KR20200013233A

KR20200013233A - 신규 항 cd3 항체

Info

Publication number: KR20200013233A
Application number: KR1020197035542A
Authority: KR
Inventors: 테 군데; 크리스티안 헤스; 세바스티안 메이어; 알렉산더 시모낭; 테디 벨트라메티; 데이비드 우레흐
Original assignee: 누맙 세러퓨틱스 아게
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2020-02-06
Also published as: JP7247110B2; MA49250A; US20220403028A1; JP2020522260A; CA3064163A1; US20200115449A1; AU2018280681A1; US11319371B2; CN110691789A; EP3634998A1; KR102651965B1; IL271128A; IL271128B1

Abstract

본 발명은 인간 CD3 도메인, 구체적으로 CD3ε 도메인에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.

Description

신규 항 CD3 항체

본 발명은 인간 CD3, 구체적으로 CD3ε 도메인에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.

본 발명은 높은 친화성과 큰 효능을 함께 보이는 신규 항 CD3 항체, 구체적으로 CD3ε 도메인에 대해 생성된 항체, 구체적으로 특이성과 교차 반응성 프로필이 개선된 신규 항체에 관한 것이다.

T 세포 수용체 또는 TCR은 T 림프구(또는 T 세포) 표면상에서 발견되고, 항원 제시 세포(APC) 표면상에 있는 주조직적합성복합체(MHC) 분자와 결합한 항원을 인지하는데 기여하는 분자이다. TCR과 항원 사이의 결합은 비교적 낮은 친화성으로 일어난다. TCR이 항원 및 MHC와 결합하게 될 때, T 림프구는 연관 효소들, 공 수용체, 특화된 부속 분자들에 의해 매개되고, 그 결과 전사 인자들을 활성화 또는 방출시키는 일련의 생화학적 과정들을 통해 활성화된다.

TCR은 변별적 사슬 3개(γ, δ 및 ε)(포유류)와, ζ2(CD247) 사슬 또는 ζ/η 사슬 중 어느 하나를 가지는 기타 분자, 예컨대 CD3과 결합한다. 이러한 부속 분자들은 경막 영역을 가지고, TCR로부터 세포로 신호를 전파하는 데 있어 핵심적인 역할을 하는데; TCR의 세포질 미부는 매우 짧고, 이 점은 TCR이 신호전달에 관여할 것 같지 않도록 만든다. CD3 사슬들과 ζ 사슬들은 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체라고 공지된 분자를 형성한다.

CD3ε은 임의의 T 세포 표면 상에 발현되는 I형 경막 단백질이다. 이는 T 세포 수용체(TCR) 복합체 형성에 관여하고, 이 복합체의 다른 도메인들과 상호작용한다. 이러한 상호작용 파트너의 하나로서는 CD3ε과 화학양론상 1:1로 결합하는 CD3γ가 있다(De la Hera et al, J. Exp.Med.1991; 173: 7-17). 항원 제시 세포(APC) 표면상 MHC-펩티드 복합체와 TCR의 결합과, 이후 APC를 따라 진행되는 T 세포의 이동은 TCR 복합체의 임의의 회전을 초래하고, 그 결과 CD3ε 및 CD3γ는 서로 급격하게 분리되는데, 이는 효율적인 TCR 신호전달과 이로 인한 T 세포 활성화에 필요한 과정인 것으로 생각된다. CD3ε에 대한 임의의 항체는 TCR 신호전달을 유도하는 것으로 입증되었으나, 다른 것들은 그렇지 않았다. TCR 활성화 항체는 통상 CD3ε상에 노출된 에피토프와 결합하는 반면에, 다른 비자극성 항체들은 CD3ε 및 CD3γ 사이의 계면과 결합하거나, 또는 동반되어 CD3ε 및 CD3γ와 결합함으로써 CD3ε 및 CD3γ의 상대적 치환을 방해할 수 있음이 입증되었다(Kim et al, JBC.2009; 284: 31028-31037).

펩티드-MHC 복합체는 낮은 친화성과 빠른 해리 속도(off-rate)로 TCR과 결합한다는 사실은 잘 정립되어 있다(Matsui et al, Science.1991; 254: 1788-1791; Weber et al, Nature.1992; 356: 793-796). 이처럼 낮은 친화성은 소수의 펩티드-MHC 복합체가 결합과 해리를 반복하면서 다수의 TCR을 순차적으로 자극하는 것을 허용하는데 중요함이 시사된 바 있다(Valitutti et al, Nature.1995; 375: 148-151). 이와 같은 순차적 자극은 시간이 경과함에 따라 신호전달을 유지하다가, 결국에는 T 세포가 활성화 역치에 도달하도록 허용함에 중요하다(Valitutti et al, Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia et al, Cell. 1999; 96: 1-4). 이 개념은, 고 친화성 항 CD3 항체가 TCR을 화학양론상 1:1로 자극하므로, 이 고 친화성 항 CD3 항체는 펩티드-MHC 복합체와 비교되었을 때 T 세포를 효율적으로 자극하지 못한다는 발견에 의해 뒷받침되고(Viola et al, Science 1996; 273: 104-106), 이 점은, 저 친화성 항체가 반복적으로 CD3ε과 해리되었다가 다시 결합하는 능력으로 말미암아 TCR 신호전달을 통해 T 세포를 자극함에 있어 이 항체가 더욱 유효할 수 있음을 암시한다. 실상, 항 CD3ε 항체 TR66의 유도체 3개(모두 상이한 친화성으로 결합함)의 직접적인 비교에서, 중간 정도의 친화성을 가지는 야생형 TR66은 이의 유도체들(즉 야생형 TR66보다 더 높은 친화성 또는 더 낮은 친화성을 가지는 유도체들)과 비교되었을 때 T 세포 활성화에서 최고의 효율을 보였다(Bortoletto et al, J. Immuno.2002;32:3102-3107). 그러므로 TR66의 K_D와 거의 비슷한 K_D는 T 세포 자극에 이상적이다. TR66의 친화성은 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술뿐만 아니라 유세포분석법을 이용하여 확정되었으며, 그 결과 평형 해리 상수는 각각 2.6 x 10^-7 M(Moore et al, Blood.2011; 117: 4542-4551) 및 1.0 x 10^-7 M(Amann et al, Cancer Res. 2008; 68: 143-151)임이 확인되었다. 이와 함께, 친화성이 10^-8 M 미만(미국 특허 제7,112,324호)인 항 CD3 항체를 사용할 것이 권장되었고, 인간 치료용으로서 알려진 T 세포 자극성 항체는 인간 CD3ε에 대한 친화성과 동일한 범위의 친화성으로 인간 CD3ε과 결합한다. 따라서 일련의 TCR 자극에 관한 이론에 따르고, 항 CD3ε 항체에 대하여 공지된 결과들과 일치되게, 공지된 항체의 친화성보다 유의미하게 더 높은 친화성을 가지는 모노클로날 항체는 T 세포에 대하여 더 강력한 자극인자인 것으로 예상되지만, 그 반대로 더 약한 활성인자인 것으로 예상된다.

CD3ε에 대한 항체들로서 공지된 것들 중 몇몇은 동물을 T 세포 제제로 면역화한 다음, 소위 하이브리도마 방법에 의해 모노클로날 항체를 단리함으로써 제조되었다. 이 접근법의 약점은, 한편으로 동물에서 외래 (인간) T 세포의 다양한 항원에 대해 비선택적 면역 반응을 일으키고, 다른 한편으로는 하이브리도마 방법의 효율이 떨어져, T 세포 자극 활성을 가지는 모노클로날 항체가 동정될 확률이 감소한다는 점인데, 이점 또한 이러한 효현성 항체가 전체 항 CD3ε 항체중 소수에 해당할 수 있기 때문이다. 표적 에피토프에 전반적으로 분포하는 선형 펩티드에 의한 면역화는, 면역 반응의 선택성을 증가시키지만, 원산 전장 CD3ε을 인지하지 못하거나, 최적이 아닌 TCR 자극을 초래할 수 있는 항체를 만들 수 있다.

동물을 다른 I형 경막 단백질로 면역화하기 위해, 정제된 세포외 도메인(ECD)을 사용하는 것이 특히 유용할 수 있다. 그러나 CD3ε의 정제된 ECD는 응집되는 경향이 있으며, 응집체는 원산 단백질에 비해 변경된 구조를 가질 수 있다. 또한 이 접근법은 우선적으로 항체가 CD3ε 및 CD3γ 사이 계면에 결합하는 것을 유도할 수 있다. 이와는 반대로, 가요성 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 사슬 단백질로서 형성된 CD3ε 및 CD3γ의 복합체는 단량체 분획 및 자체의 원산 입체형태로서 정제될 수 있다(Kim et al, JMB.2000; 302: 899-916). 그러나, 이러한 CD3ε/γ 단일 사슬 단백질에 의한 동물의 면역화는 CD3ε 및 CD3γ와 동반되어 결합하여 길항 효과를 보이게 될 항체를 생성할 수 있다.

인간 CD3ε에 대해 생성된 몇몇 항체가 과거 개발된 바 있다.

모노클로날 항체 SP34는 비인간 영장류 CD3과 교차 반응하고, 인간 PBMC 및 비인간 영장류 PBMC 둘 다에서도 또한 세포 증식을 유도할 수 있는 마우스 항체이다 (Pessano et al., "The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20 kD T3(T3δ and T3ε) subunits". EMBO J 4 (1985) 337-344).

WO 2007/042261 및 WO 2008/119567(둘 다 Micromet(현 Amgen Research(Munich)에 양도됨)에는, CD3ε 중 에피토프 FSEXE 및 QDGNE 각각에 대해 생성된 교차 반응성 결합체들이 개시되어 있다. 승인된 유럽특허 EP 2 155 783(WO 2008/119567의 국내 단계 출원을 기반으로 함)의 몇몇 이의신청인들에 의해 제기된 이의신청 절차에서는 SP34 역시 에피토프 QDGNE에 결합한다고 주장되고 있다.

WO 2014/191113에는 CD3ε의 N-말단에 있는 신규 에피토프에 대해 생성된 교차 반응성 결합체가 개시되어 있는데, 여기서 상기 에피토프는 결합에 중요한 역할을 하는 잔기로서 아미노산 잔기 N4를 포함하고, 상기 에피토프는 또한 결합에 관여하는 잔기로서 아미노산 잔기 E6을 추가로 포함한다. 이러한 항체들은 높은 친화성과 큰 효능 둘 다를 보이는 것으로 확인될 수 있었다. 그러나 WO 2014/191113에 따르면, 이 출원에 개시된 항체는 비인간 영장류로부터 유래한 CD3과 시험관 내 교차 반응을 하는 한편, 세포내 환경에서 사이노몰거스 CD3에 대해서 교차 반응성은 확인될 수 없었던 것이 추가로 확인될 수 있었다. 따라서 이러한 항체는 항 CD3 항체를 포함하는 의약품의 전임상 개발과 관련하여 사용될 때 큰 제약이 따른다.

그러므로 요망되는 친화성과 효능 프로필을 보이되, 추가로 시험관 내 그리고 세포내 환경 둘 다에서 다른 종, 구체적으로 비인간 영장류, 예컨대 사이노몰거스 원숭이와 교차 반응성을 보이는 신규 CD3 결합 분자, 구체적으로 신규 항 CD3 항체를 개발함에 있어 충족되지 못한 요구들이 아직도 많이 남아있다.

본 발명은 상기 요구들을 해결하고, 인간 CD3에 특이적인 신규 항체, 구체적으로 CD3ε 도메인에 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 해결책, 즉 토끼의 펩티드 면역화와, 친화성 성숙 기억 B 세포, 구체적으로 요구되는 교차 반응성 프로필을 보이는 CD3 결합 분자, 구체적으로 항 CD3 항체, 구체적으로 CD3ε 도메인에 특이적인 항체의 선별에 의해 수득된 CD3 결합 분자, 구체적으로 항 CD3 항체는 지금까지 그 어떠한 선행 기술에 의해서도 달성 또는 제안된 바 없었다. 본 발명의 신규 CD3 항체는 요망되는 친화성과 효능 프로필을 보이고, 다른 종, 구체적으로 비인간 영장류, 예컨대 사이노몰거스 원숭이와 시험관내 및 세포내 환경 둘 다에서 교차 반응성이다. 게다가 본 발명의 항체는, 예컨대 단량체 형태인 항체의 퍼센트 및 시차주사형광측정법(DSF)에 의해 확정되는 열 언폴딩(thermal unfolding)에 의해 정의되는 바에 따르면 유리한 생물물리학적 특성들, 예컨대 품질, 안정성 또는 가용성을 가진다.

제1 양태에서, 본 발명은 인간 CD3에 특이적인 항체 또는 이의 기능성 단편으로서,

가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 4에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 대응 LCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]를 포함하는 가변 경쇄; 그리고

가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 함께 서열 번호 8에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]

를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.

제2의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다.

제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드와, 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

제4 측면에서, 본 발명은 의약물로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단에 관한 것이다.

제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단에 관한 것이다.

제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포에 관한 것이다.

