CN117940460A - 双特异性抗原结合分子及其应用 - Google Patents

双特异性抗原结合分子及其应用 Download PDF

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王玉霞
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Abstract

提供了双特异性抗原结合分子或其抗原结合片段、包含所述双特异性抗原结合分子或其抗原结合片段的衍生物以及药物组合物。此外，还提供了所述双特异性抗原结合分子或其抗原结合片段在治疗癌症和检测诊断方面的相关应用。

Description

双特异性抗原结合分子及其应用 技术领域
本公开属于免疫学领域，一般涉及双特异性抗原结合分子。此外，本公开还涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸、载体以及宿主细胞。本公开还涉及包含双特异性抗原结合分子的药物组合物及其在治疗和预防癌症方面的相关应用。
背景技术
能够结合两种抗原的双特异性抗原结合分子为本领域已知。这类双特异性结合蛋白可以通过杂交瘤细胞融合，化学缀合或基因工程等来产生。
双特异性抗原结合分子对治疗应用具有巨大的利益，因为它们允许同时结合两种靶抗原，从而减少了对联合治疗的需要。双特异性抗原结合分子的另一应用是作为免疫效应细胞的招募者用于肿瘤的免疫治疗。为了此目的，设计与靶细胞上的表面抗原和免疫T细胞表面的激活成分结合的双特异性抗原结合分子。这种抗体与它的两种靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间暂时相互作用，导致任意细胞毒性T淋巴细胞的激活和随后的靶细胞裂解。
CD3是由四条不同的链组成的T细胞共受体，在哺乳动物中，CD3多亚基形成的复合物与T细胞受体的分子缔合，以便在T淋巴细胞中产生激活信号。在没有CD3的情况下，T细胞受体(TCR)不能适当的组装并且降解。研究发现CD3结合所有成熟的T细胞的膜，并且几乎不与其它细胞类型结合。
T细胞上TCR复合物的CD3已被用作靶标，以促使在T细胞和肿瘤细胞之间形成免疫学突触。CD3和肿瘤抗原的共结合激活了T细胞，从而裂解表达肿瘤抗原的肿瘤细胞。
IL-13主要是由活化T细胞产生的12KD的多效性细胞因子，可在B淋巴细胞，内皮细胞，单核细胞等诸多细胞中通过由IL-4Rα，IL-13Rα1和IL-13Rα2组成的复杂受体系统发挥效应。IL-13Rα1单独和IL-13结合能力很弱，但与IL-4Rα形成异源二聚体后却可形成高亲和力的IL-13受体复合物，并激活Janus蛋白激酶/信号转导子及转录激活子(JAK/STAT)信号通路发挥功能。目前已证实IL-13与多种疾病如哮喘，湿疹，纤维化及肿瘤等密切相关。IL-13Rα2比IL-13Rα1更易与IL-13结合，所以它能与IL-13Rα1竞争IL-13并阻断JAK/STAT信号通路介导的功能。
IL-13Rα2是相对分子量为56000Da的糖基化蛋白，包括380个氨基酸，人和小鼠的蛋白序列的同源性有59％。人的IL-13Rα1与IL-13Rα2的胞外区同源性有33％，IL-13Rα2胞内区有17个氨基酸残基，缺乏和JAK相互作用的区域。IL-13Rα2在正常组织中不表达或少量表达(如人的睾丸)。在多种癌细胞上有较高的表达，如人胶质母细胞瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌等。
人神经胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，占颅内恶性肿瘤的48.3％。年发病率在3-10/10万，平均生存率低于15个月，5年生存率低于3％。目前脑胶质瘤的治疗没有突破性进展，仍用传统的外科手术加经静脉或口服化疗加经颅放疗的综合治疗为主，治疗效果非常有限。因此开发新的靶点和新的治疗手段是广大病人的迫切需求。研究发现IL-13Rα2在正常脑组织不表达，在脑胶质瘤中表达，且病理级别越高其表达越强。IL-13Rα2高表达的病人预后较差，可以作为脑胶质瘤治疗的特异性靶标。人IL-13Rα2作为人神经胶质瘤的治疗靶点早在1988年已引起美国FDA的注意，该组织先后制备了针对人IL-13Rα2治疗靶点的药物IL-13-PE38和针对人IL-13Rα2的单链抗体scFv-PE融合分子。尽管IL-13-PE38在神经胶质瘤，头颈部肿瘤，卵巢癌和肾癌等恶性肿瘤的治疗中取得了疗效并被FDA批准进入临床期治疗，但由于在治疗过程中，IL-13-PE38不仅与肿瘤细胞表面特异性表达的IL-13Rα2结合，也可以与表达于正常组织细胞表面的IL-13Rα1结合，损伤正常组织和细胞。由于缺乏严格的靶向性，限制了IL-13-PE38的进一步应用。目前针对IL-13Rα2的细胞疗法和疫苗疗法在开发中。
发明概述
本公开涉及一种双特异性抗原结合分子或其片段，其包含：
a)特异性结合第一抗原的VHH抗体，其选自：
(1)1个特异性结合第一抗原的VHH抗体，和
(2)2个特异性结合第一抗原的VHH抗体VHH(1)和VHH(2)，其中，VHH(1)和VHH(2)相同或不同；
b)特异性结合第二抗原的单链抗体scFv，所述scFv包含VH和VL，其选自：
(1)1个特异性结合第二抗原的单链抗体scFv抗体；和
(2)2个特异性结合第二抗原的单链抗体scFv(1)和scFv(2)，所述scFv(1)和scFv(2)相同或不同；和
c)Fc结构域，其包含第一Fc结构域亚基Fc(1)和第二Fc结构域亚基Fc(2)，所述Fc(1)和Fc(2)形成异源二聚体；
所述双特异性抗原结合分子由两条肽链组成，其中第一条肽链中1或2个VHH抗体和/或scFv抗体融合在Fc(1)的N端或C端，第二条肽链中1或0个VHH抗体和/或scFv抗体融合在Fc(2)的N端或C端；所述双特异性抗原结合分子提供与所述第一抗原的单价或双价/二价结合，同时所述双特异性抗原结合分子提供与所述第二抗原的单价结合；任选的，至少还包括一个肽接头。
以及，所述双特异性抗原结合分子肽链或其片段的连接顺序选自多种方式中的一种：(i)第一条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第一VHH抗体VHH(1)在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述第一Fc结构域亚基Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第二VHH抗体VHH(2)在其C端与所述第二Fc结构域亚基Fc(2)的N端融合；或(ii)第一条肽链的连接顺序为：所述VHH(1)在其C端与所述Fc(1)的N端融合，所述Fc(1)在其C端与所述scFv抗体的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述VHH(2)在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或(iii)第一条肽链的连接顺序为：所述第一抗原VHH抗体在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述一个或多个肽接头在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或(iv)第一条肽链的连接顺序为：所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的VHH抗体在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或(v)第一条肽链的连接顺序为：所述VHH(1)在其C端与所述VHH(2)的N端融合，所述VHH(2)在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述scFv抗体在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或(vi)第一条肽链的连接顺序为：所述VHH(1)在其C端与所述Fc(1)的N端融合，所述Fc(1)在其C端与所述scFv(1)抗体的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述VHH(2)在其C端与所述Fc(2)的N端融合；所述Fc(2)在其C端与所述scFv(2)抗体的N端融合；或(vii)第一条肽链的连接顺序为：所述第一抗原VHH(1)抗体在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述一个或多个肽接头在其C端与所述Fc(2)的N端融合；所述Fc(2)在其C端与所述scFv(2)抗体的N端融合；所述scFv(2)抗体在其C端与所述第一抗原VHH(2)的N端融合。
在一些实施例中，双特异性抗原结合分子提供与所述第一抗原的单价或双价/二价结合。在另一些实施例中，双特异性抗原结合分子提供与所述第二抗原的单价或双价/二价结合。
在一些实施例中，特异性结合第一抗原的VHH抗体为纳米抗体；优选的，为人源化的骆驼科纳米抗体。在另一些实施例中，特异性结合第二抗原的scFv抗体包含VH和VL；优选的，其连接顺序为VH的C端与VL的N端融合。
在一些优选实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段的第一条肽链的连接顺序，从N端到C端为：VHH(1)-VH-VL-Fc(1)、VHH(1)-Fc(1)-VH-VL、VH-VL-Fc(1)或VHH(1)-VHH(2)-Fc(1)；所述第二条肽链的连接顺序，从N端到C端为：VHH(2)-Fc(2)、VH-VL-Fc(2)或Fc(2)。
在另一些优选实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段，使用一个或多个肽接头进行连接，第一条肽链的连接方式，从N端到C端为：VHH(1)-肽接头-VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(1)、VHH(1)-肽接头-Fc(1)-肽接头-VH-肽接头-VL、VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(1)或VHH(1)-肽接头-VHH(2)-Fc(1)；所述第二条肽链的连接方式，从N端到C端为：VHH(2)-肽接头-Fc(2)、VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(2)或肽接头-Fc(2)。
在另一些优选实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段的肽接头选自L1、L2、L3或L4，其中，L1的序列如SEQ ID NO:26所示，L2的序列如SEQ ID NO:27所示，L3的序列如SEQ ID NO:28所示，L4的序列如SEQ ID NO:29所示。优选的，L2肽接头为(G 4S)xA，所述x为3或4。
在一些具体的实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段，使用一个或多个肽接头进行连接，从N端到C端为：VHH(1)-L1-VH-L2-VL-L3-Fc(1)、VHH(1)-L3-Fc(1)-L1-VH-L2-VL、VH-L1-VL-L3-Fc(1)或VHH(1)-L1-VHH(2)-L3-Fc(1)；所述第二条肽链的连接方式，从N端到C端为：L4-Fc(2)、VHH(2)-L3-Fc(2)或VH-L2-VL-L3-Fc(2)。
在一些实施例中，特异性结合第一抗原的VHH抗体靶向肿瘤细胞表面抗原；优选的，所述VHH抗体靶向IL-13Rα2。优选的，靶向IL-13Rα2的VHH抗体包含3个选自SEQ ID NO:13～24序列所示的HCDR。更优选的，包含选自SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22所示的HCDR1；以及，选自SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23所示的HCDR2；以及，选自SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24所示的HCDR3。
