DE68927523T2

DE68927523T2 - Modifikation der Domäne der Konstantregion der Antikörpern

Info

Publication number: DE68927523T2
Application number: DE68927523T
Authority: DE
Inventors: Sherie L Morrison; Vernon T Oi
Original assignee: Becton Dickinson and Co; Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1988-02-05
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1997-05-28
Anticipated expiration: 2009-02-04
Also published as: EP0327378B1; WO1989007142A1; JP3095168B2; DE68927523D1; ATE146221T1; AU2894289A; EP0327378A1; CA1340863C; AU637313B2; JPH02503056A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper und insbesondere genetisch modifizierte monoklonale Antikörper mit domänenmodifizierten Konstantregionen.
Natürlich vorkommende spezifische Bindemoleküle, wie z.B. Immunglobuline, Enzyme und Membranproteine, erlebten im Laufe des vergangenen Jahrzehnts eine außergewöhnliche Ausweitung ihrer kommerziellen Anwendungsgebiete. Mit dem Aufkommen monoklonaler Antikörper nahm die Nützlichkeit von Immunglobulinen erheblich zu. In vielen Anwendungen jedoch wird die Verwendung monoklonaler Antikörper stark eingeschränkt, wenn diese in einer biologischen Umgebung eingesetzt werden sollen. Beispielsweise sind monoklonale Antikörper, die in Nagetieren, z.B. in Mäusen, der gängigsten Herstellerspezies, produziert wurden, gegenüber anderen Spezies immunogen.
Speziesübergreifende Immunogenität ist eine Funktion der konstanten Region von Immunglobulinen. Die Konstantregion besitzt neben der Immunogenität einige spezifische Funktionen, z.B. Komplementbindung, Zellrezeptor-Bindesteuerung der katabolischen Rate, Anaphylaxe, Opsonisierung, Plazenta- und Darmübergang und Immunregulierung. Es werden daher Situationen eintreten, in denen es wünschenswert ist, über Konstantregionen, die sich an Zeilen oder Proteine aus einer bestimmten Spezies binden, zusammen mit Binderegionen (variablen Regionen), die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, zu verfügen.
Obwohl es im allgemeinen relativ einfach war, monoklonale Mäuse-Antikörper mit der erwünschten Antigenspezifität herzustellen, war es viel schwieriger, menschliche monoklonale Antikörper mit den erwünschten Konstantregioneigenschaffen zu erzeugen. Menschliche monoklonale Antikörper sind für viele Anwendungen vorzuziehen, insbesondere für die in vivo-Diagnose und die Humantherapie. Chimäre Antikörper mit Antigenspezifität, die aus einer Mäuse-Myelomzelle oder einem Hybridom stammen, wurden mit menschlichen Konstantregionen verbunden, um die monoklonalen Antikörpern innewohnenden Spezieseinschränkungen teilweise zu überwinden. Genetisch manipulierte, durch Transfektome hergestellte Antikörper ermöglichten es Forschern, den Isotyp des Antikörpers zu ändern, der das Ergebnis der Fusion mit einer normalen Milzzelle ist, um üblicherweise IgG-Antikörper herzustellen.
Man stieß jedoch bei der Verwendung von Transfektomen zur Herstellung chimärer Antikörper mit variablen Regionen von Mäusen und menschlichen Konstantregionen auf einige Schwierigkeiten. Beispielsweise waren anfänglich hergestellte chimäre Antikörper auf jene beschränkt, deren Konstantregion alle Eigenschaften der menschlichen Donor- Konstantregionen aufwies. Verstärkte oder abgeschwächte Eigenschaften, wie z.B. Komplementbindung, sind für viele Anwendungen wünschenswert.
Demzufolge besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung von Immunglobulinen mit modifizierten biologischen Funktionen, während das breite Spektrum an Bindespezifität, das durch Verwendung variabler Regione aus einer leicht erhältlichen Quelle vorhanden ist, beibehalten wird.

