ES2542328T3 - Métodos para la identificación, evaluación y tratamiento de pacientes con terapia de inhibición del proteasoma - Google Patents

Métodos para la identificación, evaluación y tratamiento de pacientes con terapia de inhibición del proteasoma Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para determinar un régimen de terapia de inhibición del proteasoma para tratar un tumor en un paciente que comprende: a) determinar el nivel de expresión de marcadores en un conjunto de marcadores que comprende al menos dos marcadores de predicción seleccionados del grupo que consiste en los marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 en una muestra de paciente que comprende células tumorales; y b) determinar un régimen basado en la inhibición del proteasoma para tratar el tumor basándose en la expresión de los marcadores de predicción, en el que un nivel de expresión significativo es indicativo de que el paciente es tanto un paciente sensible como un paciente no sensible.

Description

REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. número 60/431.514, presentada el 6 de diciembre de 2002.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La inhibición del proteasoma representa una estrategia importante recientemente desarrollada en el tratamiento del cáncer. El proteasoma es un complejo multi-enzimático presente en todas las células que desempeña una función en la degradación de proteínas que participan en la regulación del ciclo celular. Por ejemplo, King et al., demostraron que la vía de la ubiquitina-proteasoma desempeña una función esencial en regular el ciclo celular, crecimiento neoplásico y metástasis. Varias proteínas reguladoras clave, que incluyen p53, ciclinas y las cinasas dependientes de ciclinas p21 y p27KIP1, son temporalmente degradadas durante el ciclo celular por la vía de la ubiquitinaproteasoma. La degradación ordenada de estas proteínas se requiere para que la célula avance a través del ciclo celular y experimente la mitosis. Véase, por ejemplo, Science 274:1652-1659 (1996). Además, la vía de la ubiquitinaproteasoma se requiere para la regulación transcripcional. Palombella et al., enseñan que la activación del factor de transcripción NF-kB está regulada por la degradación mediada por el proteasoma de la proteína inhibidora IkB. Véase la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 95/25533. A su vez, NF-kB desempeña una función central en la regulación de genes que participan en las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Por ejemplo, Read et al. demostraron que la vía de la ubiquitina-proteasoma se requiere para la expresión de moléculas de adhesión a células, tales como E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1. Véase Immunity 2:493-506 (1995). Hallazgos adicionales soportan adicionalmente la función para la inhibición del proteasoma en terapia para el cáncer, ya que Zetter encontró que las moléculas de adhesión a células participan en la metástasis y angiogénesis de tumor in vivo, dirigiendo la adhesión y extravasación de células tumorales a y de la vasculatura a sitios de tejido remotos dentro del cuerpo. Véase, por ejemplo, Seminars in Cancer Biology 4:219-229 (1993). Además, Beg y Baltimore encontraron que NF-kB es un factor antiapoptósico, y la inhibición de la activación de NF-kB hace a las células más sensibles al estrés ambiental y agentes citotóxicos. Véase Science 274:782 (1996).
Adams et al. han descrito compuestos de ésteres y ácidos borónicos de péptido útiles como inhibidores del proteasoma. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.780.454 (1998), la patente de EE.UU. nº 6.066.730 (2000) y la patente de EE.UU. nº 6.083.903 (2000). Describen el uso de los compuestos de ésteres borónicos y ácidos borónicos desvelados para reducir la tasa de degradación de proteína del músculo, para reducir la actividad de NF-kB en una célula, para reducir la tasa de degradación de la proteína p53 en una célula, para inhibir la degradación de ciclina en una célula, para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa y para inhibir la adhesión de células dependiente de NF-kB. Adams et al. han descrito uno de los compuestos, ácido N-pirazincarbonil-Lfenilalanina-L-leucinaborónico (PS-341, ahora se conoce como bortezomib) ya que ha demostrado actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumor humano. Este compuesto particular se recibido recientemente la autorización para el tratamiento de pacientes que tienen mieloma múltiple resistente al tratamiento recidivante, y está actualmente sometiéndose a ensayos clínicos en indicaciones adicionales, que incluyen cánceres hematológicos adicionales, además de tumores sólidos.
Debido a que el proteasoma desempeña una función generalizada en la fisiología normal, además de la patología, es importante optimizar (por ejemplo, evitar la excesiva) inhibición del proteasoma si se usan inhibidores del proteasoma como agentes terapéuticos. Además, uno de los constantes problemas con la terapia en pacientes con cáncer es las diferencias individuales en la respuesta a terapias. Con el estrecho índice terapéutico y el potencial tóxico de muchas terapias para el cáncer disponibles, éste contribuye potencialmente a que muchos pacientes reciban regímenes de terapia ineficaces innecesarios e incluso perjudiciales. Si una terapia diseñada pudiera optimizarse para tratar pacientes individuales, tales situaciones podrían reducirse o incluso eliminarse. Por consiguiente, existe una necesidad de identificar pacientes con cáncer particulares contra los que los inhibidores del proteasoma son particularmente eficaces, tanto solos como en combinación con otras quimioterapias. Por tanto, existe una necesidad de identificar pacientes particulares que respondan bien al tratamiento con un inhibidor del proteasoma (respondedores) frente a aquellos pacientes que no responden al tratamiento del proteasoma (no respondedores). Por tanto, sería beneficioso proporcionar el diagnóstico, estadificación, pronóstico y monitorización de pacientes con cáncer, que incluyen, por ejemplo, pacientes con cáncer hematológico (por ejemplo, mieloma múltiple, leucemias, linfoma, etc.), además de pacientes con cáncer de tumor sólido, que se beneficiarían de terapias de inhibición del proteasoma; o para indicar una predisposición de tales pacientes a tales medidas preventivas. La presente invención se dirige hacia estas necesidades.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a los métodos y kit definidos en las reivindicaciones adjuntas. Estos métodos
normalmente incluyen determinar el nivel de expresión de dos o más marcadores de predicción en el tumor de un paciente (por ejemplo, células de cáncer de un paciente) e identificar si la expresión en la muestra incluye un patrón
o perfil de expresión de un marcador de predicción seleccionado o conjunto de marcadores que se correlaciona con respuesta o no respuesta a terapia de inhibición del proteasoma.
Los métodos proporcionados de la invención pueden eliminar el uso ineficaz o inapropiado de regímenes de terapia de inhibición del proteasoma.
Los presentes métodos y composiciones se diseñan para su uso en diagnósticos y terapéuticos para un paciente que padece cáncer. El cáncer puede ser del tipo tumor líquido o sólido. Los tumores líquidos incluyen tumores de origen hematológico, que incluyen, por ejemplo, mielomas (por ejemplo, mieloma múltiple), leucemias (por ejemplo, síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica, otras leucemias) y linfomas (por ejemplo, linfomas de linfocitos B, linfoma no Hodgkin). Los tumores sólidos pueden originarse en órganos, e incluyen cánceres tales como pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñón e hígado.
Agentes terapéuticos para su uso en los métodos de la invención incluyen une nueva clase de agentes terapéuticos conocidos como inhibidores del proteasoma. Un ejemplo de un inhibidor del proteasoma que se autorizó recientemente para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple resistente al tratamiento recidivante y está actualmente siendo probado en ensayos clínicos para indicaciones adicionales es bortezomib. Se conocen en la técnica otros ejemplos de inhibidores del proteasoma y se describen en más detalle en el presente documento. Los regímenes de terapia de inhibición del proteasoma también pueden incluir agentes terapéuticos adicionales tales como agentes quimioterapéuticos. Algunos ejemplos de agentes quimioterapéuticos tradicionales se exponen en la Tabla A. Alternativamente o en combinación con estos agentes quimioterapéuticos, las clases más nuevas de agentes quimioterapéuticos también pueden usarse en terapia de inhibición del proteasoma.
Una realización de la invención proporciona métodos para determinar un régimen basado en inhibición del proteasoma para tratar un tumor en un paciente. Tales métodos se definen en las reivindicaciones. Un nivel de expresión significativo del marcador de predicción o marcadores en la muestra de paciente puede ser una indicación de que el paciente es un paciente sensible y se beneficiaría de la terapia de inhibición del proteasoma cuando el marcador de predicción o conjunto de marcadores proporcionado en el presente documento indicara tal sensibilidad. Adicionalmente, un nivel de expresión significativo de un marcador de predicción o marcadores en un paciente puede ser una indicación de que el paciente no es un paciente sensible y no se beneficiaría de la terapia de inhibición del proteasoma cuando el marcador o marcadores proporcionados en el presente documento indicaran tal no sensibilidad.
Marcadores de predicción seleccionados para su uso en los métodos comprenden marcadores de predicción sensibles como se indica en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3.
En ciertos aspectos, el nivel de expresión del marcador de predicción en el tumor de paciente puede medirse aislando una muestra del tumor y realizando análisis sobre la muestra aislada, o una porción de la misma. En otro aspecto, el nivel de expresión del marcador de predicción en el tumor de paciente puede medirse usando técnicas de obtención de imágenes in vivo.
En ciertos aspectos, el determinar el nivel de expresión comprende detección de ARNm. Tal detección puede llevarse a cabo por cualquier método relevante, que incluye, por ejemplo, PCR, Northern, detección de matriz de nucleótidos, obtención de imágenes in vivo usando sondas de ácido nucleico. En otros aspectos, el determinar el nivel de expresión del marcador de predicción comprende la detección de proteína. Tal detección puede llevarse a cabo usando cualquier método relevante para la detección de proteínas, que incluye, por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunoensayo, detección de matriz de proteínas, obtención de imágenes in vivo usando sondas de péptido.
La determinación del nivel de expresión de un marcador de predicción puede compararse con un nivel de control estándar predeterminado de la expresión con el fin de evaluar si la expresión de un marcador o conjunto de marcadores es significativa y hacer una evaluación para determinar si el paciente es sensible o no sensible. Adicionalmente, la determinación del nivel de expresión de un marcador de predicción puede compararse con un nivel de marcador de control interno de expresión que se mide al mismo tiempo que el marcador de predicción con el fin de hacer una evaluación para determinar si el paciente es sensible o no sensible. El nivel de expresión puede determinarse como significativamente expresado en exceso en ciertos aspectos. El nivel de expresión puede expresarse por defecto en otros aspectos. En todavía otros aspectos, el nivel de expresión se determina contra un patrón predeterminado como se ha determinado por los métodos proporcionados en el presente documento.
Los métodos de la invención pueden usar al menos dos de los marcadores de predicción expuestos en una cualquiera de la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6 o Tabla 7. Adicionalmente, los métodos proporcionados pueden usar dos, tres, cuatro, cinco, seis o más marcadores para formar un conjunto de marcadores de predicción. Por ejemplo, pueden generarse conjuntos de marcadores seleccionados de los marcadores en la Tabla 1, Tabla 2 y/o Tabla 3 usando los métodos proporcionados en el presente documento y pueden comprender
entre dos y todos los marcadores expuestos en la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla 3 y todas y cada una de las combinaciones entre ellos (por ejemplo, cuatro marcadores seleccionados, 16 marcadores seleccionados, 74 marcadores seleccionados, etc.). En una realización, los marcadores comprenden aquellos expuestos en la Tabla 4, Tabla 5 o Tabla 6.
Los métodos de la invención proporcionan adicionalmente la capacidad de construir conjuntos de marcadores a partir de los marcadores de predicción individuales expuestos en la Tabla 1 Tabla 2 y Tabla 3 usando los métodos descritos en más detalle en el presente documento. En otro aspecto, más de un conjunto de marcadores puede usarse en combinación para los métodos de diagnóstico, pronóstico y de tratamiento proporcionados.
Los métodos de la invención pueden realizarse de forma que la determinación del nivel de expresión de un marcador de predicción se mida antes de la terapia contra el tumor con el fin de identificar si el paciente será sensible a una terapia de inhibición del proteasoma.
Además, los métodos de la invención pueden realizarse simultáneamente con terapia contra el tumor en curso para determinar si el paciente está tanto respondiendo a la presente terapia de inhibición del proteasoma como responderá a terapia adicional que comprende terapia de inhibición del proteasoma.
Aún más, los métodos de la invención pueden realizarse después de haberse llevado a cabo la terapia contra el tumor con el fin de evaluar si el paciente será sensible al futuro ciclo de terapia de inhibición del proteasoma.