제8 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단, 또는 본 발명의 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

제9 측면에서, 본 발명은 다중 특이적 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 결합 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열, 그리고 선택적으로 추가의 결합 도메인 또는 이의 단편 1개 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 다중 특이적 구조체로 클로닝하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 농도 10 mg/mL일 때, 실험 개시시(d0)와, 4℃에서 28일의 기간 동안 보관된 후, SE-HPLC에 의해 확정된 각각의 시료중 단량체 함량을 보여준다.
도 2는 인간 PBMC가 사용될 때, PRO460(IL23RxCD3_I2C _Amgen) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 의해 유도된 T 세포 매개 표적 세포 고갈을 보여준다. 좌측 패널은 표적 발현 세포의 세포 용해를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포의 세포 용해를 보여준다. 표적 발현 세포 존재시 어떤 분자에 대한 최고 유효 농도 절반(EC₅₀)의 수치 값은 그래프 아래에 기재되어 있다.
도 3은 FC 검정에 의해 확정된, 분자 PRO460(IL23RxCD3_I2C _Amgen) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 T 세포 활성화를 보여주는 것이다. 좌측 패널은 표적 발현 세포 존재시 활성화를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포 존재시 활성화를 보여준다.
도 4는 인간 PBMC가 사용될 때, PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 의해 유도된 T 세포 매개 표적 세포 고갈을 보여준다. 좌측 패널은 표적 발현 세포의 세포 용해를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포의 세포 용해를 보여준다. 표적 발현 세포 존재시 어떤 분자에 대한 최고 유효 농도 절반(EC₅₀)의 수치 값은 그래프 아래에 기재되어 있다.
도 5는 FC 검정에 의해 확정된, 분자 PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 T 세포 활성화를 보여주는 것이다. 좌측 패널은 표적 발현 세포 존재시 활성화를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포 존재시 활성화를 보여준다.
도 6은 NFAT 리포터 유전자 검정법에 의해 확정된, 분자 PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 T 세포 활성화를 보여준다. 좌측 패널은 표적 발현 세포 존재시 활성화를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포 존재시 활성화를 보여준다. 표적 발현 세포 존재시 어떤 분자에 대한 최고 유효 농도 절반(EC₅₀)의 수치 값은 그래프 아래에 기재되어 있다.
도 7은 사이노몰거스 PBMC가 사용될 때, PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 의해 유도된 T 세포 매개 표적 세포 고갈을 보여준다. 좌측 패널은 표적 발현 세포의 세포 용해를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포의 세포 용해를 보여준다. 표적 발현 세포 존재시 어떤 분자에 대한 최고 유효 농도 절반(EC₅₀)의 수치 값은 그래프 아래에 기재되어 있다.
도 8은 인간 PBMC가 사용될 때, 16시간 후(도 8a) 및 40시간 후(도 8b) PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})에 의해 유도된 T 세포 매개 표적 세포 고갈을 보여준다. 좌측 패널은 표적 발현 세포의 세포 용해를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포의 세포 용해를 보여준다. 표적 발현 세포 존재시 어떤 분자에 대한 최고 유효 농도 절반(EC₅₀)의 수치 값은 그래프 아래에 기재되어 있다.
도 9는 FC 검정에 의해 확정된, 16시간 후(도 9a) 및 40시간 후(도 9b) 분자 PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})의 T 세포 활성화를 보여주는 것이다. 좌측 패널은 표적 발현 세포 존재시 활성화를 보여주는 한편, 우측 패널은 표적 음성 세포 존재시 활성화를 보여준다.

본 발명은 인간 CD3에 특이적인 신규 항체, 구체적으로 CD3ε 도메인에 특이적인 항체에 관한 것이다.

달리 정의되어 있지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자들에 의해 일반적으로 이해되고 있는 의미와 동일한 의미를 가진다.

"~를 포함하는(comprising)" 및 "~를 포함하는(including)"이란 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 제약을 두지 않고 비제한적인 의미로 사용된다. 그러므로 이처럼 비제한적 의미로 사용되는 구현예들과 관련하여, "~를 포함하는"이란 용어는 이보다 협소한 의미의 용어인 "~으로 이루어진"을 포함한다.

본 발명을 기술하는 내용(특히 첨부된 청구항들의 내용) 중 "하나의" 및 "한"및 "본"이란 용어, 그리고 유사 언급대상은, 본원에 달리 명시되지 않았거나 내용과 명백히 상충하지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 예를 들어 "한 세포"란 용어는 세포 혼합물을 비롯한 세포 다수를 포함한다. 복수 형태를 나타내는 용어가 화합물과 염 등에 대해 사용되는 경우, 이 용어는 또한 단일의 화합물 또는 염도 의미하는 것으로 간주된다.

제1 측면에서, 본 발명은 인간 CD3에 특이적이고,

(a) 가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4을 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 4에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 대응 LCDR들에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]; 그리고

(b) 가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 함께 서열 번호 8에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 대응 HCDR들에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]

를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.

본 발명의 내용 중, "항체"란 용어는 "면역글로불린"(Ig)에 대한 유의어로서 사용되는데, 이는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgY 또는 IgD 군(또는 이의 임의의 하위군)에 속하는 단백질로서 정의되고, 종래에 공지된 항체 모두를 포함한다. 자연발생 "항체"는, 중(H) 쇄 적어도 2개와 경(L) 쇄 적어도 2개가 이황화 결합에 의해 상호 결합되어 포함되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성되어 있다. VH 영역 및 VL 영역은 추가로, 틀 영역(FW)이라 칭하여지는 더욱 잘 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하여지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 CDR 3개와 FW 4개로 구성된다: FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

"항체 단편"이란 용어는, 비변형 항체 또는 이의 재조합 변이체의 일부분 적어도 1개를 지칭하고, "기능성 단편" 또는 "기능성 항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"이란 용어는, 기능성 항체 단편의 표적, 예컨대 항원의 항원 결정기 인지 및 이 표적과의 특이적 결합을 제공하기에 충분한, 비변형 항체의 적어도 항원 결합 도메인, 예컨대 가변 영역 일부를 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 기능성 항체 단편의 예로서는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 그리고 항체 단편, 예컨대 경첩 영역에서 이황화물 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개 이상, 예컨대 2개, 또는 결합한 항체의 단리된 CDR 또는 기타 에피토프 결합 단편 2개 이상, 예컨대 2개를 포함하는 2가 단편으로 제조된 다중 특이적 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 본 발명의 기능성 단편은 scFv이다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv에 통합될 수 있다(예컨대 문헌(Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005) 참조). 항체 단편은 또한 제III형 피브로넥틴(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 그래프팅(grafting)될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디가 기술되어 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항체의 "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 도메인"은, 통상 항체의 초가변 영역(들) 1개 이상, 즉 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 발견되지만; 가변 "틀" 영역도 또한, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 다양한 면역계 세포(예컨대 효과기 세포)와 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)의 결합을 매개할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는, 예를 들어 모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체를 포함한다. 항체는 임의의 이소타입의 것(예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 군의 것(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위군의 것일 수 있다.

"상보성 결정 영역" ("CDR")은 Kabat외 다수에 의해 기술된 체계(1991)("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) ("Kabat" 번호 매김 체계), Al-Lazikani외 다수에 의해 기술된 체계(1997)(JMB 273, 927-948) ("Chothia" 번호 매김 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호 매김에 의한 체계(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P외 다수(Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" 번호 매김 체계)를 비롯한 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것이 사용되어 경계가 결정되는 아미노산 서열이다. 예를 들어 고전적인 포맷의 경우 Kabat 체계하에서 중쇄 가변 도메인(VH) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 31번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2), 그리고 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Chothia 체계하에서 VH 중의 CDR 아미노산은 26번 ~ 32번(HCDR1), 52번 ~ 56번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; VL 중의 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Kabat 체계 및 Chothia 체계 둘 다에 의한 CDR 정의들을 조합하였을 때, 인간 VH 중의 CDR은 26번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어지고, 인간 VL 중의 CDR은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어진다. IMGT 하에서 VH 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26번 ~ 35번(HCDR1), 51번 ~ 57번(HCDR2) 및 93번 ~ 102번(HCDR3)으로 번호가 매겨지고, VL 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27번 ~ 32번(LCDR1), 50번 ~ 52번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)으로 번호가 매겨진다("Kabat" 체계에 따른 번호 매김). IMGT하에 항체의 CDR들은 IMGT/DomainGap Align이라는 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 내용에서는 달리 특별히 언급되지 않는 한 Honegger 및 Pluckthun에 의해 제안된 번호 매김 체계("AHo 번호 매김")가 사용된다(Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670). 또한 하기 잔기들이 CDR로서 정의된다: LCDR1(CDR-L1라고도 지칭됨): L24 ~ L42; LCDR2(CDR-L2라고도 지칭됨): L58 ~ L72; LCDR3(CDR-L3라고도 지칭됨): L107 ~ L138; HCDR1(CDR-H1라고도 지칭됨): H27 ~ H42; HCDR2(CDR-H2라고도 지칭됨): H57 ~ H76; HCDR3(CDR-H3라고도 지칭됨): H108 ~ H138. 명료함을 도모하기 위해, Honegger 및 Pluckthun에 따르는 번호 매김 체계는 자연 발생 항체, 즉 상이한 VH 및 VL 하위 과 둘 다, 구체적으로 CDR에서 발견되는 길이의 다양성을 고려하고, 이 서열들에 갭을 제공한다. 그러므로 주어진 항체의 가변 도메인에서, 보통 1번 ~ 149번 위치 전체가 반드시 아미노산 잔기에 의해 점유되는 것은 아닐 것이다.

바람직하게 "항원 결합 영역"은 적어도 가변 경(VL) 쇄의 4번 ~ 138번 아미노산 잔기와, 가변 중(VH) 쇄의 5번 ~ 138번 아미노산 잔기(각각의 경우 번호 매김은 Honegger 및 Pluckthun에 따름), 더욱 바람직하게 VL의 3번 ~ 144번 아미노산 잔기 및 VH의 4번 ~ 144번 아미노산 잔기를 포함하고, 특히 바람직하게는 전체 VL 및 VH 사슬(VL의 1번 ~ 149번 아미노산 위치 및 VH의 1번 ~ 149번 아미노산 위치)이다. 틀 영역 및 CDR은 표 1에 보인 서열들에 명시되어 있다. 본 발명에서 사용하기 바람직한 면역글로불린 군은 IgG이다. 본 발명의 "기능성 단편"은 F(ab')₂ 단편, Fab 단편, Fv 및 scFv의 도메인을 포함한다. F(ab')₂ 또는 Fab는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 일어나는 분자간 이황화물 상호작용이 최소화되거나 완전히 제거되도록 조작될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 섹션 [0076] ~ [0111]에 추가로 기술된 바와 같이 이기능성 또는 다기능성 폴리펩티드의 일부일 수 있다.

하기 용어들은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간 서열 관계를 기술하는데 사용된다: "서열 동일성" 또는 "서열 동일성 퍼센트. 본원에 사용된 바와 같은 "서열 동일성"이란 용어는, 2개의 폴리펩티드 서열간 동일한 아미노산 잔기의 최대 수를 산정함으로써 확정되는데, 단 최대의 서열 중첩도를 허용시키기 위해서는 갭 및/또는 삽입이 고려될 수 있다. 예를 들어 완전히 동일한 100머 폴리펩티드 2개는 서열 동일성이 100%이다. 이들 폴리펩티드들이 하나의 돌연변이에 의해 상이해지거나, 또는 하나의 폴리펩티드가 하나의 아미노산 결실을 함유하면, 서열 동일성은 99%이다(100개의 위치 중 99개의 위치가 동일). 다시 말해서, "서열 동일성 퍼센트"는, 비교 윈도우에 대해 최적으로 정렬된 서열 2개를 비교하고, 동일한 핵산 염기(예컨대 A, T, C, G, U 또는 I) 또는 아미노산 잔기가 두 서열에 출현하는 위치의 수를 확정하여, 매칭된 위치의 수를 산출한 다음, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내에 있는 위치의 총 수(즉 윈도우 크기)로 나눈 후, 이로부터 얻어진 결과에 100을 곱하여, 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 산정된다. "서열 유사성"은 2개의 서열이 비교되었을 때 이 두 서열들이 닮은 정도이다. 필요하거나 요망되는 경우, 예를 들어 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. MoI. Biol. 48:443-53 (1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)), 이들 알고리즘(예컨대 Wisconsin Genetics 소프트웨어 팩키지 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터를 통한 실행, 또는 시각적 관찰에 의하여, 비교에 최적인 서열 정렬이 수행될 수 있다(일반적으로 Ausubel외 다수 편저 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999) 참조). 본원에 달리 명시되지 않는 한, 본원에 지칭된 서열의 유사도는 Dayhoff PAM 매트릭스를 이용하여 확정된다(M.O. Dayhoff, R. Schwartz, B.C. Orcutt: A model of Evolutionary Change in Proteins, pages 345-352; in: Atlas of protein sequence and structure, National Biomedical Research Foundation, 1979).

