CN102405236A - 改进的抗-tnfr1多肽，抗体可变结构域和拮抗剂 - Google Patents

改进的抗-tnfr1多肽，抗体可变结构域和拮抗剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗-TNFR1多肽、抗体单个可变结构域（dAb）、拮抗剂和多特异性配体，以及它们的方法和用途。所述抗-TNFR1多肽、抗体单个可变结构域（dAb）、拮抗剂和多特异性配体可用于治疗和/或预防炎症疾病，例如关节炎或CORD，以及用于肺部施用，口服施用，递送至患者的肺和递送至患者的胃肠道。

Description

改进的抗-TNFR1多肽,抗体可变结构域和拮抗剂
本发明涉及抗-肿瘤坏死因子1（TNFR1、p55、CD120a、P60、TNF受体超家族成员1A、TNFRSF1A、TNFαI型受体）多肽，免疫球蛋白（抗体）单个可变结构域和包含这些的拮抗剂。本发明还涉及包含或使用这些抗-TNFR1配体的方法、用途、制剂、组合物和设备。
发明背景
TNFR1
TNFR1是一种跨膜受体，其包含与配体结合的胞外区和缺乏固有信号转导活性但可以和信号转导分子相联系的胞内结构域。结合TNF的TNFR1复合物包含3条TNFR1链和3条TNF链。(Banner 等人, Cell, 73(3) 431-445 (1993)。TNF配体以三聚体存在，其与3条TNFR1链结合。（同上）。在受体-配体复合物中3条TNFR1链紧密聚集在一起，并且此聚集是TNFR1介导的信号转导的前提。事实上，结合TNFR1的多价试剂，例如抗-TNFR1抗体可在缺乏TNF的情况下诱导TNFR1聚集和信号转导并通常被用作TNFR1拮抗剂。（见例如Belka 等人, EMBO, 14(6):1156-1165 (1995)；Mandik-Nayak 等人, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)）。因此，结合TNFR1的多价试剂通常不是有效的TNFR1拮抗剂，即使它们阻止TNFα和TNFR1的结合。
在此段落中的SEQ ID号指的是在WO2006038027中使用的编号。TNFR1的胞外区包含13个氨基酸的氨基端区段（SEQ ID NO:603（人）的1-13位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的1-13位氨基酸），结构域1（SEQ ID NO:603（人）的14-53位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的14-53位氨基酸），结构域2（SEQ ID NO:603（人）的54-97位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的54-97位氨基酸），结构域3（SEQ ID NO:603（人）的98-138位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的98-138位氨基酸），和结构域4（SEQ ID NO:603（人）的139-167位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的139-167位氨基酸），结构域4之后是膜近侧区（SEQ ID NO:603（人）的168-182位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的168-183位氨基酸）。（见Banner 等人, Cell 73(3) 431-445 (1993)和Loetscher 等人, Cell 61(2) 351-359 (1990)）。结构域2和3与结合的配体(TNFβ, TNFα)进行接触。(Banner 等人, Cell, 73(3) 431-445 (1993)。TNFR1的胞外区也包含被称为配体组装前结构域或PLAD结构域（SEQ ID NO:603（人）的1-53位氨基酸；SEQ ID NO:604（小鼠）的1-53位氨基酸）（美国政府，WO 01/58953；Deng 等人, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)）。在体内TNFR1通过下述过程从细胞表面脱落以产生可溶形式的TNFR1，所述过程包括TNFR1在结构域4或膜近侧区（SEQ ID NO:603的168-182位氨基酸；SEQ ID NO:604的168-183位氨基酸）的蛋白水解。可溶的TNFR1保留结合TNFα的能力，并因此作为TNFα活性的内源抑制剂发挥功能。
WO2006038027、WO2008149144和WO2008149148公开了抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域和包含这些的拮抗剂。这些文件也公开了这些结构域和拮抗剂在治疗和/或预防通过TNFα介导的病症中的用途。WO2006038027公开了名为TAR2h-205的免疫球蛋白单个可变结构域（dAb）（WO2006038027中的SEQ ID NO: 627），其具有针对人TNFR1的适度效力。希望提供改进的抗-人TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域、拮抗剂、配体和包含这些的产品。它们的目的是提供改进的诊断试剂用于检测样品中的人TNFR1，以及或可选地提供改进的疗法用于治疗和/或预防在人或其他哺乳动物中TNFR1介导的病症和疾病。特别希望提供的抗-人TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域、拮抗剂、配体和包含这些的产品是TNFR1，特别是人TNFR1的有效中和剂（比TAR2h-205更有效）；在人TNFR1和至少一种其他物种（例如通常用作药物开发和检测模型的物种，例如小鼠、大鼠、狗、猪或非人灵长类）的TNFR1之间具有交叉反应；对蛋白酶（例如在患者中可能遇到的蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或leucozyme）具有抗性；具有良好的药物动力学（例如有利的半衰期）；和/或展示结合TNFR1，例如人TNFR1的高亲和力。在本文中将TAR2h-205称为DOM1h-574 (SEQ ID NO: 11)（参见图5）。
本发明的多个方面满足了这些希望的特征。
发明概述
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述单个可变结构域是包含一个或多个以下突变（根据Kabat编号）的DOM1h-574-14的突变体：
位置30是L或F，
位置52是A或T，
位置52a是D或E，
位置54是A或R，
位置57是R、K或A，
位置60是D、S、T或K，
位置61是E、H或G，
位置62是A或T，
位置100是R、G、N、K、Q、V、A、D、S或V，和
位置101是A、Q、N、E、V、H或K。
任选地，所述单个可变结构域是包含一个或多个以下突变（根据Kabat编号）的DOM1h-574-14的突变体：
位置30是L或F，
位置52是A或T，
位置52a是D，
位置54是A，
位置57是R，
位置 60是D、S或T，
位置61是H，
位置62是A，
位置100是V、A、R、G、N或K，和
位置101是E、V、K、A Q或N。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白重链单个可变结构域，其在第101位（根据Kabat编号）包含缬氨酸。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一个或多个，其中编号根据Kabat，其中单个可变结构域的氨基酸序列在其他位置与DOM1h-574的氨基酸序列相同。在一个实施方案中，提供了结合人、鼠类或食蟹猴（Cynomologus monkey） TNFR1的可变结构域。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-156、DOM1h-574-109、 DOM1h-574-132、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。此方面提供的可变结构域在细胞测定中是TNFR1（例如，至少为人TNFR1）的有效中和剂。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-109、DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137或DOM1h-574-160的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列。此方面提供的可变结构域是蛋白水解稳定的。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-133、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-139、DOM1h-574-155、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。此方面提供的可变结构域以高亲和力结合人TNFR1并任选地也展示对鼠类TNFR1的理想亲和力。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，其中所述单个可变结构域由与下表12中所示的任一个DOM1h序列（除了DOM1h-574以外）至少80、85、90、95、96、97、98或99%相同的核苷酸序列编码。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，其中所述单个可变结构域由与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、96、97、98或99%相同的核苷酸序列编码。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含与DOM1h-574-72的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中当在下述条件下孵育时所述单个可变结构域具有蛋白酶抗性：
（i）至少10微克/ml浓度（c）的蛋白酶在37℃孵育至少1小时的时间（t）；或
（ii）至少40微克/ml浓度（c’）的蛋白酶在30℃孵育至少1小时的时间（t），
其中可变结构域包含与DOM1h-574-126或DOM1h-574-133的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列，并任选地在第101位（Kabat编号）包含缬氨酸。
在一个方面，本发明涉及多肽，其包含本发明的免疫球蛋白单个可变结构域和抗体恒定结构域，任选地抗体Fc区，任选地其中Fc的N端连接（任选地直接连接）可变结构域的C端。
在一个方面，本发明涉及多特异性配体，其包含本发明的免疫球蛋白单个可变结构域和任选地至少一个特异性结合血清白蛋白（SA）的免疫球蛋白单个可变结构域。令人惊讶地，本发明人发现根据本发明的抗-TNFR1单个可变结构域与抗-SA单个可变结构域的融合不但提供了改进的半衰期（相比单独的抗-TNFR1 dAb）的优势，而且具有对于TNFR1结合的改进的亲和力（KD）的额外好处。此发现在本领域现有技术中从未公开过。在一个实施方案中，多特异性配体是或包含选自本文公开的标注为“DMS”的任意构建体，例如DMS0111、0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、0133、0134、0135、0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、0190、0191、0192、5519、5520、5521、5522、5525和5527 (SEQ ID NO: 45-92)中任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，多特异性配体是或包含由本文公开的任意DMS的核苷酸序列，例如DMS0111、0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、0133、0134、0135、0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、0190、0191、0192、5519、5520、5521、5522、5525和5527的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了编码包含抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域的多特异性配体的核酸，其中所述核酸包含任意本文公开的DMS的核苷酸序列，例如，DMS0111、0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、0133、0134、0135、0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、0190、0191、0192、5519、5520、5521、5522、5525和5527的核苷酸序列中的任一个。这里提供了包含这样的核酸的载体，以及包含这样的载体的宿主细胞（例如，非人宿主细胞）。
在一个方面，本发明提供了多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156的氨基酸序列至少93%相同（任选地至少94、95、96、97、98或99%相同或100%相同）的氨基酸序列，（ii）至少一个特异性结合SA的抗血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11-3的序列至少80%（任选地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%）相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在抗-TNFR1单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。可选地，所述接头是AS(G4S)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G4S)3。
在一个方面，本发明提供了多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156的氨基酸序列至少93%相同（任选地至少94、95、96、97、98或99%相同或100%相同）的氨基酸序列，（ii）至少一个特异性结合SA的抗血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-14-10的序列至少80%（任选地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%）相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在抗-TNFR1单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。可选地，所述接头是AS(G4S)n，其中n是1、2、3 、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。
在一个方面，本发明提供了TNFR1拮抗剂，其包含本发明的任一前述方面的单个可变结构域、多肽或多特异性配体。
在一个方面，本发明提供了本发明的TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于口服递送、递送至患者的胃肠道、肺部递送、递送至患者的肺部或全身递送。
在一个方面，本发明提供了TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。
在一个方面，本发明提供了TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
在一个方面，本发明提供了TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了本发明的TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂包含免疫球蛋白单个可变结构域，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含选自DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的单个可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了本发明的TNFR1拮抗剂，其用于治疗和/或预防炎症病症。
在一个方面，本发明提供了本发明的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎症病症的药物中的用途。
在一个方面，提供了本发明的任一方面的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1的表位序列。
在一个方面，提供了本发明的任一方面的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1的表位序列，以治疗和/或预防上文指定的任意病症或疾病。
在一个方面，本发明提供了在患者中治疗和/或预防上文指定的任意病症或疾病的方法，所述方法包括对患者施用本发明的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于在患者中靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1的表位序列。
本发明的一个方面提供了多特异性配体，其包含抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域和至少一个特异性结合血清白蛋白（SA）的免疫球蛋白单个可变结构域，其中
（a）所述抗-TNFR1单个可变结构域包含与DOM1h-574-156、DOM1m-15-12或DOM1m-21-23的氨基酸序列至少80%（任选地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%）相同的氨基酸；和
（b）所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11-12或DOM7h-11-12dh的氨基酸序列至少80%（任选地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%）相同的氨基酸；和
（c）所述配体包含在所述可变结构域之间的接头，所述接头包含氨基酸序列AS或AST。本发明的另一个方面提供多特异性抗体，其包含DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540或由DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540组成。本发明的一个方面提供编码任一多特异性配体的核酸。本发明的另一个方面提供包含与DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540的核苷酸序列至少80%（任选地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%）相同的核苷酸序列的核酸。本发明还提供包含所述核酸的载体，以及包含所述载体的宿主，任选地非人胚细胞。
附图说明
图1. 来自对人TNFR1初次（na?ve）选择的dAb的BIAcore结合。在SA BIAcore芯片上包被生物素化的人TNFR1。将来自初次选择的4种纯化的dAb (DOM1h-509、DOM1h-510、DOM1h-549和DOM1h-574)注射到人TNFR1上并测定结合。用箭头指示对应每种dAb的曲线。
图2. 来自对人TNFR1初次选择的dAb的MRC5细胞测定。在MRC5细胞测定中，就对TNFα介导的IL-8释放的功能抑制，分析了来自初次选择的4种纯化的dAb(DOM1h-509、DOM1h-510、DOM1h-549和DOM1h-574)和对照dAb(DOM1h-131-511)。如描述的进行测定并用箭头指示对应每种dAb的曲线。在图中，将dAb浓度对观察到的中和百分比作图（使用Graphpad Prism）。
图3. 来自对人TNFR1初次选择的dAb的受体结合测定。在受体结合测定中测定了来自初次选择的4种纯化的dAb(DOM1h-509、DOM1h-510、DOM1h-549和DOM1h-574)和阳性对照dAb(DOM1h-131-511)以测定与TNFα的竞争。已知阳性对照dAb与TNFα竞争并显示了完全抑制曲线。选择的抗-TNFR1 dAb不能抑制TNFα与受体的结合。如描述的进行测定并用箭头指示对应每种dAb的曲线（使用Graphpad Prism）。在y-轴上的“%中和”指示TNFα结合抑制。
图4. 来自对人TNFR1易错试验成熟（test maturation）的dAb的MRC5细胞测定。在MRC5细胞测定中，就对TNFα介导的IL-8释放的功能抑制，分析了来自初次选择的3种纯化的dAb(DOM1h-574-7、DOM1h-574-8和DOM1h-574-10)和对照dAb(DOM1h-131-511)。如描述的进行测定并用箭头指示对应每种dAb的曲线。在图中，将dAb浓度对观察到的中和百分比作图（使用Graphpad Prism）。与图2中显示的亲本DOM1h-574相比，这些dAb在MRC5细胞测定中证明增加的效力。
图5. 从DOM1h-574的易错文库中鉴定的dAb及其后续重组体的氨基酸序列比对。对改进的DOM1h-574 dAb的易错、试验成熟选择在DOM1h-574-7、DOM1h-574-8、DOM1h-574-10、DOM1h-574-11、DOM1h-574-12和DOM1h-574-13中鉴定出导致亲和力提高的位置。这些突变(V30G、G44D、L45P、G55D、H56R和K94I )的重组产生DOM1h-574-14至DOM1h-574-19。在特定位置处的“.”表示与在DOM1h-574中的该位置发现的氨基酸相同。用下划线和粗体表示CDR（第一个下划线序列是CDR1，第二个下划线序列是CDR2和第三个下划线序列是CDR3）。
图6. 来自人、食蟹猴、狗和小鼠的TNFR1的胞外区的氨基酸序列比对。比对突出了在人和小鼠TNFR1之间的有限的序列保守。在特定位置处的“.”表示与在人ECD TNFR1中的该位置发现的氨基酸相同。
图7. 通过BIAcore测定监控DOM1h-574-16和DOM1h-131-206与狗TNFR1的结合。用生物素化的狗TNFR1包被BIAcore SA芯片。之后，将纯化的dAb DOM1h-574-16和DOM1h-131-206以每种100nM注射到狗TNFR1上。通过示踪曲线（traces）明显可见，尽管DOM1h-574-16显示了显著结合，对DOM1h-131-206仅观察到有限的结合。
图8. 通过BIAcore测定监控DOM1h-574-16与小鼠TNFR1的结合。用生物素化的小鼠TNFR1包被BIAcore SA芯片。之后，将纯化的dAb DOM1h-574-16以1 μM注射到小鼠TNFR1上。示踪曲线明确证明DOM1h-574-16结合小鼠TNFR1。
图9. DOM1h-574-16在小鼠L929细胞测定中的功能活性。通过检测纯化的DOM1h-574-16在放线菌素存在下保护小鼠L929细胞免受TNFα的细胞毒性作用的能力，测定了纯化的DOM1h-574-16（黑线，三角形）与小鼠TNFR1的功能性交叉反应。作为阳性对照，小鼠TNFR1结合dAb，DOM1m-21-23（灰线，正方形）被包括在内并显示为有活性。在图中，将dAb浓度对TNFα活性的中和百分比作图（使用Graphpad Prism）。如实施例中描述的进行测定。
图10. DOM1h-574-16在食蟹猴CYNOM-K1细胞测定中的功能活性。通过检测DOM1h-574-16抑制CYNOM-K1细胞应答TNFα的IL-8释放的能力，测定了纯化的DOM1h-574-16（灰虚线，三角形）与食蟹猴TNFR1的功能性交叉反应。如实施例中描述的进行测定。作为阳性对照，DOM1h-131-511 (黑实线，正方形)被包括在内。2种dAb都显示了完全中和。在图中，将dAb浓度对TNFα活性的中和百分比作图（使用Graphpad Prism）。
图11A-C. 在亲和成熟中鉴定的DOM1h-574系中最有效的dAb的氨基酸序列比对。将在MRC5细胞测定中具有最高效力的dAb的氨基酸序列与亲本DOM1h-574，用于开始亲和成熟的模板(DOM1h-574-14)和较早鉴定出具有提高的效力的dAb(DOM1h-574-72)一起列出。在特定位置处的“.”表示与在DOM1h-574中的该位置发现的氨基酸相同。用下划线和粗体表示CDR（第一个下划线序列是CDR1，第二个下划线序列是CDR2和第三个下划线序列是CDR3）。
图12A-C. 在亲和成熟中鉴定的DOM1h-574系中对蛋白酶最稳定的dAb的氨基酸序列比对。在亲和成熟后鉴定的显示对胰蛋白酶消化最具抗性的dAb的氨基酸序列。为了比对，也包括了亲本dAb DOM1h-574。在特定位置处的“.”表示与在DOM1h-574中的该位置发现的氨基酸相同。用下划线和粗体表示CDR（第一个下划线序列是CDR1，第二个下划线序列是CDR2和第三个下划线序列是CDR3）。
图13A-C. 选为详细表征的dAb的氨基酸序列比对。比对包括12种被选为详细表征的dAb以及DOM1h-574（亲本dAb）和DOM1h-574-16，DOM1h-574-16较早用于该系的表征。在特定位置处的“.”表示与在DOM1h-574中的该位置发现的氨基酸相同。用下划线和粗体表示CDR（第一个下划线序列是CDR1，第二个下划线序列是CDR2和第三个下划线序列是CDR3）。
图14. 通过BIAcore对DOM1h-574-16和DOM1h-131-511的表位作图。用生物素化的人TNFR1包被BIAcore SA芯片。穿过该表面注入DOM1h-131-511和DOM1h-574-16（以每种200 nM并之后再生（regeneration）注入（未显示））。测定了每种dAb的结合RU（反应单位）数。之后，注入相同浓度的DOM1h-131-511，然后立刻注入DOM1h-574-16。如可清楚看到的，DOM1h-574-16的第二次注入的结合单位数与第一次注入的相同，表示dAb结合非竞争表位。
图15. 通过BIAcore对DOM1h-574-16和MAB225 (R&D Systems)的表位作图。用生物素化的人TNFR1包被BIAcore SA芯片。穿过表面注入DOM1h-574-16并定量结合。在再生后（未显示），注入MAB225，随后再次注入DOM1h-574-16。DOM1h-574-16的结合水平与MAB225不存在时观察到的相差无几，表示结合表位和MAB225是非竞争性的。
图16. 通过BIAcore对DOM1h-574-16和mAb克隆4.12的表位作图。用生物素化的人TNFR1包被BIAcore SA芯片。穿过表面注入克隆4.12(Invitrogen、Zymed)并定量结合。在再生后（未显示），注入DOM1h-574-16，随后再次注入克隆4.12。观察到克隆4.12的第二次注入的结合水平比DOM1h-574-16不存在时观察到的减少约20%。此结果表示人TNFR1表位结合的有限竞争。DOM1h-574-16与克隆4.12可能具有轻微重叠的表位。在注入前和注入后立即的RU信号跳动是缓冲液跳动，其未被扣除。
图17. 通过BIAcore对DOM1h-574-16和DOM1h-510的表位作图。用生物素化的人TNFR1包被BIAcore SA芯片。穿过表面注入DOM1h-510并定量结合。之后，注入DOM1h-574-16，随后再次注入DOM1h-510。很明显，DOM1h-510的第二次注入显示了少得多的结合，表示DOM1h-510结合竞争表位。
图18. 通过BIAcore对DOM1h-574-16和DOM1m-21-23的表位作图。用生物素化的小鼠TNFR1包被BIAcore SA芯片。穿过表面注入DOM1h-574-16并定量结合。之后，注入DOM1m-21-23，随后再次注入DOM1h-574-16。第二次注入后DOM1h-574-16结合的RU数和DOM1m-21-23不存在时观察到的很相似。这表示DOM1m-21-23和DOM1h-574-16在小鼠TNFR1上具有不同的结合表位。
图19. 通过BIAcore将DOM1h-574-16对TNFR1的线性肽片段进行表位作图。用4种生物素化的肽分别包被BIAcore SA芯片的4个通道。所述肽为：1) 人TNFR1的肽片段，其不显示在ForteBio上的结合并用作阴性对照，A3(SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2) 结构域-1肽D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY)，3)结构域-3肽D5 (SGSGCRKNQYRHYWSENLF)和4)重叠结构域-3肽E5 (SGSGNQYRHYWSENLFQCF)。使DOM1h-574-16 (2.5 μM)流经所有4种肽并测定结合量。在对照肽A3上没有观察到DOM1h-574-16的结合，而所述dAb结合3种其他肽。在图中，通过肽标识符指示对应不同肽的示踪曲线。
图20. 通过BIAcore评估DOM1m-21-23与TNFR1的4种线性肽片段的结合。用4种生物素化的肽分别包被BIAcore SA芯片的4个通道。所述肽为：1)人TNFR1的肽片段，其不显示在ForteBio上的结合并用作阴性对照，A3(SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2)结构域-1肽D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY)，3)结构域-3肽D5 (SGSGCRKNQYRHYWSENLF)和4)重叠结构域-3肽E5 (SGSGNQYRHYWSENLFQCF)。为确定DOM1m-21-23也结合这些肽，将DOM1m-21-23 (2.5 μM)注射到所有4种肽上。如图所示，DOM1m-21-23未显示和4种肽中的任一种结合。曲线彼此重叠。
图21. 通过BIAcore将DOM1h-131-511对TNFR1的线性肽片段进行表位作图。用4种生物素化的肽分别包被BIAcore SA芯片的4个通道。所述肽为：1）人TNFR1的肽片段，其不显示在ForteBio上的结合并用作阴性对照，A3(SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2）结构域-1肽D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY)，3)结构域-3肽D5 (SGSGCRKNQYRHYWSENLF)和4)重叠结构域-3肽E5 (SGSGNQYRHYWSENLFQCF)。使DOM1h-131-511 (2.5 μM)流经所有4种肽并测定结合数。如图所示，DOM1h-131-511未显示和4种肽中的任一种结合。曲线几乎重叠并通过箭头和对应的肽编号指示。
