KR20110119806A - 개선된 항­ｔｎｆｒ1 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-TNFR1 폴리펩티드, 항체 단일 가변 도메인(dAb), 길항제 및 다중특이적 리간드, 뿐만 아니라 이들의 방법 및 용도에 관한 것이다. 항-TNFR1 폴리펩티드, 항체 단일 가변 도메인(dAb), 길항제 및 다중특이적 리간드는 관절염 또는 COPD와 같은 염증성 질환의 치료 및/또는 예방뿐 아니라, 폐 투여, 경구 투여, 폐로의 전달 및 환자의 위장관으로의 전달에 유용하다.

Description

개선된 항­ＴＮＦＲ1 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제{IMPROVED ANTI-TNFR1 POLYPEPTIDES, ANTIBODY VARIABLE DOMAINS ＆ ANTAGONISTS}
본 발명은 항-종양 괴사 인자 1(TNFR1, p55, CD120a, P60, TNF 수용체 상과 구성원 1A, TNFRSFlA, TNFα 수용체 I형) 폴리펩티드, 면역글로불린(항체) 단일 가변 도메인 및 이들을 포함하는 길항제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 항-TNFR1 리간드를 포함하거나 사용하는 방법, 용도, 제형, 조성물 및 장치에 관한 것이다.
TNFR1
TNFR1은 리간드에 결합하는 세포의 영역, 및 내재적 신호 전달 활성이 없으나 신호 전달 분자와 회합할 수 있는 세포내 도메인을 함유하는 막횡단(transmembrane) 수용체이다. TNFR1과 결합 TNF와의 복합체는 3개의 TNFR1 사슬 및 3개의 TNF 사슬을 함유한다(문헌[Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)]). TNF 리간드는 3량체로 존재하며, 이는 3개의 TNFR1 사슬에 의해 결합된다(상기 문헌과 동일한 문헌). 3개의 TNFR1 사슬은 수용체-리간드 복합체에서 함께 가까이 클러스터링되며, 이러한 클러스터링은 TNFR1-매개의 신호 전달의 요건이다. 사실상, TNFR1에 결합하는 다가 제제, 이를 테면 항-TNFR1 항체는 TNF의 부재 하에서 TNFR1 클러스터링 및 신호 전달을 유도할 수 있고, 통상적으로 TNFR1 작용제로 사용된다(참조예: 문헌[Belka et al., EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995)]; 문헌[Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167: 1920-1928 (2001)]). 따라서, TNFR1에 결합하는 다가 제제는 이것이 TNFα의 TNFR1으로의 결합을 차단하더라도 일반적으로 효과적인 TNFR1의 길항제가 아니다.
본 단락에서의 서열 번호는 WO2006038027호에 사용되는 넘버링(numbering)을 말한다. TNFR1의 세포외 영역은 13개 아미노산 아미노-말단 세그먼트(서열 번호 603의 아미노산 1-13(인간); 서열 번호 604의 아미노산 1-13(마우스)), 도메인 1(서열 번호 603의 아미노산 14-53(인간); 서열 번호 604의 아미노산 14-53(마우스)), 도메인 2(서열 번호 603의 아미노산 54-97(인간); 서열 번호 604의 아미노산 54-97(마우스)), 도메인 3(서열 번호 603의 아미노산 98-138(인간); 서열 번호 604의 아미노산 98-138(마우스)) 및 도메인 4(서열 번호 603의 아미노산 139-167(인간); 서열 번호 604의 아미노산 139-167(마우스))에 이어서, 막-근위 영역(서열 번호 603의 아미노산 168-182(인간); 서열 번호 604의 아미노산 168-183(마우스))을 포함한다(참조 문헌[Banner et al., Cell 73(3) 431-445 (1993)] 및 참조 문헌[Loetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990)]). 도메인 2 및 3은 결합 리간드(TNFβ, TNFα)와 접촉한다(문헌[Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)]). 또한, TNFR1의 세포외 영역은 프레-리간드(pre-ligand) 결합 어셈블리 도메인 또는 PLAD 도메인(서열 번호 603의 아미노산 1-53(인간); 서열 번호 604의 아미노산 1-53(마우스))으로 지칭되는 영역을 함유한다(문헌[The Government of the USA, WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005)]). TNFR1은 도메인 4 또는 막-근위 영역(서열 번호 603의 아미노산 168-182; 서열 번호 604의 아미노산 168-183)에서의 TNFR1의 단백질 가수분해를 포함하는 과정을 통하여 생체 내에서 세포의 표면으로부터 떨어져, TNFR1의 용해성 형태를 생성한다. 용해성 TNFR1은 TNFα에 결합하는 능력을 계속 유지하여, TNFα의 활성의 내인성 억제제로 작용한다.
WO2006038027호, WO2008149144호 및 WO2008149148호는 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 이들을 포함하는 길항제를 개시하고 있다. 또한, 이들 문헌은 TNFα에 의해 매개되는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 이러한 도메인 및 길항제의 용도를 개시하고 있다. WO2006038027호는 TAR2h-205로 불리우는 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)을 개시하고 있으며(WO2006038027호의 서열 번호 627), 이는 인간 TNFR1에 대하여 보통의 역가를 갖는다. 개선된 항-인간 TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 이들을 포함하는 길항제, 리간드 및 제품을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이들의 목표는 샘플 내의 인간 TNFR1을 검출하기 위한 개선된 진단 시약을 제공하는 것뿐만 아니라, 또는 다르게는 인간 또는 기타 포유동물에서 TNFR1-매개의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 개선된 치료제를 제공하는 것일 것이다. TNFR1, 특히 인간 TNFR1의 강력한 중화제(TAR2h-205보다 더한)이고; 인간 TNFR1 및 하나 이상의 다른 종(예를 들면, 약물 개발 및 시험을 위한 모델로 통상 사용되는 종, 예를 들어, 마우스, 랫트, 개, 돼지 또는 비인간 영장류)으로부터의 TNFR1 간에 교차-반응성이며; 프로테아제(예를 들어, 환자에게 유입될 것 같은 프로테아제, 예를 들면 트립신, 키모트립신, 펩신 또는 류코자임)에 내성이며; 우수한 약물동력학(예를 들어, 유리한 반감기)를 갖고/거나; TNFR1, 예를 들어 인간 TNFR1에 대한 높은 친화성 결합을 나타내는 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 이들을 포함하는 길항제, 리간드 및 제품을 제공하는 것이 특히 바람직할 것이다. 본 명세서에서 TAR2h-205는 DOM1h-574(서열 번호 11)로 명명한다(또한, 도 5 참조).
본 발명의 다양한 태양은 이들 바람직한 특징을 만족시킨다.
발명의 요약
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 하기의 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 DOM1h-574-14의 돌연변이체이다(카바트(Kabat) 넘버링에 따른 넘버링):
위치 30은 L 또는 F,
위치 52는 A 또는 T,
위치 52a는 D 또는 E,
위치 54는 A 또는 R,
위치 57은 R, K 또는 A,
위치 60은 D, S, T 또는 K,
위치 61은 E, H 또는 G,
위치 62는 A 또는 T,
위치 100은 R, G, N, K, Q, V, A, D, S 또는 V,
위치 101은 A, Q, N, E, V, H 또는 K.
임의로, 상기 단일 가변 도메인은 하기의 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 DOM1h-574-14의 돌연변이체이다(카바트 넘버링에 따른 넘버링):
위치 30은 L 또는 F,
위치 52는 A 또는 T,
위치 52a는 D,
위치 54는 A,
위치 57은 R,
위치 60은 D, S 또는 T,
위치 61은 H,
위치 62는 A,
위치 100은 V, A, R, G, N 또는 K,
위치 101은 E, V, K, A, Q 또는 N.
일 태양에서, 본 발명은 위치 101(카바트 넘버링에 따른 넘버링)에 발린을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 중쇄 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 30G, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R 중 하나 이상을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 넘버링은 카바트 넘버링에 따른 것이고, 상기 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 다르게는 DOM1h-574의 아미노산 서열과 동일하다. 일 실시형태에서, 인간, 뮤린(murine) 또는 사이노몰구스 원숭이(Cynomologus monkey) TNFR1에 결합하는 가변 도메인이 제공된다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-156, DOM1h-574-109, DOM1h-574-132, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 세포 검정에서 TNFR1(예를 들어, 적어도 인간 TNFR1)의 강력한 중화제인 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-109, DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137, 또는 DOM1h-574-160의 아미노산과 94% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 단백질 가수분해에 안정한 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-133, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-139, DOM1h-574-155, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162, 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 인간 TNFR1에 높은 친화성으로 결합하며, 임의로, 뮤린 TNFR1에 대해서도 원하는 친화성을 나타내는 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 DOM1h-574를 제외한 하기 표 12에 나타낸 DOM1h 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 상기 단일 가변 도메인은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 선택된 아미노산 서열과 상이하며, 선택된 아미노산 서열의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 선택된 아미노산 서열과 상이하며, 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 DOM1h-574-72의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 선택된 아미노산 서열과 상이하며, 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 상기 단일 가변 도메인은
(i) 37 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 10㎍/㎖ 이상의 농도(c)의 프로테아제; 또는
(ii) 30 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 40㎍/㎖ 이상의 농도(c')의 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 대해 내성이며, 여기서 상기 가변 도메인은 DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-133의 아미노산 서열과 94% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 임의로 위치 101(카바트 넘버링)에 발린을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 항체 불변 도메인, 임의로 항체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 임의로, 여기서 Fc의 N-말단은 가변 도메인의 C-말단에 연결된다(임의로 직접 연결된다).
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 임의로 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항-TNFR1 단일 가변 도메인의 항-SA 단일 가변 도메인으로의 융합이 개선된 반감기(단독의 항-TNFR1 dAb 단량체에 비해)의 이점을 제공할 뿐 아니라, TNFR1 결합에 대한 친화성(KD)의 개선의 이점을 부가한다는 것을 발견하였다. 이러한 관찰은 당 분야의 상태에서 이전에 개시된 적이 없다. 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 본 명세서에 개시된 "DMS"로 표지된 임의의 작제물의 아미노산 서열, 예를 들어, DMS0111, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0121, 0122, 0123, 0124, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0162, 0163, 0168, 0169, 0176, 0177, 0182, 0184, 0186, 0188, 0189, 0190, 0191, 0192, 5519, 5520, 5521, 5522, 5525 및 5527(서열 번호 45-92) 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 본 명세서에 개시된 임의의 DMS의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, DMS0111, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0121, 0122, 0123, 0124, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0162, 0163, 0168, 0169, 0176, 0177, 0182, 0184, 0186, 0188, 0189, 0190, 0191, 0192, 5519, 5520, 5521, 5522, 5525 및 5527의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 의해 엔코딩된 아미노산 서열이거나, 이를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 항-SA 단일 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 본 명세서에 개시된 임의의 DMS의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, DMS0111, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0121, 0122, 0123, 0124, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0162, 0163, 0168, 0169, 0176, 0177, 0182, 0184, 0186, 0188, 0189, 0190, 0191, 0192, 5519, 5520, 5521, 5522, 5525 및 5527의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함한다. 이러한 핵산을 포함하는 벡터뿐 아니라, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 비-인간 숙주 세포)가 제공된다.
일 태양에서, 본 발명은 (i) DOM1h-574-156의 아미노산 서열과 93% 이상 동일한(임의로, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) DOM7h-11-3의 서열과 80% 이상 동일한(임의로, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하며 SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 여기서 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드를 제공한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다.
일 태양에서, 본 발명은 (i) DOM1h-574-156의 아미노산 서열과 93% 이상 동일한(임의로, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) DOM7h-14-10의 서열과 80% 이상 동일한(임의로, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하며 SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 여기서 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커는 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 선행 태양의 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 포함하는 TNFR1 길항제를 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 폐 전달, 환자의 폐로의 전달 또는 전신 전달을 위한 본 발명의 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180으로부터 선택되는 단일 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 서열을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 TNFR1 길항제를 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 염증 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에서의 본 발명의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다.
일 태양에서, NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TNFR1의 에피토프 서열을 표적으로 하는 본 발명의 임의의 일 태양의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다.
일 태양에서, 상술된 임의의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TNFR1의 에피토프 서열을 표적으로 하는 본 발명의 임의의 일 태양의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다.
일 태양에서, 본 발명은 환자에서 상술된 임의의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 환자에서 NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TNFR1의 에피토프 서열을 표적으로 하는 본 발명의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 태양은 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중 특이적 리간드를 제공하며, 여기서,
(a) 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인은 DOM1h-574-156, DOM1m-15-12 또는 DOM1m-21-23의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한(임의로 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산을 포함하며;
(b) 상기 항-SA 단일 가변 도메인은 DOM7h-11-12 또는 DOM7h-11-12dh의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한(임의로 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 아미노산을 포함하며;
(c) 상기 리간드는 상기 가변 도메인 사이에 링커를 포함하며, 상기 링커는 아미노산 서열 AS 또는 AST를 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 DMS5537, DMS5538, DMS5539 또는 DMS5540을 포함하거나, 이들로 이루어진 다중특이적 리간드를 제공한다. 본 발명의 일 태양은 어느 한쪽의 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 다른 태양은 DMS5537, DMS5538, DMS5539 또는 DMS5540의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한(임의로 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터뿐 아니라 벡터를 포함하는 숙주, 임의로 비-인간 배아 세포를 추가로 제공한다.
도 1. 나이브(naive) 선택으로부터 dAb의 인간 TNFR1에 대한 BIAcore 결합. 비오티닐화된 인간 TNFR1을 SA BIAcore 칩 상에 코팅하였다. 나이브 선택으로부터의 4가지의 정제된 dAb(DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-549 및 DOM1h-574)를 인간 TNFR1 위에 주입하고, 결합을 결정하였다. 각각의 dAb에 상응하는 곡선을 화살표로 표시한다.
도 2. 나이브 선택으로부터의 dAb를 위한 인간 TNFR1에 대한 MRC5 세포 검정. 나이브 선택으로부터의 4가지의 정제된 dAb(DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-549 및 DOM1h-574) 및 대조군 dAb(DOM1h-131-511)를 TNFα 매개의 IL-8 방출의 기능적 억제를 위한 MRC5 세포 검정에서 분석하였다. 기재된 바와 같이 검정을 수행하였고, 각각의 dAb에 상응하는 곡선을 화살표로 표시한다. 그래프에서, dAb 농도를 관찰된 중화 퍼센트에 대하여 작도하였다(그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 사용).
도 3. 나이브 선택으로부터의 dAb를 위한 인간 TNFR1에 대한 수용체 결합 검정. 나이브 선택으로부터의 4가지 정제된 dAb(DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-549 및 DOM1h-574) 및 양성 대조군 dAb(DOM1h-131-511)를 수용체 결합 검정에서 검정하여 TNFα와의 경쟁을 결정하였다. 양성 대조군 dAb는 TNFα와 경쟁적인 것으로 알려졌으며, 완전 억제 곡선을 보여준다. 선택된 항-TNFR1 dAb는 TNFα의 수용체로의 결합을 억제하지 않는다. 검정을 기재된 바와 같이 수행하였고, 각각의 dAb에 상응하는 곡선(그래프패드 프리즘 사용)을 화살표로 표시한다. y-축 상의 "중화%"는 TNF 알파 결합 억제를 나타낸다.
도 4. 변이-유발(error-prone) 시험 돌연변이로부터의 dAb를 위한 인간 TNFR1에 대한 MRC5 세포 검정. 나이브 선택으로부터의 3가지 정제된 dAb(DOM1h-574-7, DOM1h-574-8 및 DOM1h-574-10) 및 대조군 dAb(DOM1h-131-511)를 TNFα 매개의 IL-8 방출의 기능적 억제를 위한 MRC5 세포 검정에서 분석하였다. 검정을 기재된 바와 같이 수행하였고, 각각의 dAb에 상응하는 곡선을 화살표로 표시한다. 그래프에서, dAb 농도를 관찰된 중화 퍼센트에 대하여 작도한다(그래프패드 프리즘 사용). 이들 dAb는 도 2에 나타낸 모 DOM1h-574에 비해, MRC5 세포 검정에서 증가된 역가를 나타낸다.
도 5. DOM1h-574의 변이-유발 라이브러리로부터 동정된 dAb 및 이들의 이후의 재조합에 대한 아미노산 서열 정렬. 개선된 DOM1h-574 dAb에 대한 변이-유발 시험 돌연변이 선택으로, DOM1h-574-7, DOM1h-574-8, DOM1h-574-10, DOM1h-574-11, DOM1h-574-12 및 DOM1h-574-13에서 친화성 개선을 초래하는 위치를 동정하였다. 이들 돌연변이(V30G, G44D, L45P, G55D, H56R 및 K94I)의 재조합으로 DOM1h-574-14 내지 DOM1h-574-19를 생성하였다. 특정 위치에서의 "."은 DOM1h-574에서 그 위치에서 관찰되는 것과 동일한 아미노산을 표시한다. CDR을 밑줄 및 진한 문자로 표시한다(첫번째 밑줄친 서열은 CDR1이고, 두번째 밑줄친 서열은 CDR2이고, 세번째 밑줄친 서열은 CDR3임).
도 6. 인간, 사이노몰구스 원숭이, 개 및 마우스로부터의 TNFR1의 세포외 도메인의 아미노산 서열 정렬. 상기 정렬은 인간과 마우스 TNFR1 간의 서열의 제한된 보존을 강조표시한다. 특정 위치에서의 "."은 인간 ECD TNFR1에서 그 위치에서 관찰되는 것과 동일한 아미노산을 표시한다.
도 7. BIAcore에 의해 결정되는 경우, DOM1h-574-16 및 DOM1h-131-206의 개 TNFR1으로의 결합의 모니터링. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 개 TNFR1으로 코팅하였다. 이어서, 각각 100 nM의 정제된 dAb DOM1h-574-16 및 DOM1h-131-206을 개 TNFR1 위에 주입하였다. 추적에서, DOM1h-574-16이 상당한 결합을 나타낸 반면, DOM1h-131-206에 대해서는 오직 제한된 결합만이 관찰되는 것이 명백하다.
도 8. BIAcore에 의해 결정되는 경우, 정제된 DOM1h-574-16의 마우스 TNFR1 으로의 결합의 모니터링. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 마우스 TNFR1으로 코팅하였다. 이후에, 1 μM의 정제된 dAb DOM1h-574-16을 마우스 TNFR1 위에 주입하였다. 추적으로, 마우스 TNFR1에 대한 DOM1h-574-16의 결합이 명백히 나타났다.
도 9. 마우스 L929 세포 검정에서 DOM1h-574-16의 기능 활성. 마우스 L929 세포를 액티노마이신의 존재 하에서 TNFα의 세포독성 효과로부터 보호하는 DOM1h-574-16의 능력을 시험함으로써, 정제된 DOM1h-574-16(검정색 선, 삼각형)을 마우스 TNFR1과의 기능 교차-반응성에 대해 검정하였다. 양성 대조군으로서, 마우스 TNFR1 결합 dAb, DOM1m-21-23(회색선, 사각형)을 포함시켰으며, 활성인 것으로 나타났다. 그래프에서, dAb 농도를 TNFα 활성의 중화 퍼센트에 대하여 작도한다(그래프패드 프리즘 사용). 검정을 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 10. 사이노몰구스 원숭이 CYNOM-K1 세포 분석에서 DOM1h-574-16의 기능 활성. TNFα에 대한 반응으로 CYNOM-K1 세포로부터의 IL-8 방출을 억제하는 DOM1h-574-16의 능력을 시험함으로써, 정제된 DOM1h-574-16(회색 파선, 삼각형)을 사이노몰구스 원숭이 TNFR1과의 기능 교차-반응성에 대해 검정하였다. 검정을 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 양성 대조군으로서, DOM1h-131-511(검은 실선, 사각형)을 포함시켰다. dAb 둘 모두는 완전한 중화를 나타내었다. 그래프에서, dAb 농도를 TNFα 활성의 중화 퍼센트에 대하여 작도한다(그래프패드 프리즘 사용).
도 11a-c. 친화성 성숙 동안 동정된 DOM1h-574 계통으로부터의 가장 강력한 dAb에 대한 아미노산 서열 정렬. MRC5 세포 검정에서 가장 높은 역가를 갖는 dAb의 아미노산 서열을 모 DOM1h-574, 친화성 성숙의 개시에 사용된 주형(DOM1h-574-14) 및 증가된 역가를 갖는 것으로 이전에 동정된 dAb(DOM1h-574-72)와 함께 열거하였다. 특정 위치에서의 "."은 DOM1h-574에서 그 위치에 관찰되는 것과 동일한 아미노산을 표시한다. CDR을 밑줄 및 진한 문자로 표시한다(첫번째 밑줄친 서열은 CDR1이고, 두번째 밑줄친 서열은 CDR2이고, 세번째 밑줄친 서열은 CDR3임).
도 12a-c. 친화성 성숙 동안 동정된 DOM1h-574 계통으로부터의 가장 프로테아제에 대해 안정한 dAb에 대한 아미노산 서열 정렬. 트립신 분해에 가장 내성이 있는 것으로 나타냈던 dAb의 아미노산 서열을 친화성 성숙 후에 동정하였다. 정렬의 목적으로, 모 dAb DOM1h-574도 또한 포함시킨다. 특정 위치에서의 "."은 DOM1h-574에서 그 위치에 관찰되는 것과 동일한 아미노산을 표시한다. CDR을 밑줄 및 진한 문자로 표시한다(첫번째 밑줄친 서열은 CDR1이고, 두번째 밑줄친 서열은 CDR2이고, 세번째 밑줄친 서열은 CDR3임).
도 13a-c. 상세한 특성화를 위해 선택된 dAb에 대한 아미노산 서열 정렬. 정렬은 상세한 특성화를 위해 선택된 12개의 dAb뿐 아니라, DOM1h-574(모 dAb) 및 DOM1h-574-16을 포함하며, 이 DOM1h-574-16은 계통의 특성화를 위해 이전에 사용되었다. 특정 위치에서의 "."은 DOM1h-574에서 그 위치에 관찰되는 것과 동일한 아미노산을 표시한다. CDR을 밑줄 및 진한 문자로 표시한다(첫번째 밑줄친 서열은 CDR1이고, 두번째 밑줄친 서열은 CDR2이고, 세번째 밑줄친 서열은 CDR3임).
도 14. DOM1h-574-16 및 DOM1h-131-511에 대한 BIAcore에 의한 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 인간 TNFR1으로 코팅하였다. 이러한 표면의 도처에, DOM1h-131-511 및 DOM1h-574-16의 주입을 수행하였다(각각 200 nM에 이어서 재생 주입(미도시)). dAb의 각각에 결합된 RU(반응 유닛)의 수를 결정하였다. 이어서, 동일한 농도의 DOM1h-131-511을 주입하고, 즉시 DOM1h-574-16의 주입으로 이어졌다. 명백하게 알 수 있는 바와 같이, DOM1h-574-16의 2차 주입에 대한 결합 유닛의 수는 1차 주입과 동일하였고, 이는 dAb가 비경쟁적 에피토프에 결합함을 나타낸다.
도 15. DOM1h-574-16 및 MAB225(R&D Systems)에 대한 BIAcore에 의한 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 인간 TNFR1으로 코팅하였다. 이러한 표면의 도처에, DOM1h-574-16을 주입하고, 결합을 정량화하였다. 재생(미도시) 후에, MAB225를 주입하고, 이어서 다시 DOM1h-574-16을 주입하였다. DOM1h-574-16에 대한 결합 수준은 MAB225의 부재 하에서 관찰되는 것과 매우 유사하며, 이는 결합 에피토프가 MAB225와 비-경쟁적임을 나타낸다.
도 16. DOM1h-574-16 및 mAb 클론 4.12에 대한 BIAcore에 의한 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 인간 TNFR1으로 코팅하였다. 표면의 도처에, 클론 4.12(Invitrogen, Zymed)를 주입하고, 결합을 정량화하였다. 재생(미도시) 후에, DOM1h-574-16을 주입하고, 이어서 다시 클론 4.12를 주입하였다. 클론 4.12의 2차 주입에 대하여 관찰되는 결합 수준은 DOM1h-574-16의 부재 하에 관찰되는 수준보다 약 20% 미만이다. 이러한 결과는 인간 TNFR1 상의 결합 에피토프에 대한 제한된 경쟁을 나타낸다. DOM1h-574-16 및 클론 4.12는 약간 중첩하는 에피토프를 가질 수 있다. 주입 직전 및 직후의 RU 신호의 급변화는 완충액 급변화이며, 이를 감산하지 않는다.
도 17. DOM1h-574-16 및 DOM1h-510에 대한 BIAcore에 의한 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 인간 TNFR1으로 코팅하였다. 표면의 도처에, DOM1h-510을 주입하고, 결합을 정량화하였다. 이어서, DOM1h-574-16을 주입하고, 이어서 다시 DOM1h-510을 주입하였다. 명백하게 DOM1h-510의 2차 주입은 훨씬 덜한 결합을 나타내었으며, 이는 경쟁적 에피토프가 DOM1h-510에 결합되어 있음을 나타낸다.
도 18. DOM1h-574-16 및 DOM1m-21-23에 대한 BIAcore에 의한 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩을 비오티닐화된 마우스 TNFR1으로 코팅하였다. 표면의 도처에, DOM1h-574-16을 주입하고, 결합을 정량화하였다. 이어서, DOM1m-21-23을 주입하고, 이어서 다시 DOM1h-574-16을 주입하였다. 2차 주입 후의 DOM1h-574-16의 결합 RU의 수는 DOM1m-21-23의 부재 하에 관찰되는 것과 매우 유사하였다. 이는 DOM1m-21-23 및 DOM1h-574-16이 마우스 TNFR1 상에 상이한 결합 에피토프를 가짐을 나타낼 것이다.
도 19. BIAcore에 의한 TNFR1의 선형 펩티드 단편에 대한 DOM1h-574-16의 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩의 4개의 채널을 4가지의 비오티닐화된 펩티드 중 하나로 각각 코팅하였다. 펩티드는 1) 포르테바이오(ForteBio) 상에서 결합을 나타내지 않으며, 음성 대조군으로 소용되는 인간 TNFR1의 펩티드 단편, A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC), 2) 도메인-1 펩티드 D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY), 3) 도메인-3 펩티드 D5(SGSGCRKNQYRHYWSENLF) 및 4) 중첩 도메인-3 펩티드 E5(SGSGNQYRHYWSENLFQCF)였다. DOM1h-574-16(2.5 μM)을 모든 4가지 펩티드 위에서 흐르게 하고, 결합량을 결정하였다. 대조군 펩티드 A3에서는 DOM1h-574-16의 결합이 관찰되지 않았으나, dAb가 다른 3가지 펩티드에는 결합하였다. 도면에서, 상이한 펩티드에 상응하는 추적을 펩티드 식별자로 나타낸다.
도 20. BIAcore에 의한 TNFR1의 4가지 선형 펩티드 단편에 대한 DOM1m-21-23의 결합 평가. BIAcore SA 칩의 4개의 채널을 4가지의 비오티닐화된 펩티드 중 하나로 각각 코팅하였다. 펩티드는 1) 포르테바이오 상에서 DOM1h-574-16으로의 결합을 나타내지 않으며, 음성 대조군으로 소용되는 인간 TNFR1의 펩티드 단편, A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC), 2) 도메인-1 펩티드 D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY), 3) 도메인-3 펩티드 D5(SGSGCRKNQYRHYWSENLF) 및 4) 중첩 도메인-3 펩티드 E5(SGSGNQYRHYWSENLFQCF)였다. 또한, DOM1m-21-23이 이들 펩티드에 결합하는지 확증하기 위하여, DOM1m-21-23(2.5 μM)을 모든 4가지 펩티드 위에 주입하였다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, DOM1m-21-23은 4가지 펩티드 중 어떤 것으로의 결합도 나타내지 않았다. 곡선은 서로 중첩된다.
도 21. BIAcore에 의한 TNFR1의 선형 펩티드 단편에 대한 DOM1h-131-511의 에피토프 맵핑. BIAcore SA 칩의 4개의 채널을 4가지의 비오티닐화된 펩티드 중 하나로 각각 코팅하였다. 펩티드는 1) 포르테바이오 상에서 DOM1h-574-16으로의 결합을 나타내지 않으며, 음성 대조군으로 소용되는 인간 TNFR1의 펩티드 단편, A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC), 2) 도메인-1 펩티드 D2(SGSGNSICCTKCHKGTYLY), 3) 도메인-3 펩티드 D5(SGSGCRKNQYRHYWSENLF) 및 4) 중첩 도메인-3 펩티드 E5(SGSGNQYRHYWSENLFQCF)였다. DOM1h-131-511(2.5 μM)을 모든 4가지 펩티드 위에 흐르게 하고, 결합량을 결정하였다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, DOM1h-131-511은 4가지 펩티드 중 어떤 것으로의 결합도 나타내지 않았다. 곡선은 거의 중첩되며, 화살표와 해당하는 펩티드 번호로 나타낸다.
도 22. 마우스 혈청 알부민(MSA)에 대한 DOMO100-AlbudAb 인-라인 융합의 결합에 대한 BIAcore 분석. MSA(Sigma-Aldrich)를 제조처의 지시에 따라 EDC/NHS 화학물질을 사용하여 BIAcore CM5 칩 상에 코팅하였다. 이어서, 각각 N-말단에서 C-말단으로 항-TNFR1 dAb - 링커 - AlbudAb로 이루어지고 표 6에서 확인된 DMS 작제물을 MSA 표면 위에 1 μM로 주입하고, 결합을 모니터링하였다. BIAcore 추적으로부터 알 수 있는 바와 같이, DMSO192 및 DMSO188은 최적의 전반적인 동역학을 가졌으나, DMSO182 및 DMSO184는 MSA에 대한 가장 약한 결합제였다. 각각의 DMS 클론에 대한 상응하는 BIAcore 추적을 화살표로 나타낸다.