"아미노산"이란 용어는, 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산의 작용 방식과 유사한 방식으로 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라, 사후에 변형된 아미노산, 예컨대 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본원에서 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체를 지칭하는 것으로서 호환되어 사용되고 있다. 이 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 인공 모의체인 아미노산 중합체에 적용될 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 폴리펩티드 서열은 또한 명백하게 이 서열의 보존적으로 변형된 변이체도 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "결합 특이성"이란 용어는, 하나의 항원 결정기와 반응하고, 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 개별 항체 조합 부위(antibody combining site)의 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 결합 분자는 이러한 결합 분자가 이러한 표적 생물분자 및 하나 이상의 기준 분자(들)를 구별할 수 있을 때, 표적, 예컨대 인간 CD3"에 특이적"이거나, 표적, 예컨대 인간 CD3"을 특이적으로 인지"하거나, 또는 표적, 예컨대 인간 CD3"에 특이적으로 결합"하는 분자인데, 왜냐하면 결합 특이성은 절대적인 것이 아니고, 상대적인 특성이기 때문이다. 자체의 가장 일반적인 형태로 존재할 때 (그리고 한정된 기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"이란, 예를 들어 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 확정되는 바와 같이, 결합 분자가 관심 표적 생물분자와 무관 생물분자를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 이러한 검정 방법으로서는 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR(표면 플라스몬 공명법) 검정 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 점수매김(scoring)은 표준 발색법(예컨대 서양고추냉이 과산화물과 2차 항체, 그리고 테트라메틸벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 임의의 웰 내에서의 반응은, 예컨대 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수가 매겨진다. 통상의 백그라운드(= 음성 반응)는 약 0.1 OD일 수 있고; 통상의 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이는, 양의 점수와 음의 점수 사이의 비가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 추가의 예에서, SPR 검정이 수행될 수 있는데, 이때 백그라운드와 신호 간 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배 차이가 있음은 특이적 결합이 이루어졌음을 나타낸다. 통상적으로 결합 특이성의 확정은 단일 기준 생물분자를 사용하여 수행되는 것이 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 생물분자, 예컨대 분유 또는 트랜스페린 등으로 이루어진 세트를 사용하여 수행된다. 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 CD3, 바람직하게 인간 CD3ε에 대해 결합 특이성을 가진다.

일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 CD3 및 비 침팬지 영장류 CD3에 대해 결합 특이성을 가진다. 당 업자에게 자명한 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 종간 특이성을 보이는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 또한, 예컨대 침팬지 CD3과도 결합할 수 있음은 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다. 다른 한편으로, 오로지 인간 CD3과만 결합하되, 비 침팬지 영장류 CD3과는 결합하지 않는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 본 발명의 범위로부터 배제됨은 분명하다. 이는, 필요한 부분만 약간 수정되어 비 침팬지 영장류 CD3에만 결합하고 인간 CD3에는 결합하지 않는 결합 도메인, 예컨대 모노클로날 항체 FN-18의 도메인에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "비 침팬지 영장류" 또는 "비 침프(non-chimp) 영장류" 또는 이의 문법에 맞는 변형어들은 침팬지를 제외한 임의의 영장류, 즉 팬(Pan) 속에 속하는 동물, 예를 들어 팬 패니스쿠스(Pan paniscus) 및 팬 트로글로다이테스(Pan troglodytes)(안트로포피테쿠스 트로글로다이테스(Anthropopithecus troglodytes) 또는 시미아 사티루스(Simia satyrus)라고도 공지됨)를 제외한 임의의 영장류를 지칭한다. "영장류", "영장류 종", "영장류들" 또는 이의 문법에 맞는 변형어는 원원류와 유인원과 같이 2개의 아류로 구분되고, 사람, 유인원, 원숭이 및 여우원숭이를 포함하는 진수류 목의 포유류를 나타낸다. 특히 본원에 사용된 바와 같은 "영장류들"은 아목 곡비원류(비 타르시에르 프로시미안스(tarsier prosimians)), 예컨대 하목인 레뮤리포르메스(Lemuriformes)(이 자체는 상과인 케이로갈레오이데아(Cheirogaleoidea) 및 레뮤로이데아(Lemuroidea)를 포함함), 하목 키로마이이포르메스(Chiromyiformes)(이 자체는 다우벤토니이다에(Daubentoniidae) 과를 포함함) 및 하목 로리시포르메스(Lorisiformes)(이 자체는 로리시다에(Lorisidae) 및 갈라기다에 Galagidae)를 포함함)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "영장류들"은 또한 아목 하플로리니(Haplorrhini), 예컨대 하목 타르시이포르메스(Tarsiiformes)(이 자체는 타르시이다에(Tarsiidae)과를 포함함), 하목 시미이포르메스(Simiiformes)(이 자체는 플라티리니(Platyrrhini), 또는 광비원류(New World monkeys), 그리고 카타리니(Catarrhini), 예컨대 세르코피테시데아(Cercopithecidea) 또는 구세계 원숭이(Old World Monkeys)를 포함함)를 포함한다. 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스 원숭이라고 공지되어 있는 것으로서 본 실시예에서는 "사이노몰거스"라 명명됨)가 가장 바람직하다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 CD3 및 사이노몰거스 CD3에 대해 결합 특이성을 가진다.

내용에 따라서 "특이적 결합"이란 용어는 또한 결합 분자가 표적 생물분자와, 기준점으로 사용되는 1개 이상의 밀접하게 관련된 생물분자(들), 예컨대 상이한 종으로부터 유래하는 CD3 분자, 예컨대 마우스 CD3을 구별하는 능력을 지칭할 수도 있다. 추가로 "특이적 결합"은 결합 분자가 자체의 표적 항원의 상이한 부분들, 예컨대 표적 생물분자의 상이한 도메인, 영역 또는 에피토프, 구체적으로 CD3ε도메인을 구별하는 능력, 또는 표적 생물분자의 아미노산 잔기 확장부 또는 핵심 아미노산 잔기 1개 이상을 구별하는 능력과 관련이 있을 수도 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 CD3ε에 대해 결합 특이성을 가진다.

"CD3" 란 용어는, T 세포 수용체의 일부로서 발현되는 분자를 지칭하며, 선행 기술이 통상적으로 이 용어에 부여하는 의미를 가진다. 인간에서 이 CD3은 개별적이거나 독립적으로 합하여진 CD3 서브유닛들, CD3 입실론, CD3 델타 및 CD3 감마를 포함한다. 본원에 언급된 바와 같은 비 침팬지 영장류 CD3 항원은, 예를 들어 마카카 파시큘라리스 CD3 및 마카카 뮬라토(Macaca mulatto) CD3이다. 마카카 파시큘라리스에서 CD3은 CD3 엡실론 FN-18^- 및 CD3 엡실론 FN-18⁺, CD3 감마 및 CD3 델타를 포함한다. 마카카 뮬라토에서, CD3은 CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타를 포함한다.

바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 상기 CD3은 특히 CD3ε과 관련된다. "인간 CD3ε"이란 용어는, 구체적으로 GenBank 승인 번호 NM_000733이자 UniProt ID 번호 P07766(본원에서는 서열 번호 19 또는 이의 변이체로서 재현됨)인 인간 CD3ε을 지칭한다. 마카카 파시큘라리스의 CD3ε "FN-18^-"(즉 상기 제시된 바와 같이 다형성으로 말미암아 모노클로날 항체 FN-18에 의해 인지되지 못하는 CD3ε)은 GenBank 승인 번호 AB073994로 나타낸다. 마카카 파시큘라리스의 CD3ε "FN-18⁺"(즉 모노클로날 항체 FN-18에 의해 인지되는 CD3 엡실론)은 GenBank 승인 번호 AB073993로 나타낸다.

인간 CD3 감마는 GenBank 승인 번호 NM 000073로 나타낸다. 인간 CD3 델타는 GenBank 승인 번호 NM NM 000732로 나타낸다. 마카카 파시큘라리스의 CD3 감마는 GenBank 승인 번호 AB073992로 나타낸다. 마카카 파시큘라리스의 CD3 델타는 GenBank 승인 번호 AB073991로 나타낸다.

적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 및 사이노몰거스(마카카 파시큘라리스) CD3ε을 표적화한다.

적합하게 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 아미노산 서열이 동일한 유전자 공급원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 이러한 공급원으로부터 유래하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정의 에피토프에 결합 특이성 및 친화성을 보이거나, 특이 에피토프에 결합 특이성 및 친화성을 보인다.

본 발명의 내용에 있어 "에피토프"란 용어는, 표적 생물분자와 결합 분자간의 특이적 결합에 필요한, 주어진 표적 생물분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 연속적일 수 있거나(즉 표적 생물분자 내에 존재하는 인접 구조 요소들에 의해 형성될 수 있거나), 또는 불연속적일 수 있다(즉 표적 생물분자의 1차 서열, 예컨대 표적인 단백질의 아미노산 서열 내 상이한 위치에 있지만, 예컨대 체액 중 표적 생물분자가 채택하는 3차원 구조상으로는 매우 가까이에 있는 구조적 요소에 의해 형성될 수 있다).

본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"키메라 항체" (또는 이의 기능성 단편)이란 용어는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교환되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 군의 불변 영역, 효과기 기능을 보이는 불변 영역 및/또는 종의 불변 영역과 결합되었나, 또는 키메라 항체에 새로운 특성들을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등과 결합되었거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 가지는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교체된 항체 분자(또는 이의 기능성 단편)이다. 예를 들어 마우스 항체는 이의 불변 영역을 인간 면역글로불린 유래 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로 치환됨으로 말미암아, 키메라 항체는 항원을 인지함에 있어서 특이성을 보유할 수 있는 동시에, 인간에서의 항원성은 원래 마우스 항체와 비교되었을 때 감소한다.

본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체 (또는 이의 기능성 단편)은 비인간 항체의 반응성을 보유하되, 인간에서의 면역원성은 작은 항체 (또는 이의 기능성 단편)이다. 이는, 예를 들어 비인간 CDR 영역은 유지시키면서, 항체의 나머지 부분들은 인간에 있어 대응 부분(즉 불변 영역과, 가변 영역의 틀 부분)으로 치환하여 달성될 수 있다. 추가의 틀 영역 변형은 인간 틀 서열뿐만 아니라 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래하는 CDR 서열 내에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 시험관내 도입된 돌연변이, 또는 체세포 돌연변이에 의해 생체내 도입된 돌연변이, 또는 안정성을 촉진하거나 제조를 용이하게 만들기 위한 보존적 치환에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994]을 참조한다. 항체 공학 기법의 다른 예로서는 미국 특허 제5,766,886호에 개시된 Xoma 기법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은 "재조합 인간화 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 본 발명의 인간화 항체 모두, 예컨대 동물(예컨대 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포에 형질감염으로 도입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 제조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 (존재한다면) 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역 및 불변 영역을 가진다. 하지만, 이러한 항체는 시험관내 돌연변이유발법의 대상이 될 수 있으므로 (또는 인간 Ig 서열이 유전자이식된 동물이 사용되는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발법의 대상이 될 수 있으므로), 재조합 항체의 VH(항체 중쇄 가변 영역) 및 VL(항체 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열은 자연에서 인간 항체 생식계열에 존재할 수 없지만, 인간 생식계열 VH 서열 및 VL 서열로부터 유래하고, 이와 관련된 서열이다.

적합하게 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인공 또는 단리된 항체 또는 이의 기능성 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은 "인공 항체"란 용어는, 자체의 기원 또는 조작에 의해 (i) 숙주 세포 내에 발현 벡터의 일부분에 의한 발현 생성물로서 존재하거나, 또는 (ii) 자연에서 결합하고 있는 단백질이나 화학기 이외의 단백질이나 기타 화학기와 결합하거나, 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 항체 또는 이의 기능성 단편을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리된 항체"란 용어는, 숙주 세포 내에서 발현되어, 이와 결합하고 있던 단백질들로부터 겔 크로마토그래피에 의해 정제된 항체를 지칭한다. "단리된 항체"란 용어는 또한 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체로부터 실질적으로 분리되어 있는 항체를 지칭한다(예컨대 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 실질적으로 인간 CD3 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있음). 그러나 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터 유래한 CD3 분자(예컨대 비인간 영장류 및/또는 설치류 CD3)에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가 단리된 항체는 기타 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 분리되어 있을 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 LCDR1; (b) 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 LCDR2; (c) 서열 번호 3에 제시된 바와 같은 LCDR3; (d) 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1; (e) 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 HCDR2; 그리고 (f) 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 HCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.

본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다. 본 발명의 내용 중 "VH"(가변 중쇄), "Vκ" 및 "Vλ"란 용어는, 서열 동일성 및 상동성에 따라서 분류되는 항체 중쇄 서열 및 경쇄 서열의 과들을 지칭한다. 예컨대 상동성 검색 매트릭스, 예컨대 BLOSUM(Henikoff, S. &Henikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919)을 사용하여 서열 상동성을 확정하기 위한 방법과, 상동성에 따라서 서열을 분류하기 위한 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. VH의 경우 상이한 하위 과 Vκ 및 Vλ는, 예컨대 VH1A, VH1B 및 VH2 ~ VH6인 VH, Vκ1 ~ Vκ4인 Vκ, 그리고 Vλ1 ~ Vλ3인 Vλ로 구분한 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86]에 보인 바와 같이 식별될 수 있다. 항체 Vκ 사슬, Vλ 사슬 및 VH 사슬은 생식계열 κ 사슬 V 및 J 분절, 생식계열 λ 사슬 V 및 J 분절, 그리고 중쇄 V, D 및 J 분절 각각의 생체 내 무작위 재배열의 결과이다. 주어진 항체 가변 사슬이 어느 하위 과에 속하는지는, 대응하는 V 분절, 구체적으로 틀 영역 FW1 ~ FW3에 의해 결정된다. 그러므로 본 출원에서 오로지 특정의 틀 영역 HFW1 ~ HFW3 세트에 의해서만 특징지어지는 임의의 VH 서열은 임의의 HFW4 서열, 예컨대 중쇄 생식계열 J 분절로부터 취하여진 HFW4 서열, 또는 재배열된 VH 서열로부터 취하여진 HFW4 서열과 합하여질 수 있다. 구체적인 구현예들에서, HFW4 서열은 WGQGTLVTVSS이다.