Si los métodos se realizan durante la terapia contra el tumor en curso o después de un ciclo de terapia contra el tumor, la terapia contra el tumor puede comprender terapia de inhibición del proteasoma o formas alternativas de terapia contra el cáncer. Los métodos proporcionados se diseñan para determinar si el paciente se beneficiará de terapia de inhibición del proteasoma adicional o futura, y pueden incluir tal terapia de inhibición del proteasoma sola
o en combinación con agentes terapéuticos adicionales.
La invención también se refiere a un kit como se define en las reivindicaciones.
Se proporcionan conjuntos de marcadores y métodos para la identificación de conjuntos de marcadores que comprenden al menos dos marcadores de predicción aislados expuestos en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Los conjuntos de marcadores comprenden reactivos para la detección de los marcadores de predicción relevantes expuestos en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Tales reactivos incluyen sondas de ácido nucleico, cebadores, anticuerpos, derivados de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos y sondas de péptido.
Adicionalmente se proporcionan kits para su uso en determinar un régimen basado en inhibición del proteasoma para tratar un tumor en un paciente. Los kits de la invención incluyen reactivos para evaluar marcadores de predicción (por ejemplo, al menos dos marcadores de predicción) y conjuntos de marcadores de predicción (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro o más marcadores seleccionados de la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3), además de instrucciones para su uso según los métodos proporcionados en el presente documento. Los kits proporcionados contienen sondas de ácido nucleico para la evaluación de marcadores de predicción. Los kits proporcionados contienen anticuerpo, fragmento de anticuerpo derivado de anticuerpo, o reactivos de péptido para la evaluación de marcadores de predicción.
Según la invención, los marcadores y conjuntos de marcadores están seleccionados de forma que el valor predictivo positivo de los métodos de la invención sea al menos aproximadamente el 10 %, preferentemente aproximadamente el 25 %, más preferentemente aproximadamente el 50 % y lo más preferentemente aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 % o el 90 % o mayor. También se prefieren para su uso en los métodos de la invención marcadores que se expresan diferencialmente en tumores, en comparación con células normales, al menos una vez y media y preferentemente al menos dos veces en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente aproximadamente el 50 %, y lo más preferentemente aproximadamente el 75 % o más de cualquiera de las siguientes condiciones: respondedores parciales, respondedores completos, respondedores mínimos y no respondedores a terapia de inhibición del proteasoma.
La presente invención proporciona además dianas previamente desconocidas o no reconocidas para el desarrollo de agentes antineoplásicos, por ejemplo, compuestos quimioterapéuticos. Los marcadores de predicción y conjuntos de marcadores descritos en el presente documento también proporcionan nuevas dianas tanto solos como en combinación, que pueden usarse para el desarrollo de novedosos terapéuticos para cánceres. Así, ácidos nucleicos y proteínas representadas por cada uno de los marcadores descritos en el presente documento pueden usarse como dianas en el desarrollo de tratamientos (tanto agente individual como múltiple agente) para cánceres, que incluyen, por ejemplo, tumores malignos hematológicos o tumores malignos sólidos.
Así, adicionalmente se describen en el presente documento métodos para el uso de los marcadores de predicción identificados, además del ácido nucleico y polipéptidos correspondientes para métodos de cribado para la identificación de compuestos novedosos para su uso como terapéuticos contra el cáncer. Tales compuestos recientemente identificados pueden ser útiles solos, o en combinación con terapia de inhibición del proteasoma,
como terapéutico complementario.
La presente invención se basa, en parte, en la identificación de marcadores individuales y conjuntos de marcadores que pueden usarse para determinar si un tumor puede ser eficazmente tratado mediante tratamiento con una terapia de inhibición del proteasoma. Por ejemplo, las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para determinar si un paciente será sensible o no sensible a un agente terapéutico de inhibición del proteasoma.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos preferidos y materiales se describen en el presente documento. En caso de conflicto controlará la presente memoria descriptiva, que incluye definiciones.
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa al menos un elemento y puede incluir más de un elemento.
Un “marcador” es un polímero que se produce naturalmente correspondiente a al menos uno de los ácidos nucleicos
o proteínas asociados a identificadores de conjuntos de sondas Affymetrix enumerados en una cualquiera de la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla 3. Por ejemplo, los marcadores incluyen, sin limitación, hebras codificantes y no codificantes de ADN genómico (es decir, que incluyen cualquier intrón que se produce en ellas), ARN generado por transcripción de ADN genómico (es decir, antes del corte y empalme), ARN generado por corte y empalme de ARN transcrito de ADN genómico y proteínas generadas por traducción de ARN cortado y empalmado (es decir, que incluye proteínas tanto antes como después de la escisión de regiones normalmente escindidas tales como secuencias señal transmembranarias). Como se usa en el presente documento, “marcador” también puede incluir un ADNc preparado por transcripción inversa de un ARN generado por transcripción de ADN genómico (incluyendo ARN cortado y empalmado). “Conjunto de marcadores” es un grupo de marcadores. Los marcadores de la presente invención incluyen los marcadores de predicción identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3.
Un “Marcador de Predicción” o “marcador de predicción”, como se usa en el presente documento, incluye un marcador que se ha identificado por tener expresión diferencial en células tumorales de un paciente y es representativo de una característica de un paciente que es sensible en tanto un modo positivo como negativo al tratamiento con un régimen de inhibidor del proteasoma. Por ejemplo, un marcador de predicción incluye un marcador que está regulado por incremento en un paciente no sensible; alternativamente, un marcador de predicción incluye un marcador que está regulado por incremento en un paciente sensible. Similarmente, un marcador de predicción pretende incluir aquellos marcadores que se regulan por disminución en un paciente no sensible, además de aquellos marcadores que se regulan por disminución en un paciente sensible. Así, como se usa en el presente documento, marcador de predicción pretende incluir todas y cada una de estas posibilidades, y adicionalmente puede incluir cada una individualmente como marcador de predicción; o alternativamente puede incluir una o más, o todas las características conjuntamente cuando se hace referencia a “marcadores de predicción” o “conjuntos de marcadores de predicción”.
Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico “que se produce naturalmente” se refiere a una molécula de ARN o de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).
El término “sonda” se refiere a cualquier molécula que pueda unirse selectivamente a una molécula diana específicamente prevista, por ejemplo, un marcador de la invención. Las sondas pueden ser tanto sintetizadas por un experto en la materia como derivarse de preparaciones biológicas apropiadas. Para fines de detección de la molécula diana, las sondas pueden diseñarse específicamente para marcarse, como se describe en el presente documento. Ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y monómeros orgánicos.
El nivel “normal” de expresión de un marcador es el nivel de expresión del marcador en células en un entorno similar
o situación de respuesta, en un paciente no afectado con cáncer. Un nivel normal de expresión de un marcador puede también referirse al nivel de expresión de una “muestra de control” (por ejemplo, muestra de un sujeto sano que no tiene la enfermedad asociada al marcador). Una muestra de control puede comprender una base de datos de control. Alternativamente, un nivel “normal” de expresión de un marcador es el nivel de expresión del marcador en células no tumorales en un entorno similar o situación de respuesta del mismo paciente del que se deriva el tumor.
“Expresión en exceso” y “expresión por defecto” de un marcador se refieren a la expresión del marcador de un paciente a un nivel mayor o menor, respectivamente, del nivel normal de expresión del marcador (por ejemplo, más
de una vez y media, al menos dos veces, al menos tres veces, nivel mayor o menor, etc.).
“Complementario” se refiere al amplio concepto de complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma hebra de ácido nucleico. Se sabe que un residuo de adenina de una primera región de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno específicos (“apareamiento de bases”) con un residuo de una segunda región de ácido nucleico que es antiparalela a la primera región si el residuo es timina o uracilo. Similarmente, se sabe que un residuo de citosina de una primera hebra de ácido nucleico es capaz de apareamiento de bases con un residuo de una segunda hebra de ácido nucleico que es antiparalela a la primera hebra si el residuo es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria a una segunda región del mismo o un ácido nucleico diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas en un modo antiparalelo, al menos un residuo de nucleótido de la primera región es capaz de apareamiento de bases con un residuo de la segunda región. Preferentemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, por lo que, cuando la primera y segunda porciones están dispuestas en una forma antiparalela, al menos aproximadamente el 50 %, y preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de los residuos de nucleótido de la primera porción son capaces de apareamiento de bases con residuos de nucleótidos en la segunda porción. Más preferentemente, todos los residuos de nucleótidos de la primera porción son capaces de apareamiento de bases con residuos de nucleótido en la segunda porción.
“Homólogo”, como se usa en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencias de nucleótidos entre dos regiones de la misma hebra de ácido nucleico o entre regiones de dos hebras de ácidos nucleicos diferentes. Cuando una posición de residuo de nucleótido en ambas regiones está ocupada por el mismo residuo de nucleótido, entonces las regiones son homólogas en esa posición. Una primera región es homóloga a una segunda región si al menos una posición de residuo de nucleótido de cada región está ocupada por el mismo residuo. La homología entre dos regiones se expresa en términos de la proporción de posiciones de residuos de nucleótidos de las dos regiones que están ocupadas por el mismo residuo de nucleótido. A modo de ejemplo, una región que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-ATTGCC-3' y una región que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-TATGGC-3' comparten el 50 % homología. Preferentemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, por lo que, al menos aproximadamente el 50 %, y preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de las posiciones de residuos de nucleótidos de cada una de las porciones están ocupadas por el mismo residuo de nucleótido. Más preferentemente, todas las posiciones de residuos de nucleótidos de cada una de las porciones están ocupadas por el mismo residuo de nucleótido.
Un marcador está “fijado” a un sustrato si está covalentemente o no covalentemente asociado al sustrato tal que el sustrato pueda aclararse con un fluido (por ejemplo, citrato salino patrón, pH 7,4) sin que se disocie una fracción sustancial del marcador del sustrato.
Como se usa en el presente documento, expresión “significativa”, o un marcador “significativamente” expresado, pretende referirse a la expresión diferencial de un marcador de predicción que es indicativo de sensibilidad o no sensibilidad. Un marcador o conjunto de marcadores en un paciente se expresa “significativamente” a un mayor (o menor) nivel que el nivel normal de expresión de un marcador o conjunto de marcadores si el nivel de expresión del marcador o conjunto de marcadores es mayor o menos, respectivamente, que el nivel normal por una cantidad superior al error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión. Preferentemente, un nivel de expresión significativo es al menos dos veces, y más preferentemente tres, cuatro, cinco o diez veces esa cantidad. Alternativamente, la expresión del marcador o conjunto de marcadores en el paciente puede considerarse “significativamente” mayor o menos que el nivel normal de expresión si el nivel de expresión es al menos aproximadamente dos, y preferentemente al menos aproximadamente tres, cuatro o cinco veces, mayor o menor, respectivamente, que el nivel normal de expresión del marcador o conjunto de marcadores. Aún más, un nivel de expresión “significativo” puede referirse a un nivel que tanto cumple como está por encima como por debajo de una puntuación predeterminada para un conjunto de marcadores de predicción como se ha determinado por métodos proporcionados en el presente documento.
Un cáncer o tumor se trata o diagnostica según los métodos descritos en el presente documento. “Cáncer” o “tumor” pretende incluir cualquier crecimiento neoplásico en un paciente, que incluye un tumor inicial y cualquier metástasis. El cáncer puede ser del tipo tumor líquido o sólido. Tumores líquidos incluyen tumores de origen hematológico, que incluyen, por ejemplo, mielomas (por ejemplo, mieloma múltiple), leucemias (por ejemplo, síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica, otras leucemias) y linfomas (por ejemplo, linfomas de linfocitos B, linfoma no Hodgkin). Los tumores sólidos pueden originarse en órganos, e incluyen cánceres tales como pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñón e hígado. Como se usa en el presente documento, células cancerosas, que incluyen células tumorales, se refiere a células que se dividen a una velocidad anormal (elevada). Las células cancerosas incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, tales como carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, adenocarcinoma, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma no diferenciado, carcinoma broncogénico, melanoma, carcinoma de células renales, hepatoma-carcinoma de células del hígado, carcinoma de las vías biliares, colangiocarcinoma, carcinoma papilar, carcinoma de células transitorias, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma
embrionario, carcinomas mamarios, carcinoma gastrointestinal, carcinomas colónicos, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata y carcinoma de células escamosas de la región del cuello y la cabeza y; sarcomas, tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, condrosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, sinoviosarcoma y mesoteliosarcoma; cánceres hematológicos, tales como mielomas, leucemias (por ejemplo, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica, leucemia monocítica, leucemia linfocítica) y linfomas (por ejemplo, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma maligno, plasmocitoma, sarcoma de células del retículo o enfermedad de Hodgkin); y tumores del sistema nervioso que incluyen glioma, meningioma, meduloblastoma, schwanoma o epidimoma.
