TW202317639A - 抗人cd3抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及抗人CD3抗體及其用途,具體涉及特異性結合人CD3之抗體或其抗原結合片段、多特異性抗原結合分子、分離之核酸分子、載體、細胞、免疫效應細胞,所述抗體或其抗原結合片段、所述多特異性抗原結合分子和所述免疫效應細胞之製備方法,藥物組合物,製藥用途和疾病之治療方法。
Description
本申請涉及生物醫藥領域,具體而言,涉及抗人CD3抗體及其應用。
T細胞(抗原)受體(T cell receptor,TCR)是T細胞表面之特異性受體,存在兩種亞單位TCRαβ和TCRγδ,主要功能是識別並結合MHC分子提呈之抗原,TCR之胞漿區非常短,單獨TCR無法傳導信號,需要借助CD3分子。CD3分子是T細胞膜上之重要分化抗原,主要由ε、δ、γ和ζ四種鏈組成。在CD3-TCR複合體中,CD3γ、δ和ε以兩種非共價鍵形式之γε和δε異源二聚體存在,ζ鏈絕大多數以同源二聚體即ζ-ζ形式存在。CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ之細胞質結構域中都包含了保守之基於免疫受體酪胺酸之啟動基序(immune receptor tyrosine-based activation motif,ITAM)。其中CD3ζ具有三個ITAM,而其他CD3鏈各包含一個ITAM,不同之抗原刺激能夠誘導TCR之10個ITAM發生不同之磷酸化,最終觸發不同之下游信號通路。CD3ε之細胞質結構域在近膜區域有一個富含鹼性胺基酸之序列(basic residue-rich sequence,BRS),然後是一個非冗余之富含脯胺酸殘基之序列(proline residue-rich sequence,PRS)以及一個ITAM。因此,CD3ε亞基中之BRS可以通過離子相互作用有效地招募Lck以啟動TCR磷酸化。已證明針對CD3ε之某些抗體可誘導TCR信號傳導,而其他抗體則不能。基於CD3在TCR信號轉導和免疫應答方面之重要作用,開發針對CD3之抗體具有重要意義。
另外,多特異性抗體通過與腫瘤細胞上之靶抗原和T細胞上之CD3結合,形成不依賴於TCR之人為免疫突觸並避開HLA之限制。但是CD3抗體存在發生細胞因子風暴之風險。Faroudi等人觀察到靶細胞裂解之啟動閾值比細胞因子釋放之啟動閾值敏感1000倍以上,這種差異主要是由於靶細胞表面抗原濃度和pMHC:TCR複合物數量不同導致的。低親和力有助於通過不斷的快速結合和解離使一些肽-MHC複合物連續觸發許多TCR,這種連續觸發對於維持一定時間內之信號傳遞至關重要,其允許T細胞最終達到啟動閾值。而高親和力之抗CD3抗體可能較難解離,不能連續觸發TCR,而不能有效地刺激T細胞,這表明合適親和力範圍之抗體可能會更有效地通過TCR信號傳遞刺激T細胞。
因此,開發新型抗CD3抗體仍然存在很大之需求。
相關申請之交叉引用
本申請要求於2021年9月13日向中國國家智慧財產權局提交之、發明名稱為“抗人CD3抗體及其應用”、申請號為CN202111069892.7之發明專利申請之優先權,其全部內容通過援引整體併入本文中。
本申請提供了特異性結合人CD3之抗體或其抗原結合片段、多特異性抗原結合分子、分離之核酸分子、載體、細胞、免疫效應細胞,所述抗體或其抗原結合片段、所述多特異性抗原結合分子和所述免疫效應細胞之製備方法,藥物組合物,製藥用途和疾病之治療方法。
在第一方面,本申請提供了特異性結合人CD3之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區,所述重鏈可變區包含HCDR1-3,所述輕鏈可變區包含LCDR1-3,所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3選自表10或表18。
在第一方面之一些實施方案中,所述HCDR1包含SEQ ID NO:31-33、44-46、57-59、70-72、83-85、96-98和109-111中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列;和
所述HCDR2包含SEQ ID NO:34-36、137、47-49、60-62、73-75、86-88、99-101和112-114中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列;和
所述HCDR3包含SEQ ID NO:37-38、138-139、50-51、142-143、63-64、76-77、89-90、102-103和115-116中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列;和/或
所述LCDR1包含SEQ ID NO:39-40、140-141、52-53、65-66、78-79、91-92、104-105和117-118中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列;和
所述LCDR2包含SEQ ID NO:41-42、54-55、67-68、80-81、93-94、106-107和119-120中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列;和
所述LCDR3包含SEQ ID NO:43、56、69、82、95、108和121中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變或差異之序列。
在第一方面之一些實施方案中,所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3根據Kabat、Chothia或IMGT方式確定。
在第一方面之一些實施方案中,所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、124、126、128、130、132、134和136中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多15個胺基酸突變或差異之序列。
在第一方面之一些實施方案中,所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、123、125、127、129、131、133和135中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多15個胺基酸突變或差異之序列。
在第一方面之一些實施方案中,所述至少70%之同一性為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性。
在第一方面之一些實施方案中,所述至多3個突變或差異為至多3、2、1或0個突變或差異。
在第一方面之一些實施方案中,所述至多15個突變或差異為至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個突變或差異。
在第一方面之一些實施方案中,所述突變為插入、缺失或替換。在一些實施方案中,所述替換為保守胺基酸替換。
在第一方面之一些實施方案中,所述突變為回復突變或熱點突變。
在第一方面之一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 18所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 20所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 21所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 22所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 23所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 24所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 25所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 26所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 30所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 124所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 123所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 126所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 125所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 128所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 127所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 130所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 129所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 132所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 131所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 134所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 133所示;或者
所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 136所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 135所示。
在第一方面之一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
在第一方面之一些實施方案中,所述重鏈恆定區選自IgG,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在第一方面之一些實施方案中,所述重鏈恆定區可選自人IgG,例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。
在第一方面之一些具體實施方案中,所述重鏈恆定區可選自SEQ ID NO:13。
在第一方面之一些實施方案中,所述輕鏈恆定區選自κ鏈或λ鏈。
在第一方面之一些具體實施方案中,所述輕鏈恆定區可選自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:122。
在第一方面之一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段選自:單克隆抗體(亦稱為單株抗體)、多克隆抗體(亦稱為多株抗體)、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體之片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)
2、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)和單域抗體。
在第一方面之一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段與治療劑或示蹤劑綴合。
在第一方面之一些實施方案中,所述治療劑可選自:放射性同位素、化療藥和免疫調節劑。
在第一方面之一些實施方案中,所述示蹤劑可選自:放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑和光敏劑。
在第一方面之一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段還結合猴CD3。
在第一方面之一些實施方案中,所述CD3選自CD3ε亞基和包含CD3ε亞基之二聚體,例如,CD3ε/δ二聚體。
在第二方面,本申請提供了多特異抗原結合分子,其中所述多特異性抗原結合分子至少包括第一抗原結合模組和第二抗原結合模組,所述第一抗原結合模組包含第一方面所述之抗體或其抗原結合片段,和/或所述第二抗原結合模組結合與所述第一抗原結合模組不同之其他靶點或結合相同靶點之不同表位。
在第二方面之一些實施方案中,所述其他靶點選自腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA)。
在第二方面之一些實施方案中,所述多特異性抗原結合分子為雙特異性T細胞接合器(BiTE)。
在第三方面,本申請提供了分離之核酸分子,其中所述核酸分子編碼第一方面所述之抗體或其抗原結合片段、或第二方面所述之多特異性抗原結合分子。
在第三方面之一些實施方案中,所述核酸分子還編碼嵌合抗原受體。
在第三方面之一些實施方案中,編碼第一方面所述抗體或其抗原結合片段、或第二方面所述多特異性抗原結合分子之核酸與編碼所述嵌合抗原受體之核酸通過編碼自裂解肽之核酸序列或IRES核酸序列連接。
在第四方面,本申請提供了載體,其包含第三方面所述之核酸分子。
在第五方面,本申請提供了細胞,其包含第四方面所述之載體。
在第六方面,本申請提供了免疫效應細胞,其表達嵌合抗原受體,和/或表達第一方面所述之抗體或其抗原結合片段或第二方面所述之多特異性抗原結合分子。
在第六方面之一些實施方案中,所述免疫效應細胞選自:T細胞、自然殺手細胞(NK細胞,natural killer cell)、自然殺手T細胞(NKT細胞,natural killer T cell)、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和肥大細胞。
在第六方面之一些實施方案中,所述T細胞選自:細胞毒性T細胞、調節性T細胞和輔助性T細胞。
在第六方面之一些實施方案中,所述免疫效應細胞為自體免疫效應細胞或同種異體免疫效應細胞。
在第七方面,本申請提供了製備第一方面所述之抗體或其抗原結合片段或第二方面所述之多特異性抗原結合分子之方法,其中所述方法包括:(1)培養第五方面所述之細胞;和/或(2)分離所述細胞表達之抗體或其抗原結合片段,或多特異性抗原結合分子。
在第八方面,本申請提供了製備第六方面所述之免疫效應細胞之方法,其中所述方法包括:(1)將a.編碼所述嵌合抗原受體之核酸分子和b.編碼第一方面所述之抗體或其抗原結合片段或第二方面所述之多特異性抗原結合分子之核酸分子導入初始之免疫效應細胞;和/或(2)使導入上述核酸分子之免疫效應細胞表達所述嵌合抗原受體和第一方面所述之抗體或其抗原結合片段或第二方面所述之多特異性抗原結合分子。
在第九方面,本申請提供了藥物組合物,其中所述藥物組合物包含第一方面所述之抗體或其抗原結合片段、第二方所述之多特異性抗原結合分子、第三方面所述之核酸分子、第四方面所述之載體、第五方面所述之細胞、第六方面所述之免疫效應細胞或根據第七或第八方面所述之方法製備得到之產品。
在第九方面之一些實施方案中,所述組合物還包含藥學上可接受之運載體(carrier)、稀釋劑或助劑。
在第十方面,本申請提供了第一方面所述之抗體或其抗原結合片段、第二方面所述之多特異性抗原結合片段、第三方面所述之核酸分子、第四方面所述之載體、第五方面所述之細胞、第六方面所述之免疫效應細胞、根據第七或第八方面所述之方法製備得到之產品、或第九方面所述之藥物組合物,在製備治療腫瘤或癌症之藥物中之用途。
在第十方面之一些實施方案中,所述腫瘤或癌症選自血液瘤或實體瘤。
在第十方面之一些實施方案中,所述血液瘤可選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在第十方面之一些實施方案中,所述實體瘤可選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌和肝癌。
在第十一方面,本申請提供了治療腫瘤或癌症之方法,其中所述方法包括向受試者施用有效量之藥物,所述藥物包括第一方面所述之抗體或其抗原結合片段、第二方面所述之多特異性抗原結合分子、第三方面所述之核酸分子、第四方面所述之載體、第五方面所述之細胞、第六方面所述之免疫效應細胞、根據第七或第八方面所述之方法製備得到之產品或第九方面所述之藥物組合物。
在第十一方面之一些實施方案中,所述腫瘤或癌症選自血液瘤或實體瘤。
在第十一方面之一些實施方案中,所述血液瘤可選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在第十一方面之一些實施方案中,所述實體瘤可選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌和肝癌。
在第十二方面,本申請提供了第一方面所述之抗體或其抗原結合片段、第二方面所述之多特異性抗原結合分子、第三方面所述之核酸分子、第四方面所述之載體、第五方面所述之細胞、第六方面所述之免疫效應細胞、根據第七或第八方面所述之方法製備得到之產品或第九方面所述之藥物組合物,其用於治療腫瘤或癌症。