在一些具体的实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段能够特异性结合IL-13Rα2，其重链可变区包含选自下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；或SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；或SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；或SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
在另一些具体的实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段能够特异性结合IL-13Rα2，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1、HCDR2和HCDR3来自于SEQ ID NO:9～12所示的重链可变区。
在另一些具体的实施例中，所述双特异性抗原结合分子包括与SEQ ID NO:9～12序列的互补决定区(CDR)具有至少95％同一性的可变区结构域，所述双特异性抗原结合分子特异性结合IL-13Rα2。
在一些具体的实施例中，双特异性抗原结合分子或其片段能够特异性结合IL-13Rα2，包含重链可变区(VHH)，重链可变区具有与SEQ ID NO:9～12所示序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其片段中包含靶向T细胞表面抗原(第二抗原)的scFv抗体；优选的，所述scFv抗体靶向CD3。优选的，靶向CD3的scFv抗体的CDR序列如SEQ ID NO：1～6所示；优选的，HCDR1的序列如SEQ ID NO：1所示；HCDR2的序列如SEQ ID NO：2所示；HCDR3的序列如SEQ ID NO：3所 示；LCDR1的序列如SEQ ID NO：4所示；LCDR2的序列如SEQ ID NO：5所示；LCDR3的序列如SEQ ID NO：6所示。更优选的，双特异性抗原结合分子或其片段能够特异性结合CD3，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3来自于SEQ ID NO:7所示的重链可变区；和其还包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3来自于SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，靶向CD3的scFv抗体，包含重链可变区(VH)，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:7所示序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:8所示序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在所述scFv抗体中，VH和VL可以采用肽接头，也可以不采用，连接顺序既可以是VH-VL，也可以是VL-VH。优选的，所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO:25所示。在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其片段包含与SEQ ID NO:25中的互补决定区(CDR)具有至少95％同一性的轻链和重链可变区结构域，所述双特异性抗原结合分子或其片段特异性结合CD3。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其片段包含第一多肽链和第二多肽链，其含有如本公开所示的特异性结合IL-13Rα2的氨基酸序列，以及，本公开所示的特异性结合CD3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其片段还包括重链恒定区CH2和CH3，以及不含轻链恒定区和/或重链恒定区CH1；优选的，所述重链恒定区包括Fc结构域或变体Fc；更优选的，Fc来源于鼠或人。
在另一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其片段的Fc结构域是IgG Fc结构域；优选的，所述Fc结构域是IgG1结构域或IgG4结构域。
在一些具体实施方案中，Fc结构域包含促进所述Fc(1)结构域与所述Fc(2)结构域结合的修饰。优选的，构成Fc结构域的两个多肽序列相互具有不同的序列，且构成Fc结构域的两个多肽的Knob链的氨基酸残基中按照EU编号特定的366位氨基酸突变为色氨酸，另一个Hole链的氨基酸残基中按照EU编号特定的366位氨基酸突变为丝氨酸、368位氨基酸突变为丙氨酸、407位氨基酸突变为缬氨酸；更优选的，Knob链包括S354C和T366W氨基酸取代，Hole链包括Y349C、T366S、L368A和Y407V氨基酸取代；进一步优选的，Hole链还包括H435R的取代；更进一步优选的，Fc段还包括L234A和L235A的取代。Fc(1)链可以是Knob链(Knob-Fc)或Hole链(Hole-Fc)；Fc(2)链可以是Knob链或Hole链。在一些具体实施方案中，Fc结构域的序列如SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:31所示，例如Fc(1)如SEQ ID NO:30所示，和所述Fc(2)如SEQ ID NO:31所示。
在一些具体实施方案中，双特异性蛋白分子，还包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32～35、40、42或43任一项所示，和/或所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36～39、41或44任一项所示；优选的，所述双特异性蛋白分子的第一多肽链和第二多肽链选自如组合中的一种：a.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或b.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:33所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:37所示；或c.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:34所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:38所示；或d.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:35所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:39所示；或e.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:33所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:39所示；或f.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:40所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或g.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:41所示；或h.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:42所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或i.第一多肽链的序列如SEQ ID NO:43所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:44所示。
在一些具体实施方案中，所述双特异性蛋白分子或双特异性抗原结合分子包括与SEQ ID NO:32-35、40、42或43中的互补决定区(CDR)具有至少95％同一性的重链可变(VH)结构域和与SEQ ID NO:36-39、41或44中的互补决定区(CDR)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变(VL)结构域，所述双特异性蛋白分子或双特异性抗原结合分子特异性结合IL-13Rα2和CD3。
本公开还保护一种多核苷酸，其编码本公开涉及的双特异性抗原结合分子或其片段或本公开涉及的双特异性蛋白分子。在一些具体实施方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。
本公开还保护一种重组载体，其包含本公开中的多核苷酸。
本公开还保护一种宿主细胞，其包含本公开的多核苷酸或本公开的重组载体。
本公开还保护生产本公开双特异性抗原结合分子或其片段或双特异性蛋白分子的方法。
本公开还保护一种药物组合物，包含可药用载体，和由本公开双特异性抗原结合分子或其片段、本公开双特异性蛋白分子、本公开多核苷酸、本公开重组载体和/或本公开宿主细胞组成的组中的一种或多种。
本公开还保护双特异性抗原结合分子或其片段、双特异性蛋白分子、多核苷酸、重组载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于在有需要的个体中治疗和/或预防疾病药物中的用途；优选的，所述疾病是癌症；更优选的，所述癌症为IL-13Rα2阳性的肿瘤。其中，癌症可以选自胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌或胃癌等。
本公开还保护双特异性抗原结合分子或其片段、双特异性蛋白分子、多核苷酸、重组载体、宿主细胞或药物组 合物在有需要的个体中治疗和/或预防疾病的用途；优选的，所述疾病是癌症；更优选的，所述癌症为IL-13Rα2阳性的肿瘤。其中，癌症可以选自胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌或胃癌等。
本公开还保护一种治疗和/或预防受试者中与表达IL-13Rα2相关的疾病的方法，包括给予所需患者治疗和/或预防有效量的本公开涉及的双特异性抗原结合分子或其片段、双特异性蛋白分子、多核苷酸、重组载体、宿主细胞或药物组合物；优选的，所述表达IL-13Rα2相关的疾病为癌症；更优选的，所述癌症选自胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌或胃癌等。
附图说明
附图更进一步说明了本说明书所公开的新特性。参照这些附图将能更好地理解本说明书中所公开的特性和优点，但应当理解，这些附图仅用于说明本文所公开原理的具体的实施方案，而非意欲对所附权利要求的范围加以限制。
图1显示了双特异性抗原结合分子示意图，其中图1中的A为Format-1，B为Format-2，C为Format-3，D为Format-4，E为Format-5；其中，特异性结合第一抗原的VHH抗体可以为1个或2个，当为2个时，其可以相同或不同。
图2显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系A375细胞的结合情况。其中图2A为不同format的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的结合实验，图2B为IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子和IL-13Rα2单价双特异性抗原结合分子的结合实验，图2C为相同format不同的抗IL-13Rα2抗体单抗序列的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的结合实验。
