEQ ID NO:44的VL序列，或(ii)针对CD137且包括SEQ ID NO:77的VH序列和SEQ ID NO:78的VL序列。
48.根据项目21至28中任一项所述的多特异性抗体，其中所述与HSA特异性结合的结构域包括(i)分别为SEQ ID NO:45、46和47的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及为SEQ IDNO:48、49和50的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，(ii)分别为SEQ ID NO:53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及为SEQ ID NO:56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，或者(iii)分别为SEQ ID NO:61、62和63的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及为SEQ ID NO:64、65和66的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述CDR序列中的一个或多个任选地包含一个或两个突变，特别是突变为丙氨酸残基。
49.根据项目48所述的多特异性抗体，其中所述与HSA特异性结合的结构域包括(i)VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:51至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:52至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；(i)VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:59至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:60至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；(i)VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:67至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:69至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；或者(i)VH，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:68至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列；和VL，其包括与氨基酸序列SEQ ID NO:70至少90％，特别是至少95％相同的氨基酸序列。
50.根据项目49所述的多特异性抗体，其包括(i)SEQ ID NO:51的VH序列和SEQ IDNO:52的VL序列；(ii)SEQ ID NO:59的VH序列和SEQ ID NO:60的VL序列；(iii)SEQ ID NO:67的VH序列和SEQ ID NO:69的VL序列；或(iv)SEQ ID NO:68的VH序列和SEQ ID NO:70的VL序列。
51.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含两条链的组合，每条链的氨基酸序列(i)与选自SEQ ID NO:79和80；SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQ ID NO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ ID NO:89和90、SEQ ID NO:91和92、SEQID NO:93和94、SEQ ID NO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQ ID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106、SEQ ID NO:107和108、SEQ ID NO:109和110、SEQ ID NO:111和112、SEQ ID NO:113和114、SEQ ID NO:123和124、SEQ ID NO:125和126、SEQ ID NO:127和128、SEQ ID NO:129和130、SEQ ID NO:131和132、SEQ ID NO:133和134、及SEQ ID NO:135和136的链的组合的序列，或与选自SEQ ID NO:115至136的序列之一中包含的序列的组合，特别是SEQ ID NO:123和124的链的组合，或SEQ ID NO:127和128的链的组合具有至少80％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少95％同一性，包括100％同一性，且其中所述抗体包含
(i)特异性结合PD-L1的第一结构域，其包括分别为SEQ ID NO:1、2和3或分别为SEQ ID NO:1、2和4的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO:5、6和7；分别为SEQID NO:5、6和8；分别为SEQ ID NO:5、6和9；或分别为SEQ ID NO:5、6和10的LCDR1、LCDR2和LCDR3，及
(ii)特异性结合HER2的第二结构域，其包括(i)分别为SEQ ID NO:17、18和19的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:20、21和22的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，或者，特别是，(ii)分别为SEQ ID NO:27、28和29的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:30、31和32的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列
(iii)任选地，第三结构域，所述第三结构域特异性结合(i)CD3，包括分别为SEQID NO:37、38和39的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:40、41和42的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(ii)CD137，包括分别为SEQ ID NO:71、72和73的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:74、75和76的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，
(iv)任选地，特异性结合HSA的另一个结构域，其包括(i)分别为SEQ ID NO:45、46和47的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:48、49和50的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，(ii)分别为SEQ ID NO:53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO:56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(iii)分别为SEQ ID NO:61、62和63的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:64、65和66的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
52.一种组合，其包括(i)项目1至51中任一项的多特异性抗体和(ii)第二种化合物，其选自(iia)针对TAA的抗体，特别是针对HER2的抗体，特别是其中该抗体是曲妥珠单抗，(iib)免疫检查点抗原的调节剂，特别是其中所述免疫检查点抗原不是肿瘤相关免疫检查点抗原，和/或特别是其中所述免疫检查点抗原存在于T细胞或NK细胞上，和(iic)血管生成调节剂。
53.根据项目52所述的组合，其中所述调节剂是抗体。
54.根据项目52或53所述的组合，其中所述调节剂是激动剂，且所述免疫检查点抗原是免疫细胞抗原。
55.根据项目54所述的组合，其中所述免疫细胞抗原选自由以下组成的组：CD28、ICOS、HVEM、CD27、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、2B4、TIM1、TIM2、CD226、CTLA4、PD-1、淋巴细胞激活基因3、及T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3、BTLA、TIM3、TIGIT、CD160、LAG3、LAIR1、B7-1、及B7-H1。
56.根据项目55所述的组合，其中所述刺激性免疫细胞抗原是CD3或CD137，特别是CD3。
57.根据项目52或53所述的组合，其中所述调节剂是抑制剂，且所述免疫细胞抗原是抑制性免疫检查点抗原。
58.根据项目57所述的组合，其中所述抑制性免疫细胞抗原选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、PD-1、淋巴细胞激活基因3、及T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，优选地其中所述抑制性免疫检查点抗原是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)，更优选地，其中所述调节剂是伊匹单抗。
59.一种组合，其包括(i)项目1至51中任一项的多特异性抗体和(ii)针对TAA的抗体。
60.根据项目59所述的组合，其中所述TAA选自HER2和间皮素，特别是HER2，特别是其中所述抗体是曲妥珠单抗。
61.一种药物组合物，其包括项目1至51中任一项的多特异性抗体，或者项目52至60中任一项的组合，和药学上可接受的载体。
62.项目29、30和34至41中任一项所定义的PD-L1结合结构域。
63.项目42至44中任一项所定义的HER2结合结构域。
64.项目45(i)至47(i)中任一项所定义的CD3结合结构域。
65.项目45(ii)至47(ii)中任一项所定义的CD137结合结构域。
66.项目48至50中任一项所定义的HSA结合结构域。
67.项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合或项目62至66中任一项的结合结构域，其用作药物。
68.项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合、项目61的药物组合物或项目62至66中任一项的结合结构域，其用于治疗有此需要的受试者的癌症。
69.项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合、项目61的药物组合物或项目62至66中任一项的结合结构域在治疗有此需要的受试者的癌症中的用途。
70.项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合、项目61的药物组合物或项目62至66中任一项的结合结构域在制备用于在有此需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途。
71.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的项目1至51、67和68中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合、项目61的药物组合物、或项目62至66中任一项的结合结构域、或项目69或70的用途，其中所述癌症是对所述TAA和所述肿瘤相关免疫检查点抗原呈阳性的癌症，特别是其中所述癌症是TAA+/PDL+，更特别是其中所述癌症是HER2+/PD-L1+。
72.项目68所述的多特异性抗体、项目69或70所述的用途或项目71所述的方法，其中所述癌症是HER2和PD-L1阳性的癌症，并且其中所述癌症对标准护理疗法，特别是曲妥珠单抗是难治的。
73.编码项目1至51中任一项的多特异性抗体或项目62至66中任一项的结合结构域的核酸。
74.一种载体，其包括项目73的核酸。
75.一种宿主细胞，其包括项目73所述的核酸或项目74所述的载体。
76.一种生产项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目62至66中任一项的结合结构域的方法，所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目62至66中任一项的结合结构域的核酸或载体。
77.一种试剂盒，其包括项目1至51中任一项的多特异性抗体、项目52至60中任一项的组合、项目61的药物组合物或项目62至66中任一项的结合结构域。
78.根据项目1至50中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含两条链的组合，选自SEQ ID NO:79和80；SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQ ID NO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ ID NO:89和90、SEQ ID NO:91和92、SEQ ID NO:93和94、SEQ IDNO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQ ID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106、SEQ ID NO:107和108、SEQ ID NO:109和110、SEQ ID NO:111和112、SEQ ID NO:113和114、SEQ ID NO:123和124、SEQ ID NO:125和126、SEQ ID NO:127和128、SEQ ID NO:129和130、SEQ ID NO:131和132、SEQ ID NO:133和134、及SEQ ID NO:135和136的链的组合的，或与选自SEQ ID NO:115至136的序列之一中包含的序列的组合，特别是SEQ ID NO:123和124的链的组合，或SEQ ID NO:127和128的链的组合。
附图的简要说明
图1通过流式细胞术评估与PD-L1表达细胞的结合。(A)PRO1434和(B)PRO1494与PD-L1表达细胞的结合。PRO830用作参照。PRO1434仅在100μg/ml时显示信号，而PRO1494在3.5μg/ml时观察到结合。
图2NFAT报告基因检测中PD-1/PD-L1相互作用的阻断。由(A)PRO1434和(B)PRO1494中和PD-L1。阿维鲁单抗用作参照。对于测试的两种分子，在测试的最高浓度(162μg/ml)下，仅观察到PD-L1与PD-1相互作用的部分中和。
图3多特异性分子的结构。三种不同多特异性格式三体、DVD-三体和MATCH-4的示意图和描述。表14描述了所生产的不同分子中包含的结构域以及它们在分子中的位置。不同结构域的靶点是：曲妥珠单抗：Her2；克隆14-11-D07：IL23R；克隆23-13-A01：人/小鼠血清白蛋白；克隆28-21-D09：CD3e；克隆33-02-G02及其突变体：PD-L1。图中显示了连接各个结构域的Gly-Ser接头序列。
图4Her2表达细胞上的PD-1/PD-L1相互作用的阻断。在浓度增加的阿维单抗、PRO1454、PRO1456和PRO1497存在下，PD-1与(A)表达PD-L1和Her2的细胞(HCC1954)或(B)表达PD-L1但不显著表达Her2的细胞(HCC827)的结合的抑制。PRO1454抑制PD-1与PD-L1/高Her2表达细胞(HCC1954)上的PD-L1的结合，IC50为205ng/ml，以及与PD-L1表达细胞(HCC827)上的PD-L1的结合，IC50为1204ng/ml。含有亲和力低50倍的抗PD-L1结构域的PRO1497抑制了PD-1与Her2/PD-L1表达细胞的结合，其效力与PRO1454相当，但在测试浓度下对PD-1与仅表达PD-L1的细胞的结合仅显示出非常弱的抑制。不含抗PD-L1结构域的PRO1456不影响两种细胞系上的PD-1结合。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图5在人血清白蛋白的存在下，对Her2表达细胞上PD-1/PD-L1相互作用的阻断。A)在浓度增加的阿维单抗、纳武单抗、PRO1543(Her2xCD3xHSAxPD-L1低亲和力)和PRO1546(HER2xCD3xHSAxIL23R)存在下，PD-1与表达PD-L1和Her2的细胞(HCC1954)的结合的抑制。B)PD-1与表达PD-L1但不显著表达Her2的细胞(HCC827)的结合的抑制。PRO1543仅抑制PD-1与PD-L1/高Her2表达细胞上的PD-L1的结合，IC50值为600ng/ml。不含抗PD-L1结构域的PRO1546不影响两种细胞系上的PD-1结合。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图6在存在人血清白蛋白的情况下，在NFAT-荧光素酶报告基因测定中评估的CD3活化和伴随的PRO1454或PRO1497对PD-L1的阻断。A)在PD-L1/Her2表达细胞(HCC1954)存在下，PRO1454和PRO1456以相似的EC50激活Jurkat细胞中的CD3信号传导，但与含有抗IL23R虚拟结构域而非抗PD-L1结构域的PRO1456相比，PRO1454(携带低亲和力抗PD-L1结构域的分子)的最大激活更高。这表明在共表达Her2和PD-L1的细胞的存在下，PRO1454同时阻断PD-L1并激活免疫突触内的CD3。用PRO1455观察到了较弱的激活，PRO1455是一种不携带抗Her2结构域但携带低亲和力抗PD-L1结构域的分子(33-03-G02G109A)。B)测试了三体分子PRO1497，其含有抗PD-L1结构域，携带两个丙氨酸突变(Q108A和G109A)，亲和力比A中测试的分子和相应对照中掺入的结构域低至少50倍。对于这些分子，同时观察到PD-L1的阻断和CD3的激活，因为含有低亲和力抗PD-L1结构域的PRO1497比含有抗IL23R结构域的PRO1456诱导了更高的最大激活。与PRO1455相比，由于掺入的抗PD-L1结构域的亲和力低得多，PRO1498触发的激活要弱得多。加入Jurkat报告细胞后5小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图7在存在人血清白蛋白的情况下，在NFAT-荧光素酶报告基因测定中评估的CD3活化和伴随的PRO1543对PD-L1的阻断。A)在PD-L1/Her2表达细胞(HCC1954)存在下，PRO1543和PRO1557以相似的EC50激活Jurkat细胞中的CD3信号传导，但与含有抗IL23R虚拟结构域而非抗PD-L1结构域的PRO1557相比，PRO1543(携带低亲和力抗PD-L1结构域的分子)的最大激活更高。这表明在共表达Her2和PD-L1的细胞的存在下，PRO1543同时阻断PD-L1并激活免疫突触内的CD3。以下结果进一步支持了这一观察结果：向所有分子中添加1μg/ml纳武单抗，导致在PRO1557和PRO1543存在下与单独的PRO1543相似的最大激活，证实了PRO1543对PD-L1/PD-1的完全阻断。用PRO1546没有观察到激活，PRO1546是一种不携带抗Her2结构域但携带低亲和力抗PD-L1结构域的分子。B)对于独立于抗Her2结构域的存在而携带抗PD-L1结构域的分子(PRO1543和PRO1546)，在表达PD-L1的CHO细胞存在下，没有观察到激活。由于PRO1557不含抗PD-L1结构域，因此没有观察到该分子的激活作用。加入Jurkat报告细胞后5小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图8与HCC827肿瘤细胞(HER2低，PD-L1+)共孵育后，在存在PRO1543、PRO1895和对照分子PRO2290的情况下，CD8+ T细胞活化，如CD69的上调所测量的。
