JP2020522260A - 新規抗ｃｄ３抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトCD3に、特にCD3εドメインに特異的である新規抗体に関する。【選択図】図２
Description
本発明は、ヒトCD3、特にCD3εドメインに特異的である新規抗体に関する。
本発明は、高親和性と高効力を併せ持つ新規抗CD3抗体、特にCD3εドメインに対する抗体、および特に、改善された特異性と交差反応性プロファイルを有する新規抗体に関する。
Ｔ細胞受容体すなわちTCRは、Ｔリンパ球（またはＴ細胞）の表面上に認められる分子であって、抗原提示細胞（APC）の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。TCRと抗原との結合は比較的低親和性である。TCRが抗原およびMHCと会合すると、関連する酵素、コレセプター、特殊なアクセサリー分子および活性化もしくは放出された転写因子により媒介される一連の生化学的過程を通してＴリンパ球が活性化される。
TCRは、哺乳類では３つの異なる鎖（γ、δおよびε）と、ζ2（CD247）鎖またはζ／η鎖のいずれかとを有する、CD3のような別の分子と会合する。それらのアクセサリー分子は膜貫通領域を有し、TCRからのシグナルを細胞中に伝達するために不可欠である；TCRの細胞質テールは非常に短く、そのためそれはシグナル伝達に関与しないと思われる。CD3およびζ鎖はTCRと一緒になって、Ｔ細胞受容体複合体として知られる複合体を形成する。
CD3εはある種のＴ細胞の表面上に発現されるＩ型膜貫通タンパク質である。それはＴ細胞受容体（TCR）複合体に関与し、この複合体の別のドメインと相互作用する。それらの相互作用相手の１つは、１：１化学量論でCD3εに結合するCD3γである（De la Hera他、J. Exp. Med. 1991; 173: 7-17）。抗原提示細胞（APC）の表面上に存在するMHCぺプチド複合体へのTCRの結合と、それに続いてAPCに沿って起こるＴ細胞の移動は、TCR複合体の一定の回転を引き起こし、互いに関してCD3εとCD3γの転位を生じ、それが効率的なTCRシグナル伝達と結果としてＴ細胞の活性化に必要である。CD3εに対するある種の抗体は、他のものでは誘導しないTCRシグナル伝達を誘導することが証明されている。TCR活性化抗体は、典型的にはCD3ε上に露出したエピトープに結合し、その一方で幾つかの非刺激性抗体はCD3εとCD3γの間の界面に結合するか、またはCD3εとCD3γに同時に結合し、かくして恐らくCD3εとCD3γの相対的変位を妨害するであろうと示されている（Kim他、JBC. 2009; 284:31028-31037）。
ペプチド−MHC複合体は低親和性でかつ急速なオフ速度でTCRを結合することが十分に確立されている（Matsui他、Science 1991; 254: 1788-1791；Weber他、Nature 1992; 356: 793-796）。この低親和性は、少数のペプチド−MHC複合体が、結合と解離を繰り返すことによって多数のTCRを次々とトリガーすると示唆されている。この連続的なトリガーは、一定時間の間シグナル伝達を保持し、Ｔ細胞が最終的に活性化閾値に到達できるようにするために重要である（Valitutti他、Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia他、Cell 1999; 96: 1-4）。この概念は、高親和性抗CD3抗体が１：１化学量論でTCRをトリガーするため、ペプチド−MHC複合体に比較すると、それらの抗CD3抗体がＴ細胞を効率的に刺激しないという知見により裏付けられ（Viola他、Science 1996; 273: 104-106）、低親和性抗体がCD3εを繰り返し解離し再結合する能力を有するためにTCRシグナル伝達を介してＴ細胞を刺激するのにより効果的であり得ることを示唆している。実際、全てが異なる親和性で結合する抗CD3ε抗体TR66の３つの誘導体の直接比較において、中間の親和性を有する野生型TR66は、それより高いまたは低い親和性を有するその誘導体と比較した時に、Ｔ細胞活性化において最高の効能を示した（Bortoletto他、J. Immuno. 2002; 32:3102-3107）。よって、TR66の値に近いＫDは、Ｔ細胞の刺激に理想的である。TR66の親和性は表面プラズモン共鳴（SPR）技術の利用により並びにフローサイトメトリーにより決定されており、2.6×10-7 M（Moore他、Blood 2011; 117: 4542-4551）および1.0×10-7 M（Amann他、Cancer Res. 2008; 68: 143-151）の平衡解離定数をそれぞれ与えた。これと並列して、10-8 M未満の親和性を有する抗CD3抗体（米国特許第7,112,324号）、およびヒト治療用に発表されている、同程度にヒトCD3εを結合するＴ細胞刺激性抗体を使用することが推奨されている。従って、連続TCR誘発の理論に従えば、更に抗CD3ε抗体について発表された結果と一致して、発表されたものよりも有意に高い親和性を有するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞の有力な刺激剤であるとは予想されず、反対に、弱い活性化剤であると予想される。
CD3εに対する公表された抗体の幾つかは、Ｔ細胞製剤を用いた動物の免疫処置とその後のいわゆるハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体の単離により作製されている。このアプローチの弱点は、一方で動物における外来（ヒト）のＴ細胞の様々な抗原に対する非選択的免疫応答と、他方でハイブリドーマ技術の乏しい効率のため、Ｔ細胞刺激活性を有するモノクローナル抗体を同定する確率が減少してしまうことであり、更にそれらのアゴニスト性抗体が抗CD3ε抗体の全体において少数派を占めるという理由もある。
別のＩ型膜貫通タンパク質による動物の免疫処置には、精製された細胞外ドメイン（ECD）を使用することが特に有用であり続けている。しかしながら、CD3εの精製ECDは凝集する傾向があり、凝集体は生来のタンパク質に比較して改変した構造を有することがある。更にこのアプローチはCD3εとCD3γの間の界面に結合する抗体を優先的に導く。対照的に、フレキシブルなペプチドリンカーによって連結された一本鎖タンパク質として産生されるCD3εとCD3γの複合体は、モノマー（単量体）画分においてかつその生来のコンホメーション（立体構造）で精製することができる（Kim他、JMB. 2000; 302: 899-916）。しかしながら、そのようなCD3ε/γ一本鎖タンパク質による動物の免疫処置は、CD3εとCD3γに同時に結合する抗体を生じ、これはアンタゴニスト効果をもたらし得る。
ヒトCD3εに対する幾つかの抗体が今までに開発されている。
モノクローナル抗体SP34は、非ヒト霊長類CD3と交差反応し、そしてヒトと非ヒト霊長類PBMCの両方に細胞増殖を誘導することもできるマウス抗体である（Pessano他、The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20 kD T3 (T3δ and T3ε) subunits. EMBO J 4 (1985) 337-344）。
WO 2007/042261 およびWO 2008/119567（共にMicromet（現名称Amgen Research (Munich)）に譲渡された）は、CD3ε中のエピトープFSEXEおよびQDGNEそれぞれに対する交差反応性バインダーを開示している。特許付与された欧州特許第EP 2 155 783号（WO 2008/119567の国内段階に基づく）に対する数名の異議申立人により提出された異議申立てにおいて、SP34はエピトープQDGNEにも同様に結合していると提起されている。
WO 2014/191113は、CD3εのＮ末端にある新規エピトープに対する交差反応性バインダーを開示しており、前記エピトープは結合に不可欠な残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含み、そして前記エピトープは結合に関与する残基としてアミノ酸残基Ｅ６を更に含む。それらの抗体は高い親和性と高い効力を示すことが証明できる。しかしながら、WO 2014/191113において、その中に開示された抗体が、非ヒト霊長類からのCD3とインビトロで交差反応することを証明することができたのに対し、細胞環境中でカニクイザルCD3に対しては交差反応性を示すことができなかった。よって、これらの抗体は、抗CD3抗体を含む医薬品の前臨床開発に関してかなり限定的な用途を有するものである。
よって、新規CD3結合分子、特に所望の親和性と効力プロファイルを示すが、その上他の種、特にカニクイザルなどの非ヒト霊長類、と交差反応性である新規抗CD3抗体を開発する満たされていないニーズがまだ存在する。
本発明は、上記ニーズに対処し、かつヒトCD3に特異的である新規抗体、特にCD3εドメインに特異的である抗体を提供する。本発明により提供される解決手段、すなわちCD3結合分子、特にウサギのペプチド免疫処置とアフィニティー成熟記憶Ｂ細胞のスクリーニングにより得られる抗CD3抗体、特にCD3結合分子、特に必要な交差反応性プロファイルを有する抗CD3抗体、特にCD3εドメインに特異的な抗体は、今までのところ従来技術により達成または示唆されていない。本発明の新規CD3抗体は、望ましい親和性と力価プロファイルを示し、インビトロと細胞環境の両方において、他の種、特にカニクイザルなどの非ヒト霊長類と交差反応性である。その上、本発明の抗体は望ましい生物物理学的特性、例えば品質、安定性または溶解性、例えば単量体形の抗体の比率および示差走査蛍光測定法（DSF）により決定されるような熱変性により定義される特性を有する。
第一の観点では、本発明は、ヒトCD3に特異的である抗体またはその機能的断片であって、以下：
可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで各LFWは軽鎖フレームワーク領域を表し、そして各LCDRは軽鎖相補性決定領域を表し、そして前記LCDRは一緒になって、配列番号４に記載のVL配列から得られる対応するLCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変軽鎖；および
可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで各HFWは重鎖フレームワーク領域を表し、そして各HCDRは重鎖相補性決定領域を表し、そして前記HCDRは一緒になって、配列番号８に記載のVH配列から得られる対応するHCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変重鎖
を含む前記抗体またはその機能的断片に関する。
可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで各LFWは軽鎖フレームワーク領域を表し、そして各LCDRは軽鎖相補性決定領域を表し、そして前記LCDRは一緒になって、配列番号４に記載のVL配列から得られる対応するLCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変軽鎖；および
可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで各HFWは重鎖フレームワーク領域を表し、そして各HCDRは重鎖相補性決定領域を表し、そして前記HCDRは一緒になって、配列番号８に記載のVH配列から得られる対応するHCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変重鎖
を含む前記抗体またはその機能的断片に関する。
第二の観点では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片を含む多重特異的ポリペプチドに関する。
第三の観点では、本発明は、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または本発明の多重特異性ポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
第四の観点では、本発明は、医薬として用いられる、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または本発明の多重特異性ポリペプチドに関する。
第五の観点では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする核酸配列または核酸配列の集合体に関する。
第六の観点では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸配列の集合体を含む、ベクターまたはベクターの集合体に関する。
第七の観点では、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合体または本発明のベクターもしくはベクターの集合体を含む、宿主細胞、特に発現宿主細胞に関する。
第八の観点では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片の産生方法であって、、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合体、または本発明のベクターもしくはベクターの集合体、または本発明の宿主細胞、特に本発明の発現宿主細胞を発現させる段階を含む方法に関する。
第九の観点では、本発明は、多重特異性構築物の作製方法であって、１以上の段階において、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする１または複数の核酸配列を、少なくとも第二の結合ドメインまたはその断片をコードする核酸配列と、随意に、１または複数の追加の結合ドメインまたはその断片とを含む多重特異性構築物中にクローニングする段階を含む方法に関する。
発明の詳細な説明
本開示はヒトCD3に特異的な新規抗体、特にCD3εドメインに特異的な抗体に関する。
本開示はヒトCD3に特異的な新規抗体、特にCD3εドメインに特異的な抗体に関する。
特に異なって定義されない限り、本明細書中で用いる全ての技術用語と科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
「含む」および「包含する」という用語は、特に断らない限り、本明細書中では自由な非限定的な意味で用いられる。そういった後者の実施形態に関しては、「含む」という用語はより狭域の「から成る」という用語を含む。
１つの（「a」と「an」）およびその（「the」）という語並びに本発明を記載する範囲で類似の言及は、本明細書中で異なって指摘されない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を含むと解釈すべきである。例えば、「１つの細胞（a cell）」は、その混合物を含む複数の細胞を包含する。化合物、塩などに複数形が用いられる場合、それは単一の化合物、塩なども意味すると解釈される。
第一の態様では、本発明は、ヒトCD3に特異的である抗体またはその機能的断片であって、以下：
(a) 可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで各LFWは軽鎖フレームワーク領域を表し、そして各LCDRは軽鎖相補性決定領域を表し、そして前記LCDRは一緒になって、配列番号４に記載のVL配列から得られる対応するLCDRに対して少なくとも60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98または99％、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す、可変軽鎖；および
(b) 可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで各HFWは重鎖フレームワーク領域を表し、そして各HCDRは重鎖相補性決定領域を表し、そして前記HCDRは一緒になって、配列番号８に記載のVH配列から得られる対応するHCDRに対して少なくとも60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98または99％、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す、可変重鎖
を含む前記抗体またはその機能的断片に関する。
(a) 可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで各LFWは軽鎖フレームワーク領域を表し、そして各LCDRは軽鎖相補性決定領域を表し、そして前記LCDRは一緒になって、配列番号４に記載のVL配列から得られる対応するLCDRに対して少なくとも60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98または99％、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す、可変軽鎖；および
(b) 可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで各HFWは重鎖フレームワーク領域を表し、そして各HCDRは重鎖相補性決定領域を表し、そして前記HCDRは一緒になって、配列番号８に記載のVH配列から得られる対応するHCDRに対して少なくとも60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98または99％、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す、可変重鎖
を含む前記抗体またはその機能的断片に関する。
本発明に関しては、用語「抗体」は、「免疫グロブリン（Ig）」の同義語として用いられ、クラスIgG, IgM, IgE, IgA, IgYまたはIgD（またはそれの任意サブクラス）に属するタンパク質として定義され、そして従来より既知の抗体を全て包含する。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された２本の重（H）鎖と２本の軽（L）鎖を少なくとも含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記される）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、CH1, CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記される）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインCLから構成される。VHとVL領域は、更に、フレームワーク領域（FW）と呼ばれる高度に保存性のある領域が散在して組み入れられている、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各VHとVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順序：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4に配列された、３つのCDRと４つのFWから構成される。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
