CZ20012925A3 - Humanizovaný imunoglobulin reaktivní s B7 molekulami a způsob léčení - Google Patents

Description

Humanizovaný imunoglobulin reaktivní s B7 molekulami a způsob léčení

Oblast techniky

Vynález se týká humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7 molekuly, přípravy a použití takových imunoglobulinů.

Dosavadní stav techniky

Antigenně specifická aktivace T-lymfocytů a iniciace imunitní reakce závisí nejprve na interakci receptorového komplexu (TCR) T-lymfocytů s peptidem/hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) přítomným na buňkách prezentujících antigen (APC). B7 molekuly, B7-1 a B7-2, jsou molekuly, které jsou přítomné na APC. Ko-stimulační signál, poskytnutý interakcí B7-1 a B7-2 na APC s jejich ligandy CD28 a CTLA4 na T-lymfocytech, je nutný pro dokončení aktivace Tlymfocytů a následnou regulaci imunitní odpovědi. Existuje potřeba regulovat B7-1 a B7-2 dráhu, která je označována jako B7:CD28/CTLA4 dráha. Dále existuje potřeba vývoje způsobů léčby onemocnění, která jsou ovlivněna touto dráhou.

Podstata vynálezu

Vynález se týká humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7 molekuly. Přesněji vynález zahrnuje humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1, který obsahuje vazebný region pro antigen jiného než lidského původu (například od hlodavce) a alespoň část lidského původu (například lidský konstantní region, jako je konstantní region IgG a/nebo lidský region pracovního rámce). V jednom provedení může humanizovaný • · · · · ·· ·· · • ··· · ·· · · ··· • · ···· · · · • · · · ······ · · ? · ······· ···· ··· ·· ·· ·· ··· konstantní region buď humanizovaného anti-B2-7 nebo humanizovaného anti-B7-l imunoglobulinu také obsahovat mutaci, která redukuje efektorovou funkci humanizovaného imunoglobulinu. Humanizovaný B7-2 imunoglobulin podle předkládaného vynálezu může soutěžit s myším 3D1 o vazbu na B7-2. Obdobně, humanizovaný B7-1 imunoglobulin podle předkládaného vynálezu může soutěžit s myším 1F1 o vazbu na B7-1. V určitých provedeních je vazebný region pro antigen humanizovaného B7-2 imunoglobulinu odvozen od 3D1 monoklonální protilátky a vazebný region pro antigen humanizovaného B7-1 imunoglobulinu odvozen od 1F1 monoklonální protilátky.

Humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat konstantní region lidského původu a vazebný region pro antigen, kde vazebný region pro antigen nonlidského původu obsahuje jeden nebo více regionů určujících komplementaritu (CDR) od hlodavců (například z 3D1 monoklonální protilátky), které se váží na B7-2, nebo jeden nebo více CDR od hlodavců (například z 1F1 monoklonální protilátky), které se váží na B7-1, a kde část imunoglobulinu lidského původu je odvozena od lidského pracovního regionu (FR) .

Vazebný region pro antigen humanizované B7-2 protilátky může dále obsahovat lehký řetězec a těžký řetězec, kde lehký a těžký řetězec mají každý tři CDR odvozené od 3D1 protilátky. FR lehkého řetězce pro humanizovanou B7-2 protilátku může být odvozen, například, od lehkého řetězce lidské H2F protilátky a těžký řetězec může být odvozen, například, od těžkého řetězce lidské I2R protilátky. Konkrétním provedením vynálezu je humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B72, který je odvozen od buněčné linie uložené v Američan Type Culture Collection (ATCC), přírůstkové č. CRL-12524.

Vazebný region pro antigen humanizované B7-1 protilátky může obsahovat lehký řetězec a těžký řetězec, kde lehký a těžký řetězec máji každý tři CDR odvozené od 1F1 protilátky. FR lehkého a těžkého řetězce humanizované B7-1 protilátky může být odvozen, například, od lehkého a těžkého řetězce lidské III-2R protilátky. Konkrétním provedením vynálezu je humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B71, který je odvozen od buněčné linie uložené v Američan Type Culture Collection (ATCC), přírůstkové č. PTA-263.

Vynález také poskytuje humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-1 nebo B7-2 obsahující těžký řetězec a/nebo lehký řetězec. V jednom provedení má humanizovaný imunoglobulin vazebnou specificitu pro B7-2 a lehký řetězec obsahuje alespoň jeden CDR (například CDR1, CDR2 a CDR3) odvozený od protilátky non-lidského původu, který se váže na B7-2 a FR odvozený od lehkého řetězce lidského původu (například z H2F protilátky); a těžký řetězec obsahuje alespoň jeden CDR (například CDR1, CDR2 a CDR3) odvozený od protilátky non-lidského původu, který se váže na B7-2 a FR odvozený od těžkého řetězce lidského původu (například z lidské I2R protilátky). V jiném provedení má humanizovaný imunoglobulin vazebnou specificitu pro B7-1 a lehký a/nebo těžký řetězec obsahuje alespoň jeden CDR (například CDR1, CDR2 a CDR3) odvozený od protilátky non-lidského původu, který se váže na B7-1 a FR odvozený od lehkého a/nebo těžkého řetězce lidského původu (například III-2R). Imunoglobuliny mohou dále obsahovat CDR1, CDR2 a CDR3 pro lehký nebo těžký řetězec mající zde uvedené aminokyselinové sekvence nebo aminokyselinové sekvence v podstatě stejné, jako jsou tyto aminokyselinové sekvence, takže se protilátky váží na B7-2 nebo B7-1. Předkládaný vynález se také týká lehkých řetězců humanizovaných imunoglobulinů a těžkých řetězců humanizovaných imunoglobulinů. Vynález se dále týká izolovaných nukleových kyselin majících sekvenci, která kóduje humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu (například jednořetězcové protilátky), a dále se týká izolovaných nukleových kyselin, které obsahují sekvenci, která kóduje lehký nebo těžký řetězec B7-2 nebo B7-1 humanizovaného imunoglobulinů.

Jedním provedením vynálezu je lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinů mající vazebnou specificitu pro B7-2 obsahující CDR1, CDR2 a/nebo CDR3 lehkého řetězce myší 3D1 protilátky, a FR lidského lehkého řetězce (například H2F protilátky). Obdobně, vynález poskytuje lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinů B7-1 mající vazebnou specificitu pro B7-1 obsahující CDR1, CDR2 a/nebo CDR3 lehkého řetězce myši 1F1 protilátky, a FR lidského lehkého řetězce (například III-2R protilátky). Jiným provedením je lehký řetězec humanizovaného B7-2 nebo B7-1 imunoglobulinů, který obsahuje variabilní region uvedený na obr. 2B (SEQ ID NO: 8) nebo variabilní region uvedený na obr. 7B (SEQ ID NO: 28). Vynález se také týká izolované sekvence nukleové kyseliny, která kóduje humanizovaný variabilní lehký řetězec specifický pro B7-2 nebo B7-1, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedeno na obr. 2B (SEQ ID NO: 7) nebo na obr, 7B (SEQ ID NO: 27), v příslušném pořadí, sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2B (SEQ ID NO: 8) nebo na obr. 7B (SEQ ID NO: 28), v příslušném pořadí, sekvenci nukleové kyseliny, která hybridizuje na tyto sekvence za středně přísných hybridizačnich podmínek, nebo sekvenci nukleové kyseliny, která je komplementární k uvedené sekvenci.

Jiným provedením vynálezu je těžký řetězec humanizovaného • ·

«μ • ·· ·· ·· · • · · ·· · · · · · • · · · · ·· · • ·· ····«· · · • · · · · · · ··· ·· · · ·· · · · imunoglobulinu, který je specifický pro B7-2 a který obsahuje CDR1, CDR2 a/nebo CDR3 těžkého řetězce 3D1 protilátky, a FR lidského těžkého řetězce (například I2R protilátky). Dalším provedením vynálezu je těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu B7-1, který je specifický pro B7-1 a který obsahuje CDR1, CDR2 a/nebo CDR3 těžkého řetězce 1F1 protilátky, a FR lidského těžkého řetězce (například III-2R protilátky). Vynález se také týká těžkého řetězce humanizovaného imunoglobulinu, který obsahuje variabilní region uvedený na obr. 2 (SEQ ID NO: 6) nebo na obr. 7A (SEQ ID NO: 26). Vynález se také týká izolované sekvence nukleové kyseliny, která kóduje humanizovaný variabilní těžký řetězec specifický pro B7-2, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou na obr. 2A (SEQ ID NO: 5), izolovanou sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2A (SEQ ID NO: 6), sekvenci nukleové kyseliny, která hybridizuje na tyto sekvence za středně přísných hybridizačních podmínek, nebo sekvenci nukleové kyseliny, která je komplementární k uvedené sekvenci. Vynález se také týká izolované sekvence nukleové kyseliny, která kóduje humanizovaný variabilní těžký řetězec specifický pro B7-1, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou na obr. 7A (SEQ ID NO: 25), izolovanou sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 7A (SEQ ID NO: 26), sekvenci nukleové kyseliny, která hybridizuje na tyto sekvence za středně přísných hybridizačních podmínek, nebo sekvenci nukleové kyseliny, která je komplementární k uvedené sekvenci.

Konkrétně, provedením předkládaného vynálezu je humanizovaný imunoglobulin, který se specificky váže na B7-2 a obsahuje humanizovaný lehký řetězec obsahující tři CDR lehkého řetězce z myší 3D1 protilátky, a sekvenci pracovního rámce φφ • · variabilního regionu lehkého řetězce z lehkého řetězce lidského imunoglobulinu, a humanizovaný těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce z myší 3D1 protilátky, a sekvenci pracovního rámce variabilního regionu těžkého řetězce z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu. Myší 3D1 protilátka může dále obsahovat variabilní doménu zralého lehkého řetězce, jako je variabilní doména zralého lehkého řetězce uvedená na obr. 1B (SEQ ID NO: 4) a variabilní doménu zralého těžkého řetězce, jako je variabilní doména zralého těžkého řetězce uvedená na obr. 1A (SEQ ID NO: 2).

Jiným provedením předkládaného vynálezu je humanizovaný imunoglobulin, který se specificky váže na B7-1 a obsahuje humanizovaný lehký řetězec obsahující tři CDR lehkého řetězce z myší 1F1 protilátky, a sekvenci pracovního rámce variabilního regionu lehkého řetězce z lehkého řetězce lidského imunoglobulinu, a humanizovaný těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce z myší 1F1 protilátky, a sekvenci pracovního rámce variabilního regionu těžkého řetězce z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu. Myší 1F1 protilátka může dále obsahovat variabilní doménu zralého lehkého řetězce, jako je variabilní doména zralého lehkého řetězce uvedená na obr. 6B (SEQ ID NO: 24) a variabilní doménu zralého těžkého řetězce, jako je variabilní doména zralého těžkého řetězce uvedená na obr. 6A (SEQ ID NO: 22).

Vynález dále obsahuje expresní vektor, který obsahuje fúzní gen, který kóduje lehký a/nebo těžký řetězec humanizovaného B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobulinu. Gen obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující CDR odvozený od lehkého a/nebo těžkého řetězce non-lidské protilátky mající vazebnou specificitu pro B7-2 a/nebo B7-1 (například myší 3D1 nebo 1F1 protilátky, v příslušném pořadí), a FR odvozený od lidského lehkého a/nebo těžkého řetězce.

Předkládaný vynález se také týká hostitelské buňky obsahující nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu, včetně jednoho nebo více konstruktů obsahujících nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení vynález obsahuje hostitelskou buňku obsahující první B7-2 rekombinantní nukleovou kyselinu, která kóduje lehký řetězec humanizovaného B7-2 imunoglobulinu a druhou B7-2 rekombinantní nukleovou kyselinu, která kóduje těžký řetězec humanizovaného B7-2 imunoglobulinu. První B7-2 nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden CDR odvozený od lehkého řetězce myší 3D1 protilátky a FR odvozený od lehkého řetězce lidského původu. Druhá B7-2 nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden CDR odvozený od těžkého řetězce myší 3D1 protilátky a FR odvozený od těžkého řetězce lidského původu. V jiném provedení vynález obsahuje hostitelskou buňku obsahující první B7-1 rekombinantní nukleovou kyselinu, která kóduje lehký řetězec humanizovaného B7-1 imunoglobulinu a druhou B7-1 rekombinantní nukleovou kyselinu, která kóduje těžký řetězec humanizovaného B7-1 imunoglobulinu. První B7-1 nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden CDR odvozený od lehkého řetězce myší 1F1 protilátky a FR odvozený od lehkého řetězce lidského původu. Druhá B7-1 nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden CDR odvozený od těžkého řetězce myší 1F1 protilátky a FR odvozený od těžkého řetězce lidského původu. Vynález se dále týká hostitelské buňky obsahující vektor nebo nukleovou kyselinu, která kóduje humanizované B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobuliny, jak jsou zde popsány.

Vynález se dále týká způsobů přípravy humanizovaných ·· · φφ φφ φφφ φφφφ «φφφ φφφφ φφ φφφφ φφφ • φ φφ φφφφφφ φφ

8Φ φ «φφφφφ φφφφ «φφ φφ φφ ····· imunoglobulinů, které zahrnuji kultivaci hostitelských buněk, které kóduji humanizovaný imunoglobulin, který je specifický pro B7-2 nebo B7-1, jak je zde popsán, za podmínek vhodných pro expresi humanizovaného imunoglobulinu, při kterých jsou exprimovány řetězce humanizovaného imunoglobulinu (jeden nebo více) a je produkován humanizovaný imunoglobulin. Způsob dále zahrnuje stupeň izolování humanizovaného B7-2 nebo B7-1 imunoglobulinu.

Vynález dále zahrnuje způsoby pro inhibici interakce první buňky nesoucí B7-2 receptor s druhou buňkou nesoucí B7-2, které zahrnují kontaktování druhé buňky s účinným množstvím humanizovaného B7-2 imunoglobulinu, jak je zde popsán. Vynález dále zahrnuje způsoby pro inhibici interakce první buňky nesoucí B7-1 receptor s druhou buňkou nesoucí B7-1, které zahrnují kontaktování druhé buňky s účinným množstvím humanizovaného B7-1 imunoglobulinu, jak je zde popsán. V souladu s tím se vynález týká inhibice B7-1 a B7-2 receptorů pomocí B7-1 a B7-2 ligandů, kde tato inhibice vyžaduje kontaktování buněk nesoucích B7-1 a B7-2 receptory s dávkou humanizovaného anti-B7-l a B7-2 imunoglobulinu. Tak se vynález týká různých způsobů léčby. Vynález se týká způsobu pro modulování imunitní reakce u jedince (například u pacienta) nebo léčby jedince s transplantovaným orgánem, tkání, buňkami a podobně, kde uvedené způsoby zahrnují podání účinného množství humanizovaného B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobulinu, jak je zde popsán, s nebo bez nosiče (například farmaceutického nosiče), což moduluje imunitní odpověď. Vynález se týká léčby akutní a/nebo chronické rejekce transplantátu, například dlouhodobé léčby (v řádu dnů, měsíců či roků). Vynález se také týká způsobů pro léčbu onemocnění asociovaných s modulací B7-2 a/nebo B7-1 molekul (například autoimunitních onemocnění, infekčních onemocnění, zánětlivých onemocnění, systémového lupus erythematodes, diabetes mellitus, asthma, insulinitis, arthritis, zánětlivých onemocněni střevních, zánětlivé dermatitidy a roztroušené sklerosy), při kterých je jedinci (například pacientovi) podáno účinné množství (například terapeuticky účinné množství) B7-2 a/nebo B7-1 humanizovaného imunoglobulinu, jak je zde popsán, s nebo bez nosiče. Dále vynález obsahuje farmaceutické prostředky obsahující B7-2 a/nebo B7-1 humanizované imunoglobuliny, jak jsou zde popsány.

Vynález se také týká způsobů přípravy humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-2 z myší protilátky specifické pro B7-2, a/nebo způsobů přípravy humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-1 z myší protilátky specifické pro B7-1. Způsoby obsahují stanovení nebo zajištění CDR protilátky non-lidského původu (například myší), který má vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1; získání lidské protilátky mající aminokyselinovou sekvenci pracovního rámce vhodnou pro přenos CDR; a přenos CDR protilátky non-lidského původu do FR lidské protilátky.

Vynález se také týká způsobů pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti B7-1 a/nebo B7-2 ve vzorku. Způsob zahrnuje získání humanizované protilátky specifické pro B7-2 a/nebo B71, nebo jejího fragmentu, v množství dostatečném pro umožnění tvorby komplexů mezi B7-2 a/nebo B7-1 a anti-B7-2 a/nebo antiB7-1 protilátkou, v příslušném pořadí, a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti tvorby komplexu. Přítomnost komplexu naznačuje přítomnost B7-2 a/nebo B7-1 ve vzorku.

Vynález se týká způsobů léčby jedinců majících onemocnění, která zahrnují podání množství (například terapeuticky účinného množství) humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-1 a/nebo množství (například terapeuticky účinného • · φφ · ♦ · ·· ·· φφφφ φφφφ · φφ φ φ φ φ φ φ φ _1Λ · φ φ φ φ ··· φφφ · φ «ΦΦΦΦ·· φφφφ φφφ φφ ·· φφ φ·· množství) humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-2. Termín onemocnění, jak je zde použit, zahrnuje například autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, asthma, zánětlivá onemocnění, systémový lupus erythematodes, diabetes mellitus, insulitis, arthritis, zánětlivá onemocnění střevní, zánětlivou dermatitis a roztroušenou sklerosu. Tento způsob se také týká modulování imunitní odpovědi jedince majícího transplantovaný orgán, tkáň, buňku a podobně, při kterém se podá účinné množství humanizovaného imunoglobulinu, který se váže na B7-1 a/nebo humanizovaného imunoglobulinu, který se váže na B7-2. Tento způsob dále zahrnuje podání léku, který se používá pro modulování imunitní odpovědi jedince majícího transplantovaný orgán, tkáň, buňku a podobně. Lékem může být, například, methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitory dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonisté IL-2 receptorů (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) a jejich analogy. Tyto léky mohou být podány před, s nebo po podání humanizovaných imunoglobulinů.

Vynález se také týká způsobů pro transplantování buněk (například kostní dřeně, krevních buněk, složek krve a jiných buněk) jedincům potřebujícím takovou léčbu, které zahrnují získání buněk (například kostní dřeně, krevních buněk nebo složek) od dárce a kontaktování buněk s imunoglobulinem specifickým pro B7-1 a/nebo imunoglobulinem specifickým pro B7-2, a buňkami příjemce, za zisku směsi. Imunoglobuliny a buňky příjemce se inkubují pro dobu dostatečně dlouhou pro indukci tolerance. Směs (označovaná jako přípravek kostní dřeně nebo krevní přípravek) se potom aplikuje jedinci. Buňkami příjemce mohou být lymfocyty (například lymfocyty • *· · · exprimující antigeny třídy I (MHCI) nebo lymfocyty periferní krve (PBL)). Místo buněk příjemce je možno v uvedeném způsobu použít také tkáně, orgány nebo buňky, které exprimují antigeny MHC třídy I, 37-1 a/nebo B7-2 molekuly. Buňky mohou být zpracovány tak, aby exprimovaly akceptorové molekuly. Buňkami od dárce mohou být buňky kostní dřeně nebo buňky/složky krve (například kmenové nebo nezralé buňky). B7 imunoglobuliny jsou v kontaktu s kostní dření dárce a akceptorovými buňkami po dobu, která je dostatečně dlouhá pro indukci tolerance (například po dobu přibližně 1 až 96 hodin, lépe po dobu přibližně 36 až 48 hodin). Jedincem potřebujícím takovou transplantaci je jedinec, který má onemocnění léčitelné nebo příznivě ovlivnitelné transplantací kostní dřeně. Takovými onemocněními jsou, například, proliferativní onemocnění (například leukemie, lymfomy a nádory), anemie (například srpkovitá anemie, thalasemie a aplastická anemie) , vrozené metabolické vady, kongenitální imunodeficience a myelodysplastický syndrom (MDS). Způsob dále zahrnuje podání léku, který se používá pro modulování imunitní odpovědi (jako je například methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitory dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonisté IL-2 receptoru (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) a jejich analogy).

Konkrétně vynález zahrnuje způsoby pro transplantaci kostní dřeně u jedinců s onemocněním (například proliferativním onemocněním, jako je leukemie, lymfom a nádory, anemií, jako je srpkovitá anemie, thalasemie a aplastická anemie, vrozenou metabolickou vadou, kongenitální imunodeficiencí a myelodysplastickým syndromem), které se léčí transplantací • · kostní dřeně, kde uvedené způsoby zahrnuji získáni kostní dřeně od dárce a kontaktování kostní dřeně s imunoglobuliny specifickými pro B7-1 a/nebo imunoglobuliny specifickými pro B7-2, a akceptorovými buňkami (například lymfocyty). Kostní dřeň, imunoglobuliny a akceptorové buňky jsou v kontaktu po dobu dostatečnou pro indukci tolerance (například po dobu 1 až 96 hodin, výhodně 36 až 48 hodin). Způsob potom zahrnuje reaplikaci ošetřené kostní dřeně jedinci. Způsob dále zahrnuje podání léku, který se používá pro modulování imunitní odpovědi (jako je například methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitory dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonisté IL-2 receptoru (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) nebo jejich analogy).

Vynález dále zahrnuje způsoby pro léčbu příjemce transplantátu nebo pro prevenci rejekce transplantátu u příjemce transplantátu, ve kterých je příjemci transplantátu podané účinné množství imunoglobulinu specifického pro B7-1 a/nebo účinné množství imunoglobulinu specifického pro B7-2. Imunoglobulin specifický pro B7-1 je podán v množství přibližně 1 mg/kg až 100 mg/kg a imunoglobulin specifický pro B7-2 je podán v množství přibližně 1 mg/kg až 100 mg/kg. Imunoglobuliny specifické pro B7-1 a B7-2 mohou být podány v den transplantace (například v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a přibližně 25 mg/kg) a mohou být také podávány periodicky (například denně, týdně nebo měsíčně) po transplantaci (například v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a přibližně 5 mg/kg). Způsob dále zahrnuje podání prostředku používaného pro prevenci rejekce transplantátu, jako jsou inhibitory kalcineurinu (například cyklosporin A nebo FK506), steroidy ·· • · • · • · • · ·· « ·

(například methylprednison nebo prednison) nebo imunosupresivní činidla, která zastavují růst buněk imunitního systému (jako je například rapamycin), inhibitory CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitory dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonisté IL-2 receptorů (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) nebo jejich analogy. Předkládaný vynález se také týká způsobu transplantace buněk, tkání nebo orgánů jedinci potřebujícímu takovou transplantaci, který zahrnuje transplantaci buněk, tkání nebo orgánů a podání účinného množství imunoglobulinů specifického pro B7-1 a účinného množství imunoglobulinů specifického pro B7-2 j edinci.

Vynález se také týká způsobů snížení protilátkové odpovědi na antigen u savce, při kterém je jedinci podáno účinné množství humanizovaného imunoglobulinů specifického pro B7-1 a/nebo humanizovaného imunoglobulinů specifického pro B7-2, za přítomnosti antigenu. Způsob dále zahrnuje podání antigenu (například tetanického toxoidu, faktoru VIII, faktoru IX, insulinu, růstového hormonu nebo vektoru pro přenos genu) jedinci. Antigen může být podán ve formě polypeptidu nebo ve formě nukleové kyseliny (například pomocí genové terapie pomocí adeno-asociovaných virů (AAV), retrovirů, holých DNA vektorů atd.).

Mezi výhody předkládaného vynálezu patří schopnost regulovat nebo modulovat B7 ko-stimulační dráhu. Ovlivnění této ko-stimulační dráhy humanizovanými anti-B7-2 a/nebo antiB7-1 protilátkami umožňuje léčbu mnoha různých onemocnění. Humanizované anti-B7-2 a anti-B7-l protilátky si udržují přibližně stejnou specificitu pro příslušné B7 molekuly jako »· • · «

····

•		··
··	•	•	• *	• ·	··
•	•	•	4 ·	4» ·	•
•	« ·	•	>· ·	• · ·	•
•	•	•	•	• ·	•
···	·*	<··»	··	·

příslušné myší protilátky, ale mají sníženou imunogenicitu prodloužený poločas u člověka ve srovnání s myšími protilátkami. Proto může být vynález výhodně použit pro léčbu imunitních onemocnění/poruch, nebo pro léčbu onemocnění, při kterých mají významnou úlohu B7-2 a/nebo B7-1 molekuly.Vynález se zejména týká způsobů pro léčbu autoimunitních onemocnění a způsobů pro modulování imunitní reakce u jedinců s transplantovanými orgány, tkáněmi nebo buňkami.

Popis obrázků na připojených výkresech

Další provedení, charakteristiky a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu výhodných provedení vynálezu, která jsou dokreslena na následujících výkresech.

Obr. 1A ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ ID NO: 1 a 2, v příslušném pořadí) myší 3D1 protilátky, kde aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého těžkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 1B ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 3 a 4, v příslušném pořadí) myší 3D1 protilátky, kde sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého lehkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 2A ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ ID NO: 5 a 6, v příslušném pořadí) humanizované 3D1 protilátky, kde

• · · ·· · • · · · ·· · • · · · ·· • · · ······ • · · ··· • ·· · · · · · sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého těžkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 2B ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 7 a 8, v příslušném pořadí) humanizované 3D1 protilátky, kde sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého lehkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 3 je graf ukazující výsledky testu kompetitivní vazby.

Graf ukazuje výsledky testu kompetitivní vazby myší nebo humanizované anti-lidský B7-2 mAb na CHO buňky exprimující na svém povrchu rhB7-2 (CHO/hB7-2). Stoupající koncentrace neznačených kompetitivních protilátek byly inkubovány s CHO/hB7-2 buňkami za přítomnosti radioaktivně značené antilidský B7-2 mAb a určoval se poměr navázané:volné protilátky.

Obr. 4 je graf ukazující výsledky testu přímé vazby myší nebo humanizované anti-lidský B7-2 mAb na CHO/hB7-2 buňky.

Stoupající koncentrace radioaktivně značených protilátek se inkubovaly s CHO nebo CHO/hB7-2 buňkami a určilo se množství specifické protilátky navázané na CHO/hB7-2 buňky.

Obr. 5 je graf znázorňující výsledky testu proliferace Tlymfocytů. Stoupající koncentrace myší nebo humanizované antilidský B7-2 mAb se přidávaly k CD28+ lidským T-lymfocytům stimulovaným PMA a CHO/hB7-2 buňkami a sledovala se inhibice proliferace T-lymfocytů těmito mAb.

Obr. 6A ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ ID NO: 21 a • ·

• · · · · • · · ♦ · · • · · · · · · · • · · · · • · · · · ·

22, v příslušném pořadí) myší 1F1 protilátky, kde aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého těžkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 6B ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 23 a 24, v příslušném pořadí) myší 1F1 protilátky, kde sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého lehkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 7A ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce (SEQ ID NO: 25 a 26, v příslušném pořadí) humanizované 1F1 protilátky (hulFl), kde sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého těžkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 7B ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce (SEQ ID NO: 27 a 28, v příslušném pořadí) humanizované 1F1 protilátky (hulFl), kde sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) jsou podtrženy a první aminokyselina zralého lehkého řetězce je dvakrát podtržena.

Obr. 8 je graf ukazující výsledky testu kompetitivní vazby. Graf ukazuje výsledky testu kompetitivní vazby myší nebo humanizované anti-lidský B7-1 mAb na CHO buňky transfektované rhB7-l (CHO/hB7-l). Stoupající koncentrace neznačených kompetitivních protilátek byly inkubovány s CHO/hB7-l buňkami za přítomnosti radioaktivně značené humanizované 1F1 a určoval se poměr navázané:volné protilátky.

Obr. 9A je graf ukazující Scatchardovu analýzu vazby myších 1F1 protilátek na CHO buňky transfektované rhB7-l.

Radioaktivně značené myší 1F1 protilátky se inkubovaly s CHO buňkami transfektovanými rhB7-l a určoval se poměr navázané:volné radioaktivitě.

Obr. 9B je graf ukazující Scatchardovu analýzu vazby humanizovaných 1F1 protilátek na CHO buňky transfektované rhB7-l. Radioaktivně značené humanizované 1F1 protilátky se inkubovaly s CHO buňkami transfektovanými rhB7-l a určoval se poměr navázané:volné radioaktivitě.

Obr. 10 je graf ukazující výsledky testu kompetitivní vazby myší nebo humanizované anti-lidský B7-1 mAb na CHO buňky exprimující rhB7-l (CHO/hB7-l) na svém povrchu. Stoupající koncentrace neznačených kompetitivních protilátek byly inkubovány s CHO/hB7-l buňkami za přítomnosti radioaktivně značené myší anti-lidský B7-1 mAb a určoval se poměr navázané:volné protilátky.

Obr. 11 je graf ukazující výsledky testu přímé vazby myší nebo humanizované anti-lidský B7-1 mAb na CHO/hB7-l buňky.

Stoupající koncentrace radioaktivně značených protilátek se inkubovaly s CHO nebo CHO/hB7-l buňkami a určilo se množství specifické protilátky navázané na CHO/hB7-l buňky.

Obr. 12 je graf znázorňující výsledky testu proliferace Tlymfocytů. Stoupající koncentrace myší nebo humanizované antilidský B7-1 mAb se přidávaly k CD28+ lidským T-lymfocytům stimulovaným PMA a CHO/hB7-l buňkami a sledovala se inhibice proliferace T-lymfocytů těmito mAb.

Obr. 13 je graf znázorňující výsledky testu jednocestné reakce lymfocytární směsi (MLR). Fixní koncentrace myší nebo humanizované anti-lidský B7-2 (IgG2.M3 izotyp) nebo lidský CTLA4Ig se přidávaly ke směsi lidských reaktivních a stimulačních PBL a proliferace reaktivních PBL se určovala ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 14 je graf ukazující výsledky jednocestného sekundárního MLR testu provedeného za použití PBL z primární MLR jako reaktivních buněk a PBL od stejného nebo jiného jedince jako primární MLR jako stimulátorů. Humanizovaná anti-lidský B7-1 mAb se přidala pouze k primární MLR. Proliferace reaktivních PBL v sekundární MLR se určovala ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 15 je graf ukazující výsledky jednocestného sekundárního MLR testu provedeného za použití PBL z primární MLR jako reaktivních buněk a PBL od stejného nebo jiného jedince jako primární MLR jako stimulátorů. Humanizovaná anti-lidský B7-2 mAb (izotyp IgG2.M3) se přidala pouze do primární MLR.

Proliferace reaktivních PBL v sekundární MLR se určovala ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 16 je graf ukazující výsledky jednocestného sekundárního MLR testu provedeného za použití PBL z primární MLR jako reaktivních buněk a PBL od stejného nebo jiného jedince jako primární MLR jako stimulátorů. Humanizované anti-lidský B7-1 a B7-2 mAb (izotyp IgG2.M3) se přidaly pouze do primární MLR. Proliferace reaktivních PBL v sekundární MLR se určovala ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 17 je graf ukazující výsledky jednocestného primárního MLR testu provedeného za použití PBL jako reaktivních buněk a

ozářených B PBL stimulátorů. Reaktivní a stimulační buňky byly ošetřeny humanizovanou anti-B7-2 protilátkou, humanizovanou anti-B7-l mAb, kombinací humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 mAb, 10 pg/ml CTLA4 Ig, 20 gg/ml CTLA4 Ig nebo kontrolním Ig. Proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 18 je graf ukazující výsledky jednocestného primárního MLR testu provedeného za použití PBL jako reaktivních buněk a ozářených C PBL stimulátorů. Reaktivní a stimulační buňky byly ošetřeny humanizovanou anti-B7-2 protilátkou, humanizovanou anti-B7-l mAb, kombinací humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 mAb, 10 pg/ml CTLA4 Ig, 20 gg/ml CTLA4 Ig nebo kontrolním Ig. Proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 19 je graf ukazující výsledky jednocestného primárního MLR testu provedeného za použití reaktivních buněk z B stimulátorů primární MLR (viz obr. 17) a čerstvých B stimulátorů. Reaktivní a stimulační buňky byly ošetřeny humanizovanou anti-B7-2 protilátkou, humanizovanou anti-B7-l mAb, kombinací humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 mAb, 10 pg/ml CTLA4 Ig, 20 pg/ml CTLA4 Ig nebo kontrolním Ig, pouze v primární MLR. Do sekundární MLR se nepřidávalo nic. Proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 20 je graf ukazující výsledky jednocestného primárního MLR testu provedeného za použití reaktivních buněk z B stimulátorů primární MLR (viz obr. 17) a čerstvých c stimulátorů. Reaktivní a stimulační buňky byly ošetřeny humanizovanou anti-B7-2 protilátkou, humanizovanou anti-B7-l • ·

mAb, kombinaci humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 mAb, 10 gg/ml CTLA4 Ig, 20 gg/ml CTLA4 Ig nebo kontrolním Ig, pouze v primární MLR. Do sekundární MLR se nepřidávalo nic. Proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu.