图22. DOM0100-AlbudAb串联（in-line）融合物与小鼠血清白蛋白（MSA）结合的BIAcore分析。在BIAcore CM5芯片上包被MSA(Sigma-Aldrich)，使用EDC/NHS化学根据制造商的说明书进行。之后，将N-端至C端分别由抗-TNFR1 dAb – 接头 – AlbudAb组成的DMS构建体（如表6所示）以1 μM注射到MSA表面上并监控结合。如BIAcore示踪曲线所示，DMS0192和DMS0188具有最好的总体动力学，而DMS0182和DMS0184与MSA结合最弱。用箭头指示了每个DMS克隆的对应BIAcore示踪曲线。
图23. DOM0100-AlbudAb串联融合物与人血清白蛋白（HSA）结合的BIAcore分析。在BIAcore CM5芯片上包被HSA(Sigma-Aldrich)，使用EDC/NHS化学根据制造商的说明书进行。之后，将N-端至C端分别由抗-TNFR1 dAb – 接头 – AlbudAb组成的DMS构建体（如表6所示）以1 μM注射到MSA表面上并监控结合。如BIAcore示踪曲线所示，DMS0189和DMS0190具有最好的总体动力学，而图中显示的其他DMS克隆(DMS0182、DMS0184、DMS0186和DMS0188)与HSA的亲和力非常相似并且显著较弱。用箭头指示了每个DMS克隆的对应BIAcore示踪曲线。
图24. DOM0100-AlbudAb融合物在小鼠中的PK。对小鼠给药DMS0168 (2.5 mg/kg、静脉内)、DMS0169 (2.5 mg/kg、静脉内)或DMS0182 (10 mg/kg、腹膜内)。在每个时间点(0.17、1、4、12、24、48和96h)处死3只小鼠并分析其血清的各种DOM0100-AlbudAb融合物水平。在每个时间点测定每种DOM0100-AlbudAb融合物的平均量并对时间作图，DMS0168 (灰虚线)、DMS0182 (黑点线)和DMS0169 (黑实线)（对应的线也用箭头指示）。使用WinNonLin分析软件包（例如版本5.1（可从Pharsight Corp.、Mountain View、CA94040、USA处获得）中的无隔分析（NCA），测定了每种分子的终末半衰期。DMS0182具有5.9h的终末半衰期，DMS0168为15.4h和DMS0169为17.8h。由于腹膜内给药，DMS0182的曲线具有不同于DMS0168和DMS0169观察到的形状（通过Biacore显示曲线）。
图25. 在盐水和DMS0169处理期间Tg197/hp55 KI小鼠的关节炎评分。在此研究中使用的转基因小鼠品系是Tg197 (过表达人TNFα) 和hp55 (敲入人TNFR1、又称p55)的杂种（cross-bred），其自发地产生关节炎。从第6周至第15周，用10 mg/kg DMS0169或盐水每周2次处理每组中的12只小鼠。每周测定每只小鼠两个后部关节的关节炎评分并将12只小鼠的平均关节炎评分和平均值标准误对时间作图。很明显，DMS0169处理的动物较少产生关节炎。
图26. 在盐水和DMS0169处理期间Tg197/hp55 KI小鼠的体重。在此研究中使用的转基因小鼠品系是Tg197 (过表达人TNFα) 和hp55 (敲入人TNFR1、又称p55)的杂种，其自发地产生关节炎。从第6周至第15周，用10 mg/kg DMS0169或盐水每周2次处理每组中的12只小鼠。每周对小鼠称重并对平均数作图，图中显示指示平均值标准误的误差条（error bar）。图中明显可见，与用盐水处理的动物相比，DMS0169倾向于更重，尽管不是统计上显著的。
图27. 在盐水和DMS0169处理后第15周的Tg197/hp55 KI小鼠的组织学和关节炎评分。在此研究中使用的转基因小鼠品系是Tg197 (过表达人TNFα) 和hp55 (敲入人TNFR1、又称p55)的杂种，其自发地产生关节炎。从第6周至第15周，用10 mg/kg DMS0169或盐水每周2次处理每组中的12只小鼠。在第15周处死小鼠并对关节炎评分（黑条）和关节中的组织学（空白条）二者评分(Keffer 等人 EMBO. J. 10、p4025 (1991))。每组由12只动物组成并计算标准误。显示处理组之间的差异是统计上显著的(p<0.001)。
发明详述
在此说明书中以使成文的说明书清楚和简明的方式参考实施方案描述了本发明。意图是并应当理解在不背离本发明的情况下可不同地组合或分离实施方案。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语和本领域（例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学）普通技术人员通常理解的具有相同的含义。使用标准技术用于分子、遗传和生化方法（一般见Sambrook 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.和Ausubel 等人, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第四版 John Wiley & Sons, Inc。其在此引入作为参考）和化学方法。
本文描述的免疫球蛋白单个可变结构域（dAb）包含互补决定区(CDR1, CDR2和CDR3)。CDR和框架（FR）区的位置和编号系统已由Kabat 等人 (Kabat, E.A. 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991))定义。本文描述的VH和VL (Vκ) dAb的CDR (CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列对本领域技术人员将是显而易见的，其是基于熟知的Kabat氨基酸编号系统和CDR的定义。根据Kabat编号系统重链CDR-H3具有不同的长度，在残基H100和H101之间用直到K的字母（即H100、H100A ... H100K、H101）编号插入。可选地CDR也可使用Chothia系统 (Chothia 等人, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature 342, p877-883)确定，根据AbM或根据以下的Contact法。确定CDR的合适方法见http://www.bioinf.org.uk/abs/。
一旦编号了每个残基，然后可应用以下CDR定义（“-”表示和Kabat显示的相同的残基编号）：
Kabat-最常使用的基于序列可变性的方法
（使用Kabat编号）：
CDR H1: 31-35/35A/35B
CDR H2: 50-65
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
Chothia-基于结构环区的位置
（使用Chothia编号）：
CDR H1: 26-32
CDR H2: 52-56
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
AbM-Kabat和Chothia的折中
（使用Kabat编号）：     （使用Chothia编号）：
CDR H1: 26-35/35A/35B      26-35
CDR H2: 50-58                     -
CDR H3: 95-102                   -
CDR L1: 24-34                      -
CDR L2: 50-56                      -
CDR L3: 89-97                      -
Contact-基于晶体结构和与抗原接触残基的预测
（使用Kabat编号）：     （使用Chothia编号）：
CDR H1: 30-35/35A/35B      30-35
CDR H2: 47-58                    -
CDR H3: 93-101                   -
CDR L1: 30-36                     -
CDR L2: 46-55                      -
CDR L3: 89-96                      - 。
如本文使用的，术语“肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）拮抗剂”或“抗-TNFR1拮抗剂”等等指结合TNFR1并可抑制（即一种或多种）TNFR1功能的试剂（例如，分子，化合物）。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFα结合TNFR1和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。因此，TNFR1介导的过程和细胞应答（例如，在标准L929细胞毒性测定中TNFα诱导的细胞死亡）可被#拮抗剂抑制。
如本文使用的，“肽”指通过肽键连接在一起的约2至约55个氨基酸。
如本文使用的，“多肽”指通过肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽一般包括三级结构且折叠成功能结构域。
如本文使用的，当在适合于蛋白酶活性的条件下与蛋白酶温育时，“对蛋白酶降解有抗性的”肽或多肽（例如，结构域抗体（dAb））基本上不由蛋白酶降解。当在适合于蛋白酶活性的温度与蛋白酶温育约1小时后，不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约14％、不超过约13％、不超过约12％、不超过约11％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％、或基本上无一蛋白质由蛋白酶降解时，多肽（例如，dAb）基本上不降解。例如在37或50℃。蛋白质降解可以使用任何合适的方法例如通过SDS-PAGE或如本文描述的功能测定（例如配体结合）进行评估。
如本文使用的，“展示系统”指这样的系统，其中多肽或肽的集合可用于基于期望特征，例如物理、化学或功能特征的选择。展示系统可为合适的多肽或肽库（例如在溶液中，在合适的支持物上固化）。展示系统也可为使用细胞表达系统（例如，在例如转化的、感染的、转染的或转导的细胞中表达核酸库并在细胞表面展示编码的多肽）或非细胞表达系统（例如乳剂区室化和展示）的系统。示例性展示系统将核酸的编码功能和核酸编码的多肽或肽的物理、化学和/或功能特征联系在一起。当使用这样的展示系统时，可选择具有期望物理、化学和/或功能特征的多肽或肽并可容易地分离或回收编码选择的多肽或肽的核酸。将核酸的编码功能和多肽或肽的物理、化学和/或功能特征联系在一起的多种展示系统是本领域已知的，例如细菌噬菌体展示（噬菌体展示，例如噬菌粒展示），核糖体展示，乳剂区室化和展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，细菌展示，质粒上的展示，共价展示等等（见例如EP 0436597 (Dyax), 美国专利号6,172,197 (McCafferty 等人), 美国专利号6,489,103 (Griffiths 等人)）。
如本文使用的，“库”指由氨基酸序列多样性表征的多肽或肽集合。库的单个成员可具有共同特征，例如共同结构特征（例如共同核心结构）和/或共同功能特征（例如能够结合共同的配体（例如通用配体或靶配体，TNFR1））。
如本文使用的，“功能”描述了具有生物学活性，例如特定结合活性的多肽或肽。例如，术语“功能多肽”包括通过其抗原结合位点结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。
如本文使用的，“通用配体”(“generic ligand”)指结合给定库的功能成员的基本部分（例如基本上全部）的配体。通用配体（例如共同的通用配体）可结合给定库的多个成员即使所述成员可能不具有对共同靶配体的结合特异性。大体上，在多肽上存在的功能通用配体结合位点（由结合通用配体的能力指示）表示所述多肽是正确折叠的和有功能的。通用配体的合适实例包括超抗原，结合在库功能成员基本部分上表达的表位的抗体，等等。
“超抗原”是本领域的术语，其指和免疫球蛋白超家族成员在异于这些蛋白质的靶配体结合位点的位点相互作用的通用配体。葡萄球菌肠毒素是和T细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括结合IgG恒定区的蛋白质G(Bjorck和Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984))；结合IgG恒定区和VH结构域的蛋白质A(Forsgren和Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966))；和结合VL结构域的蛋白质L(Bjorck, J. Immunol., 140:1194 (1988))。
如本文使用的，“靶配体”指特异性或选择性被多肽或肽结合的配体。例如，当多肽是抗体或其抗原结合片段时，靶配体可为任意期望抗原或表位。结合靶抗原依赖于有功能的多肽或肽。
如本文使用的，抗体指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段（例如Fab 、F（ab’）2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体），无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术生成的；无论是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌中分离的。
如本文使用的，“抗体形式”，“形式化”或类似术语指任何合适的多肽结构，其中可以掺入一个或多个抗体可变结构域，以便在结构上赋予对于抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任何一种的抗原结合片段（例如Fv片段（例如，单链Fv（scFv）、二硫键连接的Fv）、Fab片段、Fab’片段、F（ab’）2片段）、单个抗体可变结构域（例如，dAb、VH、VHH、VL）和前述任何一种的修饰形式（例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价附着修饰的或人源化VHH）。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”指抗体可变结构域（VH、VHH、VL），其不依赖于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位。免疫球蛋白单个可变结构域可以以具有其他可变区或可变结构域的形式（例如，同或异多聚体）存在，其中所述其他区或结构域不是通过单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需的（即，其中免疫球蛋白单个可变结构域不依赖于另外的可变结构域结合抗原）。“结构域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单个可变结构域”相同，如该术语在本文中使用的。“单个免疫球蛋白可变结构域”与“免疫球蛋白单个可变结构域”相同，如该术语在本文中使用的。“单个抗体可变结构域”或“抗体单个可变结构域”与“免疫球蛋白单个可变结构域”相同，如该术语在本文中使用的。免疫球蛋白单个可变结构域在一个实施方案中是人抗体可变结构域，但还包括来自其他物种例如啮齿类动物（例如，如WO 00/29004中公开的，其内容整体引入本文作为参考）、护士鲨（nurse shark）和骆驼科物种（Camelid）VHH dAbs的单个抗体可变结构域。骆驼科物种VHH是免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。VHH可以是人源化的。
“结构域”是具有不依赖于蛋白质的其余的三级结构的折叠蛋白质结构。一般地，结构域负责蛋白质的不连续功能性质，并且在许多情况下可以添加、去除或转移至其他蛋白质，而不丧失蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。“单个抗体可变结构域”是包括抗体可变结构域特有的序列的折叠的多肽结构域。它因此包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已由并非抗体可变结构域特有的序列替换，或已截短或包括N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
术语“文库”指异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员具有单一的多肽或核酸序列。在这种情况下，“文库”（“library”）和“库”（“repertoire”）是同义词。文库成员之间的序列差异是文库中存在多样性的原因。文库可采用多肽或核酸的简单复合物的形式，或可为用核酸文库转化的生物或细胞，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等等的形式。在一个实施方案中，每个单独生物或细胞仅包含一个或有限数目的文库成员。在一个实施方案中，将核酸参入表达载体以允许核酸编码的多肽的表达。因此在一个方面，文库可采用宿主生物群的形式，每个生物包含一个或多个拷贝的表达载体，表达载体包含核酸形式的单个文库成员，其可被表达以产生其对应的多肽成员。因此，宿主生物群具有编码不同多肽的大库的潜能。
“通用框架”是对应如Kabat定义（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）的保守序列的抗体区或对应如Chothia和Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917定义的人种系免疫球蛋白库或结构的单个抗体框架序列。文库和库可使用单个框架，或一组这样的框架，已发现这样的框架允许通过单独在高变区中的变异产生几乎任意结合特异性。
如本文使用的，术语“剂量”指一次（单位剂量）全部或经过限定时间间隔以2次或更多次施用施用于受试者的配体的量。例如，剂量可以指在1天（24小时）（日剂量）、2天、1周、2周、3周或一个或多个月（例如，通过单次施用，或通过2次或更多次施用）的过程期间施用于受试者的配体（例如，包括结合靶抗原的免疫球蛋白单个可变结构域的配体）的量。剂量之间的时间间隔可以是任何所需时间量。
如本文使用的，“流体动力学大小”指基于分子通过水溶液的扩散，分子（例如蛋白质分子、配体）的表观大小。可以处理蛋白质通过溶液的扩散或运动，以得到蛋白质的表观大小，其中大小由蛋白质粒子的“斯托克斯（Stokes）半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学大小”依赖于质量和形状（构象），从而使得基于蛋白质的总体构象，具有相同分子量的2种蛋白质可以具有不同的流体动力学大小。
如本文提及的，术语“竞争”意指第一种靶与其关连靶（cognate target）结合结构域的结合在第二种结合结构域的存在下被抑制，所述第二种结合结构域对于所述关连靶特异。例如，结合可以在立体上被抑制，例如通过结合结构域的物理封闭或通过结合结构域的结构或环境的改变，从而使得其对于靶的亲和力或抗体亲抗原性减少。关于如何执行竞争ELISA和竞争BiaCore实验，以测定第一种和第二种结合结构域之间的竞争的详细说明，参见WO2006038027。
如下执行2个序列之间的“同源性”或“同一”或“相似性”（该术语在本文中可互换使用）的计算。序列就最佳比较目的进行比对（例如，缺口可以引入第一个和第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，并且非同源序列为了比较目的可以被忽视）。在一个实施方案中，就比较目的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、80％、90％、100％。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置由与第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在那个位置上是等同的（如本文使用的，氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”）。2个序列之间的百分比相同性是由序列共享的等同位置数目的函数，其中考虑缺口数目和每个缺口的长度，这需要引入用于2个序列的最佳比对。如本文定义的，氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或相同性可以使用算法BLAST 2 Sequences进行制备且测定，其中使用缺省参数（Tatusova，T. A.等人，FEMS Microbiol Lett，174:187-188（1999）。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，单个可变结构域为DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162、DOM1h-574-180、DOM1h-574-7、DOM1h-574-8、DOM1h-574-10、DOM1h-574-12、DOM1h-574-13、DOM1h-574-14、DOM1h-574-15、DOM1h-574-16、DOM1h-574-17、DOM1h-574-18或DOM1h-574-19。在一个实施方案中，根据此方面的可变结构域可具有本发明的任意其他方面的一个或多个特征并且本文正文的公开应当被解释为使这些特征能够被组合，例如包含在本文的权利要求书中。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，单个可变结构域为DOM1h-510、DOM1h-543或DOM1h-549。在一个实施方案中，根据此方面的可变结构域可具有本发明的任意其他方面的一个或多个特征并且本文正文的公开应当被解释为使这些特征能够被组合，例如包含在本文的权利要求书中。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中单个可变结构域为包含一个或多个以下突变（根据Kabat编号）的DOM1h-574-14突变体：
位置30是L或F，
位置52是A或T，
位置52a是D或E，
位置54是A或R，
位置57是R、K或A，
位置60是D、S、T或K，
位置61是E、H或G，
位置62是A或T，
位置100是R、G、N、K、Q、V、A、D、S或V，和
位置101是A、Q、N、E、V、H或K。
在此方面的一个实施方案中，突变的氨基酸序列与DOM1h-574的氨基酸序列至少98%或99%相同。在一个实施方案中，突变的氨基酸序列与DOM1h-574-14的氨基酸序列相同或至少98%或99%相同。在一个实施方案中，根据此方面的可变结构域可具有本发明的任意其他方面的一个或多个特征并且本文正文的公开应当被解释为使这些特征能够被组合，例如包含在本文的权利要求书中。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其在第101位（根据Kabat编号）包含缬氨酸。本发明人惊讶地发现V101经常与结合TNFR1（例如人TNFR1）的高KD相联系。在一个实施方案中，根据此方面的可变结构域可具有本发明的任意其他方面的一个或多个特征并且本文正文的公开应当被解释为使这些特征能够被组合，例如包含在本文的权利要求书中。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其在第101位（根据Kabat编号）包含缬氨酸。本发明人惊讶地发现V101经常和蛋白水解稳定性相联系。有关蛋白水解稳定性和蛋白水解稳定的免疫球蛋白单个可变结构域的更多详细说明可在WO2008149144和WO2008149148中找到，其公开在此以其整体引入作为参考，特别是提供用于测定可变结构域和其他抗-TNFR1配体、拮抗剂和结合结构域的蛋白酶稳定性的试验。在一个实施方案中，根据此方面的可变结构域可具有本发明的任意其他方面的一个或多个特征并且本文正文的公开应当被解释为使这些特征能够被组合，例如包含在本文的权利要求书中。
在一个实施方案中，根据任意方面的单个可变结构域包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一个或多个，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含45P、55D、56R、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含55D、56R、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含45P、55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含30G、44D、55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。
在一个方面，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一个或多个，其中编号是根据Kabat，其中单个可变结构域的氨基酸序列在其他位置与DOM1h-574的氨基酸序列相同。在一个实施方案中，提供用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1的可变结构域。在一个实施方案中，可变结构域包含45P、55D、56R、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含55D、56R、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含45P、55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。在一个实施方案中，可变结构域包含30G、44D、55D、94I和98R，其中编号是根据Kabat。
在一个方面，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、DOM1h-574-156、DOM1h-574-109、DOM1h-574-132、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列相同的或至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供了在细胞测定中是TNFR1（例如至少人TNFR1）的有效中和剂的可变结构域，例如在标准MRC5测定中通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定；或在标准L929测定中通过TNFα诱导的细胞毒性的抑制测定；在标准食蟹猴KI测定中通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定。用于TNFR1拮抗剂的标准测定详细说明是本领域已知的，例如在WO2006038027, WO2008149144和WO2008149148中。也在下面的实施例章节中提供了详细说明。在一个实施方案中，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与下表11中所示的除了DOM1h-574以外的任一DOM1h可变结构域的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-89至DOM1h-574-179中任一个氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-109、 DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126或DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137或DOM1h-574-160的氨基酸序列相同的或至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供了蛋白水解稳定的可变结构域。参考上文有关蛋白酶稳定性的讨论。
在一个方面，本发明提供抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72、 DOM1h-574-109、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-133、DOM1h-574-135或DOM1h-574-138、DOM1h-574-139、DOM1h-574-155、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列相同的或至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供以高亲和力结合人TNFR1并任选地也展示对鼠类TNFR1的理想亲和力的可变结构域。
单个可变结构域为例如TNFR1的非竞争性抑制剂。在一个实施方案中，本发明的任意方面的抗-TNFR1单个可变结构域结合TNFR1（例如人TNFR1）但不（或基本上不）与TNFα竞争或抑制TNFα结合TNFR1（例如在标准受体结合测定中）。在此实施方案中，在一个实例中可变结构域特异性结合TNFR1例如人TNFR1的结构域1。在此实施方案中，在一个实例中可变结构域特异性结合TNFR1例如人TNFR1的PLAD。
在一个实施方案中，本发明的任意方面的抗-TNFR1单个可变结构域包含特异性结合下述的结合位点：
（i）人TNFR1，以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低、或150 pM或更低的解离常数（KD），其通过表面等离子体共振测定；或
（ii）非人灵长类TNFR1（例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1），以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD），其通过表面等离子体共振测定；或
（iii）鼠类TNFR1，以（或以约）7 nM或更低、6 nM或更低、5 nM或更低、4 nM或更低、3 nM或更低、2 nM或更低、或1 nM或更低的解离常数（KD），其通过表面等离子体共振测定。在一个实例中，可变结构域特异性结合(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)、(ii)和(iii)；或(ii)和(iii)。
在一个实施方案中，本发明的任意方面的单个可变结构域包含特异性结合下述的结合位点：
（a）人TNFR1，以（或以约）2 x 10-4 S-1 或更低、或1 x 10-4 S-1 或更低、或1 x 10-5 S-1或更低的解离速率常数(Koff)，其通过表面等离子体共振测定；
（b）非人灵长类TNFR1（例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1），以（或以约）2 x 10-4 S-1 或更低、或1 x 10-4 S-1 或更低、或1 x 10-5 S-1或更低的解离速率常数(Koff)，其通过表面等离子体共振测定；或
（c）鼠类TNFR1，以（或以约）1 x 10-3 S-1 或更低、或1 x 10-4 S-1 或更低的解离速率常数(Koff)，其通过表面等离子体共振测定。在一个实例中，可变结构域特异性结合(a)和(b)；(a)和(c)；(a)、(b)和(c)；或(b)和(c)。
在一个实施方案中，本发明的任意方面的单个可变结构域包含特异性结合下述的结合位点：
（a’）人TNFR1，以（或以约）5 x 104 M-1s-1或更高、1 x 105 M-1s-1或更高、2 x 105 M-1s-1或更高、3 x 105 M-1s-1或更高、4 x 105 M-1s-1或更高、或5 x 105 M-1s-1或更高的结合速率常数(Kon)，其通过表面等离子体共振测定；