Un cáncer es “sensible” a un agente terapéutico si su velocidad de crecimiento se inhibe como resultado del contacto con el agente terapéutico, en comparación con su crecimiento en ausencia de contacto con el agente terapéutico. El crecimiento de un cáncer puede medirse en una variedad de formas, por ejemplo, puede medirse el tamaño de un tumor o la expresión de marcadores tumorales apropiados para ese tipo de tumor. Por ejemplo, se usaron las definiciones de respuesta usadas para identificar marcadores asociados a mieloma y su respuesta a terapia de inhibición del proteasoma, los criterios del Grupo Oncológico del Suroeste (SWOG) como se describen en Blade et al., Br J Haematol. 1998 Sep;102(5):1115-23 (véase también, por ejemplo, la Tabla C). La calidad de ser sensible a una terapia de inhibición del proteasoma es variable, presentando cánceres diferentes niveles de “sensibilidad” diferentes a un agente terapéutico dado, bajo condiciones diferentes. Aún más, las medidas de la sensibilidad pueden evaluarse usando criterios adicionales más allá del tamaño de crecimiento de un tumor, que incluyen calidad de vida del paciente, grado de metástasis, etc. Además, pueden evaluarse marcadores de pronóstico clínico y variables (por ejemplo, proteína M en mieloma, niveles de PSA en cáncer de próstata) en situaciones aplicables.
Un cáncer es “no sensible” a un agente terapéutico si su velocidad de crecimiento no se inhibe, o se inhibe a un grado muy bajo, como resultado del contacto con el agente terapéutico cuando se compara con su crecimiento en ausencia de contacto con el agente terapéutico. Como se ha establecido anteriormente, el crecimiento de un cáncer puede medirse en una variedad de formas, por ejemplo, puede medirse el tamaño de un tumor o la expresión de marcadores de tumor apropiados para ese tipo de tumor. Por ejemplo, se usaron las definiciones de respuesta usadas para identificar marcadores asociados a la no respuesta de mieloma múltiple a agentes terapéuticos, los criterios del Grupo Oncológico del Suroeste (SWOG) como se describen en Blade et. al. en los experimentos descritos en el presente documento. La calidad de no ser sensible a un agente terapéutico es altamente variable, presentando diferentes cánceres diferentes niveles de “no sensibilidad” a un agente terapéutico dado, bajo diferentes condiciones. Aún más, las medidas de no sensibilidad pueden evaluarse usando criterios adicionales más allá del tamaño de crecimiento de un tumor, que incluyen la calidad de vida del paciente, grado de metástasis, etc. Además, pueden evaluarse marcadores de pronóstico clínico y variables (por ejemplo, proteína M en mieloma, niveles de PSA en cáncer de próstata) en situaciones aplicables.
“Tratamiento” debe significar prevenir o inhibir adicionalmente el crecimiento tumoral, además de causar el encogimiento de un tumor. El tratamiento también pretende incluir la prevención de metástasis de tumor. Un tumor se “inhibe” o “trata” si al menos un síntoma (como se determina por indicadores de sensibilidad/no sensibilidad conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) del cáncer o tumor se alivia, termina, ralentiza, minimiza o previene. Cualquier mejora de cualquier síntoma, físico o de otro modo, de un tumor conforme a tratamiento usando cualquier inhibidor del proteasoma, está dentro del alcance de la invención.
Como se usa en el presente documento, el término “agente” se define ampliamente como algo a lo que las células cancerosas, que incluyen células tumorales, pueden exponerse en un protocolo terapéutico. En el contexto de la presente invención, tales agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes de inhibición del proteasoma, además de agentes quimioterapéuticos, como se describen en detalle adicional en el presente documento.
“Inhibidor del proteasoma” debe significar cualquier sustancia que inhiba directa o indirectamente el proteasoma 20S
o 26S o la actividad del mismo. Preferentemente, tal inhibición es específica, es decir, el inhibidor del proteasoma inhibe la actividad del proteasoma a una concentración que es inferior a la concentración del inhibidor requerida para producir otro efecto biológico no relacionado. Preferentemente, la concentración del inhibidor del proteasoma requerida para la inhibición del proteasoma es al menos 2 veces inferior, más preferentemente al menos 5 veces inferior, incluso más preferentemente al menos 10 veces inferior, y lo más preferentemente al menos 20 veces inferior a la concentración requerida para producir un efecto biológico no relacionado. Los inhibidores del proteasoma incluyen aldehídos peptídicos, ácidos borónicos peptídicos, lactacistina y análogos de lactacistina, vinilsulfonas, y alfa.'.beta.'-epoxicetonas. Los inhibidores del proteasoma se describen en más detalle en el presente documento.
Un kit es cualquier artículo de fabricación (por ejemplo, un envase o recipiente) que comprende al menos un reactivo, por ejemplo una sonda, para detectar específicamente un marcador o conjunto de marcadores de la invención. El artículo de fabricación puede promoverse, distribuirse o comercializarse como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. Los reactivos incluidos en tal kit comprenden sondas/cebadores y/o anticuerpos para su uso en detectar la expresión de marcadores sensibles y no de predicción. Además, los kits de la presente invención pueden contener preferentemente instrucciones que describen un ensayo de detección
adecuado. Tales kits pueden usarse convenientemente, por ejemplo, en la práctica clínica, para diagnosticar y evaluar pacientes que presentan síntomas de cáncer, en pacientes particulares que presentan la posible presencia de un cáncer capaz de tratamiento con terapia de inhibición del proteasoma, que incluye, por ejemplo, cánceres hematológicos, por ejemplo, mielomas (por ejemplo, mieloma múltiple), linfomas (por ejemplo, linfoma no Hodgkin), leucemias y tumores sólidos (por ejemplo, pulmón, mama, ovario, etc.).
Los marcadores usados en los métodos o kits de la presente invención, cuya expresión se correlaciona con la respuesta a un agente, se identifican en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6 y Tabla 7. Examinando la expresión de uno o más de los marcadores o conjuntos de marcadores identificados en un tumor, es posible determinar qué agente terapéutico o combinación de agentes será la que más probablemente reduzca la velocidad de crecimiento de las células cancerosas. Examinando la expresión de uno o más de los marcadores o conjuntos de marcadores identificados en un cáncer, también es posible determinar qué agente terapéutico o combinación de agentes será la que más probablemente reduzca la velocidad de crecimiento de células cancerosas. Examinando la expresión de uno o más de los marcadores o conjuntos de marcadores identificados, es, por tanto, posible eliminar agentes terapéuticos ineficaces o inapropiados. También es posible identificar nuevas dianas para agentes antineoplásicos examinando la expresión de uno o más marcadores o conjuntos de marcadores. Así, en una realización, las células tumorales usadas en los métodos de la presente invención son de una muestra de médula ósea. Y, lo que es más importante, estas determinaciones pueden hacerse en una base paciente por paciente o en una base agente por agente. Así, puede determinarse si es probable que un tratamiento terapéutico particular beneficie o no a un paciente particular o grupo/clase de pacientes, o si debe continuarse un tratamiento particular.
La Tabla 1 enumera marcadores identificados usando análisis estadístico aplicado a genes de 44 muestras de pacientes con mieloma. Los marcadores en la Tabla 1 se expresan significativamente en muestras de pacientes que son tanto sensibles como no sensibles al tratamiento con el inhibidor del proteasoma bortezomib. Así, se apreciaría que los marcadores identificados pueden funcionar en un modelo predictivo para identificar prospectivamente la respuesta de pacientes a terapia de inhibición del proteasoma, que incluye respuesta a bortezomib u otra terapia de inhibición del proteasoma conocida en la técnica, además de aquellas descritas en detalle adicional en el presente documento. En particular, los marcadores en la Tabla 1 se correlacionan con una respuesta positiva a terapia (denominados en el presente documento “marcadores no de predicción, (NR)”). Un paciente con una respuesta positiva (tanto completa, parcial como mínima; véase la Tabla C) a terapia se denomina en lo sucesivo un “respondedor”. Adicionalmente, los marcadores de predicción en la Tabla 1 se correlacionan con una respuesta negativa o mala a un agente (denominados en el presente documento “marcadores no de predicción, (NR)”). Un paciente con una mala respuesta (llamada una enfermedad progresiva o resistente al tratamiento; véase la Tabla C) al tratamiento se denomina en lo sucesivo un “no responder”. Un paciente sin respuesta al tratamiento se denomina en lo sucesivo “estable” (véase la Tabla C).
La Tabla 2 enumera marcadores identificados usando análisis estadístico aplicado usando un análisis de riesgo proporcional de Cox para determinar variables independientes del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) en pacientes con mieloma múltiple recidivante y resistente al tratamiento. Estos marcadores son útiles como marcadores de predicción adicionales que se expresan significativamente en pacientes que es probable que progresen en la enfermedad a una velocidad más rápida, y menos probable que sean sensibles a terapia que otros pacientes. Estos marcadores de predicción servirán de factor adicional en la identificación de pacientes que probablemente son sensibles a terapia de inhibición del proteasoma.
La Tabla 3 enumera marcadores identificados usando análisis estadístico aplicado a genes de 44 muestras de mieloma. Los marcadores de predicción en la Tabla 2 se expresan significativamente en muestras de pacientes con mieloma cuya enfermedad es resistente al tratamiento con el inhibidor del proteasoma bortezomib. Estos marcadores de predicción servirán adicionalmente para distinguir pacientes resistentes al tratamiento de aquellos que serán tanto estables como sensibles al tratamiento.
La invención también se refiere a diversos reactivos y kits para diagnosticar, estadificar, pronosticar, monitorizar y tratar un paciente con cáncer (por ejemplo, un paciente con un tumor líquido o un tumor sólido como se describe en detalle adicional en el presente documento), con terapia de inhibición del proteasoma.
Según la invención, los marcadores están seleccionados de forma que el valor predictivo positivo de los métodos de la invención sea al menos aproximadamente el 10 %, preferentemente aproximadamente el 25 %, más preferentemente aproximadamente el 50 % y lo más preferentemente aproximadamente el 90 %. También se prefieren para su uso en los métodos de la invención marcadores que se expresan diferencialmente, en comparación con células normales, al menos dos veces en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente aproximadamente el 50 %, y lo más preferentemente aproximadamente el 75 % de cualquiera de las siguientes condiciones: pacientes sensibles (por ejemplo, respuesta completa, respuesta parcial, respuesta mínima); y pacientes no sensibles (por ejemplo, sin cambio, recaída de la respuesta).
Identificación de marcadores sensibles y no de predicción
En el presente documento se describen marcadores que se expresan en un tumor que es sensible a terapia de
inhibición del proteasoma y cuya expresión se correlaciona con sensibilidad a ese agente terapéutico. En el presente documento también se describen marcadores que se expresan en un tumor que no es sensible a terapia de inhibición del proteasoma y cuya expresión se correlaciona con no sensibilidad a tal terapia. La invención también caracteriza combinaciones de marcadores, denominadas en el presente documento “conjuntos de marcadores”, que pueden predecir pacientes que es probable que respondan o no respondan a un régimen de terapia de inhibición del proteasoma.
La Tabla 1 identifica marcadores cuya expresión se correlaciona con sensibilidad a un inhibidor del proteasoma. Es preferible determinar la expresión de al menos dos o más de los marcadores de predicción identificados; o tres o más de los marcadores de predicción identificados que comprenden un conjunto de los marcadores de predicción identificados. Así, es preferible evaluar la expresión de un conjunto o panel de marcadores de predicción, es decir, el perfil de expresión de un conjunto de marcadores de predicción.
