BRPI0914251B1 - Imunoligante recombinante, seu fragmento de ligação ao antígeno, uso dos mesmos, e composição - Google Patents

Imunoligante recombinante, seu fragmento de ligação ao antígeno, uso dos mesmos, e composição Download PDF

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David Urech
Tea Gunde
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Abstract

IMUNOLIGANTE RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO DITO IMUNOLIGANTE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA CODIFICANDO O DITO IMUNOLIGANTE, USO DE DITO IMUNOLIGANTE, MÉTODO DE PRODUZIR UM IMUNOLIGANTE QUE TEM REATIVIDADE CRUZADA COM VEGF DE RATO/CAMUNDONGO E HUMANO. A presente invenção refere-se a imunoligantes anti-VEGF solúveis e estáveis compreendendo CDRs de anticorpos monoclonais de coelho. Os anticorpos referidos são planejados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por VEGF. A invenção também refere-se a hibridomas, ácido nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.

Description

Informação Relacionada
[0001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente US 61/133,212 depositado em 25 de junho de 2008, para o Pedido de Patente US 61/075,697 de 25 de junho de 2008, para o Pedido de Patente US 61/155,041 de 24 de fevereiro de 2009, e para o Pedido de Patente US 61/075,692 de 25 de junho de 2008.
[0002] Os conteúdos de quaisquer patentes, pedidos de patente, e referências citados do início ao fim deste relatório descritivo são por este incorporados por meio de referência em suas totalidades.
Antecedentes da Invenção
[0003] A angiogênese está implicada na patogênese de uma vari edade de distúrbios inclusive tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tais como retinopatias proliferativas ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD), artrite reumatoide, e psoríase (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. An- nu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); e Garner A, Vascular diseases . Em: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth G K, Eds. 2nd Edition Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). Em tumores sólidos, a angiogênese e o crescimento de nova vasculatura permitem a sobrevivência do tumor, e foi demonstrada uma correlação entre a densidade de microvasos em seções tumorais e a sobrevida dos pacientes em cânceres de mama e diversos (Weidner et al. N Engl J Med 324: 1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340: 11201124 (1992); e Macchiarini et al. Lancet 340: 145-146 (1992)).
[0004] O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um regulador conhecido de angiogênese e neovascularização, e foi demonstrado que é um mediador-chave de neovascularização associada com tumores e distúrbios intraoculares (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18: 4-25 (1997)). O mRNA do VEGF é superexpressado em muitos tumores humanos, e a concentração de VEGF em fluidos dos olhos é altamente correlacionada com a presença de proliferação ativa de vasos sanguíneos em pacientes com retinopatias diabéticas e outras relacionadas com isquemia (Berkman et al., J Clin Invest 91: 153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol. 26: 86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73: 931-934 (1996); e Dvorak et al. Am J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995); Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)). Além disso, estudos recentes mostraram a presença de VEGF localizado em membranas ne- ovasculares coroidais em pacientes afetados por degeneração macular relacionada com a idade (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37: 855-868 (1996)). Anticorpos neutralizantes anti-VEGF podem ser usados para suprimir o crescimento de uma variedade de linhagens celulares de tumor humano em camundongos nus e também inibir an- giogênese intraocular em modelos de distúrbios retinais isquêmicos (Kim et al. Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); e Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) (Adamis et al. Arch. Opthalmol. 114: 66-71 (1996)).
[0005] Portanto, existe a necessidade de anticorpos monoclonais anti-VEGF capazes de ser usados para o tratamento de tumores sólidos e várias doenças intraoculares neovasculares.
Sumário da Invenção
[0006] A invenção proporciona imunoligantes anti-VEGF solúveis eestáveis compreendendo CDRs de anticorpos monoclonais de coelho. Os referidos anticorpos são projetados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por VEGF. Também são revelados os hibridomas, ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para ex- pressão dos anticorpos recombinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.
Breve Descrição dos Desenhos
[0007] A Figura 1 ilustra a cinética da ligação de scFvs seleciona dos a hVEGF165 usando Biacore (hVEGF165). A Figura 1a mostra os dados obtidos para 511max: Ka (1/Ms): 6,59E+05; SE (ka): 1,10E+03; kd(1/s):4,40E-05; SE(kd):6,30E-07; KD(M): 6,67E-11. A Figura 1b mostra os dados obtidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10.
[0008] A Figura 2 ilustra a especificidade da espécie mostrando a cinética da ligação de 578max a VEGF humano, de camundongo e de rato. A Figura 2a mostra os dados obtidos para VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd):8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A Figura 2b mostra os dados obtidos para VEGF164 de camundongo: Ka (1/Ms): 1,03E+06; SE (ka): 2,30E+03; kd(1/s): 4,40E-04; SE(kd): 9,40E-07; KD(M): 4,29E-10. A Figura 2c mostra os dados obtidos para VEGF164de rato: Ka (1/Ms): 8,83E+05; SE (ka): 2,50E+03; kd(1/s): 5,28E-04; SE(kd): 1,20E-06; KD(M): 5,98E- 10.
[0009] A Figura 3 ilustra a cinética da ligação de 578max a isoformas de VEGF (hVEGF121 e hVEGF110). A Figura 3a mostra os dados obtidos para VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,4E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A Figura 3b mostra os dados obtidos para VEGF121 humano: Ka (1/Ms): 5,87E+05; SE (ka): 1,20E+03; kd(1/s): 5,58E-04; SE(kd): 9,60E-07;KD(M): 9,50E-11. A Figura 3c mostra os dados obtidos para VEGF110 humano: Ka (1/Ms): 5,23E+05; SE (ka): 1,30E+03; kd(1/s): 7,22E-04; SE(kd): 8,10E-07; KD(M): 1,38E-09.
[00010] A Figura 4 representa a cinética da ligação de 578max, 578minmax e 578wt a hVEGF165. A Figura 4a mostra os dados obtidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E- 04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A Figura 4b mostra os dados obtidos para 578minmax: Ka (1/Ms): 8,06E+05; SE (ka): 2,10E+03; kd(1/s): 5,04E-04; SE(kd): 1,10E-06; KD(M): 6,25E-10. A Figura 4c mostra os dados obtidos para 578wt-His: Ka (1/Ms): 8,45E+05; SE (ka): 1,60E+03; kd(1/s): 1,69E-04; SE(kd): 7,60E-07; KD(M): 2,00E-10.
[00011] A Figura 5 ilustra a estabilidade térmica de 578max, 578minmax e 578minmax_DHP (desdobramento medido por FT-IR). Figura 5a: 578minmax (ESBA903): Tm = 71,1°C; Figura 5b: 578minmax_DHP (no. 961): Tm= 70,2°C; Figura 5c: 578max (no. 821): Tm = 70,4°C.
[00012] A Figura 6 ilustra a desnaturação e precipitação de 578 derivados depois de stress térmico (Figura 6a: 50°C, Figura 6b: 60°C, Figura 6c: 70°C) por 30 min.
[00013] A Figura 7 ilustra a solubilidade de 578max, 578minmax e 578minmax_DHP (determinada por precipitação por sulfato de amô- nio). Figura 7a: 578max (no. 821). A V50 foi de 27,24 %. Figura 7b: 578minmax (ESBA903). A V50 foi de 28,13. Figura 7c: 578minmax_DHP (no. 961). A V50 foi de 32,36 %.
[00014] A Figura 8 ilustra a VEGFR2 competição ELISA versus HUVEC ensaio como métodos para medir a potência. Figura 8a: Comparação de Lucentis e 511max (no. 802) em ELISA de competição VEGFR2. R2 de Lucentis: 0,9417; R2 de ESBA802: 0,9700. EC50 de Lucentis: 7,137 nM; EC50 de no. 802: 0,8221 nM. Figura 8b: Comparação de Lucentis e 578max (no. 821). em ELISA de competição VEGFR2. Figura 8c: Comparação de Lucentis, 511maxC-his e 534max em prova HUVEC. R2 de Lucentis 0,9399; R2 de EP511maxC-his: 0,9313, R2 de EP534max: 0,7391. EC50 de Lucentis: 0,08825 nM, EC50 de 511maxC-his: 0,7646 nM, EC50 de 534max: 63,49 nM. Figura 8d: Comparação de Lucentis, 578min e 578max em prova HUVEC. R2 e Lucentis: 0,9419, R2 de EP578min: 0,8886, R2 de EP578max: 0,9274. EC50 de Lucentis: 0,1529 nM, EC50 de 578min: 1,528 nM, EC50 de 578max: 0,1031 nM.
[00015] A Figura 9 ilustra os efeitos de 578minmax sobre proliferação HUVEC induzida por hVEGF165. Os parâmetros da prova foram os seguintes: concentração de hVEGF165: 0,08 nM (3 ng/mL); incubação com VEGF e item de teste: 96 horas. A EC50 foi de 0,08959 nM para Lucentis e de 0,05516 nM para 578minmax, ao passo que a R2 foi de 0,9066 para Lucentis e de 0,9622 para 578minmax.
[00016] A Figura 10 ilustra os efeitos de 578minmax sobre Proliferação de HUVEC induzida por VEGF164 de camundongo e VEGF164 de rato. Os parâmetros da prova foram os seguintes: concentração de VEGF164 de camundongo: 0,08 nM (3 ng/mL); concentração de VEGF164 de rato: 0,3 nM (11,3 ng/mL). Ambas as concentrações foram selecionadas a EC90 para proliferação HUVEC induzida por VEGF; incubação com VEGF e item de teste: 96 horas. A Figura 10a ilustra os dados obtidos para VEGF de camundongo. A EC50 foi de 0,1196 nM para V1253 e de 0,06309 nM para 578minmax, ao passo que a R2 foi de 0,02744 para Lucentis, de 0,9348 para V1253 e de 0,9767 para EP578minmax. Lucentis não inibiu proliferação HUVEC induzida por VEGF de camundongo. A Figura 10b ilustra os dados obtidos para VEGF de rato. A EC50 foi de 1,597 nM para V1253 e de 0,06974 nM para 578minmax, ao passo que a R2 foi de 0,7664 para V1253 e de 0,6635 para 578minmax.
[00017] A Figura 11 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles em porcos da índia nus (parte I). O corante azul almar 1 foi administrado por via intravenosa a porcos da índia nus. Uma hora depois da injeção de corante, uma pré-mistura 2 de hVEGF (2,61 nM) e Lu- centis, ESBA903 ou no. 802, respectivamente, foi injetada na pele do animal 3. Uma hora depois da injeção das soluções, os animais 3 fo- ram eutanizados e as peles foram coletadas, limpas e fotografadas digitalmente usando luz incidente e transmitida. A área de corante azul Evans Blue que extravasou para dentro dos sítios de injeção foi avaliada usando Image J e a retenção dose-área foi plotada.
[00018] A Figura 12 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles em porcos da índia nus (parte II). A Figura 12a mostra os resultados obtidos para no. 803 (511max). A EC50 foi de 5,990 nM e teve uma dispersão estatística entre 2,060 e 17,41 nM ao passo que a R2 foi de 0,5800. A Figura 12b mostra os resultados obtidos para ES- BA903 (578minmax). A EC50 foi de 3,989 e teve uma dispersão estatística entre 1,456 e 10,93 nM ao passo que a R2 foi de 0,3920. A Figura 12c mostra a área de escoamento de corante para Lucentis. A EC50 não pode ser calculada para Lucentis devido ao pobre ajuste da curva.
[00019] A Figura 13 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles modificada em ratos (pré-mistura de hVEGF165 e 578minmax (ESBA903)). A Figura 13a ilustra a eficácia antipermeabilidade de Avastin no derrame vascular retinal induzido por VEGF em ratos - dose resposta. Avastin inibe a permeabilidade vascular retinal induzida por hVEGF. Pré-misturada antes da injeção. Aproximadamente equimolar, excesso de 3 vezes, ou de 10 vezes. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (tratados com Avastin vs. VEGF). A Figura 13b mostra a eficácia antipermeabilidade de ESBA903 no derrame vascular retinal induzido por VEGF em ratos. Dose resposta (pré-misturada, ivt). Completa inibição por ESBA903 da permeabilidade vascular retinal induzida por hVEGF. Pré-misturada antes. Aproximadamente equimolar, excesso de 3 vezes, ou de 10 vezes. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (tratados com ESBA903 vs. VEGF).
[00020] A Figura 14 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles modificada em ratos (administração tópica de 578minmax (ES- BA903)). A eficácia anti-permeabilidade de AL-51287 (ESBA903) no derrame vascular retinal induzido por VEGF em ratos foi testada na administração tópica. Cinco dias pré-tratamento, 4 gotas/ dia com uma formulação de 10 ng/mL de ESBA903. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (VEGF vs. AL-51287), ***p=0,060 (AL-51287 vs. AL-52667), **** (VEGF vs. AL-39324); p<0,05 (AL-39324 vs. veículo controle de referência). AL-51287: ESBA903; AL-52657: veículo controle de referência tópico; AL-39324: inibidor de RTK de molécula pequena.
[00021] A Figura 15 ilustra a definição de CDR1 de VH conforme usado aqui, neste requerimento de patente.
Descrição Detalhada
[00022] A invenção proporciona imunoligantes anti-VEGF solúveis e estáveis compreendendo CDRs de anticorpos monoclonais de coelho. Os referidos imunoligantes são projetados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por VEGF. Também são revelados os hibridomas, ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.
Definições
[00023] De modo a que a presente invenção possa ser mais prontamente entendida, alguns termos serão definidos a seguir. Definições adicionais são determinadas do início ao fim da descrição detalhada.
[00024] O termo "VEGF" se refere ao fator de crescimento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos, e fatores de crescimento celular endotelial vascular relacionados de 121, de 189, e de 206 aminoá- cidos, conforme descrito por Leung et al., Science 246: 1306 (1989), e Houck et al., Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991) junto com as formas aléli- cas que ocorrem naturalmente e processadas destes fatores de crescimento.
[00025] O termo "receptor do VEGF" ou "VEGFr" se refere a um receptor celular para VEGF, ordinariamente um receptor da superfície celular encontrado sobre células endoteliais vasculares, bem como variantes do mesmo o qual conserva a capacidade para ligar hVEGF. Um exemplo de um receptor do VEGF é a tirosina quinase fms-like (flt), um receptor transmembrana na família das tirosina quinases. DeVries et al., Science 255: 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5: 519 (1990). O receptor flt compreende um domínio extracelular, um domínio transmembrana, e um domínio intracelular com atividade de tirosi- na quinase. O domínio extracelular está envolvido na ligação do VEGF, ao passo que o domínio intracelular está envolvido na transdu- ção de sinalização. Outro exemplo de um receptor do VEGF é o receptor flk-1 (também referido como KDR). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6: 1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992). A ligação do VEGF ao receptor flt resulta na formação de no mínimo dois complexos de alto peso molecular, tendo um peso molecular aparente de 205.000 e 300.000 Dáltons. Acredita-se que o complexo de 300.000 Dáltons seja um dímero compreendendo duas moléculas de receptor ligadas a uma única molécula de VEGF.
[00026] O termo "coelho" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um animal pertencente à família das leporidae.
[00027] O termo "anticorpo" conforme usado aqui, neste pedido de patente, é um sinônimo para "imunoglobulina." Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser imunoglobulinas inteiras ou fragmentos das mesmas, compreendendo no mínimo um domínio variável de uma imunoglobulina, tais como domínios variáveis únicos, Fv (Sker- ra A. e Pluckthun, A. (1988) Science 240: 1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242: 423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83), Fab, (Fab')2 ou outros fragmentos de conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica.
[00028] O termo " CDR" se refere a uma das seis regiões hipervari- áveis dentro dos domínios variáveis de um anticorpo que essencialmente contribuem para ligação de antígeno. Uma das definições mais comumente usadas para as seis CDRs foi proporcionada por Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a definição de Kabat de CDRs somente se aplica para CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3, ou L1, L2, L3), bem como para CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3, ou H2, H3). CDR1 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H1 ou H1), no entanto, conforme usado aqui, neste pedido de patente, é definido pelos seguintes resíduos (numeração de Kabat): Começa com a posição 26 e termina antes da posição 36. Isto é basicamente uma fusão de CDR H1 conforme definido diferentemente por Kabat e Chotia (vide também a Figura 15 para ilustração). O termo "estrutura de anticorpo", ou algumas vezes somente "estrutura", conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere à parte do domínio variável, quer VL ou VH, a qual serve como um andaime para os loops de ligação de antígeno (CDRs) deste domínio variável. Em essência é o domínio variável sem as CDRs.