Fachliteratur

Oi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1983) 80: 825-829; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:6851-6855; Ochi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)80: 6351-6355; und Ochi et al., Nature (London) (1983) 302: 340-342 beschreiben die Immunglobulin-Expression in Transfektomen. Neuberger et al., Nature (London) (1985) 314: 268-270 und Bouhanne et al., Nature (London) (1984) 312: 643 beschreiben Transfektome, die Antikörper mit variablen Mäuseregionen und menschlichen Konstantregionen sekretieren. Neuberger et al., Nature (London) (1984) 312: 604-608 beschreiben die Expression von Antigenbindedomänen, die kovalent mit Nicht- Immunglobulinsequenzen assoziiert sind. Advances in Immunology, Bd. 40, S.61-134, gibt einen Überblick über die biologischen Aktivitäten in der Fc-Region von Ig. Immunglobulin-Gene werden in zahlreichen Veröffentlichungen geoffenbart und diskutiert, wie z.B. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Bd. II, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Kalifornien, 4. Ausgabe, 1987, Kapitel 23 und in den hierin angeführten Veröffentlichungen.
EP-A-125.023 offenbart Antikörperketten, worin eine gesamte Konstantregion eines Typs durch eine Konstantregion eines anderen Typs substituiert wurde; EP-A-184.187 offenbart die Herstellung chimärer Immunglobulin-Gen-Expressionsplasmide, die DNA enthalten, die für eine gesamte variable H-Kettenregion eines Mäuseimmunglobulins kodiert, die an ein DNA-Fragment ligiert ist, das für eine gesamte menschliche Konstantregion kodiert.
Im Gegensatz dazu ist in der vorliegenden Erfindung ein Antikörper mit zumindest einem Bindestellenregion und einer domänenmodifizierten Konstantregion bereitgestellt, worin die Domänenmodifikation entweder eine Substitution, Insertion oder Deletion im wesentlichen aller Aminosäuren zumindest einer der Domänen einer Konstantregion ist: CL, Ch1, Hinge ("Scharnier"), CH2, CH3 oder CH4. Die funktionalen Eigenschaften der Antikörper mit domänenmodifizierter Konstantregion werden ausgewählt, um die erwünschten biologischen Funktionen für eine bestimmte Anwendung zu verstärken. Antikörper-Konstantregiondomänen können eliminiert, insertiert oder durch eine Domäne eines unterschiedlichen Isotyps oder einer unterschiedlichen Immunglobulin-Klasse oder durch eine Domäne aus der leichten Kette ersetzt werden. Die substituierte oder insertierte Domäne kann aus dem gleichen Antikörper oder einem anderen Antikörper des gleichen Tiers, der gleichen Tierspezies oder einer anderen Tierspezies stammen. Auf diese Weise können die funktionalen Eigenschaften des biologischen Moleküls für die erwünschte Anwendung optimiert werden. DNA-Konstrukte, die für domänenmodifizierte Konstantregionen kodieren, Konstrukte, die für vollständige Antikörper mit domänenmodifizierter Konstantregion kodieren, und Zellen, die solche Antikörper exprimieren, werden auch bereitgestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig.1 zeigt eine zum Austausch von Konstantregionen verwendete Klonierkassette;
Fig.2 zeigt eine zum Austausch von Konstantregiondomänen verwendete Klonierkassette;
Fig.3 zeigt eine Klonierkassette, die zum Löschen oder Verdoppeln von Konstantregiondomänen verwendet wird;
Fig.4 zeigt eine Klonierkassette, die zum Löschen einer carboxy-terminalen Domäne verwendet wird; und
Fig.5 zeigt zwei Variationen von Klonierkassetten, die zum Löschen einer amino- terminalen Domäne verwendet werden.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden neuartige Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von Antikörpern mit domänenmodifizierten Konstantregionen bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung betrifft konkret Modifikationen einer oder mehrerer Domänen der Konstantregion eines Antikörpers, der an einer Bindestelle oder einer variablen Region des ursprünglichen Antikörpers, aus dem die Konstantregion stammt, oder einem anderen Antikörper befestigt sein kann oder befestigt ist. Die vollständigen Antikörper besitzten zumindest eine Bindestellenregion, die in einem Wirtstier natürlich vorkommen oder genetisch modifiziert sein kann. Änderungen der Bindestellenregion der Antikörper stellen keinen Teil der vorliegenden Erfindung dar, obwohl solche Antikörper mit geänderter Bindestelle innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung liegen, wenn ihre Konstantregionen so modifiziert sind, wie dies hierin beschrieben ist.
Der Ausdruck "domänenmodifizierter Konstantregion" bedeutet hier, daß im wesentlichen alle Aminosäuren zumindest einer der Domänen von CL, CH1, Hinge, CH2, CH3 oder CH4 in einer Antikörperkette entweder deletiert, insertiert oder ausgetauscht sind. Unter "ausgetauscht" ist zu verstehen, daß eine Domäne aus einer anderen Quelle an die Stelle einer Domäne tritt, die anfangs im Antikörper vorhanden ist. Wenn die Modifikation eine Substitution ist, wird die Domäne üblicherweise durch die äquivalente Domäne eines Antikörpers eines unterschiedlichen Isotyps oder einer unterschiedlichen Klasse bzw. durch die äquivalente Domäne aus der leichten Kette des gleichen oder eines anderen Antikörpers substituiert bzw. ersetzt. Üblicherweise ist die Insertion einer Domäne die Verdopplung einer oder mehrerer Domänen des ursprünglichen Antikörpers. Andere Substitutionen und/oder Verdopplungen können jedoch auch durchgeführt werden.