Obr. 21 je graf ukazující výsledky jednocestného primárního MLR testu provedeného za použití reaktivních buněk z B stimulátorů primární MLR (viz obr. 17) a čerstvých B nebo C stimulátorů. Reaktivní a stimulační buňky byly ošetřeny humanizovanou anti-B7-2 protilátkou, humanizovanou anti-B7-l mAb, kombinací humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 mAb, 10 pg/ml CTLA4 Ig, 20 gg/ml CTLA4 Ig nebo kontrolním Ig, pouze v primární MLR. Do sekundární MLR se nepřidávalo nic. Proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5 pomocí přidání radioaktivně značeného thymidinu. Obr. 21 je kompilací obr. 19 a 20.

Obr. 22 je graf znázorňující anti-tetanickou odpověď (log titr) u non-lidských primátů imunizovaných tetanickým toxoidem. Opice makak rhesus se imunizovaly přečištěným tetanickým toxoidem a ošetřily se humanizovanou anti-B7-l a humanizovanou anti-B7-2 protilátkami. Sérové titry antitetanických protilátek (IgM a IgG) se měřily jednou týdně po dobu 26 týdnů.

Obr. 23 je graf znázorňující anti-tetanickou odpověď (log titr) u non-lidských primátů imunizovaných tetanickým toxoidem. Opice makak rhesus se imunizovaly tetanickým toxoidem v den 0 a ošetřily se v den 0 jednou i.v. dávkou humanizované anti-B7-l a humanizovanou anti-B7-2 protilátky v kombinaci nebo vehikulem. V týden 14 se zvířata imunizovala podruhé tetanickým toxoidem bez dalšího podání humanizované ♦ · anti-B7-l nebo humanizované anti-B7-2 protilátky. Sérové titry anti-tetanických protilátek (IgM a IgG) se měřily jednou týdně po dobu 18 týdnů.

Obr. 24 je graf znázorňující anti-tetanickou odpověď (log titr) u non-lidských primátů imunizovaných tetanickým toxoidem. Opice makak rhesus se imunizovaly tetanickým toxoidem v den 0 a ošetřily se v den 0 jednou i.v. dávkou humanizované anti-B7-l samotné nebo vehikulem. V týden 14 se zvířata imunizovala podruhé tetanickým toxoidem bez dalšího podání humanizované anti-B7-l protilátky. Sérové titry antitetanických protilátek (IgM a IgG) se měřily jednou týdně po dobu 18 týdnů.

Obr. 25 je graf znázorňující anti-tetanickou odpověď (log titr) u non-lidských primátů imunizovaných tetanickým toxoidem. Opice makak rhesus se imunizovaly tetanickým toxoidem v den 0 a ošetřily se v den 0 jednou i.v. dávkou humanizované anti-B7-2 samotné nebo vehikulem. V týden 14 se zvířata imunizovala podruhé tetanickým toxoidem bez dalšího podání humanizované anti-B7~2 protilátky. Sérové titry antitetanických protilátek (IgM a IgG) se měřily jednou týdně po dobu 18 týdnů.

Obr. 26 je sloupcový graf ukazující plochu pod křivkou titru anti-tetanické protilátky (log titr) pro každou pokusnou skupinu (skupiny: skupina 1 - vehikulum; skupiny 2-4 - 10, 1 nebo 0,1 mg/kg hlFl samotné; skupiny 5-7 - 10, 1 nebo 0,1 mg/kg h3Dl samotné; skupiny 8-11 - 10, 1 nebo 0,1 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci). Opice makak rhesus byly imunizované v den 0 tetanickým toxoidem a byla jim aplikována jediná i.v. dávka humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 protilátky v kombinaci, humanizované anti-B7-l protilátky nebo • * • ·

·♦ · humanizované anti-B7-2 protilátky samostatně, nebo vehikula (n=3 na skupinu). Plocha pod křivkou (AUC) se vypočetla z doby 0 až 14 týdnů. Všechny titry tetanických protilátek se normalizovaly na základní hodnotu 0 před tím, než se provedl výpočet AUC pro křivku titru tetanických protilátek. Tyto AUC hodnoty relativizovány frakcí počtu zvířat v každé skupině, která produkovala detekovatelné titry protilátky, za účelem zjištění počtu reagujících zvířat v každé skupině.

Obr. 27 je graf ukazující sérové koncentrace anti-B7-l a antiB7-2 (IgG2.M3 izotyp) mAb v různou dobu po podání i.v. dávky 10 mg/kg.

Obr. 28 je graf ukazující procentuální přežívání během přibližně 1 roku pro opice makak rhesus, kterým byla provedena allotransplantace ledviny. Opice byly léčeny humanizovanou anti-B7-l a humanizovanou anti-B7-2 protilátkou v kombinaci, humanizovanou anti-B7-l nebo humanizovanou anti-B7-2 protilátkou samostatně, nebo vehikulem. Humanizované protilátky byly podány v počáteční dávce 20 mg/kg následované dávkou 5 mg/kg a potom byly podávány jednou týdně v dávce 5 mg/kg po dobu 60-80 dnů.

Podrobný popis předkládaného vynálezu

Vynález se týká humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1, které obsahují vazebný region pro antigen jiného než lidského původu a alespoň část imunoglobulinu lidského původu. Výhodně se humanizované imunoglobuliny mohou vázat na B7-2 nebo B7-1 s afinitou alespoň přibližně 10⁷ M'¹, lépe alespoň přibližně 10 M^-1, a nejlépe alespoň přibližně ΙΟ⁹ Μ^-1. V jednom provedení

• ·♦ ·· ·· ·· ···· · · · • · · · · · · • 9 9 · 9 · 9 · 99 • · · 9 99

9 9 99 9999 9 obsahují humanizované imunoglobuliny vazebný region pro antigen non-lidského původu, který se váže na B7-2 nebo B7-1, a konstantní region odvozený od lidského konstantního regionu. Lidský konstantní region může v pracovním regionu (FR) obsahovat non-lidské zbytky. V jiném provedení obsahují humanizované imunoglobuliny, které se váží na B7-2 nebo B7-1 regiony určující komplementaritu (jeden nebo více) nonlidského původu a variabilní pracovní region (jeden nebo více) lidského původu, a volitelně konstantní region lidského původu. Volitelně může FR region imunoglobulinů obsahovat zbytky non-lidského původu. Například mohou humanizované imunoglobuliny obsahovat těžký řetězec a lehký řetězec, kde lehký řetězec obsahuje region určující komplementaritu odvozený od protilátky non-lidského původu, která se váže na B7-2, a region pracovního rámce odvozený od lehkého řetězce lidského původu, a těžký řetězec obsahuje region určující komplementaritu odvozený od protilátky non-lidského původu, která se váže na B7-2, a region pracovního rámce odvozený od těžkého řetězce lidského původu. V jiném provedení mohou humanizované imunoglobuliny obsahovat těžký řetězec a lehký řetězec, kde lehký řetězec obsahuje region určující komplementaritu odvozený od protilátky non-lidského původu, která se váže na B7-1, a region pracovního rámce odvozený od lehkého řetězce lidského původu, a těžký řetězec obsahuje region určující komplementaritu odvozený od protilátky nonlidského původu, která se váže na B7-1, a region pracovního rámce odvozený od těžkého řetězce lidského původu. Vynález také zahrnuje, samostatně nebo ve funkčních kombinacích, lehké řetězce, těžké řetězce, variabilní regiony, variabilní lehké řetězce a variabilní těžké řetězce.

Vynález se také týká humanizované B7-2 protilátky, která má v podstatě stejnou vazebnou specificitu jako myší B7-2 ·· · ·· ·« ·· • « ·· · · · · · • · ···· · · • · ·· ······ · • · · · · · · ·«·* · ·· ·♦ · · ·· protilátka, ze které je humanizovaná protilátka připravena, ale která má redukovanou imunogenicitu u primátů (například u člověka). Obdobně se vynález také týká humanizované B7-1 protilátky, která má v podstatě stejnou vazebnou specificitu jako myší B7-1 protilátka, ze které je humanizovaná protilátka připravena, ale která má redukovanou imunogenicitu u primátů (například u člověka). Humanizované B7-2 nebo B7-1 protilátky mohou mít menší, v podstatě stejnou nebo větší vazebnou afinitu jako jejich myší protějšky. Viz obr. 3, 4, 8, 9A a 9B.

Přirozené imunoglobuliny mají společnou základní strukturu, ve které dva identické lehké řetězce (přibližně 24 kD) a dva identické těžké řetězce (přibližně 55 nebo 70 kD) tvoří tetramer. Amino-koncová část každého řetězce je známá jako variabilní (V) region a označuje se též jako vazebný region pro antigen, a může být odlišen od více konzervovaných konstantních (C) regionů ve zbytku každého řetězce. Ve variabilním regionu lehkého řetězce je C-koncová část známá jako J region. Ve variabilním regionu je kromě J regionu přítomen také D region. Většina variací aminokyselinové sekvence v imunoglobulinech je omezena na tři samostatné regiony ve V regionech, které se označují jako hypervariabilní regiony neboli regiony určující komplementaritu (CDR), které se přímo účastní vazby antigenů. Variabilní region je ta část protilátky, které se váže na antigen. Konstantní region má různé funkce, jako je schopnost vazby na Fc receptory na fagocytárních buňkách, buňkách placenty, žírných buňkách a podobně. Každý lehký a těžký řetězec má variabilní region a konstantní region. V souladu s tím se vynález týká humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1. Humanizované B7-1 nebo B7-2 imunoglobuliny obsahují lehký řetězec a těžký řetězec, ve kterých dva lehké řetězce a dva těžké řetězce tvoří tetramer.

• «

Variabilní region dále vytváří dva typy regionů, pracovní region (FR) a region určující komplementaritu (CDR). CDR jsou hypervariabilní regiony, které obsahují většinu variací aminokyselinové sekvence mezi imunoglobuliny. Od amino-konce jsou tyto regiony označeny jako CDR1, CDR2 a CDR3, v příslušném pořadí. Viz obr. 1A-1B, 2A-2B, 6A-6B a 7A-7B. CDR jsou spojeny více konzervovanými FR. Od amino-konce jsou tyto regiony označeny FR1, FR2, FR3 a FR4, v příslušném pořadí. Umístění CDR a FR regionů a systém číslování byl definován Kabatem a kol. (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991); Kabat, E.A. et al., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2. vydání, Holt, Rinehart and Winston, New York (1976); Kabat, E.A., Sequences of Immunoglobulin Chains: Tabulation and Analysis of Amino Acids Sequences of Precursors, V-regions, C-regions, J-Chain and β2Microglobulins, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Sevice (1979); Kabat, E.A. et al., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, Holt, Rinehart and Winston, New York (1968); Kabat, E.A., Experimental Immunochemistry, 2. vydání, Springfield, Thomas (1967). Během procesu humanizace imunoglobulinu se jeden nebo více CDR z protilátky mající specificitu pro B7-2 nebo B7-1 z od jiného druhu než od člověka přenese na FR lidské protilátky. Dále, způsobem, který je zde popsán, mohou být provedeny některé pro člověka nepřirozené substituce v pracovním rámci. Výsledná humanizovaná protilátka má CDR od jiného druhu než od člověka, například od myši, a FR z lidské protilátky, takže si humanizovaná protilátka zachovává antigenní specificitu a afinitu k B7-1 nebo B7-2.

4 •·

44 • 4 • 4

4 4 •

4

-44 * • · ·· • · · » 4 4 4 · · • 4· 4 *

Vynález se také týká lehkého řetězce B7-1 nebo B7-2 humanizovaného imunoglobulin nebo těžkého řetězce B7-1 nebo B7-2 humanizovaného imunoglobulin. V jednom provedení se vynález týká humanizovaného B7-2 lehkého řetězce obsahujícího jeden nebo více CDR lehkého řetězce (například CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 18) a/nebo CDR3 (SEQ ID NO: 20)) non-lidského původu a pracovní rámec lidského lehkého řetězce (viz obr. 2B). V jiném provedení se vynález týká humanizovaného B7-2 těžkého řetězce obsahujícího jeden nebo více CDR těžkého řetězce (například CDR1 (SEQ ID NO: 10) , CDR2 (SEQ ID NO: 12) a/nebo CDR3 (SEQ ID NO: 14)) non-lidského původu a pracovní rámec lidského lehkého řetězce (viz obr. 2A). CDR mohou být odvozeny od non-lidského imunoglobulinu, jako je myší variabilní region těžkého (např. SEQ ID NO: 1, obr. 1A) a lehkého (např. SEQ ID NO: 3, obr. 1B) řetězce 3D1 protilátky, které jsou specifické pro B7-2.

V jiném provedení se vynález týká humanizovaného B7-1 lehkého řetězce obsahujícího jeden nebo více CDR lehkého řetězce (například CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 38) a/nebo CDR3 (SEQ ID NO: 40)) non-lidského původu a pracovní rámec lidského lehkého řetězce (viz obr. 7B). V jiném provedení se vynález týká těžkého řetězce B7-1 humanizovaného imunoglobulinu obsahujícího jeden nebo více CDR těžkého řetězce (například CDR1 (SEQ ID NO: 30), CDR2 (SEQ ID NO: 32) a/nebo CDR3 (SEQ ID NO: 34)) non-lidského původu a pracovní rámec lidského těžkého řetězce (viz obr. 7A). CDR mohou být odvozeny od non-lidského imunoglobulinu, jako je myší variabilní region těžkého (např. SEQ ID NO: 21, obr. 6A) a lehkého (např. SEQ ID NO: 23, obr. 6B) řetězce 1F1 protilátky, které jsou specifické pro B7-1.

Vynález se také týká humanizované anti-B7-2 protilátky

	w ·♦	··	to·
4 ·	• ·	♦	•	t 9	• · ·
•		to	r	9 9	• ·
	• «	9	•	toto ·>	to· to
•	•	to	•	to	to ·
		• to			• to »

exprimované buněčnou linií uloženou v ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02110-2209, 5.5.1998, ATCC č.: CRL12524. Buněčná linie, která exprimuje humanizovanou anti-B7-2 protilátku, uložená v ATCC, je označena jako rekombinantní CHO buněčná linie (PA-CHO-DUKX-1538) exprimující humanizovanou anti-lidský B7-2 (CD86) monoklonální protilátku (#HF2-3D1) izotypu IgG2.M3.

Vynález se také týká humanizované anti-B7-l protilátky exprimované buněčnou linií uloženou v ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02110-2209, 22.6.1999, pod ATCC č.: PTA-263. Buněčná linie, která exprimuje humanizovanou anti-B71 protilátku, uložená v ATCC, je označena jako rekombinantní CHO buněčná linie (PA-CHO-DUKX-1538) exprimující humanizovanou anti-lidský B7-1 (CD80) monoklonální protilátku (#1F1).

Lidské imunoglobuliny mohou být děleny do tříd a podtříd, podle izotypu těžkého řetězce. Třídami jsou IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, ve kterých jsou těžké řetězce gamma (γ) , mí (μ), alfa (a), delta (δ), resp. epsilon (ε) . Podtřídami jsou IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl a IgA2, ve kterých jsou těžké řetězce γΐ, γ2, γ3, γ4, al, resp. α.2. Lidské imunoglobulinové molekuly daných tříd a podtříd mohou obsahovat buď kappa (k) nebo lambda (λ) lehké řetězce. Viz například Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., ed., kapitola 45, str. 41-50, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2. vydání, kapitola 4, strana 45-65, Sinauer Associates, lne., Sunderland, MA (1984).

Termíny HF2.3D1 a 3D1 označují myší imunoglobulin specifický pro B7-2. Termíny humanizovaný HF2.3D1,

• · · · · · • · · · · · · • · · ♦ · · ·· · · · · · · · • · · · · • ·· · · *· · humanizovaný 3D1, hu3Dl, h3Dl, B7-2 humanizovaný imunoglobulin nebo humanizovaný B7-2 imunoglobulin označují humanizovaný imunoglobulin specifický pro lidský B7-2 (například myší anti-lidský B7-2 protilátku). Termíny 1F1 nebo myší 1F1 označují myší imunoglobulin, který je specifický pro B7-1. Termíny humanizovaný 1F1, hulFl, hlFl, B7-1 humanizovaný imunoglobulin nebo humanizovaný B71 imunoglobulin označují humanizovaný imunoglobulin specifický pro lidský B7-1 (například myší anti-lidský B7-1 protilátku). Termín B7 molekuly označuje B7-1 a B7-2 molekuly. Termín B7 protilátky označuje anti-lidský B7-2 a anti-lidský B7-1 protilátky.

Termíny imunoglobulin nebo protilátka označují celé protilátky a jejich biologicky funkční fragmenty. Takové biologicky funkční fragmenty si zachovávají alespoň jednu vazebnou funkci pro antigen příslušné kompletní protilátky a výhodně si zachovávají schopnost inhibovat interakci B7-2 nebo B7-1 s jedním nebo více z jejich receptorů (například CD28, CTLA4). Ve výhodném provedení mohou biologicky funkční fragmenty inhibovat vazbu B7-2 a/nebo B7-1 za účelem ovlivnění ko-stimulační dráhy. Příklady použitelných biologicky funkčních fragmentů jsou fragmenty schopné vazby na B7-2 nebo B7-1, včetně jednořetězcových protilátek, Fv, Fab, Fab' a (F(ab')2 fragmentů. Takové fragmenty mohou být produkovány enzymatickým štěpením nebo rekombinantními technikami. Například, štěpení papainem nebo pepsinem může být použito pro přípravu Fab nebo F(ab')2 fragmentů, v příslušném pořadí. Protilátky mohou být také produkovány v různých zkrácených formách za použiti genů pro protilátky, ve kterých jsou jeden nebo více stop kodonů vloženy před přirozený stop kodon. Například, chimérický gen kódující těžký řetězec F(ab')₂ • · · · φ··· · · φφ ΦΦΦΦΦΦ • · · · ΦΦΦΦΦΦ φ

OQ φ Φ Φ φ φφφ ^⁷ φφφφ φφφ φφ ·· ·· fragmentu může být navržen tak, aby obsahoval DNA sekvence kódující CHi doménu a pantový region těžkého řetězce. Vynález zahrnuje jednořetězcové protilátky (například jednořetězcové FV), které obsahují obě části těžkého a lehkého řetězce.

Termín humanizovaný imunoglobulin, jak je zde použit, označuje imunoglobulin obsahující části imunoglobulinů různého původu, kde alespoň jedna část je lidského původu. Například může humanizovaná protilátka obsahovat části odvozené od imunoglobulinu non-lidského původu s požadovanou specificitou, například myšího původu, a části z imunoglobulinu lidského původu (jak je tomu například u chimérického imunoglobulinu). Tyto části mohou být navázány na sebe chemicky za použití běžných technik (například synteticky) nebo mohou být připraveny ve formě kontinuálního polypeptidu za použití technik genetického inženýrství (například může být exprimována DNA kódující proteinové části chimérické protilátky za zisku kontinuálního polypeptidového řetězce). Jiným příkladem humanizovaného imunoglobulinu podle předkládaného vynálezu je imunoglobulin obsahující jeden nebo více imunoglobulinových řetězců obsahujících CDR odvozený od protilátky non-lidského původu a pracovní region odvozený od lehkého a/nebo těžkého řetězce lidského původu (například protilátky s přeneseným CDR s nebo bez změn v pracovním regionu). Chimérické protilátky nebo jednořetězcové protilátky s přeneseným CDR jsou také zahrnuty termínem humanizovaný imunoglobulin. Viz, například, Cabilly et al., US patent č. 4816567; Cabilly et al., Evropská patentová přihláška č. 0125023 Bl; Boss et al., US patent č. 4816397; Boss et al., Evropská patentová přihláška č. 0120694 Bl; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Evropská patentová přihláška č. 0194276 Bl; Winter, US patent č. 5225539; Winter, Evropská patentová přihláška č. 0239400 Bl; Padlan, E.A. et • · • ·

• · · · • · · · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · • ·· ♦· ♦♦ al., Evropská patentová přihláška č. 0519596 Al. Viz též Ladner et al., US patent č. 4946778; Huston, US patent č. 5476786; a Bird, R.E. et al., Science 242: 423-426 (1988), které se týkají jednořetězcových protilátek.

Jak je ukázáno na příkladné protilátce podle předkládaného vynálezu, zahrnuje termín humanizovaný imunoglobulin také imunoglobulin obsahující lidský pracovní region, alespoň jeden CDR z non-lidské protilátky, ve kterém je jakýkoliv konstantní region v podstatě identický s konstantním regionem lidského imunoglobulinů, například z alespoň 60-90%, lépe z alespoň 95% identický. Proto jsou všechny části humanizovaného imunoglobulinů, s výjimkou možných CDR, v podstatě identické s příslušnými částmi jednoho nebo více přirozených lidských imunoglobulinů. V některých případech obsahuje humanizovaný imunoglobulin, kromě CDR z non-lidské protilátky, další nonlidské zbytky v lidském pracovním regionu.

Návrh humanizovaných imunoglobulinů může být proveden následujícím způsobem. Když patří aminokyseliny do následujících kategorií, tak je aminokyselina použitého pracovního regionu lidského imunoglobulinů (akceptorového imunoglobulinů) nahrazena aminokyselinou pracovního regionu z non-lidského imunoglobulinů dodávajícího CDR (donorového imunoglobulinů):

(a) aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinů je neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, zatímco příslušná aminokyselina v donorovém imunoglobulinů je typická pro lidský imunoglobulin v této pozici;

(b) pozice aminokyseliny je v bezprostředním sousedství jednoho CDR; nebo (c) aminokyselina může reagovat s CDR v modelu terciární struktury imunoglobulinu (viz Queen et al., op. cit., a Co et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2869 (1991)).

Pro podrobný popis produkce humanizovaných imunoglobulinů viz Queen et al., výše, a Co et al., výše, a US patenty 5585089; 5693761 a 5530101.

Obvykle jsou CDR regiony v humanizovaných protilátkách v podstatě identické, nebo častěji identické, s příslušnými CDR regiony v myší protilátce, od které jsou odvozeny. Ačkoliv to není obvykle žádoucí, je někdy možno provést jednu nebo více konzervativních aminokyselinových substitucí zbytků v CDR bez významnějšího ovlivnění vazebné afinity výsledného humanizovaného imunoglobulinu. Některé substituce CDR regionů mohou zvýšit vazebnou afinitu.

Na rozdíl od specifických aminokyselinových substitucí popsaných výše jsou pracovní regiony humanizovaných imunoglobulinů v podstatě identické, a častěji identické, s pracovními regiony lidských protilátek, od kterých jsou odvozeny. Je samozřejmé, že mnoho aminokyselin v pracovním regionu přispívá málo nebo vůbec ke specificitě nebo afinitě protilátky. Proto může být tolerováno mnoho jednotlivých konzervativních substitucí zbytků pracovního regionu, které nemění specificitu nebo afinitu výsledného humanizovaného imunoglobulinu.

Vazebný region pro antigen humanizovaného B7-2 imunoglobulinu (non-lidská část) může být odvozen od imunoglobulinu jiného než lidského původu, který se označuje jako donorový imunoglobulin, který má specificitu pro B7-2 (například 3D1 protilátky) nebo B7-1 (například 1F1 protilátka) . Například může být vhodný vazebný region pro • · ······· • · ·· ······ · · __ ········ 32 ···· ··· ·» ·· ·· ··· antigen pro humanizovanou B7-2 protilátku odvozen od HF2.3D1 monoklonální protilátky, myší anti-lidský B7-2 protilátky. US pořadové č. 08/101624, podaný 26.7.1993, 08/109393, podaný 19.8.1993 a 08/147773, podaný 3.12.1993, nazvané B72:CTLA4/CD28 Counter Receptor. Viz též Freeman et al., WO 95/03408, B7-2:CTLA4/CD28 Counter Receptor, publikováno 2.2.1995. Vhodný vazebný region pro antigen humanizované B7-1 protilátky může být odvozen od myší 1F1 monoklonální protilátky, myší anti-lidský B7-1 protilátky. Dalšími zdroji jsou protilátky specifické pro B7-2 nebo B7-1 získané od jiných zdrojů než od člověka, jako jsou hlodavci (například myši a krysy) , králíci, prasata, kozy nebo non-lidští primáti (například opice) nebo velbloudovitých zvířat (jako jsou velbloudi nebo lamy).

Dále mohou být připraveny jiné polyklonální nebo monoklonální protilátky, jako jsou protilátky, které se váží na stejný nebo podobný epitop jako myší HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky )například Kohler et al., Nátuře, 256: 495-497 (1975); Harlow et al., 1988, Antibodies: A laboratory manual, (Cold Spring Harbor, NY); a Current Protocols in Molecular Biology, svazek 2 )Supplement 27, Summer '94), Ausubel et al., ed., (John Wiley and Sons, New York, NY), kapitola 11 (1991)). Například mohou být protilátky namířeny proti vhodnému imunogenu ve vhodném savci, jako je myš, krysa, králík, ovce nebo velbloud. Buňky obsahující B7-2 nebo B7-1 imunogenní fragmenty B7-2 nebo B7-1, a B7-2 nebo B7-1 peptidy konjugované na vhodný nosič, jsou příklady vhodných imunogenů (například DNA nebo peptidových imunogenů). Buňky produkující protilátky (například lymfocyty) mohou být izolovány například z lymfatických uzlin nebo sleziny imunizovaného zvířete. Tyto buňky mohou být potom fúzovány s vhodnými imortalizovanými buňkami (například myelomovou buněčnou linií) za vzniku • ·

hybridomů. Fúzované buňky mohou být izolovány za použití technik selektivní kultivace. Buňky, které produkují protilátky s požadovanou specificitou, mohou být selektovány pomocí vhodného testu, jako je ELISA. Imunoglobuliny nonlidského původu mající vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1 mohou být také získány z protilátkových knihoven, jako je fágová knihovna obsahující non-lidské Fab molekuly. Humanizované imunoglobuliny mohou být připraveny také za použití jiných technik.

V jednom provedení obsahuje vazebný region pro antigen humanizovaných imunoglobulinů CDR non-lidského původu. V tomto provedení obsahují humanizované imunoglobuliny mající vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1 alespoň jeden CDR non-lidského původu. Například může být CDR odvozen od variabilních regionů lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů non-lidského původu, takže humanizovaný B7-2 imunoglobulin obsahuje v podstatě aminokyselinové sekvence CDR1 (např. SEQ ID NO: 10), CDR2 (např. SEQ ID NO: 12) a/nebo CDR3 (např. SEQ ID NO: 14) těžkého řetězce, a/nebo aminokyselinové sekvence CDR1 (např. SEQ ID NO: 16), CDR2 (např. SEQ ID NO: 18) a/nebo CDR3 (např. SEQ ID NO: 20) lehkého řetězce, z jednoho nebo více imunoglobulinů non-lidského původu, a vzniklý humanizovaný imunoglobulin má vazebnou specificitu pro B7-2. CDR mohou být také odvozeny od variabilních regionů lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů non-lidského původu, které jsou specifické pro B7-1. Humanizovaná B7-1 protilátka obsahuje v podstatě aminokyselinové sekvence CDR1 (např. SEQ ID NO: 30), CDR2 (např. SEQ ID NO: 32) a/nebo CDR3 (např. SEQ ID NO: 34) těžkého řetězce, a/nebo aminokyselinové sekvence CDR1 (např. SEQ ID NO: 36), CDR2 (např. SEQ ID NO: 38) a/nebo CDR3 (např. SEQ ID NO: 40) lehkého řetězce, z jednoho nebo více imunoglobulinů non-lidského původu, a vzniklý humanizovaný imunoglobulin má vazebnou specificitu pro B7-1. Všechny tři CDR vybraného řetězce mohou být v podstatě stejné jako CDR příslušného řetězce donoru, a výhodně jsou všechny tři CDR lehkého a těžkého řetězce v podstatě stejné jako CDR příslušného donorového řetězce. Sekvence nukleové kyseliny CDR1 (např. SEQ ID NO: 9), CDR2 (např. SEQ ID NO: 11) a CDR3 (např. SEQ ID NO: 13) B7-2 těžkého řetězce a/nebo CDR1 (např. SEQ ID NO: 15), CDR2 (např. SEQ ID NO: 17) a CDR3 (např. SEQ ID NO: 19) B7-2 lehkého řetězce mohou být také použity při přenosu CDR na lidský pracovní rámec. Dále, sekvence nukleové kyseliny CDR1 (např. SEQ ID NO: 29), CDR2 (např. SEQ ID NO: 31) a CDR3 (např. SEQ ID NO: 33) B7-1 těžkého řetězce a/nebo CDR1 (např. SEQ ID NO: 35), CDR2 (např. SEQ ID NO: 37) a CDR3 (např. SEQ ID NO: 39) B7-1 lehkého řetězce mohou být také použity při přenosu CDR na lidský pracovní rámec.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1 obsahujících těžký řetězec a lehký řetězec. Lehký řetězec může obsahovat CDR odvozený od protilátky nonlidského původu, která se váže na B7-2 nebo B7-1, a FR odvozený od lehkého řetězce lidského původu. Například může lehký řetězec obsahovat CDR1, CDR2 a/nebo CDR3, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou dále nebo aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako tyto aminokyselinové sekvence, takže se protilátka specificky váže na B7-2: CDR1 KSSQSLLNSRTRENYLA (SEQ ID NO: 16), CDR2 WASTRES (SEQ ID NO: 18), a CDR3 TQSYNLYT (SEQ ID NO: 20). Těžký řetězec může obsahovat CDR1, CDR2 a/nebo CDR3, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou dále nebo aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako tyto aminokyselinové sekvence, takže se protilátka specificky váže na B7-2: těžký řetězec: CDR1

DYAIQ (SEQ ID NO: 10), CDR2 VINIYYDNTNYNQKFKG (SEQ ID NO: 12), a CDR3 AAWYMDY (SEQ ID NO: 14) .

Lehký řetězec, který je specifický pro B7-1, může obsahovat CDR1, CDR2 a/nebo CDR3, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou dále nebo aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako tyto aminokyselinové sekvence, takže se protilátka specificky váže na B7-1: CDR1 SVSSSISSSNLH (SEQ ID NO: 30), CDR2 GTSNLAS (SEQ ID NO: 32), a CDR3 QQWSSYPLT (SEQ ID NO: 34). Těžký řetězec může obsahovat CDR odvozený od protilátky non-lidského původu, která se váže na B7-1, a FR odvozený od těžkého řetězce lidského původu. Těžký řetězec, který je specifický pro B7-1, může obsahovat CDR1, CDR2 a/nebo CDR3, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou dále nebo aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako tyto aminokyselinové sekvence, takže se protilátka specificky váže na B7-1: CDR1 DYYMH (SEQ ID NO: 36), CDR2 WIDPENGNTLYDPKFQG (SEQ ID NO: 38), a CDR3 EGLFFAY (SEQ ID NO: 40).

Provedením vynálezu je humanizovaný imunoglobulin, který se specificky váže na B7-2 a obsahuje humanizovaný lehký řetězec obsahující tři CDR lehkého řetězce od myší 3D1 protilátky a pracovní sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce z lehkého řetězce lidského imunoglobulinů. Vynález dále zahrnuje humanizovaný B7-2 těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce od myší 3D1 protilátky a pracovní sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce z těžkého řetězce lidského imunoglobulinů. Myší 3D1 protilátka může dále mít variabilní doménu zralého lehkého řetězce, jak je uvedeno na obr. 1B (SEQ ID NO: 4) a variabilní doménu zralého těžkého řetězce, jak je uvedeno na obr. 1A (SEQ ID NO: 2).