用語「抗体断片」は、完全抗体の少なくとも一部分、またはその組換え変異体を指し、そして用語「機能的断片」または「機能的抗体断片」または「抗原結合断片」は、少なくとも抗原結合ドメイン、例えば、標的、例えば抗原の抗原決定基に対する機能的抗体断片の認識と特異的結合を付与するのに十分である、完全抗体の可変領域の当該部分を少なくとも含む。機能的抗体断片の例としては、限定されないが、単一ドメイン抗体、例えばsdAb（VLまたはVHのいずれか)、ラクダ科VHHドメイン、および、ヒンジ領域の所でジスルフィド架橋により連結された２以上（例えば２個）のFab断片、または２以上（例えば２個）の単離されたCDRもしくは抗体の他のエピトープ結合断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多重特異性分子が挙げられる。一実施形態では、本発明の機能的断片はscFvである。抗体断片は単一ドメイン抗体、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、ナノボディ（nanobody）、イントラボディ（intrabody）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、v-NARおよびbis-scFvに具体化することもできる（例えば、Hollinger & Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005）。抗体断片は、フィブロネクチンIII型（Fn3）のようなポリペプチドをベースにした足場の中に移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載している米国特許第6,703,199号を参照のこと）。抗体の「抗原結合領域」または「抗原結合ドメイン」は、典型的には、抗体の１または複数の超可変領域、すなわちCDR1、CDR2および／またはCDR3領域中に見つかる；しかしながら、可変「フレームワーク」領域は、、例えばCDRのための足場を提供することにより、抗原結合において重要な役割を担うこともできる。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）や古典的補体系の第一補体成分（Clq）をはじめとする、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。本明細書中で用いる場合の用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を包含する。抗体は任意のアイソタイプ（例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスのものであることができる。
「相補性決定領域」(“CDR”)は、Kabat他 (1991)、“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（“Kabat”番号付け方式）；Al-Lazikani他 (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia”番号付け方式） およびImMunoGenTics (IMGT) 番号付け法〔Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P.他、Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (“IMGT”番号付け方式）〕により記載されたものをはじめとする、多数の周知の方式のいずれかを使って決定された境界を有するアミノ酸配列である。例えば、Kabat法による標準的なフォーマットでは、重鎖可変ドメイン（VH）中のCDRアミノ酸残基は、31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)および95-102 (HCDR3)と番号付けられ；そして軽鎖可変ドメイン（VL）中のCDRアミノ酸残基は、24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)および89-97 (LCDR3)と番号付けられる。Chothia法では、VH中のCDRアミノ酸は26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2)および95-102 (HCDR3)と番号付けられ；そしてVL中のアミノ酸残基は24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)および89-97 (LCDR3)と番号付けられる。KobatとChothiaの両方のCDR定義を組み合わせることにより、CDRはヒトVH中でアミノ酸残基26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)および95-102 (HCDR3) そしてヒトVL中でアミノ酸残基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)および89-97 (LCDR3)である。IMGTの下では、VH中のCDRアミノ酸残基は大体26-35 (HCDR1)、51-57 (HCDR2) および93-102 (HCDR3)と番号付けられ、そしてVL中のCDRアミノ酸残基は大体27-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)および89-97 (LCDR3) と番号付けられる（“Kabat”による番号付け）。IMGT法では、抗体の各CDRはプログラムIMGT/DomainGap Alignを使って決定することができる。
本発明に関しては、具体的に異なって言及されない限り、Honegger & Pluckthunにより提案された番号付け法 (“AHo番号付け法”) が用いられる（Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670）。更に、次の残基がCDRとして定義される：LCDR1 (CDR-L1とも称する）: L24-L42；LCDR2（CDR-L2とも称する）:L58-L72；LCDR3（CDR-L3とも称する）：L107-L138；HCDR1（CDR-H1とも称する）:H27-H42；HCDR2（CDR-H2とも称する）:H57-H76；HCDR3（CDR-H3とも称する）：H108-H138。明確化の目的で、Honegger & Pluckthunに従った番号付け法は、異なるVHおよびVL両サブファミリーにおいて、特にCDRにおいて天然に認められる長さ多様性を考慮に入れており、そして配列中にギャップ（空隙）を備える。よって、ある所定の抗体可変ドメインにおいて、一般に１〜149位の全ての位置がアミノ酸残基により占有されるわけではないだろう。
好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（VL）鎖のアミノ酸残基４〜138と、可変重（VH）鎖のアミノ酸残基５〜138（各場合に番号付けはHonegger & Pluckthunに従う）とを含み、より好ましくはVLのアミノ酸残基３〜144とVHの残基４〜144とを含み、特に好ましいのは完全なVL鎖とVH鎖（VLのアミノ酸１〜149位とVHのアミノ酸１〜149位）である。フレームワーク領域とCDRは表１に記載の配列において示される。本発明での使用のための免疫グロブリンの好適なクラスはIgGである。本発明の「機能的断片」は、F(ab')2断片、Fab断片、FvおよびscFv断片のドメインである。F(ab')2 またはFabは、CH1ドメインとCLドメインの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化するまたは完全に除去するように遺伝子操作することができる。本発明の抗体またはその機能的断片は、段落[００７６]〜[０１１１]中に記載されるように、二重または多重機能ポリペプチドであることができる。
以下の用語は２以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列関係を記載するために使用される：「配列同一性」または「配列一致率」。本明細書中で用いる用語「配列同一性」は、２つのポリペプチド配列間で同一であるアミノ酸残基の最大数を計算することにより決定され、ここで最大の程度の配列重複を可能にするようにギャップ（空隙）および／または挿入が要因として含められる。例えば、完全に同一である２つの100merポリペプチドは、100％の配列同一性を有する。それらが単一突然変異により異なる場合、または１つのポリペプチドが１アミノ酸の欠失を含む場合、配列同一性は99％である（100箇所の位置のうち99箇所が同一である）。言い換えれば、「配列一致率」は、比較ウィンドウの上で最適に整列（アラインメント）された２つの配列を比較することにより計算され、それは同一核酸塩基（例えばA, T, C, G, UまたはI）またはアミノ酸残基が両配列中に存在して一致した位置の数を与え、その一致した位置の数を比較ウィンドウ中の全位置の総数（すなわちウィンドウのサイズ）により除し、そしてその結果に100を乗ずることにより、配列一致度が算出される。「配列相同性」は、２つの配列を比較した時にそれらの配列間の類似性の程度である。必要または所望であれば、例えば、Smith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))により、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. MoI. Biol. 48:443-53 (1970)）により、Peason & Lipmanの相同性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)）により、それらのアルゴリズムのコンピュータ実装により〔例えば、Wisconsin Genetics ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA〕、または目視検査により、比較のために最適な配列アラインメントを行うことができる。（総説はAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999)を参照のこと）。特に断らない限り、本明細書中で言及される配列相同性の程度は、Dayhoff PAMマトリクス (M.O. Dayhoff, R. Schwartz, B.C. Orcutt: A model of Evolutionary Change in Proteins, pages 345-352; in: Atlas of protein sequence and structure, National Biomedical Research Foundation, 1979）の使用により決定される。
用語「アミノ酸」は天然アミノ酸と合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸に類似した方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、並びに後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーと非天然のアミノ酸ポリマーだけでなく、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の合成化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。特に断らない限り、特定のポリペプチド配列は保存的修飾されたそれの変異体も黙示包含する。
本明細書中で用いる「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基と反応するが別の抗原決定基とは反応しない個々の抗体結合部位の能力を指す。本明細書中で用いる時、結合分子は、その結合分子が標的生体分子と１または複数の参照分子との間を識別することができる時、結合特異性が絶対的でなく相対的性質であるために、標的、例えばヒトCD3に「特異的である」、「特異的に認識する」または「特異的に結合する」という。その最も一般的な形態（そして何も限定された対照が言及されない場合）、「特異的結合」は、例えば当業界で周知の特異性アッセイ方法に従って測定した時、目的の標的生体分子と無関係の生体分子との間を識別する生体分子の能力を指している。そのような方法は、限定されないが、ウエスタンブロット、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR（表面プラズモン共鳴）試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、標準ELISAアッセイを実施することができる。採点法（スコア付）は標準発色法（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ接合二次抗体とテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を用いる）により実施できる。幾つかのウェルの反応は、光学濃度、例えば450 nmでの光学濃度により採点される。典型的なバックグラウンド（陰性反応）は約0.1 ODであり；典型的な陽性反応は約1 ODでありうる。これは、正のスコア（陽性）と負のスコア（陰性）との比が10倍以上であることができることを意味する。更なる例では、SPRアッセイを実施することができ、その場合、バックグラウンドとシグナル間の差が少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍の反応が特異的結合を表す。典型的には、結合特異性の測定は、単一の参照生体分子でなく、約３〜５個の無関係の生体分子（例えば粉乳、トランスフェリン等）のセットを用いることにより実施される。本発明の抗体またはその機能的断片は、ヒトCD3、好ましくはヒトCD3εに対して結合特異性を有する。
一実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、ヒトCD3および非チンパンジー霊長類CD3に対して結合特異性を有する。当業者に明白なように、本明細書中に定義されるような交差種特異性を示す本発明の抗体またはそれの機能的断片が、例えばチンパンジーCD3にも結合することができるものは、本発明の範囲から除外されない。他方で、ヒトCD3にのみ結合し、非チンパンジー霊長類CD3には結合しない本発明の抗体またはその機能的断片は、本発明の範囲から除外されることは明白である。このことは、非チンパンジー霊長類CD3にのみ結合するが、ヒトCD3には結合しない結合ドメイン、例えばモノクローナル抗体FN-18の結合ドメインにも必要な変更を加えて適用する。
本明細書中で用いる場合、「非チンパンジー霊長類」または「非chimp霊長類」またはそれの文法的変形は、チンパンジー以外の任意の霊長類、すなわち、ボノボ（Pan paniscus）およびチンパンジー（Pan troglodytes）（Anthropopithecus troglodytesまたはSimia satyrusとしても知られる）を含むチンパンジー属（Pan）に属する動物以外のものを指す。「霊長類」、「霊長類種」、「霊長類（複数形）」またはそれの文法的変形は、原猿と類人猿の２つの亜目に二分される新獣哺乳類（eutherian mammals）の目を意味し、ヒト、類人猿、サルおよびキツネザルを含む。具体的には、本明細書中で用いる「霊長類」は、曲鼻猿亜目（suborder Strepsirrhini）（非メガネザル原猿）を含み、キツネザル下目（infraorder Lemuriformes）(それ自体コビトキツネザル上科とキツネザル上科を含む）、アイアイ下目（それ自体アイアイ科を含む）、およびロリス下目（それ自体ロリス科とガラゴ科を含む）を含む。本明細書中で用いる「霊長類」は、直鼻猿亜目（suborder Haplorrhini）を含み、メガネザル下目（infraorder Tarsiiformes）(それ自体メガネザル科を含む）、真猿下目(infraorder Simiiformes)(それ自体、広鼻下目（Platyrrhini）または新世界サル、および狭鼻下目（Catarrhini）（オナガザル科（Cercopithecidea）を含む）または旧世界サルを含む）を含む。最も好ましいのは、カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cynomolgus monkeyとしても知られ、従って実施例では「カニクイザル」（Cynomolgus）と称する）である。適切には、本発明の抗体またはそれの機能的断片はヒトCD3に対しおよびカニクイザルCD3に対し結合特異性を有する。
更に、文脈によって、用語「特異的結合」は、標的生体分子と、リファレンス（比較対象）点として使用される１または複数の密接に関連した生体分子との間を識別する、例えばCD3分子を異なる種、例えばマウスCD3分子から識別する能力を指すことができる。その上、「特異的結合」は、その標的抗原の異なる部分間を識別する結合分子の能力に関してもよく、例えば標的生体分子の種々のドメイン、領域またはエピトープ、特にCD3εドメイン間、または標的生体分子のアミノ酸残基の１もしくは複数の重要なアミノ酸残基またはストレッチ間を識別する能力に関してもよい。
一実施形態では、本発明の抗体またはそれの機能的断片はヒトCD3に対する結合特異性を有する。
用語「CD3」はＴ細胞受容体の一部として発現され、従来技術において典型的にそれに帰するものと同じ意味を有する。ヒトでは、それは個々のまたは独立に組み合わせたCD3サブユニットCD3イプシロン(ε)、CD3デルタ(δ)およびCD3ガンマ(γ)を包含する。本明細書中で言及されるような非チンパンジー霊長類CD3抗原は、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）CD3 およびアカゲザル（Macaca mulatto）CD3である。カニクイザルでは、それはCD3εFN-18陰性およびCD3εFN-18陽性、CD3γおよびCD3δを包含する。アカゲザルでは、それはCD3ε、CD3γおよびCD3δを包含する。
