DE69034022T2

DE69034022T2 - Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen

Info

Publication number: DE69034022T2
Application number: DE69034022T
Authority: DE
Inventors: Stephen D. Gillies
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-09-20
Filing date: 1990-08-01
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2010-08-02
Also published as: CA2066612A1; ATE152174T1; EP0765937B1; AU6335290A; DE69030579D1; DE69034022D1; DK0493418T3; DE69030579T2; WO1991004329A1; EP0493418A1; ES2103274T3; CA2066612C; DK0765937T3; JPH05500310A; EP0493418B1; AU633357B2; EP0765937A1; EP0493418A4; ATE228566T1; ES2187598T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden, und insbesondere auf die Herstellung von synthetischen Proteinen, die mehrere fusionierte Bereiche besitzen. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Fusionsproteinen, die zweierlei biologische Wirksamkeiten, wie zum Beispiel das Binden von Molekülen und Rezeptorproteinen mit vorgewählter Spezifität und Aktivität besitzen. Solche Fusionsproteine sind zum Beispiel nützlich beim Aufzeigen von Verfahren, bei der Diagnose und Behandlung von verschiedenen menschlichen Krebsarten, infektiösen Krankheiten und Dysfunktionen und bei der Entwicklung von Impfstoffen.
Fusionsproteine mit zweierlei Aktivitäten und/oder Funktionen sind bekannt und schließen Kombinationen von Peptidhormonen, Enzymen, Transport- und Rezeptorproteinen, viralen Hüllpoteinen, Interleukinen, Lymphokinen, Immunglobulinen (Igs) und Fragmenten davon ein. Einige dieser Fusionsproteine sind bekannt, dass sie eine gesteigerte Antigenität besitzen und sind daher nützlich bei der Herstellung von Impfstoffen. Andere haben eine hohe biologische Aktivität und sind deshalb nützlich bei der Behandlung von verschiedenen infektiösen Erkrankungen und Mangelerkrankungen und Störungen. Wiederum andere Fusionsproteine sind nützlich als diagnostische Wirkstoffe, wegen Ihrer gesteigerten Zielfähigkieten. (siehe zum Beispiel U.S. 4,223,270, U.S. 4,801,536, CA 1217156A, WO 8806630A, und JP 63267278A als Beispiele für solche Fusionsproteine.)
Immunglobulinmoleküle wurden als Fusionsproteine hergestellt (z. B. Chimäre Antikörper). Ihre Struktur ist insbesondere dienlich zur Bildung von fusionierten Polipeptiden, die einen ersten Proteinbereich besitzen (z. B. eine variable Region) von einem ersten Ig Molekül von einer Spezies, die eine besondere Spezifität besitzt, und einen zweiten Bereich (z. B. eine konstante Region) von einem zweiten Ig von einer unterschiedlichen Spezies (und eventuell Spezifität). Sie wurden als eine Alternative zu nicht-chimären monoklonalen Antikörpern entwickelt, von denen viele nicht-humanen (z. B. murinen) Ursprungs sind, und daher für Menschen antigene Eigenschaften besitzen. Humane monoklonale Antikörper sind die am meisten bevorzugten therapeutischen Wirkstoffe, da ihre Verwendung eine im großen Maße reduzierte Immunantwort in Menschen hervorrufen sollte. Jedoch ist die Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern durch Zellfusionsverfahren schwierig, da immunisierte menschliche Milzzellen nicht sogleich erhältlich sind, und da menschliche Hypridome denkbar unstabil sind.
Chimäre Antikörper, die sowohl aus menschlichen und nicht- menschlichen Aminosäuresequenzen zusammengesetzt sind, sollten eine geringe Immunantwort im Menschen hervorrufen und sollten daher einen verbesserten therapeutischen Wert besitzen. Dementsprechend wurden Hybridantikörpermoleküle vorgeschlagen, welche aus Ig leichten (L) und schweren (H) Aminosäuresequenzen von verschiedenen Säugetierquellen zusammengesetzt sind. Die Chimären Antikörper, die entwickelt worden sind, umfassen daher variable (V) Regionen von einer Säugetierquelle (üblicherweise Maus), und konstante (C) Regionen aus menschlichen oder anderen Säugetierquellen (siehe zum Beispiel EPO Anmeldenummern 84302368.0 (Genentech), 85102665.8 (Research Development Corporation of Japan) und 85305604.2 (Standford University); P.C.T. Anmeldenummer PCT/GB85/00392 (Celltech Limited); Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 5851-6855; Boulianne et al. (1984) Nature 312: 643-646; und Sahagan et al. (1986) J. Immunol. 137: 1066-1076).
Die Herstellung von rekombinanten Chimären Antikörpern mit vorbestimmter Spezifität wurde üblicherweise in die Verwendung von klonierten genomischen DNA Fragmenten involviert. Beispielweise können die genomischen DNA Sequenzen, welche H und L Ketten kodieren, in ihrer wiederangeordneten Form kloniert werden (d. h. in der DNA Sequenz, welche aus Rekombinationsvorgängen während der B-Zell-Maturation resultiert). Als solche enthalten diese genomischen Sequenzen die Information, welche für ihre Expression nötig ist, (d. h. die 5' untranslatierten Sequenzen, Promoter, Enhancer, proteinkodierenden Regionen und Donor-Splice-Stellen). Die Donor-Splice-Signale an dem 3' Ende von dem V Gen Segment sind mit den Splice-Akzeptorsignalen an dem 5' Ende der Ig Regionen von anderen Spezies kompatibel. Das heißt, das Splice Produkt zwischen den zwei enthält den korrekten Ableserahmen. Zum Beispiel, wenn ein Maus V und ein humanes Cκ Segment miteinander verbunden werden und in die geeignete Wirtszelle transfiziert werden, wird das primäre Transkript korrekt gespleißt und resultiert in einem vollentwickelten Messenger RNA (mRNA)- Molekül mit einem offenen Ableserahmen, durch sowohl die V und C Regionen.
Es gibt Nachteile in der Verwendung von genomischen V Region-Fragmenten für die Expression von rekombinanten Chimären Antikörpern. Der erste schließt, den Klonierungsprozess selbst ein, welcher ziemlich arbeitsaufwendig für Einzelkopie-Gene sein kann, und dabei das Screening von vielen unabhängigen Klonen von einer Phagen-Bücherei erfordert. Desweiteren enthalten viele Hypridome vielfach wiederangeordnete V Gene, welche nicht produktive rekombinatorische Vorgänge darstellen. Die Idendifikation der exprimierten VL oder VH Segmente kann öfter eine extensive DNA Sequenzanalyse erfordern, ebenso wie die Bestätigung durch Klonierung und Sequenzierung der DNA Kopie der exprimierten mRNA (komplementär oder cDNA).