（b’）非人灵长类TNFR1（例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1），以（或以约）5 x 104 M-1s-1或更高、1 x 105 M-1s-1或更高、2 x 105 M-1s-1或更高、3 x 105 M-1s-1或更高、4 x 105 M-1s-1或更高、或5 x 105 M-1s-1或更高的结合速率常数(Kon)，其通过表面等离子体共振测定；或
（c’）鼠类TNFR1，以（或以约）0.5 x 105 M-1s-1或更高、1 x 105 M-1s-1或更高、或2 x 105 M-1s-1或更高的结合速率常数(Kon)，其通过表面等离子体共振测定。在一个实例中，可变结构域特异性结合(a’)和(b’)；(a’)和(c’)；(a’)、(b’)和(c’)；或(b’)和(c’)。
在一个实施方案中，本发明的任意方面的单个可变结构域特异性结合人、食蟹猴和任选地犬TNFR1。特异性结合由10微摩尔或更低，任选地1微摩尔或更低的解离常数KD指示。抗原结合蛋白质与抗原或表位的特异性结合可通过合适的测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争结合测定，例如放射免疫测定（RIA）、酶免疫测定例如ELISA和夹心竞争测定和其不同的变体测定。在一个实例中，可变结构域也特异性结合鼠类TNFR1。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，单个可变结构域抑制人、食蟹猴和任选地犬TNFR1结合DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180，例如在标准细胞测定中（例如本文或在WO2006038027、WO2008149144或WO2008149148中描述的）。在本发明的任意方面的实施方案中，单个可变结构域抑制人、食蟹猴和任选地犬TNFR1结合DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180，例如在标准受体结合测定中（例如本文或在WO2006038027、WO2008149144或WO2008149148中描述的）。在一个实例中，在这些实施方案中的“抑制”是可为全部（100%抑制）或基本上（至少90%、95%、98%,或99%）的抑制。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单个可变结构域、拮抗剂、配体或多肽以（或以约）5、4、3、2或1 nM或更低的ND50在标准MRC5测定中中和TNFR1（例如人TNFR1），其通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单个可变结构域、拮抗剂、配体或多肽以150、100、50、40、30或20 nM或更低；或从(约) 150至10 nM；或从(约) 150至20 nM；或从(约) 110至10 nM；或从(约) 110至20 nM的ND50在标准L929测定中中和TNFR1（例如鼠类TNFR1），其通过TNFα诱导的细胞毒性的抑制测定。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单个可变结构域、拮抗剂、配体或多肽以5、4、3、2或1 nM或更低；或从（约）5至（约）1 nM的ND50在标准食蟹猴KI测定中中和TNFR1（例如人TNFR1），其通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，单个可变结构域包含末端，任选地C-端半胱氨酸残基。例如，半胱氨酸残基可用于连接PEG至可变结构域，例如使用马来酰亚胺连接（见例如WO04081026）。在本发明的任意方面的实施方案中，单个可变结构域被连接至聚亚烷基二醇部分，任选地聚乙二醇部分。合适的PEG部分和结合方法和试验见例如WO04081026。本文引入这些公开以提供在下面的权利要求中包含的公开内容，例如特定PEG。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同的，或与选定的氨基酸序列在不超过25、20、15、10或5个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR1序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR1序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25、20、15、10或5个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR2序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR2序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR2序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR2序列。另外地或可选地，在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR3序列。另外地或可选地，在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域包含与选定的氨基酸序列的CDR1序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR1序列。
在一个方面，本发明提供了抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25、20、15、10或5个氨基酸位置处不同并具有与选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中当在下述条件下孵育时所述单个可变结构域具有蛋白酶抗性：
（i）至少10微克/ml浓度（c）的蛋白酶在37℃孵育至少1小时的时间（t）；或
（ii）至少40微克/ml浓度（c’）的蛋白酶在30℃孵育至少1小时的时间（t），
其中可变结构域包含与DOM1h-574-126或DOM1h-574-133的氨基酸序列至少94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，并任选地在第101位（Kabat编号）包含缬氨酸。在另一个方面，本发明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中当在下述条件下孵育时所述单个可变结构域具有蛋白酶抗性：
（i）至少10微克/ml浓度（c）的蛋白酶在37℃孵育至少1小时的时间（t）；或
（ii）至少40微克/ml浓度（c’）的蛋白酶在30℃孵育至少1小时的时间（t），其中可变结构域包含与DOM1h-574、DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137或DOM1h-574-160的氨基酸序列至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，并任选地在第101位（Kabat编号）包含缬氨酸。
在这些方面的一个实施方案中，蛋白酶抗性的抗-TNFR1可变结构域是非竞争性可变结构域（即，其不（基本上不）抑制TNFα结合TNFR1）。见上文有关非竞争性可变结构域的讨论，其也应用于这些实施方案。
在这些方面的一个实施方案中，浓度（c或c’）为至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一个实施方案中，时间（t）为1、3或24小时或过夜。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）下是抗性的，并且浓度（c）是10或100微克/ml蛋白酶，并且时间（t）是1小时。在一个实施方案中，可变结构域在条件（ii）下是抗性的，并且浓度（c’）是40微克/ml蛋白酶，并且时间（t）是3小时。在一个实施方案中，蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂。在一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中，可变结构域对胰蛋白酶和至少另一种选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂的蛋白酶有抗性。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）或（ii）下孵育后特异性结合TNFR1。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）或（ii）下孵育后在ELISA中具有至少0.404的OD450读数。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）或（ii）下孵育后特异性结合蛋白质A或蛋白质L。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）或（ii）下孵育后在凝胶电泳中基本上展示单一条带。在一个实施方案中，可变结构域具有至少50℃的Tm。有关蛋白酶抗性的更多详细说明可在WO2008149144和WO2008149148中找到。
在一个方面，本发明涉及多肽，其包含本发明的免疫球蛋白单个可变结构域和效应基团或抗体恒定结构域，任选地抗体Fc区，任选地其中Fc的N-端连接（任选地直接连接）至可变结构域的C-端。在WO04058820中描述的任意“效应基团”可用于本发明的此方面，并且本文明确引入WO04058820中对效应基团的描述和在该出版物中公开的将它们连接至可变结构域的方法作为参考以提供可用于本文的描述，例如在本文的权利要求书中。在一个实施方案中，多肽包含DOM1h-574-16或DOM1h-574-72的Fc融合。
在一个方面，本发明涉及多特异性配体，其包含本发明的免疫球蛋白单个可变结构域和任选地至少一个特异性结合血清白蛋白（SA）的免疫球蛋白单个可变结构域。令人惊讶地，本发明人发现根据本发明的抗-TNFR1单个可变结构域与抗-SA单个可变结构域的融合不但提供了改进的半衰期（相比单独的抗-TNFR1 dAb）的优势，而且具有与TNFR1结合的改进的亲和力（KD）的额外好处。此发现在本领域现有技术中从未公开过。在这方面，本发明提供了包含本发明的抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域和抗-SA（例如抗-人SA）免疫球蛋白单个可变结构域的多特异性配体以提供比以可变结构域单体提供的（即当抗-TNFR1可变结构域是非形式化的，例如非PEG化的或不与抗体恒定区例如Fc区融合的，和不与任意其他结构域融合的）抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域具有与TNFR1结合的更长的半衰期和更低的KD的配体。在一个实施方案中，多特异性配体以比TNFR1单体的KD低至少2倍的KD结合TNFR1（例如人TNFR1）。另外地或可选地，在一个实施方案中，多特异性配体具有所述单体的至少5、10、20、30、40、50或100倍的半衰期。另外地或可选地，在一个实施方案中，多特异性配体在人中具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天的终末半衰期（例如在人志愿者中经验上测定的或使用技术人员熟悉的常规技术通过在动物系统例如小鼠、狗和/或非人灵长类（例如食蟹猴、狒狒、恒河猴）中配体的半衰期推断计算的）。例如其中抗-SA结构域在人SA和来自动物的SA之间有交叉反应。
在本发明的多特异性配体的一个实施方案中，配体是TNFR1（例如人TNFR1），任选地TNFR1介导的信号转导的拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了具有范围在（或约）2.5小时或更长的tβ半衰期的根据本发明的可变结构域、多特异性配体或拮抗剂。在一个实施方案中，范围的下端是（或是约）3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时 、11小时、或12小时。此外或可选地，tβ半衰期是（或是约）长达并包括21或25天。在一个实施方案中，范围的上端是（或是约）12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天、19天 20天、21天或22天。例如，根据本发明的可变结构域或拮抗剂将具有12至60小时范围（或约12至60小时）的tβ半衰期。在另一个实施方案中，tβ半衰期将在12至48小时的范围（或约12至48小时）。在另一个实施方案中，tβ半衰期将在12至26小时的范围（或约12至26小时）。
作为使用二室模型的替代方案，技术人员将熟悉无隔模型的使用，其可用于测定终末半衰期（在此方面，本文使用的术语“终末半衰期”指使用无隔模型测定的终末半衰期）。可使用WinNonlin 分析软件包, 例如版本5.1 (可从Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA获得)，例如用这种方法模拟曲线。在此情况下，在一个实施方案中单个可变结构域、多特异性配体或拮抗剂具有至少（或至少约）8小时、10小时、12小时、15小时、28小时、20小时、1 day、2天、3天、7天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天的终末半衰期。在一个实施方案中，此范围的上端是（或是约）24小时、48小时、60小时或72小时或120小时。例如，终末半衰期例如在人中是（或是约）从8小时至60小时,或8小时至48小时或12至120小时。
除了上述标准以外或可选地，根据本发明的可变结构域或拮抗剂具有范围在（或约）1 mg.min/ml或更高的AUC值（曲线下的面积）。在一个实施方案中，所述范围的下端是（或是约）5、10、15、20、30、100、200或300 mg.min/ml。此外或可选地，根据本发明的可变结构域、多特异性配体或拮抗剂具有范围在（或约）高达600 mg.min/ml的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上端是（或是约）500、400、300、200、150、100、75或50 mg.min/ml。有利地可变结构域或拮抗剂将具有在（或约在）选自下述的范围中的AUC：15至150 mg.min/ml、15至100 mg.min/ml、15至75 mg.min/ml,和15至50mg.min/ml。
通过提供和PEG或特异性结合血清白蛋白（例如小鼠和/或人血清白蛋白（SA）的单个可变结构域（或结合部分）连接的一个或多个抗-TNFR1单个可变结构域（或本文定义的其他结合部分）可从人和/或动物（例如小鼠或非人灵长类，例如狒狒、恒河猴、食蟹猴）中得到tα、tβ和终末半衰期以及本文引述的AUC中的一个或多个。PEG大小可为（或为约）至少20 kDa，例如30、40、50、60、70或80 kDa。在一个实施方案中，PEG为40kDa，例如2x20kDa PEG。在一个实施方案中，为得到tα、tβ和终末半衰期或本文引述的AUC，提供了包含和抗-SA免疫球蛋白单个可变结构域连接的抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域的拮抗剂。在一个实施方案中，PEG为40kDa，例如2x20kDa PEG。例如，拮抗剂仅包含1个这样的抗-TNFR1可变结构域，例如1个仅与1个抗-SA可变结构域连接的这样的结构域。在一个实施方案中，为得到tα、tβ和终末半衰期或本文引述的AUC，提供了包含与PEG，例如40-80 kDa PEG，例如40 kDa PEG连接的抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域的拮抗剂。例如，拮抗剂仅包含1个这样的抗-TNFR1可变结构域，例如1个与40 kDa PEG连接的这样的结构域。
在本发明的多特异性配体的一个实施方案中，配体包含抗-SA（例如HSA）单个可变结构域，所述可变结构域包含与DOM7h-11、DOM7h-11-3、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18或DOM7m-16的序列相同的或至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。可选地或另外地，在一个实施方案中，多特异性配体包含在抗-TNFR1单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域之间提供的接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。可选地，所述接头是AS(G4S)n、其中n是1、2、3 、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。例如，配体包含（从N-至C-端）DOM1h-574-16-AST-DOM7h-11;或DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7m-16;或DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7h-11-12。
在一个方面，本发明提供了多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体 (TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156的氨基酸序列相同的或至少93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，（ii）至少1个特异性结合SA的抗-血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11-3的序列相同的或至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在抗-TNFR1单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。可选地，所述接头是AS(G4S)n、其中n是1、2、3,、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。例如，配体包含任选地由AST或ASTSGPS连接的DOM1h-574-156和DOM7h-11-3。可选地，所述接头是AS(G4S)n、其中n是1、2、3、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。在此实例或方面中，任选地使配体适合对患者血管内、皮下、肌肉内、腹膜内或通过吸入施用。在一个实施方案中，以干燥粉末或冻干的组合物（任选地在施用前将其与稀释剂混合）提供配体。
在一个方面，本发明提供了多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体 (TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156的氨基酸序列相同的或至少93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，（ii）至少1个特异性结合SA的抗-血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-14-10的序列相同的或至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在抗-TNFR1单个可变结构域和抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。可选地，所述接头是AS(G4S)n、其中n是1、2、3 、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。例如，配体包含任选地由AST或ASTSGPS连接的DOM1h-574-156和DOM7h-14-10。可选地，所述接头是AS(G4S)n、其中n是1、2、3 、4、5、6、7或8、例如AS(G4S)3。在此实例或方面中，任选地使配体适合对患者血管内、皮下、肌肉内、腹膜内或通过吸入施用。在一个实施方案中，以干燥粉末或冻干的组合物（任选地在施用前将其与稀释剂混合）提供配体。
本发明提供TNFR1拮抗剂，其包含本发明的任意方面或实施方案的单个可变结构域、多肽或多特异性配体。例如，本发明的拮抗剂或可变结构域单价结合TNFR1。例如，本发明的拮抗剂或可变结构域是单价的或基本上单价的，如通过标准SEC-MALLS测定。通过可变结构域或拮抗剂的不超过5、4、3、2或1%以非单价形式存在指示基本上单价，如通过标准SEC-MALLS测定。
在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含第一和第二个抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域，其中每个可变结构域是根据本发明的任意方面或实施方案的。第一和第二个免疫球蛋白单个可变结构域在一个实例中是相同的。在另一个实例中它们是不同的。
在一个实例中，本发明的拮抗剂或拮抗剂中的每个抗-TNFR1单个可变结构域的氨基酸序列与DOM1h-574-16或DOM1h-574-72的氨基酸序列相同。
在一个方面，本发明提供了包含根据本发明的任意方面的抗-TNFR1可变结构域的TNFα1型受体 (TNFR1；p55)拮抗剂，用于口服递送、递送至患者的胃肠道、肺部递送、递送至患者的肺或全身递送。在另一个方面，本发明提供了本发明的任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于口服递送的药物中的用途。在另一个方面，本发明提供了本发明的任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于递送至患者的胃肠道的药物中的用途。在一个实例中拮抗剂或可变结构域对胰蛋白酶、弹性蛋白酶和/或胰酶制剂有抗性。
在一个方面，本发明提供了本发明的任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于肺部递送的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于递送至患者的肺的药物中的用途。在一个实例中拮抗剂或可变结构域对leucozyme有抗性。
在一个方面，本发明提供了用于药物的口服递送或递送至患者的胃肠道或患者的肺或肺部组织的方法，其中所述方法包括对患者施用药物有效量的本发明的TNFR1拮抗剂。
在一个方面，本发明提供了用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1的TNFα1型受体 (TNFR1；p55)拮抗剂，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的CDR1序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR1序列。任选地，所述拮抗剂也可具有与选定序列的CDR2序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR2序列。任选地、另外地或可选地，所述拮抗剂也可具有与选定序列的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1的TNFα1型受体 (TNFR1；p55)拮抗剂，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的CDR2序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR2序列。任选地，所述拮抗剂也可具有与选定序列的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1的TNFα1型受体 (TNFR1；p55)拮抗剂，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR3序列。
在一个方面，本发明提供了用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1的TNFα1型受体 (TNFR1；p55)拮抗剂，所述拮抗剂包含含有选自DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180的单个可变结构域的CDR1、CDR2、和/或CDR3的序列的免疫球蛋白单个可变结构域。
本发明提供了任意方面的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防炎症病症。本发明提供了任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎症病症的药物中的用途。在拮抗剂或其用途的一个实施方案中，病症选自关节炎、多发性硬化、炎症性肠病和慢性阻塞性肺病。在一个实例中，关节炎是类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎。在一个实例中，炎症性肠病选自克罗恩病（Crohn’s disease）和溃疡性结肠炎。在一个实例中，慢性阻塞性肺病选自慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎和肺气肿。在一个实例中，肺炎是细菌性肺炎。在一个实例中，细菌性肺炎是葡萄球菌肺炎。
本发明提供了任意方面的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防呼吸道疾病。本发明提供了任意方面的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防呼吸道疾病的药物中的用途。在一个实例中所述呼吸道疾病选自肺炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒细胞浸润症、环境相关肺病、肺炎、支气管炎、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞、胸膜疾病、纵隔膜疾病、隔膜疾病、换气不足、换气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合症、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、过敏性鼻炎、过敏、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵略性肺炎球菌疾病、流感、非结核性分枝杆菌、胸膜积液、尘肺病、肺孢子虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓塞、肺炎症、肺组织细胞增多病X、肺动脉高压、肺诺卡氏病、肺结核、肝静脉闭塞病、类风湿性肺病、肉状瘤病和韦格纳肉芽肿病（Wegener's granulomatosis）。
在一个方面，提供本发明的任一方面的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、 CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1表位序列。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向NSICCTKCHKGTYLY。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向NSICCTKCHKGTY。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向CRKNQYRHYWSENLF。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向NQYRHYWSENLFQCF。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向NSICCTKCHKGTYLY、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF。在一个实例中，提供所述抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF。在一个实例中，这样的靶向用于治疗和/或预防上面详细说明的任意病症或疾病。在一个方面，本发明提供了在患者中治疗和/或预防上面详细说明的任意病症或疾病的方法，所述方法包括对患者施用本发明的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向如任意前述实施方案中描述的1个或多个TNFR1表位序列。
多肽，dAb和拮抗剂
多肽、配体、dAb、配体或拮抗剂可以在大肠杆菌或毕赤酵母属物种（例如巴斯德毕赤酵母（P. pastoris））中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母属物种（例如巴斯德毕赤酵母）中表达时，配体或dAb单体以至少约0.5 mg/L的量分泌。尽管当在大肠杆菌或毕赤酵母属物种（例如巴斯德毕赤酵母）中表达时，本文描述的配体和dAb单体可以是可分泌的，但它们可以使用不采用大肠杆菌或毕赤酵母属物种的任何合适方法产生，例如合成化学方法或生物生产方法。
在一些实施方案中，多肽、配体、dAb、配体或拮抗剂不包括骆驼科动物免疫球蛋白可变结构域，或由骆驼科动物种系抗体基因区段编码的免疫球蛋白可变结构域独特的一个或多个框架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。在一个实施方案中，本发明的抗-TNFR1可变结构域在根据Kabat的位置44上包含G残基并任选地在其他位置例如位置37或103上包含一个或多个骆驼科特异性氨基酸。
根据本发明的TNFR1拮抗剂可以是单价或多价的。在一些实施方案中，拮抗剂是单价的，并且包含与TNFR1相互作用的一个结合位点，所述结合位点由本发明的多肽或dAb提供。单价拮抗剂结合一个TNFR1，并且可以不诱导TNFR1在细胞表面上的交联或聚簇，这可以导致受体激活和信号转导。
在其他实施方案中，TNFR1的拮抗剂是多价的。TNFR1的多价拮抗剂可以包含关于TNFR1的特定结合位点的2个或更多个拷贝，或包含结合TNFR1的2种或更多种不同结合位点，至少一种结合位点由本发明的多肽或dAb提供。例如，如本文描述的，TNFR1的拮抗剂可以是包括结合TNFR1的本发明的特定多肽或dAb的2个或更多个拷贝，或结合TNFR1的2种或更多种不同的本发明的多肽或dAbs的二聚体、三聚体或多聚体。在一个实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂在标准细胞测定中基本上不激动TNFR1（充当TNFR1的激动剂）（即在测定中当以1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1000 μM或5,000 μM的浓度存在时，导致不超过约5%的由TNFα (100 pg/ml)诱导的TNFR1介导的活性）。
在某些实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂包含对于TNFR1的期望表位或结构域的2个或多个结合位点。例如，TNFR1的多价拮抗剂可包含对于TNFR1的结构域1中的相同表位结合的2个或多个结合位点。