好ましくは、本明細書中で用いる前記CD3は、具体的にはCD3εに関する。用語「ヒトCD3ε」は特に、GenBank 受入番号NM_00733、本明細書中で配列番号19として複製されるUniProt ID番号P07766、を有するヒトCD3εまたはその変異体を指す。カニクイザルのCD3ε 「FN-18陰性体」（すなわち上述した通り多型のためにモノクローナル抗体FN-18により認識されないCD3ε）は、GenBank受入番号AB073994に示される。カニクイザルのCD3ε「FN-18陽性体」（すなわちモノクローナル抗体FN-18により認識されるCD3ε）はGenBank受入番号AB073993により示される。
ヒトCD3γはGenBank受入番号NM 000073により表示される。ヒトCD3δはGenBank受入番号NM 000732により表示される。カニクイザルのCD3γはGenBank受入番号AB073992に示される。カニクイザルのCD3δはGenBank受入番号AB073991により表示される。
適当には、本発明の抗体またはその機能的断片はヒトおよびカニクイザル（Macaca fascicularis）CD3εを標的とする。
適当には、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、アミノ酸配列が実質的に同じであるかまたは同じ遺伝源に由来する抗体を指す。モノクローナル抗体組成物は、１つの特定エピトープに対する結合特異性と親和性を示すか、または複数の特定エピトープに対する結合特異性と親和性を示す。
本発明において、用語「エピトープ」は、標的生体分子と結合分子の間の特異的結合に必要である、所定の標的生体分子の部分を指して言う。エピトープは連続的、すなわち標的生体分子の一次配列中、例えば標的としてのタンパク質のアミノ酸配列中の異なる位置にあるが、標的生体分子が体液中でとるような三次元構造中（例えば体液中）では近接した位置にある構造要素により構成されてよい。
本発明の抗体としては、限定されないが、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体が含まれる。
用語「キメラ抗体」（またはそれの機能的断片）は、(a) 抗原結合部位（可変領域）またはその一部分が、異なるまたは変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな性質を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に連結されるように、定常領域またはその部分が改変、置換または交換されている抗体分子；または(b) 可変領域またはその一部分が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域へと改変、置換または入れ替えられている、抗体分子（またはその機能的断片）である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンの定常領域により置換することにより改変することができる。ヒト定常領域との置換により、キメラ抗体は抗原を認識するその特異性を保持することができ、一方で元のマウス抗体に比較してヒトでの抗原性を低減させることができる。
本明細書中で用いる場合の「ヒト化」抗体（またはその機能的断片）は、ヒトでの免疫原性を低く抑えながら、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体（またはその機能的断片）である。このヒト化は、例えば、非ヒトCDR領域を保持しておき、かつ抗体の残りの部分をそれらのヒト相当物（すなわち定常領域並びに可変領域のフレームワーク領域）で置換することにより達成することができる。ヒトフレームワーク配列内だけでなく、別の哺乳動物種の生殖細胞系列（ジャームライン）に由来するCDR配列の中で、追加のフレームワーク領域修飾を行ってもよい。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により、または安定性や生産性を向上させるための保存的置換により、導入される突然変異）を含んでもよい。例えば、Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison & Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen他, Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991;およびPadlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照されたい。抗体改変技術の他の例としては、限定されないが、米国特許第5,766,886号に記載のXoma技術が挙げられる。
本明細書で使用される「組換えヒト化抗体」という用語は、動物（例えばマウス）から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された本発明の全てのヒト化抗体；宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む他の任意手段により調製、発現、作製または単離された抗体を全て包含する。そのような組換え抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（存在する場合）を有する。しかしながら、かかる抗体は、in vitro（試験管内）突然変異誘発（またはヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合、in vitro体細胞突然変異誘発）に供することができるため、組換え抗体のVH（抗体重鎖可変領域）とVL（抗体軽鎖可変領域）はヒト生殖細胞系列のVHとVL配列に由来し、関連しているが、ヒト抗体生殖細胞系内に天然には存在しないかもしれない配列である。
適切には、本発明の抗体またはその機能的断片は、人工抗体もしくは単離抗体またはその機能的断片である。本明細書で使用される「人工抗体」という用語は、その起源または操作のために、(i) 発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞に存在する、または(ii) 本来連結しているもの以外のタンパク質または他の化学成分と結合している、または(iii) 本来存在しない、抗体またはその機能的断片を意味する。本明細書で使用する「単離抗体」という用語は、宿主細胞中で発現され、ゲルクロマトグラフィーなどにより付随タンパク質から精製された抗体を指す。「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体も指す（例えば、ヒトCD3に特異的に結合する単離抗体は、ヒトCD3以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトCD3以外の抗原に特異的に結合する単離抗体は、他の種（例えば非ヒト霊長類および／またはげっ歯類CD3）からのCD3分子などの他の抗原に対して交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないだろう。
一実施形態では、本発明は、(a) 配列番号１に記載のLCDR1；(b) 配列番号２に記載のLCDR2；(c) 配列番号３に記載のLCDR3；(d) 配列番号５に記載のHCDR1；(e) 配列番号６に記載のHCDR2；(f) 配列番号７に記載のHCDR3を含む抗体またはそれの機能的断片に関する。
本発明の抗体またはその機能的断片は、可変重鎖（VH)ドメインと可変軽鎖（VL)ドメインとを含む。本発明において、用語「VH」（可変重鎖）、「Vκ」および「Vλ」は、配列同一性と相同性に従ってグループ化される抗体重鎖配列と軽鎖配列のファミリーを指す。例えば、BLOSUM（Henikoff, S. & Henikoff, J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919)のような相同性検索マトリクスを利用して配列相同性を決定する方法、および相同性による配列のグループ化方法は、当業者に周知である。VH、VκおよびVλについては、例えばKnappik他、J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86中に示された通り、VHをVH1A、VH1BおよびVH2〜VH6に分類し、VκをVκ1〜Vκ4に分類し、そしてVλをVλ1〜Vλ3に分類する。インビボでは、抗体Vκ鎖、Vλ鎖およびVH鎖は、生殖細胞系列κ鎖のVおよびJセグメント、生殖細胞系列λ鎖のVおよびJセグメント、並びに重鎖V、DおよびJセグメントのそれぞれのランダム再配列の結果である。所定の抗体可変鎖がどのサブファミリーに属するかは、対応するVセグメントによって決定され、特にフレームワーク領域FW1〜FW3により決定される。従って、本願において、フレームワーク領域HFW1〜HFW3の特定のセットのみによって特徴付けられるVH配列は、任意のHFW4配列、例えば、重鎖生殖細胞系列Jセグメントの１つから得られるHFW4配列、または再配列されたVH配列から得られるHFW4配列と組み合わせることができる。特定の実施形態では、HFW4配列はWGQGTLVTVSSである。
適切には、本発明は、CD3（例えばヒトCD3タンパク質、特にヒトCD3ε）と特異的に結合する抗体またはその機能的断片を提供し、前記抗体またはその機能的断片はVH4またはVH3ドメイン、好ましくはVH3ドメインを含む。
適切には、本発明は、CD3（例えばヒトCD3タンパク質、特にヒトCD3ε）を特異的に結合する抗体またはその機能的断片を提供し、前記抗体またはその機能的断片は、(i) VκフレームワークFW1、FW2およびFW3、特にVκ1またはVκ3フレームワーク、好ましくはFW1〜FW3、および(ii) VκFW4、特にVκ1 FW4、Vκ3 FW4、およびVλ FW4から選択されるフレームワークFW4、を含む。適切なVκ1 FW1〜FW3は、配列番号４のVκ1配列から得られる対応するフレームワーク領域に対して少なくとも60、70、80、90％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す。適当なVκ1 FW4は、配列番号４のVκ1配列から得られる対応するFW4に対して、少なくとも60、70、80、90％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性を示す。適切には、Vκ1 FW4は配列番号４のVκ1配列から得られたFW4である。適切なVκ FW4は、配列番号17または配列番号18に記載の通りである。一実施形態では、本発明は、CD3（例えばヒトCD3タンパク質、特にCD3ε）に特異的に結合する抗体またはその機能的断片を提供し、ここで前記抗体またはその機能的断片は、配列番号17から配列番号18のいずれかから選択されるアミノ酸配列（好ましくは配列番号17）に対し少なくとも60、70、80、90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVλ FW4を含む。
特定の実施形態では、前記可変軽鎖はVκ1軽鎖であり、および／または前記可変重鎖はVH3鎖である。別の特定の実施形態では、前記可変軽鎖は、Vκフレームワーク領域Ｉ〜IIIとVλフレームワーク領域IVとを含むキメラ軽鎖である。一実施形態では、軽鎖は以下を含むキメラ軽鎖である：
(i) 各々配列番号１、２および３のLCDR1、LCDR2およびLCDR3配列；
(ii) ヒトVκフレームワーク領域FW1〜FW3、特にヒトVκ1フレームワーク領域FW1〜FW3；
(iii) FW4であって、(a) FW4のヒトVλ生殖細胞系配列、特に配列番号17と配列番号18から、好ましくは配列番号17から選択されるヒトVλ生殖細胞系配列；および(b) Vλベースの配列であって、配列番号17と配列番号18から、好ましくは配列番号17から選択されるアミノ酸配列を含むFW4の最も近いヒトVλ生殖細胞系配列と比較して、１つまたは２つの突然変異、特に１つの突然変異を有するVλベースの配列、から選択されるFW4。
(i) 各々配列番号１、２および３のLCDR1、LCDR2およびLCDR3配列；
(ii) ヒトVκフレームワーク領域FW1〜FW3、特にヒトVκ1フレームワーク領域FW1〜FW3；
(iii) FW4であって、(a) FW4のヒトVλ生殖細胞系配列、特に配列番号17と配列番号18から、好ましくは配列番号17から選択されるヒトVλ生殖細胞系配列；および(b) Vλベースの配列であって、配列番号17と配列番号18から、好ましくは配列番号17から選択されるアミノ酸配列を含むFW4の最も近いヒトVλ生殖細胞系配列と比較して、１つまたは２つの突然変異、特に１つの突然変異を有するVλベースの配列、から選択されるFW4。
一実施形態では、前記可変軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％の配列同一性を示し、および／または前記可変重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％の配列同一性を示す。特定の実施形態では、前記可変軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、および／または前記可変重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す。
適切には、本発明は、可変軽鎖を含むヒトCD3、特にヒトCD3εに特異的な抗体またはその機能的断片に関し、ここで前記可変軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、そして前記可変軽鎖は、軽鎖アミノ酸位置54（AHo番号付け法）にアルギニン（R）またはリジン（K）、好ましくはアルギニン（R）を含む。更なる実施形態では、前記可変軽鎖は、軽鎖アミノ酸位置50（AHo番号付け法）にグルタミン（Q）、および／または軽鎖アミノ酸位置51（AHo番号付け法）にセリン（S）、および任意に軽鎖アミノ酸位置44（AHo番号付け法）にフェニルアラニン（F）または軽鎖アミノ酸位置88（AHo番号付け法）にグルタミン（Q）または軽鎖アミノ酸位置88（AHo番号付け法）にヒスチジン（H）を更に含む。特定の実施形態では、本発明は、可変軽鎖を含むヒトCD3、特にヒトCD3εに特異的な抗体またはその機能的断片に関し、前記可変軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、そして前記可変軽鎖は、軽鎖アミノ酸位置54（AHo番号付け法）にアルギニン（R)、軽鎖アミノ酸位置50（AHo番号付け法）にグルタミン（Q）、軽鎖アミノ酸位置51（AHo番号付け法）にセリン（S）、および軽鎖アミノ酸位置44（AHo番号付け法）にフェニルアラニン（F）を含む。
更に別の実施形態では、本発明は、可変軽鎖を含むヒトCD3、特にヒトCD3εに特異的な抗体またはその機能的断片に関し、前記可変軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、そして前記可変軽鎖は、軽鎖アミノ酸位置54（AHo番号付け法）にアルギニン（R）、および軽鎖アミノ酸位置44（AHo番号付け法）にフェニルアラニン（F）を含む。
適切には、本発明は、可変重鎖を含むヒトCD3、特にヒトCD3εに特異的な抗体またはその機能的断片に関し、前記可変重鎖は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、そして前記可変重鎖は次の群より選択されたアミノ酸のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つを含む：重鎖アミノ酸位置53（AHo番号付け法）にアラニン（A）、重鎖アミノ酸位置103（AHo番号付け法）にトレオニン（T）、および重鎖アミノ酸位置105（AHo番号付け法）にフェニルアラニン（F）。一実施形態では、前記可変重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、そして重鎖アミノ酸位置53（AHo番号付け法）にアラニン（A）、重鎖アミノ酸位置103（AHo番号付け法）にトレオニン（T）、および重鎖アミノ酸位置105（AHo番号付け法）にフェニルアラニン（F）を含む。
一実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列またはその保存的修飾変異体を含む可変軽鎖と、配列番号８のアミノ酸配列またはその保存的修飾変異体を含む可変重鎖とを含む、本発明の抗体またはその機能的断片に関する。
用語「保存的修飾変異体」または「保存的変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が或る一定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンが１つのコドンにより特定されている全ての位置では、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載の対応するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的修飾変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUGと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く）を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識するだろう。従って、記載の各配列には、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が暗黙的に含まれている。
ポリペプチド配列については、「保存的改変変異体」または「保存的変異体」は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすポリペプチドに対する個々の置換、欠失または付加を包含する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換一覧表は、当業界で周知である。そのような保存的改変変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子変異体を付加的に含みかつそれを除外しない。次の８グループは互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1) アラニン (A), グリシン (G); 2) アスパラギン酸 (D), グルタミン酸 (E); 3) アスパラギン (N), グルタミン (Q); 4) アルギニン (R), リジン (K); 5) イソロイシン (I), ロイシン (L), メチオニン (M), バリン (V); 6) フェニルアラニン (F), チロシン(Y), トリプトファン (W); 7) セリン (S), トレオニン (T); および 8) システイン (C), メチオニン (M) (例えばCreighton, Proteins (1984)参照)。一実施形態では、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないまたは変更しないアミノ酸修飾を指すために用いられる。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変重鎖とを含む。