도 23. 인간 혈청 알부민(HSA)으로의 DOMO100-AlbudAb 인-라인 융합의 결합에 대한 BIAcore 분석. MSA(Sigma-Aldrich)를 제조처의 지시에 따라 EDC/NHS 화학물질을 사용하여 BIAcore CM5 칩 상에 코팅하였다. 이어서, 각각 N-말단에서 C-말단으로 항-TNFR1 dAb - 링커 - AlbudAb로 이루어지고 표 6에서 확인된 DMS 작제물을 HSA 표면 위에 1 μM로 주입하고, 결합을 모니터링하였다. BIAcore 추적으로부터 알 수 있는 바와 같이, DMS0189 및 DMS0190은 최적의 전반적인 동역학을 가졌으나, 도면에 나타낸 다른 DMS 클론(DMSO182, DMSO184, DMSO186 및 DMSO188)은 매우 유사하였고, HSA에 대한 그들의 친화성이 상당히 더 약했다. 각각의 DMS 클론에 대한 상응하는 BIAcore 추적을 화살표로 나타낸다.
도 24. 마우스에서 DOMO100-AlbudAb 융합의 PK. 마우스에 DMS0168(2.5 mg/kg, 정맥내), DMS0169(2.5 mg/kg, 정맥내) 또는 DMS0182(10 mg/kg, 복강내)를 투여하였다. 각 시간(0.17, 1, 4, 12, 24, 48 및 96시간)에, 3 마리의 마우스를 희생시키고, 그들의 혈청을 각각의 DOMO1OO-AlbudAb 융합 수준에 대하여 분석하였다. 각각의 DOMO1OO-AlbudAb 융합의 평균량을 각 시간에 결정하고, 시간에 대하여 작도하였다, DMSO168(회색 파선), DMSO182(검정색 점선) 및 DMS0169(검정색 실선) (상응하는 선을 또한 화살표로 나타낸다). 윈논린(WinNonLin) 분석 패키지(예를 들어, 버전 5.1(Pharsight Corp.(Mountain View, CA94040, USA)으로부터 입수가능))의 비-구획 분석(non-compartmental analysis, NCA)을 사용하여, 분자 각각에 대한 최종 반감기를 결정하였다. DMSO182는 5.9시간의 최종 반감기를 가졌으며, DMSO168은 15.4시간이었고, DMSO169는 17.8시간이었다. 복강내 투여 때문에, DMSO182에 대한 곡선은 DMS0168 및 DMS0169에 대해 관찰된 형상과 상이한 형상을 갖는다(나타낸 곡선은 BIAcore에 의한 것임).
도 25. 염수 및 DMS0169 처리 동안 Tg197/hp55 KI 마우스에 대한 관절염 점수. 본 연구에 사용된 트랜스제닉 마우스 스트레인(strain)은 Tg 197(인간 TNFα를 과발현) 및 hp55(p55로도 알려져 있는 인간 TNFR1의 낙-인(knock-in))의 교잡종이며, 여기에서 자발적으로 관절염이 발생한다. 6주 내지 15주에, 각 그룹에서 12 마리의 마우스를 주 2회 10 mg/kg의 DMS0169 또는 염수로 처리하였다. 각 주에, 마우스마다 2개의 뒷 관절에 대하여 관절염 점수를 결정하고, 12 마리의 마우스에 걸친 평균 관절염 점수 및 평균의 표준 오차를 시간으로 작도하였다. 명백하게, DMSO169로 처리한 동물에서 관절염이 덜 발생한다.
도 26. 염수 및 DMS0169 처리 동안 Tg197/hp55 KI 마우스의 체중. 본 연구에 사용된 트랜스제닉 마우스 스트레인은 Tg 197(인간 TNFα를 과발현) 및 hp55(p55로도 알려져 있는 인간 TNFR1의 낙-인)의 교잡종이며, 여기에서 자발적으로 관절염이 발생한다. 6주 내지 15주에, 각 그룹에서 12 마리의 마우스를 주 2회 10 mg/kg의 DMS0169 또는 염수 중 어느 하나로 처리하였다. 각 주에, 마우스를 칭량하고, 평균의 표준 오차를 나타내는 에러바(error bar)와 함께 평균 데이터를 작도하였다. 도면으로부터 DMSO169에 대한 경향이 염수 처리 동물에 비해 더 많은 것이 명백하나, 통계적으로 유의미하지 않다.
도 27. 염수 및 DMS0169 처리 15주 후에 Tg197/hp55 KI 마우스에 대한 조직학 및 관절염 점수. 본 연구에 사용된 트랜스제닉 마우스 스트레인은 Tg 197(인간 TNFα를 과발현) 및 hp55(p55로도 알려져 있는 인간 TNFR1의 낙-인)의 교잡종이며, 여기에서 자발적으로 관절염이 발생한다. 6주 내지 15주에, 각 그룹에서 12 마리의 마우스를 주 2회 10 mg/kg의 DMS0169 또는 염수 중 어느 하나로 처리하였다. 15주에, 마우스를 희생시키고, 관절에서 관절염 점수(검정색 막대) 및 조직학(빈 막대) 둘 모두를 점수화하였다(Keffer et al.. EMBO. J. 10, p4025 (1991)). 12 마리의 동물로 이루어진 각 그룹 및 표준 오차를 계산하였다. 처리군 간의 차이는 통계적으로 유의미한 것으로 나타난다(p<0.001).
발명의 상세한 설명
본 명세서 내에서, 본 발명은 명확하고 정확한 명세서가 기재될 수 있도록 하는 방식으로, 실시형태를 참조하여 기재되었다. 상기 실시형태는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양하게 조합되고 분리될 수 있도록 의도되며 그럴 수 있음이 이해되어야 한다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 해당 분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기법 및 생화학 분야)의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법은 분자적, 유전학적 및 생화학적 방법(일반적으로, 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.] 및 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.]을 참조)과 화학적 방법에 사용된다.
본 명세서에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)은 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. CDR 및 프레임워크(FR) 영역의 위치 및 넘버링 시스템은 카바트 등에 의해 정의되었다(문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)]). 본 명세서에 기재된 VH 및 VL(Vκ) dAb의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)의 아미노산 서열은 잘 알려져 있는 카바트 아미노산 넘버링 시스템 및 CDR의 정의에 기초하여, 해당 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 카바트 넘버링 시스템에 따라, 중쇄 CDR-H3은 다양한 길이를 가지며, 잔기 H1OO과 H101 사이의 삽입을 K까지의 문자로 넘버링한다(즉, H100, H100A ... H100K, H101). 다르게는, CDR은 다음과 같은 AbM에 따라, 또는 접촉 방법에 따라, 초티아 시스템을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342 (6252), p877-883]). CDR을 결정하는 적합한 방법에 대해서는 http://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조하길 바란다.
일단 각각의 잔기가 넘버링되면, 하기의 CDR 정의를 적용할 수 있다("-"는 카바트 넘버링에 대해 나타낸 바와 동일한 잔기 번호를 의미한다):
카바트-서열 가변성에 기초하여 가장 통상적으로 사용되는 방법
(카바트 넘버링 사용)
CDR H1: 31-35/35A/35B
CDR H2: 50-65
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
초티아: 구조적 루프 영역의 위치에 기초
(초티아 넘버링 사용)
CDR H1: 26-32
CDR H2: 52-56
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
AbM: 카바트와 초티아 간의 절충
(카바트 넘버링 사용): (초티아 넘버링 사용):
CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35
CDR H2: 50-58 -
CDR H3: 95-102 -
CDR L1: 24-34 -
CDR L2: 50-56 -
CDR L3: 89-97 -
접촉: 결정 구조 및 항원과의 접촉 잔기의 예측에 기초
(카바트 넘버링 사용): (초티아 넘버링 사용):
CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35
CDR H2: 47-58 -
CDR H3: 93-101 -
CDR L1: 30-36 -
CDR L2: 46-55 -
CDR L3: 89-96 -
본 명세서에서 사용되는 용어 "종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1)의 길항제" 또는 "항-TNFR1 길항제" 등은 TNFR1에 결합하고, TNFR1의 하나의(즉, 하나 이상의) 기능을 억제할 수 있는 물질(예를 들어, 분자, 화합물)을 지칭한다. 예를 들어, TNFR1의 길항제는 TNFα의 TNFR1으로의 결합을 억제하고/거나 TNFR1을 통해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있다. 따라서, TNFR1-매개의 과정 및 세포 반응(예를 들어, 표준 L929 세포독성 검정에서의 TNFα-유도된 세포사)은 TNFR1의 길항제를 사용하여 억제될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 약 2개 내지 약 50개의 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 약 50개 이상의 아미노산을 지칭한다. 폴리펩티드는 일반적으로 3차 구조를 포함하며 기능성 도메인으로 폴딩된다.
본 명세서에 사용되는 "프로테아제 분해에 대해 내성인" 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 도메인 항체(dAb))는 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 프로테아제 활성에 적합한 온도, 예를 들어 37 ℃ 또는 50 ℃에서 약 1시간 동안 프로테아제와 함께 인큐베이션된 후에, 단백질의 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하가 프로테아제에 의해 분해되거나 단백질이 실질적으로 프로테아제에 의해 분해되지 않는 경우에, 폴리펩티드(예를 들어, dAb)는 실질적으로 분해되지 않는다. 단백질 분해는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능 검정(예를 들어, 리간드 결합)에 의해 평가할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "디스플레이 시스템"은 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합체(collection)가 원하는 특징, 예컨대, 물리적, 화학적 또는 기능적 특징에 기초한 선택을 위해 접근가능한 시스템을 의미한다. 디스플레이 시스템은 (예를 들어, 용액 중의, 적합한 지지체에 고정된) 폴리펩티드 또는 펩티드의 적합한 레퍼토리일 수 있다. 디스플레이 시스템은 또한 세포 발현 시스템(예를 들어, 형질변환되거나, 감염되거나, 트랜스펙션되거나 형질도입된 세포내에서 핵산 라이브러리의 발현 및 세포의 표면상에서 엔코딩된 폴리펩티드의 디스플레이) 또는 무세포 발현 시스템(예를 들어, 에멀젼 구획화 및 디스플레이)을 이용하는 시스템일 수 있다. 예시적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결시킨다. 이와 같은 디스플레이 시스템이 이용되는 경우, 원하는 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 지니는 폴리펩티드 또는 펩티드가 선택될 수 있고, 선택된 폴리펩티드 또는 펩티드를 엔코딩하는 핵산은 용이하게 분리되거나 회수될 수 있다. 핵산의 코딩 기능과 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결시키는 다수의 디스플레이 시스템이 해당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이(파지 디스플레이, 예를 들어, 파지미드 디스플레이), 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 공유결합성 디스플레이 등이 있다(예를 들어, 제EP 0436597호(Dyax), 미국 특허 제6,172,197호(McCafferty 등), 미국 특허 제6,489,103호(Griffiths 등)를 참조).
본 명세서에서 사용되는 "레퍼토리"는 아미노산 서열 다양성을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합체를 지칭한다. 레퍼토리의 개별 구성원은 공통의 특징, 예를 들어, 공통의 구조적 특징(예를 들어, 공통의 코어 구조) 및/또는 공통의 기능적 특징(예를 들어, 공통의 리간드(예를 들어, 제네릭(generic) 리간드 또는 표적 리간드, TNFR1)에 결합하는 능력)을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "기능적"은 생물학적 활성, 예컨대, 특정 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드를 기술한다. 예를 들어, 용어 "기능적 폴리펩티드"는 항원 결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "제네릭 리간드"는 제공된 레퍼토리의 기능적 구성원의 상당한 부분(예를 들어, 실질적으로 모든 부분)에 결합하는 리간드를 지칭한다. 제네릭 리간드(예를 들어, 공통의 제네릭 리간드)는 제공된 레퍼토리의 많은 구성원에 결합할 수 있는데, 상기 구성원이 공통의 표적 리간드에 대해 결합 특이성을 갖지 않더라도 상기 구성원에 결합할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 상의 기능적 제네릭 리간드 결합 부위의 존재(제네릭 리간드에 결합하는 능력에 의해 나타남)는 폴리펩티드가 정확하게 폴딩되었고 기능성임을 나타낸다. 제네릭 리간드의 적합한 예는 초항원(superantigen), 레퍼토리의 기능적 구성원의 상당한 부분에서 발현되는 에피토프에 결합하는 항체 등을 포함한다.
"초항원"은 이들 단백질의 표적 리간드 결합 부위와 다른 부위에서 면역글로불린 상과의 구성원과 상호작용하는 제네릭 리간드를 지칭하는 해당 분야의 용어이다. 포도구균 장독소가 T 세포 수용체와 상호작용하는 초항원의 예이다. 항체에 결합하는 초항원은 IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G(문헌[Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)]); IgG 불변 영역 및 VH 도메인에 결합하는 단백질 A(문헌[Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)]); 및 VL 도메인에 결합하는 단백질 L(문헌[Bjorck, J. Immunol, 140:1194 (1988)])을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "표적 리간드"는 폴리펩티드 또는 펩티드가 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 리간드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 경우, 표적 리간드는 임의의 요망되는 항원 또는 에피토프일 수 있다. 표적 항원으로의 결합은 기능성인 폴리펩티드 또는 펩티드에 좌우된다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"는 항체를 천연적으로 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되었는지의 여부에 상관없이; 또한 혈청, B-세포, 하이브리도마, 이입세포(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리되었는지의 여부에 상관없이, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 닫힌 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody))을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 포맷"은 하나 이상의 항체 가변 도메인이 항원에 대한 결합 특이성을 구조에 부여하도록 통합될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화된 VHH의 공유 결합에 의해 변형됨)와 같은 다양한 적합한 항체 포맷이 해당 분야에 공지되어 있다.
어구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다량체 또는 이종다량체)으로 존재할 수 있고, 여기서 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일 실시형태에서 인간 항체 가변 도메인이나, 이는 또한 설치류(예를 들어, 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는 WO 00/29004호에 기재된 것과 같은), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. VHH는 인간화될 수 있다.
"도메인"은 단백질의 나머지와는 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특징을 책임지며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 전달될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 절두형(truncated) 항체 가변 도메인, 또는 N-말단 신장 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
용어 "라이브러리"는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 지칭한다. 라이브러리는 구성원들로 구성되고, 이들 구성원 각각은 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는다. 본 명세서에서, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 구성원 간의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성의 원인이다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 각각의 개별 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 한정된 수의 라이브러리 구성원을 함유한다. 일 실시형태에서, 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 핵산은 발현 벡터로 통합된다. 따라서, 일 태양에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 이러한 각각의 유기체는 핵산의 해당 폴리펩티드 구성원을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 구성원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 큰 레퍼토리의 다양한 폴리펩티드를 엔코딩하는 능력을 갖는다.
"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 카바트(문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services])에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역에 상응하거나 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 정의된 인간 생식계 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열이다. 라이브러리 및 레퍼토리는 단독의 과변이 영역에서의 변이를 통하여 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 이러한 프레임워크의 세트를 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "용량"은 한번에 모두(단위 용량), 또는 규정된 시간 간격에 걸쳐 2회 이상의 투여로 대상체에게 투여되는 리간드의 양을 지칭한다. 예를 들어, 용량은 1일(24시간)(매일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주, 또는 1개월 이상의 기간에 걸쳐(예컨대, 단일 투여, 또는 2회 이상의 투여로) 대상체에게 투여되는 리간드(예컨대, 표적 항원에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 지칭할 수 있다. 투여 간의 간격은 임의의 요망되는 기간일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유체역학적 크기"는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 명백한 크기를 지칭한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 운동은 단백질의 명백한 크기를 유도하도록 처리될 수 있고, 여기서 상기 크기는 단백질 입자의 "스톡스 반경(Stokes radius)" 또는 "유체역학 반경"으로 제공된다. 단백질의 "유체역학적 크기"는 질량 및 형상(형태) 둘 모두에 좌우되어, 동일한 분자 질량을 갖는 2개의 단백질이 단백질의 종합적인 형태에 기초하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "경쟁하다"는 동족체 표적 결합 도메인에 대한 제1 표적의 결합이 동족체 표적에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 존재하에서 억제되는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합 도메인의 물리적 차단, 또는 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체구조적으로 결합이 억제되어, 표적에 대한 친화성 또는 결합력이 감소될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인 간의 경쟁을 결정하기 위한 경쟁 ELISA 및 경쟁 BiaCore 실험을 수행하기 위한 방법의 상세사항은 WO2006038027호를 참조하길 바란다.
두 서열 간에 "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"(상기 용어는 본 명세서에서 상호 교환하여 사용된다)의 계산은 하기와 같이 실시된다. 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다(예컨대, 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교를 목적으로 무시할 수 있다). 일 실시형태에서, 비교를 목적으로 정렬한 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 30% 이상, 임의로 40% 이상, 임의로 50% 이상, 임의로 60% 이상 및 임의로 70%, 80%, 90% 이상, 또는 100%일 수 있다. 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 한 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 채워져 있는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다). 2개 서열 간에 동일성 퍼센트는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어질 필요가 있는 각 갭의 길이, 갭의 수를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 명세서에서 정의된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 알고리듬 BLAST 2 서열을 이용하고 디폴트 파라미터를 이용하여 작성되고 결정될 수 있다(문헌[Tatusova, T. A. et al ., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188(1999)]).
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162, DOM1h-574-180, DOM1h-574-7, DOM1h-574-8, DOM1h-574-10, DOM1h-574-12, DOM1h-574-13, DOM1h-574-14, DOM1h-574-15, DOM1h-574-16, DOM1h-574-17, DOM1h-574-18 또는 DOM1h-574-19이다. 일 실시형태에서, 이러한 태양에 따른 가변 도메인은 본 발명의 다른 태양 중 임의의 것의 하나 이상의 특징을 가질 수 있으며, 본 명세서의 개시내용은 예를 들어 본 명세서에서 청구범위 내의 포함을 위해 이들 특징이 합해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-510, DOM1h-543 또는 DOM1h-549의 아미노산 서열과 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 DOM1h-510, DOM1h-543 또는 DOM1h-549이다. 일 실시형태에서, 이러한 태양에 따른 가변 도메인은 본 발명의 다른 태양 중 임의의 것의 하나 이상의 특징을 가질 수 있으며, 본 명세서의 개시내용은 예를 들어 본 명세서에서 청구범위 내의 포함을 위해 이들 특징이 합해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 태양에서, 단일 가변 도메인이 하기의 돌연변이(카바트 넘버링에 따른 넘버링) 중 하나 이상을 포함하는 DOM1h-574-14의 돌연변이체인 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다:
위치 30은 L 또는 F,
위치 52는 A 또는 T,
위치 52a는 D 또는 E,
위치 54는 A 또는 R,
위치 57은 R, K 또는 A,
위치 60은 D, S, T 또는 K,
위치 61은 E, H 또는 G,
위치 62는 A 또는 T,
위치 100은 R, G, N, K, Q, V, A, D, S 또는 V,
위치 101은 A, Q, N, E, V, H 또는 K.
이러한 태양의 일 실시형태에서, 돌연변이체 아미노산 서열은 DOM1h-574의 아미노산 서열과 98 또는 99% 이상 동일하다. 일 실시형태에서, 돌연변이체 아미노산 서열은 DOM1h-574-14의 아미노산 서열과 동일하거나, 98 또는 99% 이상 동일하다. 일 실시형태에서, 이러한 태양에 따른 가변 도메인은 본 발명의 다른 태양 중 임의의 것의 하나 이상의 특징을 가질 수 있으며, 본 명세서의 개시내용은 예를 들어 본 명세서에서 청구범위 내의 포함을 위해 이들 특징이 합해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 태양에서, 본 발명은 위치 101(카바트 넘버링에 따른 넘버링)에 발린을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 중쇄 단일 가변 도메인을 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도 V101이 종종 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1) 결합에 대한 높은 KD와 관련이 있음을 발견하였다. 일 실시형태에서, 이러한 태양에 따른 가변 도메인은 본 발명의 다른 태양 중 임의의 것의 하나 이상의 특징을 가질 수 있으며, 본 명세서의 개시내용은 예를 들어 본 명세서에서 청구범위 내의 포함을 위해 이들 특징이 합해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 태양에서, 본 발명은 위치 101(카바트 넘버링에 따른 넘버링)에 발린을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 중쇄 단일 가변 도메인을 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도 V101이 종종 단백질 가수분해 안정성과 관련이 있음을 관찰하였다. 단백질 가수분해 안정성 및 단백질 가수분해에 안정한 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 더욱 상세한 사항은 WO2008149144호 및 WO2008149148호에서 찾을 수 있으며, 이들 개시물은 특히 가변 도메인 및 다른 항-TNFR1 리간드, 길항제 및 결합 도메인의 프로테아제 안정성을 결정하기 위한 시험을 제공하기 위하여, 그들 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 일 실시형태에서, 이러한 태양에 따른 가변 도메인은 본 발명의 다른 태양 중 임의의 것의 하나 이상의 특징을 가질 수 있으며, 본 명세서의 개시내용은 예를 들어 본 명세서에서 청구범위 내의 포함을 위해 이들 특징이 합해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 실시형태에서, 임의의 태양에 따른 단일 가변 도메인은 3OG, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 55D, 56R, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 45P, 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 3OG, 44D, 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다.
일 태양에서, 본 발명은 3OG, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R 중 하나 이상을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따르고, 여기서 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 다르게는 DOM1h-574의 아미노산 서열과 동일하다. 일 실시형태에서, 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 가변 도메인이 제공된다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 55D, 56R, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 45P, 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 30G, 44D, 55D, 94I 및 98R을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-156, DOM1h-574-109, DOM1h-574-132, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 동일하거나 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 세포 검정에서, 예를 들어, 표준 MRC5 검정에서 TNF 알파-유도된 IL-8 분비로 결정시; 또는 표준 L929 검정에서 TNF 알파-유도된 세포독성의 억제로 결정시; 표준 사이노몰구스 KI 검정에서 TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시, TNFR1(예를 들어, 하나 이상의 인간 TNFR1)의 강력한 중화제인 가변 도메인을 제공한다. TNFR1 길항제에 대한 표준 검정의 상세사항은 해당 분야에, 예를 들어, WO2006038027호, WO2008149144호 및 WO2008149148호에 공지되어 있다. 또한, 상세사항이 하기 실험 부분에 제공된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 DOM1h-574를 제외하고 하기 표 11에 나타낸 DOM1h 가변 도메인 중 임의의 것의 아미노산 서열과 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 DOM1h-574-89 내지 DOM1h-574-179 중 임의의 것의 아미노산 서열과 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-109, DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137 또는 DOM1h-574-160의 아미노산 서열과 동일하거나, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 단백질 가수분해에 안정한 가변 도메인을 제공한다. 프로테아제 안정성에 대해서는 상기 고찰을 참조한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-133, DOM1h-574-135 또는 DOM1h-574-138, DOM1h-574-139, DOM1h-574-155, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 아미노산 서열과 동일하거나, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 이러한 태양은 인간 TNFR1에 높은 친화성으로 결합하고 임의로 또한 뮤린 TNFR1에 대하여도 요망되는 친화성을 나타내는 가변 도메인을 제공한다.
단일 가변 도메인은 예를 들어, TNFR1의 비경쟁적 억제제이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 태양의 항-TNFR1 단일 가변 도메인은 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1)에 결합하나, (예를 들어, 표준 수용체 결합 검정에서) TNFR1으로의 결합을 위해 TNF 알파와 경쟁하거나 이를 억제하지 않는다(또는 실질적으로 경쟁하거나 이를 억제하지 않는다). 이러한 실시형태에서, 일 예에서, 가변 도메인은 TNFR1, 예를 들어 인간 TNFR1의 도메인 1에 특이적으로 결합한다. 이러한 실시형태에서, 일 예에서, 가변 도메인은 TNFR1, 예를 들어 인간 TNFR1의 PLAD에 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 태양의 항-TNFR1 단일 가변 도메인은
(i) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 50O pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 인간 TNFR1에 특이적으로 결합하거나;
(ii) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 50O pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 비-인간 영장류 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스(rhesus) 또는 비비(baboon) TNFR1)에 특이적으로 결합하거나;
(iii) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1nM 이하의 해리 상수(KD)로 뮤린(murine) TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다. 일 예에서, 가변 도메인은 (i) 및 (ii); (i) 및 (iii); (i), (ii) 및 (iii), 또는 (ii) 및 (iii)에 따라 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 태양의 단일 가변 도메인은
(a) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 2 x 10-4 S-1 이하, 또는 1 x 10-4 S-1 이하, 또는 1 x 10-5 S-1 이하의 오프-레이트(off-rate) 상수(Koff)로 인간 TNFR1에 특이적으로 결합하거나;
(b) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 2 x 10-4 S-1 이하, 1 x 10-4 S-1 이하, 또는 1 x 10-5 S-1 이하의 오프-레이트 상수(Koff)로 비-인간 영장류 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 TNFR1)에 특이적으로 결합하거나; 또는
(c) 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 1 x 10-3 S-1 이하, 또는 1 x 10-4 S-1 이하의 오프-레이트 상수(Koff)로 뮤린 TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다. 일 예에서, 가변 도메인은 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a), (b) 및 (c), 또는 (b) 및 (c)에 따라 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 태양의 단일 가변 도메인은
(a') 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 5 x 104 M-1S-1 이상, 1 x 105 M-1S-1 이상, 2 x 105 M-1S-1 이상, 3 x 105 M-1S-1 이상, 4 x 105 M-1S-1 이상, 또는 5 x 105 M-1S-1 이상의 온-레이트(on-rate) 상수(Kon)로 인간 TNFR1에 특이적으로 결합하거나;
(b') 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 5 x 104 M-1S-1 이상, 1 x 105 M-1S-1 이상, 2 x 105 M-1S-1 이상, 3 x 105 M-1S-1 이상, 4 x 105 M-1S-1 이상, 또는 5 x 105 M-1S-1 이상의 온-레이트 상수(Kon)로 비-인간 영장류 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 TNFR1)에 특이적으로 결합하거나; 또는
(c') 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 0.5 x 105 M-1S-1 이상, 1 x 105 M-1S-1 이상, 또는 2 x 105 M-1S-1 이상의 온-레이트 상수(Kon)로 뮤린 TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다. 일 예에서, 가변 도메인은 (a') 및 (b'); (a') 및 (c'); (a'), (b') 및 (c'), 또는 (b') 및 (c')에 따라 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 태양의 단일 가변 도메인은 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1에 특이적으로 결합한다. 특이적인 결합은 10 마이크로몰 이하, 임의로 1 마이크로몰 이하의 해리 상수 KD로 표시된다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 에피토프로의 특이적인 결합은 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 이를 테면 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 효소 면역측정법, 이를 테면 ELISA 및 샌드위치 경쟁 검정 및 이의 상이한 변형을 비롯한 적합한 검정에 의해 결정될 수 있다. 일 예에서, 가변 도메인은 또한 뮤린 TNFR1에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 예를 들어, 표준 세포 분석(예를 들어, 본 명세서 또는 WO2006038027호, WO2008149144호 또는 WO2008149148호에 기재된)에서 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1의 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180으로의 결합을 억제한다. 본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 예를 들어, 표준 수용체 결합 검정(예를 들어, 본 명세서 또는 WO2006038027호, WO2008149144호 또는 WO2008149148호에 기재된)에서 인간, 뮤린, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1의 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180으로의 결합을 억제한다. 일 예에서, 이러한 실시형태에서의 "억제하다"는 완전(100% 억제) 또는 실질적(90%, 95%, 98%, 또는 99% 이상)일 수 있는 억제이다.
본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 항-TNFR1 단일 가변 도메인, 길항제, 리간드 또는 폴리펩티드는 표준 MRC5 검정에서 TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시, (약) 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하의 ND50으로 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1)을 중화시킨다.
본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 항-TNFR1 단일 가변 도메인, 길항제, 리간드 또는 폴리펩티드는 표준 L929 검정에서 TNF 알파-유도된 세포독성의 억제로 결정시, 150, 100, 50, 40, 30 또는 20 nM 이하; 또는 (약) 150 내지 10 nM; 또는 (약) 150 내지 20 nM; 또는 (약) 110 내지 10 nM; 또는 (약) 110 내지 20 nM의 ND50으로 TNFR1(예를 들어, 뮤린 TNFR1)을 중화시킨다.
본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 항-TNFR1 단일 가변 도메인, 길항제, 리간드 또는 폴리펩티드는 표준 사이노몰구스 KI 검정에서 TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하; 또는 (약) 5 내지 (약) 1 nM의 ND50으로 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이 TNFR1)을 중화시킨다.
본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 말단, 임의로 C-말단의 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 예를 들어 말레이미드 결합을 사용하여 PEG를 가변 도메인에 부착하는데 사용될 수 있다(참조예 WO04081026호). 본 발명의 임의의 태양의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 폴리알킬렌 글리콜 부분, 임의로 폴리에틸렌 글리콜 부분에 연결된다. 적합한 PEG 부분 및 컨쥬게이션(conjugation) 방법 및 시험에 대해서는 WO04081026호를 참조하길 바란다. 이들 개시물은 예를 들어 하기 첨구범위에 포함될 특정 PEG의 개시물을 제공하기 위하여 본 명세서에 포함된다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 선택된 아미노산 서열과 25, 20, 15, 10 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서 다르며, 선택된 아미노산 서열의 CDR1 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98 % 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 선택된 아미노산 서열과 25, 20, 15, 10 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서 다르며, 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR2 서열을 포함한다.
부가적으로, 또는 다르게는, 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함한다. 부가적으로, 또는 다르게는, 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 선택된 아미노산 서열의 CDR1 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 선택된 아미노산 서열과 25, 20, 15, 10 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서 다르며, 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 단일 가변 도메인은
(i) 37 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 10㎍/㎖ 이상의 농도(c)의 프로테아제; 또는
(ii) 30 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 40㎍/㎖ 이상의 농도(c')의 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 대해 내성이며, 여기서 가변 도메인은 DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-133의 아미노산 서열과 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 임의로 위치 101(카바트 넘버링)에서 발린을 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명은 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 단일 가변 도메인은
(i) 37 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 10㎍/㎖ 이상의 농도(c)의 프로테아제; 또는
(ii) 30 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 40㎍/㎖ 이상의 농도(c')의 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 대해 내성이며, 여기서 가변 도메인은 DOM1h-574, DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137 또는 DOM1h-574-160의 아미노산 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 임의로 위치 101(카바트 넘버링)에서 발린을 포함한다.