[00029] O termo "anticorpo de cadeia única", "Fv de cadeia única" ou "scFv" pretende se referir a uma molécula compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; VL) conectados por um encadeador. As moléculas de scFv referidas podem ter as estruturas gerais: NH2-VL-encadeador-VH-COOH ou NH2-VH-encadeador-VL-COOH.
[00030] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "identidade" se refere à combinação de sequências entre dois polipeptídeos, moléculas ou entre dois ácidos nucleicos. Quando uma posição em ambas as duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA for ocupada por ade- nina, ou uma posição em cada um de dois polipeptídeos for ocupada por uma lisina), então as respectivas moléculas são idênticas nesta posição. A "percentagem de identidade" entre duas sequências é uma função do número de posições combinando partilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são combinadas, então as duas sequências têm 60% de identidade. A título de exemplo, as sequências de DNA CTGACT e CAGGTT partilham 50% de identidade (3 das 6 posições totais são combinadas). De modo geral, é feita uma comparação quando duas sequências são alinhadas para dar máxima identidade. Semelhante alinhamento pode ser proporcionado usando, por exemplo, o método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas de computação tais como o programa Align (DNAstar, Inc.). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de extensão de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando quer uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de extensão de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
[00031] Sequências "similares" são aquelas as quais, quando alinhadas, partilham resíduos aminoácidos idênticos e similares, onde resíduos similares são substituições conservadoras para resíduos aminoácidos correspondentes em uma sequência de referência alinhada. A este respeito, uma "substituição conservadora" de um resíduo em uma sequência de referência é uma substituição por um resíduo que é fisicamente ou funcionalmente similar ao resíduo de referência correspondente, por exemplo, que tem um tamanho, formato, carga elétrica, propriedades químicas, inclusive a capacidade para formar ligações covalentes ou de hidrogênios, similares ou semelhantes. Deste modo, uma sequência "modificada por substituição conservadora" é uma sequência que difere de uma sequência de referência ou de uma sequência selvagem em que uma ou mais substituições conservadoras estão presentes. A "percentagem de similaridade" entre duas sequências é uma função do número de posições que contêm resíduos combinando ou substituições conservadoras partilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são combinadas e 2 de 10 posições contêm substituições conservadoras, então as duas sequências têm 80% de similaridade positiva.
[00032] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "modificações de sequências conservadoras" pretende se referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram negativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. As modificações de sequências conservadoras referidas incluem substituições, adições e eliminações de nucleotídeos e de aminoácidos. Por exemplo, modificações podem ser introduzidas por técnicas de rotina conhecidas na área, tais como mutagênese sítio- dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoáci- dos conservadoras incluem substituições nas quais o resíduo aminoá- cido é substituído com um resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais similares têm sido definidas na técnica. Estas famílias incluem amino- ácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, his- tidina), cadeias laterais acidíferas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, gli- cina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, tripto- fano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leuci- na, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidi- na). Deste modo, um resíduo aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-VEGF humano é preferencialmente substituído com outro resíduo aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificar substituições conservadoras de nucleotídeos e de ami- noácidos os quais não eliminam ligação de antígeno são de conhecimento geral na técnica (vide, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997))
[00033] " Sequência de consenso de aminoácidos" conforme usadoaqui, neste pedido de patente, se refere a uma sequência de aminoá- cidos que pode ser gerada usando uma matriz de no mínimo duas, e preferencialmente mais, sequências de aminoácidos alinhadas, e permitindo intervalos no alinhamento, de tal modo que é possível determinar o resíduo aminoácido mais frequente em cada posição. A sequência de consenso é a sequência a qual compreende os aminoácidos os quais são mais frequentemente representados em cada posição. No evento de que dois ou mais aminoácidos sejam igualmente representados em uma única posição, a sequência de consenso inclui ambos ou todos aqueles aminoácidos.
[00034] A sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser analisada em vários níveis. Por exemplo, conservação ou variabilidade podem ser apresentadas no nível de resíduo único, no nível de resíduo múltiplo, resíduo múltiplo com intervalos, etc. Resíduos podem apresentar conservação do resíduo idêntico ou podem ser conservados no nível de classe. Exemplos de classes de aminoácidos incluem grupamentos R polares mas não carregados (Serina, Treonina, Asparagina e Glutamina); grupamentos R carregados positivamente (Lisina, Argi- nina, e Histidina); grupamentos R carregados negativamente (Ácido glutâmico e Ácido aspártico); grupamentos R hidrofóbicos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptofano, Valina e Tiro- sina); e aminoácidos especiais (Cisteína, Glicina e Prolina). Outras classes são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica e podem ser definidas usando determinações estruturais ou outros dados para avaliar a substitubilidade. Neste sentido, um aminoácido substituível pode ser referir a qualquer aminoácido o qual pode ser substituído e manter conservação funcional naquela posição.
[00035] No entanto, será reconhecido que aminoácidos da mesma classe podem variar em grau por suas propriedades biofísicas. Por exemplo, será reconhecido que alguns grupamentos R hidrofóbicos (por exemplo, Alanina, Serina, ou Treonina) são mais hidrofílicos (isto é, de maior hidrofilicidade ou menor hidrofobicidade) do que outros grupamentos R hidrofóbicos (por exemplo, Valina ou Leucina). A hidro- filicidade ou hidrofobicidade relativa pode ser determinada usando métodos reconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) e Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
[00036] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, quando uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma primeira sequência VH ou VL) é alinhada com uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais (por exemplo, uma ou mais sequências VH ou VL em um banco de dados), uma posição de aminoácido em uma sequência (por exemplo, a primeira sequência VH ou VL) pode ser comparada com uma "posição correspondente" na uma ou mais sequências de amino- ácidos adicionais. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a "posição correspondente" representa a posição equivalente na uma ou mais sequências sendo comparadas quando as sequências são otimamente alinhadas, isto é, quando as sequências são alinhadas para obter a maior percentagem de identidade ou percentagem de similaridade.
[00037] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "banco de dados de anticorpos" se refere a uma compilação de duas ou mais sequências de aminoácidos de anticorpos (uma "multiplicidade" de sequências), e tipicamente se refere a uma compilação de dezenas, centenas ou ainda milhares de sequências de aminoácidos de anticorpos. Um banco de dados de anticorpos pode armazenar sequências de aminoácidos de, por exemplo, uma coleção de regiões VH de anticorpos, regiões VL de anticorpos ou ambas, ou pode armazenar uma coleção de sequências de scFv consistindo em regiões VH e VL. Preferencialmente, o banco de dados é armazenado em um meio fixo, pesquisável, tal como sobre um computador dentro de um programa de computador pesquisável. Em uma modalidade, o banco de dados de anticorpos é um banco de dados compreendendo ou consistindo em sequências de anticorpos de linhagem germinativa (germline). Em outra modalidade, o banco de dados de anticorpos é um banco de dados compreendendo ou consistindo em sequências de anticorpos maduras (isto é, expressadas) (por exemplo, um banco de dados de Ka- bat de sequências de anticorpos maduras, por exemplo, um banco de dados KBD). Em ainda outra modalidade, o banco de dados de anticorpos compreende ou consiste em sequências selecionadas funcio- nalmente (por exemplo, sequências selecionadas a partir de uma prova de QC).
[00038] O termo "imunoligante" se refere a uma molécula que contém todo ou uma parte do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, por exemplo, todo ou parte do domínio variável de cadeia pesada e/ou leve, de tal modo que o imunoligante reconhece especificamente um antígeno-alvo. Exemplos não limitantes de imunoligantes incluem moléculas de imunoglobulina de extensão total e scFvs, bem como fragmentos de anticorpos, inclusive mas não limitados a (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab encadeados por uma ponte dissulfe- to na região de articulação; (iii) um fragmento Fab’, o qual é essencialmente um Fab com parte da região de articulação (vide, Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (vi) um anticorpo de domínio único tal como um fragmento Dab (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH ou VL, um Camelid (vide Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), e Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) ou um anticorpo de tubarão (por exemplo, Nanobodies® Ig-NARs de tubarão); e (vii) um nanocorpo, uma região de cadeia pesada contendo o domínio variável e dois domínios constantes.
[00039] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "propriedade funcional" é uma propriedade de um polipeptídeo (por exemplo, um imunoligante) para o qual um aprimoramento (por exemplo, em relação a um polipeptídeo convencional) é desejável e/ou vantajoso para uma pessoa versada na técnica, por exemplo, de modo a melhorar as propriedades de fabricação ou a eficácia terapêutica do polipeptídeo. Em uma modalidade, a propriedade funcional é estabilidade (por exemplo, estabilidade térmica). Em outra modalidade, a propriedade funcional é solubilidade (por exemplo, sob condições celulares). Em ainda outra modalidade, a propriedade funcional é não agregação. Em ainda outra modalidade, a propriedade funcional é expressão de proteína (por exemplo, em uma célula procariótica). Em ainda outra modalidade a propriedade funcional é uma eficiência de redo- bramento depois de uma solubilização de corpos de inclusão em um processo de purificação correspondente. Em algumas modalidades, afinidade de ligação de antígeno não é uma propriedade funcional desejada para aprimoramento.
[00040] O termo "epitopo" ou "determinante antigênico" se refere a um sítio sobre um antígeno (por exemplo, sobre VEGF) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo liga especificamente. Um epitopo tipicamente inclui no mínimo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 ami- noácidos consecutivos ou não consecutivos em uma conformação espacial única. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology , Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
[00041] Os termos "ligação específica," "ligação seletiva," "liga sele-tivamente," e "liga especificamente," se referem à ligação de anticorpo a um epitopo sobre um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga com uma afinidade (KD) de cerca de menos de 10-7 M, tal como cerca de menos de 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor.
[00042] O termo "KD," ou "Kd" se refere à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação antígeno-anticorpo em particular. Tipicamente, os anticorpos da invenção ligam a VEGF com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos de cerca de 10-7 M, tal como menos de cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor, por exemplo, conforme determinado usando tecnologia de ressonância de plasmônio superficial (SPR) em um instrumento BIACORE.
[00043] Os termos "neutraliza VEGF," "inibe VEGF," e "bloqueia VEGF" são usados de modo intercambiável para se referir à capacidade de um anticorpo da invenção para evitar que VEGF interaja com um ou mais receptores do VEGF tais como VEGFR-1 e/ou VEGFR-2, e, por exemplo, dispare transdução de sinalização.
[00044] Um "imunoligante recombinante" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um imunoligante sendo produzido por expressão de DNA recombinante.
[00045] Um imunoligante "quimérico" conforme usado aqui, neste pedido de patente, tem uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, ao passo que o restante da uma ou mais cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de semelhantes anticorpos. Anticorpo humanizado conforme usado aqui, neste pedido de patente, é um subgrupo de anticorpos quiméricos.
[00046] "Anticorpos humanizados" conforme usado aqui, neste pedido de patente, são imunoligantes que foram sintetizados usando tecnologia de DNA recombinante para evitar a reação imune a antígenos estranhos. Humanização é uma técnica bem-estabelecida para reduzir a imunogenicidade de anticorpos monoclonais de fontes xenogênicas. Isto envolve a escolha de uma estrutura aceitadora, preferencialmente uma estrutura aceitadora humana, a extensão das CDRs do imunoli- gante doador a ser inserido na estrutura aceitadora e a substituição de resíduos da estrutura doadora dentro da estrutura aceitadora. Um método geral para enxertar CDRs em estruturas aceitadoras humanas foi revelado por Winter na Patente U.S. No. 5.225.539, a qual é por este incorporada por meio de referência em sua totalidade. A Patente U.S. No. 6.407.213 cujos ensinamentos são incorporados por meio de referência em sua totalidade, revela uma série de posições de aminoácidos da estrutura onde é preferencial uma substituição do imunoligante doador.
[00047] O termo "molécula de ácido nucleico," se refere a moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é "encadeado operavelmente" quando ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou reforçador é encadeado operavelmente a uma sequência codificante se afetar a transcrição da sequência.
[00048] O termo "vetor," se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido encadeado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," o qual se refere a um loop de DNA de fita dupla circular dentro do qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados dentro do genoma de uma célula hospedeira na introdução dentro da célula hospedeira, e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro.
[00049] O termo "célula hospedeira" se refere a uma célula na qual um vetor de expressão tenha sido introduzido. Células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, de plantas ou animais. Bactérias, as quais são suscetíveis à transformação, incluem membros das enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Sal monella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, e Haemophilus influenzae. Micróbios adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Linhagens de células hospedeiras animais adequadas incluem células CHO (linhagens de Ovário de Hamster Chinês) e NS0.
[00050] Os termos "tratar," "tratando," e "tratamento," se referem a medidas terapêuticas ou preventivas descritas aqui, neste pedido de patente. Os métodos de "tratamento" empregam administração a um indivíduo, que necessite de semelhante tratamento, de um anticorpo da presente invenção, por exemplo, um indivíduo tendo um distúrbio mediado por VEGF ou um indivíduo o qual essencialmente pode adquirir um distúrbio semelhante, de modo a prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade de, ou melhorar um ou mais sintomas do distúrbio ou distúrbio recidivante, ou de modo a prolongar a sobrevida de um indivíduo além da esperada na ausência de semelhante tratamento.
[00051] O termo "distúrbio mediado por VEGF" se refere a qualquer distúrbio, o início, progressão ou a persistência dos sintomas ou estados de doença o qual requer a participação do VEGF. Distúrbios mediados por VEGF exemplares incluem, mas não estão limitados a, degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolen- tal, carcinomas de mama, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofageanos, carcinomas colorretais, carcinomas hepáticos, carcinomas ovarianos, os comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicais, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endo- metriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma,câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe, carcinomas de laringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de pele, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de pâncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligodendro glioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiossarcomas, carcinomas do trato urinário, carcinomas da tireoide, tumor de Wilm, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, proliferação vascular anormal associada com fa- comatoses, edema (tal como o associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, artrite reumatoide, psoríase e aterosclerose.
[00052] O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" se refere a uma quantidade suficiente para atingir ou no mínimo atingir parcialmente o efeito desejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou no mínimo parar parcialmente a doença e suas complicações em um paciente já sofrendo da doença. Quantidades eficazes para esta aplicação vão depender da gravidade do distúrbio sendo tratado e do estado geral do sistema imune do próprio paciente.
[00053] O termo "indivíduo" se refere a qualquer animal humano ou não-humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio mediado por VEGF.
[00054] O termo "Min-graft" ou "min" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um domínio variável humanizado que foi gerado por enxerto de CDRs de coelho de um domínio variável de coelho em uma estrutura aceitadora humana que ocorre naturalmente (FW 1.4, SEQ ID No. 172). Não são feitas alterações nas regiões da estrutura. A própria estrutura foi pré-selecionada por propriedades funcionais desejáveis (solubilidade e estabilidade).
[00055] O termo "Max-graft" ou "max" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um domínio variável humanizado que foi gerado por enxerto de CDRs de coelho de um domínio variável de coelho dentro da estrutura aceitadora humana "rabbitized", "RabTor" (rFW1.4, SEQ ID No. 173), ou dentro de um derivado da mesma refe- rido como rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174). A estrutura "RabTor" foi preparada incorporando resíduos de coelho conservados (os quais de modo diverso são de preferência variáveis em outras espécies) em posições da estrutura geralmente envolvidas em estrutura de domínio variável de coelho e estabilidade, com o objetivo de gerar uma estrutura aplicável universalmente que aceita virtualmente qualquer grupo de CDRs de coelho sem a necessidade de enxerto de resíduos de estrutura doadora além de em posições que são diferentes em sua sequência progenitora presumível, por exemplo, que foram alterados durante hipermutação somática e deste modo, possivelmente contribuem para ligação de antígeno. A sequência progenitora presumível é definida como sendo o complemento da linhagem germinativa de coelho mais próxima e em caso de não poder ser estabelecido o complemento da linhagem germinativa mais próxima, as sequências de consenso do subgrupo de coelho ou as sequências de consenso de coelho com uma alta percentagem de similaridade.
[00056] O termo "Min-Max" ou "minmax" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um domínio variável humanizado consistindo em uma cadeia leve variável "Min-graft" combinada com uma cadeia pesada variável "Max-graft".
[00057] O termo "Max-Min" ou "maxmin" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um domínio variável humanizado consistindo em uma cadeia leve variável "Max-graft" combinada com uma cadeia pesada variável "Min-graft".