적합하게 본 발명은 CD3(예컨대 인간 CD3 단백질, 구체적으로 인간 CD3ε)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공하는데, 단 상기 항체 또는 그의 기능성 단편은 VH4 도메인 또는 VH3 도메인, 바람직하게 VH3 도메인을 포함한다.

적합하게 본 발명은 CD3(예컨대 인간 CD3 단백질, 구체적으로 인간 CD3ε)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공하는데, 단 상기 항체 또는 그의 기능성 단편은 (i) Vκ 틀 FW1, FW2 및 FW3, 구체적으로 Vκ1 틀 또는 Vκ3 틀, 바람직하게 Vκ1 틀 FW1 ~ FW3, 그리고 (ii) Vκ FW4, 구체적으로 Vκ1 FW4, Vκ3 FW4 및 Vλ FW4로부터 선택되는 틀 FW4를 포함한다. 적합하게 Vκ1 FW1 ~ FW3는, 서열 번호 4에 따른 Vκ1 서열로부터 취하여진 대응 틀 영역들에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다. 적합한 Vκ1 FW4는 서열 번호 4에 따른 Vκ1 서열로부터 취하여진 대응 FW4에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다. 적합하게 Vκ1 FW4는, 서열 번호 4에 따른 Vκ1 서열로부터 취하여진 FW4이다. 적합한 Vλ FW4는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 본 발명은 CD3(예컨대 인간 CD3 단백질, 구체적으로 인간 CD3ε)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편을 제공하는데, 단 상기 항체 또는 그의 기능성 단편은 서열 번호 17 ~ 서열 번호 18 중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FW4를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 Vκ1 경쇄이고/이거나 상기 가변 중쇄는 VH3 사슬이다. 다른 구체적인 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 Vκ 틀 영역 I ~ III과, Vλ 틀 영역 IV를 포함하는 키메라 경쇄이다. 일 구현예에서, 경쇄는

(i) 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;

(ii) 인간 Vκ 틀 영역 FW1 ~ FW3, 특히 인간 Vκ1 틀 영역 FW1 ~ FW3;

(iii) (a) FW4에 대한 인간 Vλ 생식계열 서열, 특히 서열 번호 17 및 서열 번호 18로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호 17인 Vλ 생식계열 서열; 및 (b) 가장 가까운 FW4에 대한 인간 Vλ 생식계열 서열에 비하여 돌연변이를 1개 또는 2개, 특히 돌연변이를 1개 가지고, 서열 번호 17 및 서열 번호 18로부터 선택되는 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 Vλ 기반 서열로부터 선택되는 FW4

를 포함하는 키메라 경쇄이다.

일 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보이고/보이거나, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보인다. 구체적인 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이거나, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다.

적합하게 본 발명은 인간 CD3, 구체적으로 인간 CD3ε에 특이적이고, 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것으로서, 단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고, 상기 가변 경쇄는 경쇄 아미노산 위치 54번(AHo 번호 매김)에 아르기닌(R) 또는 리신(K), 바람직하게 아르기닌(R)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 경쇄 아미노산 위치 50번(AHo 번호 매김)에 글루타민(Q)을, 그리고/또는 경쇄 아미노산 위치 51번(AHo 번호 매김)에 세린(S)을, 그리고 선택적으로 경쇄 아미노산 위치 44번(AHo 번호 매김)에 페닐알라닌(F)을, 또는 경쇄 아미노산 위치 88번(AHo 번호 매김)에 글루타민(Q)을, 또는 경쇄 아미노산 위치 88번(AHo 번호 매김)에 히스티딘(H)을 추가로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 CD3, 구체적으로 인간 CD3ε에 특이적이고, 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것으로서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고, 상기 가변 경쇄는 경쇄 아미노산 위치 54번(AHo 번호 매김)에 아르기닌(R)을, 경쇄 아미노산 위치 50번(AHo 번호 매김)에 글루타민(Q)을, 경쇄 아미노산 위치 51번(AHo 번호 매김)에 세린(S)을, 그리고 경쇄 아미노산 위치 44번(AHo 번호 매김)에 페닐알라닌(F)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간 CD3, 구체적으로 인간 CD3ε에 특이적이고, 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것으로서, 단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고, 상기 가변 경쇄는 경쇄 아미노산 위치 54번(AHo 번호 매김)에 아르기닌(R)을, 경쇄 아미노산 위치 44번(AHo 번호 매김)에 페닐알라닌(F)을 포함한다.

적합하게 본 발명은 인간 CD3, 구체적으로 인간 CD3ε에 특이적이고, 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것으로서, 단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고, 상기 가변 중쇄는 중쇄 아미노산 위치 53번(AHo 번호 매김)의 알라닌(A), 중쇄 아미노산 위치 103번(AHo 번호 매김)의 트레오닌(T), 그리고 중쇄 아미노산 위치 105번(AHo 번호 매김)의 페닐알라닌(F)으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 아미노산 적어도 1개, 예컨대 적어도 2개, 바람직하게 적어도 3개를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고, 중쇄 아미노산 위치 53번(AHo 번호 매김)에 알라닌(A)을, 중쇄 아미노산 위치 103번(AHo 번호 매김)에 트레오닌(T)을, 그리고 중쇄 아미노산 위치 105번(AHo 번호 매김)에 페닐알라닌(F)을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 경쇄와, 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"란 용어는, 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정의 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 핵산 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 말미암아 기능상 동일한 핵산 다수가 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 그러므로 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서 이 코돈은, 암호화된 폴리펩티드를 변경시키지 않고, 기술된 대응 코돈들 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형되는 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산에 일어날 수 있는 모든 침묵 변형을 기술하기도 한다. 당 업자는 핵산 내에 있는 각각의 코돈(보통 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와, 보통 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어, 기능상 동일한 분자가 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 그러므로 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 일어나는 침묵 변이 각각은 기술된 각각의 서열 내에 내포되어 있다.

폴리펩티드 서열에 있어서 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"는 어떤 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 일으키는, 폴리펩티드 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이처럼 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 대립형질, 종간 상동체 및 다형성 변이체에 부가적이고, 이것들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로 간에 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 그리고 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(에컨대 문헌(Creighton, Proteins (1984)) 참조). 일 구현예에서, "보존적 서열 변형"이란 용어는, 어떤 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미한 영향을 미치지 않거나, 이를 유의미하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄와, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 기능성 단편은 IgG 항체, Fab 및 scFv 단편으로부터 선택된다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 scFv 항체 단편이다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 단 이들 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로 Fv 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에, sFv가 표적 결합에 요망되는 구조를 형성하도록 만들 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다(예컨대 문헌(Pluckthun, The pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994, pp. 269-315) 참조).

적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 scFv이다. 구체적인 구현예들에서, 상기 기능성 단편은 서열 번호 15에 따르는 링커를 포함하는 scFv 포맷이다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 서열 번호 4, 8, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및 42로 이루어진 목록으로부터 선택되는 아미노산 서열 적어도 1개를 포함하는 scFv이다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 서열 번호 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및 42로 이루어진 목록으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.

본원에 사용된 바와 같은 "친화성"이란 용어는, 단일 결합 부위 또는 분자, 예컨대 항체 또는 이의 기능성 단편과, 이의 결합 파트너, 예컨대 항원 사이의 비공유 상호작용 세기의 총 합을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성"이란, 결합 쌍의 일원들 간 1:1 상호작용, 예컨대 단일 항체 결합 도메인과 이의 항원의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 친화성은, 일반적으로 해리 상수(K_D)로 표시될 수 있다. 친화성은 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있다.

적합한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편의 인간 CD3 및/또는 사이노몰거스 CD3에 대한 K_D는, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 0.1 nM 내지 100 nM, 0.1 nM 내지 90 nM, 0.1 nM 내지 80 nM, 0.1 nM 내지 70 nM, 0.1 nM 내지 60 nM, 0.5 nM 내지 50 nM, 0.5 nM 내지 40 nM, 0.5 nM 내지 30 nM, 0.5 nM 내지 20 nM, 0.5 nM 내지 10 nM, 0.5 nM 내지 9 nM, 0.5 nM 내지 8 nM, 0.5 nM 내지 7 nM, 0.5 nM 내지 6 nM, 0.5 nM 내지 5 nM 일 수 있다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편의, 인간 CD3 및/또는 사이노몰거스 CD3에 대한 K_D 값은, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 대략적으로 100 nM 미만, 대략적으로 90 nM 미만, 대략적으로 80 nM 미만, 대략적으로 70 nM 미만, 대략적으로 60 nM 미만, 대략적으로 55 nM 미만, 대략적으로 40 nM 미만, 대략적으로 45 nM 미만, 대략적으로 40 nM 미만, 대략적으로 35 nM 미만, 대략적으로 30 nM 미만, 대략적으로 25 nM 미만, 대략적으로 20 nM 미만, 대략적으로 15 nM 미만, 대략적으로 10 nM 미만, 대략적으로 9 nM 미만, 대략적으로 8 nM 미만, 대략적으로 7 nM 미만, 대략적으로 6 nM 미만, 대략적으로 5 nM 미만, 대략적으로 4 nM 미만, 대략적으로 3 nM 미만, 대략적으로 2 nM 미만, 대략적으로 1 nM 미만일 수 있다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편의 인간 CD3 및/또는 사이노몰거스 CD3에 대한 K_D 값은, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 10 nM 미만, 바람직하게 6 nM 미만이다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 하기 매개변수들 중 1개 이상에 의해 특징지어진다:

(i) 인간 CD3와의 결합에 대한 K_D 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 40 nM 미만, 구체적으로 10 nM 미만, 더욱 구체적으로 6 nM 미만임;

(ii) 사이노몰거스 CD3와의 결합에 대한 K_D 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 20 nM 미만, 구체적으로 10 nM 미만, 더욱 구체적으로 5 nM 미만임;

(iii) 구체적으로 이미 기술된 시차주사형광측정법(DSF)(Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221)에 의해 확정되는 바에 따르면, 구체적으로 시료들이 pH 값 3.5 내지 7.5 범위이고, 0.15 M ~ 0.25 M NaCl, 특히 0.15 M NaCl을 함유하는 인산염-시트르산염 완충제 5개 중에서 희석될 때, scFv 항체 포맷(단일 사슬 가변 단편 포맷)으로 발현될 때의 열 언폴딩 온도(Tm)의 평균 중간점은 적어도 60℃, 특히 적어도 65℃를 초과하여야 함 [scFv 구조체의 열 언폴딩에 있어서의 전이 중간점은 형광 염료인 SYPRO® 오렌지를 사용하여 시차주사형광측정법에 의해 확정됨(Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840 참조). 유관 수용 조건하에 있는 시료는 유관 완충제 중에 제조된 수용 원액에 스파이킹(spiking)하여 최종 단백질 농도 50　μg　ml^-1이 되도록 준비됨. 완충제 정탐 실험(scouting experiment)을 위해, 시료는 최종 scFv 완충제 중에 희석되되, 단 pH 값은 상이하게 하고(pH 3.4, 4.4, 5.4, 6.4 및 7.2), 5x SYPRO^® 오렌지는 총 부피 100　μl 중 최종 농도로 포함시킴. scFv DSF 기준은 미지의 시료들과 함께 내부 대조군으로서 측정됨. 준비된 시료 25 마이크로리터만큼이 백색의 벽으로 둘려있는 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가됨. 검정은 고온 순환기로서 사용되는 qPCR 기기내에서 수행되고, 형광 발광은 소프트웨어의 맞춤 염료 교정 루틴에 따라서 검출됨. 검정 시료가 담긴 PCR 평판 온도는 1℃씩 승온하여 25℃에서 96℃까지 상승되고, 매 승온 시마다 30초씩 휴지기를 둠. 총 검정 시간은 약 2시간임. Tm은 곡선의 변곡점을 산정하기 위한 산술적 2차도함수법을 이용하여 소프트웨어 GraphPad Prism에 의해 산정됨. 보고된 Tm은 3회 측정값의 평균임. 구체적인 구현예에서, Tm의 확정은 실시예 2.2에 기술된 바와 같이 수행되되, 단 시료는 pH 값 6.4이고, 0.25 M NaCl을 함유하는 인산염-시트르산염 완충제 중에 희석됨].