Eine direktere Annäherung ist es, die cDNAs für sowohl die L und H Ketten zu klonieren, und cDNA Expressionsvektoren für ihre Expression zu benutzen. In diesem Fall ist die Klonierung einfach und schnell, da die mRNA in sehr großem Ausmaße in Hypridomzellen vorhanden ist, und hoch-effiziente Verfahren zur cDNA Klonierung verfügbar sind. Jedoch entsteht, wenn jemand diese Annäherung benutzt, ein Problem, wenn die separate Expression von verschieden V und C Regionen von verschiedenen Ig cDNAs gewünscht ist, wie es zum Beispiel bei Chimären Antikörpern der Fall ist, welche beispielsweise murine V Regionen und humane C Regionen besitzen. Die Ig cDNA stellt eine direkte Kopie der mRNA dar, welche umgekehrt eine Fusion von V und C Exons ist, durch normales in vivo RNA Splicing in eine kontinuierliche Polynukleotidsequenz. Eine präzise Exzision und Rekombination einer murinen VH mit einer humanen Cγ&sub1; ist beispielsweise nicht möglich, weil geeignete Restriktionsstellen an der VC Verbindung von beiden Sequenzen fehlen.
Die Expression von Chimären Antikörpern wurde durch die Verwendung von klonierten cDNAs erreicht. Dieses Verfahren kann die Mutagenese von Sequenzen in sowohl der murinen V Region und humanen C Region enthalten, in der Nähe der VC Grenzfläche, so dass eine gemeinsame Restriktionsstelle zur direkten Verbindung der cDNA Segmente geschaffen wird (Liu et al. (1987) Gene 54: 33- 40).
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von fusionierten Polypeptiden bereitzustellen. Eine andere Aufgabe ist es, Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen zu bereitzustellen, welche zweifache Aktivitäten und/oder Funktionen besitzen, wie beispielsweise chimäre Immunglobulinmoleküle, welche eine vorbestimmte Antigen- Spezifität besitzen. Eine andere Aufgabe ist es, ein relativ einfaches und schnelles Verfahren bereitzustellen zur Bereitstellung von humanen/nicht-humanen Säugetier-chimären Antikörpern und Stammversionen davon, welche eine reduzierte Antigenität in dem menschlichen Körper besitzen. Wiederum eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein schnelles Verfahren bereitzustellen zur Herstellung von nach Maß angefertigten Chimären Immunoglobinmolekülen, unter Verwendung eines spezifisch hergestellten V Region Gens, welches leicht an ein anderes Gen angeheftet und in einer Wirtszelle transfiziert und exprimiert werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur allgemeinen Anwendbarkeit für die Herstellung von Fusionsproteinen einschließlich mindestens eines Teil von einem Enzym, Peptidtoxin, Peptidhormon, Lymphokin, Hormon, Interleukim und/oder Immunglobulin. Die Erfindung sieht weiterhin die Modifikation von klonierten cDNAs, wie beispielsweise Ig cDNAs, vor, so dass ein Polipeptid wie eine V Region mit vorbestimmter Selektivität als eine unabhängige. Einheit exprimiert werden kann, welche mit irgend einer aus einer Vielzahl von Polypeptiden fusioniert sein kann, wie beispielsweise einer Ig C Region aus derselben oder einer unterschiedlichen Spezies.
Eine erste DNA Sequenz, welche ein erstes Polypeptid kodiert, wird an einer Restriktionsstelle verdaut, welche am 3' Ende und angrenzend an sein 5' Ende lokalisiert ist, und produziert dadurch ein neues 5' Ende der ersten DNA Sequenz. Ein 1/a wird dann an das neue 5' Ende der ersten DNA Sequenz ligiert. Dieses 1/a schließt, in Sequenz von seinem 3' Ende, eine DNA ein, welche diesen Teil des ersten Polypeptides kodiert, der sich von einer (nahen) 5' terminalen Restriktionsstelle zu seinem 5' Terminus erstreckt, und eine Splice-Akzeptor-Stelle, welche kompatibel ist mit einer Splice- Donor-Stelle auf dem 3' Terminus der DNA, welche ein zweites Polypeptid kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt das 1/a mehr als ungefähr 80 Nukleotidbasen in der Länge ein.
Um das Fusionsprotein herzustellen, wird die DNA, welche das erste Polipeptid kodiert, an einer geeigneten Restriktionsstelle in der Nähe des 5' Endes des Gens verdaut.
Das 3' Ende des 1/a wird dann an die Restriktionsstelle ligiert, und produziert dabei eine Kassette mit einer Splice-Akzeptor- Stelle an seinem 5' Ende. Eine eukaryotische Wirtszelle wird mit der Kassette transfiziert ebenso wie mit einer zweiten DNA Sequenz, welche das zweite Polipeptid kodiert und welche die entsprechende Splice-Partnerstelle (Splice-Donor) an seinem 3' Ende besitzt. Die transfizierte Zelle wird dann kultiviert, um die Kassette und die zweite DNA Sequenz als ein einzelnes Kettenfusionsprotein zu koexprimieren.
EP 493418 im Namen von Abbott Laboratories wurde gemäß einer Anmeldung erteilt, welche dasselbe Einreichungs- und Prioritätdatum wie die vorliegende Erfindung besitzt. Bezug genommen wird hierin zu bestimmten Teilen der Offenbarung von EP 493418 zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung, während festgehalten wird, dass eine solche Bezugnahme nicht ein Teil der Erfindung bildet, welche hierin beansprucht wird. Daher lehrt im Falle der Produktion von Chimären Antikörpern die EP 493418 ein Verfahren, welches die Rekonstruktion einer cDNA beschreibt, beschränkt auf eine natürlich vorkommende Restriktionsstelle, die einzigartig ist für den V Region kodierenden Teil der cDNA, durch Ligation einer synthetisch hergestellten DNA Sequenz, welche den entfernten 3' Terminus der V Regionen ersetzt, und eine 3' Donor-Splice-Stelle hinzufügt, welche die Donor-Splice-Stelle, die normalerweise auf der genomischen V Region kodierenden DNA gefunden wird, imitiert. Diese V Region "Kassette" kann in Verbindung mit jeder C Regionkodierenden DNA Sequenz verwendet werden, oder anderen Proteinkodierenden Exons, welche eine komplementäre 5' Splice-Akzeptor- Seite besitzen. Eine cDNA wird synthetisiert unter Verwendung von reverser Transkriptase und eine mRNA Sequenz wie das Template, welches mindestens die mRNA Sequenz enthält, welche die Ig V Region kodiert. Diese V Region kodierende DNA Sequenz schließt eine Restriktionsstelle ein, welche an der 5' Stelle lokalisiert ist, und daran angrenzend die Grenzfläche (VC) von der V Region Sequenz und der angrenzenden Sequenz, welche eine C Region kodiert. Die einzigartige Restriktionsstelle soll eine spezifische DNA Sequenz sein, welche selten oder nur einmal in der V Region DNA gefunden wird, und welche durch eine spezielle Restriktions-Endonuklease bekannt wird, welche in der Lage ist, die DNA an dieser Sequenz abzuspalten.
Die Verdauung an der einzigartigen Restriktionsstelle hinterlässt ein Fragment, welches zumindest das meiste der V Region kodiert, und vorzugsweise das 3' Ende definiert. An das 3' Ende ist ein Oligodeoxynekleotid ligiert, welches hierin als eine 1/a Sequenz bezeichnet wird. Die 1/a Sequenz schließt einen DNA Abschnitt ein, welcher sich von der VC Grenzfläche 5'-wärts zu der Restriktionsstelle erstreckt. Zusätzlich schließt die 1/a Sequenz an ihrem 3' Ende eine Donor-Splice-Stelle ein, welche die Funktion der Splice-Stelle imitiert, die in genomischer V Region kodierender DNA anwesend ist vor den Splice- und Wiederanordnungsvorgängen, die in dem Nukleus während der rnRNA- Anordnung auftreten. Wenn sie miteinander ligiert werden, bilden die eingeschränkte V Region kodierende cDNA und die 1/a Sequenz etwas, was hierin als eine V Region Kassette bezeichnet wird.