Jiným provedením vynálezu je humanizovaný imunoglobulin, který se specificky váže na B7-1 a obsahuje humanizovaný lehký ··· · ·

řetězec obsahující tři CDR lehkého řetězce od myší 1F1 protilátky a pracovní sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce z lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Vynález dále zahrnuje humanizovaný B7-1 těžký řetězec obsahující tři CDR těžkého řetězce od myši 1F1 protilátky a pracovní sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu. Myší 1F1 protilátka může dále mít variabilní doménu zralého lehkého řetězce, jak je uvedeno na obr. 6B (SEQ ID NO: 24) a variabilní doménu zralého těžkého řetězce, jak je uvedeno na obr. 6A (SEQ ID NO: 22).

Část humanizovaného imunoglobulinu nebo imunoglobulinového řetězce, která je lidského původu (lidská část) může být odvozena od vhodného lidského imunoglobulinu nebo imunoglobulinového řetězce. Například, lidský konstantní region nebo jeho část, pokud je přítomen, může být odvozen od κ nebo λ lehkých řetězců, a/nebo y (například yl, γ2, γ3, γ4) , μ, a (například al, a2), δ nebo ε těžkých řetězců lidských protilátek, včetně alelických variant. Konkrétní konstantní region, jako je IgG2 nebo IgG4, jeho varianty nebo části, může být vybrán podle zamýšlené efektorové funkce. Například, mutovaný konstantní region, který se také označuje jako varianta, může být zapracován do fúzního proteinu pro minimalizaci vazby na Fc receptory a/nebo schopnosti fixace komplementu (viz například Winter et al., US patent č. 5648260 a 5624821; GB 2209757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO94/29351, 22.12.1994). Dále, může být připravena mutovaná IgG2 Fc doména, která redukuje mitogenní reakci ve srovnání s přirozenými Fc regiony (viz Tso et al., US patent č. 5834597, který je zde uveden jako odkaz ve své úplnosti). Pro mutace provedené na humanizované anti-B7-2 protilátce viz příklad 3 a pro mutace provedené na humanizované anti-B7-l protilátce viz příklad 10.

• ·

Pokud jsou přítomny, jsou lidské FR výhodně odvozeny od variabilního regionu lidské protilátky majícího podobnou sekvenci jako analogický nebo ekvivalentní region vazebného regionu pro antigen donoru. Jinými zdroji FR pro části lidského původu humanizovaného imunoglobulinu jsou lidské variabilní konvenční sekvence (viz Kettleborough, C.A. et al., Protein Engineering 4: 773-783 (1991); Queen et al., US patenty č. 5585089, 5693762 a 5693761). Například může být sekvence variabilního regionu protilátky použitá pro získání non-lidské části srovnána s lidskými sekvencemi popsanými v Kabat, E.A., et al·., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991). Ve výhodném provedení jsou FR humanizovaných imunoglobulinových řetězců odvozeny od lidského variabilního regionu majícího alespoň 60% celkovou identitu sekvence, lépe alespoň 80% celkovou identitu sekvence, s variabilní regionem non-lidského donoru (například myší HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky). Například celková identita sekvence mezi pracovními regiony lehkého řetězce myší HF21.3D1 a lidským H2F je 82,5% a celková identita sekvence mezi pracovními regiony těžkého řetězce myší HF21.3D1 a lidským I2R je 62,5%. Pro B7-1 protilátku je celková identita sekvence mezi variabilními pracovními regiony lehkého řetězce myší 1F1 a humanizovaného III-2R je 69% a celková identita sekvence mezi variabilními pracovními regiony těžkého řetězce myší III2R je 79%.

Termín v podstatě identický v souvislosti se dvěma nukleovými kyselinami nebo polypeptidy (například DNA kódujícími humanizované imunoglobuliny nebo aminokyselinovými sekvencemi humanizovaného imunoglobulinu) znamená to, že dvě nebo více sekvencí nebo podsekvencí mají alespoň 80%, lépe 90• 9

·· ·· ·· · • ·♦ · · · · ♦ • · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · • · ·· · · ·· · až 95% nebo vyšší identitu na úrovni nukleotidů nebo aminokyselinových zbytků při srovnávání a seřazení pro maximální identitu a měření pomocí způsobu pro srovnávání sekvencí a/nebo vizuální inspekcí. Takové v podstatě identické sekvence se obvykle považují za homologické sekvence. Výhodně existuje podstatná identita v regionu sekvencí délky alespoň 50 zbytků, lépe v regionu délky alespoň přibližně 100 zbytků, a nejlépe jsou sekvence v podstatě identické v regionu délky alespoň 150 zbytků, nebo v celé délce srovnávaných sekvencí. Jak je popsáno dále, mohou být dvě protilátkové sekvence seřazeny pouze jedním způsobem, za použití číslování dle Kabata. Proto má pro protilátky procento identity jedinečný a dobře definovaný význam.

Aminokyseliny z variabilních regionů zralých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů jsou označeny Hx a Lx, v příslušném pořadí, kde x je číslo označující pozici aminokyseliny podle Kabatova schématu, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 a 1991). Kabat uvádí mnoho aminokyselinový sekvencí pro protilátky pro každou podskupinu a také seznam nej častějšleh aminokyselin pro každou pozici v každé podskupině. Kabat používá metodu pro přiřazení čísla ke každé aminokyselině sekvence. Kabatovo schéma lze použít i pro další protilátky neobsazené v souboru pomocí přiřazení dané protilátky k jedné z konvenčních sekvencí v Kabátově souboru. Pomocí Kabatova systému číslování se snadno identifikují aminokyseliny v ekvivalentních pozicích různých protilátek. Například, aminokyselina v pozici L50 lidské protilátky se vyskytuje v ekvivalentní pozici k aminokyselinové pozici L50 myší protilátky.

Základní strukturální jednotka protilátky je tvořena • *

···· • · · · · · · • · ······ · · • · · · · · • · «· ·♦ · · · tetramerem. Každý tetramer je složen ze dvou identických párů polypeptidových řetězců, kde každý pár je tvořen jedním lehkým (přibližně 25 kDa) a jedním těžkým (přibližně 50 až 70 kDa) řetězcem. Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní region velikosti přibližně 100 až 110 nebo více aminokyselin primárně odpovědný za rozpoznávání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní region primárně odpovědný za efektorovou funkci. Variabilní regiony každého páru lehký/těžký řetězec tvoří vazebné místo pro protilátku. Proto má intaktní protilátka dvě vazebná místa.

Lehké řetězce se dělí na kappa a lambda. Těžké řetězce se dělí na gamma, mí, alfa, delta a epsilon, a definují izotyp protilátky jako IgG, IgM, IgA, IgD, resp. IgE. V lehkých a těžkých řetězcích jsou variabilní a konstantní regiony spojeny J regionem velikosti přibližně 12 nebo více aminokyselin a těžké řetězce také obsahují D region velikosti přibližně 10 nebo více aminokyselin. Viz Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 3. vydání, Raven Press, N.Y., 1993, kapitola 9).

Od N-konce k C-konci obsahují variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce střídavě pracovní regiony a CDR, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Pořadí aminokyselin v každém regionu je v souladu s definicemi Kabata (1987) a (1991), výše, a/nebo Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nátuře 342: 878-883 (1989).

V jednom provedení obsahují humanizované imunoglobuliny alespoň jeden z FR odvozený od jednoho nebo více řetězců protilátky lidského původu. Tak může FR obsahovat FR, FR2, FR3 a/nebo FR4 odvozený od jedné nebo více protilátek lidského ·· · ·· ···· • · ·· ··*♦ ♦· ♦ • · ···· ·· • « · « e ·♦· · ·· • · ♦ ♦ · ·· ♦ ·φ· ··· ·♦ ···· · původu. Výhodně obsahuje lidská část vybraného humanizovaného řetězce FR1, FR2, FR3 a/nebo FR4 z variabilního regionu lidského původu (například z lidského imunoglobulinového řetězce, z lidské konvenční sekvence). Ve výhodném provedení jsou FR pro variabilní region B7-2 lehkého řetězce z lidské protilátky H2F a FR pro variabilní region B7-2 těžkého řetězce jsou z lidské protilátky I2R. FR pro variabilní regiony B7-1 lehkého a těžkého řetězce jsou z III-2R protilátky.

Imunoglobulinové části lidského a non-lidského původu pro použití v předkládaném vynálezu mají sekvence, které jsou identické s imunoglobuliny nebo částmi imunoglobulinů, od kterých jsou odvozeny, nebo s jejich variantami. Mezi takové varianty patří mutanty lišící se adicemi, delecemi nebo substitucemi jednoho nebo více zbytků. Jak bylo uvedeno výše, CDR, které jsou non-lidského původu, jsou v podstatě stejné, jako u non-lidského donoru, a výhodně jsou identické s CDR non-lidského donoru. Jak je zde uvedeno, mohou být provedeny změny v FR, jako jsou změny substituující zbytek FR lidského původu zbytkem z příslušné pozice donoru. Mohou být připraveny jedna nebo více mutací v FR, včetně delecí, insercí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin. Několik takových substitucí je popsáno v popisu přípravy humanizované HF2.3D1 protilátky v příkladu 2 a v popisu humanizované 1F1 v příkladu 9. Pro vybrané humanizované protilátky nebo řetězce mohou být mutace v pracovním regionu navrženy zde popsaným způsobem. Výhodně se B7-2 a B7-1 humanizované imunoglobuliny mohou vázat na B7-2 nebo B7-1, v příslušném pořadí, s afinitou podobnou nebo vyšší než non-lidská donorová protilátka. Varianty mohou být připraveny různými způsoby, včetně mutagenese non-lidských donorových nebo akceptorových lidských řetězců.

Humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu

9999

• ·· ···· • ♦ · · · ♦9 • 9 9 9 99

9 9 9 999 ·9 • · · 9 9 99

999 99 99 99 999 mají vazebnou specificitu pro lidský B7-2 nebo B7-1 a patři mezi ně humanizované imunoglobuliny (včetně fragmentů), které mohou vázat determinanty B7-2 nebo B7-1. Ve výhodném provedeni má humanizovaný imunoglobulin podle předkládaného vynálezu alespoň jednu funkční charakteristiku myší HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky, jako je vazebná funkce (například mají specificitu pro B7-2 nebo B7-1, mají stejnou nebo podobnou epitopovou specificitu), a/nebo inhibiční funkce (například mají schopnost inhibovat vazbu buněk nesoucích CD28 nebo CTLA4 na B7-2 nebo B7-1 ligand). Tak mohou mít výhodné humanizované imunoglobuliny vazebnou specificitu myší HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky, epitopovou specificitu myší HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky (například mohou soutěžit s myší HF2.3D1 nebo 1F1, chimérickou HF2.3D1 nebo 1F1 protilátkou nebo humanizovanou HF2.3D1 nebo 1F1 protilátkou o vazbu na B7-2 nebo B7-1, v příslušném pořadí) a/nebo inhibiční funkci.

Vazebná funkce humanizovaného imunoglobulinů majícího vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1 může být detekována pomocí standardních imunologických metod, například pomocí testů monitorujících tvorbu komplexů mezi humanizovaným imunoglobulinem a B7-2 nebo B7-1 (například membránovou frakcí obsahující B7-2 nebo B7-1, nebo lidskou lymfocytární linií nebo rekombinantní hostitelskou buňkou obsahující nukleovou kyselinu exprimující B7-2 nebo B7-1).

Testy vazby a/nebo adhese nebo jiné vhodné metody mohou být také použity v postupech pro identifikaci a/nebo izolaci humanizovaných imunoglobulinů (například z knihovny) s požadovanou specificitou (například testy, které sledují adhesi mezi buňkami nesoucími B7-2 nebo B7-1 receptor a B7 molekulou a jiné vhodné metody).

• · ♦ ···

Imunoglobulinová část non-lidského původu pro použiti v předkládaném vynálezu obsahuje lehké řetězce, těžké řetězce a části lehkých a těžkých řetězců. Tyto imunoglobulinové části mohou být získány nebo odvozeny od imunoglobulinů (například de novo syntézou části) nebo mohou být připraveny a exprimovány nukleové kyseliny kódující imunoglobulin nebo jeho řetězec mající požadované vlastnosti (například vazbu na B7-2 nebo B7-1, podobnost sekvence). Humanizované imunoglobuliny obsahující požadované části (například vazebný region pro antigen, CDR, FR, C region) lidského nebo non-lidského původu mohou být produkovány za použití syntetických a/neb o rekombinantních nukleových kyselin pro přípravu genů (například cDNA) kódujících požadovaný humanizovaný řetězec. Pro přípravu části řetězce může být do požadované pozice vložen jeden nebo více stop kodonů. Například, sekvence nukleové kyseliny kódující nově navržené humanizované variabilní regiony mohou být připraveny pomocí metody PCR mutagenese použité pro změnu existujících DNA sekvencí (viz např. Kamman, M. et al., Nucl. Acids Res. 17: 5404 (1989)). PCR primery kódující nové CDR mohou hybridizovat na DNA templát dříve humanizovaného variabilního regionu, který je připraven podle stejného nebo velmi podobného lidského variabilního regionu (Sáto, K., et al., Cancer Research 53: 851-856 (1993)). Pokud není pro templát dostupná podobná DNA sekvence, může být nukleová kyselina obsahující sekvenci kódující sekvenci variabilního regionu konstruována ze syntetických oligonukleotidů (viz například Kolbinger, F., Protein Engineering 8: 971-980 (1993)). Sekvence kódující signální peptid může být také zapracována do nukleové kyseliny (například při syntéze, pomocí inserce do vektoru). Pokud je sekvence přirozeného signálního peptidů nedostupná, může být použita sekvence signálního peptidů z jiné protilátky (viz například Kettleborough, C.A., Protein Engineering, 4: 773-783 • · · « »·· » · · · , » · · ···· «»*· ··· ·· ♦· »· ··· (1991)) . Pomocí těchto metod, zde popsaných metod a jiných vhodných metod mohou být snadno připraveny varianty. V jednom provedení mohou být klonované variabilní regiony mutované a mohou být vybrány sekvence kódující varianty s požadovanou specificitou (například z fágové knihovny; viz například Krebber et al., US 5514548; Hoogengoom et al., WO 93/06213, publikováno 1.4.1993)).

Nukleové kyseliny a konstrukty obsahující nukleové kyseliny

Vynález se také týká izolovaných a/nebo rekombinantních (včetně například v podstatě čistých) nukleových kyselin obsahujících sekvence, které kódují humanizovaný B7-1 nebo B72 imunoglobulin, nebo lehký nebo těžký řetězec humanizovaného B7-1 nebo B7-2 imunoglobulinu podle předkládaného vynálezu.

Nukleové kyseliny označovaná jako izolované jsou nukleové kyseliny, které byly separovány od nukleových kyselin genomové DNA nebo buněčné RNA jejich zdroje (například jak se vyskytují v buňkách nebo ve směsi nukleových kyselin, jako je knihovna), a nukleové kyseliny získané zde popsanými metodami nebo jinými vhodnými metodami, včetně v podstatě čistých nukleových kyselin, nukleové kyseliny produkované chemickou syntézou, kombinací biologických a chemických metod, a rekombinantní nukleové kyseliny, které jsou izolované (viz např. Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res. 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. aj.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).

Nukleové kyseliny označované jako rekombinantní jsou nukleové kyseliny, které byly produkovány technikou rekombinantní DNA, včetně těch nukleových kyselin, které byly připraveny postupy spočívajícími v artificiální rekombinaci, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR) a/nebo klonování do

Λ Φ *		·♦	4» 4
• ·	··	•	•	« 4	•	•	• ·
•	•		•	• ·	4	•	4
•	«	• ·	4	444	• 4	•	•
•	•	4	4	4	•	•	4
MM		4 A	44	44		444

vektoru (například plasmidu) za použití restrikčních enzymů. Rekombinantní nukleové kyseliny jsou také ty, které vznikají v důsledku rekombinace probíhající přirozenými buněčnými mechanismy, ale které jsou vybrány po vložení nukleových kyselin navržených pro umožnění a zvýšení pravděpodobnosti požadované rekombinace do buněk.

Vynález se také týká izolovaných a/nebo rekombinantních nukleových kyselin obsahujících nukleotidové sekvence, které kódují humanizovaný HF2.3D1 nebo 1F1 imunoglobulin, též označovaný jako humanizovaný 3D1” nebo humanizovaný 1F1, v příslušném pořadí (například humanizovaný imunoglobulin podle předkládaného vynálezu, ve kterém je non-lidská část odvozena od myší HF2.3D1 nebo 1F1 monoklonální protilátky), nebo jeho řetězec. V jednom provedení obsahuje lehký řetězec tři regiony určující komplementaritu odvozené od lehkého řetězce HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky, a těžký řetězec obsahuje tři regiony určující komplementaritu odvozené od těžkého řetězce HF2.3D1 nebo 1F1 protilátky. Mezi takové nukleové kyseliny patří, například: (a) nukleová kyselina obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu těžkého řetězce humanizovaného HF2.3D1 nebo 1F1 imunoglobulinu (například SEQ ID NO: 5, viz obr. 2A, nebo SEQ ID NO: 25, viz obr. 7A); (b) nukleová kyselina obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce humanizovaného HF2.3D1 nebo 1F1 imunoglobulinu (například SEQ ID NO: 7, viz obr. 2B, nebo SEQ ID NO: 27, viz obr. 7B); (c) nukleová kyselina obsahující sekvenci kódující alespoň funkční část variabilního regionu lehkého nebo těžkého řetězce humanizovaného HF2.3D1 nebo 1F1 imunoglobulinu (například část dostačující pro vazbu humanizovaného imunoglobulinu obsahujícího řetězec na antigen). Z důvodů degenerace

V • to •

····

•	toto		• to
··	• ·	•	«	•	to
•	• ·	•	•	•	•
•	» · to	···	• ·	•
to ···	to · ··	•	to	to toto

• toto genetického kódu může být připraveno mnoho nukleových kyselin, které kóduji vybraný polypeptid. V jednom provedeni obsahuje nukleová kyselina nukleotidovou sekvenci variabilního regionu, jak je uvedena na obr. 2A a/nebo 2B, nebo na obr. 7A a/nebo 7B, včetně dvou řetězcových nebo jednořetězcových polynukleotidů. Izolované a/nebo rekombinantní nukleové kyseliny splňující tato kriteria mohou obsahovat nukleové kyseliny kódující sekvence identické se sekvencemi humanizované HF2.3D1 nebo humanizované 1F1 protilátky nebo její varianty, jak je popsáno výše.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro produkci humanizovaných imunoglobulinů majících vazebnou specificitu pro B7-1 nebo B7-2. Například může být nukleová kyselina (například DNA) kódující humanizovaný imunoglobulin podle předkládaného vynálezu vložena do vhodného konstruktu (například vektoru) pro další zpracování sekvencí nebo pro produkci kódovaného polypeptidu ve vhodných hostitelských buňkách.

Způsob přípravy humanizovaných imunoglobulinů majících specificitu pro B7-2 a/nebo B7-1

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy humanizovaného imunoglobulinu majícího specificitu pro B7-2 nebo B7-1. Humanizovaný imunoglobulin může být získán, například, expresí jedné nebo více rekombinantních nukleových kyselin kódujících humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-1 nebo B7-2 ve vhodných hostitelských buňkách.

Vynález také poskytuje konstrukty nebo expresní vektory vhodné pro expresi humanizovaného imunoglobulinu majícího • · • · · · · · · · • · ·· ······ · _Α£· ·····♦· ···· ··· ·· ·· ·· vazebnou specificitu pro B7-2 a/nebo B7-1. Konstrukty mohou být vloženy do vhodné hostitelské buňky a mohou být připraveny buňky, které exprimuji humanizovaný imunoglobulin podle předkládaného vynálezu, které mohou být kultivovány v kultuře. Vhodné hostitelské buňky mohou být prokaryotické, včetně bakteriálních buněk jako je E. coli, B. subtilis a jiné vhodné bakterie, nebo eukaryotické, jako jsou houby nebo kvasinky (například Pichia pastoris, Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), nebo jiné nižší eukaryotické buňky, a buňky vyšších eukaryotických organizmů, jako jsou hmyzí buňky (například Sf9 hmyzí buňky (WO 94/26087, 0'Connor, publikováno 24.11.1994)). Vhodné hostitelské buňky mohou být také rostlinné, z transgenních zvířat nebo savců (například COS buňky, NSO buňky, SP2/0, ovariální buňky čínského křečka (CHO), HuT 78 buňky, 293 buňky) (viz např. Ausubel, F.M. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley and Sons lne., 1993).

Hostitelské buňky, které produkují humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-2 a/nebo B71, mohou být produkovány následujícím způsobem. Například může být nukleová kyselina kódující celou nebo část kódující sekvence vybraného humanizovaného imunoglobulinů insertována do nukleokyselinového vektoru, například DNA vektoru, jako je plasmid, virus nebo jiná expresní jednotka. Existuje mnoho vektorů, včetně vektorů, které jsou uchovávány v jedné kopii nebo v mnoha kopiích, nebo které se integrují do chromosomu hostitelské buňky.

Vhodné expresní vektory mohou obsahovat mnoho složek, včetně, například, následujících složek: sekvenci rozpoznávající počátek replikace, selektovatelný markerový

gen, jeden nebo více kontrolních elementů pro expresi, jako je například transkripční kontrolní element (například promotor, zesilovač transkripce, terminátor), a/nebo jeden nebo více translačních signálů, signální sekvenci nebo vedoucí sekvence pro přesun do membrány nebo sekreci. V konstruktu může být signální sekvence dodána vektorem nebo jiným zdrojem. Pro řízení exprese mohou být použity transkripční a/nebo translační signály imunoglobulinu.

Pro expresi ve vhodné hostitelské buňce může být nutný promotor. Promotory mohou být konstitutivní nebo indukovatelné. Například může být promotor operativně navázán na nukleovou kyselinu kódující humanizovaný imunoglobulin nebo imunoglobulinový řetězec, takže řídí expresi kódovaného polypeptidu. Jsou dostupné různé vhodné promotory pro prokaryotické (například lac, tac, T3 a T7 promotory pro E. coli) a eukaryotické (například promotory kvasinkové alkoholdehydrogenasy (ADH) a SV40, CMV) hostitele.

Dále, expresní vektory obvykle obsahují selektovatelný markér pro selekci hostitelské buňky obsahující vektor a, v případě replikovatelných expresních vektorů, sekvenci rozpoznávající počátek replikace. Geny kódující produkty, které způsobují resistenci na antibiotika, jsou běžnými selektovatelnými markéry a mohou být použity v prokaryotických (například β-laktamasový gen (resistence na ampicilin) a Tet gen (resistence na tetracyklin)) a eukaryotických buňkách (například geny pro resistenci na neomycin (G418 nebo geneticin), gpt (kyselina mykofenolová), ampicilin a hygromycin). Markerový gen pro dihydrofolat-reduktasu umožňuje selekci pomocí methotrexatu v mnoha buňkách. Geny kódující genové produkty auxotrofních markérů hostitele (například LEU2, URA3 a HIS3) jsou často používány jako selektovatelné • · « · v · · · · * • · · ····· · markéry u kvasinek. Použití virových (například bakulovirových) nebo fágových vektorů a vektorů, které jsou schopné integrace do genomu hostitelských buněk, jako jsou retrovirové vektory, jsou také použitelné. Vynález se také týká buněk nesoucích tyto expresní vektory.

Nukleová kyselina (jedna nebo více) kódující těžké a lehké řetězce humanizovaného imunoglobulinM majícího vazebnou specificitu pro B7-2 nebo B7-1, nebo konstrukt (jeden nebo více) obsahující takovou nukleovou kyselinu, může být, například, vložena do hostitelské buňky způsobem vhodným pro danou hostitelskou buňku (například transformací, transfekcí, elektroporací, infekcí) tak, že nukleová kyselina je operativně navázaná na jeden nebo více expresních kontrolních elementů (například ve vektoru, v konstruktu vytvořeném v buňce buněčnými procesy, integrovaná v genomu hostitelské buňky). Hostitelská buňka může být kultivována za podmínek vhodných pro expresi (například za přítomnosti induktoru, vhodného media doplněného vhodnými solemi, růstovými faktory, antibiotiky, nutričními doplňky, atd.), za produkce kódovaného polypeptidu. Pokud je to žádoucí, může být kódovaný protein (například humanizovaná HF2.3D1 nebo 1F1 protilátka) izolována z hostitelských buněk, media nebo mléka. Tento proces zahrnuje expresi v hostitelských buňkách transgenního zvířete (viz např. WO 92/03918, GenPharm International, publikovaný 19.3.1992).

Mohou být produkovány fúzní proteiny, ve kterých je humanizovaný imunoglobulin nebo imunoglobulinový řetězec navázán na neimunoglobulinovou skupinu (například na skupinu, která se za přirozených okolností nevyskytuje v přírodě) na Nkonci, C-konci nebo uvnitř fúzního proteinu. Některá provedení mohou být připravena pomocí inserce nukleové kyseliny kódující • ·

imunoglobulinové sekvence do vhodného expresního vektoru, jako je pET vektor (například pET-15b, Novagen), fágového vektoru (např. pCANTAB 5E, Pharmacia) nebo jiného vektoru (např. pRIR2T Protein A fúzní vektor, Pharmacia). Vzniklý konstrukt může být vložen do vhodné hostitelské buňky za účelem exprese. Po expresi mohou být některé fúzní proteiny izolovány nebo přečištěny z buněčného lyzátu za použití vhodné afinitní matrice (viz např. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., ed., svazek 2, Suppl. 26, strana 16.4.1-16.7.8 (1991)) .

Terapeutické způsoby a prostředky

Existují dva typy T-lymfocytů: pomocné T-lymfocyty a cytotoxické T-lymfocyty. Pomocné T-lymfocyty mohou rozpoznávat antigen, který je vázán s hlavním histokompatibilním komplexem (MHC). Buňky prezentující antigen internalizuji antigen a reexprimují antigen s MHC molekulou. Po rozpoznání antigen dojde k sekreci cytokinů. Sekrece cytokinů aktivuje B-lymfocyty, cytotoxické T-lymfocyty, fagocyty a jiné buňky. Nicméně, sekrece cytokinů a buněčná proliferace vyžadují více než jen rozpoznání antigenu. Kompletní aktivace T-lymfocytů vyžaduje druhý signál označovaný jako ko-stimulační signál. Tyto kostimulačni signály slouží pro iniciaci, udržení a regulaci aktivační kaskády. Významná ko-stimulační dráha se nazývá B7:CD28/CTLA4 dráha.

B7:CD28/CTLA4 dráha zahrnuje dva ko-stimulační ligandy, B71 (CD80) a B7-2 (CD86). B7-1 a B7-2 ligandy, které jsou přítomné na buňkách prezentujících antigen, se váží na dva receptory na T-lymfocytech označované jako CD28 a CTLA4.

Exprese B7 polypeptidů, B7-1 (CD80) a B7-2 (CD86), je jemně • · ···· ···· · ♦ • · ······ • · ·· ······ ·

5(Ί ·····«· ···· ··· ·· ·· ·· regulována (Linsley, P.S. et al., Immunity 1: 793-801 (1994). Nestimulované buňky prezentující antigen obvykle neexprimují B7-1 a B7-2, s výjimkou dendritických buněk. Po aktivaci zvyšují dendritické buňky, epidermální Langerhansovy buňky, Blymfocyty a makrofágy expresi B7-2 a B7-1. Dále může být B7-2 exprimován na granulocytech a T-lymfocytech, a B7-1 na fibroblastech a T-lymfocytech (Reiser et al., New England J. of Med. 335: 18, 1369-1377 (1996)).

Při většině imunitních reakcí je B7-2 indukován dříve než B7-1 a ve větších koncentracích. B7-2 také ovlivňuje produkci interleukinu-4 (IL-4) a tvorbu pomocných T-lymfocytů 2. typu. B7 molekuly (B7-2 a B7-1) jsou také odpovědné za ko-stimulaci CD8 T-lymfocytů za nepřítomnosti CD4 T-lymfocytů, což může být užitečné při přípravě vakcín proti melanomu. B7 molekuly mohou ko-stimulovat přirozené zabíječe a γ/δ T-lymfocyty. Proto je ovlivnění B7 molekul významné pro protinádorovou a antimikrobiální imunitu.

B7:CD28/CTLA4 dráha se účastní na vzniku mnoha onemocnění, včetně infekčních onemocnění, astmatu, autoimunitních onemocnění, zánětlivých onemocnění, rejekce orgánových transplantátů nebo reakce štěpu proti hostiteli. Tato dráha se také účastní v profylaxi a mechanismech, které stimulují imunitní systém. Transfekce geny kódujícími ko-stimulátory, jako jsou B7 molekuly, jsou použitelné pro protinádorové a anti-virové vakcíny. B7 molekuly se také účastní na autoimunitních onemocněních, jako je systémový lupus erythematodes, diabetes mellitus, insulitis, arthritis, zánětlivá onemocnění střevní, zánětlivá dermatitis (psoriasis vulgaris a atopická dermatitida) a roztroušená sklerosa. (Reiser et al., New England J. of Med. 335 (18): 1369 (1996)). V souladu s tím se předkládaný vynález týká způsobů léčby • ♦ · · · onemocnění, jak jsou zde uvedena, které zahrnují podání imunoglobulinů, které se váží na B7-1 a/nebo B7-2.

Imunoglobuliny by měly být podány v terapeuticky účinných množstvích a, volitelně, s nosičem.

Léčbou jedince majícího onemocnění se rozumí minimalizace nebo zmírnění jednoho nebo více příznaků spojených s onemocněním. Léčba jedince s rejekcí transplantátu znamená minimalizaci nebo zmírnění jednoho nebo více příznaků spojených s rejekcí transplantátu (například horečky, ztráty funkce ledviny, odloučení ledviny, T-lymfocytárni/APC buněčnou rejekcí). Prevence onemocnění u jedince znamená prevenci výskytu jednoho nebo více příznaků onemocnění. Prevence rejekce transplantátu znamená snížení jedné nebo více imunitních reakcí spojených s takovou rejekcí transplantátu.

Proto může být modulování nebo ovlivnění úlohy B7 molekul použitelné při léčbě jedinců s uvedenými chorobami. Ovlivnění B7 molekul je také užitečné při léčbě jedinců s imunitními nebo autoimunitními nemocemi a poruchami, na kterých se účastní B7-1 a/nebo B7-2. Modulace B7-1 nebo B7-2 může být také použitelná pro léčbu onemocnění souvisejících s nebo ovlivnění IL-4 a/nebo tvorbou pomocných T-lymfocytů 2. typu. Tyto poruchy/onemocnění mohou být léčeny pomocí protilátky specifické pro B7-1 a/nebo B7-2. Výhodně je protilátkou humanizovaná protilátka specifická pro B7-2 nebo B7-1. Léčba těchto onemocnění může být usnadněna současným podáním antiB7-2 protilátky, anti-B7-l protilátky, včetně jejich chimérických a humanizovaných verzí, a/nebo protilátek k příslušným receptorům, CD28 a CTLA4.

Kromě zde popsaných onemocnění mohou být imunoglobuliny, které se váží na B7-1 a/nebo B7-2, podány jedinci • fr ······ • · · · ······ · • · · · · · · «··· «·· ·· ·· · · · s transplantovaným orgánem, tkání nebo buňkami. Inhibice B7 dráhy brání nebo redukuje rejekci transplantované tkáně, orgánu nebo buněk. Vynález se týká dlouhodobé (například v řádu dnů, měsíců, roků) léčby akutní a/nebo chronické rejekce transplantátu. K akutní rejekci transplantátu obvykle dochází během několika prvních týdnů po transplantaci, zatímco k chronické rejekci transplantátu dochází po prvních několika týdnech. Dávky anti-B7-l a anti-B7-2 protilátek jsou zde popsány.

Konkrétně se vynález týká způsobů léčby příjemce transplantátu nebo prevence rejekce transplantátu. Tyto způsoby zahrnují podání humanizované anti-B7-l a anti-B7-2 protilátky v množství dostatečném pro prevenci rejekce transplantátu. Transplantátem mohou být buňky, tkáně nebo orgány. Protilátky mohou být podány před a/nebo po transplantaci, nebo během transplantace. Protilátky se podají v dávkách například přibližně 1 mg/kg až přibližně 100 mg/kg. Konkrétně, protilátky se podají ve vyšších dávkách (například mezi přibližně 1 mg/kg a přibližně 25 mg/kg) v den transplantace a potom se podávají opakovaně v nižších dávkách po transplantaci (například jednou týdně v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a přibližně 5 mg/kg). Taková aplikace vede k významné redukci až úplné prevenci imunitní reakce směřující k rejekci transplantátu. Viz příklady 22 a 23.