图3显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系U87细胞的结合情况。
图4显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系U251细胞的结合情况。
图5显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子与高表达CD3的T细胞系Jurkat细胞的结合情况。其中图5A为不同format的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的结合实验，图5B为IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子和IL-13Rα2单价双特异性抗原结合分子的结合实验，图5C为相同format不同的抗IL-13Rα2抗体单抗序列的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的结合实验。
图6显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子与高表达食蟹猴IL-13Rα2的稳定细胞株细胞(食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1细胞)的结合情况。
图7显示了LDH方法检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与高表达人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞株细胞共孵育时，对肿瘤细胞的杀伤情况。其中图7A为IL-13Rα2单价或双价双特异性抗原结合分子对A375细胞杀伤实验，图7B为不同fomat的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子对A375细胞杀伤实验，图7C为相同format不同的抗IL-13Rα2抗体单抗序列的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子对A375细胞杀伤实验。
图8显示了LDH方法检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与不表达人IL-13Rα2的MCF-7肿瘤细胞株细胞共孵育时，对肿瘤细胞的杀伤情况。
图9显示了LDH方法检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与高表达人IL-13Rα2的U87肿瘤细胞株细胞共孵育时，对肿瘤细胞的杀伤情况。
图10显示了LDH方法检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与高表达人IL-13Rα2的U251肿瘤细胞株细胞共孵育时，对肿瘤细胞的杀伤情况。
图11显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与高表达人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞株细胞共孵育时，细胞因子IFNγ和IL-2的释放情况。其中图11A为细胞因子IFNγ的释放情况，图11B为细胞因子IL-2的释放情况。
图12显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与不表达人IL-13Rα2的MCF-7肿瘤细胞株细胞共孵育时，细胞因子IFNγ和IL-2的释放情况。其中图12A为细胞因子IFNγ的释放情况，图12B为细胞因子IL-2的释放情况。
图13显示了流式细胞术检测的双特异性抗原结合分子在T细胞与高表达人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞株细胞共孵育时，对T细胞的活化情况。
图14A显示了化学发光方法检测的双特异性抗原结合分子在Jurkat-NFAT细胞与高表达人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞株细胞共孵育时，Jurkat细胞的活化情况；图14B显示了化学发光方法检测的双特异性抗原结合分子在Jurkat-NFAT细胞与高表达人IL-13Rα2的U251肿瘤细胞株细胞共孵育时，Jurkat细胞的活化情况；图14C显示了化学发光方法检测的双特异性抗原结合分子在Jurkat-NFAT细胞无其它肿瘤细胞共孵育时，Jurkat细胞的活化情况。
图15显示了LDH方法检测的双特异性抗原结合分子在NK细胞与高表达食蟹猴人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞株细胞共孵育时，对肿瘤细胞的杀伤情况。
图16显示了双特异性抗原结合分子在人PBMC重建的小鼠A375模型中的抗肿瘤疗效检测。其中图16A为给药后肿瘤体积的变化情况，图16B为给药后小鼠体重的变化情况。
图17显示了双特异性抗原结合分子在人PBMC重建的小鼠U251模型中的抗肿瘤疗效检测。其中图17A为给 药后肿瘤荧光信号值(Radiance)的变化情况，图17B为给药后小鼠体重的变化情况。
具体实施方式
术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
在下文详细描述本公开前，应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本公开的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本公开的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
本文所用的术语“抗原结合分子”在其最广泛的含义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
术语“双特异性的”意指抗原结合分子能够特异性结合两个不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合部位，两个抗原结合部位中的每一个对不同的抗原决定簇特异。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其是表达在两种不同细胞上的两个抗原决定簇。
术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、或完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ECD。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象存在并且包括至少3-15个氨基酸。由给定的抗体确定其结合的表位的方法是本领域熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链、环状或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，特别是保守修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括改性的氨基酸聚合物例如已经通过硫酸化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、转移-RNA介导的氨基加成如精氨酸化、泛在化、或任何其他操作如与标记组分缀合等改性的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。“衍生自”指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。该术语还包括由指定的核酸序列表达的多肽。
术语“氨基酸修饰”(或“修饰的氨基酸”)包括在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”或“替代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代S32A指第32位的丝氨酸被丙氨酸替换。
“特异性结合”意指该结合对抗原具有选择性，且可以与不想要或非特异的相互作用区分开。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测定抗体结合特异性抗原决定簇的能力，该其他技术例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J，17，323-329(2000))和传统结合测定(Heeley Endocr,Res,28,217-229(2002))。
“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合部位和它的结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗原结合部分和抗原，或受体和它的配体)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以表示为解离常数(KD)，其是解离和结合速率常数(分别为koff和kon)的比值。因此，等同的亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比值保持相同。亲和力可以通过本领域已知的完善方法来测量，包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
本文所用的术语“价”指抗原结合分子中指定数目的抗原结合区的存在。因此，术语“双价/二价双特异性抗原结合分子”是指双特异性抗原结合分子中针对某个靶点具有两个抗原结合区，例如IL-13Rα2双价/二价双特异性抗原结合分子是指在该双特异性抗原结合分子中包含两个针对IL-13Rα2的抗原结合区。术语“单价双特异性抗原结合分子”是指双特异性抗原结合分子中针对某个靶点只有一个抗原结合区，例如IL-13Rα2单价双特异性抗原结合分子指在该双特异性抗原结合分子中包含一个针对IL-13Rα2的抗原结合区。
“抗原结合部位”指抗原结合分子的部位，即一个或多个氨基酸残基，其提供与抗原的相互作用。例如，抗体的抗原结合部位包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，涵盖包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段的多种抗体结构，只要它们显示希望的抗原结合活性。
本文所用的术语“特异性结合IL-13Rα2的抗原结合分子”“抗IL-13Rα2的抗体”、“靶向IL-13Rα2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合IL-13Rα2蛋白或其片段，并且不显著结合IL-13Rα1，以致所述抗体可以用作靶向IL-13Rα2的诊断剂和/或治疗剂。
本文所用“抗CD3的抗体”或“靶向CD3的抗体”，是指能特异性结合单独的CD3链(例如CD3(γ)链、CD3(δ)链或CD3(ε)链)或由两条或更多条单独的CD3链形成的复合物(例如一条以上CD3(ε)链的复合物、CD3(γ)链和CD3(ε)链的复合物、CD3(δ)链CD3(ε)链的复合物)的抗体。在某些实施方案中，抗CD3抗体能特异性结合CD3(γ)、CD3(δ)或CD3(ε)或其任何组合，更优选地，能特异性结合CD3(ε)。“抗人CD3的抗体”和“抗hCD3的抗体”是指能特异性结合人来源的CD3的抗体。
需说明的是，本公开的抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本公开的抗体序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本公开的范围内。
术语“序列同一性”或“序列相似性”或“序列同源性”，是指在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