[00058] Foram usadas diferentes nomenclaturas para os imunoli- gantes gerados. Estes são tipicamente identificados por um número (por exemplo, no. 578). Nos casos em que foi usado um prefixo tal como EP ou Epi (por exemplo, EP 578 o qual é idêntico a Epi 578), o mesmo imu- noligante é deste modo indicado. Ocasionalmente, um imunoligante recebeu uma segunda designação a qual é identificada pelo prefixo "ESBA". Por exemplo, ESBA903 designa o mesmo imunoligante que 578minmax ou EP578minmax ou Epi578minmax.
[00059] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado que o entendido comumente por uma pessoa com conhecimento regular da técnica à qual esta invenção diz respeito. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste pedido de patente, possam ser usados na prática ou experimentação da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, inclusive definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não se pretende que sejam limi- tantes.
[00060] Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes adicionais nas seguintes subseções. Deve ser entendido que as várias modalidades, preferências e alcances podem ser combinados à vontade. Além disso, dependendo da modalidade específica, definições, modalidades ou alcances selecionados podem não se aplicar.
Imunoligantes Anti-VEGF
[00061] Em um aspecto, a presente invenção proporciona imunoli- gantes que ligam VEGF e portanto são adequados para bloquear a função do VEGF in vivo. As CDRs destes imunoligantes são derivadas de anticorpos monoclonais anti-VEGF de coelho os quais foram obtidos a partir de coelhos que foram imunizados com VEGF humano e/ou um fragmento do mesmo (SEQ ID No.1). Que se saiba, esta é a primeira vez que anticorpos monoclonais anti-VEGF foram obtidos a partir de coelhos e caracterizados em detalhes. Surpreendentemente, foi visto que as afinidades (Kd) são extraordinariamente elevadas.
[00062] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um imu- noligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo no mí- nimo uma de uma sequência de aminoácidos CDRH1, uma sequência de aminoácidos CDRH2, uma sequência de aminoácidos CDRH3, uma sequência de aminoácidos CDRL1, uma sequência de aminoácidos CDRL2, ou uma sequência de aminoácidos CDRL3. Sequências de aminoácidos CDR exemplares para aplicação nos imunoligantes da invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 (Tabelas 1 a 6). Tabela 1. sequências de aminoácidos CDR H1 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0001
Tabela 2. sequências de aminoácidos CDR H2 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0002
Figure img0003
Tabela 3. sequências de aminoácidos CDR H3 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0004
Tabela 4. sequências de aminoácidos CDR L1 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0005
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Tabela 5. sequências de aminoácidos CDR L2 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0007
Tabela 6. sequências de aminoácidos CDR L3 de imunoligantes anti- VEGF da invenção.
Figure img0008
Figure img0009
[00063] Em uma modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência de consenso do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 71. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 37 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 71. Preferencialmente, a CDR é selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 70.
[00064] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61. Preferenci-almente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 27 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61. Em outra modalidade preferencial, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 27 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61.
[00065] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, e SEQ ID NO: 62. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, e SEQ ID NO: 62.
[00066] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 63. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 63.
[00067] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 64. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 30 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 64.
[00068] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 65. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 31 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 65.
[00069] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 66. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 32 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 66.
[00070] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 67. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 33 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 67.
[00071] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 68. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 34 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 68
[00072] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 35 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69. Alternativamente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 35 e/ou as CDRs do VL do referido imunoli- gante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69.
[00073] Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoli- gante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70. Prefe-rencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 36. Adicionalmente ou alternativamente, o VL do referido imunoligante compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70, por exemplo, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70; ou SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70.
[00074] Em uma modalidade muito preferencial, o imunoligante revelado aqui, neste pedido de patente, neutraliza VEGF humano e tem reatividade cruzada com VEGF de rato/ camundongo ou uma porção do mesmo.
[00075] O imunoligante pode compreender um anticorpo ou qualquer andaime de ligação alternativo capaz de acomodar CDRs. As CDRs determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 podem ser enxertadas sobre qualquer andaime de ligação adequado usando quaisquer métodos reconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029- 10033; a Patente U.S. No. 5.225.539 para Winter, e as Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.). No entanto, é preferencial que os imunoligantes revelados aqui, neste pedido de patente, sejam humanizados, e portanto adequados para aplicações terapêuticas.
[00076] No caso de anticorpos, as CDRs de coelho determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 podem ser enxertadas dentro das regiões de estrutura de qualquer anticorpo de quaisquer espécies. No entanto, foi verificado previamente que anticorpos ou derivados de anticorpos compreendendo as estruturas identificadas na chamada triagem de "controle de qualidade" (publicação de patente internacional No. WO0148017) são caracterizadas por uma estabilidade e/ou solubilidade geralmente elevada e portanto também podem ser úteis no contexto de aplicações extracelulares tais como neutralização de VEGF humano. Além disso, foi verificado adicionalmente que uma combinação em particular destas estruturas solúveis e estáveis de VL (cadeia leve variável) e de VH (cadeia pesada variável) é particularmente adequada para acomodar CDRs de coelho. Por conseguinte, em uma modalidade, as CDRs determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 são enxertadas dentro das estruturas de anticorpos humanos derivadas por triagem de "controle de qualidade" reveladas na patente europeia No. EP1479694. As sequências de aminoácidos de estruturas exemplares para uso na invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 172 a 174. Foi visto surpreendentemente que na enxertação dentro da referida estrutura ou de seus derivados, pode ser totalmente mantida a conformação de loop de uma grande variedade de CDRs de coelho, largamente independente da sequência da estrutura do doador. Além disso, a referida estrutura ou seus derivados contendo diferentes CDRs de coelho são bem expressados e produzidos ao contrário das cadeias únicas selvagens de coelho e ainda quase totalmente retêm a afinidade dos anticorpos de coelho do doador original.
[00077] Portanto, em uma modalidade preferencial, as CDRs e/ou motivos de CDR revelados aqui, neste pedido de patente, estão pre-sentes em uma sequência de estrutura da região variável de cadeia pesada tendo no mínimo 80% de identidade de sequência, mais prefe-rencialmente no mínimo 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 169. Em uma modalidade preferencial, a sequência de estrutura de região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 170 ou SEQ ID NO: 171.
[00078] Em uma modalidade preferencial, as CDRs e/ou motivos de CDR revelados aqui, neste pedido de patente, estão presentes em uma sequência de estrutura da região variável de cadeia leve tendo no mínimo 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente no mínimo 90%, 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 167, mais preferencialmente compreendendo SEQ ID NO: 167 ou SEQ ID NO: 168.
[00079] Em anticorpos de coelho, CDRs podem conter resíduos cis- teína que se tornam dissulfeto ligado a resíduos cisteína na estrutura do anticorpo. Por conseguinte, pode ser necessário, ao enxertar CDRs de coelho contendo resíduos cisteína dentro de regiões de estrutura não de coelho, introduzir resíduos cisteína na estrutura não de coelho por, por exemplo, mutagênese para facilitar a estabilização de CDR de coelho através de uma ligação dissulfeto.
[00080] Em outras modalidades, a invenção proporciona um imuno- ligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo no mínimo uma de uma sequência de aminoácidos de VL ou uma sequência de aminoácidos de VH. Sequências de aminoácidos de VH ou de VL exemplares para uso nos imunoligantes da invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 72 a 106 e 107 a 166, respectivamente.
[00081] Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 131 (VH 60-11-4, VH 60-11-6, VH 60-11-4min, VH 60-11-6min, VH 60-11-4max e VH 60- 11-6max, respectivamente);
[00082] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:82 e SEQ ID NO: 93 (VL 60, VL 60min, VL 60max, respectivamente).
[00083] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 132 (VH 435, VH 435min e VH 435max, respectivamente);
[00084] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO:94 (VL 435, VL 435min e VL 435max, respectivamente).
[00085] Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais pre-ferencialmente 100% de identidade com a SEQ ID NO: 175 (435max).
[00086] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencial- mente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 133 (VH 453, VH 453min e VH 453max, respectivamente);
[00087] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:84 e SEQ ID NO: 95(VL 453, VL 453min e VL 453max, respectivamente).
[00088] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 134 (VH 375, VH 375min e VH 375max, respectivamente);
[00089] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO:96 (VL 375, VL 375min e VL 375max, respectivamente).
[00090] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 123 e 135 (VH 610, VH 610min e VH 610max, respectivamente);
[00091] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 97 (VL 610, VL 610min e VL 610max, respectivamente).
[00092] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 e SEQ ID NO: 166 (VH 578 e variantes das mesmas);
[00093] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 105 (VL 578 e variantes das mesmas).
[00094] Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais pre-ferencialmente 100% de identidade com a SEQ ID NO: 178 (578min), SEQ ID NO: 179 (578max) ou SEQ ID NO: 180 (578minmax).
[00095] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 137 (VH 534, VH 534min e VH 534max, respectivamente);
[00096] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identi- dade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 99 (VL 534, VL 534min e VL 534max, respectivamente).
[00097] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO:138 e SEQ ID NO: 143 (VH 567, VH 567min e VH 567max, respectivamente);
[00098] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO:. 79, SEQ ID NO:89 e SEQ ID NO: 100 (VL 567, VL 567min e VL 567max, respectivamente).
[00099] Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais pre-ferencialmente 100% de identidade com a SEQ ID NO: 177 (567min).
[000100] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO:139 e SEQ ID NO: 140 (VH 509, VH 509min, VH 509max e VH 509maxII, respectivamente);
[000101] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 101 (VL 509, VL 509min e VL 509max, respectivamente).
[000102] Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 145 (VH 511, VH 511min, VH 511max e VH 511maxDHP, respectivamente);
[000103] e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 106 (VL 511, VL 511min, VL 511max e VL 511minC41L, respectivamente).
[000104] Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais pre-ferencialmente 100% de identidade com a SEQ ID NO: 176 (511_max).
[000105] Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substancial similaridade com uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2 a 166 e nas SEQ ID Nos: 175 a 180, e em que o imunoligante essencialmente retém ou aprimora as propriedades funcionais desejadas do imunoligante anti-VEGF da invenção. Percentagens de similaridades preferenciais incluem, mas não estão limitadas a, no mínimo 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade.
[000106] Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substancial identidade com uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2166 e nas SEQ ID Nos. 175-180, e em que o imunoligante retém ou aprimora as propriedades funcionais desejadas do imunoligante anti- VEGF da invenção. Percentagens de identidades preferenciais incluem, mas não estão limitadas a, no mínimo 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade.
[000107] Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substituições conservadoras em relação a uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2 a 166 e nas SEQ ID Nos. 175 a 180, e em que o imu- noligante retém ou aprimora as propriedades funcionais desejadas do imunoligante anti-VEGF da invenção.
[000108] Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoli- gantes que ligam especificamente a VEGF humano e têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VEGF de rato, VEGF de coelho ou VEGF de porco da índia. Em uma modalidade em particular o imunoligante anti-VEGF pode ligar especificamente a VEGF humano e de rato/ camundongo.
[000109] Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoli- gantes que ligam especificamente a VEGF humano e não têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VEGF de rato, VEGF de coelho ou VEGF de porco da índia.
[000110] Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoli- gantes que ligam especificamente a VEGF humano e em que os imu- noligantes são maturados por afinidade.
[000111] Em uma modalidade, anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção são anticorpos de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab. No caso de anticorpos scFv, um domínio VL selecionado pode ser encadeado a um domínio VH selecionado em outra orientação por um encadeador flexível. Um encadeador do estado da técnica adequado consiste em sequências de aminoácidos GGGGS repetidas ou variantes das mesmas. Em uma modalidade preferencial da presente invenção um encadeador (GGGGS)4 da sequência de aminoácidos determinada na SEQ ID NO: 181, mas variantes de 1 a 3 repetições também são possíveis (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros encadeadores que podem ser usados para a presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50: 51-59. A disposição pode ser quer VL-encadeador- VH ou VH-encadeador-VL, com a orientação precedente sendo a orientação preferencial. No entanto, anticorpos de domínio único VH ou VL também são contemplados. No caso de fragmentos Fab, domínios variáveis de cadeia leve selecionados VL são fundidos à região constante de uma cadeia kappa de Ig humana, ao passo que os domínios variáveis de cadeia pesada adequados VH são fundidos ao primeiro domínio constante (N-terminal) CH1 de uma IgG humana. No C- término do domínio constante ou em outros sítios do domínio variável ou constante, pode ser formada uma ponte dissulfeto inter-cadeias. Alternativamente, as duas cadeias também podem ser encadeadas por um encadeador flexível resultando em um anticorpo Fab de cadeia única.
[000112] Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ter afinidades para VEGF humano com constantes de dissociação Kd em uma faixa de 10-14M a 10-5M. Em uma modalidade preferencial da presente invenção a Kd é <1 nM. A afinidade de um anticorpo por um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando um método adequado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", em Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman e Company: New York, NY ) e métodos descritos nos mesmos.
[000113] A empresa Epitomics vende um anticorpo anti-VEGF o qual é um anticorpo monoclonal de coelho (VEGF (C-term) Rabbit Antibody, Cat. no. 1909-1). O referido anticorpo é direcionado contra resíduos sobre o C-término de VEGF humano e portanto não tem capacidade de neutralizar VEGF. Portanto, o referido anticorpo não é adequado para aplicações terapêuticas. Além disso, a referida IgG monoclonal não é um anticorpo humanizado mas é uma imunoglobulina de extensão total de coelho natural. Além disso, foi demonstrado que este anticorpo não reconhece a forma nativa de VEGF.
Imunoligantes que ligam os mesmos epitopos sobre VEGF
[000114] Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos que ligam a um epitopo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211. Os anticorpos referidos podem ser identificados com base em sua capacidade para competição cruzada com um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 em provas de ligação de VEGF de rotina inclusive, mas não limitadas a, ELISA. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação a VEGF humano de um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 demonstra que o anticorpo de teste é capaz de competição cruzada portanto interage com um epitopo de sobreposição sobre VEGF humano como um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211.
[000115] Adicionalmente ou alternativamente, os referidos anticorpos também podem ser identificados usando técnicas de mapeamento de epitopos de rotina para determinar se eles ligam aos mesmos imuno- gênios peptídicos. Técnicas de modelagem estrutural também podem ser empregadas para definir adicionalmente os precisos determinantes moleculares para a interação anticorpo/VEGF, inclusive, mas não limi-tadas a, RMN , cristalografia de raios X, modelagem computacional, ou tomografia de proteína (Banyay et al., 2004, ASSAY and Drug Deve-lopment Technologies (2), 5, Page 516-567). Na verdade, a estrutura cristalina de VEGF foi resolvida e os resíduos aminoácidos superficiais envolvidos na ligação de VEGFr são conhecidos (Fuh, et al., 2006, J. Biol. Chem., 281, 6625-6631). Por conseguinte, dada a sequência de aminoácidos do imunogênio peptídico e o conhecimento estrutural de VEGF disponíveis na técnica, está dentro do conhecimento geral da técnica a identificação de anticorpos que ligam a um epítope sobre VEGF reconhecido pelos anticorpos compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211.
[000116] Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epi- topo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 ligam a VEGF com uma afinidade de no mínimo 107 M-1, por exemplo, no mínimo 107 M-1, no mínimo 108 M-1, no mínimo 109 M-1, no mínimo 1010 M-1, no mínimo 1011 M-1, no mínimo 1012 M1 ou no mínimo 1013 M-1.
[000117] Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epi- topo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 ligam especificamente a VEGF humano e não têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VGEF de rato, VEGF de coelho, ou VEGF de porco da índia.
[000118] Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epi- topo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VEGF de rato, ou VEGF de coelho.
Variantes Otimizadas
[000119] Os anticorpos da invenção podem ser adicionalmente oti-mizados para propriedades funcionais aprimoradas, por exemplo, para solubilidade e/ou estabilidade reforçadas.
[000120] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são otimizados de acordo com a metodologia de "consenso funcional" re-velada na publicação do Pedido de Patente No. de Série PCT/EP2008/001958, intitulado "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", depositado em 12 de março de 2008, a qual é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
[000121] Por exemplo, os imunoligantes de VEGF da invenção podem ser comparados com um banco de dados de scFvs funcionalmente selecionados para identificar posições de resíduos aminoácidos que são ou mais ou menos tolerantes de variabilidade do que a posição ou posições correspondentes no imunoligante de VEGF, deste modo indi-cando que a posição ou posições de resíduos identificados podem ser adequadas para manipulação para melhorar a funcionalidade tal como estabilidade e/ou solubilidade.