Determinación de la sensibilidad o no sensibilidad a un agente
El nivel de expresión (incluyendo nivel de proteína) de los marcadores sensibles y no de predicción identificados puede usarse para: 1) determinar si un paciente puede tratarse por un agente o combinación de agentes; 2) determinar si un paciente está respondiendo a tratamiento con un agente o combinación de agentes; 3) seleccionar un agente apropiado o combinación de agentes para tratar un paciente; 4) monitorizar la eficacia de un tratamiento en curso; 5) identificar nuevos tratamientos de terapia de inhibición del proteasoma (tanto agente inhibidor del proteasoma individual como agentes complementarios que puedan usarse alternativamente o en combinación con los agentes de inhibición del proteasoma); 6) diferenciar reaparición temprana frente a tardía de un cáncer; y 7) seleccionar un agente apropiado o combinación de agentes en el tratamiento de reaparición temprana y tardía de un cáncer. En particular, los marcadores sensibles y no de predicción identificados pueden utilizarse para determinar terapia apropiada, para monitorizar terapia clínica y ensayos humanos de un fármaco que se prueba para eficacia, y para desarrollar nuevos agentes y combinaciones terapéuticas.
En una realización de la invención, un cáncer puede tener predisposición a responder a un agente si dos o más de los marcadores de predicción correspondientes identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 se expresan significativamente. En otra realización de la invención, la predisposición de un cáncer a ser sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en los que se evalúa la expresión significativa de los marcadores de predicción individuales de los conjuntos de marcadores identificados en la Tabla 4, Tabla 5 o Tabla 6. Asimismo, la predisposición de un paciente a ser sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en los que se genera un conjunto de marcadores usando los métodos descritos en el presente documento en los que los marcadores que comprenden el conjunto de marcadores incluyen marcadores de predicción expuestos en la Tabla 1, Tabla 2, y/o Tabla 3, y se evalúa la expresión del conjunto de marcadores.
En otra realización de la invención, un cáncer puede tener predisposición a no sensibilidad a un agente si dos o más de los marcadores no de predicción correspondientes se expresan significativamente. En otra realización de la invención, un cáncer puede tener predisposición a no sensibilidad a un agente si dos o más de los marcadores de predicción correspondientes identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 se expresan significativamente. En otra realización de la invención, la predisposición de un cáncer a ser no sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en los que se evalúa la expresión significativa de los marcadores de predicción individuales de los conjuntos de marcadores identificados en la Tabla 4, Tabla 5 o Tabla 6. Asimismo, la predisposición de un paciente a ser no sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en los que se genera un conjunto de marcadores usando los métodos descritos en el presente documento en los que los marcadores que comprenden el conjunto de marcadores incluyen marcadores de predicción expuestos en la Tabla 1, Tabla 2, y/o Tabla 3, y se evalúa la expresión del conjunto de marcadores.
En un aspecto, el marcador de predicción o marcadores evaluados están seleccionados de aquellos expuestos en la Tabla 1. En otro aspecto más, el marcador de predicción o marcadores evaluados están seleccionados de aquellos expuestos en la Tabla 2. En otro aspecto adicional, el marcador de predicción o marcadores evaluados están seleccionados de aquellos expuestos en la Tabla 3. Todavía otro aspecto contempla marcadores expuestos en tanto la Tabla 1 sola como en combinación con marcadores expuestos en la Tabla 2 y/o Tabla 3, o alternativamente, aquellos marcadores expuestos en la Tabla 2 sola o en combinación con la Tabla 1 y/o la Tabla 3.
La fuente de las células cancerosas usadas en el presente método se basará en cómo está siendo usado el método de la presente invención. Por ejemplo, si el método está siendo usado para determinar si el cáncer de un paciente puede tratarse con un agente, o una combinación de agentes, entonces la fuente de células cancerosas preferida será células cancerosas obtenidas de un tumor del paciente, por ejemplo, una biopsia del tumor (incluyendo un tumor sólido o líquido), una muestra de sangre. Alternativamente, puede ensayarse una línea de células cancerosas similar al tipo de cáncer que está tratándose. Por ejemplo, si está tratándose mieloma múltiple, entonces puede usarse una línea de células de mieloma. Si el método está siendo usado para predecir o monitorizar la eficacia de un protocolo terapéutico, entonces una muestra de tejido o de sangre del paciente que está tratándose es la fuente preferida. Si el método está siendo usado para identificar nuevos agentes terapéuticos o combinaciones, puede usarse cualquier célula cancerosa, por ejemplo, células de una línea de células cancerosas,.
Un experto puede seleccionar y obtener fácilmente las células cancerosas apropiadas que se usan en el presente método. Para líneas de células cancerosas se prefieren fuentes tales como el Instituto Nacional del Cáncer, para las células NCI-60. Para células cancerosas obtenidas de un paciente pueden emplearse métodos de biopsia estándar, tales como una aguja de biopsia.
Se usaron muestras de mieloma para identificar los marcadores de la presente invención. Además, el nivel de expresión de los marcadores puede evaluarse en otros tipos de tejido que incluyen trastornos de tipos de células hematológicas relacionadas, que incluyen, por ejemplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome mielodisplásico y otros cánceres hematológicos que incluyen linfomas, leucemias, además de tumores de diversos tejidos sólidos. Así, se apreciará que las células de otros tumores malignos hematológicos que incluyen, por ejemplo, linfomas de linfocitos B, linfoma no Hodgkin, síndrome de Waldenstrom, u otras leucemias serán útiles en los métodos de la presente invención. Aún más, también pueden ser útiles marcadores de predicción que predicen la agresividades de enfermedades, además de la sensibilidad y no sensibilidad a los agentes terapéuticos de inhibición del proteasoma en tumores sólidos (por ejemplo, pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñón e hígado) en los métodos de la presente invención.
En los métodos de la presente invención se determina el nivel de expresión de dos o más marcadores de predicción seleccionados del grupo que consiste en los marcadores identificados en la Tabla 1 Tabla 2 y Tabla 3. Como se usa en el presente documento, el nivel o cantidad de expresión se refiere al nivel absoluto de expresión de un ARNm codificado por el marcador o al nivel absoluto de expresión de la proteína codificada por el marcador (es decir, si se produce o no expresión en las células cancerosas).
Generalmente, es preferible determinar la expresión de dos o más de los marcadores sensibles o no de predicción identificados, o tres o más de los marcadores sensibles o no de predicción identificados, o aún más un mayor conjunto de los marcadores sensibles y/o no de predicción identificados, seleccionados de los marcadores de predicción identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Por ejemplo, la Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6 exponen conjuntos de marcadores identificados usando los métodos descritos en el presente documento y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Aún más, pueden generarse conjuntos de marcadores adicionales y/o alternativos que comprenden los marcadores de predicción identificados en el presente documento usando los métodos y marcadores de predicción proporcionados. Así, es posible evaluar la expresión de un panel de marcadores sensibles y no de predicción usando los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento.
Como una alternativa a hacer determinaciones basadas en el nivel absoluto de expresión de marcadores seleccionados, las determinaciones pueden basarse en niveles de expresión normalizados. Los niveles de expresión se normalizaron corrigiendo el nivel absoluto de expresión de un marcador sensible o no de predicción comparando su expresión con la expresión de un marcador de control que no es un marcador sensible o no de predicción, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se expresa constitutivamente. Marcadores adecuados para la normalización incluyen genes de mantenimiento, tales como el gen de actina. Se conocen en la técnica genes constitutivamente expresados y pueden identificarse y seleccionarse según el tejido relevante y/o situación del paciente y los métodos de análisis. Tal normalización permite comparar el nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra tumoral, con otra muestra, por ejemplo, una muestra no tumoral, o entre muestras de diferentes fuentes.
Además, el nivel de expresión puede proporcionarse como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador o conjunto de marcadores, el nivel de expresión del marcador de predicción o conjunto de marcadores se determina para 10 o más muestras individuales, preferentemente 50 o más muestras individuales, con el fin de establecer un nivel de referencia, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Para establecer una medición de referencia, se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los marcadores de predicción o conjuntos de marcadores ensayados en el mayor número de muestras y éste se usa como nivel de expresión de referencia para los marcadores de predicción o conjuntos de marcadores en cuestión. El nivel de expresión del marcador o conjunto de marcadores determinado para la muestra de prueba (nivel absoluto de expresión) se divide entonces entre el valor de expresión medio obtenido para ese marcador o conjunto de marcadores. Esto proporciona un nivel de expresión relativo y ayuda a identificar casos extremos de sensibilidad
o no sensibilidad.
Preferentemente, las muestras usadas serán de tumores similares o de células no cancerosas del mismo origen de tejido que el tumor en cuestión. La elección de la fuente de células depende del uso de los datos del nivel de expresión relativo. Por ejemplo, el uso de tumores de tipos similares para obtener una puntuación de expresión media permite la identificación de casos extremos de sensibilidad o no sensibilidad. El usar la expresión encontrada en tejidos normales como una puntuación de expresión media ayuda en la validación de si el marcador sensible/no de predicción o conjunto de marcadores ensayado es específico del tumor (frente a células normales). Un uso posterior tal es particularmente importante en identificar si un marcador sensible o no de predicción o conjunto de marcadores puede servir de marcador diana o conjunto de marcadores. Además, como se acumulan más datos, el valor de expresión media puede revisarse, proporcionando valores de expresión relativa mejorada basados en datos acumulados.
Aún más, como se explica resumidamente anteriormente, hay diversos métodos disponibles para examinar la expresión de los marcadores, que incluyen tecnología de matriz/chip de genes, RT-PCR, hibridación in situ, inmunohistoquímica, inmunotransferencia, FISH (hibridación in situ por fluorescencia), análisis de FACS, transferencia Northern, transferencia Southern o análisis citogenéticos. Un experto puede seleccionar de estos u otros métodos apropiados y disponibles basándose en la naturaleza del (de los) marcador(s), muestra de tejido y enfermedad en cuestión. Diferentes métodos o combinaciones de métodos podrían ser apropiados en diferentes casos o, por ejemplo, en diferentes tipos de tumores sólidos o hematológicos.
Ensayos de detección
Un método a modo de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador descrito en el presente documento en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica (por ejemplo, una muestra tumoral) de un sujeto de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente que puede detectar el polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico o ADNc). Los métodos de detección de la invención pueden así usarse para detectar ARNm, proteína, ADNc o ADN genómico, por ejemplo, en una muestra biológica in vitro, además de in vivo. Por ejemplo, técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones Northern, hibridaciones in situ y ensayos TaqMan (Applied Biosystems) bajo condiciones de laboratorio aprobadas de GLP. Las técnicas in vitro para la detección de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vitro para la detección de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra el polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse por técnicas de obtención de imágenes estándar.
Un principio general de tales ensayos de diagnóstico y pronóstico implica preparar una muestra o mezcla de reacción que puede contener un marcador, y una sonda, bajo condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el marcador y la sonda interaccionen y se unan, formando así un complejo que puede eliminarse y/o detectarse en la mezcla de reacción. Estos ensayos pueden realizarse en una variedad de formas.
Por ejemplo, un método para realizar un ensayo tal implicaría anclar el marcador o sonda sobre un soporte de fase sólida, también denominado un sustrato, y detectar los complejos de marcador/sonda diana anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En una realización de un método tal, una muestra de un sujeto, que va a ensayarse para la presencia y/o concentración de marcador, puede anclarse sobre un vehículo o soporte de fase sólida. En otra realización, la situación inversa es posible, en la que la sonda puede anclarse a una fase sólida y puede dejarse que una muestra de un sujeto reaccione como un componente sin anclar del ensayo. Un ejemplo de una realización tal incluye el uso de una matriz o chip que contiene un marcador de predicción o conjunto de marcadores anclados para el análisis de expresión de la muestra.
Hay muchos métodos establecidos para anclar componentes de ensayo a una fase sólida. Estos incluyen, sin limitación, moléculas de marcador o de sonda que se inmovilizan mediante conjugación de biotina y estreptavidina. Tales componentes de ensayo biotinilados pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemical, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). En ciertas realizaciones, las superficies con componentes de ensayo inmovilizados pueden prepararse por adelantado y guardarse.
Otros vehículos adecuados o soportes de fase sólida para tales ensayos incluyen cualquier material que pueda unir la clase de molécula a la que pertenece el marcador o sonda. Soportes o vehículos muy conocidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, poliestireno, nailon, polipropileno, nailon, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.
Con el fin de realizar ensayos con los enfoques anteriormente mencionados, el componente no inmovilizado se añade a la fase sólida, tras lo cual se ancla el segundo componente. Después de completarse la reacción, los componentes sin complejar pueden eliminarse (por ejemplo, lavando) en condiciones de forma que cualquier complejo formado quedará inmovilizado sobre la fase sólida. La detección de complejos de marcador/sonda anclados a la fase sólida puede llevarse a cabo en varios métodos brevemente expuestos en el presente documento.