Eine geeignete Wirtszelle, wie zum Beispiel ein Hypridom oder Myelon, wird dann mit einem Vektor transfiziert, der die V Region Kassette enthält und mit DNA, welche mindestens einen Teil von einem Polypeptid kodiert, wie beispielsweise die C Region Sequenz, welche eine Splice-Akzeptor-Stelle an ihrem 5' Ende und ein Stoppsignal einschließt. Die Splice-Akzeptor-Stelle ist mit der Splice-Donor-Stelle auf dem 3' Ende von der V Region Kassette kompatibel. Die DNA Sequenz, welche das zweite Polypeptid kodiert, kann leicht aus humanen Genbüchereien erhalten werden. Wenn sie einmal isoliert wurde, kann sie immer wieder verwendet werden, um Ig mit humanen C Regionen herzustellen.
Die transfizierte Zelle wird dann kultiviert, um die V Region Kassette und die C Region DNA zu koexprimieren. Ein Klon, welcher die V Region Kassette und die C Region DNAs integriert, spleißt die getrennten VC Region DNAs, um eine mRNA herzustellen, welche ein synthetisches Fusionsprotein kodiert, welches die volle Länge V Region und eine C Region oder Teile davon umfasst. Die Kotransfektion mit Konstrukten, welche VH und VL kodieren, welche in geeigneter Weise hintereinander mit CH und CL Sequenzen eingeführt wurden, exprimieren die Bindungsproteine, welche eine authentische FV Domain besitzen mit Bindungseigenschaften, welche ähnlich sind zu solchen der ursprünglichen Ig und C Regionen von einer gewünschten Spezies.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließt das resultierende Polypeptid eine Ig V Region von murinem Ursprung ein und mindestens einen Teil einer humanen C Region, wodurch ein chimäres Ig oder ein Fragment davon gebildet wird. Der Ausdruck "chimäres Ig" wird hierin verwendet, um ein Ig zu beschreiben, das Aminosäuresequenzen besitzt, die von Igs von unterschiedlichen Spezifitäten und/oder unterschiedlichen Spezies abgeleitet sind.
Jedoch sollte anerkannt werden, dass eine gegebene V Region oder ein Teil davon in dieser Art und Weise an Polypeptide ligiert sein kann, die anders sind als Ig C Regionen, um chimäre Bindungsmoleküle zu produzieren, die anders sind, als Igs. Desweiteren muss eine V Region nicht Teil des fusionierten Proteins im Ganzen sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Das Vorhergehende und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung, ebenso wie die Erfindung selbst, kann besser im Ganzen durch die folgende Beschreibung verstanden werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, in welchen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung ist;
Fig. 2 ist die Nukleinsäuresequenz und die abgeleitete entsprechende Aminosäuresequenz der monoklonalen murinen 14.18 H Ketten V Region, einschließlich einer Leader-Sequenz, V Region, VC Grenzfläche und einem Teil einer C Region;
Fig. 3 ist die Nukleinsäuresequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz der murinen monoklonalen 14.18 L Ketten V Region, einschließlich einer Leader-Sequenz, V Region, VC Grenzfläche und einem Teil einer C Region;
Fig. 4, 5 und 6 sind Referenzfiguren und sind nicht als Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt, sondern lediglich zum besseren Verständnis (Fig. 4, 5 und 6 stellen Ausführungsformen dar, die durch EP 493418 eingeschlossen sind).
Fig. 4 zeigt schematisch die Konstruktion einer repräsentativen H Ketten V Region. Kassette: 4A ist eine schematische Darstellung der murinen H Ketten cDNA, einschließlich einer V und einer C Region; 4B ist eine schematische Darstellung einer V Region Kassette, einschließlich der V Region cDNA-Sequenz, die an die ScaI-Stelle an einer 1/a DNA-Sequenz gekoppelt ist, welche eine Kopie des 3' Endes der V Region und eine Splice-Donor-Stelle (ScaI-Hind III) umfasst; 4C ist die Aminosäuresequenz und die entsprechende cDNA-Sequenz eines Teils der murinen H Ketten genomischen DNA, welche sich von der einzigartigen Restriktionsstelle (hier Sca I) in die V Region durch die VC Grenzfläche (gezeigt durch eine vertikale Linie) erstreckt; 4D ist die Nukleinsäuresequenz von dem 1/a, welches den Teil der V Region Sequenz unifasst, der sich von der einzigartigen Restriktionsstelle zu der VC Grenzfläche erstreckt und einschließlich eines "universal Introns", welches eine Splice-Donor-Stelle besitzt, die angrenzend ist an den V Region Terminus; und 4E ist eine schematische Darstellung des 1/a;
Fig. 5 zeigt schematisch die Konstruktion einer repräsentativen L Ketten V Region Kassette: 5A ist eine schematische Darstellung der murinen L Ketten cDNA, einschließlich einer V und C Region; 5B ist eine schematische Darstellung einer V Region Kassette, einschließlich der V Region cDNA-Sequenz, die an der Afl III-Stelle an eine 1/a-DNA-Sequenz gekoppelt ist; 5C ist die Aminosäuresequenz und die entsprechende cDNA-Sequenz eines Teils der murinen L Kette, welche sich von der einzigartigen Restriktionsstelle" (hier Afl III) in die V Region durch die VC Grenzfläche (gezeigt durch eine vertikale Linie) erstreckt; 5D ist die Nukleinsäuresequenz des 1/a, welches den Teil der V Region-DNA-Sequenz umfasst, die sich von der einzigartigen Restriktionsstelle zu der VC Grenzfläche erstreckt und einschließlich eines "universal Introns", welches eine Splice-Donor-Stelle besitzt, die an den V Region Terminus angrenzend ist; und 5E ist eine schematische Darstellung des 1/a;
Fig. 6 beschreibt eine exemplarische Klonierungsstrategie für die Konstruktion eines Chimären Ig Expressions-Vektors: 6A ist eine schematische Darstellung der Integration der VH Region Kassette (bestehend aus einer VH Kassette und einer humanen C Region DNA) in einem pDEM Expressions-Vektor; 6B ist eine schematische Darstellung des kompletten H Ketten pDEM-VC Expressions-Vektors, einschließlich der VH Region Kassette und des humanen C Region-Genes; 6C ist eine schematische Darstellung eines kompletten L Ketten pDEKp-VC Expressions-Vektors, einschließlich der VL Region und Kassette und des humanen C Region-Genes und zeigt den Insertionsort der fusionierten DNA- Sequenz der VL Region Kassette - humanen konstanten Region in den pDEM-VC-Vektor.

Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren der Erfindung schließt die Herstellung einer Polypeptid-kodierenden Kassette ein, einschließlich einer DNA- Sequenz, welche das Spleißen des Polypeptid-kodierenden Segments an ein zweites Polipeptid-kodierendes DNA Segment erlaubt, welches eine kompatible Splice-Sequenz besitzt, wodurch die nachfolgende Transkription und Translation eines fusionierten Proteins erlaubt wird. Fig. 1 beschreibt schematisch das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
In Fig. 1 wird eine Kassette hergestellt, einschließlich der Rekonstruktion des 5' Endes einer Splice-Akzeptor-Stelle (s. a.) und sein Anheften an das 5' Ende einer DNA-Sequenz oder eines Exons, welches ein erstes Polypetid kodiert (z. Bsp. Toxin, Enzym, Lymphokin, Interleukim, Wachstumsfaktor oder Ig Domain, wie beispielsweise eine konstante (C) Region). Die Kassette wird mit exprimierbarer DNA kotransfiziert (Strukturgen, z. Bsp. ein Wachstumsfaktor, Toxin, Enzym, Lymphokin, Interleukim oder Ig Domain, wie beispielsweise ein Gen einer konstanten Region), welche eine kompatible Splice- Akzeptor-Stelle an ihrem 5' Ende besitzt. Während der Abfolge der Ereignisse, welche zur Expression in der transfizierten Zelle führen, werden die beiden Exons gespleißt, um eine reife mRNA herzustellen, welche ein 3' Ende besitzt, das das erste Polypetid kodiert und ein 5' Ende, das eine andere Proteindomain kodiert. Das resultierende Einzelkettenpolypeptid ist eine Fusion des ersten und zweiten Polypeptids.
Beispielsweise kann in EP 493418 eine Ig V Region Kassette gespleißt werden in eine C Region Immunglobulinsequenz, dabei resultierend in der Expression eines intakten Ig Moleküls, einer H oder L Kette oder eines Fragments davon. In der vorliegenden Erfindung kann eine Toxin-kodierende Kassette gespleißt werden in eine Ig V Region, dabei resultierend in einen therapeutischen Wirkstoff des "Magic Bullet"-Types.
Während der Sequenz von Vorgängen, welche zur Expression des Fusionsproteins in der transfizierten Zelle, führen, werden mRNA, welche aus den beiden DNA Sequenzen abgeleitet sind, gespleißt, um eine reife mRNA zu produzieren, welche ein 5' Ende besitzt, welches eine komplette VH oder VL kodiert und ein 3' Ende besitzt, welches eine andere Protein-Domain kodiert, beispielsweise die gesamte oder einen Teil der menschlichen C Region. Das resultierende Einzelkettenpolypeptid ist eine Fusion der V Region und des Polypeptides, welches durch das Exon des Strukturgens kodiert wurde.
Eine cDNA kodiert eine H oder L Ketten V Region (meistens nicht human, zum Beispiel murin) von einer definierten Spezifität, während die C Region Exon(s) die R oder L Ketten C Region von einer anderen (meist humanen) Ig Spezies kodieren. Die Expression von H und L Konstrukten in einer einzelnen kompetenten Wirtszelle führt zur Herstellung von intakten Chimären Immunglobulinen, welche eine gewünschte Spezifität besitzen, und beispielsweise eine intakte humane konstante Region. Nützliche V Regionen schließen die VH und VL Domain von dem murinen monoklonalen Antikörper 14.18 ein (Mujoo et al. (1987) Cancer Res. 47: 1098-1104), welche die disialoganglioside GD2 auf der Oberfläche von vielen Neuroplastomen, Melanomen, Gliomen und kleinen Lungen-Karzinomen-Linien und Geweben erkennt. Diese V Region kann mit verschiedenen c Regionen kombiniert werden, wie beispielsweise die der humanen Ig Gamma (H) und Kappa (L) Ketten. Alternativ kann die V Region humanen Ursprungs sein.
Die cDNA wird aus mRNA synthetisiert, welche aus Zellen isoliert wurde, die reich sind in V Region kodierender mRNA. Nützliche Zellquellen schließen Lymphoidzellen, wie beispielsweise Lymphozyten, Myelone und Hybridome ein. Eine Anzahl von anerkannten Protokollen ist erhältlich zur mRNA Isolation und cDNA Synthese (siehe z. Bsp. Maniatis et al., ibid.). Die längsten cDNA Moleküle wurden identifiziert beispielsweise mit spezifischen CH (Cγ3), CL (Cκ) Sequenzen oder anderen nicht translatierten oder Oligonukletid-Sequenzen, um entweder eines oder beide der L Ketten oder H Ketten zu detektieren. Sie werden dann sequenziert, um die DNA Sequenz des 3' Endes der V Region zu identifizieren.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein DNA Fragment synthetisiert, welches die 5' Stelle der Akzeptor-Splice-Stelle wiederherstellt. Das Fragment sollte genug DNA einschließen (mindestens ungefähr 80 Nukleotidbasen), um sicherzustellen, dass ein effizientes Splicen auftritt, mit einer geeigneten Splice-Partner-Sequenz. Zusätzlich ist es essentiell, dass ein Splice-Donor/Akzeptorpaar verwendet wird, welches zu einem Splicen führt, das den originalen Ableserahmen aufrecht erhält.
Ein Splice-Akzeptor kann von genomischer Ig DNA abgeleitet werden, welcher alles oder einen Teil einer Immunglobulin C Region kodiert. Wenn ein 1/a verwendet wird, welches ein universales Intron einschließt, dann kann jedes dieser bekannten Splice-Akzeptor-Stellen in die Sequenz eingeführt werden. Typischerweise schließt das 5' Ende der Splice-Akzeptor-Stelle eine pyrimidinreiche Region (d. h. T, C) ein, gefolgt von der Sequenz AG und der Splice-Grenzfläche. Darum kann das universale Intron eine solche Splice-Akzeptor-Stelle an ihrem 5' Ende einschließen, wenn die 1/a, die verwendet werden soll, an das 5' Ende der ersten DNA Sequenz angeheftet werden soll. Beispielhafte Sequenzen, welche geeignete Splice-Akzeptor- Stellen umfassen, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Diese Sequenzen sind die Akzeptorsequenzen von der: (1) CH&sub1;, (2) Gelenk, (3) CH&sub2; und (4) CH&sub3; Exons von dem Cγ1 Gen. Jedoch können viele andere Splice-Akzeptorsequenzen in der Literatur gefunden werden.