Antikörper mit einer domänenmodifizierten Konstantregion können aus fusionierten Genen hergestellt werden, die ein Gensegment, das für einen Teil des Antikörpers kodiert, der an der Bindung beteiligt ist, und ein Gensegment enthalten, das für eine domänenmodifizierte Konstantregion kodiert, die aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Wirtstier stammt. Zwei Expressionskassetten, wobei eine für die schwere Kette und eine für die leichte Kette kodiert, sind im allgemeinen an der Herstellung vollständiger Antikörper mit domänenmodifizierter Konstantregion beteiligt, welche Gene unter für die Expression und die Verarbeitung geeigneten Bedingungen in einen geeigneten eukaryotischen Wirt eingebracht werden. Wenn die Gene exprimiert werden und sich die Antikörperketten aneinanderbinden, erhält man einen zusammengesetzten Antikörper. Die Antikörper umfassen IgM-, IgG-, IgA-, IgD- und IgE-Klassen sowie die verschiedenen Unterklassen der einzelnen Klassen (z.B. menschliches IgG1 bis IgG4). Die Kettentypen umfassen κ und λ für die leichte Kette und µ, γ, α, δ und &epsi; für die schwere Kette. Die Klassifizierung nach Isotyp bezieht sich auf Klasse und Unterklasse, Leichtkettentyp und Subtyp und kann auch auf die Gruppen und Untergruppen der variablen Regionen angewendet werden. Ein Beispiel für eine Isotyp- Kennzeichnung für ein Mäuse-Immunglobulin ist IgG2a(κ).
Die Bindestelle oder die variable Region variiert in Konformation mit der Aminosäuresequenz, die für die erwünschte Spezifität sorgt. Die variable Region der Immunglobuline stammt aus einer geeigneten Quelle, üblicherweise einem Säugetier, das ein Nagetier sein kann wie z.B. eine Maus oder Ratte, ein Hase bzw. ein anderes Wirbeltier, Säugetier o.dgl., das Immunglobuline herstellen kann. Die variable Region kann genetisch modifiziert sein oder natürlich vorkommen.
Die Konstantregion der Immunglobuline sowie die j-Kette für IgM (entspricht nicht der J- Region der schweren oder leichten Kette eines Immunglobulins) stammt aus einer Wirbeltierquelle, die mit der Quelle der variablen Region übereinstimmt oder eine andere ist, insbesondere aus einer Säugetierquelle, vor allem von Primaten oder Haus- bzw. Nutztieren wie z.B. Rindern, Schweinen, Pferden, Hunden, Katzen o.dgl., insbesondere vom Menschen. Die Konstantregion kann vom gleichen Tier oder anderen Tieren der gleichen oder einer anderen Spezies stammen wie die variable Region.
Es ist bekannt, daß die Konstantregion einer Antikörperkette für eine Spezies spezifisch ist. Innerhalb jeder Klasse gibt es eine Vielzahl an Allotypen. Der domänenmodifizierte Konstantregionabschnitt des Antikörpers wird normalerweise in Einklang mit den beabsichtigten Verwendungszwecken des Antikörpers ausgewählt. Als erste Überlegung wird dort, wo der Antikörper zur Diagnose oder Therapie in ein Wirtstier eingebracht werden soll, der konstante oder immunogene Abschnitt so ausgewählt, daß die Immunreaktion des Wirts minimiert wird. Häufig ist demnach die Quelle der Konstantregion eine menschliche, wenn die Verwendung im Menschen beabsichtigt ist.
Die möglichen Anwendungen von Antikörpermolekülen wird nicht nur durch ihre Antigenspezifität, sondern auch durch ihre Effektorfunktionen bestimmt. Daher werden als zweite Überlegung die domänenmodifizierten Antikörper ausgewählt, um ihre Fähigkeit, eine bestimmte Funktion zu erfüllen, zu optimieren. Beispielsweise wird bzw. werden die Domäne(n), die an der Steigerung der Halbwertszeit der Antikörper beteiligt ist bzw. sind, modifiziert, um je nach der konkreten Anwendung eine gesteigerte oder verkürzte Halbwertszeit zu erzielen. Andere Funktionen, die mittels hierin dargelegter Verfahren selektiv in Antikörpern modifiziert werden können, umfassen die Verteilung in Geweben, die Fähigkeit der Komplementfixierung und die Fähigkeit, an antikörperbedingter zellulärer Zytotoxizität beteiligt zu sein.
Als dritte Überlegung werden die Antikörper modifiziert, um in vitro-Manipulationen zu vereinfachen. Beispielsweise können Antikörper solcherart geändert werden, daß es leichter ist, mehr Moleküle eines radioaktiven Isotops oder Arzneimittels zuzugeben, ohne die Bindestellenspezifität zu verändern. Wenn der Antikörper als Arzneimittelzufuhrsystem dienen soll, wäre die Verstärkung der kovalenten Bindung des Arzneimittels in einem Antikörper, der in großen Mengen sekretiert werden kann, wünschenswert.
Die Modifikation der Konstantregion kann die Deletion, Insertion oder Substitution im wesentlichen aller Aminosäuren zumindest einer Domäne sein. In Zusammenhang mit den Aminosäuren einer Domäne bedeutet "im wesentlichen alle" 100% der manipulierten Aminosäuren, kann sich jedoch auch auf weniger als 100% der Aminosäuren, wie z.B. auf 80%, 85%, 90% oder 95%, beziehen. Die Manipulation von 100% der Aminosäuren in einer Domäne durch Verwendung der Restriktionsstellen in Introns ist am häufigsten. Einige Antikörperfunktionen wurden in einer oder mehreren Domänen lokalisiert, wie dies aus Tabelle 1 ersichtlich ist. Siehe Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, NY, USA, 1984. Tabelle 1
Da die Funktion dieser Domänen bekannt ist, kann eine bestimmte Effektorfunktion modifiziert werden, indem eine dieser Funktion zugehörige Domäne deletiert oder insertiert wird oder eine Domäne einer anderen Antikörperklasse oder eines anderen Antikörperisotyps für eine entsprechende Domäne substituiert wird, die für eine erwünschte Eigenschaft weniger wirkungsvoll ist.
Bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen domänenmodifizierten Konstantregion können eine oder mehrere Deletionen auftreten. Mehrere gelöschte Domänen können angrenzend oder nichtangrenzend sein. Die gelöschte(n) Domäne(n) können die carboxyterminale Domäne der Konstantregion, eine oder mehrere innere Domänen oder die aminoterminale Domäne sein. Domänen, die zu Funktionen gehören, die für einen bestimmten Verwendungszweck nicht notwendig oder schädlich sind, können eliminiert werden. Die Deletion unwesentlicher Domänen kann die Sekretion oder den Aufbau von Antikörpermolekülen vereinfachen. Beispielsweise kann die CH2-Domäne deletiert werden, wenn Komplementbindung unerwünscht ist, und die Deletion von CH1, der vorgeschlagenen Bindestelle des Bindeproteins der schweren Kette, würde die Sekretion schwerer Ketten ohne zugehörige leichte Ketten ermöglichen. Domänendeletionen können ausgewählt werden, beliebige biologische Eigenschaften von Immunglobulin zu beeinflussen.
