BRPI0914251A2 - Anticorpos estáveis e solúveis inibindo vegf - Google Patents

Anticorpos estáveis e solúveis inibindo vegf Download PDF

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BRPI0914251A2
BRPI0914251A2 BRPI0914251-7A BRPI0914251A BRPI0914251A2 BR PI0914251 A2 BRPI0914251 A2 BR PI0914251A2 BR PI0914251 A BRPI0914251 A BR PI0914251A BR PI0914251 A2 BRPI0914251 A2 BR PI0914251A2
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vegf
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immunoligant
fact
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BRPI0914251-7A
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Leonardo Borras
David Urech
Tea Gunde
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Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc
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Abstract

imunoligante recombinante, composição compreendendo dito imunoligante, molécula de ácido nucleico isolada codificando o dito imunoligante, uso de dito imunoligante, método de produzir um imunoligante que tem reatividade cruzada com vegf de rato/camundongo e humano. a presente invenção refere-se a imunoligantes anti-vegf solúveis e estáveis compreendendo cdrs de anticorpos monoclonais de coelho. os anticorpos referidos são planejados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por vegf. a invenção também refere-se a hibridomas, ácido nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.

Description

i 1/106 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNOLIGAN- TE RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO DITO IMUNOL!- GANTE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA CODIFICANDO O DITO IMUNOLIGANTE, USO DE DITO IMUNOLIGANTE, MÉTODO DE PRO-
DUZIR UM IMUNOLIGANTE QUE TEM REATIVIDADE CRUZADA COM VEGF DE RATO/ CAMUNDONGO E HUMANO", Informação Relacionada O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Paten- te U.S. No. 61/133.212 depositado em 25 de junho de 2008, para o Pedido de Patente U.S. No. 61/075.697 de 25 de junho de 2008, para o Pedido de Patente U.S. No. 61/155.041 de 24 de fevereiro de 2009, e para o Pedido de Patente U.S. No. 61/075.692 de 25 de junho de 2008. Os conteúdos de quaisquer patentes, pedidos de patente, e refe- : rências citados do início ao fim deste relatório descritivo são por este incor- » 15 porados por meio de referência em suas totalidades. Antecedentes da Invenção A angiogênese está implicada na patogênese de uma variedade de distúrbios inclusive tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tais como retinopatias proliferativas ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD), artrite reumatoide, e psoríase (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); e Garner A, Vascular diseases . Em: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth G K, Eds. 2nd Edition Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). Em tumores sólidos, a angiogênese e o crescimento de nova vasculatura permitem a sobrevivência do tumor, e foi demonstrada uma correlação entre a densidade de microvasos em seções tumorais e a sobre- vida dos pacientes em cânceres de mama e diversos (Weidner et al. N Engl J Med 324: 1-6 (1991); Horak et a/. Lancet 340: 1120-1124 (1992); e Mac- chiarini et al. Lancet 340: 145-146 (1992)). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um regula- dor conhecido de angiogênese e neovascularização, e foi demonstrado que é um mediador-chave de neovascularização associada com tumores e dis-
: 2/106 túrbios intraoculares (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18: 4-25 (1997)). O MRNA do VEGF é superexpressado em muitos tumores humanos, e a concentra- ção de VEGF em fluidos dos olhos é altamente correlacionada com a pre- sença de proliferação ativa de vasos sanguíneos em pacientes com retino- patias diabéticas e outras relacionadas com isquemia (Berkman et al., J Clin Invest 91: 153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol. 26: 86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Can- cer. 73: 931-934 (1996); e Dvorak et al. Am J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995); Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)). Além disso, estudos recentes mostraram a presença de VEGF localizado em membranas neovasculares coroidais em pacientes afetados por degeneração macular relacionada com a idade (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37: 855- 868 (1996)). Anticorpos neutralizantes anti-VEGF podem ser usados para ' suprimir o crescimento de uma variedade de linhagens celulares de tumor » 15 humanoem camundongos nus e também inibir angiogênese intraocular em modelos de distúrbios retinais isquêmicos (Kim et al. Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); e Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) (Adamis et a/. Arch. Opthalmol. 114: 66-71 (1996)).
Portanto, existe a necessidade de anticorpos monocionais anti- VEGF capazes de ser usados para o tratamento de tumores sólidos e várias doenças intraoculares neovasculares.
Sumário da Invenção A invenção proporciona imunoligantes anti-VEGF solúveis e es- táveis compreendendo CDRs de anticorpos monocionais de coelho. Os refe- ridos anticorpos são projetados para o diagnóstico e/ou tratamento de dis- túrbios mediados por VEGF. Também são revelados os hibridomas, ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos re- combinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.
Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 ilustra a cinética da ligação de scFvs selecionados a
: 3/106 hVEGF165 usando Biacore (hVEGF165). A figura 1a mostra os dados obtidos para 511max: Ka (1/Ms): 6,59E+05; SE (ka): 1,10E+03; kd(1/s):4,40E-05; SE(kd):6,30E-07; KD(M): 6,67E-11. A figura 1b mostra os dados obtidos pa- ra 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd):8,50E-07; KD(M):4,39E-10.
A figura 2 ilustra a especificidade da espécie mostrando a cinéti- ca da ligação de 578max a VEGF humano, de camundongo e de rato. A figu- ra 2a mostra os dados obtidos para VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A figura 2b mostra os dados obtidos para VEGF164 de camun- dongo: Ka (1/Ms): 1,03E+06; SE (ka): 2,30E+03; kd(1/s): 4,40E-04; SE(kd): 9,40E-07; KD(M): 4,29E-10. A figura 2c mostra os dados obtidos para VEGF164de rato: Ka (1/Ms): 8,83E+05; SE (ka): 2,50E+03; kd(1/s): 5,28E- Ú 04; SE(Kkd): 1,20E-06; KD(M): 5,98E-10.
- 15 A figura 3 ilustra a cinética da ligação de 578max a isoformas de VEGF (hVEGF121 e hvVEGF110). A figura 3a mostra os dados obtidos para VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,4E+03; kd(1/s): 3,07E- 04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A figura 3b mostra os dados obtidos para VEGF121 humano: Ka (1/Ms): 5,87E+05; SE (ka): 1,20E+03; kd(1/s): 5,58E-04; SE(kd): 9,60E-07; KD(M): 9,50E-11. A figura 3c mostra os dados obtidos para VEGF110 humano: Ka (1/Ms): 5,23E+05; SE (ka): 1,30E+03; kd(1/s): 7,22E-04; SE(kd): 8,10E-07; KD(M): 1,38E-09.
A figura 4 representa a cinética da ligação de 578max, 578minmax e 578wt a hvEGF165. A figura 4a mostra os dados obtidos para 578max: Ka (1/Ms):7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. A figura 4b mostra os dados obtidos para 578minmax: Ka (1/Ms): 8,06E+05; SE (ka): 2,10E+03; kd(1/s): 5,04E-04; SE(kd): 1,10E-06; KD(M): 6,25E-10. A figura 4c mostra os dados obtidos para 578wt-His: Ka (1/Ms): 8,45E+05; SE (ka): 1,60E+03; kd(1/s): 1,69E-04; SE(kd): 7,60E-07; —KD(M):2,00E-10.
A figura 5 ilustra a estabilidade térmica de 578max, 578minmax e 578minmax DHP (desdobramento medido por FT-IR). Figura 5a: 578minmax
V 4/106 (ESBA903): Tm = 71,1ºC; Figura 5b: 578minmax DHP (no. 961): Tm= 70,2ºC; Figura 5c: 578max (no. 821): Tm =70,4"C.
A figura 6 ilustra a desnaturação e precipitação de 578 derivados depois de stress térmico (Figura 6a: 50ºC, Figura 6b: 60ºC, Figura 6c: 70ºC) por3Omin.
A figura 7 ilustra a solubilidade de 578max, 578minmax e 578minmax DHP (determinada por precipitação por sulfato de amônio). Fi- gura 7a: 578max (no. 821). A V50 foi de 27,24 %. Figura 7b: 578minmax (ESBAS903). A V50 foi de 28,13. Figura 7c: 578minmax DHP (no. 961). A V50foide32,36%.
A figura 8 ilustra a VEGFR2 competição ELISA versus HUVEC ensaio como métodos para medir a potência. Figura 8a: Comparação de Lucentis e 51 1max (no. 802) em ELISA de competição VEGFR2. R? de Lu- i centis: 0,9417; R? de ESBA802: 0,9700. EC50 de Lucentis: 7,137 nM; ECSO - 15 de no 802: 0,8221nM. Figura 8b: Comparação de Lucentis e 578max (no.
821). em ELISA de competição VEGFR?2. Figura 8c: Comparação de Lucen- tis, 511ImaxC-his e 534max em prova HUVEC. R? de Lucentis 0,9399; R? de EP511maxC-his: 0,9313, R?º de EP534max: 0,7391. EC50 de Lucentis: 0,08825 nM, EC50 de 511maxC-his: 0,7646 nM, EC5O0 de 534max: 63,49 nM. Figura 8d: Comparação de Lucentis, 578min e 578max em prova HU- VEC. R? e Lucentis: 0,9419, R? de EP578min: 0,8886, Rº de EP578max: 0,9274. EC50 de Lucentis: 0,1529 nM, EC50 de 578min: 1,528 nM, EC50 de 578max: 0,1031 nM.
A figura 9 ilustra os efeitos de 578minmax sobre proliferação —HUVEC induzida por hvEGF165. Os parâmetros da prova foram os seguin- tes: concentração de hvEGF165: 0,08 nM (3 ng/ml); incubação com VEGF e item de teste: 96 horas. A EC50 foi de 0,08959 nM para Lucentis e de 0,05516 nM para 578minmax, ao passo que a R? foi de 0,9066 para Lucentis e de 0,9622 para 578minmax.
A figura 10 ilustra os efeitos de 578minmax sobre Proliferação de HUVEC induzida por VEGF164 de camundongo e VEGF164 de rato. Os parâmetros da prova foram os seguintes: concentração de VEGF164 de ca-
. 5/106 mundongo: 0,08 nM (3 ng/ml); concentração de VEGF164 de rato: 0,3 nM (11,3 ng/ml). Ambas as concentrações foram selecionadas a EC90 para pro- liferação HUVEC induzida por VEGF; incubação com VEGF e item de teste: 96 horas. A figura 10a ilustra os dados obtidos para VEGF de camundongo. AECB50foide0,11968nM para V1253 e de 0,06309 nM para 578minmax, ao passo que a R? foi de 0,02744 para Lucentis, de 0,9348 para V1253 e de 0,9767 para EP578minmax. Lucentis não inibiu proliferação HUVEC induzida por VEGF de camundongo. A figura 10b ilustra os dados obtidos para VEGF de rato. A EC50 foi de 1,597 nM para V1253 e de 0,06974 nM para 578minmax, aopasso que a R? foide 0,7664 para V1253 e de 0,6635 para 578minmax.
A figura 171 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles em porcos da índia nus (parte |). O corante azul almar 1 foi administrado por via intravenosa a porcos da índia nus. Uma hora depois da injeção de corante, uma pré-mistura 2 de hvVEGF (2,61 nM) e Lucentis, ESBA903 ou no. 802, - 15 respectivamente, foi injetada na pele do animal 3. Uma hora depois da inje- ção das soluções, os animais 3 foram eutanizados e as peles foram coleta- das, limpas e fotografadas digitalmente usando luz incidente e transmitida. A área de corante azul Evans Blue que extravasou para dentro dos sítios de injeção foi avaliada usando Image J e a retenção dose-área foi plotada.
A figura 12 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles em porcos da índia nus (parte |I). A figura 12a mostra os resultados obtidos para no. 803 (511max). A EC50 foi de 5,990 nM e teve uma dispersão estatística entre 2,060 e 17,41 nM ao passo que a R? foi de 0,5800. A figura 12b mostra os resultados obtidos para ESBA9O03 (578minmax). A EC50 foi de 3,989 e teve uma dispersão estatística entre 1,456 e 10,93 nM ao passo que a R? foi de 0,3920. A figura 12c mostra a área de escoamento de corante para Lu- centis. A EC50 não pode ser calculada para Lucentis devido ao pobre ajuste da curva.
A figura 13 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles modificada em ratos (pré-mistura de hVEGF165 e 578minmax (ESBA903)). A figura 13a ilustra a eficácia antipermeabilidade de Avastin no derrame vas- cular retinal induzido por VEGF em ratos — dose resposta. Avastin inibe a
B 6/106 permeabilidade vascular retinal induzida por hvVEGF. Pré-misturada antes da injeção. Aproximadamente equimolar, excesso de 3 vezes, ou de 10 vezes. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (tratados com Avastin vs. VEGF). A figura 13b mostra a eficácia antipermeabilidade de ESBA903 no derrame vascular retinal induzido por VEGF em ratos. Dose resposta (pré-misturada, ivt). Completa inibição por ESBA9O03 da permeabilidade vascular retinal induzida por hVEGF. Pré-misturada antes. Aproximadamente equimolar, excesso de 3 vezes, ou de 10 vezes. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (tratados com ESBAS903 vs. VEGF).
A figura 14 ilustra estudos de eficácia usando prova de Miles modificada em ratos (administração tópica de 578minmax (ESBA9O03)). À eficácia anti-permeabilidade de AL-51287 (ESBA9O03) no derrame vascular retinal induzido por VEGF em ratos foi testada na administração tópica. Cin- | co dias pré-tratamento, 4 gotas/ dia com uma formulação de 10 ng/ml de - 15 ESBA9O3. *p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (VEGF vs. AL-51287), ***p=0,060 (AL-51287 vs. AL-52667), **** (VEGF vs. AL-39324); p<0,05 (AL- 39324 vs. veículo controle de referência). AL-51287: ESBA903; AL-52657: veículo controle de referência tópico; AL-39324: inibidor de RTK de molécula pequena.
A figura 15 ilustra a definição de CDR1 de VH conforme usado aqui, neste requerimento de patente.
Descrição Detalhada A invenção proporciona imunoligantes anti-VEGF solúveis e es- táveis compreendendo CDRs de anticorpos monoclonais de coelho. Os refe- ridos imunoligantes são projetados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por VEGF. Também são revelados os hibridomas, áci- dos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção, métodos para isolar os mesmos e a aplicação dos referidos anticorpos em medicina.
Definições De modo a que a presente invenção possa ser mais prontamen- te entendida, alguns termos serão definidos a seguir. Definições adicionais
: 7/106 são determinadas do início ao fim da descrição detalhada.
O termo "VEGF" se refere ao fator de crescimento celular endo- telial vascular de 165 aminoácidos, e fatores de crescimento celular endote- lial vascular relacionados de 121, de 189, e de 206 aminoácidos, conforme descrito por Leung ef al., Science 246: 1306 (1989), e Houck et a/., Mol. En- docrin. 5: 1806 (1991) junto com as formas alélicas que ocorrem naturalmen- te e processadas destes fatores de crescimento.
O termo "receptor do VEGF" ou "VEGFr" se refere a um receptor celular para VEGF, ordinariamente um receptor da superfície celular encon- trado sobre células endoteliais vasculares, bem como variantes do mesmo o qual conserva a capacidade para ligar nvVEGF. Um exemplo de um receptor do VEGF é a tirosina quinase fms-like (flt), um receptor transmembrana na família das tirosina quinases. DeWVries et a/., Science 255: 989 (1992); Shibu- ya et al, Oncogene 5: 519 (1990). O receptor flt compreende um domínio - 15 extracelular, um domínio transmembrana, e um domínio intracelular com ati- vidade de tirosina quinase. O domínio extracelular está envolvido na ligação do VEGF, ao passo que o domínio intracelular está envolvido na transdução de sinalização. Outro exemplo de um receptor do VEGF é o receptor flk-1 (também referido como KDR). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6: 1677 (1991); Terman et a/., Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992). A ligação do VEGF ao re- ceptor flt resulta na formação de no mínimo dois complexos de alto peso mo- lecular, tendo um peso molecular aparente de 205.000 e 300.000 Dáltons. Acredita-se que o complexo de 300.000 Dáltons seja um dímero compreen- —dendoduas moléculas de receptor ligadas a uma única molécula de VEGF.
O termo "coelho" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um animal pertencente à família das leporidae.
O termo "anticorpo" conforme usado aqui, neste pedido de pa- tente, é um sinônimo para "imunoglobulina." Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser imunoglobulinas inteiras ou fragmentos das mesmas, compreendendo no mínimo um domínio variável de uma imunoglo- bulina, tais como domínios variáveis únicos, Fv (Skerra A. e Pluckthun, A.
: 8/106 (1988) Science 240: 1038-41), scFv (Bird, RE. et a/. (1988) Science 242: 423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83), Fab, (Fab')2 ou outros fragmentos de conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica.
O termo " CDR" se refere a uma das seis regiões hipervariáveis dentro dos domínios variáveis de um anticorpo que essencialmente contri- buem para ligação de antígeno. Uma das definições mais comumente usa- das para as seis CDRs foi proporcionada por Kabat E.A. et al., (1991) Se- quences of proteins of immunologíical interest. NIH Publication 91-3242).
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a definição de Kabat de CDRs somente se aplica para CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3, ou L1, L2, L3), bem como para C- DR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3, ou i H2, H3). CDR1 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H1 ou H1), no - 15 entanto, conforme usado aqui, neste pedido de patente, é definido pelos se- guintes resíduos (numeração de Kabat): Começa com a posição 26 e termi- na antes da posição 36. Isto é basicamente uma fusão de CDR H1 conforme definido diferentemente por Kabat e Chotia (vide também a figura 15 para ilustração).
O termo "estrutura de anticorpo", ou algumas vezes somente "estrutura", conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere à parte do domínio variável, quer VL ou VH, a qual serve como um andaime para os loops de ligação de antígeno (CDRs) deste domínio variável. Em essência é o domínio variável sem as CDRs.
O termo "anticorpo de cadeia única", "Fv de cadeia única" ou "scFv" pretende se referir a uma molécula compreendendo um domínio vari- ável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; V4) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; V,) conectados por um encadeador. As moléculas de scFv referidas podem ter as estruturas gerais: NH>-V.- —encadeador-V.-COOH ou NH>-Vu-encadeador-V, - COOH.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "identidade" se refere à combinação de sequências entre dois polipeptídeos, moléculas ou
' 9/106 entre dois ácidos nucleicos.
Quando uma posição em ambas as duas se- quências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomé- rica de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, ou uma posição em cada um de dois polipeptídeos for ocupada por uma lisina), então as respectivas molécu- las são idênticas nesta posição.
A "percentagem de identidade" entre duas sequências é uma função do número de posições combinando partilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são combinadas, então as duas sequências têm 60% de identidade.
A título de exemplo, as sequências de DNA CTGACT e CAGGTT partilham 50% de identidade (3 das 6 posições totais são combinadas). De modo geral, é feita uma compa- ração quando duas sequências são alinhadas para dar máxima identidade. i Semelhante alinhamento pode ser proporcionado usando, por exemplo, o - 15 métodode Needleman et al. (1970) J.
Mol.
Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas de computação tais como o programa A- lign (DNAstar, Inc.). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E.
Me- yers e W.
Miller (Comput.
Appl.
Biosci., 4: 11-17 (1988)) o qual foi incorpora- dono programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de extensão de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas se- quências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Nee- dleman e Wunsch (J.
Mol.
Biol. 48:444-453 (1970)) o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando quer uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de extensão de 1,2,3,4,5,
ou6. Sequências "similares" são aquelas as quais, quando alinhadas, partilham resíduos aminoácidos idênticos e similares, onde resíduos simila- res são substituições conservadoras para resíduos aminoácidos correspon- dentes em uma sequência de referência alinhada.
A este respeito, uma
: 10/106 "substituição conservadora" de um resíduo em uma sequência de referência é uma substituição por um resíduo que é fisicamente ou funcionalmente si- milar ao resíduo de referência correspondente, por exemplo, que tem um tamanho, formato, carga elétrica, propriedades químicas, inclusive a capaci- dade para formar ligações covalentes ou de hidrogênios, similares ou seme- lhantes. Deste modo, uma sequência "modificada por substituição conserva- dora" é uma sequência que difere de uma sequência de referência ou de uma sequência selvagem em que uma ou mais substituições conservadoras estão presentes. A "percentagem de similaridade" entre duas sequências é uma função do número de posições que contêm resíduos combinando ou substituições conservadoras partilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posi- : ções em duas sequências são combinadas e 2 de 10 posições contêm subs- tituições conservadoras, então as duas sequências têm 80% de similaridade - 15 positiva.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "modifi- cações de sequências conservadoras" pretende se referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram negativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. As modificações de sequências conservadoras referidas incluem substituições, adições e eli- minações de nucleotídeos e de aminoácidos. Por exemplo, modificações podem ser introduzidas por técnicas de rotina conhecidas na área, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácidos conservadoras incluem substituições nas quais o resíduo ami- —noácidoé substituído com um resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais similares têm sido definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com ca- deias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias late- rais acidíferas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias late- rais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metio-
- 11/106 nina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, iso- leucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Deste modo, um resíduo aminoácido não essencial pre- visto em um anticorpo anti-VEGF humano é preferencialmente substituído com outro resíduo aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificar substituições conservadoras de nucleotídeos e de aminoáci- dos os quais não eliminam ligação de antígeno são de conhecimento geral na técnica (vide, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)) " Sequência de consenso de aminoácidos" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a uma sequência de aminoácidos que : pode ser gerada usando uma matriz de no mínimo duas, e preferencialmente mais, sequências de aminoácidos alinhadas, e permitindo intervalos no ali- * 15 nhamento,detalmodo que é possível determinar o resíduo aminoácido mais frequente em cada posição. A sequência de consenso é a sequência a qual compreende os aminoácidos os quais são mais frequentemente representa- dos em cada posição. No evento de que dois ou mais aminoácidos sejam igualmente representados em uma única posição, a sequência de consenso inclui ambos ou todos aqueles aminoácidos.
A sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser analisa- da em vários níveis. Por exemplo, conservação ou variabilidade podem ser apresentadas no nível de resíduo único, no nível de resíduo múltiplo, resíduo múltiplo com intervalos, etc. Resíduos podem apresentar conservação do resíduo idêntico ou podem ser conservados no nível de classe. Exemplos de classes de aminoácidos incluem grupamentos R polares mas não carrega- dos (Serina, Treonina, Asparagina e Glutamina); grupamentos R carregados positivamente (Lisina, Arginina, e Histidina); grupamentos R carregados ne- gativamente (Ácido glutâmico e Ácido aspártico); grupamentos R hidrofóbi- cos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptofano, Valina e Tirosina); e aminoácidos especiais (Cisteína, Glicina e Prolina). Outras classes são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica e podem
H 12/106 ser definidas usando determinações estruturais ou outros dados para avaliar a substitubilidade. Neste sentido, um aminoácido substituível pode ser referir a qualquer aminoácido o qual pode ser substituído e manter conservação funcional naquela posição. No entanto, será reconhecido que aminoácidos da mesma clas- se podem variar em grau por suas propriedades biofísicas. Por exemplo, será reconhecido que alguns grupamentos R hidrofóbicos (por exemplo, A- lanina, Serina, ou Treonina) são mais hidrofílicos (isto é, de maior hidrofilici- dade ou menor hidrofobicidade) do que outros grupamentos R hidrofóbicos (porexemplo, Valina ou Leucina). A hidrofilicidade ou hidrofobicidade relativa pode ser determinada usando métodos reconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) e Cornette et al., J. Mol.
Biol., 195: 659-685 (1987)). Conforme usado aqui, neste pedido de patente, quando uma se- - 15 quênciade aminoácidos (por exemplo, uma primeira sequência V4y ou V1) é alinhada com uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais (por e- xemplo, uma ou mais sequências VH ou VL em um banco de dados), uma posição de aminoácido em uma sequência (por exemplo, a primeira sequên- cia V4 ou V,) pode ser comparada com uma "posição correspondente" na uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a "posição correspondente" representa a posição equivalente na uma ou mais sequências sendo comparadas quando as se- quências são otimamente alinhadas, isto é, quando as sequências são ali- nhadas para obter a maior percentagem de identidade ou percentagem de similaridade.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "banco de dados de anticorpos" se refere a uma compilação de duas ou mais se- quências de aminoácidos de anticorpos (uma "multiplicidade" de sequên- cias), e tipicamente se refere a uma compilação de dezenas, centenas ou ainda milhares de sequências de aminoácidos de anticorpos. Um banco de dados de anticorpos pode armazenar sequências de aminoácidos de, por exemplo, uma coleção de regiões V"y de anticorpos, regiões V, de anticorpos í 13/106 ou ambas, ou pode armazenar uma coleção de sequências de scFv consis- tindo em regiões V,4 e V.. Preferencialmente, o banco de dados é armaze- nado em um meio fixo, pesquisável, tal como sobre um computador dentro de um programa de computador pesquisável.
Em uma modalidade, o banco de dados de anticorpos é um banco de dados compreendendo ou consistin- do em sequências de anticorpos de linhagem germinativa (germline). Em outra modalidade, o banco de dados de anticorpos é um banco de dados compreendendo ou consistindo em sequências de anticorpos maduras (isto é, expressadas) (por exemplo, um banco de dados de Kabat de sequências de anticorpos maduras, por exemplo, um banco de dados KBD). Em ainda outra modalidade, o banco de dados de anticorpos compreende ou consiste em sequências selecionadas funcionalmente (por exemplo, sequências sele-
cionadas a partir de uma prova de QC). | O termo "imunoligante" se refere a uma molécula que contém - 15 todo ou uma parte do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, por e- xemplo, todo ou parte do domínio variável de cadeia pesada e/ou leve, de tal modo que o imunoligante reconhece especificamente um antígeno-alvo.
E- xemplos não limitantes de imunoligantes incluem moléculas de imunoglobu- lina de extensão total e scFvs, bem como fragmentos de anticorpos, inclusi- ve mas não limitados a (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios V,, Vu, Cr e Chn1; (ii) um fragmento F(ab'),, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab encadeados por uma ponte dissulfeto na região de articulação; (ili) um fragmento Fab', o qual é essencialmente um Fab com parte da região de articulação (vide, Funda- mental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd con- sistindo nos domínios Vy e Ch41; (v) um fragmento Fv consistindo nos domí- nios V, e Va de um único braço de um anticorpo, (vi) um anticorpo de domínio único tal como um fragmento Dab (Ward et a/., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio V4 ou Vi1, um Camelid (vide Hamers- Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), e Dumoulin, et al, Protein Science 11:500-515 (2002)) ou um anticorpo de tubarão (por exemplo, Na- nobodies& Ig-NARs de tubarão); e (vii) um nanocorpo, uma região de cadeia í 14/106 pesada contendo o domínio variável e dois domínios constantes.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "propri- edade funcional" é uma propriedade de um polipeptídeo (por exemplo, um imunoligante) para o qual um aprimoramento (por exemplo, em relação a um polipeptídeo convencional) é desejável e/ou vantajoso para uma pessoa ver- sada na técnica, por exemplo, de modo a melhorar as propriedades de fabri- cação ou a eficácia terapêutica do polipeptídeo. Em uma modalidade, a pro- priedade funcional é estabilidade (por exemplo, estabilidade térmica). Em outra modalidade, a propriedade funcional é solubilidade (por exemplo, sob condições celulares). Em ainda outra modalidade, a propriedade funcional é não agregação. Em ainda outra modalidade, a propriedade funcional é ex- pressão de proteína (por exemplo, em uma célula procariótica). Em ainda outra modalidade a propriedade funcional é uma eficiência de redobramento depois de uma solubilização de corpos de inclusão em um processo de puri- - 15 ficação correspondente. Em algumas modalidades, afinidade de ligação de antígeno não é uma propriedade funcional desejada para aprimoramento.
O termo "epitopo" ou "determinante antigênico" se refere a um sítio sobre um antígeno (por exemplo, sobre VEGF) ao qual uma imunoglo- bulina ou anticorpo liga especificamente. Um epitopo tipicamente inclui no mínimo3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma conformação espacial única. Vide, por exem- plo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology , Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Os termos "ligação específica," "ligação seletiva," "liga seletiva- mente," e"liga especificamente," se referem à ligação de anticorpo a um epi- topo sobre um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga com uma afinidade (Kp) de cerca de menos de 107 M, tal como cerca de menos de 10º M, 10º M ou 10º M ou ainda menor.
O termo "Kp/" ou "Kã" se refere à constante de equilíbrio de dis- —sociaçãode uma interação antígeno-anticorpo em particular. Tipicamente, os anticorpos da invenção ligam a VEGF com uma constante de equilíbrio de dissociação (Kp) de menos de cerca de 10” M, tal como menos de cerca de
: 15/106 10º M, 10º M ou 107º M ou ainda menor, por exemplo, conforme determi- nado usando tecnologia de ressonância de plasmônio superfícial (SPR) em um instrumento BIACORE.
Os termos "neutraliza VEGF," "inibe VEGF," e "bloqueia VEGF" são usados de modo intercambiável para se referir à capacidade de um anti- corpo da invenção para evitar que VEGF interaja com um ou mais recepto- res do VEGF tais como VEGFR-1 e/ou VEGFR-2, e, por exemplo, dispare transdução de sinalização.
Um "imunoligante recombinante" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um imunoligante sendo produzido por expres- são de DNA recombinante.
Um imunoligante "quimérico" conforme usado aqui, neste pedido de patente, tem uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homólo- ga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie - 15 em particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, ao passo que o restante da uma ou mais cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de semelhantes anticorpos.
Anticorpo humanizado conforme usado aqui, neste pedido de patente, é um subgrupo de anticorpos quiméricos. "Anticorpos humanizados" conforme usado aqui, neste pedido de patente, são imunoligantes que foram sintetizados usando tecnologia de DNA recombinante para evitar a reação imune a antígenos estranhos.
Hu- manização é uma técnica bem-estabelecida para reduzir a imunogenicidade de anticorpos monoclonais de fontes xenogênicas.
Isto envolve a escolha de uma estrutura aceitadora, preferencialmente uma estrutura aceitadora hu- mana, a extensão das CDRs do imunoligante doador a ser inserido na estru- tura aceitadora e a substituição de resíduos da estrutura doadora dentro da estrutura aceitadora.
Um método geral para enxertar CDRs em estruturas —aceitadoras humanas foi revelado por Winter na Patente U.S.
No. 5.225.539, a qual é por este incorporada por meio de referência em sua totalidade.
À Patente U.S.
No. 6.407.213 cujos ensinamentos são incorporados por meio
" 16/106 de referência em sua totalidade, revela uma série de posições de aminoácidos da estrutura onde é preferencial uma substituição do imunoligante doador.
O termo "molécula de ácido nucleico," se refere a moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita únicaoudefitadupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é "encadeado operavelmente" quando ele é colocado em uma rela- ção funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um pro- motor ou reforçador é encadeado operavelmente a uma sequência codifican- te se afetar a transcrição da sequência.
O termo "vetor," se refere a uma molécula de ácido nucleico ca- paz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido encadeado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," o qual se refere a um loop de DNA de fita dupla circular dentro do qual segmentos de DNA adicionais podem ser liga- dos. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicio- - 15 nais podem ser ligados dentro do genoma viral. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introdu- zidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados dentro do geno- made uma célula hospedeira na introdução dentro da célula hospedeira, e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro.
O termo "célula hospedeira" se refere a uma célula na qual um vetor de expressão tenha sido introduzido. Células hospedeiras podem inclu- ir células bacterianas, microbianas, de plantas ou animais. Bactérias, as —quaissão suscetíveis à transformação, incluem membros das enterobacteri- aceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis, Pneumococcus; Streptococcus, e Haemophilus influ- enzae. Micróbios adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Linhagens de células hospedeiras animais adequadas incluem cé- lulas CHO (linhagens de Ovário de Hamster Chinês) e NSO0.
Os termos "tratar," "tratando," e "tratamento," se referem a medi- das terapêuticas ou preventivas descritas aqui, neste pedido de patente. Os
] 17/106 métodos de "tratamento" empregam administração a um sujeito, que neces- site de semelhante tratamento, de um anticorpo da presente invenção, por exemplo, um sujeito tendo um distúrbio mediado por VEGF ou um sujeito o qual essencialmente pode adquirir um distúrbio semelhante, de modo a pre- venir, curar, retardar, reduzir a gravidade de, ou melhorar um ou mais sinto- mas do distúrbio ou distúrbio recidivante, ou de modo a prolongar a sobrevi- da de um sujeito além da esperada na ausência de semelhante tratamento. O termo "distúrbio mediado por VEGF" se refere a qualquer dis- túrbio, o início, progressão ou a persistência dos sintomas ou estados de doença o qual requer a participação do VEGF. Distúrbios mediados por VEGF exemplares incluem, mas não estão limitados a, degeneração macu- lar relacionada com a idade, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, : retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofageanos, - 15 carcinomas colorretais, carcinomas hepáticos, carcinomas ovarianos, os comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicais, carcinoma endometrial, hi- perplasia endometrial, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe, carcinomas de laringe, he- patoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de pele, heman- gioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de pân- creas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligodendro- glioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma os- teogênico, leiomiossarcomas, carcinomas do trato urinário, carcinomas da tireoide, tumor de Wilm, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tal como o associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, artrite reumatoide, psoríase e aterosclerose.
O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" se refere a uma quantidade suficiente para atingir ou no mínimo atingir parcialmente o efeito desejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou no mínimo parar parcialmente a doença e suas complicações em um paciente já sofrendo da doença. Quantidades eficazes para esta aplicação vão depender da gravidade do distúrbio sendo tratado e do estado geral do sistema imune do próprio paciente.
O termo "sujeito" se refere a qualquer animal humano ou não- humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para tratar um sujeito com um distúrbio mediado por VEGF.
O termo "Min-graft" ou "min" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a um domínio variável humanizado que foi gerado por enxerto de CDRs de coelho de um domínio variável de coelho em uma estru- tura aceitadora humana que ocorre naturalmente (FW 1.4, SEQ ID No. 172). Não são feitas alterações nas regiões da estrutura. A própria estrutura foi pré-selecionada por propriedades funcionais desejáveis (solubilidade e esta- bilidade).
i O termo "Max-graft" ou "max" conforme usado aqui, neste pedi- - 15 dode patente, se refere a um domínio variável humanizado que foi gerado por enxerto de CDRs de coelho de um domínio variável de coelho dentro da estrutura aceitadora humana "rabbitized", "RabTor" (rFW1.4, SEQ ID No. 173), ou dentro de um derivado da mesma referido como rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174). A estrutura "RabTor" foi preparada incorporando resíduos de coelho conservados (os quais de modo diverso são de preferência variáveis em outras espécies) em posições da estrutura geralmente envolvidas em estrutura de domínio variável de coelho e estabilidade, com o objetivo de gerar uma estrutura aplicável universalmente que aceita virtualmente qual- quer grupo de CDRs de coelho sem a necessidade de enxerto de resíduos de estrutura doadora além de em posições que são diferentes em sua se- quência progenitora presumível, por exemplo, que foram alterados durante hipermutação somática e deste modo, possivelmente contribuem para liga- ção de antígeno. A sequência progenitora presumível é definida como sendo o complemento da linhagem germinativa de coelho mais próxima e em caso —denão poder ser estabelecido o complemento da linhagem germinativa mais próxima, as sequências de consenso do subgrupo de coelho ou as sequên- cias de consenso de coelho com uma alta percentagem de similaridade.
O termo "Min-Max" ou "minmax" conforme usado aqui, neste pe- dido de patente, se refere a um domínio variável humanizado consistindo em uma cadeia leve variável "Min-graft' combinada com uma cadeia pesada variável "Max-graft".
O termo "Max-Min" ou "maxmin" conforme usado aqui, neste pe- dido de patente, se refere a um domínio variável humanizado consistindo em uma cadeia leve variável "Max-graft" combinada com uma cadeia pesada variável "Min-graft".
Foram usadas diferentes nomenclaturas para os imunoligantes gerados. Estes são tipicamente identificados por um número (por exemplo, no.
578). Nos casos em que foi usado um prefixo tal como EP ou Epi (por exemplo, . EP 578 o qual é idêntico a Epi 578 ), o mesmo imunoligante é deste modo indi- cado. Ocasionalmente, um imunoligante recebeu uma segunda designação a qual é identificada pelo prefixo "ESBA". Por exemplo, ESBA9O03 designa o - 15 mesmo imunoligante que 578minmax ou EP578minmax ou Epi578minmax.
A menos que definido de modo diverso, todos os termos técni- cos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo signifi- cado que o entendido comumente por uma pessoa com conhecimento regu- lar da técnica à qual esta invenção diz respeito. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste pedido de patente, pos- sam ser usados na prática ou experimentação da presente invenção, méto- dos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o pre- sente relatório descritivo, inclusive definições, controlará. Além disso, os ma- teriais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não se pretende que sejamlimitantes.
Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes adicio- nais nas seguintes subseções. Deve ser entendido que as várias modalida- des, preferências e alcances podem ser combinados à vontade. Além disso, dependendo da modalidade específica, definições, modalidades ou alcances selecionados podem não se aplicar.
Imunoligantes Anti-VEGF Em um aspecto, a presente invenção proporciona imunoligantes que ligam VEGF e portanto são adequados para bloquear a função do VEGF in vivo. As CDRs destes imunoligantes são derivadas de anticorpos mono- clonais anti-VEGF de coelho os quais foram obtidos a partir de coelhos que foram imunizados com VEGF humano e/ou um fragmento do mesmo (SEQ 1DNo1). Que se saiba, esta é a primeira vez que anticorpos monocilonais anti-VEGF foram obtidos a partir de coelhos e caracterizados em detalhes. Surpreendentemente, foi visto que as afinidades (Kd) são extraordinariamen- te elevadas. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um imunoli- gante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo no mínimo uma de uma sequência de aminoácidos CDRH1, uma sequência de aminoácidos CDRH2, uma sequência de aminoácidos CDRH3, uma sequência de amino- ácidos CDRL1, uma sequência de aminoácidos CDRL2, ou uma sequência de aminoácidos CDRL3. Sequências de aminoácidos CDR exemplares para - 15 aplicação nos imunoligantes da invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 (Tabelas 1a6).
Tabela 1. sequências de aminoácidos CDR H1 de imunoligantes anti-VEGF da invenção. 865 lersemmowwe — | e == >| 56 jersrmew ag | 546 jersasenmws — o
Tabela 2. sequências de aminoácidos CDR H2 de imunoligantes antiVEGF da invenção. 6 “ Jeraessesnmvaswake |15 === 606 Ivproepryyaswake | 19 ———õ& 506“ jeioweptoyaswake |33 === õ& : | Tabela 3. sequências de aminoácidos CDR H3 de imunoligantes antiVEGF da invenção.
“O | identcadorde sequência [corn === Jssoinno | 66 JenvoivrDeevavaeien 37 06 Ílesgemeim 3 =|
Tabela 4. sequências de aminoácidos CDR L1 de imunoligantes anti-VEGF da invenção. 6 leasosissris — => 38 === 455 = U jossosvwwnnRta — ao — >| 565º [oasenvss = 4 60 leasesissms = e | Is06 “ jleasonrmvis = ag == : [sima — ——————|easasnvvs == ag ==> “+ [consenso == [oasosintiaáínnvts Jar = Tabela 5. sequências de aminoácidos CDR L2 de imunoligantes anti-VEGF da invenção. : 66 “| karas | 6 | o leastas | mo Raras | [consenso — Ú/J-lRastmas = | |
Tabela 6. sequências de aminoácidos CDR L3 de imunoligantes anti-VEGF da invenção.
66 “0 Joswveessspye—nn 61 ——— >| 0 jonvvswmwevear ja = | Bo fomvvuastvean or | 5675 — — Jonnamverneor — 6g => 506 “UU jennamvetnmet — 6e ===> =| Em uma modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, 5 preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência de consenso do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 71. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante com- preende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 37 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreen- dem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 71. Preferencialmente, a CDR é selecionada entre o grupo consistin- do em SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 25, SEQIDNO:27aSEQID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 70.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante com- preende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 e SEQIDNO:27 &e/ouasCDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61. Em outra modalidade preferencial, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 27 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compre- endem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no - 15 mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, e SEQ ID NO:
62. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 e/ouasCDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, e SEQ ID NO: 62.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO:
63. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 e/ouasCDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 63.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ 1DNO:18,SEQID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO:
64. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 30 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 64.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ - 15 1IDNO:19,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO:
65. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 31 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 65.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ 1DNO:20,SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO:
66. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 32 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 66.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO:
67. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 33 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 67. Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 68. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 34 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 68 Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69. Preferencialmente, o VH do refe- rido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 35 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69. Alternativamente, o VH do referido imuno- ligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ IDNO:25eSEQID NO: 35 e/ou as CDRs do VL do referido imunoligante compreendem CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 69.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo no mínimo uma CDR tendo no mínimo 75% de similaridade, preferencialmente no mínimo 75% de identidade, mais preferencialmente no mínimo 80%, 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com uma sequência do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70. Preferencialmente, o VH do referido imunoligante compreende as CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 36. Adicionalmente ou alternativamente, o VL do referido imunoligante compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70, por exemplo, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 70; ou SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: : 59, e SEQ ID NO: 70. Em uma modalidade muito preferencial, o imunoligante revelado - 15 aqui, neste pedido de patente, neutraliza VEGF humano e tem reatividade cruzada com VEGF de rato/ camundongo ou uma porção do mesmo. O imunoligante pode compreender um anticorpo ou qualquer andaime de ligação alternativo capaz de acomodar CDRs. As CDRs deter- i minadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 podem ser enxertadas sobre qualquer an- daime de ligação adequado usando quaisquer métodos reconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Riechmann, L. et a/. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033; a Patente U.S. No. 5.225.539 para Winter, e as Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e
6.180.370 para Queen et al). No entanto, é preferencial que os imunoligan- tes revelados aqui, neste pedido de patente, sejam humanizados, e portanto adequados para aplicações terapêuticas. No caso de anticorpos, as CDRs de coelho determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 podem ser enxertadas dentro das regiões de estrutura de qualquer anticorpo de quaisquer espécies. No entanto, foi descoberto previamente que anticorpos ou derivados de anticorpos compreendendo as estruturas identificadas na chamada triagem de "controle de qualidade" (pu-
blicação de patente internacional No. WO0148017) são caracterizadas por uma estabilidade e/ou solubilidade geralmente elevada e portanto também podem ser úteis no contexto de aplicações extracelulares tais como neutrali- zação de VEGF humano. Além disso, foi descoberto adicionalmente que uma combinação em particular destas estruturas solúveis e estáveis de VL (cadeia leve variável) e de VH (cadeia pesada variável) é particularmente adequada para acomodar CDRs de coelho. Por conseguinte, em uma moda- lidade, as CDRs determinadas nas SEQ ID Nos: 2 a 72 são enxertadas den- tro das estruturas de anticorpos humanos derivadas por triagem de "controle de qualidade" reveladas na patente europeia No. EP1479694. As sequên- cias de aminoácidos de estruturas exemplares para uso na invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 172 a 174. Foi visto surpreendentemente . que na enxertação dentro da referida estrutura ou de seus derivados, pode ser totalmente mantida a conformação de loop de uma grande variedade de *— 15 CDRs de coelho, largamente independente da sequência da estrutura do doador. Além disso, a referida estrutura ou seus derivados contendo diferen- tes CDRs de coelho são bem expressados e produzidos ao contrário das cadeias únicas selvagens de coelho e ainda quase totalmente retêm a afini- dade dos anticorpos de coelho do doador original.