本発明の一実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、IgG 抗体、FabおよびscFv断片を含む。適当には、本発明の抗体またはその機能的断片はscFv 抗体断片である。「一本鎖Fv」または「scFv」または「Fv」抗体断片は、抗体のVHとVLドメインを含み、ここでそれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドは更に、sFvが所望の構造を形成できるようにする、VHとVLドメイン間にポリペプチドリンカーを含む（例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg & Moore編、Springer-Verlag, New York, 1994, pp. 269-315)。
適切には、本発明の抗体またはその機能的断片はscFvである。特定の実施形態では、前記機能的断片は、配列番号15のリンカーを含むscFv形である。適切には、本発明の抗体またはその機能的断片は、次のリストから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むscFvである：配列番号4, 8, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41および42。適切には、本発明の抗体またはその機能的断片は、次のリストから選択されるアミノ酸配列を含むscFvである：配列番号29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41および42。
本明細書で用いられる用語「親和性（アフィニティー）」は、単一の結合部位または分子（例えば抗体またはその機能的断片）と、それの結合相手（例えば抗原）との間の総合的な非共有結合的相互作用の強さの総和を指す。特に断らない限り、本明細書で用いる「結合親和性」は、結合ペアのメンバー間の1：1相互作用を反映する固有結合親和性、例えば単一抗体結合ドメインとそれの抗原との相互作用を指す。親和性は一般に解離定数(ＫD)により表すことができる。親和性は本明細書中に記載のものを含む当業界での常法により測定することができる。
適当な実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、特に表面プラズモン共鳴により測定した時に、ヒトCD3に対しおよび／またはカニクイザルCD3に対して0.1〜100 nM、0.1〜90 nM、0.1〜80 nM、0.1〜70 nM、0.1〜60 nM、0.5〜50 nM、0.5〜40 nM、0.5〜30 nM、0.5〜20 nM、0.5〜10 nM、0.5〜9 nM、0.5〜8 nM、0.5〜7 nM、0.5〜6 nM、0.5〜5 nMのＫDを有してもよい。適当な実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、特に表面プラズモン共鳴により測定した時に、ヒトCD3に対しおよび／またはカニクイザルCD3に対して約100 nM未満、約90 nM未満、約80 nM未満、約70 nM未満、約60 nM未満、約55 nM未満、約40 nM未満、約45 nM未満、約40 nM未満、約35 nM未満、約30 nM未満、約25 nM未満、約20 nM未満、約15 nM未満、約10 nM未満、約9 nM未満、約8 nM未満、約7 nM未満、約6 nM未満、約5 nM未満、約4 nM未満、約3 nM未満、2 nM未満、1 nM未満のＫDを有してもよい。適当には、特に表面プラズモン共鳴により測定した時に、本発明の抗体またはその機能的断片は、ヒトCD3および／またはカニクイザルCD3に対して10 nM未満、好ましくは6 nM未満のＫDを有する。
特定の実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、次のパラメータの１つ以上により特徴づけられる：
(i) 特に表面プラズモン共鳴により測定した時、より特に実施例2.1に記載の方法により決定した時、40 nM未満、特に10 nM未満、より特に6 nM未満のヒトCD3への結合のKD値；
(ii) 特に表面プラズモン共鳴により測定した時、より特に実施例2.1に記載の方法により決定した時、20 nM未満、特に10 nM未満、より特に5 nM未満のカニクイザルCD3への結合のKD値；および
(iii)以前に記載された（Egan他、MAbs, 9(1) (2017), 68-84；Niesen他、Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）示差走査蛍光分析法（DSF）により測定した時、特にサンプルを0.15-0.25 M NaCl、特に0.15 M NaClを含む3.5〜7.5の範囲のpH値を有する５つのリン酸−クエン酸緩衝液中に希釈した時、scFv抗体フォーマットで発現させた場合に、少なくとも60℃、特に少なくとも65℃、より特に少なくとも68℃を超える熱変性温度（Tm）の平均中点。scFv構築物の熱変性の遷移の中間点は、蛍光色素SYPRO（登録商標）Orangeを使用した示差走査蛍光分析によって決定される（Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840参照）。関連する賦形剤条件中のサンプルは、関連の緩衝液中に調製した原液賦形剤中にスパイクすることにより、50μg/mlの最終タンパク質濃度で調製する。緩衝液スカウティング実験では、総量100μLの５×SYPRO（登録商標）Orangeの最終濃度を含む、異なるpH値（pH 3.4, 4.4, 5.4, 6.4および7.2）を有する最終scFv緩衝液中にサンプルを希釈する。未知のサンプルと共に、scFv DSF参照を内部標準として測定する。25μLの調製サンプルを、３連で白色のAB遺伝子PCRプレートに添加する。アッセイはサーマルサイクラーとして使用されるqPCR装置上で実行され、蛍光発光はソフトウェアのカスタム色素較正ルーチン分析を使用して検出される。試験サンプルを含むPCRプレートは、25℃から１℃刻みで96℃までの温度勾配にかけられ、各昇温後に30秒の休止を含む。総アッセイ時間は約２時間である。Tmは、曲線の変曲点を計算するために数学的二次導関数を使用し、ソフトウェアGraphPad Prismによって計算される。報告されたTmは、３回の測定値の平均である。特定の実施形態において、Tmの測定は実施例2.2に記載のように実施され、サンプルは0.25 M NaClを含有するpH 6.4のリン酸−クエン酸緩衝液で希釈される。
(i) 特に表面プラズモン共鳴により測定した時、より特に実施例2.1に記載の方法により決定した時、40 nM未満、特に10 nM未満、より特に6 nM未満のヒトCD3への結合のKD値；
(ii) 特に表面プラズモン共鳴により測定した時、より特に実施例2.1に記載の方法により決定した時、20 nM未満、特に10 nM未満、より特に5 nM未満のカニクイザルCD3への結合のKD値；および
(iii)以前に記載された（Egan他、MAbs, 9(1) (2017), 68-84；Niesen他、Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）示差走査蛍光分析法（DSF）により測定した時、特にサンプルを0.15-0.25 M NaCl、特に0.15 M NaClを含む3.5〜7.5の範囲のpH値を有する５つのリン酸−クエン酸緩衝液中に希釈した時、scFv抗体フォーマットで発現させた場合に、少なくとも60℃、特に少なくとも65℃、より特に少なくとも68℃を超える熱変性温度（Tm）の平均中点。scFv構築物の熱変性の遷移の中間点は、蛍光色素SYPRO（登録商標）Orangeを使用した示差走査蛍光分析によって決定される（Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840参照）。関連する賦形剤条件中のサンプルは、関連の緩衝液中に調製した原液賦形剤中にスパイクすることにより、50μg/mlの最終タンパク質濃度で調製する。緩衝液スカウティング実験では、総量100μLの５×SYPRO（登録商標）Orangeの最終濃度を含む、異なるpH値（pH 3.4, 4.4, 5.4, 6.4および7.2）を有する最終scFv緩衝液中にサンプルを希釈する。未知のサンプルと共に、scFv DSF参照を内部標準として測定する。25μLの調製サンプルを、３連で白色のAB遺伝子PCRプレートに添加する。アッセイはサーマルサイクラーとして使用されるqPCR装置上で実行され、蛍光発光はソフトウェアのカスタム色素較正ルーチン分析を使用して検出される。試験サンプルを含むPCRプレートは、25℃から１℃刻みで96℃までの温度勾配にかけられ、各昇温後に30秒の休止を含む。総アッセイ時間は約２時間である。Tmは、曲線の変曲点を計算するために数学的二次導関数を使用し、ソフトウェアGraphPad Prismによって計算される。報告されたTmは、３回の測定値の平均である。特定の実施形態において、Tmの測定は実施例2.2に記載のように実施され、サンプルは0.25 M NaClを含有するpH 6.4のリン酸−クエン酸緩衝液で希釈される。
一態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片を含む、多重特異性分子、例えば二重特異性分子、三重特異性分子、四重特異性、五重特異性、六重特異性分子、または多価分子、例えば二価、三価、四価、五価、六価分子に関する。特定の実施形態では、多重特異性分子は多重特異性ポリペプチドである。特定の実施形態では、多価分子は多価ポリペプチドである。
本明細書で使用する「二重特異性抗体」または「二重特異性ポリペプチド」という用語は、２つの異なるエピトープ、特に２つの異なる標的上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本明細書で使用される「三重特異性抗体」または「胆汁特異性ポリペプチド」という用語は、３つの異なるエピトープ、特に３つの異なる標的上の３つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
本発明の抗体またはその機能的断片は、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体リガンド）に誘導体化または連結させて、少なくとも２つの結合部位および／または異なる標的分子に結合する多重特異性分子（例えば多重特異性ポリペプチド）を生成することができる。実際、本発明の抗体は、２つ以上の別の機能性分子に誘導体化または連結させて、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子（例えば多重特異性ポリペプチド）を生成することができる。本発明の多重特異性分子を創製するために、本発明の抗体を別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣体などの１または複数の他の結合分子に機能的に連結させ（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他によって）、多重特異性分子を生成することができる。
一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) CD3以外の異なる標的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含有する。
本明細書で用いる場合の「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」または「機能的断片」などの用語は、所定の抗原（例えばCD3, IL23R, HER2, HSA)に特異的に結合する能力を保持している、完全抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全抗体の断片によって果たすことができる。幾つかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、Fab断片、即ちヒンジ領域の所でジスルフィド架橋によって連結された２つのFab断片を含む二価断片；VHとCHIドメインから成るFd断片；抗体の単一アームのVLドメインとVHドメインから成るFv断片；VHドメインから成る単一ドメイン抗体(dAb)断片（Ward他、1989 Nature 341:544-546)；単離された相補性決定領域(CDR)、dsFv、scAb、STAB、単一ドメイン抗体(sdAbまたはdAb)、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、VHH、VNAR、サメ由来のVNAR構造をベースにした単一ドメイン抗体、およびアンキリンベースのドメインを含む別の足場をベースにした結合ドメイン、ファイノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えばf-star technology)を含むがこれらに限定されない代替足場をベースにした結合ドメインからなる群より選択される。適切には、本発明の結合ドメインは、一本鎖Fv断片（scFv) または単一抗体可変ドメインである。好ましい実施形態では、本発明の結合ドメインは一本鎖Fv断片（scFv)である。
適切には、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) 少なくとも１つ、好ましくは１つの腫瘍関連抗原（TAA）結合ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) 少なくとも１つ、好ましくは１つのIL23R結合ドメインを含む。
インターロイキン（IL)-23は、２つのタンパク質サブユニットから構成されるヘテロ二量体サイトカインであり、それらのおよその分子量からp40およびp19と呼ばれる。P40タンパク質はIL-12とIL-23の間で共有されているが、p19タンパク質サブユニットはIL-23に特有である。IL-23は、p40に結合するIL-12受容体β1（IL-12Rβ1）鎖と、IL-23特異的細胞内シグナル伝達を付与するユニークなIL-23受容体鎖（IL23R)とから成る二本鎖受容体複合体を介してシグナルを伝達する。「IL23R」という用語は、特にUniProt ID番号Q5VWK5を有するヒトIL23Rを指す。
一部の実施形態では、IL23R結合ドメインはモノクローナル抗体または抗体断片に由来する。
適切なIL23R結合ドメインは、ヒトIL23Rに特異的であり、且つ、可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで前記各LFWは軽鎖フレームワーク領域を示し、各LCDRは軽鎖相補性決定領域を示し、前記LCDRは一緒になって配列番号11のVL配列から得られた対応するHCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変軽鎖；および、可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで前記各HFWは重鎖フレームワーク領域を示し、各HCDRは重鎖相補性決定領域を示し、前記HCDRは一緒になって配列番号12のVH配列から得られた対応するHCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す。適切には、本発明のIL23R結合ドメインは、(i) 配列番号11のVL配列から得られた対応するCDR領域に示されるようなLCDR1, LCDR2, LCDR3、および(ii) 配列番号12のVH配列から得られた対応するCDR領域に示されるようなHCDR1, HCDR2, HCDR3を含む。
一実施形態では、IL23R結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、および／または前記IL23R結合ドメインの前記可変重鎖は、配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す。特定の実施形態では、本発明のIL23R結合ドメインは、(i) 配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖であって、配列番号11のVL配列から得られた対応するCDR領域に示されるLCDR1, LCDR2, LCDR3を含む可変軽鎖、および／または(ii) 配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖であって、配列番号12のVH配列から得られた対応するCDR領域に示されるHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む可変重鎖を含む。特定の実施形態では、IL23R結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号11のアミノ酸配列またはその保存的修飾変異体を含み、および／または前記IL23R結合ドメインの前記可変重鎖は配列番号12のアミノ酸配列またはその保存的修飾変異体を含む。より具体的な実施形態では、IL23R結合ドメインの前記可変軽鎖は配列番号11のアミノ酸配列を含み、および／またはIL23R結合ドメインの前記可変重鎖は配列番号12のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、前記IL23R結合ドメインは、配列番号15のリンカーを含むscFvフォーマットである。
一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) 少なくとも１つのIL23R結合ドメインを含み、ここで前記多重特異性ポリペプチドは配列番号26のアミノ酸配列に対して少なくとも60、70、80、90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは前記多重特異性ポリペプチドは配列番号26のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) 少なくとも１つ、好ましくは１つのHER2結合ドメインを含む。
用語「HER2」は、特に、UniProt ID番号Q5VWK5を有するヒトHER2を指す。
幾つかの実施形態において、HER2結合ドメインは、モノクローナル抗体または抗体断片に由来する。