[000122] Posições de estruturas exemplares para substituição são descritas na publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. PCT/ CH2008/000285, intitulado "Methods of Modifying Antibodies, e Modified Antibodies com Improved Functional Properties" , depositado em 25 de junhode 2008, e PCT Pedido de Patente No. PCT/CH2008/000284, intitulado "Sequence Based Engineering e Op- timization of Single Chain Antibodies", depositado em 25 de junho de 2008. Por exemplo, uma ou mais das seguintes substituições podem ser introduzidas em uma posição de aminoácido (a numeração AHo é referida para cada uma das posições de aminoácidos listadas abaixo) na região variável de cadeia pesada de um imunoligante da invenção: (a) Q ou E na posição de aminoácido 1; (b) Q ou E na posição de aminoácido 6; (c) T, S ou A na posição de aminoácido 7, mais preferenci-almente T ou A, de modo ainda mais preferencial T; (d) A, T, P, V ou D, mais preferencialmente T, P, V ou D, na posição de aminoácido 10, (e) L ou V, mais preferencialmente L, na posição de amino- ácido 12, (f) V, R, Q, M ou K, mais preferencialmente V, R, Q ou M na posição de aminoácido 13; (g) R, M, E, Q ou K, mais preferencialmente R, M, E ou Q, de modo ainda mais preferencial R ou E, na posição de aminoácido 14; (h) L ou V, mais preferencialmente L, na posição de amino- ácido 19; (i) R, T, K ou N, mais preferencialmente R, T ou N, de modo ainda mais preferencial N, na posição de aminoácido 20; (j) I, F, L ou V, mais preferencialmente I, F ou L, de modo ainda mais preferencial I ou L, na posição de aminoácido 21; (k) R ou K, mais preferencialmente K, na posição de ami- noácido 45; (l) T, P, V, A ou R, mais preferencialmente T, P, V ou R, de modo ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 47; (m) K, Q, H ou E, mais preferencialmente K, H ou E, de modo ainda mais preferencial K, na posição de aminoácido 50; (n) M ou I, mais preferencialmente I, na posição de aminoá- cido 55; (o) K ou R, mais preferencialmente K, na posição de ami- noácido 77; (p) A, V, L ou I, mais preferencialmente A, L ou I, de modo ainda mais preferencial A, na posição de aminoácido 78; (q) E, R, T ou A, mais preferencialmente E, T ou A, de modo ainda mais preferencial E, na posição de aminoácido 82; (r) T, S, I ou L, mais preferencialmente T, S ou L, de modo ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 86; (s) D, S, N ou G, mais preferencialmente D, N ou G, de modo ainda mais preferencial N, na posição de aminoácido 87; (t) A, V, L ou F, mais preferencialmente A, V ou F, de modo ainda mais preferencial V, na posição de aminoácido 89; (u) F, S, H, D ou Y, mais preferencialmente F, S, H ou D, na posição de aminoácido 90; (v) D, Q ou E, mais preferencialmente D ou Q, de modo ainda mais preferencial D, na posição de aminoácido 92; (w) G, N, T ou S, mais preferencialmente G, N ou T, de modo ainda mais preferencial G, na posição de aminoácido 95; (x) T, A, P, F ou S, mais preferencialmente T, A, P ou F, de modo ainda mais preferencial F, na posição de aminoácido 98; (1) R, Q, V, I, M, F, ou L, mais preferencialmente R, Q, I, M, F ou L, de modo ainda mais preferencial Y, de modo ainda mais prefe-rencial L, na posição de aminoácido 103; e (z) N, S ou A, mais preferencialmente N ou S, de modo ainda mais preferencial N, na posição de aminoácido 107.
[000123] Adicionalmente ou alternativamente, uma ou mais das substituições que se seguem podem ser introduzidas na região variável de cadeia leve de um imunoligante da invenção: (aa) Q, D, L, E, S, ou I, mais preferencialmente L, E, S ou I, de modo ainda mais preferencial L ou E, na posição de aminoácido 1; (bb) S, A, Y, I, P ou T, mais preferencialmente A, Y, I, P ou T, de modo ainda mais preferencial P ou T na posição de aminoácido 2; (cc) Q, V, T ou I, mais preferencialmente V, T ou I, de modo ainda mais preferencial V ou T, na posição de aminoácido 3; (dd) V, L, I ou M, mais preferencialmente V ou L, na posição de aminoácido 4; (ee) S, E ou P, mais preferencialmente S ou E, de modo ainda mais preferencial S, na posição de aminoácido 7; (ff) T ou I, mais preferencialmente I, na posição de aminoá- cido 10; (gg) A ou V, mais preferencialmente A, na posição de ami- noácido 11; (hh) S ou Y, mais preferencialmente Y, na posição de ami- noácido 12; (11) T, S ou A, mais preferencialmente T ou S, de modo ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 14; (jj) S ou R, mais preferencialmente S, na posição de amino- ácido 18; (kk) T ou R, mais preferencialmente R, na posição de ami- noácido 20; (12) R ou Q, mais preferencialmente Q, na posição de ami- noácido 24; (mm) H ou Q, mais preferencialmente H, na posição de aminoácido 46; (nn) K, R ou I, mais preferencialmente R ou I, de modo ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 47; (oo) R, Q, K, E, T, ou M, mais preferencialmente Q, K, E, T ou M, na posição de aminoácido 50; (pp) K, T, S, N, Q ou P, mais preferencialmente T, S, N, Q ou P, na posição de aminoácido 53; (qq) I ou M, mais preferencialmente M, na posição de ami- noácido 56; (rr) H, S, F ou Y, mais preferencialmente H, S ou F, na po-sição de aminoácido 57; (55) I, V ou T, mais preferencialmente V ou T, R, de modo ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 74; (tt) R, Q ou K, mais preferencialmente R ou Q, de modo ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 82; (uu) L ou F, mais preferencialmente F, na posição de ami- noácido 91; (vv) G, D, T ou A, mais preferencialmente G, D ou T, de modo ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 92; (xx) S ou N, mais preferencialmente N, na posição de ami- noácido 94; (yy) F, Y ou S, mais preferencialmente Y ou S, de modo ainda mais preferencial S, na posição de aminoácido 101; e (zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G ou I, mais preferencialmente H, E, L, A, T ,V, S, G ou I, de modo ainda mais preferencial A ou V, na posição de aminoácido 103.
[000124] O sistema de numeração AHo é descrito adicionalmente em Honegger, A. e Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670). Alter-nativamente, pode ser usado o sistema de numeração de Kabat conforme descrito adicionalmente em Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health e Human Services, NIH Publication No. 913242). Tabelas de conversão para os dois sistemas de numeração diferentes usados para identificar posições de resíduos aminoácidos em regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos são proporci-onadas em A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
[000125] Em outras modalidades, os imunoligantes da invenção compreendem uma ou mais mutações de reforço da solubilidade e/ou estabilidade descritas no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.692, intitulado "Solubility Optimization of Immunobinders", depositado em 25 de junho de 2008. Em algumas modalidades prefe-renciais, o imunoligante compreende uma mutação de reforço da solu-bilidade em uma posição de aminoácido selecionada entre o grupo de posições de aminoácidos de cadeia pesada consistindo em 12, 103 e 144 (convenção de Numeração AHo). Em uma modalidade preferencial, o imunoligante compreende uma ou mais substituições selecionadas entre o grupo consistindo em: (a) Serina (S) na posição de amino- ácido de cadeia pesada 12; (b) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 103; e (c) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 144. Em outra modalidade, o imunoligante compreende as seguintes substituições: (a) Serina (S) na posição de aminoácido de cadeia pesada 12; (b) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 103; e (c) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 144.
Hibridomas Expressando Anticorpos Anti-VEGF de Coelho
[000126] Em outro aspecto, a invenção proporciona um hibridoma expressando um anticorpo monoclonal compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 72-81. Métodos para produzir hibridomas a partir de células B de coelho são de conhecimento geral na técnica e são revelados, por exemplo, no pedido de patente U.S. No. 2005/0033031.
Produção de Imunoligantes Anti-VEGF
[000127] Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente in- venção podem ser gerados usando técnicas de rotina no campo da ge-nética recombinante. Conhecendo as sequências dos polipeptídeos, os cDNAs codificando as mesmas podem ser gerados por síntese genética (www.genscript.com). Estes cDNAs podem ser clonados em plasmí- deos de vetores adequados. Uma vez que o DNA codificando um domínio VL e/ou um domínio VH é obtido, mutagênese sítio direcionado, por exemplo, por PCR usando iniciadores mutagênicos, pode ser realizada para obter vários derivados. A melhor sequência "de partida" pode ser escolhida dependendo do número de alterações desejadas nas sequências VL e/ou VH.
[000128] Métodos para incorporar ou enxertar CDRs em regiões da estrutura incluem os determinados, por exemplo, em Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 1002910033; na Patente U.S.No. 5.225.539 para Winter, e nas Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al, bem como os revelados no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.697, intitulado "Humanization of Rabbit Antibodies Using Universal Antibody Frameworks" , depositado em 25 de junho de 2008.
[000129] Técnicas de clonagem e mutagênese de rotina de conhecimento geral da pessoa versada na técnica podem ser usadas para anexar encadeadores, domínios de permuta ou fusões de construto para a produção de fragmentos Fab. Protocolos básicos revelando os métodos gerais desta invenção são descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed. 2001) e em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).
[000130] A sequência de DNA carregando um gene codificando um polipeptídeo de scFv, ou no caso de fragmentos Fab, codificando quer dois genes separados ou um operon bi-cistrônico compreendendo os dois genes para as fusões VL-CK e as VH-CH1 são clonados em um vetor de expressão adequado, preferencialmente um com um promotor indutível. Deve-se ter cuidado para que na frente de cada gene esteja presente um sítio de ligação de ribossoma apropriado que assegure translação. Deve ser entendido que os anticorpos da presente invenção compreendem as sequências reveladas ao invés de eles consistirem nas mesmas. Por exemplo, estratégias de clonagem podem necessitar que seja produzido um construto a partir do qual esteja presente um anticorpo com um ou uns poucos resíduos adicionais na extremidade de N-terminal. Especificamente, a metionina derivada do códon de partida pode estar presente na proteína final em casos em que não foi clivada pós-translacionalmente. A maioria dos construtos para anticorpos scFv dão origem a uma alanina adicional na extremidade de N-terminal. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, é escolhido um vetor de expressão para expressão periplás- mica em E. coli (Krebber, 1997). O referido vetor compreende um promotor na frente de uma sequência de sinalização clivável. A sequência codificante para o peptídeo do anticorpo é em seguida fundida em estrutura à sequência de sinalização clivável. Isto possibilita o direcionamento do polipeptídeo expressado para o periplasma bacteriano onde a sequência de sinalização é clivada. O anticorpo é em seguida dobrado. No caso dos fragmentos Fab, tanto os peptídeos de fusões VL-CK quanto os VH-CH1 devem ser encadeados a um sinal de exportação. A ligação S-S covalente é formado nas cisteínas de C-terminal depois dos peptídeos terem atingido o periplasma. Se for preferencial expressão citoplasmática de anticorpos, os referidos anticorpos geralmente podem ser obtidos em altas produções a partir de corpos de inclusão, os quais podem ser facilmente separados de outros fragmentos celulares e proteína. Neste caso os corpos de inclusão são solubi- lizados em um agente desnaturante tal como, por exemplo, cloridrato de guanidina (GndHCl) e em seguida redobrado por procedimentos de renaturação de conhecimento geral daqueles versados na técnica.
[000131] Plasmídeos expressando os polipeptídeos scFv ou Fab são introduzidos em um hospedeiro adequado, preferencialmente uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero, o mais preferencialmente uma cepa de E. coli adequada como, por exemplo, JM83 para expressão periplásmica ou BL21 para expressão em corpos de inclusão. O polipeptídeo pode ser colhido quer a partir do periplasma ou formar corpos de inclusão e ser purificado usando técnicas de rotina tais como cromatografia de permuta iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia por afinidade e/ou filtração por gel de conhecimento da pessoa versada na técnica.
[000132] Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados com respeito à produção, solubilidade e estabilidade in vitro. As capacidades de ligação a VEGF, prefe-rencialmente a VEGF humano, podem ser testadas in vitro por ELISA ou ressonância de plasmônio superficial (BIACore), usando VEGF humano recombinante conforme descrito na patente internacional No. WO 97/29131, o último método também possibilitando determinar a taxa constante koff, a qual deve ser preferencialmente menos de 10-3s- 1. Valores de Kd de ^10 nM são preferenciais.
[000133] À parte de anticorpos com forte afinidade de ligação para VEGF humano, também é desejável selecionar anticorpos anti-VEGF os quais têm outras propriedades benéficas de uma perspectiva terapêutica. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo o qual inibe o crescimento de células HUVEC em resposta a VEGF (vide o Exemplo 3). Em uma modalidade, o anticorpo pode ser capaz de inibir a proliferação de células HUVEC em resposta a uma concentração quase maximamente eficaz de VEGF (0,08 nM). Preferencialmente, o anticorpo tem um valor de dose eficaz 50 (ED50) de não mais de cerca de 5 nM, preferencialmente não mais de cerca de 1 nM, preferencialmente não mais de cerca de 1 nM, preferencialmente não mais de cerca de 0,5 nM e o mais preferencialmente não mais de cerca de 0,06 nM, para inibir a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF nesta " prova de crescimento de células endoteliais", isto é, nestas concentrações o anticorpo é capaz de inibir o crescimento de células endoteliais induzido por VEGF in vitro por, por exemplo, 50% ou mais.
Moléculas biespecíficas
[000134] Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-VEGF, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antígeno do mesmo, pode ser derivado ou encadeado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que liga a no mínimo dois sítios de ligação diferentes ou moléculas-alvo diferentes. O anticorpo da invenção pode ser derivado ou encadeado a mais de uma molécula funcional diversa para gerar moléculas multiespecíficas que ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas-alvo diferentes; também se pretende que as moléculas multiespecíficas referidas sejam englobadas pelo termo "molécula biespecífica" conforme usado aqui, neste pedido de patente. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente encadeado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de modo diverso) a uma ou mais moléculas de ligação diversas, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, antígenos específicos de tumor ou específicos de patógeno, peptídeo ou miméti- co de ligação, de tal modo que resulte uma molécula biespecífica. Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo no mínimo uma primeira molécula de ligação tendo especificidade para VEGF e uma segunda molécula de ligação tendo espe- cificidade para um ou mais epitopos-alvo adicionais.
[000135] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem uma especificidade de ligação no mínimo um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, inclusive, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou um constru- to de cadeia única conforme descrito por Ladner et al. na Patente U.S. No. 4.946.778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por meio de referência.
[000136] Apesar de serem preferenciais anticorpos monoclonais hu-manos, outros anticorpos os quais podem ser empregados nas molé-culas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
[000137] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando especificidades de ligação dos constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especi-ficidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separa-damente e em seguida conjugada a uma outra. Quando as especifici-dades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de ligação ou de reticulação podem ser usados para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclo-haxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação preferenciais são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[000138] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados através de ligação sulfidrila, por exemplo, através das regiões de articulação de C-término das duas cadeias pesadas ou outros sítios, quer ocorrendo naturalmente ou introduzidos artificialmente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, preferencialmente um, antes da conjugação.
[000139] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender no mínimo duas moléculas de cadeia única. Adicionalmente, uma molécula biespecífica pode ser um scFv que liga especificamente ao primeiro alvo, em que o VH e o VL do referido scFv são encadeados com um encadeador flexível compreendendo um domínio proporcionando ligação específica a um segundo alvo. Encadeadores adequados são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S. No. 60/937.820. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; na Patente U.S. Número 5.455.030; na Patente U.S. Número 4.881.175; na Patente U.S. Número 5.132.405; na Patente U.S. Número 5.091.513; na Patente U.S. Número 5.476.786; na Patente U.S. Número 5.013.653; na Patente U.S. Número 5.258.498; e na na Patente U.S. Número 5.482.858.
[000140] A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bio- ensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou por ensaio de “imu- noblot". Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente etiquetado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos VEGF-anticorpo podem ser detectados usando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à enzima o qual reconhece e liga especificamente aos complexos anticorpo-VEGF. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando qualquer um de uma variedade de imu- noensaios diversos. Por exemplo, o anticorpo pode ser etiquetado radioativamente e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, de março de 1986, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este pedido de patente). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como a aplicação de um contador yO ou um contador de cintilação ou por autorradiografia.