图9与HCC1954肿瘤细胞(HER2高，PD-L1+)共孵育后，在存在PRO1543、PRO1895和对照分子PRO2290的情况下，CD8+ T细胞活化，如CD69的上调所测量的。
图10CD4+和CD8+ T细胞的生存力。在最高浓度的测试分子下，CD4+ T细胞(A)和CD8+ T细胞(B)的生存力仅降低了5至10％。在PD-L1/高Her2表达癌细胞(HCC1954)存在下开始PBMC的细胞毒性评估40小时后，通过荧光标记的抗体对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。16小时后获得了类似的数据。
图11在A)Her2+++/PD-L1+HCC1954和B)Her2+/PD-L1-MCF-7存在下，T细胞介导的靶细胞杀伤和CD8+细胞活化。在该测定中，在不同的测试分子存在下，将新鲜分离的人PBMC与指定的靶细胞共培养16小时。PRO1543对Her2+++/PD-L1+表现出比Her2/CD3 scDb(PRO957)好50至100倍的效力，相比之下，对PD-L1阴性细胞仅观察到稍微不同的效力。由于在这些细胞中PD-L1阻断的EC50比靶细胞裂解的EC50高得多，因此含有抗PD-L1结构域的分子活性的提高很可能是由亲和力增加引起的。因此，与Her2和PD-L1双阳性细胞的结合强于与表达Her2的PD-L1阴性细胞的结合。这种亲和力结合增加了治疗窗，因为它选择性地提高了对肿瘤细胞(Her2/PD-L1双阳性)的效力，但对PD-L1阴性的表达Her2的正常细胞没有作用。
图12在A)Her2+/-/PD-L1+HCC827和B)Her2-/PD-L1+CHO PD-L1细胞存在下，T细胞介导的靶细胞杀伤和CD8+细胞活化。在不同分子的存在下，将新鲜分离的人PBMC与指定的靶细胞共培养16小时。PRO1543对Her2+/-/PD-L1+表现出比Her2/CD3 scDb好20倍的效力。在Her2阴性PD-L1阳性细胞存在下，在携带低亲和力PD-L1结构域的高浓度MATCH4下，仅观察到少量靶细胞杀伤和CD8+细胞激活，提供了非常大的治疗窗。
图13用HCC1954导管乳腺癌细胞移植人PBMC取代的NOG小鼠(每组n＝8)。在第0、5、10、15、20、25和30天(虚线垂直线)对小鼠进行治疗。每周两次记录肿瘤生长和体重。PRO1678 scMATCH3具有与纳武单抗相似的抗肿瘤作用，显示出有效的肿瘤靶向PD-L1阻断。PRO1543 MATCH4疗法比纳武单抗/曲妥珠单抗联合疗法具有更强的抗肿瘤功效。
图14多特异性分子的设计。三种不同多特异性格式三体、DVD-三体和MATCH-4的示意图和描述。表25描述了所产生的不同分子的结构域组分以及它们在分子中的位置。不同结构域的靶点是：曲妥珠单抗：Her2；克隆14-11-D07：IL23R；克隆23-13-A01：人/小鼠SA；克隆28-21-D09：CD3e；克隆33-02-G02及其突变体：PD-L1。图中显示了连接各个结构域的Gly-Ser接头序列。
图15PRO1993对NF-kB Jurkat报道细胞中CD137信号活性的影响。在HCC1954(高水平表达Her2和PD-L1)和HCC827(低水平表达Her2但高水平表达PD-L1)的存在下，Jurkat细胞与PRO1993孵育24小时后，通过检测发光来评估CD137信号传导的活性。在高Her2表达的HCC1954细胞的存在下，PRO1993激活CD137信号，而在低水平Her2表达的HCC827细胞中，仅观察到CD137信号的轻微激活。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图16在人血清白蛋白的存在下，对Her2表达细胞上PD-1/PD-L1相互作用的阻断在浓度增加的阿维单抗和PRO1993(Her2xCD137xHSAxPD-L1低亲和力)的存在下，PD-1与A)表达PD-L1和高Her2水平的细胞(HCC1954)，或(B)表达PD-L1和较低水平Her 2的细胞(HCC827)的结合水平。PRO1993以166.7ng/ml的IC50值抑制PD-L1/高Her2表达细胞上PD-1与PD-L1的结合，而在HCC827细胞上没有发现PD-1结合的抑制。作为比较，阿维单抗抑制这种相互作用，IC50为127.7ng/ml(HCC1954)和46.03ng/ml(HCC827)。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图17scDb-scFv的设计。scDb-scFv分子的示意图和描述。
图18在人血清白蛋白的存在下，对Her2表达细胞上PD-1/PD-L1相互作用的阻断在浓度增加的阿维单抗和PRO1678(Her2xHSAxPD-L1低亲和力)的存在下，PD-1与A)表达PD-L1和高Her2水平的细胞(HCC1954)，或(B)表达PD-L1和较低水平Her 2的细胞(HCC827)的结合水平。PRO1678抑制PD-1与PD-L1的结合，对PD-L1/高Her2表达细胞的效力比对PD-L1表达细胞(HCC827)的效力高100倍，IC50值为428.2ng/ml。作为比较，阿维单抗抑制这种相互作用，IC50为127.7ng/ml(HCC1954)和46.03ng/ml(HCC827)。使用S形曲线4PL拟合(GraphPadPrism)拟合数据。
图19MATCH4分子PRO1543和PRO1895与SK-OV3、MCF-7和CHO PD-L1细胞的质膜结合。MATCH4分子PRO1543和PRO1895以及临床阶段抗HER2抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗对SK-OV3(左上)、MCF-7(右上)和CHO PD-L1(右下)的浓度-反应曲线。MATCH4分子与表达高水平HER2的SK-OV3细胞结合，其表观结合亲和力与临床阶段抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相当。另一方面，当评估与MCF-7细胞的结合时，MATCH4分子的表观结合亲和力不如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
图20MATCH4分子PRO1543和PRO1895与IFNy-刺激的HCC1954和HCC827细胞的质膜结合。MATCH4分子PRO1543和PRO1895以及临床阶段抗HER2抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗对HCC1954(左)和HCC827(右)的浓度-反应曲线。在流式细胞仪测试之前，用10ng/ml的IFNy刺激细胞24小时。当评估与高水平表达HER2和PD-L1的HCC1954细胞的结合时，MATCH4分子的表观结合亲和力不如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。另一方面，MATCH4分子与表达低水平HER2和高水平PD-L1的HCC827细胞结合，表观结合亲和力与临床阶段抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(右)相似。注意，在右图中，PRO1543和PRO1895的最高浓度没有用于曲线拟合。
图21在曲妥珠单抗和帕妥珠单抗存在下，MATCH4分子PRO1543和PRO1895与SK-OV3细胞的质膜结合。显示了添加或不添加曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的MATCH4分子PRO1543(左)和PRO1895(右)的浓度-反应曲线。在加入MATCH4分子之前，用50nM的曲妥珠单抗或帕妥珠单抗孵育细胞1小时。然后在流式细胞仪中评估PRO1543和PRO1895的质膜结合。PRO1543在单独应用和在有帕妥珠单抗存在的情况下测试时，显示出与表达HER2的SK-OV3细胞的结合。另一方面，PRO1895证明了在曲妥珠单抗存在下和单独测试时与细胞的结合。当分别在曲妥珠单抗或帕妥珠单抗存在下测试PRO1543和PRO1895时，没有发现结合。
具体实施方式
即使利用抑制肿瘤相关免疫检查点抗原(如PD-L1)与其同源配体(如PD-1)的相互作用的治疗性抗体是一种非常有前途的治疗策略，但它也伴随着高毒性和不良事件等困难。因此，在医学领域需要抑制肿瘤相关免疫检验点抗原与其同源配体的相互作用的新方法，该方法比目前可用的方法具有更低的剂量限制性毒性和不良事件发生率。
本发明提供了一种多特异性抗体，其包括：以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的至少第一结构域，和特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二结构域。由于所述第一结构域特异性结合所述TAA，本发明的多特异性抗体能够结合展示所述TAA的靶细胞，并且由于亲和力效应，所述低亲和力结合结构域能够同时结合存在于相同靶细胞上的所述肿瘤相关免疫检查点抗原，从而抑制所述肿瘤相关免疫检查点抗原的相互作用。由于所述第一结构域的低亲和力，不会在任何相关程度上发生与仅展示所述肿瘤相关免疫检查点抗原而不展示所述TAA的非靶细胞的特异性结合。因此，本发明的多特异性抗体由于其能够介导(例如激动)所述靶细胞上的所述肿瘤相关免疫检验点抗原的有效信号传导，而不与非靶细胞相互作用，因此用本发明的多特异性抗体治疗不会导致不表达TAA的细胞的耗竭。
此外，令人惊讶地发现，如实施例和附图所示，包含(a)至少所述第一结构域，(b)至少所述第二结构域，和(c)特异性结合免疫细胞抗原的至少第三结构域的本公开的多特异性抗体表现出进一步的有益特性。此外，延长半衰期的抗HSA结构域的任选添加不仅使给药方便，而且应该会促进分子向肿瘤微环境的递送。
因此，本发明的多特异性抗体提供了优于常规组合物和疗法的独特治疗优势。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
在一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包括以低亲和力特异性结合肿瘤相关免疫检查点抗原的至少第一结构域，和特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的至少第二结构域。
如本文所用，术语“抗体”等包括：完全抗体或其单链；及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“结合结构域”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完全抗体的一个或多个片段，其保留了与给定的抗原(例如，CD137、PD-L1、HSA)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体的结合结构域选自由以下组成的组：Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；分离的互补决定区(CDR)、dsFv、scAb、STAB、单结构域抗体(sdAb或dAb)、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体、VHH、VNAR、基于鲨鱼的VNAR结构的单结构域抗体、和基于替代支架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白(fibronectin)和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如f-star技术(F-star’s Modular AntibodyTechnologyTM))。合适地，本发明的结合结构域是单链Fv片段(scFv)或单抗体可变结构域。在一个优选的实施方案中，本发明的结合结构域是单链Fv片段(scFv)。
术语“互补决定区”(“CDR”)是指使用许多著名方案中的任何一种确定边界的氨基酸序列，这些著名方案包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteinsof Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)，以及Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号方案)描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。
在本发明的背景下，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中，特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及规定标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，优选至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。
合适地，本发明的抗体是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-L1和HER2的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-L1和HER2以外的抗原的抗体，例如特异性结合PD-L1、HER2和人血清白蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-L1、HER2和人血清白蛋白以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
合适地，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的抗体。单克隆抗体组合物对某个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。
本发明的抗体包括但不限于嵌合的、人的和人源化的。
术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)是一种抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连，或与一个完全不同的分子相连，该分子赋予嵌合抗体新的特性，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比对人类的抗原性降低。
如本文所用，术语“人抗体”(或其抗原结合片段)旨在包括具有可变区的抗体(及其抗原结合片段)，其中框架区和CDR区均源自人源序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自这种人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式。本发明的人类抗体及其抗原结合片段可包含非由人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol,222:581(1991))。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已经被修饰，以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用，例如，免疫的xenomice(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的信息，还参见例如Li et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
如本文所用，“人源化”抗体(或其抗原结合片段)是保留了非人抗体的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体(或其抗原结合片段)。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及衍生自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如从转化为表达人源化抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)中分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体。
合适地，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。合适地，本发明的抗体是人源化的并且包含来源于兔的CDR。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，PD-L1和HER2)上的两个或更多个不同表位结合的抗体。术语“多特异性抗体”包括双特异性、三特异性、四特异性、五特异性和六特异性。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与至少两个不同靶标(例如PD-L1和HER2)上的两个不同表位结合的抗体。如本文所用，术语“三特异性抗体”是指与至少三个不同靶标(例如PD-L1、HER2和HSA)上的三个不同表位结合的抗体。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“构象”表位和“线性”表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
如本文所用，术语“构象表位”是指，当多肽链折叠形成天然蛋白时，在表面上聚集在一起的抗原氨基酸残基。
术语“线性表位”是指一种表位，其中蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生(连续)。
术语“远端表位”是指包含在远离细胞表面的细胞结合抗原的细胞外部分区域中的表位。
如本文所用，术语“识别”是指发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)的抗体其抗原结合片段。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。
“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体片段和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
本文所用的术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”或“KD”或“KD值”通过使用表面等离子体共振测定法来测量。如第[0185]节所述，通过表面等离子体共振(SPR)测量来确定对PD-L1的亲和力。如第[0198]节所述，通过SPR测量多特异性构建体对重组人CD3εECD、重组人IL-23R和重组人Her2 ECD的结合亲和力。如第[0199]节所述，通过SPR测量确定分子与人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的亲和力。
合适地，本发明的多特异性抗体对于PD-L1特异性是单价、二价或多价的。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体对于PD-L1特异性是二价的。在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体对于PD-L1特异性是单价的。
用于本发明的多特异性抗体的合适的PD-L1-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明PD-L1-BD包括但不限于序列在表1中列出的人源化单克隆抗体。
合适地，本发明的多特异性抗体对于HER2特异性是单价、二价或多价的。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体对于HER2特异性是二价的。在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体对于HER2特异性是单价的。
用于本发明的多特异性抗体的合适的HER2-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明HER2-BD包括但不限于序列在表2中列出的人源化单克隆抗体。
术语“多价抗体”是指具有不止一个价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与相同靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，单个结合分子可以结合靶分子上的一个以上结合位点。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等。