Wenn die Konstantregion einer schweren Kette durch eine Substitution modifiziert wird, betrifft die Substitution im wesentlichen alle Aminosäuren zumindest einer der Domänen CL, CH1, Hinge, CH2 oder CH3 oder - im Falle von IgM und IgE - die CH4- Domäne. Die Domäne kann durch eine Konstantregiondomäne aus einem Antikörper eines anderen Isotyps bzw. einer anderen Klasse substituiert werden. Weiters kann die Konstantdomäne der leichten Kette durch Domänen der schweren Region substituiert werden, einschließlich das Verbinden der variablen Region der schweren Kette (VH) mit der Konstantregion der leichten Kette (CL). Üblicherweise - aber nicht notwendigerweise - wird eine Domäne durch die entsprechende Domäne eines Antikörpers eines anderen Isotyps bzw. einer anderen Klasse substituiert. Es wird beispielsweise eine CH1-Domäne durch eine andere CH1-Domäne ausgetauscht.
Neben dem Austausch von Domänen zur Bildung von Antikörpern mit derzeit vorhersagbaren Eigenschaften können Moleküle mit einzigartigen Kombinationen derzeit noch unbekannter biologischer Funktionen hergestellt werden, je mehr Einsicht man über den Beitrag jeder Domäne zur biologischen Aktivität erlangt. Beispielsweise sollte es möglich sein, die Fähigkeit von IgG&sub3;, Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen zu binden, mit der längeren Serumhalbwertszeit von IgG&sub2; zu kombinieren, wenn diese Eigenschaften mit unterschiedlichen Domänen assoziiert sind. Die eingeschränkte Fähigkeit von IgG&sub4; zur Komplementaktivierung kann mit der Fähigkeit von IgG&sub1;, sich mit hoher Affinität an Fc-Rezptoren zu binden, kombiniert werden. Durch Kombinieren von Domänen aus IgA und IgG kann es möglich sein, IgG-Moleküle zu produzieren, die mit einem sekretorischen Abschnitt zusammenwirken und so weniger anfällig für Proteolyse im Darm sind.
Die Konstantregion kann auch durch Insertion im wesentlichen aller Aminosäuren zumindest einer Domäne der Konstantregion (CL, CH1, CH2, CH3 oder CH4) domänenmodifiziert werden. In einigen Fällen bildet die Insertion ein Duplikat zumindest einer Konstantregiondomäne, die bereits vorhanden ist, um eine Konstantregion zu bieten, die eine oder mehrere der Domänen als Mehrfachkopien aufweist. Außerdem kann die eingesetzte Domäne aus einem Antikörper eines unterschiedlichen Isotyps bzw. einer unterschiedlichen Klasse oder aus einer anderen Kette stammen. Normalerweise wird die Insertion die Domänen in ihrer natürlichen Ordnung bewahren. Alle vorhandenen Hingedomänen befinden sich z.B. zwischen den CH1- und CH2-Domänregionen. Alternativ dazu kann die natürliche Ordnung innerhalb der eingesetzten Gruppe aufrechterhalten werden, wenn zwei oder mehr angrenzende Domänen eingesetzt werden. D,h. eine zweite Kopie der CH1 und Hingedomänen kann der ersten Hingedomäne folgen. Das Domänenverdoppeln kann auch dazu dienen, erwünschte Funktionen zu verstärken. Beispielsweise ist Kohlehydrat in der CH2- Domäne von IgG enthalten; Kohlehydrat wurde zum Befestigen radioaktiver Marker an Ig verwendet. Durch Verdoppeln von CH2 ist mehr Kohlehydrat vorhanden und steht potentiell für Markierungsverfahren zur Verfügung.
Die substituierte oder insertierte Domäne kann aus der gleichen Wirtstierquelle wie die Konstantregion oder aus einer unterschiedlichen Quelle stammen. Die andere Quelle kann die gleiche oder einer andere Spezies sein. Die substituierte oder insertierte Domäne kann weiters eine natürlich vorkommende oder eine genetisch modifizierte Domäne sein. Zu den genetischen Modifikationen zählt hier das Hinzufügen von Aminosäuren, die die kovalente Bindung von Arzneimitteln oder Radioisotopen erleichtern, wie z.B. durch Einbau von Cysteinen oder Lysinen in die Domäne, üblicherweise als Substitution für eine Aminosäure, die in der Domäne aus natürlichen Quellen vorhanden ist. Eine weitere erwartete genetische Modifikation wäre die Hinzufügung bzw. Deletion von Kohlehydrat, was durch Substitution von Aminosäuren erfolgen könnte, um zusätzliche Aminosäuren vorzusehen oder Aminosäuren zu deletierten, die als Befestigungspunkte für Kohlehydrate dienen.
Einige beispielhafte Antikörper mit domänenmodifizierter Konstantregion, die hergestellt wurden, sind in Tabelle 2 im Versuchsteil angeführt. Neben den angeführten Antikörpern wurde eine Reihe von γ&sub3;-Proteinen mit 0, 1, 2, 3, 4 und 7 Hinge-Exons hergestellt. Proteine, worin VH an CL und CL an VH gebunden wurde, wurden ebenfalls hergestellt. Diese Proteine banden Antigen und wurden sekretiert.
Erfindungsgemäße Antikörper werden im allgemeinen in Mikroorganismen oder Zellinien mittels eines Expressionsvektorsystems hergestellt, umfassend Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen und ein Gen, das eine domänenmodifizierte Konstantregion unter der Steuerung der Regulationssequenzen herstellen kann. Geeignete Expressionssysteme sind allgemein bekannt und stellen keinen Teil der vorliegenden Erfindung dar. Zur Transfektion von Ig-Genen verwendete Vektoren sind in Bio Techniques 4: 214-221 beschrieben. Diese Vektoren bieten ein mögliches Zufuhrsystem; die Zufuhr durch alternative Vektoren läge ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung.