En una realización preferida, la sonda, cuando es el componente de ensayo sin anclar, puede marcarse con el fin de detección y lectura del ensayo, tanto directa como indirectamente, con marcas detectables tratadas en el presente documento y que son muy conocidas para un experto en la materia.
También es posible detectar directamente la formación de complejos de marcador/sonda sin manipulación o marcado adicional de cualquier componente (marcador o sonda), por ejemplo, utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE.UU. nº 5.631.169; Stavrianopoulos,
et al., patente de EE.UU. nº 4.868.103). Se selecciona una marca de fluoróforo sobre la primera molécula 'donante' de forma que, tras la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por una marca fluorescente sobre una segunda molécula 'aceptora', que a su vez puede fluorescer debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína 'donante' puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de residuos de triptófano. Se eligen marcas que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de forma que la marca de la molécula 'aceptora' pueda diferenciarse de la del 'donante'. Como la eficiencia de transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, pueden evaluarse relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la que la unión se produce entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de la molécula 'aceptora' en el ensayo debe ser máxima. Un evento de unión FET puede medirse convenientemente mediante medios de detección fluorométrica estándar muy conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro).
En otra realización, la determinación de la capacidad de una sonda para reconocer un marcador puede llevarse a cabo sin marcar ningún componente del ensayo (sonda o marcador) utilizando una tecnología tal como análisis de interacción biomolecular (BIA) en tiempo real (véase, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Como se usa en el presente documento, “BIA” o “resonancia de plasmones superficiales” es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore). Cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) producen alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmones superficiales (SPR)), produciendo una señal detectable que puede usarse como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
Alternativamente, en otra realización, pueden realizarse ensayos de diagnóstico y pronóstico análogos con marcador y sonda como solutos en una fase líquida. En un ensayo tal, el marcador y sonda complejados se separan de los componentes sin complejar por cualquiera de varias técnicas convencionales, que incluyen, pero no se limitan a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, los complejos de marcador/sonda pueden separarse de los componentes del ensayo sin complejar mediante una serie de etapas de centrífuga, debido a los diferentes equilibrios de sedimentación de los complejos basándose en sus diferentes tamaños y densidades (véase, por ejemplo, Rivas, G., y Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). También pueden utilizarse técnicas cromatográficas estándar para separar moléculas complejadas de sin complejar. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel separa moléculas basándose en el tamaño, y mediante la utilización de una resina de filtración en gel apropiada en un formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente mayor puede separarse de los componentes sin complejar relativamente más pequeños. Similarmente, pueden explotarse las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo de marcador/sonda en comparación con los componentes sin complejar para diferenciar el complejo de componentes sin complejar, por ejemplo, mediante la utilización de resinas de cromatografía de intercambio iónico. Tales resinas y técnicas cromatográficas son muy conocidas para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., y Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(12):499-525). También puede emplearse electroforesis en gel para separar componentes del ensayo complejados de componentes sin unir (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocolos in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999). En esta técnica, complejos de proteína o de ácido nucleico se separan basándose, por ejemplo, en el tamaño o carga. Con el fin de mantener la interacción de unión durante el proceso electroforético, normalmente se prefieren materiales de matriz de gel no desnaturalizante y condiciones en ausencia de agente reductor. Condiciones apropiadas para el ensayo particular y componentes del mismo serán muy conocidas para un experto en la materia.
En una realización particular, el nivel de ARNm correspondiente al marcador puede determinarse tanto por formatos in situ como in vitro en una muestra biológica usando métodos conocidos en la técnica. El término “muestra biológica” pretende incluir tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, además de tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Muchos métodos de detección de la expresión usan ARN aislado. Para métodos in vitro puede utilizarse cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de ARN de células tumorales (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocolos in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). Adicionalmente, pueden procesarse fácilmente grandes números de muestras de tejido usando técnicas muy conocidas para aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de una sola etapa de Chomczynski (1989, patente de EE.UU. nº 4.843.155).
El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o de amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern o Northern, reacción en cadena de la polimerasa y análisis TaqMan y matrices de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm codificado por el gen que se detecta. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente bajo condiciones rigurosas con un ARNm o ADN genómico que codifica un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en el presente documento. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el marcador en cuestión
está siendo expresado.
En un formato, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, haciendo migrar el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, la(s) sonda(s) se inmoviliza(n) sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda(s), por ejemplo, en una matriz GeneChip de Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en detectar el nivel de ARNm codificado por los marcadores.
Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm correspondiente a un marcador en una muestra implica el proceso de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, por rtPCR (la realización experimental expuesta en Mullis, 1987, patente de EE.UU. nº 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), replicación auto-sostenida de secuencias (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:11731177), replicasa Q-Beta (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et al., patente de EE.UU. nº 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácidos nucleicos si tales moléculas están presentes en números muy bajos. Como se usa en el presente documento, cebadores de amplificación se define como que son un par de moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse con regiones 5' o 3' de un gen (hebras más y menos, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entremedias. En general, los cebadores de amplificación tienen de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. Bajo condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.
Para métodos in situ, el ARNm no necesita aislarse de las células cancerosas antes de la detección. En tales métodos, una célula o muestra de tejido se prepara/procesa usando métodos histológicos conocidos. La muestra se inmoviliza entonces sobre un soporte, normalmente un portaobjetos de vidrio, y a continuación se pone en contacto con una sonda que puede hibridarse con ARNm que codifica el marcador.
Como una alternativa a hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizada del marcador. Los niveles de expresión se normalizaron corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador comparando su expresión con la expresión de un gen de control que no es un marcador, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se expresa constitutivamente. Genes adecuados para la normalización incluyen genes de mantenimiento tales como el gen de actina, o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de paciente, con otra muestra, por ejemplo, una muestra no de cáncer, o entre muestras de diferentes fuentes.
Alternativamente, el nivel de expresión puede proporcionarse como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, el nivel de expresión del marcador se determina para 10 o más muestras de aislados de células normales frente a cancerosas, preferentemente 50 o más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los marcadores y conjuntos de marcadores ensayados en el mayor número de muestras y éste se usa como nivel de expresión de referencia para el marcador. El nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de prueba (nivel de expresión absoluto) se divide entonces entre el valor de expresión medio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
En otra realización, se detecta un polipéptido correspondiente a un marcador. Un agente preferido para detectar un polipéptido es un anticuerpo que puede unirse a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, preferentemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')2). El término “marcado”, con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende englobar el marcado directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, enlazando físicamente) una sustancia detectable con la sonda o anticuerpo, además del marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Ejemplos de marcado indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado y marcado de extremos de una sonda de ADN con biotina de forma que pueda detectarse con estreptavidina fluorescentemente marcada.
Puede emplearse una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se une a un anticuerpo dado. Ejemplos de tales formatos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), análisis de transferencia Western y enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección de proteína/anticuerpo conocidos para su uso en determinar si células cancerosas expresan un marcador descrito en el presente documento.
En un formato, pueden usarse anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, en métodos tales como transferencias Western o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, generalmente es preferible inmovilizar tanto el anticuerpo como las proteínas sobre un soporte sólido. Soportes o vehículos de fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte que pueda unir un antígeno o un anticuerpo. Soportes o vehículos muy conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.
Un experto en la materia conocerá muchos otros vehículos adecuados para unir el anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar tal soporte para su uso con la presente invención. Por ejemplo, puede hacerse migrar proteína aislada de células tumorales sobre una electroforesis en gel de poliacrilamida e inmovilizarse sobre un soporte de fase sólida tal como nitrocelulosa. El soporte puede entonces lavarse con tampones adecuados, seguido de tratamiento con el anticuerpo detectablemente marcado. El soporte de fase sólida puede entonces lavarse con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo sin unir. La cantidad de marca unida sobre el soporte sólido puede entonces detectarse mediante medios convencionales.
La invención también engloba kits para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica (por ejemplo, un líquido corporal asociado al ovario tal como una muestra de orina). Tales kits pueden usarse para determinar si un sujeto padece o está en riesgo elevado de desarrollar cáncer. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto marcado o agente que puede detectar un polipéptido o un ARNm que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad del polipéptido o ARNm en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se une al polipéptido o una sonda de oligonucleótidos que se une a ADN o ARNm que codifica el polipéptido). Los kits también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos usando el kit.
Para kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; y, opcionalmente,
(2) un segundo anticuerpo, diferente, que se une a tanto el polipéptido como al primer anticuerpo y está conjugado con una marca detectable.
Para kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido detectablemente marcado, que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención; o (3) un conjunto de marcadores que comprende oligonucleótidos que se hibridan con al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que codifican marcadores de predicción de polipéptido de la invención. El kit también puede comprender, por ejemplo, un agente de tamponamiento, un conservante o un agente estabilizante de proteínas. El kit puede comprender además componentes necesarios para detectar la marca detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). Para conjuntos de marcadores, el kit puede comprender una matriz o chip de conjunto de marcadores para su uso en detectar los marcadores de predicción. El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que pueden ensayarse y compararse con la muestra de prueba. Cada componente del kit puede estar encerrado dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un único envase, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el kit.
Monitorización de la eficacia de un agente antineoplásico
Como se trata anteriormente, los marcadores sensibles y no de predicción identificados pueden usarse como marcadores farmacodinámicos para evaluar si el tumor se ha vuelto resistente a un tratamiento en curso (por ejemplo, una terapia de inhibición del proteasoma). Si el cáncer no está respondiendo a un tratamiento, el perfil de expresión de las células tumorales cambiará: el nivel o expresión relativa de dos o más de los marcadores de predicción (por ejemplo, aquellos marcadores de predicción identificados en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3) de forma que el perfil de expresión represente un paciente no sensible.
Como se usa en el presente documento, un paciente se refiere a cualquier sujeto que recibe terapia de inhibición del proteasoma para el tratamiento de cáncer. En una realización, el sujeto será un paciente humano que recibe inhibición del proteasoma usando un único agente de inhibición del proteasoma (por ejemplo, bortezomib u otro agente relacionado). En otra realización, el sujeto es un paciente humano que recibe inhibición del proteasoma usando un agente de inhibición del proteasoma conjuntamente con otro agente (por ejemplo, un tratamiento de quimioterapia). Esta realización de la presente invención también puede incluir comparar dos o más muestras obtenidas de un paciente que recibe tratamiento contra el cáncer que incluye terapia de inhibición del proteasoma. En general, es concebible obtener una primera muestra del paciente antes de empezar la terapia y una o más muestras durante el tratamiento. En un uso tal se determina un nivel de referencia de expresión antes de la terapia, luego se monitorizan los cambios en el estado de referencia de la expresión durante el transcurso de la terapia. Alternativamente, pueden usarse dos o más muestras sucesivas obtenidas durante el tratamiento sin necesidad de una muestra de referencia previa al tratamiento. En un uso tal, la primera muestra obtenida del sujeto se usa como nivel de referencia para determinar si la expresión de un marcador particular o conjunto de marcadores está aumentando o disminuyendo.
En general, cuando se monitoriza la eficacia de un tratamiento terapéutico, se examinan dos o más muestras de un paciente. En otro aspecto, se usan tres o más muestras sucesivamente obtenidas, que incluyen al menos una muestra previa al tratamiento.
Matrices legibles por aparato electrónico
En el presente documento se describen matrices legibles por aparato electrónico que comprenden al menos dos marcadores de predicción descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, “medios legibles por aparato electrónico” se refiere a cualquier medio adecuado para guardar, conservar o contener datos o información que puede leerse y a la que puede accederse directamente por un aparato electrónico. Como se usa en el presente documento, el término “aparato electrónico” pretende incluir cualquier aparato informático o de procesamiento adecuado u otro dispositivo configurado o adaptado para guardar datos o información. Ejemplos de aparato electrónico adecuado para su uso con la presente invención incluyen aparato informático autónomo; redes, que incluyen una red de área local (LAN), una red de área amplia (WAN), internet, intranet y extranet; dispositivos electrónicos tales como asistentes digitales personales (PDA), teléfono móvil, mensáfono y similares; y sistemas de procesamiento local y distribuido. Como se usa en el presente documento, “registrado” se refiere a un proceso para guardar o codificar información en el medio legible por aparato electrónico. Aquellos expertos en la materia pueden adoptar fácilmente cualquiera de los métodos presentemente conocidos para registrar información en medios conocidos para generar fabricaciones que comprenden los marcadores descritos en el presente documento.