如本文所用，术语“单价抗体”是指与靶分子(例如PD-L1)上的单个表位结合的抗体。此外，如本文所用，术语“结合结构域”或“单价结合结构域”是指与靶分子(例如PD-L1)上的单个表位结合的结合结构域。
如本文所用，术语“二价抗体”是指与至少两个相同靶分子，例如PD-L1靶分子上的两个表位结合的抗体。
本发明的发明人现已惊奇地发现，当与等当量剂量(与体外测定的活性相同)的纳武单抗相比时，添加三特异性分子PRO1678(抗-HSAxPDL1xHER2)导致HCC1954异种移植物NOG小鼠模型中的肿瘤生长显著降低。PRO1678的五分之一低剂量导致该模型中肿瘤生长的相同减少(见图13)。发明人还惊奇地发现，包含第四种CD3-BD的四特异性分子如PRO1543(抗CD3xHSAxPDL1xHER2)导致HCC1954异种移植物NOG小鼠模型中肿瘤的完全消退。这一发现是令人惊讶的，因为不能先验地预期在复杂的多靶、多细胞体内情况下，所有四个结合结构域保持功能而不在空间上的或以其他方式相互抑制。由于在这些细胞中PD-L1阻断的EC50比靶细胞裂解的EC50高得多，因此含有抗PD-L1结构域的分子活性的提高很可能是由亲和力增加引起的。因此，与Her2和PD-L1双阳性细胞的结合强于与表达Her2的PD-L1阴性细胞的结合。这种亲和力结合增加了治疗窗，因为它选择性地提高了对肿瘤细胞(Her2/PD-L1双阳性)的效力，但对PD-L1阴性的表达Her2的正常细胞没有作用。
术语“肿瘤相关免疫检查点抗原”是指由肿瘤表达的抑制免疫细胞活性的跨膜蛋白，特别是选自下组的抗原：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD276(B7-H3)和VTCN1(B7-H4)，更特别是PD-L1。
术语“低亲和力”是指以50nM至2000nM，优选100nM至1000nM的解离常数(KD)与其同源靶标结合的结合结构域。
术语“肿瘤相关抗原(TAA)”指在肿瘤细胞表面上表达的抗原。在特定的实施方案中，TAA是与非肿瘤细胞相比优先在肿瘤细胞上表达的抗原，特别是其中肿瘤细胞上TAA的表达比来自相同生物体或患者的非肿瘤细胞高至少5倍以上、至少10倍以上、至少20倍以上、至少50倍以上或至少100倍以上。特别是，TAA选自下组：EGFRvlll、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu(HER2)、MUC1、EGFR、NCAM、Ephrin B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、Legumain、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧酸酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP和GFRα4。
术语“免疫细胞抗原”指存在于免疫细胞中的抗原，特别是选自T细胞、NK细胞和骨髓细胞的免疫细胞。特别地，该术语涉及蛋白质，其是所述免疫细胞的刺激或共刺激分子。
在本发明的语境中，术语“所述免疫细胞的刺激性分子”涉及分子例如CD3和CD16。
在本发明的语境中，术语“所述免疫细胞的共刺激分子”涉及分子例如由以下组成的分子组中包括的分子：CD137、CD28、ICOS、HVEM、CD27、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、2B4、TIM1、TIM2和CD226。
在具体实施方案中，本发明的多特异性抗体还包含(i)针对CD3的结合结构域，或(ii)针对CD137的结合结构域。
用于本发明的多特异性抗体的合适的CD3-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明CD3-BD包括但不限于序列在表3中列出的人源化单克隆抗体。
用于本发明的多特异性抗体的合适的CD137-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明CD137-BD包括但不限于序列在表5中列出的人源化单克隆抗体。
合适地，本发明的多特异性抗体具有两种不同的特异性(PD-L1和HER2)。合适地，本发明的多特异性抗体是双特异性抗体。本发明的多特异性抗体可以包含其他一个特异性(三特异性)或多个特异性(四特异性、五特异性或六特异性抗体)。在一个实施方案中，多特异性抗体是三特异性的。在另一个实施方案中，多特异性抗体是四特异性的。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体包含免疫球蛋白Fc区多肽。本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。合适的天然序列Fc区包括人lgG1、lgG2(lgG2A、JgG2B)、lgG3和lgG4。“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.5:203-234(1997))。FcR的概述见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capet et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”包括其他FcR，包括将来将要鉴定的FcR。术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994).测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie and Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.TJI(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al).可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。还参见，例如，Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体不包含免疫球蛋白Fc区多肽。
为了在相同或更低分子量下，增加特异性/功能性的数量，使用包含抗体片段的抗体是有利的，例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段以及其他抗体片段。这些较小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性，并且与完整的免疫球蛋白分子相比，还表现出改善的组织渗透性和药代动力学特性。尽管相对于完整的免疫球蛋白，此类片段似乎显示出许多优势，但它们还受到血清清除率高的困扰，因为它们缺少在体内具有长半衰期的Fc结构域(Medasan等人,1997,J.Immunol.158:2211-2217)。具有较低分子量的分子能更有效地穿透靶标组织(例如实体癌)，因此有希望在相同或较低剂量下改善功效。
发明人惊奇地发现，向本发明的多特异性抗体中添加人血清白蛋白结合结构域(HSA-BD)不会干扰其它结合结构域结合其各自靶标的能力。这一发现是令人惊讶的，因为不能先验地预期在复杂的多靶、多细胞体内情况下，所有四个结合结构域保持功能而不在空间上的或以其他方式相互抑制。
合适地，本发明的多特异性抗体可以包含对人血清白蛋白具有特异性的另一结合结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体包含：(i)至少一个PD-L1-BD；(ii)至少一个HER2-BD；和(iii)至少一个HSA-BD。合适地，本发明的多特异性抗体包含：(i)一个PD-L1-BD；(ii)至少一个HER2-BD，优选一个PD-L1-BD或两个PD-L1-BD，更优选一个PD-L1-BD；和(iii)至少一个HSA-BD，优选一个HSA-BD。
术语“HSA”特别是指具有UniProt ID号P02768的人血清白蛋白。人血清白蛋白(HSA)是人血清中66.4kDa的丰富蛋白(占总蛋白的50％)，由585个氨基酸组成(Sugio,Protein Eng,Vol.12,1999,439-446)。多功能HSA蛋白与其结构相关联，该结构允许结合并运输许多代谢物，例如脂肪酸、金属离子、胆红素和某些药物(Fanali,Molecular Aspectsof Medicine,Vol.33,2012,209-290)。血清中的HSA浓度约为3.5-5g/dL。白蛋白结合抗体及其片段可用于例如延长与其缀合的药物或蛋白质的体内血清半衰期。
在一些实施方案中，HSA-BD衍生自单克隆抗体或抗体片段。
用于本发明的多特异性抗体的合适的HSA-BD是本公开中提供的结合结构域。本发明的HSA-BD包括但不限于序列在表4中列出的人源化单克隆抗体。
特别是，本发明的HSA-BD特异性结合人血清白蛋白。本发明的HSA-BD包含VH CDR，所述VH CDR具有表4中列出的VH CDR中任意一个的氨基酸序列。特别是，本发明提供了HSA-BD，其包括一个、两个、三个或更多个VH CDR，所述VH CDR具有表4中列出的VH CDR中任意一个的氨基酸序列。
本发明还提供了HSA-BD，其包括VL CDR，所述VL CDR具有表4中列出的VH CDR中任意一个的氨基酸序列。特别是，本发明提供了HSA-BD，其包括一个、两个、三个或更多个VLCDR，所述VH CDR具有表4中列出的VL CDR中任意一个的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人血清白蛋白的HSA-BD，其中所述结合结构域包含VH结构域和VL结构域。
用于本发明的多特异性抗体的另一个合适的HSA-BD包含或衍生自选自由以下组成的组的抗体：(i)结合血清白蛋白的多肽(参见，例如，Smith等人,2001,BioconjugateChem.12:750-756；EP0486525；US6267964；WO 2004/001064；WO 2002/076489；和WO 2001/45746)；(ii)Holt等人,Protein Engineering,Design&Selection,vol 21,5,pp283-288,WO 2004/003019,WO 2008/096158,WO 2005/118642,WO 2006/0591056和WO 2011/006915中描述的抗血清白蛋白结合单可变结构域；(iii)WO 2009/040562,WO 2010/035012和WO2011/086091中描述的抗血清白蛋白抗体。
在特定的实施方案中，本发明的多特异性抗体包含HSA结合结构域，其具有SEQ IDNO:61至66中定义的CDR序列和SEQ ID NO:67至70中定义的VH/VL序列。
这些HSA-BD显示出特别有利的性质，特别是高稳定性和对食蟹猴血清白蛋白(CSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的交叉反应性，以进一步改善本发明多特异性抗体已经有利的性质。更具体地，所述HSA-BD的特征在于以下参数中的一个或多个：
a.结合人血清白蛋白(HSA)，在约5.5的pH值下，单价解离常数(KD)小于20nM，特别是KD为0.01至20nM，特别是0.05至10nM，特别是0.1至5nM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述hSA-BD是scFv形式；
b.结合人血清白蛋白(HSA)，在约5.5和约7.4的pH值下，单价解离常数(KD)小于20nM，特别是KD为0.01至20nM，特别是0.05至10nM，特别是0.1至5nM，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，特别是其中所述HSA-BD是scFv形式；
c.与食蟹猴(Macaca fascicularis)血清白蛋白(CSA)具有交叉反应性，特别是在约5.5和约7.4的pH值下，结合CSA的单价小于15nM，特别是KD为0.01至15nM，特别是0.05至7nM，特别是0.1至4nM，如通过SPR测量的，特别是其中所述HSA-BD是scFv形式；
d.与小家鼠(Mus musculus)血清白蛋白(MSA)具有交叉反应性，特别是在约5.5的pH值下，结合MSA的单价KD小于20nM，特别是KD为0.01至20nM，特别是0.05至10nM，特别是0.1至5nM，如通过SPR测量的，特别是其中所述HSA-BD是scFv形式；
e.保持抗体结合的HSA与FcRn结合的能力；
f.当为scFv形式时，通过差示扫描荧光分析法(DSF)测定的熔化温度(Tm)为至少72℃、优选至少75℃、更优选至少78℃，特别是其中所述HSA-BD配制在pH 6.4的含150mMNaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
g.当为scFv形式时，当所述抗原结合片段的起始浓度为50mg/ml时，在4℃下储存至少两周后，单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述HSA-BD配制在pH 6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；
h.当为scFv形式时，当所述抗原结合片段的起始浓度为10mg/ml时，在40℃下储存至少两周后，单体含量损失小于11％，例如小于8％，小于5％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述HSA-BD配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中；和/或
i.当为scFv形式时，当所述抗原结合片段的起始浓度为10mg/ml时，在40℃下储存至少四周后，蛋白质含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％，并且特别是其中所述HSA-BD配制在pH6.4的含150mM NaCl的50mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中。
本发明的其他可变结构域包括已突变、但仍在CDR区中与表1至5中描述的序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。本发明的其他可变结构域包括突变氨基酸序列，其中当与表1至5中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个。
合适地，本发明的结合结构域的VH结构域属于VH3或VH4家族。在一个实施方案中，本发明的结合结构域包含属于VH3家族的VH结构域。在本发明的语境中，术语“属于VHx家族(或VLx家族)”是指框架序列FR1至FR2与所述VHx家族(或VLx)显示最高程度的同源性。VH和VL家族的实例在Knappik et al.,J.Mol.Biol.296(2000)57-86或在WO 2019/057787中给出。属于VH3家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:142表示，属于VH4家族的VH结构域的具体实例由SEQ ID NO:143表示。特别是，取自SEQ ID NO:142的框架区FR1至FR4属于VH3家族(表7，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH3家族的VH包含与SEQ ID NO:142的FR1至FR4具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性的FR1至FR4。VH3序列的其他实例，以及VH4序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57/-86中或WO 2019/057787中找到。合适地，本发明的HSA-BD包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，优选Vκ1框架FR1至3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4。合适的Vκ1框架FR1至3在SEQ ID NO:144中列出(表7，FR区以非粗体标记)。Vκ1序列的其他实例，以及Vκ2、Vκ3或Vκ4序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。合适的Vκ1框架FR1至3包含与对应于FR1至3并选自SEQ ID NO:144的氨基酸序列(表7，FR区以非粗体标记)具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。合适的VλFR4如SEQ ID NO:145至SEQ ID NO:152所示。在一个实施方案中，本发明的VL结构域包含VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO:145至SEQ ID NO:152中任意一个的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:146或152具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。
本发明的结合结构域包括表1至5中所列的VH结构域。合适地，本发明的结合结构域包含表1至5中的一个中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。合适地，本发明的结合结构域包含表1至5中的一个中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。本发明的其他结合结构域包括已突变、但仍在VH区中与表1至5中的一个中描述的相应序列中描述的VH区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
特别是，本发明的结合结构域包括表1至5之一中列出的VL结构域。合适地，本发明的结合结构域包含表1至5中的一个中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。合适地，本发明的结合结构域包含表1至5中的一个中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。本发明的其他结合结构域包括已突变、但仍在VL区中与表1至5中描述的序列中描述的VL区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的语境中，术语“本发明的结合结构域”既涉及这样的结合结构域，即独立于多特异性语境，又特别涉及包含在多特异性构建体中的结合结构域，例如包含在双特异性、三特异性或四特异性构建体中的结合结构域之一。
合适地，本发明的结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、和STAB。
合适地，本发明的结合结构域是scFv抗体片段。
本发明的多特异性抗体可以是任何合适的形式。
合适地，多特异性抗体的结合结构域可操作地连接。本发明的多特异性抗体的结合结构域能够同时结合它们各自的抗原或受体。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体包含至少一个PD-L1-BD、至少一个HER2-BD，其中：(i)所述PD-L1-BD和所述HER2-BD均可操作地彼此连接。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体包含至少一个PD-L1-BD、至少一个HER2-BD、至少一个HSA-BD，其中：(i)所述D-L1-BD和所述HER2-BD均与所述HSA-BD可操作地连接；或者(ii)所述PD-L1-BD和所述HSA-BD均与所述HER2-BD可操作地连接；或者(iii)所述HER2-BD和所述HSA-BD均与所述PD-L1-BD可操作地连接。在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体包含至少一个PD-L1-BD、至少一个HER2-BD、至少一个HSA-BD，其中所述PD-L1-BD和所述HSA-BD均与所述HER2-BD可操作地连接。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个分子(例如，多肽、结构域、结合结构域)连接，从而各自保留功能活性。无论两个分子是直接连接还是间接连接(例如，通过接头，通过部分，通过接头连接到部分)，它们都可以是“可操作地连接”。术语“接头”是指任选地位于本发明的结合结构域或抗体片段之间的肽或其他部分。可以使用多种策略将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-末端和C-末端之间的多肽连接，通过二硫键的连接，以及通过化学交联剂的连接。在该实施方案的一方面，接头是通过重组技术或肽合成产生的肽键。对于要连接两条多肽链的特定情况，选择合适的接头取决于各种参数，包括但不限于两条多肽链的性质(例如，它们是否天然寡聚)、要连接的N-末端和C-末端之间的距离(如果知道)和/或接头对蛋白水解和氧化的稳定性。此外，接头可以包含提供柔韧性的氨基酸残基。