在第十二方面之一些實施方案中,所述腫瘤或癌症選自血液瘤或實體瘤。
在第十二方面之一些實施方案中,所述血液瘤可選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在第十二方面之一些實施方案中,所述實體瘤可選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌或肝癌。
本申請第一方面至第十二方面中任一方面所述之實施方案至少具有以下一種或多種有益效果:
(1) 本申請所述方法篩選獲得與現有抗體不同的、新的CD3抗體,其特異性結合CD3ε亞基或其複合物,或特異性結合表達所述CD3ε亞基或其複合物之細胞,尤其是T細胞;
(2) 本公開所述抗體對CD3具有適當之親和力,能夠有效地通過TCR信號傳遞從而刺激T細胞,優選獲得高效啟動T細胞之抗體。
術語定義和說明
除非本申請另外定義,與本申請相關之科學和技術術語應具有本領域普通技術人員所理解之含義。
此外,除非本文另有說明,本文單數形式之術語應包括複數形式,複數形式之術語應包括單數形式。更具體地,如在本說明書和所附請求項中所使用的,除非另外明確指出,否則單數形式“一種”和“這種”包括複數指示物。
本文術語“包括”、“包含”和“具有”之間可互換使用,旨在表示方案之包含性,意味著所述方案可存在除所列出之元素之外之其他元素。同時應當理解,在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述,也提供“由……組成”方案。示例性地,“一種組合物,包括A和B”,應當理解為以下技術方案:由A和B組成之組合物,以及除A和B外,還含有其他組分之組合物,均落入前述“一種組合物”之範圍內。
術語“和/或”在本文使用時,包括“和”、“或”和“由所屬術語連結之要素之全部或任何其他組合”之含義。
本文術語“特異性結合”是指抗原結合分子(例如抗體)通常以高親和力特異性結合抗原和實質上相同之抗原,但不以高親和力結合不相關抗原。親和力通常以平衡解離常數(equilibrium dissociation constant,KD)來反映,其中較低KD表示較高親和力。以抗體為例,高親和力通常指具有約10
-6M或更低、約10
-7M或更低、約10
-8M或更低、約1×10
-9M或更低、約1×10
-10M或更低、約1×10
-11M或更低、或約1×10
-12M或更低之KD。KD計算方式如下:KD = Kd/Ka,其中Kd表示解離速率,Ka表示結合速率。可採用本領域周知之方法測量平衡解離常數KD,如表面等離子共振(例如Biacore)或平衡透析法測定,示例性地,可參見本文實施例8所示KD值獲得方法。
本文術語“抗原結合分子”按最廣義使用,是指特異性結合抗原之分子。示例性地,抗原結合分子包括但不限於抗體或抗體模擬物。“抗體模擬物”是指能夠與抗原特異性結合,但與抗體結構無關之有機化合物或結合域,示例性地,抗體模擬物包括但不限於affibody、affitin、affilin、經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)、核酸適體或Kunitz型結構域肽。
本文術語“抗體”按最廣義使用,是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區之足夠序列和/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區之足夠序列,從而能夠特異性結合至抗原之多肽或多肽組合。本文“抗體”涵蓋各種形式和各種結構,只要它們展現出期望之抗原結合活性。本文“抗體”包括具有移植之互補決定區(CDR)或CDR衍生物之替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括抗體衍生之支架(其包含引入以例如穩定化抗體三維結構之突變)以及包含例如生物相容性聚合物之全合成支架。參見,例如Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function, and Bioinformatics,53(1):121-129(2003);Roque等人,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此類支架還可以包括非抗體衍生之支架,例如本領域已知可用於移植CDR之支架蛋白,包括但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。
本文“抗體”包括一種典型之“四鏈抗體”,其屬於由兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)組成之免疫球蛋白;重鏈是指這樣之多肽鏈,其在N端到C端之方向上由重鏈可變區(VH)、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區(HR)、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成;並且,當所述全長抗體為IgE同種型時,任選地還包括重鏈恆定區CH4結構域;輕鏈是在N端到C端方向上由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成之多肽鏈;重鏈與重鏈之間、重鏈與輕鏈之間通過二硫鍵連接,形成“Y”字型結構。由於免疫球蛋白重鏈恆定區之胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將本文“免疫球蛋白”分為五類,或稱為免疫球蛋白之同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應之重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵之數目和位置之差別,又可分為不同之亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,IgA可分為IgA1和IgA2。輕鏈通過恆定區之不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
本文“抗體”還包括不包含輕鏈之抗體,例如,由單峰駝(Camelus dromedarius)、雙峰駝(Camelus bactrianus)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)和羊駝(Vicugna pacos)等產生之重鏈抗體(heavy-chain antibodies, HCAbs)以及在鯊等軟骨魚綱中發現之免疫球蛋白新抗原受體(Ig new antigen receptor, IgNAR)。
本文“抗體”可以來源於任何動物,包括但不限於人和非人動物,所述非人動物可選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物和脊椎動物,例如駱駝科動物、大羊駝、原鴕、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱(例如鯊)。
本文“抗體”包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體之片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。
本文術語“單克隆抗體”是指從基本上同質之抗體群體獲得之抗體,即,除了可能之變異體(例如含有天然存在之突變或在製劑之生產過程中產生,此類變體通常以少量存在)之外,包含所述群體之各個抗體是相同之和/或結合相同之表位。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多克隆抗體製劑相反,單克隆抗體製劑中之每種單克隆抗體針對抗原上之單一決定簇。本文修飾語“單克隆”不應解釋為需要通過任何特定方法產生所述抗體或其抗原結合分子。舉例來說,單克隆抗體可通過多種技術制得,包括(但不限於)雜交瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法和其它本領域已知之方法。
本文術語“天然抗體”是指通過多細胞生物體之免疫系統製造和配對之抗體。本文術語“工程化抗體”之抗體是指通過基因工程、抗體工程等技術獲得之非天然抗體,示例性地,“工程化抗體”包括人源化抗體、小分子抗體(例如scFv等)、雙特異性抗體等等。
本文術語“單特異性”是指表示具有一個或多個結合位點,其中每個結合位點結合相同抗原之相同表位。
本文術語“多特異性抗體”是指具有至少兩個抗原結合位點,所述至少兩個抗原結合位點中之每一個抗原結合位點與相同抗原之不同表位或與不同抗原之不同表位結合。因此,諸如“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合之不同表位之數目。
本文術語“價”表示抗體/抗原結合分子中規定數目之結合位點之存在。因此,術語“單價”、“二價”、“四價”和“六價”分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點之存在。
本文“全長抗體”、“完好抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用,是指具有基本上與天然抗體結構相似之結構。
本文“抗原結合片段”和“抗體片段”在本文中可互換使用,其不具備完整抗體之全部結構,僅包含完整抗體之局部或局部之變體,所述局部或局部之變體具備結合抗原之能力。本文“抗原結合片段”或“抗體片段”包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)
2、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)和單域抗體。
完整抗體之木瓜蛋白酶消化生成兩個同一之抗原結合片段,稱作“Fab”片段,每個含有重鏈可變域和輕鏈可變域,還有輕鏈之恆定域和重鏈之第一恆定域(CH1)。如此,本文術語“Fab片段”指包含輕鏈之VL域和恆定域(CL)之輕鏈片段,和重鏈之VH域和第一恆定域(CH1)之抗體片段。Fab’片段因在重鏈CH1域之羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同,包括來自抗體鉸鏈區之一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH是其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團之Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)和Fc區之一部分之F(ab’)
2片段。
本文術語“Fd”是指由VH和CH1結構域組成之抗體。本文術語“Fv”是指由單臂VL和VH結構域組成之抗體片段。Fv片段通常被認為是,能形成完整之抗原結合位點之最小抗體片段。一般認為,六個CDR賦予抗體之抗原結合特異性。然而,即便是一個可變區(例如Fd片段,其僅僅含有三個對抗原特異之CDR)也能夠識別並結合抗原,儘管其親和力可能低於完整之結合位點。
本文術語“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH結構域之單個多肽鏈,其中所述VL和VH通過接頭(linker)相連(參見,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和Moore編,Springer-Verlag,紐約,第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構:NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適之現有技術接頭由重複之GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如,可使用具有胺基酸序列(GGGGS)
4之接頭,但也可使用其變體(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用於本申請之其他接頭由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在一些情況下,scFv之VH與VL之間還可以存在二硫鍵,形成二硫鍵連接之Fv(dsFv)。
本文術語“雙抗體(diabody)”,其VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達,但使用太短之連接體以致不允許在相同鏈之兩個結構域之間配對,從而迫使結構域與另一條鏈之互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位(參見,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
本文術語“單域抗體”(single domain antibody,sdAb)、“VHH”和“奈米抗體(nanobody)”具有相同之含義並可互換使用,指克隆抗體重鏈之可變區,構建僅由一個重鏈可變區組成之單域抗體,它是具有完整功能之最小之抗原結合片段。通常先獲得天然缺失輕鏈和重鏈恆定區1(CH1)之抗體後,再克隆抗體重鏈之可變區,構建僅由一個重鏈可變區組成之單域抗體。單域抗體可以衍生自駱駝科重鏈抗體或軟骨綱魚類IgNAR。
本文術語“裸抗體”是指不與治療劑或示蹤劑綴合之抗體;術語“綴合抗體”是指與治療劑或示蹤劑綴合之抗體。
本文術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”是指,這樣之抗體,其輕鏈或/和重鏈之一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類),且輕鏈或/和重鏈之另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同之物種或屬於相同或不同之抗體類或亞類),但無論如何,其仍保留對目標抗原之結合活性(U.S.P 4,816,567,Cabilly等人;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。例如,術語“嵌合抗體”可包括這樣之抗體(例如人鼠嵌合抗體),其中抗體之重鏈和輕鏈可變區來自第一抗體(例如鼠源抗體),而抗體之重鏈和輕鏈恆定區來自第二抗體(例如人抗體)。
本文術語“人源化抗體”是指,經基因工程改造之非人源抗體,其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體之序列之同源性。通常而言,人源化抗體之全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體),全部或部分之非CDR區(例如,可變區FR和/或恆定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體之預期性質,包括但不限於,抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性之能力、增強免疫應答之能力等。
本文術語“全人抗體”是指具有其中FR和CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列之可變區之抗體。此外,如果抗體包含恆定區,則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本文全人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如,通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入之突變)。然而,本文“全人抗體”不包括其中來源於另一個哺乳動物物種(例如小鼠)之種系之CDR序列已被移植到人框架序列上之抗體。
本文術語“可變區”是指抗體重鏈或輕鏈中牽涉使抗體結合抗原之區域,“重鏈可變區”與“VH”、“HCVR”可互換使用,“輕鏈可變區”與“VL”、“LCVR”可互換使用。天然抗體之重鏈和輕鏈之可變域(分別是VH和VL)一般具有相似之結構,每個域包含四個保守之框架區(FR)和三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文術語“互補決定區”與“CDR”可互換使用,通常指重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)之高變區(HVR),該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密之互補,故又稱為互補決定區,其中,重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR,輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本術語“構架區”或“FR區”可互換,是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外之那些胺基酸殘基。通常典型之抗體可變區由4個FR區和3個CDR區按以下順序組成:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