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 다중 특이적 분자, 예컨대 이중 특이적 분자, 삼중 특이적 분자, 사중 특이적 분자, 오중 특이적 분자, 육중 특이적 분자 또는 다가 분자, 예컨대 2가, 3가, 4가, 5가, 6가 분자에 관한 것이다. 구체적인 구현예에서, 다중 특이적 분자는 다중 특이적 폴리펩티드이다. 구체적인 구현예에서, 다가 분자는 다가 폴리펩티드이다.

본원에 사용된 바와 같은 "이중 특이적 항체" 또는 "이중 특이적 폴리펩티드"란 용어는, 상이한 에피토프 2개, 구체적으로 상이한 표적 2개에 존재하는 상이한 에피토프 2개와 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "삼중 특이적 항체" 또는 "삼중 특이적 폴리펩티드"란, 상이한 에피토프 3개, 구체적으로 상이한 표적 3개에 존재하는 상이한 에피토프 3개와 결합하는 항체를 지칭한다.

본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 다른 기능성 분자, 예컨대 다른 펩티드 또는 단백질(예컨대 다른 항체 또는 어떤 수용체에 대한 리간드)로 유도체화될 수 있거나 이것과 결합하여, 결합 부위 및/또는 상이한 표적 분자 적어도 2개와 결합하는 다중 특이적 분자(예컨대 다중 특이적 폴리펩티드)를 형성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실상 다른 기능성 분자 2개 이상으로 유도체화될 수 있거나 또는 다른 기능성 분자 2개 이상과 결합하여, 상이한 결합 부위 및/또는 상이한 표적 분자 2개 이상과 결합하는 다중 특이적 분자(예컨대 다중 특이적 폴리펩티드)를 형성할 수 있다. 본 발명의 다중 특이적 분자를 형성하기 위해 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모의체와 (예컨대 화학 결합, 유전자 융합 또는 비공유 결합 등에 의해) 기능상 결합할 수 있으며, 그 결과 다중 특이적 분자가 생성될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) CD3 이외의 상이한 표적과 결합하는 결합 도메인 적어도 1개를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 항체의 "결합 도메인", "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부" 또는 "기능성 단편"등과 같은 용어는, 주어진 항원(예컨대 CD3, IL23R, HER2, HSA)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 비변형 항체의 단편 1개 이상을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 비변형 항체의 단편들에 의해 발휘될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CHI 도메인들로 이루어진 1가 단편; Fab 단편 2개가 경첩 영역에서 이황화 결합에 의해 결합된 채 포함되어 있는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 단리된 상보성 결정 영역(CDR), dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조를 기반으로 한 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드를 기반으로 한 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 피노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 그리고 (예컨대 f-스타 기법에 의해) 항체의 불변 영역으로 구성될 결합 부위들(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합하게 본 발명의 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 단편(scFv) 또는 단일 항체 가변 도메인이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다.

적합하게, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) 종양 연관 항원(TAA) 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게는 1개를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) IL23R-결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게는 1개를 포함한다.

인터루킨(IL)-23은 자체의 분자량 근사치에 따라 p40 및 p19라 명명되는 단백질 서브유닛 2개로 구성된 헤테로이량체 시토카인이다. p40 단백질은 IL-12 및 IL-23이 공유하는 한편, p19 단백질 서브유닛은 IL-23에만 고유하다. IL-23은 IL-12 수용체 베타-1(IL-12Rβ1) 사슬(p40에 결합)과, 고유 IL-23 수용체 사슬(IL23R)(IL-23 특이적 세포내 신호전달 제공)로 이루어진 2개 사슬 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. "IL23R"이란 용어는, 구체적으로 UniProt ID 번호 Q5VWK5인 인간 IL23R을 지칭한다.

몇몇 구현예들에서, IL23R 결합 도메인은 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.

적합한 IL23R 결합 도메인은 인간 IL23R에 특이적이고, 가변 경쇄[단 이 가변 경쇄는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4를 포함하는데, 여기서 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 11에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 LCDR에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]와 가변 중쇄[단 가변 경쇄는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는데, 여기서 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 서열 번호 12에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]를 포함한다. 적합하게 본 발명의 IL23R 결합 도메인은 (i) 서열 번호 11에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3과, (ii) 서열 번호 12에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다.

일 구현예에서, IL23R 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 11에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이거나, IL23R 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 IL23R 결합 도메인은 (i) 서열 번호 11에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 11에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함함] 및/또는 (ii) 서열 번호 12에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 12에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함함]를 포함한다. 구체적인 구현예에서, IL23R 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 11에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함하고/포함하거나, IL23R 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 12에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서, IL23R 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 11에 따르는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나 IL23R 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 12에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.

구체적인 구현예들에서, 상기 IL23R 결합 도메인은 서열 번호 15에 따르는 링커를 포함하는 scFv 포맷 내에 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) IL23R 결합 도메인 적어도 1개를 포함하는데, 단 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 서열 번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 서열 번호 26에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) HER2 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게는 1개를 포함한다.

"HER2"란 용어는, 구체적으로 UniProt ID 번호 Q5VWK5인 인간 HER2를 지칭한다.

몇몇 구현예들에서, HER2 결합 도메인은 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.

적합한 HER2 결합 도메인은 인간 HER2에 특이적이고, 가변 경쇄[단 이 가변 경쇄는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4를 포함하는데, 여기서 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 20에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 LCDR에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]와 가변 중쇄[단 가변 경쇄는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는데, 여기서 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 서열 번호 21에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]를 포함한다. 적합하게 본 발명의 HER2 결합 도메인은 (i) 서열 번호 20에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3과, (ii) 서열 번호 21에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다.

일 구현예에서, HER2 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 20에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이며, HER2 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 21에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 HER2 결합 도메인은 (i) 서열 번호 20에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 20에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함함] 및/또는 (ii) 서열 번호 21에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 21에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함함]를 포함한다. 구체적인 구현예에서, HER2 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 20에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함하고/포함하거나, 상기 HER2 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 21에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서, HER2 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 20에 따르는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나 HER2 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 21에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.

구체적인 구현예들에서, 상기 HER2 결합 도메인은 서열 번호 15에 따르는 링커를 포함하는 scFv 포맷 내에 있다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 HER2 결합 도메인은 트라스투주맙 또는 이의 기능성 단편이다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, (b) HER2 결합 도메인 적어도 1개를 포함하는데, 단 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 서열 번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 서열 번호 27에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민에 대한 특이성을 가지는 추가의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, (b) IL23R 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게 1개, 그리고 (c) HSA 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게 1개를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, (b) HER2 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게 1개, 그리고 (c) HSA 결합 도메인 적어도 1개, 바람직하게 1개를 포함한다.

"HSA"란 용어는, 구체적으로 UniProt ID 번호 P02768인 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체를 지칭한다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 인간 혈청중에 풍부하게 존재하고(총 단백질의 50%), 585개의 아미노산으로 구성된 66.4 kDa의 단백질이다(Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). 다기능성 HSA 단백질은 다수의 대사물질, 예컨대 지방산, 금속 이온, 빌리루빈 및 몇몇 약물의 결합 및 운반을 허용하는 구조와 결합되어 있다(Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). HSA의 혈청중 농도는 약 3.5 g/dL ~ 약 5 g/dL이다. 알부민 결합 항체와 이의 단편은, 예를 들어 약물이나 이 약물과 접합한 단백질의 생체 내 혈청중 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다.

몇몇 구현예들에서, HSA 결합 도메인은 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.

본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드에 사용하기 적합한 HAS 결합 도메인은 본 발명에 제공된 결합 도메인들이다. 본 발명의 HSA 결합 도메인은 서열이 표 1에 나열된 인간화 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

적합한 HSA 결합 도메인은 인간 HSA에 대해 특이적이고, 서열 번호 22에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 23에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 HSA 결합 도메인은 (i) 서열 번호 22에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 22에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함함] 및/또는 (ii) 서열 번호 23에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 23에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함함]를 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서, HSA 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 22에 따르는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나, HSA 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 23에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 인간 HSA에 특이적인 HSA 결합 도메인으로서 또 다른 적합한 것은 서열 번호 24에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 25에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 HSA 결합 도메인은 (i) 서열 번호 24에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 24에 따른 VL 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함함] 및/또는 (ii) 서열 번호 25에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 25에 따른 VH 서열로부터 취한 대응 CDR 영역에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함함]를 포함한다. 구체적인 구현예에서, HSA 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 24에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함하고/포함하거나, HSA 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 25에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 변이체를 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서, HSA 결합 도메인의 상기 가변 경쇄는 서열 번호 24에 따르는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나, HSA 결합 도메인의 상기 가변 중쇄는 서열 번호 25에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.

구체적인 구현예들에서, 상기 HSA 결합 도메인은 서열 번호 15에 따르는 링커를 포함하는 scFv 포맷 내에 있다.

적합하게, 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 다중 특이적 포맷, 예컨대 이중 특이적 포맷, 비제한적 예를 들자면 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 이중 특이적 T 세포 점유체(Bispecific T-cell Engager; BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv₂, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 이중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HAS-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 그리고 납-인투-홀(Knob-into-Hole) 항체(KiHs)(KiH 기법에 의해 제조된 이중 특이적 IgG), MATCH(WO2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84에 기술됨) 그리고 듀오바디(DuoBody)(듀오바디 기법에 의해 제조된 이중 특이적 IgG)(MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307)를 기반으로 하는 포맷으로부터 선택되는 항체 포맷이다. 단일 사슬 다이아바디(scDb), 구체적으로 이중 특이적 단량체 scDb 또는 scDb-scFv, 구체적으로 삼중 특이적 단량체 scDb-scFv가 본원에 사용되기에 특히 적합하다.

"다이아바디"란 용어는 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 내 VL과 결합된 VH(VH-VL)를 포함한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이의 쌍 형성을 허용하지 않는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 다이아바디는 이가 또는 이중 특이적일 수 있다. 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.

이중 특이적 scDb, 구체적으로 이중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 상기 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.

링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 구체적인 구현예에서, L1 및 L3는 둘 다 GGGGS(서열 번호 16)이다. 중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 구체적인 구현예들에서, L2는 (GGGGS)₄ (서열 번호 15)이다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 도는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드는 문헌[WO2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84]에 기술된 MATCH 포맷의 다중 특이적 및/또는 다가 항체이다.

본 발명의 이중 특이적, 이가, 다중 특이적 및/또는 다가 구조체는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다[예컨대 이중 특이적 구조체의 제조에 관한 문헌(Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14); 이중 특이적 다이아바디 및 탠덤 scFv에 관한 문헌(Hornig, N. &Fδrber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727, 및 WO 99/57150) 참조]. 본 발명의 이중 특이적 구조체를 제조하는데 적합한 방법의 구체 예로서는, 여타의 것들 중 Genmab 기법(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150 참조) 및 Merus 기법(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750 참조)을 추가로 포함한다. 기능성 항체 Fc 부분을 포함하는 이중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법도 또한 당 분야에 공지되어 있다[예컨대 문헌(Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134); 및 Suresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228) 참조].

이러한 방법은, 통상, 예컨대 하이브리도마 기법을 이용하여 원하는 항원으로 면역화된 마우스 유래 비장 세포와 골수종 세포를 융합하거나(예컨대 Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol.Chapter 2, Unit 2.5, 2006 참조), 또는 재조합 항체 조작(레파토리 클로닝 또는 파아지 전시/효모 전시)에 의하거나(예컨대 Chames&Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8 참조), 그리고 상이한 모노클로날 항체 2개의 항원 결합 도메인 또는 이의 단편이나 부분을 조합함으로써, 공지의 분자 클로닝 기법을 사용하여 이중 특이적 구조체를 만들어 모노클로날 항체를 생성하는 단계를 수반한다.

구체적인 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는 1개 이상의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.

구체적인 구현예들에서, 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 단량체 폴리펩티드, 구체적으로 본 발명에 따르는 항체 또는 이의 기능성 단편이 링커를 통하여 제2의 결합 도메인, 구체적으로 제2의 scFv 항체 단편과 결합된 scFv 항체 단편인 단량체 폴리펩티드이다.

구체적인 구현예들에서, 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드, 구체적으로 폴리펩티드 2개의 결합이 상기 다중 특이적 폴리펩티드 내에 포함된 항체 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인 간의 결합에 의해 유발되는 이량체 폴리펩티드이다. 이러한 구체적인 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는 WO 2016/202457의 교시에 따르는 다중 특이적 항체 구조체이다. 또 다른 구체적인 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는 단일 사슬 다이아바디 구조체(scDb)이다. 또 다른 구체적인 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는, VL-CL 및 VH-CH1으로 이루어진 Fab 단편(단 불변 도메인 중 하나는 스캐폴드를 형성함)의 헤테로이량체성 조립을 이용하는 (Fab-scFv)_n 구조체[여기서 n은 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고, scFv 단편 1개 이상은 가요성 링커를 통해 부착됨]이다.