Imunoconjugados
[000141] Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza um anticorpo anti-VEGF, ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Os conjugados referidos são referidos aqui, neste pedido de patente, como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para (por exemplo, mata) células. Exem- plos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glu- cocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromici- na e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracila decarbazi- na), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa cloram- bucila, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfa- mida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis- diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleo- micina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
[000142] Outros exemplos preferenciais de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duo- carmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e derivados das mesmas. Um exemplo de um conjugado de anticorpo de calique- amicina está disponível comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
[000143] Citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção usando tecnologia de encadeadores disponíveis na técnica. Exemplos de tipos de encadeadores que têm sido usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e encadeadores contendo peptídeo. Pode ser escolhido um encadeador que é, por exemplo, suscetível à clivagem por baixo pH dentro do compartimento lisossô- mico ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressadas em tecido tumoral tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).
[000144] Para discussão adicional de tipos de citotoxinas, encadea- dores e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, vide também Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
[000145] Anticorpos da presente invenção também podem ser conju-gados a um isótopo radioativo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para serem usados de modo diagnóstico ou terapeuticamente incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodos para preparar radioimunoconjugados estão estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis comercialmente, inclusive Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para preparar radioimu- noconjugados usando os anticorpos da invenção.
[000146] Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção de fármaco não deve ser considerada como estando limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. As proteínas referidas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina diftérica; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferon-y; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.
[000147] Técnicas para conjugação da porção terapêutica referida a anticorpos são de conhecimento geral, vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer The-rapy" , em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy , Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Aplicações de Anticorpos Anti-VEGF
[000148] Para aplicações terapêuticas, os anticorpos anti-VEGF da invenção são administrados a um mamífero, preferencialmente um ser humano, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável tal como as discutidas aqui, neste pedido de patente, inclusive as que po-dem ser administradas a um ser humano por via intravenosa, como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias tópica, intraocular, intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, ou por inalação. Os anticorpos também são convenientemente administrados por vias intratumoral, peritumoral, intralesional, ou perilesional, para exer- cer efeitos terapêuticos locais bem como sistêmicos. Espera-se que a via intraperitoneal seja particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores de ovário.
[000149] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem de anticorpo apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratado, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico do paciente e da reação ao anticorpo, e do critério do médico assistente. O anticorpo é administrado convenientemente ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.
[000150] Os anticorpos anti-VEGF são úteis no tratamento de doenças mediadas por VEGF conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Por exemplo, degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é uma causa importante de perda visual grave na população idosa. A forma exsudativa de degeneração macular relacionada com a idade é caracterizada por neovascularização coroidal e desprendimento de células epiteliais do pigmento retinal. Como a neovascularização coroidal está associada com uma dramática piora no prognóstico, os anticorpos contra VEGF da presente invenção são especialmente úteis para reduzir a gravidade da degeneração macular relacionada com a idade. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais inclusive oftalmoscopia, microscopia do fundo ocular, e tomografia computadorizada ocular.
[000151] São consideradas todas as doses e todos os regimes apro-vados pelo FDA adequados para aplicação com Lucentis. Outras doses e regimes são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.641, intitulado "Improved Immunobinder Formulations And Methods For Adminstration", depositado em 25 de junho de 2008, e no Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/058.504, os quais são expressamente incorporados aqui, a este pedido de patente.
[000152] De acordo com outra modalidade da invenção, a eficácia do anticorpo para prevenir ou tratar doença pode ser aprimorada adminis-trando o anticorpo serialmente ou em combinação com outro agente que é eficaz para estes fins, tal como fator de necrose tumoral (TNF), um anticorpo capaz de inibir ou neutralizar a atividade angiogênica de fator de crescimento de fibroblasto acidífero ou básico (FGF) ou fator de crescimento de hepatócito (HGF), um anticorpo capaz de inibir ou neutralizar as atividades coagulantes de fator tecidual, proteína C, ou proteína S (vide Esmon et al., Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 91/01753, publicada em 21 de fevereiro de 1991), um anticorpo capaz de ligar ao receptor HER2 (vide Hudziak et al., Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 89/06692, publicada em 27 de julho de 1989), ou um ou mais agentes terapêuticos convencionais tais como, por exemplo, agentes alquilantes, fotocoagulantes (tais como verteporfina), antagonistas do ácido fólico, antimetabólitos do metabolismo do ácido nucleico, antibióticos, análogos da pirimidina, 5- fluorouracila, cisplatina, nucleosídeos purina, aminas, aminoácidos, nucleosídeos de triazol, ou corticosteroides. Outros agentes semelhantes podem estar presentes na composição sendo administrada ou podem ser administrados separadamente. Além disso, o anticorpo é convenientemente administrado serialmente ou em combinação com tratamentos radiológicos, quer envolvendo irradiação ou administração de substâncias radioativas.
[000153] Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida tal como uma resina Sephadex ou papel filtro, usando métodos de conhecimento geral na técnica. O anticorpo imobilizado é contactado com uma amostra contendo a proteína do VEGF (ou fragmento da mesma) a ser purificada, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substanci- almente todo o material na amostra exceto a proteína do VEGF, a qual é ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que liberará a proteína de VEGF do anticorpo.
[000154] Anticorpos anti-VEGF também podem ser úteis em provas de diagnóstico para proteína VEGF, por exemplo, detectando sua expressão em células, tecidos, ou soro específicos. Os métodos de diagnóstico podem ser úteis no diagnóstico do câncer.
[000155] Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente será etiquetado com uma porção detectável. Estão disponíveis numerosas etiquetas as quais podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categories: (a) Radioisótopos, tais como 111 In, 99 Tc, 14 C, 131 I, 125 I, 3 H, 32 P ou 35 S. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo usando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida usando contagem por cintilação. (b) Etiquetas fluorescentes tais como quelatos terrosos raros (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, aficoeritrina e Vermelho do Texas estão disponíveis. As etiquetas fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpo usando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, acima, por exemplo, a Fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro. (c) Várias etiquetas de enzima-substrato estão disponíveis e a Patente U.S. No. 4.275.149 proporciona uma revisão de algumas destas. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do subs-trato cromogênico a qual pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração na cor em um subs trato, a qual pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativa-mente, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimiluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. O substrato quimiluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode em seguida emitir luz a qual pode ser medida (usando um quimiluminômetro, por exemplo,) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Exemplos de etiquetas enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga- lume e luciferase bacteriana; Patente U.S. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de raiz forte (HRPO), fosfatase alcalina, .beta.- galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidroge- nase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. Técnicas para con-jugação de enzimas a anticorpos são descritas por O'Sullivan et al., em Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo,: (i) Peroxidase de raiz forte (HRPO) com peroxidase de hi-drogênio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) .beta.-D-galactosidase (.beta.-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, P-nitrofenil-.beta.-D-galactosidase) ou um substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-.beta.-D-galactosidase.
[000156] Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-VEGF não precisa ser etiquetado, e a presença do mesmo pode ser detectada usando um anticorpo etiquetado o qual liga ao anticorpo contra VEGF.
[000157] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaio de ligação competitiva, ensaios de sanduíche direto e indireto, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
[000158] Ensaios de ligação competitiva se baseiam na capacidade de um padrão etiquetado para competir com o analisado da amostra de teste para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de proteína VEGF na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se torna ligado, os anticorpos geralmente são insolubilizados antes ou depois da competição, de modo que o padrão e o analisado que são ligados aos anticorpos podem ser convenientemente separados da amostra e do analisado os quais permanecem não ligados.
[000159] Ensaios de sanduíche envolvem a aplicação de dois anticorpos, cada um capaz de ligação a uma porção imunogênica diferente, ou epitopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio de sanduíche, o analisado da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo o qual é imobilizado sobre um suporte sólido, e depois disso um segundo anticorpo liga ao analisado, deste modo formando um complexo insolúvel de três partes. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.376.110. O segundo anticorpo pode ser o próprio etiquetado com uma porção detectável (ensaio de sanduíche direto) ou pode ser medido usando um anticorpo anti-imunoglobulina que é etiquetado com uma porção detectável (ensaio de sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio de sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a porção detectável é uma enzima.
[000160] Para imunohistoquímica, a amostra tumoral pode ser fresca ou congelada ou pode ser embutida em parafina e fixada com um con-servante tal como formalina, por exemplo,
[000161] Os anticorpos também podem ser usados para ensaios de diagnóstico in vivo. De modo geral, o anticorpo é etiquetado com um radionuclídeo (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de modo que o tumor pode ser localizado usando imunocintigrafia.
[000162] O anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado em um kit, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o teste de diagnóstico. Onde o anticorpo é etiquetado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato o qual proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos tais como estabilizan- tes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser amplamente variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes as quais substancialmente otimizam a sensibilidade do teste. Particularmente, os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, geralmente liofilizados, inclusive excipientes os quais na dissolução proporcionarão uma solução de reagente tendo a concen-tração apropriada.
Preparações Farmacêuticas
[000163] Em um aspecto a invenção proporciona formulações farma-cêuticas compreendendo anticorpos anti-VEGF para o tratamento de doenças mediadas por VEGF. O termo "formulação farmacêutica" se refere a preparações as quais estão em semelhante forma de modo a permitir a atividade biológica do anticorpo ou derivado de anticorpo para ser inequivocamente eficaz, e as quais não contêm componentes adicionais os quais são tóxicos para os indivíduos aos quais a formu-lação seria administrada. Excipientes (veículos, aditivos) "farmaceuti- camente aceitáveis" são aqueles os quais podem ser administrados razoavelmente a um indivíduo mamífero para proporcionar uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.
[000164] Uma formulação "estável" é uma formulação na qual o anticorpo ou derivado de anticorpo na mesma essencialmente retém sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica no armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade proteica estão disponíveis na técnica e são revisadas em Peptide e Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo, a estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Prefe-rencialmente, a formulação é estável em temperatura ambiente (cerca de 30o C) ou a 40 oC por no mínimo 1 semana e/ou estável a cerca de 2 a 8 oC por no mínimo 3 meses a 2 anos. Além disso, a formulação é preferencialmente estável depois de congelamento (até, por exemplo, - 70o C) e descongelamento da formulação.
[000165] Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade física" em uma formulação farmacêutica se satisfizer as especificações de liberação definidas para agregação, degradação, precipitação e/ou desnaturação no exame visual da cor e/ou claridade, ou conforme medido por dispersão de luz UV ou por cromatografia de exclusão de tamanho, ou outros métodos reconhecidos na técnica adequados.
[000166] Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade química" em uma formulação farmacêutica, se a estabilidade química em um dado tempo é tal que a proteína é considerada para ainda reter sua atividade biológica conforme definido abaixo. A estabi- lidade química pode ser avaliada detectando e quantificando formas da proteína quimicamente alterada. A alteração química pode envolver modificação de tamanho (por exemplo, corte (clipping)) a qual pode ser avaliada usando cromatografia de exclusão de tamanho, SDS- PAGE e/ou dessorção ionização a laser assistida por matriz / espec- trometria de massa de tempo de voo (MALDI/TOF MS), por exemplo. Outros tipos de alteração química incluem alteração de carga (por exemplo, ocorrendo como um resultado de desamidação) a qual pode ser avaliada por cromatografia de permuta iônica, por exemplo,
[000167] Um anticorpo ou derivado de anticorpo " retém sua estabilidade biológica" em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo em um dado tempo estiver dentro de cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida na ocasião que a formulação farmacêutica foi preparada conforme determinado em um ensaio de ligação antigênica, por exemplo. Outros ensaios de "atividade biológica" para anticorpos são elaborados abaixo aqui, neste pedido de patente.
[000168] Por "isotônica" se indica que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotônicas geralmente têm uma pressão osmótica a partir de cerca de 250 até 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando uma pressão de vapor ou osmômetro do tipo de congelamento por gelo, por exemplo.
[000169] Um "poliol" é uma substância com múltiplos grupamentos oxidrila, e inclui açúcares (açúcares redutores e não redutores), al- coóis de açúcar e ácidos de açúcar. Polióis preferenciais aqui, neste pedido de patente, têm um peso molecular o qual é de menos de cerca de 600 kD (por exemplo, na faixa de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é um açúcar o qual contém um grupamento hemiacetal que pode reduzir íons metálicos ou reagir de modo covalente com lisina e outros grupamentos amino em proteínas e um " açúcar não redutor" é um açúcar o qual não tem estas propriedades de um açúcar redutor. Exemplos de açúcares redutores são frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. Açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezi- tose e rafinose. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerol são exemplos de alcoóis de açúcar. Quanto a ácidos de açúcar, estes in-cluem L-gluconato e sais metálicos do mesmo. Onde se deseja que a formulação seja estável a congelação-descongelação, o poliol é prefe-rencialmente um poliol o qual não cristaliza em temperaturas de con-gelamento (por exemplo, -20o C) de tal modo que desestabilize o anti-corpo na formulação. Açúcares não redutores tais como sacarose e trealose são os polióis preferenciais aqui, neste pedido de patente, com trealose sendo preferencial em relação a sacarose, devido à estabilidade superior da solução de trealose.
[000170] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "tampão" se refere a uma solução tamponada que resiste a alterações no pH pela ação de seus componentes do conjugado ácido-base. O tampão desta invenção tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 8,0; preferencialmente de cerca de 5,5 a cerca de 7. Exemplos de tampões que controlarão o pH nesta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. Onde se deseja uma formulação estável a congelação-descongelação, preferencialmente o tampão não é fosfato.
[000171] Em um sentido farmacológico, no contexto da presente in-venção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo ou derivado de anticorpo se refere a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para o tratamento da qual o anticorpo ou derivado de anticorpo é eficaz. Uma "doença/ distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria de tratamento com o anticorpo ou derivado de anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicos e agudos inclusive as condições patológicas as quais predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.
[000172] Um "conservante" é um composto o qual pode ser incluído na formulação para reduzir essencialmente a ação bacteriana na mesma, deste modo facilitando a produção de uma formulação multiu- so, por exemplo. Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloreto de alquilbenzildimetil amônio na qual os grupamentos alquila são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem alcoóis aromáticos tais como fenol, butila e álcool benzílico, alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3- pentanol, e m-cresol. O conservante mais preferencial aqui, neste pedido de patente, é álcool benzílico.
[000173] A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos de anticorpos ou derivados de anticorpos, junto com no mínimo um veículo ou exci- piente fisiologicamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, um ou mais de água, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tampo- nada com fosfato), etanol, óleo mineral, óleo vegetal, dimetil sulfóxido, carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, adjuvantes, polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tais como EDTA ou gluta- tiona e/ou conservantes. Conforme mencionado acima, outros ingredientes ativos podem (mas não precisam) ser incluídos nas composições farmacêuticas propocrionadas aqui, neste pedidoo de patente.
[000174] Um veículo é uma substância que pode ser associada com um anticorpo ou derivado de anticorpo antes da administração a um paciente, frequentemente para a finalidade de controlar a estabilidade ou a biodisponibilidade do composto. Veículos para uso dentro de se-melhantes formulações são geralmente biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis. Veículos incluem, por exemplo, moléculas monovalentes ou multivalentes tais como albumina sérica (por exemplo, humana ou bovina), albumina de ovo, peptídeos, polilisina e polis- sacarídeos tais como aminodextrano e poliamidoaminas. Veículos também incluem materiais de suporte sólido tais como contas e micro- partículas compreendendo, por exemplo, polilactato poliglicolato, po- li(lactida-co-glicolídeo), poliacrilato, látex, amido, celulose ou dextrano. Um veículo pode carregar os compostos em uma variedade de modos, inclusive ligação covalente (quer diretamente ou através de um gru-pamento encadeador), interação não covalente ou mistura.
[000175] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração apropriada, inclusive, por exemplo, administração tópica, intraocular, oral, nasal, retal ou parenteral. Em algumas modalidades, são preferenciais composições em uma forma adequada para aplicação tópica, por exemplo, como gotas oculares. Outras formas incluem, por exemplo, pílulas, comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós dispersíveis ou grânulos, emulsão, cápsulas duras ou moles, ou xaropes ou elixires. Dentro ainda de outras modalidades, as composições proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ser formuladas como um liofilizado. O termo parenteral conforme usado aqui, neste pedido de patente, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracranial, intratecal e intraperitoneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão similar.
[000176] A composição farmacêutica pode ser preparada como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril na qual o modulador, dependendo do veículo e da concentração usada, é ou suspendido ou dissolvido no veículo. Uma composição semelhante pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes, umectantes e/ou de suspensão adequado tais como os mencionados acima. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empre-gados estão água, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotô- nica de cloreto de sódio. Além disso, óleos não voláteis e estéreis podem ser empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim pode ser empregado quaisquer óleos não voláteis leves, inclusive mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oleico podem ser usados na preparação de composições injetáveis, e adjuvantes tais como anestésicos locais, conservantes e/ou agentes de tamponamento podem ser dissolvidos no veículo.