이들 태양의 일 실시형태에서, 프로테아제 내성 항-TNFR1 가변 도메인은 비경쟁적 가변 도메인이다(즉, 이는 TNF 알파의 TNFR1으로의 결합을 (실질적으로) 억제하지 않는다). 비경쟁적 가변 도메인에 대해서는 상기 고찰을 참조하길 바라며, 이는 또한 이들 실시형태에 적용된다.
이들 태양의 일 실시형태에서, 농도(c 또는 c')는 100 또는 1000 ㎍/㎖ 이상의 프로테아제이다. 일 실시형태에서, 시간(t)은 1시간, 3시간 또는 24시간 또는 하룻밤이다. 일 예에서, 가변 도메인은 조건 (i) 하에서 내성이며, 농도(c)는 10 또는 100 ㎍/㎖의 프로테아제이며, 시간(t)은 1시간이다. 일 예에서, 가변 도메인은 조건 (ii) 하에서 내성이며, 농도(c')는 40 ㎍/㎖의 프로테아제이며, 시간(t)은 3시간이다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타제, 류코자임 및 판크레아틴으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 트립신이다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 트립신, 및 엘라스타제, 류코자임 및 판크레아틴으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 프로테아제에 대해 내성이다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii) 하에서의 인큐베이션 후에 TNFR1에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii) 하에서의 인큐베이션 후에 ELISA에서의 OD450 판독치가 0.404 이상이다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii) 하에서의 인큐베이션 후에 단백질 A 또는 단백질 L에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 조건 (i) 또는 (ii) 하에서의 인큐베이션 후에 겔 전기영동에서 실질적으로 단일의 밴드를 나타낸다. 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 Tm이 50 ℃ 이상이다. 프로테아제 내성에 관한 더 상세한 사항은 WO2008149144호 및 WO2008149148호에서 찾을 수 있다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 이펙터 그룹(effector group) 또는 항체 불변 도메인, 임의로 항체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 임의로, 여기서 Fc의 N-말단은 가변 도메인의 C-말단에 연결(임의로 직접 연결)된다. WO04058820호에 기재된 임의의 "이펙터 그룹"은 본 발명의 이러한 태양에 사용될 수 있으며, WO04058820호에서의 이펙터 그룹의 설명 및 이 문헌에 기재된 이들을 가변 도메인으로 연결시키는 방법은 예를 들어, 본 명세서에서 청구범위에 사용될 수 있는 본 명세서의 설명을 제공하기 위하여 본 명세서에 명시적으로 참고로 포함된다. 일 실시형태에서, 폴리펩티드는 DOM1h-574-16 또는 DOM1h-574-72의 Fc 융합을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 임의로 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항-TNFR1 단일 가변 도메인의 항-SA 단일 가변 도메인으로의 융합이 개선된 반감기(단독의 항-TNFR1 dAb 단량체에 비해)의 이점을 제공할 뿐 아니라, TNFR1 결합에 대한 친화성(KD)의 개선의 이점이 부가된다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 당 분야의 상태에서 이전에 개시된 적이 없다. 이러한 점에서, 본 발명은 가변 도메인 단량체로 제공되는 경우(즉, 항-TNFR1 가변 도메인이 비포맷화(unformatted)되며, 예를 들어, 페길화(PEGylated)되지 않거나 항체 불변 영역, 이를 테면 Fc 영역으로 융합되지 않으며, 임의의 다른 도메인에 융합되지 않는 경우)의 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인보다 TNFR1 결합(예를 들어, 인간 TNFR1 결합)에 대한 더 긴 반감기와 더 낮은 KD를 갖는 리간드를 제공하기 위한 항-SA(예를 들어, 항-인간 SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 본 발명의 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 TNFR1 단량체의 KD보다 2배 이상 더 낮은 KD로 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1)에 결합한다. 부가적으로 또는 다르게는, 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 반감기가 단량체의 반감기의 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 100배 이상이다. 부가적으로 또는 다르게는, 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 인간에서의 최종 반감기가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일 이상이다(예를 들어, 인간 자원자에서 실험적으로 결정되거나 또는 예를 들어, 항-SA 도메인이 인간 SA 및 동물로부터의 SA 간에 교차 반응성인 경우, 동물 시스템, 이를 테면 마우스, 개 및/또는 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 비비, 레수스 원숭이)의 반감기로부터 추론함으로써 당업자에게 친숙한 통상의 기법을 사용하여 계산되는 경우).
본 발명의 다중특이적 리간드의 일 실시형태에서, 리간드는 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1)의, 임의로 TNFR1-매개의 신호전달의 길항제이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 tβ 반감기가 (약) 2.5시간 이상의 범위인 본 발명에 따른 가변 도메인, 다중특이적 리간드 또는 길항제를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 (약) 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 부가적으로 또는 다르게는, tβ 반감기는 (약) 21일 또는 25일 이하이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 (약) 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 19일, 20일, 21일 또는 22일이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 가변 도메인 또는 길항제는 tβ 반감기가 12 내지 60시간(또는 약 12 내지 60시간) 범위일 것이다. 추가의 실시형태에서, 이는 12 내지 48시간(또는 약 12 내지 48시간)의 범위일 것이다. 추가의 실시형태에서, 이는 12 내지 26시간(또는 약 12 내지 26시간)의 범위일 것이다.
2-구획 모델링(two-compartment modeling)을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 숙련자는 비-구획 모델링의 사용이 친숙할 것이며, 상기 비-구획 모델링은 최종 반감기를 결정하는데 사용될 수 있다(이러한 면에서, 본 명세서에 사용되는 용어 "최종 반감기"는 비-구획 모델링을 사용하여 결정되는 최종 반감기를 의미한다). 예를 들어, 이러한 방법으로 곡선을 모델링하기 위하여 윈논린 분석 패키지, 예를 들어 버전 5.1(Pharsight Corp.(Mountain View, CA94040, USA)으로부터 입수가능)이 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인, 다중특이적 리간드 또는 길항제는 최종 반감기가 (약) 8시간, 10시간, 12시간, 15시간, 28시간, 20시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일 또는 25일 이상이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 (약) 24시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 또는 120시간이다. 예를 들어, 인간에서의 최종 반감기는 (약) 8시간 내지 60시간, 또는 8시간 내지 48시간, 또는 12 내지 120시간이다.
상기 기준에 부가적으로 또는 그와 다르게는, 본 발명에 따른 가변 도메인 또는 길항제는 AUC 값(곡선 아래 면적)이 (약) 1 ㎎.분/㎖ 이상의 범위이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 (약) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 ㎎.분/㎖이다. 부가적으로 또는 다르게는, 본 발명에 따른 가변 도메인, 다중특이적 리간드 또는 길항제는 AUC가 (약) 600 ㎎.분/㎖ 이하의 범위이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 ㎎.분/㎖이다. 유리하게는 가변 도메인 또는 길항제는 AUC가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 (대략의) 범위일 것이다: 15 내지 150 ㎎.분/㎖, 15 내지 100 ㎎.분/㎖, 15 내지 75 ㎎.분/㎖ 및 15 내지 50 ㎎.분/㎖.
t 알파, t 베타 및 최종 반감기뿐 아니라 본 명세서에 인용된 AUC 중 하나 이상은 혈청 알부민, 예를 들어 마우스 및/또는 인간 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 PEG 또는 단일 가변 도메인(또는 결합 부분) 중 어느 하나에 연결된 하나 이상의 항-TNFR1 단일 가변 도메인(또는 본 명세서에서 정의된 다른 결합 부분)을 제공함으로써, 인간 및/또는 동물(예를 들어, 마우스 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 비비, 레수스, 사이노몰구스 원숭이)에서 수득될 수 있다. PEG 크기는 (약) 20 kDa, 예를 들어 30, 40, 50, 60, 70 또는 80 kDa 이상일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG는 40 kDa, 예를 들어 2x20kDa PEG이다. 일 실시형태에서, t 알파, t 베타 및 최종 반감기 또는 본 명세서에 인용된 AUC를 얻기 위하여, 항-SA 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결된 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 길항제를 제공한다. 일 실시형태에서, PEG는 40 kDa, 예를 들어 2x20kDa PEG이다. 예를 들어, 길항제는 오직 하나의 이러한 항-TNFR1 가변 도메인, 예를 들어 오직 하나의 항-SA 가변 도메인에 연결된 하나의 이러한 항-TNFR1 가변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, t 알파, t 베타 및 최종 반감기 또는 본 명세서에 인용된 AUC를 얻기 위하여, PEG, 예를 들어 40-80 kDa PEG, 예를 들어 40 kDa PEG에 연결된 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 길항제를 제공한다. 예를 들어, 길항제는 오직 하나의 이러한 항-TNFR1 가변 도메인, 예를 들어 40 kDa PEG에 연결된 하나의 이러한 도메인을 포함한다.
본 발명의 다중특이적 리간드의 일 실시형태에서, 리간드는 DOM7h-11, DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 또는 DOM7m-16의 서열과 동일하거나 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-SA(예를 들어, HSA) 단일 가변 도메인을 포함한다. 다르게는 또는 부가적으로, 일 실시형태에서, 다중특이적 리간드는 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 제공되는 링커를 포함하며, 상기 링커는 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다. 예를 들어, 상기 리간드는 (N-에서 C-말단으로) DOM1h-574-16-AST-DOM7h-11; 또는 DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7m-16; 또는 DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7h-11-12를 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 (i) DOM1h-574-156의 아미노산 서열과 동일하거나 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서, 상기 항-SA 단일 가변 도메인이 DOM7h-11-3의 서열과 동일하거나 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 여기서 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 상기 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드를 제공한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다. 예를 들어, 상기 리간드는 임의로 AST 또는 ASTSGPS에 의해 연결된 DOM1h-574-156 및 DOM7h-11-3을 포함한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다. 이러한 예 또는 이러한 태양에서, 상기 리간드는 임의로 정맥내, 피하, 근육내, 복강내 또는 흡입에 의한 환자로의 투여에 적합하게 된다. 일 예에서, 상기 리간드는 건조-분말(dry-powder) 또는 동결건조된 조성물로 제공된다(이는 임의로 투여 전에 희석제와 혼합된다).
일 태양에서, 본 발명은 (i) DOM1h-574-156의 아미노산 서열과 동일하거나 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서, 상기 항-SA 단일 가변 도메인이 DOM7h-14-10의 서열과 동일하거나 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 여기서 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 상기 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드를 제공한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다. 예를 들어, 상기 리간드는 임의로 AST 또는 ASTSGPS에 의해 연결된 DOM1h-574-156 및 DOM7h-14-10을 포함한다. 다르게는, 상기 링커는 AS(G4S)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)이며, 예를 들어, AS(G4S)3이다. 이러한 예 또는 이러한 태양에서, 상기 리간드는 임의로 정맥내, 피하, 근육내, 복강내 또는 흡입에 의한 환자로의 투여에 적합하게 된다. 일 예에서, 상기 리간드는 건조-분말 또는 동결건조된 조성물로 제공된다(이는 임의로 투여 전에 희석제와 혼합된다).
본 발명은 본 발명의 임의의 태양 또는 실시형태의 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 포함하는 TNFR1 길항제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제 또는 가변 도메인은 TNFR1 결합에 대하여 일가이다. 예를 들어, 본 발명의 길항제 또는 가변 도메인은 표준 SEC-MALLS로 결정시 일가 또는 실질적으로 일가이다. 실질적인 일가는 표준 SEC-MALLS로 결정시 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하의 가변 도메인 또는 길항제가 비-일가 형태로 존재하는 것을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명의 길항제는 제1 및 제2 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 가변 도메인은 본 발명의 임의의 태양 또는 실시형태에 따른다. 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일 예에서 동일하다. 다른 예에서 이들은 상이하다.
길항제의 일 예에서, 본 발명의 길항제에서 상기 또는 각각의 항-TNFR1 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 DOM1h-574-16 또는 DOM1h-574-72의 아미노산 서열과 동일하다.
일 태양에서, 본 발명은 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 폐 전달, 환자의 폐로의 전달 또는 전신 전달을 위한 본 발명의 임의의 태양에 따른 항-TNFR1 가변 도메인을 포함하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공한다. 다른 태양에서, 본 발명은 경구 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 환자의 위장관으로의 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다. 일 예에서, 길항제 또는 가변 도메인은 트립신, 엘라스타제 및/또는 판크레아틴에 대해 내성이다.
일 태양에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다. 일 예에서, 길항제 또는 가변 도메인은 류코자임에 대해 내성이다.
일 태양에서, 본 발명은 경구 전달, 또는 환자의 위장관 또는 환자의 폐 또는 폐 조직으로의 약제의 전달 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 환자에게 약제학적 유효량의 본 발명의 TNFR1 길항제를 투여하는 것을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 CDR1 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는다. 임의로, 상기 길항제는 또한 선택된 서열의 CDR2 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는다. 임의로, 부가적으로 또는 다르게는, 상기 길항제는 또한 선택된 서열의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 CDR2 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는다. 임의로, 상기 길항제는 또한 선택된 서열의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180의 CDR3 서열과 동일하거나 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제를 제공하며, 상기 길항제는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180으로부터 선택된 단일 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 서열을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
본 발명은 염증 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 임의의 태양의 TNFR1 길항제를 제공한다. 본 발명은 염증 질환의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에서의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다. 길항제 또는 용도의 일 실시형태에서, 상기 질환은 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환 및 만성폐쇄폐병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 상기 관절염은 류머티스 관절염 또는 연소성 류머티스 관절염이다. 일 예에서, 상기 염증성 장질환은 크론병 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 상기 만성폐쇄폐병은 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 상기 폐기종은 세균성 폐기종이다. 일 예에서, 상기 세균성 폐기종은 포도구균(Staphylococcal) 폐렴이다.
본 발명은 호흡기 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 임의의 태양의 TNFR1 길항제를 제공한다. 본 발명은 호흡기 질환의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에서의 임의의 태양의 TNFR1 길항제의 용도를 제공한다. 일 예에서, 호흡기 질환은 폐 염증, 만성폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 과민성 폐간질염, 호산구증가증을 갖는 폐 침윤물, 환경성 폐질환, 폐렴, 기관지확장증, 낭성 섬유증, 간질성 폐질환, 원발성 폐고혈압, 폐혈전색전증, 늑막 장애, 종격 장애, 횡경막 장애, 저환기, 과호흡, 수면중 무호흡, 급성 호흡 곤란 증후군, 중피종, 육종, 이식거부, 이식편대숙주병, 폐암, 알러지성 비염, 알러지, 석면증, 아스페르길루스종, 아스페르길루스증, 기관지확장증, 만성기관지염, 폐기종, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 침습성 폐렴구균 질환, 인플루엔자, 비결핵성 미코박테리아, 흉막삼출, 진폐증, 뉴모시스티스병, 폐렴, 폐방선균증, 폐포단백증, 폐탄저병, 폐부종, 폐색전, 폐염증, 폐 X 조직구증, 폐고혈압, 폐의 노카르디아증, 폐결핵, 폐정맥폐쇄병, 류머티스성 폐 질환, 사르코이드증 및 베게너 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 태양에서, NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TNFR1의 에피토프 서열을 표적으로 하는 본 발명의 임의의 일 태양의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, NSICCTKCHKGTYLY를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, NSICCTKCHKGTYL를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, CRKNQYRHYWSENLF를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, NQYRHYWSENLFQCF를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, NSICCTKCHKGTYLY, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF를 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드가 제공된다. 일 예에서, 이러한 표적화는 상술된 임의의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다. 일 태양에서, 본 발명은 환자에서의 상술된 임의의 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 전술한 실시형태 중 임의의 것에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 TNFR1의 에피토프 서열을 표적으로 하는 본 발명의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
폴리펩티드, dAb 및 길항제
폴리펩티드, 리간드, dAb, 리간드 또는 길항제는 이. 콜라이(E. coli) 또는 피키아(Pichia) 종(예컨대, 피. 파스토리스(P. pastoris))에서 발현될 수 있다. 일 실시형태에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 이. 콜라이 또는 피키아 종(예컨대, 피. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 0.5 mg/L 이상의 양으로 분비된다. 비록 본 명세서에 기재된 리간드 및 dAb 단량체가 이. 콜라이 또는 피키아 종(예컨대, 피. 파스토리스)에서 발현될 때 분비될 수 있으나, 이들은 이. 콜라이 또는 피키아 종을 사용하지 않는 합성 화학적 방법이나 생물학적 생성 방법과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb, 리간드 또는 길항제는 예컨대 위치 108, 37, 44, 45 및/또는 47에서 카멜리드 생식선 항체 유전자 세그먼트(segment)에 의해 엔코딩되는 면역글로불린 가변 도메인에 유일한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 또는 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항-TNFR1 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 44에 G 잔기를 포함하며, 임의로 다른 위치, 예를 들어 위치 37 또는 103에 하나 이상의 카멜리드-특이적 아미노산을 포함한다.
본 발명에 따른 TNFR1의 길항제는 일가 또는 다가일 수 있다. 일부 실시형태에서, 길항제는 일가이고 TNFR1과 상호작용하는 하나의 결합 부위를 포함하는데, 이 결합 부위는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 일가 길항제는 하나의 TNFR1에 결합되며 수용체의 활성화 및 신호전달을 초래할 수 있는 세포의 표면 상의 TNFR1의 가교결합 또는 클러스터링(cluestering)을 유도하지 않을 수 있다.
다른 실시형태에서, TNFR1의 길항제는 다가이다. TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1에 대한 특정 결합 부위의 둘 이상의 카피를 함유하거나 TNFR1에 결합되는 둘 이상의 상이한 결합 부위를 함유할 수 있는데, 이 결합 부위들 중 하나 이상은 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 대로 TNFR1의 길항제는 TNFR1에 결합되는 본 발명의 특정 폴리펩티드 또는 dAb의 둘 이상의 카피, 또는 TNFR1에 결합되는 본 발명의 둘 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 dAb를 포함하는 이량체, 삼량체 또는 다량체일 수 있다. 일 실시형태에서, TNFR1의 다가 길항제는 표준 세포 검정에서 TNFR1을 실질적으로 효능화(TNFR1의 작용제로 작용)시키지 않는다(즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우에 상기 검정에서 TNFα(100 pg/㎖)에 의해 유도되는 TNFR1 매개 활성의 약 5% 이하를 유발함).
특정 실시형태에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 대한 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 예를 들어, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1 내의 동일한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 상이한 에피토프 또는 도메인에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공되는 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 일 실시형태에서, 상기 다가 길항제는 WO2006038027호에 기재된 바와 같이 표준 L929 세포독성 검정 또는 표준 HeLa IL-8 검정에서 약 1 nM, 또는 약 10 nM, 또는 약 100 nM, 또는 약 1 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화시키지 않는다.
TNFR1의 다른 길항제는 TNFR1로의 TNFα의 결합을 억제하지 않는다. 이러한 리간드(및 길항제)는 진단제로 유용할 수 있는데, 이는 이들이 샘플 내의 TNFR1에 결합하여 이를 검출하거나, 정량하거나, 측정하는데 사용될 수 있고, 이는 TNFR1으로의 결합에 대해 샘플 내의 TNF와 경쟁하지 않을 것이기 때문이다. 따라서, TNFR1이 샘플 내에 존재하는지의 여부 또는 얼마나 많이 존재하는지의 여부의 정확한 결정이 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 TNFR1에 결합하여 표준 세포 검정에서 ≤ 100 nM의 ND5O으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, ≤ 10 μM의 농도에서 dAb는 상기 검정에서 TNFR1의 활성을 ≤ 5%로 효능화시킨다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 표준 세포 검정에서 TNFR1을 실질적으로 효능화(TNFR1의 작용제로 작용)시키지 않는다(즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우에 상기 검정에서 TNFα(100 pg/㎖)에 의해 유도된 TNFR1 매개 활성의 약 5% 이하를 유발함).
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 유효량이 투여되는 경우에 만성 염증 질환의 모델에서 유효하다. 일반적으로 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다(예컨대 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg). 만성 염증 질환의 모델(WO2006038027호에 기재된 것을 참조)은 인간에서의 치료적 효능을 예보하는 것으로 당업자에게 인식된다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 유효하다(상기 모델의 세부사항은 WO2006038027호 참조). 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, 리간드 dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 4개의 사지의 평균 관절염 스코어 합계를 적합한 대조군에 비해 약 1 내지 약 16, 약 3 내지 약 16, 약 6 내지 약 16, 약 9 내지 약 16, 또는 약 12 내지 약 16까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 관절염의 징후의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일까지 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 표준 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델에서 0 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 10 내지 약 15, 약 12 내지 약 15, 또는 약 14 내지 약 15의 4개 사지의 평균 관절염 스코어 합계를 야기할 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 관절염의 마우스 ΔARE 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027호 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 평균 관절염 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 관절염의 징후의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일까지 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 관절염의 마우스 ΔARE 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 관절염 스코어를 야기할 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 염증성 장질환(IBD)의 마우스 ΔARE 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027호 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 IBD의 징후의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일까지 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 ΔARE 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 야기할 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 IBD의 마우스 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 유도 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027호 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 평균 중증도 스코어를 적합한 대조군에 비해 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 IBD의 징후의 발생을 적합한 대조군에 비해, 예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일까지 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 투여하는 것은 IBD의 마우스 DSS 모델에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 중증도 스코어를 야기할 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제는 만성폐쇄폐병(COPD)의 마우스 담배 연기 모델(이러한 모델의 세부사항은 WO2006038027호 및 WO2007049017호 참조)에서 유효하다. 예를 들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 적합한 대조군에 비해 COPD의 징후의 발생을 감소시키거나 지연시킬 수 있다.
질환에 대해 보호하거나 이를 치료하는데 있어서 TNFR1의 길항제(예를 들어, 리간드, 항체 또는 이의 결합 단백질)의 효과를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 감수성 마우스에서 전신홍반루푸스(SLE)를 시험하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다(Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). 중증근무력증(MG)은 또 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질을 이용하여 이러한 질환을 유도함으로써 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). 관절염은 Ⅱ형 콜라겐의 주입에 의해 마우스의 감수성 스트레인에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). 애쥬번트 관절염이 미코박테리아 열 충격 단백질의 주입에 의해 감수성 랫트에서 유도되는 모델이 기재되어 있다(Van Eden et al. (1988) Nature, 331:171). 갑상선염은 기재된 바와 같이 티로글로불린(thyroglobulin)의 투여에 의해 마우스에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 자연 발생하거나, 문헌[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27:113]에 기재된 바와 같이 마우스의 특정 스트레인에서 유도될 수 있다. 마우스 및 랫트에서의 EAE는 인간에서의 MS에 대한 모델로 제공된다. 이러한 모델에서, 탈수초성 질병은 수초 염기성 단백질의 투여에 의해 유도된다(Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179 참조).
일반적으로, 본 리간드 (예컨대, 길항제)는 약리학적으로 적합한 담체와 함께 정제된 형태로 사용될 것이다. 전형적으로, 이러한 담체는 수성 또는 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충된 매질을 포함하는 임의의 것을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스와 염화나트륨 및 락테이트화 링거를 포함한다. 필요에 따라, 폴리펩티드 복합체를 현탁액에 유지하기 위하여, 적합한 약리학적으로 허용되는 애쥬번트를 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 증점제로부터 선택할 수 있다.
정맥내 비히클은 링거 덱스트로오스에 기초한 것들과 같은, 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스도 존재할 수 있다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). 연장된 방출 제형을 포함하는 다양한 적합한 제형이 이용될 수 있다.
본 발명의 리간드(예컨대, 길항제)는 별도로 또는 다른 작용제와 함께 투여되는 조성물로서 이용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료적 약물, 예컨대 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 리간드와 함께 다양한 세포독성제 또는 기타 작용제의 "칵테일", 또는 심지어 상이한 특이성을 지니는 본 발명에 따른 리간드의 조합물을 포함하는데, 예컨대 리간드는 이들이 투여 전에 풀링되는지와 무관하게, 상이한 표적 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 경로일 수 있다. 제한 없이 면역치료법을 포함하는 치료법을 위해, 본 발명에서 선택된 이의 리간드를 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여할 수 있다.
투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 폐 경로를 거쳐, 또는 적합하게는 카테터를 이용한 직접 주입에 의한 것을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 이루어질 수 있다. 투여 용량 및 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 맞조치(counterindication) 및 의사에 의해 고려되는 다른 파라미터에 의존적일 것이다. 투여는 지시된 대로 국소적(예컨대, 폐 투여에 의해 폐로의 국소 전달, 예컨대 비내 투여) 또는 전신적일 수 있다.
본 발명의 리간드는 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타나 있으며 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있고 (예컨대, 통상적인 면역글로불린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 큰 활성 손실을 지니기 쉽다) 이용 수준은 보상을 위해 상향 조정되어야 할 수 있음을 이해할 것이다.
본 리간드(예컨대, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 예방 및/또는 치료적 처치를 위해 투여할 수 있다. 특정 치료적 적용에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적인 억제, 억압, 조절, 치사, 또는 몇몇 다른 측정가능한 파라미터를 달성하기에 충분한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이 용량을 달성하는데 요구되는 양은 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 의해 좌우될 것이나 일반적으로 체중 킬로그램 당 0.005 내지 10.0 mg의 리간드, 예컨대 dAb 또는 길항제 범위일 것이며, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량이 더욱 일반적으로 사용된다. 예방적 적용을 위해, 본 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 질환의 발병을 예방, 억제 또는 지연(예컨대, 관해 또는 정지의 유지, 또는 급성기 예방)하기 위해 유사하거나 다소 낮은 용량으로 투여할 수 있다. 숙련된 의사는 질환을 치료, 억제 또는 예방하기 위한 적절한 투여 간격을 결정할 수 있을 것이다. 만성 염증 질환을 치료, 억제 또는 예방하기 위해 TNFR1의 리간드(예컨대, 길항제)를 투여할 때, 이것은 예를 들어, 약 10 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg , 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 하루에 4회 이하, 1주에 2회, 1주에 1회, 2주에 1회, 매 1개월에 1회나 매 2개월에 1회 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, TNFR1의 리간드(예컨대, 길항제)를 만성 염증 질환을 치료, 억제 또는 예방하기 위해 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg(예컨대, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)의 용량으로 매 2주에 1회 또는 1개월에 1회 투여한다.
하나 이상의 징후가 치료 전에 존재하는 동일한 징후에 비해, 또는 상기 조성물이나 기타 적합한 대조군으로 치료되지 않은 개체(인간 또는 모델 동물)에서의 동일한 징후에 비해 감소된 경우(예컨대, 10% 이상 또는 임상적 평가 척도 상에서 1점 이상만큼) 본 명세서에 개시된 조성물을 이용하여 수행된 치료 또는 치료법은 "효과적"인 것으로 간주된다. 징후는 표적으로 하는 질환 또는 질병에 따라 명백히 다양할 것이나, 보통의 숙련된 의사 또는 전문가에 의해 측정될 수 있다. 이러한 징후는, 예를 들어 질환 또는 질병의 하나 이상의 생화학적 지표의 수준(예컨대, 질환과 관련된 효소 또는 대사산물, 영향받은 세포 수 등의 수준)을 모니터링하거나, 물리적 조짐(예컨대, 염증, 종양 크기 등)을 모니터링하거나, 인정된 임상적 평가 척도, 예를 들어, 확장장애상태척도(Expanded Disability Status Scale)(다발성 경화증에 대한 것임), 어빈 염증성 장질환 질문서(장 기능, 전신 징후, 사회적 기능 및 감정 상태와 관련된 삶의 질을 평가하는 32 포인트의 평가 - 32 내지 224 범위의 스코어, 보다 높은 스코어는 보다 나은 삶의 질을 나타냄), 류머티스 관절염 스케일의 삶의 질, 또는 당 분야에 공지된 다른 허용되는 임상 평가 스케일에 의해 판단될 수 있다. 제공된 임상 스케일에서 10% 이상 또는 1점 이상의 질환 또는 질병 징후의 지속된(예를 들어, 1일 이상, 또는 이 이상의 기간) 감소는 "효과적인" 치료를 나타낸다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 조성물을 이용하여 수행된 예방은 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체(인간 또는 동물 모델)에서의 징후에 비해 하나 이상의 징후의 발생 또는 중증도가 지연되거나, 감소되거나, 제거된 경우에 "효과적"이다.
포유동물에서 선택 표적 세포 집단을 변경, 비활성화, 사멸 또는 제거하는 것을 돕기 위해 본 발명에 따른 리간드(예컨대, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 예방적 및 치료적 환경에서 이용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리는 체외순환에 의해서나 시험관 내에서 표적 세포 집단을 세포의 이종 집합물로부터 선택적으로 사멸, 고갈 또는 달리 효과적으로 제거하기 위해 이용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액을 체외순환에 의해 리간드와 조합시킴으로써 요망되지 않는 세포를 사멸시키거나 다르게는 표준 기술에 따라 포유동물로 돌려보내기 위해 혈액으로부터 제거할 수 있다.
포유동물에서 선택 표적 세포 집단을 변경, 비활성화, 사멸 또는 제거하는 것을 돕기 위해 본 발명에 따른 리간드(예컨대, 길항제)를 함유하는 조성물을 예방적 및 치료적 환경에서 이용할 수 있다.