Tabelle 1

Murine Ig Splice-Akzeptor-Stellen

5' Ende 3' Ende
(1) CTCTTGCAG CCTCC
(2) TCTCTGCAG AGCCC
(3) CTTCCTCAG CACCT
(4) GTCCTACAG GGCAG
Nach der Co-Expression der beiden DNAs produzieren die nuklearen Enzyme der Wirtszelle mRNA durch Implementation der normalen Splice-Vorgänge und resultieren in einer mRNA, welche ein fusioniertes Protein kodiert. Im Falle eines Chimären Bindungsproteins kodieren die mRNA (5' bis 3') eine VH oder VL Domain, welche direkt an ein anderes Polypetid angeheftet ist, wie zum Beispiel mindestens an einen Teil von mindestens einer C Region Domain, welche beispielsweise humane Sequenzen umfassen kann.
In der vorliegenden Erfindung kann eine Splice-Akzeptor- Stelle, welche eine geeignete Sequenz besitzt, an das 5' Ende von irgendeiner exprimierbaren DNA Sequenz ligiert werden, welche dann an eine DNA Sequenz fusioniert wird, welche eine V Domain kodiert, mit einer Spezifität, die nur durch die Spezifität von verfügbaren monoklonalen Antikörpern oder denjenigen, welche durch solche Techniken herstellbar sind, begrenzt ist.
Normalerweise werden, im Falle von Chimären Ig Molekülen beide Exons auf den selben Vektor platziert, unter Kontrolle von einer einzelnen, regulierenden Sequenz. Ebenfalls ist es bevorzugt, sowohl L und H Ketten-Konstrukte zu ko-expremieren, so dass die Wirtszelle ein intaktes Fusionsprotein ansondert. Das Verfahren erfordert die Verwendung einer Wirtszelle, welche die Enzyme besitzt, welche die DNA Splice-Signale erkennen und ein sauberes Splicen bewirken.
Die spezielle Vektor-Konstruktion, die Wirtzellselektion, die Transformation und die Verfahren der Expression stellen für sich genommen keinen Aspekt der Erfindung dar, sondern können durch Fachmänner ausgewählt und durchgeführt werden, basierend auf persönlichen Vorzügen und Eignungen. Anwendbare Techniken zur Verwendung in der Erfindung sind offenbart, zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates, 430 Fourth Street, Brooklyn, N.Y., 1989). Nützliche Vektoren schließen eine Anzahl von bekannten Plasmiden ein, welche die korrekten Signale zur Transkription und Translation von Genen von Interesse enthalten. Beschleunigungselemente können anwesend sein und zusätzliche Signale zur Polyadenylierung und Splicing müssen in Fällen anwesend sein, wo sie nicht durch das Gen selbst bereitgestellt sind. Beispielsweise sind alle der Signale zur Expression von funktional wiederangeordneten Ig Genen einem kontinuierlichen Streifen von DNA anwesend und schließen den Transkriptionspromoter ein, die Polyadenylierungs- und Terminierungsstellen und die Splice-Signale zur Exzision der Intron-Sequenzen. Zusätzliche Information, die bereitgestellt sein muss, durch den Vektor ist ein selektierbares Marker-Gen. Diese Gen muss ebenfalls die Signale zur Expression der selektierbaren Phenotypen enthalten (üblicherweise Resistenz gegenüber dem tödlichen Effekt eines toxischen Arzneistoffes, wie beispielsweise Methotrexat). Daher ist es nötig, wenn der Vektor sowohl die ersten als auch die zweiten Polypeptide kodiert, dass es die Sequenzinformation für drei separate Transkriptionseinheiten in einer begrenzten Menge an Platz liefert.
Der rekombinante Kassetten-enthaltende Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle transfiziert. Die Wahl der Wirtszell-Linie, zusätzlich zu den Kriterien, die oben erwähnt wurden, wird auf seine Fähigkeit in einem Wachstumsmedium zu wachsen, basieren, vorzugsweise einem, welches kommerziell erhältlich ist und ein serumfreies Medium ist, ebenso wie nach seiner Selektivitätsleichtigkeit nach der Transformation. Zur Herstellung von Chimären Antikörpern schließen nützliche Wirtszellen Myelome oder Hypridome ein, wie beispielsweise Murine non-Ig-produzierende Sp2/0 Ag 14 Hybridomzell-Linie. Nützliche Zellen sind in weitem Maße erhältlich in Reprositorien und von kommerziellen Quellen und können von denen, die im Fachgebiet bewandert sind, leicht aus natürlichen Quellen isoliert werden.
Ein Verfahren zur Einführung rekombinanter DNA in Zellen ist die Elektroporation (siehe z. Bsp. Potter et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161-7165), welches eine spezialisierte Ausrüstung erfordert und die Verfügbarkeit von hochgereinigter DNA. Jedoch können viele verschiedene Linien unter Verwendung dieses Verfahrens transformiert werden, wenn die Bedingungen optimiert werden für die spezifischen Zelltypen.
Ein anderes Transfektionsverfahren ist die Protoplast (Spheroplast) Fusion (siehe z. Bsp. Sandri-Goldin et al. (1981) Molec. Cell. Biol. 1: 743-752). Bakterien, welche das rekombinante Plasmid beherbergen, werden an die Lymphoidzellen fusioniert mit einem chemischen Wirkstoff, üblicherweise 45-50% Polyethylenglycol in einer gepufferten isotonen Lösung. Dieses Verfahren ist einfach und erfordert keine extensive Reinigung der Plasmid DNA. Zusätzlich können sehr hohe Transformationsfrequenzen erreicht werden und die Zeit zur Erreichung von hochproduktiven, transfizierten Zellklonen ist reduziert, weil dieses Transsektionsverfahren wahrscheinlich Transfektanten ergibt, welche multiple Kopien enthalten.
Zellen, welche erfolgreich mit den Kassetten-enthaltenden Vektor transformiert wurden, müssen dann von denen, welchen es nicht wurden, isoliert werden. Viele Verfahren sind erhältlich zur Selektion von transfizierten Zellen. Beispielsweise können die Guanin-Phosphoribosyl-transferase- (gpt) und Neomycin- Resistenz- Marker zu Selektionszwecken in Lymphoidzellen verwendet werden. Das Gen, welches den Marker kodiert, würde auf dem V Region kodierenden Vektor eingeschlossen werden. Die resistente Form von Dihydrofolatreduktase (DHFR) kann ebenfalls verwendet werden für die Selektion von Hypridomzelltransformanden, ebenso wie für die nachfolgende Amplifikation des Markers und seitlich angrenzenden Produktgene.
Die transfizierte Zelle wird dann kultiviert, um das Polypeptid zu exprimieren, welches durch die Kassette kodiert wurde. Die Kultivierung kann in vitro oder im Falle von rekombinanten Antikörpern durch die Verwendung von anderen Strategien, wie zum Beispiel in vivo Kultivierung in Ascites- Fluid bewerkstelligt werden.
Verbesserungen in der Produktivität von transfizierten Zellen ist möglich durch die Verwendung von multiplen Subklonierungsschritten in der Anwesenheit von MTX, wenn die Sequenzen von Interesse mit dem DHFR Marker ko-exprimiert werden. Beispielsweise werden nach zwei Zyklen von Subklonierung durch limitierende Verdünnung Zellen erhalten, welche in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, in einem verwendeten Suspensions-Kultur-Medium, bei Leveln von 35-100 ug/ml. Diese Expressionslevel werden in großem Maße reduziert, wenn die Zellen in Abwesenheit von MTX hindurchgeführt werden. Es ist jedoch möglich. Stockkulturen in der Anwesenheit des Arzneistoffes aufrecht zu erhalten und ihn dann vom letzten Steigerungsschritt wegzulassen. Die endgültigen Erträge von Antikörpern sind in diesem Fall durch das Weglassen von nicht vermindert.
Zusätzlich zu offenen Suspensionskulturverfahren sind andere Steigerungs-Perfusionstechnologien zum Beispiel Ganz- Faserreaktoren (siehe z. Bsp. Von Wedel (1987) in Commercial Production of Monoclonal Antibodies: A Guide for Scale Up (Seaver, ed.) Marcel Dekker, Inc., New York) und Mikroverkapselung (siehe z. Bsp. Rupp (1986) "Use of Cellular Microencapsulation in Large Scale Production of Monoclonal Antibodies" in Large Scale Mammalian Cell Culture (Tolbert und Feder, eds.) Academic Press, New York) sind besonders nützlich mit dem vorliegenden Expressionssystem. Beispielsweise ist es möglich, hohe Level eines rekombinanten humanen Antikörpers zu exprimieren, innerhalb von Mikrokapseln, unter Verwendung von murinen Hypridomtransfektanden. Die eingeschlossenen Zellkulturen können aufrecht erhalten werden in einem Medium, welches in großem Maße reduzierte Level an fetalem bovinen Serum enthält und in einigen Fällen in komplett serumfreien Medien.
Perfusionsverfahren erlauben nicht nur höhere Zelldichten (welche Zell-Zell Interaktionen fördern und dadurch das Serumerfordernis verringern), sondern sind auch nützlich für die Entfernung von MTX aus der Kultur vor der Reinigung des Antikörpers. Dies ist möglich unter Verwendung von Mikroverkapselungskultur, worin die semipermeable Kapselmembran hergestellt wird, um den hoch molekular-gewichtigen Antikörper rückzuhalten, aber die Diffusion hinaus aus der Kapsel von kleineren Molekülen zu erlauben. Am Ende eines durchströmten Kulturdurchlaufes lange nachdem die Zellteilung gestoppt wurde, aber die Produktion von Antikörpern weiter andauert, konnte die Kultur ohne MTX aufrechterhalten werden. Eine weitere Entfernung des Arzneistoffes ist möglich, indem gewaschen wird und die Kapseln in physiologischer Salzlösung vor ihrer Zerstörung dialysiert werden.
Die Erfindung wird weiter verstanden werden aus den folgenden nicht begrenzenden Beispielen, welche bezüglich der Fig. 4-6 nicht repräsentativ sind für die Ausführungsformen der Erfindung, aber nützliche Beispiele darstellen, zum Verständnis der Erfindung.