[000177] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações de liberação gradual (isto é, uma formulação tal como uma cápsula que efetua uma liberação lenta de modulador depois da administração). As formulações referidas geralmente podem ser preparadas usando tecnologia de conhecimento geral e administradas, por exemplo, por implantação oral, retal, ou subcutânea, ou por implantação no sítio-alvo desejado. Veículos para uso dentro de semelhantes formulações são biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis; preferencialmente a formulação proporciona um nível de liberação de modulador relativamente constante. A quantidade de um anticorpo ou derivado de anticorpo contido dentro de uma formulação de liberação gradual depende, por exemplo, do sítio de implantação, da taxa e da duração esperada da liberação e da natureza da doença/ distúrbio a ser tratado ou prevenido.
[000178] Anticorpo ou derivados de anticorpos proporcionados aqui, neste pedido de patente, são geralmente administrados em uma quan-tidade que atinge uma concentração em um fluido corporal (por exem- plo, sangue, plasma, soro, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lágrimas ou urina) que é suficiente para ligar de modo detectável a VEGF e prevenir ou inibir doenças / distúrbios mediados por VEGF. Uma dose é considerada como sendo eficaz se resultar em um benefício para o paciente discernível conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Doses sistêmicas preferenciais variam a partir de cerca de 0,1 mg a cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por paciente por dia), com doses orais geralmente sendo cerca de 5 a 20 vezes maiores do que doses intravenosas. A quantidade de anticorpo ou derivado de anticorpo que pode ser combinada com os materiais de veículo para produzir uma forma de dosagem única vai variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração em particular. Formas de unidade de dosagem geralmente vão conter entre a partir de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.
[000179] As composições farmacêuticas podem ser embaladas para tratar condições responsivas a um anticorpo ou derivado de anticorpo direcionado para VEGF. Composições farmacêuticas embaladas podem incluir um recipiente encerrando uma quantidade eficaz de no mínimo um anticorpo ou derivado de anticorpo conforme descrito aqui, neste pedido de patente, e instruções (por exemplo, rotulagem) indicando que a composição contida deve ser usada para tratar uma doença / um distúrbio responsivo a um anticorpo ou derivado de anticorpo depois de administração no paciente.
[000180] Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção também podem ser quimicamente modificados. Grupamentos de modificação preferenciais são polímeros, por exemplo, um polímero de polialqueno, polialquenileno, ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo de cadeia ramificada ou não ramificada. Um grupamento efetor semelhante pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo. Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol) (PEG), poli(propileno glicol), poli(álcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou derivados dos mesmos. Polímeros particulares que ocorrem naturalmente incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos. O tamanho do polímero pode ser variado conforme desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso mo-lecular médio de 500 Da a 50000 Da. Para aplicação local onde o anti-corpo é designado para penetrar tecido, um peso molecular preferencial do polímero é em torno de 5000 Da. A molécula do polímero pode ser anexado ao anticorpo, em particular à extremidade de C-terminal da cadeia pesada do fragmento Fab através de um peptídeo da articulação encadeado de modo covalente conforme descrito na patente internacional No. WO0194585. Com respeito à anexação de porções de PEG, é feita referência a "Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, New York.
[000181] Depois de preparação do anticorpo ou derivado de anticorpo de interesse conforme descrito acima, a formulação farmacêutica compreendendo este é preparada. O anticorpo a ser formulado não foi submetido à liofilização anterior e a formulação de interesse aqui, neste pedido de patente, é uma formulação aquosa. Preferencialmente o anticorpo ou derivado de anticorpo na formulação é um fragmento de anticorpo, tal como um scFv. A quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo presente na formulação é determinada levando em conta os volumes das doses desejadas e o modo ou modos de administração, por exemplo. A partir de cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, preferencialmente a partir de cerca de 0,5 mg/mL até cerca de 40 mg/mL e o mais preferencialmente a partir de cerca de 10 mg/mL até cerca de 20 mg/mL é uma concentração de anticorpo exemplar na formulação.
[000182] Uma formulação aquosa é preparada compreendendo o anticorpo ou derivado de anticorpo em uma solução de pH-tamponado. O tampão desta invenção tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 8,0, preferencialmente de cerca de 5,5 a cerca de 7. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro desta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. A concentração de tampão pode ser a partir de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, preferencialmente a partir de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação.
[000183] Um poliol, o qual age como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, é incluído na formulação. Em modalidades preferenciais, a formulação não contém uma quantidade tonificante de um sal tal como cloreto de sódio, uma vez que isto pode fazer com que o anticorpo ou derivado de anticorpo precipite e/ou possa resultar em oxidação em baixo pH. Em modalidades preferenciais, o poliol é um açúcar não redutor, tal como sacarose ou trealose. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade a qual pode variar com respeito à iso- tonicidade desejada da formulação. Preferencialmente a formulação aquosa é isotônica, em cujo caso concentrações adequadas do poliol na formulação são na faixa de cerca de 1% a cerca de 15% em peso/ vol, preferencialmente na faixa de cerca de 2% a cerca de 10% em peso/ vol, por exemplo. No entanto, formulações hipertônicas ou hipo- tônicas também podem ser adequadas. A quantidade de poliol adicionada também pode alterar com respeito ao peso molecular do poliol. Por exemplo, pode ser adicionada uma quantidade menor de um mo- nossacarídeo (por exemplo, manitol), em comparação com um dissa- carídeo (tal como trealose).
[000184] Um tensoativo também é adicionado ao anticorpo ou derivado de anticorpo formulação. Tensoativos exemplares incluem tenso- ativos não iônicos tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80, etc) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de tensoativo adicionado é tal que reduz a agregação do anticorpo / derivado de anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de par- ticulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Por exemplo, o tenso- ativo pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, preferencialmente de cerca de 0,005% a cerca de 0,2% e o mais preferencialmente de cerca de 0,01% a cerca de 0,1%.
[000185] Em uma modalidade, a formulação contém os agentes identificados acima (isto é, anticorpo ou derivado de anticorpo, tampão, poliol e tensoativo) e é essencialmente livre de um ou mais con-servantes, tais como álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutanol e cloreto de benzetônio. Em outra modalidade, um conservante pode ser incluído na formulação, particularmente onde a formulação é uma for-mulação multidose. A concentração de conservante pode estar na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 2%, o mais preferencialmente de cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais veículos, excipientes ou esta- bilizantes farmaceuticamente aceitáveis diversos tais como os descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006) podem ser incluídos na formulação contanto que eles não afetem de modo adverso as características desejadas da formulação. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: agentes de tamponamento adicionais, cossolventes, antioxidantes in-clusive ácido ascórbico e metionina, agentes quelantes tais como EDTA, complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína), po- límeros biodegradáveis tais como poliésteres, e/ou contraíons forma-dores de sais tais como sódio.
[000186] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes, ou depois, da preparação da formulação.
[000187] A formulação é administrada a um mamífero que necessite de tratamento com o anticorpo, preferencialmente um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou por inalação. Em modalidades preferenciais, a formulação é administrada ao mamífero por aplicação tópica de gotas oculares à superfície ocular. Para semelhantes fins, a formulação pode ser aplicada usando um aplicador de gotas oculares, por exemplo,
[000188] A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") do anticorpo dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da gravidade e do curso da condição, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico do paciente e da resposta ao anticorpo, do tipo de anticorpo usado, e do critério do médico assistente. O anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado convenientemente ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos e pode ser administrado ao paciente a qualquer momento a partir do diagnóstico em diante. O anticorpo ou derivado de anticorpo pode ser administrado como o único tratamento ou em combinação com outros fármacos ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.
[000189] Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamen- te eficaz do anticorpo ou derivado de anticorpo administrado será na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente quer por uma ou mais administrações, com a faixa típica de anticorpo usado sendo cerca de 0,3 a cerca de 20 mg/kg, mais preferencialmente cerca de 0,3 a cerca de 15 mg/kg, administrados diariamente, por exemplo. No entanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais.
[000190] São considerados doses e regimes adequados para uso com Lucentis aprovados pela agência de regulamentação de drogas e alimentos dos Estados Unidos FDA.
[000191] Outras doses e regimes são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.641, intitulado "Improved Immuno-binder Formulations And Methods For Adminstration" , depositado em 25 de junho de 2008, o qual é expressamente incorporado aqui, a este pedido de patente.
Artigos de Fabricação
[000192] Em outra modalidade da invenção, é proporcionado um artigo de fabricação compreendendo um recipiente o qual encerra a formulação farmacêutica aquosa da presente invenção e opcionalmente proporciona instruções para seu uso. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, aplicadores de gotas oculares e seringas. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. Um recipiente exemplar é um frasco de vidro ou plástico de uso único de 3 a 20 cm3. Alternativamente, para uma formulação multidose, o recipiente pode ser frasco de vidro de 3 a 100 cm3. O recipiente encerra a formulação e o rótulo sobre, ou associado com o recipiente pode indicar intruções para uso. O artigo de fabricação pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, inclusive outros tampões, dilu- entes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.
Exemplificação
[000193] A presente dscoberta é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais não devem ser considerados como adicionalmente limitantes. O conteúdo de todas as Figuras e de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados do início ao fim deste pedido são expressamente incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em suas totalidades.
[000194] Do início ao fim dos exemplos, foram usados os seguintes materiais e métodos a menos que determinado de modo diverso.
Materiais e Métodos Gerais
[000195] Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de modo diverso, técnicas convencionais de química, biologia molecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (es-pecialmente, por exemplo, tecnologia de anticorpo), e técnicas de rotina de preparação de polipeptídeos. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology , eds. Au- subel et al., John Wiley & Sons (1992).
Medições da termoestabilidade
[000196] Foram obtidos espectros de IV de transformada de Fourier (FTIR-ATR) de reflectância total atenuada para várias moléculas de cadeias únicas e derivadas usando a célula FT-IR Bio-ATR em um Tensor Bruker. As moléculas foram concentradas até 3 mg/mL e diali- sadas de um dia para o outro a 4°C contra PBS, pH 6,5 e o fluxo de tampão direto foi coletado como em branco. Os perfis de desnaturação foram obtidos por termo estimulação das moléculas com uma ampla gama de temperaturas em etapas de 5°C (25 a 95°C). Todas as mani-pulações espectrais foram realizadas usando o software OPUS. O principal tampão e o plano de fundo atmosférico transitório (CO2 e H2O) foram subtraídos do espectro de proteína. O espectro de proteína resultante foi em seguida corrigido pela linha basal e o espectro da amida proteica I foi determinado a partir da largura do pico mais amplo resolvível na região esperada. Segundos espectros derivados foram obtidos para os espectros da banda de amida I usando uma função polinomial de terceiro grau com uma função de suavização. Alterações na estrutura da proteína foram estimadas por análise do segundo derivado de amida I usando uma curva de calibração linear para os cálculos de ajuste de curva iniciais presumindo 0% de desnaturação para as 3 medições inferiores e 100% de desnaturação para as 3 medições su-periores. Os perfis de desnaturação foram usados para aproximar pontos centrais das transições de desdobramento térmico (TM) para cada vari-ante aplicando o modelo sigmoidal de Boltzmann.
Medições da solubilidade
[000197] A solubilidade relativa de várias moléculas de scFv foi medida depois de reforçar a agregação e precipitação de proteína em presença de sulfato de amônio. Sulfato de amônio foi adicionado à proteína em soluções aquosas para produzir incrementos de 5% de saturação na mistura final sal-proteína. A precipitação na faixa dinâmica foi determinada empiricamente e os intervalos de saturação reduzidos nesta faixa até 2,5% de intervalos de saturação na mistura final. Depois da adição de sulfato de amônio, as amostras foram delicadamente misturadas e centrifugadas 30 minutos a 6000 rpm. A proteína remanescente em sobrenadantes foi recuperada para cada percentagem de saturação de sulfato de amônio. Curvas de solubilidade foram determinadas por medição da concentração de proteína no sobrena- dante por medições UV-VIS usando Espectrofotômetro NanoDropTM 1000. As medições de proteína solúvel remanescente em sobrenadan- tes foram normalizadas e usadas para estimar os pontos centrais de solubilidade relativa para cada variante aplicando o modelo sigmoidal de Boltzmann.
Teste de Estabilidade de Curto Termo
[000198] As moléculas de scFv foram examinadas depois de duas semanas de incubação a 40°C para a presença de agregados solúveis e produtos de degradação. Proteínas com uma concentração de 10 mg/mL foram dialisadas de um dia para o outro a 4°C contra PBS com uma a pHs (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,5). Moléculas controle com a mesma concentração em PBS tampão padrão (pH 6,5) foram armazenadas a -80°C durante o período de 2 semanas. Foi feita determinação de bandas de degradação por SDS-PAGE nos pontos de tempo t=0 e t=14d e agregados solúveis foram avaliados na SEC-HPLC. Foi feita determinação da atividade remanescente depois de 2 semanas a 40°C usando Biacore.
EXEMPLO 1 ESTRATÉGIA DE IMUNIZAÇÃO PARA PRODUZIR ANTICORPOS ANTI-VEGF.
[000199] Neste exemplo, é descrita uma estratégia de imunização a qual usou um novo peptídeo derivado de VEGF antigênico, para gerar anticorpos capazes de reconhecer VEGFA humano, de camundongo e de coelho.
[000200] A partir de estudos de mutagênese por varredura com ala- nina realizados na Genentech são conhecidos os resíduos de VEGFA que são cruciais para interação de alta afinidade com VEGFr (Fuh, G. et al, (2006) J. Biol. Chem. 281, 6625-6631). Embora o sítio de ligação de receptor provavelmente represente um epitopo conformacional, a maioria dos resíduos cruciais se situam sobre uma alfa hélice, sobre os primeiros 10 aminoácidos de VEGFA maturo.
[000201] VEGFA de coelho contém três alterações de aminoácidos nesta alfa hélice, em comparação com a sequência humana; em contraste, VEGFA de camundongo é idêntico ao humano nesta região. Portanto, para a produção de anticorpos com reação cruzada com camundongo-humano, o coelho apresenta uma espécie adequada para imunização. Além disso, a imunização do coelho pode levar a Abs com maior afinidade do que a imunização de camundongo.
[000202] Conforme resumido acima, a interação com resíduos sobre a alfa hélice de N-terminal de VEGFA parece ser a mais crucial para ligação a VEGFR1. Portanto, este trecho de 10 aminoácidos de extensão pode ser usado como um epitopo para imunização. Alternativamente, VEGFA de extensão total pode ser injetado, no entanto, outros trechos de peptídeos sobre VEGFA são mais imunogênicos, deste modo reduzindo a probabilidade de dar origem a anticorpos neutrali- zantes. Esta hipótese é corroborada pelo fato de que dois peptídeos diferentes, ambos situados próximos ao C-término de VEGFA são potencialmente imunogênicos conforme previsto pelo método de Johnson e Wolf. Este método prevê potencial imunogênico somente inferior para a alfa hélice de N-terminal. Portanto, imunização com o peptídeo constituindo a alfa hélice somente, pode ser mais constante do que imunização com VEGFA de extensão total. A probabilidade de provocar uma forte reação imune pode ser adicionalmente aumentada por fusão ou ligação química do peptídeo a Hemocianina de lapa de buraco de fechadura ("Keyhole Limpet") (KLH).
[000203] Foram realizadas quatro estratégias de imunização como se segue
[000204] Pré-Imunização de coelhos com VEGFA165 humano de extensão total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais. Segundo reforço com peptídeo do trecho de aminoácidos 16- KFMDVYQRSYC HP-28 (sublinhado: interação de receptor; duplo sub- linhado, divergente em coelho, Cys está envolvida em ligação dissulfe- to de acordo com estrutura cristalina). A Cys contida na sequência de peptídeos pode ser usada para ligação a KLH e portanto não seria ex-posta como Cys livre. O peptídeo final seria como se segue: KFMDVYQRSY-Cys-KLH. A. Pré-Immunização de camundongos com VEGFA165 de extensão total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais. Segundo reforço com peptídeo do trecho de aminoácidos 16- KFMDVYQRSYCHP -28 ( Cys está envolvida em ligação dissulfeto de acordo com estrutura cristalina). A Cys contida na sequência de peptí- deos pode ser usada para ligação a KLH e portanto não seria exposta como Cys livre. O peptídeo final seria como se segue: KFMDVYQRSY- Cys-KLH. B. Pré-imunização de coelhos/ camundongos com peptídeo do trecho de aminoácidos 16- KFMDVYQRSYCHP -28 (peptídeo final: KFMDVYQRSY-Cys-KLH). Segundo reforço com VEGFA165 de extensão total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais. C. Imunização com VEGFA165 de extensão total em coelhos.