La matriz puede usarse para ensayar la expresión de uno o más marcadores de predicción o conjuntos de marcadores de predicción en la matriz. En una realización, la matriz puede usarse para ensayar la expresión de marcadores de predicción o conjuntos de marcadores expresión en un tejido para determinar la especificidad por tejido de marcadores en la matriz. De este modo, hasta aproximadamente 44.000 marcadores pueden ensayarse simultáneamente para la expresión. Esto permite desarrollar un perfil que muestra una batería de marcadores específicamente expresados en uno o más tejidos.
La matriz también es útil para determinar patrones de expresión diferenciales de dos o más marcadores en células normales y anormales (por ejemplo, tumor). Esto proporciona una batería de marcadores de predicción que podría servir de herramienta para facilitar la identificación de pacientes sensibles y no sensibles.
Además de tal determinación cualitativa, la invención permite la cuantificación de marcador expresión. Así, los marcadores de predicción pueden agruparse basándose en conjuntos de marcadores o indicaciones sensibles y no sensibles por el nivel de expresión en la muestra. Esto es útil, por ejemplo, en la determinación de la indicación sensible o no sensible de la muestra en virtud de puntuar los niveles de expresión según los métodos proporcionados en el presente documento.
En otra realización, la matriz puede usarse para monitorizar el transcurso de tiempo de expresión de dos o más marcadores de predicción en la matriz.
La matriz también es útil para determinar el efecto de la expresión de un marcador sobre la expresión de otros marcadores de predicción en la misma célula o en células diferentes. Esto proporciona, por ejemplo, una selección de dianas moleculares alternativas para intervención terapéutica si el régimen de inhibición del proteasoma es no sensible.
Agentes terapéuticos
Se muestra que los marcadores de la presente invención son predictivos de pacientes que son sensibles o no sensibles (sensibles o resistentes) a terapia de inhibición del proteasoma. La terapia de inhibición del proteasoma puede comprender el tratamiento de un paciente con cáncer con un agente inhibidor del proteasoma, solo o en combinación con agentes adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos.
Los ejemplos descritos en el presente documento implican el uso del inhibidor del proteasoma ácido borónico de Npirazincarbonil-L-fenilalanina-L-leucina, bortezomib ((VELCADE™); anteriormente conocido como MLN341 o PS341). El lenguaje “inhibidor del proteasoma” pretende incluir bortezomib, compuestos que son estructuralmente similares a bortezomib y/o análogos de bortezomib. El lenguaje “inhibidor del proteasoma” también puede incluir “miméticos”. “Miméticos” pretende incluir compuestos que pueden no ser estructuralmente similares a bortezomib, pero imitan la actividad terapéutica de bortezomib o compuestos estructuralmente similares in vivo. Los compuestos inhibidores del proteasoma de la presente invención son aquellos compuestos que son útiles para inhibir el crecimiento tumoral (por ejemplo, crecimiento tumoral de mieloma múltiple, otros tumores hematológicos o sólidos como se describen en detalle adicional en el presente documento) en pacientes. Inhibidor del proteasoma también pretende incluir sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos.
Inhibidores del proteasoma para su uso en la práctica de la invención incluyen ácidos borónicos peptídicos adicionales tales como los desvelados en Adams et al., patente de EE.UU. nº 5.780.454 (1998), patente de EE.UU.
nº 6.066.730 (2000), patente de EE.UU. nº 6.083.903 (2000), patente de EE.UU. nº 6.548.668 (2003) y Siman et al., documento WO 91/13904, que incluyen todos los compuestos y fórmulas desvelados en su interior. Preferentemente, un compuesto de ácido borónico para su uso en la presente invención está seleccionado del grupo que consiste en: ácido borónico de N-(4-morfolin)carbonil-.beta.-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina; ácido borónico de N
5 (8-quinolin)sulfonil-.beta.-(1-naftil)-L-alanina-L-alanina-L-leucina; ácido borónico de N-(2-pirazin)carbonil-Lfenilalanina-L-leucina y ácido borónico de N-(4-morfolin)carbonil-[O-(2-piridilmetil)]-L-tirosina-L-leucina.
Adicionalmente, inhibidores del proteasoma incluyen inhibidores del proteasoma de aldehído peptídico tales como los desvelados en Stein et al., patente de EE.UU. nº 5.693.617 (1997) y las publicaciones de patente internacional
10 WO 95/24914 publicada el 21 de septiembre de 1995 y Siman et al., documento WO 91/13904 publicado el 19 de septiembre de 1991; Iqbal et al. J. Med. Chem. 38:2276-2277 (1995), además de Bouget et al., Bioorg Med Chem 17:4881-4889 (2003), que incluyen todos los compuestos y fórmulas desvelados en su interior.
Además, los inhibidores del proteasoma incluyen lactacistina y análogos de lactacistina que se han desvelado en
15 Fentany et al., patente de EE.UU. nº 5.756.764 (1998), y la patente de EE.UU. nº 6.147.223 (2000), Schreiber et al. patente de EE.UU. nº 6.645.999 (2003), y Fenteany et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:3358, que incluyen todos los compuestos y fórmulas desvelados en su interior.
Adicionalmente, se han desvelado inhibidores del proteasoma de vinilsulfona de péptido sintético e inhibidores del
20 proteasoma de epoxicetona y son útiles en los métodos de la invención. Véase, por ejemplo, Bogyo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6629 (1997); Spaltensteinet al. Tetrahedron Lett. 37:1343 (1996); Meng L, Proc. Natl. Acad Sci 96: 10403 (1999); y Meng LH, Cancer Res 59: 2798 (1999).
Aún más, recientemente se ha mostrado que compuestos naturales que tienen actividad de inhibición del 25 proteasoma pueden usarse en los presentes métodos. Por ejemplo, se han identificado TMC-95A, un péptido cíclico
o gliotoxina, ambos metabolitos fúngicos, o compuestos de polifenoles encontrados en el té verde como inhibidores del proteasoma. Véase, por ejemplo, Koguchi Y, Antibiot (Tokyo) 53:105. (2000); Kroll M, Chem Biol 6:689 (1999); y Nam S, J. Biol Chem 276: 13322(2001).
30 Además de lo anterior, el lenguaje terapia de inhibición del proteasoma también puede incluir agentes adicionales, además de los agentes de inhibición del proteasoma, que incluyen agentes quimioterapéuticos. Un “agente quimioterapéutico” pretende incluir reactivos químicos que inhiben el crecimiento de células o tejidos proliferantes en los que no es deseable el crecimiento de tales células o tejidos. Agentes quimioterapéuticos tales como agentes antimetabólicos, por ejemplo, Ara AC, 5-FU y metotrexato, agentes antimitóticos, por ejemplo, taxano, vinblastina y
35 vincristina, agentes alquilantes, por ejemplo, melfalan, BCNU y mostaza de nitrógeno, inhibidores de la topoisomerasa II, por ejemplo, VW-26, topotecan y bleomicina, agentes de rotura de las cadenas, por ejemplo, doxorubicina y DHAD, agentes de reticulación, por ejemplo, cisplatino y CBDCA, radiación y luz ultravioleta. En una realización preferida, el agente es un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, bortezomib u otros compuestos relacionados). Son muy conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Gilman A.G., et al., The Pharmacological Basis
40 of Therapeutics, 8th Ed., Sec 12:1202-1263 (1990)), y normalmente se usan para tratar enfermedades neoplásicas. Los agentes quimioterapéuticos generalmente empleados en tratamientos de quimioterapia se enumeran a continuación en la Tabla A.
TABLA A
CLASE
TIPO DE AGENTE NOMBRE NO PROPIETARIO (OTROS NOMBRES)
Alquilante
Mostazas de Nitrógeno Mecloretamina (HN2) Ciclofosfamida Ifosfamida Melfalan (L-sarcolisin) Clorambucil
Etileniminas y Metilmelaminas
Hexametilmelamina Tiotepa
Alquil Sulfonatos
Busulfan
Alquilante
Nitrosoureas Carmustina (BCNU) Lomustina (CCNU) Semustina (metil-CCNU) Streptozocin (streptozotocin)
Alquilante
Triacenos Decarbacina (DTIC; dimetiltriacenoimidazolecarboxamida)
Alquilante
cis-diamminedicloroplatino II (CDDP)
60 5
CLASE
TIPO DE AGENTE NOMBRES NO PROPIETARIOS (OTROS NOMBRES)
Antimetabolitos
Análogos de Ácidos Fólicos Metotrexato (ametopterin)
Análogos de Pirimidina
Fluorouracil (’5-fluorouracil; 5-FU) Floxuridina (fluorode-oxyuridine; FUdR) Citarabina (citosina arabinosida)
Análogos de Purina y Inhibidores Relacionados
Mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP) Tioguanina (6-tioguanina; TG) Pentostatin (2’ -deoxicoformicin)
Productos Naturales
Alcaloides Vinca Vinblastin (VLB) Vincristina
Inhibidores Topoisomerasa
Etoposida Teniposida Camptotecin Topotecan 9-amino-campototecin CPT-11
Antibióticos
Dactinomicin (actinomicin D) Adriamicin Daunorubicin (daunomicin; rubindomyicin) Doxorubicin Bleomicin Plicamicin (mitramicin) Mitomicin (mitomycin C) TAXOL Taxotero
Encimas
L-Asparaginasa
Productos Naturales
Modificadores de Respuesta Biológica Interfon alfa Interleukin 2
Agentes Misceláneos
Complejos de Coordinación de Platino cis-diamminedicloroplatino II (CDDP) Carboplatin
Antracendiona
Mitoxantrona
Urea Sustituida
Hidroxiurea
Derivado de Metil Hidraxcina
0 ERO1 (S. cerevisiae)-like /FL=gb:AF0
Adrenocortical Suppressant
Mitotano (o,p’-DDD) Aminoglutetimida
Hormonas y Antagonistas
Adrenocorticosteroides Prednisona
Progestinas
Hidroxiprogesterona caproato Medroxiprogesterona acetato Megestrol acetato
Estrógenos
Dietilstilbestrol Etinil estradiol
Anti estrógenos
Tamoxifen
Andrógenos
Testosterona propionato Fluoximesterona
CLASE
TIPO DE AGENTE NOMBRES NO PROPIETARIOS (OTROS NOMBRES)
Anti andrógeno
Flutamida
Liberando -Gonadotropina Análogo de Hormona
Leuprolida
Los agentes probados en los presentes métodos pueden ser un único agente o una combinación de agentes. Por ejemplo, los presentes métodos pueden usarse para determinar si un único agente quimioterapéutico, tal como metotrexato, puede usarse para tratar un cáncer o si una combinación de dos o más agentes puede usarse en combinación con un inhibidor del proteasoma. Combinaciones preferidas incluirán agentes que tienen diferentes mecanismos de acción, por ejemplo, el uso de un agente antimitótico en combinación con un agente alquilante y un inhibidor del proteasoma.
Los agentes desvelados en el presente documento pueden administrarse por cualquier vía, que incluye intradérmicamente, subcutáneamente, por vía oral, intrarterialmente o intravenosamente. Preferentemente, la administración será por la vía intravenosa. Preferentemente puede proporcionarse administración parenteral en un bolo o por infusión.
La concentración de un compuesto desvelado en una mezcla farmacéuticamente aceptable variará dependiendo de varios factores, que incluyen la dosificación del compuesto que va a administrarse, las características farmacocinéticas del (de los) compuesto(s) empleado(s) y la vía de administración. Cantidades eficaces de agentes para tratar isquemia o lesión por reperfusión variarían ampliamente entre aproximadamente 10 µg y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal de un mamífero receptor. El agente puede administrarse en una dosis única o en dosis repetidas. un mamífero receptor. El agente puede administrarse en una dosis única o en dosis repetidas. Los tratamientos pueden administrarse diariamente o más frecuentemente dependiendo de varios factores, que incluyen la salud general de un paciente y la formulación y vía de administración del (de los) compuesto(s) seleccionado(s).