Portanto, em uma modalidade preferencial, as CDRs e/ou moti- vos de CDR revelados aqui, neste pedido de patente, estão presentes em uma sequência de estrutura da região variável de cadeia pesada tendo no mínimo 80% de identidade de sequência, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90% 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 169. Em uma modalidade preferencial, a sequên- cia de estrutura de região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 170 ou SEQ ID NO: 171.
Em uma modalidade preferencial, as CDRs e/ou motivos de CDR revelados aqui, neste pedido de patente, estão presentes em uma se- quênciade estrutura da região variável de cadeia leve tendo no mínimo 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente no mínimo 90%, 95%, de modo ainda mais preferencial 100% de identidade com a sequência de
SEQ ID NO: 167, mais preferencialmente compreendendo SEQ ID NO: 167 ou SEQ ID NO: 168. Em anticorpos de coelho, CDRs podem conter resíduos cisteína que se tornam dissulfeto ligado a resíduos cisteína na estrutura do anticorpo. Por conseguinte, pode ser necessário, ao enxertar CDRs de coelho contendo resíduos cisteína dentro de regiões de estrutura não de coelho, introduzir resi- duos cisteína na estrutura não de coelho por, por exemplo, mutagênese para facilitar a estabilização de CDR de coelho através de uma ligação dissulfeto.
Em outras modalidades, a invenção proporciona um imunoligan- te, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo no mínimo uma de uma sequência de aminoácidos de VL ou uma sequência de aminoácidos de VH. Sequências de aminoácidos de VH ou de VL exemplares para uso nos imunoligantes da invenção são determinadas nas SEQ ID Nos: 72 a 106 e 107 a 166, respectivamente.
- 15 Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ 1IDNO:30eSEQID NO: 131 (VH 60-11-4, VH 60-11-6, VH 60-11-4min, VH 60-11-6min, VH 60-114max e VH 60-11-6max, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 72, SEQIDNO:82eSEQID NO: 93 (VL 60, VL 60min, VL 60max, respectiva- mente).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 132 (VH 435, VH 435min e VH 435max, respectivamente);
e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO:94 (VL 435, VL 435min e VL 435max, respec- tivamente).
Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmen- te 100% de identidade com a SEQ ID NO: 175 (435max).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 133 (VH 453, VH 453min e VH 453max, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:84 e SEQ ID NO: 95(VL 453, VL 453min e VL 453max, respecti- vamente).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 134 (VH 375, VH 375min e VH375max, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO:96 (VL 375, VL 375min e VL 375max, respec- tivamente).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen-
cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 123 e 135 (VH 610, VH 610min e VH 610max, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 97 (VL 610, VL 610min e VL 610max, respec- tivamente).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em | SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ - 15 1IDNO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: . 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ i ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO:165eSEQID NO: 166 (VH 578 e variantes das mesmas); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:104eSEQID NO: 105 (VL 578 e variantes das mesmas). Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmen- te 100% de identidade com a SEQ ID NO: 178 (578min), SEQ ID NO: 179 (578max) ou SEQ ID NO: 180 (578minmax).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 137 (VH 534, VH 534min e VH 534max, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 99 (VL 534, VL 534min e VL 534max, respec- tivamente). Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO:138 e SEQ ID NO: 143 (VH 567, VH 567min e VH 567max, respectivamente); - 15 e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com : uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO:. 79, SEQ ID NO:89 e SEQ ID NO: 100 (VL 567, VL 567min e VL 567max, respec- tivamente).
Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmen- te 100% de identidade com a SEQ ID NO: 177 (567min).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO:139 e SEQ ID NO: 140 (VH 509, VH 509min, VH 509max e VH 509maxIl, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 101 (VL 509, VL 509min e VL. 509max, res-
pectivamente).
Em outra modalidade preferencial, a invenção proporciona um imunoligante compreendendo um VH tendo no mínimo 80%, mais preferen- cialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 145 (VH 511, VH 511min, VH 511max e VH 511maxDHP, respectivamente); e/ou um VL tendo no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmente 100% de identidade com uma sequência selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 106 (VL 511, VL 511min, VL 511max e VL 51 1IminC41L, respectivamente).
Preferencialmente, o referido imunoligante tem no mínimo 80%, i mais preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, o mais preferencialmen- - 15 te100%de identidade com a SEQ ID NO: 176 (511 max).
Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substancial similaridade com uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2 a 166 e nas SEQ ID Nos: 175a180,e em que o imunoligante essencialmente retém ou aprimora as propriedades funcionais desejadas do imunoligante anti-VEGF da invenção. Percentagens de similaridades preferenciais incluem, mas não estão limita- das a, no mínimo 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identi- dade.
Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substancial identidade com uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2-166 e nas SEQ ID Nos. 175-180, e em que o imunoligante retém ou aprimora as propriedades fun- cionais desejadas do imunoligante anti-VEGF da invenção. Percentagens de identidades preferenciais incluem, mas não estão limitadas a, no mínimo 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade.
Em certas modalidades, a invenção proporciona adicionalmente um imunoligante, o qual liga especificamente VEGF, compreendendo uma sequência de aminoácidos com substituições conservadoras em relação a uma sequência de aminoácidos determinada nas SEQ ID Nos: 2 a 166 e nas SEQIDNos.175a180,e em que o imunoligante retém ou aprimora as pro- priedades funcionais desejadas do imunoligante anti-VEGF da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoligantes que ligam especificamente a VEGF humano e têm reação cruzada com mo- léculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VEGF de rato, VEGF de coelho ou VEGF de porco da índia. Em uma moda- lidade em particular o imunoligante anti-VEGF pode ligar especificamente a VEGF humano e de rato/ camundongo. : Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoligantes que ligam especificamente a VEGF humano e não têm reação cruzada com 7 15 moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundon- go, VEGF de rato, VEGF de coelho ou VEGF de porco da índia. - Em algumas modalidades, a invenção proporciona imunoligantes que ligam especificamente a VEGF humano e em que os imunoligantes são maturados por afinidade. Em uma modalidade, anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção são anticorpos de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab. No caso de anticorpos scFv, um domínio VL selecionado pode ser encadea- do a um domínio VH selecionado em outra orientação por um encadeador flexível. Un encadeador do estado da técnica adequado consiste em se- —quências de aminoácidos GGGGS repetidas ou variantes das mesmas. Em uma modalidade preferencial da presente invenção um encadeador (GGGGS),4 da sequência de aminoácidos determinada na SEQ ID NO: 181, mas variantes de 1 a 3 repetições também são possíveis (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros encadeadores que podem ser usados para a presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et a/. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et a/. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol.
Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
Immunother. 50: 51-59. A disposição pode ser quer Vl-encadeador-VH ou VH-encadeador- VL, com a orientação precedente sendo a orientação preferencial.
No entan- to, anticorpos de domínio único VH ou VL também são contemplados.
No casode fragmentos Fab, domínios variáveis de cadeia leve selecionados VL são fundidos à região constante de uma cadeia kappa de lg humana, ao passo que os domínios variáveis de cadeia pesada adequados VH são fun- didos ao primeiro domínio constante (N-terminal) CH1 de uma IgG humana.
No C-término do domínio constante ou em outros sítios do domínio variável ou constante, pode ser formada uma ponte dissulfeto inter-cadeias.
Alterna- tivamente, as duas cadeias também podem ser encadeadas por um encade- ador flexível resultando em um anticorpo Fab de cadeia única.
Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção i podem ter afinidades para VEGF humano com constantes de dissociação Kg * 15 emuma faixade 10**M a 10ºM.
Em uma modalidade preferencial da pre- sente invenção a Kg é <1 nM.
A afinidade de um anticorpo por um antígeno - pode ser determinada experimentalmente usando um método adequado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", em Fundamental Immuno- : logy, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J.
Immuno- logy W.H.
Freeman e Company: New York, NY ) e métodos descritos nos mesmos.
A empresa Epitomics vende um anticorpo anti-VEGF o qual é um anticorpo monoclonal de coelho (VEGF (C-term) Rabbit Antibody, Cat. no. 1909-1). O referido anticorpo é direcionado contra resíduos sobre o C- término de VEGF humano e portanto não tem capacidade de neutralizar VEGF.
Portanto, o referido anticorpo não é adequado para aplicações tera- pêuticas.
Além disso, a referida IgG monoclonal não é um anticorpo humani- zado mas é uma imunoglobulina de extensão total de coelho natural.
Além disso, foi demonstrado que este anticorpo não reconhece a forma nativa de VEGF.
Imunoligantes que ligam os mesmos epitopos sobre VEGF Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos que ligam a um epitopo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211. Os anticorpos referidos podem ser identificados com base em Sua capacidade para competição cruzada com um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 em provas de ligação de VEGF de rotina inclusive, mas não limitadas a, ELISA. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação a VEGF humano de um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 demonstra que o anticorpo de teste é capaz de competição cruzada portanto interage com um epitopo de sobreposição sobre VEGF humano como um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de amino- ácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211.
Adicionalmente ou alternativamente, os referidos anticorpos - 15 também podem ser identificados usando técnicas de mapeamento de epito- pos de rotina para determinar se eles ligam aos mesmos imunogênios peptí- ' dicos. Técnicas de modelagem estrutural também podem ser empregadas para definir adicionalmente os precisos determinantes moleculares para a ] interação anticorpo/VEGF, inclusive, mas não limitadas a, RMN , cristalogra- fiade raios X, modelagem computacional, ou tomografia de proteína (Ban- yay et al., 2004, ASSAY and Drug Development Technologies (2), 5, Page 5516-567). Na verdade, a estrutura cristalina de VEGF foi resolvida e os resí- duos aminoácidos superficiais envolvidos na ligação de VEGFr são conheci- dos (Fuh, et a/., 2006, J. Biol. Chem., 281, 6625-6631). Por conseguinte, da- daa sequência de aminoácidos do imunogênio peptídico e o conhecimento estrutural de VEGF disponíveis na técnica, está dentro do conhecimento ge- ral da técnica a identificação de anticorpos que ligam a um epítope sobre VEGF reconhecido pelos anticorpos compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211. Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epitopo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a
211 ligam a VEGF com uma afinidade de no mínimo 107 M', por exemplo, no mínimo 10º M*, no mínimo 10º M”, no mínimo 10º M*, no mínimo 10ºº M' 1, no mínimo 10** M", no mínimo 10º? M* ou no mínimo 10º M*. Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epitopo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 ligam especificamente a VEGF humano e não têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundon- go, VGEF de rato, VEGF de coelho, ou VEGF de porco da índia.
Em algumas modalidades, anticorpos que ligam a um epitopo sobre VEGF reconhecido por um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 2 a 211 têm reação cruzada com moléculas de VEGF de outras espécies, por exemplo, VEGF de camundongo, VEGF de rato, ou VEGF de coelho.
7 15 Variantes Otimizadas Os anticorpos da invenção podem ser adicionalmente otimizados - para propriedades funcionais aprimoradas, por exemplo, para solubilidade e/ou estabilidade reforçadas. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são otimi- zados de acordo com a metodologia de "consenso funcional" revelada na publicação do Pedido de Patente No. de Série PCT/EP2008/001958, intitula- do "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibo- dies", depositado em 12 de março de 2008, a qual é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
Por exemplo, os imunoligantes de VEGF da invenção podem ser comparados com um banco de dados de scFvs funcionalmente selecionados para identificar posições de resíduos aminoácidos que são ou mais ou me- nos tolerantes de variabilidade do que a posição ou posições corresponden- tes no imunoligante de VEGF, deste modo indicando que a posição ou posi- ções de resíduos identificados podem ser adequadas para manipulação para melhorar a funcionalidade tal como estabilidade e/ou solubilidade.
Posições de estruturas exemplares para substituição são descri- * tas na publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No.
PCT/ CH2008/000285, intitulado "Methods of Modifying Antibodies, e Modified An- tibodies com Improved Functional Properties" , depositado em 25 de junhode 2008, e PCT Pedido de Patente No.
PCT/CH2008/000284, intitulado "Se- quence Based Engineering e Optimization of Single Chain Antibodies", de- positado em 25 de junho de 2008. Por exemplo, uma ou mais das seguintes substituições podem ser introduzidas em uma posição de aminoácido (a nu- meração AHo é referida para cada uma das posições de aminoácidos lista- das abaixo) na região variável de cadeia pesada de um imunoligante da in- venção: (a) Q ou E na posição de aminoácido 1; . (b) Q ou E na posição de aminoácido 6; (c) T, S ou A na posição de aminoácido 7, mais preferencialmen- “15 teTouaA, de modo ainda mais preferencial T; (d) A, T, P, Vou D, mais preferencialmente T, P, V ou D, na po- . sição de aminoácido 10, (e) L ou V, mais preferencialmente L, na posição de aminoácido 12, (NV, R, Q, M ou K, mais preferencialmente V, R, Q ou M na po- sição de aminoácido 13; (9) R M, E, Q ou K, mais preferencialmente R, M, E ou Q, de modo ainda mais preferencial R ou E, na posição de aminoácido 14; (h) L ou V, mais preferencialmente L, na posição de aminoácido 19 (1) R, T, Kou N, mais preferencialmente R, T ou N, de modo ain- da mais preferencial N, na posição de aminoácido 20; () 1, F, L ou V, mais preferencialmente |, F ou L, de modo ainda mais preferencial | ou L, na posição de aminoácido 21; (k) R ou K, mais preferencialmente K, na posição de aminoácido 45; () T, P, V, A ou R, mais preferencialmente T, P, V ou R, de mo-
do ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 47; (m) K, Q, H ou E, mais preferencialmente K, H ou E, de modo ainda mais preferencial K, na posição de aminoácido 50; (n) M ou |, mais preferencialmente |, na posição de aminoácido 55 (o) K ou R, mais preferencialmente K, na posição de aminoácido TT; (Pp) A, V, L ou |, mais preferencialmente A, L ou |, de modo ainda mais preferencial A, na posição de aminoácido 78; (q) E, R, T ou A, mais preferencialmente E, T ou A, de modo a- inda mais preferencial E, na posição de aminoácido 82; (1) T, S, | ou L, mais preferencialmente T, S ou L, de modo ainda : mais preferencial T, na posição de aminoácido 86; (s) D, S, N ou G, mais preferencialmente D, N ou G, de modo a- 7 15 indamais preferencial N, na posição de aminoácido 87; (N) A, V, L ou F, mais preferencialmente A, V ou F, de modo ain- - da mais preferencial V, na posição de aminoácido 89; (u) F, S, H, D ou Y, mais preferencialmente F, S, H ou D, na po- sição de aminoácido 90; (v) D, Q ou E, mais preferencialmente D ou Q, de modo ainda mais preferencial D, na posição de aminoácido 92; (w)G, N, Tou S, mais preferencialmente G, N ou T, de modo a- inda mais preferencial G, na posição de aminoácido 95; () T, A, P, Fou S, mais preferencialmente T, A, P ou F, de mo- doaindamais preferencial F, na posição de aminoácido 98; (y) R, Q, V, I, M, F, ou L, mais preferencialmente R, Q, |, M, F ou L, de modo ainda mais preferencial Y, de modo ainda mais preferencial L, na posição de aminoácido 103; e (2) N, S ou A, mais preferencialmente N ou S, de modo ainda mais preferencial N, na posição de aminoácido 107. Adicionalmente ou alternativamente, uma ou mais das substitui ções que se seguem podem ser introduzidas na região variável de cadeia leve de um imunoligante da invenção: (aa) Q, D, L, E, S, ou |, mais preferencialmente L, E, S ou |, de modo ainda mais preferencial L ou E, na posição de aminoácido 1; (bb) S, A, Y, |, P ou T, mais preferencialmente A, Y, |, P ou T, de modo ainda mais preferencial P ou T na posição de aminoácido 2; (co) Q, V, T ou |, mais preferencialmente V, T ou |, de modo ain- da mais preferencial V ou T, na posição de aminoácido 3; (dd) V, L, | ou M, mais preferencialmente V ou L, na posição de aminoácido 4; (ee) S, E ou P, mais preferencialmente S ou E, de modo ainda mais preferencial S, na posição de aminoácido 7; (ff) T ou |, mais preferencialmente |, na posição de aminoácido : 10; (gg) A ou V, mais preferencialmente A, na posição de aminoáci- 7“ 15 do; (hh) S ou Y, mais preferencialmente Y, na posição de aminoáci- . do 12; (ii) T, S ou A, mais preferencialmente T ou S, de modo ainda i mais preferencial T, na posição de aminoácido 14; (ji) S ou R, mais preferencialmente S, na posição de aminoácido 18; (kk) T ou R, mais preferencialmente R, na posição de aminoáci- do 20; (I)) R ou Q, mais preferencialmente Q, na posição de aminoácido 24 (mm) H ou Q, mais preferencialmente H, na posição de aminoá- cido 46; (nn) K, R ou |, mais preferencialmente R ou |, de modo ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 47; (00) R, Q, K, E, T, ou M, mais preferencialmente Q, K, E, Tou M, na posição de aminoácido 50; (Pp) K, T, S, N, Q ou P, mais preferencialmente T, S, N, Qou P,
na posição de aminoácido 53; (qq) | ou M, mais preferencialmente M, na posição de aminoáci- do 56; (rr) H, S, F ou Y, mais preferencialmente H, S ou F, na posição deaminoácido 57; (ss) |, V ou T, mais preferencialmente V ou T, R, de modo ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 74; (tt) R, Q ou K, mais preferencialmente R ou Q, de modo ainda mais preferencial R, na posição de aminoácido 82; (uu) L ou F, mais preferencialmente F, na posição de aminoácido 91; (vw) G, D, T ou A, mais preferencialmente G, D ou T, de modo : ainda mais preferencial T, na posição de aminoácido 92; (xx) S ou N, mais preferencialmente N, na posição de aminoáci- - 15 do9o4 (yy) F/ You S, mais preferencialmente Y ou S, de modo ainda . mais preferencial S, na posição de aminoácido 101; e (22) D, E, HA E, L A, T, V, S, G ou |, mais preferencialmente H, E, L, A, TV, S, G ou |, de modo ainda mais preferencial A ou V, na posição deaminoácido 103.
O sistema de numeração AHo é descrito adicionalmente em Ho- negger, A. e Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670). Alternativamen- te, pode ser usado o sistema de numeração de Kabat conforme descrito adi- cionalmente em Kabat et a/. (Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of Prote- ins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health e Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Tabelas de conversão para os dois sistemas de numeração diferentes usados para identificar posições de resíduos aminoácidos em regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos são proporcionadas em A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 6657-670.
Em outras modalidades, os imunoligantes da invenção compre- endem uma ou mais mutações de reforço da solubilidade e/ou estabilidade descritas no Pedido de Patente Provisória U.S.