EXEMPLO 2 Enxerto de CDR e Humanização Funcional de anticorpos monoclonais anti-VEGF de coelho. Enxerto de CDRs de Coelho
[000205] Diferentemente de métodos de humanização tradicionais os quais empregam a estrutura aceitadora de anticorpo humano que partilha a maior homologia de sequência com o anticorpo doador não- humano, as CDRs de coelho foram enxertadas quer na estrutura FW1.4 (SEQ ID No. 172) para gerar um Min-graft quer na estrutura "rabbitized" rFW1.4 (SEQ ID No. 173) ou sua variante rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174) para gerar um Max-graft. Ambas as estruturas foram selecionadas essencialmente por propriedades funcionais desejáveis (solubilidade e estabilidade), conveniência estrutural para conciliar uma grande variedade de CDRs de coelho e homologia razoável com a sequência de consenso de domínio variável de coelho. A estrutura rFW1.4 é um derivado de FW1.4 que foi adicionalmente manipulado com o objetivo de servir como estrutura aceitadora universal para virtualmente qualquer grupo de CDRs de coelho. Embora a sequência de estrutura estável e solúvel FW1.4 apresente alta homologia com anticorpos de coelho, não é a sequência mais homóloga disponível.
Identificação de resíduos potencialmente envolvidos em ligação
[000206] Para cada sequência de domínio variável de coelho, foi identificado o complemento da linhagem germinativa de coelho mais próxima. Se a linhagem germinativa mais próxima não pôde ser estabelecida, a sequência foi comparada contra o subgrupo de consenso ou o consenso de sequências de coelho com uma alta percentagem de similaridade. Resíduos de estrutura rara foram considerados como possível resultado de hipermutação somática e portanto desempenhando um papel na ligação de antígeno. Consequentemente, os resíduos referidos foram considerados para enxerto sobre a estrutura aceitadora rFW1.4 ou rFW1.4(v2) para gerar Max-grafts. Particularmente, foram enxertados resíduos potencialmente implicados em contato an- tigênico direto ou influenciando a disposição de VL e VH. Resíduos adicionais descritos por influenciar a estrutura de CDR foram substituídos caso requerido. Não foram feitas substituições de estrutura quando CDRs foram enxertadas sobre FW1.4 (Min-grafts). Por exemplo, para gerar 578minmax o resíduo VH 94 (H94) de rFW1.4 foi mutado para resíduo correspondente na sequência doadora. O anticorpo de coelho 578 contém Gly em H94 ao passo que ambos, a linhagem ger- minativa mais homóloga e o consenso de coelho contêm Arg na posição H94. Gly tem uma flexibilidade excepcional (ângulos fi positivos) que não é encontrada para outros aminoácidos. Isto sugere um papel no ângulo de torsão da cadeia principal e uma possível forte influência da conformação do loop com implicações sobre a atividade. Exemplos adicionais de posições de estruturas que foram enxertadas para obter os Max-grafts conforme revelados aqui, neste pedido de patente, podem ser identificados fazendo um alinhamento de sequências das regiões das estruturas de rFW1.4, rFW1.4(v2) e as sequências scFv de interesse proporcionadas aqui, neste pedido de patente. Ferramentas na internet (Webtools) conforme é de conhecimento geral na técnica podem ser usadas, por exemplo, para a finalidade referida (por exemplo, Clus- talW conforme disponível em 23 de junho de 2009 em http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmL ou MultiAlin conforme disponível em 23 de junho de 2009 em http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas as posições de estruturas nas quais rFW1.4 e rFW1.4(v2) contêm os mesmos resíduos e nas quais o scFv de interesse revela um resíduo diferente, são posições de estrutu-ras que foram enxertadas para obter os Max-grafts.
Permutação de domínio
[000207] Cadeias leves variáveis de Min-grafts foram combinadas com Max-grafts de cadeia pesada variável para identificar combinações ótimas em termos de propriedades biofísicas (solubilidade e estabilidade) e atividade.
Clonagem e expressão de scFvs
[000208] Os scFvs descritos e caracterizados aqui, neste pedido de patente, foram produzidos como se segue. As sequências de VL hu-manizadas (SEQ ID NOs: 82 a 106) foram conectadas a sequências de VH humanizadas (SEQ ID NOs: 118 a 166) através do encadeador de SEQ ID NO: 181 para produzir um scFv da seguinte orientação: NH2-VL- encadeador-VH-COOH. Em muitos casos sequências de DNA codifi-cando para os vários scFvs foram sintetizadas de novo no provedor Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Os insertos de DNA resul-tantes foram clonados no vetor de expressão bacteriana pGMP002 através de sítios de restrição NcoI e HindIII introduzidos na extremidade 5’ e 3’ da sequência de DNA de scFv, respectivamente. Entre a se-quência de DNA do domínio VL e do domínio VH, está localizado um sítio de restrição BamHI. Em alguns casos o DNA codificando scFv não foi sintetizado de novo, mas os construtos expressando scFv foram clonados por permuta de domínio. Por conseguinte, os domínios VL foram excisados e introduzidos nos novos construtos através dos sítios de restrição NcoI e BamHI, os domínios VH através dos sítios de restrição BamHI e HindIII. Em outros casos, mutações de ponto foram introduzidas no domínio VH e/ou VL usando métodos de montagem por PCR do estado da técnica. A clonagem de GMP002 é descrita no Exemplo 1 da publicação de patente internacional No. WO 2008/006235. A produção dos scFvs foi feita análoga a para ESBA105 conforme descrito no Exemplo 1 da publicação de patente internacional No. WO 2008/006235.
EXEMPLO 3 ANÁLISE DA LIGAÇÂO de BIACORE DE SCFVS ANTI-VEGF
[000209] Neste exemplo, a capacidade de ligação de Biacore de scFvs foi testada e a afinidade de ligação foi medida usando o método de ressonância de plasmônio superficial típico com BIAcoreTM-T100. As proteínas de VEGF, testadas para ligação por estes scFvs candidatos, neste exemplo e em exemplos posteriores incluem VEGF165 humano recombinante expressado em Escherichia coli purificado (Pe- proTech EC Ltd.), VEGF121 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF110 humano recombinante (ESBATech AG), VEGF164 muri- no recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF164 de rato recombinante (Biovision), VEGF110 de coelho recombinante (ESBATech AG), e PLGF humano recombinante (PeproTech EC Ltd.). Para o experimento de ressonância de plasmônio superficial, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM4, GE Healthcare) foram ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida e N-hidroxissuccinimida de acordo com as instruções do fornecedor. Cada uma das 6 diferentes formas de VEGF, conforme exemplificado acima, foi acoplada a 1 das 4 diferentes células de fluxo sobre um chip sensor CM4 usando um procedimento de ligação de amina de rotina. A gama de respostas obtidas com estas moléculas de VEGF imobilizadas depois de ligação e bloqueio foram -250 a 500 unidades de resposta (RU) para hVEGFwõ, -200 RU para hVEGFn0, hVEGF121, VEGF164 murino, VEGF164 de rato e VEGF110 de coelho e -400 RU para PLGF. A 4a. célula de fluxo de cada chip foi tratada de modo similar exceto que não foram imobilizadas proteínas antes do bloqueio, e a célula de fluxo foi usada como referência in-line. Várias concentrações de scFvs anti-VEGF (por exemplo, 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3,33 nM, 1,11 nM, 0,37 nM, 0,12 nM e 0,04 nM) em tampão de HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4 ou 5, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de ten- soativo P20) foram injetadas dentro das células de fluxo em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 5 min. Dissociação do scFv anti-VEGF a partir do VEGF sobre o chip CM4 foi liberada para prosseguir por 10 min a 25 °C. Sensorgramas foram gerados para cada amostra de scFv anti- VEGF depois de correção da célula de referência in-line seguida por subtração da amostra de tampão. A constante da taxa de dissociação aparente (kd), a constante da taxa de associação aparente (ka) e a constante de equilíbrio de dissociação aparente (KD) foram calculadas usando o modelo de ligação de Langmuir um para um (one-to-one) com o Software de avaliação BIAcore T100 versão 1.1.
[000210] Como um resultado típico, alguns scFvs anti-VEGF candidatos de exemplo são listados na Tabela 7 mostrando sua capacidade de ligação a hVEGF165. Sua potência como inibidores de VEGF, a qual é medida usando ensaio ELISA de competição de VEGFR e/ou prova de HUVEC e descrita em exemplos posteriores, também é mostrada na Tabela 7. As curvas cinéticas de alguns candidatos de exemplo típicos, por exemplo, 511max e 578max, para sua ligação a hVEGF165 são ilustradas na Figura 1. Suas constantes de afinidade (kd, ka e KD) também foram determinadas. Alguns candidatos de exemplo também apresentam especificidade de espécie em sua ligação a várias proteínas de VEGF de diferentes fontes. Por exemplo, alguns dados de afinidade medidos em pH 5 usando VEGF164 de camundongo e de rato como parceiro de ligação são mostrados nas Tabelas 8 a e b. Um scFv candidato de exemplo típico, 578minmax, tem uma KD de 5,76E-10 M e 7,48E-10 M em sua ligação a VEGF164 de camundongo e de rato, respectivamente em um pH de 5 (Tabelas 8 a e b) e 2,73E-11 e 2,19E- 11 em um pH de 7,4 (dados não mostrados). Esta especificidade de espécie é adicionalmente ilustrada na Figura 4 nas curvas cinéticas e dados de afinidade para a ligação entre 578minmax e proteínas VEGF humanas, de camundongo ou de rato.
[000211] Além da especificidade de espécie em sua ligação a VEGFs de diferentes organismos, muitos scFv candidatos de exemplo também apresentam especificidades de ligação diferenciadas para várias isoformas de VEGF. Por exemplo, os dados de afinidade medidos em pH 5,0 para alguns scFvs candidatos ligando a VEGF165, VEGF121 e VEGF110 humanos são comparados na Tabela 9. Nos mesmos experimentos, a proteína PIGF também foi usada como um controle negativo sem capacidade de ligação a estes scFvs candidatos. Além disso, as curvas cinéticas diferenciadas e dados de afinidade para a ligação entre 578Max e isoformas de VEGF, como um exemplo, são ilustrados na Figura 3.
[000212] A presente invenção também revela derivados originários dos candidatos de exemplo de scFv anti-VEGF, os quais são mencio- nados acima. Alguns derivados de exemplo do candidato 578 e 511, conforme listado na Tabela 10, são exemplificados por sua afinidade e potência (medida em pH 5,0). Neste experimento, foi usada medição por Biacore para a afinidade destes derivados em relação a hVEGF165, ao passo que foram usados ensaio ELISA de competição de hVEGFR2 e/ou prova de HUVEC para definir sua potência para inibir VEGFs (Tabela 10). Três derivados, 578max, 578minmax e 578 wt- His, são adicionalmente exemplificados em suas curvas cinéticas e dados de afinidade para ligação a hVEGF165 na Figura 4.
[000213] Para derivados de candidatos de exemplo, suas caracterizações biofísicas foram determinadas e exemplificadas nas Figuras 5 a 7 e na tabela 11. Estas características incluem, conforme exemplificado na tabela 11, Tm determinada por FTIR, a percentagem de β- lâmina ou perda de proteína depois de incubação a 60°C por 30 min, solubilidade determinada por precipitação de sulfato de amônio, produção de redobramento durante o processo de produção e níveis de expressão em E. coli. Três derivados, 578max, 578minmax e 578minmax_DHP, foram caracterizados por sua estabilidade térmica em suas curvas de desdobramento contra diferentes temperaturas medidas por FT-IR (Figura 5).
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[000214] Alguns derivados, conforme listado na Figura 6, foram compa-rados por sua desnaturação e precipitação depois de stress térmico (por exemplo, sob 50°C, 60°C, ou 70°C) por 30 minutos. 578max, 578minmax e 578minmax_DHP foram adicionalmente exemplificados por sua solubili-dade, a qual foi determinada por precipitação de sulfato de amônio. Como na Figura 7, a percentagem de proteínas solúveis destes derivados sob várias concentrações de sulfato de amônio foram comparadas. Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 50°C
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Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 60°C
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Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 70°C
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EXEMPLO 4 PROVAS DE BLOQUEIO DE RECEPTOR DE VEGF
[000215] Para scFv anti-VEGF candidatos ou seus derivados revelados na presente invenção, sua potência como inibidores de VEGF também foi medida além de sua afinidade de ligação a VEGFs no Exemplo 3. Os métodos para medir sua potência incluem, por exemplo, o ELISA de competição de VEGFR, conforme exemplificado neste exemplo, e provas de HUVEC (Figura 8).
[000216] Os ensaios ELISA de competição de VEGFR incluem, por exemplo, ensaios de bloqueio de Receptor VEGFR2 e ensaios de blo-queio de Receptor VEGFR1. Para o ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR2, VEGF165 humano foi revestido sobre uma lâmina Maxisorp ELISA de 96 poços (Nunc) a 0,05 μg/mL em PBS e bloqueado usando PBS com 0,1% de BSA e 0,2% de Tween 20 (PBST). 500 ng/mL de quimera recombinante VEGFR2 humano/Fc (R&D Systems Inc.), con-sistindo nos resíduos aminoácidos 1-764 do domínio extracelular de VEGFR2 humano fundido a um Fc, com etiqueta de 6x histidina, de IgG1 humana, foram primeiro incubados com scFvs anti-VEGF diluídos serialmente 3 vezes em PBST. Depois de 30 a 60 min de incubação em temperatura ambiente, as misturas foram transferidas para a lâmina imobilizada de VEGF165 humano e incubadas por 90 min. A ligação da quimera VEGFR2/Fc ao VEGF165 imobilizado foi detectada com Fcy de IgG anti-humana de cabra (Fab2) acoplado à peroxidase de raiz forte (Jackson ImmunoResearch) seguido por substrato (substrato BM Blue POD, Roche Diagnostics). A densidade ótica a 450 nm (OD de 450 nm) foi medida usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Te- can). Os dados foram analisados usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros, e os valores da EC50 foram calculados a partir das curvas de dose-resposta dos scFvs. A potência exemplar de candidatos de exemplo ou seus derivados, medida por ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR2, é listada nas Tabelas 7 e 9.
[000217] Para o ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR1, VEGF165 humano foi revestido sobre uma lâmina Maxisorp ELISA de 96 poços (Nunc) a 0,0125 μg/mL em PBS e bloqueado usando PBS com 0,4% de BSA e 0,1% de Tween 20. 100 ng/mL de quimera recombinante VEGFR1 humano/Fc (R&D Systems Inc.), consistindo nos resíduos aminoácidos 1-687 do domínio extracelular de VEGFR1 humano fundido a um Fc, com etiqueta de 6x histidina, de IgG1 humana, foram primeiro incubados com scFvs anti-VEGF diluídos serialmente 3 vezes em PBST. Depois de 30 a 60 min de incubação em temperatura ambiente, as misturas foram transferidas para a lâmina imobilizada de VEGF165 humano e incubadas por 90 min. A ligação da quimera VEGFR1/Fc ao VEGF165 imobilizado foi detectada com Fcy de IgG anti-humana de cabra (Fab2) acoplado à peroxidase de raiz forte (Jackson ImmunoResearch) seguido por substrato (substrato BM Blue POD, Roche Diagnostics). A densidade ótica a 450 nm (OD de 450 nm) foi medida usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Tecan). Os dados foram analisados conforme acima, e os valores da EC50 foram calculados a partir das curvas de dose-resposta dos scFvs. A potência exemplar de candidatos de exemplo, medida por ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR1, é listada na Tabela 7.
EXEMPLO 5 PROVA HUVEC DE INIBIÇÃO DE VEGF
[000218] Este exemplo exemplifica provas HUVEC como outro método para medir a potência dos scFv anti-VEGF candidatos revelados, ou seus derivados, como inibidores de VEGF.