在其他实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂包含由本发明的多肽或dAb提供的与TNFR1的不同表位或结构域结合的2个或多个结合位点。在一个实施方案中，当在标准L929细胞毒性测定或在如WO2006038027中描述的标准HeLa IL-8测定中以约1 nM、或约10 nM、或约100 nM、或约1 μM、或约10 μM的浓度存在时，这样的多价拮抗剂不激动（agonize）TNFR1。
TNFR1的其他拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合。这样的配体（和拮抗剂）可用作诊断试剂，因为它们可用于结合和检测，定量或测量样品中的TNFR1并且不与样品中的TNF竞争结合TNFR1。因此，可对样品中是否有或有多少TNFR1进行精确的测定。
在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂结合TNFR1并在标准细胞测定中以≤ 100 nM的ND50拮抗TNFR1的活性，并且在测定中≤ 10μM浓度的dAb拮抗≤ 5%的TNFR1活性。
在特定的实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在标准细胞测定中基本上不激动TNFR1（充当TNFR1的激动剂）（即在测定中当以1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1000 μM或5,000 μM的浓度存在时，导致不超过约5%的由TNFα (100 pg/ml)诱导的TNFR1介导的活性）。
在某些实施方案中，本发明的多肽、配体、dAb或拮抗剂当以有效量施用时在慢性炎症疾病模型中有效。通常有效量为约1 mg/kg至约10 mg/kg (例如，约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约5 mg/kg、约6 mg/kg、约7 mg/kg、约8 mg/kg、约9 mg/kg,或约10 mg/kg)。慢性炎症疾病模型（见WO2006038027中描述的那些）用于在人中预测治疗效力是本领域技术人员认可的。
在特定实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型（模型的详细说明见WO2006038027）中有效。例如，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中降低四肢总和的平均关节炎评分，例如和合适的对照相比降低约1至约16、约3至约16、约6至约16、约9至约16,或约12至约16。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中延缓关节炎症状的发作，例如和合适的对照相比延缓约1天 约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可导致在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中四肢总和的平均关节炎评分降低0至约3、约3至约5、约5至约7、约7至约15、约9至约15、约10至约15、约12至约15,或约14至约15。
在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在关节炎的小鼠ΔARE模型（模型的详细说明见WO2006038027）中有效。例如，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在关节炎的小鼠ΔARE模型中降低平均关节炎评分，例如和合适的对照相比降低约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在关节炎的小鼠ΔARE模型中延缓关节炎症状的发作，例如和合适的对照相比延缓约1 day、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可导致在关节炎的小鼠ΔARE模型中的平均关节炎评分降低0至约0.5、约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2、或约2至约2.5。
在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在炎症性肠病（IBD）的小鼠ΔARE模型（模型的详细说明见WO2006038027）中有效。例如，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在IBD的小鼠ΔARE模型中降低平均急性和/或慢性炎症评分，例如和合适的对照相比降低约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在IBD的小鼠ΔARE模型中延缓IBD症状的发作，例如和合适的对照相比延缓约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可导致IBD的小鼠ΔARE模型中的平均急性和/或慢性炎症评分降低0至约0.5、 约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2、或约2至约2.5。
在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在IBD的小鼠右旋糖酐硫酸酯钠（DSS）诱导模型（模型的详细说明见WO2006038027）中有效。例如，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在IBD的小鼠DSS模型中降低平均严重度评分，例如和合适的对照相比降低约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可在IBD的小鼠DSS模型中延缓IBD症状的发作，例如和合适的对照相比延缓约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一个实例中，施用有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂可导致IBD的小鼠DSS模型中的平均严重度评分降低0至约0.5、 约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2、或约2至约2.5。
在特定实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在慢性阻塞性肺病（CORD）的小鼠烟草烟雾模型（模型的详细说明见WO2006038027）中有效。例如，和合适的对照相比，施用有效量的配体可减少或延缓CORD症状的发作。
可用于筛选TNFR1拮抗剂（例如其配体、抗体或结合蛋白）在防御或治疗疾病中的有效性的动物模型系统是现有的。在易感小鼠中检测全身性红斑狼疮的方法是本领域已知的(Knight 等人 (1978) J. Exp. Med., 147: 1653；Reinersten 等人 (1978) New Eng. J. Med., 299: 515)。在SJL/J雌性小鼠中通过用来自另一个物种的可溶性AchR蛋白诱导疾病检测重症肌无力（MG）(Lindstrom 等人 (1988) Adv. Immunol., 42: 233)。在小鼠的易感品系中通过注射II型胶原诱导关节炎(Stuart 等人 (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233)。通过注射分支杆菌热休克蛋白在易感大鼠中诱导佐剂关节炎的模型已有描述(Van Eden 等人 (1988) Nature, 331: 171)。如描述的通过施用甲状腺球蛋白在小鼠中诱导甲状腺炎(Maron 等人 (1980) J. Exp. Med., 152: 1115)。在小鼠的特定品系中天然发生或可诱导胰岛素依赖的糖尿病（IDDM），如Kanasawa 等人 (1984) Diabetologia, 27: 113描述的那些。小鼠和大鼠中的EAE充当人的MS模型。在此模型中，通过施用髓磷脂碱性蛋白诱导脱髓鞘疾病(见Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer 等人, eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213；McFarlin 等人 (1973) Science, 179: 478:和Satoh 等人 (1987) J. Immunol., 138: 179)。
通常，本发明的配体（例如拮抗剂）将以纯化形式与药理学上的合适载体一起使用。通常，这些载体包括水或醇/水溶液，乳剂或悬浮剂，任意包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸林格氏。如果需要在悬浮液中保存多肽复合物，可从增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐中选择合适的生理上可接受的佐剂。
静脉内载体包括液体和营养补充液和电解质补充液，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版)。可使用多种制剂，包括延长释放制剂。
本发明的配体（例如，拮抗剂）可以作为分开施用的组合物或与其他试剂一起使用。这些可以包括各种免疫治疗药物，例如cylcosporine、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂，和免疫毒素。
药物组合物可以包括与本发明的配体一起的各种细胞毒性的或其他试剂的“混合物（cocktails）”，或甚至具有不同特异性的根据本发明的配体的组合，例如使用不同靶抗原或表位选择的配体，无论它们是否在施用前合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可为本领域普通技术人员通常已知的任意施用途径。用于治疗，包括但不限于免疫治疗，可对任意患者依照标准技术施用本发明的选定的其配体。
施用可通过任意合适的方式，包括胃肠外、静脉、肌肉内、腹膜内、皮下、经皮、经肺通道，或也可合适地通过用导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，同时施用的其他药物，禁忌和临床医生将考虑的其他参数。施用可为如指示的局部（例如通过肺施用例如鼻内施用局部递送至肺）或全身的。
本发明的配体可以冻干用于贮存且在使用前在合适载体中重构。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可以采用领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将认识到冻干和重构可以导致不同程度的抗体活性丧失（例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体趋于具有比IgG抗体更大的活性丧失），并且使用水平可能必须向上调整以补偿。
包含本发明的配体（例如拮抗剂）或其混合物的组合物可以施用用于预防和/或治疗处理。在特定治疗应用中，实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻抑、调节、杀死或一些其他可测量参数的足够量可以被定义为“治疗有效剂量”。达到这个剂量所需的量将依赖于疾病的严重程度和患者的自身免疫系统的一般状态，但通常范围在每千克体重0.005至10.0 mg配体，例如dAb或拮抗剂，更常使用0.05至2.0 mg/kg/剂量的剂量。用于预防应用，包含本发明的配体或其混合物的组合物也可以类似或略微降低的剂量施用，以预防、抑制或延缓疾病的发作（例如维持缓解或静止，或预防急性期）。有经验的临床医生将能够确定治疗、阻抑或预防疾病的合适给药时间间隔。当施用TNFR1的配体（例如拮抗剂）以治疗、阻抑或预防慢性炎症疾病时，其可以多达每日4次、每周2次、每周1次、每2周1次，1个月1次或每2个月1次以例如约10 μg/kg至约80 mg/kg、约100 μg/kg至约80 mg/kg、约1 mg/kg至约80 mg/kg、约1 mg/kg至约70 mg/kg、约1 mg/kg至约60 mg/kg、约1 mg/kg至约50 mg/kg、约1 mg/kg至约40 mg/kg、约1 mg/kg至约30 mg/kg、约1 mg/kg至约20 mg/kg 、约1 mg/kg至约10 mg/kg、约10 μg/kg至约10 mg/kg、约10 μg/kg至约5 mg/kg、约10 μg/kg至约2.5 mg/kg、约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约5 mg/kg、约6 mg/kg、约7 mg/kg、约8 mg/kg、约9 mg/kg或约10 mg/kg的剂量施用。在特定的实施方案中，用于治疗、阻抑或预防慢性炎症疾病的TNFR1的配体（例如拮抗剂）以每2周1次或1个月1次以约10 μg/kg至约10 mg/kg (例如、约10 μg/kg、约100 μg/kg、约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约5 mg/kg、约6 mg/kg、约7 mg/kg、约8 mg/kg、约9 mg/kg或约10 mg/kg的剂量施用。
如果相对于治疗前存在的此种症状，或相对于未用此种组合物治疗的个体（人或模型动物）中的此种症状或其他合适对照，一种或多种症状减少（例如，在临床评估量表上至少10％或至少1个点），那么使用本文描述的组合物进行的治疗或疗法被视为“有效的”。症状将明显依赖于靶向的疾病或病症而改变，但可以通过普通有经验的临床医生或技术员进行测量。例如通过监控疾病或病症的一种或多种生物化学指示剂的水平（例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平、受累细胞数目等），通过监控物理表现（例如炎症，肿瘤大小等等）或通过公认的临床评估量表，例如扩展残疾状态量表（用于多发性硬化），Irvine炎症性肠病问卷（有关肠功能、全身症状、社交功能和情绪状态的32点评估评价生活质量——评分范围从32至324，较高的评分指示较好的生活质量），生活质量类风湿性关节炎量表或其他公认的本领域已知的临床评估量表可以测量此种症状。在疾病或失调症状中持续减少至少10%或在给定临床量表中减少1或更多点指示“有效”治疗。类似地，如果相对于未用此种组合物治疗的相似个体（人或模型动物）中的此种症状，一种或多种症状的发作或严重程度延迟、减少或取消，那么使用如本文描述的组合物执行的预防是“有效的”。
包含根据本发明的配体（例如拮抗剂）或其混合物的组合物可用于预防和治疗性装备以辅助改变、失活、杀死或去除在哺乳动物中的选定的靶细胞群。此外，本文描述的选定的多肽库可选择性地在身体外或体外使用以从异种细胞集合中杀死、消耗或否则有效去除靶细胞群。依照标准技术，来自哺乳动物的血液可在身体外与配体组合从而从血液中杀死或否则去除不需要的细胞，然后使血液返回哺乳动物。
包含根据本发明的配体（例如拮抗剂）或其混合物的组合物可用于预防和治疗性装备以辅助改变、失活、杀死或去除在哺乳动物中的选定的靶细胞群。
配体（例如抗-TNFR1拮抗剂，dAb单体）可与一种或多种另外的治疗或活性试剂一起施用或配制。当配体（例如dAb）与另外的治疗剂一起施用时，可在施用另外的试剂之前、同时或之后施用配体。通常，以提供重叠的治疗效果的方式施用配体和另外的试剂。
在一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防慢性炎症疾病的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防关节炎（例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎）的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防银屑病的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防炎症性肠病（例如克罗恩病、溃疡性结肠炎）的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防慢性阻塞性肺病（例如慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿）的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防肺炎（例如细菌性肺炎，例如金黄色葡萄球菌肺炎）的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
本发明提供了治疗、阻抑或预防除了慢性阻塞性肺病以外的肺病和肺炎的方法。依照本发明可治疗、阻抑或预防的其他肺病包括例如囊性纤维化和哮喘（例如类固醇抗性的哮喘）。因此，在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防肺病（例如囊性纤维化和哮喘）的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在特定的实施方案中，经肺部递送，例如通过吸入（例如支气管内、鼻内或口腔吸入，鼻内滴剂）或通过全身性递送（例如胃肠外、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下）施用TNFR1的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明是治疗、阻抑或预防感染性休克的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。
在本发明的另一个方面，提供了组合物，其包含根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂和制药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明提供了使用根据本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂或组合物治疗疾病的方法。在一个实施方案中疾病为癌症或炎症疾病，例如类风湿性关节炎、哮喘或克罗恩病。
在本发明的另一个方面，提供了组合物，其包含根据本发明的多肽、单个可变结构域、配体或拮抗剂和制药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在特定的实施方案中，经肺部递送，例如通过吸入（例如支气管内、鼻内或口腔吸入，鼻内滴剂）或通过全身性递送（例如胃肠外、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下）施用多肽、配体、单个可变结构域、拮抗剂或组合物。
本发明的一个方面提供了包含根据本发明的多肽、单个可变结构域、配体、组合物或拮抗剂的肺部递送装置。所述装置可为吸入器或鼻内施用装置。
在其他实施方案中，本文描述的任意配体（例如拮抗剂或单个可变结构域）还包含延长半衰期的部分，例如聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其部分、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含在体内增加半衰期的多肽的结合位点的部分。在一些实施方案中，延长半衰期的部分包含在体内增加半衰期的多肽的结合位点，所述多肽选自亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域、EGF结构域和avimer。
在其他实施方案中，延长半衰期的部分是聚乙二醇部分。在一个实施方案中，拮抗剂包含（任选地由下述组成）与聚乙二醇部分（任选地，其中所述部分具有约20至约50 kDa的大小，任选地约40 kDa线性或分支的PEG）连接的本发明的单个可变结构域。有关dAb的PEG化和结合部分的更多详细说明参考WO04081026。在一个实施方案中，拮抗剂由与PEG连接的dAb单体组成，其中dAb单体是根据本发明的单个可变结构域。可提供此拮抗剂用于治疗炎症疾病、肺病症（例如哮喘、流感或CORD）或癌症或任选地用于静脉内施用。
在其他实施方案中，延长半衰期的部分是抗体或抗体片段（例如免疫球蛋白单个可变结构域），其包含血清白蛋白或新生Fc受体的结合位点。
本发明还涉及组合物（例如药物组合物），其包含本发明的配体（例如拮抗剂或单个可变结构域）和制药上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含用于静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、囊内、关节内、皮下施用、肺、鼻内、阴道或直肠施用的载体。
本发明还涉及包含本发明的组合物（例如药物组合物）的药物递送装置。在一些实施方案中，药物递送装置包含多个治疗有效剂量的配体。
在其他实施方案中，药物递送装置选自胃肠外递送装置、静脉内递送装置、肌肉内递送装置、腹膜内递送装置、经皮递送装置、肺部递送装置、动脉内递送装置、囊内递送装置、关节内递送装置、皮下递送装置、鼻内递送装置、阴道递送装置、直肠递送装置、注射器、经皮递送装置、胶囊、药片、中和剂、吸入器、喷雾器（atomizer）、雾化器、喷雾器（mister）、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器（sprayer）、定量喷雾器（mister）、定量喷雾器（atomizer）和导管。
可如本文描述的形式化本发明的配体（例如单个可变结构域、拮抗剂或多特异性配体）。例如，可形式化本发明的配体以定制体内血清半衰期。如果需要，配体可进一步包含如本文描述的毒素或毒素部分。在一些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如自由基产生物（例如含硒毒素）或放射性核素。在其他实施方案中，毒素或毒素部分是具有特异性结合细胞内靶的结合位点的多肽结构域（例如dAb）。在特定的实施方案中，配体是具有对TNFR1（例如人TNFR1）的结合特异性的IgG样形式。
在一个方面，本发明提供了包含本发明的单个可变结构域的融合蛋白。可变结构域可被融合至例如肽或多肽或蛋白质。在一个实施方案中，可变结构域被融合至抗体或抗体片段，例如单克隆抗体。通常，可通过从单个核酸序列表达融合产物或通过表达包含单个可变结构域的多肽然后使用常规技术将此多肽组装进较大的蛋白质或抗体形式中实现融合。
在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体恒定结构域。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体Fc，任选地其中Fc的N-端连接（任选地直接连接）可变结构域的C-端。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含延长半衰期的部分。延长半衰期的部分可为聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含在体内增加半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。延长半衰期的部分可为包含血清白蛋白或新生Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。延长半衰期的部分可为dAb、抗体或抗体片段。在一个实施方案中，提供免疫球蛋白单个可变结构域或拮抗剂或融合蛋白使可变结构域（或拮抗剂或融合蛋白包含的可变结构域）进一步包含聚亚烷基二醇部分。聚亚烷基二醇部分可为聚乙二醇部分。下面提供了进一步的讨论。
在一个方面，本发明提供了本发明的任意方面或实施方案的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、组合物或装置，用于提供以下一种或多种目的（在此公开2种或多种以下目的的明确组合并可为权利要求的主题）：
（i）与人TNFR1的有效结合（例如以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD），通过表面等离子体共振测定）；
（ii）与非人灵长类TNFR1（例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1）的有效结合（例如以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD），通过表面等离子体共振测定）；
（iii）与人TNFR1的有效结合（例如以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD），通过表面等离子体共振测定）和与非人灵长类TNFR1（例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1）的有效结合（例如以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD），通过表面等离子体共振测定）；
（iv）与人、食蟹猴和鼠类TNFR1的有效结合（例如以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD）结合人TNFR1，通过表面等离子体共振测定；以（或以约）500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低,或150 pM或更低的解离常数（KD）结合食蟹猴TNFR1，通过表面等离子体共振测定；和以（或以约）7 nM或更低、6 nM或更低、5 nM或更低、4 nM或更低、3 nM或更低、2 nM或更低,或1nM或更低的解离常数（KD）结合鼠类TNFR1，通过表面等离子体共振测定；）
（v）有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本发明的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、配体或组合物以（或以约）5、4、3、2或1 nM或更低的 ND50在标准MRC5测定中中和人TNFR1，通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定；
（vi）有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本发明的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、配体或组合物以5、4、3、2或1 nM或更低；或（约）5至（约）1 nM的 ND50在标准食蟹猴KI测定中中和食蟹猴TNFR1，通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定；
（vii）有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本发明的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、配体或组合物以150、100、50、40、30或20 nM或更低；或从(约) 150至10 nM；或从(约) 150至20 nM；或从 (约) 110至10 nM；或从(约) 110至20 nM的 ND50在标准L929测定中中和鼠类TNFR1，通过TNFα诱导的细胞毒性的抑制测定；
（viii）有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本发明的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、配体或组合物以5、4、3、2或1 nM或更低；或（约）5至（约）1 nM的 ND50在标准食蟹猴KI测定中中和食蟹猴TNFR1，通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制测定；并以150、100、50、40、30或20 nM或更低；或从(约) 150至10 nM；或从(约) 150至20 nM；或从 (约) 110至10 nM；或从(约) 110至20 nM的 ND50在标准L929测定中中和鼠类TNFR1，通过TNFα诱导的细胞毒性的抑制测定；
（ix）在多于1种物种的灵长类TNFR1（任选地，人和食蟹猴和/或恒河猴TNFR1和/或狒狒TNFR1，例如人和食蟹猴TNFR1）和任选的鼠类TNFR1之间提供交叉反应性；和
（x）提供蛋白酶稳定性（任选地，胰蛋白酶稳定性）。
在一个方面，本发明提供了本发明的任意方面或实施方案的单个可变结构域、蛋白质、多肽、拮抗剂、配体、组合物或装置在提供前述紧接的段落中的（i）至（x）中一个或多个目的中的用途。本发明也提供相应的方法。
参考WO2006038027，其公开了抗-TNFR1免疫球蛋白单个可变结构域。本文以其整体引入此文件的公开，以特别提供用于抗-TNFR1单个可变结构域、配体、拮抗剂等等的用途、形式、选择方法、产生方法、配制方法和测定，因此这些公开可在本发明的上下文中特别和明确地应用，包括为引入本公开的权利要求书提供明确的描述。
本发明的抗-TNFR1是免疫球蛋白单个可变结构域，其任选地为人可变结构域或包含或来源于人框架区（例如DP47或DPK9框架区）的可变结构域。在某些实施方案中，可变结构域是基于如本文描述的通用框架。
在某些实施方案中，具有对TNFR1的结合特异性的结合位点的多肽结构域（例如免疫球蛋白单个可变结构域）抵抗聚集，可逆地展开（见WO04101790，本文引入其中的教导作为参考）。
核酸分子，载体和宿主细胞
本发明也提供分离的和/或重组的核酸分子，其编码如本文描述的配体（单个可变结构域、融合蛋白、多肽、双特异性配体和多特异性配体）。
在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其编码包含根据本发明的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-132、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-109、DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126或DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137或DOM1h-574-160的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-133、DOM1h-574-135或DOM1h-574-138、DOM1h-574-139、DOM1h-574-155、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-126或DOM1h-574-133的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其中核酸包含与DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸编码包含特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其中核酸包含与DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、 DOM1h-574-132、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸编码包含特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其中核酸包含与DOM1h-574-109、DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126或DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137或DOM1h-574-160的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸编码包含特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其中核酸包含与DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、 DOM1h-574-109、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-133、DOM1h-574-135或DOM1h-574-138、DOM1h-574-139、DOM1h-574-155、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸编码包含特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供了分离的和/或重组的核酸分子，其中核酸包含与DOM1h-574-126或DOM1h-574-133的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸编码包含特异性结合TNFR1的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。