No. de Série 61/075.692, intitulado "Solubility Optimization of Immunobinders", depositado em 25 de junho de 2008. Em algumas modalidades preferenciais, o imunoligante com- preende uma mutação de reforço da solubilidade em uma posição de ami- —noácido selecionada entre o grupo de posições de aminoácidos de cadeia pesada consistindo em 12, 103 e 144 (convenção de Numeração AHo). Em uma modalidade preferencial, o imunoligante compreende uma ou mais substituições selecionadas entre o grupo consistindo em: (a) Serina (S) na posição de aminoácido de cadeia pesada 12; (b) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 103; e (c) Serina (S) ou Treoni- na (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 144. Em outra modalida- de, o imunoligante compreende as seguintes substituições: (a) Serina (S) na posição de aminoácido de cadeia pesada 12; (b) Serina (S) ou Treonina (T) na posição de aminoácido de cadeia pesada 103; e (c) Serina (S) ou Treoni- - 15 na(T)naposição de aminoácido de cadeia pesada 144. Hibridomas Expressando Anticorpos Anti-VEGF de Coelho R Em outro aspecto, a invenção proporciona um hibridoma expres- sando um anticorpo monoclonal compreendendo qualquer uma ou mais das ] sequências de aminoácidos determinadas nas SEQ ID Nos 72-81. Métodos para produzir hibridomas a partir de células B de coelho são de conhecimen- to geral na técnica e são revelados, por exemplo, no pedido de patente U.S.
No. 2005/0033031. Produção de Imunoligantes Anti-VEGF Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção — podem ser gerados usando técnicas de rotina no campo da genética recombi- nante.
Conhecendo as sequências dos polipeptídeos, os cDNAs codificando as mesmas podem ser gerados por síntese genética (www.genscript.com). Estes CDNAs podem ser clonados em plasmídeos de vetores adequados.
Uma vez que o DNA codificando um domínio VL e/ou um domínio VH é obtido, muta- — gênese sítio direcionado, por exemplo, por PCR usando iniciadores mutagê- nicos, pode ser realizada para obter vários derivados.
A melhor sequência "de partida" pode ser escolhida dependendo do número de alterações dese-
jadas nas sequências VL e/ou VH.
Métodos para incorporar ou enxertar CDRs em regiões da estru- tura incluem os determinados, por exemplo, em Riechmann, L. ef a/. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen, C.
etal (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033; na Patente U.S.No. 5.225.539 para Winter, e nas Patentes US. Nos. 5.530.101;
5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al, bem como os revelados no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.697, intitulado "Humanization of Rabbit Antibodies Using Universal Antibody Frameworks" , depositado em 25 de junho de 2008.
Técnicas de clonagem e mutagênese de rotina de conhecimento geral da pessoa versada na técnica podem ser usadas para anexar encade- adores, domínios de permuta ou fusões de construto para a produção de fragmentos Fab. Protocolos básicos revelando os métodos gerais desta in- - 15 venção são descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambro- ok & Russell, 3" ed. 2001) e em Current Protocols in Molecular Biology (Au- . subel et a/., 1999). A sequência de DNA carregando um gene codificando um poli- Ú peptídeo de scFv, ou no caso de fragmentos Fab, codificando quer dois ge- nes separados ou um operon bi-cistrônico compreendendo os dois genes para as fusões VL-CK e as VH-CH1 são clonados em um vetor de expressão adequado, preferencialmente um com um promotor indutível. Deve-se ter cuidado para que na frente de cada gene esteja presente um sítio de ligação de ribossoma apropriado que assegure translação. Deve ser entendido que os anticorpos da presente invenção compreendem as sequências reveladas ao invés de eles consistirem nas mesmas. Por exemplo, estratégias de clo- nagem podem necessitar que seja produzido um construto a partir do qual esteja presente um anticorpo com um ou uns poucos resíduos adicionais na extremidade de N-terminal. Especificamente, a metionina derivada do códon de partida pode estar presente na proteína final em casos em que não foi clivada pós-translacionalmente. A maioria dos construtos para anticorpos scFv dão origem a uma alanina adicional na extremidade de N-terminal. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, é escolhido um vetor de expressão para expressão periplásmica em E. coli (Krebber, 1997). O referi- do vetor compreende um promotor na frente de uma sequência de sinaliza- ção clivável.
A sequência codificante para o peptídeo do anticorpo é em se- guidafundidaem estrutura à sequência de sinalização clivável.
Isto possibili- ta o direcionamento do polipeptídeo expressado para o periplasma bacteria- no onde a sequência de sinalização é clivada.
O anticorpo é em seguida do- brado.
No caso dos fragmentos Fab, tanto os peptídeos de fusões VL-CK quanto os VH-CH1 devem ser encadeados a um sinal de exportação.
A liga- çãoS-S covalente é formado nas cisteínas de C-terminal depois dos peptí- deos terem atingido o periplasma.
Se for preferencial expressão citoplasmá- tica de anticorpos, os referidos anticorpos geralmente podem ser obtidos em altas produções a partir de corpos de inclusão, os quais podem ser facilmen- | te separados de outros fragmentos celulares e proteína.
Neste caso os cor- * 15 posdeinclusão são solubilizados em um agente desnaturante tal como, por exemplo, cloridrato de guanidina (GndHCI) e em seguida redobrado por pro- - cedimentos de renaturação de conhecimento geral daqueles versados na técnica. : Plasmídeos expressando os polipeptídeos scFv ou Fab são in- troduzidos em um hospedeiro adequado, preferencialmente uma célula bac- teriana, de levedura ou de mamífero, o mais preferencialmente uma cepa de E. coli adequada como, por exemplo, JM83 para expressão periplásmica ou BL21 para expressão em corpos de inclusão.
O polipeptídeo pode ser colhi- do quer a partir do periplasma ou formar corpos de inclusão e ser purificado usando técnicas de rotina tais como cromatografia de permuta iônica, croma- tografia de fase reversa, cromatografia por afinidade e/ou filtração por ge! de conhecimento da pessoa versada na técnica.
Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados com respeito à produção, solubilidade e estabili- dadein vitro.
As capacidades de ligação a VEGF, preferencialmente a VEGF humano, podem ser testadas in vitro por ELISA ou ressonância de plasmô- nio superficial (BIACore), usando VEGF humano recombinante conforme descrito na patente internacional No.
WO 97/29131, o último método tam- bém possibilitando determinar a taxa constante kor, a qual deve ser prefe- rencialmente menos de 10ºs”. Valores de Kg de <10 nM são preferenciais.
À parte de anticorpos com forte afinidade de ligação para VEGF humano, também é desejável selecionar anticorpos anti-VEGF os quais têm outras propriedades benéficas de uma perspectiva terapêutica.
Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo o qual inibe o crescimento de células HU- VEC em resposta a VEGF (vide o Exemplo 3). Em uma modalidade, o anti- corpo pode ser capaz de inibir a proliferação de células HUVEC em resposta auma concentração quase maximamente eficaz de VEGF (0,08 nM). Prefe- rencialmente, o anticorpo tem um valor de dose eficaz 50 (ED50) de não mais de cerca de 5 nM, preferencialmente não mais de cerca de 1 nM, prefe- : rencialmente não mais de cerca de 1 nM, preferencialmente não mais de cerca de 0,5 nM e o mais preferencialmente não mais de cerca de 0,06 nM, 7 15 parainibira proliferação de células endoteliais induzida por VEGF nesta " prova de crescimento de células endoteliais", isto é, nestas concentrações o - anticorpo é capaz de inibir o crescimento de células endoteliais induzido por VEGF in vitro por, por exemplo, 50% ou mais.
Moléculas biespecíficas Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-VEGF, ou um fragmento do mesmo, da invenção.
Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antígeno do mesmo, pode ser derivado ou encadeado a outra molécula fun- cional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticor- po ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que liga a no mínimo dois sítios de ligação diferentes ou moléculas-alvo diferen- tes.
O anticorpo da invenção pode ser derivado ou encadeado a mais de uma molécula funcional diversa para gerar moléculas multiespecíficas que ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas-alvo diferen- tes; também se pretende que as moléculas multiespecíficas referidas sejam englobadas pelo termo "molécula biespecífica" conforme usado aqui, neste pedido de patente.
Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente encadeado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de modo diverso) a uma ou mais moléculas de ligação diversas, tais como outro anti- corpo, fragmento de anticorpo, antígenos específicos de tumor ou especiífi- cosde patógeno, peptídeo ou mimético de ligação, de tal modo que resulte uma molécula biespecífica. Por conseguinte, a presente invenção inclui mo- léculas biespecíficas compreendendo no mínimo uma primeira molécula de ligação tendo especificidade para VEGF e uma segunda molécula de ligação tendo especificidade para um ou mais epitopos-alvo adicionais.
Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem uma especificidade de ligação no mínimo um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, inclusive, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo - 15 domesmotalcomo um Fv ou um construto de cadeia única conforme descri- to por Ladner et al. na Patente U.S. No. 4.946.778, cujo conteúdo é expres- - samente incorporado por meio de referência.
Apesar de serem preferenciais anticorpos monoclonais huma- nos, outros anticorpos os quais podem ser empregados nas moléculas bies- pecíficas da invenção são anticorpos monocilonais murinos, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando especificidades de ligação dos constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de liga- çãoda molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e em seguida conjugada a uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de ligação ou de reticulação podem ser usados para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclo-haxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo,
Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Sci- ence 229: 81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). A- gentes de conjugação preferenciais são SATA e sulfo-SMCC, ambos dispo- níveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles po- dem ser conjugados através de ligação sulfidrila, por exemplo, através das regiões de articulação de C-término das duas cadeias pesadas ou outros sítios, quer ocorrendo naturalmente ou introduzidos artificialmente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a região de articulação é modifica- da para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, preferencialmente : um, antes da conjugação. Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem * 15 ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de ca- deia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender no mínimo duas moléculas de cadeia única. Adicionalmente, uma molécula biespecífica pode ser um scFv que liga especificamente ao primeiro alvo, em que o VH e o VL do referido scFv são encadeados com um encadeador fle- xível compreendendo um domínio proporcionando ligação específica a um segundo alvo. Encadeadores adequados são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S. No. 60/937.820. Métodos para preparar moléculas biespecí- ficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; na Pa- tente U.S. Número 5.455.030; na Patente U.S. Número 4.881.175; na Paten- teUS. Número 5.132.405; na Patente U.S. Número 5.091.513; na Patente U.S. Número 5.476.786; na Patente U.S. Número 5.013.653; na Patente U.S. Número 5.258.498; e na na Patente U.S. Número 5.482.858.
A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado à en- zima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exem- plo, inibição de crescimento), ou por ensaio de “imunoblot"”. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente etiquetado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os com- plexos VEGF-anticorpo podem ser detectados usando, por exemplo, um an- ticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à enzima o qual reconhece e liga especificamente aos complexos anticorpo-VEGF. Alternativamente, os com- plexos podem ser detectados usando qualquer um de uma variedade de i- munoensaios diversos. Por exemplo, o anticorpo pode ser etiquetado radioa- : tivamente e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Wein- traub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on “15 RadioligandAssay Techniques, The Endocrine Society, de março de 1986, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este pedido de patente). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como a aplicação de um contador you um contador de cintilação ou por autorradiografia.
Imunoconjugados Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza um anticorpo anti-VEGF, ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma porção terapêuti- ca, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Os conjugados referidos são referidos aqui, neste pedi- do de patente, como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para (por exem- plo, mata) células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracina diona,mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glu- cocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos também inclu-
em, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercapto- purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracila decarbazina), agentes alqui- lantes (por exemplo, mecioretamina, tioepa clorambucila, meifalan, carmus- tina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanito|, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (11) (DDP) cispla- tina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomici- na) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes an- timitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
Outros exemplos preferenciais de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e derivados das mesmas. Um : exemplo de um conjugado de anticorpo de caliqueamicina está disponível comercialmente (Mylotarg'TY; Wyeth-Ayerst).
a Es) Citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção u- sando tecnologia de encadeadores disponíveis na técnica. Exemplos de ti- - pos de encadeadores que têm sido usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, és- teres, dissulfetos e encadeadores contendo peptídeo. Pode ser escolhido um encadeador que é, por exemplo, suscetível à clivagem por baixo pH dentro do compartimento lisossômico ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressadas em tecido tumoral tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).
Para discussão adicional de tipos de citotoxinas, encadeadores e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, vide tam- bém Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. ef al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, |. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D.e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
Anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referi-
dos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que po- dem ser conjugados a anticorpos para serem usados de modo diagnóstico ou terapeuticamente incluem, mas não estão limitados a, iodo'*!, índio”"*, ftrio? º jutécio”””. Métodos para preparar radioimunoconjugados estão esta- —belecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis comercialmente, inclusive Zevalin'y (IDEC Pharmaceuticals) e BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para pre- parar radioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção.
Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção de fármaco não deve ser considerada como estando limitada a agentes terapêuticos químicos clássi- cos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipepti- : deo possuindo uma atividade biológica desejada. As proteínas referidas po- dem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento * 15 ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina diftérica;, uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interfe- - ron-y; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfo- cinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), | fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de cres- cimento.
Técnicas para conjugação da porção terapêutica referida a anti- corpos são de conhecimento geral, vide, por exemplo, Arnon et al., "Mono- clonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em —Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy , Reisfeld et al. (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et a/. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclional Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detec-
tion And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Aplicações de Anticorpos Anti- VEGF Para aplicações terapêuticas, os anticorpos anti-VEGF da inven- ção são administrados a um mamífero, preferencialmente um ser humano, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável tal como as discu- tidas aqui, neste pedido de patente, inclusive as que podem ser administra- das a um ser humano por via intravenosa, como um bolo ou por infusão con- tínua durante um período de tempo, por vias tópica, intraocular, intramuscu- lar, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovi- al, intratecal, oral, ou por inalação. Os anticorpos também são conveniente- mente administrados por vias intratumoral, peritumoral, intralesional, ou peri- lesional, para exercer efeitos terapêuticos locais bem como sistêmicos. Es- 7 15 pera-se que a via intraperitoneal seja particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores de ovário.
: Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem de anti- corpo apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratado, conforme defi- nido acima, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é administra- do para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clíni- co do paciente e da reação ao anticorpo, e do critério do médico assistente.
O anticorpo é administrado convenientemente ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.
Os anticorpos anti-VEGF são úteis no tratamento de doenças —mediadas por VEGF conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Por exemplo, degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é uma cau- sa importante de perda visual grave na população idosa. A forma exsudativa de degeneração macular relacionada com a idade é caracterizada por neo- vascularização coroidal e desprendimento de células epiteliais do pigmento retinal. Como a neovascularização coroidal está associada com uma dramá- tica piora no prognóstico, os anticorpos contra VEGF da presente invenção são especialmente úteis para reduzir a gravidade da degeneração macular relacionada com a idade. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais inclusive oftalmoscopia, microscopia do fundo ocular, e tomografia computadorizada ocular. São consideradas todas as doses e todos os regimes aprovados peloFDA adequados para aplicação com Lucentis. Outras doses e regimes são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/075.641, intitulado "Improved Immunobinder Formulations And Methods For Admins- tration", depositado em 25 de junho de 2008, e no Pedido de Patente Provi- sória U.S. No. 61/058.504, os quais são expressamente incorporados aqui, a estepedido de patente.
De acordo com outra modalidade da invenção, a eficácia do an- ticorpo para prevenir ou tratar doença pode ser aprimorada administrando o : anticorpo serialmente ou em combinação com outro agente que é eficaz pa- ra estes fins, tal como fator de necrose tumoral (TNF), um anticorpo capaz 7 15 de inibirou neutralizar a atividade angiogênica de fator de crescimento de fibroblasto acidífero ou básico (FGF) ou fator de crescimento de hepatócito - (HGF), um anticorpo capaz de inibir ou neutralizar as atividades coagulantes de fator tecidual, proteína C, ou proteína S (vide Esmon et a/., Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 91/01753, publicada em 21 de fevereiro de1991),um anticorpo capaz de ligar ao receptor HER2 (vide Hudziak et a/., Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 89/06692, publicada em 27 de julho de 1989), ou um ou mais agentes terapêuticos convencionais tais como, por exemplo, agentes alquilantes, fotocoagulantes (tais como verte- porfina), antagonistas do ácido fólico, antimetabólitos do metabolismo do ácido nucleico, antibióticos, análogos da pirimidina, 5-fluorouracila, cisplati- na, nucleosídeos purina, aminas, aminoácidos, nucleosídeos de triazol, ou corticosteroides. Outros agentes semelhantes podem estar presentes na composição sendo administrada ou podem ser administrados separadamen- te. Além disso, o anticorpo é convenientemente administrado serialmente ou em combinação com tratamentos radiológicos, quer envolvendo irradiação ou administração de substâncias radioativas. Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida tal como uma resina Sephadex ou papel filtro, usando métodos de conhecimento geral na técnica. O anticorpo imobilizado é con- tactado com uma amostra contendo a proteína do VEGF (ou fragmento da mesma) a ser purificada, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exce- to a proteína do VEGF, a qual é ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glici- na, pH 5,0, que liberará a proteína de VEGF do anticorpo.
Anticorpos anti-VEGF também podem ser úteis em provas de di- agnóstico para proteína VEGF, por exemplo, detectando sua expressão em células, tecidos, ou soro específicos. Os métodos de diagnóstico podem ser : úteis no diagnóstico do câncer. Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente será eti- 7 15 quetadocom uma porção detectável. Estão disponíveis numerosas etiquetas as quais podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categories: . (a) Radioisótopos, tais como *** In, * Tc, * EC, 9 1,21,?H,?%P ou * S. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo usando as técni- cas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen etal, Ed. WileyInterscience, New York, N.Y., Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida usando contagem por cintilação.
(b) Etiquetas fluorescentes tais como quelatos terrosos raros (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, aficoeritrina e Vermelho do Texas estão dispo- níveis. As etiquetas fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpo usan- do as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, acima, por exemplo, a Fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro.
(c) Várias etiquetas de enzima-substrato estão disponíveis e a Patente U.S. No. 4.275.149 proporciona uma revisão de algumas destas. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogêni- co a qual pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração na cor em um substrato, a qual pode ser medi-
da espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a flu- orescência ou a quimiluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. O substrato quimilumi- nescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode em seguida emitir luz a qual pode ser medida (usando um quimiluminômetro, por exemplo,) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Exemplos de eti- quetas enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vagalu- me e luciferase bacteriana; Patente U.S. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-di- hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de raiz forte (HRPO), fosfatase alcalina, .beta.-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocícli- : cas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. Técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos são des- “15 critas por O'Sullivan et al, em Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in - Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo,: (i) Peroxidase de raiz forte (HRPO) com peroxidase de hidrogê- nio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um pre- cursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato como subs- trato cromogênico; e (iii) .beta.-D-galactosidase (.beta.-D-Gal) com um substrato cro- mogênico (por exemplo, P-nitrofenil-.beta.-D-galactosidase) ou um substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-.beta.-D-galactosidase.
Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-VEGF não precisa ser etiquetado, e a presença do mesmo pode ser detectada usando um anticorpo etiquetado o qual liga ao anticorpo contra VEGF.
Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaio de ligação competiti- va, ensaios de sanduíche direto e indireto, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Ensaios de ligação competitiva se baseiam na capacidade de um padrão etiquetado para competir com o analisado da amostra de teste para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de proteína VEGF na amostra de teste é inversamente proporcional à quantida- de de padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determina- çãoda quantidade de padrão que se torna ligado, os anticorpos geralmente são insolubilizados antes ou depois da competição, de modo que o padrão e o analisado que são ligados aos anticorpos podem ser convenientemente : separados da amostra e do analisado os quais permanecem não ligados. Ensaios de sanduíche envolvem a aplicação de dois anticorpos, 7 15 cadaum capaz de ligação a uma porção imunogênica diferente, ou epitopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio de sanduíche, o analisado da - amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo o qual é imobilizado so- bre um suporte sólido, e depois disso um segundo anticorpo liga ao analisa- do, deste modo formando um complexo insolúvel de três partes. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.376.110. O segundo anticorpo pode ser o próprio etiquetado com uma porção detectável (ensaio de sanduíche direto) ou pode ser medido usando um anticorpo anti-imunoglobulina que é etique- tado com uma porção detectável (ensaio de sanduíche indireto). Por exem- plo, um tipo de ensaio de sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a porção detectável é uma enzima.
Para imunohistoquímica, a amostra tumoral pode ser fresca ou congelada ou pode ser embutida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo, Os anticorpos também podem ser usados para ensaios de diag- —nósticoin vivo. De modo geral, o anticorpo é etiquetado com um radionucli- deo (tal como "In, *Tc, Vc, 141, 1251, 3H, ?P ou *S) de modo que o tumor pode ser localizado usando imunocintigrafia.
O anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado em um kit, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeter- minadas com instruções para realizar o teste de diagnóstico. Onde o anti- corpo é etiquetado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores re- queridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato o qual pro- porciona o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, podem ser inclu- ídos outros aditivos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades rela- tivas dos vários reagentes podem ser amplamente variadas para proporcio- nar concentrações em solução dos reagentes as quais substancialmente otimizam a sensibilidade do teste. Particularmente, os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, geralmente liofilizados, inclusive excipien- : tes os quais na dissolução proporcionarão uma solução de reagente tendo a concentração apropriada. * 15 Preparações Farmacêuticas Em um aspecto a invenção proporciona formulações farmacêuti- - cas compreendendo anticorpos anti-VEGF para o tratamento de doenças mediadas por VEGF. O termo "formulação farmacêutica" se refere a prepa- i rações as quais estão em semelhante forma de modo a permitir a atividade biológica do anticorpo ou derivado de anticorpo para ser inequivocamente eficaz, e as quais não contêm componentes adicionais os quais são tóxicos para os sujeitos aos quais a formulação seria administrada. Excipientes (veí- culos, aditivos) "farmaceuticamente aceitáveis" são aqueles os quais podem ser administrados razoavelmente a um sujeito mamífero para proporcionar uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.