Moléculas de ácido nucleico aisladas, vectores y células huésped
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que se corresponden con un marcador de predicción, que incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción o una porción de un polipéptido tal. Los ácidos nucleicos aislados también incluyen moléculas de ácidos nucleicos suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que se corresponden con un marcador de predicción, que incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción, y fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, aquellos adecuados para su uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácidos nucleicos. Como se usa en el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína correspondiente a un marcador enumerado en una cualquiera de la Tabla 1, Tabla 2 y/o Tabla 3, puede aislarse y manipularse (por ejemplo, amplificarse, clonarse, sintetizarse, etc.) usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de secuencias en los registros de bases de datos descritos en el presente documento (por ejemplo, descritos en Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Además, una molécula de ácido nucleico puede comprender solo una porción de una secuencia de ácidos nucleicos, en la que la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa comprende un marcador de predicción de la invención o que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención. Tales ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, como sonda o cebador. La sonda/cebador se usa normalmente como uno o más oligonucleótidos sustancialmente purificados. El oligonucleótido normalmente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 7, preferentemente aproximadamente 15, más preferentemente aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 o más nucleótidos consecutivos.
Pueden usarse sondas basadas en la secuencia de una molécula de ácido nucleico para detectar transcritos o secuencias genómicas correspondientes a uno o más marcadores de predicción. La sonda comprende un grupo de marca unido a la misma, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. Tales sondas pueden usarse como parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan la proteína, tal como midiendo niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectar niveles de ARNm o determinar si un gen que codifica la
proteína se ha mutado o delecionado.
Además de las secuencias de nucleótidos descritas en los registros de bases de datos descritos en el presente documento, se apreciará por aquellos expertos en la materia que polimorfismos de secuencias de ADN que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Tales polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que se produce alternativamente en un locus genético dado. Además, se apreciará que también pueden existir polimorfismos de ADN que afectan los niveles de expresión de ARN que pueden afectar el nivel de expresión global de ese gen (por ejemplo, afectando la regulación
o degradación).
Como se usa en el presente documento, los términos “gen” y “gen recombinante” se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, que incluyen, por ejemplo, secuencias que se diferencian, debido a degeneración del código genético, de la secuencia de nucleótidos de ácidos nucleicos que codifica una proteína que se corresponde con un marcador de la invención, y así codifican la misma proteína.
Como se usa en el presente documento, la expresión “variante alélica” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se produce en un locus dado o para un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Tales variaciones alélicas naturales pueden normalmente producir el 1-5 % de varianza en la secuencia de nucleótidos de un gen dado. Pueden identificarse alelos alternativos por secuenciación del gen de interés en varios individuos diferentes. Esto puede llevarse a cabo fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una variedad de individuos. Todas y cada una de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional pretenden estar dentro del alcance de la invención.
Moléculas de ácidos nucleicos antisentido son moléculas que son complementarias a un ácido nucleico sentido, por ejemplo, complementarias a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario correspondiente a un marcador o complementarias a una secuencia de ARNm correspondiente a un marcador. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con (es decir, hibridarse con) un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificante entera, o a solo una porción de la misma, por ejemplo, toda o parte de la región codificante de proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido también puede ser antisentido para toda o parte de una región no codificante de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. Las regiones no codificantes (“regiones sin traducir 5' y 3'”) son las secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos.
Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 o más nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen naturalmente o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltioN6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).
En diversas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos pueden modificarse en el resto de base, resto de azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato de desoxirribosa de los ácidos nucleicos puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). Como se usa en el presente documento, los términos “ácidos nucleicos peptídicos” o “PNA” se refieren a miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, miméticos de ADN, en los que el esqueleto de fosfato de desoxirribosa está sustituido con un esqueleto de pseudopéptido y solo se retienen cuatro nucleobases naturales. Se ha mostrado que el esqueleto neutro de PNA permite la hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. Puede realizarse la síntesis de oligómeros de PNA usando protocolos de síntesis de péptidos estándar en fase sólida como se ha descrito en
Hyrup et al. (1996), arriba; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675.
Los PNAs pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, los PNA pueden usarse, por ejemplo, en el análisis de mutaciones de pares de bases individuales en un gen por, por ejemplo, pinzamiento por PCR dirigida a PNA; como enzimas de restricción artificiales cuando se usa en combinación con otras enzimas, por ejemplo, S1 nucleasas (Hyrup (1996), arriba; o como sondas o cebadores para secuencia e hibridación de ADN (Hyrup, 1996, arriba; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675).
En otro aspecto, los PNA pueden modificarse, por ejemplo, para potenciar su estabilidad o captación celular, uniendo grupos lipófilos u otros auxiliares a PNA, por formación de quimeras de PNA-ADN, o por el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse quimeras de PNA-ADN que pueden combinar las ventajosas propiedades de PNA y ADN. Tales quimeras permiten que enzimas de reconocimiento de ADN, por ejemplo, RNasa H y ADN polimerasas, interaccionen con la porción de ADN mientras que la porción de PNA proporcionaría alta afinidad de unión y especificidad. Las quimeras de PNA-ADN pueden enlazarse usando conectores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de bases, número de enlaces entre las nucleobases y orientación (Hyrup, 1996, supra). La síntesis de quimeras de PNA-ADN puede realizarse como se describe en Hyrup (1996), arriba, y Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63. Por ejemplo, puede sintetizarse una cadena de ADN sobre un soporte sólido usando química de acoplamiento de fosforamidito estándar y análogos de nucleósidos modificados. Pueden usarse compuestos tales como fosforamidito de 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidina como enlace entre el PNA y el extremo 5' de ADN (Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). Entonces, los monómeros de PNA se acoplan de una manera escalonada para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA en 5' y un segmento de ADN en 3' (Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). Alternativamente, pueden sintetizarse moléculas quiméricas con un segmento de ADN en 5' y un segmento de PNA en 3' (Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:111911124).
En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como péptidos (por ejemplo, para dirigirse a receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; publicación PCT nº WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicación PCT nº WO 89/10134). Además, pueden modificarse oligonucleótidos con agentes de escisión desencadenada por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenada por la hibridación, agente de transporte, agente de escisión desencadenada por la hibridación, etc.
Ácidos nucleicos de baliza molecular que tienen al menos una región que es complementaria a un marcador son útiles para cuantificar la presencia del marcador de predicción en una muestra. Un ácido nucleico de “baliza molecular” es un ácido nucleico que comprende un par de regiones complementarias y que tiene un fluoróforo y un extintor fluorescente asociados a él. El fluoróforo y el extintor están asociados con diferentes porciones del ácido nucleico en una orientación tal que cuando las regiones complementarias se hibridan ente sí, la fluorescencia del fluoróforo se inactiva por el extintor. Cuando las regiones complementarias del ácido nucleico no se hibridan ente sí, la fluorescencia del fluoróforo se inactiva a un menor grado. Ácidos nucleicos de baliza molecular se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.876.930.
Pueden usarse vectores, preferentemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción para la producción de ácido nucleico y proteínas correspondientes a marcadores de predicción; además de para la producción de composiciones referentes a los marcadores de predicción. Vectores útiles comprenden además secuencias promotoras y/o reguladoras para la eficaz expresión del ácido nucleico y/o proteína correspondiente al marcador de predicción de interés. En ciertos casos, los promotores pueden incluir secuencias promotoras constitutivas/reguladoras, secuencias promotoras inducibles/reguladoras, secuencias promotoras específicas de tejido/reguladoras, o las secuencias promotoras/reguladoras endógenas naturales correspondientes al marcador de predicción de interés, según se requiera. Diversos vectores de expresión son muy conocidos en la técnica y pueden adaptarse para adecuar el sistema particular para la expresión. Por ejemplo, pueden diseñarse vectores de expresión recombinantes para la expresión de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células de insecto {usando vectores de expresión de baculovirus}, células de levadura o células de mamífero). Células huésped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel, arriba. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.
Como se usa en el presente documento, el término “secuencia promotora/reguladora” significa una secuencia de ácidos nucleicos que se requiere para la expresión de un producto génico operativamente ligado a una secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. Una secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que
expresa el producto génico en una manera específica de tejido.
Un promotor “constitutivo” es una secuencia de nucleótidos que, cuando se liga operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula humana viva bajo la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la célula.
Un promotor “inducible” es una secuencia de nucleótidos que, cuando se liga operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente solo cuando un inductor que se corresponde con un promotor está presente en la célula.
Un promotor “específico de tejido” es una secuencia de nucleótidos que, cuando se liga operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente a un promotor.
Células huésped en las que un vector de expresión recombinante se ha introducido se describen en el presente documento. Los términos “célula huésped” y “célula huésped recombinante” se usan indistintamente en el presente documento. Se entiende que tales términos se refieren no solo a la célula sujeto particular, sino a la progenie o posible progenie de una célula tal. Debido a que ciertas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a tanto mutación como influencias ambientales, tal progenie puede, en realidad, no ser idéntica a la célula parental, pero está todavía incluida dentro del alcance del término como se usa en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, E. coli) o eucariota (por ejemplo, células de insecto, levadura o células de mamífero).
Puede introducirse ADN de vector en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usa en el presente documento, los términos “transformación” y “transfección” pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño en una célula huésped, que incluye co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook, et al. (arriba), y otros manuales de laboratorio.
Una célula huésped, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir un polipéptido correspondiente a un marcador. Por consiguiente, métodos para producir un polipéptido correspondiente a un marcador usando las células huésped se describen en el presente documento. En una realización, el método comprende cultivar la célula huésped (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido) en un medio adecuado de forma que se produzca el marcador. En otra realización, el método comprende además aislar el polipéptido marcador del medio o la célula huésped.
Proteínas aisladas y anticuerpos
En el presente documento se describen proteínas aisladas que se corresponden con marcadores de predicción, y porciones biológicamente activas de las mismas, además de fragmentos de polipéptidos adecuados para su uso como inmunógenos para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción. Los polipéptidos pueden aislarse, purificarse o producirse usando la información de identificación de genes proporcionada en el presente documento en combinación con técnicas rutinarias de biología molecular, purificación de proteínas y de ADN recombinante muy conocidas en la técnica.
Porciones biológicamente activas de un polipéptido correspondiente a un marcador incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente al marcador de predicción, que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa, y presentan al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Normalmente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína correspondiente. Una porción biológicamente activa de una proteína de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Además, pueden prepararse otras porciones biológicamente activas, en las que se delecionan otras regiones de la proteína, por técnicas recombinantes, y evaluarse para una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de un polipéptido de la invención.
Polipéptidos preferidos tienen la secuencia de aminoácidos enumerada en uno de los registros de las bases de datos GenBank y NUC descritos en el presente documento. Otras proteínas útiles son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, preferentemente el 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 99 %) a una de estas secuencias y retienen la actividad funcional de la proteína de la proteína que se produce naturalmente correspondiente, aunque se diferencian en la secuencia de aminoácidos debido a variación alélica natural o mutagénesis.
La determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático que determina el número de posiciones idénticas compartidas entre dos secuencias. La determinación puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la materia para la comparación de identidad y similitud.
Ejemplos de métodos usados pueden incluir, por ejemplo, un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo tal se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos en BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas en BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar un búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Si se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17. Un algoritmo tal se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Si se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de similitud de secuencias local y alineamiento es el algoritmo FASTA como se describe en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. Si se usa el algoritmo FASTA para comparar secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, una tabla de residuos de peso PAM120 puede usarse, por ejemplo, con un valor k-tuple de 2. La identidad en porcentaje entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. En el cálculo de la identidad en porcentaje solo se cuentan coincidencias exactas.
Proteínas quiméricas o de fusión correspondientes a un marcador se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” comprende todo o parte (preferentemente una parte biológicamente activa) de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención operativamente ligado a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto del polipéptido correspondiente al marcador). Dentro de la proteína de fusión, está previsto que el término “operativamente ligado” indique que el polipéptido de la invención y el polipéptido heterólogo están fusionados en marco entre sí. El polipéptido heterólogo puede fusionarse con el extremo amino o el extremo carboxilo del polipéptido de la invención. Proteínas de fusión útiles pueden incluir GST, c-myc, FLAG, HA, y cualquier otra marca heteróloga muy conocida para su uso en la producción de proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de un polipéptido recombinante de la invención.
Además, las proteínas de fusión pueden incluir una secuencia señal de otra proteína tal como gp67, melitina, fosfatasa alcalina placentaria humana y phoA. En otro aspecto más, la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina en la que todo o parte de un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción de la invención está fusionado con secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. La proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la invención en un sujeto, para purificar ligandos y en ensayos de cribado para identificar moléculas que inhiben la interacción de receptores con ligandos.