Způsoby léčby také zahrnují současné podání humanizované anti-B7-l protilátky a/nebo humanizované anti-B7-2 protilátky se známými standardními léky (například s léky používanými pro modulování imunitní reakce u jedinců s transplantovaným orgánem, tkání nebo buňkami, a podobně). Lékem může být, například, methotrexat, imunosupresivní činidlo zastavující růst imunitních buněk nebo inhibující progresi buněčného cyklu (např. rapamycin), steroid (například prednison nebo jeho deriváty), inhibitor calcineurinu (například cyklosporin nebo FK506), inhibitor CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitor dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonista IL-2 receptoru (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) a jejich analogy, nebo léky používané pro léčbu rejekce transplantátu v budoucnosti. Zde uvedená data ukazují, že cyklosporin A, prednison a rapamycin účinkují stejně dobře v prevenci rejekce transplantátu, když je jakákoliv z těchto sloučenin podána s humanizovanou anti-B7-l a humanizovanou anti-B7-2 protilátkou. Podaná dávka těchto sloučenin je různá. Vyšší sérové koncentrace vedou k aplikaci nižších dávek a nižší sérové koncentrace vedou k aplikaci vyšších dávek. Například cyklosporin A může být podán v dávce od přibližně 150 ng/ml do přibližně 100 mg/ml (například 200300 ng/ml), prednison může být podán v dávce od přibližně 0,2 mg/ml do přibližně 2,0 mg/ml, methylprednison může být podán v dávce od přibližně 0,2 mg/ml do přibližně 2,0 mg/ml a rapamycin může být podán v dávce od přibližně 0,5 mg/ml do přibližně 2,0 mg/ml, když jsou tyto sloučeniny podány s humanizovanou anti-B7-l a humanizovanou anti-B7-2 protilátkou.

Vynález také zahrnuje ex vivo metody pro transplantování buněk (například krevních buněk nebo složek krve, nebo kostní dřeně) jedinci, který potřebuje takovou léčbu. Jedincem potřebujícím takovou transplantaci je jedinec, který má onemocnění léčitelné transplantací (jako jsou, například, proliferativní onemocnění (například leukemie, lymfomy a nádory), anemie (například srpkovitá anemie, thalasemie a aplastická anemie), vrozené metabolické vady, kongenitální · ·♦<· · ♦ · • «. · ····»· · · • · · · · · · ·*·· ··· ·· 9· t* ··· imunodeficience a myelodysplastický syndrom). Způsob zahrnuje získáni buněk od dárce. Obvykle obsahuje dárcovská kostní dřeň jak zralé, tak nezralé lymfocyty. Buňky krve od dárce mohou být kromě buněk kostní dřeně kmenové buňky nebo nezralé krevní buňky.Buňky dárce jsou výhodně, ale ne nezbytně, od jedince, který má podobné charakteristiky jako pacient/příjemce (například odpovídá kostní dřeň dárce kostní dřeni pacienta). Charakteristikami, které jsou analyzovány pro určení toho, zda dárce odpovídá pacientovi, jsou MHC třídy 1 a 2 (například HLA-A, HLA-B a/nebo HLA-DR). Způsob zahrnuje kontaktování buněk (například kostní dřeně nebo jiných složek krve) s imunoglobulinem specifickým pro B7-1 a/nebo imunoglobulinem specifickým pro B7-2 a buňkami příjemce (například lymfocyty od pacienta) za zisku směsi, která se označuje jako ošetřené buňky. Množství použité protilátky závisí na počtu přítomných buněk. Větší množství buněk vyžaduje více protilátky a menší množství buněk vyžaduje menší množství protilátky. Zde popsané pokusy využívají 10 mg/ml každé protilátky, která je přítomna v 10-100-násobném nadbytku. Množství anti-B7-l a/nebo anti-B72 protilátky použité v tomto provedení by mělo být dostatečné pro indukci anergie, například se jedná o množství přibližně 0,01 až přibližně 10 mg/ml. Buňky dárce, imunoglobuliny a buňky příjemce jsou v kontaktu po dobu dostatečnou pro indukci tolerance (například přibližně 1-96 hodin, výhodně 36-48 hodin). Indukce tolerance (například anergie) označuje chybění reaktivity na antigen, které bylo indukováno ošetřením B7-1 a/nebo B7-2 protilátkami, takže T-lymfocyty dále nereagují adekvátně s antigenem. Viz příklad 18. Buňky příjemce (například lymfocyty periferní krve (PBL) nebo lymfocyty, které exprimují antigeny třídy I (MHC-I))) se ozáří pro prevenci dělení buněk. Místo buněk příjemce se mohou použít tkáně, orgány nebo upravené buňky, které exprimují MHC antigeny třídy I, a B7-1 a/nebo B7-2 molekuly. Způsob dále • to to to to to to <

• * · · »····· · • ·« · « · • to toto· ·· · to ·* zahrnuje aplikaci směsi /například ošetřených buněk) nebo ošetřené kostní dřeně pacientovi. Tento způsob léčby slouží pro prevenci reakce štěpu proti hostiteli. Buňky v ošetřené kostní dřeni se stanou tolerantními k alloantigenům příjemce, což redukuje nebo eliminuje reakci štěpu proti hostiteli a zlepší přijetí dárcovské dřeně (například kmenových buněk). V souladu s tím zahrnují způsoby podle předkládaného vynálezu léčbu nebo prevenci reakce štěpu proti hostiteli. Anti-B7-1 a anti-B7-2 protilátky redukují rejekci dárcovské kostní dřeně nebo dárcovských buněk u příjemce. Nicméně, tyto metody mohou redukovat rejekci bez významného narušení schopnosti pacienta detekovat a rozvíjet imunitní reakci na jiné cizorodé buňky a antigeny. Proto tyto metody umožňují specifickou transplantaci a umožňují rejekci cizorodých antigenů bez ohrožení transplantátu. Viz příklady provedení vynálezu.

Vynález se také týká způsobů pro snížení protilátkové odpovědi na antigen u jedince pomocí podání humanizované antiB7-1 a/nebo humanizované anti-B7-2 protilátky jedinci. Protilátky mohou být podány za přítomnosti antigenů. Antigenem mohou být růstové faktory, srážecí faktory, cytokiny, chemokiny, vehikula genové terapie nebo hormony. Konkrétně může antigenem být například tetanický toxoidu, faktor VIII, faktor IX, insulin, růstový hormon nebo vektor pro přenos genu. Antigeny mohou být ve formě polypeptidů nebo ve formě nukleových kyselin (jak je tomu například při genovém přenosu pomocí adeno-asociovaných virů, retrovirů, holých DNA vektorů atd.). Potlačení protilátkové odpovědi na tyto antigeny je užitečné při léčbě mnoha onemocnění, například u hemofiliků, u kterých se rozvíjí protilátkové odpověď na podávané faktory VIII nebo IX, což vede k poruchám srážlivosti krve. Popsaná data ukazují, že podání účinných dávek humanizované anti-B7-l nebo humanizované anti-B7-2 protilátky společně s modelovým

Φ

Φ0Φ0 ·♦ φ· ··0 • ♦ · ♦ 9 ·· 0 · 0 0 0 ·· * · 0·0*0φ 00

0 0 0 00

0· 0 0 0* «00 antigenem, tetanickým toxoidem, inhibuje protilátkovou odpověď na tetanický toxoid. Protilátky mohou být pro dosažení požadovaného efektu (například potlačení protilátkové reakce) podány společně s antigenem nebo krátce před nebo po podání antigenů. Humanizované anti-B7-l a humanizované anti-B7-2 protilátky jsou podány během přibližně 3 týdnů (poločas protilátky) okolo podání antigenů, například v období přibližně 14 dnů před a 2 dnů po podání antigenů. Humanizovaná anti-B7-l a humanizovaná anti-B7-2 protilátka jsou podány v dávce od přibližně 0,01 mg/kg do přibližně 10 mg/kg.

Vynález se týká farmaceutických prostředků obsahujících humanizovanou anti-B7-l a/nebo humanizovanou anti-B7-2 protilátku, s nebo bez nosiče. Výhodným provedením je podání B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobulinů v injekční formě nebo ve formě kapsle. Konkrétně, injekční formou mohou být intravenosní nebo podkožní injekce. Termín farmaceuticky přijatelný nosič nebo nosič označuje jakoukoliv obecně přijatelnou přísadu nebo přípravek pro podání léku, který je relativně inertní a netoxický. Příklady nosičů jsou uhličitan vápenatý, sacharosa, dextrosa, mannosa, albumin, škrob, celulosa, silikagel, polyethylenglykol (PEG), sušené odstředěné mléko, rýžová moučka, stearan horečnatý a podobně. Vhodné přípravky a další nosiče jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydání, Mack Publ. Co.,, Easton, PA).

Vhodnými nosiči (například farmaceutickými nosiči) také jsou, například, sterilní voda, roztoky solí (jako je například Ringerův roztok), alkoholy, polyethylenglykoly, želatina, karbohydráty jako je laktosa, amylosa nebo škrob, stearan horečnatý, talek, kyseliny křemičité, viskózní parafin, estery mastných kyselin, hydroxymethylcelulosa, polyvinylpyrolidon, atd. Takové přípravky mohou být • · • · · · · · · · f · • · ····♦· * · · · ··♦··· · <7 «····'· ···· ··· ·· ·· ·♦ sterilizované a pokud je to vhodné, tak smísené s pomocnými činidly, například s kluznými činidly, konzervačními činidly, stabilizačními činidly, smáčivými činidly, emulgačními činidly, solemi pro ovlivnění osmotického tlaku, pufry, barvivý a/nebo aromatickými substancemi a podobnými činidly, které nereagují nežádoucím způsobem s imunoglobulinem. Také mohou být v případě potřeby smíšeny s jinými aktivními substancemi, například inhibitory enzymů, pro redukci metabolické degradace. Nosič (například farmaceuticky přijatelný nosič) je výhodně, ale ne nezbytně, přidán k imunoglobulinu.

Pro parenterální aplikaci jsou zejména vhodné injekční, sterilní roztoky, výhodně olejové nebo vodné roztoky, stejně jako suspenze, emulze nebo implantáty, včetně čípků. Mezi nosiče pro přípravky pro parenterální podání patří vodné roztoky dextrosy, salinický roztok, čistá voda, ethanol, glycerol, propylenglykol, podzemnicový olej, sezamový olej, blokové polymery polyoxyethylenu-polyoxypropylenu a podobně. Ampule, fioly a injekční stříkačky jsou vhodnými dávkovými j ednotkami.

Imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány intravenosně, intramuskulárně, podkožně, orálně, nasálně, inhalací, implantací, injekcí nebo ve formě čípků. Prostředky mohou být podány v jedné dávce nebo opakovaně během určité doby, za účelem dosažení požadovaného efektu.

Skutečné účinné dávky imunoglobulinu se liší podle konkrétního použitého imunoglobulinu, konkrétního prostředku, způsobu podání a věku, hmotnosti, stavu pacienta, a závažnosti onemocnění. Jak bylo uvedeno, účinné množství B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobulinu je množství, které inhibuje nebo moduluje • A A ·· ·· ·· ♦ • A·· · · A · « · A · ♦ A ···«♦·«

9 9 9 9 999 9 9 9 9 co #»·♦·«·♦ •JO · A A * A · · · · 9 9 9 9 99 9

B7/CD28/CTLA4 dráhu. Dávky pro určitého pacienta jsou zde popsány a mohou být určeny odborníkem v oboru za použití běžných způsobů (například pomocí vhodných, obvyklých farmakologických protokolů).

Podání humanizované B7-1 protilátky, humanizované B7-2 protilátky a/nebo jiných léků může být simultánní nebo sekvenční. Tyto sloučeniny nebo prostředky mohou být podány současně nebo před nebo po sobě. Termín současné podání, jak je zde použit, znamená to, že humanizovaný B7-1 a/nebo B7-2 imunoglobulin a/nebo jiný prostředek jsou podávány v intervalech za účelem léčby zde popsaných onemocnění nebo indukce tolerance (mezi tyto prostředky patří například, methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40-dráhy (například anti-CD40 protilátky, protilátky proti ligandu CD40 a malé molekuly inhibující CD40 dráhu), inhibitory dráhy rejekce transplantátu (například mykofenolat mofetil (MMF)), antagonisté IL-2 receptorů (například Zeonpax® od Hoffmann-La Roche lne., a Simulet od Novartis, lne.) a jejich analogy). Způsoby podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny sekvencí, ve které jsou podávány protilátky nebo prostředky, pokud jsou podávány v intervalech dostatečných pro dosažení požadovaného efektu.

Vynález se také týká způsobů pro stanovení přítomnosti, nepřítomnosti nebo množství B7-1 nebo B7-2 pomocí humanizovaných anti-B7-l nebo B7-2 protilátek, v příslušném pořadí. Přítomnost nebo nepřítomnost B7-1 nebo B7-2 může být detekována v testu (například ELISA, radioimunotestu (RIA), FACS nebo imunohistochemicky). Testem může být přímá detekce nebo nepřímá detekce (například kompetitivní test).

Při stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti B7-2 nebo B7-1 φ · · φ · φ φφφ φ φ • · φ · φ φ φ • · φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ ·· φφ φ ve vhodném vzorku za použití ELISA testu způsob zahrnuje smísení vhodného vzorku s prostředkem obsahujícím humanizovanou nebo myši anti-B7-2 nebo B7-1 protilátku jako detekční činidlo (například biotinylovanou anti-B7-2 nebo B7-1 mAb a HRP-streptavidin, nebo HRP konjugovanou anti-B7-2 nebo B7-1 mAb) a přidání pevného nosiče (například mikrotitrační plotny) obsahujícího navázanou protilátku pro zachycení antiB7-2 nebo B7-1 (přímé nebo nepřímé). Detekční protilátka se může vázat na různé B7-2 nebo B7-1 epitopy a po rozpoznání zachycovací protilátkou dojde - za vhodných podmínek - ke tvorbě komplexu mezi anti-B7-2 nebo anti-B7-l protilátkou a B7-2 nebo B7-1, v příslušném pořadí. Způsob dále zahrnuje stanovení tvorby komplexů ve vzorku.

Přítomnost B7-2 nebo B7-1 může být také stanovena pomocí radioimunotestu nebo fluorescenčního testu. Například může být přítomnost B7-2 nebo B7-1 hodnocena testem imunitní vazby, který zahrnuje získáni vzorku, kontaktování vzorku s prostředkem obsahujícím anti-B7-2 nebo anti-B7-l protilátku (například humanizovanou nebo myší anti-B7-2 nebo B7-1 protilátku obsahující radioaktivní nebo fluorescentní značkovací činidlo; nebo humanizovanou nebo myší anti-B7-2 nebo B7-1 protilátku obsahující vazebné místo pro druhou protilátku obsahující radioaktivní nebo fluorescentní značkovací činidlo), výhodně v množství, které přesahuje množství nutné pro vazbu na B7-2 nebo B7-1, za podmínek vhodných pro tvorbu značených komplexů. Způsob dále zahrnuje stanovení (detekci nebo měření) tvorby komplexů ve vzorku. Podobně může být přítomnost nebo množství B7-1 nebo B7-2 určeno pomocí fluorescencí aktivovaného třídění buněk (FACS) nebo histochemickou analýzou tkání, za použití humanizovaných anti-B7-l nebo B7-2 protilátek podle předkládaného vynálezu.

• ·

Příklady provedeni vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen následujícími příklady, které nijak neomezují jeho rozsah.

Příklad 1: Klonování a sekvencování cDNA variabilního regionu myší 3D1 cDNA variabilního regionu lehkého a těžkého řetězce myší 3D1 (též označované jako HF2.3D1) byly klonovány z mRNA izolované z hybridomových buněk za použití zakotvená PCR (Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)). Použité 5' primery se tepelně navázaly na poly-dG koncovky přidané k cDNA a 3' primery se tepelně navázaly na konstantní regiony.

Amplifikované genové fragmenty se potom insertovaly do plasmidu pUC18. Nukleotidové sekvence pro V_L a V_H cDNA byly určeny z několika nezávislých klonů. Pro těžký řetězec byla identifikována jedna jedinečná sekvence, typická pro variabilní region myšího těžkého řetězce. Pro lehký řetězec byly identifikovány dvě jedinečné sekvence, obě homologické se sekvencemi variabilního regionu myšího lehkého řetězce. Nicméně, jedna sekvence nebyla funkční z důvodu chybění nukleotidu, které způsobilo posun čtecího rámce v místě J-V spojení a tato sekvence byla identifikována jako neproduktivní alela. Druhá sekvence byla typická pro funkční variabilní region myšího kappa řetězce. cDNA sekvence variabilního regionu těžkého řetězce a funkčního lehkého řetězce a translatované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 1A-1B. Myší V_L sekvence náleží do Kabatovy podskupiny I myšího kappa řetězce. Myší V_H sekvence náleží do Kabatovy podskupiny II(A) těžkého řetězce.

Příklad 2: Návrh variabilních regionů humanizovaného 3D1 ··

Pro zachováni vazebné afinity myší protilátky v humanizované protilátce byl použit postup podle Queena a kol. (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989), US patenty č. 5585089 a 5693762, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti). Volba zbytků pracovního rámce může být zásadní pro zachování vazebné afinity. V zásadě může sekvence pracovního regionu z jakékoliv lidské protilátky sloužit jako templát pro přenos CDR; nicméně, bylo prokázáno, že prosté nahrazení CDR v takovém pracovním regionu může vést k významné ztrátě vazebné afinity pro antigen (Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 17: 217 (1992)). Č9m více je lidská protilátka homologická k původní myší protilátce, tím méně je pravděpodobné, že lidský pracovní rámec vnese změny do myších CDR, které sníží afinitu. Podle homologie sekvence byla I2R vybrána pro dodání pracovního regionu pro těžký řetězec humanizované 3D1 a H2F pro dodání variabilního regionu lehkého řetězce humanizované 3D1. Manheimer-Lory, A., et al., J. Exp. Med. 174(6): 1639-52 (1991). jiné vysoce homologické lidské protilátkové řetězce jsou také vhodné pro dodání pracovního regionu humanizované protilátky, zejména kappa lehké řetězce z lidské podskupiny 4 a těžké řetězce z lidské podskupiny 1, jak jsou definovány Kabatem.

Pro dodáni sekvencí pracovního regionu se obvykle vybírá těžký a lehký řetězec ze stejné lidské protilátky, aby se snížila možnost inkompatibility při sestavování obou řetězců. I2R protilátka vykazuje vysokou homologii s těžkým a lehkým řetězcem 3D1 a proto byla vybrána pro pracovní region pro prvotní model humanizované protilátky. Variabilní region lehkého řetězce 3D1 nicméně vykazuje významně vyšší homologii s pracovním regionem H2F než s jakýmkoliv jiným, včetně I2R.

··

Proto byla H2F vybrána pro dodáni pracovního rámce pro variabilní region lehkého řetězce humanizované 3D1, zatímco I2R byla vybrána pro dodání pracovního regionu pro variabilní region těžkého řetězce.

Počítačové programy ABMOD a ENCODE (Levitt et al., J. Mol. Biol. 168: 595 (1983)) byly použity pro konstrukci molekulového modelu variabilní domény 3D1, který byl použit pro lokalizaci aminokyselin v pracovním regionu 3D1, které jsou dosti blízko k CDR pro to, aby s nimi mohly potenciálně interagovat. Pro návrh variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce 3D1 byly CDR z těžkého řetězce myší 3D1 přeneseny na pracovní regiony těžkého řetězce lidské I2R a CDR z lehkého řetězce myší 3D1 byly přeneseny na pracovní regiony lehkého řetězce lidské H2F. V pozicích pracovních regionů, kde počítačový model naznačil významný kontakt s CDR, byly aminokyseliny z myší protilátky substituovány za původní aminokyseliny lidského pracovního regionu. Pro humanizovanou 3D1 bylo toto provedeno ve zbytcích 27, 30, 48, 67, 70 a 72 těžkého řetězce a ve zbytku 22 lehkého řetězce. Dále, zbytky pracovního regionu, které se vyskytovaly pouze vzácně ve svých pozicích v databázi lidských protilátek byly nahrazeny konvenčními aminokyselinami v těchto lidských pozicích. Pro humanizovanou 3D1 bylo toto provedeno ve zbytku 113 těžkého řetězce a ve zbytku 3 lehkého řetězce.

Sekvence variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce humanizované 3D1 protilátky jsou uvedeny na obr. 2A-2B. Nicméně, mnoho z potenciálních kontaktních zbytků pro CDR je vhodných pro substituce za jiné aminokyseliny, které mohou zachovávat významnou vazebnou afinitu protilátky pro antigen. Tabulka 1 uvádí čísla pozic v pracovních regionech, ve kterých mohou být vhodné alternativní aminokyseliny (LC = lehký řetězec; HC = těžký řetězec). Pozice uvedená v tabulce je pořadí aminokyseliny od první aminokyseliny zralého řetězce, která je označena dvojitým podtržením (obr. 2A-2B). Například, pozice LC-22 je dvacátá druhá aminokyselina od dvojitě podtržené kyseliny asparagové, D (nebo čtyřicátá druhá aminokyselina od start kodonu).

Tabulka 1: Aminokyselinové substituce a/nebo alternativy

Pozice	Humanizovaná 3D1	Alternativy
LC-22	S	N
HC-27	Y	G
HC-30	T	S
HC-48	I	M
HC-67	K	R
HC-68	A	V
HC-70	M	I
HC-72	V	A

Obdobně, mnoho zbytků pracovního regionu, které nejsou v kontaktu s CDR v lehkém a těžkém řetězci humanizované 3D1, může být substituováno aminokyselinami z příslušných pozic pracovních regionů I2R a H2F, jiných lidských protilátek, myší 3D1 protilátky nebo jiných myších protilátek, bez významné ztráty afinity nebo neimunogenicity humanizované protilátky. Tabulka 2 uvádí čísla dalších pozic v pracovním regionu, ve kterých mohou být vhodné alternativní aminokyseliny.

Tabulka 2: Aminokyselinové substituce a/nebo alternativy v pracovním regionu

Pozice	Humanizovaná 3D1	Alternativy
LC-3	V	Q
HC-113	T	I

Výběr různých alternativních aminokyselin může být použit pro přípravu verzí humanizované 3D1, které mají různé kombinace afinity, specificity, non-imunogenicity, snadnosti výroby, a jiných žádoucích vlastností. Příklady uvedené v tabulkách jsou proto pouze ilustrativní, nikoliv limitující.

Příklad 3: Příprava humanizované 3D1

Po navržení aminokyselinové sekvence humanizovaného variabilního regionu se připravily geny kódující tyto sekvence, včetně signálních peptidů, sestřihových donorových signálů a vhodných restrikčních míst (obr. 2A-2B). Geny pro variabilní region lehkého a těžkého řetězce byly konstruovány a amplifikovány za použití překrývajících se syntetických oligonukleotidů velikosti od přibližně 65 do 85 baží (viz He et al., J. Immunol. 160: 1029 (1998)). Oligonukleotidy byly párově tepelně zpracovány a prodlouženy pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerasy I, za zisku čtyř dvouřetězcových fragmentů. Získané fragmenty byly denaturovány, tepelně zpracovány a prodlouženy Klenowovým fragmentem, za zisku dvou fragmentů. Tyto fragmenty byly znovu denaturovány, tepelně zpracovány a prodlouženy, za zisku kompletního genu. Získaný produkt byl amplifikován polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Taq polymerasy, byl přečištěn na gelu, tráven Xbal, opět přečištěn na gelu a subklonován do Xbal místa pVk pro expresi lehkého řetězce a pVg4 nebo pVg2.M3 pro expresi těžkých řetězců. pVk vektor pro expresi kappa lehkého řetězce byl popsán dříve (viz Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)). pVg4 vektor pro expresi γ4 těžkého řetězce byl připraven nahrazením Xbal-BamHI fragmentu pVgl obsahujícího gen pro konstantní region γΐ (viz Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)) s přibližně 2000 bp fragmentem genu pro konstantní region lidského g4 (Ellison and Hood, Proč. Nati.

·«	•	*»α		·<		•
• ·	··	•	•	• ·	• ·	• ·
•		•	•	• ·	•	•	•
	•	t ·	•	···	• ·	•	•
•	•	•	•	•	•	•	•
	···	··		··		·«·

Acad. Sci. USA 79: 1984 (1982)), který sahá od HindlII místa před ChI exonem γ4 genu po 27 0 bp po Nsil místu po Ch4 exonu genu. pVg2.M3 vektor pro expresi γ2 těžkého řetězce byl popsán v Cole et al., J. Immunology 159: 3613 (1997). pVg2.M3 je mutovaný z lidského přirozeného IgG2 nahrazením aminokyselin Val a Gly v pozicích 234 a 237 Ala. Tato varianta má sníženou interakci s Fc receptory a proto má minimální efektorovou protilátkovou aktivitu.

Struktura konečných plasmidů byla potvrzena sekvencováním nukleotidů a restrikčním mapováním. Všechny úpravy DNA byly provedeny standardními způsoby známými odborníkům v oboru.

Dvě humanizované 3D1, IgG4 a IgG2.M3, byly připraveny pro srovnávací testy. Při konstrukci buněčné linie produkující humanizovanou 3D1 (IgG4 nebo IgG2.M3) byly plasmidy pro lehký řetězec a příslušný těžký řetězec transfektovány do myší myelomové buněčné linie Sp2/O-Agl4 (ATCC CRL 1581). Plasmidy byly také transfektovány do CHO buněk za použití metod známých v oboru. Před transfekcí byly plasmidy obsahující lehký a těžký řetězec linearizovány za použití restrikčních endonukleas. Kappa řetězec a γ2 řetězec byly linearizovány za použití FspI; γ4 řetězec byl linearizován za použití BstZ17I. Přibližně 20 Mg plasmidů pro lehký a těžký řetězec bylo transfektováno do 1 χ 10⁷ buněk v PBS. Transfekce byla provedena elektroporací za použití Gene Pulser přístroje (Bio Rad) při 360 V a kapacitance 25 MFD, podle návodu výrobce. Buňky z každé transfekce byly vloženy na čtyři 96-jamkové tkáňové kultivační plotny a po dvou dnech se přidalo selekční medium (DMEM, 10% FCS, lxHT doplněk (Sigma), 0,25 mg/ml xanthinu, 1 Mg/ml kyseliny mykofenolové).

ί • · · · · · · · • ♦ · · ······ ·

Po přibližně 2 týdnech se vzniklé klony testovaly na produkci protilátek ELISA testem. Protilátka z klonu s vysokou produkcí se připravila kultivací buněk do konfluence v správném mediu (DMEM s 10% FCS), potom nahrazením media bezsérovým mediem (Hybridoma SMF); Gibco) a kultivací v kultuře do dosažení maximálního titru protilátek. Supernatant kultury se potom zpracoval na protein Asepharosové koloně (Pharmacia); a protilátka se eluovala 0,1 M glycinem, 100 mM NaCl, pH 3, neutralizovala se a potom se odebrala do fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS). Čistota protilátky se analyzovala na akrylamidovém gelu a její koncentrace se určila odečtem při OD28CU za předpokladu, že 1,0 mg protilátky má při OD280 hodnotu absorbance 1,4.

Příklad 4: Afinita humanizované anti-B7-2 protilátky

Test kompetitivní vazby

Relativní afinity myší a humanizované 3D1 protilátky pro B7-2 antigen byly stanoveny testem kompetitivní vazby. Trojnásobná sériová ředění neznačené humanizované nebo myší 3D1 protilátky byla smísena s radioaktivním jodem značenou myší 3D1 protilátkou (40000-5000 cpm na test v PBS obsahujícím 2% fetální telecí sérum).

Potom se přidalo 1 x 10⁵ CHO buněk exprimujících na povrchu rhB7-2 (CHO/hB7-2) a směs (v celkovém objemu 200 μΐ) se inkubovala po dobu 2 hodin při 4 °C za jemného třepání. Suspenze buněk-protilátek se potom přenesla do Sarstedt mikrozkumavek (č. 72.702) obsahujících 100 μΐ 80% dibutylftalatu-20% olivový olej. Po odstředění na mikroodstředivce se Sarstedt zkumavky vložily na několik minut do suchého ledu. I navázaný na buňky se určil připevněním »· · · · · · · • · · · *····· · • · · · · · · ···· ··· ·· e· ·· · konců každé zkumavky (obsahující buněčnou peletu) do scintilačni fioly a odečtem v gamma-čítači. Určily se hodnoty volné a navázané radioaktivity a poměr se zanesl do grafu proti koncentracím neaktivních kompetičních protilátek způsobem podle Berzofsky a Berkower (J.A. Berzofsky and I.J.Berkower, ve Fundamental Immunology, 9. vydání, W.E. Paul), Raven Press (New York), 595 (1984)).

Buněčná linie

Rekombinantní linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO) exprimující hB7-2 na svých povrchových membránách byla klonována z buněk transfektovaných B7-2 cDNA sekvencí a G418 resistencí. Exprese hB7-2 na povrchu CHO buněk během mnoha pasáží pod selekčním tlakem byla potvrzena pomocí myších antiB7-2 protilátek a FACS analýzy.

Příprava anti-hB7 mAb značených ¹²⁵I a jejich charakterizace

Anti-hB7 protilátky byly značeny ¹²⁵I reakcí s ¹²⁵I-BoltonHunterovým činidlem podle návodu výrobce (Amersham Corp., Arlington Hts, IL). Protein byl separován od volného činidla pomocí NAP-25 kolony. HPLC kolona s vylučováním podle velikosti byla použita pro potvrzení toho, že protilátky jsou intaktní a neagregovaly a pro měření koncentrace proteinu proti standardům připraveným z neznačené protilátky. Značení typicky vedlo k 4 až 8 μ^ na μρ proteinu, neboli přibližně 3060% protilátky bylo označeno.

Výsledky

Graf kompetitivní vazby je uveden na obr. 3. Každý bod představuje průměr ze tří měření. Výsledky ukazují, že jak humanizovaná IgG4, tak humanizovaná IgG2.M3 anti-lidský B7-2 protilátka mají podobnou vazebnou afinitu jako myší antilidský B7-2 protilátka (přibližně 1 x 10⁹ M¹) , což naznačuje, že nedošlo ke ztrátě afinity pro B7-2 při humanizaci 3D1. Jak myší, tak humanizované anti-B7-2 rozpoznávaly hB7-2 exprimovaný na povrchu buněk s vysokou afinitou.

Příklad 5: Přímá vazba humanizovaných anti-B7 mAb na CHO/hB7 buňky

Buněčný vazebný test

Vazebné testy se zahájily umístěním buněk na 96-jamkové tkáňové kultivační plotny v koncentraci 10000 CHO/hB7-2 buněk na jamku. O dva dny později se adherující buňky jemně promyly pufrem obsahujícím odtučněný sušený mléčný protein (pro blokování nespecifické vazby) a azid sodný (pro prevenci internalizace protilátek buňkami). Pro testy přímé vazby se

ΊOC 1OC

I-značené anti-B7 protilátky ( I-myší anti-lidský B7-2; 826 cpm/fmol; humanizovaná anti-lidský B7-2, 883 cpm/fmol) sériově ředily v testovacím pufru a inkubovaly se s buňkami přes noc, což umožnilo vazbu protilátek na B7 na povrchu buněk a ustanovení rovnováhy. Nenavázané protilátky se opatrně vypláchly a navazane protilátky značené I se detekovaly za použití I scintilacniho a fotodetektorového systému. Nespecifická vazba na CHO buňky se určila pro každé ředění stejným způsobem, ale za použití buněk exprimujících B7-1 molekulu, která není rozpoznávána testovanými protilátkami.

Výsledky

Graf přímé vazby je uveden na obr. 4. Data, průměry ze tří jamek s odečtenou nespecifickou vazbou, se upravila pro • * · · · · · · • · · · ······ · • · · · · · ♦ r··· «· · ·· ·· ·· · hyperbolickou saturační křivku za použití Graphpad PrismJ softwaru. K_D protilátek určené jako koncentrace odpovídají polovině maximální vazby ukázaly, že myší a humanizované antiB7-2 mAb mají podobné a vysoké vazebné afinity (přibližně 10 ⁹m) pro B7-2. Jak myší, tak humanizované anti-B7-2 rozpoznávaly hB7-2 exprimovaný na povrchu buněk s vysokou afinitou.