Uma formulação "estável" é uma formulação na qual o anticorpo ou derivado de anticorpo na mesma essencialmente retém sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica no armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade proteica estão dispo- níveis na técnica e são revisadas em Peptide e Protein Drug Delivery, 247- 301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo, a estabili-
dade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Preferencialmente, a formulação é estável em tempera- tura ambiente (cerca de 30º C) ou a 40 ºC por no mínimo 1 semana e/ou es- tável a cerca de 2 a 8 ºC por no mínimo 3 meses a 2 anos. Além disso, a formulação é preferencialmente estável depois de congelamento (até, por exemplo, -70º C) e descongelamento da formulação.
Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade física" em uma formulação farmacêutica se satisfizer as especificações de liberação definidas para agregação, degradação, precipitação e/ou desnatu- ração no exame visual da cor e/ou claridade, ou conforme medido por dis- persão de luz UV ou por cromatografia de exclusão de tamanho, ou outros métodos reconhecidos na técnica adequados.
: Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade química" em uma formulação farmacêutica, se a estabilidade química em um “15 dadotempoé talque a proteína é considerada para ainda reter sua atividade biológica conforme definido abaixo. A estabilidade química pode ser avaliada - detectando e quantificando formas da proteína quimicamente alterada. À alteração química pode envolver modificação de tamanho (por exemplo, cor- te (clipping)) a qual pode ser avaliada usando cromatografia de exclusão de tamanho, SDS-PAGE e/ou dessorção ionização a laser assistida por matriz / espectrometria de massa de tempo de voo (MALDI/TOF MS), por exemplo. Outros tipos de alteração química incluem alteração de carga (por exemplo, ocorrendo como um resultado de desamidação) a qual pode ser avaliada por cromatografia de permuta iônica, por exemplo, Um anticorpo ou derivado de anticorpo " retém sua estabilidade biológica" em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anti- corpo em um dado tempo estiver dentro de cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida na ocasião que a formulação far- macêutica foi preparada conforme determinado em um ensaio de ligação antigênica, por exemplo. Outros ensaios de "atividade biológica" para anti- corpos são elaborados abaixo aqui, neste pedido de patente.
Por "isotônica" se indica que a formulação de interesse tem es-
sencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Formula- ções isotônicas geralmente têm uma pressão osmótica a partir de cerca de 250 até 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando uma pressão de vapor ou osmômetro do tipo de congelamento por gelo, por exemplo.
Um "poliol" é uma substância com múltiplos grupamentos oxidri- la, e inclui açúcares (açúcares redutores e não redutores), alcoóis de açúcar e ácidos de açúcar. Polióis preferenciais aqui, neste pedido de patente, têm um peso molecular o qual é de menos de cerca de 600 kD (por exemplo, na faixa de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é um açúcar o qual contém um grupamento hemiacetal que pode reduzir íons metálicos ou rea- gir de modo covalente com lisina e outros grupamentos amino em proteínas e um " açúcar não redutor" é um açúcar o qual não tem estas propriedades : de um açúcar redutor. Exemplos de açúcares redutores são frutose, mano- se, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. “ 15 Açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerol são exemplos de - alcoóis de açúcar. Quanto a ácidos de açúcar, estes incluem L-gluconato e sais metálicos do mesmo. Onde se deseja que a formulação seja estável a congelação-descongelação, o poliol é preferencialmente um poliol o qual não cristaliza em temperaturas de congelamento (por exemplo, —20º C) de tal modo que desestabilize o anticorpo na formulação. Açúcares não redutores tais como sacarose e trealose são os polióis preferenciais aqui, neste pedido de patente, com trealose sendo preferencial em relação a sacarose, devido à estabilidade superior da solução de trealose.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "tampão" se re- fere a uma solução tamponada que resiste a alterações no pH pela ação de seus componentes do conjugado ácido-base. O tampão desta invenção tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 8,0; preferencialmente de cerca de 5,5 a cerca de 7. Exemplos de tampões que controlarão o pH nesta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. Onde se deseja uma formulação estável a congelação-descongelação, pre-
ferencialmente o tampão não é fosfato.
Em um sentido farmacológico, no contexto da presente inven- ção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo ou derivado de anticorpo se refere a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para o tratamento da qual o anticorpo ou derivado de anti- corpo é eficaz. Uma "doença/ distúrbio" é qualquer condição que se benefi- ciaria de tratamento com o anticorpo ou derivado de anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicos e agudos inclusive as condições patológicas as quais predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.
Um "conservante" é um composto o qual pode ser incluído na formulação para reduzir essencialmente a ação bacteriana na mesma, deste modo facilitando a produção de uma formulação multiuso, por exemplo. E- : xemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de “15 cloreto de alquilbenzildimetil amônio na qual os grupamentos alquila são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de con- - servantes incluem alcoóis aromáticos tais como fenol, butila e álcool benzíli- co, alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol, e m-cresol. O conservante mais preferencial aqui, neste pedido de patente, é álcool benzílico.
A presente invenção também proporciona composições farma- cêuticas compreendendo um ou mais compostos de anticorpos ou derivados de anticorpos, junto com no mínimo um veículo ou excipiente fisiologicamen- te aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender, por exem- plo, umoumaisde água, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), etanol, óleo mineral, óleo vegetal, dimetil sulfóxido, carboidratos (por exemplo, glicose, manose, saca- rose ou dextranos), manitol, proteínas, adjuvantes, polipeptídeos ou aminoá- cidos tais como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa e/ou conservantes. Conforme mencionado acima, outros ingredi- entes ativos podem (mas não precisam) ser incluídos nas composições far- macêuticas propocrionadas aqui, neste pedidoo de patente.
Um veículo é uma substância que pode ser associada com um anticorpo ou derivado de anticorpo antes da administração a um paciente, frequentemente para a finalidade de controlar a estabilidade ou a biodisponi- bilidade do composto. Veículos para uso dentro de semelhantes formulações são geralmente biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis. Veí- culos incluem, por exemplo, moléculas monovalentes ou muitivalentes tais como albumina sérica (por exemplo, humana ou bovina), albumina de ovo, peptídeos, polilisina e polissacarídeos tais como aminodextrano e poliamido- aminas. Veículos também incluem materiais de suporte sólido tais como con- tase micropartículas compreendendo, por exemplo, polilactato poliglicolato, poli(lactida-co-glicolídeo), poliacrilato, látex, amido, celulose ou dextrano. Um veículo pode carregar os compostos em uma variedade de modos, inclusive ligação covalente (quer diretamente ou através de um grupamento encadea- dor), interação não covalente ou mistura.
Ns Es) As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração apropriada, inclusive, por exemplo, ad- - ministração tópica, intraocular, oral, nasal, retal ou parenteral. Em algumas modalidades, são preferenciais composições em uma forma adequada para aplicação tópica, por exemplo, como gotas oculares. Outras formas incluem, por exemplo, pílulas, comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós dispersíveis ou grânulos, emulsão, cápsulas duras ou mo- les, ou xaropes ou elixires. Dentro ainda de outras modalidades, as compo- sições proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ser formuladas como um liofilizado. O termo parenteral conforme usado aqui, neste pedido de patente, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exem- plo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracranial, intratecal e intraperi- toneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão similar. A composição farmacêutica pode ser preparada como uma sus- pensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril na qual o modulador, depen- —dendo do veículo e da concentração usada, é ou suspendido ou dissolvido no veículo. Uma composição semelhante pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes, umectantes e/ou de sus-
pensão adequado tais como os mencionados acima. Entre os veículos e sol- ventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos não voláteis e estéreis podem ser empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim pode ser empregado quaisquer óleos não volá- teis leves, inclusive mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oleico podem ser usados na preparação de composi- ções injetáveis, e adjuvantes tais como anestésicos locais, conservantes e/ou agentes de tamponamento podem ser dissolvidos no veículo.
As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações de liberação gradual (isto é, uma formulação tal como uma cáp- sula que efetua uma liberação lenta de modulador depois da administração).
: As formulações referidas geralmente podem ser preparadas usando tecno- logia de conhecimento geral e administradas, por exemplo, por implantação 7 15 oral, retal, ou subcutânea, ou por implantação no sítio-alvo desejado. Veícu- los para uso dentro de semelhantes formulações são biocompatíveis, e tam- - bém podem ser biodegradáveis; preferencialmente a formulação proporciona um nível de liberação de modulador relativamente constante. A quantidade de um anticorpo ou derivado de anticorpo contido dentro de uma formulação deliberação gradual depende, por exemplo, do sítio de implantação, da taxa e da duração esperada da liberação e da natureza da doença/ distúrbio a ser tratado ou prevenido.
Anticorpo ou derivados de anticorpos proporcionados aqui, neste pedido de patente, são geralmente administrados em uma quantidade que atinge uma concentração em um fluido corporal (por exemplo, sangue, plasma, soro, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celu- lar, lágrimas ou urina) que é suficiente para ligar de modo detectável a VEGF e prevenir ou inibir doenças / distúrbios mediados por VEGF. Uma dose é considerada como sendo eficaz se resultar em um benefício para o paciente discernível conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Doses sistêmi- cas preferenciais variam a partir de cerca de 0,1 mg a cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por pa-
ciente por dia), com doses orais geralmente sendo cerca de 5 a 20 vezes maiores do que doses intravenosas. A quantidade de anticorpo ou derivado de anticorpo que pode ser combinada com os materiais de veículo para pro- duzir uma forma de dosagem única vai variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração em particular. Formas de unidade de dosagem geralmente vão conter entre a partir de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.
As composições farmacêuticas podem ser embaladas para tratar condições responsivas a um anticorpo ou derivado de anticorpo direcionado paraWVEGF. Composições farmacêuticas embaladas podem incluir um reci- piente encerrando uma quantidade eficaz de no mínimo um anticorpo ou de- rivado de anticorpo conforme descrito aqui, neste pedido de patente, e ins- : truções (por exemplo, rotulagem) indicando que a composição contida deve ser usada para tratar uma doença / um distúrbio responsivo a um anticorpo ouderivado de anticorpo depois de administração no paciente. Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção - também podem ser quimicamente modificados. Grupamentos de modifica- ção preferenciais são polímeros, por exemplo, um polímero de polialqueno, polialquenileno, ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcional- mente substituído ou um polissacarídeo de cadeia ramíficada ou não ramifi- cada. Um grupamento efetor semelhante pode aumentar a meia-vida do an- ticorpo in vivo. Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem po- lifetileno glicol) (PEG), poli(propileno glicol), polifálcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou derivados dos mesmos. Po- límeros particulares que ocorrem naturalmente incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos. O tamanho do polímero po- de ser variado conforme desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da. Para aplicação local onde o anticorpo é designado para penetrar tecido, um peso molecular preferencial do polímero é em torno de 5000 Da. A molécula do polímero pode ser ane- xado ao anticorpo, em particular à extremidade de C-terminal da cadeia pe- sada do fragmento Fab através de um peptídeo da articulação encadeado de modo covalente conforme descrito na patente internacional No. WO0194585. Com respeito à anexação de porções de PEG, é feita referência a "Poly (e- thyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York e "Bioconjugation Prote- in Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, New York.
Depois de preparação do anticorpo ou derivado de anticorpo de interesse conforme descrito acima, a formulação farmacêutica compreen- dendo este é preparada. O anticorpo a ser formulado não foi submetido à liofiização anterior e a formulação de interesse aqui, neste pedido de paten- te, é uma formulação aquosa. Preferencialmente o anticorpo ou derivado de anticorpo na formulação é um fragmento de anticorpo, tal como um scFv. À : quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo presente na formulação é determinada levando em conta os volumes das doses desejadas e o modo ou modos de administração, por exemplo. A partir de cerca de 0,1 mg/ml até cerca de 50 mg/ml, preferencialmente a partir de cerca de 0,5 mg/ml até cerca - de 40 mg/ml e o mais preferencialmente a partir de cerca de 10 mg/ml até cer- ca de 20 mg/ml é uma concentração de anticorpo exemplar na formulação.
Uma formulação aquosa é preparada compreendendo o anticor- po ou derivado de anticorpo em uma solução de pH-tamponado. O tampão desta invenção tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 8,0, preferen- cialmente de cerca de 5,5 a cerca de 7. Exemplos de tampões que controla- rão o pH dentro desta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. A concentração de tampão pode ser a partir de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, preferencialmente a partir de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotoni- cidade desejada da formulação.
Um poliol, o qual age como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, é incluído na formulação. Em modalidades preferenciais, a formu- lação não contém uma quantidade tonificante de um sal tal como cloreto de sódio, uma vez que isto pode fazer com que o anticorpo ou derivado de anti-
corpo precipite e/ou possa resultar em oxidação em baixo pH. Em modalida- des preferenciais, o poliol é um açúcar não redutor, tal como sacarose ou trealose. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade a qual pode variar com respeito à isotonicidade desejada da formulação. Preferencial- mente a formulação aquosa é isotônica, em cujo caso concentrações ade- quadas do poliol na formulação são na faixa de cerca de 1% a cerca de 15% em peso/ vol, preferencialmente na faixa de cerca de 2% a cerca de 10% em peso/ vol, por exemplo. No entanto, formulações hipertônicas ou hipotônicas também podem ser adequadas. A quantidade de poliol adicionada também pode alterar com respeito ao peso molecular do poliol. Por exemplo, pode ser adicionada uma quantidade menor de um monossacarídeo (por exemplo, manitol), em comparação com um dissacarídeo (tal como trealose). : Um tensoativo também é adicionado ao anticorpo ou derivado de anticorpo formulação. Tensoativos exemplares incluem tensoativos não iôni- costaiscomo polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80, etc) ou polo- xâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de tensoativo adicio- . nado é tal que reduz a agregação do anticorpo / derivado de anticorpo for- mulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Por exemplo, o tensoativo pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, preferencialmente de cerca de 0,005% a cerca de 0,2% e o mais preferencialmente de cerca de 0,01% a cerca de 0,1%.
Em uma modalidade, a formulação contém os agentes identifi- cados acima (isto é, anticorpo ou derivado de anticorpo, tampão, poliol e tensoativo) e é essencialmente livre de um ou mais conservantes, tais como álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutano! e cloreto de benzetônio. Em outra modalidade, um conservante pode ser incluído na formulação, particu- larmente onde a formulação é uma formulação multidose. A concentração de conservante pode estar na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 2%, o mais preferencialmente de cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis diversos tais co- mo os descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, O-
sol, A. Ed. (2006) podem ser incluídos na formulação contanto que eles não afetem de modo adverso as características desejadas da formulação. Veícu- los, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recepto- res nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: agentes de tam- ponamento adicionais, cossolventes, antioxidantes inclusive ácido ascórbico e metionina, agentes quelantes tais como EDTA, complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína), polímeros biodegradáveis tais como poli- ésteres, e/ou contraíons formadores de sais tais como sódio.
As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de mem- branas de filtração estéreis, antes, ou depois, da preparação da formulação.
A formulação é administrada a um mamífero que necessite de : tratamento com o anticorpo, preferencialmente um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias intra- muscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, . intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou por inalação. Em modalidades prefe- renciais, a formulação é administrada ao mamífero por aplicação tópica de gotas oculares à superfície ocular. Para semelhantes fins, a formulação pode seraplicada usando um aplicador de gotas oculares, por exemplo, A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") do anticorpo dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da gravida- de e do curso da condição, se o anticorpo é administrado para fins preventi- vos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico do paciente e da resposta ao anticorpo, do tipo de anticorpo usado, e do critério do médico assistente. O anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado convenien- temente ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos e po- de ser administrado ao paciente a qualquer momento a partir do diagnóstico em diante. O anticorpo ou derivado de anticorpo pode ser administrado co- moo único tratamento ou em combinação com outros fármacos ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.
Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamente efi-
caz do anticorpo ou derivado de anticorpo administrado será na faixa de cer- ca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente quer por uma ou mais administrações, com a faixa típica de anticorpo usado sendo cerca de 0,3 a cerca de 20 mg/kg, mais preferencialmente cerca de 0,3 a cerca de 15 mg/kg, administrados diariamente, por exemplo, No entanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis.
O progresso desta terapia é facilmente moni- torado por técnicas convencionais.
São considerados doses e regimes adequados para uso com Lucentis aprovados pela agência de regulamentação de drogas e alimentos dos Estados Unidos FDA.
Outras doses e regimes são descritos no Pedido de Patente Provisória U.S.
No. de Série 61/075.641, intitulado "!Improved Immunobinder : Formulations And Methods For Adminstration" , depositado em 25 de junho de 2008, o qual é expressamente incorporado aqui, a este pedido de patente. “15 Artigos de Fabricação Em outra modalidade da invenção, é proporcionado um artigo de - fabricação compreendendo um recipiente o qual encerra a formulação far- macêutica aquosa da presente invenção e opcionalmente proporciona ins- i truções para seu uso.
Recipientes adequados incluem, por exemplo, garra- fas,frascos, aplicadores de gotas oculares e seringas.
O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico.
Um re- cipiente exemplar é um frasco de vidro ou plástico de uso único de 3 a 20 cm?. Alternativamente, para uma formulação multidose, o recipiente pode ser frasco de vidro de 3 a 100 cm?. O recipiente encerra a formulação e o rótulo sobre, ou associado com, o recipiente pode indicar intruções para uso.
O artigo de fabricação pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, inclusive outros tampões, dilu- entes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.
Exemplificação A presente dscoberta é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais não devem ser considerados como adicionalmente limi- tantes.
O conteúdo de todas as figuras e de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados do início ao fim deste pedido são ex- pressamente incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de refe- rência em suas totalidades.
Do início ao fim dos exemplos, foram usados os seguintes mate- riaise métodos a menos que determinado de modo diverso.
Materiais e Métodos Gerais Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de modo diverso, técnicas convencionais de química, biologia mo- lecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia de anticorpo), e técnicas de rotina de preparação de polipeptídeos.
Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering : Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, “15 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L.
Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology , - eds.
Ausubel et a/., John Wiley & Sons (1992). Medições da termoestabilidade Foram obtidos espectros de IV de transformada de Fourier (FTIR-ATR) de reflectância total atenuada para várias moléculas de cadeias únicas e derivadas usando a célula FT-IR Bio-ATR em um Tensor Bruker.
As moléculas foram concentradas até 3 mg/ml e dialisadas de um dia para o outro a 4ºC contra PBS, pH 6,5 e o fluxo de tampão direto foi coletado como em branco.
Os perfis de desnaturação foram obtidos por termo estimulação dasmoléculas com uma ampla gama de temperaturas em etapas de 5ºC (25 a 95ºC). Todas as manipulações espectrais foram realizadas usando o soft- ware OPUS.
O principal tampão e o plano de fundo atmosférico transitório (CO, e HzO) foram subtraídos do espectro de proteína.
O espectro de prote- ina resultante foi em seguida corrigido pela linha basal e o espectro da ami- da proteicalfoideterminado a partir da largura do pico mais amplo resolvível na região esperada.
Segundos espectros derivados foram obtidos para os espectros da banda de amida | usando uma função polinomial de terceiro grau com uma função de suavização.
Alterações na estrutura da proteína foram estimadas por análise do segundo derivado de amida | usando uma curva de calibração linear para os cálculos de ajuste de curva iniciais presu- mindo 0% de desnaturação para as 3 medições inferiores e 100% de desna- turação para as 3 medições superiores.
Os perfis de desnaturação foram usa- dos para aproximar pontos centrais das transições de desdobramento térmico (TM) para cada variante aplicando o modelo sigmoidal de Boltzmann.
Medições da solubilidade A solubilidade relativa de várias moléculas de scFv foi medida depois de reforçar a agregação e precipitação de proteína em presença de sulfato de amônio.
Sulfato de amônio foi adicionado à proteína em soluções aquosas para produzir incrementos de 5% de saturação na mistura final sal- : proteína.
A precipitação na faixa dinâmica foi determinada empiricamente e os intervalos de saturação reduzidos nesta faixa até 2,5% de intervalos de saturação na mistura final.
Depois da adição de sulfato de amônio, as amos- tras foram delicadamente misturadas e centrifugadas 30 minutos a 6000 - rpm.
A proteína remanescente em sobrenadantes foi recuperada para cada percentagem de saturação de sulfato de amônio.
Curvas de solubilidade fo- ram determinadas por medição da concentração de proteína no sobrenadan- te por medições UV-VIS usando Espectrofotômetro NanoDropTM 1000. As medições de proteína solúvel remanescente em sobrenadantes foram nor- malizadas e usadas para estimar os pontos centrais de solubilidade relativa para cada variante aplicando o modelo sigmoidal de Boltamann.