在一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。在一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。提供了产生包含免疫球蛋白单个可变结构域的多肽的方法，所述方法包括在适于表达核酸或载体的条件下维持宿主细胞，由此产生包含免疫球蛋白单个可变结构域的多肽。任选地，所述方法还包括分离多肽和任选地产生变体例如突变的变体的步骤，所述变体和分离的多肽相比具有改进的亲和力（KD）；在标准MRC5、L929或食蟹猴KI测定中具有改进的中和TNFR1的ND50。
本文中被称为“分离的”核酸是已从其本来的来源（例如其存在于细胞中或核酸混合物例如文库中）的基因组DNA或细胞RNA的核酸中分离出来的核酸，并包括通过本文描述的方法或其它合适的方法得到的核酸，其包括基本上纯的核酸，通过化学合成，通过生物学和化学方法组合产生的核酸，和分离的重组核酸(见例如, Daugherty, B.L. 等人, Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991)；Lewis, A.P.和J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991))。
本文中被称为“重组的”核酸是通过重组DNA技术产生的核酸，包括通过依赖人工重组方法，例如聚合酶链式反应（PCR）和/或使用限制酶克隆进载体的程序产生的核酸。
在某些实施方案中，分离的和/或重组的核酸包含编码如本文描述的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含与结合本文描述的TNFR1的dAb，例如DOM1h-574-156、DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162或DOM1h-574-180的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%氨基酸序列相同性的氨基酸序列。可在编码选定的抗-TNFR1 dAb的核苷酸序列全长上测定核苷酸序列相同性。
本发明也提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体是包含与本发明的重组核酸有效连接的一个或多个表达控制元件或序列的表达载体。本发明也提供包含本发明的重组核酸分子或载体的宿主细胞。合适的载体（例如质粒、噬菌粒）、表达控制元件、宿主细胞和产生本发明的重组宿主细胞的方法是本领域已知的，并且本文进一步描述了实例。
合适的表达载体可包含若干成分，例如复制起点，可选择的标记基因，一个或多个表达控制元件，例如转录控制元件（例如启动子、增强子、终止子）和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列，等等。如果存在，可通过载体或其它来源提供表达控制元件和信号序列。例如，克隆的编码抗体链的核酸的转录和/或翻译控制序列可用于引导表达。
可提供启动子用于在期望的宿主细胞中的表达。启动子可为组成型或诱导型的。例如，启动子可有效连接至编码抗体、抗体链或其部分的核酸，从而引导核酸的转录。用于原核（例如用于大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子）和真核（例如猿猴病毒40早期或晚期启动子，劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子，巨细胞病毒启动子，腺病毒晚期启动子）宿主的多种合适的启动子是现有的。
此外，表达载体通常包含可选择的标记用于选择携带载体的宿主细胞，并且在可复制的表达载体的情况下包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常用的可选择的标记并可用于原核（例如内酰胺酶基因（氨苄青霉素抗性），Tet基因用于四环素抗性）和真核细胞（例如新霉素（G418或遗传霉素），gpt（霉酚酸），氨苄青霉素或潮霉素抗性基因）。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨喋呤在多种宿主中选择。编码宿主的营养缺陷标记的基因产物的基因（例如LEU2、URA3、HIS3）经常用作酵母中的可选择的标记。也考虑使用病毒（例如杆状病毒）或噬菌体载体，和能够整合进宿主细胞基因组的载体，例如逆转录病毒载体。用于在哺乳动物细胞和原核细胞（大肠杆菌）、昆虫细胞（施耐德果蝇（Drosophila Schnieder）S2细胞，Sf9）和酵母（嗜甲醇毕赤酵母（P. methanolica）、巴斯德毕氏酵母（P. pastoris）、酿酒酵母（S. cerevisiae））中合适的表达载体是本领域熟知的。
合适的宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和/或其它合适的细菌；真核细胞，例如真菌或酵母细胞（例如巴斯德毕氏酵母、曲霉属物种（Aspergillus sp.）、酿酒酵母、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、粗糙脉胞菌（Neurospora crassa）），或其它低等真核细胞，和高等真核细胞例如来自昆虫（例如施耐德果蝇S2细胞，Sf9昆虫细胞 (WO 94/26087 (O’Connor)）、哺乳动物（例如COS细胞，例如COS-1 (ATCC登记号CRL-1650)和COS-7 (ATCC登记号CRL-1651), CHO (例如ATCC登记号CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G.和Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (ATCC登记号CRL-1573), HeLa (ATCC登记号CCL-2), CV1 (ATCC登记号CCL-70), WOP (Dailey, L.,等人, J. Virol., 54:739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)) NS0细胞, SP2/0, HuT 78细胞等等，或植物(例如烟草)的细胞。(见例如, Ausubel, F.M.等人, 编 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)。)在一些实施方案中，宿主细胞是分离的宿主细胞并且不是多细胞生物（例如植物或动物）的一部分。在某些实施方案中，宿主细胞是非人宿主细胞。
本发明也提供产生本发明的配体（例如双特异性配体、多特异性配体）的方法，包括在适于表达重组核酸的条件下维持包含本发明的重组核酸的重组宿主细胞，由此表达重组核酸和产生配体。在一些实施方案中，方法进一步包含分离配体。
适用于本发明的实施方案的公开细节参考WO2006038027。例如，相关公开涉及基于免疫球蛋白单个可变结构域的配体的制备、文库载体系统、文库构建、组合单个可变结构域、配体的表征、配体的结构、骨架、蛋白质支架、典范序列的变化、测定和治疗和诊断组合物和用途，以及“有效连接”、“初次（naive）”、“预防”、“阻抑”、“治疗”和“治疗有效剂量”的定义。
形式
增加的半衰期在免疫球蛋白，特别是抗体和最特别地小尺寸的抗体片段的体内应用中有用。这些片段（Fvs、二硫键键合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs）可以遭受从身体快速清除的缺点；因此，虽然它们能够快速到达身体的大多数部分，并且快速生产且更易于处理，但它们的体内应用已受其在体内的仅短暂持续限制。本发明的一个实施方案解决了此问题，通过提供增加的配体体内半衰期和因此提供配体的功能活性在体内的更长的持续时间。
用于药物代谢动力学分析和配体半衰期测定的方法将是本领域技术人员熟悉的。细节可以在Kenneth，A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists 和 Peters等人，Pharmacokinetic analysis：A Practical Approach（1996）中找到。还参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，published by Marcel Dekker，2nd Rev. ex edition（1982），其描述了药物代谢动力学参数，例如tα和tβ半衰期和曲线下面积（AUC）。上文提供了半衰期和AUC的定义。
在一个实施方案中，本发明提供了配体（例如多肽、可变结构域、拮抗剂、多特异性配体）或包含根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在15分钟或更多的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，范围的下端是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时 或12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物将具有在最高达且包括12小时的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的例子是1 - 6小时、2 - 5小时或3 - 4小时。
在一个实施方案中，本发明提供了配体（例如多肽、可变结构域、拮抗剂、多特异性配体）或包含根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在约2.5小时或更多的范围中的tβ半衰期。在一个实施方案中，范围的下端为3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约10小时 、约11小时,或约12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物将具有在最高达且包括21天的范围中的tβ半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是约12小时、约24小时、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天或约20天。在一个实施方案中，根据本发明的配体或组合物将具有约12至约60小时范围中的tβ半衰期。在另一个实施方案中，将具有约12至约48小时的范围。在另一个实施方案中，将具有约12至约26小时的范围。
除了上述标准以外或可选地，本发明提供了配体或包括根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在1 mg.分钟/ml或更多的范围中的AUC值（曲线下面积）。在一个实施方案中，范围的下端是约5、约10、约15、约20、约30、约100、约200或约300 mg.分钟/ml。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物具有在最高达600 mg.分钟/ml的范围中的AUC。在一个实施方案中，范围的上端是约500、约400、约300、约200、约150、约100、约75或约50 mg.分钟/ml。在一个实施方案中，根据本发明的配体将具有在选自下述的范围中的AUC：约15至约150 mg.分钟/ml、约15至约100 mg.分钟/ml、约15至约75 mg.分钟/ml、和约15至约50mg.分钟/ml。
本发明的多肽和dAb和包含其的拮抗剂可以形式化为具有较大的流体动力学大小，例如通过附着PEG基团、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，多肽、dAb和拮抗剂可以形式化为抗体的较大抗原结合片段或抗体（例如，形式化为Fab、Fab’、F（ab）2、F（ab’）2、IgG、scFv）。
本发明的配体（例如，dAb单体和多聚体）的流体动力学大小可以使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，凝胶过滤层析可以用于测定配体的流体动力学大小。用于测定配体的流体动力学大小的合适凝胶过滤基质例如交联琼脂糖基质是众所周知且可容易获得的。
配体形式的大小（例如，与dAb单体附着的PEG部分的大小）可以依赖于所需应用而改变。例如，如果需要配体离开循环并进入外周组织，那么可以保持配体的低流体动力学大小以便于从血流中外渗。可选地，如果需要dAb保留在体循环中更长时间段，那么可以例如通过形式化为Ig样蛋白质增加配体的大小。
通过靶向增加体内半衰期的抗原或表位的半衰期延长
配体的流体动力学大小及其血清半衰期还可以通过使本发明的TNFR1结合多肽、dAb或拮抗剂与结合结构域（例如，抗体或抗体片段）缀合或结合得到增加，所述结合结构域结合增加体内半衰期的抗原或表位，如本文描述的。例如，TNFR1结合试剂（例如多肽）可以与抗血清白蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv缀合或连接，或与抗SA亲和体或抗新生Fc受体亲和体或抗SA avimer、或抗SA结合结构域缀合或连接，其包括选自但不限于下述的支架：CTLA-4、脂质运载蛋白（lipocallin）、SpA、亲和体、avimer、GroEl和纤连蛋白（关于这些结合结构域的公开内容，参见WO2008096158，所述结构域及其序列引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分）。缀合指包括与结合结构域键合（共价或非共价）的本发明的多肽、dAb或拮抗剂的组合物，所述结合结构域结合血清白蛋白。
增强体内血清半衰期的合适多肽包括例如运铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白质（参见美国专利号5,977,307，其教导引入本文作为参考）、脑毛细血管内皮细胞受体、运铁蛋白、运铁蛋白受体（例如，可溶性运铁蛋白受体）、胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF 1）受体、胰岛素样生长因子2（IGF 2）受体、胰岛素受体、凝血因子X、αl-抗胰蛋白酶和HNF 1α。增强血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白（血清类粘蛋白；AAG）、α-1抗胰凝乳蛋白酶（ACT）、α-1微球蛋白（蛋白质HC；AIM）、抗凝血酶III（AT III）、脱脂载脂蛋白A-1（Apo A-1）、脱脂载脂蛋白B（Apo B）、血浆铜蓝蛋白（Cp）、补体成分C3（C3）、补体成分C4（C4）、C1酯酶抑制剂（C1 INH）、C反应蛋白（CRP）、铁蛋白（FER）、血红素结合蛋白（HPX）、脂蛋白（a）（Lp（a））、甘露糖结合蛋白（MBP）、肌红蛋白（Myo）、前白蛋白（运甲状腺素蛋白；PAL）、视黄醇结合蛋白（RBP）和类风湿因子（RF）。
来自细胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原是细胞外基质的主要蛋白质。约15种类型的胶原分子是目前已知的，在身体的不同部分中发现，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原（占90％的身体胶原），或在软骨、脊椎盘、脊索和眼的玻璃体液中发现的II型胶原。
来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白质（例如，血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原（例如，纤维蛋白原A、纤维蛋白原B）、血清淀粉状蛋白A蛋白、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白）、酶和酶抑制剂（例如，纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂）、免疫系统的蛋白质例如免疫球蛋白蛋白质（例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链（κ/λ））、转运蛋白（例如，视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白）、防卫素（例如，β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3）等。
在血脑屏障处或在神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸盐转运蛋白等。
增强体内血清半衰期的合适多肽还包括定位至肾的蛋白质（例如，多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann氏抗原）、定位至肝的蛋白质（例如，醇脱氢酶、G250）、定位至肺的蛋白质（例如，分泌成分，其结合IgA）、定位至心脏的蛋白质（例如，HSP 27，其与扩张型心肌病相关）、定位至皮肤的蛋白质（例如，角蛋白）、骨特异性蛋白质例如形态发生蛋白质（BMPs），其是显示生骨活性的蛋白质的转化生长因子β超家族亚群（例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8）、肿瘤特异性蛋白质（例如，滋养层抗原、赫赛汀（herceptin）受体、雌激素受体、组织蛋白酶（例如，组织蛋白酶B，其可以在肝和脾中发现））。
合适的疾病特异性蛋白质包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG-3（淋巴细胞活化基因）、护骨蛋白配体（OPGL；参见Nature 402，304-309（1999））、OX40（TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达且在人T细胞白血病病毒I型（HTLV-I）生产细胞中特异性上调；参见Immunol. 165（1）:263-70（2000））。合适的疾病特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶（与关节炎/癌症相关），包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；和生血管生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子（FGF-1）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）、血管内皮生长因子/血管通透因子（VEGF/VPF）、转化生长因子-α（TGF α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管生成素、白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-8（IL-8）、血小板衍生内皮生长因子（PD-ECGF）、胎盘生长因子（P1GF）、中期因子（midkine）血小板衍生生长因子-BB（PDGF）、和CXXXC趋化因子（fractalkine）。
增强体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白质例如热休克蛋白（HSP）。HSP通常在细胞内发现。当它们在细胞外发现时，它是细胞已死亡且溢出其内容物的指示剂。当由于创伤、疾病或损伤，细胞外HSP触发来自免疫系统的应答时，这种非程序性细胞死亡（坏死）发生。与细胞外HSP结合可以导致本发明的组合物定位至疾病部位。
涉及Fc转运有关的合适蛋白质包括例如Brambell受体（也称为FcRB）。这种Fc受体具有2种功能，这两者对于递送都潜在有用。功能是（1）IgG从母亲跨越胎盘转运到孩子，（2）保护IgG不受降解，从而延长其血清半衰期。认为受体使来自内体的IgG再循环。（参见，Holliger等人，Nat Biotechnol 15（7）:632-6（1997）.）
结合血清白蛋白的dAb
本发明在一个实施方案中提供了结合TNFR1的配体、多肽或拮抗剂（例如包含抗-TNFR1 dAb的双特异性配体（第一种dAb））和结合血清白蛋白（SA）的第二种dAb，第二种dAb以通过表面等离子体共振测定的约1nM至约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约100、约200、约300、约400或约500 μM (即、x 10-9至5 x 10-4M),或约100 nM至约10 μM,或约1至约5 μM或约3至约70 nM或约10nM至约1、约2、约3、约4或约5μM的KD结合SA。例如通过表面等离子体共振测定的约30至约70 nM。在一个实施方案中，第一种dAb（或dAb单体）以通过表面等离子体共振测定的大概约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300 nM或约1、约2或约3 μM的KD结合SA（例如HSA）。在一个实施方案中，对于包括第一种抗-SA dAb和针对TNFR1的第二种dAb的双特异性配体，第二种dAb对于其靶的亲和力（例如，如通过表面等离子体共振测量的KD和/或Koff，例如使用BiaCore）是第一种dAb对于SA的亲和力的约1至约100000倍（例如约100至约100000,或约1000至约100000,或约10000至约100000倍）。在一个实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白（HSA）。例如，第一种dAb以大概约10 μM的亲和力结合SA，而第二种dAb以约100 pM的亲和力结合其靶。在一个实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白（HSA）。在一个实施方案中，第一种dAb以大概约50、例如约70、约100、约150或约200 nM的KD结合SA（例如HSA）。双特异性配体的详细说明可在WO03002609、WO04003019、WO2008096158和WO04058821中找到。
本发明的配体在一个实施方案中包含以通过表面等离子体共振测定的约1nM至约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约100、约200、约300、约400或约500 μM (即、x 约10-9至约5 x 10-4M),或约100 nM至约10 μM,或约1至约5 μM或约3至约70 nM或约10nM至约1、约2、约3、约4或约5μM的KD结合血清白蛋白（SA）的dAb。例如通过表面等离子体共振测定的约30至约70 nM。在一个实施方案中，第一种dAb（或dAb单体）以通过表面等离子体共振测定的大概约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300 nM或约1、约2或约3 μM的KD结合SA（例如HSA）。在一个实施方案中，第一和第二种dAb通过接头连接，例如从1至4个氨基酸或从1至3个氨基酸，或大于3个氨基酸或大于4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的接头。在一个实施方案中，使用较长的接头（大于3个氨基酸）以增强效价（在拮抗剂中的1种或2种dAb的KD）。
在配体和拮抗剂的特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自DOM7h-11、DOM7h-11-3、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18和DOM7m-16的dAb竞争结合白蛋白。
在配体和拮抗剂的特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自下述的dAb竞争结合白蛋白
MSA-16、MSA-26（关于这些序列的公开内容参见WO04003019，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分），
DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473)、DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501)、DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517)（关于这些序列的公开内容参见WO2007080392，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分；这个段落中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些），dAb8 (dAb10)、DAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20)、DAb7r21 (DOM7r21)、DAb7r22 (DOM7r22)、DAb7r23 (DOM7r23)、DAb7r24 (DOM7r24)、DAb7r25 (DOM7r25)、DAb7r26 (DOM7r26)、DAb7r27 (DOM7r27)、DAb7r28 (DOM7r28)、DAb7r29 (DOM7r29)、DAb7r29 (DOM7r29)、DAb7r31 (DOM7r31)、DAb7r32 (DOM7r32)、DAb7r33 (DOM7r33)、DAb7r33 (DOM7r33)、DAb7h22 (DOM7h22)、DAb7h23 (DOM7h23)、DAb7h24 (DOM7h24)、DAb7h25 (DOM7h25)、DAb7h26 (DOM7h26)、DAb7h27 (DOM7h27)、DAb7h30 (DOM7h30)、DAb7h31 (DOM7h31)、DAb2 (dAbs 4,7,41)、DAb4, dAb7, dAb11, dAb12 (dAb7m12)、DAb13 (dAb 15)、DAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16)  , dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 ( dAb26, dAb7m26)、DAb27, dAb30 (dAb35)、DAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54)、DAb41, dAb46 (dAbs 47, 52和56)、DAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM 7r1)、DAb7r3 (DOM7r3)、DAb7r4 (DOM7r4)、DAb7r5 (DOM7r5)、DAb7r7 (DOM7r7)、DAb7r8 (DOM7r8)、DAb7r13 (DOM7r13)、DAb7r14 (DOM7r14)、DAb7r15 (DOM7r15)、DAb7r16 (DOM7r16)、DAb7r17 (DOM7r17)、DAb7r18 (DOM7r18)、DAb7r19 (DOM7r19)、DAb7h1 (DOM7h1)、DAb7h2 (DOM7h2)、DAb7h6 (DOM7h6)、DAb7h7 (DOM7h7)、DAb7h8 (DOM7h8)、DAb7h9 (DOM7h9)、DAb7h10 (DOM7h10)、DAb7h11 (DOM7h11)、DAb7h12 (DOM7h12)、DAb7h13 (DOM7h13)、DAb7h14 (DOM7h14)、DAb7p1 (DOM7p1),和dAb7p2 (DOM7p2)（关于这些序列的公开内容参见WO2008096158，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分）。备选名称显示于dAb后的括号中，例如dAb8具有其为dAb10的备选名称，即dAb8（dAb10）。
在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并且包括与选自DOM7h-11、DOM7h-11-3、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18和DOM7m-16的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并且包括与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列MSA-16、MSA-26、DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473)、DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501)、DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (这个段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中出现的那些), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1,和dAb7p2。
例如，结合人血清白蛋白的dAb可以包括与DOM7h-11-3或DOM7h-14-10具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。