對於CDR之進一步描述,參考Kabat等人, J. Biol. Chem.,252:6609-6616 (1977);Kabat等人, 美國衛生與公共服務部,“Sequences of proteins of immunological interest ”(1991); Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B.等人, J.Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum 等人, J. Mol.Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan和Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P.等人, Dev. Comp.Immunol., 27: 55-77 (2003); 以及Honegger和Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)。“CDR”可由Kabat編號系統加以定義,工具網站包括abYsis網站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)
本文術語“Kabat編號系統”通常是指由Elvin A.Kabat提出之免疫球蛋白比對及編號系統(參見,例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文術語“重鏈恆定區”是指抗體重鏈之羧基端部分,其不直接參與抗體與抗原之結合,但是表現出效應子功能,諸如與Fc受體之相互作用,其相對於抗體之可變結構域具有更保守之胺基酸序列。“重鏈恆定區”至少包含:CH1結構域,鉸鏈區,CH2結構域,CH3結構域,或其變體或片段。“重鏈恆定區”包括“全長重鏈恆定區”和“重鏈恆定區片段”,前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似之結構,而後者僅包括“全長重鏈恆定區之一部分”。示例性地,典型之“全長抗體重鏈恆定區”由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成;當抗體為IgE時,其還包括CH4結構域;當抗體為重鏈抗體時,則其不包括CH1結構域。示例性地,典型之“重鏈恆定區片段”可選自CH1、Fc或CH3結構域。
本文術語“輕鏈恆定區”是指抗體輕鏈之羧基端部分,其不直接參與抗體與抗原之結合,所述輕鏈恆定區可選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。
本文術語“Fc”是指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成之抗體羧基端部分,典型地,其包含抗體之CH3和CH2結構域。Fc區包括例如天然序列Fc區、重組Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可以略微變化,但是人IgG重鏈之Fc區通常被定義為從Cys226位置之胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區之C末端賴胺酸(根據Kabat編號系統之殘基447)可以例如在抗體之產生或純化過程中,或通過對編碼抗體重鏈之核酸重組工程化而除去,因此,Fc區可包括或不包括Lys447。
本文術語“保守胺基酸”通常是指屬於同一類或具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性)之胺基酸。示例性地,下述每組內之胺基酸屬於彼此之保守胺基酸殘基,組內胺基酸殘基之替換屬於保守胺基酸之替換:
示例性地,以下六組是被認為是互為保守性置換之胺基酸之實例:
1) 丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);
2) 天冬胺酸(D)、穀胺酸(E);
3) 天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);
4) 精胺酸(R)、賴胺酸(K)、組胺酸(H);
5) 異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);和
6) 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
本文術語“同一性”可通過以下方式計算獲得:為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之“同一性”百分數,將所述序列出於最佳比較目之比對(例如,可以為最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由第二序列中對應位置處之相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則所述分子在這個位置處是相同的。
考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入之空位之數目和每個空位之長度,兩個序列之間之同一性百分數隨所述序列共有之相同位置變化而變化。
可以利用數學演算法實現兩個序列間之序列比較和同一性百分數之計算。例如,使用已經集成至GCG套裝軟體之GAP程式中之Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)演算法(在www.gcg.com可獲得),使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個胺基酸序列之間之同一性百分數。又例如,使用GCG套裝軟體中之GAP程式(在www.gcg.com可獲得),使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個核苷酸序列之間之同一性百分數。特別優選之參數集合(和除非另外說明否則應當使用之一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5之Blossum62評分矩陣。
還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12,空位罰分4,利用已經併入ALIGN程式(2.0版)之E.Meyers和W.Miller演算法,((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間之同一性百分數。
可選地,可以進一步使用本申請所述之核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共資料庫執行檢索,以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。例如,可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10之NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)執行此類檢索。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程式,評分=100、字長度=12執行,以獲得與本申請核酸(SEQ ID NO:1)分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程式、評分=50、字長度=3執行,以獲得與本申請蛋白質分子同源之胺基酸序列。為了出於比較目的獲得帶空位之比對結果,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那樣使用空位BLAST。當使用BLAST和空位BLAST程式時,可以使用相應程式(例如,XBLAST和NBLAST)之默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文術語“嵌合抗原受體(CAR)”是指經改造以在免疫效應細胞上表達並且特異性結合抗原之人工細胞表面受體,其包含至少(1)細胞外抗原結合結構域,例如抗體之可變重鏈或輕鏈,(2)錨定CAR進入免疫效應細胞之跨膜結構域,和(3)胞內信號傳導結構域。CAR能夠利用細胞外抗原結合結構域以非MHC限制性之方式將T細胞和其它免疫效應細胞重定向至所選擇之靶標,例如癌細胞。
本文術語“核酸”包括包含核苷酸之聚合物之任何化合物和/或物質。每個核苷酸由鹼基,特別是嘌呤或嘧啶鹼基(即胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即去氧核糖或核糖)和磷酸基團組成。通常,核酸分子由鹼基之序列描述,由此所述鹼基代表核酸分子之一級結構(線性結構)。鹼基之序列通常表示為5’至3’。在本文中,術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA),包括例如互補DNA(cDNA)和基因組DNA、核糖核酸(RNA),特別是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA之合成形式,以及包含兩種或更多種這些分子之混合之聚合物。核酸分子可以是線性之或環狀的。此外,術語核酸分子包括有義鏈和反義鏈二者,以及單鏈和雙鏈形式。而且,本文所述之核酸分子可含有天然存在之或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之例子包括具有衍生之糖或磷酸骨架鍵合或化學修飾之殘基之修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還涵蓋DNA和RNA分子,其適合作為載體用於在體外和/或體內,例如在宿主或患者中,直接表達本申請之抗體。此類DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)載體可以是未修飾之或修飾的。例如,可以對mRNA進行化學修飾以增強RNA載體之穩定性和/或被編碼分子之表達,從而可以將mRNA注入到受試者內以在體內產生抗體(參見例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,published online 2017年6月12日,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分離之”核酸指已經與其天然環境之組分分開之核酸分子。分離之核酸包括在下述細胞中含有之核酸分子,所述細胞通常含有該核酸分子,但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
本文術語“載體”是指能夠擴增與其連接之另一個核酸之核酸分子。該術語包括作為自我複製型核酸結構之載體以及整合入已引入該載體之宿主細胞之基因組中之載體。某些載體能夠指導與它們可操作連接之核酸之表達,這樣之載體在本文中稱為“表達載體”。
本文術語“宿主細胞”是指細胞中引入外源核酸之細胞,包括這種細胞之後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化之細胞”,其包括原代之經轉化之細胞和來源於其之後代,而不考慮傳代之次數。後代在核酸內容物上可能與親本細胞不完全相同,而是可以包含突變。本文中包括具有與在初始轉化之細胞中篩選或選擇之相同功能或生物學活性之突變體後代。
本文術語“藥物組合物”是指這樣之製劑,其以允許包含在其中之活性成分之生物學活性有效之形式存在,並且不含有對施用所述藥物組合物之受試者具有不可接受之毒性之另外之成分。
本文術語“治療”是指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment),其目的是預防、減緩(減少)治療物件中不希望之生理變化或病變,如癌症之進展。有益之或所希望之臨床結果包括但不限於症狀之減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即,未惡化)、疾病進展之延遲或減慢、疾病狀態之改善或緩和、以及緩解(無論是部分緩解或完全緩解),無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療之物件包括已患有病症或疾病之物件以及易於患上病症或疾病之物件或打算預防病症或疾病之對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時,其含義也包括消除、消失、不發生等情況。
本文術語“受試者”是指接受對如本申請所述之特定疾病或病症之治療之生物體。物件和患者之實例包括接受疾病或病症治療之哺乳動物,如人、靈長類動物(例如,猴)或非靈長類哺乳動物。
本文術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或物件時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展之治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀,例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症,或治療、治癒、防止或緩解這些病症之速度增加之化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時,治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時,治療有效劑量指產生治療作用之活性成分之組合用量,而無論是組合、連續或同時給予。
本文術語“癌症”指向或描述哺乳動物中典型地以不受調節之細胞生長為特徵之生理狀況。此定義中包括良性和惡性癌症。本文術語“腫瘤”或“瘤”是指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
本文術語“EC50”是指半最大有效濃度,其包括在指定暴露時間之後誘導基線與最大值之間之半途回應之抗體濃度。EC50本質上代表其中觀察到其最大作用之50%之抗體濃度,可通過本領域已知方法測量。
下面結合具體實施例來進一步描述本申請,本申請之優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未注明具體條件者,按照常規條件或製造商建議之條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市售購買獲得之常規產品。
本申請實施例僅是範例性的,並不對本申請之範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是,在不偏離本申請之精神和範圍下可以對本申請技術方案之細節和形式進行修改或替換,但這些修改和替換均落入本申請之保護範圍內。
實施例1 對照抗體之製備
陽性對照抗體(VH、VL序列詳見表1):SP34、OKT3、I2C、40G5c、F2B和7221G20均識別人CD3之抗體,其中SP34、I2C和40G5c克隆識別人CD3ε蛋白、CD3ε/δ異源二聚體和CD3γ/δ異源二聚體;OKT3、F2B和7221G20克隆僅識別人CD3ε/δ異源二聚體。
陽性對照抗體之製備方法如下:將陽性對照抗體之輕鏈可變區序列分別克隆到包含信號肽和人源抗體IgG1之輕鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1HLK,重鏈可變區序列分別克隆到包含信號肽和人源抗體IgG1之重鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1HH1,獲得SP34-hIgG1、OKT3-hIgG1、I2C-hIgG1、40G5c-hIgG1、7221G20-hIgG1和F2B-hIgG1,以下分別簡稱SP34、OKT3、I2C、40G5c、7221G20和F2B。按已建立之標準分子生物學方法製備質粒,具體方法參見Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)。另外,按照相同方法將抗體輕鏈可變區和重鏈可變區分別克隆到包含信號肽和鼠IgG1輕鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1MLK,和包含信號肽和鼠IgG1重鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1MH1。具體序列資訊參見表1。
將表達載體按照PEI(購自Polysciences,貨號:24765-1)說明書暫態轉染HEK293E細胞(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)並使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific,貨號:12338018)在37℃下連續培養5天,離心去除細胞成分,獲得含抗體之培養上清液。將培養上清液上樣到蛋白A層析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和層析柱BXK16/26均購自博格隆,貨號:AA0273和B-1620),使用PBS磷酸鹽緩衝液(pH7.4)清洗後再用20mM PB,1M NaCl(pH 7.2)進行清洗,最後使用pH3.4之檸檬酸緩衝液進行洗脫,收集從蛋白A層析柱上洗脫之抗體,用1/10體積之pH8.0之1M Tris中和,用PBS在4℃條件透析過夜,透析後之蛋白經0.22微米濾膜無菌過濾後分裝於-80℃保存。