在本发明的语境中，术语“多肽接头”是指连接两个结构域的通过肽键连接的由氨基酸残基链组成的接头，每个结构域与接头的一端连接。多肽接头的长度应足以连接两个分子，以使它们彼此之间具有正确的构象，从而保持所需的活性。在特定的实施方案中，多肽接头具有2至30个氨基酸残基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基)的连续链。此外，选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应表现出不会显著干扰多肽活性的特性。因此，整体上接头肽不应表现出与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一种或多种单体中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重阻碍受体单体结构域的结合。在特定的实施方案中，多肽接头是非结构化的多肽。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸或GS接头。如本领域技术人员将理解的，“Gly-Ser”或“GS”接头是指串联的甘氨酸和丝氨酸的聚合物(包括例如(Gly-Ser)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头，例如用于shaker钾离子通道的系链，以及多种其他柔性肽接头。甘氨酸-丝氨酸聚合物是优选的，因为这两个氨基酸都是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链。其次，丝氨酸是亲水的，因此能够溶解可能是球状甘氨酸链的物质。第三，已显示相似的链可有效连接重组蛋白(如单链抗体)的亚基。
合适地，多特异性抗体的形式选自本领域已知的任何合适的多特异性(例如双特异性)形式，包括但不限于基于以下的形式：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)或双体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的Fv、scFv、scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD，MATCH(描述于WO2016/0202457；Egan T.等人,mAbs 9(2017)68-84)和DuoBodies(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)。特别适用于本文的是单链双抗体(scDb)或scDb-scFv。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体的形式选自由scDb(双抗体(diabody))、scDb-scFv、三抗体(triabody)和三体(tribody)组成的组。特别适用于本文的是单链双抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb。而且，特别适合用于本文的是scDb-scFv，特别是其中所述CD137-BD和所述PD-L1-BD是scDb的形式，并且所述HSA-BD是与所述scDb可操作地连接的scFv。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用接头，该接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体在例如EP404097、WO 93/01161、Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更充分地描述。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别是包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，它们通过接头L1、L2和L3以以下顺序连接VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。
接头L1特别是2-10个氨基酸，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽，并且接头L3特别是1-10个氨基酸，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽。在特定实施方案中，接头L1和/或L3包含一个或两个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1或2，优选n＝1。
中间接头L2特别是10-40个氨基酸，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝4。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体是scDb-scFv。术语“scDb-scFv”是指抗体形式，其中单链Fv(scFv)片段通过柔性Gly-Ser接头与单链双抗体(scDb)融合。在一个实施方案中，所述柔性Gly-Ser接头是2-40个氨基酸，例如2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10个氨基酸，特别是10个氨基酸氨基酸的肽。在特定实施方案中，所述接头包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝2。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多特异性抗体是WO 2016/0202457；EganT.等人,mAbs 9(2017)68-84中描述的MATCH形式。
本发明的多特异性抗体可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&
Figure BDA0003720714700000511
A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于生产包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,MethodsEnzyMol.121(1986)210-228)。
这些方法通常涉及单克隆抗体的产生，例如通过将骨髓瘤细胞与小鼠的脾细胞融合，该小鼠已经用杂交瘤技术用所需抗原免疫(参见，例如，Yokoyama等人,Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2,Unit 2.5,2006)或通过重组抗体工程技术(库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如，Chames&Baty,FEMS Microbiol.Letters 189(2000)1-8)，以及使用已知的分子克隆技术，将两种或多种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或者其片段或部分组合，以得到双特异性或多特异性构建体。
可以使用本领域已知的方法通过将组成结合特异性缀合来制备本发明的多特异性分子。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.NO.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,111)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，例如一个。
或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配体X Fab融合蛋白时，此方法是特别有用的。本发明的多特异性抗体可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者可以是包含两个结合决定簇的单链多特异性抗体。多特异性抗体可以包含至少两个单链分子。制备多特异性抗体和分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
多特异性抗体与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域。可以对此类核酸序列进行优化以在哺乳动物细胞中表达。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，即在所述序列中，一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer等人,NucleicAcid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述多特异性抗体的区段或结构域。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出抗原结合能力或本发明的多特异性抗体的能力。
本发明中还提供了多核苷酸，其编码表1至表4中列出的本发明的多特异性抗体的结合结构域的至少一个CDR区并且通常编码所有三个CDR区。由于密码子的简并性，多种核酸序列将编码所述免疫球蛋白氨基酸序列的每一个。
多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Narang等人,1979,Meth.EnzyMol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.EnzyMol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles和Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods和Applications,Innis等人(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods和Applications 1:17,1991。
本发明还提供了表达载体和宿主细胞，用于生产本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域。
术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在该具体背景下，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。
可以使用各种表达载体来表达编码多特异性抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达CD137结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.MicroBiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell68:143,1992。
表达载体的选择取决于要在其中表达所述载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码多特异性抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止插入序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达多特异性抗体链或片段还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，从而与由插入的本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域序列所编码的多肽形成融合蛋白。更经常地，将插入的本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域序列与信号序列连接，然后包含在载体中。用于接收编码多特异性抗体轻链和重链可变结构域的结合结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区是人的。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
用于携带和表达本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，例如酵母，也可以用于表达本发明的CD137结合多肽。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。
在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROMGENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入包含目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(大体上参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子/核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88/223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达本发明的多特异性抗体或其片段或其结合结构域的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1-2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术使增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸或载体，由此表达本公开的所述抗体或其片段。
一方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体或其结合结构域或其片段的方法，该方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明的多特异性抗体或其结合结构域或其片段的核酸。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即本发明的多特异性抗体)可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。
本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained和Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的本发明的多特异性抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的多特异性抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。
本发明的多特异性抗体通常多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中本发明的多特异性抗体的血液水平所指示的。或者，本发明的多特异性抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。
一方面，本发明涉及用作药物的本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。在合适的实施方案中，本发明提供了多特异性抗体或药物组合物，其用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症。
另一方面，本发明提供了多特异性抗体或药物组合物，其用于生产用于治疗增生性疾病，特别是癌症的药物。
另一方面，本发明涉及多特异性抗体或药物组合物用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症中的用途。
另一方面，本发明涉及多特异性抗体或药物组合物在制备用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症的药物中的用途。
另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。在合适的实施方案中，本发明涉及治疗受试者的增生性疾病，特别是癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，增生性疾病是癌症。术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体(例如扩散或循环的)肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。本文使用的术语“癌症”是指广泛的肿瘤，包括所有实体和血液恶性肿瘤。此类肿瘤的例子包括但不限于：良性或特别是恶性肿瘤、实体瘤、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、腹部癌(例如胃肿瘤)、食道癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、阴道癌、甲状腺癌、黑素瘤(例如不可切除的或转移性黑素瘤)、肾细胞癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤或胃肠道癌尤其是结肠癌或结直肠腺瘤、头颈部肿瘤、子宫内膜癌、Cowden综合征、Lhermitte-Duclos病、Bannayan-Zonana综合征、前列腺增生、赘生物尤其是上皮特征的赘生物优选乳癌癌或鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病(例如费城染色体阳性慢性骨髓性白血病)、急性淋巴细胞性白血病(例如费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病及其任意组合。在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌。
本发明的多特异性抗体或本发明的组合物抑制实体瘤的生长，但也抑制液体瘤的生长。在另一个实施方案中，增生性疾病是实体瘤。术语“实体瘤”尤其是指乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、腹部癌(尤其是胃癌)、子宫颈癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)和头颈部肿瘤。此外，取决于肿瘤类型和所使用的特定组合，可以获得肿瘤体积的减小。本发明的多特异性抗体或本发明的组合物还适合于预防患有癌症的受试者中的肿瘤的转移扩散和微转移瘤(micrometastases)的生长或发展。
在一个实施方案中，所述癌症是PD-L1阳性的，优选地，其中与健康组织相比，所述癌症表达高水平的PD-L1，特别是其中与健康组织中的PD-L1表达(分别为mRNA或蛋白)相比，所述癌症表达PD-L1(mRNA或蛋白质)的水平高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍，至少100倍。在一些实施方案中，所述癌症是恶性的。在一些实施方案中，所述癌症是良性的。在一些实施方案中，所述癌症是原发性的。在一些实施方案中，所述癌症是继发性的。在一个实施方案中，所述癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌。
一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。试剂盒可以包括一个或多个其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记，治疗剂或可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其他方式偶联的试剂，或放射防护组合物；用于制备用于施用的抗体分子的装置或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者施用的装置或其他材料。在一个具体的实施方案中，试剂盒包含药学有效量的本发明的多特异性抗体。在另一个实施方案中，试剂盒包含药学有效量的冻干形式的本发明的多特异性抗体和稀释剂，以及任选地使用说明。所述试剂盒还可以包括用于重构的过滤针和用于注射的针。