常规的免疫球蛋白是四聚体，由两条重链和两条轻链组成，组合分子量约150kDa。在骆驼科(Camelidae)成员中，相当比例的血清抗体是同源二聚体IgG，分子量约80kD(Hamers-Casterman等，1993，Nature，363，446-448)。这些重链免疫球蛋白(Ig)包含三个结构域，其可变区被称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)。重组VHH(约12至14kD)构成完整的抗原结合结构域并显示出广阔的抗原结合谱。扩大它们的高变区，并表现出独特的特性，如三至四个(与常规抗体VL相互作用的)疏水框架残基被更多亲水性氨基酸取代。为了稳定扩大的CDR，除了常规的二硫键以外，在单峰骆驼CDR1和CDR3之间，在美洲驼的CDR2和CDR3之间，VHH可具有额外的二硫键(Harmsen和De Haard,2007，Appl Microbiol Biotechnol.，77，13-22；Muyldermans，2001，J Biotechnol.，74，277-302)。扩大的CDR3环可以采取凸面构象，而常规的互补位被限制在凹的或者平面结构(Muyldermans，2001，J Biotechnol.，74，277-302)。这些特征允许VHH识别对于常规抗体而言免疫原性较差的独特表位(Lafaye，2009，Mol Immuno.，46，695-704；Wernery,2001，J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.，48，561-568)。尽管VHH被定义为单价抗体，默认排除任何亲合力效果，被测量表示为体外IC 50的生物活性可类似于常规的二价抗体分子(Thys等，2010，Antiviral Res.，87，257-264)。在本公开中，“VHH抗体”、“重链可变区(VHH)”以及“纳米抗体VHH”可以互换使用。
在某些实施方式中，本公开可涉及嵌合的骆驼科动物/人抗体，特别是其中VH和/或VL结构域完全是骆驼科动物序列(例如大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，而抗体的其余部分完全是人序列的嵌合抗体。在本公开的一些优选实施方式中，还包括“人源化”或“种系化”的骆驼科抗体以及骆驼科/人嵌合抗体，其中VH和/或VL结构域相对于通过主动免疫获得的骆驼科VH和/或VL结构域来说在框架区包含一个或多个氨基酸替换。用人种系VH或VL结构域中的对应残基来取代起始骆驼科VH或VL结构域中的不匹配氨基酸残基，这样的“人源化”过程提高了与人种系VH或VL结构域的序列一致性百分比。
本公开包括天然、重组的VHH或VH。
根据本公开的VHH能够是单体的形式或者同源多聚体的形式，如同源二聚体或同源三聚体。
本公开的抗体包括骆驼源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“嵌合抗体”是一种构建体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这个或这些链的剩余部分与来自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列相同或同源。狭义的，嵌合抗体包含与人类轻链和重链恒定区可操作地连接的全部或大多数的所选鼠类重链和轻链可变区。恒定区序列或其变体或衍生物可以使用标准分子生物学技术可操作地与所披露的重链和轻链可变区缔合，以提供本身可以使用或可以掺入本公开的抗IL-13Rα2的全长抗体。
术语“人源化抗体”是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的杂合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被来自具有所需的特异性、亲 和力和性能的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代，例如小鼠、大鼠、兔子或灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区残基被相应的非人残基代替。在某些情况下，“回复突变”可以引入到人源化抗体中，其中受体人类抗体的可变区的一个或多个FR中的残基被来自非人类物种供体抗体的相应残基替换。这样的回复突变可以有助于保持一种或多种嫁接CDR的适当三维构型并因此改进亲和性和抗体稳定性。可以使用来自各种供体物种的抗体，这些供体物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的新残基，以为进一步改善抗体性能。
术语“单域抗体”又称为纳米抗体，可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中，FR1-FR4分别是指构架区(Frame)1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3。“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen，2000EMBO J.，19，921-930；Muyldermans，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot，2011，Antiviral Res.，92，389-407)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-肽接头-VH或可以包括VH-肽接头-VL。
本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，对应的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以进一步分为不同的亚类，例如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。
在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，该恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分离，该铰链区是可变长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
术语“Fc”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的形成二聚体的两条多肽链。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端，例如，IgG Fc域包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
“促进Fc结构域的第一和第二亚基的结合的修饰”是Fc结构域亚基的肽主链或翻译后修饰的操作，其减少或防止包含该Fc结构域亚基的多肽与相同的多肽结合形成同二聚体。本文所用的促进结合的修饰尤其包括对希望结合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)的每一个进行的分开的修饰，其中该修饰彼此互补，以便促进两个Fc结构域亚基的结合。例如，促进结合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一个或两个的结构或电荷，以便分别使得它们的结合在空间上或静电上有利。因此，在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生(异)二聚化，其可以在与各亚基(例如Fab片段)融合的其他成分不同的意义上不同。在一些实施方案中，促进结合的修饰包含Fc结构域中的氨基酸突变，具体而言，氨基酸取代。在具体实施方案中，促进结合的修饰包括Fc结构域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体而言，氨基酸取代。
有数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化，它们详细记载于例如WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012/058768，WO2013/157954，WO2013/096291。典型地，在所有此类办法中，Fc域的第一多肽链的CH3域和Fc域的第二多肽链的CH3域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。
在一个特定的实施方案中，所述促进Fc域的第一多肽链和第二多肽链联合的修饰是所谓的“节-入-穴”(Knob-into-Hole)修饰，其包含在Fc域的两个多肽链之一中的“节”修饰和在Fc域的两个多肽链之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5731168；US 7695936；Ridgway等，Prot Eng，9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth，248，7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽链的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽链的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽链界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽链的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一个具体的实施方案中，在本公开的双特异性抗原结合分子的Fc域的第一多肽链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一多肽链的CH3域内生成隆起，其可安置于第二多肽链的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二多肽链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二多肽链的CH3域内生成空腔，其中可安置第一多肽链的CH3域内的隆起。
优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，和色氨酸(W)。 优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，和缬氨酸(V)。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
本公开“Knob-Fc”是指在抗体Fc区包含T366W的点突变，以形成类似Knob的空间结构。相对于地，“Hole-Fc”指在抗体Fc区包含T366S，L368A，Y407V地点突变，以形成类似hole地空间结构。Knob-Fc和Hole-Fc由于空间位阻地原因，更易形成异二聚体。为减少hole-hole同二聚体地产生，hole的H435R突变，可减少纯化时protein A的结合。为进一步地促进异二聚体地形成，还可在Knob-Fc和Hole-Fc分别引入S354C和Y349C地点突变，通过二硫键进一步促进异二聚体地形成。同时，为消除或减弱抗体Fc引起地ADCC效应，还可向Fc引入地234A和235A地取代突变。例如，本公开优选地Knob-Fc和Hole-Fc分别如SEQ ID NO:30和31所示。在双特异性抗原结合分子中，Knob-Fc和Hole-Fc既可以作为第一多肽链的Fc区域，也可以作为第二多肽链的Fc区域，在同一双特异性抗原结合分子中，第一多肽链和第二多肽链的Fc区不同时为Knob-Fc和Hole-Fc。
需说明的是，本公开的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本公开的单抗序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本公开的范围内。