陰性對照抗體hIgG1為針對雞卵溶菌酶之抗體抗hel-hIgG1(購自百英,貨號:B117901),以下簡稱hIgG1。
陰性對照抗體mIgG1為針對雞卵溶菌酶之抗體抗hel-mIgG1(購自百英,貨號:B118301),簡稱mIgG1。
表1 抗人CD3之陽性抗體之重鏈和輕鏈序列資訊
序列名稱 | SEQ ID NO: | 胺基酸序列 |
OKT3-VH | 1 | QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS |
OKT3-VL | 2 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN |
I2C-VH | 3 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS |
I2C-VL | 4 | QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL |
40G5c-VH | 5 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSS |
40G5c-VL | 6 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK |
7221G20-VH | 7 | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYSMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKYGSGYGKFYYYGMDVWGQGTTVTVSS |
7221G20-VL | 8 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK |
F2B-VH | 9 | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS |
F2B-VL | 10 | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIK |
SP34-VH | 11 | EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS |
SP34-VL | 12 | QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL |
人重鏈恆定區 | 13 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
人輕鏈恆定區 | 14 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
鼠重鏈恆定區 | 15 | AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK |
鼠輕鏈恆定區 | 16 | RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC |
實施例2 表達CD3細胞之鑒定
2.1 內源性表達CD3細胞株之鑒定
將懸浮細胞Jurkat細胞(購自中國科學院細胞庫)在T-175細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期,離心棄去培養基上清,細胞沉澱用PBS洗滌2次。對上一步之細胞進行細胞計數後將細胞沉澱用[PBS+2%(w/v)FBS]封閉液重懸至4×10
6個細胞/毫升,按50µl/孔加入到96孔FACS反應板中,離心去除上清,加入起始濃度100nM,1:5梯度稀釋之檢測抗體及IgG陰性對照,每孔100µl,將細胞混勻,冰上孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌3次,加入50µl/孔Alexa647標記之二抗(購自Jackson,貨號:109-605-088),冰上孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌5次,用FACS(FACS CantoⅡ,購自BD公司)檢測和分析結果。通過軟體(CellQuest)進行資料分析,得到細胞之平均螢光強度(MFI)。再通過軟體(GraphPad Prism8)分析,進行資料擬合,計算EC50值。其中檢測抗體為SP34、OKT3抗體,對照為hIgG1。分析結果如表2以及圖1所示。結果表明:Jurkat細胞可與SP34及OKT3結合,與hIgG1不結合,Jurkat細胞可作為CD3抗體篩選之陽性細胞。
表2 內源性細胞系Jurkat之FACS檢測結果
序號 | 抗體名稱 | Jurkat細胞平均螢光強度 | |
最大螢光-Alexa647 | EC50 (nM) | ||
1 | SP34 | 7327 | 0.45 |
2 | OKT3 | 8931 | 0.15 |
3 | hIgG1 | 108 | 陰性 |
2.2 不表達CD3細胞株之鑒定
將MOLT4細胞(購自中科院細胞庫,TCHU224)在T-175細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期,離心棄去培養基上清,細胞沉澱用PBS洗滌2次。按照實施例2.1之方法進行FACS檢測與資料分析。其中檢測抗體為SP34和OKT3抗體,對照為hIgG1。分析結果如表3所示。結果表明:MOLT4細胞不與SP34及OKT3結合,MOLT4細胞可作為CD3抗體篩選之陰性細胞。
表3 內源性細胞系MOLT4之FACS檢測結果
序號 | 抗體名稱 | MOLT4細胞平均螢光強度 | |
最大螢光值Alexa 647 | EC50 (nM) | ||
1 | SP34 | 211 | 陰性 |
2 | OKT3 | 285 | 陰性 |
3 | hIgG1 | 273 | 陰性 |
2.3 人T細胞之擴增
將人PBMC細胞(購自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司)按照T細胞啟動/擴增試劑盒(T Cell Activation/Expansion Kit (人類,購自美天旎,貨號:130-091-441))之說明書描述完成T細胞之擴增實驗。當細胞培養至14天時,離心棄去培養基上清,細胞沉澱用PBS洗滌2次。用SP34抗體作為一抗,Alexa647標記之二抗(購自Jackson Immuno,貨號:109-605-098),按照實施例2.1之方法進行FACS檢測與資料分析。分析結果如表4以及圖2所示。結果表明人PBMC經擴增後得到了CD3陽性之T細胞。
表4 人T細胞之FACS檢測結果
抗體名稱 | T細胞平均螢光強度 | |
最大螢光值Alexa 647 | EC50 (nM) | |
SP34 | 6145 | 2.54 |
hIgG1 | 480 | 陰性 |
2.4 食蟹猴T細胞之擴增
將食蟹猴PBMC(以下簡稱猴PBMC,購自上海美迪西生物醫藥股份有限公司)按照T細胞啟動/擴增試劑盒(T Cell Activation/Expansion Kit (非人靈長目動物,購自美天旎,貨號:130-092-919))之說明書描述完成食蟹猴(以下簡稱猴)T細胞之擴增實驗。當細胞培養至14天時,離心棄去培養基上清,細胞沉澱用PBS洗滌2次。用SP34抗體作為一抗,Alexa647標記之二抗(購自Jackson Immuno,貨號:109-605-098),按照實施例2.1之方法進行FACS檢測與資料分析。分析結果如表5以及圖3所示。結果表明:猴PBMC經擴增後得到了CD3陽性之T細胞。
表5 猴T細胞之FACS檢測結果
抗體名稱 | T細胞平均螢光強度 | |
最大螢光值Alexa 647 | EC50 (nM) | |
SP34 | 21174 | 0.49 |
hIgG1 | 299 | 陰性 |
實施例
3
抗人
CD3
雜交瘤單克隆抗體之製備
3.1 小鼠免疫和雜交瘤融合
使用含人CD3ε-ECD之蛋白(購自Sino biological,10977-H02H)作為免疫原,免疫6~8周齡雌性BALB∕c AnNCrl小鼠,SJL/JorllcoCrl小鼠,MRL/lpr小鼠或C57小鼠(均購自上海斯萊克公司)。初次免疫時,免疫原用TiterMax(購自Sigma,貨號T2684)乳化後皮下與腹腔分別注射0.1毫升,即每只小鼠注射50微克免疫原蛋白。加強免疫時,免疫原用Imject Alum佐劑(購自Thermofisher scientific貨號:77161)皮下與腹腔分別注射0.1毫升,即每只小鼠注射25微克免疫原。
脾細胞融合前3天在皮下和腹膜內注射50μg/只之生理鹽水配製之抗原溶液進行最後一次加強免疫。分離脾臟後加入ACK裂解緩衝液(購自Gibco,貨號:A1049201),裂解脾細胞中摻雜之紅細胞,獲得脾細胞懸液。用DMEM(購自Gibco,貨號10569-010)基礎培養基1000轉每分鐘離心清洗細胞3次,然後按照活細胞數目2:1比率與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(購自ATCC,CRL-1581)混合,採用BTX ECM2001+高效電融合方法(參見METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220)進行細胞融合。融合後之細胞稀釋到含10%胎牛血清(ExCell Bio,貨號FSD500)、1×HAT(購自Sigma,貨號:H0262)之DMEM培養基(購自Gibco,貨號:10569-010)中,所述百分比為體積百分比。然後按2×10
4/200微升每孔加入到96孔細胞培養板中,放入5% CO
2、37℃培養箱中進行培養,雜交瘤分泌抗體後之培養基上清作為雜交瘤上清液進行陽性克隆篩選。
3.2小鼠雜交瘤篩選
通過ELISA檢測雜交瘤上清與人CD3
ε/δ-His(購自北京義翹神州科技有限公司,貨號:CT038-H2508H)和猴CD3
ε/δ-His(購自Acrobiosystems,CDD-C52W4)之結合,對雜交瘤上清液進行篩選(參照下文之實施例10.1)。通過流式細胞術檢測ELISA陽性克隆雜交瘤上清與Jurkat細胞、猴T細胞之結合以及通過報告基因系統(方法參照實施例2.1、實施例2.4和下文之實施例7.1)檢測雜交瘤上清對Jurkat-Lucia NFAT(購自InvivoGen,貨號jktl-nfat)細胞之啟動情況。根據雜交瘤上清檢測結果,挑選優秀克隆(詳見表6-8),擴大培養,液氮凍存即得本申請雜交瘤細胞。
表6 ELISA測試雜交瘤上清與人和猴CD3ε/δ之結合
表7 通過流式細胞術檢測與Jurkat細胞和猴T細胞之結合
表8 報告基因檢測CD3抗體啟動下游通路信號
ELISA(OD 450) | ||
克隆號 | 人CD3ε/δ | 猴CD3ε/δ |
1-22.6 | 2.17 | 3.08 |
SP34-mIgG1 | 2.65 | 2.88 |
mIgG1 | 0.05 | 0.07 |
克隆號 | 人CD3ε/δ | 猴CD3ε/δ |
5-7.13 | 2.08 | 2.09 |
5-40.21 | 2.15 | 1.82 |
SP34-mIgG1 | 1.82 | 1.87 |
mIgG1 | 0.05 | 0.04 |
克隆號 | 人CD3ε/δ | 猴CD3ε/δ |
6-35.22 | 2.01 | 1.74 |
6-44.5 | 2.06 | 1.94 |
SP34-mIgG1 | 1.79 | 1.63 |
mIgG1 | 0.04 | 0.05 |
克隆號 | 人CD3ε/δ | 猴CD3ε/δ |
7-35.6 | 1.56 | 1.46 |
SP34-mIgG1 | 1.40 | 1.57 |
mIgG1 | 0.04 | 0.04 |
克隆號 | 人CD3ε/δ | 猴CD3ε/δ |
8-18.1 | 2.04 | 2.14 |
SP34-mIgG1 | 1.79 | 1.84 |
mIgG1 | 0.04 | 0.04 |
克隆號 | Jurkat平均螢光強度 | 猴T細胞平均螢光強度 | MOLT4平均螢光強度 |
1-22.6 | 767 | 20819 | 132 |
SP34-mIgG1 | 1293 | 22144 | 52 |
mIgG1 | 92 | 158 | 122 |
克隆號 | Jurkat平均螢光強度 | 猴T細胞平均螢光強度 | MOLT4平均螢光強度 |
5-7.13 | 8276 | 16321 | 61 |
5-40.21 | 6906 | 15166 | 105 |
SP34-mIgG1 | 5275 | 7562 | 156 |
mIgG1 | 152 | 51 | 143 |
克隆號 | Jurkat平均螢光強度 | 猴T細胞平均螢光強度 | MOLT4平均螢光強度 |
6-35.22 | 7048 | 32618 | 124 |
6-44.5 | 7240 | 36249 | 98 |
SP34-mIgG1 | 6388 | 23752 | 124 |
mIgG1 | 242 | 82 | 107 |
克隆號 | Jurkat平均螢光強度 | 猴T細胞平均螢光強度 | MOLT4平均螢光強度 |
7-35.6 | 284 | 1646 | 44 |
SP34-mIgG1 | 6034 | 13383 | 180 |
mIgG1 | 70 | 28 | 80 |
克隆號 | Jurkat平均螢光強度 | 猴T細胞平均螢光強度 | MOLT4平均螢光強度 |
8-18.1 | 895 | 3102 | 69 |
SP34-mIgG1 | 3141 | 10636 | 75 |
mIgG1 | 145 | 71 | 56 |
報告測定(RLU) | ||
克隆號 | 雜交瘤上清被稀釋4倍 | 雜交瘤上清被稀釋20倍 |
1-22.6 | 15970 | 8890 |
SP34-mIgG1 | 5420 | 22840 |
mIgG1 | 2220 | 2560 |
克隆號 | 雜交瘤上清被稀釋4倍 | 雜交瘤上清被稀釋20倍 |
5-7.13 | 24510 | 27830 |
5-40.21 | 18880 | 15550 |
SP34-mIgG1 | 15100 | 25250 |
mIgG1 | 2370 | 1940 |
克隆號 | 雜交瘤上清被稀釋4倍 | 雜交瘤上清被稀釋20倍 |
6-35.22 | 29050 | 34110 |
6-44.5 | 26170 | 21410 |
SP34-mIgG1 | 38630 | 23640 |
mIgG1 | 3930 | 5190 |
克隆號 | 雜交瘤上清被稀釋4倍 | 雜交瘤上清被稀釋20倍 |
7-35.6 | 27450 | 14800 |
SP34-mIgG1 | 21530 | 38540 |
mIgG1 | 1760 | 1790 |
克隆號 | 雜交瘤上清被稀釋4倍 | 雜交瘤上清被稀釋20倍 |
8-18.1 | 26950 | 17770 |
SP34-mIgG1 | 25370 | 23930 |
mIgG1 | 1100 | 1200 |
實施例
4
雜交瘤陽性克隆輕鏈重鏈可變區胺基酸序列測定及人鼠嵌合抗體之生產
4.1雜交瘤陽性克隆輕鏈重鏈可變區胺基酸序列測定
收集處於對數生長期之陽性雜交瘤細胞,用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)充分裂解後於-80℃保存待測。樣品委託蘇州金唯智生物科技有限公司測定雜交瘤陽性克隆輕鏈重鏈可變區胺基酸序列,抗體重鏈可變區與輕鏈可變區如表9所示,對應CDR如表10所示。
表9 雜交瘤篩選抗體之輕鏈可變區與重鏈可變區序列
表10 抗體CDR序列
SEQ ID NO: | 克隆名稱 | 序列 |
17 | 1-22.6-VH | QIPLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTSYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARLKNNPFCWGQGSTLTVFS |
18 | 1-22.6-VL | DVLMTQSPLSLPVRLGDQASISCRSSQLILHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPWTFGGGTKLEIK |
19 | 5-7.13-VH | QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWVHWVKQRPGQGLEWIGNINPSDGVTNYNEKFKSRATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDAYGQYYFDDWGQGTTLTVSS |
20 | 5-7.13-VL | DIVMSQSPSSLVVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASVRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQAEDLAVYYCIQSYYLRTFGGGTILEIK |