BEISPIEL

Zwei separate H und L Ketten cDNA Büchereien wurden hergestellt, entsprechend dem Verfahren von Gubler et al. (Gene (1983) 25: 263-269), welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Doppel-strängige, stumpf-endige cDNA wird aus polyadenylierter polyA mRNA synthetisiert, welche aus der murine Hybridomzell-Linie 14.18 isoliert wurde.
Ein Doppel-strängiger Polylinker mit der Sequenz:
wird dann an die cDNA ligiert. Dieser Linker ist für mehrere Zwecke nützlich. Der erste erlaubt der stumpf endigen cDNA, dass sie in die EcoRI Stelle von λgt10 Phagen DNA über die AATT sticky-Ende Sequenz kloniert wird. Es soll bemerkt werden, dass nur das 5' stumpfe Ende phosphoryliert wurde für die Ligierung an die stumpf-endige cDNA. Wenn das 5' EcoRI sticky-Ende nicht posphoryliert wird, tritt eine Polymerisierung der angehefteten cDNA nicht auf und eine nachfolgende enzymatische Verdauung nach der Linker-Ligation ist nicht notwendig. Dieses wiederum macht es unnötig, die interne EcoRI Stelle zu methylieren, welche andererseits in den Verfahren herausgeschnitten worden wäre. Das 5' phosphorylierte sticky-Ende, welches durch die EcoRI verdaute λgt10 DNA bereitgestellt wird, ist ausreichend für die Ligierung und das nachfolgende Klonieren der cDNA in den Phagen-Wirt.
Eine andere Funktion dieser Linker-Sequenz ist es, XhoI (CTCGAG) und SalI (GTCGAC) -Stellen für nachfolgende Manipulationen bereitzustellen. Diese Stellen kommen selten in murinen Ig cDNAs vor und liefern daher einzigartige Restriktionsstellen an den 5' und 3' Enden. Da beide Stellen die selbe 5' Überhang-Sequenz liefern nach Restriktion (TCGA), können sie jeweils in Expressions-Vektoren mit XhoI Klonierungsstellen verwendet werden. Wenn eine Stelle zufällig in der cDNA Sequenz vorkommt, sind die Chancen gering, dass die zweite Stelle ebenso anwesend ist.
Die mit einem Linker versehene cDNA wird dann durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) fraktioniert, um die Voll-Längen L und H Ketten cDNAs anzureichern. Zwei Fraktionen der cDNA, welche der Voll-Längen L Kette (900-1100 bp) und der H Kette (1400-1600 bp) entsprechen, können separat isoliert werden. Die DNA in jeder Gel-Fraktion wird separat eluiert und an EcoRI verdaute λgt10 DNA ligiert. Nach der in vitro Verpackung mit kommerziell erhältlicher Verpackungsmischung (Stratagene, San Diego, CA), wird die rekombinante Phage beschichtet und durch Filterhybridisierung unter Verwendung von verschiedenen C Region-Sonden gescreent.
Zehn Phagen Klone aus jedem Screening werden weiter durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI analysiert. Dies wird am schnellsten erreicht durch Herstellung von kleinen Phagenlysaten, welche genügend DNA liefern für die Restriktionsverdauung und die Bestimmung der Länge des cDNA Inserts. Klone, die in ihrer vollen Länge zu sein scheinen, werden radioaktiv markiert, beispielsweise an den einzigartigen EcoRI Stellen an den 5' und 3' Enden (relativ zu der originalen mRNA Polarität). Nach der Verdauung mit einem zweitem Enzym, werden die Klone durch das Verfahren von Maxam und Gilbert (Meth. Enzymol. (1980) 65: 499-559) sequenziert und mit Sonden für Murine Cγ3 und Cκ Sequenzen gescreent.
Die längste H cDNA Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt. Der H Ketten Klon scheint sehr nahe an seiner vollen Länge zu sein, wenn angenommen wird, dass das zweite ATG in der Sequenz das wahre Initiations-Codon darstellt. Obwohl beide ATG Codons in dem korrekten Ableserahmen sind, ist das erste wahrscheinlich zu nahe an dem 5' Ende der mRNA für eine effiziente Initioation und wenn es translatiert wird, würde es eine uncharakteristisch lange Leader-Sequenz kodieren. Die Verwendung von dem zweitem ATG Codon würde in der Synthese einer sehr typischen Ig Leader- Sequenz von 19 Aminosäuren resultieren. Weil zusätzliche 5' untranslatierte Sequenzen zu dieser cDNA in dem Expressions- Vektor hinzugefügt werden müssen (siehe unten) würde das erste ATG nicht mehr an dem 5' Ende von der resultierenden mRNA sein und würde dabei die Wahrscheinlichkeit der Translation der abweichenden Leader-Sequenz erhöhen. Um dieses Problem zu vermeiden, wird die cDNA Sequenz durch limitierte Ba131 Exonuklease-Behandlung abgestutzt. Zu dem resultierenden modifizierten cDNA Klon (H2c) wird dann ein XhoI Linker (siehe Fig. 2) angeheftet. Die Expression dieser cDNA sollte in eine mRNA resultieren, welche eine normale Ig Leader-Sequenz kodiert. Der Rest von dem VH Teil der klonierten cDNA scheint eine normale, funktionale variable Region zu sein.
Die Prüfung des L Ketten Klones (Fig. 3) zeigt eine typische L Ketten Sequenz, welche einen 19 Aminosäure-Leader kodiert, gefolgt von Sequenzen, welche in hohem Maße homolog zu der Anti-GAT-Familie von Vκ Genen sind. Die murine κ C Region beginnt mit dem Argininrest an Position 114.
Die Rekonstruktion der Donor-Splice-Stellen auf den 3' Enden der klonierten cDNAs für VH und für VL wird ausgeführt wie gezeigt in den Fig. 4 und 5. Der erste Schritt ist dabei, sowohl die VH und VL Regionen zu sequenzieren und dann einzigartige Restriktionsstellen in der Nähe der Grenzflächen der V und C Regionen zu identifizieren (siehe Fig. 2 und 3).
Die Sequenz zwischen der einzigartigen Restriktionsstelle und der originalen Splice-Donor-Stelle in dem genomischen V-Gen Segment wird dann wiederhergestellt, unter Verwendung der universalen Intron-Sequenz, welche vorher in Tabelle 1 gezeigt wurde. Der Einfachheit halber werden in Oligonukleotide, welche benutzt werden, um die Intron-Sequenz wiederherzustellen, als ein SnaB1 bis HindIII-Fragment kloniert (die zuletzt genannte Stelle war ursprünglich kein Teil des Introns). Die SnaB1-Stelle kann dann geschnitten werden, um ein stumpfes Ende herzustellen, welches mit GTA beginnt (die Basen, welche das Splice-Signal wiederherstellen), während die HindIII-Stelle als die 3' Klonierungsstelle zur Insertion der Kassette in dem Expressions- Vektor dient.
Die kleinen Linker-Abschnitte der V Regionen, welche in den Fig. 4 und 5 gezeigt sind, werden durch die Hybridisierung und die Ligierung von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert, um Fragmente herzustellen mit dem geeigneten klebrigen 5' Ende, ebenso wie einem stumpfen 3' Ende. Jede synthetische 1/a Sequenz wird dann zur Sequenzverifikation in einen Plasmid-Vektor kloniert. In einigen Fällen kann die 5' Klonierungs-Stelle nicht einzigartig oder anwesend in einem geeigneten Plasmid sein. In diesen Fällen können zusätzliche Restriktionsstellen zu dem 5' Ende der synthetischen DNA für Klonierungszwecke hinzugefügt werden. Nach der DNA Sequenzierung werden die 1/a Fragmente an die übrig gebliebenen Abschnitte der V Regionen ligiert. Die kompletten VH und VK Region Kassetten werden dann als Xhol bis HindIII-Fragmente kloniert.