本文所使用的“同源”和“异源”是一组相对的概念，既可以指构建体中不同要素的来源相同或不同，也可以指构建体构建完成以后，原本来源相同即“同源”的多个要素之间，有的要素进行了改造，与未进行改造的其他原要素相比发生了改变，从而变成“异源”。
“融合”意指成分(例如scFv抗体和Fc结构域亚基)直接或经一个或多个肽接头通过肽键连接。
术语“接头”是指用于连接两个不同功能单元(例如抗原结合片段)的任何工具。接头的类型包括但不限于化学接头和多肽接头。多肽接头(“肽接头”)的序列不受限制。多肽接头优选是非免疫原性和柔性的，例如包含丝氨酸和甘氨酸序列的那些。取决于具体的构建体，接头可以长或短。
根据本公开，连接不同功能单元的接头优选包含柔性肽接头，例如甘氨酸-丝氨酸肽接头。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或(G4S)xA，其中x是1-6中的任意整数选择，优选包含氨基酸序列(G4S) 3或(G4S) 3A。连接VH和VL结构域以形成VH-VL或VL-VH的scFv结构域的肽接头优选包含柔性肽接头，例如甘氨酸-丝氨酸肽接头。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或(G4S)xA，其中x是1-6中的任意整数选择，优选包含氨基酸序列G 4S(SEQ ID NO:45)、(G 4S) 3(SEQ ID NO:46)、(G 4S) 4(SEQ ID NO:49)、(G 4S) 3A(SEQ ID NO:47)或(G 4S) 4A(SEQ ID NO:48)。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)指抗体结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的Fc受体(FcR)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
本文所用的术语“改造”包括天然存在或重组的多肽或其片段的主链或翻译后修饰的任意操作。改造包括氨基酸序列、糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用载体”或“药学上可接受的载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。
术语“有效量”指包含本公开的活性成分的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞及从其衍生的后代，而不考虑代数。后代在核酸含量上可以并非与亲本细胞完全相同，但可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本公开的双特异性抗原结合分子的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养细胞，例如哺乳动物培养细胞，如包括Jurkat细胞，PBMC细胞，A375细胞，U251细胞及U87细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，以及包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“稳定转染”或“稳转”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”(stable transfectant)是指将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
术语“分离的多核苷酸”指已从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本公开的目的，将包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常含有该多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置上。分离的 RNA分子包括本公开的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。本公开的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以包括或不包括调节元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或其抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站(http://imgt.cines.fr)得到，或者从免疫球蛋白杂志(The Immunoglobulin FactsBook，(2001)ISBN：012441351)上获得。
本公开工程化的抗体或其抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。
本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
抗体的制备和筛选
制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler G.等，(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of PredefinedSpecificity”Nature，256:495-497的方法或其修改形式。
抗原结合结构域
例如，CD3抗原结合结构域scFv的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)来源于WO2021022304A2中所公开的序列。示例性的抗CD3的CDR、VH、VL或scFv序列如表1所示：
表1双特异性抗原结合分子中CD3抗原结合结构域的序列表
示例性的IL-13Rα2抗原结合结构域序列如表2所示：
表2双特异性抗原结合分子中IL-13Rα2抗原结合结构域的序列表
本文公开的一些实施方式中双特异性抗原结合分子的分子结构如图1的A-E所示，其由两条肽链组成，双特异性抗原结合分子包含：特异性结合第一抗原的纳米抗体VHH、特异性结合第二抗原的scFv抗体、能够形成稳定异源二聚体的第一和第二亚基的Fc结构域和一个或多个肽接头(图1的C和D)；或包含：特异性结合第一抗原的第一和第二纳米抗体VHH(其中第一和第二纳米抗体VHH可以相同也可以不同)、特异性结合第二抗原的scFv抗体、能够形成稳定异源二聚体的第一和第二亚基的Fc结构域和一个或多个肽接头(图1的A、B和E)。双特异性抗原结合分子提供与所述第二抗原的单价结合，以及，与第一抗原的单价或双价结合。特异性结合第一抗原的纳米抗体VHH靶向肿瘤细胞表面抗原，特异性结合第二抗原的scFv抗体靶向T细胞表面抗原。示例性的，当纳米抗体VHH靶向IL-13Rα2，scFv抗体靶向CD3时，具体的双特异性抗原结合分子的分子结构(Format)见下表3，表3中的Format1-5分别对应于附图1中的A-E。
表3双特异性抗原结合分子的分子结构
分子结构名称 第一多肽链排列顺序 第二多肽链排列顺序
Format-1 VHH IL-13Rα2-L1-VH CD3-L2-VL CD3-L3-Knob-Fc VHH IL-13Rα2-L3-Hole-Fc
Format-2 VHH IL-13Rα2-L3-Knob-Fc-L1-VH CD3-L2-VL CD3 VHH IL-13Rα2-L3-Hole-Fc
Format-3 VHH IL-13Rα2-L1-VH CD3-L2-VL CD3-L3-Knob-Fc L4-Hole-Fc
Format-4 VH CD3-L1-VL CD3-L3-Knob-Fc VHH IL-13Rα2-L3-Hole-Fc
Format-5 VHH IL-13Rα2-L1-VHH IL-13Rα2-L3-Knob-Fc VH CD3-L2-VL CD3-L3-Hole-Fc
注：L1、L2、L3和L4表示肽接头，用于连接各抗原结合结构域以及Fc区。
用于连接抗原结合结构域以及Fc区的肽接头可选自其他任何可用于连接抗体功能结构域的肽接头，而不仅限于下述序列所限制的肽接头。示例性的，肽接头如表4所示，包含氨基酸序列(G 4S)x(SEQ ID NO:26)、(G 4S)xA(SEQ ID NO:27)、EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:28)或DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:29)，其中x是1-6中的任意整数，优选的，x为3，肽接头氨基酸序列包含(G 4S) 3或(G 4S) 3A。
表4肽接头(linker)序列的选择
肽接头 SEQ ID NO: 结构或序列
L1 26 (G 4S)x，x是1-6中的任意整数
L2 27 (G 4S)xA，x是1-6中的任意整数
L3 28 EPKSSDKTHTCPPCP
L4 29 DKTHTCPPCP
重复单元G 4S序列编号为SEQ ID NO:45。
双特异性抗原结合分子还可以包括Fc区(即Fc结构域)，如表3所示，其可以为Knob-Fc和Hole-Fc。Fc区能维持抗体正常半衰期和良好稳定性。一个优选的实施例中，双特异性抗原结合分子可以使用包含促进所述第一和第二Fc结构域亚基的结合修饰的Fc结构域，经过两条链的设计，达到了大大降低错配几率的目的，提高了样品的均一性和目的抗体的得率。示例性的，双特异性抗原结合分子为双特异性异源二聚体，由Knob-Fc链和Hole-Fc链组成，Knob-Fc链的结构，包括S354C和T366W两个位点的氨基酸取代，Hole-Fc链的结构，包括Y349C、T366S、L368A和Y407V四个位点的氨基酸取代。以及，为便于双特异性抗原结合分子的纯化，Hole-Fc链还可进行H435R的取代。此外，为降低抗体的ADCC活性，Fc段还可进行L234A和L235A的氨基酸取代。例如，如表5所示，改造后的Knob-Fc链(Fc(1))序列如SEQ ID NO:30所示，Hole-Fc链(Fc(2))序列如SEQ ID NO:31所示。
表5不同Fc的序列表
实施例1双特异性抗原结合分子的制备、表达和纯化
双特异性抗原结合分子002-1、039、040、042、044、005-1、025、027和003的分子结构Format-1、Format-2、Format-3、Format-4或Format-5如图1的A-E以及表3所示，双特异性抗原结合分子002-1、039、040、042、044、005-1、025、027和003的具体序列如表6所示。
将前述双特异性抗原结合分子第一多肽链和第二多肽链的氨基酸的编码DNA序列，分别克隆到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述多肽或抗原结合片段。经测序，挑选完全正确的克隆。将编码前述双特异性抗原结合分子的第一多肽链和第二多肽链的目的基因片段分别克隆到pTT5表达载体中，制备转染级别的表达质粒，第一多肽链(链1)：第二多肽链(链2)为1：1，转染ExpiCHO细胞(Thermo Fisher Scientific)，将细胞接种在摇瓶(Corning公司)中，并在37℃，8％CO 2的环境中置于摇床上培养。细胞培养8-10天后收集表达上清，高速离心去除细胞碎片，用Protein A柱进行亲和纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，换液到PBS分装备用。对最终纯化的人源化抗体进行SDS-PAGE及HPLC纯度分析和A280浓度测定。
表6双特异性抗原结合分子的序列表
实施例2双特异性抗原结合分子与细胞的结合实验