例如，结合人血清白蛋白的dAb可以包括与下述具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列相同性的氨基酸序列DOM7h-2 (SEQ ID NO:482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO:483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO:484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO:485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO:486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO:496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO:497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO:498)、DOM7h-22 (SEQ ID NO:489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO:490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO:491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO:492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO:493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO:494)或DOM7h-27 (SEQ ID NO:495) (这个段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中出现的那些),或dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13或dAb7h14。
在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并且包括与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列DOM7h-2 (SEQ ID NO:482)、DOM7h-6 (SEQ ID NO:485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO:486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO:496)、DOM7h-22 (SEQ ID NO:489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO:490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO:491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO:492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO:493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO:494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO:495)(这个段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中出现的那些)，dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13和dAb7h14。
在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白的Vκ dAb并具有选自下述的氨基酸序列DOM7h-2 (SEQ ID NO:482)、DOM7h-6 (SEQ ID NO:485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO:486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO:496) (这个段落中的SEQ ID NO是WO2007080392中出现的那些)，dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13和dAb7h14。在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白的VH dAb并具有选自dAb7h30和dAb7h31的氨基酸序列。
在更特定的实施方案中，dAb是dAb7h11或dAb7h14。在一个实例中，dAb是DOM7h-11-3。在另一个实例中，dAb是DOM7h-14-10。
在其他实施方案中，dAb、配体或拮抗剂结合人血清白蛋白并包含任意前述氨基酸序列的一个、两个或三个CDR，例如DOM7h-11-3, DOM7h-14-10, dAb7h11或dAb7h14的一个、两个或三个CDR。
结合血清白蛋白的合适骆驼科物种VHH包括WO 2004/041862（Ablynx N.V.）和WO2007080392中公开的那些（所述VHH序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分），例如序列A（SEQ ID NO:518）、序列B（SEQ ID NO:519）、序列C（SEQ ID NO:520）、序列D（SEQ ID NO:521）、序列E（SEQ ID NO:522）、序列F（SEQ ID NO:523）、序列G（SEQ ID NO:524）、序列H（SEQ ID NO:525）、序列I（SEQ ID NO:526）、序列J（SEQ ID NO:527）、序列K（SEQ ID NO:528）、序列L（SEQ ID NO:529）、序列M（SEQ ID NO:530）、序列N（SEQ ID NO:531）、序列O（SEQ ID NO:532）、序列P（SEQ ID NO:533）、序列Q（SEQ ID NO:534），这些序列编号与WO2007080392 或WO 2004/041862（Ablynx N.V.）中引用的那些对应。在某些实施方案中，骆驼科物种VHH结合人血清白蛋白，并且包括与WO2007080392中公开的ALB1或SEQ ID NOS:518-534中的任何一个具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列，这些序列编号与WO2007080392 或WO 2004/041862中引用的那些对应。
在一些实施方案中，配体或拮抗剂包括与本文公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争结合血清白蛋白（例如人血清白蛋白）的抗-血清白蛋白dAb。
在可选的实施方案中，拮抗剂或配体包含特异性针对SA（例如人SA）的结合部分，其中所述部分包含如在WO2008096158中描述的非免疫球蛋白序列，这些结合部分、其产生和选择（例如从不同的文库中）方法和其序列的公开内容引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分）。
与半衰期延长部分（例如，白蛋白）缀合
在一个实施方案中，（一个或多个）半衰期延长部分（例如，白蛋白、运铁蛋白及其片段和类似物）与本发明的TNFR1结合多肽、dAb或拮抗剂缀合或结合。用于在TNFR1结合形式中使用的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的例子在WO 2005077042中描述，其公开内容引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分。特别地，下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可以在本发明中使用：
·  SEQ ID NO:1（如WO 2005077042中公开的，这个序列明确引入本公开内容作为参考）；
·  包括WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸1-387或由WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸1-387组成的白蛋白片段或变体；
·  包括选自下述的氨基酸序列的白蛋白、或其片段或变体：（a）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸54 - 61；（b）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸76 - 89；（c）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸92 - 100；（d）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸170 - 176；（e）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸247 - 252；（f）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸266 - 277；（g）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸280 - 288；（h）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸362 - 368；（i）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸439 - 447；（j）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸462 - 475；（k）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸478 - 486；和（l）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸560 - 566。
用于以TNFR1结合形式使用的合适白蛋白、片段和类似物的进一步例子在WO 03076567中描述，其公开内容引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分。特别地，下述白蛋白、片段或变体可以在本发明中使用：
·  如 WO 03076567中例如在图3中描述的人血清白蛋白（这个序列信息明确引入本公开内容作为参考）；
·  由具有式分子量66,500的585个氨基酸的单条非糖基化多肽链组成的人血清白蛋白（HA）（参见，Meloun,等人，FEBS Letters 58:136（1975）；Behrens,等人，Fed. Proc. 34:591（1975）；Lawn,等人，Nucleic Acids Research 9:6102-6114（1981）；Minghetti,等人，J. Biol. Chem. 261:6747（1986））；
·  如Weitkamp,等人，Ann. Hum. Genet. 37:219（1973）中描述的白蛋白的多态变体或类似物或片段；
·  如EP 322094中描述的白蛋白片段或变体，例如HA（1-373.、HA（1-388）、HA（1-389）、HA（1-369）和HA（1-419）和在1-369和1-419之间的片段；
·  如EP 399666中描述的白蛋白片段或变体，例如HA（1-177）和HA（1-200）和在HA（1-X）之间的片段，其中X是从178到199的任何数目。
当（一个或多个）半衰期延长部分（例如，白蛋白、运铁蛋白及其片段和类似物）用于形式化本发明的TNFR1结合多肽、dAbs和拮抗剂时，它可以使用任何合适方法进行缀合，例如通过直接融合至TNFR1结合部分（例如抗-TNFR1 dAb），例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中所述融合蛋白以单条多肽链编码，在TNFR1结合部分的N-或C-端具有半衰期延长部分。可替代地，缀合可以通过使用部分之间的肽接头来达到，例如如WO 03076567或WO 2004003019中描述的肽接头（这些接头公开内容引入本公开内容作为参考，以提供用于在本发明中使用的例子）。一般地，增强体内血清半衰期的多肽是这样的多肽，其在体内天然存在并且抵抗通过内源机制的降解或去除，所述内源机制从生物（例如，人）中去除不希望有的材料。例如，增强体内血清半衰期的多肽可以选自来自细胞外基质的蛋白质，在血液中发现的蛋白质，在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，定位至肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白质，应激蛋白质，疾病特异性蛋白质或与Fc转运有关的蛋白质。
在本公开通篇描述的本发明的实施方案中，作为在本发明的拮抗剂或配体中使用抗-TNFR1单个可变结构域（“dAb”）的替代，考虑有技能的读者（addressee）可使用包含结合TNFR1的本发明的dAb的1个或多个或所有3个CDR（例如，嫁接至合适的蛋白质支架或骨架，例如亲和体，SpA支架，LDL受体A类结构域或EGF结构域上的CDR）的多肽或结构域。因此本公开作为一个整体应当被解释为提供使用这些结构域替代dAb的拮抗剂的公开。在此方面，有关如何产生基于蛋白质支架的文库和从这些文库中选择和表征结构域的细节见WO2008096158，引入其公开内容作为参考。
在一个实施方案中，因此，本发明的拮抗剂包含对TNFR1具有结合特异性的免疫球蛋白单个可变结构域或结构域抗体（dAb）或合适形式的这样的dAb的互补决定区。拮抗剂可为由这样的dAb组成的，或基本上由这样的dAb组成的多肽。拮抗剂可为包含合适形式的dAb（或dAb的CDR），例如抗体形式（例如，IgG样形式，scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2）的多肽，或为包含结合TNFR1的dAb和结合另一种靶蛋白、抗原或表位（例如血清白蛋白）的第二种dAb的双特异性配体。
根据本发明的多肽、dAb和拮抗剂可形式化为多种合适的本领域已知的抗体形式，例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任意抗原结合片段（例如Fv片段（例如，单链Fv（scFv）、二硫键键合的Fv）、Fab片段、Fab’片段、F（ab’）2片段）、单个可变结构域（例如，VH、VL）和任意前述的修饰形式（例如通过聚亚烷基二醇（例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇）或其他合适聚合物的共价连接修饰的）。
在一些实施方案中，本发明提供了IgG样形式的配体（例如抗-TNFR1拮抗剂）。这样的形式具有IgG分子的常规4链结构（2条重链和2条轻链），其中一个或多个可变区（VH和或VL）已被替换为本发明的dAb。在一个实施方案中，每个可变区（2个VH区和2个VL区）被替换为dAb或单个可变结构域，其中至少1个是根据本发明的抗-TNFR1 dAb。在IgG样形式中包含的dAb或单个可变结构域可具有相同的特异性或不同的特异性。在一些实施方案中，IgG样形式是四价的并可具有1（仅抗-TNFR1）、2（例如抗-TNFR1和抗-SA）、3或4种特异性。例如，IgG样形式可为单特异性的并包含4个具有相同特异性的dAb；双特异性的并包含3个具有相同特异性的dAb和另一个具有不同的特异性的dAb；双特异性的并包含2个具有相同特异性的dAb和2个具有共有的但不同特异性的dAb；三特异性的并包含具有相同特异性的第一和第二个dAb，具有不同特异性的第三个dAb和与第一、第二和第三个dAb具有不同特异性的第四个dAb；或四特异性的并包含4个分别具有不同特异性的dAb。可制备IgG样形式的抗原结合片段（例如Fab, F(ab’)2, Fab’, Fv, scFV）。在一个实施方案中，IgG样形式或抗原结合片段对TNFR1可为单价的。如果需要补体激活和/或抗体依赖性细胞毒性（ADCC），配体可为IgG1样形式。如果需要，IgG样形式可包含突变的恒定区（变体IgG重链恒定区）以最小化与Fc受体的结合和/或固定补体的能力。（见例如Winter 等人, GB 2,209,757 B；Morrison 等人, WO 89/07142；Morgan 等人, WO 94/29351, December 22, 1994）。
本发明的配体（例如多肽、dAb和拮抗剂）可形式化为包含与第二个免疫球蛋白单个可变结构域直接融合的第一个免疫球蛋白单个可变结构域的融合蛋白。如果需要，这样的形式可进一步包含半衰期延长部分。例如，配体可包含与第二个免疫球蛋白单个可变结构域直接融合的第一个免疫球蛋白单个可变结构域，第二个免疫球蛋白单个可变结构域与结合血清白蛋白的免疫球蛋白单个可变结构域直接融合。
一般地，具有对于靶具有结合特异性的结合位点的多肽结构域的定向，和配体是否包括接头，是设计选择的问题。然而，一些定向连同或不连同接头，可以提供比其他定向更好的结合特征。由本发明包含的所有定向（例如，dAb1-接头- dAb2；dAb2-接头- dAb1）是包含提供所需结合特征的定向的配体，可以通过筛选容易地鉴定。
根据本发明的多肽和dAb包括dAb单体、二聚体和三聚体，可以与抗体Fc区连接，包括CH2和CH3结构域中的一个或两个，和任选地铰链区。例如，编码作为单个核苷酸序列与Fc区连接的配体的载体可以用于制备此种多肽。
此外本发明提供上述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。
实施例
抗-TNFR1 dAb的初次选择
抑制TNF 1型受体（p55）信号转导的2种不同机制已有描述(WO2006038027)。第一种包括通过用结构域抗体在一个表位结合TNFR1抑制信号转导，在所述表位上结构域抗体直接竞争TNFα与其受体的结合。此竞争可在例如体外受体结合测定中测定，其中将受体包被在固体支持物上，结构域抗体和生物素化TNFα结合受体的竞争通过使用例如链霉抗生物素-HRP测量剩余的生物素化TNFα结合来测定。竞争性TNFR1抑制剂将阻止TNFα与其受体结合，造成无TNFα信号。相反地，非竞争性TNFR1抑制剂将对TNFα与受体的结合具有很小的影响，导致持续的生物素化TNFα的读出，甚至在μM级浓度的抑制性dAb的存在下。在功能性细胞测定中，例如人MRC5成纤维细胞细胞系在低水平的TNFα (10-200 pg/ml, 持续18h)刺激下释放IL-8，然而，竞争性和非竞争性抑制剂都以剂量依赖的方式减少IL-8分泌。后一结果证明2种类型的抑制剂在基于细胞的系统中的功能活性。因此具体的目的是分离在细胞测定中结合TNFR1并抑制其功能活性的结构域抗体，然而这些结构域抗体应当（基本上）不与TNFα竞争结合TNFR1。
为了分离非竞争性TNFR1结合dAb，设计了选择策略以富集此亚类的dAb。所述方法包括使用Domantis’4G和6G 天然（na?ve）噬菌体文库，噬菌体文库展示从GAS1前导序列（见WO2005093074）表达的抗体单个可变结构域用于4G和另外地具有加热/冷却预先则用于6G（见WO04101790）。这些噬菌体文库在第一轮中与200 nM生物素化的人TNFR1（R&D systems, 货号636-R1/CF, 使用EZ-Link NHS-LC-LC-生物素(Pierce 货号21343)生物素化，根据制造商的说明书）孵育，接着用链霉抗生物素包被的磁珠下拉（pull-down）。在第2和3轮中，噬菌体和TNFR1(200 nM – 第2轮, 75 nM – 第3轮)预孵育，并且然后和生物素化的TNFα (Peprotech 货号300-01A) (200 nM – 第2轮, 75 nM – 第3轮 )，接着用链霉抗生物素包被的磁珠下拉。在所有轮中，洗涤磁珠以去除弱结合的噬菌体并在扩增前通过胰蛋白酶消化洗脱结合的噬菌体。基本原理是能够在TNFα存在下结合TNFR1的那些dAb将被特别富集而与TNFα竞争的那些将不被下拉，因为此表位是TNFα结合磁珠所需要的。使用此实验设计，进行了3轮噬菌体选择并且将第2轮和第3轮都克隆至pDOM5大肠杆菌表达载体（见PCT/EP2008/067789；WO2009/002882）中，接着表达dAb和在BIAcore?上筛选TNFR1结合。pDOM5载体是基于pUC119的载体。蛋白质的表达通过LacZ启动子驱动。GAS1前导序列（见WO 2005/093074）确保分离的可溶性dAb分泌至大肠杆菌的周质和培养上清。通过SalI/NotI将dAb克隆进此载体，所述载体在dAb的C-端添加myc标签。结合的dAb以50 ml规模表达并亲和纯化以用于功能表征。这包括测定在MRC5细胞测定中TNFα介导的信号转导的抑制（如上所述）以及在受体结合测定中TNFα与TNFR1结合的抑制（如下所述）。对6000个上清的筛选得到许多TNFR1结合物。然而，绝大多数或者结合无关表位，因此在细胞测定或受体结合测定中不具有活性，或者是竞争性的，如在受体结合测定中证明的。尽管大多数如此，对1）在BIAcore上结合TNFR1（图1），2）在MRC5细胞测定中抑制TNFα（图2）同时3）在受体结合测定中证明无TNFα竞争（图3）的那些dAb的序列分析鉴定出5个独特的dAb（DOM1h-543的数据在图中未显示）。这5个dAb是：DOM1h-509、DOM1h-510、DOM1h-543、DOM1h-549和DOM1h-574。
通过易错突变的选定dAb的试验成熟
为了测定DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-543, DOM1h-549和DOM1h-574的成熟性，使用Genemorph II试剂盒(Stratagene (San Diego, USA) 货号200550)根据制造商的说明书制备了dAb突变体的易错PCR文库。序列分析显示这些文库具有约2%的在氨基酸水平上的平均突变率。将这些文库克隆进噬菌体载体pDOM4并在噬菌体上表达。pDOM4是丝状噬菌体（fd）展示载体，其基于具有myc标签的fd载体并且其中可在限制性位点之间克隆蛋白质序列以提供蛋白质-基因III融合物。以SalI/NotI 片段克隆编码dAb的基因。
进行了连续3轮与递减量的生物素化人TNFR1(R&D Systems) (50 nM (第1轮)、5 nM (第2轮)和0.5 nM (第3轮))孵育的改进的结合物的选择。在3轮选择后，将dAb基因克隆进大肠杆菌表达载体pDOM5，表达并通过BIAcore筛选上清在结合动力学中的改进。选择了来源于所有5个亲本系的变体；当在BIAcore上筛选时来自DOM1h-574系的dAb显示了在解离速率中的显著改进。纯化了在解离速率中改进最显著的那些dAb并在MRC5细胞测定中表征（表1和图4），最佳的dAb是：DOM1h-574-7、DOM1h-574-8、DOM1h-574-10、DOM1h-574-11、DOM1h-574-12和DOM1h-574-13。在检查了这些dAb之后，我们进行了我们的判断并鉴定出可能导致亲和力改进的位置和突变，具体是：V30G、G44D、L45P、G55D、H56R和K94I（Kabat编号）。为了寻求累加效应，我们生成了在单个dAb中组合这些特定突变的新dAb变体。使用DOM1h-574模板改造的新变体为：DOM1h-574-14 (G55D、H56R和K94I)、DOM1h-574-15 (G55D和K94I)、DOM1h-574-16 (L45P、G55D、H56R和K94I)、DOM1h-574-17 (L45P、G55D和K94I)、DOM1h-574-18 (V30G、G44D、G55D、H56R和K94I)和DOM1h-574-19 (V30G、G44D、G55D和K94I) (图5)。这些变体在MRC5细胞测定中的效价和在BIAcore上对TNFR1的亲和力的表征鉴定了进一步的改进（表1）。最有效的dAb是DOM1h-574-16。
表1：对DOM1h-574亲本和在试验成熟中鉴定的并通过有利突变的重组构建的dAb的BIAcore亲和力和在MRC细胞测定中的效价的总结。DOM1h-574-16组合了在BIAcore上的最高亲和力和在MRC5细胞测定中的最高效价。当未测定数值时指示（ND）
Figure 488796DEST_PATH_IMAGE001
EC50测量通过Graphpad Prism测定。估计对DOM1h-574的EC50测量是DOM1h-574-16的EC50测量的约200倍。
DOM1h-574-16的物种交叉反应性
抗-TNFR1 dAb的显著优势可为不同物种间的交叉反应性。考虑到小鼠、狗、食蟹猴和人之间的TNFR1胞外结构域的有限序列保守性（图6），对任意抗体或单个可变结构域，以类似的亲和力识别这些不同物种的TNFR1将是优越的（exceptional）。因此，我们在BIAcore上检测了DOM1h-574-16结合小鼠TNFR1 (R&D systems 货号425-R1-050/CF), 狗TNFR1 (R&D Systems 货号4017-TR-025/CF)和人TNFR1 (R&D Systems)的能力。用于小鼠实验，使用EZ-Link NHS-LC-LC-生物素 (Pierce 货号21343)根据制造商的说明书生物素化TNFR1，接着使生物素化的TNFR1结合链霉抗生物素包被的BIAcore芯片（小鼠实验）。用于人和狗TNFR1，使用胺连接的TNFR1。然后，将DOM1h-574-16注入人、小鼠和狗TNFR1并在BIAcore上监控结合。图7和8中显示了结合不同物种的实例，且结果总结在表2中。很明显，DOM1h-574-16证明了与不同TNFR1的高亲和力结合，与我们以前描述的（WO2008149148）竞争性抗-TNFR1 dAb DOM1h-131-206形成对比，DOM1h-131-206基本未显示与小鼠TNFR1的结合并且仅与狗TNFR1非常微弱地结合。
表2：通过BIAcore测定的DOM1h-131-206和DOM1h-574-16与小鼠、狗和人TNFR1的结合亲和力。 *=亲和力过低无法通过BIAcore测定（> μM）
Figure 281303DEST_PATH_IMAGE002
使用Bioevaluation 3.1软件包估计数据。
下一步评估了DOM1h-574-16抑制小鼠细胞（L929）的TNFα介导的细胞毒性和抑制食蟹猴细胞（CYNOM-K1）的TNFα介导的IL-8释放的效价。标准小鼠L929和CYNOM-K1细胞测定都依照前面(WO2006038027)和下面描述的进行。简单来说，小鼠L929细胞和100 pg/ml小鼠TNFα在放线菌素D和一定剂量范围的DOM1h-574-16的存在下孵育过夜。18小时后，检测细胞活力并对DOM1h-574-16浓度作图。在食蟹猴CYNOM-K1细胞测定中，在剂量范围的DOM1h-574-16的存在下用(200 pg/ml)刺激细胞18小时。孵育后，移取培养基并测定IL-8水平。将中和百分比对DOM1h-574-16浓度作图。在2种细胞类型中，DOM1h-574-16都能够有效抑制TNFα介导的效应。其效价在小鼠标准基于L929细胞的测定中为~250 nM和在食蟹猴CYNOM-K1测定中为~10 nM（图9和10）。这些结果证明DOM1h-574-16在基于细胞的测定中的功能性物种交叉反应性。
DOM1h-574的亲和成熟
基于此试验成熟和组合突变体的结果，决定使用DOM1h-574-14作为模板用于进一步的亲和成熟。尽管此特定dAb不是最有效的，其相比种系DP47框架不具有任何框架突变，因此被选中。用于亲和成熟，通过使用以下寡核苷酸扩增CDR随机化DOM1h-574-14的CDR：AS1029和AS339 (CDR1), AS1030和AS339 (CDR2)和AS1031和AS339 (CDR3)。使用以下寡核苷酸组合产生用于每个文库的第二个PCR片段：AS1031’和AS9 (CDR1), AS1032和AS9 (CDR2), AS1033和AS9 (CDR3)。使用SOE PCR (Horton 等人 Gene, 77, p61 (1989))组合2个CDR1 PCR产物以产生CDR1文库，组合CDR2产物用于CDR2文库和组合CDR3产物用于CDR3文库。用于所有反应，然后使用巢式引物AS639和AS65扩增SOE产物并通过SalI/NotI连接进WO2006018650中描述的pIE2aA2载体。随机化寡核苷酸(AS1029, AS1030和AS1031)由固定位置（由大写字母指示和在此情况下100%的寡核苷酸具有在该位置指示的核苷酸）和混合核苷酸组合（由小写字母指示，在此情况下85%的寡核苷酸将具有在该位置的优势核苷酸和15%将在其余3个核苷酸之间具有平等的分割）构成。使用DNA展示构建体pIE2aA2制备了3个不同的文库。使用等分试样的文库转化大肠杆菌并测序。相比亲本克隆，亲和成熟文库包含遍布CDR的许多突变。使用在乳剂中的体外分割和通过scArc DNA结合蛋白的DNA展示进行选择（见WO2006018650）。总共进行了13轮选择，同时保持文库分开。4轮平衡选择使用20、20、10和10 nM的生物素化人TNFR1 (R&D Systems)，接着是7轮在130 nM 非生物素化hTNFR1和5nM生物素化hTNFR1存在下长达150分钟的解离速率选择。未标记的hTNFR1是竞争物。也使用合并的文库进行选择（共14轮选择用于合并的文库）。通过实时PCR测定了在选择过程中的文库适度。使用的方法的原理如下：通过qPCR的多克隆群体适度的体外滴定提供了多克隆dAb群体平均亲和力的半定量测量，通过在溶液条件中（无基因型-表型连接）的体外表达反应后测量通过表面结合的抗原捕获的具有dAb-scArc蛋白的复合物中编码DNA的量。回收的输入DNA的部分越高，多克隆dAb群体越有效。合适的参考点是亲本克隆与用无关抗原包被的非特异性表面的结合水平和与用靶抗原包被的表面的特异性结合。在不同选择阶段回收的DNA模板在0.1 mg/ml RNA溶液中稀释至1.7 nM浓度。在10 μl体积的补充0.3 μl 100 mM氧化型谷胱甘肽, 0.05 μl 340 nM抗-HA mAb 3F10 （来自Roche）和0.5 μl 1.7 nM DNA模板的EcoPro T7大肠杆菌提取物中进行体外表达反应。用生物素化的hTNFR1靶抗原（0.1 μl 30 μM 储液/孔）或BSA阴性对照(0.1 μl 2 mg/ml储液/孔)包被Strep ThermoFast板的孔，室温进行1小时，接着用缓冲液C(10 mM Tris, 100 mM KCl, 0.05% Tween 20, 5 mM MgCl2和0.1 mM EDTA)洗3次。体外表达反应在25℃孵育3小时，然后使用缓冲液C稀释至100 μl，以2个50 μl的等分试样应用于之前用生物素化hTNFR1或BSA包被的Strep ThermoFast板(ABgene, UK)的孔，在室温再孵育1小时并用缓冲液C洗3次以去除任意未结合的DNA。使用寡核苷酸AS79和AS80和 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, 货号170-8880)（其根据制造商的说明书使用）扩增结合的DNA分子，并且扩增循环是：2分钟94℃, 接着是40个循环的15秒94℃, 30秒60℃和30秒72℃。在BioRad MiniOpticon Real-Time PCR Machine (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)上定量并使用Bio-Rad Laboratories提供的Opticon Monitor version 3.1.32 (2005)软件分析DNA的量。从已知DNA浓度的样品得到的标准曲线覆盖从500至5x108分子/反应的范围。直到第10轮选择时，文库的适度增加，因为每轮比上一轮回收更多的DNA，指示结合的dAb的平均数在增加。从此点往后，通过实时PCR测定的回收的DNA水平未见增加，提示更多轮的选择在dAb亲和力中未得到显著的进一步改进。第9和14轮的选定群体被克隆进pDOM13载体(见WO2008/149148)，测序，表达并用BIAcore测定在未纯化形式中的解离速率常数。