리간드(예컨대, 항-TNFR1 길항제, dAb 단량체)를 하나 이상의 추가의 치료제 또는 활성제와 함께 투여하고/거나 제형화할 수 있다. 리간드(예컨대, dAb)를 추가의 치료제와 함께 투여할 때, 리간드는 추가 작용제의 투여 이전에, 이와 동시에 또는 이에 후속하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 리간드와 추가 작용제는 치료적 효과의 중복을 제공하는 방식으로 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 만성 염증 질환의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 염증 질환의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 관절염(예를 들어, 류머티스 관절염, 연소성 류머티스 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염)의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 관절염의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 건선의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 건선의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 염증성 장질환(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염)의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장질환의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 만성폐쇄폐병(예를 들어, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 폐기종)의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 만성폐쇄폐병의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 폐렴(예를 들어, 세균성 폐렴, 예를 들어, 포도구균 폐렴)의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 폐렴의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
본 발명은 만성폐쇄폐병 및 폐렴 외의 다른 폐 질환의 치료, 억제, 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료되거나, 억제되거나, 예방될 수 있는 다른 폐 질환은, 예를 들어, 낭성 섬유증 및 천식(예를 들어, 스테로이드 내성 천식)을 포함한다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 폐 질환(예를 들어, 낭성 섬유증, 천식)의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 폐 질환의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
특정 실시형태에서, TNFR1의 길항제는 폐 전달, 예를 들어, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 비내 점적) 또는 전신 전달(예를 들어, 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하)에 의해 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제를 패혈성 쇼크의 치료, 억제, 또는 예방이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 패혈성 쇼크의 치료, 억제, 또는 예방 방법이다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 TNFR1의 폴리펩티드, 리간드, dAb 또는 길항제, 또는 조성물을 이용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 질환은 암 또는 염증 질환, 예를 들어, 류머티스 관절염, 천식 또는 크론병이다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드 또는 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 리간드, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물은 폐 전달, 예를 들어, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 비내 점적) 또는 전신 전달(예를 들어, 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하)에 의해 투여된다.
본 발명의 일 태양은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드, 조성물 또는 길항제를 함유하는 폐 전달 장치를 제공한다. 상기 장치는 흡입기 또는 비내 투여 장치일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인) 중 임의의 것은 반감기 연장 부분, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 그의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 그의 트랜스페린-결합 부분, 또는 생체 내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 부분은 친화체(affibody), SpA 도메인, LDL 수용체 클래스 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머(avimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생체 내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분이다.
다른 실시형태에서, 반감기 연장 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분이다. 일 실시형태에서, 길항제는 폴리에틸렌 글리콜 부분(임의로, 여기서 상기 부분은 크기가 약 20 내지 약 50 kDa, 임의로 약 40 kDa 선형 또는 분지형 PEG임)에 연결된 본 발명의 단일 가변 도메인을 포함한다(임의로, 이로 이루어진다). dAb의 페길화(PEGylation) 및 결합 부분에 대한 더욱 상세사항에 대해서는 WO04081026호를 참조하길 바란다. 일 실시형태에서, 길항제는 PEG에 연결된 dAb 단량체로 이루어지며, 여기서, dAb 단량체는 본 발명에 따른 단일 가변 도메인이다. 이 길항제는 염증 질환, 폐 질환(예를 들어, 천식, 인플루엔자 또는 COPD) 또는 암의 치료를 위해 제공될 수 있으며, 임의로 이는 정맥내 투여용이다.
다른 실시형태에서, 반감기 연장 부분은 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)이다.
본 발명은 또한 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인) 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내, 근육내, 복강내, 동맥내, 척추강내, 관절내, 피하 투여, 폐, 비내, 질내 또는 직장내 투여용 비히클을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함하는 약물 전달 장치에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 약물 전달 장치는 다수의 치료적 유효 용량의 리간드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약물 전달 장치는 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근육내 전달 장치, 복강내 전달 장치, 경피 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 척수강내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비내 전달 장치, 질내 전달 장치, 직장내 전달 장치, 주사기, 경피 전달 장치, 캡슐, 정제, 네뷸라이저, 흡입기, 아토마이저, 에어로졸분무기, 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 정량식 스프레이, 정량식 미스터, 정량식 아토마이저, 및 카테터로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 리간드(예를 들어, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 다중특이적 리간드)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리간드는 생체내 혈청 반감기를 조정하기 위해 포맷화될 수 있다. 필요에 따라, 리간드는 본 명세서에 기재된 독소 또는 독소 부분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 자유 라디칼 생성체(예를 들어, 셀레늄 함유 독소) 또는 방사성핵종(radionuclide)과 같은 표면 활성 독소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 독소 또는 독소 부분은 세포내 표적에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인(예를 들어, dAb)이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 TNFR1(예를 들어, 인간 TNFR1)에 대한 결합 특이성을 갖는 IgG-형 포맷이다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단일 가변 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 가변 도메인은 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단백질에 융합될 수 있다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 모노클로날 항체에 융합된다. 일반적으로, 융합은 단일 핵산 서열로부터 융합 생성물을 발현하거나, 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현한 다음, 이 폴리펩티드를 통상적인 기법을 사용하여 더 큰 단백질 또는 항체 포맷으로 어셈블링(assembling)함으로써, 달성될 수 있다.
일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 항체 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 항체 Fc를 포함하며, 임의로, 여기서 Fc의 N-말단은 가변 도메인의 C-말단에 연결된다(임의로 직접 연결된다). 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 반감기 연장 부분을 포함한다. 반감기 연장 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린-결합 부분, 또는 생체 내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 반감기 연장 부분은 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 반감기 연장 부분은 dAb, 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일 실시형태에서, 가변 도메인(또는 길항제 또는 융합 단백질이 포함하는 가변 도메인)이 폴리알킬렌 글리콜 부분을 추가로 포함하도록 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질이 제공된다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분일 수 있다. 추가의 검토가 하기에 제공된다.
일 태양에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 제공하기 위한 본 발명의 임의의 태양 또는 실시형태의 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제, 조성물 또는 장치를 제공한다(하기의 목적 중 둘 이상의 명백한 조합이 본 명세서에 개시되며, 청구범위의 대상일 수 있다):
(i) 인간 TNFR1의 강력한 결합(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시(약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로);
(ii) 비-인간 영장류 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 TNFR1)의 강력한 결합(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로);
(iii) 인간 TNFR1의 강력한 결합(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로) 및 비-인간 영장류 TNFR1(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 TNFR1)의 강력한 결합(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로);
(iv) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 뮤린 TNFR1의 강력한 결합(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 인간 TNFR1에 결합; 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 500 pM 이하, 400 pM 이하, 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하 또는 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합; 및 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 (약) 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하의 해리 상수(KD)로 뮤린 TNFR1에 결합);
(v) 환자에서의 인간 TNFR1의 강력한 중화, 예를 들어, TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시 표준 MRC5 검정에서 (약) 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하의 ND50으로 인간 TNFR1을 중화시키는 본 발명의 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제, 리간드 또는 조성물을 이용한 중화;
(vi) 환자에서의 인간 TNFR1의 강력한 중화, 예를 들어, TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시 표준 사이노몰구스 KI 검정에서 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하; 또는 (약) 5 내지 (약) 1 nM의 ND50으로 사이노몰구스 원숭이 TNFR1을 중화시키는 본 발명의 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;
(vii) 환자에서의 인간 TNFR1의 강력한 중화, 예를 들어, TNF 알파-유도된 세포독성의 억제로 결정시 표준 L929 검정에서 150, 100, 50, 40, 30, 20 nM 이하; 또는 (약) 150 내지 10 nM; 또는 (약) 150 내지 20 nM; 또는 (약) 110 내지 10 nM; 또는 (약) 110 내지 20 nM의 ND50으로 뮤린 TNFR1을 중화시키는 본 발명의 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;
(viii) 환자에서의 인간 TNFR1의 강력한 중화, 예를 들어, TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시 표준 사이노몰구스 KI 검정에서 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 이하; 또는 (약) 5 내지 (약) 1 nM의 ND50으로 사이노몰구스 원숭이 TNFR1을 중화시키고; TNF 알파-유도된 세포독성의 억제로 결정시 표준 L929 검정에서 150, 100, 50, 40, 30, 20 nM 이하; 또는 (약) 150 내지 10 nM; 또는 (약) 150 내지 20 nM; 또는 (약) 110 내지 10 nM; 또는 (약) 110 내지 20 nM의 ND50으로 뮤린 TNFR1을 중화시키는 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;
(ix) 1종 초과의 영장류 TNFR1(임의로, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 및/또는 레수스 TNFR1 및/또는 비비 TNFR1, 예를 들어 인간 및 사이노몰구스 원숭이 TNFR1) 및 임의로 뮤린 TNFR1 간의 교차-반응성 제공; 및
(x) 프로테아제 안정성(임의로, 트립신 안정성) 제공.
일 태양에서, 본 발명은 직전 단락에서 (i) 내지 (x) 중 하나 이상을 제공하기 위한 본 발명의 임의의 태양 또는 실시형태의 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제, 리간드, 조성물 또는 장치의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상응하는 방법을 제공한다.
WO2006038027호를 참조하길 바라며, 이는 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 개시한다. 이 참고문헌의 개시내용은 특히 본 명세서의 청구범위로의 도입을 위한 명시적인 설명을 제공하는 것을 비롯하여, 항-TNFR1 단일 가변 도메인, 리간드, 길항제 등에 대한 용도, 포맷, 선택 방법, 생성 방법, 제형화 방법 및 검정을 제공하기 위하여, 이들 개시물이 본 발명의 문맥에 특별히 그리고 명시적으로 적용될 수 있도록 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 항-TNFR1은 면역글로불린 단일 가변 도메인이며, 임의로 인간 가변 도메인이거나 인간 프레임워크 영역(예를 들어, DP47 또는 DPK9 프레임워크 영역)을 포함하거나 이로부터 유래되는 가변 도메인이다. 특정 실시형태에서, 가변 도메인은 본 명세서에 기재된 유니버셜 프레임워크를 기반으로 한다.
특정 실시형태에서, TNFR1에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)은 내응집성이며, 가역적으로 언폴드(unfold)된다(그 교시가 본 명세서에 참고문헌로 포함되는 WO04101790호를 참조하길 바란다).
핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 리간드(단일 가변 도메인, 융합 단백질, 폴리펩티드, 이중특이적 리간드 및 다중특이적 리간드)를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-132, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM1h-574-109, DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137 또는 DOM1h-574-160의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-133, DOM1h-574-135 또는 DOM1h-574-138, DOM1h-574-139, DOM1h-574-155, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-133의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 일 태양에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-132, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 일 태양에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 DOM1h-574-109, DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137 또는 DOM1h-574-160의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 일 태양에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-133, DOM1h-574-135 또는 DOM1h-574-138, DOM1h-574-139, DOM1h-574-155, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 일 태양에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 DOM1h-574-126 또는 DOM1h-574-133의 뉴클레오티드 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포를 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 유지시킴으로써, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하여, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공된다. 임의로, 이 방법은 폴리펩티드를 분리하고, 임의로 분리된 폴리펩티드보다 표준 MRC5, L929 또는 사이노몰구스 KI 검정에서 개선된 친화성(KD); TNFR1 중화에 대한 ND50을 갖는 변이체, 예를 들어 돌연변이된 변이체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에서 "분리된"으로 지칭되는 핵산은 그들의 기원(예를 들어, 세포 내에 존재하거나 또는 라이브러리와 같은 핵산 혼합물의 존재)의 세포 RNA 또는 게노믹(genomic) DNA의 핵산으부터 분리된 핵산이며, 이는 본 발명에 기술된 방법 또는 다른 적합한 방법에 의해 수득된 핵산을 포함하며, 본질적으로 순수한 핵산, 화학적 합성, 생물학 및 화학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산, 및 분리된 재조합 핵산을 포함한다(예를 들어, 문헌[Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991)]; 문헌[Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)]을 참조하길 바란다).
본 명세서에서 “재조합”으로 지칭되는 핵산은 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 핵산이며, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한효소를 이용한 벡터로의 클로닝과 같은 인공 재조합 방법에 의존하는 절차에 의하여 생성되는 핵산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 본 명세서에서 기재된 리간드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 상기 리간드는 본 명세서에 개시된 TNFR1에 결합하는 dAb의 아미노산 서열, 예를 들어 DOM1h-574-156, DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 또는 DOM1h-574-180과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 동일성은 선택된 항-TNFR1 dAb를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 비해 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 재조합 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 엘리먼트(element) 또는 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 적합한 벡터(예를 들어, 플라스미드, 파지미드), 발현 제어 엘리먼트, 숙주 세포 및 본 발명의 재조합 숙주 세포를 생성시키는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있고, 예가 본 명세서에 추가로 설명되어 있다.
적합한 발현 벡터는 다수의 성분, 예를 들어 복제 기원, 선택가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 제어 엘리먼트, 예를 들어 전사 제어 엘리먼트(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 터미네이터) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 제어 엘리먼트 및 신호 서열은 존재하는 경우 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 항시성(constitutive) 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 핵산의 전사를 지시하도록 항체, 항체 사슬 또는 이의 부분을 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵(예를 들어, 이. 콜라이의 경우 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵(예를 들어, 시미안(simian) 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터) 숙주에 대한 다양한 적합한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 수반하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하며, 복제가능한 발현 벡터의 경우, 복제 기원을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자는 공통의 선택가능한 마커이며, 원핵 세포(예를 들어, 락타마아제 유전자(암피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(마이코페놀산), 암피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에 사용될 수 있다. 다이하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 사용한 선택을 가능하게 한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)는 종종 효모의 선택가능한 마커로서 사용된다. 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 게놈으로 통합할 수 있는 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 이용이 또한 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵 세포(이. 콜라이), 곤충 세포(드로소필라 슈나이더(Drosphila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모(피. 메타놀리카(P. methanolica), 피. 파스토리스(P. pastoris), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae))에서 발현하기에 적합한 발현 벡터는 해당 분야에 널리 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적합한 박테리아와 같은 박테리아 세포를 포함하는 원핵 세포; 진핵 세포, 이를 테면 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길루스 종(Aspergillus sp.), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), 또는 다른 하등 진핵 세포, 및 고등 진핵생물의 세포, 예를 들어 곤충(예를 들어, 드로소필라 슈나이더 S2 세포, Sf9 곤충 세포(WO94/26087호(O'Connor)), 포유동물(예를 들어, COS-1(ATCC 수탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7(ATCC 수탁 번호 CRL-1651)와 같은 COS 세포, CHO(예를 들어, ATCC 수탁 번호 CRL-9096, CHO DG44(문헌[Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. ScL USA, 77(7):4216-4220 (1980)])), 293(ATCC 수탁 번호 CRL-1573), HeLa(ATCC 수탁 번호 CCL-2), CV1(ATCC 수탁 번호 CCL-70), WOP(문헌[Dailey, L., et al., J. Virol, 54:739-749 (1985)]), 3T3, 293T(문헌[Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)]) NS0 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등), 또는 식물(예를 들어 담배)로부터의 세포일 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)] 참조). 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 분리된 숙주 세포이며, 다세포 생물(예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 비인간(non-human) 숙주 세포이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 유지시킴으로써 재조합 핵산이 발현되어 리간드가 생성되는 단계를 포함하여 본 발명의 리간드(예를 들어, 이중-특이적 리간드, 다중특이적 리간드)를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 리간드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 실시형태에 적용가능한 개시물의 상세사항을 위하여 WO2006038027호를 참조하길 바란다. 예를 들어, 관련 개시물은 면역글로불린 단일 가변 도메인 기반의 리간드의 제조, 라이브러리 벡터 시스템, 라이브러리 작제, 단일 가변 도메인의 결합, 리간드의 특성화, 리간드의 구조, 골격, 단백질 스캐폴드, 정규 서열(Canonical sequence)의 다변화, 검정, 및 치료 및 진단 조성물 및 용도, 뿐만 아니라 "작동가능하게 연결된", "나이브", "예방", "억제", "치료", 및 "치료적 유효 용량"의 정의에 관한 것이다.
포맷
증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체 및 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체 내 적용에 유용하다. 이러한 단편(Fv, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터의 신속한 제거를 경험하므로, 이들은 신체의 대부분에 신속하게 도달하고 생성이 빠르며 다루기가 용이한 한편, 이들의 생체내 적용은 생체내에서의 이들의 짧은 지속성에 의해 제한되어 왔다. 본 발명의 일 실시형태는 생체 내에서 리간드의 반감기 증가 및 결과적으로 리간드 기능 활성의 신체에서의 보다 긴 지속 시간을 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다. 리간드 반감기를 약물동력학적 분석 및 결정 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 상세사항은 문헌[Kenneth, A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 찾아볼 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선 아래 면적(AUC)과 같은 약물동력학적 파라미터를 기술하고 있는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]도 참조하길 바란다. 반감기와 AUC 정의는 상기에 제공된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 tα 반감기가 15분 이상의 범위인 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물 또는 리간드(예를 들어, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 다중특이적 리간드)를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 다르게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tα 반감기가 12시간 이하의 범위일 것이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간, 또는 3 내지 4시간이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 tβ 반감기가 약 2.5시간 이상의 범위인 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물 또는 리간드(폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 다중특이적 리간드)를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간이다. 추가로 또는 다르게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tβ 반감기가 약 21일 이하의 범위이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일 또는 약 20일이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tβ 반감기가 약 12 내지 약 60시간 범위일 것이다. 추가의 실시형태에서, 이것의 범위는 약 12 내지 약 48시간일 것이다. 여전히 추가의 실시형태에서, 이것의 범위는 약 12 내지 약 26시간일 것이다.
상기 기준에 추가하여 또는 다르게는, 본 발명은 AUC 값(곡선 아래 면적)이 약 1 mg·분/㎖ 이상의 범위인 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물 또는 리간드를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 100, 약 200 또는 약 300 mg/분/㎖이다. 추가로 또는 다르게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 AUC가 약 600 mg/분/㎖ 이하이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 약 500, 약 400, 약 300, 약 200, 약 150, 약 100, 약 75 또는 약 50 mg/분/㎖이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 리간드는 AUC가 약 15 내지 약 150 mg/분/㎖, 약 15 내지 약 100 mg/분/㎖, 약 15 내지 약 75 mg/분/㎖, 및 약 15 내지 약 50 mg/분/㎖로 이루어진 군으로부터 선택된 범위일 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 dAb, 및 이들을 포함하는 길항제는 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착에 의해, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해, 더 큰 유체역학적 크기를 갖도록 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 dAb 및 길항제는 항체의 더 큰 항원-결합 단편으로 또는 항체로 포맷화된다(예컨대, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로 포맷화됨).
본 발명의 리간드(예를 들어, dAb 단량체 및 다량체)의 유체역학적 크기는 해당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위한 적합한 겔 여과 매트릭스, 예를 들어, 가교 결합된 아가로스 매트릭스는 잘 알려져 있고, 용이하게 이용가능하다.
리간드 포맷의 크기(예를 들어, dAb 단량체에 부착된 PEG 부분의 크기)는 원하는 응용에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환계를 벗어나 말초 조직에 들어가고자 하는 경우, 혈류로부터의 유출을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 작게 유지하는 것이 바람직하다. 다르게는, 리간드가 전신 순환계에서 더 오랜 시간 동안 남아 있기를 원하는 경우, 예를 들어, Ig형 단백질로서 포맷화함으로써 리간드의 크기를 증가시킬 수 있다.
생체 내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프의 표적화에 의한 반감기 연장
또한, 리간드의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기는 본 발명의 TNFR1 결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 본 명세서에서 기재된 바와 같은 생체 내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)으로 컨쥬게이트시키거나 또는 회합시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, TNFR1 결합제(예를 들어, 폴리펩티드)는 항혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 친화체 또는 항-신생아 Fc 수용체 친화체 또는 항-SA 아비머, 또는 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 친화체, 아비머, GroEl 및 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는 스캐폴드를 포함하는 항-SA 결합 도메인에 컨쥬게이트되거나 연결될 수 있다(이들 결합 도메인의 개시내용에 대해서는 WO2008096158호를 참조하길 바라며, 이 도메인 및 이들의 서열은 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다). 컨쥬게이팅은 혈청 알부민에 결합하는 결합 도메인에 결합된(공유적으로 또는 비공유적으로) 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 포함하는 조성물을 지칭한다.
생체 내에서 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어, 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(미국 특허 제5977307호 참조, 상기 문헌의 개시물은 본 발명에 참고문헌으로 포함됨), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예를 들어, 용해성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린-유사 성장인자 1(IGF1) 수용체, 인슐린-유사 성장인자 2(IGF2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-안티트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 또한, 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 알파-1 당단백질(오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 안티키모트립신(ACT), 알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC, AIM), 안티트롬빈 III(AT III), 아포리포프로테인 A-1(Apo A-1), 아포리포프로테인 B(Apo B), 세루로플라스민(Cp), 보체 성분 C3(C3), 보체 성분 C4(C4), C1 에스테라제 억제제(C1 INH), C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER), 헤모펙신(HPX), 리포프로테인(a)(Lp(a)), 만노스-결합 단백질(MBP), 미오글로빈(Myo), 프레알부민(트랜스티레틴, PAL), 레티놀-결합 단백질(RBP) 및 류마토이드 인자(RF)도 포함한다.
세포외 매트릭스로부터의 적합한 단백질은 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주된 단백질이다. 약 15종의 콜라겐 분자가 현재 알려져 있고, 신체의 다른 부분에서 발견되며, 예를 들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부기관에서 1형 콜라겐(신체 콜라겐의 90%를 차지함)이 발견되거나 또는 연골, 척추 디스크, 척색 및 눈의 유리체 액에서 2형 콜라겐이 발견된다.
혈액으로부터의 적합한 단백질은 예를 들어, 혈장 단백질(예를 들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐(예를 들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 햅토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-마크로글로불린), 효소 및 효소 억제제(예를 들어, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄(카파/람다))와 같은 면역계의 단백질, 수송 단백질(예를 들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 디펜신(예를 들어, 베타-디펜신 1, 뉴트로필 디펜신 1, 뉴트로필 디펜신 2 및 뉴트로필 디펜신 3) 등을 포함한다.
혈관-뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적합한 단백질은 예를 들어, 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코브산염 수송체 등을 포함한다.
생체 내에서 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 신장에 국소화된 단백질(예를 들어, 폴리시스틴, IV형 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만스(Heymann's) 항원), 간에 국소화된 단백질(예를 들어, 알콜 탈수소효소, G250), 폐에 국소화된 단백질(예를 들어 IgA에 결합하는 분비 성분), 심장에 국소화된 단백질(예를 들어, 팽창성 심근증과 관련된 HSP27), 피부에 국소화된 단백질(예를 들어, 케라틴), 몰포제닉 프로테인(BMP)과 같은 뼈 특이적 단백질(상기 BMP는 골형성 활성을 보이는 변형 성장 인자 β 상과 단백질의 서브셋(subset)이다(예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)). 종양 특이적 단백질(예를 들어, 트로포블라스트 항원, 헤르셉틴 수용체, 오에스트로겐(oestrogen) 수용체, 카텝신(예를 들어, 간과 비장에서 발견할 수 있는 카텝신 B)를 포함한다.
적합한 질병-특이적 단백질은 예를 들어, LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드(OPGL; 문헌[Nature 402, 304-309 (1999)] 참조), OX40(TNF 수용체 패밀리의 구성원, 활성화된 T 세포에서 발현되고, 특이적으로 인간 T 세포 백혈병 바이러스 I형(HTLV-1)-생성 세포에서 상향 조절됨; 문헌[Immunol. 165(1): 263-70 (2000)] 참조)을 포함하는 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원을 포함한다. 적합한 질병-특이적 단백질은 또한, 예를 들어, CG6512 드로소필라, 인간 파라프레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH를 포함하는 메탈로프로테아제(관절염/암과 연관); 및 산성 섬유모세포 성장 인자(FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 전환 성장 인자-α(TFG-α), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판-유래 내피 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(P1GF), 미드킨 혈소판-유래 성장인자-BB(PDGF) 및 프랙탈킨을 포함하는 혈관신생 성장 인자를 포함한다.
또한, 생체 내에서 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 열충격 단백질(HSP)과 같은 스트레스 단백질을 포함한다. HSP는 보통 세포 내에서 발견된다. 그들이 세포 외에서 발견되면, 세포가 죽어 그 내용물이 빠져나왔다는 것을 나타낸다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 죽음(괴사)은 외상, 질환 또는 손상의 결과로 세포외 HSP가 면역계로부터의 반응을 일으킬 때 발생한다. 세포외 HSP로의 결합은 본 발명의 조성물의 질환 부위로의 국소화를 야기할 수 있다.
Fc 수송에 수반되는 적합한 단백질은, 예를 들어 브람벨(Brambell) 수용체(FcRB라고도 알려짐)를 포함한다. 이러한 Fc 수용체는 2가지 기능이 있고, 이들 모두는 운반에 잠재적으로 유용하다. 이 기능은 (1) 태반을 통하여 엄마로부터 아이에게 IgG를 수송하는 것 (2) 분해로부터 IgG를 보호하여 혈청 반감기를 연장하는 것이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재활용하는 것으로 여겨진다(문헌[Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)] 참조).
혈청 알부민에 결합하는 dAb
일 실시형태에서, 본 발명은 리간드, 폴리펩티드 또는 길항제(예를 들어, TNFR1에 결합하는 항-TNFR1 dAb(제1 dAb) 및 혈청 알부민(SA)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드)를 제공하며, 상기 제2 dAb는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400 또는 약 500 μM(즉, x 10-9 내지 5 x 10-4M), 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 1 내지 약 5 μM 또는 약 3 내지 약 70 nM 또는 약 1O nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 μM, 예를 들어, 약 30 내지 약 70 nM의 KD로 SA에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 dAb(또는 dAb 단량체)는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 대략 약 1, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300 nM 또는 약 1, 약 2 또는 약 3 μM의 KD로 SA(예를 들어, HSA)에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 항-SA dAb 및 TNFR1에 대한 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드에 대하여, 제2 dAb의 그의 표적에 대한 친화성(예컨대, 표면 플라즈몬 공명으로 측정시의 KD 및/또는 Koff, 예컨대 BiaCore 이용)은 제1 dAb의 SA에 대한 친화성의 약 1 내지 약 100000배(예를 들어, 약 100 내지 약 100000배, 또는 약 1000 내지 약 100000배, 또는 약 10000 내지 약 100000배)이다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 예를 들어, 제1 dAb는 대략 10 μM의 친화성으로 SA에 결합하나, 제2 dAb는 약 100 pM의 친화성으로 그 표적에 결합한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일 실시형태에서, 제1 dAb는 대략적으로 약 50, 예를 들어 약 70, 약 100, 약 150 또는 약 200 nM의 KD로 SA(예컨대, HSA)에 결합한다. 이중 특이적 리간드의 상세사항은 WO03002609호, WO04003019호, WO2008096158호 및 WO04058821호에서 관찰된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 리간드는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400 또는 약 500 μM(즉, x 약 10-9 내지 약 5 x 10-4M), 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 1 내지 약 5 μM 또는 약 3 내지 약 70 nM 또는 약 1O nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 μM, 예를 들어, 약 30 내지 약 70 nM의 KD로 혈청 알부민(SA)에 결합하는 dAb를 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 dAb(또는 dAb 단량체)는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 대략적으로 약 1, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300 nM 또는 약 1, 약 2 또는 약 3 μM의 KD로, SA(예를 들어, HSA)에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 및 제2 dAb는 링커, 예를 들어, 1 내지 4개 아미노산 또는 1 내지 3개 아미노산, 또는 3개 초과의 아미노산, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 초과의 아미노산에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 더 긴 링커(3개 초과의 아미노산)가 역가(길항제에서 1개 또는 2개 모두의 dAb의 KD)를 증가시키기 위하여 사용된다.
리간드 및 길항제의 특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 알부민에 결합하기 위하여, DOM7h-11, DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 및 DOM7m-16으로 이루어진 군으로부터 선택된 dAb와 경쟁한다.
리간드 및 길항제의 특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 알부민에 결합하기 위하여,
MSA-16, MSA-26(이들 서열의 공개에 대해서는 WO04003019호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다),
DOM7m-16(서열 번호 473), DOM7m-12(서열 번호 474), D0M7m-26(서열 번호 475), DOM7r-1(서열 번호 476), DOM7r-3(서열 번호 477), DOM7r-4(서열 번호 478), DOM7r-5(서열 번호 479), DOM7r-7(서열 번호 480), DOM7r-8(서열 번호 481), DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7r-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7r-15(서열 번호 499), DOM7r-16(서열 번호 500), DOM7r-17(서열 번호 501), DOM7r-18(서열 번호 502), DOM7r-19(서열 번호 503), DOM7r-20(서열 번호 504), DOM7r-21(서열 번호 505), DOM7r-22(서열 번호 506), DOM7r-23(서열 번호 507), DOM7r-24(서열 번호 508), DOM7r-25(서열 번호 509), DOM7r-26(서열 번호 510), DOM7r-27(서열 번호 511), DOM7r-28(서열 번호 512), DOM7r-29(서열 번호 513), DOM7r-30(서열 번호 514), DOM7r-31(서열 번호 515), DOM7r-32(서열 번호 516), DOM7r-33(서열 번호 517)(이들 서열의 공개에 대해서는 WO2007080392호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다; 본 단락의 서열 번호는 WO2007080392호에 나타난 것이다),
dAb8(dAb10), dAb10, dAb36, dAb7r20(DOM7r20), dAb7r21(DOM7r21), dAb7r22(DOM7r22), dAb7r23(DOM7r23), dAb7r24(DOM7r24), dAb7r25(DOM7r25), dAb7r26(DOM7r26), dAb7r27(DOM7r27), dAb7r28(DOM7r28), dAb7r29(DOM7r29), dAb7r29(DOM7r29), dAb7r31(DOM7r31), dAb7r32(DOM7r32), dAb7r33(DOM7r33), dAb7r33(DOM7r33), dAb7h22(DOM7h22), dAb7h23(DOM7h23), dAb7h24(DOM7h24), dAb7h25(DOM7h25), dAb7h26(DOM7h26), dAb7h27(DOM7h27), dAb7h30(DOM7h30), dAb7h31(DOM7h31), dAb2(dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12(dAb7m12), dAb13 (dAb15), dAb15, dAb16(dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25(dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30(dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38(dAb54), dAb41, dAb46(dAb 47, 52 및 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1(DOM7r1), dAb7r3(DOM7r3), dAb7r4(DOM7r4), dAb7r5(DOM7r5), dAb7r7(DOM7r7), dAb7r8(DOM7r8), dAb7r13(DOM7r13), dAb7r14(DOM7r14), dAb7r15(DOM7r15), dAb7r16(DOM7r16), dAb7r17(DOM7r17), dAb7r18(DOM7r18), dAb7r19(DOM7r19), dAb7h1(DOM7h1), dAb7h2(DOM7h2), dAb7h6(DOM7h6), dAb7h7(DOM7h7), dAb7h8(DOM7h8), dAb7h9(DOM7h9), dAb7h1O(DOM7H10), dAb7h11(DOM7h11), dAb7h12(DOM7h12), dAb7h13(DOM7h13), dAb7h14(DOM7h14), dAb7p1(DOM7p1) 및 dAb7p2(DOM7p2)(이들 서열의 공개에 대해서는 WO2008096158호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb와 경쟁한다. 대안적인 명칭을 dAb 뒤에 괄호 안에 나타내었으며, 예를 들어, dAb8은 dAb10의 대안적인 명칭을 가지며, 즉 dAb8(dAb10)이다.