Příklad 6: Vazba humanizovaných anti-B7-2 mAb na proteinové ligandy

Určeni afinity pomoci BIACORE®

BIACORE® biosenzor (BIACORE®, Uppsala, Švédsko) byl použit pro určeni kinetik vazby myši a humanizované anti-B7-2 protilátky na lidský B7-2g. Lidský B7-2g (hB7-2g) byl imobilizován na dextranové matrici čipu BIACORE® senzoru. Humanizovaná a myši anti-B7-2 byly testovány v koncentracích 200, 100, 50 a 20 nM. Každé ředění bylo testováno 4-krát na pokus a celkem byly provedeny tři pokusy. Vazba protilátky proti lidskému B7-2 byla měřena v reálném čase povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR) a globální analýza byla provedena za použití modelu bivalentní vazby v BIA vyhodnocovacím softwaru (verze 3.1). Pro každý vzorek byla stanovena asociační (k_a) , disociační (k_d) a rovnovážná disociační konstanta (K_D) .

Příprava hB7-2 Ig

Solubilní forma hB7-2Ig byla získána z kultivačního media CHO buněk zpracovaných tak, aby secernovaly tento protein. Rekombinantní hB7-2Ig byl získán fúzí DNA kódující sekvence odpovídající extracelulární doméně B7-2 genu na pantové-CH2CH3 domény těžkého řetězce lidského IgGl. Rekombinantní hB770 • · · · · «· ·· · • «·· · · · · ♦ *·· • · · · · · ··· • · ·· ······ · · • · · · · · · · ···· ··· ·« ·· <· ···

2Ig byl přečištěn z kultivačního media pomocí proteinu A.

Výsledky

Tabulka 3 uvádí průměrné hodnoty získané pro myší a humanizovanou anti-lidský B7-2 protilátku. Vazebné konstanty pro myší a humanizovanou anti-B7-2 mAb určené SPR ukázaly, že myši a humanizovaná forma anti-B7-2 mAb jsou podobné a že myší anti-B7-2 mAb má o něco vyšší vazebnou konstantu pro imobilizovaný hB7-2Ig než humanizovaná anti-B7-2 mAb.

Přibližně 2,8-násobně vyšší afinita vypočítaná pro myší antiB7-2 mAb může představovat reálný, ale jemný rozdíl mezi myší a humanizovanou anti-B7-2 mAb, který byl vnesen při procesu humanizace. Jinou možností jsou technické odlišnosti při přípravě, zpracování a analýze těchto protilátek. Jak je uvedeno v příkladech 4, 5 a 7, nebyl tento rozdíl pozorován pro vazebnou afinitu humanizované hB7-2 v buněčných testech.

Tabulka 3: Afinita anti-B7-2 mAb určená pomocí BIACORE®

mAb	Průměrná Kd
myší anti-B7-2	1,8 x 10'9 M
anti-B7-2	5,1 x ΙΟ'9 M

Příklad 7: Inhibice ko-stimulace T-lymfocytů humanizovanou anti-B7-2

Test proliferace CD28⁺ T-lymfocytů/CHO-B7

CD28⁺ T-lymfocyty, izolované způsobem popsaným výše, se jednou promyly a resuspendovaly se v RPMI kompletním mediu doplněném 2 ng/ml PMA (Calbiochem) v hustotě 5xl0⁵ buněk/ml. CD28⁺ T-lymfocyty (100 μΐ, 5xl0⁴ buněk) se přidaly ke směsi protilátka/CHO/hB7-2 (viz dále), inkubovaly se po dobu 3 dnů při 37 °C, 5% CO2 a proliferace T-lymfocytů se měřila pulsováním kultury po dobu alespoň 6 hodin 1 μΰί [³H]-thymidinu (NEN, Boston, MA). Buňky se sklízely na filtru a inkorporovaná radioaktivita se měřila ve scintilačním čítači.

Materiály

CD28⁺ lidské T-lymfocyty se izolovaly negativní selekcí s imunoabsorpcí z lidských lymfocytů periferní krve, jak bylo popsáno (June et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4472-4481 (1987)). Filtry potažené leukocyty se získaly leukoforesou zdravých lidských dárců a lymfocyty periferní krve (PBL) se izolovaly odstředěním podle gradientu hustoty. Monocyty se odstranily z PBL absorpcí na plast. CD28⁺ T-lymfocyty se izolovaly z nonadherentních buněk negativní selekcí za použití protilátek k CD11, CD20, CD16 a CD14 (tato sada protilátek potahuje všechny B-lymfocyty, monocyty, velké granulární lymfocyty a CD28’ T-lymfocyty) a separace na magnetických korálcích za použití magnetických korálků potažených kozím anti-myším imunoglobulinem.

CHO/hB7-2 buňky byly odloučeny od tkáňových kultivačních ploten inkubací ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku s Ca²⁺ a Mg²⁺ (PBS) s 0,5 mM EDTA, promyly se a fixovaly se čerstvě připraveným paraformaldehydem.

Různé koncentrace anti-B7-2 protilátky (ve dvojím provedení) se preinkubovaly po dobu 1 hodiny při 37 °C, 5% CO2, s lxlO⁴ CHO/hB7-2 buněk ve 100 μΐ RPMI kompletního media (RPMI 1640 medium, 10% fetální hovězí sérum (FBS), 100 U/ml penicilinu, 100 gg/ml streptomycinu) v mikrotitrační plotně (ploché dno, 96-jamek, Costar, Cambridge, MA).

Výsledky

Obr. 5 ukazuje výsledky inhibice proliferace lidských CD28⁺ T-lymfocytů myší a humanizovanou anti-B7-2 mAb. Obě protilátky vykazovaly na dávce závislou inhibici proliferace T-lymfocytů indukovanou B7-2 s podobnou hodnotou IC50 (inhibiční koncentrace 50%; množství protilátky nutné pro inhibici maximální proliferace T-lymfocytů o 50%) - 72 pm pro myší anti-hB7-2 a 50 pm pro humanizovanou anti-hB7-2, což ukazuje, že obě protilátky jsou podobně účinné v inhibici stimulace Tlymfocytů B7-2. Toto prokazuje, že vysoce afinitní anti-B7-2 mAb mohou blokovat funkci B7-2 v inhibici (například prevenci) aktivace a/nebo proliferace T-lymfocytů. Předpokládá se, že tyto protilátky budou mít stejnou kapacitu při použití in vivo pro inhibici reakce T-lymfocytů.

Příklad 8: Klonování a sekvencování cDNA variabilního regionu myší 1F1 cDNA variabilního regionu lehkého a těžkého řetězce myší 1F1 byly klonovány z mRNA izolované z hybridomových buněk za použití zakotvené PCR (Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)). Použité 5' primery se tepelně navázaly na poly-dG koncovky přidané k cDNA a 3' primery se tepelně navázaly na konstantní regiony. Amplifikované genové fragmenty se potom vložily do plasmidu pUC19. Nukleotidové sekvence pro Vl a Vh cDNA byly určeny z několika nezávislých klonů. Pro těžký řetězec byla identifikována jedna jedinečná sekvence, typická pro variabilní region myšího těžkého řetězce. Pro lehký řetězec byly identifikovány dvě jedinečné sekvence, obě homologické se sekvencemi variabilního regionu myšího lehkého řetězce. Nicméně, jedna sekvence nebyla funkční z důvodu chybění nukleotidu, které způsobilo posun čtecího rámce • 9 · · · · «··· ··· ·♦ ·· «· ··· v místě J-V spojení a tato sekvence byla identifikována jako neproduktivní alela. Druhá sekvence byla typická pro funkční variabilní region myšího kappa řetězce. cDNA sekvence variabilního regionu těžkého řetězce a funkčního lehkého řetězce a translatované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 6A a 6B, v příslušném pořadí. Myší V_H sekvence náleží do Rabatový podskupiny II(C) těžkého řetězce. Myší V_K sekvence náleží do Rabatový podskupiny IV myšího kappa řetězce.

Příklad 9: Návrh variabilních regionů humanizovaného 1F1

Pro zachování vazebné afinity myší protilátky v humanizované protilátce byl použit postup podle Queena a kol. (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989), US patenty č. 5585089 a 5693762, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti). Volba zbytků pracovního rámce může být zásadní pro zachování vazebné afinity. V zásadě může sekvence pracovního regionu z jakékoliv lidské protilátky sloužit jako templát pro přenos CDR; nicméně, bylo prokázáno, že prosté nahrazení CDR v takovém pracovním regionu může vést k významné ztrátě vazebné afinity pro antigen (Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 17: 217 (1992)). Čím více je lidská protilátka homologická k původní myší protilátce, tím méně je pravděpodobné, že lidský pracovní rámec vnese změny do myších CDR, které sníží afinitu. Podle srovnávání homologie sekvence v Rabatově databázi protilátkových sekvencí (Rabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)), byla III-2R (Manheimer-Lory, A., et al., J. Exp. Med. 176: 309 (1992) vybrána pro dodání variabilního regionu lehkého a těžkého řetězce humanizované 1F1. Jiné vysoce homologické lidské protilátkové řetězce jsou φ · · φ · · «β·· ··· také vhodné pro dodání pracovního regionu humanizované protilátky, zejména kappa lehké řetězce z lidské podskupiny 1 a těžké řetězce z lidské podskupiny 1, jak jsou definovány Kabatem.

Pro dodání sekvencí pracovního regionu se obvykle vybírá těžký a lehký řetězec ze stejné lidské protilátky, aby se snížila možnost inkompatibility při sestavování obou řetězců. III-2R protilátka vykazuje vysokou homologii s těžkými a lehkými řetězci 1F1 a proto byla vybrána pro dodání pracovního regionu pro humanizovanou protilátku. Variabilní doména těžkého řetězce humanizované 1F1 obsahuje 69 zbytků z 87 zbytků pracovního regionu, které jsou identické se zbytky v pracovním regionu těžkého řetězce myší 1F1, čili je z 79% identická. Variabilní doména lehkého řetězce humanizované 1F1 obsahuje 5 zbytků z 80 zbytků pracovního regionu, které jsou identické se zbytky v pracovním regionu lehkého řetězce myší 1F1, čili je z 69% identická.

Počítačové programy ABMOD a ENCODE (Levitt et al., J. Mol. Biol. 168: 595 (1983)) byly použity pro konstrukci molekulového modelu variabilní domény 1F1, který byl použit pro lokalizaci aminokyselin v pracovním regionu 1F1, které jsou dosti blízko k CDR pro to, aby s nimi mohly potenciálně interagovat. Pro návrh variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce 1F1 byly CDR z těžkého řetězce myší 1F1 přeneseny na pracovní regiony těžkého řetězce lidské III-2R a CDR z lehkého řetězce myší 1F1 byly přeneseny na pracovní regiony lehkého řetězce lidské II-2R. V pozicích pracovních regionů, kde počítačový model naznačil významný kontakt s CDR, byly aminokyseliny z myší protilátky substituovány za původní aminokyseliny lidského pracovního regionu. Pro humanizovanou 1F1 bylo toto provedeno ve zbytcích 1, 24, 27, 28, 29, 30, 48, a 68 těžkého řetězce a ve zbytcích 47 a 72 lehkého řetězce. Dále, zbytky pracovního regionu, které se vyskytovaly pouze vzácně ve svých pozicích v databázi lidských protilátek, byly nahrazeny konvenčními aminokyselinami v těchto lidských pozicích. Pro humanizovanou 1F1 bylo toto provedeno ve zbytcích 16, 74 a 113 těžkého řetězce a ve zbytku 44 lehkého řetězce. Celkem obsahovala variabilní doména těžkého řetězce humanizované 1F1 88 zbytků, které jsou identické s variabilní doménou těžkého řetězce lidského III-2R, a variabilní doména lehkého řetězce humanizované 1F1 88 zbytků, které jsou shodné s variabilní doménou lehkého řetězce lidského III-2R.

Sekvence variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce humanizované 1F1 protilátky jsou uvedeny na obr. 7A a 7B. Nicméně, mnoho z potenciálních kontaktních zbytků pro CDR je vhodných pro substituce za jiné aminokyseliny, které mohou zachovávat významnou vazebnou afinitu protilátky pro antigen. Tabulka 4 uvádí čísla pozic v pracovních regionech, ve kterých mohou být vhodné alternativní aminokyseliny (LC = lehký řetězec; HC = těžký řetězec).

Tabulka 4:

Pozice	Humanizovaná 1F1	Alternativy
HC-1	E	Q
HC-24	P	A
HC-27	F	G,Y
HC-28	N	T
HC-29	I	F
HC-30	K	S,T
HC-48	I	M
HC-67	K	R
HC-68	A	V
LC-72	Y	F

• · • « « »

Obdobně, mnoho zbytků pracovního regionu, které nejsou v kontaktu s CDR v lehkém a těžkém řetězci humanizované 1F1, může být substituováno aminokyselinami z příslušných pozic pracovního regionu III-2R, jiných lidských protilátek, myší 1F1 protilátky nebo jiných myších protilátek, bez významné ztráty afinity nebo neimunogenicity humanizované protilátky. Tabulka 5 uvádí čísla dalších pozic v pracovním regionu, ve kterých mohou být vhodné alternativní aminokyseliny.

Tabulka 5:

Pozice	Humanizovaná 1F1	Alternativy
HC-16	A	S
HC-74	T	K
HC-113	T	I
LC-44	A	s, v

Výběr různých alternativních aminokyselin může být použit pro přípravu verzí humanizované 1F1, které mají různé kombinace afinity, specificity, non-imunogenicity, snadnosti výroby, a jiných žádoucích vlastností. Příklady uvedené v tabulkách jsou proto pouze ilustrativní, nikoliv limitující.

Příklad 10: Příprava humanizované 1F1

Po navržení aminokyselinové sekvence humanizovaného variabilního regionu se připravily geny kódující tyto sekvence, včetně signálních peptidů, sestřihových donorových signálů a vhodných restrikčních míst (obr. 7A a 7B). Geny pro variabilní region lehkého a těžkého řetězce byly konstruovány a amplifikovány za použití překrývajících se syntetických oligonukleotidů velikosti od přibližně 65 do 85 baží (viz He et al., J. Immunol. 160: 1029 (1998)). Oligonukleotidy byly • » ♦ ♦ · ·· ·· • · · · « · 9 ·« • · · · · · ·· • · ·· ·♦·♦··« • · «V « «· ··· ··« «♦ 9··· párově tepelně zpracovány a prodlouženy pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerasy I, za zisku čtyř dvouřetězcových fragmentů. Získané fragmenty byly denaturovány, tepelně zpracovány a prodlouženy Klenowovým fragmentem, za zisku dvou fragmentů. Tyto fragmenty byly znovu denaturovány, tepelně zpracovány a prodlouženy, za zisku kompletního genu. Získaný produkt byl amplifikován polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Taq polymerasy, byl přečištěn na gelu, tráven Xbal, opět přečištěn na gelu a subklonován do Xbal místa pVg2.M3 pro expresi těžkého řetězce a pVk pro expresi lehkého řetězce. pVg2.M3 vektor pro expresi γ2 těžkého řetězce byl popsán v Cole et al., J. Immunology 159: 3613 (1997). Lidský γ2 konstantní region v pVg2.M3 plasmidu je mutovaný z lidského přirozeného γ2 regionu nahrazením aminokyselin Val a Gly v pozicích 234 a 237 Ala. Tato varianta má sníženou interakci s Fc receptory a proto má minimální efektorovou protilátkovou aktivitu. pVk vektor pro expresi lidského kappa lehkého řetězce byl popsán dříve (viz Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)).

Struktura konečných plasmidu byla potvrzena sekvencováním nukleotidů a restrikčním mapováním. Všechny úpravy DNA byly provedeny standardními způsoby známými odborníkům v oboru.

Pro vazebné testy byla připravena IgG2.M3 forma humanizované 1F1 protilátky. Při konstrukci buněčné linie produkující humanizovanou 1F1 byly plasmidy pro lehký a těžký řetězec transfektovány do myší myelomové buněčné linie Sp2/OAgl4 (ATCC CRL 1581). Před transfekcí byly plasmidy obsahující lehký a těžký řetězec linearizovány za použití restrikčních endonukleas. Plasmid pro γ2 těžký řetězec a plasmid pro kappa lehký řetězec byly linearizovány za použití Fspl. Přibližně 40 μg plasmidu pro těžký řetězec a 20 μg plasmidu pro lehký řetězec bylo transfektováno do 1 x 10⁷ buněk v PBS. Transfekce ·· · ·* ·· ·· • · · · φ φ φ ·φ • φ φ · φ · φ* • φ ·· φ φφφφφφ φ φ · φ φφφ ··· ··· «· φφ ·· byla provedena elektroporací za použiti Gene Pulser přístroje (Bio Rad) při 360 V a kapacitance 25 gFD, podle návodu výrobce. Buňky z každé transfekce byly vloženy na čtyři 96-jamkové tkáňové kultivační plotny a po dvou dnech se přidalo selekční medium (DMEM, 10% FCS, lxHT doplněk (Sigma), 0,25 mg/ml xanthinu, 1 gg/ml kyseliny mykofenolové).

Po přibližně 2 týdnech se vzniklé klony testovaly na produkci protilátek ELISA testem. Protilátka z klonu s vysokou produkcí se připravila kultivací buněk do konfluence ve správném mediu (DMEM s 10% FCS), potom nahrazením media bezsérovým mediem (Hybridoma SMF; Gibco) a kultivací v kultuře do dosažení maximálního titru protilátek. Supernatant kultury se potom zpracoval na protein A-sepharosové koloně (Pharmacia); a protilátka se eluovala 0,1 M glycinem, 100 mM NaCI, pH 3, neutralizovala se a potom se odebrala do fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS). Čistota protilátky se analyzovala na akrylamidovém gelu a její koncentrace se určila odečtem při OD₂₈o< za předpokladu, že 1,0 mg protilátky má při OD₂8o hodnotu absorbance 1,4.

Také byla připravena a přečištěna IgG4 forma humanizované 1F1 protilátky, za použití způsobu popsaného dále.

Pro umožnění vyšší exprese v CHO buňkách byly kompletní geny pro lehký a těžký řetězec humanizované lidské 1F1 (hlFl) a lidské 3D1 (h3Dl) nezávisle subklonovány do selektovatelného, amplifikovatelného expresního vektoru pED (Kaufman, R.J. et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485-4490 (1991)). Expresní plasmidy odvozené od pED byly sekvencovány pro potvrzení, že kódují správné lehké a těžké řetězce hlFl a h3Dl. Bylo zjištěno, že předposlední zbytek IgG2m3 CH3 domény je serin, oproti glycinu, který je popisován v této pozici pro

ΊΟ φ φφφφ φφφ φφφ φ φ φ «φ φφφφ • φφφ φφ* ·· φφ φφ φφφ všechny publikované IgG2 a IgGl sekvence. Tento serin byl v pED expresních konstruktech nahrazen obvyklejším glycinem. Expresní plasmidy pro lehký a těžký řetězec hlFl (pED.lFlv2KA a pED.lFlv2G2m3gly) byly linearizovány a ko-transfektovány do CHO PA-DUKX.153.8 buněčné linie, která byla preadaptována pro růst v bezsérové suspenzní kultuře (Sinacore M.S: et al., Biotechnol. Bioeng. 52: 518-528 (1996)). Buněčné linie exprimující h3Dl byly připraveny stejným způsobem kotransfekcí linearizovanými plasmidy pED.3DlKA a pED.3DlG2m3gly. V každém případě vedla stabilní integrace genů pro lehké a těžké řetězce do genomu CHO buňky, následovaná methotrexatovou selekcí a amplifikací, k zisku rekombinantních hlF nebo h3Dl buněčných linií. CHO buněčné linie exprimující anti-B7-l nebo anti-B7-2 byly kultivovány v bezsérovém kultivačním mediu a secernované protilátky byly přečištěny z kondicionovaného supernatantu kultury chromatografii na protein A sepharose. Navázané protilátky byly eluovány v kyselém pufru a potom se provedla neutralizace na pH 7,0. Přečištěné protilátky se převedly do PBS a sterilně se přefiltrovaly.

Příklad 11: Vlastnosti humanizované 1F1

Afinity myší a humanizované 1F1 protilátky pro B7-1 antigen byly stanoveny testem kompetitivní vazby s humanizovanou 1F1 protilátkou značenou radioaktivním jodem. Trojnásobná sériová ředění neznačené humanizované nebo myší 1F1 protilátky byla smísena s fixním množstvím radioaktivním jodem značené myší 1F1 protilátkou (40000-5000 cpm na test) v PBS obsahujícím 2% fetální telecí sérum, 0,1% azid sodný. Potom se přidalo 3 x 10⁴ CHO buněk exprimujících na povrchu rhB7-l a směs (v celkovém objemu 200 μΐ) se inkubovala po dobu 2 hodin při 4 °C za jemného třepání. Suspenze buněk-protilátek se potom přenesla do Sarstedt mikrozkumavek (č. 72.702) obsahujících 100 μΐ 80%

4 ολ 4 4 · 4 9 44« 44 44 ον 4 4 4 44444

4444 444 ·♦ 44 «4444 dibutylftalatu-20% olivový olej. Po odstředěni na mikroodstředivce se Sarstedt zkumavky vložily na několik minut do suchého ledu. I navázaný na buňky se určil připevněním konců každé zkumavky (obsahující buněčnou peletu) do scintilační fioly a odečtem v gamma-čítači. Určily se hodnoty volné a navázané radioaktivity a poměr se zanesl do grafu proti koncentracím neaktivních kompetičních protilátek způsobem podle Berzofsky a Berkower (J.A. Berzofsky and I.J.Berkower, ve Fundamental Immunology, 9. vydání, W.E. Paul), Raven Press (New York), 595 (1984)).

Grafy kompetitivní vazby jsou uvedeny na obr. 8. Každý bod představuje průměr ze tří měření. Výsledky ukazují, že IgG2.M3 protilátka má podobnou vazebnou afinitu jako myší protilátka (přibližně 1 x 10⁹ M”¹) , což naznačuje, že nedošlo ke ztrátě afinity při humanizaci 1F1.

Afinita myší a humanizované 1F1 protilátky pro B7-1 antigen byla potvrzena Scatchardovou analýzou vazby radioaktivně značených protilátek. Dvojnásobná sériová ředění radioaktivně značené humanizované nebo myší 1F1 protilátky byla inkubována s 5 x 10⁴ CHO buněk exprimujících na povrchu rhB7-l v PBS obsahujícím 2% fetální telecí sérum, 0,1% azid sodný, v celkovém objemu 200 μΐ. Směs se inkubovala po dobu 6 hodin při 4 °C za jemného třepání. Suspenze buněk-protilátek se potom přenesla do Sarstedt mikrozkumavek (č. 72.702) obsahujících 100 μΐ 80% dibutylftalatu-20% olivový olej. Po odstředění na mikroodstředivce se Sarstedt zkumavky vložily na několik minut do suchého ledu. I navázaný na buňky se určil připevněním konců každé zkumavky (obsahující buněčnou peletu) do scintilační fioly a odečtem v gamma-čítači. Určily se hodnoty volné a navázané radioaktivity a poměr se zanesl do grafu proti koncentraci navázané protilátky způsobem podle • *

Scatcharda (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949)). Metoda nejmenších čtverců se použila pro určeni přímky a hodnota Ka se určila ze sklonu křivky.

Scatchardovy grafy jsou uvedeny na obr. 9A a 9B. Každý bod představuje průměr ze dvou měření. Výsledky ukazují, že IgG2.M3 protilátka má podobnou vazebnou afinitu jako myší protilátka (přibližně 1 x 10⁹ Μ’¹) , což naznačuje, že nedošlo ke ztrátě afinity při humanizaci 1F1.

Přiklad 12: Afinita humanizované anti-B7-l monoklonální protilátky

Test kompetitivní vazby

Relativní afinity myší a humanizované anti-B7-l (1F1) protilátky pro B7-1 antigen byly stanoveny testem kompetitivní vazby. Trojnásobná sériová ředění neznačené humanizované nebo myší anti-B7-l mAb byla smísena s fixním množstvím radioaktivním jodem značené myší anti-B7-l mAb (¹²⁵I-anti-B7-l, 2800 cpm/fmol; 40000-5000 cpm na test v PBS obsahujícím 2% fetální telecí sérum). Potom se přidalo 1 x 10⁵ CHO buněk exprimujících na povrchu hB7-l (CHO/hB7-l) a směs (v celkovém objemu 200 μΐ) se inkubovala po dobu 2 hodin při 4 °C za jemného třepání. Směs buněk a protilátek se potom přenesla do Sarstedt mikrozkumavek (č. 72.702) obsahujících 100 μΐ 80% dibutylftalatu-20% olivový olej. Po odstředění na mikroodstředivce se Sarstedt zkumavky vložily na několik minut do suchého ledu. mAb značené ¹²⁵I navázané na buňky se určily připevněním konců každé zkumavky (obsahující buněčnou peletu) do scintilační fioly a odečtem v gamma-čitači. Určily se hodnoty volné a navázané radioaktivity. Hodnoty navázané radioaktivity se zanesly do grafu proti koncentracím

neaktivních kompetičních mAb.

CHO/hB7-l buněčná linie

Rekombinantní linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO) exprimující hB7-l na svých povrchových membránách byla klonována z buněk transfektovaných B7-1 cDNA sekvencí a G418 resistenci. Stabilní exprese hB7-l na povrchu CHO buněk během mnoha pasáží pod selekčním tlakem byla potvrzena pomocí myších anti-B7-l mAb a FACS analýzy.

Příprava anti-hB7-l mAb značených ¹²⁵I

Myší a humanizované anti-hB7-l protilátky byly značeny ¹²⁵I reakcí s ¹²⁵I-Bolton-Hunterovým činidlem podle návodu výrobce (Amersham Corp., Arlington Hts, IL). Protein byl separován od volného činidla pomocí NAP-25 kolony. HPLC kolona s vylučováním podle velikosti byla použita pro potvrzení toho, že protilátky jsou intaktní a neagregovaly po značení a pro měření koncentrace proteinu. Značení typicky vedlo k 4 až 8 μCi na gg mAb, neboli přibližně 30-60% protilátky bylo označeno, myší a humanizované anti-B7-l mAb měly specifickou aktivitu 2800 cpm/fmol, resp. 950 cpm/fmol.

Výsledky

Grafické znázornění dat kompetitivní vazby je uvedeno na obr. 10. Každý bod představuje průměr ze tří měření. Výsledky ukazují, že jak humanizovaná anti-B7-l mAb, tak myší anti-B7-l mAb, ze která je první protilátka odvozena, mají podobnou vazebnou afinitu pro B7-1 (přibližně 1 x 10⁹ M’¹) , což naznačuje, že nedošlo ke ztrátě afinity u humanizované antiB7-1 mAb. Jak myší, tak humanizované anti-B7-l soutěžily • 0 • 0 • * podobně a efektivně se značenou myší anti-B7-l mAb o vazbu na B7-1 exprimovaný na povrchu buněk.

Příklad 13: Přímá vazba humanizovaných anti-B7-l mAb na

B7-1

Buněčný vazebný test

Vazebné testy se zahájily umístěním CHO/hB7-l buněk na 96jamkové tkáňové kultivační plotny v koncentraci 10000 buněk na jamku v kompletním mediu a plotny se inkubovaly při 37 °C po dobu 2 dnů. O dva dny později se adherující buňky jemně promyly pufrem obsahujícím odtučněný sušený mléčný protein a _v 125 azid sodný. Myší a humanizované anti-B7-l mAb znacene I se sériově ředily v testovacím pufru a inkubovaly se s buňkami přes noc při 4 °C, což umožnilo vazbu a ustanovení rovnováhy. Nenavázané značené protilátky se opatrně odstranily sérií opatrných výplachů testovacím pufrem a navázané protilátky značené ¹²⁵I se detekovaly za použití ¹²⁵I scintilačního a detektorového systému. Nespecifická vazba se určila pro každé ředění stejným způsobem, ale za použití CHO buněk exprimujících B7-2 molekulu, která není rozpoznávána ani myší, ani humanizovanou anti-B7-l mAb.

Výsledky

Grafické znázornění výsledků testu přímé vazby je uvedeno na obr. 11. Data, průměry ze tří jamek s odečtenou nespecifickou vazbou, se upravila pro hyperbolickou saturační křivku za použití Graphpad Prism softwaru. Vazebné konstanty (Kb), určené jako koncentrace protilátky odpovídají polovině maximální saturace vazebných míst, pro myší a humanizovanou protilátku, ukázaly, že obě protilátky mají podobné a vysoké vazebné afinity (přibližně 10 ⁹m) pro B7-1. Jak myší, tak humanizované anti-B7-l mAb rozpoznávaly lidský B7-1 exprimovaný na povrchu buněk.

Příklad 14: Vazba humanizovaných anti-B7-l mAb na proteinové ligandy

Určení afinity pomocí BIACORE®

BIACORE® biosenzor (BIACORE®, Uppsala, Švédsko) byl použit pro určení kinetik vazby myší a humanizované anti-B7-l monoklonální protilátky na lidský B7-lIg (hB7-lIg). Lidský B7llg byl imobilizován na dextranové matrici čipu BIACORE® senzoru. Humanizovaná a myší anti-B7-l mAb byly testovány v koncentracích 200, 100, 50 a 20 nM na imobilizovaném hB7llg. Každé ředěni mAb bylo testováno 4-krát na pokus a celkem byly provedeny tři pokusy. Vazba protilátky proti lidskému B7llg byla měřena v reálném čase povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR) a globální analýza byla provedena za použití modelu bivalentní vazby v BIA vyhodnocovacím softwaru (verze 3.1). Pro každý vzorek byla stanovena asociační (k_a) , disociační (k_d) a rovnovážná disociační konstanta (K_D) .

Tabulka 6 uvádí průměrné hodnoty získané pro myší a humanizovanou anti-lidský B7-1 mAb. Vazebné konstanty pro myší a humanizovanou anti-B7-l mAb určené SPR ukázaly, že myší a humanizovaná forma anti-B7-l mAb jsou podobné a že myší antiB7-1 mAb má o něco vyšší vazebnou konstantu pro hB7-lIg než humanizovaná anti-B7-l mAb. Přibližně 5-násobně vyšší afinita vypočítaná pro myší anti-B7-l mAb může představovat reálný, ale jemný rozdíl mezi myší a humanizovanou anti-B7-l mAb, který byl vnesen při procesu humanizace. Jinou možností jsou technické odlišnosti při přípravě, zpracování a analýze těchto protilátek. Jak je uvedeno v příkladech 12, 14 a 19, nebyl

	•					·«
Φ ·	··	•	»	• ·	•	♦
•	♦	•	•	Φ ·	•	•
•	a	• ·	•	»•4 ·	•	•
•	•		•	•	•	•
Φ · · ·			··	• t		t ·

tento rozdíl pozorován pro vazebnou afinitu humanizované hB7-l v buněčných testech nebo funkčních testech.

Tabulka 6: Afinita anti-B7-l mAb určená pomocí BIACORE®

mAb	Průměrná Kd	Standardní odchylka
myší anti-B7-l	5,6 x 10'1 M	1,9 x 1Ο’Ιϋ M
humanizovaná anti-B7-l	2,8 x 10'9 M	1,2 x 10 y M

Příprava hB7-Hg

Solubilní forma hB7-lIg byla získána z kultivačního media CHO buněk zpracovaných tak, aby secernovaly tento protein. Rekombinantní hB7-lIg byl získán fúzí DNA kódující sekvence odpovídající extracelulární doméně hB7-l genu na pantové-CH2CH3 domény těžkého řetězce lidského IgGl. Rekombinantní protein byl přečištěn z kultivačního media pomocí chromatografíe na proteinu A.

Příklad 15: Inhibice ko-stimulace T-lymfocytů humanizovanou anti-B7-l mAb

Test proliferace CD28⁺ T-lymfocytů/CHO-B7

CD28⁺ T-lymfocyty, izolované způsobem popsaným výše, se jednou promyly a resuspendovaly se v RPMI kompletním mediu doplněném 2 ng/ml PMA (Calbiochem) v hustotě 5xl0⁵ buněk/ml. CD28⁺ T-lymfocyty (100 μΐ, 5xl0⁴ buněk) se přidaly ke směsi protilátka/CHO/hB7-l (viz dále), inkubovaly se po dobu 3 dnů při 37 °C, 5% CO₂ a proliferace T-lymfocytů se měřila pulsováním kultury po dobu alespoň 6 hodin 1 μ<0ί [³H]-thymidinu (NEN, Boston, MA). Buňky se sklízely na filtru a inkorporovaná radioaktivita se měřila ve scintilačním čítači.