21 | 5-40.21-VH | QVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNTYPGSGSTNYDEKFKSKATLTVDSSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDRYGVYYFDYWGQGTTLTVSS |
22 | 5-40.21-VL | DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCTQSYNLRTFGGGTKLEIK |
23 | 6-35.22-VH | EVKLVESGGGLVQPGASLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLAMSRNKAKGHTIEYSSSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARDTYESYDGYFDVWGAGTTVIVSS |
24 | 6-35.22-VL | DIVMSQSPSSLAVSAGETVTMSCKSSQSLFNSRSRKNYLAWYQQKPGQTPKLLIYWASIRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYYLYTFGSGTKLEIK |
25 | 6-44.5-VH | EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGHTFTSHIMHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDRTEYSEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAGEAYYSNSLYAMDYWGQGTSVTVSS |
26 | 6-44.5-VL | DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPELLIYWASTRESGVPVRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYYLRTFGGGTKLEVK |
27 | 7-35.6-VH | EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKINNYATYYGDSVKDRFTISRDDSQSMFYLQMNNLKTEDTAMYYCVIHENYGSISWFAYWGQGTLVTVSA |
28 | 7-35.6-VL | QAVVTQESTLTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL |
29 | 8-18.1-VH | QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYIFTMNTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPYSGYTKYNQIFKDKATLTADKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCLRGGEGVWGQGTTLTVSS |
30 | 8-18.1-VL | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSELGSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK |
抗體名稱 | 定義方式 | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
1-22.6-VH | Kabat | SYGMS (SEQ ID NO:31) | WINTYSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO:34) | LKNNPFC (SEQ ID NO:37) |
Chothia | GYTFTSY (SEQ ID NO:32) | NTYSGV (SEQ ID NO:35) | LKNNPFC (SEQ ID NO:37) | |
IMGT | GYTFTSYG (SEQ ID NO:33) | INTYSGVP (SEQ ID NO:36) | ARLKNNPFC (SEQ ID NO:38) | |
1-22.6-VL | Kabat | RSSQLILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:39) | KVSNRFS (SEQ ID NO:41) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) |
Chothia | RSSQLILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:39) | KVSNRFS (SEQ ID NO:41) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) | |
FQGSHFPWT FQGSHFPWT | IMGT | QLILHSNGNTY (SEQ ID NO:40) | KVS (SEQ ID NO:42) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) |
5-7.13-VH | Kabat | SYWVH (SEQ ID NO:44) | NINPSDGVTNYNEKFKS (SEQ ID NO:47) | DAYGQYYFDD (SEQ ID NO:50) |
Chothia | GYTFTSY (SEQ ID NO:45) | NPSDGV (SEQ ID NO:48) | DAYGQYYFDD (SEQ ID NO:50) | |
IMGT | GYTFTSYW (SEQ ID NO:46) | INPSDGVT (SEQ ID NO:49) | TRDAYGQYYFDD (SEQ ID NO:51) | |
5-7.13-VL | Kabat | KSSQSLLNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:52) | WASVRDS (SEQ ID NO:54) | IQSYYLRT (SEQ ID NO:56) |
Chothia | KSSQSLLNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:52) | WASVRDS (SEQ ID NO:54) | IQSYYLRT (SEQ ID NO:56) | |
IMGT | QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO:53) | WAS (SEQ ID NO:55) | IQSYYLRT (SEQ ID NO:56) | |
5-40.21-VH | Kabat | SYWMH (SEQ ID NO:57) | NTYPGSGSTNYDEKFKS (SEQ ID NO:60) | DRYGVYYFDY (SEQ ID NO:63) |
Chothia | GYTFTSY (SEQ ID NO:58) | YPGSGS (SEQ ID NO:61) | DRYGVYYFDY (SEQ ID NO:63) | |
IMGT | GYTFTSYW (SEQ ID NO:59) | TYPGSGST (SEQ ID NO:62) | TRDRYGVYYFDY (SEQ ID NO:64) | |
5-40.21-VL | IMGT | KSSQSLLNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:65) | WASTRES (SEQ ID NO:67) | TQSYNLRT (SEQ ID NO:69) |
Chothia | KSSQSLLNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:65) | WASTRES (SEQ ID NO:67) | TQSYNLRT (SEQ ID NO:69) | |
IMGT | QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO:66) | WAS (SEQ ID NO:68) | TQSYNLRT (SEQ ID NO:69) | |
6-35.22-VH | Kabat | DYYMS (SEQ ID NO:70) | MSRNKAKGHTIEYSSSVKG (SEQ ID NO:73) | DTYESYDGYFDV (SEQ ID NO:76) |
Chothia | GFTFTDY (SEQ ID NO:71) | RNKAKGHT (SEQ ID NO:74) | DTYESYDGYFDV (SEQ ID NO:76) | |
IMGT | GFTFTDYY (SEQ ID NO:72) | SRNKAKGHTI (SEQ ID NO:75) | ARDTYESYDGYFDV (SEQ ID NO:77) | |
6-35.22-VL | Kabat | KSSQSLFNSRSRKNYLA (SEQ ID NO:78) | WASIRES (SEQ ID NO:80) | KQSYYLYT (SEQ ID NO:82) |
Chothia | KSSQSLFNSRSRKNYLA (SEQ ID NO:78) | WASIRES (SEQ ID NO:80) | KQSYYLYT (SEQ ID NO:82) | |
IMGT | QSLFNSRSRKNY (SEQ ID NO:79) | WAS (SEQ ID NO:81) | KQSYYLYT (SEQ ID NO:82) | |
6-44.5-VH | Kabat | SHIMH (SEQ ID NO:83) | YINPNNDRTEYSEKFKG (SEQ ID NO:86) | EAYYSNSLYAMDY (SEQ ID NO:89) |
Chothia | GHTFTSH (SEQ ID NO:84) | NPNNDR (SEQ ID NO:87) | EAYYSNSLYAMDY (SEQ ID NO:89) | |
IMGT | GHTFTSHI (SEQ ID NO:85) | INPNNDRT (SEQ ID NO:88) | AGEAYYSNSLYAMDY (SEQ ID NO:90) | |
6-44.5-VL | Kabat | KSSQSLFNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:91) | WASTRES (SEQ ID NO:93) | KQSYYLRT (SEQ ID NO:95) |
Chothia | KSSQSLFNSRTRKNYLA (SEQ ID NO:91) | WASTRES (SEQ ID NO:93) | KQSYYLRT (SEQ ID NO:95) | |
IMGT | QSLFNSRTRKNY (SEQ ID NO:92) | WAS (SEQ ID NO:94) | KQSYYLRT (SEQ ID NO:95) | |
7-35.6-VH | Kabat | TYAMN (SEQ ID NO:96) | RIRSKINNYATYYGDSVKD (SEQ ID NO:99) | HENYGSISWFAY (SEQ ID NO:102) |
Chothia | GFTFNTY (SEQ ID NO:97) | RSKINNYA (SEQ ID NO:100) | HENYGSISWFAY (SEQ ID NO:102) | |
IMGT | GFTFNTYA (SEQ ID NO:98) | IRSKINNYAT (SEQ ID NO:101) | VIHENYGSISWFAY (SEQ ID NO:103) | |
7-35.6-VL | Kabat | RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:104) | GTNNRAP (SEQ ID NO:106) | ALWYSNHWV (SEQ ID NO:108) |
Chothia | RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:104) | GTNNRAP (SEQ ID NO:106) | ALWYSNHWV (SEQ ID NO:108) | |
IMGT | TGAVTTSNY (SEQ ID NO:105) | GTN (SEQ ID NO:107) | ALWYSNHWV (SEQ ID NO:108) | |
8-18.1-VH | Kabat | MNTMH (SEQ ID NO:109) | YINPYSGYTKYNQIFKD (SEQ ID NO:112) | GGEGV (SEQ ID NO:115) |
Chothia | GYIFTMN (SEQ ID NO:110) | NPYSGY (SEQ ID NO:113) | GGEGV (SEQ ID NO:115) | |
IMGT | GYIFTMNT (SEQ ID NO:111) | INPYSGYT (SEQ ID NO:114) | LRGGEGV (SEQ ID NO:116) | |
8-18.1-VL | Kabat | KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:117) | LVSELGS (SEQ ID NO:119) | WQGTHFPRT (SEQ ID NO:121) |
Chothia | KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:117) | LVSELGS (SEQ ID NO:119) | WQGTHFPRT (SEQ ID NO:121) | |
IMGT | QSLLDSDGKTY (SEQ ID NO:118) | LVS (SEQ ID NO:120) | WQGTHFPRT (SEQ ID NO:121) |
4.2 人鼠嵌合抗體之生產
委託泰州市百英生物科技有限公司將表9所列之重鏈可變區序列分別克隆到包含信號肽和人源抗體IgG1之重鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1HH1(重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示),輕鏈可變區序列分別克隆到包含信號肽和對應人源抗體IgG1 κ輕鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-B1HLK(輕鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示)或包含信號肽和人源抗體IgG1之λ輕鏈恆定區之表達載體pcDNA3.4-BIHL5(輕鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO:122所示),獲得人鼠嵌合抗體之表達載體並參照實施例1所示方法表達和純化嵌合抗體。
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:122)。
實施例5 CD3人鼠嵌合抗體之鑒定
5.1 流式細胞實驗(FACS)檢測嵌合抗體與不同CD3表達細胞之結合
嵌合抗體與細胞表面CD3之結合情況,通過檢測抗體與Jurkat細胞及人T細胞結合來分析。將懸浮細胞Jurkat細胞在T-75細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期,離心棄去培養基上清,細胞沉澱用PBS洗滌2次,備用。經擴增後之人T細胞,用PBS洗滌2次,備用。對上一步之細胞進行細胞計數後將細胞沉澱用[PBS+2%(w/w)BSA]封閉液重懸至4×10
6個細胞/毫升,按50µl/孔加入到96孔FACS反應板中,按50µl/孔加入待測嵌合抗體,4℃孵育1h。用PBS緩衝液離心洗滌3次,加入50µl/孔Alexa Flour 647標記之二抗(購自Jackson Immuno,貨號:109-605-098),冰上孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌5次,用FACS(FACS CantoTM,購自BD公司)檢測和分析結果。通過軟體(CellQuest)進行資料分析,得到細胞之平均螢光密度(MFI)。再通過軟體(GraphPad Prism8)分析,進行資料擬合,計算EC50值。使用同樣之方法同時檢測嵌合抗體與內源CD3陰性之細胞MOLT4細胞之結合。分析結果如表11-1~11-4以及圖4A-4D和圖5A-5C所示,嵌合抗體可結合Jurkat細胞和人T細胞,不結合MOLT4細胞,具有很好之特異性。另外,與Jurkat細胞系相比,嵌合抗體與人T細胞之結合更能反映抗體與免疫細胞上CD3之結合情況,因此,未再檢測8-18.1嵌合抗體與Jurkat細胞之結合。
表11-1. FACS檢測嵌合抗體與Jurkat、人T細胞和MOLT4之結合反應
注:NB代表未結合。
表11-2. FACS檢測嵌合抗體與Jurkat、人T細胞和MOLT4之結合反應