高表达人IL-13Rα2的A375(ATCC，货号：CRL-1619)，U87(ATCC，货号：HTB-14)及U251(中科院，货号：TcHu 58)肿瘤细胞系，以及稳定转染食蟹猴IL-13Rα2的食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1细胞株(即，Cyno IL-13Rα2-CHO-K1)，用0.25％胰酶(含EDTA)消化后，加入完全培养基终止消化反应。1500rpm离心5分钟弃上清，使用含有1％BSA的PBS重悬后计数。将细胞密度调整到1×10 6/ml，以100μL/孔，接种到corning-3799号96孔培养板中培养，在37℃，5％CO 2的环境中培养过夜，之后将96孔培养板以1500rpm离心5分钟弃上清，4℃放置备用。高表达人CD3的Jurkat(ATCC，货号：TIB-152)用PBS重悬，1500rpm离心5分钟弃上清，使用含有1％BSA的PBS重悬后计数。将细胞密度调整到1×10 6/ml，以100μL/孔，接种到corning-3799号96孔培养板中，4℃放置备用。
取实施例1中获得的双特异性抗原结合分子，用含有1％BSA的PBS分别配制双特异性抗原结合分子溶液，倍比稀释，获得多个浓度点样品。
用配制好的抗体重悬细胞培养板，100μL/孔。将重悬好的细胞培养板在4℃冰箱孵育1小时。1500rpm离心5分钟，弃上清，160μL含1％BSA的PBS洗涤一遍，弃上清备用。用含1％BSA的PBS配制二抗(goat anti human IgG Fc PE)，1：200稀释。用配制好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃冰箱孵育0.5小时。1500rpm离心5分钟，弃上清，160μL含1％BSA的PBS洗涤一遍，弃上清，100μL含1％BSA的PBS重悬细胞，300目纱布过滤细胞，然后在流式细胞仪上分析抗体与细胞结合的平均荧光强度。从流式细胞仪导出FCS文件，用Flowjo软件分析PE通道 平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC 50)，结果如表7及附图2、3、4、5和6所示。其中图2A、图2B和图2C为不同双特异性抗原结合分子与A375细胞的结合实验，图5A、图5B和图5C图为不同双特异性抗原结合分子与Jurkat细胞的结合实验。
结果显示，IL-13Rα2双价的双特异性抗原结合分子均能与高表达人或食蟹猴IL-13Rα2的细胞系结合，且有浓度依赖效应，IL-13Rα2单价的双特异性抗原结合分子与高表达人IL-13Rα2的细胞系结合，也有浓度依赖效应，但是其结合弱于IL-13Rα2双价的双特异性抗原结合分子。预示着IL-13Rα2双价的双特异性抗原结合分子，相对于IL-13Rα2单价的双特异性抗原结合分子，在高表达IL-13Rα2细胞上的结合优势更明显，会有更好的安全窗口。
所有双特异性抗原结合分子均可与Jurkat细胞系结合，呈浓度依赖效果。不同设计方法的双特异性抗原结合分子与Jurkat的结合EC 50值接近。
表7双特异性抗原结合分子与表达IL-13Rα2或CD3细胞的结合
注：“/”表示未做实验。
实施例3体外T细胞杀伤实验
本实施例研究了双特异性抗原结合分子的体外T细胞杀伤能力。双特异性抗原结合分子介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的水平来实现的。乳酸脱氢酶存在于细胞内，当细胞受损后，会快速的释放到细胞培养液中。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度，适用于许多种细胞毒性分析。杀伤实验也可以通过定量检测细胞的增殖情况来实现。利用cell titer-glo检测细胞中ATP的含量，ATP是活细胞新陈代谢的一个指标，直接与培养物中的细胞数量成正比。
共用了四种不同的靶细胞，包括黑色素瘤细胞系A375(ATCC，货号：CRL-1619)，胶质瘤细胞系U251(中科院，货号：TcHu 58)及U87(ATCC，货号：HTB-14)肿瘤细胞系和一种不表达IL-13Rα2但表达IL-13Rα1的MCF-7细胞系(ATCC，HTB-22)，效应细胞是来自健康志愿者的PBMC(外周血单个核细胞)或者PBMC分离的T细胞。将靶细胞接种在96孔板中，过夜培养，次日，每孔加入等量的新鲜抽提的PBMC或T细胞和梯度稀释的待测双特异性抗原结合分子。培养24或48小时，用LDH或CTG检测，酶标仪读取信号值，最终换算成细胞杀伤百分比，用Graphpad Prism5对数据进行处理分析。
细胞杀伤百分比％(cytotoxicity％)＝100-(信号值样本-信号值空白)/(信号值对照-信号值空白)
实验1：IL-13Rα2单价和IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的比较
对于含有抗CD3抗体重链可变区的scFv构建成的双特异性抗原结合分子，以Format-1(002-1)和Format-3(025)，Format-4(027)结构比较为例，IL-13Rα2单价双特异性抗原结合分子和IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子均有明显的杀伤活性，同时IL-13Rα2单价双特异性抗原结合分子的杀伤活性略低于IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子。实验结果如图7A和表8所示。
表8 IL-13Rα2单价或IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子对A375细胞杀伤的比较
实验2：IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子不同结构排序分子结构对肿瘤杀伤活性的影响
对具有相同抗原结合结构域，但format不同的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子，如Format-1(002-1)，Format-2(005-1)，Format-5(003)的肿瘤细胞杀伤活性进行平行试验，结果显示，不同结构顺序的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子对A375细胞均有显著的杀伤作用。其中，双特异性抗原结合分子003和005-1的杀伤活性略低于双特异性抗原结合分子002-1。实验结果如图7B和表9所示。
表9 IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的不同结构对A375细胞杀伤的比较
实验3：IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子中抗IL-13Rα2抗体单抗序列不同对肿瘤杀伤活性的影响
对于Format-1的IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子，检测了不同的抗IL-13Rα2抗体序列的双特异性抗原结合分子002-1、039、040和044对肿瘤杀伤活性的影响。平行试验的结果显示，双特异性抗原结合分子002-1、039、040和044均有明显的杀伤活性，044的活性略强于002-1，039和040。实验结果如图7C和表10所示。
表10 IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子的不同抗IL-13Rα2单抗序列对A375细胞杀伤的比较
实验4：双特异性抗原结合分子对不同IL-13Rα2表达水平的肿瘤细胞均有杀伤疗效
测试了双特异性抗原结合分子002-1在高表达IL-13Rα2的U87和U251肿瘤细胞系上的体外杀伤效果，实验结果如图8、9和10，以及表11所示。在表达IL-13Rα2的细胞系上均有明显的杀伤(图9和图10)。在IL-13Rα2不表达细胞系MCF-7上没有明显的杀伤效果(图8)。
表11双特异性抗原结合分子对多种细胞杀伤的比较
注：“/”表示未做实验。
实施例4体外T细胞活化实验
本实施例研究了双特异性抗原结合分子的体外T细胞活化作用。
实验1：双特异性抗原结合分子对T细胞活化的作用
双特异性抗原结合分子在T细胞和肿瘤细胞共孵育的系统中，除了对肿瘤细胞的杀伤作用，同时也活化了T细胞。对T细胞活化作用的检测，一方面用ELISA的方法检测细胞培养上清中细胞因子IFNγ和IL-2的水平，另外，通过检测T细胞表面活化表面标志CD25和CD69的水平来实现。
共用了2种不同的靶细胞，包括黑色素瘤细胞系A375和一种不表达IL-13Rα2，表达IL-13Rα1的MCF-7细胞系，效应细胞是来自健康志愿者的PBMC分离的T细胞。将靶细胞接种在96孔板中，过夜培养，次日，每孔加入等量的新鲜抽提的PBMC或T细胞和梯度稀释的待测双特异性抗原结合分子。培养24小时，收集细胞上清，加入到包被有IFNγ抗体或IL-2抗体的ELISA板子中，按照ELISA的实验步骤进行操作，最后酶标仪读取信号值，根据标准曲线，最终换算成细胞因子的绝对值，用Graphpad Prism5对数据进行处理分析。
测试了IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子002-1、005-1和003在A375或MCF-7肿瘤细胞系与T细胞共孵育的体系细胞因子释放结果。在A375与T细胞共孵育的体系，002-1、005-1和003均能显著的剂量依赖性的增加细胞因子IFNγ和IL-2的水平，而且细胞因子的释放水平与双特异性抗原结合分子的杀伤活性成正相关，实验结果如图11以及表12所示。在MCF-7与T细胞共孵育的体系，002-1、005-1和003对细胞因子的水平没有增加作用，实验结果如图12所示。结果表明对T细胞的活化是IL-13Rα2高表达细胞依赖性的活化。
表12双特异性抗体对T细胞活化的作用(IFNγ/IL-2)
CD25和CD69的检测使用了A375细胞，其它体系同细胞因子释放实验。培养24小时后，收集PBMC或者T 细胞，加入CD25和CD69荧光标记抗体，孵育后，清洗掉游离的抗体，用流式细胞仪分析T细胞表面CD25和CD69的表达水平。根据T细胞表面CD25和CD69双阳性的细胞比例，用Graphpad Prism5对数据进行处理分析。
测试了IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子002-1在A375与T细胞共孵育的体系上的CD25和CD69双阳性细胞的比例，其中NC-hG1AA为(上海百英生物，货号：B109802)阴性对照。实验结果如图13以及表13所示，002-1可以剂量依赖性的增加T细胞表面CD25和CD69的水平。
表13双特异性抗原结合分子对T细胞活化的作用(CD25/CD69)
抗体名称 EC 50(nM) 最大值％
002-1 0.004 87.7
NC-hG1AA NA 2.47
实验2：双特异性抗原结合分子对T细胞的活化功能的检测
利用生物学方法，在Jurkat细胞上构建的NFAT驱动的荧光素酶报告基因系统，获得Jurkat-NFAT重组细胞系。实验2利用Jurkat-NFAT重组细胞系，在有或没有A375/U251肿瘤细胞系存在的情况下，检测Jurkat被激活后NFAT驱动的荧光素酶报告基因的表达。
接种A375或U251细胞于96孔细胞培养板上(4×10 5/mL，100μL/孔)，放置于37℃，5％CO 2的环境中培养过夜。次日，移除细胞培养上清后，向每孔加入50μL的Jurkat细胞悬液(1×10 6/mL)，和50μL梯度稀释的待测双特异性抗原结合分子，放置于37℃，培养6小时。非肿瘤细胞特异的Jurkat重组细胞活化，是直接向空白96孔培养板中加入Jurkat重组细胞和待测抗体。共培养结束后，每孔加入50μL的Bright-Glo Reagent(Promega，cat#:E2620)，置于室温放置5分钟，使用酶标仪读取化学发光信号值，根据荧光信号值计算抗体的EC 50。
将IL-13Rα2双价双特异性抗原结合分子002-1、039、040、042和044分别在A375/U251存在或不存在的情况下检测Jurkat重组细胞的激活情况，以验证双特异性抗原结合分子对T细胞的特异性激活效果，其中，NC-hG1AA为阴性对照。实验结果如图14A、14B和14C，以及表14所示，所有双特异性抗原结合分子在A375(图14A)或U251(图14B)肿瘤细胞系存在的情况下，都能有效地激活Jurkat重组细胞系，显著地诱导荧光素酶的表达，阴性对照抗体不能诱导荧光素酶地表达。Jurkat重组细胞的激活，需要通过双特异性抗原结合分子共募集表达CD3的Jurkat重组细胞和表达IL-13Rα2的肿瘤细胞才能实现，在只有Jurkat重组细胞，且无肿瘤细胞的情况下，荧光素酶的表达比较低，只有在高浓度点能检测到一些弱信号(图14C)。