[000219] Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) (Promocell), reunidas a partir de vários doadores, foram usadas na passagem 2 até a passagem 14. As células foram semeadas a 1000 células/ poço em 50 μl de meio de crescimento de células endoteliais completo (ECGM) (Promocell), que continha 0,4% de ECGS/H, 2% de Soro de Feto de Vitelo, 0,1 ng/mL de Fator de Crescimento Epidermal, 1 μg/mL de Hidrocortisona, 1 ng/mL de Fator de Fibroblasto básico e 1% de penicilina / estreptomicina (Gibco). 7 a 8 h depois, 50 μl de meio de inanição (ECGM sem suplementos contendo 0,5% de FCS inativa- do por calor e 1% de penicilina / estreptomicina) foram adicionados às células e as células foram submetidas à inanição (starved) por 15 a 16 horas. Diluições seriais de 3 vezes de scFvs anti-VEGF (0,023 a 150 nM) e um dos seguintes - VEGFWÕ humano recombinante (0,08 nM), VEGF164 de camundongo recombinante (0,08 nM), ou VEGF164 de rato recombinante (0,3 nM) - foram preparados em meio de inanição e pré- incubados por 30 a 60 min em temperatura ambiente. As diferentes concentrações de VEGFs foram usadas para compensar por suas diferentes atividades biológicas relativas. Foram usadas concentrações que estimulam proliferação induzida por VEGF submáxima (EC90). 100 μl das misturas foram adicionados às lâminas de cultura de tecido de 96 poços contendo a suspensão de HUVEC e incubados por 4 dias em uma incubadora umificada a 37 °C/5% de CO2. A proliferação de HU- VECs foi avaliada medindo a absorvência a 450 nm (620 nm usado como comprimento de onda de referência) depois da adição de 20 μl/ poço de reagente de proliferação celular WST-1 (Roche) usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Tecan). Os dados foram analisados usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros, e a concentração de scFvs anti-VEGF requerida para inibir a proliferação de HUVEC por 50% (EC50) foi derivada das curvas de inibição.
[000220] A potência típica de candidatos de exemplo ou seus derivados, medida por provas de HUVEC, é listada na Tabela 7. Além disso, a inibição de proliferação de HUVEC induzida por hVEGF165 por um derivado de candidatos de exemplo, 578minmax, é exemplificada na Figura 9. A EC50 de 578minmax para inibição de proliferação celular induzida por hVEGF165 é determinada como sendo de 0,06 nM (Figura 9). A potência de 578minmax como um inibidor de VEGF é cerca de 1,6 vez melhor comparada com Lucentis. A inibição da proliferação de HUVEC induzida por VEGF164 de camundongo ou de rato por 578minmax também é exemplificada na Figura 10. A EC50 de 578minmax para inibição de proliferação celular induzida por VEGF164 de camundongo e de rato é de 0,06 nM e de 0,07 nM, respectivamente (Figura 10). Portanto, VEGF de camundongo e de rato são equipoten- tes a VEGF humano por serem inibidos pelo derivado típico (578minmax). Além disso, neste experimento, Lucentis não inibe proliferação induzida por VEGF de roedor.
EXEMPLO 6 EFEITOS DE SCFVS ANTI-VEGF SOBRE PERMEABILIDADE VAS-CULAR INDUZIDA POR HVEGF165 EM PORCOS DA ÍNDIA PELADOS
[000221] Neste exemplo, o efeito de scFvs anti-VEGF sobre VEGF165 humano induziu permeabilidade vascular foi avaliado em porcos da índia usando a prova de Miles. Trinta sítios de aplicação por animal foram marcados sobre o dorso de porcos da índia machos pelados usando um marcador permanente. No dia de tratamento cada animal foi administrado por via intravenosa com 1 mL de uma solução a 1% de corante azul de Evans sob anestesia geral. Uma hora depois de injeção de corante, 0,1 mL de solução de teste contendo 2,61 nM de VEGF165 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.) e várias concentrações de scFvs anti-VEGF (0 nM, 0,085 nM, 0,256 nM, 0,767 nM, 2,3 nM, 6,9 nM, 20,7 nM, 62,1 nM; n = 7 animais por item de teste) foram injetados em triplicata dentro das marcas sobre o dorso (3 injeções por concentração de item de teste). Injeções de PBS serviram como um controle negativo em todos os animais. Como um controle adicional, 6,9 nM de Lucentis (Novartis) foram injetados em todos os animais.
[000222] Uma hora depois da injeção das soluções de teste, os animais foram eutanizados, e as peles foram coletadas, limpas, e fotografadas digitalmente usando luz incidente e transmitdia. A área de corante azul de Evans que extravasou para dentro dos sítios de injeção foi avaliada usando ImageJ. Para cada animal, a concentração de scFv anti-VEGF versus área de escoamento de corante foi analisada usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros. A concentração de scFvs anti-VEGF requerida para inibir derrame vascular por 50% (EC50) foi derivada a partir das curvas de inibição.
[000223] O protocolo do experimento é exemplificado na Figura 11. Além disso, a eficácia de scFv candidatos, ESBA903 (578minmax) e 802 (511max), na inibição do hVEGF foi ilustrada na Figura 11, representada por diferentes tamanhos de áreas contendo o corante azul de Evans escoado do sistema vascular para dentro da pele. Os dados de eficácia para 903 e 802 são mostrados na Figura 12. Em 6,9 nM, 903 e 802 apresentaram inibição mais forte de derrame vascular induzido por VEGF dentro da pele em comparação com Lucentis em todos os animais testados (Figura 12).
EXEMPLO 7 EFEITOS DE TRATAMENTO TÓPICO COM SCFVS ANTI-VEGF SO-BRE DERRAME VASCULAR RETINAL INDUZIDO POR HVEGF165 EM RATOS
[000224] Neste exemplo, a eficácia tópica de 578minmax é demonstrada usando uma prova de Miles modificada. Estas modificações incluem, por exemplo, estudo pré-misturado com injeções intravítreas e aplicação tópica de scFvs.
[000225] Diferentes concentrações pré-misturadas de scFv anti- VEGF (10, 3, e excesso molar de 1 vez sobre VEGF) e VEGF (500 ng) foram aplicadas através de uma única injeção intravitreal. Avastin (Roche) (excesso molar de 10 vezes, 3 vezes, e 1 vez sobre VEGF) foi usado como um controle positivo. Veículo para 578minmax (Tampão de Citrato, 20 mM de Citrato de Na, 125 mM de NaCl, pH 7) foi usado como controle negativo. Conforme ilustrado na Figura 13, pré- misturando com hVEGF165 facilitou 578minmax (ESBA903) a inibir completamente a permeabilidade vascular retinal induzida por hVEGF. Neste experimento, o efeito inibitório de 578minmax (ESBA903) foi mais significativo em comparação com Avastin.
[000226] Para aplicação tópica, cinco dias antes da estimulação de VEGF, ratos Sprague-Dawley adultos receberam 578minmax (1% = 10 mg/mL) através de dosagem tópica bilateral qid (4 gotas/ dia) até o dia da perfusão (Dia 6). Veículo para 578minmax (dosagem tópica) e Alcon RTKi (10 mg/kg/d, gavage oral) foram usados como controles negativo e positivo. No Dia 5, os ratos são anestesiados e suas pupilas são dilatadas. Todos os animais recebem injeções intravitreais de 500 ng de hrVEGF (10 μl) em ambos os olhos. Depois de 24 horas pós- injeção de VEGF, infusão intravenosa de 3% de corante azul de Evans é realizada em todos os animais durante anestesia geral. Depois do corante ter circulado por 90 minutos, os ratos são eutanizados. Ambas as amostras são colhidas, em seguida os ratos são perfundidos com solução salina estéril, então ambos os olhos de cada rato são imedia-tamente enucleados e as retinas colhidas usando um microscópio ci-rúrgico. Tanto para amostras de retina quanto de plasma, 60 μL de sobrenadante são usados para medir a absorvência do corante azul de Evans (ABS) com um espectrofotômetro a 620/740 nm. A ruptura da barreira sanguínea-retinal e subsequente permeabilidade vascular retinal conforme medida pela absorvência de corante são calculadas como médias ± s.e.m. de net ABS/wet weight/plasma ABS (ABS líqui- da/peso a úmido/ABS plasmática). ANOVA One way é usado para determinar uma diferença global entre meios de tratamento, em que P < 0,05 é considerado significativo. Conforme exemplificado na Figura 14, a administração tópica (5 dias de pré-tratamento, 4 gotas por dia) de 578minmax (903) inibiu significativamente a permeabilidade vascular retinal induzida por hVEGF. Esta é a primeira demonstração de um anticorpo topicamente eficaz útil para o tratamento de doença intraocular.
EQUIVALENTES
[000227] Numerosas modificações e modalidades alternativas da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica em vista da descrição precedente. Por conseguinte, esta descrição deve ser considerada como ilustrativa somente e é para ensinar aos versados na técnica o melhor modo para realizar a presente invenção. Detalhes da estrutura podem variar substancialmente sem se afastar do espírito da invenção, e é reservado o uso exclusivo de todas as modificações que estão dentro do âmbito das reivindicações anexadas. Pretende-se que a presente invenção seja limitada somente na extensão requerida pelas reivindicações anexadas e pelas regras da legislação aplicável.
[000228] Toda a literatura e material similar citado neste pedido, in-clusive, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, tratados, disserta ções, páginas na internet, Figuras e/ou anexos, independente do formato de semelhante literatura e de materiais similares, são expressamente incorporados por meio de referência em sua totalidade. No evento de que um ou mais da literatura e materiais similares incorporados difiram de ou contradigam este relatório descritivo, inclusive termos definidos, uso de termos, técnicas descritas, ou semelhantes, este relatório descritivo controla.
[000229] Os títulos de seções usados aqui, neste pedido de patente, são para fins organizacionais somente e não devem ser considerados como limitantes para o tema descrito de modo algum.
[000230] Apesar das presentes invenções terem sido descritas em combinação com várias modalidades e exemplos, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a semelhantes modalidades ou exemplos. Pelo contrário, as presentes invenções englobam várias alternativas, modificações, e equivalentes, conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica.
[000231] As reivindicações não devem ser lidas como limitadas à ordem ou aos elementos descritos a menos que declarado para este efeito. Deve ser entendido que podem ser feitas várias alterações na forma de detalhes sem se afastar do âmbito das reivindicações anexadas. Portanto, são reivindicadas todas as modalidades que estão dentro do âmbito e do espírito das reivindicações que se seguem e equivalentes das mesmas.

Claims (22)

1. Imunoligante recombinante, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a VEGF humano com um Kd inferior a 10-8 M e compreende uma cadeia pesada variável (VH) e/ou uma cadeia leve variável (VL) que neutraliza VEGF humano, em que: a. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 2, CDR-H2 de SEQ ID NO: 15 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 27, e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 38, CDR-L2 de SEQ ID NO: 50 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 61; b. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 3, CDR-H2 de SEQ ID NO: 15 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 27, e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 38, CDR-L2 de SEQ ID NO: 50 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 61; c. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 4, CDR-H2 de SEQ ID NO: 16, CDR-H3 de SEQ ID NO: 28, e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, CDR-L2 de SEQ ID NO: 51, e CDR-L3 de SEQ ID NO: 62; d. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 5, CDR-H2 de SEQ ID NO: 17, CDR-H3 de SEQ ID NO: 29 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 40, CDR-L2 de SEQ ID NO: 52 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 63; e. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 6, CDR-H2 de SEQ ID NO: 18 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 30 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 41, CDR-L2 de SEQ ID NO: 53 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 64; f. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 7, CDR-H2 de SEQ ID NO: 19 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 31 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 42, CDR-L2 de SEQ ID NO: 54 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 65; g. a VH compreende CDR-H1 de SEQIDNO: 8, CDR-H2 de SEQ ID NO: 20 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 32 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 43, CDR-L2 de SEQ ID NO: 55 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 66; h. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 9, CDR-H2 de SEQ ID NO: 21 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 33 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 44, CDR-L2 de SEQ ID NO: 56 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 67; i. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 10, CDR-H2 de SEQ ID NO: 22 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 34 e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 45, CDR-L2 de SEQ ID NO: 57 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 68; j. a VH compreende CDRs: (i) CDR-H1 de SEQ ID NO: 11, CDR-H2 de SEQ ID NO: 23 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 35; (ii) CDR-H1 de SEQ ID NO: 11, CDR-H2 de SEQ ID NO: 25 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 35; (iii) CDR-H1 de SEQ ID NO: 13, CDR-H2 de SEQ ID NO: 23 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 35; ou (iv) CDR-H1 de SEQ ID NO: 13, CDR- H2 de SEQ ID NO: 25 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 35; e a VL compreende CDR-L1 de SEQ ID NO: 46, CDR-L2 de SEQ ID NO: 58 e CDR- L3 de SEQ ID NO: 69; k. a VH compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 12, CDR-H2 de SEQ ID NO: 24 e CDR-H3 de SEQ ID NO: 36 e a VL compreende (i) CDR-L1 de SEQ ID NO: 47, CDR-L2 de SEQ ID NO: 59 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 70; ou (ii) CDR-L1 de SEQ ID NO: 48, CDR-L2 de SEQ ID NO: 59 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 70.
2. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que compreende uma sequência de estrutura de região variável de cadeia pesada apresentando a sequência de SEQ ID NO: 169.
3. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que a estrutura de região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO: 170 ou SEQ ID NO: 171.
4. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que apresenta deleções nas posições 1, 83 ou 87 da região variável de cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração AHo.
5. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 4, caracterizado pelo fato de de que apresenta uma substi-tuição em pelo menos uma das posições 2, 12, 24, 25, 46, 54, 55, 83, 84, 87, 89, 103, 105, 108 ou 144 na região variável de cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração AHo, em que as referidas substituições são selecionadas do grupo consistindo em: i .Glutamina na posição 2; ii .Serina na posição 12; iii .Treonina na posição 24; iv .Valina na posição 25; v .Leucina na posição 46; vi .Tirosina na posição 54; vii .Isoleucina na posição 55; viii .Alanina na posição 83; ix .Asparagina na posição 84 x .Alanina ou Leucina na posição 87; xi .Alanina ou Leucina na posição 89; xii .Serina ou Treonina na posição 103; xiii .Fenilalanina na posição 105; xiv .Arginina na posição 108; e xv .Serina ou Treonina na posição 144.
6. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma se- quência de estrutura de região variável de cadeia leve apresentando a sequência de SEQ ID NO: 167.
7. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizado pelo fato de que a estrutura de região variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 167 ou SEQ ID NO: 168.
8. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que apresenta uma substi-tuição em pelo menos uma das posições 1, 2, ou 15 da região variável de cadeia leve de acordo com o sistema de numeração AHo, em que as referidas substituições são selecionadas do grupo consistindo em: i. Aspartato na posição 1; ii. Valina na posição 2; e iii. Treonina na posição 15.
9. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 2 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; b. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 e uma região va-riável compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 73; c. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; d. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 e uma região va- riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; f. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; g. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; h. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; i. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; j. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.
10. Imunoligante de acordo com a reivindicação 9, caracte-rizado pelo fato de que apresenta a SEQ ID NO: 176, a SEQ ID NO: 177, a SEQ ID NO: 178, a SEQ ID NO: 179 ou a SEQ ID NO: 180.
11. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a VEGF humano e de rato/ camundongo.
12. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo, scFv, Fab ou Dab.
13. Imunoligante, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que está em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável às vias tópica, intraocular, in-tramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intraarti-cular, intrassinovial, intratecal, oral ou inalação.
14. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 e a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87.
15. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 136 e a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87.
16. Imunoligante, de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180.
17. Fragmento de ligação ao antígeno do imunoligante, como definido na reivindicação 1 ou qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o fragmento é um scFv ou um Fab, um F(ab')2 ou um Fab'.
18. Fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o fragmento é um scFv, e que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve estão ligadas pela sequência da SEQ ID NO: 181.
19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoligante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou o fragmento de ligação ao antígeno, como definido na rei-vindicação 17 ou 18, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, carac-terizada pelo fato de que é formulada para administração tópica, intra-ocular, oral, nasal, retal ou parental.
21. Uso do imunoligante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou do fragmento de ligação ao antígeno, como definido na reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que é na produção de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença mediada por VEGF humano.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença mediada por VEGF é selecionada dentre o grupo consistindo em degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, retinopatia da prematuri-dade, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama, carcinomas pulmo-nares, carcinomas gástricos, carcinomas esofageanos, carcinomas colorretais, carcinomas hepáticos, carcinomas ovarianos, os comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicais, carcinoma endometrial, hiper- plasia endometrial, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe, carcinomas de laringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de pele, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de pâncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiossarcomas, carcinomas do trato urinário, carcinomas da tireoide, tumor de Wilm, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, proliferação vas cular anormal associada com facomatoses, edema (tal como o associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, artrite reumatoide, psoríase e aterosclerose.
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