注:NB代表未結合。
表11-3. FACS檢測嵌合抗體與Jurkat、人T細胞和MOLT4之結合反應
注:NB代表未結合。
表11-4. FACS檢測嵌合抗體與人T細胞和MOLT4之結合反應
注:NB代表未結合。
抗體名稱 | 人T細胞 | Jurkat | MOLT4 | ||
EC50(nM) | MFI_Max | EC50(nM) | MFI_Max | MFI_Max | |
1-22.6 | 18.15 | 15126 | 4.28 | 2083 | 124 |
SP34 | 0.43 | 43060 | 0.13 | 7022 | 570 |
F2B | 7.56 | 8775 | 8.77 | 841 | 93 |
40G5c | 0.46 | 40947 | 0.16 | 6345 | 156 |
hIgG1 | NB | 148 | NB | 151 | 126 |
抗體名稱 | 人T細胞 | Jurkat | MOLT4 | ||
EC50(nM) | MFI_Max | EC50(nM) | MFI_Max | MFI | |
5-7.13 | 0.10 | 15922 | 0.06 | 32219 | 328 |
5-40.21 | 0.99 | 11416 | 0.44 | 26740 | 146 |
6-35.22 | 3.62 | 8902 | 8.30 | 26743 | 123 |
6-44.5 | 0.62 | 13290 | 0.15 | 31689 | 225 |
40G5c | 0.70 | 12335 | 0.10 | 29471 | 168 |
F2B | 10.44 | 1985 | 20.35 | 4861 | 66 |
hIgG1 | 19.92 | 823 | NB | 490 | 68 |
抗體名稱 | 人T細胞 | Jurkat | MOLT4 | ||
MFI_Max | EC50(nM) | MFI_Max | EC50(nM) | MFI_Max | |
7-35.6 | 3804 | 4.62 | 2802 | 3.37 | 61 |
40G5c | 15415 | 0.66 | 11330 | 0.47 | 59 |
F2B | 2365 | 15.78 | 2079 | 6.18 | 58 |
hIgG1 | 195 | NB | 182 | NB | 66 |
抗體名稱 | FACS | ||
人T細胞 | MOLT4 | ||
EC50(nM) | MFI_Max | MFI_Max | |
8-18.1 | 1.58 | 8982 | 139 |
40G5c | 0.99 | 26501 | 161 |
F2B | 5.71 | 5076 | 81 |
hIgG1 | NB | 124 | 82 |
實施例6 嵌合抗體之種屬交叉結合活性檢測
6.1 FACS檢測嵌合抗體與猴CD3表達細胞之結合
將實施例2.4凍存之猴T細胞按照實施例5.1之方法進行FACS檢測與資料分析。分析結果如表12-1~12-3以及圖6A-6D所示,所有嵌合抗體與猴T細胞均有結合活性。
表12-1 FACS檢測嵌合抗體與猴T細胞之結合反應
注:NB代表未結合。
表12-2 FACS檢測嵌合抗體與猴T細胞之結合反應
注:NB代表未結合。
表12-3 FACS檢測嵌合抗體與猴T細胞之結合反應
注:NB代表未結合。
表12-4 FACS檢測嵌合抗體與猴T細胞之結合反應
抗體名稱 | 猴T細胞 | |
EC50(nM) | MFI_Max | |
1-22.6 | 5.51 | 43563 |
SP34 | 0.27 | 64682 |
hIgG1 | NB | 87 |
F2B | NB | 67 |
40G5c | 0.28 | 65994 |
抗體名稱 | 猴T細胞 | |
EC50(nM) | MFI_Max | |
5-7.13 | 0.09 | 26500 |
5-40.21 | 1.09 | 24382 |
6-35.22 | 4.18 | 18150 |
6-44.5 | 0.42 | 27135 |
40G5c | 0.63 | 24086 |
F2B | NB | 296 |
hIgG1 | NB | 1566 |
抗體名稱 | 猴T細胞 | |
MFI_Max | EC50(nM) | |
7-35.6 | 11512 | 2.74 |
40G5c | 24937 | 0.53 |
F2B | 62 | 25.53 |
hIgG1 | 195 | NB |
抗體名稱 | 猴T細胞 | ||
抗體濃度 | 100nM | 20nM | 4nM |
8-18.1 | 24771 | 22143 | 16094 |
40G5c | 41398 | 41063 | 40999 |
F2B | 61 | 60 | 63 |
hIgG1 | 170 | 80 | 64 |
實施例7 CD3嵌合抗體之功能鑒定
7.1 螢光素酶報告基因(報告測定)檢測嵌合抗體之功能
為檢測嵌合抗體啟動CD3細胞內之信號通路,將待檢測之抗體用PBS稀釋,起始濃度為133nM,按1:2梯度稀釋後,以100µl/孔加到96孔板。蓋好蓋子,37℃孵育3小時後,用PBS洗板3次。收集處於對數生長期之Jurkat-Lucia NFAT(購自InvivoGen,貨號jktl-nfat),用含2% FBS之培養基(RPMI 1640,採購於Gibco,貨號12633012)調節細胞濃度至2e6/mL,按200µL/孔將細胞加入洗好之96孔板中。37℃孵育24小時後400g離心5分鐘,取上清20µL至黑色不透明96孔檢測板中,加入50µL檢測試劑(採購於QUANTI-Luc,品牌:Invivogen,貨號:rep-qlc2),通過PerkiElmer Ensight酶標儀讀取回應值,再通過軟體(GraphPad Prism8)分析,進行資料擬合,計算EC50值。結果如表13-1~13-4及圖7A-7D所示,在報告測定中,所有抗體均能啟動Jurkat-Lucia NFAT細胞之下游信號通路。
表13-1 螢光素酶報告基因檢測人鼠嵌合抗體啟動Jurkat-Lucia NFAT細胞信號通路
表13-2 螢光素酶報告基因檢測人鼠嵌合抗體啟動Jurkat-Lucia NFAT細胞信號通路
表13-3 螢光素酶報告基因檢測人鼠嵌合抗體啟動Jurkat-Lucia NFAT細胞信號通路
表13-4 螢光素酶報告基因檢測人鼠嵌合抗體啟動Jurkat-Lucia NFAT細胞信號通路
抗體名稱 | EC50(nM) | 最大回應值(RLU) |
1-22.6 | 11.63 | 31670 |
F2B | 23.7 | 14540 |
40G5c | 1.74 | 33440 |
hIgG1 | 陰性 | 1830 |
抗體名稱 | EC50(nM) | 最大回應值(RLU) |
5-7.13 | 0.70 | 55440 |
5-40.21 | 4.79 | 46150 |
6-35.22 | 0.82 | 27020 |
6-44.5 | 1.84 | 33600 |
40G5c | 5.97 | 46910 |
F2B | 擬合差 | 12040 |
hIgG1 | 陰性 | 2330 |
抗體名稱 | EC50(nM) | 最大回應值(RLU) |
7-35.6 | 11.81 | 8570 |
40G5c | 5.04 | 14320 |
F2B | 7.41 | 6560 |
hIgG1 | 陰性 | 4250 |
抗體名稱 | EC50(nM) | 最大回應值(RLU) |
8-18.1 | 11.85 | 10390 |
40G5c | 22.49 | 25450 |
F2B | 擬合差 | 8220 |
hIgG1 | 陰性 | 3780 |
實施例8 CD3抗體親和力測定
8.1 嵌合抗體與人CD3ε-His蛋白親和力測定
使用Protein A晶片(GE Helthcare;29-127-558)捕獲抗人CD3嵌合抗體。樣品和運行緩衝液是HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20) (GE Healthcare;BR-1006-69)。流經池設置為25℃。樣品塊設置為16℃。兩者都用運行緩衝液預處理。在每一個迴圈中,首先用Protein A晶片捕獲待測抗體,然後注入單一濃度之CD3ε抗原蛋白(購自北京義翹神州科技有限公司,貨號:10977-H08H),記錄抗體和抗原蛋白之結合和解離過程,最後用甘胺酸溶液(pH1.5,GE Helthcare; BR-1003-54 )完成晶片再生。通過注射溶液中不同濃度之重組人CD3ε-ECD His持續240秒來測量結合,其中流速為30μL/分鐘,從200nM起始 (測試之實際濃度見詳細結果),以1:1稀釋,總共5個濃度。監測解離相長達600秒,並通過從樣品溶液切換到運行緩衝液觸發。通過用10mM甘胺酸溶液(pH1.5)以30μL/分鐘之流速洗滌30秒,再生表面。通過減去從山羊抗人Fc表面獲得之回應來校正本體折射率(Bulk refractive index)差異。也減去空白注射(=雙重參照)。為了計算表觀KD和其他動力學參數,使用Langmuir 1:1模型。嵌合抗體與人CD3ε-His蛋白之結合速率(Ka)、解離速率(Kd)及結合親和力(KD)如表14所示。嵌合抗體與人CD3之親和力在0.1nM到10nM之間。
表14 SPR(biacore)檢測嵌合抗體與人CD3ε之親和力
抗體名稱 | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) |
1-22.6 | 1.27E+05 | 6.99E-04 | 5.51E-09 |
5-40.21 | 6.86E+05 | 3.79E-04 | 5.53E-10 |
5-7.13 | 7.85E+05 | 2.70E-04 | 3.45E-10 |
6-44.5 | 5.81E+05 | 2.59E-04 | 4.45E-10 |
7-35.6 | 2.72E+05 | 2.61E-04 | 9.59E-10 |
8-18.1 | 4.45E+05 | 2.41E-04 | 5.42E-10 |
40G5c | 1.58E+06 | 3.21E-04 | 2.03E-10 |
實施例9 抗體之人源化設計
鼠源抗體6-44.5、6-35.22、7-35.6、8-18.1、5-7.13、5-40.21和1-22.6之人源化設計:通過比對IMGT(http://imgt.cines.fr)人類抗體重鏈輕鏈可變區種系基因資料庫,挑選合適之序列作為鼠源抗體之人源化輕鏈範本和人源化重鏈範本。首先,將鼠源抗體之CDR分別移植到其人源範本之FR中,形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之可變區序列。根據抗體之三維結構類比,將人源化抗體之FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應之胺基酸,以保證原有之親和力。另外,根據具體需要,將人源化抗體之CDR區序列中之部分胺基酸突變為人源範本對應之同源胺基酸以提高人源化程度,或者突變為其他胺基酸以優化分子之理化性質(例如對容易發生脫醯胺修飾、糖基化修飾以及異構化之位點就行hot spot突變),得到人源化抗體。本實施例抗體之CDR區由Kabat編號系統確定並注釋(http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)。其中鼠源抗體對應之人源化範本參見表15,最終人源化抗體對應之VL和VH參見表16,具體序列參見表17,部分人源化抗體序列之CDR(發生hot spot突變)參見表18,其餘CDR序列在人源化前後未發生變化,此處未再次列出。參照實施例4.2生產人源化抗體。
表15 鼠源抗體對應之人源化範本
表16 人源化抗體對應之VL和VH
表17 人源化抗體VL和VH序列
表18 部分人源化抗體之CDR序列
注:帶字元邊框為hot spot修復突變位點。
鼠源抗體克隆號 | 人源化輕鏈範本 | 人源化重鏈範本 |
6-44.5 | IGKV2-40*01 + IGKJ4*01 | IGHV1-69*02 + IGHJ6*01 |
6-35.22 | IGKV4-1*01 + IGKJ2*01 | IGHV3-30*01 + IGHJ6*01 |
7-35.6 | IGLV7-43*01 + IGLJ2*01 | IGHV3-73*01 + IGHJ1*01 |
8-18.1 | IGKV2-30*01 + IGKJ4*01 | IGHV1-3*01 + IGHJ6*01 |
5-7.13 | IGKV4-1*01,IGKV2-40*01和IGKJ4*01 | IGHV1-3*01和IGHJ6*01 |
5-40.21 | IGKV4-1*01,IGKV2-40*01和IGKJ4*01 | IGHV1-3*01和IGHJ6*01 |
1-22.6 | IGKV2-40*01,IGKV4-1*01和IGKJ4*01 | IGHV7-4-1*02和IGHJ6*01 |
人源化抗體 | VL | VH |
6-44.5-H1-L2 | 6-44.5-L2(SEQ ID NO:123) | 6-44.5-H1(SEQ ID NO:124) |
6-35.22-H1-L1 | 6-35.22-L1(SEQ ID NO:125) | 6-35.22-H1(SEQ ID NO:126) |
7-35.6-H2-L3 | 7-35.6-L3(SEQ ID NO:127) | 7-35.6-H2(SEQ ID NO:128) |
8-18.1-H1-L2 | 8-18.1-L2(SEQ ID NO:129) | 8-18.1-H1(SEQ ID NO:130) |
5-7.13-H1a-L2 | 5-7.13-L2(SEQ ID NO:131) | 5-7.13-H1a(SEQ ID NO:132) |
5-40.21-H3-L1 | 5-40.21-L1(SEQ ID NO:133) | 5-40.21-H3(SEQ ID NO:134) |
1-22.6-1-H2a-L2a | 1-22.6-1-L2a(SEQ ID NO:135) | 1-22.6-1-H2a(SEQ ID NO:136) |
編號 | 序列 |
6-44.5-L2 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYYLRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:123) |
6-44.5-H1 | EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGHTFSSHIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPNNDRTEYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGEAYYSNSLYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:124) |
6-35.22-L1 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSRSRKNYLAWYQQKPGQTPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYYLYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:125) |
6-35.22-H1 | EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVAMSRNKAKGHTIEYSSSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTYESYDGYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:126) |
7-35.6-L3 | ETVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFTGLIGGTNNRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:127) |
7-35.6-H2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKINNYATYYGDSVKDRFTISRDDSKNTFYLQMNSLKTEDTAVYYCVIHENYGSISWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:128) |
8-18.1-L2 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSELGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:129) |
8-18.1-H1 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTMNTMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYSGYTKYNQIFKDRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCLRGGEGVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:130) |