发现文库多样性大大降低了，并具有若干克隆展示改进的（2-3倍）解离速率常数，其通过BIAcore dAb上清筛选测定。这些改进的dAb的DNA测序鉴定出DOM1h-574-25至DOM1h-574-40。
下面对每个CDR单独列出了基于这些dAb鉴定的有利突变（编号根据Kabat）：
CDR1: V30被有利地突变为I、L或F，
CDR2: S52被有利地突变为A或T，
           N52a被有利地突变为D或E，
           G54被有利地突变为A或R，
           T57被有利地突变为R、K或A，
           A60被有利地突变为D、S、T或K，
           D61被有利地突变为E、H或G，
           S62被有利地突变为A或T，
CDR3: E100被有利地突变为Q、V、A、D或S，
         D101被有利地突变为E、V、H或K。
最初，克隆DOM1h-574-30、-31、-38和-39的CDR1+2在小型文库中与克隆DOM1h-574-25、-27、-28、-29和-32的CDR3重组。选择这些dAb是因为它们代表了在BIAcore亲和力中具有最大改进的dAb和因此组合这些dAb最有可能鉴定出具有提高的亲和力的新序列。得到的重组dAb是DOM1h-574-65至DOM1h-574-79，和DOM1h-574-84至DOM1h-574-88，其中DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)是最有效的。之后使用此dAb评估单个氨基酸突变的有效性，通过使用-72作为模板和引入氨基酸改变以产生克隆DOM1h-574-89至DOM1h-574-93，DOM1h-574-109至DOM1h-574-149，和DOM1h-574-151至DOM1h-574-180。大多数这些克隆被表达、纯化和测定在BIAcore上的结合，在MRC5细胞测定中的效价和通过对胰蛋白酶消化的抗性测定蛋白酶稳定性。蛋白酶稳定性通过孵育在PBS中的1 mg/ml dAb和递减量的胰蛋白酶(Promega, V511A 胰蛋白酶)测定。在5个不同浓度的胰蛋白酶(34、17、8.5、4.25和2.13 μg/ml)以及缺乏胰蛋白酶的对照下进行孵育。在37 ℃孵育3小时后，通过加入上样染料终止蛋白水解反应并在LabChip 90 system (Caliper Life Sciences)上测定残余的未被切割的dAb的量。改进最大的克隆比用于亲和成熟的起始dAb，DOM1h-574-16具有约30倍的效价改进。在MRC5细胞测定中最有效的是：DOM1h-574-109、DOM1h-574-132、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180 (图11)。
令人惊讶地，发现一方面有关亲和力/效价和另一方面有关蛋白酶稳定性的结构决定因素是不同的。尽管大多数列举的突变将亲和力改进至低于nM范围（通过BIAcore测定），它们也导致降低的胰蛋白酶抗性（有关测定dAb的蛋白酶稳定性的合适测定的更多细节见WO2008149143和WO2008149148）。另一方面，突变D101V（Kabat编号）非常频繁地与最佳蛋白酶稳定性相联系，虽然和任意其他检测的序列相比以约2倍的dAb亲和力的降低作为代价。蛋白酶稳定性最高的dAb是：DOM1h-574-93、DOM1h-574-123、DOM1h-574-125、DOM1h-574-126、DOM1h-574-129、DOM1h-574-133、DOM1h-574-137和DOM1h-574-160 (图12)。
最有希望的DOM0100 dAb的表征
基于BIAcore结合和MRC5细胞测定效价的数据，选择了12个DOM0100 dAb的子集以进一步表征与TNFR1的结合动力学，在细胞测定中的效价和生物物理性能。用于所有这些实验，在大肠杆菌中表达dAb并使用蛋白质A流线型（streamline）纯化，接着在PBS中透析。用于此表征的12个dAb是：DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-126、DOM1h-574-133、DOM1h-574-135、DOM1h-574-138、DOM1h-574-139、DOM1h-574-155、DOM1h-574-156、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180。在某些实验中包括DOM1h-574-16作为参考（图13）。
DOM0100 dAb(抗-TNFR1 dAb)的结合性能
进行了BIAcore以测定不同dAb的结合和解离速率并以该方法确定其与人和小鼠TNFR1的结合亲和力。使用各个物种的生物素化TNFR1(R&D Systems)联接链霉抗生物素包被的BIAcore芯片，接着注入浓度范围的dAb进行实验。结果总结在表3中。所有dAb显示以高亲和力结合人TNFR1(KD <350 pM)以及对小鼠TNFR1(KD <7 nM)的良好亲和力。考虑到小鼠和人TNFR1之间的有限序列同源性，在人和小鼠TNFR1之间约20倍的dAb亲和力中的此差异非常惊人并可能指示靶向受体中的高度保守基序。
表3：DOM0100 dAb与人和小鼠TNFR1的结合和解离的BIAcore分析。最有效的抗-人TNFR1 dAb也倾向于是最有效的抗-小鼠TNFR1 dAb，例如DOM1h-574-138和DOM1h-574-156。
Figure 61040DEST_PATH_IMAGE003
DOM0100 dAb的生物物理性能
对DOM0100 dAb进一步表征了其生物物理性能，这包括其蛋白酶稳定性、热稳定性和溶液内状态。蛋白酶稳定性通过孵育在PBS中的1 mg/ml dAb和递减量的胰蛋白酶(Promega, V511A trypsin)测定。在5个不同浓度的胰蛋白酶(34, 17, 8.5, 4.25和2.13 μg/ml)以及缺乏胰蛋白酶的对照下进行孵育。在37℃孵育3小时后，通过加入上样染料终止蛋白水解反应并在LabChip 90 system (Caliper Life Sciences)上测定残余的未被切割的dAb的量。将dAb量定量为相对对照反应中存在的量的百分比并总结在表4中。DOM0100 dAb的稳定性使用差示扫描量热法（DSC）仪器(MicroCal, MA)测定。在仪器中孵育在PBS中的1 mg/ml dAb并测定熔解温度。结果总结在表4中。最后，dAb的溶液内状态使用大小排阻层析和多角度激光光散射(SEC-MALLS)测定。将在PBS中的1 mg/ml dAb注入SEC-MALLS并测定主峰的质量。基于其的溶液内状态，DOM0100 dAb可分为2组，单体或二聚体。总结见表4。
表4：DOM0100 dAb的生物物理性能总结。在dAb中组合性能的目的是为了其高胰蛋白酶稳定性、高热稳定性和单体的溶液内状态以避免受体交联和之后的活性激动（agonism）或缺乏。下表列出了在37℃与34 μg/ml胰蛋白酶孵育3小时后的残余活性，以相对t0时的活性的百分比表示。通过DSC测定熔解温度（Tm）并通过SEC-MALLS测定溶液内状态。下表指示胰蛋白酶稳定性最高的dAb(DOM1h-574-133)是二聚体并因此不适合。具有最佳性能组合的dAb是：DOM1h-574-109、DOM1h-574-156和DOM1h-574-162。其中指示的值是未测定的（ND）。
Figure 708447DEST_PATH_IMAGE004
DOM0100 dAb的功能表征
表征了DOM0100 dAb的功能活性和物种交叉反应性，使用人MRC-5细胞测定，小鼠L929细胞测定和如下所述的食蟹猴CYNOM-K1细胞系。用于人TNFR1信号转导的功能抑制，将人成纤维细胞系MRC-5与剂量范围的dAb孵育并然后用200 pg/ml TNFα (Peprotech)（除了在L929测定中使用20pg/ml小鼠TNFα (R&D Systems)以外）刺激18小时。此刺激后，移去培养基并使用ABI8200 (Applied Biosystems)测定培养基中细胞应答TNFα产生的IL-8水平。dAb阻止IL-8分泌的能力是其在多大程度上抑制TNFR1介导的信号转导的功能性读出。在MRC5细胞测定中检测12个DOM0100 dAb的结果在表5种显示。功能性小鼠交叉反应性使用小鼠L929细胞系测定，其中评估了通过12个DOM0100 dAb对抗TNFα诱导的细胞毒性提供的保护水平。在此测定中，细胞再一次与剂量范围的dAb孵育，接着用TNFα在放线菌素的存在下刺激。过夜孵育后，测量细胞活力并对dAb浓度作图。DOM0100 dAb对抗TNFα细胞毒性并导致在20-40 nM范围中的ND40值。在人MRC5细胞和小鼠L929细胞之间观察到的DOM0100 dAb的效价差异和通过BIAcore测定的亲和力的差异具有相似的数量级。最后，dAb的食蟹猴交叉反应性使用CYNOM-K1细胞系检测。简单地说，dAb和CYNOM-K1细胞(ECACC 90071809) (5x103细胞/孔)在平底细胞培养板上在37℃孵育1小时。加入重组人TNFα(Peprotech)（终浓度200pg/ml） 并将板孵育18-20小时。然后在培养上清中使用DuoSet ELISA显色系统(R&D Systems, catTNFR1 DY208)根据制造商的说明书（文档号750364.16版本11/08）测量分泌的IL-8水平。通过dAb浓度对IL-8分泌抑制的百分比作图测定ND50。DOM0100 dAb的结果显示在表5中。
表5：DOM0100 dAb在不同物种的基于细胞的测定中的功能活性总结。所有数值以在各个细胞测定中测定的ND50值（单位nM）表示，同时ND代表未测定。尽管在MRC5测定中DOM0100 dAb之间的差异有限，其与在小鼠和食蟹猴细胞测定中观察到的具有相同的趋势。在物种间，DOM1h-574-156、DOM1h-574-109和DOM1h-574-138是最有效的dAb。对MRC5测定，我们采用被判断为S形的曲线。在表中显示了来自这些曲线的平均值。
Figure 522819DEST_PATH_IMAGE005
DOM0100 dAb的表位作图
由于DOM0100 dAb在TNFR1上的结合表位可与作用机制相关，进行了多种努力以确定TNFR1中的哪些残基被DOM0100 dAb识别。选择了2种实验方法确定表位：1）BIAcore表位竞争和2）使用部分重叠的肽进行肽扫描。
1）BIAcore表位竞争：
测定2个不同抗体或抗体片段之间是否存在对TNFR1上的单个表位的竞争的一种定量方法可通过BIAcore进行(Malmborg, J. Immunol. Methods 183, p7 (1995))。为此，在BIAcore SA-芯片上包被生物素化TNFR1，接着连续注入不同dAb或抗体以确定每种抗体在缺乏任意竞争抗体（片段）时的结合水平。之后，使用相同浓度的抗体（片段）重复注入，但现在在抗体注入后立刻注入待测定的竞争抗体。结合抗体（片段）被定量为共振单位（RU）并比较存在或缺乏第二种抗体时的结合抗体。如果在2种抗体（片段）之间不存在竞争，在存在或缺乏另一种抗体时结合的RU数将是相同的。相反地，如果存在竞争，在注入第二种抗体（片段）期间将有很少或没有结合的RU。对DOM1h-574-16，结果显示在存在或缺乏TNFα竞争性dAb (DOM1h-131-511 (见WO2008149144))和mAb (mAb225 (R&D systems；货号MAB225)时结合的共振单位数没有变化。指示相对提及的dAb和mAb的新表位（图14和15）。TNFR1是多结构域受体，由4个富含半胱氨酸的结构域组成。结构域2和3负责TNFα结合(Banner 等人, Cell, 73, p431 (1993))，而第一个结构域，又称配体组装前结构域促进受体与TNFα结合前的预组装(Chan 等人 Science, vol 288, p2351 (2000))。在BIAcore上与已知PLAD结合mAb克隆4.12, (Supplied by Invitrogen, 货号Zymed 33-0100)的竞争很有限，结合的克隆4.12的RU数在存在DOM0100 dAb (DOM1h-574-16)时相比其缺乏时显示了最高20%的降低（图16）。这指示DOM1h-574-16识别的表位的绝大部分不被克隆4.12识别。显示与DOM1h-574-16完全竞争的唯一dAb是在选择期间分离的另一个DOM0100 dAb：DOM1h-510 (图17)。由于DOM0100 dAb显示了与小鼠TNFR1的交叉反应性，相同的实验可在小鼠TNFR1包被的BIAcore芯片上进行以确定是否存在与抗-鼠类TNFR1、非竞争性dAb DOM1m-21-23 (见WO2006038027)的竞争。惊人地，没有观察到DOM1m-21-23和DOM0100 dAb DOM1h-574-16之间的竞争（图18）。DOM1h-574 dAb与小鼠交叉反应的独特性能也强调了其肯定是识别了新的表位，因为上述dAb或抗体(DOM1h-131-511, mAB225, 克隆4.12和DOM1m-21-23)无一显示了任何显著的小鼠/人交叉反应性。
2）TNFR1的肽扫描
为了确定是否TNFR1上的任意线性表位被我们的DOM1h-574 dAb系识别，合成了用于扫描的15肽，每种肽位移3个残基以覆盖TNFR1的完整胞外结构域。这些肽各自含有用于联接至ForteBio Octet仪器(Menlo Park, CA, USA)的不同传感器末端的生物素基团。ForteBio Octet仪器使用Bio-Layer Interferometry (BLI)，一种能够实时测量分子相互作用的无标记的生物传感器技术。Octet仪器照射白光至生物传感器并收集反射回来的光。与生物传感器末端结合的分子数的任意变化导致此反射光的干涉图形的偏移并被实时测定。在我们的实验中，每个末端用不同的肽包被并与DOM1h-574-16 dAb孵育并监控dAb与每个末端的结合。绝大部分末端显示了不可信的结合。将3种肽和在BioForte Octet上未显示任何结合的阴性对照肽一起联接至链霉抗生物素包被的BIAcore芯片并测定DOM1h-574-16, DOM1h-131-511和DOM1m-21-23与这些肽的结合（图19、20和21）。只有DOM0100 dAb (DOM1h-574-16)显示了与这些特定肽的轻微结合，而其他dAb无一显示任何结合。在阴性肽对照上未观察到与任意dAb的结合。3种TNFR1肽可分为2组：1）位于结构域1的肽1(NSICCTKCHKGTYLY)和2）肽2(CRKNQYRHYWSENLF) 和3(NQYRHYWSENLFQCF)，其有重叠且位于TNFR1的结构域3。特别地，肽1值得注意，因为除了最后1个残基以外，此序列对应在小鼠和人TNFR1之间完全保守的TNFR1中唯一的15个连续的氨基酸残基段（此保守段具有序列：NSICCTKCHKGTYL）。与此表位的结合可解释在DOM1h-574系中观察到的小鼠交叉反应性。
形式化DOM0100 dAb以延长体内半衰期
为了将DOM0100 dAb用于治疗慢性炎症性疾病，例如RA和银屑病，可能希望全身递送dAb并使其在延长的时间段中有活性。为了实现此目的可使用许多不同的方法，其中包括例如添加PEG部分至dAb，作为与血清白蛋白结合dAb(AlbudAb?)基因融合或与IgG的Fc部分的基因融合表达dAb。对DOM0100 (抗-TNFR1) dAb DOM1h-574-16检测了PEG和AlbudAb融合二者。
1）通过缀合40K(40 KDa)线性PEG延长半衰期
为此创造了DOM1h-574-16变体，其在dAb的C-端具有游离半胱氨酸（C-端丝氨酸被取代为半胱氨酸）。在大肠杆菌中表达变体并使用蛋白质A流线型纯化。使用马来酰亚胺化学过程（见WO04081026）将40K线性PEG DOWpharma)缀合至此DOM1h-574-16变体的C端并通过流经FPLC柱净化。将所述分子命名为DMS0162。在大鼠PK研究中评估了PEG缀合延长DMS0162的半衰期的作用。以2.5 mg/kg的靶剂量对3只雌性Sprague-Dawley大鼠静脉内施用蛋白质。在施用后0.17、1、4、8、24、48、72、96、120和168小时从大鼠中采集血样并测定以确定DMS0162在血液中的量。在用TNFR1-捕获和山羊抗-hfAb检测的ELISA中检测DMS0162样品。将测定中的原始数据转化为在每个血清样品中的药物浓度。然后在WinNonLin分析软件, 例如版本5.1 (可从Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA获得)中使用无隔分析（NCA）分析了在各个时间点的平均μg/mL值。从这些数据得到DMS0162在大鼠中的平均终末半衰期为20.4h。
2）通过与AlbudAb?的基因融合延长半衰期
a）具有AlbudAb的抗-TNFR1 dAb融合物的功能表征
前面我们描述了使用具有白蛋白结合dAb（AlbudAb）的基因融合物延长dAb的体内PK半衰期（见例如WO04003019、WO2006038027、WO2008149148）。这些融合物的理想方面是：
1）AlbudAb的融合应当不基本影响TNFR1结合dAb的结合亲和力，
2）AlbudAb对来自不同物种的白蛋白的亲和力应当为这样，即可预期PK半衰期的增加。
为了评估DOM1h-574-16和不同AlbudAb对，构建了表6中所列的配对（构建体从N-至C-端为，抗-TNFR1 dAb（即DOM0100 dAb）-接头-AlbudAb-myc)。除了DMS0184以外都在C-端包含myc标签，其可能用于检测目的。
表6：抗-TNFR1 dAb/AlbudAb融合物的BIAcore解离速率参数和抗-TNFR1 dAb在MRC5细胞测定中的效价。除了DMS0184以外，列出的所有dAb/AlbudAb融合物都在AlbudAb的C-端包含myc标签。在一些情况下通过BIAcore观察到与血清白蛋白无结合（NB），而在其他情况下未测定结合（ND）。在MRC5测定中，一些数据常常未能充分地测定以证明引用的值正确（ND*）。
Figure 719183DEST_PATH_IMAGE006
下文提供所有AlbudAb的序列。本文公开了DOM7h-11和DOM7m-16的核苷酸和氨基酸序列。
在表达和纯化后，在BIAcore上检测所有构建体与小鼠和人血清白蛋白二者的结合。测定了解离速率并用于区分AlbudAb延长融合分子的半衰期的其适合性。鉴于接头对AlbudAb与白蛋白的亲和力具有很小的影响，显著差异存在于dAb和其白蛋白亲和力之间。在小鼠结合中最佳的AlbudAb是DOM7h-11-15，然后是DOM7m-16和DOM7h-11-12 (图22)。然而，DOM7m-16显示对人白蛋白无结合，而DOM7h-11-15和DOM7h-11-3是人白蛋白结合中的最佳配对（图23）。尽管观察到测定变化，大体上在人MRC-5细胞中亲和力（单体DOM1h-574-16和当与DOM7h-11系的任意AlbudAb融合时的相同dAb得到的ND50）仅有有限的减少。然而当与DOM1h-574-72配对和当与DOM7h-11-12比较时观察到AlbudAb DOM7m-16的影响。DOM7m-16配对导致融合物的抗-TNFR1部分在MRC-5细胞测定中的效价的显著降低，而当相同的抗-TNFR1 dAb与DOM7h-11-12配对时未观察到此现象。这些结果强调了与来自DOM7h-11系的AlbudAb配对的优势（例如，抗-血清白蛋白dAb具有与DOM7h-11的氨基酸序列至少80、90或95%相同的氨基酸序列）。
b）不同DOM0100-AlbudAb融合物的小鼠和大鼠PK
PEG的一个替代方案可为以具有识别血清白蛋白的结构域抗体(AlbudAb)的基因融合物表达DOM0100 dAb。为评估此方法，构建了由DOM1h-574-16, 丙氨酸丝氨酸苏氨酸(AST)接头和DOM7h-11接着是myc标签(DMS0182)组成的基因构建体(DMS0182)。将此构建体连接进大肠杆菌表达载体pDOM5，转化大肠杆菌菌株HB2151并表达。从上清中纯化DMS0182，使用联接至固相支持物的ProteinL，接着用蛋白质A-流线型去除任意游离的单体。以5 mg/kg的剂量对3只雌性Sprague-Dawley大鼠静脉内施用DMS0182。施用后0.17, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120和168小时采集血样。制备血清样品并且然后在3个单独的ELISA中检测它们：1）用山羊抗-myc捕获和兔抗-人κ链检测，2）用山羊抗-myc捕获和TNFR1-Fc检测和通过抗-人-Fc/HRP读出和3）用TNFR1捕获和山羊抗-fAb检测和通过抗-山羊HRP读出。将测定中的原始数据转化为在每个血清样品中的药物浓度。然后在WinNonLin中使用无隔分析（NCA）分析了在各个时间点的平均μg/mL值。在3个提及的测定中检测DMS0182，其具有5.2 – 6.4小时的终末半衰期。
使用相同DMS0182进行了另外的PK研究，这次在小鼠中以10 mg/kg腹膜内给药。在每一个以下时间点：0.17, 1, 4, 12, 24, 48和96小时对3只小鼠取血。使用上面提及的测定方案2的血清分析鉴定出DMS0182在小鼠中的血清半衰期为约5.9小时（图24）。很明显AlbudAb DOM7h-11的加入与之前在小鼠和大鼠中注射游离dAb时观察到的（约20分钟的T1/2，见例如WO04003019 WO04003019）相比延长了dAb的半衰期。然而，在半衰期中的进一步改进将是有利的。当与DOM1h-574-16融合时DOM7h-11对大鼠和小鼠白蛋白的亲和力的检查鉴定出超过1 μM的亲和力，通过BIAcore测定。因此，对用于这些串联融合物的AlbudAb以及接头都进行了改变。构建了由不同的DOM0100 dAb (DOM1h-574-72)、不同的接头(ASTSGPS)、2个不同的AlbudAbs (DOM7m-16和DOM7h-11-12)且后面都接着myc标签组成的2个新基因构建体，分别得到DMS0168和DMS0169（构建体从N-至C-端为，抗-TNFR1 dAb（即DOM0100 dAb）-接头-AlbudAb-myc）。将这些构建体克隆进pDOM5，在大肠杆菌中表达并使用蛋白质L和蛋白质A纯化。在BIAcore上分析了二者与MSA的结合并观察到导致2个构建体在小鼠白蛋白结合亲和力为约200 nM的显著改进。为了测定改进的白蛋白结合对半衰期延长的效果，以2.5 mg/kg在小鼠中静脉内给药DMS0168和DMS0169，接着在每个以下时间点：0.17、1、4、8、24、48、96和168小时对3只小鼠取血。通过用基于ELISA的方法定量血清中的融合蛋白测定这2个分子的血清半衰期；对DMS0168使用山羊抗-myc用于捕获接着用TNFR1-Fc检测和通过抗-人-Fc/HRP读出。对DMS0169使用TNFR1-Fc捕获接着用山羊抗-Fab检测和通过抗-山羊HRP读出。除了此方法以外，使用BIAcore定量DMS0169，通过与用高密度人TNFR1包被的芯片的结合，并且将数据作图以计算在小鼠中的终末半衰期。DMS0168具有15.4小时（ELISA）的终末半衰期和DMS0169具有17.8小时（ELISA）或22.0小时（BIAcore）的终末半衰期（图24）。与DOM0100 dAb与DOM7h-11融合时的半衰期相比，这些半衰期都具有显著的延长，并强调了与白蛋白的提高的亲和力对AlbudAb融合物的终末半衰期的影响。
DOM0100-AlbudAb融合物的功能表征和生物物理性能
为了测定抗-TNFR1 dAb与抗-白蛋白dAb融合的最佳形式，采用单个抗-TNFR1 dAb(DOM1h-574-72)并与4个不同的AlbudAb配对(DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-14-10和DOM7h-14-18)，使用3种不同的接头(AST, ASTSGPS和AS(GGGGS)3)。这些构建体无一包含myc标签。在大肠杆菌中表达所有12个构建体并使用蛋白质L后接蛋白质A纯化的两步法纯化，然后定量表达水平。此外，使用SEC-MALLS测定了分子的溶液内状态。结果总结在表7中。对结果的分析得到几个惊人的观察结果：1）当与DOM7h-14系配对比较时，DOM1h-574-72与DOM7h-11系dAb的配对导致显著更高的表达水平，2）对DOM7h-11配对观察到单体的溶液内状态，同时与DOM7h-14的配对导致单体/二聚体平衡。单体的溶液内状态是优选的，因为这些分子不太可能引起受体交联和因此导致受体激活（激动）或中和抑制剂活性。此外，从开发的角度来看单体的溶液内状态是理想的，因为这些分子倾向于较少聚集和当通过大小排阻层析（SEC）分析时更清晰。相比DOM7h-14 AlbudAb配对，与DOM7h-11 AlbudAb配对导致更高的表达水平和更高的单体溶液内状态百分比二者的观察结果有利于DOM7h-11配对。
表7. 为了评估对于表达和溶液内状态的最佳接头和AlbudAb组合而产生的融合分子组合的概括。使用了3种不同的接头，通过其氨基酸组成指示，AST、ASTSGPS和由AS与4个甘氨酸和1个丝氨酸的3次重复组成的甘氨酸-丝氨酸接头(AS(G4S)3)。使用SEC-MALLS测定了溶液内状态并以单体或单体/二聚体平衡表示。对一些AlbudAb融合物，其表达过低以致没有足够的材料可用于测定溶液内状态并且其被指示为（ND）。
此外，分别使用BIAcore T100和MRC5细胞测定测定了纯化的融合分子的亲和力和效价。BIAcore T100是高度灵敏的BIAcore版本，其理想地适用于测定高亲和力的结合体(Papalia 等人, Anal Biochem. 359, p112 (2006))。在芯片上包被生物素化的人TNFR1并且将12种AlbudAb融合物的每一种以4个不同浓度(2, 10, 50和250 nM)通过此表面。目的是确定配对是否对抗-TNFR1 dAb (DOM1h-574-72)与其靶的结合亲和力具有任意显著影响。如可从下表8所看到的，通过BIAcore的测定，配对之间和其对亲和力的影响没有显著差异。所有组合得到类似的亲和力，除了DOM7h-14-18配对(DMS0118和DMS0124)以外，其显示了是其他配对3倍高的亲和力。可是令人惊讶地是，当与未融合的DOM1h-574-72 dAb相比，观察到在所有AlbudAb融合分子中的DOM1h-574-72的至少2-3倍的亲和力改进（KD）。观察到的此改进和用于配对的AlbudAb无关并且改进最大的是与DOM7h-14-18的配对。用于确定不同配对是否影响抗-TNFR1 dAb的功能活性的第二个实验是MRC5细胞测定（表8）。在MRC5测定中观察到配对之间的更显著的差异，其中在与DOM7h-11-3和DOM7h-11-12的配对中观察到最高效价而与DOM7h-14-10 (DMS0117)的配对导致效价的显著降低。
表8：使用3种不同接头，DOM1h-574-72与4种不同的AlbudAb配对的BIAcore T100和MRC5分析。DMS克隆的组合请参阅表7。由于材料不够，所以未测定（ND）所有构建体的亲和力常数。总的来说，在AlbudAb配对后未观察到对亲和力的打击（hit）。在MRC5测定中在DOM7h-11-3和DOM7h-11-12配对中得到最一致的数据。
Figure 437314DEST_PATH_IMAGE008
使用单体DOM1h-574 抗-TNFR1 dAb和与AlbudAb的配对二者的生物物理和功能表征的结果，构建、表达、纯化和表征了5种融合分子的子集。这5种分子各自包含以下抗-TNFR1 dAb中的一种：DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162和DOM1h-574-180，各自使用AST接头与DOM7h-11-3配对。构建体从N-至C-端为，抗-TNFR1 dAb（即DOM0100 dAb）-接头-AlbudAb，这些构建体无一包含标签）。表达的分子通过SEC-MALLS表征了溶液内状态，通过DSC表征了热稳定性，通过BIAcore表征了对人和小鼠TNFR1的亲和力和在MRC5测定中表征了功能活性。
这5种串联融合分子的生物物理表征证明所有分子都具有>55℃的熔解温度和为溶液内的单体（表9）。高熔解温度指示提高的分子稳定性，其对下游处理和分子的储存都有利。此外，当分子作为药物在患者体内发挥功能时，其可有利于分子的稳定性，其通过使分子对降解较不敏感和因此延长其终末半衰期来进行。
表9：用于半衰期延长的抗-TNFR1 dAb和DOM7h-11-3 AlbudAb的优选组合的概述。纯化后，检测了这些融合分子的热稳定性（DSC）和溶液内状态(SEC-MALLS)。所有分子都为单体且DMS0133和DMS0134具有最高的熔解温度。
Figure 981559DEST_PATH_IMAGE009
通过BIAcore表征的抗-TNFR1亲和力和在人MRC5和标准小鼠L929细胞测定中表征的功能活性（表10）指示dAb之间的差异有限。然而，当综合来自熔解温度、溶液内状态、表达、BIAcore、人MRC5细胞测定和标准小鼠L929细胞测定的所有数据时，DMS0133和DMS0134显示为优选的组合。这2种分子的熔解温度最高，同时它们属于在功能性人和小鼠细胞测定中的最有效组合。在细胞测定中的功能活性是决定优选分子的关键驱动因素。
表10：5种最佳抗-TNFR1/AlbudAb融合分子的功能表征和表达。在纯化后测定了表达水平。通过BIAcore测定了亲和力和在人MRC5和标准小鼠L929细胞测定二者中测定了功能活性。DMS0132, DMS0135和DMS0134的表达最佳，且在细胞测定中最有效的组合是DMS0133, DMS0134和DMS0135。
在类风湿性关节炎的鼠类模型中证明DOM0100的体内效力
为了证明描述的抗-TNFR1 dAb的活性有用并可修饰疾病，用DMS0169（融合物，从N-至C-端为DOM1h-574-72 – ASTSGPS – DOM7h-11-12-myc标签）处理类风湿性关节炎的鼠类模型。此鼠类模型是转基因小鼠模型，其中过表达人TNFα(Tg197)并且用人TNFR1（hp55）基因替换编码小鼠TNFR1的基因。经过一段时间这些小鼠自发产生关节炎，在治疗期间通过测量关节大小（临床评分）和在15周后通过进行关节的组织学分析(Keffer 等人, EMBO.J., 10, p4025 (1991))对关节炎评分。此外，可从每周测量1次的小鼠体重推断小鼠的总体健康。从第6周以后，每周2次用10 mg/kg DMS0169或每周1次用盐水注射（对照）处理12只小鼠。从第6周直到第15周，每周1次对每只小鼠评分临床分数和体重二者（图25和26）。15周后处死小鼠并进行关节炎症的组织学分析（图27）。DMS0169对临床评分和第15周时的组织学二者的影响都高度显著(p<0.001)并且用DMS0169处理的小鼠的体重与盐水处理对照动物相比是有利的，指示DMS0169在类风湿性关节炎中的潜在治疗益处。
标准细胞测定
标准MRC-5 IL-8释放测定