Der Zell-Expressions-Vektor aus einem Säugetier, welcher für die Expression des Chimären 14.18 Antikörpers verwendet wird, ist in Fig. 6 gezeigt. Er wurde von dem pDEM-Vektor (Fig. 6A) abgeleitet, welcher verwendet wurde, um cDNA Sequenzen in lymphoiden Zellen zu expremieren. Dieser Vektor wurde folgendermaßen hergestellt. An dem linken Ende der schematischen linearen Repräsentation befindet sich das selektierbare Marker-Gen, DHFR, welches so ausgerichtet ist, dass die Transkription von rechts nach links ablaufen würde. Diese Transkriptionseinheit setzt sich zusammen aus SV40 regulatorischen Signalen (Enhancer und Promoter), einer cDNA, welche die resistente Form von Maus DHFR kodiert und einer SV40 polyA-Stelle.
Angrenzend an dieses Gen (nach rechts von der SalI-Stelle) befindet sich die Transkriptionseinheit für die cDNA von Interesse. Der erste Sequenzblock stellt den Ig H Ketten Enhancer (Eu) dar, die Sequenz, welche normalerweise in die aktive Transkription von Ig H-Ketten-Genen involviert ist. Der Verstärkersequenz folgt der Promoter für das murine Metallothionein (MT)-Gen. Viele andere Promoter können in dieser Position verwendet werden, einschließlich derer aus Ig-Genen, wie in der L Ketten Transkriptionseinheit, welche in Fig. 6c gezeigt ist. Eine synthetische Restriktionsstelle (für XhoI) wird in der 5' untranslatierten Region der MT-Sequenz platziert, sodass cDNAs an dieser Stelle eingeführt werden können und als Fusions-mRNAs von dem MT-Promoter transkribiert werden können. In diesem Fall ist es notwendig, dass die cDNA ihr eigenes Translations-Initations-Codon besitzt, da es nicht durch den Vektor bereitgestellt wird. Außerhalb der XhoI-Stelle (nach der Insertionsstelle für cDNAs) befindet sich ein Segment, welches von der 3' untranslatierten Region der murinen Cκ Region abgeleitet ist, welches die polyA-Additionsstelle enthält. Eine cDNA, welche von dieser Transkriptionseinheit exprimiert wird, würde dann aus der 5' untranslatierten Sequenz von der MT mRNA zusammengesetzt sein, der spezifischen Kodierungssequenz von Interesse und der 3' untranslatierten Sequenz, welche normalerweise auf murinen κ mRNAs gefunden wird.
Im vorliegenen Beispiel von chimären Antikörpern sind einige der Komponenten von diesem Plasmid überflüssig, nämlich die 3' untranslatierte Sequenz und die polyA-Stelle von dem κ- Gen-Segment. Statt dieser Komponenten werden die V Region Kassette und das humane C Region Gen-Segment zwischen der Xhol und SalI-Stelle von Plasmid pDEM (siehe Fig. 6A) eingefügt. Da das C Region Gen schon die 3' untranslatierten Sequenzen und die polyA-Stelle bereitstellt, sind die einzigen Signale, die von dem Plasmid verwendet werden müssen, diejenigen, welche für die Transkription der cDNA notwendig sind (Enhancer und Promoter). Das resultierende Plasmid ist in Fig. 6B gezeigt.
Ein ähnliches Konstrukt wird für die L Kette hergestellt, aber in diesem Fall besitzt das Plasmid ein Guanin- Phosphoribosyltransferase (gpt) auswählbares Marker-Gen, welches nicht in dem End-Vektor anwesend ist und die C Region ist die, des humanen κ-Genes. Der Promoter, welcher für die L Ketten cDNA Expression verwendet wird, ist von einem Vκ-Gen abgeleitet und eine einzigartige XhoI-Stelle wird in der 5' untranslatierten Region platziert zur Fusion an die cDNA. Dieses letztgenannte Konstrukt wurde kreiert, sodass die ganze L Ketten Transkriptionseinheit an SalI-Stellen angrenzt, während im Fall des H Ketten-Vektors nur eine einzige SalI-Stelle zurückgehalten wird. Dadurch ist es möglich, die gesamte L Ketten Transkriptionseinheit (ungefähr 3 kb) auszuschneiden und sie dann in die einzigartige SalI-Stelle des H Ketten Expressions- Vektors (Fig. 5C) einzufügen.
Ein anderes wichtiges Design-Merkmal des Ig-Expressions- Vektors schließt die Verwendung des Eu-Enhancers zur Expression von sowohl den H und L Ketten ein. Da dieser Enhancer viel mehr Kraft besitzt, als der L Ketten Gegenpart (zumindest in Transfektionsexperimenten) ist ein höherer und ausgewogenerer Level der Expression von beiden Ketten möglich. Die L Ketten Transkriptionseinheit enthält ebenfalls einige zusätzliche Sequenzen zwischen der SalI-Stelle und der Eu-Sequenz. Diese Sequenz ist von dem λ&sub1; L Ketten-Promoter abgeleitet und dient dazu, den in zweifacher Richtung verstärkenden Effekt von Eu in eine Richtung zu schwächen (weg von der L Ketten Transkritionseinheit) ohne die Verstärkung der Transkription der cDNA anzugreifen (EPO 87/300658.9). Wenn die L Ketten Transkriptionseinheit in den Expressions-Vektor eingeführt wird, wie in Fig. 6 gezeigt, verhindert diese Sequenz die Überexpression von angrenzenden Marker-Gen indem der verstärkende Effekt in diese Richtung blockiert wird. Dadurch wird gehofft, dass die Transfektanden mehr von dem transfizierten Protein von Interesse relativ zu dem Produkt des Marker-Genes produzieren.
Die murine non-Ig-produzierende Hybridomzell-Linie Sp2/0 Ag 14 Zellen werden mit dem Chimären Ig-Plasmid Konstrukt, welches oben beschrieben wurde, transfiziert, unter Verwendung, eines modifizierten Protoplast-Fusionsverfahrens (Gillies et al. (1983) Cell 13: 717-728).
Nach dem Beschichten in 96-Kammer-Kultur-Gefäße, wird Selektionsmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum), welches MTX enthält (0,1 uM) hinzugefügt. Zellen werden mit 50% Kulturmediumersatz in 3-4 Tagesintervallen gefüttert, für insgesamt 3 Fütterungen. Kolonien von MTX resistenten Zellen erscheinen in 10-14 Tagen.
An dieser Stelle werden Kulturüberstände auf abgesonderte humane Antikörper-Determinanten durch einen ELISA-Assay untersucht. Beinahe alle MTX resistenten Kolonien sondern signifikante Level von humanem Antikörper in das Medium ab.
Nachdem die Klone, welche die meisten Antikörper absondern, identifiziert wurden, wird der Expressionslevel verstärkt, indem die Konzentration von MTX in dem Medium erhöht wird. Die Zellen passen sich schnell an dramatische Erhöhungen der Konzentration an (soviel wie 10fach in einem einzelnen Schritt) mit wenig oder gar keinem Zelltod. Der Spiegel an MTX wird von 0,1 auf 10 uM in einem Zeitraum von ungefähr drei Wochen erhöht. Während dieser Zeit steigt die Konzentration an Antikörpern von einem Bereich von 2 bis auf 8 ug/ml (bei 0,1 uM MTX) bis auf einen Bereich von 10 bis 40 ug/ml von verbrauchtem Kulturmedium (bei 10 uM MTX). Überschüssige Level an 100 ug/ml von verbrauchtem Kulturmedium wurden erhalten, unter Verwendung von diesem und anderen ähnlichen Konstrukten, welche die Erfindung ausmachen.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer ersten DNA Sequenz, die ein erstes Polypeptid kodiert und die eine Restriktionsstelle definiert, die sich 3' zum und angrenzend an das 5' Ende der Sequenz befindet;