Man kann die allgemeinen Expressionsvektorsysteme, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper verwendet werden, variieren, um einige günstige Eigenschaften zu erzielen. Erstens können sich die H- und L-Ketten auf getrennten Plasmiden befinden. Obwohl sich beide Gene auf dem gleichen Plasmid befinden können und keine inhärente Größenbeschränkung besteht, ist es zweckmäßiger, kleinere Plasmide aufgrund der verfügbaren neuen Restriktionsstellen genetisch zu manipulieren. Zweitens können einzelne Stellen mittels Linkern in die Vektoren eingebracht werden, um die Übertragung variabler Regione zwischen Plasmiden zu erleichtern. Dies wird besser in kleinen Plasmiden erreicht. Drittens: Sobald eine variable Region in einen Expressionsvektor kloniert wurde, ist es einfacher, diese assoziiert mit unterschiedlichen Konstantregionen in einem kleinen Plasmid zu exprimieren als zwei Änderungen im gleichen großen Plasmid vor der Expression vorzusehen.
Die für die einzelnen Antikörperdomänen kodierenden Gensegmente werden typischerweise durch Verbindergruppen verbunden. Diese Verbindergruppen können natürliche Introns oder Introns sein, die durch künstliche Manipulation modifiziert wurden. Die Intron/Exon-Beschaffenheit des Antikörpergens kann dazu dienen, die Herstellung domänenmodifizierter Konstantregionen der Erfindung zu erleichtern. Die Domänenstruktur von Antikörpermolekülen spiegelt sich in der Struktur der Gene wider, die dafür kodieren, wobei für jede Domäne ein getrenntes Exon kodiert. Die dazwischenliegenden DNA-Sequenzen (Introns), die jede Domäne trennen, boten ideale Stellen zur Manipulation des Antikörpergens. Da die dazwischenliegenden Sequenzen durch RNA-Spleißen entfernt werden und sich nicht in der reifen mRNA befinden, betreffen Änderungen in der dazwischenliegenden Sequenz die Struktur des reifen Proteinmoleküls nicht.
Weiters können die RNA-Spleißverbindungsstellen zwischen Exons der variablen und konstanten Regionen in Genen schwerer und leichter Ketten in der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise verwendet werden, da diese Verbindungsstellen selbst zwischen den Spezies konserviert sind. Die Aminosäure an der Domänengrenze besteht immer aus zwei Nukleotidem aus der 5'-Domäne und einem Nukleotid aus der 3'- Domäne. Somit ist es durch Ligieren von Gensegmenten innerhalb der dazwischen liegenden DNA-Sequenzen möglich, chimäre Moleküle innerhalb der Kette und zwischen den Ketten sowie speziesübergreifend zu bilden.
Die allgemeine Strategie, die typischerweise bei der Herstellung chimärer Moleküle der Erfindung zum Tragen kommt, ist die Bildung von Klonierkassetten (siehe Fig.1), die zumindest die zu manipulierenden Domänen enthalten. Ein ähnliches Verfahren wurde gemäß dem Stand der Technik zur Bildung chimärer schwerer Ketten mit variabler Mäuse-/menschlicher Konstantregion angewendet. Wenn die Vektoren zur Bildung chimärer schwerer Ketten mit variabler Mäuse-/menschlicher Konstantregion konstruiert werden, kann beispielsweise eine Sall-Stelle in die dazwischenliegende Sequenz mittels DNA-Oligonukleotidlinkern eingebracht werden. Dies macht die menschlichen Konstantregion-Gensegmente zu Sall-BamHI-Fragmenten und erleichtert die Insertion anderer Konstantregionen neben die Gensegmente variabler Regionen. Sobald eine auf diese Weise gebildete variable Region kloniert ist, kann sie neben die unterschiedlichen Konstantregionen in neuen Kassetten gesetzt werden.
Es wurde nun bestimmt, daß man einen ähnlichen Ansatz wählen kann, um Domänenkassetten zur Herstellung domänenmodifizierter Antikörperketten zu bilden (siehe Fig.2). Unter Verwendung von Oligonukleotidlinkern können einzelne Restriktionsstellen in eine oder mehrere der dazwischenliegenden Sequenzen eingebracht werden, die die Exons trennen, die für die Domänen der schweren Ketten der Konstantregionen der IgG-Gene kodieren. Beispiele für Restriktionsstellen sind in den Figuren angeführt. Sobald sich diese Linker in ihren Positionen befinden, ist es möglich, Exons und somit Immunglobulindomänen auszutauschen, zu insertieren oder deletieren (siehe Fig.3). Die neuen Vektoren, die durch Austausch, Insertion oder Deletion hergestellt werden, können dann dazu dienen, Immunglobulinmoleküle mit veränderten Strukturen zu erzeugen, die die erwünschte funktionale Eigenschaft verstärken.
Konkrete Verfahren sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Die vorliegende Erfindung zeigte, daß Restriktionsstellen in die dazwischenliegenden Sequenzen, die die für die Domänen kodierenden Exons trennen, sowie zwischen konstante und variable Regionen eingebracht werden können; die Verfahren, die in zahlreichen wissenschaftlichen Veröffentlichungen über die Herstellung chimärer Antikörpermoleküle mit antigenbindenden Domänen und Konstantregiondomänen aus unterschiedlichen Säugetierquellen erläutert sind, können daher beim Austausch, der Insertion oder Deletion von Domänen innerhalb der Konstantregion unter Anleitung der vorliegenden Beschreibung zum Tragen kommen. Einige einschlägige Veröffentlichungen sind oben im Abschnitt über Fachliteratur angeführt.
Die obige Strategie eignet sich auch zur Bildung innerer Deletionen im Ig-Molekül. Ein etwas anderer Ansatz kann verwendet werden, um Deletionen am Amino- oder Carboxyterminus des Moleküls durchzuführen.
Es gibt zwei Möglichkeiten, eine carboxyterminale Deletion durchzuführen. Die erste besteht darin, ein Nichtsense-Codon durch stellengerichtete Mutagenese zu insertieren. Durch diese Vorgangsweise können Ketten, die an jedem beliebigen Rest enden, geschaffen werden. Alternativ dazu kann eine Kassette geschaffen und 3' von einem Exon positioniert werden, um eine Terminierung nach diesem Exon zu bewirken. Als Ausgangsmaterial kann z.B. man das für CH2b-CH3 von Mäuse-γ&sub2;b kodierende Gen verwenden. Dieses Gen enthält geeignete Restriktionsstellen. Zuerst wird ein Großteil von CH3 deletiert. Dann wird ein Terminationscodon in allen drei Leserahmen am 5'- Ende der CH2-Domäne eingesetzt. Ein einzelner Linker kann in IVS 5' von CH2 eingesetzt werden. Diese Kassette kann anschließend 3' von jedem Exon positioniert werden. Das davorliegende Exon kann an CH2 von γ2b gespleißt werden; die resultierende Message (m-RNA) enthält an diesem Punkt ein Terminationscodon.