適切なHER2結合ドメインは、ヒトHER2に特異的であり、且つ、可変軽鎖であって、ここで前記可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで前記各LFWは軽鎖フレームワーク領域を示し、各LCDRは軽鎖相補性決定領域を示し、前記LCDRは一緒になって配列番号20のVL配列から得られた対応するLCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示する、可変軽鎖；および、可変重鎖であって、ここで前記可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで前記各HFWは重鎖フレームワーク領域を示し、各HCDRは重鎖相補性決定領域を示し、前記HCDRは一緒になって配列番号21のVH配列から得られた対応するHCDRに対して少なくとも90％の配列同一性を示す、可変重鎖を含む。適切には、本発明のHER2結合ドメインは、(i) 配列番号20のVL配列から得られた対応するCDR領域に示されるようなLCDR1、LCDR2、LCDR3、および(ii) 配列番号21のVH配列から得られた対応するCDR領域に示されるようなHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む。
一実施形態では、HER2結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号20のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、および／またはHER2結合ドメインの前記可変重鎖は、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す。特定の実施形態では、本発明のHER2結合ドメインは (i) 配列番号20のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖であって、配列番号20のVL配列から得られる対応するCDR領域中に示されるLCDR1、LCDR2、LCDR3を含む前記可変軽鎖、および／または(ii) 配列番号21にアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖であって、配列番号21のVH配列から得られる対応するCDR領域中に示されるHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む前記可変重鎖を含む。特定の実施形態では、HER2結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号20に記載のアミノ酸配列またはそれの保存的改変変異体を含み、および／またはHER2結合ドメインの前記可変重鎖は配列番号21に記載のアミノ酸配列またはそれの保存的改変変異体を含む。より具体的な実施形態では、HER2結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号20のアミノ酸配列を含み、および／またはHER2結合ドメインの前記可変重鎖は、配列番号21のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、前記HER2結合ドメインは、配列番号15のリンカーを含むscFvフォーマットである。
ある特定の実施形態では、本発明のHER2結合ドメインはトラスツズマブまたはその機能的断片である。一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは: (a) 本発明の抗体またはその機能的断片、および(b) 少なくとも１つのHER2結合ドメインを含み、ここで前記多重特異性ポリペプチドは配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも60、70、80、90％同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは前記多重特異性ポリペプチドは配列番号27に記載のアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する追加の結合ドメインを含んでもよい。一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、(a) 本発明の抗体またはその機能的断片、(b) 少なくとも１つの、好ましくは１つの、IL23R-結合ドメイン、および(c) 少なくとも１つの、好ましくは１つのHSA結合ドメインを含む。一実施形態では、本発明の多重特異性ポリペプチドは: (a) 本発明の抗体またはそれの機能的結合断片、(b) 少なくとも１つの、好ましくは１つの、HER2結合ドメイン、および(c) 少なくとも１つの、好ましくは１つの、HSA結合ドメインを含む。
用語「HSA」は、特に、UniProt ID番号P02768を有するヒト血清アルブミンまたはその変異体を指す。ヒト血清アルブミン（HSA）は、585個のアミノ酸から成るヒト血清中に豊富な66.4 kDaタンパク質（総タンパク質の50％を占める）である（Sugio、Protein Eng、Vol.12、1999、439-446）。多機能HSAタンパク質は、脂肪酸、金属イオン、ビリルビンおよびある種の薬物などの多数の代謝物を結合し輸送することができるその構造に関連付けられている（Fanali、Molecular Aspects of Medicine、Vol.33、2012、209-290）。血清中のHSA濃度は約3.5〜5 g/dLである。アルブミン結合抗体およびその断片は、例えば、それに結合させた薬物またはタンパク質の生体内血中半減期を延長するために使用することができる。
幾つかの態様において、HSA結合ドメインはモノクローナル抗体または抗体断片に由来する。
本発明の多特異的ポリペプチドで使用するのに適したHSA結合ドメインは、本開示で提供される結合ドメインである。本発明のHSA結合ドメインには、その配列が表１に列挙されているヒト化モノクローナル抗体が含まれるが、それに限定されない。
適当なHSA結合ドメインはヒトHSAに特異的であり、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖、および／または配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖を含む。特定の実施形態では、本発明のHSA結合ドメインは、（i）配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖であって、配列番号22のVL配列から得られる対応するCDR領域に示されるようなLCDR1、LCDR2、LCDR3を含む前記可変軽鎖、および／または（ii）配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖であって、配列番号23のVH配列から得られる対応するCDR領域に示されるようなHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む前記可変重鎖を含む。より具体的な実施形態では、HSA結合ドメインの前記可変軽鎖は配列番号22に記載のアミノ酸配列を含み、および／またはHSA結合ドメインの前記可変重鎖は配列番号23に記載のアミノ酸配列を含む。ヒトHSAに特異的な別の適当なHSA結合ドメインは、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖、および／または配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖を含む。特定の実施形態では、本発明のHSA結合ドメインは、（i）配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変軽鎖であって、配列番号24のVL配列から得られる対応するCDR領域に示されるようなLCDR1、LCDR2、LCDR3を含む前記可変軽鎖、および／または（ii）配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す可変重鎖であって、配列番号25のVH配列から得られる対応するCDR領域に示されるようなHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む前記可変重鎖を含む。特定の実施形態では、HSA結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号24のアミノ酸配列またはそれの保存的修飾変異体を含み、および／またはHSA結合ドメインの前記可変重鎖は、配列番号25のアミノ酸配列またはその保存的修飾変異体を含む。より具体的な実施形態では、HSA結合ドメインの前記可変軽鎖は、配列番号24に記載のアミノ酸配列を含み、および／またはHSA結合ドメインの前記可変重鎖は、配列25に記載のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、前記HSA結合ドメインは、配列番号15のリンカーを含むscFvフォーマットである。
好適には、本発明の多特異的ポリペプチドは、任意の適切な多重特異性、例えば、当業界で既知である二重特異的フォーマット、例えば非限定例として、一本鎖ダイアボディ（scDb）、タンデムscDb（Tandab）、直鎖状二量体scDb（LD-scDb）、環状二量体scDb（CD-scDb）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（BiTE；タンデムdi-scFv）、タンデムtri-scFv、トリボディ（Fab-(scFv)2）またはバイボディ（Fab-(scFv)1）、Fab 、Fab-Fv2、Morrison（IgG CH3-scFv融合体（Morrison L）またはIgG CL-scFv融合体（Morrison H））、トリアボディ、scDb-scFv、二重特異性Fab2、ジ−ミニ抗体（di-miniantibody）、テトラボディ、scFv-Fc-scFv融合体、 scFv-HSA-scFv融合体、ジ−ダイアボディ、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体、例えばbsAb（軽鎖のC末端に連結したscFv）、Bs1Ab （軽鎖のN末端に連結したscFv）、Bs2Ab（重鎖のN末端に連結したscFv）、Bs3Ab（重鎖のC末端に連結したscFv）、Ts1Ab（重鎖と軽鎖の両方のN末端に連結したscFv）、Ts2Ab（重鎖のC末端に連結したdsscFv）、およびKnob-into-Hole抗体（KiHs）（KiH技術により調製された二重特異性IgG）、MATCH（WO2016/0202457；Egan T.他、mAbs 9（2017）68-84に記載）およびDuoBodies（Duobody技術により調製された二重特異性IgG）（MAbs 2017 2月/3月; 9(2):182-212.doi：10.1080/19420862.2016 .1268307）が挙げられる。本明細書での使用に特に適しているのは、一本鎖ダイアボディ（scDb）、特に二重特異性単量体scDb、またはscDb-scFv、特に三重特異性単量体scDb-scFvである。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、該断片は同一ポリペプチド鎖中でVLに連結されたVH（VH-VL）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間を対合するには短すぎるリンカーを使用することにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合して２つの抗原結合部位を構築するようになる。ダイアボディは二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、欧州特許EP 404097、国際公開WO 1993/01161、Hudson他、Nat. Med. 9：129-134（2003）、およびHollinger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448（1993）中により詳しく記載されている。トリアボディおよびテトラボディは、Hudson他、Nat. Med. 9：129-134（2003）中にも記載されている。
二重特異性scDb、特に二重特異性単量体scDbは、特にリンカーL1、L2およびL3に連結された２つの可変重鎖ドメイン（VH）またはその断片と２つの可変軽鎖ドメイン（VL）またはその断片を、VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHBまたはVLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHBの順序で含み、ここでVLAドメインとVHAドメインが一緒になって第一抗原のための抗原結合部位を形成し、VLBドメインとVHBドメインが一緒になって第二抗原のための抗原結合部位を形成する。
リンカーL1は、特に２〜10アミノ酸、より特に３〜７アミノ酸、最も特に５アミノ酸のペプチドであり、リンカーL3は、特に１〜10アミノ酸、さらに特に２〜７アミノ酸、最も特に５アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、L1およびL3は両方ともGGGGS（配列番号16）である。中間部リンカーL2は、特に10〜40アミノ酸、より特には15〜30アミノ酸、最も特には20〜25アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、L2は(GGGGS)4（配列番号15）である。
本発明の一実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチドは、国際公開第WO2016/0202457号；Egan T.他、mAbs 9 (2017) 68-84中に記載のMATCH形の多重特異性および／または多価抗体である。
本発明の二重特異性、二価、多重特異性および／または多価構築物は、当技術分野で知られている任意の便利な抗体産生方法を用いて作製することができる（例えば、二重特異性構築物の作製に関してはFischer, N.＆Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14を参照；二重特異性ダイアボディおよびタンデムscFvの作製に関してはHornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012) 713-727を参照のこと）。本発明の二重特異性構築物の調製のための適切な方法の特定例としては、特に、Genmab（Labrijn他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150参照）およびMerus（de Kruif他、Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750参照）技術が挙げられる。機能的抗体Fc部分を含む二重特異性抗体の産生方法も当技術分野で知られている（例えば、Zhu他、Cancer Lett. 86 (1994) 127-134；およびSuresh他、Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228参照）。
これらの方法は、典型的には、例えば、ハイブリドーマ技術を使用して所望の抗原で免疫処置されたマウス由来の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合する手段によるモノクローナル抗体の生成（例えば、Yokoyama他、Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2、Unit 2.5、2006参照）または組換え抗体工学（レパートリー・クローニングまたはファージ・ディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えばChames＆Baty、FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8参照）によりおよび既知の分子クローニング技術を使った２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインまたはその断片もしくは部分の組み合わせにより二重特異性構築物を得ることを含む。
特定の実施形態では、多重特異性ポリペプチドは、１または複数のポリペプチドリンカーを更に含む。
特定の実施形態では、前記多重特異性ポリペプチドは、単量体ポリペプチド、特に本発明の抗体またはその機能的断片がリンカーを介して第二の結合ドメインに連結されたscFv抗体断片である、単量体ポリペプチド、特に前記第二の結合ドメインが第二のscFv抗体断片である単量体ポリペプチドである。
特定の実施形態において、前記多重特異性ポリペプチドは、二量体ポリペプチド、特に２つのポリペプチドの会合が、前記多重特異性ポリペプチドに含まれる抗体断片の相補的VLドメインとVHドメインとの会合によって引き起こされる二量体ポリペプチドである。特定のこのような実施形態では、多重特異性ポリペプチドは、国際公開第2016/202457号の教示による多重特異性抗体構築物である。特定の他の実施形態では、多重特異性ポリペプチドは一本鎖ダイアボディ構築物（scDb）である。特定の他の実施形態では、多重特異性ポリペプチドは、一方が足場（scaffold）を形成する定常ドメインを有し、そこに１または複数のscFv断片がフレキシブルリンカーによって結合されている、VL-CLおよびVH-CH1から成るFab断片のヘテロ二量体アセンブリを使用するFab-(scFv)n構築物（nは1、2、3または4から選択される整数である）である。
第三の態様において、本発明は、本発明の抗体もしくはその機能的断片または本発明の多重特異性ポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題や合併症のない、合理的なリスク・ベネフィット（損益）比に見合った、ヒトまたは動物の組織との接触での使用に適した化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
本開示による医薬組成物は通常、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、アジュバントおよびサイトカインなどの補助免疫増強剤、並びに随意に他の治療剤をさらに含み得る。該組成物は抗酸化剤および／または防腐剤を含んでもよい。抗酸化剤として、チオール誘導体（例えばチオグリセロール、システイン、アセチルシステイン、シスチン、ジチオエリスレイトール、ジチオスレイトール、グルタチオン）、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、亜硫酸塩（例えば硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アセトン亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム）およびノルジヒドログアイアレチン酸が挙げられる。適切な防腐剤は、例えば、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化セチルピリジニウムである。