특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, DOM7h-11, DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 및 DOM7m-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고,
MSA-16, MSA-26,
DOM7m-16(서열 번호 473), DOM7m-12(서열 번호 474), DOM7m-26(서열 번호 475), DOM7r-1(서열 번호 476), DOM7r-3(서열 번호 477), DOM7r-4(서열 번호 478), DOM7r-5(서열 번호 479), DOM7r-7(서열 번호 480), DOM7r-8(서열 번호 481), DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7M-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7r-15(서열 번호 499), DOM7r-16(서열 번호 500), DOM7r-17(서열 번호 501), DOM7r-18(서열 번호 502), DOM7r-19(서열 번호 503), DOM7r-20(서열 번호 504), DOM7r-21(서열 번호 505), DOM7r-22(서열 번호 506), DOM7r-23(서열 번호 507), DOM7r-24(서열 번호 508), DOM7r-25(서열 번호 509), DOM7r-26(서열 번호 510), DOM7r-27(서열 번호 511), DOM7r-28(서열 번호 512), DOM7r-29(서열 번호 513), DOM7r-30(서열 번호 514), DOM7r-31(서열 번호 515), DOM7r-32(서열 번호 516), DOM7r-33(서열 번호 517)(본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392호에 나타나 있는 것이다),
dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 및 dAb7p2로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 DOM7h-11-3 또는 DOM7h-14-10과 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는
DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7r-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494) 또는 DOM7h-27(서열 번호 495)(이 단락의 서열 번호는 WO2007080392호에 나타나 있는 것임), 또는
dAb8, dAb10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 또는 dAb7h14와 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며,
DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495)(이 단락의 서열 번호는 WO2007080392호에 나타나 있는 것임),
dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며,
DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496)(이 단락의 서열 번호는 WO2007080392호에 나타나 있는 것임),
dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Vκ dAb이다.
더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 VH dAb이며, dAb7h30 및 dAb7h31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 dAb7h11 또는 dAb7h14이다. 일 예에서, dAb는 DOM7h-11-3이다. 다른 예에서, dAb는 DOM7h-14-10이다.
다른 실시형태에서, dAb, 리간드 또는 길항제는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 상기 아미노산 서열의 임의의 것의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개, 예를 들어 DOM7h-11-3, DOM7h-14-10, dAb7h11 또는 dAb7h14의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다.
혈청 알부민에 결합하는 적합한 카멜리드 VHH는 서열 A(서열 번호 518), 서열 B(서열 번호 519), 서열 C(서열 번호 520), 서열 D(서열 번호 521), 서열 E(서열 번호 522), 서열 F(서열 번호 523), 서열 G(서열 번호 524), 서열 H(서열 번호 525), 서열 I(서열 번호 526), 서열 J(서열 번호 527), 서열 K(서열 번호 528), 서열 L(서열 번호 529), 서열 M(서열 번호 530), 서열 N(서열 번호 531), 서열 O(서열 번호 532), 서열 P(서열 번호 533), 서열 Q(서열 번호 534)와 같은 WO 2004/041862호(Ablynx N. V.) 및 WO2007080392호(VHH 서열 및 이들의 핵산 대응물이 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다)에 개시된 것을 포함하며, 이들 서열 번호는 WO2007080392호 또는 WO 2004/041862호(Ablynx N. V.)에 기재된 것에 상응한다. 특정 실시형태에서, 카멜리드 VHH는 인간 혈청 알부민에 결합하며, WO2007080392호에 개시된 ALB1 또는 서열 번호 518-534 중 임의의 것과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 번호는 WO2007080392호 또는 WO2004/041862호에 기재된 것에 상응한다.
일부 실시형태에서, 리간드 또는 길항제는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하기 위하여 본 명세서에 개시된 임의의 항-혈청 알부민 dAb와 경쟁하는 항-혈청 알부민 dAb를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, 길항제 또는 리간드는 SA(예를 들어, 인간 SA)에 특이적인 결합 부분을 포함하며, 여기서, 이 부분은 WO2008096158호에 기재된 비-면역글로불린 서열을 포함하며, 이들 결합 부분의 개시물, 이들의 생성 및 선택 방법(예를 들어, 다양한 라이브러리로부터의) 및 이들의 서열은 본 명세서에 본 명세서의 본문의 일부로서 참고로 포함된다.
반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민)으로의 컨쥬게이션
일 실시형태에서, (하나 이상의) 반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편 및 유사체)은 본 발명의 TNFR1-결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제와 컨쥬게이트되거나 회합된다. TNFR1 결합 포맷으로 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 WO 2005077042호에 기재되어 있으며, 이 개시물은 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:
· 서열 번호 1(WO 2005077042호에 기재, 이 서열은 본 명세서에 참고로 명백히 포함된다);
· WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 이루어지는 알부민 단편 또는 변이체;
· (a) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 560 내지 566으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체.
TNFR1-결합 포맷으로 사용하기 위한 적합한 알부민, 단편 및 유사체의 추가의 예는 WO03076567호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 개시내용의 일부를 형성한다. 특히 다음의 알부민, 단편 또는 변이체가 본 발명에서 이용될 수 있다:
· WO03076567호, 예를 들어, 도 3에 기재된 인간 혈청 알부민(이 서열 정보는 참고로 본 명세서에 명백히 포함됨);
· 화학식 분자량이 66,500인 585개 아미노산의 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 사슬로 이루어진 인간 혈청 알부민(HA)(문헌[Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975)]; 문헌[Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975)]; 문헌[Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981)]; 문헌[Minghetti, et al., J. Biol Chem. 267:6747 (1986)] 참조);
· 문헌[Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 57:219 (1973)]에 기재된 알부민의 다형성 변이체 또는 유사체 또는 단편;
· 제EP 322094호에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-373., HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), 및 HA(1-419) 및 1-369와 1-419 사이의 단편;
· 제EP 399666호에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-177) 및 HA(1-200), 및 HA(1-X)간의 단편(여기서 X는 178 내지 199의 임의의 수임).
(하나 이상의) 반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)이 본 발명의 TNFR1-결합 폴리펩티드, dAb 및 길항제를 포맷화하는 데 사용되는 경우, 이는 예를 들어, 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 뉴클레오티드 작제물을 사용하여 TNFR1-결합 부분(예를 들어, 항-TNFR1 dAb)으로의 직접 융합과 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 컨쥬게이트될 수 있으며, 여기서, 융합 단백질은 TNFR1 결합 부분에 N- 또는 C-말단으로 위치한 반감기 연장 부분을 가지는 단일 폴리펩티드 사슬로 엔코딩된다. 대신에, 컨쥬게이션은 부분 사이에 펩티드 링커, 예를 들어, WO03076567호 또는 WO2004003019호(이들 링커에 대한 기재는 본 발명에서 사용하기 위한 실시예를 제공하기 위하여 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 펩티드 링커를 사용하여 달성할 수 있다. 전형적으로, 생체 내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 생체 내에서 자연적으로 발생하고, 개체(예를 들어, 인간)로부터 원하지 않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 내성인 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체 내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액 내에서 발견되는 단백질, 혈관-뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국소화된 단백질, 스트레스 단백질, 질환-특이적 단백질, 또는 Fc 수송에 수반되는 단백질로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용을 통해 기재된 본 발명의 실시형태에서, 숙련자는 본 발명의 길항제 또는 리간드에서 항-TNFR1 단일 가변 도메인("dAb")을 사용하는 것 대신에, TNFR1에 결합하는 본 발명의 dAb의 CDR(예를 들어, 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어 친화체, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상으로 이식된 CDR)의 하나 이상 또는 3개 모두를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 사용할 수 있는 것이 고려된다. 따라서, 전체로서 상기 개시내용은 dAb 대신에 이들 도메인을 사용한 길항제의 개시를 제공하는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 면에서, 단백질 스캐폴드에 기초하여 다양한 라이브러리를 생성하는 방법 및 이들 라이브러리로부터의 도메인의 선택 및 특성화에 관해서는 그 개시물이 참고문헌으로 포함되는 WO2008096158호를 참조하길 바란다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 길항제는 TNFR1에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체(dAb) 또는 적합한 포맷의 이러한 dAb의 상보성 결정 영역을 포함한다. 길항제는 이러한 dAb로 이루어지거나 이러한 dAb로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 길항제는 항체 포맷(예를 들어, IgG-형 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)과 같은 적합한 포맷의 dAb(또는 dAb의 CDR)를 포함하는 폴리펩티드, 또는 TNFR1에 결합하는 dAb 및 다른 표적 단백질, 항원 또는 에피토프(예를 들어, 혈청 알부민)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb 및 길항제는 해당 분야에 공지된 다양한 적합한 항체 포맷, 예를 들어, IgG-형 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 상기의 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH, VL), dAb 및 상기의 것 중 임의의 것의 변형된 버전(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 다른 적합한 중합체의 공유적 부착에 의한 변형)으로 포맷화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 IgG-형 포맷인 리간드(예를 들어, 항-TNFR1 길항제)를 제공한다. 이러한 포맷은 IgG　분자의 통상적인 4개 사슬 구조(2개의 중쇄와 2개의 경쇄)를 가지며, 여기서, 가변 영역(VH 및/또는 VL)의 하나 이상이 본 발명의 dAb로 대체된다. 일 실시형태에서, 각 가변 영역(2개 VH 영역 및 2개 VL 영역)은 dAb 혹은 단일 가변 도메인으로 대체되며, 이 중 적어도 하나는 본 발명에 따른 항-TNFR1 dAb이다. IgG-형 포맷으로 포함되는 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 동일하거나 상이한 특이성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, IgG-형 포맷은 4가이고, 1개(예를 들어, 오직 항-TNFR1 만), 2개(예를 들어, 항-TNFR1 및 항-SA), 3개, 혹은 4개의 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, IgG-형 포맷은 단일특이성일 수 있고, 동일한 특이성을 가지는 4개 dAb를 포함하거나; 이중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 3개 dAb 및 상이한 특이성을 가지는 다른 dAb를 포함하거나; 이중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 2개 dAb 및 이와는 상이한 공통의 특이성을 가지는 다른 2개 dAb를 포함하거나; 삼중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 제1 및 제2 dAb, 다른 특이성을 가지는 제3 dAb 및 제1, 제2 및 제3 dAb와 다른 특이성을 가지는 제4 dAb를 포함하거나; 또는 사중특이성이며, 각기 다른 특이성을 가지는 4개 dAb를 포함할 수 있다. IgG-형 포맷(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv)의 항원 결합 단편이 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, IgG-형 포맷 또는 항원-결합 단편은 TNFR1에 대하여 1가일 수 있다. 보체 활성화 및/또는 항체 의존적 세포독성(ADCC) 기능이 요구된다면, 그 리간드는 IgG1-형 포맷일 수 있다. 필요에 따라, IgG-형 포맷은 Fc 수용체로의 결합 및/또는 보체를 고정시키는 능력을 최소화하기 위하여, 돌연변이된 불변 영역(변이체 IgG 중쇄 불변 영역)을 포함할 수 있다(예컨대, 문헌 [Winter et al., GB 2,209,757 B]; 문헌[Morrison et al., WO89/07142]; 문헌[Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994] 참조).
본 발명의 리간드(예를 들어, 폴리펩티드, dAb 및 길항제)는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합되는 제1의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 융합 단백질로서 포맷화될 수 있다. 필요에 따라, 이러한 포맷이 반감기를 연장하는 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로 표적에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인의 배향, 그리고 상기 리간드가 링커를 포함하는지의 여부는 설계상 선택의 문제이다. 그러나 링커가 있든 없든 일부 배향은 다른 배향보다 더 우수한 결합 특성을 제공할 수 있다. 본 발명에 포함되는 모든 배향(예컨대, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)은 스크리닝에 의해 용이하게 동정될 수 있는 바람직한 결합 특성을 제공하는 배향을 포함하는 리간드이다.
dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 비롯한 본 발명에 따른 dAb 및 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 힌지 영역을 임의로 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 서열로서 Fc 영역에 연결된 리간드를 엔코딩하는 벡터를 사용하여, 이러한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
더욱이, 본 발명은 상술된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 다량체를 제공한다.
실시예
항-TNFR1 dAb의 나이브 선택
TNF 수용체 1(p55)의 신호전달을 억제하는 2가지 상이한 메커니즘이 기재되어 있다(WO2006038027호). 첫번째는 도메인 항체가 에피토프에서 TNFR1에 결합하고, 여기서 이 결합이 TNFα의 그의 수용체로의 결합과의 직접적인 경쟁에 의한 신호전달의 억제로 이루어진다. 이러한 경쟁은 예를 들어, 수용체를 고체 지지체에 코팅하는 시험관 내 수용체 결합 검정에서 결정될 수 있으며, 수용체로의 결합에 대한 도메인 항체와 비오티닐화된 TNFα의 경쟁은 예를 들어, 스트렙트아비딘-HRP를 사용한 잔류 비오티닐화된-TNFα 결합의 측정을 통해 결정된다. 경쟁적 TNFR1 억제제는 TNFα의 그의 수용체로의 결합을 차단하여, TNFα 신호를 남기지 않을 것이다. 역으로, 비-경쟁적 TNFR1 억제제는 TNFα의 수용체로의 결합에 거의 영향을 갖지 않을 것이며, 심지어 μM 농도의 억제 dAb의 존재 하에서도 비오티닐화된 TNFα에 대한 지속적인 판독을 초래한다. 기능 세포 검정에서, 예를 들어, 인간 MRC5 섬유모세포 세포주는 예를 들어, 낮은 수준의 TNFα(10-200 pg/㎖, 18시간 동안)로 자극시에 IL-8을 방출하나, 경쟁적 및 비-경쟁적 억제제는 용량 의존적 방식으로 IL-8 방출을 감소시킨다. 후자는 세포-기반 시스템에서 둘 모두의 유형의 억제제에 대한 기능 활성을 나타낸다. 따라서, 구체적인 목적은 TNFR1에 결합하며, 세포 검정에서 TNFR1의 기능 활성을 억제하는 도메인 항체를 분리하는 것이었으나, 이들 도메인 항체는 TNFR1으로의 결합을 위해 TNFα와 (실질적으로) 경쟁하지 않아야 한다.
비-경쟁적, TNFR1-결합 dAb를 분리하기 위하여, 선택 전략은 이러한 서브-클래스의 dAb를 농축(enrich)하도록 설계되었다. 이 방법은 도만티스(Domantis)의 4G 및 6G 나이브 파지 라이브러리로 이루어지며, 파지 라이브러리는 4G에 대해서는 GAS1 리더 서열(WO2005093074호 참조)로부터 발현된 항체 단일 가변 도메인을 나타내며, 6G에 대해서는 추가로 열/냉 사전선택(WO04101790호 참조)을 갖는다. 이들 파지 라이브러리를 1 라운드(round)에서 200 nM의 비오티닐화된 인간 TNFR1 (R&D systems, 카달로그 번호 636-Rl/CF, 제조처의 지시에 따라 EZ-Link NHS-LC-LC-비오틴(Pierce 카달로그 번호 21343)를 사용하여 비오티닐화)와 함께 인큐베이션시키고, 이어서 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드 상에서 풀-다운(pull-down)시켰다. 2 및 3 라운드에서, 파지를 TNFR1(200 nM - 2 라운드, 75 nM - 3 라운드)과 함께 사전-인큐베이션시킨 다음, 비오티닐화된 TNFα(Peprotech 카달로그 번호 300-01A) (200 nM - 2 라운드, 75 nM - 3 라운드)와 함께 사전-인큐베이션시키고, 이어서 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드 상에서 풀-다운시켰다. 모든 라운드에서, 비드를 세정하여, 약하게 결합한 파지를 제거하고, 결합된 파지를 트립신 분해에 의해 용출시킨 후 증폭시켰다. 이론적 근거는 TNFα의 존재 하에서 TNFR1에 결합할 수 있는 dAb가 특이적으로 농축될 것이나, TNFα와 경쟁하는 dAb는 자기 비드로의 TNFα 결합에 이러한 에피토프가 필요하기 때문에 풀-다운되지 않을 것이라는 점이다. 이러한 실험적 설계를 사용하여, 3 라운드의 파지 선택을 행하고, 라운드 2 및 3 둘 모두를 pDOM5 이. 콜라이 발현 벡터(PCT/EP2008/067789호; WO2009/002882호 참조) 내로 클로닝하였고, dAb 발현 및 BIAcore™ 상에서의 TNFR1 결합에 대한 스크리닝으로 이어졌다. pDOM5 벡터는 pUC119-기반의 벡터이다. 단백질의 발현은 LacZ 프로모터에 의해 구동된다. GAS1 리더 서열(WO 2005/093074호 참조)은 분리된, 용해성 dAb의 주변세포질 및 이. 콜라이의 배양 상층액으로의 분비를 보장한다. dAb를 이러한 벡터에 Sal1/Not1으로 클로닝하였으며, 이는 dAb의 C-말단에 myc 태그를 첨부한다. 결합 dAb를 50 ㎖ 규모로 발현시키고, 기능 특성화를 위해 친화성 정제하였다. 이는 MRC5 세포 검정(후술되는 바와 같은)에서 TNFα-매개의 신호전달의 억제뿐 아니라, 수용체 결합 검정(후술되는 바와 같은)에서 TNFR1으로의 TNFα 결합의 억제의 결정으로 이루어진다. 6000개의 상층액의 스크리닝으로 많은 TNFR1 결합제를 제공하였다. 그러나, 대다수는 무관한 에피토프에 결합하고, 결과적으로 세포 검정 또는 수용체 결합 검정 중 어느 것에서 활성을 갖지 않거나 수용체 결합 검정에서 나타나는 바와 같이 경쟁적이었다. 그럼에도 불구하고, 1) BIAcore 상에서 TNFR1에 결합하고(도 1), 2) MRC5 세포 검정에서 TNFα를 억제하면서(도 2), 3) 수용체 결합 검정에서 TNFα 경쟁을 보이지 않는 이러한 대다수의 dAb의 서열 분석으로, 5개의 독특한 dAb를 동정하였다(DOM1h-543에 대한 데이터는 도면에 나타내지 않음). 이들 5개의 dAb는 DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-543, DOM1h-549 및 DOM1h-574였다.
변이-유발 돌연변이생성에 의한 선택된 dAb의 시험 성숙
DOM1h-509, DOM1h-510, DOM1h-543, DOM1h-549 및 DOM1h-574의 성숙가능성을 결정하기 위하여, dAb 돌연변이체의 변이-유발 PCR 라이브러리를 제조처의 지시에 따라 제네모프(Genemorph) II 키트(Stratagene (San Diego, USA) 카달로그 번호 200550)를 사용하여 생성하였다. 서열 분석으로, 이들 라이브러리가 아미노산 수준에서 약 2%의 평균 돌연변이율을 갖는 것으로 드러났다. 이들 라이브러리를 파지 벡터 pDOM4 내에 클로닝하고, 파지 상에서 발현시켰다. pDOM4는 사상 파지(fd) 디스플레이 벡터이며, pDOM4는 myc 태그를 갖는 fd 벡터를 기반으로 하며, 여기서 단백질 서열을 제한 부위 사이에 클로닝하여, 단백질-유전자 III 융합을 제공할 수 있다. dAb를 엔코딩하는 유전자를 SalI/NotI 단편으로서 클로닝하였다.
3개의 순차적 라운드의 인큐베이션에 걸쳐 감소량의 비오티닐화된 인간 TNFR1(R&D Systems) (50 nM(1 라운드), 5 nM(2 라운드) 및 0.5 nM(3 라운드))을 사용하여 개선된 결합제에 대한 선택을 행하였다. 3 라운드의 선택 후에, dAb 유전자를 이. 콜라이 발현 벡터 pDOM5 내로 클로닝하고, 발현시키고, 상층액을 결합 동역학의 개선에 대하여 BIAcore로 스크리닝하였다. 모든 5개의 모 계통으로부터 유래된 변이체를 스크리닝하였다; DOM1h-574 계통으로부터의 dAb는 BIAcore 상에서 스크리닝할 때 해리도에서 상당한 개선을 나타내었다. 해리도에서 가장 확연한 개선을 갖는 dAb를 정제하고, MRC5 세포 검정에서 특성화시켰으며(표 1 및 도 4), 가장 뛰어난 dAb는 DOM1h-574-7, DOM1h-574-8, DOM1h-574-10, DOM1h-574-11, DOM1h-574-12 및 DOM1h-574-13이다. 이들 돌연변이의 시험으로부터, 본 발명자들은 본 발명자들의 판단을 시험하고, 친화성 개선의 원인이 될 위치 및 돌연변이, 특히 V30G, G44D, L45P, G55D, H56R 및 K94I(카바트 넘버링)를 동정하였다. 추가의 효과의 조사에서, 본 발명자들은 이들 특정 돌연변이를 단일의 dAb로 결합시킨 신규한 dAb 변이체를 생성하였다. DOM1h-574 주형을 사용하여 엔지니어링한 신규 변이체는 DOM1h-574-14(G55D, H56R 및 K94I), DOM1h-574-15(G55D 및 K94I), DOM1h-574-16(L45P, G55D, H56R 및 K94I), DOM1h-574-17(L45P, G55D 및 K94I), DOM1h-574-18(V30G, G44D, G55D, H56R 및 K94I) 및 DOM1h-574-19(V30G, G44D, G55D 및 K94I)(도 5)였다. MRC5 세포 검정에서의 역가, 및 BIAcore 상에서의 TNFR1에 대한 친화성에 대한 이들 변이체의 특성화로 추가의 개선을 식별하였다(표 1). 가장 강력한 dAb는 DOM1h-574-16이었다.
표 1: DOM1h-574 모 dAb, 및 시험 성숙 동안 동정되고 유익한 돌연변이체의 재조합을 통해 작제된 dAb에 대한 BIAcore 친화성 및 MRC5 세포 검정에서의 역가의 요약. DOM1h-574-16은 BIAcore 상의 가장 높은 친화성과 MRC5 세포 검정에서의 가장 높은 역가를 겸비한다. 값이 결정되지 않은 경우, 이를 표시한다(ND).
Figure pct00001
EC50 측정치를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)으로 결정하였다. DOM1h-574에 대한 EC50 측정치는 DOM1h-574-16의 EC50 측정치의 대략 200배인 것으로 추산된다.
DOM1h -574-16의 종 교차-반응성
항-TNFR1 dAb에 대한 유의미한 이점은 상이한 종 간의 교차-반응성일 것이다. 마우스, 개, 사이노몰구스 원숭이 및 인간 간의 TNFR1의 세포외 도메인의 서열의 제한된 보존을 가정하면(도 6), 임의의 항체 또는 단일 가변 도메인이 이들 상이한 종들의 TNFR1을 유사한 친화성으로 인식하는 것은 특별한 것이다. 따라서, 본 발명자들은 BIAcore 상에서 마우스 TNFR1(R&D systems 카달로그 번호 425-R1-050/CF), 개 TNFR1(R&D Systems 카달로그 번호 4017-TR-025/CF) 및 인간 TNFR1(R&D Systems)에 결합하는 DOM1h-574-16의 능력을 시험하였다. 마우스 실험을 위해, TNFR1을 제조처의 지시에 따라 EZ-Link NHS-LC-LC-비오틴(Pierce 카달로그 번호 21343)을 사용해 비오티닐화시키고, 비오티닐화된 TNFR1의 스트렙트아비딘-코팅된 BIAcore 칩으로의 결합으로 이어졌다(마우스 실험). 인간 및 개 TNFR1을 위해, 아민-커플링된 TNFR1을 사용하였다. 그 후에, DOM1h-574-16을 인간, 마우스 및 개 TNFR1 위에 주입하고, 결합을 BIAcore 상에서 모니터링하였다. 상이한 종으로의 결합에 대한 예를 도 7 및 8에 나타내었으며, 결과의 요약을 표 2에 나타내었다. 명백하게, DOM1h-574-16은 본 발명자들이 이전에 기재한(WO2008149148호) 경쟁적 항-TNFR1 dAb DOM1h-131-206과 달리, 상이한 TNFR1 종에 대한 고친화성 결합을 나타내며, 상기 경쟁적 항-TNFR1 dAb DOM1h-131-206은 사실상 마우스 TNFR1으로의 결합을 나타내지 않았으며, 개 TNFR1으로의 매우 약한 결합만을 나타내었다.
표 2: BIAcore로 결정시 마우스, 개 및 인간 TNFR1에 대한 DOM1h-131-206 및 DOM1h-574-16의 결합 친화성. *= BIAcore에 의해 매우 약한 친화성으로 결정(> μM).
Figure pct00002
데이터를 바이오이밸류에이션(Bioevaluation) 3.1 패키지를 사용하여 산출하였다.
다음으로, DOM1h-574-16이 마우스 세포(L929)의 TNFα-매개의 세포독성을 억제하는 능력 및 사이노몰구스 원숭이 세포(CYNOM-Kl)의 TNFα-매개의, IL-8 방출을 억제하는 능력을 평가하였다. 표준 마우스 L929 및 CYNOM-Kl 세포 검종 둘 모두를 이전에 기재된 바와 같이(WO2006038027호) 그리고 후술되는 바와 같이 수행하였다. 약술하면, 마우스 L929 세포를 액티노마이신 D 및 소정의 용량 범위의 DOM1h-574-16의 존재 하에서 100 pg/㎖의 마우스 TNFα와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 18시간 후에, 세포 생존력을 검사하고, DOM1h-574-16 농도에 대해 작도하였다. 사이노몰구스 원숭이 CYNOM-Kl 세포 검정에서, 세포를 소정의 용량 범위의 DOM1h-574-16의 존재 하에서 TNFα(200 pg/㎖)로 18시간 동안 자극시켰다. 인큐베이션 후에, 배지를 제거하고, IL-8의 수준을 결정하였다. 중화 퍼센트를 DOM1h-574-16의 농도에 대해 작도하였다. 두 세포 유형 모두에 대하여, DOM1h-574-16은 TNFα-매개의 효과를 효과적으로 억제할 수 있었다. 이들의 역가는 마우스 표준 L929 세포-기반의 검정에서 약 250 nM이었으며, 사이노몰구스 원숭이 CYNOM-Kl 검정에서 약 10 nM이었다(도 9 및 10). 이들 결과는 세포-기반의 검정에서의 DOM1h-574-16의 기능적, 종 교차-반응성을 나타낸다.