Mehrere Vorgangsweisen zur Bildung aminoterminaler Deletionen sind möglich, wobei zwei solcher Ansätze in Fig.5 veranschaulicht sind. In Fig.5A wird die 5'-Region des Ig- Gens mit seinem Promotor und Leader mit den zu exprimierenden Exons verbunden. Der Leader wird im Leserahmen an das Exon 3' davon gespleißt, wodurch eine mRNA mit geeigneten Startstellen entsteht, die für ein Protein kodiert. Die Leadersequenz kann vom vollständigen Protein abgespalten werden oder nicht. In Fig.58 werden die Promotorregionen und andere zur Ig-Transkription erforderlichen Regionen (durch kreuzschraffierten Rahmen angezeigt) direkt mit dem Exon verbunden. Wenn keine Translationsstartstelle (AUG) verfügbar ist, kann sie durch in vitro-Mutagenese gebildet werden. Die Position der Translationsstartstelle bestimmt die Größe und Struktur des Proteinprodukts.
Die Erfindung betrifft weiters DNA-Konstrukte zur Herstellung einer domänenmodifizierten Konstantregion. Die Konstrukte umfassen DNA-Sequenzen, die für Polypeptidsegmente kodieren und die im wesentlichen die gleichen sind wie jede der Konstantregiondomänen, die durch eine Verbindergruppe im Leserahmen an ihrem 5'- Ende mit dem 3'-Ende der für die vorherige Domäne kodierenden Sequenz verbunden sind. Die Konstrukte enthalten üblicherweise zusätzlich eine für die variable Region kodierende Sequenz, die durch eine Verbindergruppe an ihrem 3'-Ende mit dem 5'- Ende der für die erste Konstantregiondomäne kodierenden Sequenz verbunden ist. Wenn das Konstrukt für die schwere Kette kodiert, umfaßt es Sequenzen, die für die CH1-, Hinge-, CH2-, CH3- und gegebenenfalls die CH4-Domäne kodieren. Ebenso enthält das Konstrukt Sequenzen, die für die CL-Domäne kodieren, wenn das Konstrukt für die leichte Kette kodiert. Die Konstrukte können in Segmenten, die zusammengespleißt und kloniert werden, oder durch jedes andere biotechnologische Verfahren synthetisiert werden.
Wenn die Domänenmodifikation eine Substitution ist, umfassen die Verbindergruppen vor und nach den Gensegment(en), die für die auszutauschenden Domäne(n) kodieren, üblicherweise eine einzelne Restriktionsstelle. Die gleiche Restriktionsstelle ist dann in den Verbindergruppen, die die Sequenz, die für die auszutauschende(n) Domäne(n) eines anderen Antikörpers kodiert, umgeben, vorhanden. Zur Erleichterung der Verdopplungen oder internen Deletionen ist die gleiche erste einzelne Restriktionsstelle in der Verbindergruppe vorhanden, die vor der Sequenz angeordnet ist, die für die Domäne kodiert, welche sich am aminoterminalen Ende der Sequenz befindet, die für die zu verdoppelnde oder löschende Domäne kodiert. Eine zweite einzelne Restriktionsstelle ist in der Verbindergruppe vor der Sequenz, die für die zu verdoppelnde(n)/löschende(n) Domäne(n) im Gen kodiert, welches Gen für die eine Kette kodiert, und in der Verbindergruppe nach der Sequenz vorhanden, die für die Domäne(n) im Gen kodiert, wleches Gen für eine zweite identische Kette kodiert. Auf diese Weise ist bzw. sind nach dem Austausch die Domäne(n) in zwei Kopien (verdoppelt) im für eine Kette kodierenden Gen vorhanden und im für die zweite Kette kodierenden Gen abwesend (deletiert). Wenn die Domänenmodifizierung eine carboxyterminale Deletion ist, enthält die Verbindergruppe nach der Domäne, die den C-Terminus umfaßt, entweder ein Nichtsense-Codon oder ein Terminationscodon.
Antikörper der vorliegenden Erfindung produzierende Zellen werden ebenfalls bereitgestellt. Die Zellen enthalten DNA-Konstrukte zur Expression einer oben beschriebenen schweren Kette eines Antikörpers mit domänenmodifizierter Konstantregion. Die Zellen enthalten weiters eine DNA-Sequenz, die für eine Region einer leichten Kette kodiert, üblicherweise in einem getrennten DNA-Konstrukt. Die Herstellung von Zellen, die chimäre Antikörper produzieren (z.B. Transfektome), ist allgemein bekannt und ausführlich in den unter "Fachliteratur" angeführten Arbeiten beschrieben.
Neben vollständigen Antikörpern sind auch Antikörperfragmente, die domänenmodifizierte Konstantregionen enthalten, Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise können halbe Antikörper, die aus einzelnen leichten und einzelnen schweren Ketten hergestellt und die zur Bildung einer spezifischen Bindestelle zusammengesetzt wurden, als einwertige Bindeproteine verwendet werden. Außerdem können nichtzusammengesetzte domänenmodifizierte Konstantregionen als Antigene zur Bildung spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verwendet werden. Die Bildung einer bestimmten Antikörperspezifität kann durch Deletionen bzw. Insertionen verhindert oder verstärkt werden. Die Verwendung eines domänenmodifizierten Antikörpers mit ausgetauschten Domänen kann zur Bildung polyklonaler Antikörper mit einer einzigartigen Mischung aus Spezifitäten in hoher Ausbeute führen.
Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich hierin sowohl auf vollständige Antikörper als auch auf deren Fragmente. Ganze Antikörper enthalten zwei leichte und zwei schwere Ketten, die zur natürlichen Y-förmigen Konfiguration zusammengesetzt sind. Antikörperfragmente umfassen halbe Antikörper aus einer einzelnen leichten und schweren Kette, die zur Bildung einer spezifischen Bindestelle zusammengesetzt wurden, sowie Fragmente von ganzen oder halben Antikörpern, die durch Spaltung mit Enzymen wie z.B. Papain hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und schränken die Erfindung in keiner Weise ein.