本明細書で提供される特定の実施形態では、前記抗体またはそれの機能的断片は、組換え手段により単離し、調製し、発現させ、または構築することができ、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使って抗体を発現させ、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから抗体を単離し、または他の任意手段、例えばヒト免疫グロブリン配列をコードするDNA配列の合成、遺伝子工作による構築、またはヒト免疫グロブリンをコードする配列、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子配列を別のそのような配列へスプライシングすることを含む任意手段により、抗体を調製し、発現させ、作製し、または単離することができる。
従って、第４の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする核酸配列または核酸配列の集合体に関する。
「核酸」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖の形態のそれらのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含し、これらは合成、天然および非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、キラルメチルリン酸塩、２-Ｏ-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が挙げられるが、これらに限定されない。特に断らない限り、特定の核酸配列は、それの保存的修飾変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列、並びに明白に指摘された配列も暗黙的に包含する。具体的には、下記に詳述する通り、縮重コドン置換は、１または複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される（Batzer他、Nucleic Acid Res.19：5081、1991; Ohtsuka他、J. Biol. Chem. 260：2605-2608、1985; およびRossolini他、Mol. Cell. Probes 8：91-98、1994参照）。
第５の態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸配列の集合体を含むベクターまたはベクターの集合体に関する。「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞中での組換え発現のための本発明の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、最も一般的にはDNAプラスミドを意味する。ベクターは細胞内で複製する能力がある場合とない場合がある。本明細書に記載の抗体またはその断片の可変重鎖および／または可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドがいったん得られれば、抗体分子の産生のためのベクターを、当技術分野で周知の技術を用いる組換えDNA技術によって作製することができる。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列と適切な転写および翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ（試験管内）組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ（生体内）遺伝子組換えが含まれる。
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入することができ、次いで、得られた細胞を従来の技術によって培養し、本明細書に記載の抗体またはその断片を産生することができる。従って、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合体、または本発明のベクターもしくはベクターの集合体を含む宿主細胞、特に発現宿主細胞に関する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本発明の抗体またはその断片の可変重鎖と可変軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、２つの異なるベクター、すなわち前記抗体の可変重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第１ベクターと、前記抗体の可変軽鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第２ベクターとを含有する。他の実施形態では、第１の宿主細胞が、前記抗体の可変重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞が、前記抗体の可変軽鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含有する。
ウサギ抗体またはげっ歯類抗体のヒト化方法は、当業者に周知である（例えば、Borras、J Biol Chem. 2010 Mar 19; 285 (12):9054-66; Rader他、The FASEB Journal、速報記事10.1096/fj.02-0281fje、オンラインで2002年10月18日公開; Yu他 (2010) A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Block Tumor Growth in Tenograft Models.PLoS ONE 5 (2): e9072.doi：10.1371/journal.pone.0009072を参照のこと）。ウサギまたはげっ歯類の免疫処置は、タンパク質などの目的の抗原自体を使用して、またはペプチドもしくはタンパク質抗原の場合、目的のペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸、例えばプラスミドを用いたウサギのDNA免疫処置により、実施することができる。
第６の態様では、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合体、または本発明のベクターもしくはベクターの集合体を含む、宿主細胞、特に発現宿主細胞に関する。
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図していることを理解されたい。突然変異または環境の影響のいずれかのため、後続の世代でも特定の変更が発生する可能性があり、そのような子孫は実際には親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
第７の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片の産生方法であって、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合体、または本発明のベクターもしくはベクターの集合体、または本発明の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現させることを含む方法に関する。
第８の態様では、本発明は、多重特異性構築物を作製する方法であって、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする１以上の核酸配列を、１以上のステップでクローニングし、少なくとも第２の結合ドメインまたはその断片をコードする核酸配列と、随意に、１以上の追加の結合ドメインまたはその断片をコードする核酸配列とを含む、多重特異性構築物を作製する方法に関する。
第８の態様の特定の実施形態では、第２の結合ドメインは第２の抗体またはその機能的断片である。
特定の実施形態では、前記随意の追加の結合ドメインの少なくとも１つが存在し、特に前記追加の結合ドメインが第３の抗体またはその機能的断片である。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物に関する。
別の態様において、本発明は、医薬品の製造に使用するための、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物に関する。
一態様において、本発明は、必要な対象において癌、炎症および／または自己免疫疾患の治療に使用するための、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物に関する。
別の態様において、本発明は、必要な対象において癌、炎症および／または自己免疫疾患を治療するための、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物の使用に関する。
更なる態様において、本発明は、必要な対象において癌、炎症および／または自己免疫疾患の治療用医薬品の製造における、本発明の抗体もしくはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物の使用に関する。
一態様では、本発明は、必要な対象において癌、炎症および／または自己免疫疾患の治療方法であって、本発明の抗体またはその機能的断片、または前記抗体もしくはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド、または本発明の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を包含する。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類と非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類が含まれる。特に断りのない限り、「患者」または「対象」という用語は本明細書中で互換的に使用される。
本明細書で用いられる「処置」、「処置する」、「治療する」、「治療した」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患のおよび／または疾患に起因する有害事象の部分的もしくは完全な治癒の点からまたは疾患の進行を遅らせる点から治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳類、例えばヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、以下を含む：（a）疾患の抑制、すなわち、その発症の阻止；および（c）疾病の緩和、すなわち疾病の退行の誘起。
「治療有効量」または「有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与する時に、そのような疾患の治療を行うのに十分である薬剤の量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患およびその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なるだろう。
炎症性および／または自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、および虚血再灌流障害でありうる。
「癌」という用語は、異常細胞の急速で無制御の増殖により特徴づけられる疾患を指す。癌細胞は局所的にまたは血流やリンパ系を介して体の他の部位に拡散することができる。「腫瘍」および「癌」という用語は本明細書では互換的に使用され、例えば、両用語は、固形および液状腫瘍、例えばびまん性または循環腫瘍を包含する。本明細書で使用される「癌」または「腫瘍」という用語には、前癌性並びに悪性の癌および腫瘍が含まれる。
治療すべき癌には、限定されないが、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、口腔癌、食道癌、膵臓癌、Ｂ細胞リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫、例えば成人Ｔ細胞リンパ腫白血病（ATLL）、急性骨髄性リンパ腫（AML）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫（FL）、小児急性リンパ芽球性リンパ腫（B-ALL）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（AITL）、未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）、Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞リンパ腫、および末梢Ｔ細胞リンパ腫（PTCL）が含まれる。特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、口腔癌、食道癌、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、例えば成人Ｔ細胞リンパ腫白血病（ATLL）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（AITL）、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、Ｔ細胞/ナチュラルキラー細胞リンパ腫、および末梢Ｔ細胞リンパ腫（PTCL）が含まれる。
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示するものである。
実施例１：選択およびヒト化
CD3ε結合ドメインのリード候補の創出のために、６つのウサギモノクローナル抗体クローンを選択した。
CD3ε結合ドメインのリード候補の創出のために、６つのウサギモノクローナル抗体クローンを選択した。
選択されたクローンのヒト化は、国際公開第WO 2014/206561号に記載されているように、Vκ1/VH3タイプのscFv受容体フレームワークへのウサギCDRの導入を含んだ。このプロセスでは、ドナー（供与体）配列（ウサギmAb）上に６つのCDR領域のアミノ酸配列が同定され、それをアクセプター足場配列へと移植した。選択のために、scFvはVL−リンカー−VHの配列で構築した。一例は、タンパク質鎖のＮ末端からＣ末端へ向かって配列番号４、15および８の組み合わせであろう。
CDRポジショニングに影響を与え、従って抗原結合に影響を与える可能性があると記載されている、ある種のフレームワーク領域中のウサギドナーからの追加のアミノ酸（Borras他、2010；J. Biol. Chem., 285:9054-9066）を最終構築物中に含めた。表２は、クローン28-21-D09（AHoに従った番号付け法）に対して行われた変更を示す。これらの構築物の特性決定データの比較により、単独のCDR移植を上回る有意な利点が明らかになった。
前の項目で説明したインシリコ（in silico）構築物の設計が完了した後、対応する遺伝子を合成し、細菌発現ベクターを構築した。発現構築物の配列をDNAレベルで確認し、一般的な発現および精製プロトコルに従って構築物を製造した。
タンパク質の異種発現は、不溶性封入体として大腸菌（E.coli）中で行った。指数関数的に成長する原培養物を発現培養物に接種した。培養は、市販の富栄養培地を使用した軌道振盪器上で、振盪フラスコ内で実施した。規定のOD600＝２まで細胞を増殖させ、1 mMのイソプロピルβ-Ｄ-１-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて一晩発現を誘導した。発酵の終わりに細胞を遠心分離により収集し、超音波処理によりホモジナイズした。この時点で、細胞溶解物のSDS-PAGE分析により、種々の構築物の発現レベルを決定した。細胞残屑や他の宿主細胞不純物を除去するための数回の洗浄工程を含む遠心分離プロトコルにより、ホモジナイズした細胞ペレットから封入体を単離した。精製された封入体を変性バッファー（100 mM Tris/HCl pH 8.0、6 M Gdn-HCl、2 mM EDTA）中に可溶化し、ミリグラム量の自然に折りたたまれた単量体scFvを生成する拡張可能（スケーラブル）リフォールディングプロトコルにより、scFvをリフォールディングした。scFvを精製するために、標準化されたプロトコルを採用した。これは次の手順を含んだ。リフォールディング後の生成物を、Capto Lアガロース（GE Healthcare製）を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより捕捉し、精製scFvを得た。初期テストで親和性と効力の基準を満たしたリード候補を、HiLoad Superdex75カラム（GE Healthcare製）を使用した精製用サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。精製プロトコルに続いて、タンパク質を緩衝生理食塩水中に製剤化し、特性を評価した。
実施例２：ヒト化scFvの特性評価
2.1 ヒトおよびカニクイザルCD3εに対する親和性
ヒト化scFvのヒトおよびカニクイザルCD3εに対する親和性は、T200装置（Biacore、General Electric社製）を使用したSPR測定により決定した。アミンカップリング化学を使用して、CD3εをCM5センサーチップ（Biacore、General Electric社製）に直接結合した。再生探索と表面性能試験を実行して最適アッセイ条件を見出した後、scFv用量応答を測定し、得られた結合曲線を二重参照（空の参照チャネルとゼロの分析対象注入）し、1：1 ラングミュア（Langmuir）モデルを使用して動態パラメーターを読み取った。アッセイは、pH 7.4の１×PBS-Tweenバッファー中で行った。
2.1 ヒトおよびカニクイザルCD3εに対する親和性
ヒト化scFvのヒトおよびカニクイザルCD3εに対する親和性は、T200装置（Biacore、General Electric社製）を使用したSPR測定により決定した。アミンカップリング化学を使用して、CD3εをCM5センサーチップ（Biacore、General Electric社製）に直接結合した。再生探索と表面性能試験を実行して最適アッセイ条件を見出した後、scFv用量応答を測定し、得られた結合曲線を二重参照（空の参照チャネルとゼロの分析対象注入）し、1：1 ラングミュア（Langmuir）モデルを使用して動態パラメーターを読み取った。アッセイは、pH 7.4の１×PBS-Tweenバッファー中で行った。