表14双特异性抗原结合分子对T细胞活化的作用-Jurkat-NFAT
注：“/”表示未做实验。
实施例5 ADCC实验
检测Fc突变的双特异性抗原结合分子002-1是否具有ADCC作用，可通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的水平来实现。乳酸脱氢酶存在于细胞内，当细胞受损后，会快速地释放到细胞培养液中。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度，适用于许多种细胞毒性分析。
接种A375细胞于96孔细胞培养板上(1×10 5/mL，100μL/孔)，放置于37℃，5％CO 2的环境中培养过夜。次日，从新鲜的PBMC中分离NK细胞，移除96孔板中的细胞培养上清后，向每孔加入50μL的NK细胞悬液(1×10 6/m L)，和50μL梯度稀释的待测双特异性抗原结合分子，放置于37℃，培养过夜。NC-IgG1AA为阴性对照。用LDH或CTG检测，酶标仪读取信号值，最终换算成细胞杀伤百分比，用Graphpad Prism5对对数据进行处理分析。
结果如图15和表15所示，Fc为野生型的IL-13Rα2单抗hI-8(参见CN202110190766.0)有剂量依赖性的ADCC效应，相应的双特异性抗原结合分子002-1及阴性对照抗体均没有明显的ADCC效应。
表15双特异性抗原结合分子的ADCC效应
注：“/”表示未做实验。
实施例6人PBMC重建的小鼠A375模型的药效实验
本实施例利用人PBMC重建的NOG小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)A375模型来评价双特异性抗原结合分子在小鼠体内的抗肿瘤疗效。将A375细胞接种于NOG小鼠右侧腋窝皮下，接种体积为0.1mL/只，同一天经尾静脉注射方式将PBMC接种于NOG小鼠。待肿瘤体积长至50-100mm 3时，挑选肿瘤体积适中的入组，按照肿瘤体积大小随机分为5组：分别为G1：NC-hIgG1AA(1000μg/kg)组、G2：002-1(1000μg/kg)组、G3：002-1(200μg/kg)组、G4：002-1(40μg/kg)组、G5：002-1(8μg/kg)组。给药方式为腹腔注射给药(ip)，每周1次，连续给药3次。每周2次监测肿瘤体积和动物重量并记录数据。
实验结果如图16A所示，双特异性抗原结合分子002-1 1000μg/kg在给药7天时已经有一定的抑制肿瘤效果，给药14天时，所有小鼠中的肿瘤均完全消退，维持到实验结束。002-1 200μg/kg给药14天时，抑瘤率(TGI)达到99.6％，有60％小鼠的肿瘤消退，实验结束时有87％的小鼠的肿瘤消退。002-1 40μg/kg和8μg/kg在给药14天时的抑瘤率也有显著性差异(93％，36％)，实验结束时的抑瘤率为88％和65％，和对照组比均有显著性差异。体重的结果如图16B所示，接种后第21天(D21)时，G2-G5各给药组体重均大于G1，但与G1组相比，无明显统计学差异(P>0.05)。综上所述，从图16A和16B中可知，双特异性抗原结合分子002-1无论是在药品有效性还是安全性方面，都表现出了优异的效果。
实施例7人PBMC重建的小鼠U251模型的药效实验
本实施例利用人PBMC重建的NCG小鼠U251-luc原位模型来评价双特异性抗原结合分子在小鼠体内的抗肿瘤疗效。将U251-luc细胞(科佰，货号CBP30207L)接种于NCG小鼠脑内，接种体积为5μl/只，在接种肿瘤细胞7天后，将人PBMC以接种小鼠尾静脉建立人源免疫细胞重建小鼠模型。将小鼠根据肿瘤体积随机分组，并于分组当天(D0)开始给药。分组为G1：NC1-hG1AA(1000μg/kg)组、G2：002-1组(300μg/kg)、G3：002-1(1000μg/kg)组。给药方式为静脉给药(iv)，每周2次，连续给药4次。每周2次监测肿瘤体积和动物重量并记录数据。实验结果如图17所示，双特异性抗原结合分子002-1 1000μg/kg和300μg/kg在给药后5天时已经有一定的抑制肿瘤效果，给药后10天时，抑瘤率分别为92％和90％，和对照组比有显著性差异。实验结束时，抑瘤率均为99.6％。
实施例8双特异性抗原结合分子的物理稳定性测试
抗体具有三个过渡区，Tm1对应于非Fc部分的解折叠温度(较高的Tm决定了较高的稳定性)，Tm2对应于Fc部分的CH2结构域的解折叠温度，T agg为起始聚集温度。利用NanoDSF(微量差示荧光扫描技术)检测不同抗体在pH7.4PBS缓冲液中的热稳定性。样品浓度在1mg/mL左右，利用Prometheus NT.Plex仪器进行检测。检测前，将各个样品10000g离心10分钟。样品板每个孔加入40μL样品(仪器上样量为10μL，每个样品均有一个复孔)。扫描温度从30℃开始到95℃结束，扫描速率0.5℃/min。实验结果如表16所示，可知039、040、002-1的热稳定性均较好。
表16双特异性抗原 结合分子的NanoDSF检测结果(℃)
抗体名称 起始解折叠温度(Tonset) Tm1 Tm2 T agg
039 53.8 58.4 / 58.0
040 53.8 59.1 69.8 59.0
002-1 59.2 61.0 76.8 61.1
注：“/”表示未测出。
上文所述的本公开的实施方案仅为示例性的，任何本领域技术人员都可以认识到或者可以确定无数的特定化合物、材料和操作的等价物，而不需要进行超出常规的试验。所有这些等价物都是在本公开范围之内的，并且被权利要求所包含。

Claims (15)

  1. 一种双特异性抗原结合分子或其片段，其包含：
    a)特异性结合第一抗原的VHH抗体，其选自：
    (1)1个特异性结合第一抗原的VHH抗体，和
    (2)2个特异性结合第一抗原的VHH抗体VHH(1)和VHH(2)，所述VHH(1)和VHH(2)相同或不同；
    b)特异性结合第二抗原的单链抗体scFv，所述scFv包含VH和VL，其选自：
    (1)1个特异性结合第二抗原的单链抗体scFv抗体；和
    (2)2个特异性结合第二抗原的单链抗体scFv(1)和scFv(2)，所述scFv(1)和scFv(2)相同或不同；和
    c)Fc结构域，其包含第一Fc结构域亚基Fc(1)和第二Fc结构域亚基Fc(2)，所述Fc(1)和Fc(2)形成异源二聚体；
    所述双特异性抗原结合分子由两条肽链组成，其中第一条肽链中1或2个VHH抗体和/或scFv抗体融合在Fc(1)的N端或C端，第二条肽链中1或0个VHH抗体和/或scFv抗体融合在Fc(2)的N端或C端；
    所述双特异性抗原结合分子提供与所述第一抗原的单价或双价/二价结合，同时，所述双特异性抗原结合分子提供与所述第二抗原的单价或双价/二价结合；
    任选的，所述双特异性抗原结合分子中还包括至少一个肽接头。
  2. 如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子或其片段，所述第一条肽链的连接顺序，从N端到C端为：VHH(1)-VH-VL-Fc(1)、VHH(1)-Fc(1)-VH-VL、VH-VL-Fc(1)或VHH(1)-VHH(2)-Fc(1)；所述第二条肽链的连接顺序，从N端到C端为：Fc(2)、VHH(2)-Fc(2)或VH-VL-Fc(2)。
  3. 如权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子或其片段，所述双特异性抗原结合分子肽链的连接顺序选自如下(i)～(v)所示方式中的一种：
    (i)第一条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第一VHH抗体VHH(1)在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述第一Fc结构域亚基Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第二VHH抗体VHH(2)在其C端与所述第二Fc结构域亚基Fc(2)的N端融合；或
    (ii)第一条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第一VHH抗体VHH(1)在其C端与所述Fc(1)的N端融合，所述Fc(1)在其C端与所述scFv抗体的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第二VHH抗体VHH(2)在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或
    (iii)第一条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的VHH抗体在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述一个或多个肽接头在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或
    (iv)第一条肽链的连接顺序为：所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的VHH抗体在其C端与所述Fc(2)的N端融合；或
    (v)第一条肽链的连接顺序为：所述结合第一抗原的第一VHH抗体VHH(1)在其C端与所述结合第一抗原的第二VHH抗体VHH(2)的N端融合，所述VHH(2)在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述scFv抗体在其C端与所述Fc(2)的N端融合；
    (vi)第一条肽链的连接顺序为：所述VHH(1)在其C端与所述Fc(1)的N端融合，所述Fc(1)在其C端与所述scFv(1)抗体的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述VHH(2)在其C端与所述Fc(2)的N端融合；所述Fc(2)在其C端与所述scFv(2)抗体的N端融合；
    (vii)第一条肽链的连接顺序为：所述第一抗原VHH(1)抗体在其C端与所述scFv抗体的N端融合，所述scFv抗体在其C端与所述Fc(1)的N端融合；第二条肽链的连接顺序为：所述一个或多个肽接头在其C端与所述Fc(2)的N端融合；所述Fc(2)在其C端与所述scFv(2)抗体的N端融合；所述scFv(2)抗体在其C端与所述第一抗原VHH(2)的N端融合；
    优选的，所述scFv抗体内部VH和VL的连接顺序为VH的C端与VL的N端融合。
  4. 如前述任一项权利要求所述的双特异性抗原结合分子或其片段，其使用一个或多个肽接头将各部分进行连接，所述第一条肽链的连接方式，从N端到C端为：VHH(1)-肽接头-VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(1)、VHH(1)-肽接头-Fc(1)-肽接头-VH-肽接头-VL、VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(1)或VHH(1)-肽接头-VHH(2)-肽接头-Fc(1)；所述第二条肽链的连接方式，从N端到C端为：肽接头-Fc(2)、VHH(2)-肽接头-Fc(2)或VH-肽接头-VL-肽接头-Fc(2)。
  5. 如前述任一项权利要求的双特异性抗原结合分子或其片段，所述肽接头选自L1、L2、L3或L4，其中，L1的序列如SEQ ID NO:26所示，L2的序列如SEQ ID NO:27所示，L3的序列如SEQ ID NO:28所示，L4的序列如SEQ ID NO:29所示；优选的，所述L1肽接头为G 4S(SEQ ID NO:45)或(G 4S) 3(SEQ ID NO:46)；更优选的，所述L2肽接头为(G 4S) 3A(SEQ ID NO:47)或(G 4S) 4A(SEQ ID NO:48)。