VERSUCHSTEIL

Beispiel 1

Menschlicher γ&sub3;-Antikörper besitzt eine ausgedehnte, aus vier Exons bestehende Hinge- Region. Menschlicher γ&sub4; weist trotz deutlicher Sequenzähnlichkeiten (> 90% identische Reste in CH2 und CH3) in seinen Konstanregionen recht unterschiedliche Eigenschaften auf. IgG&sub3;-Gene wurden konstruiert und exprimiert. Die isolierten Proteine besitzen ein, zwei, drei oder vier Hinge-Exons des Wildtyps. Man beobachtete eine Änderung des Molekulargewichts der schweren Ketten durch die nachfolgenden Hinge- Deletionen. Außerdem wurde γ&sub3;-Hinge in die γ&sub4;-Konstantregion gesetzt und umgekehrt. Der Austausch der Hinge-Region von IgG&sub3; und IgG&sub4; änderte die Fähigkeit dieser Moleküle zur Komplementfixierung und Bindung an den Fc-Rezeptor nicht.

Beispiel 2

Zur Maximierung der Nützlichkeit genetisch hergestellter Antikörper für Anwendungen wie die Arzneimittelzufuhr ist es zweckmäßig, Änderungen im Antikörper vorzunehmen. Die Einschränkungen sind dahingehend zu sehen, daß die Antikörper zusammengesetzt und sekretiert werden müssen und ihre Fähigkeit behalten müssen, Antigen spezifisch zu binden.
Um zu bestimmen, ob es eine Obergrenze für die Größe eines Antikörpermoleküls gibt, das hergestellt werden könnte, wurde eine schwere IgG&sub3;-Kette konstruiert, in der die CH1- und die Hinge-Region verdoppelt waren. In einem zweiten Konstrukt waren CH1, Hinge und CH2 verdoppelt. Wenn das Gen mit verdoppeltem CH1 und Hinge zur Transfektion verwendet wurde, konnte man eine stark verringerte Transfektionshäufigkeit beobachten. Bei Analyse der überlebenden Transfektanden stellte man fest, daß keiner nachweisbares Protein der schweren Ketten erzeugte. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die schwere Kette, für die dieses Konstrukt kodierte, für die Zellen toxisch war.
Im Gegensatz dazu wurde das Gen, das für eine schwere Kette kodiert, in der CH1, Hinge und CH2 verdoppelt waren, nach der Transfektion exprimiert. Die Kette wurde mit einer leichten Kette von Mäuse-λ zusammengesetzt und sekretiert. Diese Untersuchungen zeigen, daß es zwar Beschränkungen hinsichtlich der herstellbaren spezifischen Ig-Moleküle gibt, daß diese Beschränkungen aber nicht inhärent mit der Größe zusammenhängen.

Beispiel 3

In einer ähnlichen Versuchsreihe wurden Deletionen verschiedener Domänen durchgeführt, die die Fähigkeit der Ig-Moleküle, sich zusammenzusetzen, sekretiert zu werden und zu funktionieren, beeinflussen. Gene der schweren Kette von IgG&sub3;, die für Proteine mit Deletionen von: CH2; Hinge + CH2; CH1 + Hinge; und CH1 + Hinge + CH2 kodieren, wurden konstruiert und in Myelomzellen transfiziert.
Chimäre schwere Ketten, in denen eine oder mehrere Domäne(n) gelöscht wurde(n), wurden synthetisiert. J558L wurde mit dem chimären Gen einer schweren Kette transfiziert, und Protein synthetisierende Transfektanden wurden isoliert. Transfektanden wurden drei Stunden lang mittels ³&sup5;S-Methionin markiert. Zytoplasmische und sekretierte Ig wurden durch Immunfällen mit anti-"schwerer Kette" hergestellt. Die Immunniederschläge wurden durch SDS-PAGE analysiert.
Bei Verwendung des Gens mit der Deletion von CH2 stellte man fest, daß es die Synthese eines Proteins mit dem erwarteten Molekulargewicht lenkte. Diese verkürzte schwere Kette setzte sich entweder mit der leichten Kette von Mäuse-λ oder der leichten Kette von menschlichem chimärem V-DNS-κ zu einem H&sub2;L&sub2;-Molekül zusammen, das sekretiert wurde.
Beim Löschen von Hinge + CH2 setzte sich die schwere Kette offensichtlich zu HL- Halbmolekülen zusammen, die sekretiert wurden. Es ist jedoch unmöglich, schlüssig festzustellen, daß sie keine H&sub2; sind.
Beim Löschen von CH1 + Hinge kam es zu keiner Zusammenlagerung der schweren Kette mit anderen schweren Ketten oder der L-Kette. Dies ist nicht überraschend, da das freie Cystein, das die Disulfidbindungen zwischen den Ketten bildet, in CH1 vorhanden ist. Doch selbst beim Fehlen von Disulfidbindungen zwischen den Ketten wird die verkürzte schwere Kette sekretiert.
Eine schwere Kette, in der die variable Region direkt mit CH3 verbunden ist, wurde ebenfalls gebildet. Diese schwere Kette wurde beim Co-Transfizieren mit einer chimären leichten Kette in ein nichtproduzierendes Myelom sekretiert. Sie bildete weder mit einer leichten Kette noch einer anderen schweren Kette kovalente Bindungen.

Beispiel 4

Tabelle 2 zeigt einige der hergestellten Antikörper mit domänenmodifizierten Konstantregionen. Tabelle 2 Hergestellte Domänenaustauschproteine
Die Bildung von Proteinen aus den in Tabelle 2 angeführten Vektoren und die Analyse ihrer Funktionen wurden begonnen. Vektor 1654 z.B. erzeugt ein Protein, das hinsichtlich seiner Fc-Rezeptor-Bindeaktivität analysiert wurde und sich - wie IgG&sub2; - nicht an den Fc-Rezeptor menschlicher Monozyten-Zellinien bindet.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über den Wissensstand der Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ab. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin im gleichen Umfang durch Verweis aufgenommen, so als ob bei jeder einzelnen Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angeführt wäre, daß sie durch Verweis aufgenommen ist.
Nach dieser ausführlichen Beschreibung der Erfindung ist es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß zahlreiche Änderungen und Modifikationen möglich sind.