DOM1h -574의 친화성 성숙
이러한 시험 성숙 및 조합 돌연변이의 결과에 기초하여, 추가의 친화성 성숙을 위한 주형으로서 DOM1h-574-14를 사용하는 것으로 결정하였다. 이러한 특정 dAb가 가장 강력하지는 않았지만, 이것이 생식계 DP47 프레임워크에 비해 어떤 프레임워크 돌연변이도 가지지 않아, 이에 따라 선별하였다. 친화성 성숙을 위해, 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 CDR을 증폭시킴으로써 DOM1h-574-14의 CDR을 랜덤화시켰다: AS1029 및 AS339(CDRl), AS1030 및 AS339(CDR2), 및 AS1031 및 AS339 (CDR3). 각각의 라이브러리에 대한 2차 PCR 단편을 하기의 올리고뉴클레오티드 조합을 사용하여 만들었다: AS1031' 및 AS9(CDRl), AS1032 및 AS9(CDR2), AS1033 및 AS9(CDR3). SOE PCR(Horton et al. Gene, 77, p61 (1989))을 사용하여, 2가지 CDR1 PCR 생성물을 합하여, CDR1 라이브러리를 생성하였으며, CDR2 라이브러리를 위해서는 CDR2 생성물 및 CDR3 라이브러리를 위해서는 CDR3 생성물을 합하였다. 그 다음, 모든 반응을 위하여, SOE 생성물을 WO2006018650호에 기재된 바와 같이, 네스티드(nested) 프라이머 AS639 및 AS65를 사용하여 증폭시키고, pIE2aA2 벡터 내로 Sall/NotI 라이게이션시켰다. 랜덤화 올리고뉴클레오티드(AS1029, AS1030 및 AS 1031)는 고정된 위치(대문자로 표시하고 여기서 100%의 올리고뉴클레오티드가 그 위치에 지시된 뉴클레오티드를 갖는다) 및 혼합된 뉴클레오티드 조성(소문자로 표시하고 이 경우에 85%의 올리고뉴클레오티드가 이 위치에서 우성의 뉴클레오티드를 가질 것이며, 15%는 남아있는 3개의 뉴클레오티드 사이에 동일한 분리를 가질 것이다)으로 이루어진다. DNA-디스플레이 작제물 pIE2aA2를 사용하여 3개의 상이한 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리의 분취물을 이. 콜라이를 형질전환시키는데 사용하고 시퀀싱하였다. 모 클론에 비해, 친화성 성숙 라이브러리는 CDR에 대해 많은 돌연변이를 함유하였다. 에멀젼에서 시험관 내 구획화(compartmentalisation) 및 scArc DNA 결합 단백질을 통한 DNA 디스플레이를 사용하여 선택을 수행하였다(WO2006018650호 참조). 총 13 라운드의 선택을 수행하면서, 라이브러리가 분리되게 유지하였다. 20, 20, 10 및 10 nM의 비오티닐화된 인간 TNFR1(R&D Systems)을 사용한 4 라운드의 평형 선택은 150분 이하 동안의 130 nM의 비오티닐화되지 않은 hTNFR1 및 5nM의 비오티닐화된 hTNFR1의 존재 하에서의 7 라운드의 오프-레이트 선택으로 이어졌다. 표지되지 않은 hTNFR1은 경쟁자였다. 또한, 풀링된 라이브러리를 사용하여 선택을 하였다(풀링된 라이브러리에 대하여 총 14 라운드의 선택). 선택 과정 동안 라이브러리 적합성을 리얼-타임(real-time) PCR로 검정하였다. 사용된 방법의 원리를 후술한다: qPCR에 의한 폴리클로날 집단 적합성의 시험관 내 적정은 용액 조건에서 시험관 내 발현 반응 후에 표면-결합 항원에 의해 포획된 dAb-scArc 단백질과의 복합체 내의 엔코딩 DNA의 양을 측정함으로써 폴리클로날 dAb 집단의 평균 친화성의 반정량적 측정치를 제공한다(유전형-표현형 연결 없음). 회수되는 투입 DNA의 분획이 더 많으면, 폴리클로날 dAb 집단이 더 강력하다. 적합한 기준은 모 클론의 무관한 항원으로 코팅된 비특이적인 표면으로의 결합 수준 및 표적 항원으로 코팅된 표면으로의 특이적인 결합이다. 상이한 선택 단계 동안 회수된 DNA 주형을 0.1 mg/㎖ RNA 용액 중에 1.7 nM 농도로 희석하였다. 시험관 내 발현 반응을 0.3 ㎕의 100 mM 산화된 글루타티온이 보충된 10 ㎕ 부피의 에코프로(EcoPro) T7 이. 콜라이 추출물, 0.05 ㎕의 Roche 사의 340 nM 항-HA mAb 3F10 및 0.5 ㎕의 1.7 nM DNA 주형에서 수행하였다. 스트렙 써모패스트(Strep ThermoFast) 플레이트의 웰을 비오티닐화된 hTNFR1 표적 항원(0.1 ㎕의 30 μM 스톡(stock)/웰) 또는 BSA 음성 대조군(0.1 ㎕의 2 mg/㎖ 스톡/웰)으로 실온에서 1시간 동안 코팅하고, 완충액 C(10 mM Tris, 100 mM KCl, 0.05% Tween 20, 5 mM MgCl2 및 0.1 mM EDTA)를 사용한 3회의 세척으로 이어졌다. 시험관 내 발현 반응을 25 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 완충액 C를 사용하여 100 ㎕로 희석하고, 비오티닐화된 hTNFR1 또는 BSA로 사전 코팅된 스트렙 써모패스트 플레이트(ABgene, UK)의 웰에 2개의 50 ㎕ 분취물로 적용하고, 실온에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하고, 완충액 C로 3회 세정하여, 임의의 미결합 DNA를 제거하였다. 결합 DNA 분자를 올리고뉴클레오티드 AS79 및 AS80, 및 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스(Green Supermix)(Bio-Rad Laboratories, 카달로그 번호 170-8880)를 사용하여 증폭시켰으며, iQ SYBR 그린 슈퍼믹스를 제조처의 지시에 따라 사용하고, 증폭 사이클은 다음과 같았다: 94 ℃에서 2분에 이어서, 94 ℃에서 15초, 60 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 30초의 40 사이클. DNA의 양을 바이오래드 미니옵티콘 리얼-타임 PCR(BioRad MiniOpticon Real-Time PCR) 기계(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)에서 정량화시키고, 바이오-래드 래보러터리즈(Bio-Rad Laboratories)에 의해 제공되는 옵티콘 모니터 버전(Opticon Monitor version) 3.1.32 (2005) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. DNA 농도가 알려져 있는 샘플로부터의 표준 곡선은 반응당 500 내지 5x108개 분자 범위를 커버한다. 10 라운드 이하의 선택까지, 각 라운드가 이전 라운드보다 더 많은 DNA를 회수하였고, 이는 평균 결합 dAb의 수가 증가하고 있는 것을 나타냄에 따라 라이브러리의 적합성이 증가하였다. 이 시점부터 계속 리얼-타임 PCR로 결정시 회수된 DNA 수준의 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 추가의 라운드의 선택이 dAb 친화성의 유의미한 추가의 개선을 제공하지 않았음을 시사한다. 9 및 14 라운드의 선택된 집단을 pDOM13 벡터(WO2008/149148호 참조) 내로 클로닝하고, 시퀀싱하고, 발현시키고, 미정제 형태로 해리 속도 상수에 대하여 BIAcore 검정하였다.
라이브러리 다양성이 크게 감소하였고, 많은 클론이 BIAcore dAb 상층액 스크리닝으로 결정시 개선된(2-3배) 해리 속도 상수를 나타냈음이 밝혀졌다. 이들 개선된 dAb의 DNA 시퀀싱으로 DOM1h-574-25 내지 DOM1h-574-40을 동정하였다.
이들 dAb에 기초하여 동정된 유익한 돌연변이를 하기에 각 CDR에 대해 따로 열거한다(카바트 넘버링에 따른 넘버링):
CDR1: V30은 유익하게 I, L 또는 F로 돌연변이된다.
CDR2: S52는 유익하게 A 또는 T로 돌연변이되고,
N52a는 유익하게 D 또는 E로 돌연변이되고,
G54는 유익하게 A 또는 R로 돌연변이되고,
T57은 유익하게 R, K 또는 A로 돌연변이되고,
A60은 유익하게 D, S, T 또는 K로 돌연변이되고,
D61은 유익하게 E, H 또는 G로 돌연변이되고,
S62는 유익하게 A 또는 T로 돌연변이된다.
CDR3: E1OO은 유익하게 Q, V, A, D 또는 S로 돌연변이되고,
D101은 유익하게 E, V, H 또는 K로 돌연변이된다.
먼저, 클론 DOM1h-574-30, -31, -38 및 -39의 CDR1+2를 클론 DOM1h-574-25, -27, -28, -29 및 -32의 CDR3과 미니-라이브러리로 재조합시켰다. 이들 dAb가 BIAcore 친화성에서 가장 큰 개선을 갖는 dAb를 나타냄에 따라 이들 dAb를 선택하였고, 이에 따라, 이들 dAb의 조합은 개선된 친화성을 갖는 신규 서열을 동정할 최상의 기회를 가질 것이다. 생성된 재조합된 dAb는 DOM1h-574-65 내지 DOM1h-574-79 및 DOM1h-574-84 내지 DOM1h-574-88이었으며, 이 중에서 DOM1h-574-72(서열 번호 2)가 가장 강력하였다. 이후에 -72를 주형으로 사용하고, 아미노산 변화를 도입시켜, 클론 DOM1h-574-89 내지 DOM1h-574-93, DOM1h-574-109 내지 DOM1h-574-149 및 DOM1h-574-151 내지 DOM1h-574-180을 생성함으로써, 이러한 dAb를 사용하여 개별 아미노산 돌연변이의 유용성을 평가하였다. 대부분의 이들 클론을 발현시키고, 정제하고, BIAcore 상의 결합, MRC5 세포 검정에서의 역가 및 트립신 분해에 대한 내성으로 결정되는 프로테아제 안정성에 대하여 검정하였다. 프로테아제 안정성은 PBS 중의 1 mg/㎖의 dAb를 감소하는 양의 트립신(Promega, V511A 트립신)과 함께 인큐베이션함으로써 결정하였다. 인큐베이션을 5가지의 상이한 농도의 트립신(34, 17, 8.5, 4.25 및 2.13 ㎍/㎖)뿐 아니라 트립신이 없는 대조군에서 수행하였다. 37 ℃에서 3시간의 인큐베이션 후에, 로딩 염료를 첨가함으로써 단백질 가수분해 반응을 중단시키고, 잔류하는 비절단된 dAb의 양을 랩칩(LabChip) 90 시스템(Caliper Life Sciences)에서 결정하였다. 가장 개선된 클론은 친화성 성숙을 위해 사용된 출발 dAb인 DOM1h-574-16에 비해 약 30-배의 역가 개선을 가졌다. MRC5 세포 검정에서 가장 강력한 것은 DOM1h-574-109, DOM1h-574-132, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180(도 11)이다.
놀랍게도, 한편으로는 친화성/역가 및 다른 한편으로는 프로테아제 안정성을 위한 구조적 결정자가 상이한 것으로 밝혀졌다. 대부분의 열거된 돌연변이가 친화성을 BIAcore로 결정시 서브(sub)-nM 범위로 개선시키는 데 반해, 이들은 또한 트립신 내성의 감소를 야기하였다(dAb의 프로테아제 안정성을 결정하는 적합한 검정에 대한 더 많은 설명에 대해서는 WO2008149143호 및 WO2008149148호 참조). 반면, 돌연변이 D1O1V(카바트 넘버링)는 비록 임의의 다른 시험된 서열에 비해 dAb 친화성의 약 2-배 감소의 희생이 있었지만, 최적의 프로테아제 안정성과 매우 빈번하게 관련되었다. 프로테아제에 대해 가장 안정성인 dAb는 DOM1h-574-93, DOM1h-574-123, DOM1h-574-125, DOM1h-574-126, DOM1h-574-129, DOM1h-574-133, DOM1h-574-137 및 DOM1h-574-160(도 12)이다.
가장 유망한 DOMO1OO dAb 의 특성화
BIAcore 결합 및 MRC5 세포 검정 역가에 대한 데이터에 기초하여, TNFR1에 대한 결합 동력학, 세포 검정에서의 역가 및 생물물리학적 특성의 추가의 특성화를 위해 12개의 DOMO1OO dAb의 서브셋을 선택하였다. 모든 이들 실험을 위해, dAb를 이. 콜라이에서 발현시키고, 단백질 A 스트림라인(streamline)을 사용하여 정제하고, PBS 중에서의 투석으로 이어졌다. 이러한 특성화를 위해 사용된 12개의 dAb는 DOM1h-574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-126, DOM1h-574-133, DOM1h-574-135, DOM1h-574-138, DOM1h-574-139, DOM1h-574-155, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180이었다. 특정 실험을 위해 DOM1h-574-16을 참조로 포함하였다(도 13).
DOMO1OO dAb (항- TNFR1 dAb )의 결합 특성
BIAcore는 상이한 dAb의 회합 및 해리 속도를 결정하기 위하여, 그리고 인간 및 마우스 TNFR1 둘 모두에 대한 이들의 결합 친화성을 입증하는 방식으로 행하였다. 각각의 종의 비오티닐화된 TNFR1(R&D Systems)을 사용하여 실험을 행하였으며, 스트렙트아비딘-코팅된 BIAcore 칩으로 커플링시키고, 이어서 소정의 농도 범위의 dAb를 주입하였다. 결과를 표 3에 약술한다. 모든 dAb는 인간 TNFR1에 대한 높은 친화성(KD <350 pM) 결합뿐 아니라 마우스 TNFR1에 대한 우수한 친화성(KD <7 nM)을 보여준다. 이러한 인간과 마우스 TNFR1 간의 약 20-배의 dAb 친화성의 차이는 마우스와 인간 TNFR1 간의 제한된 서열 상동성을 고려할 때 꽤 놀라운 것이며, 이는 수용체 내의 고도로 보존된 모티프의 표적화를 나타낼 것이다.
표 3: 인간 및 마우스 TNFR1에 대한 DOMO1OO dAb의 회합 및 해리의 BIAcore 분석. 가장 강력한 항-인간 TNFR1 dAb가 또한 가장 강력한 항-마우스 TNFR1 dAb인 경향이 있으며, 예를 들어 DOM1h-574-138 및 DOM1h-574-156이다.
Figure pct00003
DOMO1OO dAb 의 생물물리학적 특성
DOMO1OO dAb를 이들의 생물물리학적 특성에 대하여 추가로 특성화하였으며, 상기 생물물리학적 특성은 이들의 프로테아제 안정성, 열 안정성 및 용액-내의 상태를 포함한다. 프로테아제 안정성을 PBS 중의 1 mg/㎖의 dAb를 감소하는 양의 트립신(Promega, V511A 트립신)과 함께 인큐베이션함으로써 결정하였다. 인큐베이션을 5가지의 상이한 농도의 트립신(34, 17, 8.5, 4.25 및 2.13 ㎍/㎖)뿐 아니라 트립신이 없는 대조군에서 수행하였다. 37 ℃에서 3시간의 인큐베이션 후에, 로딩 염료를 첨가함으로써 단백질 가수분해 반응을 중단시키고, 잔류하는 비절단된 dAb의 양을 랩칩 90 시스템(Caliper Life Sciences)에서 결정하였다. 대조군 반응물에 존재하는 양의 퍼센트로서 양을 정량화하고 표 4에 약술한다. DOMO1OO dAb의 열 안정성은 시차주사열량계(DSC) 기기(MicroCal, MA)를 사용하여 결정하였다. PBS 중의 1 mg/㎖의 dAb를 기기 내에서 인큐베이션시키고, 용융 온도를 결정하였다. 결과를 표 4에 약술한다. 마지막으로, dAb의 용액-내의 상태는 크기 배제 크로마토그래피 및 멀티-앵글 레이져 광산란(multi-angle laser light scattering; SEC-MALLS)을 사용하여 결정하였다. dAb를 PBS 중의 1 mg/㎖로 SEC-MALLS 상에 주입하고, 주요 피크의 질량을 결정하였다. DOMO1OO dAb는 이들의 용액-내의 상태에 기초하여, 단량체 또는 이량체 중 어느 하나의 2개의 그룹으로 나눌 수 있다. 요약에 대해 표 4를 참조하길 바란다.
표 4: DOMO1OO dAb의 생물물리학적 특성의 요약. 목표하는 dAb 내의 특성의 조합은 높은 트립신 안정성, 높은 열 안정성 및 용액-내의 단량체 상태인데, 이는 수용체 가교결합 및 이후의 활성의 작용 또는 결여를 막기 위한 것이다. 표는 37 ℃에서의 34 ㎍/㎖ 트립신과의 3시간의 인큐베이션 후의 잔류 활성을 t0에서의 활성의 퍼센트로서 열거한 것이다. 용융 온도(Tm)를 DSC로 결정하고, SEC-MALLS로 용액-내의 상태를 결정하였다. 상기 표는 트립신에 가장 안정성인 dAb(DOM1h-574-133)가 이량체여서, 바람직하지 않음을 나타낸다. 최적의 조합의 특성을 갖는 dAb는 DOM1h-574-109, DOM1h-574-156 및 DOM1h-574-162이다. 여기서, 결정되지 않은 값을 표시하였다(ND).
Figure pct00004
DOMO1OO dAb 의 기능적 특성화
DOMO1OO dAb를 후술되는 인간 MRC-5 세포 검정, 마우스 L929 세포주 및 사이노몰구스 원숭이 CYNOM-K1 세포주를 사용하여 기능 활성 및 교차-종 반응성에 대해 특성화하였다. 인간 TNFR1 신호전달의 기능적 억제를 위하여, 인간 섬유모세포주 MRC-5를 소정의 용량 범위의 dAb와 함께 인큐베이션시킨 다음, 200 pg/㎖의 TNFα(Peprotech)로 18시간 동안 자극시켰다(20pg/㎖의 마우스 TNFα(R&D Systems)를 L929 검정을 위해 사용한 것을 제외하고). 이러한 자극 후에, 배지를 제거하고, TNFα에 대한 반응으로 세포에 의해 생성된 배지 중의 IL-8의 수준을 ABI8200(Applied Biosystems)을 사용하여 결정하였다. IL-8의 분비를 차단하는 dAb의 능력은 이들이 얼마나 TNFR1-매개의 신호전달을 잘 억제하는지에 대한 기능적 판독이다. MRC5 세포 검정에서 12가지 DOMO1OO dAb를 시험한 결과를 표 5에 나타낸다. 기능적 마우스 교차-반응성을 마우스 L929 세포주를 사용하여 결정하였으며, 여기서 TNFα-유도된 세포독성에 대해 12가지 DOMO1OO dAb에 의해 제공되는 보호의 수준을 평가하였다. 본 검정에서, 세포를 소정의 용량 범위의 dAb와 함께 다시 인큐베이션시키고, 액티노마이신의 존재 하에서의 TNFα로의 자극으로 이어졌다. 밤샘 인큐베이션 후에, 세포의 생존력을 측정하고, dAb 농도에 대하여 작도하였다. DOMO1OO dAb는 TNFα 세포독성에 대해 보호되었으며, 20-40 nM 범위의 ND50 값을 초래하였다. 인간 MRC5 세포와 마우스 L929 세포 간에 관찰된 DOMO1OO dAb의 역가 차이는 BIAcore로 측정된 친화성의 차이와 유사한 세기 순서이다. 마지막으로, dAb의 사이노몰구스 원숭이 교차-반응성을 CYNOM-K1 세포주를 사용하여 시험하였다. 간단하게, dAb를 CYNOM-K1 세포(ECACC 90071809)(5x1O3개 세포/웰)와 함께 평평한 바닥의 세포 배양 플레이트에서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 재조합 인간 TNF 알파(Peprotech)를 첨가하고(200pg/㎖의 최종 농도), 플레이트를 18 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 분비된 IL-8의 수준을 제조처의 지시(문서 번호 750364.16 버전 11/08)에 따라 듀오셋(DuoSet) ELISA 디벨롭먼트(development) 시스템(R&D Systems, 카달로그 번호 DY208)을 사용하여 배양 상층액 중에서 측정하였다. dAb 농도를 IL-8 분비 억제의 퍼센트에 대하여 작도함으로써 ND50을 결정하였다. DOMO1OO dAb에 대한 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5: 상이한 종에 대한 세포-기반 검정에서의 DOMO1OO dAb의 기능 활성의 요약. 제시된 모든 값은 각각의 세포 검정에서 결정된 ND50 값(nM 단위)이며, ND는 결정되지 않음을 나타낸다. MRC5 검정에서 DOMO1OO dAb 간의 차이가 제한적이지만, 마우스와 사이노몰구스 세포 검정에서 관찰되는 것과 동일한 경향을 따른다. 종들에 걸쳐, DOM1h-574-156, DOM1h-574-109 및 DOM1h-574-138은 가장 강력한 dAb이다. MRC5 검정을 위해, 본 발명자들은 S자형으로 판단되었던 곡선을 취하였다. 이들 곡선으로부터의 평균값을 표에 나타낸다.
Figure pct00005
DOMO1OO dAb 에 대한 에피토프 맵핑
DOMO1OO dAb의 TNFR1 상의 결합 에피토프가 활성의 메커니즘과 관련될 수 있기 때문에, TNFR1 내의 어떤 잔기가 DOMO1OO dAb에 의해 인식되는지를 규명하기 위해 많은 노력을 하였다. 2가지 실험 방법을 선택하여 에피토프를 규명하였다: 1) BIAcore 에피토프 경쟁 및 2) 부분적으로 중첩하는 펩티드를 사용한 펩티드 스캐닝.
1) BIAcore 에피토프 경쟁:
2가지 상이한 항체 또는 항체 단편 간의 경쟁이 TNFR1 상의 단일의 에피토프에 대해 존재하는지를 결정하기 위한 정성적 방법을 BIAcore에 의해 행할 수 있다(Malmborg, J. Immunol. Methods 183, p7 (1995)). 이 목적을 위하여, 비오티닐화된-TNFR1을 BIAcore SA-칩 상에 코팅하고, 상이한 dAb 또는 항체의 순차적인 주입으로 이어져, 임의의 경쟁 항체(단편)의 부재 하에서의 각각의 항체에 대한 결합 수준을 규명하였다. 그 후에, 동일한 농도의 항체(단편)를 사용하나, 경쟁을 결정할 항체의 주입 직후에 상기 주입을 반복하였다. 결합 항체(단편)를 반응 유닛(RU)으로 정량화하고, 2차 항체의 존재 및 부재 하에서 비교하였다. 두 항체(단편) 간에 경쟁이 존재하지 않는다면, 결합 RU의 수는 다른 항체의 존재 및 부재 하에서와 동일할 것이다. 반대로, 경쟁이 존재한다면, 2차 항체(단편)의 주입 동안 결합 RU가 거의 없거나 없을 것이다. DOM1h-574-16에 대하여, TNFα-경쟁적 dAb(DOM1h-131-511 (WO2008149144호 참조)) 및 mAb(mAb225(R&D systems; 카달로그 번호 MAB225)의 존재 또는 부재 하에서의 결합 공명 유닛의 수가 변하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 언급된 dAb 및 mAb에 대해 신규한 에피토프를 나타낸다(도 14 및 15). TNFR1은 멀티-도메인 수용체이며, 4개의 시스테인-풍부 도메인으로 이루어진다. 도메인 2 및 3은 TNFα 결합을 담당하며(Banner et al., Cell, 73, p431 (1993)), 프레리간드 어셈블리 도메인(preligand assembly domain; PLAD)으로도 알려져 있는 제1 도메인은 TNFα 결합 전에 수용체의 사전-어셈블리를 용이하게 한다(Chan et al. Science, vol 288, p2351 (2000)). BIAcore 상에서 공지의 PLAD-결합 mAb 클론 4.12(Invitrogen 공급, 카달로그 번호 Zymed 33- 0100)와의 경쟁은 매우 제한적이었으며, 이는 기껏해야 DOMO1OO dAb(DOM1h-574-16)의 부재에 비하여 DOMO1OO dAb(DOM1h-574-16)의 존재 하에서 결합된 클론 4.12의 RU의 수의 20%의 감소를 나타내었다(도 16). 이는 DOM1h-574-16에 의해 인식되는 대부분의 에피토프가 클론 4.12에 의해 인식되지 않음을 나타낸다. DOM1h-574-16과 완전한 경쟁을 보이는 유일한 dAb는 선택 중에 분리된 다른 DOMO1OO dAb였다: DOM1h-510(도 17). DOMO1OO dAb가 마우스 TNFR1에 대해 교차-반응 결합을 나타내기 때문에, 동일한 실험을 BIAcore 칩에 코팅된 마우스 TNFR1 상에서 수행하여, 항-뮤린 TNFR1, 비-경쟁적 dAb DOM1m-21-23(WO2006038027호 참조)와의 경쟁이 존재하는지를 규명할 수 있었다. 현저하게, DOM1m-21-23과 DOMO1OO dAb DOM1h-574-16 간에는 경쟁이 관찰되지 않았다(도 18). 또한, 마우스와 교차-반응성일 DOM1h-574 dAb의 독특한 특성은 상술된 dAb 또는 항체(DOM1h-131-511, mAB225, 클론 4.12 및 DOM1m-21-23) 중 어떤 것도 임의의 유의미한 마우스/인간 교차-반응성을 나타내지 않기 때문에, 신규한 에피토프가 인식되어야 함을 강조한다.
2) TNFR1의 펩티드 스캐닝.
TNFR1 상의 어떠한 선형 에피토프가 본 발명자들의 DOM1h-574 dAb 계통에 의해 인식되는지를 규명하기 위하여, TNFR1의 완전한 세포외 도메인을 커버하도록 각각 3개의 잔기로 오프셋(offset)되는 스캐닝 15-mer 펩티드를 합성하였다. 이들 펩티드는 각각 비오틴 기를 함유하며, 비오틴 기는 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 기기(Menlo Park, CA, USA)의 상이한 센서 팁으로의 커플링을 위해 사용하였다. 포르테바이오 옥테트 기기는 분자 상호작용의 실시간 측정을 가능하게 하는 표지가 없는 바이오센서 기법인 바이오-층(Bio-Layer) 간섭법(BLI)을 사용한다. 옥테트 기기는 바이오센서 아래에 백색 광을 비추고, 재반사된 광을 수집한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자의 수의 임의의 변화는 반사된 광의 이러한 간섭 패턴의 이동을 야기하며, 실시간으로 결정된다. 본 발명자들의 실험에서, 각각의 팁을 상이한 펩티드로 코팅하였으며, DOM1h-574-16 dAb와 함께 인큐베이션하고, 각각의 팁에 대한 dAb의 결합을 모니터링하였다. 대부분의 팁은 확실한 결합을 나타내지 않았다. 바이오포르테 옥테트 상에서 어떠한 결합도 나타내지 않았던 음성 대조군 펩티드와 함께 3가지 펩티드를 스트렙트아비딘-코팅된 BIAcore 칩에 커플링시키고, DOM1h-574-16, DOM1h-131-511 및 DOM1m-21-23의 이들 펩티드로의 결합을 결정하였다(도 19, 20 및 21). 오직 DOMO1OO dAb(DOM1h-574-16) 만이 3가지 특정 펩티드로의 임의의 결합을 나타내었으며, 다른 dAb 중 어느 것도 어떠한 결합도 나타내지 않았다. 임의의 dAb에 대한 결합이 음성 펩티드 대조군 상에서 관찰되지 않았다. 3가지 TNFR1 펩티드는 2개의 그룹으로 나눌 수 있다: 1) 도메인 1 내에 위치한 펩티드 1(NSICCTKCHKGTYLY), 및 2) 중첩되며, TNFR1의 도메인 3 내에 있는 펩티드 2(CRKNQYRHYWSENLF) 및 3(NQYRHYWSENLFQCF). 특히 펩티드 1은 맨 마지막 잔기를 제외하고, 이 서열은 오직 마우스와 인간 TNFR1 간에 완전하게 보존된 TNFR1 내의 15개의 순차적 아미노산 잔기의 스트레치(stretch)에만 상응하기 때문에(이러한 보존된 스트레치는 다음의 서열을 갖는다: NSICCTKCHKGTYL), 주목할 만하다. 이러한 에피토프로의 결합은 DOM1h-574 계통에 대해 관찰되는 마우스 교차-반응성을 설명할 것이다.
연장된 생체 내 반감기를 위한 DOMO1OO dAb의 포맷화
만성 염증 질병, 예를 들면, RA 및 건선을 치료하는 데 유용한 DOMO1OO dAb를 위해, dAb가 전신으로 전달되고, 연장된 기간의 시간 동안 활성이 있는 것이 요망될 것이다. 많은 상이한 방법이 이를 달성하는데 이용가능하며, 이는 예를 들어, PEG 부분의 dAb로의 첨가, 혈청 알부민-결합 dAb(AlbudAb™)와의 유전적 융합으로서의 dAb의 발현 또는 IgG의 Fc 부분으로의 유전적 융합을 포함한다. DOMO1OO(항-TNFR1) dAb DOM1h-574-16을 위해, PEG 및 AlbudAb 융합 둘 모두를 시험하였다.
1) 4 OK (40 KDa ) 선형 PEG 와의 컨쥬게이션에 의한 반감기 연장.
이러한 목적을 위해 dAb의 C-말단에 유리 시스테인을 갖는 DOM1h-574-16의 변이체를 만들었다(C-말단 세린을 시스테인으로 치환하였다). 변이체를 이. 콜라이에서 발현시키고, 단백질-A 스트림라인을 사용하여 정제하였다. 말레이미드 화학물질(WO04081026호 참조)을 사용하여, 4OK 선형 PEG DOWpharma를 이러한 DOM1h-574-16 변이체의 C-말단에 컨쥬게이션시키고, 반응물을 FPLC 컬럼 상에의 전개에 의해 깨끗하게 하였다. 상기 분자를 DMSO162로 명명하였다. DMSO162의 반감기 연장에서의 PEG 컨쥬게이션의 효과를 랫트 PK 연구에서 평가하였다. 3마리의 암컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트에 표적 용량의 2.5 mg/kg의 단백질을 정맥 내로 투여하였다. 투여 후 0.17, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 168시간에 혈액 샘플을 랫트로부터 취하고, 혈액 내의 DMSO162의 양을 결정하기 위하여 검정하였다. DMSO 162 샘플을 TNFR1-포획 및 염소 항-hfAb 검출 ELISA에서 시험하였다. 상기 검정으로부터의 미가공 데이터를 각 혈청 샘플 내의 약물의 농도로 변환시켰다. 그 다음, 각 시간에서의 평균 ㎍/㎖ 값을 비-구획 분석(NCA)을 사용하여 윈논린 분석 패키지, 예를 들어 버전 5.1(Pharsight Corp.(Mountain View, CA94040, USA))로부터 입수가능)에서 분석하였다. 이들 데이터는 20.4시간의 랫트에서의 평균 최종 반감기를 제공하였다.
2) AlbudAb™와의 유전적 융합을 통한 반감기 연장
a) AlbudAb와의 항-TNFR1 dAb 융합의 기능적 특성화
이전에, 본 발명자들은 생체 내에서 dAb의 PK 반감기를 연장하기 위한 알부민-결합 dAb(AlbudAb)와의 유전적 융합의 이용을 기재하였다(참조예: WO04003019호, WO2006038027호, WO2008149148호). 이들 융합의 요망되는 면은:
1) AlbudAb의 융합이 TNFR1-결합 dAb의 결합 친화성에 실질적으로 영향을 미치지 않고,
2) 알부민에 대한 상이한 종으로부터의 AlbudAb의 친화성은 PK 반감기의 증가가 예상될 수 있어야 한다.
DOM1h-574-16과 상이한 AlbudAb의 페어링을 평가하기 위하여, 표 6에 열거한 페어링을 만들었다(작제물은 N-말단에서 C-말단으로, 항-TNFR1 dAb(즉, DOMO1OO dAb-링커-AlbudAb-myc)이었다). DMS0184를 제외한 모두는 C-말단에 myc-태그를 함유하였으며, myc-태그는 아마도 검출 목적으로 사용될 수 있을 것이다.
표 6: 항-TNFR1 dAb/AlbudAb 융합의 BIAcore 오프-레이트 파라미터 및 MRC5 세포 검정에서의 항-TNFR1 dAb의 역가. DMS0184를 제외하고, 열거된 모든 dAb/AlbudAb 융합은 AlbudAb의 C-말단에 myc-태그를 함유하였다. 일부 경우에, BIAcore에 의해 혈청 알부민에 대한 결합이 관찰되지 않은 한편(NB), 다른 것들에 대해서는 결정되지 않았다(ND). MRC5 검정을 위하여, 일부 데이터는 값의 인용을 정당화하기에 충분히 결정되지 않았다(ND*)
Figure pct00006
모든 AlbudAb의 서열을 하기에 제공한다. DOM7h-11 및 DOM7m-16의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 본 명세서에 개시한다.