序列列表(根据AHo编号方案而指定的突变，根据Numab CDR定义而定义的CDR)
表1.本发明的PDL1结合结构域的实例。
Figure BDA0003720714700000621
Figure BDA0003720714700000631
表2.本发明的HER2结合结构域的实例。
Figure BDA0003720714700000632
Figure BDA0003720714700000641
Figure BDA0003720714700000651
表3.本发明的CD3结合结构域的实例。
Figure BDA0003720714700000652
Figure BDA0003720714700000661
表4.本发明的人血清白蛋白(HSA)结合结构域的实例。
Figure BDA0003720714700000662
Figure BDA0003720714700000671
Figure BDA0003720714700000681
表5.本发明的CD137结合结构域的实例。
Figure BDA0003720714700000682
表6.本发明的多特异性分子的实例。
Figure BDA0003720714700000691
Figure BDA0003720714700000701
Figure BDA0003720714700000711
Figure BDA0003720714700000721
Figure BDA0003720714700000731
Figure BDA0003720714700000741
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Figure BDA0003720714700001011
Figure BDA0003720714700001021
Figure BDA0003720714700001031
Figure BDA0003720714700001041
Figure BDA0003720714700001051
Figure BDA0003720714700001061
表7.与本发明有关的其他序列。
Figure BDA0003720714700001062
Figure BDA0003720714700001071
Figure BDA0003720714700001081
在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表6)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。
应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别是涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用的方式并入本文。
下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实施例1：低亲和力抗PD-L1分子的产生和检测：
项目目标
该项目的目标是鉴定中和PD-L1和PD-1之间的相互作用的低亲和力抗PD-L1抗体片段。最终，该结构域将在多特异性分子中，与针对与肿瘤细胞上的PD-L1共表达的选定的肿瘤相关抗原(TAA)的高亲和力结构域结合，允许特异性地在那些癌细胞上实现PD-L1的靶向及中和。设计了两组长效分子，对应于两个项目。每组分子的主要区别在于特异性的数量(3或4)以及它们的形式。两组分子都含有作为TAA的Her2结构域、低亲和力PD-L1结构域和用于半衰期延长的人血清白蛋白结合结构域，但是一组分子还含有抗CD3ε结合结构域以触发T细胞活化。该实施例描述了在这些项目中设计的低亲和力结构域以及多特异性分子的产生和表征。
scFv的设计和生产
为了产生中和PD-L1和PD-1之间相互作用的低亲和力PD-L1抗体，在先前鉴定的克隆33-03-G02的高亲和力中和抗PD-L1结构域的CDR区中引入单丙氨酸取代。作为第一步，将高亲和力结构域的CDR3区(最高氨基酸可变性)的每个氨基酸突变为丙氨酸，产生21个突变体。与原始结构域相比，三个单突变体对PD-L1的亲和力降低了100倍以上。因此，将单突变组合以产生两个双突变。平行地，设计了CDR1和CDR2区最易变残基的另外9个单突变体，以及含有CD3区其它单突变的组合的两个突变体，其仅略微降低了亲本结构域的亲和力，但可能是暴露的残基。此外，还表达了三种突变体，它们含有预测的暴露残基的多达三个丙氨酸取代。从亲和力降低100倍至6500倍的五种最令人感兴趣的分子获得的数据如下所示。
方法：
scFv生产
通过小规模诱导过夜表达，以不溶性包涵体的形式，在大肠杆菌中进行了蛋白质的异源表达(如下表8所示)。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，该离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解于变性缓冲液中，并通过可规模化的复性(refolding)方案使scFv复性，产生毫克量的天然折叠的单体scFv。在这一点上，采用标准化方案纯化scFv。通过亲和层析捕获复性后的产物，得到纯化的scFv。表8总结了scFv分子的制备。使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达(见表8)。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过Protein L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
冻融稳定性研究
针对冻融(F/T)循环评估了性能最高的scFv分子的相容性(胶体稳定性)。对于F/T稳定性评估，采用了与储存稳定性研究相同的分析方法(SE-HPLC，在280nm的UV吸光度)和参数，以监测分子在多个F/T循环中的质量。由于没有进行专门的冻融研究，冻融数据是从储存稳定性研究的-80℃样本中提取的，是在28天内获得的(在F/T循环之间最多储存7天)。
差示扫描荧光分析法(DSF)
通过差示扫描荧光法使用荧光染料
Figure BDA0003720714700001101
Orange确定scFv构建体的热解折叠的转变中点。在最终缓冲液(50mM NaCiP，150mM NaCl，pH6.4)中以50μg/mL的最终蛋白质浓度制备样品，所述缓冲液含有5x
Figure BDA0003720714700001102
Orange的最终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约两个小时。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。
表8：基于克隆ID 33-03-G02的克隆的scFv结构域的制备。
Figure BDA0003720714700001111
通过SPR测定对PD-L1的亲和力
方法：
使用Biacore T200设备(GE Healthcare)通过等离子体共振(SPR)测量确定了对PD-L1的亲和力。所有测量均在25℃下进行。在该实验中，使用GE Healthcare的HumanAntibody Capture试剂盒(货号BR-1008-39)捕获了Fc标记的人PD-L1胞外结构域(ECD,SinoBiological,Cat.10084-H02H)。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。对于亲和力测定，使用剂量响应多循环动力学测定法将scFv作为分析物注入，其中分析物的浓度范围为6.86至5000nM(三倍稀释步进)，稀释于运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、和0.05％Tween 20，pH 7.4)中。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用一对一Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(BIAevaluation,GE Healthcare)计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数和表观解离平衡常数(KD)，并基于Chi2和U-值监测拟合的质量，其中Chi2是曲线拟合质量的量度。除动力学测量外，通过拟合平衡时响应与浓度的关系图获得KD值(稳态亲和力测量)。
结果：
如表9所示，对于测试的人源化scFv，证实了与人PD-L1的结合。与亲代单链抗体PRO830相比，PRO1434对PD-L1的亲和力降低了6,500倍。
表9：基于克隆ID 33-03-G02的克隆的scFv与hPD-L1的亲和力的总结。
Figure BDA0003720714700001121
Figure BDA0003720714700001131
NA：不适用
ND：未测定
通过FC确定对PD-L1表达细胞的结合
方法：
收获CHO-K1(不表达PD-L1的对照细胞)和具有高PD-L1表达水平的CHO-PD-L1(Amsbio)，并确定细胞数量。将细胞悬浮液以400xg离心5分钟，并将在PBS-EB(1x DPBS，2％BCS H.I.，2mM EDTA)中稀释的100μl细胞悬浮液(10000个细胞)加入到非结合板的指定孔中。用PBS-EB洗涤三步后，离心细胞，吸出洗涤缓冲液。然后将100μl待测样品的系列稀释液以及阳性对照直接加入平板中。将阳性对照样品(PRO830，33-03-G02)在PBS-EB中稀释，浓度范围为3500至0.22ng/ml，样品稀释度范围为1000至0.064μg/ml。在4℃孵育1小时后，将板用100μl的PBS-EB洗涤三次。将细胞沉淀用浓度为2μg/ml的100μL Protein L-APC重悬，并在4℃下孵育1小时。接下来，将细胞再次用100μl的PBS-EB洗涤3次。将细胞沉淀用50μlPBS-EB重悬，并用NovoCyte 2060流式细胞仪进行分析。记录每个样品的5’000个事件的APC的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均值。针对非特异性抗体结合(空白和CHO-K1细胞结合)校正数据。
结果：
使用如上所述的流式细胞术评估结合表达PD-L1的细胞的能力。将待测试的各个分子的连续稀释液以及参照PRO830加入到板中。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参照分子PRO830(高亲和力PD-L1结构域)的IC50进行校准(相对EC50：EC50，PRO830/IC50，测试scFv)。表10总结了效力，表明PRO1434和PRO1494具有最弱的结合。图1显示了PRO1434和PRO1494的剂量反应曲线。
表10：基于克隆ID 33-03-G02的克隆的scFv结合hPD-L1表达细胞的能力。
Figure BDA0003720714700001141
NA：不适用
ND：未测定
NB：在最高测试浓度下没有结合
*:EC50,PRO830(ng/ml)/EC50,测试分子(ng/ml)
通过NFAT报道基因测定法检测PD-L1/PD-1中和作用
方法：
使用CHO/PD-L1/TCR(T细胞受体)激活剂和Jurkat/PD-1细胞测试了当PD-L1/PD-1两种相互作用分子都在细胞表面表达时scFv中和PD-L1/PD-1相互作用的能力。在该试验中，将在NFAT效应元件的控制下稳定表达PD-L1和TCR激活剂的CHO细胞与稳定表达PD-1和萤火虫荧光素酶(作为监测T细胞激活的报告基因)的Jurkat T细胞孵育。当CHO细胞上的TCR激活剂与Jurkat T细胞结合时，TCR信号触发NFAT诱导的萤火虫荧光素酶的表达。然而，PD-L1和PD-1之间的相互作用负调节这种TCR信号，从而减少萤火虫荧光素酶的表达。因此，阻断该系统中的PD-L1/PD-1相互作用可恢复荧光素酶活性。
将100μl细胞培养基(DMEM/F12，10％FCS)中的35’000个CHO/PDL1/TCR激活细胞添加到白细胞培养板的内孔中，并在37℃和5％CO2下孵育16-20小时。第二天，从每个孔中取出细胞培养基，并添加各待测分子的50μl的2倍浓缩系列稀释液(最终浓度从162到0.025μg/ml)和参照分子阿维单抗(终浓度为3000至0.46ng/ml)。然后，效应Jurkat细胞以400’000个细胞/ml稀释在测定缓冲液(含10％FCS的RPMI1640)中，取50μl该效应Jurkat细胞添加到每个孔中，并将板在37℃和5％CO2下孵育6小时。最后，每孔加入50μl根据制造商方案制备的荧光素酶底物(BPS Bioscience)，并将板在黑暗中孵育30分钟，使用Flexstation III多模式酶标仪。
结果：
如上所述，在基于细胞的报告基因测定中评估了中和PD-L1对PD-1的结合的效力。将要测试的各个分子的连续稀释液以及参照阿维鲁单抗加入到板中。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参照分子阿维鲁单抗(高亲和力PD-L1结构域)的IC50进行校准(相对IC50：IC50，阿维鲁单抗/IC50，测试scFv)。表11总结了效力，表明PRO1434和PRO1494效力最低。图2显示了PRO1434和PRO1494的滴定曲线。
表11：基于克隆ID 33-03-G02的克隆的scFv在报道基因分析中中和PD-L1/PD-1相互作用的能力。
Figure BDA0003720714700001151
Figure BDA0003720714700001161
NA：不适用
ND：未测定
*:IC50,阿维单抗(ng/ml)/IC50,测试分子(ng/ml)
储存稳定性研究
方法：
对人源化的scFv进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(最终缓冲液，50mM NaCiP，150mM NaCl，pH6.4)中，并在-80℃、4℃和40℃储存四周。至少，通过测量280nm处的紫外吸光度来测量蛋白质浓度，且在每次研究的一周、两周和完成后，通过SE-HPLC峰面积的积分来评估制剂中单体和低聚物的比例。记录参数，如％单体含量、％单体损失、含量和％含量损失随时间的变化。
结果：
表12和13比较了在4℃和40℃下在d0、d7、d14和在研究的d28获得的终点测量值。在4℃下，除了PRO1075和PRO1076之外，所有分子在28天内显示出小于10％的单体含量损失。在40℃下，28天后只有两种分子显示单体含量高于85％，PRO1434(86％)和PRO1494(90％)。
实施例2：靶向HER2(作为TAA的实例)、PD-L1和CD3(作为免疫细胞抗原的实例)的多特异性构建体的产生和测试：
该方法针对靶向表达HER2的恶性肿瘤的下一代多特异性免疫肿瘤学计划。HER2是医学需求未得到满足的几种癌症类型的临床验证靶标，最显著的是乳腺癌和胃癌。然而，(过)表达HER2的肿瘤谱更广，但由于机制原因，常规抗体如曲妥珠单抗无法达到，而本方法可以有效介导T细胞诱导的HER2表达肿瘤的裂解，同时通过伴随的免疫抑制性PD-L1信号传导的阻断来避免肿瘤免疫逃逸。两种添加剂的局部限制，可能对肿瘤组织同时起到作用机制，期望为根据本方法的化合物提供显著扩大的功效分布，甚至在原发性或继发性对标准抗HER2治疗难治性的HER2表达肿瘤中具有预期的临床功效。本发明的方法应该导致i)相比于阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001171
至少一样有效，且更具选择性地阻断PD-1/PD-L1相互作用。具体而言，根据本方法的化合物应有效阻断PD-1与HER2/PD-L1共表达靶细胞上的PD-L1的结合，而对不表达Her2的细胞上的PD-1/PD-L1相互作用的阻断应远不如阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001172
有效，ii)当与曲妥珠单抗/
Figure BDA0003720714700001173
阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001174
和两者的组合相比时，至少一样有效且更具选择性地通过外周血单个核细胞裂解HER2/PD-L1共表达细胞。更具体地，根据本方法的化合物应该有效地裂解共表达HER2和PD-L1的细胞，而不应该发生仅表达PD-L1的细胞的裂解。
三体、DVD-三体和MATCH-4分子的设计和生产
本方法中设计的不同格式(三体、DVD-三体和MATCH-4)的描述如图3所示。关于所有分子的产生的数据在表14中详述，其显示了所产生的不同分子的结构域组成及其在分子中的位置的描述。不同结构域的靶点是：曲妥珠单抗：Her2；克隆14-11-D07：IL23R；克隆23-13-A01：人/小鼠SA；克隆28-21-D09：CD3e；克隆33-02-G02及其突变体：PD-L1。
表12：scFv在4℃下基于克隆ID 33-03-G02的克隆的scFv片段的4w稳定性研究。
Figure BDA0003720714700001175
Figure BDA0003720714700001181
表13：scFv在40℃下的4w稳定性研究。
Figure BDA0003720714700001182
表14：根据本方法的多特异性分子的组成
Figure BDA0003720714700001183
Figure BDA0003720714700001191
Figure BDA0003720714700001201
*VL/VH结构域间二硫键，根据A.Honegger编号
**突变，根据A.Honegger编号
方法：
使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行三体、DVD-三体和MATCH-4构建体的表达。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过Protein L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
通过SPR分析对人PD-L1、IL-23R、Her2、CD3ε以及人和小鼠血清白蛋白(SA)的亲和力
方法：
使用如上所述的Biacore T200装置(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振(SPR)测量来确定对PD-L1的亲和力。使用一对一的Langmuir结合模型，用Biacore分析软件(BIAevaluation，GE Healthcare)计算表观解离常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)。根据Chi2和U值监测拟合质量。除动力学测量外，通过拟合平衡时响应与浓度的关系图获得KD值(稳态亲和力测量)。
使用Biacore T200仪器通过SPR测量多特异性构建体对重组人CD3εECD(SinoBiological,cat.10977-H08H)、重组人IL-23R(由Trenzyme定制)和重组人Her2 ECD(SinoBiological,cat.10004-HCCH)的结合亲和力。所有测量均在25℃下进行。通过胺偶联将不同的蛋白质固定在传感器芯片(CM5传感器芯片，GE healthcare)上，以达到大约100个响应单位(RU)的固定水平。以30-50μl/min的流速将多特异性分子在运行缓冲液中的0.35至90nM系列稀释液(两倍稀释步长)注射到流动池中持续5-7分钟。使多特异性构建体从CM5芯片上的CD3ε、IL-23R和Her2上解离12分钟。在每次注射循环后，用一次10mM甘氨酸盐酸盐(pH 2)的注射使表面再生。获得的结合曲线是双参照的(空参照通道和零分析物注射)，用Biacore分析软件使用一对一Langmuir结合模型计算kd、ka和KD值，并基于Chi2和U值监测拟合的质量。由于使用一对一Langmuir结合模型的拟合显示CD3ε的曲线拟合质量次优，因此还使用双态反应模型计算KD。该模型描述了分析物与固定配体的1:1结合，随后是使复合物稳定的构象变化。