  6. 如前述任一项权利要求的双特异性抗原结合分子或其片段，使用一个或多个肽接头进行连接，所述第一条肽链的连接方式，从N端到C端为：VHH(1)-L1-VH-L2-VL-L3-Fc(1)、VHH(1)-L3-Fc(1)-L1-VH-L2-VL、VH-L1-VL- L3-Fc(1)或VHH(1)-L1-VHH(2)-L3-Fc(1)；所述第二条肽链的连接方式，从N端到C端为：L4-Fc(2)、VHH(2)-L3-Fc(2)或VH-L2-VL-L3-Fc(2)。
  7. 如前述任一项权利要求的双特异性抗原结合分子或其片段，其中特异性结合第一抗原的VHH抗体靶向肿瘤细胞表面抗原；优选的，所述VHH抗体靶向IL-13Rα2；
    优选的，所述双特异性抗原结合分子能够特异性结合IL-13Rα2，包含3个选自SEQ ID NO:13～24序列所示的HCDR；
    更优选的，所述双特异性抗原结合分子，其能够特异性结合IL-13Rα2，其包含选自SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22所示的HCDR1；以及，选自SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23所示的HCDR2；以及，选自SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24所示HCDR3；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其能够特异性结合IL-13Rα2，包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；或SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；或SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；或SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其能够特异性结合IL-13Rα2，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3来自于SEQ ID NO:9～12序列所示的重链可变区；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其能够特异性结合IL-13Rα2，包含重链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:9～12所示序列至少80％至100％的序列同一性；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子包括与SEQ ID NO:9～12序列中的CDR具有至少95％同一性的可变区结构域，所述双特异性抗原结合分子特异性结合IL-13Rα2。
  8. 如前述任一项权利要求的双特异性抗原结合分子或其片段，其中特异性结合第二抗原的scFv抗体靶向T细胞表面抗原；优选的，所述scFv抗体靶向CD3；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其还能够特异性结合CD3，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3来自于SEQ ID NO:7所示的重链可变区；和，其还包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3来自于SEQ ID NO:8所示的轻链可变区；
    更优选的，所述靶向CD3的抗体的CDR序列如SEQ ID NO：1～6所示；
    进一步优选的，HCDR 1的序列如SEQ ID NO：1所示；HCDR2的序列如SEQ ID NO：2所示；HCDR3的序列如SEQ ID NO：3所示；LCDR1的序列如SEQ ID NO：4所示；LCDR2的序列如SEQ ID NO：5所示；LCDR3的序列如SEQ ID NO：6所示；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其还能够特异性结合CD3，包含重链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:7所示序列至少80％至100％的序列同一性；和包含轻链可变区，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:8所示序列至少80％至100％的序列同一性；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，其中所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO:25所示；
    进一步优选的，双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:25中的CDR具有至少95％同一性的可变区结构域，所述双特异性抗原结合分子特异性结合CD3；
    进一步优选的，所述双特异性抗原结合分子，包含第一多肽链和第二多肽链，所述双特异性抗原结合分子含有如前述任一项权利要求所示的特异性结合IL-13Rα2的氨基酸序列，以及，如前述任一项权利要求所示的特异性结合CD3的氨基酸序列。
  9. 如前述任一项权利要求所述的双特异性抗原结合分子或其片段，其还具有以下特征的一种或多种：
    (1)所述特异性结合第一抗原的VHH抗体为纳米抗体；优选的，为人源化的骆驼科纳米抗体；
    (2)其包括重链恒定区CH2和CH3，以及不含轻链恒定区和/或重链恒定区CH1；优选的，所述重链恒定区包括Fc结构域或变体Fc；更优选的，Fc来源于鼠或人；
    (3)所述Fc结构域是IgG Fc结构域；优选的，所述Fc结构域是IgG1结构域或IgG4结构域；
    (4)所述Fc结构域包含促进所述Fc(1)结构域与所述Fc(2)结构域结合的修饰；
    (5)构成Fc结构域的两个多肽序列相互具有不同的序列，且构成Fc结构域的两个多肽的Knob链的氨基酸残基中按照EU编号特定的366位氨基酸突变为色氨酸，另一个Hole链的氨基酸残基中按照EU编号特定的366位氨基酸突变为丝氨酸、368位氨基酸突变为丙氨酸、407位氨基酸突变为缬氨酸；优选的，Knob链包括S354C和T366W氨基酸取代，Hole链包括Y349C、T366S、L368A和Y407V氨基酸取代；更优选的，Hole链还包括H435R的取代；进一步优选的，Fc段还包括L234A和L235A的取代；优选的，所述Fc(1)为Knob链，和所述Fc(2)为Hole链；
    (6)Fc结构域的序列如SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:31所示；优选的，所述Fc(1)如SEQ ID NO:30所示，和所述Fc(2)如SEQ ID NO:31所示。
  10. 一种双特异性蛋白分子，包含与SEQ ID NO:32-35、40、42或43中的CDR具有至少95％同一性的可变区结构域和与SEQ ID NO:36-39、41或44中的CDR具有至少95％同一性的可变区结构域；所述双特异性蛋白分子 特异性结合IL-13Rα2和CD3；
    优选地，所述双特异性蛋白分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32～35、40、42或43任一项所示，和/或所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36～39、41或44任一项所示；
    优选的，所述双特异性蛋白分子的第一多肽链和第二多肽链选自如下(a)～(i)所示组合中的一种：
    (a)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或
    (b)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:33所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:37所示；或
    (c)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:34所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:38所示；或
    (d)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:35所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:39所示；或
    (e)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:33所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:39所示；或
    (f)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:40所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或
    (g)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:32所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:41所示；或
    (h)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:42所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:36所示；或
    (i)所述第一多肽链的序列如SEQ ID NO:43所示，以及所述第二多肽链的序列如SEQ ID NO:44所示。
  11. 一种多核苷酸，其编码权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子或其片段，或权利要求10所述的双特异性蛋白分子；或，一种重组载体，其包含所述的多核苷酸；或，一种宿主细胞，其包含所述的多核苷酸或重组载体。
  12. 生产权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子或其片段，或权利要求10所述的双特异性蛋白分子的方法。
  13. 药物组合物，其包含：可药用载体，和由权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子或其片段、权利要求10所述的双特异性蛋白分子、权利要求11中的多核苷酸、重组载体和/或宿主细胞组成的组中的一种或多种。
  14. 如权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子或其片段、权利要求10所述的双特异性蛋白分子、权利要求11所述的多核苷酸或重组载体或宿主细胞、或权利要求13所述的药物组合物在制备用于有需要的个体中治疗和/或预防疾病的药物中的用途；优选的，所述疾病是癌症；更优选的，所述癌症为IL-13Rα2阳性的肿瘤；进一步优选的，所述癌症选自胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌或胃癌。
  15. 一种治疗和/或预防受试者中与表达IL-13Rα2相关的疾病的方法，包括给予所述受试者治疗和/或预防有效量的根据权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子或其片段、权利要求10所述的双特异性蛋白分子、权利要求11所述的多核苷酸或重组载体或宿主细胞、或权利要求13所述的药物组合物；优选的，所述表达IL-13Rα2相关的疾病为癌症；更优选的，所述癌症选自胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌或胃癌。
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