··	•			• fr	• fr	•
• 4	··	•	•	• ·		•	··
•	•	•	•	• ·	• ·	•
•	•	9 ·	•	···	• ·	•	«
«	•	•	•	•	• ·	•
····	···	9·			3·	··«

CD28⁺ lidské T-lymfocyty se izolovaly negativní selekcí s imunoabsorpcí z lidských lymfocytů periferní krve, jak bylo popsáno (June et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4472-4481 (1987)). Filtry potažené leukocyty se získaly leukoforesou zdravých lidských dárců a lymfocyty periferní krve (PBL) se izolovaly odstředěním podle gradientu hustoty. Monocyty se odstranily z PBL absorpcí na plast. CD28⁺ T-lymfocyty se izolovaly z nonadherentních buněk negativní selekcí za použití protilátek k CD11, CD20, CD16 a CD14 (tato sada protilátek potahuje všechny B-lymfocyty, monocyty, velké granulární lymfocyty a CD28“ T-lymfocyty) a separace na magnetických korálcích za použití magnetických korálků potažených kozím anti-myším imunoglobulinem.

CHO/hB7-l buňky byly odloučeny od tkáňových kultivačních ploten inkubací ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku bez Ca²⁺ nebo Mg²⁺ s 0,5 mM EDTA. Buňky se promyly a potom se fixovaly čerstvě připraveným paraformaldehydem.

Různé koncentrace anti-B7-l protilátky (ve dvojím provedení) se preinkubovaly po dobu 1 hodiny při 37 °C s IxlO⁴ CHO/hB7-l buněk ve 100 μΐ RPMI kompletního media (RPMI 1640 medium, 10% FBS, 100 U/ml penicilinu, 100 gg/ml streptomycinu) v mikrotitrační plotně (ploché dno, 96-jamek, Costar, Cambridge, MA).

Výsledky

Obr. 12 ukazuje výsledky inhibice proliferace lidských CD28⁺ T-lymfocytů myší a humanizovanou anti-B7-l mAb. Obě monoklonální protilátky vykazovaly na dávce závislou inhibici proliferace T-lymfocytů indukovanou B7-1 s podobnou hodnotou

IC₅o (inhibični koncentrace 50%; množství protilátky nutné pro inhibici maximální proliferace T-lymfocytů o 50%) - 110 pm pro humanizovanou anti-hB7-l a 220 pm pro myší anti-hB7-l, což ukazuje, že obě protilátky jsou podobně účinné v inhibici stimulace T-lymfocytů B7-1. Toto prokazuje, že vysoce afinitní anti-B7-l mAb mohou blokovat funkci B7-1 inhibici nebo prevencí aktivace a/nebo proliferace lidských T-lymfocytů. Předpokládá se, že tyto protilátky budou mít stejnou kapacitu při použití in vivo pro inhibici reakce T-lymfocytů.

Příklad 16: Inhibice smíšené lymfocytární reakce anti-B7-l a anti-B7-2 mAb

Smíšená lymfocytární reakce (MLR): Lidské normální lymfocyty periferní krve (PBL) (reaktivní buňky) se kultivovaly s ozářenými (2500 cGy) normálními dárcovskými PBL (stimulační buňky) v RPMI 1640 obsahujícím 5% tepelně inaktivované lidské AB sérum při teplotě 37 °C v 5% CO₂ v konečné koncentraci 10⁶ buněk/ml. V uvedených případech se přidaly myší anti-hB7-l nebo myší anti-hB7-2 protilátky samostatně (10 μφ/ιηΐ) , v kombinaci (10 pg/ml každá) a s CTLA4Ig (10 ní(eo 20 pg/ml) . Buňky byly kultivovány ve trojím provedení v mikrotitračních plotnách v celkovém objemu 200 μΐ a proliferace byla hodnocena podle inkorporace [³H]-thymidinu během posledních 16 hodin kultivace. Sekundární MLR byla provedena za použití buněk získaných z primární MLR jako reaktivních buněk. Tyto buňky se promyly, kultivovaly se přes noc a restimulovaly se stejným způsobem jako výše za použití stejné nebo jiné skupiny stimulačních PBL. Do sekundární MLR se nepřidávaly žádné inhibitory.

Výsledky:

Výsledky uvedené na obr. 13 byly získány z primární jednocestné MLR za nepřítomnosti nebo přítomnosti B7 inhibitorů (anti-B7, CTLA4Ig). Proliferace byla měřena po 3, 4 nebo 5 dnech kultivace.

V primární MLR nemělo přidání samotné anti-B7-l mAb žádný inhibiční efekt, což ukazuje na minimální roli B7-1 samotné při řízení proliferace reaktivních T-lymfocytů. Anti-B7-2 samotná inhibovala proliferaci T-lymfocytů ve všech testovaných dnech v úrovni srovnatelné s lidským CTL4Ig (hCTL4Ig), což je rekombinantní protein, o kterém je známo, že se váže na B7-1 a B7-2. Kombinace anti-B7-l a anti-B7-2 byla nejúčinnějším inhibitorem proliferace T-lymfocytů a zcela inhibovala tuto odpověď ve všechny testované dny. Lepší schopnost kombinace anti-B7-l a anti-B7-2 inhibovat proliferaci T-lymfocytů ve srovnání s hCTL4Ig odráží vyšší afinitu anti-B7 mAb pro B7-1 a B7-2 ve srovnání s hCTL4Ig. Kombinované anti-B7-l a anti-B7-2 mAb byly lepšími inhibitory proliferace T-lymfocytů než anti-B7-2 samotná, což ukazuje na potřebu blokovat oba stimulační receptory pro úplnou inhibici reakce T-lymfocytů. Tyto výsledky ukazují, že kompletní blokáda B7-1 a B7-2 kostimulátorů úplněji blokuje alloreaktivitu v MLR. Proto tyto výsledky naznačují, že způsoby léčby zahrnující aplikaci anti-B7-l a anti-B7-2 protilátek budou účinnější než použití pouze jedné z protilátek, zejména tehdy, když jsou funkční obě ko-stimulační molekuly. Ačkoliv popsaný pár reaktivní buňky/stimulační buňky nebyl citlivý na inhibici anti-B7-l samotnou, některé páry reaktivních/stimulačních buněk vykazují mírnou (0-50%) citlivost na anti-B7-l.

Pro určení toho, zda ošetření anti-B7 mAb v primární MLR vede ke vzniku hyporeaktivity nebo anergie T-lymfocytů byly

• · ««

reaktivní T-lymfocyty z primární MLR testovány v sekundární MLR, ve které byly stimulační buňky buď od stejného dárce jako při primární MLR, nebo ze třetího zdroje. Obr. 14 ukazuje, že reaktivní T-lymfocyty z primární MLR, které byly ošetřeny anti-B7-l samotnou, vykazovaly plnou proliferativní reakci jak na původní stimulační buňky, tak na buňky ze třetího zdroje, když byly testovány v sekundární MLR bez imunosuprese, což naznačuje, že blok B7-1 receptoru samotného ošetřením anti-B71 mAb nemá žádný toleranční efekt na tyto reaktivní Tlymfocyty. Toto je v protikladu s chyběním reakce na primární stimulátory pozorovaným v sekundární MLR, když byly primární MLR ošetřeny anti-B7-2 samotnou. Výsledky na obr. 15 ukazují, že reaktivní T-lymfocyty z primární MLR ošetřené anti-B7-2 samotnou nereagovaly na stejné stimulátory, jako jsou stimulátory použité v primární MLR, ale zachovávaly si normální proliferativní odpověď na stimulátory ze třetího zdroje (nepříbuzné stimulátory), což naznačuje, že tyto reaktivní T-lymfocyty se staly tolerantními na původní stimulační PBL díky ošetření anti-B7-2 a že tolerance byla specifická pro stimulační antigen přítomný v primární MLR. U tohoto páru reaktivních/stimulačních buněk vedlo ošetření anti-B7-2 ke vzniku tolerance na stimulační buňky; nicméně, pro jiné páry reaktivních/stimulačních buněk nemusí být indukce tolerance úplná.

Obr. 16 ukazuje, že reaktivní T-lymfocyty z primární MLR ošetřené anti-B7-l a anti-B7-2 nereagovaly na stejné stimulátory, jako jsou stimulátory použité v primární MLR, ale zachovávaly si normální proliferativní odpověď na stimulátory ze třetího zdroje (nepříbuzné stimulátory). Toto naznačuje, že tyto reaktivní T-lymfocyty se staly tolerantními na původní stimulační PBL díky ošetření kombinací anti-B7-l a anti-B7-2. Výsledky získané pro tento pár reaktivních/stimulačních buněk

jsou typické pro jiné páry reaktivních/stimulačních buněk v tom, že indukce tolerance je pravidlem.

Příklad 17: Inhibice primární a sekundární MLR pomocí zpracování humanizovanými anti-B7-l a anti-B7-2

Souhrn:

Byla zkoumána schopnost anti-B7 mAb inhibovat primární MLR a indukovat specifickou dlouhodobou hyporeaktivitu nebo toleranci” v sekundární MLR. Primární MLR byly zpracovány samostatnými nebo kombinovanými mAb nebo CTLA4Ig a proliferace byla měřena ve dny 3, 4 a 5. Kombinace anti-B7-l+anti-B7-2 a CTLA4Ig inhibovaly proliferaci, zatímco jednotlivé anti-B7 mAb byly méně účinné. Buňky z primární MLR (po 48-hodinovém zpracování) byly potom přeneseny do sekundární MLR bez inhibitorů. Buňky z primární MLR zpracované kombinací anti-B7 mAb nebo CTLA4Ig vykazovaly minimální odpověď na původní stimulátory v sekundární MLR, zatímco buňky zpracované mediem nebo samotnými anti-B7 mAb reagovaly dobře. Za všech podmínek reagovaly buňky dobře na stimulátory ze třetího zdroje, což dokazuje, že hyporeaktivita pozorovaná v primární MLR pro buňky zpracované kombinací anti-B7 mAb nebo CTLA4Ig byla jak specifická, tak dlouhodobá.

Materiály a metody

Návrh testu

Buňky:

Reaktivní A buňky byly PBL připravené z čerstvě odebrané krve. PBL byly přečištěny odstředěním s Ficollovým gradientem, promyly se dvakrát kultivačním mediem a suspendovaly se v koncentraci lxl0⁶/ml v kultivačním mediu. Původní stimulační * · ·· ··♦·♦· · · • · · · · · · · «··· ··· ·· ·· ·· ···

B buňky byly PBL připravené z leukoforesy. Buňky se přečistily Ficollovou separací a promyly se dvakrát kultivačním mediem. Buňky se suspendovaly v koncentraci 2xl0⁶/ml v kultivačním mediu pro primární MLR a v koncentraci lxl0⁶/ml pro sekundární MLR. Stimulační C buňky ze třetího zdroje byly PBL připravené z leukoforesy. Buňky se přečistily Ficollovou separací a promyly se dvakrát kultivačním mediem. Buňky se suspendovaly v koncentraci lxlO⁶/ml v kultivačním mediu. ”B a C stimulátory jsou PBL od dvou geneticky odlišných lidských dárců.

Kultivační medium:

RPMI 1640 obsahující 2 mM glutaminu, 10 mM HEPES, 10% tepelně inaktivované lidské AB sérum, 100 U/ml penicilinu, 100 gg/ml strepamycinsulfatu a 5 gg/ml gentamicinsulfatu.

Testované složky:

Kontrolní Ig je chimérická mAb s variabilními doménami odvozenými od myší mAb proti obalovému proteinu HIV a konstantními doménami odvozenými od lidského IgGl. Všechny roztoky protilátek, CTLA4Ig a kontrolního Ig byly připraveny v kultivačním mediu v následujících koncentracích: anti-B7-l (40 gg/ml), anti-B7-2 (40 gg/ml), anti-B7-l+anti-B7-2 (40 gg/ml každý), CTLA4Ig (40 gg/ml), CTLA4Ig (80 gg/ml) a kontrolní Ig (40 gg/ml).

Postup pro primární MLR:

Primární MLR se provede následujícím způsobem:

- B buňky (stimulační) se ozáří dávkou 3,5 Gy;

- V 96-jamkové mikrotitrační plotně s U dnem se smísí 50 μΐ ozářených B buněk s 50 μΐ protilátky, CTLA4Ig, kontrolního Ig nebo media. Celkový objem = 100 μΐ a obsahuje lxlO⁵ B buněk • · · <· ·· ·· · • < · ♦ ·· · · · · · • · · · · · ·· · • · · · ·····« · « ♦ ♦ · 9 · » · · ···· «·· ·· 4* ·· «3φ (stimulátorů) a 2x konečnou koncentraci inhibičních činidel.

Provede se inkubace po dobu 30 minut na ledu;

- Přidá se 100 μΐ A buněk (reaktivních buněk);

- Provede se inkubace při 37 °C, v 5% CO2;

- V den 2, 3 a 4 se přidá 1 μθί [³H]-thymidinu a inkubace pokračuje přes noc;

- Buňky se odeberou a scintilační kamerou se určí inkorporovaná radioaktivita. Výsledky se určují v den 3, 4 a 5.

Postup pro spojenou primární/sekundární MLR:

Test se provede následujícím způsobem:

- B buňky (stimulační) se ozáří dávkou 3,5 Gy;

- Zmnoží se primární MLR. V T-25 zkumavce se smísí 2,5 ml ozářených B buněk (2xl0⁶/ml) s 2,5 ml protilátky, CTLAÍIg, kontrolního Ig nebo media. Celkový objem = 5 ml a obsahuje lxl06/ml B buněk (stimulátorů) a 2x konečnou koncentraci inhibičních činidel. Provede se inkubace po dobu 30 minut na ledu;

- Přidá se 5 ml A buněk (reaktivních buněk). Celkový objem v

T-25 = 10 ml;

- Provede se inkubace při 37 °C, v 5% CO2, po dobu 48 hodin;

- Buňky se odeberou odstředěním s ficollovým gradientem, promyjí se dvakrát ledově chladným mediem a suspendující se v koncentraci lxl0⁶/ml v kultivačním mediu. Buňky se ponechají po dobu 8 hodin na ledu. Buňky se promyjí dvakrát ledově chladným mediem a suspendující se v koncentraci lxl0⁶/ml v kultivačním mediu.

- C buňky (stimulační ze třetího zdroje) se ozáří dávkou 3,5 Gy, B buňky (původní stimulační) se ozáří dávkou 3,5 Gy. B a C buňky jsou v koncentraci lxl0⁶/ml;

- V 96-jamkové mikrotitrační plotně s U dnem se smísí 100 μΐ ozářených B buněk nebo ozářených C buněk a 100 μΐ buněk ze • · · «· «* · · 4 φ · « 4 · · · · ♦ · · • · Φ Φ · 4 · φ ·

Φ · · · »····« ♦ 4

Φ Φ · · «ΦΦΦ ···· ΦΦΦ · » «» Φ· <·Φ zmnožené MLR;

- Provede se inkubace při 37 °C, v 5% C0₂;

- V den 2, 3, 4 a 5 se přidá 1 gCi [³H]-thymidinu a inkubace pokračuje přes noc;

- Buňky se odeberou a scintilačni kamerou se určí inkorporovaná radioaktivita. Výsledky se určují v den 3, 4, 5 a 6.

Výsledky

Primární MLR byla provedena za použití jedněch reaktivních buněk a dvou různých stimulačních buněk a buňky byly zpracovány jednotlivými anti-B7 mAb, kombinací anti-B7 mAb, CTLA4Ig nebo kontrolním Ig a proliferace kultury se měřila ve dny 3, 4 a 5. Anti-B7-1 samotná měla minimální inhibiční efekt na proliferaci (1-35%) . Anti-B7-2 samotná měla střední inhibiční efekt na proliferaci (30-50%). Kombinace anti-B7 mAb nebo CTLA4Ig mely maximální inhibiční efekt na proliferaci (86-92%, anti-B7; 82-91%, CTLA4Ig; obr. 17 a 18).

Po 48 hodinách v primární MLR za použití jednoho ze stimulátorů a za přítomnosti inhibitorů byly buňky promyty, nechaly se zotavit a použily se v sekundární MLR za použití původních nebo třetích stimulátorů v kulturách bez inhibitorů. Proliferace kultur se měřila ve dny 3, 4, 5 a 6 (obr. 19 a 20). Souhrn dat ze sekundárních MLR pokusů je uveden na obr. 21.

Za použití dat pro maximum proliferativní odpovědi, bez ohledu na den maxima proliferativní odpovědi, byly odpovědi buněk z primární MLR zpracovaných anti-B7-l samotnou na původní a třetí stimulátory následující:

Tabulka 7

Zpracování v primární MLR	Reakce na původní stimulátory (%)	Reakce na stimulátory ze třetího zdroje
Medium	100	100
anti-B7-l	70	89
anti-B7-2	47	89
anti-B7-l+anti-B7-2	15	89
CTLA4Ig 10	19	90
CTLA4Ig 20	17	95
Kontrolní Ig	99	105

Primární MLR zpracované buď kombinaci anti-B7 mAb nebo CTLA4Ig vedly ke vzniku buněk, které byly v sekundární MLR refrakterní na proliferaci v reakci na stejné stimulátory. Zpracování jednou z anti-B7 mAb bylo méně účinné. Bez ohledu na zpracování v primární MLR reagovaly buňky normálně na stimulátory ze třetího zdroje, což dokazuje, že zpracování kombinací anti-B7 mAb nebo CTLA4Ig vedlo ke specifické, trvající hyporeaktivitě nebo anergii.

Závěr:

Humanizované anti-B7 mAb 1F1 a 3D1 použité v kombinaci inhibují primární MLR. Tato inhibice je specifická a trvalá, protože reaktivní buňky z primární MLR zpracované kombinací anti-B7 mAb reagují špatně na stejné stimulátory v sekundární MLR provedené bez inhibitorů. Reaktivní buňky z primární MLR zpracované kombinací anti-B7 mAb reagují normálně na stimulační buňky ze třetího zdroje v sekundární MLR. Kombinace anti-B7 mAb je stejně účinná jako CTLA4Ig v inhibici primární a sekundární reakce. Jednotlivé anti~B7 mAb jsou méně účinné v inhibici primární MLR a zpracování jednotlivými anti-B-7 mAb nevede ke vzniku anergie v sekundární MLR.

<· · · · · · · · · • · to · to · · ·· ♦ · · · ···«*· ·· · ♦ · · · ·» ft· *·· <· «·<··

Přiklad 18: Inhibice imunitních reakci u non-lidských primátů anti-B7 mAb; Inhibice anti-tetanické reakce

Souhrn:

Schopnost anti-B7 mAb inhibovat primární a sekundární (recall) protilátkové reakce byla určena na modelu imunizace proti tetanu na non-lidských primátech. Čtyři skupiny opic makak fasicularis (n=3) byly imunizovány tetanickým toxoidem v den 0 a o šest týdnů později v den 42. Jednou týdně byly hodnoceny titry protilátek proti tetanu. Ve skupině, které byla aplikována jedna dávka 10 mg/kg kombinace lidské anti-B71 protilátky (hlFl) a lidské anti-B7-2 protilátky (h3Dl) v den 0 byla anti-tetanická protilátková odpověď dramaticky potlačena, kdy u žádného ze 6 ošetřených zvířat nedošlo ke vzniku významného titru během šesti týdnů po imunizaci. Dále, zvířata, která byla ošetřena kombinací protilátek v den 0, nereagovala na podání tetanického antigenu v den 42 bez ohledu na to, zda jim byl aplikován v den 42 salinický roztok nebo další dávka hlFl nebo h3Dl. Ve skupině zvířat, které byl podán salinický roztok v den 0 a hlFl a h3Dl pouze v den 42 byl průměrný titr sekundární protilátkové reakce nižší než průměrný titr pozorovaný v kontrolní skupině, které byl aplikován salinický roztok. Všechny skupiny zvířat ošetřených hlFl a h3Dl byly re-imunizovány třetí dávkou tetanického antigenu za 112 dnů po poslední dávce, když byly sérové koncentrace hlFl a h3Dl pod detekovatelnými limity. V tuto dobu zvířata reagovala vytvořením anti-tetanických protilátek s kinetikou, která se podobala primární nebo sekundární protilátkové reakci. Tato data ukazují, že inhibice kostimulace blokováním B7-1 a B7-2 pomocí anti-B7-l a anti-B7-2 protilátek může dramaticky potlačit primární protilátkovou reakci na tetanus, stejně jako snížit sekundární protilátkovou reakci. Dále tato data ukazují zotavení z imunosuprese, což naznačuje, že v tomto testu nebylo dosaženo dlouhodobé tolerance proti tetanu.

Materiály a metody

Testované a kontrolní složky

Anti-B7-1 (hlFl):

Anti-B7-1 protilátka byla podána primátům pomalou i.v. infusí. Každému zvířeti v léčených skupinách byla podána dávka 10 mg/kg v den 0 a/nebo v den 42 testu.

Anti-B7 (h3Dl):

Anti-B7-2 protilátka byla podána primátům pomalou i.v. infusí. Každému zvířeti v léčených skupinách byla podána dávka 10 mg/kg v den 0 a/nebo v den 42 testu.

Kontrolní salinický roztok

Salinický roztok (9% chlorid sodný pro injekce) byl podán primátům pomalou i.v. infusí. Každému zvířeti ve skupině s aplikací salinického roztoku a ve skupinách B a C byla podána dávka 15 ml salinického roztoku v den 0 a/nebo v den 42 testu.

Přečištěný tetanický toxoid (antigen):

Tetanický toxoid (University of Mas^chusetts Medical

Center, Biologie Laboratories) byl podán v den 0. Všechna zvířata byla imunizována 10 lfu (jednotka hranice flokulace) intramuskulární (i.m.) injekcí a 1 lf jednotkou intradermální (i.d.) injekcí 9 minut po podání salinického roztoku nebo protilátky. V den 42 byla všechna zvířata imunizována 10 lf jednotkami i.m. injekcí 90 minut po podání salinického roztoku nebo protilátky. V den 84 byla všem zvířatům podána 1 lf jednotka i.d. injekcí pro testování oddálené hypersensitivity • · · · *00000 » 0 · 9 9 0000 «000 ··· t· ·0 «* «00 specifické pro tetanus (DTH). Zvířata ve skupinách B, C a D byla imunizována potřetí 10 lf jednotkami i.m. injekcí 112 dnů po poslední dávce ((po druhé imunizaci).

Průběh testu:

makaků (Macaca fasicularis) o hmotnosti 4-6 kg naivních z hlediska tetanu bylo rozděleno do 4 pokusných skupin po 3 zvířatech na skupinu:

Skupině A se podaly 2 i.m. imunizace 10 lf jednotkami (flokulačními jednotkami) tetanického toxoidu v den 0 a v den (kontrolní skupina);

Skupině B se podalo 10 mg/kg každé humanizované anti-B7-l (1GF1) a anti-B7-2 (3D1) i.v., alespoň 90 minut před i.m. podáním 10 lf jednotek tetanického toxoidu v den 0; dále se ve dny 42 a 112 aplikovala imunizace tetanickým toxoidem samotným (bez předléčení mAb) (blokáda kostimulace s primární imunizací).

Skupině C se aplikovala v den 0 imunizace tetanickým toxoidem samotným (bez předléčení mAb); dále se podalo 10 mg/kg každé humanizované anti-B7-l (1GF1) a anti-B7-2 (3D1) i.v., alespoň 90 minut před i.m. podáním 10 lf jednotek tetanického toxoidu v den 42 a 154 (blokáda kostimulace se sekundární imunizací).

Skupině D se podalo 10 mg/kg každé humanizované anti-B7-l (1GF1) a anti-B7-2 (3D1) i.v., alespoň 90 minut před i.m. podáním 10 lf jednotek tetanického toxoidu v den 0; dále se ve dny 42 a 112 aplikovalo 10 mg/kg každé humanizované anti-B7-l (1GF1) a anti-B7-2 (3D1) i.v., alespoň 90 minut před i.m. podáním 10 lf jednotek tetanického toxoidu v den 42 a • φ φ φ ·· · φ φ · imunizace tetanickým toxoidem samotným (bez předléčení mAb) v den 154 (blokáda kostimulace s primární a sekundární imunizací).

Všem skupinám se aplikovala imunizace proti tetanu ve dny 0 a 42. Skupinám B, C a D se aplikovala třetí imunizace proti tetanu 112 dnů po podání anti-B7 (tabulka 8).

Tabulka 8: Skupiny a jejich léčba

Skupina (n=3)	1. imunizace proti tetanu, den 0	2. imunizace proti tetanu, den 42	3. imunizace proti tetanu
A, kontrolní salinický roztok	salinický roztok	salinický roztok	nic
B, anti-B7 po 1. imunizaci	antiB7-l/B7-2 10 mg/kg i.v., bolus	salinický roztok	den 112
B, anti-B7 po 2. imunizaci	salinický roztok	antiB7-l/B7-2 10 mg/kg i.v., bolus	den 154
D, anti-B7 po 1. a 2. imunizaci	antiB7-l/B7-2 10 mg/kg i.v., bolus	antiB7-l/B7-2 10 mg/kg i.v., bolus	den 154

Všem skupinám se aplikovala imunizace proti tetanu ve dny 0 a

42. Skupinám B, C a D se aplikovala třetí imunizace proti tetanu 112 dnů po podání anti-B7.

ELISA test na anti-tetanické protilátky

96-jamkové ELISA plotny se potáhly tetanickým toxoidem v koncentraci 4 μg/ml. Provedly se 4-log titrace vzorků séra od 1:100. Vazba Ab na tetanus se detekovala kombinací «· · ·· • t · · · · « • · 9 · · • · · 9 ·

9 9 9 9 9 9

99 9 999 9· ·· 9 9 · monoklonálniho anti-lidského IgG a polyklonálního kozího antirhesus IgM konjugovaných na HRP, a reakcí s TNB substrátem.

Výsledky a diskuze:

Obr. 22 ukazuje anti-tetanické IgM + IgG reakce u opic imunizovaných tetanickým toxoidem a ošetřených kombinací antiB7-1 a anti-B7-2 protilátek.

Makakům byl podán buď salinický roztok nebo kombinace 10 mg/kg anti-B7-l protilátky (hlFl) a 10 mg/kg anti-B7-2 protilátky (h3Dl) i.v. infusí. 90 minut po infusi protilátek nebo salinického roztoku byla zvířata imunizována 10 Lf jednotkami přečištěného tetanického toxoidu i.m. injekcí a 1 Lf jednotkou i.d. injekcí. Titry protilátek proti tetanu byly měřeny jednou týdně. V kontrolní skupině, které byl podán salinický roztok, se průměrné log titry anti-tetanických protilátek zvýšily nad základní hodnotu v den 14, maxima dosáhly v den 49 a během celého testu zůstávaly zvýšené (obr. 22). Ve skupině, které byla podána kombinace hlF a h3Dl v den 0 (skupiny B a D) se u žádného zvířete ze 6 v den 42 nezjistil významný titr anti-tetanických protilátek. Po opakované imunizaci tetanickým toxoidem v den 42 nedošlo u zvířat ve skupině B, i přesto, že nebyla podána další dávka anti-B7 protilátek, ke vzniku významné protilátkové odpovědi na tetanus (obr. 22). Analýza séra ukázala významné koncentrace hlFl a h3Dl v séru v den 42 (průměrná sérová koncentrace > 10 mg/ml). Zvířata ve skupině D dostala další infusi hlFl a h3Dl v den 42 před reimunizací tetanickým toxoidem. Všechna tři zvířata v této skupině měla titry anti-tetanických protilátek pod detekovatelnými limity v průběhu celé studie. Ve skupině C měla zvířata, kterým byl podán salinický roztok v den 0 a h3Dl a hlFl pouze v den 42, primární protilátkovou odpověď proti «·

100 # · · «· • 9 · · *· • · *· • ·· W · • 9 ·· • 999 ····· ·* ·· • * 9 « 9

9 99 • 9 9 · 99

99 ♦ · 9 99 tetanu podobnou jako zvířata v kontrolní skupině A (salinický roztok). Nicméně, průměrný protilátkový titr pozorovaný v sekundární odpovědi ve skupině C byl nižší než průměrný protilátkový titr pozorovaný v sekundární odpovědi ve skupině A (obr. 22).

Sérové koncentrace hlFl a h3Dl byly sledovány během testu a pokud se snížily pod detekovatelné limity, byly skupiny B, C a D imunizovány potřetí tetanickým toxoidem. Každá skupina byla reimunizována 112 dnů po poslední infusi anti-B7 protilátek a nebylo aplikováno další ošetření anti-B7 protilátkami. V tuto dobu všechna zvířata reagovala tvorbou anti-tetanických protilátek s kinetikou podobnou primární protilátkové reakci (obr. 22) .

Závěr:

Tato data ukazují, že inhibice ko-stimulace blokováním B7-1 a B7-2 pomocí anti-B7-l a anti-B7-2 protilátek může dramaticky potlačit primární protilátkovou odpověď na tetanus, stejně jako sekundární protilátkovou odpověď. Dále tato data ukazují zotavení z imunosuprese, což naznačuje, že v tomto testu nebylo dosaženo dlouhodobé tolerance proti tetanu.

Proto může podání anti-B7 protilátek současně s expozicí novému antigenu (např. imunizací proti tetanu) bránit rozvoji nové protilátkové odpovědi a může snížit sílu sekundární odpovědi na stejný antigen. Jelikož mnoho onemocnění se exacerbuje vznikem takových protilátek, může léčba kombinací anti-B7 mAb bránit vzniku ' takových protilátek. Jedním takovým onemocněním je vznik inhibičních protilátek na podávané faktory VIII nebo IX u hemofiliků, což snižuje účinnost těchto život zachraňujících sloučenin. Léčba hemofiliků antí-B7 mAb brání nebo redukuje tvorbu inhibičních φφ • φ φ φ · φ φ φ φ φφ φ

101

• φ φ φ

protilátek.

Příklad 19: Farmakodynamiky anti-B7-l (hlFl) a anti-B7-2 (h3Dl) v kombinaci nebo samostatně v dávkách 0,01, 0,1 nebo 10 mg/kg v modelu imunizace makaků tetanickým toxoidem

Souhrn:

Schopnost různých dávek jednotlivých anti-B7-l nebo antiB7-2 protilátek, nebo kombinace anti-B7-l a anti-B7-2 protilátek, inhibovat primární a sekundární (recall) protilátkové reakce na tetanus byla určena na modelu imunizace proti tetanu na makakách. Makakům (n=33) se podala jedna intravenosní dávka 10, 1, 0,1 nebo 0,01 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci, 10, 1, nebo 0,1 mg/kg hlFl nebo h3Dl samostatně nebo kontrolní vehikulum. Všechna zvířata byla imunizována přečištěným tetanickým toxoidem jednu hodinu po podání hlFl a h3Dl. Zvířata byla imunizována tetanickým toxoidem znovu ve 14 týdnu pro určení toho, zda se obnovila normální funkce imunitního systému po snížení hlF a h3Dl na nedetekovatelné hodnoty.

Úplné potlačení primární protilátkové odpovědi proti tetanu bylo pozorováno po jediné i.v. dávce 10 nebo 1 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci, zatímco dávka 0,1 mg/kg vedla pouze k částečné supresi. Léčba hlFl nebo h3Dl samotnými nebyla v potlačení protilátkové odpovědi proti tetanu tak účinná jako stejné dávka hlFl a h3Dl v kombinaci.Všechna zvířata ve všech skupinách produkovala vysoký titr protilátek proti tetanu po druhé imunizaci tetanickým toxoidem, poté, co se koncentrace hlFl a h3Dl snížily na nedetekovatelné hodnoty. Toto ukazuje obnovení normální funkce imunitního systému po odeznění účinku

102 hlFl a h3Dl a dlouhodobá tolerance proti tetanu nebyla v tomto testu dosažena.

Materiály a metody:

Zvířatům byla podána jedna i.v. dávka testovaného nebo kontrolního (vehikulum) přípravku v den 0 podle tabulky 9. testovaný nebo kontrolní přípravek byl podán infusí do periferní žíly pomocí pumpy rychlostí 0,1 ml/min/kg (maximální rychlost 1 mg/min/kg). V t = 1 hodina v den 0 byl zvířatům podán přečištěný tetanický toxoid (Massachusetts Biologie Laboratories, Umass, Jamaica Plain, MA) v dávce 10 Lf jednotek (limit flokulace) pomocí i.m. injekce a 10 Lf jednotek i.d. injekcí. V t = 14 týdnů byl zvířatům podán podruhé přečištěný tetanický toxoid v dávce 10 Lf jednotek i.m. injekcí a 10 Lf jednotek i.d. injekcí. Vzorky krve se odebíraly punkcí žíly v daných časech do 3024 hodiny (126 dnů) po aplikaci dávky. Sérové koncentrace protilátek proti tetanu (IgM a IgG) se určovaly ELISA.