在以下MRC-5细胞测定中评估了结合人TNFR1的某些dAb的活性。测定是基于在MRC-5细胞中通过TNFα诱导的IL-8分泌并改自Alceson, L. 等人 Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996)中描述的方法，其中描述了在HUVEC中通过IL-1诱导的IL-8。通过使用MRC-5细胞代替HUVEC细胞系评估人TNFα的IL-8诱导评估了dAb的活性。简单地说，将MRC-5细胞(ATCC号: CCL-171)铺展于微滴定板中（5x103细胞/孔）并与剂量范围的dAb和固定量的人TNFα (200 pg/ml)过夜孵育。孵育后，吸取培养上清并使用IL-8 ABI 8200细胞检测测定(FMAT)测定IL-8释放。IL-8 FMAT测定使用来自R&D Systems的检测和捕获试剂。用捕获抗体小鼠单克隆抗-人IL-8抗体(R&D systems, 货号MAB208)包被小珠，其为包被山羊抗-小鼠IgG(H&L)的聚苯乙烯颗粒0.5% w/v 6-8μm (Spherotech Inc, 货号MP-60-5)。用于检测，使用生物素化山羊抗-人IL-8抗体(R&D systems, 货号BAF208)和链霉抗生物素Alexafluor 647 (Molecular Probes, 货号S32357)。使用重组人IL-8(R&D systems, 货号208-IL)作为标准物。和仅与TNFα孵育的对照孔相比，抗-TNFR1 dAb活性导致分泌至上清中的IL-8减少。
标准食蟹猴CYNOM-K1测定
检测了抗-TNFR1 dAb在CYNOM-K1细胞测定中的效价。简单地说，dAb与CYNOM-K1细胞(ECACC 90071809) (5x103细胞/孔)在平底细胞培养板中在37℃孵育1小时。加入重组人TNFα(Peprotech)(终浓度为200pg/ml) 并将板孵育18-20小时。然后在培养上清中使用DuoSet ELISA显色系统(R&D Systems, 货号DY208)根据制造商的说明书（文档号750364.16版本11/08）测量分泌的IL-8的水平。通过dAb浓度对IL-8分泌抑制的百分比作图测定ND50。
标准L929细胞毒性测定
也检测了抗-TNFR1 dAb中和TNFα对小鼠L929成纤维细胞(ATCC CCL-1)的细胞毒性(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248)的能力。简单都说，将铺展在微滴定板上的L929细胞(1x104细胞/孔)与抗-TNFR1 dAb、100pg/ml TNFα和1μg/ml放线菌素D (Sigma, Poole, UK)孵育过夜。在与[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑
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 (Promega, Madison, USA)孵育后通过读取490nm处的吸光度测量细胞活力。和仅与TNFα孵育的对照相比，抗-TNFR1 dAb活性导致TNFα细胞毒性的降低和因此吸光度的提高。
标准受体结合测定
在受体结合测定中测定了dAb对人TNFR1的效价。此测定测量了TNFα与TNFR1的结合和可溶性dAb阻止此相互作用的能力。在用山羊抗-人IgG(H&L)预包被的小珠上捕获TNFR1-Fc融合物。受体包被的小珠与TNFα(10ng/ml)、dAb、生物素缀合的抗-TNFα和链霉抗生物素alexa fluor 647在黑边透明底384孔板上孵育。6小时后在ABI 8200细胞检测系统上读板并测定小珠相关荧光。如果dAb阻止TNFα结合TNFR1将降低荧光强度。
使用ABI 8200分析软件分析数据。使用GraphPad Prism和具有可变斜率的S形剂量应答曲线测定浓度效应曲线和效价（EC50）。 
构建和纯化具有DOM7h-11-12的融合物用于体内效力研究
为了进行不同抗-TNFR1和对照dAb的体内效力研究，克隆了具有AlbudAb (抗-血清白蛋白dAb) DOM7h-11-12的不同dAb的基因融合物，在dAb之间使用Ala-Ser-Thr接头。为此构建了4个构建体：DMS5537 (DOM1h-574-156-AST-DOM7h-11-12)、DMS5538 (VhD2-AST-DOM7h-11-12)、DMS5539 (DOM1m-15-12-AST-DOM7h-11-12dh)和DMS5540 (DOM1m-21-23-AST-DOM7h-11-12)。
如下构建这4个构建体中的每一个：
DMS5537：使用引物AS9和ZHT304从DMS0126上PCR扩增Vh dAb DOM1h-574-156。从pDOM5载体中的DMS0169（无标签）上PCR扩增Vk dAb DOM7h-11-12，使用引物PAS40和AS65以添加AST接头。通过SOE-PCR连接反应产物并使用引物JAL102和ZHT32再次扩增。再次扩增的反应产物用Nde I/Not I切割并克隆进Nde I/Not I-切割的pET30a (Merck)。将构建体转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3) (Novagen, 货号69450)用于表达。
DMS5538：使用引物AS9和ZHT304 PCR扩增没有特异性抗原识别的Vh dAb VhD2，又名“假dAb”。使用引物PAS40和AS65从无标签的DMS0169上PCR扩增Vk dAb DOM7h-11-12。凝胶纯化2种产物并使用SOE-PCR重新组装。使用引物JAL102和ZHT327再次扩增SOE产物。用Nde I和Not I酶切割再次扩增的反应产物，凝胶纯化并连接进用Nde I和Not I酶切割的pET30。将构建体转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于表达。
DMS5539：使用引物AS9和ZHT334从pDOM5/Vk(DOM1m-15-12)上PCR扩增抗-小鼠TNFR1 Vk dAb DOM1m-15-12。因为抗-TNFR1和抗-白蛋白dAb都是Vk，对DOM7h-11-12进行标准DNA去同源化（dehomologisation）方法，即在DNA水平引入不影响氨基酸序列的沉默突变。在DNA扩增和蛋白质表达期间，这些突变降低同源重组的机会并提高质粒稳定性。此外，DOM7h-11-12 dAb也包含在第12位的Ser至Pro的突变以降低串联融合物与蛋白质L的结合从而易于纯化。使用引物ZHT333和AS65从pDOM5/Vk(DOM7h-11-12dh)上PCR扩增Vk DOM7h-11-12 S12P (DOM7h-11-12dh S12P)的去同源化版本。凝胶纯化2种产物并使用SOE-PCR重新组装。使用引物ZHT332 + ZHT327再次扩增SOE产物。用Nde I和Not I酶切割再次扩增的反应产物，凝胶纯化并连接进用Nde I和Not I酶切割的pET30。将构建体转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于表达。
DMS5540：使用引物AS9和ZHT335从DMS0127上PCR扩增抗-小鼠TNFR1 Vh dAb DOM1m-21-23 (见WO2006038027)。使用引物PAS40和AS65从DMS0169上PCR扩增Vk dAb DOM7h-11-12。凝胶纯化2种产物并使用SOE-PCR重新组装。使用引物JAL102和ZHT327再次扩增SOE产物。用Nde I和Not I酶切割再次扩增的反应产物，凝胶纯化并连接进用Nde I和Not I酶切割的pET30。将构建体转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于表达。
然后在发酵罐中表达所有4种构建体，使用以下条件：除了DMS5540用0.025mM IPTG诱导外，其他用0.01mM IPTG诱导，诱导后在27度发酵。所有发酵在5L规模上在基本培养基中进行直到高细胞密度。
从上清中进行纯化，通过与蛋白质L的分批结合，接着洗脱、中和，然后第二步与蛋白质A分批结合。在功能表征前将洗脱的蛋白质的缓冲液替换为PBS并浓缩。DMS5539通过蛋白质L纯化，然后通过SEC进一步纯化并同时将缓冲液替换为PBS。然后用内毒素消耗所有分子。
表11：氨基酸序列
DOM1h-574和DOM1h-574’具有1个氨基酸的差别（根据Kabat编码的第98位氨基酸在前者中为R在后者中为H）。
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表12：核苷酸序列
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Claims (71)

1.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
2.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述单个可变结构域是包含一个或多个以下突变（根据Kabat编号）的DOM1h-574-14 (SEQ ID NO: 10)突变体：
位置30是L或F，
位置52是A或T，
位置52a是D或E， 
位置54是A或R，
位置57是R、K或A，
位置60是D、S、T或K，
位置61是E、H或G，
位置62是A或T，
位置100是R、G、N、K、Q、V、A、D、S或V，和
位置101是A、Q、N、E、V、H或K。
3.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其在第101位（根据Kabat编号）包含缬氨酸。
4.根据权利要求3的单个可变结构域，其中所述可变结构域如权利要求1中的定义。
5.任一前述权利要求的单个可变结构域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一个或多个，其中编号根据Kabat。
6.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含30G, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I和98R中的一个或多个，其中编号根据Kabat，其中所述单个可变结构域的氨基酸序列在其他位置与DOM1h-574 (SEQ ID NO: 11；图5)的氨基酸序列相同。
7.权利要求5或6的免疫球蛋白单个可变结构域，其包含45P、55D、56R、94I和98R，其中编号根据Kabat。
8.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-132 (SEQ ID NO: 7)、DOM1h-574-135 (SEQ ID NO: 8)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 9)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
9.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-93 (SEQ ID NO: 12)、DOM1h-574-123 (SEQ ID NO: 13)、DOM1h-574-125 (SEQ ID NO: 14)、DOM1h-574-126 (SEQ ID NO: 15)或DOM1h-574-129 (SEQ ID NO: 16)、DOM1h-574-133 (SEQ ID NO: 17)、DOM1h-574-137 (SEQ ID NO: 18)或DOM1h-574-160 (SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列至少94%同一的氨基酸序列。
10.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-125 (SEQ ID NO: 14)、DOM1h-574-126 (SEQ ID NO: 15)、DOM1h-574-133 (SEQ ID NO: 17)、DOM1h-574-135 (SEQ ID NO: 8)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-139 (SEQ ID NO: 20)、DOM1h-574-155 (SEQ ID NO: 21)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
11.一种用于结合人、鼠类或食蟹猴（Cynomologus monkey）TNFR1的抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述单个可变结构域由与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 22)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 23)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 109)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 25)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 26)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 27)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列编码。
12.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域包含以通过表面等离子体共振测定的500 pM或更低的解离常数（KD）特异性结合人TNFR1的结合位点。
13.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域包含以通过表面等离子体共振测定的2 x 10-4 s-1 或更低的解离速度常数（Koff）特异性结合人TNFR1的结合位点。
14.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域特异性结合人、食蟹猴和任选地犬TNFR1。
15.权利要求14的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域结合鼠类TNFR1。
16.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域抑制人、食蟹猴和任选地犬TNFR1与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的结合。
17.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域抑制人、鼠类、食蟹猴和任选地犬TNFR1与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的结合。
18.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域在标准MRC5测定中以约5 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制所测定的。
19.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域在标准L929测定中以约150 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通过TNFα诱导的细胞毒性的抑制所测定的。
20.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域在标准食蟹猴KI测定中以约5 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通过TNFα诱导的IL-8分泌的抑制所测定的。
21.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域是TNFR1的非竞争性抑制性。
22.权利要求21的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域特异性结合TNFR1的结构域1。
23.权利要求21或22的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域特异性结合人TNFR1的PLAD结构域。
24.任一前述权利要求的免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述单个可变结构域包含末端半胱氨酸残基，任选地C-端半胱氨酸残基。
25.任一前述权利要求的免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述单个可变结构域连接聚亚烷基二醇部分，任选地聚乙二醇部分。
26.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6) 的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与所述选定的氨基酸序列的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。
27.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6) 的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与所述选定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
28.一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自氨基酸序列DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6) 的氨基酸序列相同，或与选定的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置处不同并具有与所述选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
29.根据权利要求26的一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与所述选定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
30.根据权利要求26的一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与所述选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
31.根据权利要求27的一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与所述选定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
32.根据权利要求31的一种抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。
33.一种蛋白酶抗性的抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其中当在下述条件下孵育时所述单个可变结构域具有蛋白酶抗性：
（i）至少10微克/ml浓度（c）的蛋白酶在37℃孵育至少1小时的时间（t）；或
（ii）至少40微克/ml浓度（c’）的蛋白酶在30℃孵育至少1小时的时间（t），
其中所述可变结构域包含与DOM1h-574-126(SEQ ID NO: 15)或DOM1h-574-133(SEQ ID NO: 17)的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列，并任选地在第101位（Kabat编号）包含缬氨酸。
34.任一前述权利要求的单个可变结构域，其中所述单个可变结构域具有至少50℃的Tm。
35.一种多肽，其包含如任一前述权利要求定义的免疫球蛋白单个可变结构域和抗体恒定结构域，任选地抗体Fc区，任选地其中所述Fc的N端连接（任选地直接连接）所述可变结构域的C端。
36.一种多特异性配体，其包含如任一前述权利要求定义的免疫球蛋白单个可变结构域和任选地至少一种特异性结合血清白蛋白（SA）的免疫球蛋白单个可变结构域。
37.权利要求36的多特异性配体，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11 (SEQ ID NO: 28)、DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 29)、DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 30)、DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 31)、DOM7h-14 (SEQ ID NO: 32)、DOM7h-14-10 (SEQ ID NO: 33)、DOM7h-14-18 (SEQ ID NO: 34)或DOM7m-16 (SEQ ID NO: 35)的序列至少80%相同的氨基酸序列。
38.权利要求36或37的多特异性配体，其中在所述抗-TNFR1单个可变结构域和所述抗-SA可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。
39.一种多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列至少93%相同的氨基酸序列，（ii）至少一种特异性结合SA的抗血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11-3 (SEQ ID NO: 29)的序列至少80%相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在所述抗-TNFR1单个可变结构域和所述抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。
40.一种多特异性配体，其包含（i）抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域，其包含与DOM1h-574-156(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列至少93%相同的氨基酸序列，（ii）至少一种特异性结合SA的抗血清白蛋白（SA）免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-14-10 (SEQ ID NO: 33)的序列至少80%相同的氨基酸序列，和（iii）任选地其中在所述抗-TNFR1单个可变结构域和所述抗-SA单个可变结构域之间提供接头，所述接头包含氨基酸序列AST，任选地ASTSGPS。
41.一种TNFR1拮抗剂，其包含任一前述权利要求的单个可变结构域、多肽或多特异性配体。
42.一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其包含根据权利要求33的可变结构域，其用于口服递送，递送至患者的胃肠道，肺部递送，递送至患者的肺或全身递送。
43.一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的CDR1序列至少50%相同的CDR1序列。
44.一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
45.一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂具有与DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
46.根据权利要求43的一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其具有与所述选定序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
47.根据权利要求43的一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其具有与所述选定序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
48.根据权利要求46的一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其具有与所述选定序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
49.根据权利要求44的一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其具有与所述选定序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
50.一种TNFα1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于结合人、鼠类或食蟹猴TNFR1，所述拮抗剂包含免疫球蛋白单个可变结构域，所述免疫球蛋白单个可变结构域包含选自DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的单个可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
51.权利要求41至50中任一项的TNFR1拮抗剂，其用于治疗和/或预防炎症病症。
52.权利要求41至50中任一项的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎症病症的药物中的用途。
53.权利要求51的拮抗剂或权利要求52的用途，其中所述病症选自关节炎、多发性硬化、炎症性肠病和慢性阻塞性肺病。
54.权利要求53的拮抗剂或用途，其中所述关节炎是类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎。
55.权利要求53的拮抗剂或用途，其中所述炎症性肠病选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。
56.权利要求53的拮抗剂或用途，其中所述慢性阻塞性肺病选自慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎和肺气肿。
57.权利要求53的拮抗剂或用途，其中所述肺炎是细菌性肺炎。
58.权利要求57的拮抗剂或用途，其中所述细菌性肺炎是葡萄球菌肺炎。
59.权利要求41至50中任一项的TNFR1拮抗剂，其用于治疗和/或预防呼吸道疾病。
60.权利要求41至50中任一项的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防呼吸道疾病的药物中的用途。
61.权利要求59的拮抗剂或权利要求60的用途，其中所述呼吸道疾病选自肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒细胞浸润症、环境相关肺病、肺炎、支气管炎、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞、胸膜疾病、纵隔膜疾病、隔膜疾病、换气不足、换气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合症、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、过敏性鼻炎、过敏、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵略性肺炎球菌疾病、流感、非结核性分枝杆菌、胸膜积液、尘肺病、肺孢子虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽症、肺水肿、肺栓塞、肺炎症、肺组织细胞增多病X、肺动脉高压、肺诺卡氏病、肺结核、肝静脉闭塞病、类风湿性肺病、肉状瘤病和韦格纳肉芽肿病。
62.权利要求1至50中任一项的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1表位序列。
63.权利要求62的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1表位序列，以治疗和/或预防在权利要求51至62中任一项详细说明的病症或疾病。
64.一种在患者中治疗和/或预防在利要求51至62中任一项详细说明的病症或疾病的方法，所述方法包括对患者施用权利要求1至50中任一项的抗-TNFR1拮抗剂、单个可变结构域、多肽或多特异性配体，其用于在患者中靶向一个或多个选自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFR1表位序列。
65.一种分离的或重组的核酸，其中所述核酸包含与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1h-574-72 (SEQ ID NO: 2)、DOM1h-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOM1h-574-138 (SEQ ID NO: 4)、DOM1h-574-162 (SEQ ID NO: 5)或DOM1h-574-180 (SEQ ID NO: 6)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列并且其中所述核酸编码多肽，所述多肽包含特异性结合人TNFR1的免疫球蛋白可变结构域。
66.一种多特异性配体，其包含抗-TNFα1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单个可变结构域和至少一种特异性结合血清白蛋白（SA）的免疫球蛋白单个可变结构域，其中
（a）所述抗-TNFR1单个可变结构域包含与DOM1h-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOM1m-15-12 (SEQ ID NO: 36)或DOM1m-21-23 (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸；和
（b）所述抗-SA单个可变结构域包含与DOM7h-11-12 (SEQ ID NO: 30)或DOM7h-11-12dh (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸；和
（c）所述配体包含在所述可变结构域之间的接头，所述接头包含氨基酸序列AS或AST。
67.一种多特异性配体，其包含DMS5537 (SEQ ID NO: 39)、DMS5538 (SEQ ID NO: 40)、DMS5539 (SEQ ID NO: 41)或DMS5540 (SEQ ID NO: 42)或由DMS5537 (SEQ ID NO: 39)、DMS5538 (SEQ ID NO: 40)、DMS5539 (SEQ ID NO: 41)或DMS5540 (SEQ ID NO: 42)组成。
68.一种编码权利要求66或67的多特异性配体的核酸。
69.一种核酸，其包含与DMS5537 (SEQ ID NO: 43)、DMS5538 (SEQ ID NO: 44)、DMS5539 (SEQ ID NO: 38)或DMS5540 (SEQ ID NO: 9)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列。
70.一种包含权利要求68或69的核酸的载体。
71.一种包含权利要求70的载体的宿主，任选地非人胚胎细胞。
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