使用Biacore T200装置(GE Healthcare)通过SPR测量确定分子对人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的亲和力。使用胺偶联化学将SA直接偶联至CM5传感器芯片(GE Healthcare)。在进行再生探索和表面性能测试以找到最佳测定条件后，测试了浓度范围为0.7至180nM的目标分子的剂量响应。该分析在pH 5.5的PBS-Tween缓冲液中进行。该测定在pH 5.5的PBS-Tween缓冲液中进行。缔合和解离时间分别设置为180s和720s。获得的结合曲线是双参照的(空参照通道和零分析物注射)，并使用BiaEvaluation软件(GEHealthcare)和1:1Langmuir结合模型进行拟合。使用反演的动力学参数计算表观解离平衡常数(KD)。
结果：
如表15和表16所示，对于所有测试的分子，对CD3ε、人和小鼠血清白蛋白的结合是相似的，并且含有抗IL23R结构域的分子显示出相当的对IL23R的亲和力。通过SPR测定低亲和力结构域的亲和力是非常困难的，因为必须注射大量的蛋白质以覆盖对应于分子亲和力的浓度范围。因此，对于一些分子，不能获得对PD-L1亲和力的可靠测量。此外，在低亲和力结构域的情况下，SPR测量的稳态分析可能更合适，因为观察到高整体位移，这在动力学分析中引入了假象。对人PD-L1的亲和力测量仅对一个三体即PRO1498有效。对于MATCH-4分子，使用稳态分析获得了有效的测量值。对于PRO1544、PRO1545和PRO1547，对PD-L1的最低亲和力在900nM左右。PRO1543和PRO1546在300nM附近显示出相似的亲和力。携带λ加帽曲妥珠单抗G100C/G172C突变体抗Her2结构域的MATCH-4蛋白(PRO1543、PRO1544、PRO1557和PRO1558)显示出与Her2相似的亲和力(300至400pM)，这再次与掺入三体(PRO1497)和DVD-T三体(PRO1547和PRO1548)的曲妥珠单抗抗Her2结构域的亲和力相当。
表15：通过SPR测量本方法的构建体结合人PD-L1、Her2和IL23R的亲和力总结。
Figure BDA0003720714700001221
Figure BDA0003720714700001231
Figure BDA0003720714700001232
Figure BDA0003720714700001241
#：所达到的最大结合水平标准化为理论
Rmax
表16：通过SPR测量本方法的构建体结合人CD3ε、人和小鼠血清白蛋白(SA)的亲和力总结。
Figure BDA0003720714700001242
Figure BDA0003720714700001251
NA：不适用
通过FC分析PD-L1/PD-1中和
方法：
进行这些测定以评估多特异性低亲和力PD-L1x/Her2构建体中和PD-1与HCC1954细胞(该细胞也表达Her2)上表达的PD-L1之间相互作用的能力。具体来说，这些分子应该有效地阻断PD-1与Her2/PD-L1共表达靶细胞(HCC1954)上的PD-L1的结合，而在不表达Her2的细胞(HCC827)上的PD-1/PD-L1相互作用的阻断应该远不如阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001261
或纳武单抗/
Figure BDA0003720714700001262
有效。通过FC分析PD-1与细胞结合的阻断，并与参照IgG阿维单抗进行比较。此外，HCC827细胞被用作额外的对照，因为这些细胞表达PD-L1的水平与HCC1954细胞相当，但缺乏Her2的显著表达。
用10ng/ml人IFNγ刺激HCC1954和HCC827细胞24小时，以进一步诱导PD-L1的表达。第二天，分离HCC827和HCC1954细胞，用200g离心4分钟，重新悬浮在PBS/2％FCS/2mMEDTA(染色缓冲液)中，并接种到96孔PP微孔板中(50μl/孔)。在含有500ng/ml生物素化PD 1的染色缓冲液中，制备多特异性分子和阿维单抗的三倍稀释系列，分别从20μg/ml和5μg/ml开始。将HCC827和HCC1954的平板用200g离心4分钟，将稀释系列加入到细胞中(100μl/孔)并在室温下孵育30分钟。接下来，用150μl染色缓冲液洗涤平板一次，将链霉亲和素-PE溶液加入到细胞中(100μl/孔)并在4℃下孵育30分钟。作为下一步，如上所述再次洗涤细胞，然后将细胞重新悬浮在100μl染色缓冲液中。然后使用NovoCyte流式细胞仪(ACEABioscience Inc.)处理重悬的细胞进行荧光测量。报道了PE标记的PD-1的平均荧光强度，并使用s形4PL拟合(GraphPad Prism)对数据进行拟合。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参照分子阿维鲁单抗的IC50进行校准(相对IC50：IC50，阿维鲁单抗/IC50，测试分子)。此外，还计算了在高Her2表达HCC1954和低Her2表达HCC827细胞上发现的相对IC50值之间的比值。
结果：
表17总结了根据本方法获得的构建体中和PD-1/PD-L1相互作用的效力。在表达高水平Her2和PD-L1的HCC1954细胞上，携带单丙氨酸突变体PD-L1结构域(33-03-G02 G109A)的三体PRO1454显示出与阿维单抗相似的效力，而在仅表达PD-L1的细胞(HCC827)上，PRO1454的效力低14倍。携带双丙氨酸突变体33-03-G02 Q108A/G109A的三体PRO1497中和Her2/PD-L1阳性细胞(HCC1954)上的PD-1/PD-L1相互作用，几乎与PRO1454一样有效，如相似的相对IC50值所示(PRO1454：0.66，PRO1497：0.38)。然而，与PRO1454相反，PRO1497对表达PD-L1的细胞(HCC827)仅表现出非常弱的中和效力(图4)。这一发现显示，含有亲和力相当于携带两种突变(Q108A/G109A)的结构域的PD-L1结构域的分子，例如PRO1497，比亲和力与单丙氨酸突变体(G109A)相似的结构域，具有潜在的更大的治疗窗。
当与三体PRO1497比较时，所有含有曲妥珠单抗抗Her2结构域和携带两种突变(Q108A/G109A)的抗PD-L1结构域的MATCH-4分子具有相似的效力(相对IC50值，PRO1543：0.28，PRO1544：0.24)。PRO1543和PRO1546的滴定曲线如图5所示。沿着这条路线，含有曲妥珠单抗Her2结构域和携带两种突变(Q108A/G109A)的抗PD-L1结构域的DVD-三体PRO1547中和PD-1/PD-L1相互作用，其效力类似于PRO1497(相对IC50值，PRO1547：0.25)。
表17：流式细胞术分析中多特异性分子中和PD-L1/PD-1相互作用的能力。
Figure BDA0003720714700001271
Figure BDA0003720714700001281
NA：不适用
*IC50,阿维单抗(ng/ml)/IC50,测试分子(ng/ml)
通过NFAT报告基因检测CD3激活和PD-L1/PD-1相互作用阻断
方法：
在NFAT(活化T细胞的核因子)分析中测试T细胞活化，以评估分子对CD3交联和PD-1/PD-L1阻断的同时效应。具体而言，这些分子应该有效地诱导HER2/PD-L1共表达靶细胞(HCC1954)上的CD3活化，并阻断PD-1与PD-L1的结合，而在不表达Her2的细胞(CHO-PD-L1)上的CD3活化及PD-1/PD-L1相互作用的阻断应该弱得多。Jurkat PD-1NFAT报道T细胞系在IL-2启动子的NFAT效应元件的控制下表达荧光素酶报道基因。转录因子NFAT在CD3ε交联时被激活，并诱导许多参与T细胞激活的基因。在该系统中，CD3ε的交联诱导荧光素酶报道基因的表达。此外，PD-L1和PD-1之间的相互作用负调节这种CD3ε信号，从而减少萤火虫荧光素酶的表达。因此，该系统中PD-L1/PD-1相互作用的阻断导致荧光素酶活性增加。用10ng/ml IFNy刺激24小时以增加PD-L1表达的HCC1954细胞和表达PD-L1的CHO-K1细胞(克隆A2)用作靶细胞，并以每孔25000个细胞接种于96孔培养板上的50μl中。在含有50mg/ml HSA的测定培养基中制备待测分子的系列稀释液，并向细胞中加入25μl(最终浓度范围为250nM至0.026pM)。在含有50mg/ml HSA的测定培养基中制备表达PD-1的Jurkat NFAT报道细胞，并以每孔50000个细胞的细胞密度加入。通过添加荧光素酶试剂检测荧光素酶表达，并在添加Jurkat PD-1NFAT报道细胞后5或22小时通过发光读取器读取。给出了相对发光单位(RLU)。PRO1497是HER2xPD-L1high KDxCD3 scDb-scFv，其效力被用作计算半衰期延长分子的相对效力的参照。
结果：
通过NFAT报道基因分析评估了同时触发CD3激活和PD-L1/PD-1相互作用阻断的效力，结果如表18所示。将待测试的各个分子的系列稀释液以及参照scDb-scFvHer2xCD3xPD-L1低亲和力(PRO1497)加入到平板中。在Her2和PD-L1表达细胞HCC1954存在下，将各IC50值和最大激活标准化为参照分子PRO1497的IC50和最大激活(相对IC50或最大激活：IC50或最大激活，PRO1497对HCC1954/IC50或最大激活，测试分子)。在PD-L1/Her2表达细胞(HCC1954)存在下，Tribodies PRO1454、PRO1497和PRO1456以相似的EC50激活Jurkat细胞中的CD3信号传导，但是与含有抗IL-23R哑结构域而非抗PD-L1结构域的PRO1456相比，PRO1454和PRO1497(即携带低亲和力抗PD-L1结构域的分子)的最大激活更高(图6)。这表明在存在共表达Her2和PD-L1的细胞时，PRO1454和PRO1497同时阻断PD-L1并激活免疫突触内的CD3。与PRO1454相比，用PRO1455观察到的激活弱27倍，与PRO1497相比，用PRO1498观察到的激活甚至弱475倍，PRO1455和PRO1498是不携带抗Her2结构域但分别携带低亲和力抗PD-L1结构域33-03-G02 G109A或33-03-G02 Q108A/G109A的分子。这一发现显示，含有亲和力相当于携带两种突变(Q108A/G109A)的结构域的PD-L1结构域的分子，比亲和力与单丙氨酸突变体(G109A)相似的结构域，具有潜在的更大的治疗窗，两种分子均与不携带PD-L1结构域的分子(PRO1456)具有相似的效力。表18总结了效力，表明PRO1543对Her 2/PD-L1表达细胞(HCC1954)具有最好的效力，且在PD-L1/非常低Her2表达细胞(HCC827)存在时是效力最低之一。图7给出了在存在或不存在1μg/ml纳武单抗时PRO1543和对照分子PRO1546和PRO1557以及PRO1557与低亲和力PD-L1结构域PRO1434组合的滴定曲线。
表18.在NFAT报告基因检测中，分子触发CD3激活和中和PD-L1/PD-1相互作用的能力。
NFAT报告基因分析中PD-L1/PD-1相互作用的中和
Figure BDA0003720714700001301
Figure BDA0003720714700001311
NA：不适用
*:IC50,PRO1497对HCC1954(pM)/IC50,测试分子(pM) $:最大激活,PRO1497对HCC1954(RLU)/最大激活,测试分子(RLU)
**:IC50,PRO1454对HCC1954(pM)/IC50,测试分子(pM) $$:最大激活,PRO1454对HCC1954(RLU)/最大激活,测试分子(RLU)
***:IC50,PRO1543对HCC1954(pM)/IC50,测试分子(pM) $$$:最大激活,PRO1543对HCC1954(RLU)/最大激活,测试分子(RLU)
细胞毒性试验(T细胞驱动的靶细胞去除)
为了评估本方法的化合物选择性地将T细胞导向Her2和PD-L1共表达细胞的能力，在人PBMC存在下，使用Her2和PD-L1阳性细胞系(HCC1954)进行细胞毒性测定。本方法的化合物同时结合两个靶标，导致T细胞上CD3ε的交联，并激活信号级联，触发T细胞活化(CD69上调，细胞因子分泌)和细胞毒性颗粒的释放，最终导致靶细胞杀伤。与阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001312
和曲妥珠单抗/
Figure BDA0003720714700001313
的组合相比，本方法的化合物应该选择性裂解共表达PD-L1和HER2的细胞，而不裂解仅表达PD-L1的细胞(CHO.PD-L1转染子)。
方法：
血细胞分离：
根据制造商的说明书，使用淋巴细胞分离培养基Lymphoprep(StemcellTechnologies)从健康志愿者的新鲜血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)。简而言之，用人PBMC分离缓冲液(PBS，2％FCS，2mM EDTA)或食蟹猴PBMC分离缓冲液(PBS，5％FCS，2mMEDTA)以1:2稀释血液，并加到含有推荐量的Lymphoprep培养基的Leucosep管中。将LeucoSep管在室温下以800g(人血)或2000g(食蟹猴血)不中断地离心30分钟。然后，收集含有PBMC的细胞层并用人PBMC分离缓冲液洗涤两次，并在室温下使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞5分钟。然后将分离的人细胞用各自的分离缓冲液洗涤一次，并用测定培养基(RPMI-1640，10％FCS)洗涤一次。除去血小板后，将分离的PBMC以每毫升3x106个活细胞的密度重新悬浮在测定培养基中。
基于流式细胞术的体外细胞毒性试验(FC试验)、CD8+ T细胞活化和CD11c+、CD4+T细胞、CD8+ T细胞生存力：
两种细胞系用作靶细胞：HCC1954(共表达高水平的HER2和PD-L1)和HCC827细胞(共表达低水平的HER2和PD-L1)，用10ng/ml IFNy刺激24小时以增加PD-L1表达，以及CHO-PD-L1(无Her2且高PD-L1)和CHO-K1细胞系用作阴性对照细胞系。将预先用PKH67标记并在75μl测定培养基(RPMI-1640，10％FCS)中稀释的5000个活靶细胞添加到96孔板中。将25μl在测定培养基中稀释的6倍浓缩的测试蛋白添加到合适的孔中。将150000个稀释在50μl测定培养基中的存活效应细胞(PBMC)加入到每个孔中(E:T比为30:1)，并将板在室温下在nutating混合器上混合板，然后在37℃、5％CO2下孵育。16h或40h后，将细胞用胰蛋白酶消化，重悬于染色缓冲液(PBS，2％BCS，2mM EDTA)中，并转移至非结合板中。
对细胞进行不同标记物如CD69、CD8、CD4、CD11c和Annexin-V的染色。为了进行分析，重点是凋亡和死亡的靶细胞以及活化的CD8+ T细胞。由此，通过绿色荧光(PKH67)鉴定靶细胞，并通过Annexin-V APC分析其生存力。通过检测其表面的CD8(抗CD8 PerCP-Cy5.5)来鉴定效应细胞(CD8+细胞)。最后，通过定量CD69表达(抗CD69 PE)来检测CD8+ T细胞的活化。使用CD4来更好地区分CD8+和CD4+ T细胞。使用CD11c对单核细胞和树突状细胞进行染色。对于每种标记物，除Annexin-V抗体外，均在室温下在温和搅拌下孵育30分钟。用染色缓冲液洗涤细胞一次，用Annexin结合缓冲液洗涤一次，并且在搅拌下在室温下将Annexin-V染色进行30分钟。用Annexin-V结合缓冲液洗涤细胞一次，并在Novocyte流式细胞仪上进行流式细胞术分析。
根据以下公式计算特异性靶细胞裂解的百分比，
Figure BDA0003720714700001331
活化的CD8+ T细胞的百分比与CD69+CD8+ T细胞的比例相对应。
活CD4+、CD8+ T细胞和CD11c+细胞的百分比对应于不同细胞群体中膜联蛋白-V阴性细胞的比例。
结果：
使用基于流式细胞术的细胞毒性分析评估了所选MATCH-4分子PRO1543和PRO1895的细胞毒性潜力。获得的数据见表19，PRO1543和PRO1895以及对照分子PRO2290的滴定曲线见图8和图9。带有抗Her2和低亲和力抗PD-L1结构域的PRO1543和PRO1895彼此效力类似，并且比带有帕妥珠单抗表位抗Her2结构域但不含低亲和力抗PD-L1结构域的PRO2290更有效。该数据显示了免疫突触内PD-L1靶向的额外效果，导致改善的靶细胞裂解。
表19：PRO1543裂解靶细胞的能力。
Figure BDA0003720714700001332
在16小时和40小时后分析CD4+和CD8+ T细胞存活力。这给出了安全读数，因为活化的CD4+和CD8+ T细胞表达PD-L1但不表达Her2，并且也可能被PRO1543靶向。如表21和图10所示，PRO1543将CD4+和CD8+ T细胞活性降低了5％至10％，且仅在最高测试浓度下。这可以被认为对细胞生存力具有微小影响。
对表达不同Her2和PD-L1水平的细胞的细胞毒性测定(T细胞驱动的靶细胞去除)
方法：
使用与上述实施例相同的方法。四种细胞系被用作靶细胞：HCC1954(共表达高水平的HER2和PD-L1)，HCC1827(表达非常低水平的HER2和高水平的PD-L1)，用10ng/ml IFNy刺激24小时以增加PD-L1表达，MCF-7(表达低水平的HER2和非常低水平的PD-L1)以及CHO-PD-L1(无Her2和高PD-L1，购自BPS Bioscience。请注意，与用于表18和19、图8和9所示实验的CHO-PD-L1克隆A2细胞系相比，该细胞系表达PD-L1的水平低约9倍)。
结果：
细胞毒性试验的结果见表22以及图11和图12。结果表明，包含低亲和力PD-L1结构域的分子PRO1543在杀死表达HER2和PD-L1的细胞时具有优于PRO1557和PRO957的效力，但它不杀死不表达HER2的细胞。HER2和PD-L1的共表达只发生在癌细胞上。此外，与仅表达HER2的正常细胞相比，PRO1543更有效地介导HER2/PD-L1双阳性癌细胞的溶解。因此，与不含PD-L1结合结构域的分子相比，PRO1543显示出对双阳性细胞的选择性，因此不伤害表达HER2的正常细胞。由于缺乏PD-L1结合结构域，PR01557和PRO957没有这种选择性，它们的效力仅由靶细胞的HER2表达水平决定。
表21. 40小时后存活的CD4+和CD8+ T细胞的百分比
Figure BDA0003720714700001341
Figure BDA0003720714700001351
表22.PRO1543对不同靶细胞系的杀伤能力
Figure BDA0003720714700001352
Figure BDA0003720714700001361
评估PD-L1阻断和伴随的CD3局部刺激在人细胞系来源的乳腺导管癌异种移植模型HCC1954中的抗肿瘤功效
使用来自Taconic和同种异体人外周血单个核细胞的免疫缺陷型NOG小鼠品系，在人HCC1954导管乳腺癌异种移植物中，将本方法的化合物的抗肿瘤活性与抗PD-1疗法和抗PD-1抗Her2联合疗法进行比较。将PRO1678(scMATCH3)和PRO1543(MATCH4)对肿瘤体积的影响与用抗PD-1抗体(纳武单抗)和纳武单抗/抗Her2抗体(曲妥珠单抗)组合的治疗进行比较。使用一种不相关的IgG帕利珠单抗(palivizumab)作为对照IgG。也跟踪动物体重。
研究设置和治疗计划：
细胞注射以50％的PBS中的细胞悬浮液和50％的基底胶(Matrigel)的混合物注射，总注射量为100μl。将肿瘤细胞注射到NOG小鼠中并成功植入肿瘤后(中位肿瘤体积为80-100mm3)，通过静脉注射用5x106个人PBMC替代小鼠。随机分组当天，将每组四只小鼠用供体A的PBMC重建，另四只小鼠用供体B的PBMC重建。治疗将在PBMC注射后1-2小时开始，并按以下方式应用。
Figure BDA0003720714700001362
Figure BDA0003720714700001371
体重(表24)和通过测径器测量的肿瘤体积(表23和图13)每周进行两次。动物在第33天死亡。在一些少数组中，从第27天开始，几乎没有动物死亡。没有观察到体重减轻。
表231：相对肿瘤体积
Figure BDA0003720714700001372
Figure BDA0003720714700001381
表24：相对体重
Figure BDA0003720714700001382
实施例3：靶向HER2(作为TAA的实例)、PD-L1和CD173(作为共刺激性免疫细胞抗原的实例)的多特异性构建体的产生和测试:
MATCH4分子的设计和生产：
图14显示了在当前方法的这一部分中设计的MATCH-4分子的描述。分子组成如表25所示。
表25：多特异性分子的组成
Figure BDA0003720714700001391
Figure BDA0003720714700001401
*VL/VH结构域间二硫键，根据A.