Tabulka 9: Skupiny a dávkování

Skupina	Počet zvířat	Dávka protilátky (mg/kg)	Testované činidlo
1	3	0	vehikulum
2	3	10	hlFl
3	3	1	hlFl
4	3	0,1	hlFl
5	3	10	h3Dl
6	3	1	h3Dl
7	3	0,1	h3Dl
8	3	10a	hlFl a h3Dl
9	3	la	hlFl a h3Dl
10	3	0, la	hlFl a h3Dl
11	3	0, 01a	hlFl a h3Dl

	•9 · 4« 44 44 4 « 4 4 · · · · 4 4	• 44
	4 4 «449 49	•
103	4 4 44 «44444 · • 9 4 4 4 4 9 444« 444 «4 44 «4	• 4 494

Tvorba protilátek proti tetanu

Všechna zvířata ošetřená vehikulem produkovala detekovatelný titr protilátek proti tetanu od 14 dne po imunizaci (tabulka 10, obr. 23, 24 a 25). Léčba dvěma nejvyššími dávkami (10 nebo 1 mg/kg) hlFl a h3Dl v kombinaci zcela potlačila tvorbu detekovatelného titru protilátek během 14-týdenní periody u všech zvířat. Částečné potlačení protilátkové odpovědi bylo pozorováno u zvířat ošetřených 0,1 mg/kg, kdy jedno ze tří zvířat produkovalo detekovatelný titr protilátek. Všechna zvířata ošetřená dávkou 0,01 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci produkovala detekovatelný titr protilátek; nicméně, tento titr byl o řád nižší než titry pozorované v kontrolní skupině (vehikulum), což naznačuje, že bylo dosaženo určitého potlačení protilátkové odpovědi.

·♦

104

Tabulka 10: Počet makaků, u kterých došlo ke vzniku detekovatelného titru protilátek proti tetanu po primární imunizaci tetanickým toxoidem během léčby hlFl a h3Dl

Skupina	Léčba	Počet zvířat produkujících detekovatelný titr
1	Vehikulum	3
2	10 mg/kg hlFl	1
3	1 mg/kg hlFl	3
4	0,1 mg/kg hlFl	2
5	10 mg/kg h3Dl	1
6	1 mg/kg h3Dl	1
7	0,1 mg/kg h3Dl	3
8	10 mg/kg hlFl a h3Dl	0
9	1 mg/kg hlFl a h3Dl	0
10	0,1 mg/kg hlFl a h3Dl	1
11	0,01 mg/kg hlFl a h3Dl	3

Když jsou skupiny s dávkou 0,1, 1 a 10 mg/kg brány společně, tak léčba buď hlFl (obr. 24) nebo h3Dl (obr. 25) není tak účinná jako léčba kombinací hlFl a h3Dl (obr. 23). Léčba hlFl samotnou (skupiny 2, 3 a 4) vedla u 6/9 (66%) zvířat ke vzniku detekovatelné protilátkové reakce proti tetanu. Léčba h3Dl samotnou (skupiny 5, 6 a 7) vedla u 5/9 (55%) zvířat ke vzniku detekovatelné protilátkové reakce proti tetanu, zatímco pouze 1/9 (11%) zvířat mělo detekovatelné protilátky po léčbě kombinací hlF a h3Dl (skupiny 8,9a 10). Skupina 11 nebyla zahrnuta v těchto srovnáních, protože hlFl a h3Dl nebyly podány samostatně v dávkách 0,01 mg/kg.

Při dávkách 1 a 10 mg/kg nebyly přítomny detekovatelné

105 «·· anti-tetanické protilátkové odpovědi u jakéhokoliv ze zvířat léčených hlFl a h3Dl v kombinaci; nicméně, při obou těchto dávkách byly detekovatelné protilátky u zvířat léčených hlFl a h3Dl samostatně.Když byla zvířata léčena dávkou 0,1 mg/kg, tyk byly protilátky detekovatelné u zvířat ze všech tří skupin; nicméně, byly nižší incidence (1/3) ve skupině léčené kombinací než ve skupinách léčených hlFl (2/3) nebo h3Dl (3/3) .

Obr. 26 ukazuje plochu pod křivkou titru protilátek proti tetanu (AUC) pro každou skupinu. Tyto hodnoty AUC byly vypočteny z křivek titru protilátek uvedených na obr. 23, 24 a 25. Hodnoty AUC byly vypočteny z týdnů 0 až 14. Pro započtení počtu reagujících zvířat v každé skupině byly AUC hodnoty relativizovány frakcí počtu zvířat v každé skupině, které produkovaly detekovatelné titry protilátek. Tento graf ukazuje kumulativní velikost titru protilátek neboli sílu protilátkové odpovědi během 14 týdenního pozorování. Zvířata léčená 10 nebo 1 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci (skupiny 8 a 9) vykazovala 100% potlačení (AUC = 0) protilátkové odpovědi ve srovnání s kontrolní skupinou. Léčba 0,1 nebo 0,01 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci (skupiny 10 a 11) potlačila protilátkovou odpověď o 78% nebo 86% (AUC = 402 nebo 253 log titru.hod.), v příslušném pořadí, ve srovnání s kontrolní skupinou. Protilátková odpověď byla potlačena o 8,6% až 99% (AUC = 1640 až 5,04 log titru.hod.) vzhledem ke kontrolní skupině u zvířat léčených hlFl nebo h3Dl samostatně (skupiny 2-7). Tato data ukazují, že léčba hlFl nebo h3Dl samostatně není v potlačení protilátkové odpovědi proti tetanu tak účinná jako léčba hlFl a h3Dl v kombinaci.

Po reimunizaci tetanickým toxoidem 14 týdnů po podání hlFl a h3Dl produkovala všechna zvířata ve všech skupinách vysoký

106 • A * 99 ·· AA • A A A A · A ·A • · A A A AAAA • 9 9 A A AAA AAAA • ♦ AS A A AA

AAAA AAA A· AA «· AAA titr protilátek proti tetanu (>3 log titr)_r což ukazuje, že po odeznění léčby hlFl a h3Dl došlo k obnovení normální imunitní funkce a že dlouhodobá tolerance proti tetanu nebyla v tomto testu dosažena. Zvířata ošetřená 10 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci vykazovala oddálenou protilátkovou reakci s detekovatelnými titry protilátek pozorovanými 14 dnů po imunizaci, kde tato odpověď byla podobná primární protilátkové odpovědi, což naznačuje, že odpověď na první imunizaci byla zcela blokována. Všechna ostatní zvířata vykazovala zvýšení titru protilátek 7 dnů po imunizaci, což se spíše podobá sekundární reakci než primární reakci.

Závěry:

Kompletní potlačení primární protilátkové odpovědi proti tetanu bylo pozorováno po jedné i.v. dávce 10 nebo 1 mg/kg hlFl a h3Dl v kombinaci, zatímco dávka 0,1 mg/kg vedla k pouze částečné supresi. Léčba hlFl nebo h3Dl samostatně nebyla v potlačení protilátkové odpovědi proti tetanu stejně účinná jako stejné dávky hlFl a h3Dl v kombinaci. Všechna zvířata ve všech skupinách produkovala vysoké titry protilátek proti tetanu po druhé imunizaci tetanickým toxoidem poté, co se koncentrace hlFl a h3Dl snížily pod limit detekce. Toto ukazuje, že po odeznění léčby hlFl a h3Dl došlo obnovení normální imunitní funkce.

Příklad 20: Sérový poločas anti-B7 protilátek u non-lidských primátů

Myší anti-hB7-l a myší anti-hB7-2 mAb byly testovány na primátech za účelem stanovení sérového poločasu a saturace cílových buněk. Třem makakům byla podána jedna dávka 2, 8 nebo 20 mAb/kg tělesné hmotnosti kombinace anti-hB7-l a anti-hB7-2 >·

1Λ7 ♦ ·········· ^ιν/ · ·«··«· ···· «·· ·· ·· · · · mAb. U opic se analyzovala vazba mAb na PBMC (proliferující krevní mononukleární buňky), sérová koncentrace mAb a protilátková odpověď primáta na myší protilátku (PAMA) (tabulka 11). Saturace PBMC byla stanovena průtokovou cytometrií (FACS), při které byly PBMC izolované z krve primátů, kterým byla podána mAb, barveny kozím anti-myším IgPE (% in vivo) nebo PBMC nejprve reagovaly s anti-hB7-l a anti-hB7-2 mAb a potom se provedla detekce kozím anti-myším Ig-PE (% ex vivo). Úroveň saturace PBMC v různých časech se vypočetla podle vzorce: (% in vivo/% ex vivo) x 100. Tento test ukázal, že saturace PBMC pro anti-hB7-l a anti-hB7-2 mAb klesá pod 80% mezi dny 4 až 6 (mAb @ 2 mg/ks), dny 6 až 8 (mAb @ 8 mg/ks) a dny 13 až 20 (mAb @ 20 mg/ks), v závislosti na dávce mAb. Ačkoliv nebylo provedeno přímé měření, nebyl přítomen významný pokles počtu cirkulujících B7⁺ buněk.

Sérové poločasy anti-hB7-l a anti-hB7-2 mAb byly měřeny pomocí specifické ELISA pro každou mAb za použití hB7-lIg nebo hB7-2Ig jako cíle a kozího anti-myšího Ig HRP/ABTS pro detekci. Tyto testy byly sensitivní do 400 ng/ml a 200 ng/ml pro anti-hB7-l a anti-hB7-2, v příslušném pořadí. PAMA odpovědi byly měřeny za použití komerčně dostupného kitu. Sérové koncentrace dvou anti-hB7 mAb a PAMA odpovědi jsou uvedeny pro jednotlivé dávky každé mAb. Obě mAb vykazovaly podobné sérové poločasy přibližně 48, jak bylo určeno pro všechny tři dávky. Zvyšující se dávky mAb zvyšovaly sérové koncentrace mAb srovnatelně při všech testovaných dávkách a časech. Při podání v dávce 20 mg/kg byly pro každou mAb v den 6 po aplikaci zjištěny cirkulující koncentrace mAb >30 μρ/ιηΐ.

PAMA reakce na anti-hB7-l a anti-hB7-2 mAb byly nízké a byly poprvé měřitelné od 10 dne po snížení sérových koncentrací mAb pod 10 μρ/ιηΐ.

Α·

108

Sérové poločasy humanizovaných protilátek proti lidskému B7-2 a B7-1 byly také určeny u makaků (n=6), kterým byla podána jedna dávka 10 mg/kg humanizované anti-B7-2 protilátky. Sérové koncentrace byly monitorovány specifickým ELISA testem pro každou protilátku za použiti HRP-anti-lidský IgG2 a ABTS.

Obr. 27 ukazuje sérové koncentrace humanizované B7-2 a humanizované B7-1 mAb u makaků během 42 dnů po aplikaci dávky.

Humanizované anti-lidský B7-2 a anti-lidský B7-1 mAb vykazovaly prodloužený sérový poločas u makaků ve srovnáni s hodnotou přibližně 2 dny pro myši anti-lidský B7-2 a antilidský B7-1 mAb, když byly podány ve stejné dávce, což dokazuje, že humanizované protilátky proti lidskému B7 se udržuji v cirkulaci mnohem déle než myši anti-B7 mAb.

·· • · • · ♦ · · « · • * ··

109 r · « · «··· ·· ·» «

Λ o φ 4-> '03 β

Η

Μ

ÍL

Φ α

•3 +4 cn ω

4->

XI υ

X U •Η

C •Η ι—( X

Φ

ÍX >ι

Λ Ό

Φ ι—I cn >

<ύ X ι—I

Λ 05 Η ^;

120 mg každé mAb/kg—:---1

<u Q Λ CO

o

A Ό

-

o X

2

o o

-

-

5o

řs

OĎ

ob V Z

z

Z

Z

z

Z

z

z

z

Z

z

z

Z

Zl> υ Z

Γ- Α

g

ΜΛ?Ρ_____

cm rcn

bii

•U P CQ

oo A

© Γ— cn

rCM «η

oo rt A

O ’Τ

r; NT

oo γμ

-

Ά OO

A) Ά)

m

Ox <*»

u CX

e mAb/kg—|

PBL saturace

©

a rs

© 2

2

©

2

© ©

=

Ά A

O

mg každ

< <

aú c

4J Z

H Z

H Z

r* Z

Cm Z

H Z

H Z

H Z

H Z

z

Z

H Z

Z

cůj z

© oo O xr

3 rr

dávka 8 1

l Anti-hB7-2 i

U c ab n.

-J cy m

Ό O CM

CM CM

> ΓΜ CM

o m <M

o m

CT·

m o

•ΖΊ

00

Q\ rn

_J θ' ffl

-J θ' Ώ

5 ca

mAb/kg—|

I PBL saturace

IŘ

o

©

©

© r—

A Γ

A O

A O

•A

Ξ

g každé i

< < Cm

c Qů C

ůjj Z

r- Z

H Z

H Z

H Z

t—< Z

— “z

t— Z

Z

H Z

Z

Z

2

CtJ υ Z

30 O ZN Al

o o A4

I-dávka 2 m

cm 3 c <

U ob d_

U O ca

3

A

ΓΜ A

Al a

© a

T

O Α»

A

T ri

& ©

O m

CX ca

ž'

1 có ' 05 Ό LJ

hodiny -/ΤΧλ,Λ—

2j

o L

rΌ

a

-

m

-

oo

Q T ai

S CM DO ^ř

Q rf O cx

Q © rt M·

5 30 ai O

2 2 v o CM ©.

CM O — m ΓΑ —<

O Q 22 ° Al

S Q oo rO Js

xn a oo A

Ο d '05 > ο 4-> cn 4-> φ φ β

II

Η Ζ

C t-H

Φ X •Η Ρ

Ο C Ό

Ο X

Ό Ο (X

II

Ρ1

Ο

PQ

110

	•		··	·♦		··		•
• ·	··	•	•	• ·	•		9	··
•	4	•	•	• ·	•		9	•
•	• f!	•	•	···	• ·		•	•
•	•	•	•	•	•		•	•
····	···		··	9·		99		999

Přiklad 21: Inhibice specifické T-lymfocytární odpovědi na superantigeny (toxin-1 syndromu toxického šoku; TSST-1)

NOD scid myši byly osídleny lidskými lymfocyty podáním 10⁸ lidských PBL. Po 28 dnech byl myším podán TSST-1 (10 mg, i.p.) s nebo bez podání kombinace protilátek proti lidskému B7-1 a B7-2 (50 mg, i.v.). Po dalších 14 dnech se přítomnost lidských lymfocytů, T-lymfocytů a T-lymfocytů specifických pro TSST-1 (vP2-TCR-buněk) v peritoneální dutině měřila FACS za použití protilátek specifických pro lidský CD45, CD4 a lidský Vp2-TCR.

Tabulka 12

Aplikace	Lidské T-lymfocyty (%)
TSST-1	anti-B7-l a anti-B7-2	Celkem	νβ2+
-	-	10,2	3,9
+	-	27,4	12,0
+	+	23,4	3,8

Výsledky:

Tabulka 12 ukazuje poměr celkových lidských T-lymfocytů a Vp2⁺-TCR lidských T-lymfocytů (specifických pro TSST-1) v peritoneální dutině hu-NODscid myší. Podání TSST-1 značně zvyšuje procento lidských T-lymfocytů a TSST-1 specifických lidských T-lymfocytů (Vp2⁺) u huNOD-scid myší. Podání antilidský B7-1 a B7-2 mAb středně snižuje celkový počet lidských T-lymfocytů a zcela inhibuje expanzi lidských T-lymfocytů specifických pro TSST-1, což ukazuje, že anti-B7 mAb mohou účinně inhibovat reakce lidských T-lymfocytů na superantigen.

111 • « « · · · · · « • · · · ······ · · • · ·· ···· ···· ··· ·· ·· ·· ···

Přiklad 22: Hodnocení anti-B7 protilátek hlFl (anti-B7-l) a h3D3 (anti-B7-2) modelu transplantace ledviny na makacích

Souhrn:

Tento pokus byl proveden pro hodnocení účinnosti a kompatibility monoklonálních protilátek hlFl (anti-B7-l) a h3D3 (anti-B7-2) v modelu transplantace ledviny na makacích. Účinnost a kompatibilita těchto protilátek byla hodnocena tehdy, když byly podávány v monoterapii, stejně jako v kombinaci s běžnými imunosupresivními činidly, jako je cyklosporin A (CsA) , rapamycin a steroidy.

samců makaků byla transplantována ledvina od dárce s kompatibilní krevní skupinou a neodpovídající smíšenou lymfocytární reakcí (MLR). Příjemci transplantátu byly studováni postupně v 6 skupinách, kterým byly podávány následující kombinace imunosupresivních činidel po dobu prvních 56 dnů po operaci (poDny) a potom byly po dobu dalších 65-66 dnů (celková maximální doba sledování byla 119-120 dnů) bez další léčby:

Skupině 1 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek podle protokolu A: hlFl 20 mg/kg + h3Dl 20 mg/kg preoperačně, potom hlFl 5 mg/kg + h3Dl 5 mg/kg pooperačně a hlFl 5 mg/kg + h3Dl 5 mg/kg každých 7 dnů do dnu po operaci 56; celkem 9 aplikací.

Skupině 2 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek podle protokolu B: hlFl 5 mg/kg + h3Dl 5 mg/kg preoperačně, potom hlFl 10 mg/kg + h3Dl 10 mg/kg bezprostředně po operaci a znovu v den 3 po operaci, a potom 5 mg/kg každé protilátky po 8 následujících dnů v týdenních intervalech od dne 7 po operaci a do dne 56 po operaci.

112

• ·	• · ·	0 0	0 0 0
•	•	0	0 0	0	0	•
•	0	0 0	• 0 0	0	0 0	0
•	0	0	0	0	0	0
0 0 0 0	0 0 0	0 0	00		• 0		0 0

Skupině 3 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek podle protokolu A plus mikroemulze CsA v dávce dostatečné pro udržení koncentrace během 24 hodin 200 až 300 ng/ml od dne 0 do dne 14 po operaci, potom ve snížené dávce pro dosažení průběžných koncentrací CsA během 24 hodin 150 až 250 ng/ml od dne 15 do dne 56 po operaci.

Skupině 4 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek (hlFl a h3Dl) podle protokolu A v kombinaci s klesající dávkou steroidů: methylprednisolonem v dávce 2 mg/kg i.v. po operaci a potom denně do dne 2 po operaci, potom prednisonem v dávce 0,5 mg/kg, která se snižovala o 0,05 mg/kg každé tři dny do dosažení dávky 0,2 mg/kg, která byla podávána do dne 56 po operaci.

Skupině 5 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek (hlFl a h3Dl) podle protokolu A v kombinaci s rapamycinem: rapamycin 1 mg/kg po operaci a potom denně do dne 13 po operaci a potom 0,5 mg/kg denně do dne 56 po operaci.

Skupině 6 byla podávána mikroemulze CsA v dávce dostatečné pro udržení koncentrace během 24 hodin 200 až 300 ng/ml od dne 0 do dne 14 po operaci, potom ve snížené dávce pro dosažení průběžných koncentrací CsA během 24 hodin 150 až 250 ng/ml od dne 15 do dne 56 po operaci.

Skupině 7 byl podáván rapamycin v dávce 1 mg/kg ve dny 0 až 13 po operaci a potom v dávce 0,5 mg/kg denně od dne 14 do dne 56 po operaci.

Zvířata byla utracena před dnem 12 po operaci, pokud stoupla koncentrace kreatininu nad 8,0 mg/dl, což se

113

• ·	• · ·	• · · · ·
•	•	•	• · · ·	•
•	•	• ·	• · · · · «	•
•	•	•	• · ·	•
• · · ·	• · ·	• 4	O · ·		• ·

považovalo za důkaz konečné fáze rejekce ledviny.

Přežíváni transplantovaných a léčených makaků je uvedeno v tabulce 13.

Tabulka 13: Přežívání a diagnosa transplantovaných, léčených makaků

Testovaná skupina	Léčebný protokol: anti-B7-l + anti-B72/jiná léčba	Přežívání (dny po operaci)*
historické kontroly	bez terapie	10
1	Protokol A/0	9, 48, 119, 119
2	Protokol B/0	12, 14, 18, 120
3	Protokol A/CsA	96, 119, 119, 119
4	Protokol A/steroidy	6, 77, 111, 119
5	Protokol A/rapamycin	69, 73, 81, 114
6	žádná mAb/CsA	22, 25, 38, 71
7	žádná mAb/rapamycin	11, 18, 27, 35

* příjemci ledvin přežívající do dne 119/120 byli utraceni z důvodu protokolu pokusu

Výsledky tohoto pokusu ukazují, že léčba primátů s transplantovanou ledvinou kombinací B7-1 a B7-2 monoklonálních protilátek vede k dlouhodobému přežívání. Přežívání štěpu bylo pozorováno po dobu až 66 dnů po ukončení léčby u 50% zvířat ve skupině 1. Naopak, protilátky podávané podle protokolu B, použitého ve skupině 2, nebyly dostatečné pro zabránění epizodám časné akutní rejekce u 3 ze 4 léčených zvířat a pouze jedno zvíře z této skupiny přežívalo 120 dnů. Kombinace protokolu A s mikroemulzí CsA vedla k dlouhodobému přežívání všech zvířat bez známek antagonistického imunosupresivního efektu CsA na dříve demonstrovanou účinnost

114 • * · · · · · · • · · · ·····» · φ · · · · β ·

ΦΦ·· ··· Φ· · φ ·« · protilátek. Ve skupině 4 neantagonizovalo současné podáváni steroidů s protilátkami imunosupresivni efekt protilátek v tomto modelu. Ve skupině 4 neantagonizovalo současné podáváni rapamycinu s protilátkami imunosupresivni efekt protilátek v tomto modelu. Ve skupině 6 vedla léčba CsA samotným k časnému odmítnuté transplantované ledviny u většiny zvířat. Výsledky dosažené v této skupině byly horší než výsledky získané při kombinované léčbě anti-B7 protilátkami samotnými (skupina 1) nebo kombinovanými protilátkami + CsA (skupina 4). Ve skupině 7 vedla léčba rapamycinem samotným k časnému odmítnuté transplantované ledviny u všech zvířat. Výsledky dosažené v této skupině byly horší než výsledky získané při kombinované léčbě anti-B7 protilátkami samotnými (skupina 1) nebo kombinovanými protilátkami + rapamycinem (skupina 5).

Proto jsou monoklonální protilátky hlF a h3Dl účinné v prevenci časné terminální rejekce v modelu transplantace ledviny na primátech. Protilátky jsou kompatibilní s jinými imunosupresivy a zdá se, že jejich účinnost je zvýšena kombinací s mikroemulzí CsA, rapamycinem nebo steroidy.

Následující test byl rozdělen do dvou fází. Cílem první fáze bylo definování účinnosti nových imunosupresivních protilátek hlFl a h3Dl, když jsou podány jako monoterapie makakům s transplantovanou ledvinou. Transplantovaná zvířata bez současné imunosupresivni terapie odmítla štěpy během 10 dnů po transplantaci. Pokus byl navržen pro testování dvou různých protokolů protilátkové terapie. V obou protokolech byla léčba protilátkou ukončena v den 56 po operaci a zvířata byla potom sledována do odmítnutí štěpu nebo do dne 119-120.

Druhá fáze této studie byla navržena pro testování toho

115

zda: (a) hlFl a h3Dl, při podání v kombinaci s CsA, rapamycinem nebo steroidy, antagonizují imunosupresivní efekt CsA, rapamycinu nebo steroidů, což by vedlo ke zkrácení přežívání štěpu; nebo (b) CsA, rapamycin nebo steroidy antagonizují imunosupresivní účinnost hlF a h3D buď během simultánní terapie (den 0 až den 56 po operaci) nebo po ukončení veškeré imunosupresivní terapie (> den 56 po operaci).

Materiály a metody:

Zvířata:

Samci makaků, Macaca fascicularis, o hmotnosti 5 až 8 kg, byli použiti v tomto pokusu. U zvířat byla provedena typizace krevních skupin. Dárci a příjemci byly spárováni tak, aby odpovídaly v ABO krevní skupině, měli negativní křížový test a stimulační index alespoň 2,5 ve dvoucestné MLR.

Testované a kontrolní přípravky:

hlFl a h3Dl:

Anti-B7 protilátky byly podány injekčně ve stříkačce napojené na pumpu. hlFl a h3Dl byly podány již ve směsi maximální rychlostí infuse 1 mg/kg/min periferním žilním katetrem.

Protilátky byly podány podle různých protokolů, které jsou definovány pro každou skupinu.

Mikroemulze CsA (Neoral):

Mikroemulze CsA (Neoral; 100 mg/ml (Novartis)) byla uchovávána při teplotě místnosti a byla chráněna před světlem. Vypočítaný objem Neoralu nutný pro požadovanou dávku (v mg/kg) byl odebrán přímo do nejmenší možné injekční stříkačky a byl aplikován bez jakéhokoliv ředění nasogastrickou sondou přímo • ·

116 do žaludku.

Methylprednisolon a prednison:

Methylprednisolon (Solu-Medrol, Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI) byl dodán ve fiolách s obsaženou sterilní vodou pro rekonstituci a byl rekonstituován podle návodu výrobce. Po rekonstituci se lék uchovával v chladničce a byl vyhozen po 48 hodinách.

Prednison (Mutual Pharmaceutical Co., Inc., Philadelphia, PA) byl dodán v tabletách (5 mg). Tablety se rozpustily ve sterilní vodě, jedna tableta na 5 ml vody, s výslednou koncentrací roztoku 1 mg/ml. Zbytek léku se vyhodil po ukončení aplikace každý den.

Průběh pokusu:

Celkem 24 opicím byla provedena jednostranná transplantace ledviny.

Skupina 1: hlFl a h3Dl v monoterapii (protokol A):

Skupině 1 byla podávána kombinace anti-B7 protilátek v monoterapii podle protokolu A: hlFl 20 mg/kg + h3Dl 20 mg/kg preoperačně, potom hlFl 5 mg/kg + h3Dl 5 mg/kg pooperačně a hlFl 5 mg/kg + h3Dl 5 mg/kg každých 7 dnů do dnu po operaci 56.

Skupina 2: hlFl a h3Dl v monoterapii (protokol B):

Hlavní rozdíl mezi protokoly A a B byl v tom, že v protokolu B byla první dávka po operaci snížena z 20 mg/kg na 5 mg/kg, dávka bezprostředně po operaci byla zvýšena z 5 mg/kg na 10 mg/kg a další dávka 10 mg/kg byla podána v den 3 po operaci. Zbytek aplikací po operaci byl stejný jako • ·

9

99 9 • · 4 · · ♦ 4 «· • · · · · 99 · · · · 4 4 · 4« • · 4 · 99

999 9 9 99 9 99 v protokolu A. Proto bylo celkové množství protilátky podané po operaci každému zvířeti stejné v protokolu A a B.

Skupina 3: hlFl a h3Dl (protokol A) plus CsA:

Ve skupině 3 byla léčba protilátkami (protokol A) kombinována s denním orálním podáváním mikroemulze CsA. Skupině 3 byla podávána kombinace protilátek podle protokolu A plus mikroemulze CsA v dávce dostatečné pro udržení koncentrace během 24 hodin 200 až 300 ng/ml od dne 0 do dne 14 po operaci, potom ve snížené dávce pro dosažení průběžných koncentrací CsA během 24 hodin 150 až 250 ng/ml od dne 15 do dne 56 po operaci.

Mikroemulze CsA byla podávána denně ve formě nápoje po krátké sedací ketaminem, který byl také podán v nápoji. Průběžné 24-hodinové koncentrace CsA byly měřeny třikrát za týden a denní dávka byla upravena tak, aby bylo dosaženo cílových průběžných koncentrací CsA. Další úpravy dávky CsA byly provedeny pro prevenci nadměrné ztráty hmotnosti nebo tehdy, když se usoudilo, že porucha funkce ledvin souvisí s průběžnými koncentracemi CsA.

Skupina 4: hlFl a h3Dl (protokol A) plus steroidy:

Skupině 4 byly hlFl a h3Dl podávány podle protokolu A v kombinaci s klesající dávkou steroidů: methylprednisolonem v dávce 2 mg/kg i.v. po operaci a potom denně do dne 2 po operaci, potom prednisonem v dávce 0,5 mg/kg, která se snižovala o 0,05 mg/kg každé tři dny do dosažení dávky 0,2 mg/kg, která byla podávána do dne 56 po operaci.

Po dobu prvních 3 dnů po operaci (den 0 až 2 po|bperaci) byl zvířatům podáván methylprednisolon v dávce 2 mg/kg

118 intravenosně bolusovou injekcí. Od dne 3 do dne 56 po operaci byl zvířatům zklidněným ketaminem podáván prednison v nápoji v postupně klesající dávce (viz obr. 4) od 0,5 mg/kg do 0,2 mg/kg.

Skupina 5: hlFl a h3Dl (protokol A) plus rapamycin

Skupině 5 byly hlFl a h3Dl podávány podle protokolu A v kombinaci s rapamycinem: rapamycin 1 mg/kg po operaci a potom denně do dne 13 po operaci a potom 0,5 mg/kg denně do dne 56 po operaci.

Skupina 6: CsA samotný

Skupině 6 byla podávána mikroemulze CsA v dávce dostatečné pro udržení koncentrace během 24 hodin 200 až 300 ng/ml od dne 0 do dne 14 po operaci, potom ve snížené dávce pro dosažení průběžných koncentrací CsA během 24 hodin 150 až 250 ng/ml od dne 15 do dne 56 po operaci.

Mikroemulze CsA byla podávána denně ve formě nápoje po krátké sedací ketaminem. Průběžné 24-hodinové koncentrace CsA byly měřeny třikrát za týden a denní dávka byla upravena tak, aby bylo dosaženo cílových průběžných koncentrací CsA. Další úpravy dávky CsA byly provedeny pro prevenci nadměrné ztráty hmotnosti nebo tehdy, když se usoudilo, že porucha funkce ledvin souvisí s průběžnými koncentracemi CsA.

Skupina 7: Rapamycin

Rapamycin byl podáván v nápoji po zklidnění ketaminem. Ve skupině 7 byl rapamycin podáván v dávce 1 mg/kg ve dny 0 až 13 po operaci a potom v dávce 0,5 mg/kg denně od dne 14 do dne 56 po operaci.

Výsledky a diskuze:

Φ · φ φ · ·· ·· • · · · · · · * · «φ φφ φφφφ φφ φ · · · ······ φ • φ φ φ · φ φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φ

119

Historická kontrola: Transplantace ledviny bez léčby

Historická data ukazuji, že u makaků, u kterých byla provedena transplantace ledviny a kterým nebyla podávána žádná léčba, došlo vždy k rejekci transplantované ledviny do 10 dnů po transplantaci.

Skupina 1: Monoterapie hlFl a h3Dl podle protokolu A ze 4 zvířat léčených kombinací anti-B7-l + anti-B7-2 mAb podle protokolu A si zachovala funkční transplantát do konce pokusu (120 den), zatímco u druhých dvou zvířat došlo k rejekci transplantované ledviny během léčby (den 9 a den 48). Tak si 3 ze 4 příjemců ledviny léčení podle protokolu A zachovali transplantovanou ledvinu mnohem déle než historické kontroly, což dokazuje účinnost anti-B7 terapie v prevenci rejekce transplantovaných ledvin.

Skupina 2: Monoterapie hlFl a h3Dl podle protokolu B

Oproti skupině 1 si pouze 1 ze 4 zvířat léčených anti-B7 protilátkami podle protokolu B zachovalo funkční transplantovanou ledvinu po dnu 18 po operaci. Nicméně, toto zvíře si zachovalo transplantovanou ledvinu do konce pokusu (den 120 po operaci). Tato data naznačují, že léčba anti-B7 mAb podle protokolu A vede k lepší imunosupresi rejekce ledviny než léčba podle protokolu B. Toto může být způsobeno vyššími koncentracemi anti-B7 mAb, které jsou přítomny časně po transplantaci u zvířat léčených podle protokolu A.