5-7.13-L2 | DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCIQSYYLRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:131) |
5-7.13-H1a | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWVHWVRQAPGQRLEWMGNINPSDGVTNYNEKFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDAYGQYYFDNWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:132) |
5-40.21-L1 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSYNLRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:133) |
5-40.21-H3 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNTYPGSGSTNYDEKFKSRVTITVDSSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDRYGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:134) |
1-22.6-1-L2a | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQLILHSSGNTYLEWYQQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFQGSHFPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:135) |
1-22.6-1-H2a | EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKTSGYTFTSYGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARLKNNPFVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:136) |
抗體名稱 | 定義方式 | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
1-22.6-1-H2a(hotspot修復) | Kabat | SYGMS (SEQ ID NO:31) | WINTYSGVPTYA QDFKG (SEQ ID NO:137) | LKNNPF V(SEQ ID NO:138) |
Chothia | GYTFTSY (SEQ ID NO:32) | NTYSGV (SEQ ID NO:35) | LKNNPF V(SEQ ID NO:138) | |
IMGT | GYTFTSYG (SEQ ID NO:33) | INTYSGVP (SEQ ID NO:36) | ARLKNNPF V(SEQ ID NO:139) | |
1-22.6-1-L2a(hot spot修復) | Kabat | RSSQLILHS SGNTYLE (SEQ ID NO:140) | KVSNRFS (SEQ ID NO:41) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) |
Chothia | RSSQLILHS SGNTYLE (SEQ ID NO:140) | KVSNRFS (SEQ ID NO:41) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) | |
FQGSHFPWT FQGSHFPWT | IMGT | QLILHS SGNTY (SEQ ID NO:141) | KVS (SEQ ID NO:42) | FQGSHFPWT (SEQ ID NO:43) |
5-7.13-H1a(hot spot修復) | Kabat | SYWVH (SEQ ID NO:44) | NINPSDGVTNYNEKFKS (SEQ ID NO:47) | DAYGQYYFD N(SEQ ID NO:142) |
Chothia | GYTFTSY (SEQ ID NO:45) | NPSDGV (SEQ ID NO:48) | DAYGQYYFD N(SEQ ID NO:142) | |
IMGT | GYTFTSYW (SEQ ID NO:46) | INPSDGVT (SEQ ID NO:49) | TRDAYGQYYFD N(SEQ ID NO:143) |
實施例10 人源化抗體與人CD3ε之結合能力鑒定
10.1 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體與CD3蛋白之結合
為檢測人源化抗體與CD3蛋白之結合活性,將CD3蛋白用PBS稀釋到終濃度1µg/mL,然後以50µL/孔加到96孔ELISA板,用塑膠膜封好4℃孵育過夜,第二天用PBS洗板2次,加入封閉液[PBS+2%(v/v)BSA]室溫封閉2小時。倒掉封閉液,加入起始濃度100nM,1:10梯度稀釋之抗體或陰性對照抗體50µL/孔。37℃孵育2小時後,用PBS洗板3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記之二抗(購自Jackson,貨號:309-035-088),37℃孵育半小時後,用PBS洗板5次。加入TMB底物50µl/孔,室溫孵育10分鐘後,加入終止液(1.0N HCl)50µL/孔。用ELISA讀板機(Multimode Plate Reader,EnSight,購自Perkin Elmer)讀取OD450nm數值。實驗結果如圖8A-8G、圖9A-9G和表19所示。其中IgG對照為hIgG1,40G5c、7221G20和F2B為陽性對照。表中之資料為OD450nm值。結果說明,所有人源化抗體與CD3ε蛋白或CD3ε/δ蛋白在ELISA實驗中均有結合活性。
表19-1 人源化抗體與人CD3ε/δ、CD3ε蛋白結合ELISA水準之結合反應
表19-2 人源化抗體與人CD3ε/δ、CD3ε蛋白結合ELISA水準之結合反應
表19-3 人源化抗體與人CD3ε/δ、CD3ε蛋白結合ELISA水準之結合反應
抗體名稱 | 人CD3ε/δ | 人CD3ε | ||
max_OD450 | EC50(nM) | max_OD450 | EC50(nM) | |
6-35.22-H1-L1 | 2.93 | 0.53 | 3.10 | 3.37E-02 |
7-35.6-H2-L3 | 3.15 | 0.32 | 3.12 | 3.95E-02 |
8-18.1-H1-L2 | 3.16 | 0.22 | 3.11 | 3.63E-02 |
5-7.13-H1a-L2 | 3.01 | 0.19 | 3.16 | 2.06E-02 |
40G5c | 2.83 | 0.36 | 3.09 | 1.18E-01 |
F2B | 0.16 | 陰性 | 0.10 | 陰性 |
7221G20 | 1.31 | 23.45 | 0.15 | 陰性 |
hIgG1 | 0.09 | 陰性 | 0.11 | 陰性 |
抗體名稱 | 人CD3ε/δ | 人CD3ε | ||
max_OD450 | EC50(nM) | max_OD450 | EC50(nM) | |
5-40.21-H3-L1 | 3.15 | 0.28 | 1.53 | 0.13 |
1-22.6-H2a-L2a | 3.29 | 0.45 | 1.49 | 0.10 |
40G5c | 2.83 | 0.36 | 1.49 | 0.22 |
F2B | 0.16 | 陰性 | 0.05 | 陰性 |
7221G20 | 1.31 | 23.45 | 0.05 | 陰性 |
hIgG1 | 0.09 | 陰性 | 0.09 | 陰性 |
抗體名稱 | 人CD3ε/δ | 人CD3ε | ||
max_OD450 | EC50(nM) | max_OD450 | EC50(nM) | |
6-44.5-H1-L2 | 3.05 | 0.03 | 2.70 | 0.09 |
40G5c | 2.83 | 0.36 | 2.59 | 0.22 |
F2B | 0.16 | 陰性 | 0.16 | 陰性 |
7221G20 | 1.31 | 23.45 | 0.06 | 陰性 |
hIgG1 | 0.09 | 陰性 | 0.09 | 陰性 |
10.2 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與CD3表達細胞之結合
收集擴增後之人PBMC細胞,按照實施例5.1之方法進行FACS檢測與資料分析。分析結果如圖10A-10G以及表20所示,其中IgG對照為hIgG1,40G5c、I2C、7221G20和F2B為陽性對照。結果表明,人源化抗體與人T細胞表面之CD3有特異性結合。
表 20 人源化抗體與CD3表達陽性與陰性細胞FACS水準之結合反應
抗體名稱 | 人T細胞 | MOLT4 | |
max_MFI | EC50(nM) | max_MFI | |
6-35.22-H1-L1 | 11349 | 49.66 | 80 |
1-22.6-1-H2a-L2a | 15865 | 11.04 | 77 |
7-35.6-H2-L3 | 10003 | 9.45 | 80 |
8-18.1-H1-L2 | 11482 | 7.05 | 124 |
5-40.21-H3-L1 | 18044 | 1.65 | 81 |
5-7.13-H1a-L2 | 35913 | 1.52 | 149 |
6-44.5-H1-L2 | 33953 | 0.43 | 96 |
40G5c | 33491 | 2.09 | 110 |
I2C | 38011 | 1.32 | 244 |
7221G20 | 20875 | 4.72 | 72 |
F2B | 9273 | 7.03 | 70 |
hIgG1 | 2249 | 陰性 | 76 |
10.3 表面等離子共振(SPR)檢測抗體與人CD3ε蛋白之親和力
使用表面等離子共振(SPR)方法來測定人源化抗體與CD3ε蛋白之親和力,實驗方法如下:採用Protein A晶片(GE Helthcare;29-127-558)來捕獲抗人CD3抗體,運行緩衝液是HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20) (GE Healthcare;BR-1006-69)。流經池設置為25℃。樣品塊設置為16℃。兩者都用運行緩衝液預處理。在每一個迴圈中,首先用Protein A晶片捕獲待測抗體,然後注入單一濃度之CD3ε抗原蛋白,記錄抗體和抗原蛋白之結合和解離過程,最後用Glycine pH1.5 (GE Helthcare; BR-1003-54 )完成晶片再生。通過注射溶液中不同濃度之重組人CD3ε持續240秒來測量結合,其中流速為30μL/分鐘,從200nM起始(測試之實際濃度見詳細結果),以1:1稀釋,總共5個濃度。監測解離相長達600秒,並通過從樣品溶液切換到運行緩衝液觸發。通過用10mM甘胺酸溶液(pH 1 .5)以30μL/分鐘之流速洗滌30秒,再生表面。通過減去從山羊抗人Fc表面獲得之回應來校正本體折射率(Bulk refractive index)差異,同時減去空白注射(=雙重參照)。為了計算表觀KD值和其他動力學參數,使用Langmuir 1:1模型。人源化抗體與人CD3ε蛋白之結合速率(Ka)、解離速率(Kd)及結合親和力(KD)如表21~22所示,所有檢測之人源化抗體與人CD3ε之親和力在1nM左右,與人CD3ε/δ之親和力在10-200nM之間。
表21 SPR檢測人源化抗體與人CD3ε蛋白結合之親和力
表22 SPR檢測人源化抗體與人CD3ε/δ蛋白結合之親和力
抗體名稱 | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) |
6-44.5-H1-L2 | 4.66E+05 | 3.11E-04 | 6.69E-10 |
7-35.6-H2-L3 | 2.86E+05 | 3.69E-04 | 1.29E-09 |
1-22.6-1-H2a-L2a | 8.36E+04 | 3.05E-04 | 3.64E-09 |
5-7.13-H1a-L2 | 2.66E+05 | 2.14E-04 | 8.06E-10 |
5-40.21-H3-L1 | 2.60E+05 | 4.85E-04 | 1.87E-09 |
8-18.1-H1-L2 | 2.74E+05 | 2.49E-04 | 9.08E-10 |
抗體名稱 | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) |
1-22.6-1-H2a-L2a | 1.19E+05 | 1.34E-02 | 1.13E-07 |
5-7.13-H1a-L2 | 3.58E+05 | 9.83E-03 | 2.74E-08 |
5-40.21-H3-L1 | 1.61E+05 | 1.84E-02 | 1.15E-07 |
6-44.5-H1-L2 | 4.91E+05 | 3.39E-02 | 6.90E-08 |
8-18.1-H1-L2 | 4.69E+05 | 3.17E-02 | 6.74E-08 |
7-35.6-H2-L3 | 2.31E+05 | 3.35E-02 | 1.45E-07 |
40G5c | 1.53E+06 | 3.27E-02 | 2.13E-08 |
I2C | 2.50E+05 | 1.35E-03 | 5.39E-09 |
實施例11 人源化抗體交叉結合活性之鑒定
11.1 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體與猴CD3蛋白之結合
為了檢測人源化抗體與猴CD3蛋白之結合活性,將CD3蛋白用PBS稀釋到終濃度1µg/mL,然後以50µl/孔加到96孔ELISA板根據10.1之ELISA檢測方法檢測人源化抗體與猴CD3蛋白之結合反應,其中IgG對照為hIgG1,40G5c、I2C、7221G20和F2B為陽性對照。分析結果如圖11A-11G、圖12A-12G以及表23所示,表中之資料為OD450nm值。結果說明,所有人源化抗體與猴CD3蛋白在ELISA實驗中有結合活性。
表23 人源化抗體與猴CD3ε/δ、CD3ε蛋白結合ELISA水準之結合反應
抗體名稱 | 猴CD3 ε/δ | 猴CD3 ε | ||
max_OD450 | EC50(nM) | max_OD450 | EC50(nM) | |
6-35.22-H1-L1 | 2.94 | 7.82E-02 | 3.08 | 1.18E-02 |
1-22.6-1-H2a-L2a | 3.23 | 1.24E-02 | 3.09 | 1.06E-04 |
7-35.6-H2-L3 | 3.13 | 5.52E-02 | 3.01 | 8.59E-03 |
8-18.1-H1-L2 | 3.16 | 1.93E-02 | 3.10 | 4.75E-03 |
5-40.21-H3-L1 | 3.16 | 4.56E-03 | 2.84 | 4.67E-04 |
5-7.13-H1a-L2 | 3.08 | 3.32E-03 | 2.99 | 2.63E-03 |
6-44.5-H1-L2 | 3.07 | 2.25E-04 | 2.84 | 9.47E-06 |
40G5c | 2.52 | 7.54E-02 | 2.96 | 1.28E-01 |
I2C | 2.42 | 3.60E-02 | 2.65 | 7.87E-02 |
F2B | 0.05 | 陰性 | 0.06 | 陰性 |
7221G20 | 0.11 | 陰性 | 0.23 | 陰性 |
hIgG1 | 0.15 | 陰性 | 0.16 | 陰性 |
11.2 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與猴T細胞之結合
收集經擴增之猴T細胞,按照實施例5.1之方法進行FACS檢測與資料分析。分析結果如圖13A-13G以及表24所示,其中IgG對照為hIgG1,40G5c、I2C、7221G20和F2B為陽性對照。結果表明,所有人源化抗體與猴T細胞表面之CD3有特異性結合反應。
表24 人源化抗體與猴T細胞之結合
抗體名稱 | 猴T細胞 | |
max_MFI | EC50(nM) | |
6-35.22-H1-L1 | 9957 | 35.42 |
1-22.6-1-H2a-L2a | 12287 | 6.92 |
7-35.6-H2-L3 | 10162 | 7.84 |
8-18.1-H1-L2 | 11751 | 2.84 |
5-40.21-H3-L1 | 17764 | 0.73 |
5-7.13-H1a-L2 | 25448 | 0.92 |