제3의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 다중 특이적 폴리펩티드와, 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

"약학적으로 허용 가능한"이란 어구는, 어떤 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형이 건전한 의학적 판단 범위 안에 있고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증을 보이지 않는 채 인간 또는 동물 조직과의 접촉에 사용되기 적합하며, 합리적인 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에 비례하는 경우를 지칭한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 보통 약학적으로 허용 가능한 농도만큼의 염, 완충제, 보존제, 보충적 면역증강제, 예컨대 아주반트 및 시토카인을 추가로 포함할 수 있고, 선택적으로는 기타 치료제를 포함할 수 있다. 본 조성물은 또한 항산화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 항산화제로서는 티올 유도체(예컨대 티오글리세롤, 시스테인, 아세틸시스테인, 시스틴, 디티오에리트레이톨, 디티오트레이톨, 글루타치온), 토코페롤, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 황산 염(예컨대 황산나트륨, 중아황산나트륨, 아세톤중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 포름알데히드설폭실산나트륨, 티오황산나트륨) 및 노르디하이드로구아이아레트산이 예시될 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 페놀, 클로로부탄올, 벤질알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 염화벤잘코늄 및 염화세틸피리디늄일 수 있다.

본원에 제공된 구체적인 구현예들에서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은, 재조합 수단, 예컨대 숙주 세포에 형질감염되어 도입된 재조합 발현 벡터를 통해 발현된 항체, 재조합 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 DNA 서열의 합성, 유전자 조작, 또는 인간 면역글로불린을 암호화하는 서열, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 서열의, 이와 같은 다른 서열에의 스플라이싱(splicing)을 통한 생성을 수반하는 기타 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체에 의해 단리, 제조, 발현 또는 생성될 수 있다.

그러므로 제4의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단에 관한 것이다.

"핵산"이란 용어는 본원에서 "폴리뉴클레오티드"란 용어와 호환되어 사용되고 있으며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이것들의 중합체(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태)를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하는데, 이것들은 합성, 자연발생 및 비 자연발생되는 것이고, 기준 핵산의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준 뉴클레오티드의 대사 방식과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예들로서는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 암묵적으로 (예컨대 축퇴성 코돈 치환으로 인한) 자체의 보존적 변형 변이체와 상보성 서열을 포함할 뿐만 아니라, 명백하게 명시된 서열을 포함하기도 한다. 특히 이하에 기술된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택 코돈(또는 모든 코돈)의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

제5의 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단에 관한 것이다. "벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포 내에서의 발현을 도모하기 위한 폴리뉴클레오티드, 가장 일반적으로는 DNA 플라스미드를 의미한다. 벡터는 세포 내에서 복제할 수 있거나 복제할 수 없다. 일단 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 제조를 위한 벡터는 당 분야에 널리 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 수 있다. 그러므로 항체 암호화 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하기 위한 방법이 본원에 기술되어 있다. 당 업자들에게 널리 공지된 방법은 항체 암호화 서열, 적당한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전자 재조합법을 포함한다.

발현 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포에 옮겨질 수 있고, 이로부터 말미암는 세포는 이후 종래의 기법에 의해 배양되어, 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편을 생산할 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포에 관한 것이다. 임의의 구현예들에서, 숙주 세포는, 본 발명의 항체 또는 이것들의 단편의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유한다. 구체적인 구현예들에서, 숙주 세포는 상이한 벡터 2가지를 함유하는데, 이 벡터 2가지 중 제1 벡터는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예들에서, 제1 숙주 세포는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편의 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다.

토끼 항체 또는 설치류 항체의 인간화를 위한 방법은 임의의 당 업자에게 널리 공지되어 있다(예컨대 문헌(Borras, loc. cit.; Rader et al, The FASEB Journal, 발간 논문 10.1096/fj.02-0281fje, 2002년 10월 18일 온라인 발행; Yu et al (2010) "A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models". PLoS ONE 5(2): e9072. doi:10.1371/journal.pone.0009072) 참조). 토끼 또는 설치류의 면역화는 보통 말하는 그런 관심 항원, 예컨대 단백질로 수행될 수 있거나, 펩티드 또는 단백질 항원의 경우에는 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 플라스미드로 토끼를 DNA 면역화하여 수행될 수 있다.

제6의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포에 관한 것이다.

"숙주 세포"란 용어는, 내부에 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라, 그러한 세포의 자손까지 지칭하도록 의도되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 돌연변이 또는 환경의 영향으로 말미암아 다음 세대에 임의의 변형이 일어날 수 있으므로, 사실 이러한 자손은 모 세포와 동일할 수 없지만, 본원에 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"라는 용어의 범위 안에 여전히 포함된다.

제7의 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단, 또는 본 발명의 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

제8의 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따르는 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 결합 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열과, 선택적으로는 1개 이상의 추가 결합 도메인 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 다중 특이적 구조체에 클로닝하는 단계를 포함하는, 다중 특이적 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

제8의 측면에 관한 구체적인 구현예들에서, 제2 결합 도메인은 제2 항체 또는 이의 기능성 단편이다.

구체적인 구현예들에서, 상기 선택적이고, 부가적인 결합 도메인 적어도 1개가 존재하는데, 구체적으로 상기 부가적인 결합 도메인은 제3의 항체 또는 이의 기능성 단편이다.

다른 측면에서, 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 의약품 제조에 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 암, 염증성 질환 및/또는 자가면역성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러힌 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 암, 염증성 질환 및/또는 자가면역성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러힌 질환을 치료하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다

추가의 측면에서, 본 발명은 암, 염증성 질환 및/또는 자가면역성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러한 질환을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 암, 염증성 질환 및/또는 자가면역성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물 치료적 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 상기 질환들을 치료하는 방법을 제공한다.

"대상체"란 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 명시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어들은 본원에서 호환되어 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는 것", "치료하다", "치료된" 등과 같은 용어는, 요망되는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 이 효과는 어떤 질환 및/또는 해당 질환으로 인할 수 있는 부작용을 부분적으로나 완전히 치유하거나, 해당 질환의 진행을 지연시킨다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유류, 예컨대 인간에서 어떤 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하며, (a) 해당 질환을 억제하는 것, 예컨대 이 질환의 발현을 중단시키는 것; 그리고 (c) 해당 질환을 완화시키는 것, 예컨대 이 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.

"치료적 유효량" 또는 "효과적 양"이란 용어들은, 어떤 질환을 치료하기 위해 포유류 또는 기타 대상체에 투여될 때 해당 질환의 이와 같은 치료를 달성하기 충분한, 어떤 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제, 질환 및 이의 심각성, 치료받을 대상체의 나이, 체중 등에 따라서 달라질 것이다

염증성 질환 및/또는 자가면역성 질환은 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 궤양성 장염, 크론병, 전신홍반루프스, 연소자 당뇨병, 자가면역성 포도막염 및 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 허혈-재관류 손상일 수 있다.

"암"이란 용어는, 비정상 세포의 급속하고 무제한의 성장에 의해 특징지어지는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 확산될 수 있거나, 또는 혈류와 림프계를 통해 체내 다른 부분으로 확산될 수 있다. "종양" 및 "암"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되는데, 예컨대 상기 용어 둘 다는 고형 종양 및 액체 종양, 예컨대 확산성 종양 또는 순환성 종양을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "암" 또는 "종양"이란 용어는 전악성 암 및 종양뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다.

치료될 암으로서는 결장직장암, 폐암, 유방암, 비인두암, 구강암, 식도암, 췌장암, B 세포 림프종 및 T 세포 림프종, 예컨대 성인 T 세포 림프종 백혈병(ATLL), 급성 골수성 림프종(AML), 확산성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 소아 급성 림프아구성 림프종(B-ALL), 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 퇴행성 대 세포 림프종(ALCL), T 세포/자연살해세포 림프종, 그리고 말초 T 세포 림프종(PTCL)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적인 구현예들에서, 암은 결장직장암, 폐암, 유방암, 비인두암, 구강암, 식도암, B 세포 림프종 및 T 세포 림프종, 예컨대 성인 T 세포 림프종 백혈병(ATLL), 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 퇴행성 대 세포 림프종(ALCL), T 세포/자연살해세포 림프종, 그리고 말초 T 세포 림프종(PTCL)으로부터 선택된다.

실시예

하기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 설명해주는 것이다.

실시예 1: 선택 및 인간화

CD3ε 결합 도메인의 선두 후보를 제조하기 위해 6개의 토끼 모노클로날 항체 클론을 선택하였다.

선택한 클론의 인간화는, WO 2014/206561에 기술된 바와 같이 Vκ1/VH3 유형의 scFv 수용 틀 상에 토끼 CDR을 옮기는 단계를 포함하였다. 이 과정에서 CDR 영역 6개의 아미노산 서열이 공여 서열(토끼 mAb)상에서 동정되었고, 이를 수용 스캐폴드 서열에 그래프팅하였다. 선택을 위해, scFv를 VL-링커-VH 배열로 구성하였다. 일례는 단백질 사슬의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 서열 번호 4, 15 및 8의 조합일 것이다.

토끼 공여개체로부터 유래한 것으로서, 임의의 틀 위치에 있으며, CDR 위치선정에 영향을 미치는 관계로 항원 결합에도 잠재적으로 영향을 미친다고 기술된(Borras et al., 2010; J. Biol. Chem., 285:9054-9066) 추가의 아미노산을 최종 구조체에 포함시켰다. 표 2는, 클론 28-21-D09에 일어난 변화들(AHo 체계에 따르는 번호 매김)을 보여준다. 이와 같은 구조체들에 대한 특성규명 데이터를 비교한 결과, CDR 그래프팅만이 단독으로 행하여진 경우에 비하여 유의미한 이점이 확인되었다.

일단 이전 섹션에 기술된 컴퓨터에 의한 구조체 디자인이 완료되면, 대응 유전자를 합성하고, 세균 발현 벡터를 구성하였다. 발현 구조체의 서열을 DNA 수준으로 확인하였으며, 구조체를 일반적인 발현 및 정제 프로토콜에 따라서 제조하였다.

이.콜라이(E.coli) 내에서 단백질의 불용성 봉입체로서의 이종 발현을 수행하였다. 지수 성장용 출발 배양액을 발현 배양액에 접종하였다. 궤도 진탕기 내 진탕 플라스크에서 시판중인 풍부 배지를 사용하여 배양을 수행하였다. 세포를, 규정 OD600 2가 되도록 성장시키고 나서, 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 밤새도록 발현시켜 유도하였다. 발효의 막바지에 원심분리로 세포를 수득한 다음 초음파처리에 의해 균질화하였다. 이 시점에서 상이한 구조체들의 발현 수준을, 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석으로 확정하였다. 세포 파편 및 기타 숙주 세포 불순물을 제거하기 위한 수 회의 세척 단계를 포함하는 원심분리 프로토콜에 의해, 균질화 세포 펠릿으로부터 봉입체를 단리하였다. 정제한 봉입체를 변성 완충제(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 중에 용해하였으며, scFv를 계층 리폴딩(scalable refolding) 프로토콜에 의해 리폴딩하여, 원산대로 폴딩된 단량체 scFv를 밀리그램 단위의 양만큼 생성하였다. 하기 단계들을 포함하는 표준화 프로토콜을 이용하여 scFv를 정제하였다. 리폴딩 후 생성물을, Capto L 아가로스(GE Healthcare)를 이용하는 친화성 크로마토그래피로 포획하여, 정제된 scFv를 얻었다. 초기 검정에서 친화성 기준 및 효능 기준을 충족하였던 선도 후보물질을, HiLoad Superdex75 컬럼(GE Healthcare)을 이용하는 광내기 크기별 배제 크로마토그래피(polishing size-exclusion chromatography)에 의해 추가로 정제하였다. 정제 프로토콜 이후, 완충 염수 용액 중에 단백질을 제제화하여 특성규명하였다.

실시예 2: 인간화된 scFv의 특성규명

2.1 인간 및 사이노몰거스 CD3ε에 대한 친화성

인간화된 scFv의 인간 CD3ε 및 사이노몰거스 CD3ε에 대한 친화성을, T200 디바이스(Biacore, General Electric)를 사용하는 SPR 측정법으로 확정하였다. 아민 커플링 화학을 이용하여 CD3ε을 CM5 센서 칩(Biacore, General Electric)에 직접 커플링(coupling)하였다. 재생 정탐 및 표면 성능 검정을 수행하여 최선의 검정 조건을 찾은 후, scFv의 용량 반응을 측정하였으며, 이로부터 얻어진 결합 곡선을 이중 참조(double-referencing)한 다음(공 기준 채널 및 제로 피분석물 주입), 1:1 랑뮈르(Langmuir) 모델을 이용하여 피팅함으로써, 동력학적 매개변수를 검색하였다. 본 검정은 1 X PBS-Tween 완충제(pH 7.4) 중에서 진행하였다.

SPR 실험은, 토끼 공여 IgG 유래 구조적 잔기들을 인간화 서열에 부가하였을 때의 효과를 보여준다(표 3 참조). 오로지 토끼 CDR들만을 함유하는 구조체 28-21-D09-sc03은, 표적에 대해 검출 가능한 결합을 보이지 않았다. VL의 54번 위치에 아르기닌 또는 리신을 포함하는 클론 모두는 표적과의 결합을 약간 이나마 보였다. SPR 데이터를 기반으로 하여, 구조체 28-21-D09-sc04 유래 도메인들을 scDb 포맷에서의 추가 시험관내 특성규명을 위해 선택하였다.