(b) Verdauen der ersten DNA Sequenz an der Restriktionsstelle, um ein neues 5' Ende herzustellen;

(c) Liegieren einer Linker/Adaptor (1/a) DNA Sequenz an das neue 5' Ende, um eine Kassette herzustellen, wobei die 1/a DNA Sequenz in der Reihenfolge ausgehend von ihrem 3' Ende folgendes umfaßt:

DNA, die einen Teil des ersten Polypeptids kodiert, der durch den Teil der ersten DNA Sequenz zwischen der Verdauungsstelle an der Restriktionsstelle und dem ursprünglichen 5' Ende davon kodiert wird; und

eine Spleiß-Akzeptorstelle;

(d) Transfizieren einer eukaryotischen Wirtszelle mit der Kassette und mit einer zweiten DNA Sequenz, folgendes umfassend:

DNA, die eine Spleiß-Donorstelle an ihrem 3' Ende definiert, die mit der Spleiß-Akzeptorstelle auf der 1/a DNA Sequenz kompatibel ist, und

DNA, die ein zweites Polypeptid kodiert; und

(e) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle, um nebeneinander die Kassette und die zweite DNA Sequenz als ein einzelnes Kettenfusionsprotein zu exprimieren.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Schritt (a) das Bereitstellen einer komplementären DNA (cDNA) Sequenz umfaßt, die das erste Polypeptid kodiert.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Schritt (d) das Bereitstellen einer komplementären DNA (cDNA) Sequenz umfaßt, die das zweite Polypeptid kodiert.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das erste Polypeptid gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wachstumsfaktoren, Enzymen, Hormonen, Lymphokinen, Interleukinen, Immunglobulinen, Analogen davon und Fragmenten davon.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Fusionsprotein ein chimäres Fusionprotein umfaßt.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die zweite DNA Sequenz, die in Schritt (d) bereitgestellt wird, eine DNA Sequenz umfaßt, die eine nicht-humane Immunoglobulin V Region kodiert, und wobei das Fusionsprotein ein chimäres Bindungsprotein umfaßt.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die zweite DNA Sequenz, die in Schritt (d) bereitgestellt wird, eine DNA Sequenz umfaßt, die eine murine Immunoglobulin V Region kodiert.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das erste Polypeptid mindestens einen Teil einer konstanten (C) Region eines Immunoglobulins umfaßt, und wobei das chimäre Bindungsprotein mindestens einen Teil eines Chimären Immunoglobulins umfaßt.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das erste Polypeptid mindestens einen Teil einer konstanten (C) Region eines humanen Immunoglublins umfaßt.