발현 및 정제 후에, 모든 작제물을 마우스 및 인간 혈청 알부민 둘 모두로의 결합에 대하여 BIAcore 상에서 시험하였다. 오프-레이트를 결정하고, 이를 사용하여 융합 분자의 반감기를 연장하는 데에서의 이들의 적합성에 대하여 AlbudAb를 구별하였다. 링커가 알부민에 대한 AlbudAb의 친화성에 거의 영향을 갖지 않는데 반하여, dAb와 이들의 알부민 친화성 간에는 상당한 차이가 존재하였다. 마우스 결합에 대한 최적의 AlbudAb는 DOM7h-11-15이었으며, 다음으로 DOM7m-16 및 DOM7h-11- 12였다(도 22). 그러나, DOM7m-16은 인간 알부민에서 결합을 나타내지 않은 한편, DOM7h-11-15 및 DOM7h-11-3은 인간 알부민 결합에 대한 최적의 페어링이었다(도 23). 검정 가변성이 관찰되었으나, 일반적으로 DOM7h-11 계통의 임의의 AlbudAb에 융합되는 경우 단량체 DOM1h-574-16 및 동일한 dAb에 대해 수득된 인간 MRC-5 세포 검정 ND50 값에서 친화성의 제한된 감소만이 있었다. 그러나 DOM1h-574-72와 페어링되는 경우 DOM7h-11-12에 비해 AlbudAb DOM7m-16의 영향을 관찰하였다. DOM7m-16 페어링은 MRC-5 세포 검정에서 항-TNFR1 부분의 융합에 대한 역가의 상당한 감소를 야기하였으며, 이는 동일한 항-TNFR1이 dAb DOM7h-11-12와 페어링될 때는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 DOM7h-11 계통(예를 들어, DOM7h-11의 아미노산 서열과 80, 90 또는 95 % 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 항-혈청 알부민 dAb)으로부터의 AlbudAb와의 페어링의 이점을 강조한다.
b) 상이한 DOMO1OO-AlbudAb 융합에 대한 마우스 및 랫트 PK
PEG의 대안은 혈청 알부민을 인식하는 도메인 항체(AlbudAb)와의 유전적 융합으로서 DOMO1OO dAb를 발현할 것이다. 이러한 방법을 평가하기 위하여, DOM1h-574-16, 알라닌 세린 트레오닌(AST) 링커 및 DOM7h-11에 이어서 myc 태그(DMSO182)로 이루어진 유전적 작제물을 만들었다. 이러한 작제물을 이. 콜라이 발현 벡터 pDOM5로 라이게이션하고, 이. 콜라이 균주 HB2151으로 형질전환시키고, 발현시켰다. DMSO182를 고체 지지체에 커플링된 단백질 L을 사용하여 상층액으로부터 정제하고, 단백질 A-스트림라인으로 이어져 임의의 유리 단량체를 제거하였다. DMSO1 82를 3마리의 암컷 스프라그-돌리 랫트에 5 mg/kg의 용량으로 정맥 내로 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 0.17, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 168시간에 취하였다. 혈청 샘플을 준비한 다음, 이들을 3개의 개별 ELISA에서 시험하였다: 1) 토끼 항-인간 카파 사슬 검출과 함께 염소 항-myc 포획, 2) TNFR1-Fc 검출로 염소 항-myc 포획 및 항-인간-Fc/HRP를 통한 판독 및 3) 염소 항-fAb 검출로 TNFR1 포획 및 항-염소 HRP를 통한 판독. 검정으로부터의 미가공 데이터를 각 혈청 샘플 내의 약물의 농도로 변환시켰다. 각 시간에서의 평균 ㎍/㎖ 값을 비-구획 분석(NCA)을 사용하여 윈논린에서 분석하였다. DMSO182를 3가지의 언급된 검정에서 시험하였으며, 평균 최종 반감기는 5.2 - 6.4시간이었다. 동일한 DMSO182를 사용하여, 추가의 PK 연구를 행하고, 이때 마우스에 10 mg/kg를 복강내 투여하였다. 3마리의 마우스를 각각 하기의 시간에 채혈하였다: 0.17, 1, 4, 12, 24, 48 및 96시간. 이전에 언급한 검정 옵션 2를 사용한 혈청 분석으로, 약 5.9시간의 마우스에서의 DMSO182의 혈청 반감기를 확인하였다(도 24). 명백하게, AlbudAb DOM7h-11의 첨가는 유리 dAb를 마우스와 랫트에 주입하는 경우 과거에 관찰되었던 것(약 20분의 T1/2, 예를 들어, WO04003019호 및 WO04003019호 참조)에 비해 dAb의 반감기를 연장시킨다. 그러나, 반감기의 추가의 개선이 유익할 것이다. DOM1h-574-16에 융합되는 경우 랫트 및 마우스 알부민에 대한 DOM7h-11의 결합 친화성의 평가로, BIAcore로 결정시 1 μM의 초과의 친화성을 확인하였다. 따라서, AlbudAb뿐 아니라 이들 인-라인 융합을 위해 사용한 링커에 대한 변화를 행하였다. DOMO1OO dAb(DOM1h-574-72), 상이한 링커(ASTSGPS), 2가지 상이한 AlbudAb(DOM7m-16 및 DOM7h-11-12) 및 둘 모두에 이어서 myc-태그로 이루어진 2가지 새로운 유전적 작제물을 만들어, 각각 DMS0168 및 DMS0169를 생성하였다(작제물은 N-에서 C-말단으로 항-TNFR1 dAb(즉, DOMO1OO dAb)-링커-AlbudAb-myc였다). 이들 작제물을 pDOM5 내에 클로닝하고, 이. 콜라이에서 발현시키고, 단백질-L 및 단백질-A를 사용하여 정제하였다. 둘 모두를 MSA로의 이들의 결합에 대하여 BIAcore 상에서 분석하였고, 두 작제물에 대하여 약 200 nM의 마우스 알부민-결합 친화성을 야기하는 상당한 개선이 관찰되었다. 반감기 연장에서의 개선된 알부민 결합의 효과를 결정하기 위하여, DMSO168 및 DMSO169를 마우스 내에 2.5 mg/kg으로 정맥 내로 투여하고, 이어서 각각 하기의 시간에 3마리의 마우스에서 채혈하였다: 0.17, 1, 4, 8, 24, 48, 96 및 168시간. 이들 둘 모두의 분자에 대한 혈청 반감기를 ELISA 기반의 방법으로 혈청 내의 융합 단백질의 정량화에 의하여 결정하였다; DMSO168에 대해서는, 포획을 위하여 염소 항-myc를 사용하고, TNFR1-Fc를 사용한 검출 및 항-인간-Fc/HRP를 통한 판독으로 이어졌다. DMS0169는 TNFR1-Fc를 사용하여 포획하고, 염소 항-Fab를 사용한 검출 및 항-염소 HRP를 통한 판독으로 이어졌다. 이러한 방법에 덧붙여, 고밀도의 인간 TNFR1로 코팅된 칩으로의 결합을 통한 DMSO169의 BIAcore 정량화를 사용하였으며, 데이터를 작도하여, 마우스에서의 최종 반감기를 계산하였다. DMS0168은 최종 반감기가 15.4시간(ELISA)이었고, DMSO169은 반감기가 17.8시간(ELISA) 또는 22.0시간(BIAcore) 중 어느 하나였다(도 24). 이들 반감기의 둘 모두는 DOMO1OO dAb가 D0M7h-1에 융합되는 경우의 반감기에 비해 상당한 연장을 보이며, AlbudAb 융합의 최종 반감기에서 알부민에 대한 증가된 친화성의 영향을 강조한다.
DOMO100 - AlbudAb 융합의 기능적 특성화 및 생물물리학적 특성
항-알부민 dAb와 융합된 항-TNFR1 dAb의 최적의 포맷을 결정하기 위하여, 단일의 항-TNFR1 dAb를 취하고(DOM1h-574-72), 3가지 상이한 링커(AST, ASTSGPS 및 AS(GGGGS)3)를 사용하여 4가지 상이한 AlbudAb(DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-14-10 및 DOM7h-14-18)와 페어링시켰다. 이들 작제물 중 어느 것도 myc-태그를 함유하지 않는다. 모든 12가지 작제물을 이. 콜라이에서 발현시키고, 단백질 L에 이어서 단백질 A 정제의 2-단계 과정을 사용하여 정제하고, 발현 수준을 정량화하였다. 또한, 분자의 용액-내 상태를 SEC-MALLS를 사용하여 결정하였다. 결과를 표 7에 약술한다. 결과의 분석은 몇 가지 두드러진 관찰을 야기하였다: 1) DOM1h-574-72의 DOM7h-11 계통 dAb와의 페어링은 DOM7h-14 계통 페어링에 비해 상당히 더 높은 발현 수준을 초래하였고, 2) DOM7h-11 페어링에 대해서는 단량체의 용액-내 상태가 관찰되었으나, DOM7h-14와의 페어링은 단량체/이량체 평형을 초래하였다. 단량체의 용액-내 상태가 바람직한데, 이는 이들 분자가 수용체 가교결합을 덜 유도하고, 결과적으로 수용체 활성화(효능화) 또는 억제제 활성의 중화를 야기할 것이기 때문이다. 더욱이 단량체의 용액-내 상태는 개발의 관점에서 바람직한데, 이는 이들 분자가 덜 응집되는 경향이 있고, 크기 배재 크로마토그래피(SEC)로 분석시 더 깨끗한 경향이 있기 때문이다. DOM7h-11 AlbudAb와의 페어링이 DOM7h-14 AlbudAb 페어링에 비해 더 높은 발현 수준과 단량체의 용액-내 상태의 더 높은 퍼센트 둘 모두를 야기한다는 관찰로, DOM7h-11 페어링이 선호된다.
표 7: 발현 및 용액-내 상태에 대한 링커 및 AlbudAb의 최상의 조합을 평가하기 위해 생성된 융합 분자의 조합의 개요. 그들의 아미노산 조성으로, AST, ASTSGPS, 및 AS 및 4개의 글리신과 1개의 세린의 3회의 반복(AS(G4S)3)으로 이루어진 글리신-세린 링커로 표시되는 3가지 상이한 링커를 사용하였다. 용액-내 상태를 SEC-MALLS를 사용하여 결정하고, 단량체 또는 단량체/이량체 평형 중 어느 하나로 표기하였다. 일부 AlbudAb 융합에 대해서는 발현이 너무 낮아 용액-내 상태의 결정을 위하여 충분한 물질을 입수할 수 없었으며, 이들을 (ND)로 표시하였다.
Figure pct00007
더욱이, 정제된 융합 분자의 친화성 및 역가를 각각 BIAcore T1OO 및 MRC5 세포 검정을 사용하여 결정하였다. BIAcore T1OO은 이상적으로 높은 친화성 결합제의 결정에 적합한 고감도 BIAcore 버전이다(Papalia et al., Anal Biochem. 359, pi 12 (2006)). 비오티닐화된 인간 TNFR1을 칩 상에 코팅하고, 12개 AlbudAb 융합의 각각을 4가지의 상이한 농도(2, 10, 50 및 250 nM)로 이 표면 위로 통과시켰다. 목적은 페어링이 항-TNFR1 dAb(DOM1h-574-72)의 그의 표적으로의 결합 친화성에 임의의 유의미한 효과를 갖는지를 확립하는 것이었다. 하기의 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 페어링과 BIAcore에 의한 친화성에서의 이들의 효과 간의 유의미한 차이가 없었다. 다른 페어링보다 3배 더 높은 친화성을 나타낸 DOM7h-14-18 페어링(DMSO118 및 DMS0124)을 제외하고, 모든 조합은 유사한 친화성을 초래하였다. 융합되지 않은 DOM1h-574-72 dAb와 비교할 때 모든 AlbudAb 융합 분자에서 DOM1h-574-72에 대해 관찰된 친화성(KD)의 2 내지 3배 이상의 개선은 놀라운 것이다. 이러한 개선은 페어링에 사용된 AlbudAb와 상관없이 관찰되며, DOM7h-14-18과의 페어링에 대한 개선이 가장 크다. 상이한 페어링이 항-TNFR1 dAb의 기능적 활성에 영향을 미치는지를 확립하기 위해 사용된 2차 실험은 MRC5 세포 검정이었다(표 8). 페어링 간에 더욱 명확한 차이가 MRC5 검정에서 관찰되며, 여기서 DOM7h-11-3 및 DOM7h-11-12와의 페어링에서 최적의 역가가 관찰되었으나, DOM7h-14-10(DMSO117)과의 페어링은 상당한 역가의 감소를 야기하였다.
표 8: 3가지 상이한 링커를 사용한 DOM1h-574-72의 4가지의 상이한 AlbudAb와의 페어링의 BIAcore T1OO 및 MRC5 분석. DMS 클론의 조성에 대해서는 표 7을 참조하길 바란다. 불충분한 물질 때문에 모든 작제물에 대한 친화성 상수가 결정되지 않았다(ND). 전반적으로, AlbudAb 페어링 후에 BIAcore 상에서 친화성의 히트(hit)가 관찰되지 않았다. MRC5 검정에서 가장 일치하는 데이터를 DOM7h-11-3 및 DOM7h-11-12 페어링에 대하여 수득하였다.
Figure pct00008
단량체 DOM1h-574 항-TNFR1 dAb 둘 모두 및 AlbudAb와의 페어링의 생물물리학적 및 기능적 특성화의 결과를 사용하여, 5가지 융합 분자의 서브셋을 작제하고, 발현시키고, 정제하고, 특성화하였다. 이들 5가지 각각은 하기의 항-TNFR1 dAb 중 하나를 함유하였다: AST 링커를 사용하여 DOM7h-11-3과 각각 페어링된 DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156, DOM1h-574-162 및 DOM1h-574-180. 작제물은 N-에서 C-말단으로, 항-TNFR1 dAb(즉, DOMO1OO dAb-링커-AlbudAb, 이들 작제물 중 어느 것도 태그를 함유하지 않음)였다. 발현된 분자를 용액-내 상태에 대해서는 SEC-MALLS에서, 열 안정성에 대해서는 DSC에서, 인간과 마우스 TNFR1에 대한 친화성에 대해서는 BIAcore에서, 그리고 기능적 활성에 대해서는 MRC5 세포 검정에서 특성화하였다.
이들 5가지 인-라인 융합 분자의 생물물리학적 특성화로, 모두가 55 ℃ 초과의 용융 온도를 가지며, 용액-내 단량체인 것으로 나타났다(표 9). 높은 용융 온도는 분자의 다운스트림 가공 및 보관 둘 모두 동안 유익한 분자의 안정성의 증가를 나타낸다. 또한, 이는 환자의 생체 내에서 약제학적 약물로 기능하는 경우, 분해에 덜 민감하게 하여, 그의 최종 반감기를 연장시킴으로써 분자의 안정성에 유익할 것이다.
표 9: 반감기 연장에 대한 항-TNFR1 dAb와 DOM7h-11-3 AlbudAb의 바람직한 조합의 개요. 정제 후에, 이들 융합 분자를 열 안정성(DSC) 및 용액-내 상태(SEC-MALLS)에 대하여 시험하였다. 모두 단량체인 한편, DMS0133 및 DMS0134가 가장 높은 용융 온도를 갖는다.
Figure pct00009
BIAore에 의한 항-TNFR1 친화성, 및 인간 MRC5 및 표준 마우스 L929 세포 검정에서의 기능적 활성의 특성화(표 10)는 제한적인 dAb 간의 차이를 나타낸다. 그러나, 모든 데이터를 용융 온도, 용액-내 상태, 발현, BIAcore, 인간 MRC5 세포 검정 및 표준 마우스 L929 세포 검정에서 함께 취하는 경우, DMSO133 및 DMSO134가 바람직한 조합으로 드러났다. 용융 온도는 이들 둘에 대해서 가장 높으며, 이들은 기능적 인간 및 마우스 세포 검정에서 가장 강력한 조합에 속한다. 세포 검정에서 기능적 활성은 바람직한 분자를 결정하기 위한 주요 동인이다.
표 10: 5가지 최적의 항-TNFR1/AlbudAb 융합 분자의 기능적 특성화 및 발현. 발현 수준은 정제 후에 결정하였다. 친화성은 BIAcore로 결정하고, 기능적 활성을 인간 MRC5 및 표준 마우스 L929 세포 검정 둘 모두에서 결정하였다. 발현은 DMS0132, DMS0135 및 DMS0134에 대하여 최적이었으나, 세포 검정에서의 가장 강력한 조합은 DMS0133, DMS0134 및 DMS0135였다.
Figure pct00010
뮤린 모델에서 류머티스 관절염에 대한 DOMO1OO 의 생체 내 효능의 입증
기재된 항-TNFR1 dAb의 활성이 유용하며 질환을 변경시킬 수 있는 것을 입증하기 위하여, 류머티스 관절염의 뮤린 모델을 N-에서 C-말단으로 DOM1h-574-72 - ASTSGPS - DOM7h-11-12 - myc 태그의 융합인 DMS0169로 처리하였다. 이러한 뮤린 모델은 트랜스제닉 마우스 모델이며, 여기서 인간 TNFα가 과발현되고(Tgl97), 마우스 TNFR1을 엔코딩하는 유전자가 인간 TNFR1(hp55) 유전자로 대체된다. 시간이 지나면서, 이들 마우스에 자발적 관절염이 발생하며, 이 관절염은 처리 동안 관절 크기를 측정하고(임상 점수), 15주 후에 관절의 조직학적 분석(Keffer et al., EMBOJ., 10, p4025 (1991))을 수행함으로써 점수화하였다. 또한, 마우스의 전반적인 건강을 그들의 체중으로부터 추론할 수 있으며, 체중을 주마다 측정한다. 6주부터, 12 마리의 마우스에 주마다 염수 주사(대조군) 또는 10 mg/kg의 DMSO16으로 1주에 2회 처리하였다. 6주부터 15주까지, 각각의 마우스를 주마다 임상 점수 및 체중 둘 모두에 대하여 점수화하였다(도 25 및 26). 15주 후에, 마우스를 희생시키고, 관절 염증의 조직학적 분석을 행하였다(도 27). 15주에 임상 점수 및 조직학 둘 모두에서의 DMSO169의 효과가 매우 유의미한 한편(p<0.001), DMSO169 처리된 마우스에 대한 체중은 염수 처리된 대조군 동물에 비해 바람직하였으며, 이는 류머티스 관절염에서 DMS0169의 치료적 혜택에 대한 가능성을 나타낸다.
표준 세포 검정
표준 MRC-5 IL-8 방출 검정
인간 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 활성을 하기의 MRC-5 세포 검정에서 평가하였다. 상기 검정은 MRC-5 세포 내에서 TNFα에 의한 IL-8 분비의 유도를 기반으로 하며, 문헌[Alceson, L. et al. Journal of Biological Chemistry 277:30517-30523 (1996)]에 기재된 방법을 개조한 것이며, 상기 문헌은 HUVEC 내에서 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기재한다. HUVEC 세포주 대신에 MRC-5 세포를 사용하여 인간 TNFα에 의한 IL-8 유도를 평가함으로써 dAb의 활성을 검정하였다. 약술하면, MRC-5 세포(ATCC 번호: CCL-171)를 마이크로타이터(microtitre) 플레이트(5x103개 세포/웰)에 플레이팅하고, 플레이트를 소정의 용량 범위의 dAb 및 고정량의 인간 TNFα(200 pg/㎖)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 배양 상층액을 흡인시키고, IL-8 ABI 8200 세포 검출 검정(FMAT)을 사용하여 IL-8 방출을 결정하였다. IL-8 FMAT 검정은 R&D Systems로부터의 검출 및 포획 시약을 사용하였다. 비드, 염소 항-마우스 IgG(H&L) 코팅된 폴리스티렌 입자 0.5 w/v% 6-8㎛(Spherotech Inc, 카달로그 번호 MP-60-5)를 포획 항체 마우스 모노클로날 항-인간 IL-8 항체(R&D systems, 카달로그 번호 MAB208)로 코팅하였다. 검출을 위하여, 비오티닐화된 염소 항-인간 IL-8 항체(R&D systems, 카달로그 번호 BAF208) 및 스트렙트아비딘 알렉사플루오르(Alexafluor) 647(Molecular Probes, 카달로그 번호 S32357)를 사용하였다. 재조합 인간 IL-8(R&D systems, 카달로그 번호 208-IL)을 표준물로 사용하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 오직 TNFα와 함께 인큐베이션시킨 대조군 웰에 비해 상층액으로의 IL-8 분비의 감소를 초래하였다.
표준 사이노몰구스 원숭이 CYNOM - K1 검정
항-TNFR1 dAb를 CYNOM-K1 세포 검정에서 역가에 대하여 시험하였다. 약술하면, dAb를 CYNOM-K1 세포(ECACC 90071809)(5x1O3개 세포/웰)와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 평평한 바닥의 세포 배양 플레이트에서 인큐베이션하였다. 재조합 인간 TNF 알파(Peprotech)를 첨가하고(200pg/㎖의 최종 농도), 플레이트를 18 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 분비된 IL-8의 수준을 제조처의 지시(문서 번호 750364.16 버전 11/08)에 따라 듀오셋 ELISA 디벨롭먼트 시스템(R&D Systems, 카달로그 번호 DY208)을 사용하여 배양 상층액에서 평가하였다. dAb 농도를 IL-8 분비의 억제의 퍼센트에 대하여 작도함으로써 ND50을 결정하였다.
표준 L929 세포독성 검정
또한, 항-TNFR1 dAb를 마우스 L929 섬유모세포(ATCC CCL-1)(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248)에서의 TNFα의 세포독성 활성을 중화시키는 능력에 대하여 시험하였다. 약술하면, 마이크로타이터 플레이트 내에 플레이팅한 L929 세포(1x1O4개 세포/웰)를 항-TNFR1 dAb, 100pg/㎖ TNFα 및 1 ㎍/㎖ 액티노마이신 D(Sigma, Poole, UK)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 490nm에서 흡광도를 판독하고 이어서 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(Promega, Madison, USA)과 함께 인큐베이션함으로써, 세포 생존력을 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNFα 세포독성의 감소를 야기하였고, 이에 따라 오직 TNFα 만의 대조군에 비해 흡광도의 증가를 야기하였다.
표준 수용체 결합 검정
수용체 결합 검정에서 인간 TNFR1에 대한 dAb의 역가를 결정하였다. 이러한 검정은 TNF-알파의 TNFR1로의 결합 및 이러한 상호작용을 차단하는 용해성 dAb의 능력을 측정한다. TNFR1-FC 융합을 염소 항-인간 IgG(H&L)으로 사전-코팅된 비드 상에서 포획한다. 수용체 코팅된 비드를 검정색 측면 투명한 바닥의(black sided clear bottomed) 384 웰 플레이트에서 TNF-알파(10ng/㎖), dAb, 비오틴 컨쥬게이트된 항-TNF-알파 및 스트렙트아비딘 알렉사플루오르 647과 함께 인큐베이션한다. 6시간 후에, 플레이트를 ABI 8200 세포 검출 시스템에서 판독하고, 비드 관련 형광을 결정한다. dAb가 TNF-알파의 TNFR1로의 결합을 차단한다면, 형광 세기는 감소할 것이다.
ABI 8200 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그래프패드 프리즘 및 다양한 기울기를 갖는 S자형 용량 반응 곡선을 사용하여 농도 효과 곡선 및 역가(EC50) 값을 결정하였다.
생체 내 효능 연구를 위한 DOM7h -11-12와의 융합의 작제 및 정제
상이한 항-TNFR1 및 대조군 dAb를 사용한 생체 내 효능 연구를 수행하기 위하여, dAb 사이에 Ala-Ser-Thr 링커를 사용하여 상이한 dAb의 AlbudAb(항-혈청 알부민 dAb) DOM7h-11-12와의 유전적 융합을 클로닝하였다. 이러한 목적을 위하여 4가지 작제물을 만들었다: DMS5537(DOM1h-574-156-AST-DOM7h-11-12), DMS5538(VhD2-AST-DOM7h-11-12), DMS5539(DOM1m-15-12-AST-DOM7h-11-12dh) 및 DMS5540(DOM1m-21-23-AST-DOM7h-11-12).
이들 4가지 작제물 각각의 작제는 다음과 같았다:
DMS5537: 프라이머 AS9 및 ZHT304를 사용하여 DMS0126으로부터 Vh dAb DOM1h-574-156을 PCR 증폭시켰다. 프라이머 PAS40 및 AS65를 사용하여 pDOM5 벡터 내의 DMSO169(태그 없음)로부터 Vk dAb DOM7h-11-12를 PCR 증폭시켜, AST 링커를 첨가하였다. 상기 반응 생성물을 SOE-PCR에 의해 연결시키고, 프라이머 JAL102 및 ZHT327를 사용하여 다시 증폭시켰다. 상기 재증폭 반응 생성물을 Nde I/Not I으로 절단하고, Nde I/Not I-절단 pET30a(Merck) 내로 클로닝하였다. 발현을 위하여, 작제물을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)(Novagen, 카달로그 번호 69450) 내로 형질전환시켰다.
DMS5538: 프라이머 AS9 및 ZHT304를 사용하여 특이적 항원 인식이 없는 '더미(dummy) dAb'로 불리는 Vh dAb VhD2를 PCR 증폭시켰다. 프라이머 PAS40 및 AS65를 사용하여 태그가 없는 DMS0169로부터 Vk dAb DOM7h-11-12를 PCR 증폭시켰다. 둘 모두의 생성물을 겔 정제하고, SOE-PCR을 사용하여 다시 어셈블링하였다. 프라이머 JAL102 및 ZHT327을 사용하여 SOE 생성물을 재증폭시켰다. 재증폭 반응 생성물을 Nde I 및 Not I 효소로 절단하고, 겔 정제하고, Nde I 및 Not I 효소로 절단한 pET30 내로 라이게이션하였다. 발현을 위하여, 작제물을 이. 콜라이 균주 BL2l(DE3)로 형질전환시켰다.
DMS5539: 프라이머 AS9 및 ZHT334를 사용하여 pDOM5/Vk(DOM1m-15-12)로부터 항-마우스 TNFR1 Vk dAb DOM1m-15-12를 PCR 증폭시켰다. 항-TNFR1 및 항-알부민 dAb, DOM7h-11-12 둘 모두가 Vk이기 때문에, DOM7h-11-12의 표준 DNA 데호몰로지화(dehomologisation) 방법을 수행하였으며, 즉 침묵 돌연변이를 DNA 수준에서 도입하였고, 여기서 상기 침묵 돌연변이는 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다. 이들 돌연변이는 상동성 재조합의 기회를 감소시키고, DNA 증폭 및 단백질 발현 동안 플라스미드 안정성을 증가시킨다. 게다가, DOM7h-11-12 dAb는 위치 12에서 Ser의 Pro로의 돌연변이를 함유하여, 인-라인 융합의 단백질-L로의 결합을 감소시키고 정제를 용이하게 한다. 프라이머 ZHT333 및 AS65를 사용하여 pDOM5/Vk(DOM7h-11-12dh)로부터 데호몰로지화된 버전의 Vk DOM7h-11-12 S12P(DOM7h-11-12dh S12P)를 PCR 증폭시켰다. 둘 모두의 생성물을 겔 정제하고, SOE-PCR에 의해 다시 어셈블링하였다. 프라이머 ZHT332 + ZHT327을 사용하여 SOE 생성물을 재증폭시켰다. 반응 생성물을 Nde I 및 Not I 효소로 절단하고, 겔 정제하고, Nde I 및 Not I 효소로 절단한 pET30 내로 라이게이션하였다. 발현을 위하여, 작제물을 이. 콜라이 균주 BL2l(DE3)로 형질전환시켰다.
DMS5540: 프라이머 AS9 및 ZHT335를 사용하여 DMS0127로부터 항-마우스 TNFR1 Vh dAb DOM1m-21-23(WO2006038027호 참조)을 PCR 증폭시켰다. 프라이머 PAS40 및 AS65를 사용하여 DMSO169로부터 Vk dAb D0M7h-11-12를 PCR 증폭시켰다. 둘 모두의 생성물을 겔 정제하고, SOE-PCR을 사용하여 다시 어셈블링하였다. 프라이머 JAL102 및 ZHT327을 사용하여 SOE 생성물을 재증폭시켰다. 반응 생성물을 Nde I 및 Not I 효소로 절단하고, 겔 정제하고, Nde I 및 Not I 효소로 절단한 pET30 내로 라이게이션하였다. 발현을 위하여, 작제물을 이. 콜라이 균주 BL2l(DE3)로 형질전환시켰다.
그 다음, 모든 4가지 작제물을 하기의 조건을 사용하여 발효기 내에서 발현시켰다: 유도 후 모두 27 ℃, 0.025mM IPTG로 유도하였던 DMS5540을 제외하고는 0.01mM IPTG. 모든 발효를 5L 규모로 최소 배지 내에서 높은 세포 밀도까지 하였다.
단백질-L로의 뱃치(batch) 결합에 이어서, 용출, 중화 및 단백질-A로의 뱃치 결합의 제2 단계에 의한 상층액으로부터 정제를 행하였다. 용출된 단백질을 PBS로 완충액 교환하고, 기능적 특성화 전에 농축시켰다. DMS5539를 단백질 L로 정제한 다음, PBS로의 완충액 교환과 동시에 SEC로 추가 정제하였다. 그 다음, 모든 분자는 내독소가 제거되었다.