Claims

1. Antikörperkette mit zumindest einer Bindestellenregion und einer domänenmodifizierten Konstantregion, worin die domänenmodifizierte Konstantregion eine Modifikation umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Insertion von zumindest 80% der Aminosäuren zumindest einer der Domänen CL, CH1, Hinge, CH2, CH3 und CH4, wobei der Rest der domänenmodifizierten Konstantregion die gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie eine Konstantregion eines Säugetier- Antikörpers, (2) einer Substitution von zumindest 80% der Aminosäuren zumindest einer der Domänen CL, CH1, Hinge, CH2, CH3 ader CH4 durch zumindest 80% der Aminosäuren zumindest einer, jedoch weniger als aller Domänen aus einer anderen Säugetier-Antikörperkette, wobei der Rest der domänenmodifizierten Konstantregion zu zumindest 80% die gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie eine Konstantregion eines Säugetier-Antikörpers, und (3) einer Deletion von zumindest 80% der Aminosäuren mehr als einer der Domänen CH1, Hinge, CH2, CH3 oder CH4, worin die restlichen Aminosäuren der domänenmodifizierten Konstantregion zu zumindest 80% die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie zumindest eine Domäne einer Konstantregion eines Säugetier-Antikörpers.

2. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die Bindestellenregion und die domänenmodifizierte Konstantregion aus der gleichen Säugetierquelle stammen.

3. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die Bindestellenregion aus einer ersten Säugetierquelle stammt und die domänenmodifizierte Konstantregion aus einer zweiten Säugetierquelle stammt.

4. Antikörperkette nach Anspruch 3, worin die erste Säugetierquelle der gleichen Spezies angehört wie die zweite Säugetierquelle.

5. Antikörperkette nach Anspruch 3, worin die erste Säugetierquelle einer anderen Spezies angehört als die zweite Säugetierquelle.

6. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die domänen modifizierte Konstantregion eine Substitution einer korrespondierenden Domäne eines Antikörpers eines anderen Isotyps oder einer anderen Klasse umfaßt.

7. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die substituierte Domäne aus der gleichen Tierspezies stammt wie die Konstantregion.

8. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die Quelle der substituierten Domäne aus einer anderen Spezies stammt als die Quelle der Konstantregion.

9. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die Insertion zumindest zwei Domänen umfaßt.

10. Antikörperkette nach Anspruch 1, worin die Insertion die Verdopplung zumindest einer Domäne der Konstantregion ist.

11. Antikörper, umfassend zumindest eine Antikörperkette nach Anspruch 1.

12. DNA-Konstrukt, umfassend eine für eine Antikörperkette nach Anspruch 1 kodierende DNA-Sequenz.

13. DNA-Konstrukt zur Herstellung einer domänenmodifizierten Konstantregion einer schweren Kette eines Antikörpers, umfassend:

(a) eine erste DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH1-Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(b) eine zweite DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der ersten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die zweite Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der Hinge- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(c) eine dritte DNA-Sequenz, die durch eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die dritte Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH2- Region einer schweren Kette eines Antikörpers; und

(d) eine vierte DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der dritten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die vierte Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH3- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

worin zumindest eine der Verbindungsgruppen eine Restriktionsstelle enthält, die im Konstrukt jeweils einzigartig ist;

14. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, worin zwei der Verbindungsgruppen jeweils einzigartige Restriktionsstellen umfassen.

15. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, zusätzlich umfassend eine fünfte DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der vierten Sequenz verbunden ist, die für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH4-Region einer schweren Kette eines Antikörpers.

16. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, worin die Verbindungsgruppe, die die Sequenz, die für die C-terminale Domäne der schweren Kette eines Antikörpers kodiert, mit der vorhergehenden Sequenz verbindet, ein Terminationscodon oder ein Nichtsense-Codon umfaßt.

17. DNA-Konstrukt zur Expresson einer schweren Kette eines Antikörpers mit domänenmodifizierter Konstantregion, umfassend:

(a) eine erste DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der variablen Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(b) eine zweite DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der ersten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die zweite Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH1- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(c) eine dritte DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die dritte Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der Hinge- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(d) eine vierte DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der dritten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die vierte Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH2- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

(e) eine fünfte DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der vierten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die fünfte Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH3- Region einer schweren Kette eines Antikörpers;

worin das Konstrukt für eine domänenmodifizierte Antikörperkette kodiert.

18. DNA-Konstrukt zur Express ion einer leichten Kette eines Antikörpers mit domänenmodifizierter Konstantregion, umfassend:

(a) eine erste DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das im wesentlichen gleich ist der variablen Region einer leichten Kette eines Antikörpers; und

(b) eine zweite DNA-Sequenz, die über eine Verbindungsgruppe im Leserahmen an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der ersten DNA-Sequenz verbunden ist, wobei die zweite Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das zu zumindest 80% gleich ist der CH1- Region einer schweren Kette eines Antikörpers.

19. Zelle, die DNA-Konstrukte nach Anspruch 17 zur Expression einer schweren Kette eines Antikörpers mit domänenmodifizierter Konstantregion enthält.

20. Zelle nach Anspruch 19, die zusätzlich eine DNA-Sequenz, die für eine leichte Kette eines Antikörpers kodiert, umfaßt.

21. Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers mit domänenmodifizierter Konstantregion, umfassend:

(a) das Züchten von Zeilen gemäß Anspruch 20 in einem Nährstoffmedium, wodurch die DNA-Konstrukte exprimiert und die schweren und leichten Ketten intrazellulär verbunden werden, um einen Antikörper zu bilden; und

(b) das Isolieren des Antikörpers.