Skupina 3: Terapie hlF a h3Dl podle protokolu A plus mikroemulsí CsA

120

Všechna zvířata léčená anti-B7 mAb podle protokolu A v kombinacijs CsA vykazovala značně oddálenou rejekci transplantovaných ledvin a 3 ze 4 zvířat si zachovaly funkční štěp do konce pokusu (den 119 po operaci). Tyto výsledky jsou lepší než výsledky získané po léčně anti-B7 mAb samotnými (skupina 1) nebo CsA samotným (skupina 6), což dokazuje, že neexistuje antagonismus mezi léčbou anti-B7 mAb a CsA a že současná léčba těmito činidly dále oddaluje rejekci transplantátu.

Skupina 4: Terapie hlF a h3Dl podle protokolu A plus methylprednisolon/prednison ze 4 zvířat léčených kombinací anti-B7 mAb + steroidy si zachovalo transplantovanou ledvinu do konce pokusu (den 119 po operaci). U tří zbývajících příjemců ledviny došlo u dvou k oddálené rejekci transplantovaných ledvin. Třetí opice odmítla transplantovanou ledvinu brzy (v den 6 po operaci) v důsledku nekrosy ureteru, která byla patrně způsobena podáním vysoké dávky steroidů. Dohromady tato data naznačují, že kombinace anti-B7 mAb + steroidů jsou účinné v prevenci rejekce transplantované ledviny a že použití kombinace těchto činidel není kontraindikované.

Skupina 5: Terapie hlF a h3Dl podle protokolu A plus rapamycin

Všechna čtyři zvířata léčená kombinovanými anti-VB7 mAb podle protokolu A + rapamycinem si zachovala funkční transplantované ledviny po dobu delší než léčebné období, t.j. po dobu 69 až 114 dnů po operaci. Toto dokazuje, že léčba kombinací anti-B7 mAb a rapamycinem je přínosná v oddálení rejekce transplantátu a neantagonizuje léčbu anti-B7 mAb • 9 • 9 • · · 9 • · · · · • · · · · · · • · · · ·· 99 samotnými .

Skupina 6: Terapie CsA samotným

Všechna čtyři zvířata léčená CsA samotným odmítla transplantované ledviny a tři ze čtyř zvířat odmítla ledviny během léčby CsA. Tyto výsledky jsou horší než výsledky získané u zvířat léčených kombinací anti-B7 mAb + CsA.

Skupina 7: Terapie rapamycinem samotným

Všechna čtyři zvířata léčená rapamycinem samotným odmítla transplantované ledviny během léčby.

Závěr:

Cíle pokusu bylo hodnocení účinnosti a kompatibility nových monoklonálních protilátek, hlF a h3Dl, na primátům modelu transplantace ledviny. Účinnost byla hodnocena podle incidence terminální akutní rejekce a konečného přežívání štěpu (zvířete). V tomto modelu se předpokládá, že u neléčených zvířat dojde k terminální rejekci během 10 dnů po transplantaci. Kompatibilita a účinnost byly testovány v celkem 7 různě léčených skupinách. Léčebné režimy použité v posledních skupinách se vyvinuly během postupu pokusu a byly založeny na výsledcích předchozích skupin.

Hodnocení účinnosti:

Skupina 1: Monoterapie hlFl a h3Dl (protokol A)

Zvířata v první skupině byla léčena pouze hlFl a h3Dl, které byly podávány jednou týdně po dobu 56 dnů bez terapie

122 • ·· · • ·· ·· φφ φ φ φφφφ φ· φ • · φ φ φ ·· • · ♦ · · · · · to· • · · < toto • to · « φ · · φφ · dalším imunosupresivním lékem. Výsledky ukazují, že monoterapie hlFl a h3Dl byla schopna zabránit terminální akutní rejekci u 2 ze 4 zvířat v této skupině a že tato terapie oddálila terminální rejekci u další opice do dne 48 po operaci. Podávání protilátek neprodloužilo přežívání - ve srovnání s historickou kontrolní skupinou - štěpu u jedné opice.

Skupina 2: Monoterapie hlFl a h3Dl (protokol B)

Režim a protokol podávání protilátek byl změněn ve skupině za účelem prevence epizod časné rejekce pozorovaných ve skupině 1 mezi dny 5 a 7 po operaci. Předoperační dávka v této skupině byla snížena z 20 mg/kg každé mAb na 5 mg/kg a první pooperační dávka byla zvýšena z 5 na 10 mg/kg každé mAb.

Celkové množství protilátky podané perioperačně bylo tedy sníženo z 25 mg/kg na 15 mg/kg. Další dávka 10 mg/kg byla podána v den 3 po operaci. Dále byl protokol ve skupinách 1 a 2 identický.

Tři ze 4 zvířat se nezotavili z první epizody rejekce.

Pouze jedno zvíře přežívalo po celou dobu pokusu. Toto demonstruje zásadní aspekt načasování a dávky protilátek během časného peri- a pooperačního období. Snížení perioperační dávky s největší pravděpodobností vede k silnější rejekční reakci a podání další dávky protilátek v den 3 po operaci neovlivňuje tuto reakci.

Ve skupinách 1 a 2 byla přítomna zvířata s dlouhodobým přežíváním bez jakékoliv další imunosupresivní terapie.

Přímé grafické srovnání výsledků po protokolu A (skupina 1) a protokolu B (skupina 2) ukazuje lepší výsledky pro protokol * ··

123

A. Proto byly v dalších dvou skupinách protilátky podávány podle protokolu A.

Skupina 3: hlFl a h3Dl (protokol A) plus CsA:

Ve skupině 3 byla podávána dávka mikroemulze CsA, která vedla k dosažení průběžných 24-hodinových koncentrací 200-300 ng/ml. Všechna zvířata v této skupině přežívala dlouhodobě (>56 dnů) a 3 ze 4 zvířat neměli příznaky terminální akutní rejekce do konce pokusu. Proto se anti-B7 protilátky a CsA navzájem neovlivňují negativně. Medián přežívání byl 119 dnů a průměrné přežívání bylo v této skupině 113 dnů, což je alespoň stejně dobré, ne-li lepší, než délka přežití ve skupině 1 (medián: 84 dnů, průměr: 74 dnů). V další skupině, ve které byli příjemci transplantátu léčeni pouze dávkou mikroemulze CsA (skupina 6) nutnou pro dosažení podobných průběžných koncentrací jako ve skupině 3 (po dobu 56 dnů) odmítli všechny čtyři opice transplantované ledviny a tři ze čtyř odmítli ledviny během léčebného období.

Kombinace monoklonálních protilátek s mikroemulzí CsA byla dostatečná pro prevenci epizody časné akutní rejekce.

Skupina 4: hlFl a h3Dl (protokol A) plus steroidy

Ve skupině 4 byla podávána kombinace hlF a h3Dl se snižující se dávkou steroidů. Monoterapie steroidy není v tomto modelu obvykle dostatečná pro prevenci terminální rejekce allotransplantátu. Vysoké dávky steroidů byly vybrány pro tuto skupinu pro stanovení toho, zda existuje vzájemné ovlivnění účinnosti steroidů a protilátek. 1 ze 4 zvířat léčených kombinací anti-B7 mAb a steroidy si zachovalo transplantovanou ledvinu do konce pokusu (den 119 po operaci).

124

U zbylých 3 příjemců ledviny došlo u dvou k oddálené rejekci transplantované ledviny. Třetí opice odmítla transplantovanou ledvinu brzy (v den 6 po operaci) v důsledku nekrosy ureteru, která byla patrně způsobena podáním vysoké dávky steroidů.

V této skupině nebyl pozorován jakýkoliv negativní efekt současného podání vysokých dávek steroidů na účinnost protilátek. Není jasné, zda má podávání protilátek vliv na imunosupresivní účinnost steroidů, protože nejsou dostupná data týkající se účinnosti podobného steroidního režimu v monoterapii v primátím modelu transplantace ledviny.

Skupina 5: Terapie hlFl a h3Dl podle protokolu A plus rapamycin

Všechna čtyři zvířata s léčbou kombinací anti-B7 mAb podle protokolu A a rapamycinem si zachovala funkční transplantované leviny déle než po léčebné období v rozmezí od 69 do 114 dne po operaci. Toto demonstruje, že léčba kombinovanými anti-B7 mAb + rapamycinem je účinná v oddálení rejekce orgánu a neantagonizuje léčbu anti-B7 mAb samotnými. V další skupině, ve které byli příjemci transplantátu léčeni pouze dávkou rapamycinu (skupina 7) nutnou pro dosažení podobných koncentrací jako ve skupině 5 odmítli všechny čtyři opice transplantované ledviny během léčebného období.

Skupina 6: Terapie CsA samotným

Všechny čtyři opice odmítli transplantované ledviny a tři ze čtyř odmítli ledviny během léčby CsA. Tyto výsledky jsou horší než výsledky získané pro zvířata léčená kombinací antiB7-mAb + CsA.

125

Skupina 7: Terapie rapamycinem samotným

Všechny čtyři opice odmítli transplantované ledviny během léčby rapamycinem. Tyto výsledky jsou horší než výsledky získané pro zvířata léčená kombinací anti-B7-mAb + rapamycin (skupina 5).

Příklad 23: Indukční terapie monoklonálními protilátkami proti B7-1 a B7-2 oddaluje nástup rejekce renálního allotransplantátu u primátů

Souhrn:

V tomto pokusu byla testována schopnost monoklonálních protilátek anti-B7-l (hlFl) a anti-B7-2 (h3Dl) oddalovat nástup rejekce renálního allotransplantátu u opic makak rhesus. Nejdéle trvající efekt byl dosažen při simultánní blokádě obou B7 ligandů. Mechanismus účinku nezahrnoval globální depleci T nebo B lymfocytů.

Materiály a metody:

Průběh pokusu:

MHC typizace a výběr dárců-příjemců:

Kombinace dárce-příjemce byly vybrány podle genetické nonidentity v třídě II hlavního histokompatibilního komplexu (MHC). Tato byla určena elektroforesou na denaturačním gradientovém gelu a přímým sekvencováním druhého exonu hlavního histokompatibilního antigenu, HLA-DRB. Reaktivita Tlymfocytů příjemce k dárci byla potvrzena in vitro pro všechny páry dárce-příjemce testem smíšené lymfocytární reakce (MLR). Každé zvíře bylo testováno proti všem potenciálním dárcům pro stanovení nejvíce reaktivních párů pro transplantaci.

Renální allotransplantáty:

·· · ·· ·♦ ·· • · ·· · · · · · « · • · · · · · · « inr ♦ · · · · ♦♦· » * ·

120 · · * · · · · ···· ·♦* ♦ · ·· ·· >

Renální allotransplantace byly provedeny dříve popsaným způsobem. Knechtle S.J., et al., Transplantation 63: 1-6 (1997); Kirk, A.D. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 8789-8794 (1997); Kir, A.D. et al., Nátuře Medicine 5: 686-693 (1999). Stručně, nepříbuzné mladé opice makak rhesus (ve věku 18 až 36 měsíců, samci), seronegativní na virus opičí imunodeficience a herpes B virus, byli získáni od LABS of Virginia, lne. (Yemassee, SC).

Všechny zákroky byly provedeny v celkové anestesii. Transplantace ledviny byly provedeny mezi geneticky odlišnými páry dárce-příjemce, které byly určeny analýzou MHC. Zvířata byla heparinizována (100 jednotek/kg) během odběru orgánu a implantace. Transplantát byl implantován za použití standardní mikrovaskulární techniky pro vytvoření end-to-side anastomosy mezi renální arterií dárce a distální aortou příjemce, stejně jako mezi renální žílou dárce a dolní dutou žílou příjemce. Potom byla vytvořena primární ureteroneocystostomie.

Bilaterální nefrektomie byla provedena před zašitím. Kožní stehy byly odstraněny po 77 až 10 dnech.

Anti-B7-1 a/nebo anti-B7-2 protilátky byly podávány intravenosně v dávkách uvedených dále. Zvířata byla utracena při renálním selhávání, které bylo určeno zvýšením sérové koncentrace kreatininu nebo váhovým úbytkem 15% pretransplantační hmotnosti, podle AAALAC standardů. Kompletní patologická a histopatologická analýza byla provedena při pitvě všech utracených zvířat.

Výsledky a diskuze:

Skupina I: Kontrolní zvířata ♦ · φ ·· ·»·· ···· 4 4*4··· • 4 » · 4 » · 4

197 · · · · · ··· 4 ·« / · 4 · Φ 4 · 4 ······· φ* Φ· φφ Φ zvířatům byla provedena transplantace ledviny bez jakékoliv léčby pro prevenci rejekce. U všech 5 došlo k rejekci během 8 dnů (tabulka 14, obr. 28).

Skupina II: Monoterapie hlFl

Dvě zvířata byla léčena pouze hlFl (tabulka 14, obr. 28). Protilátka byla podávána v dávce 20 mg/kg a podávání bylo zahájeno před reperfůsí štěpu. Další dávky 5 mg/kg byly podávány každých sedm dnů do rejekce. Tato dvě zvířata měla nevýznamné prodloužení přežívání štěpu s rejekci 8. a 9. den.

Skupina III: Monoterapie h3Dl

Dvě zvířata byla léčena pouze h3Dl (tabulka 14, obr. 28). Protilátka byla podávána v dávce 20 mg/kg a podávání bylo zahájeno před reperfůsí štěpu. Další dávky 5 mg/kg byly podávány každých sedm dnů do rejekce. Tato dvě zvířata měla také minimální prodloužení přežívání štěpu s rejekci 8. a 28. den.

Skupina IV: Kombinovaná terapie hlFl a h3Dl

Čtyři zvířata byla léčena kombinací hlFl a h3Dl (tabulka

14, obr. 28). Protilátky byly podávány v dávce 20 mg/kg a podávání bylo zahájeno před reperfůsí štěpu. U jednoho zvířete (AT48) byla dávka 5 mg/kg podána ihned po transplantaci. U všech zvířat byly dávky 5 mg/kg byly podávány každých sedm dnů po určenou dobu nebo do rejekce. Podávání protilátek bylo přerušeno po 60 dnech u 3 ze 4 zvířat ve skupině IV. Jednomu zvířeti byly protilátky podávány do dne 80 (AC2B). Všechna zvířata měla prodloužené přežívání štěpů do dnů 47, 67, 227 a >365. Jedno zvíře zůstávalo naživu a bez rejekce jeden rok po

128 transplantaci. Toto zvíře nebylo utraceno; nicméně, pro účely této studie bylo sledování přerušeno. Kreatinin začal stoupat přibližně jeden týden před utracením u těch zvířat, u kterých došlo k rejekci.

Zvířata s kombinovanou terapií hlFl a h3Dl měla statisticky významně delší funkci allotransplantátu (p=0,016) ve srovnání se skupinou 1. Přežívání bylo také významně delší ve skupině léčené kombinací než ve skupinách léčených monoterapií.

Tabulka 14: Přežívání a diagnosa opic makak rhesus

Datum transplantace	Skupina	Léčba	Příj emce	Přežívání (dny po operaci
1.12.1996	I	žádná	X9X	5
30.11.1996	I	žádná	1FE	7
15.11.1996	I	žádná	T4T	7
2.4.1997	I	žádná	95052	8
3.5.1999	I	žádná	AT5H	8
2.11.1998	II	hlFl	AC7 4	9
10.2.1999	II	hlFl	2WN	8
3.2.1999	III	h3Dl	AT5J	8
16.2.1999	III	h3Dl	2WF	28
26.10.1998	IV	hlFl+h3Dl	AC2B	>365a
28.10.1998	IV	hlFl+h3Dl	AC8V	47
1.3.1999	IV	hlFl+h3Dl	AT5P	67b
2.3.1999	IV	hlFl+h3Dl	AT48	227b

^a 80-denní pooperační léčba ^b 60-denní pooperační léčba

Jsou uvedeny léčebné režimy a přežívání všech transplantovaných zvířat. Humanizované protilátky byly podávány v počáteční dávce 20 mg/kg a potom 5 mg/kg a potom v týdenní dávce 5 mg/kg po dobu 60-80 dnů. Zvíře AT48 také

129 dostalo dávku 5 mg/kg ihned po transplantaci.

Obsahy všech zde citovaných odkazů, patentů a/nebo patentových přihlášek jsou uvedeny ve své úplnosti.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byl předkládaný vynález popsán na jeho výhodných provedeních, mohou být provedeny různé změny a formě a podrobnostech, která spadají do rozsahu vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích.

Claims (80)

1. Humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7 molekuly vyznačující se tím, že obsahuje vazebný region pro antigen non-lidského původu a alespoň část imunoglobulinu lidského původu.

2. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 1 vyznačující se tím, že B molekulami jsou B7-1 a/nebo B7-2.

3. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou B7-1 protilátku a humanizovanou B7-2 protilátku.

4. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje humanizovanou B7-1 protilátku a/nebo humanizovanou B7-2 protilátku.

5. Humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-1 vyznačující se tím, že obsahuje vazebný region pro antigen non-lidského původu a alespoň část imunoglobulinu lidského původu.

6. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 5 vyznačující se tím, že část imunoglobulinu lidského původu je odvozena od lidského konstantního regionu.

7. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 6 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje konstantní region IgG.

131

4· • * *···

• 00 ·· ·· · 00 '· • 0 · • • 00 • • • • · • 0 0 • • · • 0·· • · 0 0 • 0 • • • 0 0 000 00 0* 00 000

8. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 7 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje mutaci schopnou redukce efektorové funkce imunoglobulinu.

9. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 8 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje konstantní region IgG2 a aminokyselina valin v pozici 234 je substituována alaninem a/nebo aminokyselina glycin v pozici 237 je substituována alaninem.

10. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 7 vyznačující se tím, že konstantní region IgG je vybrán ze skupiny zahrnující: konstantní region IgG4 a konstantní region IgG2.

11. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 5 vyznačující se tím, že vazebný region pro antigen je od hlodavce.

12. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 5 vyznačující se tím, že vazebný region pro antigen obsahuje region určující komplementaritu od hlodavce a že část imunoglobulinu lidského původu je odvozena od lidského pracovního regionu.

13. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 12 vyznačující se tím, že region určující komplementaritu je odvozen od 1F1 monoklonální protilátky.

14. Humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro

B7-1 získaný z buněčné linie uložené v ATCC pod přírůstkovým číslem PTA-263.

• · · · ·· · • · · · ·· • · ······ • · · ·♦ • · · ·· · ·

15. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinů mající vazebnou specificitu pro B7-1 obsahující CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého řetězce myší 1F1 protilátky a pracovní region lidského lehkého řetězce.

16. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinů podle nároku

15 vyznačující se tím, že lehký řetězec obsahuje variabilní region SEQ ID NO: 28.

17. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NO: 27;

(b) nukleovou kyselinu kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28;

(c) nukleovou kyselinu, která hybridizuje na nukleovou kyselinu podle odstavce (a) nebo (b) za přísných hybridizačních podmínek; a (d) nukleovou kyselinu, která je komplementární k nukleové kyselině podle (a) nebo (b).

18. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinů mající vazebnou specificitu pro B7-1 obsahující CDR1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce 1F1 protilátky a pracovní region lidského těžkého řetězce.

19. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinů podle nároku

18 vyznačující se tím, že těžký řetězec obsahuje variabilní region SEQ ID NO: 26.

20. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NO: 25;

• · · · · · · ··· · · · ¹³³ · · · · · · · • · · · · ·· ·· · · ·· (b) nukleovou kyselinu kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26;

(c) nukleovou kyselinu, která hybridizuje na nukleovou kyselinu podle odstavce (a) nebo (b) za přísných hybridizačních podmínek; a (d) nukleovou kyselinu, která je komplementární k nukleové kyselině podle (a) nebo (b).

21. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu kódující humanizovaný imunoglobulin podle nároku 5.

22. Fúzní gen kódující lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) první sekvenci nukleové kyseliny kódující vazebný region pro antigen odvozený z myší 1F1 monoklonální protilátky; a (b) druhou nukleovou kyselinu kódující alespoň část konstantního regionu imunoglobulinu lidského původu.

23. Způsob inhibice interakce první buňky nesoucí B7-1 receptor s druhou buňkou nesoucí B7-1 vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje kontaktování uvedené první buňky s účinným množstvím humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 5.

24. Způsob léčby jedince s transplantovaným orgánem, tkání nebo buňkou vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství humanizované protilátky podle nároku 5.

25. Způsob léčby onemocnění, které je modulováno B7-1 vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství humanizované protilátky podle • · • · · ··········

134 · · · · · · · ···· ··· ·· · · · · · nároku 5.

26. Způsob přípravy humanizovaného imunoglobulinu majícího vazebnou specificitu pro B7-1, kde uvedený imunoglobulin obsahuje vazebný region pro antigen non-lidského původu a alespoň část imunoglobulinu lidského původu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) určeni regionů určujících komplementaritu protilátky nonlidského původu, které mají vazebnou specificitu pro B7-1;

(b) získání protilátky mající aminokyselinovou sekvenci pracovního regionu vhodnou pro přenos regionů určujících komplementaritu určených v (a); a (c) přenos regionů určujících komplementaritu vybraných v (a) na pracovní region lidské protilátky vybrané v (b);

a tak přípravu humanizovaného imunoglobulinu majícího vazebnou specificitu pro B7-1.

27. Způsob určení přítomnosti nebo nepřítomnosti B7-1 ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) kontaktování uvedeného vzorku s humanizovanou protilátkou specifickou pro B7-1 tak, aby byla možná tvorba komplexů mezi B7-1 a anti-B7-l protilátkou; a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedené tvorby komplexů.

28. Humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-2 vyznačující se tím, že obsahuje vazebný region pro antigen non-lidského původu a alespoň část imunoglobulinu lidského původu.

29. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 28 vyznačující se tím, že část imunoglobulinu lidského původu je odvozena od lidského konstantního regionu.

··

135 • ······· • · · ······ · · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···

30. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 29 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje konstantní region IgG.

31. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 30 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje mutace redukující efektorovou funkci imunoglobulinu.

32. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 31 vyznačující se tím, že lidský konstantní region obsahuje konstantní region IgG2 a aminokyselina valin v pozici 234 je substituována alaninem a/nebo aminokyselina glycin v pozici 237 je substituována alaninem.

33. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 30 vyznačující se tím, že konstantní region IgG je vybrán ze skupiny zahrnující konstantní region IgG4 a konstantní region IgG2.

34. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 28 vyznačující se tím, že vazebný region pro antigen je od hlodavce.

35. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 28 vyznačující se tím, že vazebný region pro antigen obsahuje region určující komplementaritu od hlodavce a že část imunoglobulinu lidského původu je odvozena od lidského pracovního regionu.

36. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 35 vyznačující se tím, že region určující komplementaritu je odvozen od 3D1 monoklonální protilátky.

• ·

1 'if, · · · · ···♦·· · · · · · · ♦··· ···· ··· ·· ·· ·· ···

37. Humanizovaný imunoglobulin mající vazebnou specificitu pro B7-2 získaný z buněčné linie uložené v ATCC pod přírůstkovým číslem CRL-12524.

38. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu mající vazebnou specificitu pro B7-2 obsahující CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého řetězce myší 3D1 protilátky a pracovní region lidského lehkého řetězce.

39. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku

38 vyznačující se tím, že lehký řetězec obsahuje variabilní region SEQ ID NO: 8.

40. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NO: 7;

(b) nukleovou kyselinu kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ

ID NO: 8;

(c) nukleovou kyselinu, která hybridizuje na nukleovou kyselinu podle odstavce (a) nebo (b) za přísných hybridizačních podmínek; a (d) nukleovou kyselinu, která je komplementární k nukleové kyselině podle (a) nebo (b).

41. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu mající vazebnou specificitu pro B7-2 obsahující CDR1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce 3D1 protilátky a pracovní region lidského těžkého řetězce.

42. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku

41 vyznačující se tím, že těžký řetězec obsahuje variabilní region SEQ ID NO: 6.

• · ,„„ · 9 ·· ··♦··· ·

137 · · · · · · · ···· ··· ·· ·· ·· ·

43. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NC: 5;

(b) nukleovou kyselinu kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6;

(c) nukleovou kyselinu, která hybridizuje na nukleovou kyselinu podle odstavce (a) nebo (b) za přísných hybridizačních podmínek; a (d) nukleovou kyselinu, která je komplementární k nukleové kyselině podle (a) nebo (b).

44. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu kódující humanizovaný imunoglobulin podle nároku 28.

45. Fúzní gen kódující lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) první sekvenci nukleové kyseliny kódující vazebný region pro antigen odvozený z myší 3D1 monoklonální protilátky; a (b) druhou nukleovou kyselinu kódující alespoň část konstantního regionu imunoglobulinu lidského původu.

46. Způsob inhibice interakce první buňky nesoucí B7-2 receptor s druhou buňkou nesoucí B7-2 vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje kontaktování uvedené první buňky s účinným množstvím humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 28.

47. Způsob léčby jedince s transplantovaným orgánem, tkání nebo buňkou vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství humanizované protilátky podle nároku 28.

• · • · ·

138 • · · · ·

48. Způsob léčby onemocnění, které je modulováno B7-2 vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství humanizované protilátky podle nároku 28.

49. Způsob přípravy humanizovaného imunoglobulinů majícího vazebnou specificitu pro B7-2, kde uvedený imunoglobulin obsahuje vazebný region pro antigen non-lidského původu a alespoň část imunoglobulinů lidského původu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) určení regionů určujících komplementaritu protilátky nonlidského původu, které mají vazebnou specificitu pro B7-2;

(b) získání protilátky mající aminokyselinovou sekvenci pracovního regionu vhodnou pro přenos regionů určujících komplementaritu určených v (a) ; a (c) přenos regionů určujících komplementaritu vybraných v (a) na pracovní region lidské protilátky v (b);

a tak přípravu humanizovaného imunoglobulinů majícího vazebnou specificitu pro B7-2.

50. Způsob určení přítomnosti nebo nepřítomnosti B7-2 ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) kontaktování uvedeného vzorku s humanizovanou protilátkou specifickou pro B7-2 tak, aby byla možná tvorba komplexů mezi B7-2 a anti-B7-2 protilátkou; a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedené tvorby komplexů.

51. Způsob transplantace buněk jedinci potřebujícímu takovou transplantaci vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) získání buněk od dárce;

(b) kontaktování buněk s imunoglobulinem specifickým pro B7-1,

139 imunoglobulinem specifickým pro B7-2 a akceptorovými buňkami od příjemce pro dobu dostatečnou pro indukci tolerance, za zisku směsi; a (c) aplikaci směsi jedinci.

52. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že buňky od dárce jsou získány z kostní dřeně nebo krve.

53. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že akceptorovou buňkou je lymfocyt.

54. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že doba je mezi přibližně 12 hodinami a přibližně 96 hodinami.

55. Způsob podle nároku 54 vyznačující se tím, že doba je mezi přibližně 36 hodinami a přibližně 48 hodinami.

56. Způsob podle nároku 55 vyznačující se tím, že jedinec má onemocnění, které je vybráno ze skupiny zahrnující: proliferativní onemocnění, anemie, vrozené metabolické vady, kongenitální imunodeficity a myelodysplastický syndrom.

57. Způsob podle nároku 56 vyznačující se tím, že proliferativní onemocnění je vybráno ze skupiny zahrnující leukemie, lymfomy a zhoubné nádory.

58. Způsob podle nároku 57 vyznačující se tím, že anemie je vybrána ze skupiny zahrnující srpkovitou anemii, thalassemii a aplastickou anemii.

59. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že zahrnuje podání léku používaného pro modulování imunitní • ·

140 reakce jedinci.

60. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že lék je vybrán ze skupiny zahrnující: methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40 dráhy, inhibitory dráhy rejekce transplantátu, antagonisty IL-2 receptoru a jejich analogy.

61. Způsob léčby příjemce transplantátu nebo prevence rejekce u příjemce transplantátu vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství imunoglobulinů specifického pro B7-1 a účinného množství imunoglobulinů specifického pro B7-2 příjemci transplantátu.

62. Způsob podle nároku 61 vyznačující se tím, že zahrnuje podání prostředku vybraného ze skupiny zahrnující: inhibitory kalcineurinu, steroidy a imunosupresivní činidla, která zastavují růst imunitních buněk, methotrexat, inhibitory CD40 dráhy, inhibitory dráhy rejekce transplantátu, antagonisty IL-2 receptoru a jejich analogy.

63. Způsob podle nároku 62 vyznačující se tím, že inhibitorem kalcineurinu je cyklosporin A nebo FK506.

64. Způsob podle nároku 62 vyznačující se tím, že steroidem je methylprednison nebo prednison.

65. Způsob podle nároku 62 vyznačující se tím, že imunosupresivním činidlem zastavujícím růst imunitních buněk je rapamycin.

66. Způsob podle nároku 61 vyznačující se tím, že imunoglobulin specifický pro B7-1 je podán v dávce mezi • · • 4 ♦ ·* ·· • · ·· · · · · ♦ fr fr fr fr ·

- . _ · fr······

141 · · · · · ···· ··· ·· ·· ·· · přibližně 1 mg/kg a 25 mg/kg a imunoglobulin specifický pro B7-2 je podán v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a 25 mg/kg.

67. Způsob podle nároku 66 vyznačující se tím, že imunoglobulin specifický pro B7-1 a imunoglobulin specifický pro B7-2 jsou podány v den provedení transplantace.

68. Způsob podle nároku 67 vyznačující se tím, že humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-1 je podáván v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a 25 mg/kg a humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-2 je podán v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a 25 mg/kg.

69. Způsob podle nároku 68 vyznačující se tím, že humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-1 a humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-2 jsou dále podávány periodicky po provedení transplantace.

70. Způsob podle nároku 69 vyznačující se tím, že humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-1 a humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-2 jsou dále podávány alespoň jednou týdně po provedení transplantace.

71. Způsob podle nároku 70 vyznačující se tím, že humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-1 je podáván v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a 5 mg/kg a humanizovaný imunoglobulin specifický pro B7-2 je podáván v dávce mezi přibližně 1 mg/kg a 5 mg/kg alespoň jednou týdně po provedení transplantace.

72. Způsob léčby jedince s onemocněním vybraným ze skupiny zahrnující autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, zánětlivá onemocnění, systémový lupus erythematodes, diabetes

142

ΦΦ · ·· «φ ·· • ΦΦΦ φφφφ φφφ φ φ φφφφ φ · • φ φφ φφφφφφ φ φ φ φ · φφφ φφφφ φφφ φφ φφ φ · · mellitus, insulitis, asthma, arthritis, zánětlivá onemocnění střevní, zánětlivou dermatitis a roztroušenou sklerosu vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinných množství humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-1 a/nebo terapeuticky účinného množství humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-2.

73. Způsob modulování imunitní reakce u jedince s transplantovaným orgánem, tkání nebo buňkou a podobně vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-1 a/nebo účinného množství humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-2 v nosiči.

74. Způsob podle nároku 73 vyznačující se tím, že zahrnuje podáni léku používaného pro modulování imunitní odpovědi u jedince s transplantovaným orgánem, tkání, buňkou a podobně, kde tento lék je vybrán ze skupiny zahrnující: methotrexat, rapamycin, cyklosporin, steroidy, inhibitory CD40 dráhy, inhibitory dráhy rejekce transplantátu, antagonisty IL2 receptorů a jejich analogy.

75. Způsob snížení protilátkové odpovědi na antigen u savce v yznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-1 a/nebo humanizovaného imunoglobulinu specifického pro B7-2, za přítomnosti antigenu.

76. Způsob podle nároku 75vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenu jedinci.

77. Způsob podle nároku 75 vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny zahrnující: tetanický toxoid,

143

Μ 4 « · ·· • · • · · • · • ·· · ··* faktor VIII, faktor IX, insulin, růstový hormon a vektor pro přenos genu.

78. Použití humanizovaného imunoglobulinu majícího vazebnou specificitu pro B7-1 a/nebo B7-2 v terapii, například autoimunitních onemocnění, infekčních onemocnění, zánětlivých onemocnění, systémového lupus erythematodes, diabetes mellitus, insulitis, asthmatu, arthritidy, zánětlivých onemocnění střevních, zánětlivé dermatitidy a roztroušené sklerosy, pomocí přípravku podle nároku 1.

79. Použití humanizovaného imunoglobulinu majícího vazebnou specificitu pro B7-1 a/nebo B7-2 pro výrobu léku pro transplantaci buněk, tkání nebo orgánů u jedince.

80. Použití humanizovaného imunoglobulinu majícího vazebnou specificitu pro B7-1 a/nebo B7-2 za přítomnosti antigenu pro výrobu léku pro snížení protilátkové odpovědi na antigen u savce.