표 11: 아미노산 서열
DOM1h-574 및 DOM1h-574'는 단 하나의 아미노산만큼 상이하다 (카바트 넘버링에 따른 아미노산 98에서 전자에서의 R은 후자에서의 H이다)
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
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표 12: 뉴클레오티드 서열
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SEQUENCE LISTING <110> Stephen DUFFIELD Carolyn ENEVER Haiqun LIU Oliver SCHON Armin SEPP Adriaan Allart STOOP <120> IMPROVED ANTI-TNFR1 POLYPEPTIDES, ANTIBODY VARIABLE DOMAINS & ANTAGONISTS <130> JRC/DB63468 WO <140> PCT/EP2010/052005 <141> 2010-02-17 <150> 61/153746 <151> 2009-02-19 <150> 61/241198 <151> 2009-09-10 <160> 449 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr 20 25 30 Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Thr Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Val Thr Met Phe Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Arg Thr Gly Arg Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Arg Asn Arg His Gly Glu Tyr Leu Ala Asp Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr 20 25 30 Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Ser Asn Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Thr Glu Arg Ser Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Glu Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Phe Ser Ala Ser Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly His Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 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Ser Ser 115 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asp Thr Gly Asp Arg Arg Tyr Tyr Asp Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 36 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 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115 <210> 95 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 95 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ala Asn Thr Ala Asp Arg Arg Tyr Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 96 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 96 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 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115 <210> 98 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 98 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ala Asn Thr Ala Asp Arg Arg Tyr Tyr Ala His Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 99 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 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Val Ser Ser 115 <210> 110 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 110 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asp Thr Ala Asp Arg Arg Tyr Tyr Asp Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 111 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 111 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 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Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 119 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 119 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asp Thr Ala Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala His Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 120 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 120 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asp Thr Gly Asp Arg Arg Tyr Tyr Asp His Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Ala Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 124 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 124 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asp Thr Ala Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala His Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Val Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 197 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Ala Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala His Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Thr Gly Arg Trp Val Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln 115 120 125 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 130 135 140 Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Gly Thr Met Leu Ser Trp Tyr Gln Gln 145 150 155 160 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Leu Ala Phe Ser Arg Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 180 185 190 Phe Thr 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Derived from a Human germline sequence. <400> 207 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 208 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 208 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Tyr Glu Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 210 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile His Thr Ser 20 25 30 Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ser Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn His Tyr Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Tyr Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ser Thr Asp 100 105 110 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly Asp 115 120 125 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Gly Thr Met Leu 130 135 140 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Leu 145 150 155 160 Phe Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 180 185 190 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ala Gly Thr His Pro Thr Thr 195 200 205 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 210 215 <210> 211 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 211 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asn Val Ser His Asp 20 25 30 Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Gly Pro Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Ala Arg His Ala Asp Thr Glu Arg Pro Pro Ser Gln Gln 100 105 110 Thr Met Pro Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Gly 145 150 155 160 Thr Met Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 165 170 175 Leu Ile Leu Phe Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ala Gly Thr His 210 215 220 Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 212 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 212 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Tyr Glu Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Ser Gln Phe Gly Ser Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 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tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctgtg 300 acgatgtttt ctcctttttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 214 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 214 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gattatggga tgcgttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgcgga ctggtcgtgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatggcgg 300 aatcggcatg gtgagtatct tgctgatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 215 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 215 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg aggtatagga tgcattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgattcta atggttctag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcgt 300 acggagcgtt cgccggtttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 216 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 216 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt gattatgaga tgcattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attagtgaga gtggtacgac gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacgtcgt 300 ttttctgctt ctacgtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 217 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 217 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 218 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 218 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcattggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 219 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 219 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttatga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 220 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 220 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 221 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 221 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 222 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 222 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 223 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 223 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagc 357 <210> 224 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 224 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccata tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 atgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 225 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 225 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg atctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 226 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 226 gaggtgcagc tgttggagtc agggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ccactggggt caggggaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 227 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 227 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 228 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 228 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 229 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 229 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 230 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 230 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 231 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 231 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagc 357 <210> 232 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 232 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagc 357 <210> 233 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 233 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg atctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 234 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 234 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg atctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 235 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 235 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 236 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 236 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 237 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 237 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 238 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 238 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 239 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 239 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 240 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 240 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggcat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 241 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 241 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttaa ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 242 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 242 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 243 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 243 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg tgccttttga caactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 244 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 244 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatt acgtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttca gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 245 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 245 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 246 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 246 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaagac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 247 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 247 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 248 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 248 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 249 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 249 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttaa gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 250 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 250 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgagcg tagatactac 180 gcagactcag tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca atcccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg agccttttga atactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 251 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 251 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aactattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttatga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt cacgagc 357 <210> 252 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 252 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 253 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 253 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 254 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 254 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 255 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 255 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 256 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 256 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 257 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 257 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggtatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 258 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 258 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 259 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 259 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 260 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 260 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 261 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 261 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 262 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 262 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 263 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 263 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 264 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 264 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 265 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 265 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 266 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 266 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 267 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 267 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 268 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 268 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga agccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 269 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 269 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaagac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 270 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 270 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 271 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 271 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 272 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 272 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagttttcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 273 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 273 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 274 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 274 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 275 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 275 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 276 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 276 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggcat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 277 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 277 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggcat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 278 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 278 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 279 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 279 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 280 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 280 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 281 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 281 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggc ccgactttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 282 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 282 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcggcct ggggtgacag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 283 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 283 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcggacg gcggtcagag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 284 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 284 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcggact ccggttaccg cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 285 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 285 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtccagagtg ggtctcacag atttcggacg ggggtacgcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 286 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 286 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcggaca agggtacgcg cacatactac 180 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ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attaacaata cgggttcgac cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 289 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 289 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 290 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 290 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 291 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 291 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 292 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 292 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 293 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 293 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 294 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 294 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 acacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 295 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 295 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg cagatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 296 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 296 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attttgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 297 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 297 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 298 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 298 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 299 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 299 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 300 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 300 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggtatatact 300 gggcgttggg tgtcttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 301 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 301 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gctatatact 300 gggcgttggg tgtcttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 302 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 302 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gtttaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggtatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 303 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 303 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gctatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 304 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 304 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata ctgctgatcg tagatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 305 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 305 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 306 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 306 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcgg cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggcgatcg tagatactac 180 gcacacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 307 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 307 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata ctgctgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 308 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 308 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcacacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 309 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 309 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tagatactac 180 gcacacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 310 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 310 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cggctgatcg tagatactac 180 gcacacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 311 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 311 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgtgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 312 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 312 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcgaata cgggtgatcg tagatactac 180 gcagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 313 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 313 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 314 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 314 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 315 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 315 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 316 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 316 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 tcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 317 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 317 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 acacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 318 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 318 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 acagacgcgg tgaaggggcg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 319 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 319 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 320 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 320 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 321 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 321 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 322 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 322 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 323 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 323 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatcactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg aaccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 324 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 324 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 325 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 325 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gatgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 326 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 326 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatcactctg tgaagggccg gttcactatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 327 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 327 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata cgggtgatcg tagatactac 180 gatgacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 328 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 328 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg ggccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 329 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 329 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg tgccttttgc ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 330 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 330 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg gaccttttca gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 331 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 331 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttca gtactggggt cagggaactc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 332 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 332 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 333 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 333 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg cgccttttca gtactggggt cagggaactc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 334 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 334 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg tgccttttca gtactggggt cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 335 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 335 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ccggtgatcg tagatactac 180 gatcactctg tgaagggccg gttcactatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 336 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 336 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 337 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 337 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 338 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 338 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 339 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 339 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttgga ggccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 340 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 340 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 341 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 341 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 342 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 342 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 tcacactccg tgaagggccg 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cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 347 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 347 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 348 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 348 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ccggtgatcg tagatactac 180 gatcactctg tgaagggccg gttcactatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 349 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 349 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ccggtgatcg tagatactac 180 gatcactctg tgaagggccg gttcactatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 350 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 350 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgcgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 351 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 351 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 352 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 352 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 353 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 353 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gatcacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 354 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 354 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 355 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 355 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gcacacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 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ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gatcactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcggtggg cgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 360 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 360 gaggtgcagc tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tagatactac 180 gatgacgcgg tgaagggccg gttcaccatc acccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttgt ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 361 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 361 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 362 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 362 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatattcat acgagtgtac agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatggg tcgtccaggt tgcatagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aatcattata gtccttttac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 363 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 363 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat aggtatagta tggggtggct ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attgattctt atggtcgtgg tacatactac 180 gaagaccccg tgaagggccg gttcagcatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaaatttct 300 cagtttgggt caaatgcgtt tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcgagc 360 <210> 364 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 364 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 365 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 365 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 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ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gctcagggtt tgaggcatcc taagacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 367 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 367 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagtgg attgggtctc agttatcttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc atgtggcgtt cctcgttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 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<211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 370 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcagt ggattgggtc tcagttatct 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcatgtggcg ttcctcgttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgctcaggg tttgaggcat 660 cctaagacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 371 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 371 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcagt ggattgggtc tcagttatct 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcatgtggcg ttcctcgttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgctcaggg tcttatgaag 660 cctatgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 372 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 372 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcggatccga catccagatg 420 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg 480 gcaagtcgtc cgattgggac gacgttaagt tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tcctttggaa ttcccgtttg caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgct 660 acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg 720 gaaatcaaac gg 732 <210> 373 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 373 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcggatccga catccagatg 420 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg 480 gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgct 660 acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg 720 gaaatcaaac gg 732 <210> 374 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 374 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcggatccga catccagatg 420 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg 480 gcaagtcagt ggattgggtc tcagttatct tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tcatgtggcg ttcctcgttg caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgct 660 acgtactact gtgctcaggg tttgaggcat cctaagacgt tcggccaagg gaccaaggtg 720 gaaatcaaac gg 732 <210> 375 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 375 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcggatccga catccagatg 420 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg 480 gcaagtcagt ggattgggtc tcagttatct tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tcatgtggcg ttcctcgttg caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgct 660 acgtactact gtgctcaggg tcttatgaag cctatgacgt tcggccaagg gaccaaggtg 720 gaaatcaaac gg 732 <210> 376 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 376 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 377 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 377 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag 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tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 379 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 379 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 tcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 380 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 380 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacacgcgg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 381 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 381 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgtgt 357 <210> 382 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 382 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tccttgcttt ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gcgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 383 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 383 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tccttgcttt ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gcgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 384 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 384 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattattaa gcatttaaag 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatggtgc atcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtcaacaggg ggctcggtgg 660 cctcagacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 385 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 385 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattattaa gcatttaaag 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatggtgc atcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtcaacaggg ggctcggtgg 660 cctcagacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 386 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 386 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 387 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 387 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 388 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 388 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt 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gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgac 360 atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagaccg tgtcaccatc 420 acttgccggg caagtcagtg gattgggtct cagttatctt ggtaccagca gaaaccaggg 480 aaagccccta agctcctgat catgtggcgt tcctcgttgc aaagtggggt cccatcacgt 540 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 600 gattttgcta cgtactactg tgctcagggt gcggcgttgc ctaggacgtt cggccaaggg 660 accaaggtgg aaatcaaacg g 681 <210> 390 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 390 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tggtttggtt cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720 gaggatctga at 732 <210> 391 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 391 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tggtttggtt cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 392 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 392 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gacgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctggtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 393 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 393 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ttgtttggtt cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720 gaggatctga at 732 <210> 394 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 394 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ttgtttggtt cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 395 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 395 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 396 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 396 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 397 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 397 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720 gaggatctga at 732 <210> 398 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 398 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga cgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ctttggaatt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 399 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 399 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gacgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcctttggaa ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 400 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 400 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcacagt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gacgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcctttggaa ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 401 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 401 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attattaagc atttaaagtg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggtgcat cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt caacagggga ctcggtggcc tcagacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720 gaggatctga at 732 <210> 402 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 402 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attattaagc atttaaagtg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggtgcat cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt caacagggga ctcggtggcc tcagacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 403 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 403 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggtgacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattattaa gcatttaaag 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatggtgc atcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtcaacaggg ggctcggtgg 660 cctcagacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa 720 ctcatctcag aagaggatct gaat 744 <210> 404 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 404 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tgggatgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag gtccagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatacg 300 ggtcgttggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggtgacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattattaa gcatttaaag 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatggtgc atcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtcaacaggg ggctcggtgg 660 cctcagacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 405 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 405 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tccttgcttt ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gcgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 406 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 406 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcattggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gacgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcctttggaa ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 407 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 407 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc cttgcttttt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgc gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 408 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 408 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc cttgcttttt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgc gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720 gaggatctga at 732 <210> 409 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 409 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc cttgcttttt cccgtttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgc gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 410 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 410 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcgaata cgggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatacg 300 ggtcattggg agccttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tccttgcttt ttcccgtttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gcgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 411 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 411 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccagtg gtccatcgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 420 gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg gcaagtcgtc cgattgggac gatgttaagt 480 tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tcttgtttgg ttcccggttg 540 caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 600 atcagcagtc tgcaacctga agattttgct acgtactact gtgcgcaggc tgggacgcat 660 cctacgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gg 702 <210> 412 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 412 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg acgacgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctggttt ggttcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgcgcag gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 413 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 413 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg acgacgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcctttgg aattcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgcgcag gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 414 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 414 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg acgatgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcttgttt ggttcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgcgcag gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 415 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 415 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg acgatgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatccttgct ttttcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgcgcgcag gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 416 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 416 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 417 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 417 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 418 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 418 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtcttatga agcctatgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 419 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 419 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattatt aagcatttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag ggggctcggt ggcctcagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 420 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 420 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggagt taacgttagc catgactcta tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtatcagcc attcgggggc ctaacggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gagtggggct 300 aggcatgcgg atacggagcg gcctccgtcg cagcagacca tgccgttttg gggtcaggga 360 accctggtca ccgtctcgag c 381 <210> 421 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 421 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat aggtatagta tggggtggct ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attgattctt atggtcgtgg tacatactac 180 gaagaccccg tgaagggccg gttcagcatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaaatttct 300 cagtttgggt caaatgcgtt tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcgagc 360 <210> 422 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 422 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtatattcat acgagtgtac agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatggg tcgtccaggt tgcatagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aatcattata gtccttttac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 423 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 423 gatatccaga tgacgcagtc tccgagctct ctgccagcga gcgttggcga ccgtgtgacc 60 atcacttgcc gcgcttctcg tccgatcggt accatgctgt cttggtacca gcagaaacca 120 ggcaaagccc cgaaactcct gatcctgttc ggttctcgcc tgcagtctgg tgtaccgagc 180 cgtttcagcg gttctggtag cggcaccgac tttaccctca cgatctctag cctgcagcca 240 gaggatttcg cgacctatta ctgtgctcag gcgggtaccc acccgactac cttcggccag 300 ggtacgaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 424 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 424 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat aggtatagta tggggtggct ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attgattctt atggtcgtgg tacatactac 180 gaagaccccg tgaagggccg gttcagcatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaaatttct 300 cagtttgggt caaatgcgtt tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcgagc 360 gctagcacca gtggtccatc ggacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 420 tctgtaggag accgtgtcac catcacttgc cgggcaagtc gtccgattgg gacgatgtta 480 agttggtacc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatcttgtt tggttcccgg 540 ttgcaaagtg gggtcccatc acgtttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 600 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gctacgtact actgtgcgca ggctgggacg 660 catcctacga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgg 705 <210> 425 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 425 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttc aagtattcga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag atttcggata ctgctgatcg tacatactac 180 gcacactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gatatatact 300 gggcgttggg tgccttttga gtactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 agcaccgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 420 gtcaccatca cttgccgggc aagtcgtccg attgggacga tgttaagttg gtaccagcag 480 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ttgtttggtt cccggttgca aagtggggtc 540 ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 600 caacctgaag attttgctac gtactactgt gcgcaggctg ggacgcatcc tacgacgttc 660 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 690 <210> 426 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 426 gacatccaga tgacccagag cccatctagc ctgtctgctt ctgtaggtga ccgcgttact 60 attacctgtc gtgcaagcca gtacatccac acctctgttc agtggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactgct gatttacggt tcttcccgtc tgcacagcgg cgttccatct 180 cgcttctctg gcagcggttc tggtacggat ttcacgctga ccattagctc tctccagccg 240 gaagactttg ccacgtacta ctgccagcag aaccactact ctccgtttac ctacggtcag 300 ggcaccaaag tggagattaa acgtgctagc accgatatcc agatgacgca gtctccgagc 360 tctctgccag cgagcgttgg cgaccgtgtg accatcactt gccgcgcttc tcgtccgatc 420 ggtaccatgc tgtcttggta ccagcagaaa ccaggcaaag ccccgaaact cctgatcctg 480 ttcggttctc gcctgcagtc tggtgtaccg agccgtttca gcggttctgg tagcggcacc 540 gactttaccc tcacgatctc tagcctgcag ccagaggatt tcgcgaccta ttactgtgct 600 caggcgggta cccacccgac taccttcggc cagggtacga aggtggaaat caaacgg 657 <210> 427 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 427 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggagt taacgttagc catgactcta tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtatcagcc attcgggggc ctaacggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gagtggggct 300 aggcatgcgg atacggagcg gcctccgtcg cagcagacca tgccgttttg gggtcaggga 360 accctggtca ccgtctcgag cgctagcacc gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg 480 acgatgttaa gttggtacca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatcttgttt 540 ggttcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat 600 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg ctacgtacta ctgtgcgcag 660 gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa acgg 714 <210> 428 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 428 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat aggtatagta tggggtggct ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attgattctt atggtcgtgg tacatactac 180 gaagaccccg tgaagggccg gttcagcatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaaatttct 300 cagtttgggt caaatgcgtt tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcgagc 360 gctagcaccg acatccagat gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 420 cgtgtcacca tcacttgccg ggcaagtcgt ccgattggga cgatgttaag ttggtaccag 480 cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atcttgtttg gttcccggtt gcaaagtggg 540 gtcccatcac gtttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 600 ctgcaacctg aagattttgc tacgtactac tgtgcgcagg ctgggacgca tcctacgacg 660 ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa cgg 693 <210> 429 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 429 caggaaacag ctatgaccat g 21 <210> 430 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 430 ttgtaaaacg acggccagtg 20 <210> 431 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 431 ttcaggctgc gcaactgttg 20 <210> 432 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 432 cgccaagctt gcatgcaaat tc 22 <210> 433 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 433 cctgtgcagc ctccggattc acctttgtta agtattcgat ggggtgggtc cgccagg 57 <210> 434 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 434 tccagggaag ggtctagagt gggtctcaca gatttcgaat acgggtgatc gtacatacta 60 cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccc 95 <210> 435 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 435 gaggacaccg cggtatatta ctgtgcgata tatacgggtc gttgggagcc ttttgactac 60 tggggtcagg gaaccctggt c 81 <210> 436 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 436 aaaggtgaat ccggaggctg cacagg 26 <210> 437 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 437 tgagacccac tctagaccct tccctgga 28 <210> 438 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 438 cgcacagtaa tataccgcgg tgtcctc 27 <210> 439 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 439 tcaagcgcta gcaccgacat ccagatgacc cagtctc 37 <210> 440 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 440 ggaattccat atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc 60 ccagccggcg atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg gg 102 <210> 441 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 441 ggttaaccgc ggccgcgaat tcggatccct cgagtcatta ccgtttgatt tccacctt 58 <210> 442 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 442 aaacgtgcta gcaccgatat ccagatgacg cagtctcc 38 <210> 443 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from a Human germline sequence. <400> 443 catctggatg tcggtgctag cgctcgagac ggt 33 <210> 444 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 444 Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 445 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 445 Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu 1 5 10 <210> 446 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 446 Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe 1 5 10 15 <210> 447 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 447 Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 1 5 10 15 <210> 448 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 448 Ala Ser Thr Ser Gly Pro Ser 1 5 <210> 449 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 449 Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser

Claims (71)

  1. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  2. 하기의 돌연변이(카바트(Kabat) 넘버링(numbering)에 따른 넘버링) 중 하나 이상을 포함하는 DOM1h-574-14(서열 번호 10)의 돌연변이체인, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인:
    위치 30은 L 또는 F,
    위치 52는 A 또는 T,
    위치 52a는 D 또는 E,
    위치 54는 A 또는 R,
    위치 57은 R, K 또는 A,
    위치 60은 D, S, T 또는 K,
    위치 61은 E, H 또는 G,
    위치 62는 A 또는 T,
    위치 100은 R, G, N, K, Q, V, A, D, S 또는 V,
    위치 101은 A, Q, N, E, V, H 또는 K.
  3. 위치 101(카바트 넘버링에 따른 넘버링)에 발린을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 중쇄 단일 가변 도메인.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가변 도메인이 제1항에서 정의된 바와 같은, 단일 가변 도메인.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 3OG, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R 중 하나 이상을 포함하며, 상기 넘버링이 카바트 넘버링에 따른 것인, 단일 가변 도메인.
  6. 3OG, 44D, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R 중 하나 이상을 포함하며, 상기 넘버링이 카바트 넘버링에 따른 것인 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서,
    상기 단일 가변 도메인의 아미노산 서열이 다르게는 DOM1h-574(서열 번호 11; 도 5)의 아미노산 서열과 동일한, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 45P, 55D, 56R, 94I 및 98R을 포함하며, 상기 넘버링이 카바트 넘버링에 따른 것인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  8. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-132(서열 번호 7), DOM1h-574-135(서열 번호 8), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 9) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  9. DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-93(서열 번호 12), DOM1h-574-123(서열 번호 13), DOM1h-574-125(서열 번호 14), DOM1h-574-126(서열 번호 15) 또는 DOM1h-574-129(서열 번호 16), DOM1h-574-133(서열 번호 17), DOM1h-574-137(서열 번호 18) 또는 DOM1h-574-160(서열 번호 19)의 아미노산 서열과 94% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  10. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-125(서열 번호 14), DOM1h-574-126(서열 번호 15), DOM1h-574-133(서열 번호 17), DOM1h-574-135(서열 번호 8), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-139(서열 번호 20), DOM1h-574-155(서열 번호 21), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  11. 인간, 뮤린(murine) 또는 사이노몰구스(Cynomologus) 원숭이 TNFR1에 결합하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서,
    상기 단일 가변 도메인이 DOM1h-574-156(서열 번호 22), DOM1h-574-72(서열 번호 23), DOM1h-574-109(서열 번호 109), DOM1h-574-138(서열 번호 25), DOM1h-574-162(서열 번호 26) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 27)의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 500 pM 이하의 해리 상수(KD)로 인간 TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는, 단일 가변 도메인.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 2 x 10-4 s-1 이하의 오프-레이트(off-rate) 상수(Koff)로 인간 TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는, 단일 가변 도메인.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1에 특이적으로 결합하는, 단일 가변 도메인.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 뮤린 TNFR1에 결합하는, 단일 가변 도메인.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1의 DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)으로의 결합을 억제하는, 단일 가변 도메인.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 인간, 뮤린, 사이노몰구스 원숭이 및 임의로 개 TNFR1의 DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)으로의 결합을 억제하는, 단일 가변 도메인.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시, 표준 MRC5 검정에서 약 5 nM 이하의 ND50으로 TNFR1을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 TNF 알파-유도된 세포독성의 억제로 결정시 표준 L929 검정에서 약 150 nM 이하의 ND50으로 TNFR1을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 TNF 알파-유도된 IL-8 분비의 억제로 결정시 표준 사이노몰구스 KI 검정에서 약 5 nM 이하의 ND50으로 TNFR1을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 TNFR1의 비-경쟁적 억제제인, 단일 가변 도메인.
  22. 제21항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 인간 TNFR1의 도메인 1에 특이적으로 결합하는, 단일 가변 도메인.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 인간 TNFR1의 PLAD 도메인에 특이적인, 단일 가변 도메인.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 말단, 임의로, C-말단 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 폴리알킬렌 글리콜 부분(moiety), 임의로 폴리에틸렌 글리콜 부분에 연결된, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  26. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 상기 선택된 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이하고 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  27. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 상기 선택된 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이하고 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  28. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 상기 선택된 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이하고 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  29. 제26항에 있어서, 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  30. 제26항에 있어서, 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  31. 제27항에 있어서, 상기 선택된 아미노산 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  32. 제31항에 있어서, DOM1h-574-72(서열 번호 2)의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함하는, 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  33. 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서, 상기 단일 가변 도메인은
    (i) 37 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 10㎍/㎖ 이상의 농도(c)의 프로테아제; 또는
    (ii) 30 ℃에서 1시간 이상의 시간(t) 동안 40㎍/㎖ 이상의 농도(c')의 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 대해 내성이며, 여기서 상기 가변 도메인이 DOM1h-574-126(서열 번호 15) 또는 DOM1h-574-133(서열 번호 17)의 아미노산 서열과 94% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 임의로 위치 101(카바트 넘버링)에 발린을 포함하는, 프로테아제 내성 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인은 Tm이 50 ℃ 이상인, 단일 가변 도메인.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 항체 불변 도메인, 임의로 항체 Fc 영역을 포함하며, 임의로, 상기 Fc의 N-말단이 상기 가변 도메인의 C-말단에 연결되는(임의로 직접 연결되는), 폴리펩티드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 임의로 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 다중특이적 리간드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항-SA 단일 가변 도메인이 DOM7h-11(서열 번호 28), DOM7h-11-3(서열 번호 29), DOM7h-11-12(서열 번호 30), DOM7h-11-15(서열 번호 31), DOM7h-14(서열 번호 32), DOM7h-14-10(서열 번호 33), DOM7h-14-18(서열 번호 34) 또는 DOM7m-16(서열 번호 35)의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 리간드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 상기 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드.
  39. (i) DOM1h-574-156(서열 번호 1)의 아미노산 서열과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) DOM7h-11-3(서열 번호 29)의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 상기 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드.
  40. (i) DOM1h-574-156(서열 번호 1)의 아미노산 서열과 93% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, (ii) DOM7h-14-10(서열 번호 33)의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, (iii) 임의로, 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인과 상기 항-SA 단일 가변 도메인 사이에 링커가 제공되며, 상기 링커가 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함하는, 다중특이적 리간드.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 포함하는 TNFR1 길항제.
  42. 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 폐 전달, 환자의 폐로의 전달 또는 전신 전달을 위한 제33항에 따른 가변 도메인을 포함하는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  43. 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제로서,
    상기 길항제가 DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  44. 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제로서,
    상기 길항제가 DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  45. 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제로서,
    상기 길항제가 DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  46. 제43항에 있어서, 상기 선택된 서열의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  47. 제43항에 있어서, 상기 선택된 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  48. 제46항에 있어서, 상기 선택된 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  49. 제44항에 있어서, 상기 선택된 서열의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 갖는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  50. 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 TNFR1에 결합하는 TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제로서,
    상기 길항제가 DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 및 DOM1h-574-180(서열 번호 6)으로부터 선택된 단일 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 서열을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 길항제.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한, TNFR1 길항제.
  52. 염증 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항의 TNFR1 길항제의 용도.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 질환이 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환 및 만성폐쇄폐병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 길항제 또는 용도.
  54. 제53항에 있어서, 상기 관절염이 류머티스 관절염 또는 연소성 류머티스 관절염인, 길항제 또는 용도.
  55. 제53항에 있어서, 상기 염증성 장질환이 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 길항제 또는 용도.
  56. 제53항에 있어서, 상기 만성폐쇄폐병이 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 길항제 또는 용도.
  57. 제53항에 있어서, 상기 폐렴이 세균성 폐렴인, 길항제 또는 용도.
  58. 제57항에 있어서, 상기 세균성 폐렴이 포도구균(Staphylococcal) 폐렴인, 길항제 또는 용도.
  59. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한, TNFR1 길항제.
  60. 호흡기 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항의 TNFR1 길항제의 용도.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 호흡기 질환이 폐 염증, 만성폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 과민성 폐간질염, 호산구증가증을 갖는 폐 침윤물, 환경성 폐질환, 폐렴, 기관지확장증, 낭성 섬유증, 간질성 폐질환, 원발성 폐고혈압, 폐혈전색전증, 늑막 장애, 종격 장애, 횡경막 장애, 저환기, 과호흡, 수면중 무호흡, 급성 호흡 곤란 증후군, 중피종, 육종, 이식거부, 이식편대숙주병, 폐암, 알러지성 비염, 알러지, 석면증, 아스페르길루스종, 아스페르길루스증, 기관지확장증, 만성기관지염, 폐기종, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 침습성 폐렴구균 질환, 인플루엔자, 비결핵성 미코박테리아, 흉막삼출, 진폐증, 뉴모시스티스병, 폐렴, 폐방선균증, 폐포단백증, 폐탄저병, 폐부종, 폐색전, 폐염증, 폐 X 조직구증, 폐고혈압, 폐의 노카르디아증, 폐결핵, 폐정맥폐쇄병, 류머티스성 폐 질환, 사르코이드증 및 베게너 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 길항제 또는 용도.
  62. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택된 TNFR1의 하나 이상의 에피토프 서열을 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드.
  63. 제62항에 있어서, 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 열거된 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한, NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택된 TNFR1의 하나 이상의 에피토프 서열을 표적으로 하는 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드.
  64. 환자에서 NSICCTKCHKGTYLY, NSICCTKCHKGTYL, CRKNQYRHYWSENLF 및 NQYRHYWSENLFQCF로 이루어진 군으로부터 선택된 TNFR1의 하나 이상의 에피토프 서열을 표적으로 하는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-TNFR1 길항제, 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 다중특이적 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 열거된 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법.
  65. DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1h-574-72(서열 번호 2), DOM1h-574-109(서열 번호 3), DOM1h-574-138(서열 번호 4), DOM1h-574-162(서열 번호 5) 또는 DOM1h-574-180(서열 번호 6)의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, TNFR1에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는, 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  66. 항-TNFα 수용체 1형(TNFR1; p55) 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 혈청 알부민(SA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드로서,
    (a) 상기 항-TNFR1 단일 가변 도메인이 DOM1h-574-156(서열 번호 1), DOM1m-15-12(서열 번호 36) 또는 DOM1m-21-23(서열 번호 37)의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산을 포함하며;
    (b) 상기 항-SA 단일 가변 도메인이 DOM7h-11-12(서열 번호 30) 또는 DOM7h-11-12dh(서열 번호 38)의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산을 포함하며;
    (c) 상기 리간드가 상기 가변 도메인 사이에 링커를 포함하며, 상기 링커는 아미노산 서열 AS 또는 AST를 포함하는, 다중특이적 리간드.
  67. DMS5537(서열 번호 39), DMS5538(서열 번호 40), DMS5539(서열 번호 41) 또는 DMS5540(서열 번호 42)을 포함하거나, 이로 이루어진, 다중특이적 리간드.
  68. 제66항 또는 제67항의 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 핵산.
  69. DMS5537(서열 번호 43), DMS5538(서열 번호 44), DMS5539(서열 번호 38) 또는 DMS5540(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  70. 제68항 또는 제69항의 핵산을 포함하는 벡터.
  71. 제70항의 벡터를 포함하는 숙주, 임의로 비-인간 배아 세포.
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