2.2 열 언폴딩

검정된 scFv 구조체의 열 언폴딩에 있어 전이의 중간점을, 본질적으로는 Niesen에 의해 기술된 바(Niesen et al., Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21)와 같은 시차주사형광측정법(DSF)으로 확정하였다. DSF 검정법을 qPCR 기기(예컨대 MX3005p, Agilent Technologies) 내에서 수행하였다. 시료를, 5x SYPRO 오렌지를 최종 농도로 함유하는 완충제(시트르산염-인산염, pH 6.4, 0.25 M NaCl) 중에 희석하였다(총 부피 25 μL). 완충제 정탐 실험에서 언폴딩 온도의 pH 의존성을 확정하였는데, 모든 구조체에 대해 거의 동일한 pH 특징들이 관찰되었다. 시료를 3회 측정한 다음, 온도를 프로그램에 따라 25℃에서 96℃로 승온시켰다. 형광 신호를 획득한 다음, 미가공 데이터를 GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)으로 분석하였다.

기능성 인간화 scFv 구조체 모두의 열 언폴딩을 전술된 바와 같이 DSF에 의해 분석하였다. 모든 구조체는 60℃보다 높은 온도인 언폴딩 중간점을 보였던 한편(표 4 참조), 큰 입체형태 안정성과 높은 친화성 사이의 상관성은 없어 보였다(표 3과 비교).

2.2 보관 안정성

각 시료의 초기 단량체 함량을 크기별 배제 고성능 크로마토그래피(SE-HPLC)로 확정하였다(d0). 시료들을 Shodex™(Showa Denko) KW402.5-4F 컬럼(전개 완충제(250 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 6.0; 유속 0.35 mL/분))에 통과시켰다. 용리된 단백질을 280 nm에서의 흡광도로 검출하였다. 단량체 단백질 퍼센트를 산정하기 위해, 단량체 체류 시간(monomer retention time)에서 피크에 이르렀던 곡선 아래 면적을, 시료 매트릭스로 인해 보일 수 없는 곡선 아래 총 면적으로 나누었다. 시료를 4℃에 보관한 다음, 농도 10 mg/mL에서 28일의 기간에 걸쳐 반복적으로 분석하였다(도 1).

실시예 3: 단일 사슬 다이아바디(scDb) 포맷의 생성

CD3 도메인의 기능상 특성을 규명하기 위해, 선택한 도메인을 단일 사슬 다이아바디 포맷에 통합하여, T 세포 활성화와 표적 세포 고갈을 유도할 잠재성이 있는 도메인을 검정하였다.

선택한 CD3 도메인을, IL23R 결합 도메인(항 IL23R 클론 14-11-D07, 서열 번호 11 및 12 참조; PRO624, 서열 번호 26 참조) 또는 HER2 결합 도메인(트라스투주맙, 서열 번호 20 및 21 참조; PRO957, 서열 번호 27 참조) 중 어느 하나와 함께 단일 사슬 다이아바디 포맷에 통합하였다. 클론 28-21-D09로부터 유래한 VL 도메인 및 VH 도메인에 더하여, 기타 공개된 CD3 결합체 2개의 VL 도메인 및 VH 도메인도 또한 검정하였다(항 CD3 클론 09-24-H09-sc10: WO 2014/191113 및 서열 번호 9 및 10 참조; 항 CD3 클론 I2C: US 2010/0150918 및 서열 번호 13 및 14 참조).

이전에 기술된 바와 같이 단일 사슬 다이아바디(scDb) 포맷으로의 구조체 디자인을 수행하였다[Holliger et al., "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448]. 요약하면, 표 1에 나열한 바와 같은 가변 도메인을 VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA 형태[단 L1 및 3는 짧은 G₄S 링커(서열 번호 16)이고, L2는 긴 (G₄S)₄ 링커(서열 번호 15)임]로 배열하였다(표 5 참조).

뉴클레오티드 서열을 새로이 합성한 다음, 이.콜라이 발현에 대해 적응시킨 벡터(pET26b(+) 백본(Novagen)을 기반으로 함)에 클로닝하였다. 발현 구조체를 이.콜라이 균주 BL12(DE3)(Novagen)에 도입하여 형질전환시킨 다음, 이 세포를 출발 배양액인 2YT 배지에서 배양하였다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual). 발현 배양액을 접종한 다음, 진탕 플라스크에서 항온처리하였다(37℃ 및 200 rpm). 일단 OD₆₀₀ 1에 도달하면, 여기에 IPT를 최종 농도 0.5 mM가 되도록 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 밤새도록 발현시키고 나서, 세포를 원심분리(4000 g)로 수득하였다. 봉입체를 제조하기 위해, 세포 펠릿을 IB 재현탁 완충제(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100) 중에 재현탁하였다. 세포 슬러리에 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 리소자임, 10 mM 루펩티드, 100 μM PMSF 및 1 μM 펩스타틴을 보충하였다. 세포를 얼음으로 냉각시키면서 초음파 균질화를 3주기 실행하여 용해하였다. 그 다음, DNAse 0.01 mg/mL를 첨가하고, 균질화물을 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 원심분리(15000 g, 4℃)에 의해 봉입체(IB)를 침강시켰다. IB를 IB 재현탁 완충제 중에 재현탁한 다음, 초음파처리로 균질화하고 나서, 또다시 원심분리를 수행하였다. IB 재현탁 완충제로 세척 단계를 적어도 총 3회 수행하고 나서, IB 세척 완충제(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)로 2회 세척한 결과, 최종 IB가 수득되었다.

단백질 리폴딩을 위해, 단리한 IB를 가용화 완충제(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 중에 습윤 IB 1 g당 5 mL 비율로 재현탁하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리하여 가용화를 진행한 다음, DTT를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가한 후, 항온처리를 30분 더 계속 진행하였다. 가용화를 완료한 후, 10분 동안 원심분리(21,500 g 및 4℃)하여 용액을 청징화하였다. 리폴딩 완충제(통상적으로 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 5.0 M 우레아, 5 mM 시스테인, 1 mM 시스틴) 중에 가용화된 단백질을 신속하게 희석시켜 최종 단백질 농도 0.3 g/L가 되도록 함으로써 리폴딩을 수행하였다. 리폴딩 반응물을 보통 적어도 14시간 동안 항온처리하였다. 생성된 단백질 용액을 10분 동안 원심분리(8,500 g 및 4℃)하여 청징화하였다. 리폴딩된 단백질을, Capto L 수지(GE Healthcare) 상 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단리한 단량체 분획을 크기별 배제 HPLC로 분석하였고, 순도 확인을 위해서는 SDS-PAGE를, 그리고 단백질 함량 확인을 위해서는 UV/Vis 분광분석법을 수행하였다. 완충제를 투석에 의해 원산 완충제(50 mM 시트르산염-인산염, pH 6.4, 200 mM NaCl)로 교체하였다. 단백질 농도를, 안정성 분석에 의도되는 값으로 조정하였다.

실시예 4: 단일 사슬 다이아바디 ( scDb ) 구조체의 기능에 관한 특성규명

4.1 NFAT 리포터 유전자 검정법에 의한 T 세포 활성화

T 세포 활성화를 NFAT 검정법으로 검정하였다. Jurkat NFAT 리포터 T 세포주 (GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat 세포)는 IL-2 프로모터로부터 유래하는 NFAT(활성화 T 세포의 핵 인자) 반응 요소의 제어하에 루시퍼라아제 리포터 유전자를 발현하였다. 전사 인자 NFAT는 CD3과 가교시 활성화되어, T 세포 활성화에 수반되는 다수의 유전자들을 유도하였다. 이 계에서, CD3의 가교는 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현을 유도하였다. 유전자이식 IL-23R 발현(도 2 ~ 도 7) 또는 HER2 발현(도 8 및 도 9) 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포를 표적 세포로 사용하였으며, 모 CHO-K1 세포주는 음성 대조군 세포주로 사용하였다. 50 μl 검정 매질(RPMI 1640, 10% FCS)로 희석한 25,000개의 표적 생세포를 백색의 편평 바닥 96웰 평판에 도말하였다. 그 다음, 검정 매질중 4배 농축한 검정 단백질 25 μl를 적당한 웰에 첨가하였다. 마지막으로 50,000개 Jurkat 세포를 함유하는 검정 매질 25 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 평판을 천천히 진탕하면서 우선 RT에서 10분 동안 항온처리한 다음, 이를 37℃ 및 5% CO₂로 옮겨 5시간 동안 방치하였다. 루시퍼라아제 활성을 검출하기 위해, 제조자의 지침에 따라서 1단계 루시퍼라아제 검정 키트(Amsbio)를 사용하였다. 간단히 말해서, 항온처리 시간의 막바지에 루시퍼라아제 시약 기질을 루시퍼라아제 시약 완충제와 혼합한 다음, 이 혼합물 50 μl를 각각의 웰에 첨가한 후, 평판을 암실 및 RT에서 15분 동안 항온처리하였다. Flexstation III 다중 모드 미세평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 평판을 판독하였다.

4.2 사이토톡스 검정법(T 세포 구동 표적 세포 고갈)

혈액 세포 분획화

제조자의 지침에 따라서 림프구 분리 매질인 림포프렙(Lymphoprep)(Stemcell technologies)을 사용하여 새로 공급된 건강한 지원자 또는 건강한 사이노몰거스 원숭이의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리하였다. 요약하면, 인간 PBMC 단리 완충제(PBS, 2% FCS, 2mM EDTA) 또는 사이노몰거스 PBMC 단리 완충제(PBS, 5% FCS, 2mM EDTA)로 혈액을 1:2로 희석한 다음, 권장량만큼의 림포프렙 매질이 담긴 루코셉(Leucosep) 튜브에 첨가하였다. 루코셉 튜브를 800 g에서 30분 동안(인간 혈액), 또는 2000g에서 30분 동안(사이노몰거스 혈액) 중단없이 원심분리하였다(RT). 그 다음, PBMC를 함유하는 세포층을 수집하고 나서, 인간 또는 사이노몰거스 PBMC 단리 완충제로 2회 세척한 후, 적혈구 용해 완충제를 사용하여 RT에서 5분 동안 적혈구를 용해하였다. 그 다음, 단리한 인간 및 사이노몰거스 세포를 이것들에 대한 각각의 단리 완충제로 1회, 그리고 검정 매질(RPMI-1640, 10% FCS)로 1회 세척하였다. 혈소판을 제거한 후, 검정 매질 중에 상기 단리 PBMC를 재현탁하였다(밀도: 1ml당 3x10⁶ 개 생존 세포).

유세포분석법 기반 시험관 내 세포독성 검정( FC 검정) 및 CD8+ T 세포 활성화

항 IL23RxCD3ε 이중 특이적 구조체의 경우, 유전자이식 IL-23R 발현 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포를 표적 세포로 사용하였고, 모 CHO-K1 세포주는 음성 대조군 세포주로 사용하였다(도 2 ~ 도 7). 항 HER2 x 항 CD3ε 이중 특이적 구조체의 경우에는, 유전자 이식 HER2 발현 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포를 사용하였다(도 8 및 도 9). 사전에 PKH67로 표지화하고, 검정 매질(RPMI-1640, 10% FCS) 75 μl 중에 희석시킨 생존 표적 세포 5,000개를 96웰 평판에 첨가하였다. 그 다음, 6배 농축 검정 단백질(검정 매질 중 희석) 25 μl를 적당한 웰에 첨가하였다. 그 다음, E:T 비를 30:1로 만들기 위해, 150,000개의 생존 효과기 세포(PBMC)(검정 매질 50 μl 중 희석)를 각각의 웰에 넣고, 평판을 RT에서 뉴테이팅 믹서(nutating mixer)상에서 혼합한 다음, 37℃ 및 5% CO₂에서 이를 항온처리하였다. 16시간 후, 세포를 트립신으로 처리하고 나서, 염색 완충제(PBS, 2%　BCS, 2　mM EDTA)에 재현탁한 후, 비결합 평판으로 옮겼다.

세포를 상이한 마커, 즉 CD69, CD8, CD4, CD11c 및 어넥신-V에 대해 염색하였다. 분석을 위해서 세포자살 및 사멸 표적 세포와, 활성화된 CD8+ T 세포에 초점을 맞추었다. 이로써 표적 세포는 녹색 형광(PKH67)에 의해 동정되었으며, 이 표적 세포의 생존능력은 어넥신-V APC로 분석하였다. 효과기 세포(CD8+ 세포)를 자체의 표면상 CD8을 검출하여 동정하였다(항 CD8 PerCP-Cy5.5). 마지막으로 CD69 발현을 정량함으로써 CD8+ T 세포의 활성화를 검출하였다(항 CD69 PE). CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포를 더 잘 구별하기 위해 CD4를 사용하였다. 단핵구와 수지상 세포를 마킹(marking)하고, 이것들을 배제하기 위해 CD11c를 사용하였다. 천천히 진탕하면서 어넥신-V를 제외한 각각의 마커에 대해 항체를 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 염색 완충제로 1회, 그리고 어넥신 결합 완충제로 1회 세척한 다음, 진탕하면서 RT에서 30분 동안 어넥신-V 염색을 수행하였다. 세포를 어넥신-V 결합 완충제로 1회 세척한 다음, Novocyte 유세포분석기로 유세포분석을 실시하였다.

하기 식에 따라서 특이적 표적 세포 용해의 %를 계산하였다:

활성화된 CD8+ T 세포의 퍼센트는 CD69+ CD8+ T 세포의 비율에 대응하였다.