6-44.5-H1-L2 | 24775 | 0.17 |
40G5c | 24131 | 0.89 |
I2C | 28242 | 1.10 |
7221G20 | 9140 | 4.71 |
F2B | 72 | 陰性 |
hIgG1 | 74 | 陰性 |
實施例12 人源化抗體之功能鑒定
為檢測人源化抗體啟動CD3細胞內之信號通路,將待檢測之抗體用含10% FBS之RPMI 1640稀釋,起始濃度1*2µg/mL,1:5梯度稀釋,然後以100µl/孔加到96孔圓底細胞培養板。復甦凍存之PBMC(購自奧賽爾斯),調節細胞濃度至1e6/mL,將細胞加入加有抗體之細胞培養板,100µL每孔。在37℃之培養箱中孵育24小時後,用PBS緩衝液離心洗滌1次。加入配製好之FACS染色試劑50µL每孔(抗-CD25-PE,購自Biolegend,貨號302602;抗-CD69-FITC購自BD,貨號555530),4℃孵育45分鐘,用PBS緩衝液離心洗滌3次,用FACS(FACS Canto,購自BD公司)檢測和分析結果。通過軟體(CellQuest)進行資料分析,得到細胞之平均螢光密度(MFI)。再通過軟體(GraphPad Prism8)分析。分析結果如圖14A-14E所示,所有人源化抗體對人PBMC具有不同程度之啟動作用。
圖1為Jurkat細胞與SP34、OKT3抗體之FACS檢測結果。
圖2為SP34抗體檢測人T細胞表面CD3之表達。
圖3為SP34抗體檢測猴T細胞表面CD3之表達。
圖4A-圖4D為FACS檢測人鼠嵌合抗體與人T細胞之結合。
圖5A-圖5C為FACS檢測人鼠嵌合抗體與Jurkat細胞之結合。
圖6A-圖6D為FACS檢測人鼠嵌合抗體與猴T細胞之結合。
圖7A-圖7D為螢光素酶報告基因檢測人鼠嵌合抗體啟動Jurkat細胞信號通路。
圖8A-圖8G為ELISA檢測人源化抗體與人CD3ε/δ蛋白結合反應。
圖9A-圖9G為ELISA檢測人源化抗體與人CD3ε蛋白結合反應。
圖10A-圖10G為FACS檢測人源化抗體與人T細胞結合反應。
圖11A-圖11G為ELISA檢測人源化抗體與猴CD3ε/δ結合反應。
圖12A-圖12G為ELISA檢測人源化抗體與猴CD3ε結合反應。
圖13A-圖13G為FACS檢測人源化抗體與猴T細胞之結合反應。
圖14A-圖14E為FACS檢測人源化抗體啟動T細胞之反應。
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Claims (20)
- 一種特異性結合人CD3之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區,所述重鏈可變區包含HCDR1-3,所述輕鏈可變區包含LCDR1-3,所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3選自表10或表18; 優選地,所述HCDR1包含SEQ ID NO:31-33、44-46、57-59、70-72、83-85、96-98和109-111中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列;和 所述HCDR2包含SEQ ID NO:34-36、137、47-49、60-62、73-75、86-88、99-101和112-114中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列;和 所述HCDR3包含SEQ ID NO:37-38、138-139、50-51、142-143、63-64、76-77、89-90、102-103和115-116中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列;和/或 所述LCDR1包含SEQ ID NO:39-40、140-141、52-53、65-66、78-79、91-92、104-105和117-118中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列;和 所述LCDR2包含SEQ ID NO:41-42、54-55、67-68、80-81、93-94、106-107和119-120中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列;和 所述LCDR3包含SEQ ID NO:43、56、69、82、95、108和121中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多3個胺基酸突變之序列; 更優選地,所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3根據Kabat、Chothia或IMGT方式確定。
- 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、124、126、128、130、132、134和136中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多15個胺基酸突變之序列;和/或 所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、123、125、127、129、131、133和135中任一項所示之序列,或與其相比具有至少70%同一性或至多15個胺基酸突變之序列。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述至少70%之同一性為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性;和/或所述至多3個突變為至多3、2、1或0個突變;和/或所述至多15個突變為至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個突變;優選地,所述突變為插入、缺失或替換;更優選地,所述替換為保守胺基酸替換;最優選地,所述突變為回復突變或熱點突變。
- 如請求項1-3中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 18所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 20所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 21所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 22所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 23所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 24所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 25所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 26所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 30所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 124所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 123所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 126所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 125所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 128所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 127所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 130所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 129所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 132所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 131所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 134所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 133所示;或者 所述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 136所示,以及所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 135所示。
- 如請求項1-4任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區; 任選地,所述重鏈恆定區選自IgG,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4;優選地,所述重鏈恆定區選自人IgG,例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4;更優選地,所述重鏈恆定區選自SEQ ID NO:13;和/或 所述輕鏈恆定區選自κ鏈或λ鏈; 優選地,所述輕鏈恆定區選自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:122。
- 如請求項1-5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段選自:單克隆抗體、多克隆抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體之片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、雙抗體和單域抗體。
- 如請求項1-6中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段與治療劑或示蹤劑綴合;優選地,所述治療劑選自:放射性同位素、化療藥和免疫調節劑;和/或所述示蹤劑選自:放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑和光敏劑。
- 如請求項1-7中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段還結合猴CD3。
- 如請求項1-8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,其中所述CD3選自CD3ε亞基和包含CD3ε亞基之二聚體,例如,CD3ε/δ二聚體。
- 一種多特異性抗原結合分子,其中所述多特異性抗原結合分子至少包括第一抗原結合模組和第二抗原結合模組,所述第一抗原結合模組包含請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,和/或所述第二抗原結合模組結合與所述第一抗原結合模組不同之其他靶點或結合相同靶點之不同表位;優選地,所述其他靶點選自腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA);任選地,所述多特異性抗原結合分子為雙特異性T細胞接合器(BiTE)。
- 一種分離之核酸分子,其中所述核酸分子編碼請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、或請求項10所述之多特異性抗原結合分子;任選地,所述核酸分子還編碼嵌合抗原受體。
- 一種載體,其包含請求項11所述之核酸分子。
- 一種細胞,其包含請求項12所述之載體。
- 一種免疫效應細胞,其表達嵌合抗原受體,和/或表達請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或請求項10所述之多特異性抗原結合分子; 優選地,所述免疫效應細胞選自:T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、自然殺手T細胞(NKT細胞)、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和肥大細胞;更優選地,所述T細胞選自:細胞毒性T細胞、調節性T細胞和輔助性T細胞;和/或 優選地,所述免疫效應細胞為自體免疫效應細胞或同種異體免疫效應細胞。
- 一種製備請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段,或請求項10所述之多特異性抗原結合分子之方法,其中所述方法包括:(1)培養請求項13所述之細胞;和/或(2)分離所述細胞表達之抗體或其抗原結合片段,或多特異性抗原結合分子。
- 一種製備請求項14所述之免疫效應細胞之方法,其中所述方法包括:(1)將a.編碼所述嵌合抗原受體之核酸分子和b.編碼請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或請求項10所述之多特異性抗原結合分子之核酸分子導入初始之免疫效應細胞;和/或(2)使導入上述核酸分子之免疫效應細胞表達嵌合抗原受體和請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或請求項10所述之多特異性抗原結合分子。
- 一種藥物組合物,其中所述藥物組合物包含請求項1-9中任一項所述抗體或其抗原結合片段、請求項10所述之多特異性抗原結合分子、請求項11所述之核酸分子、請求項12所述之載體、請求項13所述之細胞、請求項14所述之免疫效應細胞或根據請求項15或16所述方法製備得到之產品;優選地,所述組合物還包含藥學上可接受之運載體、稀釋劑或助劑。
- 如請求項1-9中任一項所述抗體或其抗原結合片段、請求項10所述之多特異性抗原結合片段、請求項11所述之核酸分子、請求項12所述之載體、請求項13所述之細胞、請求項14所述之免疫效應細胞、根據請求項15或16所述方法製備得到之產品、或請求項17所述之藥物組合物,在製備治療腫瘤或癌症之藥物中之用途; 優選地,所述腫瘤或癌症選自血液瘤和實體瘤;更優選地,所述血液瘤選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤;和/或所述實體瘤選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌和肝癌。
- 一種治療腫瘤或癌症之方法,其中所述方法包括向受試者施用有效量之藥物,所述藥物包括如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、請求項10所述之多特異性抗原結合分子、請求項11所述之核酸分子、請求項12所述之載體、請求項13所述之細胞、請求項14所述之免疫效應細胞、根據請求項15或16所述方法製備得到之產品或請求項17所述之藥物組合物; 優選地,所述腫瘤或癌症選自血液瘤和實體瘤;更優選地,所述血液瘤選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤;和/或所述實體瘤選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌和肝癌。
- 如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、請求項10所述之多特異性抗原結合分子、請求項11所述之核酸分子、請求項12所述之載體、請求項13所述之細胞、請求項14所述之免疫效應細胞、根據請求項15或16所述方法製備得到之產品或請求項17所述之藥物組合物,其用於治療腫瘤或癌症; 優選地,所述腫瘤或癌症選自血液瘤和實體瘤;更優選地,所述血液瘤選自:急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、急變期CML、脊髓發育不良綜合征(MDS)、急性B淋巴細胞白血病(B‑ALL)、急性T淋巴細胞白血病(TALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合征、毛細胞白血病(HCL)、母細胞漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、包括套細胞淋巴瘤(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)之非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤;和/或所述實體瘤選自:卵巢癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、結直腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、膠質瘤、乳腺癌和肝癌。
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