SPR実験は、ウサギドナーIgGからの構造残基をヒト化配列に追加する効果を示す（表３を参照）。ウサギCDRのみを含む構築物28-21-D09-sc03は、標的への検出可能な結合を全く示さない。VLの位置54にアルギニンまたはリジンを含むすべてのクローンは、標的への結合を示す。SPRデータに基づいて、構築物28-21-D09-sc04からのドメインが、scDb形での更なるインビトロ特徴付けのために選択された。
2.2 熱変成
試験したscFv構築物の熱変性の推移の中点を、本質的にNiesenにより記載された通りに（Niesen他、Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21）、示差走査蛍光測定法（DSF）により決定した。DSFアッセイはqPCR機器（例えばMX3005p、Agilent Technologies製）で実行される。サンプルは、総容量25μLにおいて最終濃度５×SYPROオレンジを含むバッファー（クエン酸−リン酸 pH 6.4、0.25 M NaCl）中に希釈した。バッファー探索（スカウティング）実験において、変性温度のpH依存性が決定され、全ての構築物について同等のpH特性が観察された。サンプルは同じものを３通り作製して測定し、25〜96℃の温度勾配をプログラムした。蛍光シグナルを取得し、生データをGraphPad Prism（GraphPad Software Inc.）で分析した。
試験したscFv構築物の熱変性の推移の中点を、本質的にNiesenにより記載された通りに（Niesen他、Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21）、示差走査蛍光測定法（DSF）により決定した。DSFアッセイはqPCR機器（例えばMX3005p、Agilent Technologies製）で実行される。サンプルは、総容量25μLにおいて最終濃度５×SYPROオレンジを含むバッファー（クエン酸−リン酸 pH 6.4、0.25 M NaCl）中に希釈した。バッファー探索（スカウティング）実験において、変性温度のpH依存性が決定され、全ての構築物について同等のpH特性が観察された。サンプルは同じものを３通り作製して測定し、25〜96℃の温度勾配をプログラムした。蛍光シグナルを取得し、生データをGraphPad Prism（GraphPad Software Inc.）で分析した。
すべての機能的ヒト化scFv構築物の熱変性を上記のようにDSFにより分析した。全ての構築物が60℃以上に熱変性の中点を示し（表４を参照）、高立体構造安定性と高親和性の相関は無いように思われる（表３と比較して）。
2.3 貯蔵安定性
各サンプルの初期モノマー含有量（d0)は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によって決定した。ランニングバッファー（250 mM NaCl、50 mM NaOAc、pH 6.0; 0.35 mL/分の流速）を用いて、サンプルをShodexTM（昭和電工製）KW402.5-4Fカラムに通過させた。溶出したタンパク質を280 nmでの吸光度により検出した。モノマータンパク質の割合を計算するために、モノマーの保持時間の所でピークに達する曲線下の面積を、サンプルマトリックスに起因しない曲線下総面積により除算した。サンプルを４℃で保存し、10 mg/mLの濃度で28日間に渡って繰り返し分析した（図１）。
各サンプルの初期モノマー含有量（d0)は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によって決定した。ランニングバッファー（250 mM NaCl、50 mM NaOAc、pH 6.0; 0.35 mL/分の流速）を用いて、サンプルをShodexTM（昭和電工製）KW402.5-4Fカラムに通過させた。溶出したタンパク質を280 nmでの吸光度により検出した。モノマータンパク質の割合を計算するために、モノマーの保持時間の所でピークに達する曲線下の面積を、サンプルマトリックスに起因しない曲線下総面積により除算した。サンプルを４℃で保存し、10 mg/mLの濃度で28日間に渡って繰り返し分析した（図１）。
実施例３：一本鎖ダイアボディ（scDb）フォーマットの作製
CD3ドメインの機能的特徴付けのため、Ｔ細胞活性化と標的細胞枯渇を誘発する可能性のあるドメインを試験するために、特定のドメインを一本鎖ダイアボディフォーマットに組み込んだ。
CD3ドメインの機能的特徴付けのため、Ｔ細胞活性化と標的細胞枯渇を誘発する可能性のあるドメインを試験するために、特定のドメインを一本鎖ダイアボディフォーマットに組み込んだ。
特定のCD3ドメインを、IL23R結合ドメイン（抗IL23Rクローン14-11-D07、配列番号11と12参照；PRO624、配列番号26参照）またはHER2結合ドメイン（トラスツズマブ、配列番号20と21参照；PRO957、配列番号27参照）のいずれかと一緒に、一本鎖ダイアボディフォーマット中に組み込んだ。クローン28-21-D09からのVLおよびVHドメインに加えて、他の２つの公開されたCD3バインダーのVLおよびVHドメインについても試験した（抗CD3クローン09-24-H09-sc10：国際公開第WO 2014/191113号および配列番号９と10を参照；抗CD3クローンI2C：米国特許第US 2010/0150918号および配列番号13と14を参照）。
一本鎖ダイアボディ（scDb）フォーマットの構築物設計は、前述のように実施した（Holligerら、“Diabodies”：small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448）。要するに、表１に列挙されている可変ドメインは、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHAフォーマットで整列され（表５参照）、ここで、L1とL3は短いG4Sリンカー（配列番号16）であり、L2は長い(G4S)4リンカー（配列番号15）である。
ヌクレオチド配列を新たに合成し、pET26b(+)骨格（Novagen）をベースにした大腸菌発現用の適合ベクター中にクローニングした。発現構築物を用いて大腸菌株BL12(DE3)（Novagen）を形質転換させ、スタートカルチャーとして2YT培地（Sambrook J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual）中で細胞を培養した。発現培養物を接種し、振盪フラスコで37℃および200 rpmでインキュベートした。OD600＝１に達したら、0.5 mMの最終濃度でIPTGを添加することによりタンパク質発現を誘導した。一晩発現させた後、4,000×gで遠心分離することにより細胞を回収した。封入体の調製のために、細胞ペレットをIB再懸濁バッファー（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5％Triton X-100）中に再懸濁した。細胞スラリーに、1 mM DTT、0.1 mg/mLリゾチーム、10 mMロイペプチン、100μM PMSFおよび１μMペプスタチンを補足した。氷上で冷却しながら、３サイクルの超音波ホモジナイズ処理により細胞を溶解した。その後、0.01 mg/mLのDNアーゼを添加し、ホモジネートを室温で20分間インキュベートした。15,000×g、4℃で遠心分離することにより封入体（IB）を沈降させた。IBをIB再懸濁バッファーに再懸濁し、別の遠心分離の前に音波処理によりホモジナイズした。合計でIB再懸濁バッファーで最低３回の洗浄工程を実行し、続いてIB洗浄バッファー（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM EDTA）で２回洗浄して、最終IBを得た。
タンパク質のリフォールディング（再折り畳み）のために、単離されたIBを、可溶化バッファー（100 mM Tris/HCl pH8.0、6M Gdn-HCl、2mM EDTA）中に、湿潤IB １g当たり5 mLの割合で再懸濁した。DTTが最終濃度20 mMに添加されるまで、溶解物を室温で30分間インキュベートし、次いでインキュベーションを更に30分間続けた。可溶化が完了した後、21,500×gと４℃で10分間の遠心分離により、溶液を清澄化した。リフォールディングは、リフォールディングバッファー（典型的に：100 mM Tris-HCl pH 8.0、5.0 M尿素、5 mMシステイン、1 mMシスチン）中に溶解したタンパク質を最終タンパク質濃度0.3 g/Lで急速希釈することにより実施した。リフォールディング反応は、最低14時間の間、日常的にインキュベートした。得られたタンパク質溶液は、8,500×gおよび４℃で10分間の遠心分離により清澄化した。リフォールディングされたタンパク質は、Capto L樹脂（GE Healthcare）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。分離されたモノマー画分を、サイズ排除HPLC、純度についてはSDS-PAGE、タンパク質含量についてはUV/Vis分光法により分析した。緩衝液を透析により天然の緩衝液（50 mMクエン酸−リン酸 pH 6.4、200 mM NaCl）に交換した。タンパク質濃度は、安定性分析の意図した値に調整された。
実施例４：一本鎖ダイアボディ（scDb）構築物の機能特性評価
4.1 NFATレポーター遺伝子アッセイによるＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化はNFATアッセイにおいて試験した。Jurkat NFATレポーターＴ細胞株は、IL-2プロモーターからのNFAT（活性化Ｔ細胞の核因子）応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する（GloResponseTM（商標）NFAT-luc2 Jurkat Cells）。転写因子NFATはCD3εの架橋形成によって活性化され、Ｔ細胞活性化に関与する多数の遺伝子を誘導する。このシステムでは、CD3εの架橋形成がルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導する。トランスジェニックIL-23R（図２〜７）またはHER2（図８〜９）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を標的細胞として使用し、親CHO-K1細胞株をネガティブコントロール（陰性対照）細胞株として使用した。50μLのアッセイ培地（RPMI 1640、10％FCS）で希釈した25,000個の生存可能標的細胞を、白色の平底96ウェルプレートに播種した。次に、アッセイ培地で希釈した４倍濃縮試験タンパク質25μLを適切なウェルに添加した。最後に、50,000個のJurkat細胞を含む25μLのアッセイ培地を各ウェルに加え、最初に室温で10分間プレートを穏やかに撹拌しながらインキュベートし、次に37℃、5％CO2に５時間移した。ルシフェラーゼ活性を検出するために、製造業者の指示に従って、ワンステップ・ルシフェラーゼアッセイキット（Amsbio）を使用した。手短に言えば、インキュベーション時間の終わりに、ルシフェラーゼ試薬基質をルシフェラーゼ試薬緩衝液と混合し、50μLを各ウェルに加え、プレートを室温で遮光下で15分間インキュベートした。プレートは、Flexstation IIIマルチモード・マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を使って読み取った。
4.1 NFATレポーター遺伝子アッセイによるＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化はNFATアッセイにおいて試験した。Jurkat NFATレポーターＴ細胞株は、IL-2プロモーターからのNFAT（活性化Ｔ細胞の核因子）応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する（GloResponseTM（商標）NFAT-luc2 Jurkat Cells）。転写因子NFATはCD3εの架橋形成によって活性化され、Ｔ細胞活性化に関与する多数の遺伝子を誘導する。このシステムでは、CD3εの架橋形成がルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導する。トランスジェニックIL-23R（図２〜７）またはHER2（図８〜９）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を標的細胞として使用し、親CHO-K1細胞株をネガティブコントロール（陰性対照）細胞株として使用した。50μLのアッセイ培地（RPMI 1640、10％FCS）で希釈した25,000個の生存可能標的細胞を、白色の平底96ウェルプレートに播種した。次に、アッセイ培地で希釈した４倍濃縮試験タンパク質25μLを適切なウェルに添加した。最後に、50,000個のJurkat細胞を含む25μLのアッセイ培地を各ウェルに加え、最初に室温で10分間プレートを穏やかに撹拌しながらインキュベートし、次に37℃、5％CO2に５時間移した。ルシフェラーゼ活性を検出するために、製造業者の指示に従って、ワンステップ・ルシフェラーゼアッセイキット（Amsbio）を使用した。手短に言えば、インキュベーション時間の終わりに、ルシフェラーゼ試薬基質をルシフェラーゼ試薬緩衝液と混合し、50μLを各ウェルに加え、プレートを室温で遮光下で15分間インキュベートした。プレートは、Flexstation IIIマルチモード・マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を使って読み取った。
4.2 細胞毒性アッセイ（Ｔ細胞誘導標的細胞枯渇）
血球分画：
末梢血単核細胞（PBMC）は、製造元の教示に従ってリンパ球分離培地Lymphoprep（Stemcell technologies製）を使用して、健常ボランティアまたは健常カニクイザルの新鮮血液から単離された。簡単に説明すると、血液をヒトPBMC単離バッファー（PBS、2％FCS、2 mM EDTA）またはカニクイザルPBMCs分離バッファー（PBS、5％FCS、2 mM EDTA）で１：２に希釈し、推奨量のLymphoprep培地を含むLeucoSepチューブ中に投入した。LeucoSepチューブは、ブレーキを使用せずに、RTで800×g（ヒト血液）または2,000×g（カニクイザル血液）にて30分間遠心分離した。次に、PBMCを含む細胞層を回収し、ヒトまたはカニクイザルのPBMC単離バッファーで２回洗浄し、赤血球溶解バッファーを使用して室温で５分間赤血球を溶解させた。次いで、単離されたヒト細胞およびカニクイザル細胞を、それぞれの単離用バッファーで１回およびアッセイ培地（RPMI-1640、10％FCS）で１回洗浄した。血小板除去後、単離されたPBMCは、1 mLあたり３×106個の生存細胞の密度でアッセイ培地に再懸濁した。
血球分画：
末梢血単核細胞（PBMC）は、製造元の教示に従ってリンパ球分離培地Lymphoprep（Stemcell technologies製）を使用して、健常ボランティアまたは健常カニクイザルの新鮮血液から単離された。簡単に説明すると、血液をヒトPBMC単離バッファー（PBS、2％FCS、2 mM EDTA）またはカニクイザルPBMCs分離バッファー（PBS、5％FCS、2 mM EDTA）で１：２に希釈し、推奨量のLymphoprep培地を含むLeucoSepチューブ中に投入した。LeucoSepチューブは、ブレーキを使用せずに、RTで800×g（ヒト血液）または2,000×g（カニクイザル血液）にて30分間遠心分離した。次に、PBMCを含む細胞層を回収し、ヒトまたはカニクイザルのPBMC単離バッファーで２回洗浄し、赤血球溶解バッファーを使用して室温で５分間赤血球を溶解させた。次いで、単離されたヒト細胞およびカニクイザル細胞を、それぞれの単離用バッファーで１回およびアッセイ培地（RPMI-1640、10％FCS）で１回洗浄した。血小板除去後、単離されたPBMCは、1 mLあたり３×106個の生存細胞の密度でアッセイ培地に再懸濁した。
フローサイトメトリーベースのインビトロ細胞毒性アッセイ（FCアッセイ）およびCD8+Ｔ細胞の活性化：
抗IL23RxCD3ε二重特異性構築物については、トランスジェニックIL-23R発現チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を標的細胞として使用し、親CHO-K1細胞株をネガティブコントロール（陰性対照）細胞株として使用した（図２〜７）。抗HER2x抗CD3ε二重特異性構築物には、トランスジェニックHER2を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を使用した（図８〜９）。予めPKH67で標識され、75μLのアッセイ培地（RPMI-1640、10％FCS）中に希釈した5,000個の生存可能標的細胞を96ウェルプレートに添加した。次に、アッセイ培地で希釈した６倍濃縮の試験タンパク質25μLを適当なウェルに添加した。次に、Ｅ：Ｔ比が30：1になるように、50μLのアッセイ培地中に希釈した150,000個の生存可能エフェクター細胞（PBMC）を各ウェルに加え、RTで転倒ミキサー上でプレートを混合した後、37℃で5％CO2でインキュベートした。16時間後、細胞をトリプシン処理し、染色バッファー（PBS、2％BCS、2 mM EDTA）中に再懸濁し、非結合プレートに移した。
抗IL23RxCD3ε二重特異性構築物については、トランスジェニックIL-23R発現チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を標的細胞として使用し、親CHO-K1細胞株をネガティブコントロール（陰性対照）細胞株として使用した（図２〜７）。抗HER2x抗CD3ε二重特異性構築物には、トランスジェニックHER2を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞を使用した（図８〜９）。予めPKH67で標識され、75μLのアッセイ培地（RPMI-1640、10％FCS）中に希釈した5,000個の生存可能標的細胞を96ウェルプレートに添加した。次に、アッセイ培地で希釈した６倍濃縮の試験タンパク質25μLを適当なウェルに添加した。次に、Ｅ：Ｔ比が30：1になるように、50μLのアッセイ培地中に希釈した150,000個の生存可能エフェクター細胞（PBMC）を各ウェルに加え、RTで転倒ミキサー上でプレートを混合した後、37℃で5％CO2でインキュベートした。16時間後、細胞をトリプシン処理し、染色バッファー（PBS、2％BCS、2 mM EDTA）中に再懸濁し、非結合プレートに移した。