결과

T 세포 활성화의 특이성 비교

PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab) 및 PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})에 의해 매개되는, 표적 발현 세포의 특이적 표적 세포 용해의 비교는, EC₅₀이 각각 5.3 pM 및 3.3　pM로서 유사한 효능을 보여주었다(도 2 참조). 또한, 달성할 수 있는 최고 용해 수준은, 이들 두 단백질이 동일하였다. 그러나 항원 음성 세포와 함께 있을 때 그 차이는 분자 농도가 더 높을 때 나타났는데, 이때 PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})은 음성 대조군 세포의 부분 고갈을 초래하였다(도 2). 세포독성 검정용 키트의 웰 내 효과기 세포 활성화의 유세포분석법(FC)에 의한 정량은 특이적 용해의 결과와 비슷하였다. 표적 양성 세포를 포함하는 조건에 대한 용량 반응은 또한 효과기 세포의 활성화에 대해서도 관찰되었다. 이러한 결과들은 효과기 세포 활성화의 유사한 EC₅₀을 규명하여 주었던 한편, PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)는 명백히 최대 반응에 대하여 더 낮은 안정기를 보였다(도 3 참조). 표적 음성 세포가 담긴 웰에 있어서 비특이적 활성화에 대한 EC₅₀의 분명한 차이는 두 분자를 구별시켜 주었다. 두 분자를 더 높은 농도로 투여하면, 심지어 표적이 존재하지 않더라도 활성화된 세포의 증가가 초래되었다(도 3). 그러나 이러한 효과는 분자 PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})이 약 25배 더 낮은 농도로 존재할 때 관찰되었다. 그러므로 데이터는, 동일한 포맷 및 표적 결합 도메인을 적용 및 사용한 일대일 비교에서 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 항 CD3 도메인이 PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})의 항 CD3 도메인에 비해 더 특이적인 T 세포 활성화를 보인다는 증거를 제공한다.

PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab) 및 PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 중 항 CD3 도메인들의 특이적 표적 세포 고갈을, 인간 PBMC를 사용하는 세포독성 검정에서 비교하였다. scDb 2개는, 표적 양성 세포의 표적 세포 고갈 및 표적 음성 세포의 표적 세포 고갈의 비발생의 관점에서 거의 동일한 특성을 보였다(도 4 참조). 세포독성 검정법의 웰 내 효과기 세포 활성화의 유세포분석법(FC)에 의한 정량은, 특이적 용해에 관한 결과와 비슷하였다. 표적 양성 세포를 포함하는 조건에 대한 용량 반응이 또한 효과기 세포의 활성화에 대해서도 관찰되었는데, 이때 두 분자는 유사한 반응을 초래하였다. 표적 음성 세포를 포함하는 조건에서, 활성화된 효과기 세포의 증가는 오로지 최고 검정 조건에서만 관찰되었다(도 5 참조).

확인을 위한 실험에서, 분자 PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 T 세포 활성화에 대한 효능은 NFAT 리포터 유전자 검정법을 이용하여 검정하였다. 실험에서, 항원 양성 세포가 존재할 때 T 세포 활성화를 유도하는 효능은 거의 동일한 것으로 확인되었다(도 6 참조). EC₅₀은 세포 용해시의 농도에 비하여 약 8배까지 더 높게 변하였던 한편(도 4 참조), 데이터는 동일한 실험으로부터 얻어진 활성화 데이터와 비슷하였는데(도 5 참조), 즉 활성화 데이터는 또한 분명히 5배 더 높은 EC₅₀을 보였다. 항원 음성 세포와 함께 있을 때, 두 분자는 최고 검정 농도 50　nM일 때에만 활성화 신호의 기준치에 비한 증가를 보였다.

결론적으로 상기 결과들은, PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 통합된 항 CD3 도메인이 시험관내 효능과 특이성의 관점에서 동일하게 행동하여 표적 세포 고갈과 T 세포 활성화 둘 다를 유도함을 보여주었다. 이에 비하여, PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})의 항 CD3 도메인은 동일한 분자 배경에서 표적 세포 존재하에 T 세포를 활성화하는 효능과 이 T 세포의 특이적 고갈을 매개하는 효능을 거의 동일하게 보이면서, 이 PRO460(IL23RxCD3_{I2C Amgen})은 또한 표적 세포의 부재하에 T 세포의 증가한 활성화를 보였으며, 심지어 표적 음성 세포의 세포 용해까지도 초래하였다.

추가로 PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})에 의해 매개되는 HER2-표적 발현 세포의 특이적 표적 세포 용해에 대한 비교를 수행하였다. PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})에 의해 매개되는 HER2 발현 표적 세포의 특이적 표적 세포 용해 비교는, 16시간 후에 대략적으로 10배 더 큰 PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 효능을 보였으며, 40시간 후에는 대략 3배 ~ 4배 더 큰 효능을 보였다(도 8a 및 도 8b 참조). 40시간 후 두 분자는 표적 세포의 특이적 용해 수준이 동일해지는 지경에 이르렀다. 세포독성 검정시 웰에서 효과기 세포 활성화의 유세포분석법(FC)에 의한 정량은, 특이적 용해 결과와 비슷하였다. 표적 양성 세포를 포함하는 조건에 대한 용량 반응이 또한 효과기 세포의 활성화에 대해서도 관찰되었다. 이러한 결과들은 PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})에 대한 효과기 세포 활성화시 EC₅₀이 유사함을 밝혀주었다. 그러나 표적 음성 세포가 담긴 웰에 있어서 비특이적 활성화에 대한 EC₅₀의 분명한 차이는 PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})을 구별시켜 주었다. 두 분자를 더 높은 농도로 투여하면, 심지어 표적이 존재하지 않더라도 활성화된 세포의 증가가 초래되었다. 하지만, 이 효과는 분자 PRO956(HER2xCD3_{I2C Amgen})이 약 25배 더 낮은 농도로 존재할 때에도 관찰되었다(도 9a 및 도 9b 참조). 더욱이, 항 CD3 도메인이 항 HER2 결합 도메인과 함께 검정되었을 때, PRO957(HER2xCD3_제2세대 _Numab)은 PRO956(HER2xCD3_I2C _Amgen)에 비하여 표적 세포 고갈과 T 세포 활성화 둘 다를 유도함에 있어 월등한 효능과 특이성을 보였다.

4.3 PRO624 ( IL23RxCD3 _제2세대 _Numab ) 및 PRO 389( IL23RxCD3 _제1세대 _Numab )의 사이노몰거스 원숭이에 대한 교차 반응성

항 CD3ε 결합 도메인 I2C(US　2010/0150918)의 중요한 특징은, 유도체화된 치료제의 전임상 개발에 있어서 이점을 제공하는, 인간 및 비침팬지 영장류에 대한 종간 반응성(cross-species reactivit)이다. PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab) 및 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 통합된 항 CD3ε 도메인들 둘 다는 SPR 측정법에서 재조합 인간 CD3ε 및 사이노 CD3ε과 결합하였다(표 3 및 WO　2014/191113). 그러나 PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)에 통합된 클론 09-24-H09의 도메인들의 반응성은 원형질막 결합성 CD3ε의 세포 환경에 유지되지 않았다. 이와 반대로 PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab)에 존재하는, 클론 28-21-D09 유래 도메인들은 세포 검정에서도 또한 보존된 종 반응성을 보였다. 이와 같이 차이가 나는 특징들은 효과기 세포로서 사이노몰거스 PBMC를 사용하는 사이토톡스 검정법에 의해 특징지어졌다.

사이노 PBMC를 사용하는 사이토톡스 검정법 유래 데이터(도 7 참조)는, PRO624(IL23RxCD3_제2세대 _Numab)가 특이적 표적 세포 고갈을 유도하는 효능이 인간 효과기 세포를 사용하는 검정법에서와 유사하였음을 보여주었다(도 4 참조). 뿐만 아니라, 표적 음성 세포의 환경에서도 세포의 비특이적 용해는 관찰되지 않았다. 다른 한편, PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)의 분석은, 사이노 효과기 세포에 의한 표적 세포의 고갈은 없었음을 보여주었다. 도메인에 대한 추가의 특성규명은, PRO389(IL23RxCD3_제1세대 _Numab)와 사이노 CD3ε 발현 세포의 세포 결합은 일어나지 않았음을 밝혀주었다.

마지막으로, 09-24-H09 도메인은 인간 및 비침팬지 영장류에 대해 유관 종간 반응성을 보이지 않았다는 놀라운 발견을 통하여, 오로지 도메인 28-21-D09만이 현재의 첨단 기술에 비해 특이성에 있어 이점과, 종간 반응성에 대해 요망되는 특징 둘 다를 입증하기에 이르렀다.

본 발명은, 본원에 기술된 구체적인 구현예들에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실상 본원에 기술된 본 발명의 변형예들 이외에도 다수의 변형예가 전술된 발명의 설명으로부터 당 업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형예들은 첨부된 특허청구의범위 안에 포함되도록 의도된다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 공보, 검정 방법, 문헌 및 기타 자료들은 각각의 특허법 하에서 가능한 정도로 본원에 참조로 인용되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Numab Innovation AG <120> NOVEL ANTI-CD3 ANTIBODIES <130> 114035P877PC <150> US 62/515,293 <151> 2017-06-05 <150> EP17203832.5 <151> 2017-11-27 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 1 Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 2 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 3 Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 5 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 6 Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 7 Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile 1 5 10 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Thr Cys 85 90 95 Ser Asn Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg His Tyr Asn Arg Glu Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn 85 90 95 Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 Gly <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 13 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker sequence <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker sequence <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial FW4 sequence <400> 17 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial FW4 sequence <400> 18 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VL sequence <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn 85 90 95 Phe Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial VH sequence <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial diabody sequence <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn 85 90 95 Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 165 170 175 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 180 185 190 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 195 200 205 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 210 215 220 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 260 265 270 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser 275 280 285 Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 290 295 300 Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 305 310 315 320 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 325 330 335 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala 340 345 350 Cys Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr 355 360 365 Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 370 375 380 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 385 390 395 400 Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln 405 410 415 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser 420 425 430 His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile 435 440 445 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 450 455 460 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser 465 470 475 480 Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 485 490 495 Ser <210> 27 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial diabody sequence <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 115 120 125 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser 130 135 140 Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp 145 150 155 160 Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 165 170 175 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 180 185 190 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 195 200 205 Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser Asn Ile Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 245 250 255 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 260 265 270 Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala 275 280 285 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser 290 295 300 Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 325 330 335 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ser Ala Asp 340 345 350 Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 370 375 380 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 385 390 395 400 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 405 410 415 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 420 425 430 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 435 440 445 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 450 455 460 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 465 470 475 480 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 485 490 <210> 28 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 29 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 30 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 31 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 32 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 33 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 34 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 35 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 36 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 37 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 38 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Lys 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 39 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 40 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 41 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 42 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial scFv sequence <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Thr Gly Thr Ser His Ser 225 230 235 240 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250

Claims

인간 CD3에 특이적이고,
(a) 가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4을 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR1은 서열 번호 1에 제시되어 있는 바와 같고; 상기 LCDR2는 서열 번호 2에 제시되어 있는 바와 같으며; 상기 LCDR3은 서열 번호 3에 제시되어 있는 바와 같음]; 그리고
(b) 가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR1은 서열 번호 5에 제시되어 있는 바와 같고; 상기 HCDR2는 서열 번호 6에 제시되어 있는 바와 같으며; 상기 HCDR3은 서열 번호 7에 제시되어 있는 바와 같음]
를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
제1항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 Vκ1 경쇄이고/이거나, 상기 가변 중쇄는 VH3 사슬인 항체 또는 이의 기능성 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이거나 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8에 따르는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 항체 또는 이의 기능성 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 경쇄 아미노산 위치 54번(AHo 번호 매김에 따름)에 아르기닌 또는 리신, 바람직하게 아르기닌을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 하기 매개변수들중 1개 이상에 의해 특징지어지는, 항체 또는 이의 기능성 단편:
(i) 인간 CD3와의 결합에 대한 K_D 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 40 nM 미만, 구체적으로 10 nM 미만, 더욱 구체적으로 6 nM 미만임;
(ii) 사이노몰거스 CD3와의 결합에 대한 K_D 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 20 nM 미만, 구체적으로 10 nM 미만, 더욱 구체적으로 5 nM 미만임;
(iii) 구체적으로 시차주사형광측정법에 의해 확정되는 바에 따르면, scFv 항체 포맷으로 발현될 때의 열 언폴딩 온도(Tm)의 평균 중간점은 적어도 60℃, 특히 적어도 65℃를 초과함.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제7항에 의한 다중 특이적 폴리펩티드, 그리고 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제7항에 의한 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 제8항에 의한 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제7항에 의한 다중 특이적 폴리펩티드, 또는 제8항에 의한 조성물의, 의약품을 제조함에 있어서의 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단.
제11항에 의한 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법으로서, 제11항에 의한 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 제12항에 의한 벡터 또는 벡터 집단을 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
다중 특이적 구조체를 제조하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 결합 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열과, 선택적으로는 1개 이상의 추가 결합 도메인 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 다중 특이적 구조체에 클로닝하는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 방법.