Teste de Estabilidade de Curto Termo As moléculas de scFv foram examinadas depois de duas sema- nas de incubação a 40ºC para a presença de agregados solúveis e produtos de degradação.
Proteínas com uma concentração de 10 mg/ml foram diali- sadas de um dia para o outro a 4ºC contra PBS com uma a pHs (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,5). Moléculas controle com a mesma concentração em PBS tampão padrão (pH 6,5) foram armazenadas a -80ºC durante o período de 2 semanas.
Foi feita determinação de bandas de degradação por SDS- PAGE nos pontos de tempo t=0 e t=14d e agregados solúveis foram avalia-
dos na SEC-HPLC. Foi feita determinação da atividade remanescente de- pois de 2 semanas a 40ºC usando Biacore. EXEMPLO 1 ESTRATÉGIA DE IMUNIZAÇÃO PARA PRODUZIR ANTICORPOS ANTI- VEGE.
Neste exemplo, é descrita uma estratégia de imunização a qual usou um novo peptídeo derivado de VEGF antigênico, para gerar anticorpos capazes de reconhecer VEGFA humano, de camundongo e de coelho.
A partir de estudos de mutagênese por varredura com alanina realizados na Genentech são conhecidos os resíduos de VEGFA que são cruciais para interação de alta afinidade com VEGFr (Fuh, G. et al, (2006) J. Biol. Chem. 281, 6625-6631). Embora o sítio de ligação de receptor prova- : velmente represente um epitopo conformacional, a maioria dos resíduos cru- ciais se situam sobre uma alfa hélice, sobre os primeiros 10 aminoácidos de VEGFA maturo. VEGFA de coelho contém três alterações de aminoácidos nesta - alfa hélice, em comparação com a sequência humana; em contraste, VEGFA de camundongo é idêntico ao humano nesta região. Portanto, para a produ- ção de anticorpos com reação cruzada com camundongo-humano, o coelho apresenta uma espécie adequada para imunização. Além disso, a imuniza- ção do coelho pode levar a Abs com maior afinidade do que a imunização de camundongo.
Conforme resumido acima, a interação com resíduos sobre a al- fa hélice de N-terminal de VEGFA parece ser a mais crucial para ligação a VEGFRI1. Portanto, este trecho de 10 aminoácidos de extensão pode ser usado como um epitopo para imunização. Alternativamente, VEGFA de ex- tensão total pode ser injetado, no entanto, outros trechos de peptídeos sobre VEGFA são mais imunogênicos, deste modo reduzindo a probabilidade de dar origem a anticorpos neutralizantes. Esta hipótese é corroborada pelo fato de que dois peptídeos diferentes, ambos situados próximos ao C-término de VEGFA são potencialmente imunogênicos conforme previsto pelo método de Johnson e Wolf. Este método prevê potencial imunogênico somente inferior para a alfa hélice de N-terminal.
Portanto, imunização com o peptídeo consti- tuindo a alfa hélice somente, pode ser mais constante do que imunização com VEGFA de extensão total.
A probabilidade de provocar uma forte rea- ção imune pode ser adicionalmente aumentada por fusão ou ligação química do peptídeo a Hemocianina de lapa de buraco de fechadura ("Keyhole Lim- pet") (KLH). Foram realizadas quatro estratégias de imunização como se segue A.
Pré-Imunização de coelhos com VEGFA+ 65 humano de exten- são total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais.
Segundo reforço com peptídeo do trecho de aminoácidos 16-KFMDVYQRSYCHP-28 (sublinhado: interação de receptor; duplo sublinhado, divergente em coelho, Cys está envolvida em ligação dissulfeto de acordo com estrutura cristalina). : A Cys contida na sequência de peptídeos pode ser usada para ligação a KLH e portanto não seria exposta como Cys livre.
O peptídeo final seria co- mose segue: KFMDVYQRSY-Cys-KLH.
B.
Pré-Immunização de camundongos com VEGFA:s:ss de ex- - tensão total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais.
Se- gundo reforço com peptídeo do trecho de aminoácidos 16- KEMDVYQRSY- CHP -28 ( Cys está envolvida em ligação dissulfeto de acordo com estrutura cristalina). A Cys contida na sequência de peptídeos pode ser usada para ligação a KLH e portanto não seria exposta como Cys livre.
O peptídeo final seria como se segue: KFMDVYQRSY-Cys-KLH.
C.
Pré-imunização de coelhos/ camundongos com peptídeo do trecho de aminoácidos 16- KECMDVYQRSYCHP -28 (peptídeo final: KFMDVY- QRSY-Cys-KLH). Segundo reforço com VEGFAs65 de extensão total para reforçar a probabilidade de obter ligantes estruturais.
D.
Imunização com VEGFAsr«5 de extensão total em coelhos.
EXEMPLO 2 Enxerto de CDR e Humanização Funcional de anticorpos monoclonais anti- —VEGF de coelho.
Enxerto de CDRs de Coelho Diferentemente de métodos de humanização tradicionais os quais empregam a estrutura aceitadora de anticorpo humano que partilha a maior homologia de sequência com o anticorpo doador não-humano, as CDRs de coelho foram enxertadas quer na estrutura FW1.4 (SEQ ID No. 172) para gerar um Min-graft quer na estrutura "rabbitized" rFW1.4 (SEQ ID No 173) ou sua variante rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174) para gerar um Max- graft. Ambas as estruturas foram selecionadas essencialmente por proprie- dades funcionais desejáveis (solubilidade e estabilidade), conveniência es- trutural para conciliar uma grande variedade de CDRs de coelho e homolo- gia razoável com a sequência de consenso de domínio variável de coelho. A estrutura rFW1.4 é um derivado de FW1.4 que foi adicionalmente manipula- do com o objetivo de servir como estrutura aceitadora universal para virtual- mente qualquer grupo de CDRs de coelho. Embora a sequência de estrutura : estável e solúvel FW1.4 apresente alta homologia com anticorpos de coelho, não é a sequência mais homóloga disponível.
“15 Identificação de resíduos potencialmente envolvidos em ligação Para cada sequência de domínio variável de coelho, foi identifi- - cado o complemento da linhagem germinativa de coelho mais próxima. Se a linhagem germinativa mais próxima não pôde ser estabelecida, a sequência foi comparada contra o subgrupo de consenso ou o consenso de sequências de coelhocom uma alta percentagem de similaridade. Resíduos de estrutura rara foram considerados como possível resultado de hipermutação somática e portanto desempenhando um papel na ligação de antígeno. Consequen- temente, os resíduos referidos foram considerados para enxerto sobre a es- trutura aceitadora rFW1.4 ou rFW1.4(v2) para gerar Max-grafts. Particular- mente, foram enxertados resíduos potencialmente implicados em contato antigênico direto ou influenciando a disposição de VL e VH. Resíduos adi- cionais descritos por influenciar a estrutura de CDR foram substituídos caso requerido. Não foram feitas substituições de estrutura quando CDRs foram enxertadas sobre FW1.4 (Min-grafts). Por exemplo, para gerar 578minmax o resíduo VH 94 (H94) de rFW1.4 foi mutado para resíduo correspondente na sequência doadora. O anticorpo de coelho 578 contém Gly em H94 ao passo que ambos, a linhagem germinativa mais homóloga e o consenso de coelho contêm Arg na posição H94. Gly tem uma flexibilidade excepcional (ângulos fi positivos) que não é encontrada para outros aminoácidos.
Isto sugere um papel no ângulo de torsão da cadeia principal e uma possível forte influência da conformação do loop com implicações sobre a atividade.
Exemplos adi- cionaisde posições de estruturas que foram enxertadas para obter os Max- grafts conforme revelados aqui, neste pedido de patente, podem ser identifi- cados fazendo um alinhamento de sequências das regiões das estruturas de TFWI1.4, rFW1.4(V2) e as sequências scFv de interesse proporcionadas aqui, neste pedido de patente.
Ferramentas na internet (Webtfools) conforme é de conhecimento geral na técnica podem ser usadas, por exemplo, para a finalida- de referida (por exemplo, ClustalW conforme disponível em 23 de junho de 2009 em http:/Wwww.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html ou MultiAlin conforme : disponível em 23 de junho de 2009 em http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas as posições de estruturas nas quais rFW1.4 e rFW1.4(v2) contêm os “15 mesmos resíduos e nas quais o scFv de interesse revela um resíduo diferente, são posições de estruturas que foram enxertadas para obter os Max-grafts. - Permutação de domínio Cadeias leves variáveis de Min-grafts foram combinadas com Max-grafts de cadeia pesada variável para identificar combinações ótimas em termos de propriedades biofísicas (solubilidade e estabilidade) e atividade.
Clonagem e expressão de scFvs Os scFvs descritos e caracterizados aqui, neste pedido de pa- tente, foram produzidos como se segue.
As sequências de VL. humanizadas (SEQ ID NOs: 82 a 106) foram conectadas a sequências de VH humanizadas (SEQIDNOs: 118 a 166) através do encadeador de SEQ ID NO: 181 para pro- duzir um scFv da seguinte orientação: NH2-VL-encadeador-VH-COOH.
Em muitos casos sequências de DNA codificando para os vários scFvs foram sintetizadas de novo no provedor Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Os insertos de DNA resultantes foram clonados no vetor de expressão bac- teriana pGMPO002 através de sítios de restrição Ncol e Hindill introduzidos na extremidade 5' e 3' da sequência de DNA de scFv, respectivamente.
En- tre a sequência de DNA do domínio VL e do domínio VH, está localizado um sítio de restrição BamHl.
Em alguns casos o DNA codificando scFv não foi sintetizado de novo, mas os construtos expressando scFv foram clonados por permuta de domínio.
Por conseguinte, os domínios VL foram excisados e introduzidos nos novos construtos através dos sítios de restrição Ncol e Ba- mHIl, os domínios VH através dos sítios de restrição BamHI e Hindlll.
Em outros casos, mutações de ponto foram introduzidas no domínio VH e/ou VL usando métodos de montagem por PCR do estado da técnica.
A clonagem de GMPO0O0?2 é descrita no Exemplo 1 da publicação de patente internacional No.
WO 2008/006235. A produção dos scFvs foi feita análoga a para ES- —BA105 conforme descrito no Exemplo 1 da publicação de patente internacio- nal No.
WO 2008/006235. EXEMPLO 3 : ANÁLISE DA LIGAÇÃO de BIACORE DE SCFVS ANTI-VEGFE Neste exemplo, a capacidade de ligação de Biacore de scFvs foi testadae a afinidade de ligação foi medida usando o método de ressonância de plasmônio superficial típico com BIAcore"Y-T100. As proteínas de VEGF, - testadas para ligação por estes scFvs candidatos, neste exemplo e em e- xemplos posteriores incluem VEGF 165 humano recombinante expressado em Escherichia coli purificado (PeproTech EC Ltd.), VEGF 12; humano recombi- nante (PeproTech EC Ltd), VEGF11o humano recombinante (ESBATech AG), VEGF 164 murino recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF 164 de rato recombinante (Biovision), VEGF 119 de coelho recombinante (ESBATech AG), e PLGF humano recombinante (PeproTech EC Ltd.). Para o experimento de ressonância de plasmônio superficial, chips biossensores de dextrano car- — boximetilado (CM4, GE Healthcare) foram ativados com cloridrato de N-etil- N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida e N-hidroxissuccinimida de acordo com as instruções do fornecedor.
Cada uma das 6 diferentes formas de VEGF, conforme exemplificado acima, foi acoplada a 1 das 4 diferentes célu- las de fluxo sobre um chip sensor CM4 usando um procedimento de ligação de amina de rotina.
A gama de respostas obtidas com estas moléculas de VEGF imobilizadas depois de ligação e bloqueio foram -250 a 500 unidades de resposta (RU) para hVEGF165, -200 RU para hVEGF110, hVEGF121,
VEGF 164 murino, VEGF 164 de rato e VEGF 119 de coelho e -400 RU para PLGF.
A 4º célula de fluxo de cada chip foi tratada de modo similar exceto que não foram imobilizadas proteínas antes do bloqueio, e a célula de fluxo foi usada como referência in-line.
Várias concentrações de scFvs anti-VEGF (por exemplo, 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3,33 nM, 1,11 nM, 0,37 nM, 0,12nMe 0,04 nM) em tampão de HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4 ou 5, 0,15 M de NaCiIl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensoativo P20) foram injetadas dentro das células de fluxo em uma taxa de fluxo de 30 ul/min por 5 min.
Dissocia- ção do scFv anti-VEGF a partir do VEGF sobre o chip CM4 foi liberada para prosseguir por 10 min a 25 ºC.
Sensorgramas foram gerados para cada a- mostra de scFv anti-VEGF depois de correção da célula de referência in-line seguida por subtração da amostra de tampão.
A constante da taxa de disso- ciação aparente (kj3), a constante da taxa de associação aparente (k.)) e a constante de equilíbrio de dissociação aparente (Kp) foram calculadas usan- "* 15 doomodelode ligaçãode Langmuir um para um (one-to-one) com o Softwa-
re de avaliação BlAcore T100 versão 1.1. - Como um resultado típico, alguns scFvs anti-VEGF candidatos de exemplo são listados na Tabela 7 mostrando sua capacidade de ligação a hVEGF 165. Sua potência como inibidores de VEGF, a qual é medida usando ensaio ELISA de competição de VEGFR e/ou prova de HUVEC e descrita em exemplos posteriores, também é mostrada na Tabela 7. As curvas cinéti- cas de alguns candidatos de exemplo típicos, por exemplo, 511max e 578max, para sua ligação a hVEGF 165 são ilustradas na figura 1. Suas cons- tantes de afinidade (ka, ka e Ko) também foram determinadas.
Alguns candi- datos de exemplo também apresentam especificidade de espécie em sua ligação a várias proteínas de VEGF de diferentes fontes.
Por exemplo, al- guns dados de afinidade medidos em pH 5 usando VEGF 164 de camundongo e de rato como parceiro de ligação são mostrados nas Tabelas 8 a e b.
Um scFv candidato de exemplo típico, 578minmax, tem uma Kp de 5,76E-10M e 7,48E-10M em sua ligação a VEGF 64 de camundongo e de rato, respecti- vamente em um pH de 5 (Tabelas 8 a e b) e 2,73E-11 e 2,19E-11 em um pH de 7,4 (dados não mostrados). Esta especificidade de espécie é adicionalmente ilustrada na figura 4 nas curvas cinéticas e dados de afinidade para a ligação entre 578minmax e proteínas VEGF humanas, de camundongo ou de rato. Além da especificidade de espécie em sua ligação a VEGFs de diferentes organismos, muitos scFv candidatos de exemplo também apre- sentam especificidades de ligação diferenciadas para várias isoformas de VEGF. Por exemplo, os dados de afinidade medidos em pH 5,0 para alguns scFvs candidatos ligando a VEGF165, VEGF12, e VEGF11o humanos são comparados na Tabela 9. Nos mesmos experimentos, a proteína PIGF tam- bém foi usada como um controle negativo sem capacidade de ligação a es- tes scFvs candidatos. Além disso, as curvas cinéticas diferenciadas e dados de afinidade para a ligação entre 578Max e isoformas de VEGF, como um exemplo, são ilustrados na figura 3. : A presente invenção também revela derivados originários dos candidatos de exemplo de scFv anti-VEGF, os quais são mencionados aci- ma. Alguns derivados de exemplo do candidato 578 e 511, conforme listado na Tabela 10, são exemplificados por sua afinidade e potência (medida em - PH 5,0). Neste experimento, foi usada medição por Biacore para a afinidade destes derivados em relação a hVEGF 165, ao passo que foram usados en- saio ELISA de competição de hVEGFR2 e/ou prova de HUVEC para definir sua potência para inibir VEGFs (Tabela 10). Três derivados, 578max, 578minmax e 578 wt-His, são adicionalmente exemplificados em suas cur- vas cinéticas e dados de afinidade para ligação a hVEGF 165 na figura 4. Para derivados de candidatos de exemplo, suas caracterizações biofísicas foram determinadas e exemplificadas nas figuras 5 a 7 e na tabela
11. Estas características incluem, conforme exemplificado na tabela 11, Tm determinada por FTIR, a percentagem de B-lâmina ou perda de proteína de- pois de incubação a 60ºC por 30 min, solubilidade determinada por precipi- tação de sulfato de amônio, produção de redobramento durante o processo de produção e níveis de expressão em E. coli. Três derivados, 578max, 578minmax e 578minmax DHP, foram caracterizados por sua estabilidade térmica em suas curvas de desdobramento contra diferentes temperaturas medidas por FT-IR (figura 5).
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' 88/106 Alguns derivados, conforme listado na figura 6, foram compara- dos por sua desnaturação e precipitação depois de stress térmico (por e- xemplo, sob 50ºC, 60ºC, ou 70ºC) por 30 minutos. 578max, 578minmax e 578minmax DHP foram adicionalmente exemplificados por sua solubilidade, aqualfoideterminada por precipitação de sulfato de amônio. Como na figura 7, a percentagem de proteínas solúveis destes derivados sob várias concen- trações de sulfato de amônio foram comparadas.
Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 50ºC 8 fa Be [ao a a | “o er a je 525 Toa lr 8 “Ts la | “lero ee rs Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 60ºC 66 “TB e rf lee “fas e Beco me da | 8 “es —jw |
Tabela 12a : ligantes anti-VEGF depois de incubação por 30 min a 70ºC eso TB 82 “oa leg 83 “Rg go ez ho a EXEMPLO 4 ' PROVAS DE BLOQUEIO DE RECEPTOR DE VEGFE Para scFv anti-VEGF candidatos ou seus derivados revelados na presente invenção, sua potência como inibidores de VEGF também foi : medida além de sua afinidade de ligação a VEGFs no Exemplo 3. Os méto- dos para medir sua potência incluem, por exemplo, o ELISA de competição de VEGFR, conforme exemplificado neste exemplo, e provas de HUVEC (figura 8).
Os ensaios ELISA de competição de VEGFR incluem, por e- xemplo, ensaios de bloqueio de Receptor VEGFR2 e ensaios de bloqueio de Receptor VEGFR1. Para o ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR2, VEGF 65 humano foi revestido sobre uma lâmina Maxisorp ELISA de 96 po- ços (Nunc) a 0,05 ug/ml em PBS e bloqueado usando PBS com 0,1% de BSA e 0,2% de Tween 20 (PBST). 500 ng/ml de quimera recombinante VEGFR2 humano/Fc (R&D Systems Inc.), consistindo nos resíduos aminoá- cidos 1-764 do domínio extracelular de VEGFR2 humano fundido a um Fc, com etiqueta de 6x histidina, de IgG, humana, foram primeiro incubados com scFvs anti-VEGF diluídos serialmente 3 vezes em PBST. Depois de 30 a 60 minde incubação em temperatura ambiente, as misturas foram transferidas para a lâmina imobilizada de VEGF 65 humano e incubadas por 90 min. À ligação da quimera VEGFR2/Fc ao VEGF 165 imobilizado foi detectada com
Fcy de IgG anti-humana de cabra (Fab>) acoplado à peroxidase de raiz forte (Jackson ImmunoResearch) seguido por substrato (substrato BM Blue POD, Roche Diagnostics). A densidade ótica a 450 nm (OD de 450 nm) foi medida usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Tecan). Os dados foram anali- sados usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros, e os valores da EC5,9 foram calculados a partir das curvas de dose-resposta dos scFvs. À potência exemplar de candidatos de exemplo ou seus derivados, medida por ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR?2, é listada nas Tabelas 7 e 9. Para o ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR1, VEGF 165 hu- mano foirevestido sobre uma lâmina Maxisorp ELISA de 96 poços (Nunc) a 0,0125 ug/m! em PBS e bloqueado usando PBS com 0,4% de BSA e 0,1% de Tween 20. 100 ng/ml de quimera recombinante VEGFR1 humano/Fc : (R&D Systems Inc.), consistindo nos resíduos aminoácidos 1-687 do domí- nio extracelular de VEGFR1 humano fundido a um Fc, com etiqueta de 6x histidina, de IgG, humana, foram primeiro incubados com scFvs anti-VEGF diluídos serialmente 3 vezes em PBST. Depois de 30 a 60 min de incubação ' em temperatura ambiente, as misturas foram transferidas para a lâmina imo- bilizada de VEGF 165 humano e incubadas por 90 min. A ligação da quimera VEGFR1/Fc ao VEGF'65 imobilizado foi detectada com Fcy de IgG anti- humana de cabra (Fab>) acoplado à peroxidase de raiz forte (Jackson Im- munoResearch) seguido por substrato (substrato BM Blue POD, Roche Di- agnostics). A densidade ótica a 450 nm (OD de 450 nm) foi medida usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Tecan). Os dados foram analisados conforme acima, e os valores da ECso foram calculados a partir das curvas de dose-resposta dos scFvs. A potência exemplar de candidatos de exem- plo, medida por ensaio de bloqueio de Receptor VEGFR1, é listada na Tabe- la7. EXEMPLO 5
PROVA HUVEC DE INIBIÇÃO DE VEGF Este exemplo exemplifica provas HUVEC como outro método para medir a potência dos scFv anti-VEGF candidatos revelados, ou seus derivados, como inibidores de VEGF.