細胞をCD69、CD8、CD4、CD11c、およびアネキシンＶのような種々のマーカーで染色した。分析に関しては、アポトーシスを起こして死んだ標的細胞と活性化されたCD8+Ｔ細胞に焦点をあてた。それにより、標的細胞は緑色蛍光（PKH67）により識別され、その生存率がアネキシンＶ APCにより分析される。エフェクター細胞（CD8+細胞）は、その表面上のCD8を検出することにより同定した（抗CD8 PerCP-Cy5.5）。CD8+Ｔ細胞の活性化は、最終的にCD69発現の定量化により検出される（抗CD69 PE）。CD4はCD8+Ｔ細胞とCD4+Ｔ細胞とをより良好に識別するために使用される。CD11cは、単球と樹状細胞に目印を付け、それらを除外するために使用される。アネキシンＶ以外の各マーカーについて、抗体を穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートした。細胞を染色バッファーで１回洗浄し、アネキシン結合バッファーで１回洗浄し、そして撹拌しながら室温で30分間アネキシンＶ染色を行う。細胞をアネキシンＶ結合バッファーで１回洗浄し、Novocyte Flow Cytometer上でフローサイトメトリー分析を実施した。
特異的標的細胞溶解の割合は、次の式に従って計算される：
標的細胞の特異的溶解[％]＝[１−（サンプルの標的細胞生存率）/（対照サンプルの平均生存率）] × 100
標的細胞の特異的溶解[％]＝[１−（サンプルの標的細胞生存率）/（対照サンプルの平均生存率）] × 100
活性化されたCD8+Ｔ細胞の割合は、CD69+ CD8+ Ｔ細胞の割合に対応する。
結果
Ｔ細胞活性化の特異性の比較
PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）およびPRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）によって媒介される標的発現細胞の特異的標的細胞溶解の比較は、それぞれ5.3および3.3 pMのEC50で同様の効力を示す（図２参照）。また、達成可能な最大溶解レベルは、これら２つのタンパク質で同一である。しかしながら、抗原陰性細胞との組み合わせでは、PRO460（IL23RxCD32nd gen Numab）がネガティブコントロール（陰性対照）細胞の部分的枯渇を引き起こすような高濃度の分子の所では違いが現れる（図２）。フローサイトメトリー（FC）による細胞毒性アッセイのウェルでのエフェクター細胞活性化の定量は、特異的溶解の結果と一致する。標的陽性細胞を含む条件の場合、エフェクター細胞の活性化に対する用量応答も観察される。これらの結果は、エフェクター細胞活性化について同様のEC50を示すが、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）は、見かけ上、より低い最大応答のプラトー状態に達するようである（図３参照）。標的陰性細胞を含むウェルでは、非特異的活性化のEC50の明らかな違いが見られ、２分子間を識別する。高濃度の両分子を投与すると、標的が存在しない場合でも活性化された細胞が増加する（図３）。しかし、この効果は約25倍低い濃度の分子PRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）において観察される。従って、データは、PRO389の抗CD3ドメイン（IL23RxCD31st gen Numab）が、同じフォーマットと標的結合ドメインを使用したPRO460の抗CD3ドメイン（IL23RxCD3I2C Amgen）との直接比較において、より特異的なＴ細胞活性化を示すという証拠を提供する。
Ｔ細胞活性化の特異性の比較
PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）およびPRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）によって媒介される標的発現細胞の特異的標的細胞溶解の比較は、それぞれ5.3および3.3 pMのEC50で同様の効力を示す（図２参照）。また、達成可能な最大溶解レベルは、これら２つのタンパク質で同一である。しかしながら、抗原陰性細胞との組み合わせでは、PRO460（IL23RxCD32nd gen Numab）がネガティブコントロール（陰性対照）細胞の部分的枯渇を引き起こすような高濃度の分子の所では違いが現れる（図２）。フローサイトメトリー（FC）による細胞毒性アッセイのウェルでのエフェクター細胞活性化の定量は、特異的溶解の結果と一致する。標的陽性細胞を含む条件の場合、エフェクター細胞の活性化に対する用量応答も観察される。これらの結果は、エフェクター細胞活性化について同様のEC50を示すが、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）は、見かけ上、より低い最大応答のプラトー状態に達するようである（図３参照）。標的陰性細胞を含むウェルでは、非特異的活性化のEC50の明らかな違いが見られ、２分子間を識別する。高濃度の両分子を投与すると、標的が存在しない場合でも活性化された細胞が増加する（図３）。しかし、この効果は約25倍低い濃度の分子PRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）において観察される。従って、データは、PRO389の抗CD3ドメイン（IL23RxCD31st gen Numab）が、同じフォーマットと標的結合ドメインを使用したPRO460の抗CD3ドメイン（IL23RxCD3I2C Amgen）との直接比較において、より特異的なＴ細胞活性化を示すという証拠を提供する。
PRO389の抗CD3ドメイン（IL23RxCD31st gen Numab）およびPRO460の抗CD3ドメイン（IL23RxCD3I2C Amgen）の特異的標的細胞枯渇を、ヒトPBMCを使った細胞毒性アッセイにおいて比較した。２つのscDbは、標的陽性細胞の標的細胞枯渇と、標的陰性細胞の標的細胞枯渇の欠如の点から、ほぼ等しい性質を有することを示した（図４参照）。細胞毒性アッセイのウェル中でのエフェクター細胞活性化のフローサイトメトリー（FC）による定量は、上記の特異的溶解の結果と一致している。標的陽性細胞を含む条件では、エフェクター細胞の活性化において用量応答も観察され、２つの分子とも同様な応答を生じた。標的陰性細胞を含む条件では、活性化されたエフェクター細胞の増加は、試験した最大濃度においてのみ観察される。
確認実験において、Ｔ細胞活性化に対する分子PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）およびPRO389（IL23RxCD31st gen Numab）の効力をNFATレポーター遺伝子アッセイを使用して試験した。この実験では、抗原陽性細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘導するほぼ同じ効力が確認された（図６参照）。 EC50は細胞溶解と比較して約８倍だけ高濃度側にシフトするが（図４参照）、このデータは同じ実験の活性化データ（図５参照）と一致しており、明らかに５倍高いEC50も示す。抗原陰性細胞と組み合わせて、両分子は、試験した最高濃度の50 nMでのみ、ベースラインを超える活性化シグナルの増加を示す。
結論として、上記結果は、PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）およびPRO389（IL23RxCD31st gen Numab）に組み込まれた抗CD3ドメインが、標的細胞枯渇とＴ細胞活性化の両方を誘導するインビトロ効力と特異性の点から同等に作用することを示す。これに対して、PRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）の抗CD3ドメインは、同一の分子バックグラウンドで、標的細胞の存在下でＴ細胞を活性化し、それらの特異的枯渇を媒介する同等の効力を示し、標的細胞の非存在下ではPRO460（IL23RxCD3I2C Amgen）はＴ細胞活性化の増加を示し、標的陰性細胞の細胞溶解さえも引き起こす。
さらに、PRO957（HER2xCD32nd gen Numab）およびPRO956（HER2xCD3I2C Amgen）により媒介されるHER2標的発現細胞の特異的標的細胞溶解の比較を実施した。PRO957（HER2xCD32nd gen Numab）およびPRO956（HER2xCD3I2C Amgen）によって媒介されるHER2発現標的細胞の特異的標的細胞溶解の比較は、16時間後にPRO957（HER2xCD32nd gen Numab）の10倍高い効力を示し、そして40時間後に約３〜４倍高い効力を示す（図８Ａと８Ｂ参照）。40時間後に、両分子が標的細胞の特異的溶解の同一レベルに到達する。フローサイトメトリー（FC）による細胞毒性アッセイのウェルでのエフェクター細胞活性化の定量は、特異的溶解の結果と一致している。標的陽性細胞を含む条件の場合、エフェクター細胞の活性化に対する用量応答も観察される。これらの結果は、PRO957（HER2xCD32nd gen Numab）およびPRO956（HER2xCD3I2C Amgen）のエフェクター細胞活性化のEC50が同様であることを示す。ただし、標的陰性細胞のウェルでは、非特異的活性化のEC50の明らかな違いにより、PRO957（HER2xCD32nd gen Numab）とPRO956（HER2xCD3I2C Amgen）が識別される。高濃度の両分子を投与すると、標的の非存在下でも活性化細胞が増加する。ただし、この効果は分子PRO956（HER2xCD3I2C Amgen）の濃度が約25分の１である場合に観察される（図９Ａと９Ｂ参照）。更に、抗CD3ドメインを抗HER2結合ドメインと組み合わせて試験した時、PRO957（HER2xCD32nd gen Numab）は、PRO956（HER2xCD3I2C Amgen）と比較して、標的細胞枯渇とＴ細胞活性化の両方を誘導する優れた効力と特異性を示す。
4.3 PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）とPRO 389（IL23RxCD31st gen Numab）のカニクイザルに対する交差反応性
抗CD3ε結合ドメインI2Cの重要な特徴（米国特許2010/0150918）は、ヒトと非チンパンジー霊長類に対する異種間反応性であり、誘導治療薬の前臨床開発において利点を提供する。PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）およびPRO389（IL23RxCD31st gen Numab）中に組み込まれた抗CD3εドメインは両方とも、SPR測定で組換えヒトおよびカニクイザルCD3εに結合する（表３およびWO 2014/191113）。しかしながら、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）に組み込まれているクローン09-24-H09のドメインの反応性は、細胞膜結合型CD3εの細胞環境では維持されなかった。対照的に、PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）に存在するクローン28-21-D09に由来するドメインは、細胞アッセイでも保存された種反応性を示す。このような異なる特徴は、カニクイザルPBMCをエフェクター細胞として使用した細胞毒性アッセイにより特徴付けられた。
抗CD3ε結合ドメインI2Cの重要な特徴（米国特許2010/0150918）は、ヒトと非チンパンジー霊長類に対する異種間反応性であり、誘導治療薬の前臨床開発において利点を提供する。PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）およびPRO389（IL23RxCD31st gen Numab）中に組み込まれた抗CD3εドメインは両方とも、SPR測定で組換えヒトおよびカニクイザルCD3εに結合する（表３およびWO 2014/191113）。しかしながら、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）に組み込まれているクローン09-24-H09のドメインの反応性は、細胞膜結合型CD3εの細胞環境では維持されなかった。対照的に、PRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）に存在するクローン28-21-D09に由来するドメインは、細胞アッセイでも保存された種反応性を示す。このような異なる特徴は、カニクイザルPBMCをエフェクター細胞として使用した細胞毒性アッセイにより特徴付けられた。
カニクイザルPBMCを用いた細胞毒性アッセイのデータ（図７参照）は、ヒトエフェクター細胞の使用と比較して、特異的標的細胞枯渇を誘発するPRO624（IL23RxCD32nd gen Numab）の同様の効力を示す（図４参照）。更に、標的陰性細胞の状況でも、細胞の非特異的溶解は観察されない。一方、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）の分析では、カニクイザルエフェクター細胞による標的細胞枯渇は示されなかった。ドメインの更なる特性評価は、PRO389（IL23RxCD31st gen Numab）のカニクイザルCD3ε発現細胞への細胞結合の欠如を明らかにした。
結論として、09-24-H09ドメインがヒトおよび非チンパンジー霊長類に対して関連する種間反応性を示さないという驚くべき発見により、ドメイン28-21-D09のみが、現在の技術水準を上回る特異性の利点と種間反応性の望ましい特徴の両方を提供することが示された。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によりその範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更が上記記載から当業者に明らかになるだろう。そのような変更は特許請求の範囲内に入るものと意図される。
各特許法のもとで可能な範囲に、全ての特許、特許出願、刊行物、試験法、文献および本明細書中に引用された他の資料は、参考により本明細書中に組み込まれる。
Claims (15)
- ヒトCD3に特異的である抗体またはその機能的断片であって、
(a) 可変軽鎖であって、
ここで前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4を含み、ここで各LFWは軽鎖フレームワーク領域を表し、そして各LCDRは軽鎖相補性決定領域を表し、そして前記LCDR1は配列番号１に記載の通りであり、前記LCDR2は配列番号２に記載の通りであり、そして前記LCDR3は配列番号３に記載の通りである、可変軽鎖；および
(b) 可変重鎖であって、
ここで前記可変重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、領域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4を含み、ここで各HFWは重鎖フレームワーク領域を表し、そして各HCDRは重鎖相補性決定領域を表し、そして前記HCDR1は配列番号５に記載の通りであり、前記HCDR2は配列番号６に記載の通りであり、そして前記HCDR3は配列番号７に記載の通りである、可変重鎖
を含む、抗体またはその機能的断片。 - 前記可変軽鎖がVκ1軽鎖であり、および／または前記可変重鎖がVH3である、請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
- 前記可変軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示し、および／または前記可変重鎖が配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその機能的断片。
- 前記可変軽鎖がAHo番号付け法によると軽鎖のアミノ酸位置54位にアルギニンまたはリジン、好ましくはアルギニンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
- 前記可変軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含み、そして前記可変重鎖が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項３〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体またはその機能的断片が、次のパラメータ：
(i) 特に表面プラズモン共鳴により決定した時に、40 nM未満、特に10 nM未満、より特に6 nM未満のヒトCD3への結合のKD値；
(ii) 特に表面プラズモン共鳴により決定した時に、20 nM未満、特に10 nM未満、より特に5 nM未満のカニクイザルCD3への結合のKD値；および
(iii)特に示差走査蛍光分析法（DSF）により測定した時、scFv抗体フォーマットで発現させた場合、少なくとも60℃、特に少なくとも65℃、より特に少なくとも68℃を超える熱変性温度（Tm）の平均中点
の１つまたは複数により特徴付られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。 - 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含む多重特異性ポリペプチド。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的断片または請求項７の多重特異性ポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 医薬として用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項７の多重特異性ポリペプチド、または請求項８の組成物。
- 医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項７の多重特異性ポリペプチド、または請求項８の組成物の使用。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする核酸配列または核酸配列の集合体。
- 請求項１１の核酸配列または核酸配列の集合体を含む、ベクターまたはベクターの集合体。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を生産する方法であって、請求項１１の核酸配列もしくは核酸配列の集合体、または請求項１２のベクターもしくはベクターの集合体を発現させることを含む方法。
- 多重特異性構築物の作製方法であって、
(a) １もしくは複数のステップにおいて、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする１または複数の核酸配列を、少なくとも第二の結合ドメインまたはその断片をコードする核酸配列と、随意に１または複数の追加の結合ドメインまたはその断片をコードする核酸配列とを含む多重特異性構築物へクローニングすること
を含む方法。 - 前記第二の結合ドメインが第二の抗体またはその機能的断片である、請求項１４に記載の方法。
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