Honegger编号
**突变，根据A.Honegger编号
方法：
使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行MATCH4构建体的表达。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过Protein L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
通过使用表达CD137的转NF-kB Jurkat报告细胞系的基于细胞的测定对抗Her2xCD137xHSAxPD-L1(低亲和力)MATCH4分子的CD137激动作用的评估
在该测定中，评估了Jurkat细胞中CD137信号传导的激活。通过测量Jurkat报告细胞系中，由CD137诱导的NF-kB活化所驱动的荧光素酶表达来报告CD137信号传导的活性。荧光素酶的表达与CD137的活性直接相关。而且，在Jurkat细胞和表达Her2的细胞系之间形成免疫突触会促进激活信号传导途径所需的CD137的聚集。因此，报告细胞系上CD137的聚集和激活需要Her2表达。
方法：
将癌细胞系HCC1954(高水平表达Her2和PD-L1)和HCC827(低水平表达Her2但高水平表达PD-L1)以每孔25000个细胞接种在96孔培养板上。然后，用10ng/ml IFNy刺激接种的细胞24小时，或者不刺激。接下来，制备目的MATCH4分子以及内部参照分子PRO1186或PRO1430(均为抗CD137xHSAxPD-L1(高亲和力)scMATCH3)的系列稀释液，并加入到细胞中。加入目标分子后，在含有25mg/ml HSA的测定培养基中制备Jurkat报告细胞，并以每孔40000个细胞的细胞密度添加。添加Jurkat细胞后24小时，通过添加荧光素酶试剂来检测荧光素酶的表达，并由发光读取器读取。通过将测试样品的相对发光单位(RLU)绘制成测试样品浓度的函数来呈现数据，并使用s形4PL拟合(GraphPad Prism)进行拟合。
结果：
如图15所示，当在HCC1954癌细胞存在下培养时，发现PRO1993在Jurkat报道细胞系中诱导CD137信号传导，而在HCC827癌细胞存在下，仅观察到CD137的轻微活化。表26显示了ND029分子的NF-kB报告基因分析的数据。
表26：ND029分子在NF-kB报告基因分析(CD137活性分析)中的效力。
Figure BDA0003720714700001411
Figure BDA0003720714700001421
*:IC50,PRO1430(pM)/IC50,测试分子(pM)
**:IC50,PRO1186(pM)/IC50,测试分子(pM)
$:相对于PRO1430
$$:相对于PRO1186
通过FC分析PD-L1/PD-1中和
方法：
进行这些测定以评估多特异性低亲和力PD-L1x/Her2构建体中和PD-1与HCC1954细胞(也表达Her2)上表达的PD-L1之间的相互作用的能力。具体来说，这些分子应该有效地阻断PD-1与HER2/PD-L1共表达靶细胞(HCC1954)上的PD-L1的结合，而在不表达Her2的细胞(HCC827)上的PD-1/PD-L1相互作用的阻断应该远不如阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001422
或纳武单抗/
Figure BDA0003720714700001423
有效。如上所述，在人SA存在下，通过流式细胞术分析PD-1与细胞结合的阻断。将要测试的各个分子的连续稀释液以及参照阿维鲁单抗加入到板中。将每个板上的各IC50值用在每个板上一起采集的参照分子阿维鲁单抗的IC50进行校准(相对IC50：IC50，阿维鲁单抗/IC50，测试分子)。此外，还计算了在高Her2表达HCC1954和低Her2表达HCC827细胞上发现的相对IC50值之间的比值。
结果：
表27总结了本方法的MATCH4构建体的效力。图16所示为PRO1993获得的PD-L1抑制曲线。
表27.流式细胞术分析多特异性分子在PD-L1/PD-1中和中的能力。
基于FC的分析中PD-L1/PD-1相互作用的中和
Figure BDA0003720714700001431
NA：不适用
*IC50,阿维单抗(ng/ml)/IC50,测试分子(ng/ml)
实施例4：靶向HER2(作为TAA的一个实例)和PD-L1的多特异性构建体的产生和测试：
scDb-scFv的设计和生产：
图17显示了在本方法的这一方面设计的不同scDb-scFv(scMATCH3)分子的描述。关于所有分子的产生的数据在表28中详述，其描述了所产生的不同分子的结构域组成及其在分子中的位置。
方法：
使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行scDb-scFv构建体的表达。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过Protein L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
表28：本方法的多特异性构建体的组成
Figure BDA0003720714700001441
Figure BDA0003720714700001451
*VL/VH结构域间二硫键，根据A.
Honegger编号
**突变，根据A.Honegger编号
通过SPR分析对人Her2、PD-L1以及人和小鼠血清白蛋白(SA)的亲和力
方法：
使用如上所述的Biacore T200装置(GE Healthcare)通过SPR测定对人PD-L1、Her2以及人和小鼠血清白蛋白(SA)的亲和力。获得的SPR传感图是双参照的(空参照通道和零分析物注射)，并使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)和1:1Langmuir结合模型进行拟合。根据Chi2和U值(Biacore)监测拟合质量。使用反演的动力学参数计算表观解离平衡常数(KD)。除了动力学测量之外，通过拟合平衡时响应对浓度的曲线获得了低亲和力PD-L1测量的KD值(稳态亲和力测量)。
结果：
如表29所示，所有测试分子与Her2和人SA的结合相似。使用稳态分析只能确定分子PRO1678和PRO1679对PD-L1的亲和力，对于这两种蛋白质，发现的亲和力是相当的(KD值，PRO1678：156nM，PRO1679：122nM)。
表29：本方法的scMATCH3构建体在pH5.5时针对人Her2、PD-L1以及人和小鼠血清白蛋白(SA)的亲和力总结。
Figure BDA0003720714700001461
Figure BDA0003720714700001471
NA：不
适用
通过FC分析PD-L1/PD-1中和
方法：
进行该测定以评估多特异性低亲和力PD-L1x/Her2构建体中和PD-1与HCC1954细胞(该细胞也表达Her2)上表达的PD-L1之间相互作用的能力。具体来说，这些分子应该有效地阻断PD-1与Her2/PD-L1共表达靶细胞(HCC1954)上的PD-L1的结合，而在不表达Her2的细胞(HCC827)上的PD-1/PD-L1相互作用的阻断应该远不如阿维单抗/
Figure BDA0003720714700001481
或纳武单抗/
Figure BDA0003720714700001482
有效。如上所述，在人SA存在下，通过流式细胞术分析PD-1与细胞结合的阻断。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参照分子阿维鲁单抗的IC50进行校准(相对IC50：IC50，阿维鲁单抗/IC50，测试分子)。此外，还计算了在高Her2表达HCC1954和低Her2表达HCC827细胞上发现的相对IC50值之间的比值。
结果：表30总结了本方法的scMATCH3构建体的效力。
表30.本方法的构建体在流式细胞术分析中中和PD-L1/PD-1相互作用的能力。
基于FC的分析中PD-L1/PD-1相互作用的中和
Figure BDA0003720714700001483
NA：不适用
*IC50,阿维单抗(ng/ml)/IC50,测试分子(ng/ml)
流式细胞术检测与表达Her2的SK-OV3和MCF-7细胞的结合
方法：
收获SK-OV3细胞(来自ATCC，cat.HTB-77，表达非常高水平的HER2和非常低水平的PD-L1的人卵巢癌细胞)、MCF-7(表达低水平的HER2和非常低水平的PD-L1的人乳腺癌细胞)和CHO PD-L1(来自Amsbio，表达高水平的PD-L1但不表达人Her2的对照细胞)并测定细胞数。将细胞悬浮液以400xg离心5分钟，并将在PBS-EB(1x DPBS，2％BCS H.I.，2mM EDTA)中稀释的100μl细胞悬浮液(50000个细胞)加入到非结合板的指定孔中。用PBS-EB洗涤三步后，离心细胞，吸出洗涤缓冲液。然后将待测样品(MATCH4分子：基于抗HER2曲妥珠单抗的PRO1543和基于抗HER2帕妥珠单抗的PRO1895)以50nM的浓度开始的100μl系列稀释液以及参照抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗直接加入板中。在4℃孵育1小时后，用100μl PBS-EB将平板洗涤三次。用MATCH4分子孵育的细胞沉淀用100μl Numab的框架特异性检测抗体重悬，随后通过加入浓度为2μg/ml的APC标记的抗兔IgG抗体进行检测，并在4℃孵育1小时。用参照抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗分子孵育的细胞沉淀用浓度为5μg/ml的RPE标记的100μl抗人Fc抗体重悬，并在4℃孵育1小时
接下来，将细胞再次用100μl的PBS-EB洗涤3次。将细胞沉淀用50μl PBS-EB重悬，并用NovoCyte 2060流式细胞仪进行分析。记录每个样品的5,000个事件的APC和RPE通道的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均值。数据是单参照的(减去在仅用缓冲液和检测抗体孵育的细胞上发现的荧光强度)，获得的浓度-反应曲线使用4-PL拟合(GraphPadprism软件)进行拟合。
结果：
使用流式细胞术评估结合SK-OV3、MCF-7和CHO PD-L1的表观结合亲和力。每个平板上的各EC50值根据各自参照分子的EC50进行校准(即，对于PRO1543为曲妥珠单抗，对于PRO1895为帕妥珠单抗)。获得的EC50和相对EC50以及流式细胞仪中的最大结合如表31所示。浓度-反应曲线如图19所示。
如表31所示，MATCH4分子与表达高水平HER2的SK-OV3细胞结合，其表观结合亲和力与临床阶段抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相当。该结果表明，由于亲合力效应(与HER2和PD-L1结合)，当测试与高水平表达HER2和PD-L1(即使表达非常低)的细胞的结合时，MATCH4分子可以赶上二价抗HER2抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的表观结合亲和力。
另一方面，当评估与以非常低的水平表达两种抗原的细胞(例如MCF-7细胞)的结合时，MATCH4的表观结合亲和力低于临床阶段抗体的结合亲和力，这是由于缺乏MATCH4分子的亲和力。发现帕妥珠单抗和基于帕妥珠单抗的MATCH4分子PRO1895与CHO PD-L1细胞的残留结合，这与曲妥珠单抗和基于曲妥珠单抗的MATCH4分子PRO1543的不结合形成对比。人们可能推测，帕妥珠单抗能够结合仓鼠HER2，而结合不同表位的曲妥珠单抗则不能。在任何情况下，这些数据表明MATCH4分子中掺入的低亲和力抗PD-L1部分不能与仅表达PD-L1的细胞结合。
通过流式细胞术分析与表达Her2的HCC1954和HCC827细胞的结合
方法：
在流式细胞仪中评估PRO1543和PRO1895以及临床阶段抗HER2抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗与HCC1954(高水平表达Her2和PD-L1)和HCC827(低水平表达Her2但高水平表达PD-L1)结合的表观亲和力。用IFNy刺激HCC827和HCC1954细胞24小时，以进一步增加PD-L1的表达，然后在如上所述的流式细胞术实验中进行测试，除了蛋白质的稀释系列以150nM开始。
表31：MATCH4分子PRO1543和PRO1895与SK-OV3、MCF-7和CHO PD-L1细胞的质膜结合。
表显示了EC50和相对EC50(相对于各自的参照抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗标准化)以及通过流式细胞术获得的最大结合
流式细胞术中的质膜结合
Figure BDA0003720714700001521
Figure BDA0003720714700001531
结果：
每个平板上的各EC50值根据各自参照分子的EC50值进行校准(即，对于PRO1543为曲妥珠单抗，对于PRO1895为帕妥珠单抗)。获得的EC50和相对EC50以及流式细胞仪中的最大结合如表32所示。浓度-反应曲线如图20所示。
如表32所示，MATCH4分子与IFNy刺激的表达高水平PD-L1和低水平HER2的HCC827细胞结合，其表观结合亲和力与临床阶段抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相当。另一方面，当评估与高水平表达两种抗原的细胞(IFNy刺激的HCC1954细胞)的结合时，MATCH4的表观结合亲和力不如临床阶段抗体的结合亲和力。
流式细胞术中PRO1543和帕妥珠单抗以及PRO1895和曲妥珠单抗与SK-OV3细胞的伴随结合
方法：
在存在饱和浓度的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的情况下，通过流式细胞术评估MATCH4分子与表达HER2的SK-OV3细胞结合的能力。在加入MATCH4分子之前，将导致与SK-OV3细胞饱和结合的高浓度抗体(50nM)加入细胞中，而不是测试曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的系列稀释物。在4℃下将细胞与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗孵育1小时后，向细胞中加入以50 nM开始的MATCH4分子的系列稀释液。然后如上所述通过流式细胞术评估MATCH4分子PRO1543和PRO1895的质膜结合。
结果：
每个板上的各EC50值对照各自对照的EC50值进行校准(即，在不添加抗HER2抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的情况下MATCH4分子的结合)。获得的EC50和相对EC50以及流式细胞仪中的最大结合如表33所示。浓度-反应曲线如图21所示。
如表33和图21所示，在不存在抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的情况下，MATCH4分子与SK-OV3细胞结合，其表观结合亲和力与之前描述的实验中发现的亲和力相当(见表31)。值得注意的是，PRO1543也可以在存在帕妥珠单抗的情况下与细胞结合，PRO1895也可以在存在曲妥珠单抗的情况下与细胞结合，其结合亲和力类似于在不存在相应抗体的情况下获得的亲和力(比较相对EC50值)。另一方面，当SK-OV3细胞在加入MATCH4分子之前分别与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗孵育时，没有发现PRO1543和PRO1895的结合。由于PRO1543含有曲妥珠单抗的抗HER2结合部分，而PRO1895含有帕妥珠单抗的抗HER2结合部分，因此在本实验中预期并证实了在帕妥珠单抗存在下PRO1543的结合和在曲妥珠单抗存在下PRO1895的结合。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗与人类HER2上不同的非重叠表位结合。
表32：MATCH4分子PRO1543和PRO1895与HCC1954 and HCC827细胞的质膜结合。表显示了EC50和相对EC50(相对于各自的参照抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗标准化)以及通过流式细胞术获得的最大结合。
流式细胞术中的质膜结合
Figure BDA0003720714700001541
Figure BDA0003720714700001551
Figure BDA0003720714700001561
表33：在曲妥珠单抗和帕妥珠单抗存在下，MATCH4分子PRO1543和PRO1895与SK-OV3细胞的质膜结合。表显示了EC50和相对EC50(相对于各自的参照样品标准化，无曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)以及通过流式细胞术获得的最大结合。
流式细胞术中的质膜结合
Figure BDA0003720714700001562
Figure BDA0003720714700001571
序列表
<110> 努玛治疗有限公司
<120> 多特异性抗体
<130> 115322P877PC
<150> EP19206959.9
<151> 2019-11-04
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 2
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Lys Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 4
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Ala Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
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<223> 基于人工抗体的序列
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Gly
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<213> 人工序列
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Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 28
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 30
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala
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<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 31
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 32
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile
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<223> 基于人工抗体的序列
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Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 42
Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu Gly
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 45
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 46
Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 47
Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu
1 5 10
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 48
Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn Asn Gln Leu Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 49
Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 50
Ala Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 53
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 54
Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 55
Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 56
Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 57
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 58
Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala
1 5 10
<210> 59
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 60
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn
85 90 95
Phe Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 61
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 62
His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 63
Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 64
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 65
Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser
1 5
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 66
Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr
1 5 10
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 69
Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 70
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 70
Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 71
Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Tyr Pro Cys
1 5 10
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 72
Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn Trp Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 73
Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu
1 5 10
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 74
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 75
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 76
Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp Gly Asn Ala
1 5 10
<210> 77
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp
85 90 95
Gly Asn Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 79
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
245 250 255
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
260 265 270
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
290 295 300
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
305 310 315 320
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
325 330 335
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
405 410 415
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
420 425 430
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
435 440 445
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
450 455 460
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
465 470 475
<210> 80
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
225 230 235 240
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
245 250 255
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
260 265 270
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala
275 280 285
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
290 295 300
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Gln Gln Ala Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr
325 330 335
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
355 360 365
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys
385 390 395 400
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val
405 410 415
Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
420 425 430
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
435 440 445
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
450 455 460
Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
465 470 475 480
Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 81
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln
245 250 255
Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
260 265 270
Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
275 280 285
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
290 295 300
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly
325 330 335
Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
355 360 365
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
370 375 380
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val
385 390 395 400
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala
405 410 415
Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile
420 425 430
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
435 440 445
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr
450 455 460
Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
465 470 475 480
Ser Ser
<210> 82
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
245 250 255
Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu
275 280 285
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly
325 330 335
Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
355 360 365
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met
385 390 395 400
Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys
405 410 415
Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
420 425 430
Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
435 440 445
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
450 455 460
Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr
465 470 475 480
Leu Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 83
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
245 250 255
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
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Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
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Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
405 410 415
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
420 425 430
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
435 440 445
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450 455 460
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
465 470 475
<210> 84
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
245 250 255
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
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Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala
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Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
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Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
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Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
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Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 85
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
245 250 255
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Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
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Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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465 470 475
<210> 86
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
225 230 235 240
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
245 250 255
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
260 265 270
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala
275 280 285
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
290 295 300
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr
325 330 335
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
355 360 365
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys
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Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
435 440 445
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 87
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln
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275 280 285
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
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<210> 88
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 88
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
245 250 255
Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu
275 280 285
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly
325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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485
<210> 89
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
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245 250 255
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser
275 280 285
Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
290 295 300
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
305 310 315 320
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
325 330 335
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp
340 345 350
Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
370 375 380
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr
465 470 475 480
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 90
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
145 150 155 160
Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn
225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
325 330 335
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
355 360 365
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
420 425 430
Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr
435 440 445
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
450 455 460
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
465 470 475 480
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly
485 490 495
Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 91
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
145 150 155 160
Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
195 200 205
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn
225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
260 265 270
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
275 280 285
Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
290 295 300
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
305 310 315 320
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
325 330 335
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
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Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu
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420 425 430
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
435 440 445
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
450 455 460
Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr
465 470 475 480
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485 490
<210> 92
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
275 280 285
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305 310 315 320
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
325 330 335
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355 360 365
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Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser
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Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp
485 490 495
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505
<210> 93
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
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Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
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Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
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Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn
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Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
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Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
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325 330 335
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Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
435 440 445
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450 455 460
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485 490
<210> 94
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile
145 150 155 160
Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn
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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr
225 230 235 240
Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
275 280 285
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
290 295 300
Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro
305 310 315 320
Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
325 330 335
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
340 345 350
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser
355 360 365
His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
405 410 415
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala
420 425 430
Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly
435 440 445
Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
450 455 460
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr
485 490 495
Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 95
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn
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435 440 445
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450 455 460
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<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
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Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
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Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
420 425 430
Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr
435 440 445
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
<210> 97
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln
130 135 140
Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
165 170 175
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
195 200 205
Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Thr Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
245 250 255
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
275 280 285
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
290 295 300
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
340 345 350
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
355 360 365
Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe
370 375 380
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
385 390 395 400
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
405 410 415
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
420 425 430
Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr
435 440 445
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
485 490 495
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
500 505 510
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile
515 520 525
Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
530 535 540
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
545 550 555 560
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
565 570 575
Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly
580 585 590
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595
<210> 98
<211> 618
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145 150 155 160
Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr
180 185 190
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250 255
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
260 265 270
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
275 280 285
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
290 295 300
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
325 330 335
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
340 345 350
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
355 360 365
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
370 375 380
Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
405 410 415
Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
420 425 430
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
435 440 445
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp
450 455 460
Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
500 505 510
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser
515 520 525
Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
530 535 540
Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala
545 550 555 560
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn
565 570 575
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
580 585 590
Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp
595 600 605
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
610 615
<210> 99
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln
130 135 140
Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
165 170 175
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
195 200 205
Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Thr Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
245 250 255
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
275 280 285
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
290 295 300
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
340 345 350
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
355 360 365
Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe
370 375 380
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
385 390 395 400
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
405 410 415
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
420 425 430
Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr
435 440 445
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
485 490 495
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
500 505 510
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile
515 520 525
Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
530 535 540
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
545 550 555 560
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
565 570 575
Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly
580 585 590
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595
<210> 100
<211> 620
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145 150 155 160
Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr
180 185 190
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250 255
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
260 265 270
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
275 280 285
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
290 295 300
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
325 330 335
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
340 345 350
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
355 360 365
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
370 375 380
Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
405 410 415
Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
420 425 430
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
435 440 445
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn Pro Asp
450 455 460
Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
500 505 510
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe
515 520 525
Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
530 535 540
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr
545 550 555 560
Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
565 570 575
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
580 585 590
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys
595 600 605
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
610 615 620
<210> 101
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
260 265 270
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser
275 280 285
Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
290 295 300
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
305 310 315 320
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
325 330 335
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp
340 345 350
Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
370 375 380
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr
465 470 475 480
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 102
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile
145 150 155 160
Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn
180 185 190
Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr
225 230 235 240
Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
275 280 285
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
290 295 300
Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro
305 310 315 320
Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
325 330 335
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
340 345 350
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser
355 360 365
His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
405 410 415
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala
420 425 430
Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly
435 440 445
Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
450 455 460
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr
485 490 495
Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 103
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile
145 150 155 160
Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn
180 185 190
Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr
225 230 235 240
Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
260 265 270
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln
275 280 285
Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
290 295 300
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
305 310 315 320
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
325 330 335
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
340 345 350
Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Cys Gly Thr
355 360 365
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
370 375 380
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
385 390 395 400
Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala
405 410 415
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser
420 425 430
Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
435 440 445
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
450 455 460
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp
465 470 475 480
Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485 490
<210> 104
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
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130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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260 265 270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
275 280 285
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser
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435 440 445
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Phe Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp
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<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 105
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
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195 200 205
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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465 470 475 480
Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 106
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 106
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 107
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485
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala
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Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly
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465 470 475 480
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485 490 495
Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 109
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 109
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
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<210> 110
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 110
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500 505 510
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<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 111
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195 200 205
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Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser
275 280 285
Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
290 295 300
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Asn Phe Gly Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
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450 455 460
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Val Leu Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 112
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Ser
<210> 113
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 113
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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545 550 555 560
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser
645 650 655
Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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<211> 749
<212> PRT
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 118
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<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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<211> 751
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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625 630 635 640
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
645 650 655
Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
660 665 670
Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr
675 680 685
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
690 695 700
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
705 710 715 720
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly
725 730 735
Ala Phe Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
740 745 750
<210> 123
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
195 200 205
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210 215 220
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
260 265 270
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr
275 280 285
Ser Asn Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
290 295 300
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
305 310 315 320
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
325 330 335
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe
340 345 350
Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val
355 360 365
Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
370 375 380
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln
405 410 415
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420 425 430
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
435 440 445
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
450 455 460
Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe
465 470 475 480
Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485 490
<210> 124
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 124
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
145 150 155 160
Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
195 200 205
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn
225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
325 330 335
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
355 360 365
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Ser Leu Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala
485 490 495
Phe Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 125
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser
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Arg Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln
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Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
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Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
435 440 445
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
450 455 460
Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly
465 470 475 480
Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 126
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 126
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Tyr Ile Ile Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
145 150 155 160
Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe Asn
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Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
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Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr
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485 490 495
Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 127
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
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210 215 220
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser
275 280 285
Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
290 295 300
Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
305 310 315 320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
325 330 335
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser
340 345 350
Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
355 360 365
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser
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405 410 415
Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val
420 425 430
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435 440 445
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly
450 455 460
Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
465 470 475 480
Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 128
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
130 135 140
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe
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Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr
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Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
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Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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370 375 380
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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405 410 415
Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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435 440 445
Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
450 455 460
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465 470 475 480
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe
485 490 495
Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505
<210> 129
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp
275 280 285
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
290 295 300
Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
305 310 315 320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
325 330 335
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340 345 350
Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
370 375 380
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 130
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 130
Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg
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35 40 45
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115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
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Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
260 265 270
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu
275 280 285
Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
290 295 300
Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser
305 310 315 320
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
340 345 350
Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
385 390 395 400
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser
405 410 415
Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu
420 425 430
Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr
435 440 445
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys
450 455 460
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Ala Ser Asp Ala Phe Asn Leu
485 490 495
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505
<210> 131
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser
260 265 270
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
275 280 285
Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
290 295 300
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly
305 310 315 320
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
325 330 335
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
340 345 350
Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu
355 360 365
Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
370 375 380
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
385 390 395 400
Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
405 410 415
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu
420 425 430
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
435 440 445
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
450 455 460
Tyr Cys Gln Ala Gly Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly
465 470 475 480
Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
485
<210> 132
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
260 265 270
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser
275 280 285
Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn
325 330 335
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Ala Ser Asp Ala Phe Asn Leu Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
385 390 395 400
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu
420 425 430
Trp Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp
435 440 445
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
450 455 460
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
465 470 475 480
Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp
485 490 495
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505
<210> 133
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 133
Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly Pro Phe Lys Leu Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
260 265 270
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
275 280 285
Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
290 295 300
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
305 310 315 320
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
325 330 335
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile
340 345 350
Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
370 375 380
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
385 390 395 400
Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
405 410 415
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro
420 425 430
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
435 440 445
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Gly
450 455 460
Tyr Ile Ile Thr Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
465 470 475 480
Thr Val Leu Gly
<210> 134
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro
260 265 270
Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser
275 280 285
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro
290 295 300
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val
305 310 315 320
Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser
325 330 335
Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
340 345 350
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Ala Ser
355 360 365
Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
405 410 415
Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
420 425 430
Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly
435 440 445
Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val
450 455 460
Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe
485 490 495
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 135
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp
275 280 285
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
290 295 300
Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
305 310 315 320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
325 330 335
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Gly Tyr Ile Ile Thr
340 345 350
Asp Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Phe Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
370 375 380
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
385 390 395 400
Glu Ser Ile Asn Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
405 410 415
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val
420 425 430
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
435 440 445
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly
450 455 460
Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr
465 470 475 480
Val Leu Gly
<210> 136
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser
225 230 235 240
Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
290 295 300
Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Ala Gly Asp Ile Ala
305 310 315 320
Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
325 330 335
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
340 345 350
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Ser Thr Gly
355 360 365
Pro Phe Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro
385 390 395 400
Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser
405 410 415
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val
435 440 445
Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser
450 455 460
Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
465 470 475 480
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Ala Ser
485 490 495
Asp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 137
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 137
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 138
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 139
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工接头序列
<400> 139
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工接头序列
<400> 140
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工接头序列
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 序列GGXXS在接头序列中出现2、3、4、5或6次
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(4)
<223> X是G或者不存在
<400> 141
Gly Gly Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 142
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 143
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 143
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Asp Ala Val Tyr Gly Tyr Ala Asn Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 144
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Val
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly
85 90 95
Asp Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 145
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 146
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 147
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 148
Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 149
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 150
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 151
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu Gly
1 5 10
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 152
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
<210> 153
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 153
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255

Claims (14)

1.一种多特异性抗体，其包括
(a)与PD-L1特异性结合的第一结构域，其包括SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列，和
(b)特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结构域。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述TAA选自由以下组成的组：EGFRvlll、5T4、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、IL4RA、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、IL-13RA2、ROR1、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、CLEC12A、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu(HER2)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、Ephrin B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、CD33、CD123、CD133、CD135、TEM7R、FAP、Legumain、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧酸酯酶、muthsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4；GPC3、CDH3、B7H3；FGFR1、SSTR2、CECAM6、GA733和gp120；特别是，其中所述TAA选自HER2和间皮素，更特别是HER2。
3.根据权利要求2所述的多特异性抗体，其中所述第二结构域包括SEQ ID NO:34的VH序列和SEQ ID NO:36的VL序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性抗体，还包含特异性结合免疫细胞抗原的第三结构域，特别是其中所述免疫细胞抗原存在于T细胞或NK细胞上。
5.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是激动剂，且所述第二免疫检查点抗原是刺激性免疫细胞抗原，特别是其中所述刺激性免疫细胞抗原选自由CD3和CD16组成的组，更特别是CD3。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域包括SEQ ID NO:43的VH序列和SEQ ID NO:44的VL序列。
7.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是激动剂，且所述第二免疫检查点抗原是共刺激性免疫细胞抗原，特别是其中所述共刺激性免疫细胞抗原选自由以下组成的组：CD137、CD28、ICOS、HVEM、CD27、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、2B4、TIM1、TIM2、CD226，更特别是CD137。
8.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域在CD137的胞外结构域的远端部分中所包含的表位处特异性结合CD137，特别是在富含半胱氨酸的结构域CRD1和/或CRD2内，更特别是在SEQ ID NO:153的氨基酸残基24-86内，条件是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域包括SEQ ID NO:77的VH序列和SEQ ID NO:78的VL序列。
10.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中所述第三结构域是抑制剂，且所述第二免疫检查点抗原是抑制性免疫检查点抗原，特别是其中所述抑制性免疫检查点抗原选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、PD-1、淋巴细胞激活基因3、及T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3、BTLA、TIM3、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-1、及B7-H1。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，还包括与人血清白蛋白(HSA)特异性结合的结构域。
12.根据权利要求11所述的多特异性抗体，其中所述与HSA特异性结合的结构域包括：
(a)SEQ ID NO:51的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列，
(b)SEQ ID NO:59的VH序列和SEQ ID NO:60的VL序列，
(c)SEQ ID NO:67的VH序列和SEQ ID NO:69的VL序列，或
(d)SEQ ID NO:68的VH序列和SEQ ID NO:70的VL序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三体(Fab-(scFv)2)或双体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD，MATCH和DuoBodies，特别是其中所述抗体是scDb-scFv、三体、DVD-三体、MATCH，特别是其中所述多特异性抗体是MATCH或三体形式，更特别是其中所述多特异性抗体是MATCH形式，更特别是其中所述多特异性抗体是MATCH3或MATCH4。
14.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体为MATCH4形式，且包含根据SEQ ID NO:123和124、或SEQ ID NO:127和128的两条链。
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