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) (Pro- mocel!), reunidas a partir de vários doadores, foram usadas na passagem 2 até a passagem 14. As células foram semeadas a 1000 células/ poço em 50 ul de meio de crescimento de células endoteliais completo (ECGM) (Promo- cell, que continha 0,4% de ECGS/H, 2% de Soro de Feto de Vitelo, 0,1 ng/ml de Fator de Crescimento Epidermal, 1 po/ml de Hidrocortisona, 1 ng/ml de Fator de Fibroblasto básico e 1% de penicilina / estreptomicina (Gibco). 7 a 8 h depois, 50 ul de meio de inanição (ECGM sem suplementos contendo 0,5% de FCS inativado por calor e 1% de penicilina / estreptomici- na) foram adicionados às células e as células foram submetidas à inanição (starved) por 15 a 16 horas.
Diluições seriais de 3 vezes de scFvs anti-VEGF (0,023 a 150 nM) e um dos seguintes — VEGF 165 humano recombinante (0,08 ! nM), VEGF 164 de camundongo recombinante (0,08 nM), ou VEGF 164 de rato recombinante (0,3 nM) — foram preparados em meio de inanição e pré- incubados por 30 a 60 min em temperatura ambiente.
As diferentes concen- trações de VEGFs foram usadas para compensar por suas diferentes ativi- . dades biológicas relativas.
Foram usadas concentrações que estimulam pro- liferação induzida por VEGF submáxima (ECg9). 100 ul das misturas foram adicionados às lâminas de cultura de tecido de 96 poços contendo a sus- pensãode HUVEC e incubados por 4 dias em uma incubadora umificada a 37 *C/5% de CO». A proliferação de HUVECs foi avaliada medindo a absor- vência a 450 nm (620 nm usado como comprimento de onda de referência) depois da adição de 20 ul/ poço de reagente de proliferação celular WST-1 (Roche) usando uma leitora de microlâminas Sunrise (Tecan). Os dados fo- ram analisados usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros, e a concentração de scFvs anti-VEGF requerida para inibir a proliferação de
HUVEC por 50% (ECrso) foi derivada das curvas de inibição.
A potência típica de candidatos de exemplo ou seus derivados, medida por provas de HUVEC, é listada na Tabela 7. Além disso, a inibição de proliferação de HUVEC induzida por hvEGF 165 por um derivado de candi- datos de exemplo, 578minmax, é exemplificada na figura 9. A EC50 de 578minmax para inibição de proliferação celular induzida por hVEGF165 é determinada como sendo de 0,06 nM (figura 9). A potência de 578minmax como um inibidor de VEGF é cerca de 1,6 vez melhor comparada com Lu- centis.
A inibição da proliferação de HUVEC induzida por VEGF 164 de ca- mundongo ou de rato por 578minmax também é exemplificada na figura 10. A EC50 de 578minmax para inibição de proliferação celular induzida por VEGF 164 de camundongo e de rato é de 0,06 nM e de 0,07 nM, respectiva- mente (figura 10). Portanto, VEGF de camundongo e de rato são equipoten- tes a VEGF humano por serem inibidos pelo derivado típico (578minmax). Além disso, neste experimento, Lucentis não inibe proliferação induzida por VEGF de roedor.
EXEMPLO 6 . EFEITOS DE SCFVS ANTI-VEGF SOBRE PERMEABILIDADE VASCULAR : INDUZIDA POR HVEGF65 EM PORCOS DA ÍNDIA PELADOS Neste exemplo, o efeito de scFvs anti- VEGF sobre VEGF 65 hu- mano induziu permeabilidade vascular foi avaliado em porcos da índia usan- do a prova de Miles.
Trinta sítios de aplicação por animal foram marcados ] sobre o dorso de porcos da índia machos pelados usando um marcador permanente.
No dia de tratamento cada animal foi administrado por via intra- venosa com 1 ml de uma solução a 1% de corante azul de Evans sob anes- tesia geral.
Uma hora depois de injeção de corante, 0,1 ml de solução de teste contendo 2,61 nM de VEGF 65 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.) e várias concentrações de scFvs anti-VEGF (O nM, 0,085 nM, 0,256 NM, 0,767 nM, 2,3 nM, 6,9 nM, 20,7 nM, 62,1 NM; n = 7 animais por item de teste) foram injetados em triplicata dentro das marcas sobre o dorso (3 inje- ções por concentração de item de teste). Injeções de PBS serviram como um controle negativo em todos os animais.
Como um controle adicional, 6,9 nM de Lucentis (Novartis) foram injetados em todos os animais.
Uma hora depois da injeção das soluções de teste, os animais foram eutanizados, e as peles foram coletadas, limpas, e fotografadas digi- talmente usando luz incidente e transmitdia.
A área de corante azul de E- vans que extravasou para dentro dos sítios de injeção foi avaliada usando ImageJ.
Para cada animal, a concentração de scFv anti-VEGF versus área
| 93/106 de escoamento de corante foi analisada usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros.
A concentração de scFvs anti-VEGF requerida para inibir derrame vascular por 50% (ECr9) foi derivada a partir das curvas de inibição.
O protocolo do experimento é exemplificado na figura 11. Além disso, a eficácia de scFv candidatos, ESBA9O3 (578minmax) e 802 (511max), na inibição do hvVEGF foi ilustrada na figura 11, representada por diferentes tamanhos de áreas contendo o corante azul de Evans escoado do sistema vascular para dentro da pele.
Os dados de eficácia para 903 e 802 são mostrados na figura 12. Em 6,9 nM, 903 e 802 apresentaram inibição mais forte de derrame vascular induzido por VEGF dentro da pele em com- paração com Lucentis em todos os animais testados (figura 12). EXEMPLO 7 : EFEITOS DE TRATAMENTO TÓPICO COM SCFVS ANTI-VEGF SOBRE DERRAME VASCULAR RETINAL INDUZIDO POR HVEGF 165 EM RATOS Neste exemplo, a eficácia tópica de 578minmax é demonstrada usando uma prova de Miles modificada.
Estas modificações incluem, por 7 exemplo, estudo pré-misturado com injeções intravítreas e aplicação tópica de scFvs.
Diferentes concentrações pré-misturadas de scFv anti-VEGF (10,3,e excesso molar de 1 vez sobre VEGF) e VEGF (500 ng) foram apli- cadas através de uma única injeção intravitreal.
Avastin (Roche) (excesso molar de 10 vezes, 3 vezes, e 1 vez sobre VEGF) foi usado como um contro- le positivo.
Veículo para 578minmax (Tampão de Citrato, 20 mM de Citrato de Na, 125 mM de NaCl, pH 7) foi usado como controle negativo.
Conforme ilustrado na figura 13, pré-misturando com hVEGF'165 facilitou 578minmax (ESBAS903) a inibir completamente a permeabilidade vascular retinal induzi- da por hVEGF.
Neste experimento, o efeito inibitório de 578minmax (ES- BA903) foi mais significativo em comparação com Avastin.
Para aplicação tópica, cinco dias antes da estimulação de VEGF, ratos Sprague-Dawley adultos receberam 578minmax (1% = 10 mg/ml) através de dosagem tópica bilateral qid (4 gotas/ dia) até o dia da perfusão (Dia 6). Veículo para 578minmax (dosagem tópica) e Alcon RTKi
(10 mg/Kkg/d, gavage oral) foram usados como controles negativo e positivo. No Dia 5, os ratos são anestesiados e suas pupilas são dilatadas. Todos os animais recebem injeções intravitreais de 500 ng de hrvVEGF (10 ul) em am- bos os olhos. Depois de 24 horas pós-injeção de VEGF, infusão intravenosa de 3% de corante azul de Evans é realizada em todos os animais durante anestesia geral. Depois do corante ter circulado por 90 minutos, os ratos são eutanizados. Ambas as amostras são colhidas, em seguida os ratos são per- fundidos com solução salina estéril, então ambos os olhos de cada rato são imediatamente enucleados e as retinas colhidas usando um microscópio ci- rúrgico. Tanto para amostras de retina quanto de plasma, 60 ul de sobrena- dante são usados para medir a absorvência do corante azul de Evans (ABS) com um espectrofotômetro a 620/740 nm. A ruptura da barreira sanguínea- : retinal e subsequente permeabilidade vascular retinal conforme medida pela absorvência de corante são calculadas como médias + s.e.m. de net ABS/wet weight/plasma ABS (ABS líquida/peso a úmido/ABS plasmática). ANOVA One way é usado para determinar uma diferença global entre meios f de tratamento, em que P < 0,05 é considerado significativo. Conforme e- xemplificado na figura 14, a administração tópica (5 dias de pré-tratamento, | 4 gotas por dia) de 578minmax (903) inibiu significativamente a permeabili- dade vascular retinal induzida por hVEGF. Esta é a primeira demonstração de um anticorpo topicamente eficaz útil para o tratamento de doença intrao- cular.
EQUIVALENTES Numerosas modificações e modalidades alternativas da presen- te invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica em vista da descrição precedente. Por conseguinte, esta descrição deve ser considerada como ilustrativa somente e é para ensinar aos versados na técnica o melhor modo para realizar a presente invenção. Detalhes da estrutura podem variar substancialmente sem se afastar do espírito da invenção, e é reservado o uso exclusivo de todas as modificações que estão dentro do âmbito das rei- vindicações anexadas. Pretende-se que a presente invenção seja limitada somente na extensão requerida pelas reivindicações anexadas e pelas re-
gras da legislação aplicável.
Toda a literatura e material similar citado neste pedido, inclusive, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, tratados, dissertações, páginas na internet, figuras e/ou anexos, independente do formato de semelhante literatura e de materiais similares, são expressamente incorporados por meio de referência em sua totalidade. No evento de que um ou mais da literatura e materiais similares incorporados difiram de ou contradigam este relatório descritivo, inclusive termos definidos, uso de termos, técnicas descritas, ou semelhantes, este relatório descritivo controla.
Os títulos de seções usados aqui, neste pedido de patente, são para fins organizacionais somente e não devem ser considerados como limi- tantes para o tema descrito de modo algum.
Apesar das presentes invenções terem sido descritas em combi- nação com várias modalidades e exemplos, não se pretende que os presen- tes ensinamentos sejam limitados a semelhantes modalidades ou exemplos. Pelo contrário, as presentes invenções englobam várias alternativas, modifi- - cações, e equivalentes, conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica. | As reivindicações não devem ser lidas como limitadas à ordem ou aos elementos descritos a menos que declarado para este efeito. Deve ser entendido que podem ser feitas várias alterações na forma de detalhes sem se afastar do âmbito das reivindicações anexadas. Portanto, são reivin- dicadas todas as modalidades que estão dentro do âmbito e do espírito das reivindicações que se seguem e equivalentes das mesmas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 Imunogênio Peptídico
KFMDVYQORSYC sequências VL: SEQ ID NO. 72: 60
EVVMAQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSISSYLSWYQQKPGAPPKLLIVKASTLASGVPSRFKGSRS
GTEYTLTISDLECADAATYYCOSNYGGSSSDYGNPFGGGTEAVVK SEQ ID NO. 73: 435
AFELTOTPSSVEAAVGGTVTIKCOQASQSIGSSLAWYQQKPGORPKLLIVTAANLASGVPSRFRGSRSG
AAFTLTISDLECADAATYYCONFATSDTVTFGGGTEVVVT SEQD NO: 74: 453
AVVLTQTPSPVYSAAVGGTVSISCOSSQSVWNNNRLAWFQOKSGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKG
SGSGTEFTLTISDVQCDDAATYYCAGGYSSTSDNTFGGGTEVVVK - SEQ ID NO. 75: 375
DIVMTQTPASVEATVGGTITINCOASENINIWLSWYQQKPGQPPKLLIVOASKLASGVPSRFKGSGS
GTQFTLTISDLECADAATYYCONNYSYNRYGAPFGGGTEVVVK SEQ ID NO. 76: 610
DVVMTAQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSISSWLSWYQQKPGAPPKLLIVOASTLASGVPPRSSGSG 1 SGTEYTLTISDLECADAATYFCONNYGFRSYGGAFGGGTEVVVK . SEQ ID NO.77: 578
DVVMTAQTPSSVSAAVGDTVTINCOASEIIHSWLAWYQQKPGAQPPKLLIVLASTLASGVPSRFKGSGS
GTOQFTLTISDLECADAAIYYCQNVYLASTNGANFGGGTEVVVK SEQID NO. 78: 534
DVVMTOTPSSVSAAVGDTVTIKCOASQSINIWLSWYQQKSGAQPPKLLVYKESTLASGVPSRFRGSG
SGTQFTLTISDLECADAATYYCONNYDSGNNGFPFGGGTEVVVK SEQ !D NO. 79: 567
DVVMTAQTPSSVSAAVGDTVTINCOADOSIYIWLSWYQQKPGAQPPKLLIVKASTLESGVPSRFKGSGS
GTQFTLTISDLECADAATYYCONNAHYSTNGGTFGGGTEVVVK SEQ ID NO. 80: 509
DVVMTATPSSVSAAVGDTVTIKCQASQNIRIWLSWYQQKPGAPPKLLIVKASTLESGVPSRFKGSGS
GTEFTLTISDLECADAATYYCONNAHYSTNGGTFGGGTEVVVK i 97/106 SEQID NO. 81: 511
EVVMTOTPASVEAAVGGTVTIKCOASQSINIWCSWYQQKPGHPPKLUVRASTLASGVSSRFKGSGS
GTEFTLUTISDLECADAA TYYCOANYAYSAGYGAAFGGGTEVUVK SEQ ID NO. 82: 60min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASOSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIVKASTLASGVPSRESGSGSGA
EFTUTISSLOPDDFATYVCOSNYGGSSSDYGNPFGOGTKLTVLG SEQ ID NO. 83: 435min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASQSIGSSLAWYQQKPGKAPKLLIVTAANLASGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCONFATSDTVTFGOGTKLTVLG SEQ ID NO, 84: 453min
EIVMTQOSPSTLSASVGDRVIITCOSSOSVWNNNRLAWYQQOKPGKAPKLLIVYASTLASGVPSRFSGS
GSGAEFTLTISSLOPDDFATYYCAGGYSSTSDNTFGQGTKLTVLG SEQID NO, 85: 375min”
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASENINIWLSWYQQKPGKAPKLLIVOASKLASGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCONNYSYNRYGAPFGOGTKLTVLG SEQ ID NO. 86: 610min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVITCOASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIVOASTLASGVPSRESGSGSG
AEFTUTISSLOPDDFATYYCONNYGFRSYGGAFGOGTKLTVLG SEQ ID NO. 87: 578min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASENIHSWLAWYQOKPGKAPKLUIYLASTLASGVPSRFESGSGSGA
Í EFTLVISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGQGTKLTVLG : SEQ ID NO. 88: 534min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVINTCOASOSINIWLSWYQQKPGKAPKLLUIVKESTLASGVPSRESGSGSGA
EFTLTISSLOPDDFATYYCONNYDSGNNGFPFGOQGTKLTVLG SEQ ID NO. 89: 567min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOADOSIYIWLSWYQQKPGKAPKLUIYKASTLESGVPSRESGSGSGA
EFTLTISSLOAPODFATYYCONNAHYSTNGGTFGAOGTKLTVLG SEQ1D NO. 90: 509min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASQNIRIWLSWYQQKPGKAPKLUIYKASTLESGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCONNAHYSTNGGTFGOGTKLTYLG SEQ ID NO. 91: 5i1min
EFVMTOSPSTESASVGDRVIITCOASQSINIWCSWYQOKPGKAPKLUVYRASTLASGVPSRFSGSGSG AEFTLTISSLOPDDFATYYCQANYAYSAGYGAAFGOGTKLTVLG
SEQ ID NO. 92: 578min Pref subst
EIVLTOSPSSLSASVGDRVTITCOASENHSWLAWYQORPGKAPKLUSLASTLASGVPSRFSGSGSGT
DFTFTISSLAPEDFAVIYCONVYLAS TNGANFGOGTKVEIKR SEQ ID NO. 93: 60max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASQSISSYLSWYOQKPGKAPKLLIVKASTLASGVPSRESGSGSGT
EFTLTISSLOPDDFATYYCOSNYGGSSSDYGNPFGOSTKLTVLG SEQ ID NO. 94: 435max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIIKCOASQSIGSSLAWYQOKPGKAPKLLIVTAANLASGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCONFATSDTVTFGOGTKLTVLG SEQ ID NO. 95: 453max F
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOSSOSVWNNNRLAWYQOKPGKAPKLUYYASTLASGVPSRFSGS
GSGTEFTLTISSLOAPDDFATIYCAGGYSSTSDNTFGOGTKLTVLG SEQ ID NO, 96: 375max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASENINIWLSWYQQKPGKAPKLLIVOASKLASGVPSRFSGSGSG
TQFTLTISSLAPDDFATYYCONNYSYNRYGAPFGQOGTKLTVLG SEQ IO NO. 97: 610max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASOSISSWLSWYQQKPGKAPKLLUYOASTLASGVPSRESGSGSG
TEFTLTISSLOPDDFATYYCONNYGFRSYGGAFGOGTKITVLG SEQ ID NO. 98: 578max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVINTCOASENHSWLAWYAQOKPGKAPKLLUIYLASTLASGVPSRFESGSGSGT í QFTUTISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGOGTKLTVLG , SEQ ID NO. 99: 534max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASOSINIWLSWYQQKPG KAPKLLIVKESTLASGVPSRFSGSGSGT
EFTLTISSLOPDDFATYYCONNYDSGNNGFPFGOGTKLTVLG SEQ 1D NÓ, 100: 567max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVINTCOADOSIYIWLSWYAGOKPGKAPKLLIYVKASTLESGVPSRFSGSGSGT
QFTLTISSLOPDDFATYYCONNAHYSTNGGTFGOGTKLTVLG SEQ ID NO. 101: 509max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASQNIRIWLSWYOQKPGKAPKLLVKASTLESGVPSRESGSGSGT
EFTLTISSLOPDDFATYYCONNAHYSTNGGTFGOGTKLTVLG SEQ ID NO, 102: 511max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCAASQSINIWLSWYAOKPEKAPKLUYRASTLASGVPSRESGSGSGT EFTLTISSLOPDDFATYYCOANYAYSAGYGAAFGOGTKLTVLIG
SEQ ID NO. 103: 578max Pref subst
EIVMTOSPSSLSASVGDRVTITCOASENHSWLAWYQQRPGKAPKLLISLASTLASGVPSRESGSGSGT
OFTFTISSLOPEDFAVYYCONVYLASTNGANFGOGTKVEIKR SEQ ID NO, 104: 578Mmin VL: ELD
DIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASENHSWLAWY QQKPGKAPKLLIVLASTLASGVPSRFSGSGSGA
EFTLTISSLOPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGOQGTKLTVLG SEQ ID NO, 105: 578min VL: 12V
EVVMTOSPSTLSASVGDRVIITCAASENHSWLAWYQQKPGKAPKLUYLAS TLASGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGQGTKLTVLG SEQ ID NO. 106: 511min VL: C41L
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASOSINAWLSWYQOQKPGKAPKLLIVRAS TLASGVPSRFSGSGSG
AEFTLTISSLOPDDFATYYCOANYAYSAGYGAAFGQGTKLTVLG Sequências VH: SEQID NO. 107: 60-11-4
OSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFPFSSGYWVCWVROAPGKGLEWIACIVAGSSGSTYYASWAK
GRFTISKTSSTTVTLOMTSLTAADTATYFCARGNNYYIVTDGGYAYAGLELWGPGILVTVSS SEQ ID NO, 108: 60-11-6
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSGYWICWVROAPGKGLEWIACIYAGSSGSTYYASWAKG
RFTISKTSSTIVTLOMTSLTAADTATYFCARGNNYYITDGGYAYAGLELWGPGILVTVSS SEQID NO, 109: 435 : OSLEESGGDLVOPGASLTLTCKVSGFSLNTNYWMCWVROQAPGKGLEWIGCMYTGSYNRAYYASW
AKGRFTSSKTSSTTVILEMTSLTAADTATYFCAKGSNWYSDLWGPGTLVTVSS SEQ ID NO. 110: 453
QERLVESGGGLVOQPEGSLTLTCKASGFSFSRSYYIYWVROAPGKGLEWIACIDAGSSGILVYYANWAK
GRFTISKTSSTIVTLOMTSLTAADTATYFCARGDASYGVDSFMLPLWGPGTLVTVSS SEQ ID NO. 111: 375
OSLEESGGGLVOPEGSLTLTCKASGFSFTTTDYMCWVROAPGKGLEWIGCILAGDGSTYYANWAK
GRFTGSKTSSTTVDLKMTGLTAADTATYFCARSDOPASSWSFALWGPGTLVITVSS SEQ ID NO. 112: 619
OSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGIDESGAYYMGWVROAPGKGLEWIGYIDYDGDRYYASWAKG RFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSDYSSGWGTDIWGPGTLVTVS, SEQ ID NO. 113: 578
' 100/106
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFESLTDYYYMTWVRLAPGKGLEYIGFIDPDDDPYYATWAKGRF
TISRTSTTVNLKMTSPTTEDTATYFCAGGDHNSGWGLDIWGPGTLVTVSL SEQ ID NO. 114: 534
OSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSYYYMSWVRQAPGKGLEWIGIKGPGDYTDYASWAKGRFT
ISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCGRGDDNSGWGEDIWGPGTLVTVSL SEQ ID NO, 115: 567
QOSVEESGGRLVTPGAPLTLTCSVSGFSLSDYYMCWVROAPGKGLOWIGCLDYFEGSTODASWAKGR
FTISKTSTAVDLKITSPTTEDTATYFCARTDDSRGWGLNIWGPGTLVTVSL SEQ ID NO. 116: 509
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSYYMCWVRDAPGKGLEWIGCLDYVGDTDYASWAKGRF TISKASTTVDLKITSLTTEDTATYFCARTDDSRGWGLNIWGPGTLVYTVStL SEQ ID NO, 117: 541 Na
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFESLNTYYMNWVROAPGKGLEWIGILAPDDTTYYASWAKSRST ITRDTNENTVTLKMTSLTTEDTATYFCARSGDTTAWGADIWGPGTLVTVSL ' SEQ ID NO, 118: 60-11-4min
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFPFSSGYWVCWVRQOAPGKGLEWVSCIYAGSSGSTYYASW
AKGRFTISRONSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGNNYYIVTDGGYAYAGLELWGOGTLVIVSS SEQ ID NO. 119: 60-11-6min
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLISCAASGFSFSSGYWICWVROAPGKGLEWVSCIVAGSSGSTYYASW
AKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGNNYYIYTDGGYAYAGLELWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 120: 435min
E EVOLVESGGGIVOPGGSLRLSCAASGFSLNTNYWMCWVROAPGKGLEWVSCMYTGSYNRAYYA
SWAKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGSNWYSDLWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 121: 4S3min
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSFSRSYYIYWVROAPGKGLEWVSCIDAGSSGILVYYANWA
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDASYGVDSFMLPLWGOGTLVTVSS SEQID NO, 122: 375min
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLISCAASGFSFTTTDYMCWVROAPGKGLEWVSCILAGDGSTYYANW
AKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKSDPASSWSFALWGOGTLVTVSS SEQ1D NO, 123: 610min
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGIDFSGAYY MGWVROAPGKGLEWVSYIDYDGDRYYASWA KGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKSDYSSGWGTDIWGOGTLVIVSS . SEQID NO, 124: 578min
' 101/106
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLISCAASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVSFIDPDDDPYYATWAK GRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGDHNSGWGLDIWGQGTLVIVSS . SEQ ID NO. 125: 534min EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSYYYMSWVROAPGKGLEWVS!IGPGDYTDYASWAKG RFTISRONSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGDDNSGWGEDIWGQGTLVTVSS - SEQ ID NO. 126: 567min
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSDYYMCWVROAPGKGLEWVSCLDYFGSTDDASWAK
GRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKTDDSRGWGLNIWGOGTLVIVSS SEQ ID NO. 127: 509Mmin
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMCWVROAPGKGLEWVSCLDOYVGDTDYASWAK
GRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKTDDSRGWGLNIWGOGTLVTVSS SEQD NO. 128: 511min NS
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLNTYYMNWVROAPGKGLEWVSIIAPODTTYYASWAKS
RFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKSGDTTAWGADIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO, 129: 578min Pref subst substAVOLVOTEGGLVAPGGSLRLSCAASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVSFIDPDDDPYY
ATWAKGRFTISRDNSKNTVYLOMNSLRAEDTALYYCAKGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 130: 60-11-4max
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFPFSSGYWVCWVYROAPGKGLEWVGCIVAGSSGSTYVASW
AKGRFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARGNNYYIVTDGGYAVAGLELWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 131: 60-11-6max : EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSFSSGVWICWVYROAPGKGLEWVGCIYAGSSESTYYASW
AKGRFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARGNNYYIYTDGGYAYAGLELWGOGTLVTVSS SEQ1D NO. 132: 435max
EVOLVESGSGGLVOPGGSLRLSCKVSGFSUNTNYWMCWVROAPGKGLEWVGCMYTGSYNRAYYA
SWAKGRFTSSKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGSNWYSDLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 133: 453max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCKASGFSFSRSYYIVWVROAPGKGLEWVGCIDAGSSGILVYANWA
KGRFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARGDASYGVDSFMLPLWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 134: 37S5max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCKASGFSFTTTDYMCWVROQAPGKGLEWVGCILAGDGSTYYANW
AKGRFTGSKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARSDPASSWSFALWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 135: 610max
' 102/106
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDFESGAYYMGWVRQAPGKGLEWVGYIDYDGDRYYASWA
KGRFTISKDTSKNTVWYLOMNSLRAEDTAVYYCARSDYSSGWGTDIWGOGTLVIVSS SEQ ID NO. 136: 578max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 137: S34max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLISCTASGFSLSYYYMSWVROAPGKGLEWVGINKGPGDYTDYASWAKG
RFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARGDDNSGWGEDIWGQGTLVITVSS SEQ ID NO, 138: 567max
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSVSGFSLSDYYMCIWVROAPGKGLEWVGCLDYFGSTODASWAK
GRFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARTDDSRGWGLNIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 139: 509max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLSSYYMCWVROAPGKGLEWVGCLOYVGDOTDYASWAK
GRFTISKDASKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARTDDSRGWGLNIWGOGTLVITVSS SEQID NO, 140: 509maxil
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWVGILDYVGDTDYASWAKG
RFTISKDASKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCARTDDSRGWGLNIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 141: 511max
EVOLVESGGGLVOPGGSLRESCTVSGFSUNTYYMINWVROAPGKGLEWVGIIAPDDTTYYASWAKS - RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGDTTAWGADIWGOGTLVIVSS SEQ ID NO, 142: 578max Pref subst ' substOVAOLVOTGGGLVOPGGSLRLSCTASGFESLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYY
ATWAKGRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAL YYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 143: 567minDHP
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCAASGFSLSDYYMCWVROAPGKGLEWVYVSCLDYFGSTDDASWAK
GRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTATYYCAKTDDSRGWGLNIWGOGTTVTVSS SEQ ID NO, 144: 578maxDHP
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYVMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTATIYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTIVIVSS SEQ 1D NO, 145: 511maxDHP
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTVSGFSLNTYYMNWVROAPGKGLEWVGIIAPDDTTYVASWAKS
RSTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTATYYCARSGDTTAWGADIWGOGTTVIVSS SEQ ID NO, 146: 578max Pref subst DHP
' 103/106 QVALVOTGGESVOQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA :
KGRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLONWGEQGTIVIVSS SEQ ID NO. 147: 578max VH: EL)
VOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWYROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAK
GRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVYSS SEQ ID NO. 148: 578max VH: V2Q
EQQLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPODDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTVYLQMNSELRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVIVSS SEQ ID NO. 149: 578max VH: Q46L
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGESLTDYYYMTWVRLAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAK
GRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO, 150: 578max VH: W54AY e
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEYVGFIDPDDDPYYATWAK
GRFYISRDYSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGAQGTLVTVSS SEQ ID NO. 151: 578max VH: V55I
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWIGFIDPDDDPYYATWAK
GRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVIVSS SEQID NO. 152: 578max VH: DB3A
EVOLVESGGGLVAPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRATSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVIVSS SEQ ID NO. 153: 578max VH: N87A - EVOLVESGGGLVOPGGSLRLISCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVYGFIDPDDDPYYATWA
KGRFYISRDTSKATVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGSTLVIVSS SEQ ID NO, 154; 57Bmax VH: Y105F
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYFCAGGDHNSGWGLDIWGQOGTLVIVSS SEQ ID NO. 155: 578max VH:D83
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTOYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 156: 578max VH: N87
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYVMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 157: 578max VH: TS84N
] 104/106
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDNSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 158: 578max VH: VB9L
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO, 159; 578max VH: VB9A
EVOLVESGGGLVOQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTAYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 160: 578maxDHP VH: TB4N
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDNSKNTVYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTTVTVYSS SEQD NO. 161: 578maxDHP VH: VE9L ENEIDA
EVOLVESGGGSVOPGGSIRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYAÁTIWA
KGRFTISRDTSKNTLYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTTVTVSS SEQ ID NO. 162: 578maxDHP VH: VB9A
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTASGESLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDTSKNTAYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLDIWGQOGTTVTVSS SEQID NO. 163: 578max VH:T&4N, VB9A
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
É KGRFTISRDNSKNTAYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQOGTLVTVYSS - SEQ1D NO. 164: 578max VH:T8AN, V89L
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVIVSS SEQ ID NO. 165: 578maxDHP VH: TS4N, VB89A
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDNSKNTAYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTIVTVSS SEQ ID NO, 166: 578maxDHP VH: TBAN, VB9L
EVOLVESGGGSVOPGGSLRLSCTASGFSLTOYYYMTWVROGAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWA
KGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLOIWGOGTIVTVSS sequências de estrutura (X resíduos são sítios de inserção de CDR e podem ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente. No mínimo 3 e até 50 aminoácidos podem estar presentes): SEQ ID NO. 167: Cadeia leve variável FW1.4 e rFW1.4 EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITC(X)a-3-50 WYOOKPGKAPKLUYIX)oza.50 GVPSRFSGSGSGAEFTUTISSLQPDDFATYYCIX).=3-50 FGQOGTKLT VLG
SEQ ID NO. 168: Cadeia leve variável rFW1.4 variante 2 (v2) EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3:50 WYQOOKPGKAPKLUVY(X) 3.50 GVPSRFSGSGSGAEFTLBSSLQPDDFATYYC(X)n=3-s0 FGQGTKLT VLG SEQ ID NO. 169: Cadeia pesada variável FW1.4 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAAS(X)n-3.60 WVROAPGKGLEWVS (X)n-2.50 RFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAK(X)nca.so WGOGTL VTVSS SEQIDNO. 170: Cadeia pesada variável (FW1.4 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTAS(XJne3-s0 WVROAPGKGLEWVG(X)n.3-50 RFTISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n-3-50 WGOGTLV TVS SEQ ID NO. 171: Cadeia pesada variável rFW1.4 variante 2 (v2) EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCTVS(X]n-a.s0 WVROAPGKGLEWYG(X)n23:50 RFTISKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=3.506 WGOGTLVTVYSS sequências de estrutura ScFv: SEQIDNO. 172: FW1.4 SEQ ID NO. 172: AWV1.4 EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCIX) 350 WYOQKPGKAPKLLIV(X),-3-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLOPDDFATYYC(X).-2.50 FGQGTKLTVLG GEGESCESECSCEEGSEGEGSEVQLVESGEGLVOPGGSLRLSCAAS(X)a-3.50 WVRQAPGKGLEWVS(X)ns3.50 RFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTA VYYCAK(X)nasso
WGOGTLVIVSS , SEQ ID NO, 173: (FW1.4 EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITC(X)ns2.50 WYOOQKPGKAPKLUY(X)n-3.50 - GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPDDFATYYCI(X)n-3-55 FGOGTKLTVLG SGECGSCEGESCECESGÇEGSEVQLVESGGGLVAPGGSLRLSCTAS(X)-2.50 WVROAPGKGLEWVG(X)n=350 RFTISRDTSKNTVYLOMNS LRAEDTAVYYCAR(X)n3so
WGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 174: rFW1.4 variante 2 (v2) EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITC(X) 32.50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)a-a-s0 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLAPDDFATYYC(X)nu2.50 FGAGTKLTVLG GEGESGECESSEGESCEGEGS EVOLVESGEGLVOAPGGSLRLSCTVS(X)ns3-50 WVROAAPGKGLEWVG(X)1=3-s0 RFTISKDTSKNTVYLOMNSLR AEDTAVYYCAR(X)n-250
WGOGSTLVIVSS sequências anti-VEGF ScFv:
' 106/106 SEQ ID NO. 175: 435 max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASOSIGSSLAWYQQOKPGKAPKLLIVTAANLASGVPSRFSGSRSG AEFTLTISSLOPDDFATYYCONFATSDTVTFGOGTKLTVLGGGGESCCGESCEGESCEGEGSEVAL VESGGGLVOPGGSLRLSCKASGFSLNTNYWMCWVRQAPGKGLEWVGCMYTGSYNRAYYASWA
KGRFTSSKDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGSNWYSDLWGOGTLVTVSS SEQD NO, 176: 511, max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASQSINIWLSWYQOKPGKAPKLUYRASTLASGVPSRESGSGSGT EFTLTISSLOPDDFATYYCOANYAYSAGYGAAFGOGTKLTVLGGGGGSCGEGSEGEGSCEGESEV QLVESGGGLVOPGGSLRLSCTVSGFSLNTYYMNWVRQAPGKGLEWVGIIAPDDTTYYASWAKSRS
TISRDTSKNTVYLOAMNSLRAEDTAVYYCARSGDTTAWGADIWGOGTLVTVSS SEQID NO. 177: 567 min o,
ENVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOADOSIVIWLSIWVYGOKPEKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGA EFTLTISSLOPDDFATYYCONNAHYSTNGGTFGQGTKLTVLEGGGGSGGEGSGEGESCEGESEVA LVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSDYYMCWVROAPGKGLEWVSCLDYFGSTDDASWAKGRFT
ISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKTDDSRGWGLNIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 178: 578min
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIITCOASENIHSWLAWYQOKPGKAPKLUYLASTLASGVPSRFESGSGSGA EFTLTISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGESGGGESGEGESSGGESEVA LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVSFIDPDDDPYYATWAKGRF
TISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS SEQ ID NO. 179: 578max
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIFTCOASENIHSWLAWYQOKPGKAPKLUYLASTLASGVPSRFSGSGSGT QFTLTISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGOGTKLTVLEGGGESGEGGSGEGESEEGESEVA É LVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTOYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRF
TISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGTLVTVSS É SEQUD NO. 180: 578minmax (ESBASO3)
EIVMTOSPSTLSASVGDRVIHTCOASENIHSWLAWYQOKPGKAPKLUYLASTLASGVPSRFESGSGSGA EFTLTISSLOPDDFATYYCONVYLASTNGANFGOGTKLTVLEGGGGSGEGESCGEEGGSCEGEASEVA LVESGGGLVOPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVROAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRE
TISRDTSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGOGSTLVTVSS SEQ ID No. 181 encadeador
GGEESCECESCGEGSEGEGS

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Imunoligante recombinante, caracterizado pelo fato de com- preender uma cadeia pesada variável (VH) e/ou uma cadeia leve variável (VL) o qual neutraliza VEGF humano e compreende CDRs de coelho, em | queno mínimo três CDRs têm cada no mínimo 80% de similaridade com uma sequência de consenso do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 71.
2. Imunoligante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um imunoligante quimérico.
3. Imunoligante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de ser humanizado.
4. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: a. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQID NO: 15 e SEQ ID NO: 27 e em que o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61; - b. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 27 e o VL compreende CDRs do grupo i consistindo em SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 61; c. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, e SEQ ID NO: 62; d. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 63; e. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 30 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 64; f. o VA compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO:7, SEQIDNO:19eSEQID NO: 31 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 65; g. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQIDNO:
8, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 32 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 66; h. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 33 e o VL compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 67; i. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 34 e o VL compreende CDRs do gru- po consistindo em SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 68; j. o VH compreende CDRs (i) do grupo consistindo em SEQ ID NO:11,SEQID NO: 23 e SEQ ID NO: 35; (ii) do grupo consistindo em SEQ 1D NO: 11, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 35; (iii) do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 35; ou (iv) do grupo consis- tindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 35; e o VL compre- ende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 e SEQ IDNO:689; k. o VH compreende CDRs do grupo consistindo em SEQ ID ] NO: 12, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 36 e em que o VL compreende (i) CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 70; ou (ii) CDRs do grupo consistindo em SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59eSEQIDNO:70.
5. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de estrutura de região variável de região variável de cadeia pesada tendo no mínimo 80% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 169.
6. Imunoligante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a estrutura de região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO: 170 ou SEQ ID NO: 171.
7. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter eliminações nas posições 1, 83 ou 87 da região variável de cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração AHo.
8. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindicações
] 37 1 a 7, caracterizado pelo fato de ter uma substituição em no mínimo uma das posições 2, 12, 24, 25, 46, 54, 55, 83, 84, 87, 89, 103, 105, 108 ou 144 na região variável de cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração AHo.
9. Imunoligante de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas substituições são selecionadas entre o grupo consistindo em: i.Glutamina na posição 2; ii.Serina na posição 12; iii. Treonina na posição 24; iv.Valina na posição 25; v.Leucina na posição 46; vi Tirosina na posição 54; vii.Isoleucina na posição 55; viii. Alanina na posição 83; ix. Asparagina na posição 84 - x.Alanina ou Leucina na posição 87; xi. Alanina ou Leucina na posição 89; | xii.Serina ou Treonina na posição 103; xiii.Fenilalanina na posição 105; xiv.Arginina na posição 108; e xv.Serina ou Treonina na posição 144.
10. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de estru- tura da região variável de cadeia leve tendo no mínimo 85% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 167.
11. Imunoligante de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a estrutura de região variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 167 ou SEQ ID NO: 168.
12. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de ter uma substituição em no mínimo uma das posições 1, 2, ou 15 da região variável de cadeia leve de acordo a7 com o sistema de numeração AHo.
13. Imunoligante de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que as referidas substituições são selecionadas entre o gru- po consistindo em: i.Aspartato na posição 1; ii. Valina na posição 2; e iii. Treonina na posição 15.
14. imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 13, caracterizado pelo fato de compreender: a. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 107 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 72; b. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 73; c. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma ] sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 74; | d. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 111 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 75; e. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 112 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 76; f.. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 113 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 77; g. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 114 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 78; h. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 115 e uma
: 57 região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 79; i. uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 116 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 80; j. "uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve no mínimo 80% similar à SEQ ID NO: 81.
15. Imunoligante de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de ter no mínimo 80% de identidade com a SEQ ID NO: 176, a SEQID NO: 177, a SEQ ID NO: 178, a SEQ ID NO: 179 ou a SEQ ID NO:
180.
16. Imunoligante, caracterizado pelo fato de que liga com uma afinidade de no mínimo 10º M a um epitopo sobre VEGF humano reconhe- cido pelo imunoligante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 aí6.
17. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- 7 ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que liga especificamente a VEGF humano e de rato/ camundongo. |
18. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- ções1a417, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo, scFv, Fab ou Dab.
19. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imu- noligante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
20. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de ser isolada codificando o imunoligante como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 18.
21. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 20.
22. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor de expressão como definido na reivindicação 21.
23. Uso do imunoligante como definido em qualquer uma das
Ú 67 reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser na produção de um me- dicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença mediada por VEGF humano.
24. Imunoligante de acordo com qualquer uma das reivindica- ções1a18,caracterizado pelo fato de ser para o tratamento ou prevenção de uma doença mediada por VEGF humano.
25. Uso de acordo com a reivindicação 23 ou o imunoligante de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a doença me- diada por VEGF é selecionada entre do grupo consistindo em degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma neovascular, retinopatia diabéti- ca, retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, carcinomas de ma- ma, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofagea- nos, carcinomas colorretais, carcinomas hepáticos, carcinomas ovarianos, os comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicais, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe, carcinomas de la- E ringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de pele, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de Ú pâncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligoden- droglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiossarcomas, carcinomas do trato urinário, carcinomas da tireoide, tumor de Wilm, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tal como o associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, artrite reumatoide, psoríase e aterosclerose.
26. Hibridoma, caracterizado pelo fato de produzir um anticorpo compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos determina- das nas SEQ ID NOs: 60-166 e nas SEQ ID NOs: 175-180.
27. Imunogênio, caracterizado pelo fato de ser adequado para dar origem ou identificar um imunoligante que tem reatividade cruzada com VEGF de rato/ camundongo e humano ou uma porção do mesmo.
28. Imunogênio de acordo com a reivindicação 27, caracterizado
' 77 pelo fato de ter a SEQ ID NO: 1.
29. Método de produzir um imunoligante que tem reatividade cruzada com VEGF de rato/ camundongo e humano, caracterizado pelo fato de que o método emprega o imunogênio como definido na reivindicação 28.
30. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- da pelo fato de ser formulada para administração tópica, intraocular, oral, nasal, retal ou parental.
31. Método de tratar uma doença mediada por VEGF em um mamífero, em particular em um humano, caracterizado pelo fato de compre- ender administrar a um sujeito o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável por vias tópica, intraocular, intramuscular, intraperitoneal, intrace- robrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, ou por inalação.
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Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI N? 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI N? 9279/96, A CONCESS?O DA PATENTE EST? CONDICIONADA ? ANU?NCIA PR?VIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVA??O DOS TERMOS DO PARECER N? 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL N? 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVID?NCIAS CAB?VEIS.

B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021

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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 25/06/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.