Puede usarse un polipéptido aislado correspondiente a un marcador de predicción, o un fragmento del mismo, como inmunogén para generar anticuerpos usando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Por ejemplo, un inmunogén normalmente se usa para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado (es decir, inmunocompetente) tal como un conejo, cabra, ratón, u otro mamífero o vertebrado. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, polipéptido recombinantemente expresado o químicamente sintetizado. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulante similar.
Por consiguiente, anticuerpos dirigidos contra un polipéptido se citan en el presente documento. Los términos “anticuerpo” y “sustancia de anticuerpo”, como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se unen específicamente a un antígeno, tal como un polipéptido de la invención, por ejemplo, un epítope de un polipéptido de la invención. Una molécula que se une específicamente a un polipéptido dado es una molécula que se une al polipéptido, pero no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que naturalmente contiene el polipéptido. Ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. Anticuerpos policlonales y monoclonales se citan en el presente documento.
Los anticuerpos policlonales pueden prepararse como se ha descrito anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un polipéptido de la invención como inmunogén. Composiciones de anticuerpo policlonal preferidas son aquellas que se han seleccionado para anticuerpos dirigidos contra un marcador de predicción o marcadores. El título de anticuerpos en el sujeto inmunizado puede monitorizarse con el tiempo por técnicas convencionales, tales como con
un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) usando polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo pueden recogerse o aislarse del sujeto (por ejemplo, de la sangre o suero del sujeto) y purificarse adicionalmente por técnicas muy conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción de IgG.
Alternativamente, pueden seleccionarse anticuerpos específicos para una proteína o polipéptido o (por ejemplo, purificarse parcialmente) o purificarse por, por ejemplo, cromatografía de afinidad para obtener anticuerpo sustancialmente purificado y purificado. Por una composición de anticuerpo sustancialmente purificado se indica, en este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene como máximo solo el 30 % (por peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopes distintos de aquellos de la proteína deseada o polipéptido de la invención, y preferentemente como máximo el 20 %, aún más preferentemente como máximo 10 %, y lo más preferentemente como máximo el 5 % (por peso seco) de la muestra es anticuerpos contaminantes. Una composición de anticuerpo purificado significa que al menos el 99 % de los anticuerpos en la composición están dirigidos contra la proteína deseada o polipéptido de la invención.
Adicionalmente, pueden prepararse anticuerpos monoclonales dirigidos a los marcadores de predicción. Los métodos para la generación de anticuerpos monoclonales son muy conocidos en la técnica y pueden producirse usando cualquier método. Por ejemplo, en un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos del anticuerpo específico son los mayores, pueden obtenerse células productoras de anticuerpo del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas convencionales, tales como la técnica de hibridomas originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos (véase Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), la técnica de hibridomas de EBV (véase Cole et al., pp. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) o técnicas de triomas. La tecnología para producir hibridomas es muy conocida (véase generalmente Current Protocolos in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan cribando los sobrenadantes de cultivo de hibridomas para anticuerpos que se unen al polipéptido de interés, por ejemplo, usando un ensayo de ELISA estándar.
Adicionalmente, pueden prepararse anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies de animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Cabilly et al., patente de EE.EE.UU. nº 4.816.567; y Boss et al., patente de EE.EE.UU. nº 4.816.397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las especies no humanas y una región estructural de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Queen, patente de EE.UU. nº 5.585.089, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en la publicación PCT nº WO 87/02671; solicitud de patente europea 184.187; solicitud de patente europea 171.496; solicitud de patente europea 173.494; publicación PCT nº WO 86/01533; patente de EE.EE.UU. nº 4.816.567; solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; patente de EE.UU. 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos humanos pueden producirse, por ejemplo, usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de las cadenas pesadas y ligeras humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan en el modo normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse usando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de linfocitos B, y posteriormente se someten a cambio de clase y mutación somática. Así, usando una técnica tal, es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos véase Lonberg y Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.625.126; la patente de EE.UU. 5.633.425; la patente de EE.UU. 5.569.825; la patente de EE.UU. 5.661.016; y la patente de EE.UU. 5.545.806. Además, empresas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), pueden comprometerse a proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.
Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado usando una técnica denominada “selección guiada”. En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo murino, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que
reconoce el mismo epítope (Jespers et al., 1994, Bio/Technology 12:899-903).
Puede usarse un anticuerpo dirigido contra un polipéptido correspondiente a un marcador de predicción (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) para detectar el marcador de predicción (por ejemplo, en una muestra celular) con el fin de evaluar el nivel y patrón de expresión del marcador de predicción. Los anticuerpos también pueden usarse diagnósticamente para monitorizar niveles de proteína en tejidos o líquidos corporales (por ejemplo, en una muestra tumoral) como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
Además, un anticuerpo (o fragmento del mismo) puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antiguamente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos son muy conocidos, véase, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como se describe por Segal en la patente de EE.EE.UU. nº 4.676.980.
Por consiguiente, en el presente documento se citan anticuerpos sustancialmente purificados o fragmentos de los mismos, y anticuerpos no humanos o fragmentos de los mismos, anticuerpos o fragmentos que se unen específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un marcador de predicción identificado en el presente documento. En diversas realizaciones, los anticuerpos sustancialmente purificados, o fragmentos de los mismos, pueden ser anticuerpos humanos, no humanos quiméricos y/o humanizados.
En el presente documentose citan anticuerpos no humanos o fragmentos de los mismos, anticuerpos o fragmentos que se unen específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una molécula de ácido nucleico de un marcador de predicción. Tales anticuerpos no humanos pueden ser anticuerpos de cabra, ratón, oveja, caballo, pollo, conejo o rata. Alternativamente, los anticuerpos no humanos pueden ser anticuerpos quiméricos y/o humanizados. Además, los anticuerpos no humanos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
En el presente documento se describen anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, anticuerpos o fragmentos que se unen específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la presente invención, una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de la presente invención, un fragmento de al menos 15 residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la presente invención, una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la presente invención (en la que la identidad en porcentaje se determina usando el programa ALIGN del paquete de software GCG con una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4) y una secuencia de
aminoácidos que está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que consiste en las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación de 6X SSC a 45 ºC y lavado en 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 65 ºC. Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos y/o no humanos.
Los anticuerpos sustancialmente purificados o fragmentos de los mismos pueden unirse específicamente a un péptido señal, una secuencia secretada, un dominio extracelular, un dominio transmembranario o citoplásmico o membrana citoplásmica de un polipéptido de la invención. En una realización particularmente preferida, los anticuerpos sustancialmente purificados o fragmentos de los mismos, los anticuerpos no humanos o fragmentos de los mismos, y/o los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, de la invención se unen específicamente a una secuencia secretada o un dominio extracelular de las secuencias de aminoácidos.
Ensayos de cribado
En el presente documento se describen métodos (también denominados en el presente documento “ensayos de cribado”) para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) que (a) se unen al marcador, o (b) tienen un efecto modulador (por ejemplo, estimulante o inhibidor) sobre la actividad del marcador o, más específicamente, (c) tienen un efecto modulador sobre las interacciones del marcador con uno o más de sus sustratos naturales (por ejemplo, péptido, proteína, hormona, co-factor o ácido nucleico), o (d) tienen un efecto modulador sobre la expresión del marcador. Tales ensayos normalmente comprenden una reacción entre el marcador y uno o más componentes del ensayo. Los otros componentes pueden ser tanto el propio compuesto de prueba como una combinación de compuesto de prueba y un componente de unión natural del marcador.
Pueden obtenerse compuestos de prueba a partir de cualquier fuente disponible, que incluye bibliotecas sistemáticas de compuestos naturales y/o sintéticos. Los compuestos de prueba también pueden obtenerse por cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un esqueleto de no péptido novedoso que son resistentes a la degradación enzimática, pero que sin embargo siguen siendo bioactivas; véase, por ejemplo, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas en fase sólida o en fase de disolución paralelas espacialmente direccionables; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren la deconvolución; el método de bibliotecas de 'una perla un compuesto'; y métodos de bibliotecas sintéticas usando selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de biblioteca biológica y de biblioteca de peptoides están limitados a bibliotecas de péptidos, mientras que los otro cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de péptido, oligómero no peptídico o de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la materia, por ejemplo, en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Pueden presentarse bibliotecas de compuestos en disolución (por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412421) o sobre perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias y/o esporas (Ladner, USP 5,223,409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o sobre fago (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, arriba).
Se describen ensayos en el presente documento para cribar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de un marcador o porción biológicamente activa del mismo. Además, se describen ensayos en el presente documento para cribar compuestos candidatos o de prueba que se unen a un marcador o porción biológicamente activa del mismo. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para unirse directamente a un marcador puede llevarse a cabo, por ejemplo, acoplando el compuesto con un radioisótopo o marca enzimática tal que la unión del compuesto al marcador pueda determinarse detectando el compuesto de marcador marcado en un complejo. Por ejemplo, pueden marcarse compuestos (por ejemplo, sustratos de marcador) con 125I, 35S, 14C, o 3H, tanto directa como indirectamente, y detectarse el radioisótopo por recuento directo de radioemisión o por recuento de centelleo. Alternativamente, pueden marcarse enzimáticamente componentes de ensayo con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y detectarse la marca enzimática por determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.
En el presente documento se describen ensayos para cribar compuestos candidatos o de prueba que modulan la actividad de un marcador o una porción biológicamente activa del mismo. Con toda probabilidad, el marcador puede interaccionar, in vivo, con una o más moléculas, tales como, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, hormonas, cofactores y ácidos nucleicos. Para los fines de esta discusión, tales moléculas celulares y extracelulares se denominan en el presente documento “componentes de unión” o “sustrato” de marcador. Con el fin de facilitar tal
cribado, el marcador se usa para identificar sus componentes de unión in vivo naturales. Muchos de los componentes de unión o sustratos conocidos de los marcadores de predicción identificados son tanto conocidos en la técnica como pueden identificarse usando metodologías estándar conocidas en la técnica (por ejemplo, cribado de dos híbridos, etc.).
Pueden idearse ensayos con el fin de identificar compuestos que modulan (por ejemplo, afectan tanto positiva como negativamente) interacciones entre un marcador y sus sustratos y/o componentes de unión. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas tales como anticuerpos, péptidos, hormonas, oligonucleótidos, ácidos nucleicos y análogos de los mismos. Tales compuestos también pueden obtenerse de cualquier fuente disponible, que incluye bibliotecas sistemáticas de compuestos naturales y/o sintéticos. Los componentes de ensayo preferidos para su uso es un marcador de predicción identificado en el presente documento, el componente de unión conocido y/o sustrato del mismo, y el compuesto de prueba. Pueden suministrarse compuestos de prueba de cualquier fuente.
El principio básico de los sistemas de ensayo usados para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre el marcador y su componente de unión implica preparar una mezcla de reacción que contiene el marcador y su componente de unión en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos productos interaccionen y se unan, formando así un complejo. Con el fin de probar un agente para actividad inhibidora, la mezcla de reacción se prepara en presencia y ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción, o puede añadirse en un momento posterior a la adición del marcador y su componente de unión. Las mezclas de reacción de control se incuban sin el compuesto de prueba o con un placebo. Entonces se detecta la formación de cualquier complejo entre el marcador y su componente de unión. La formación de un complejo en la reacción de control, pero menos formación o no tal formación en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción del marcador y su componente de unión. En cambio, la formación de más complejo en presencia de compuesto que en la reacción de control indica que el compuesto puede potenciar la interacción del marcador y su componente de unión.
El ensayo para compuestos que interfieren con la interacción del marcador con su componente de unión puede realizarse en un formato heterogéneo u homogéneo. Ensayos heterogéneos implican anclar tanto el marcador como su componente de unión sobre una fase sólida y detectar complejos anclados a la fase sólida al final de la reacción. En ensayos homogéneos, la reacción entera se lleva a cabo en una fase líquida. En cualquier enfoque, el orden de adición de reactantes puede variarse para obtener información diferente sobre los compuestos que se prueban. Por ejemplo, pueden identificarse compuestos de prueba que interfieren con la interacción entre los marcadores y los componentes de unión (por ejemplo, por competición) realizando la reacción en presencia de la sustancia de prueba, es decir, añadiendo la sustancia de prueba a la mezcla de reacción antes de o simultáneamente con el marcador y su componente de unión interactivo. Alternativamente, los compuestos de prueba que rompen complejos previamente formados, por ejemplo, compuestos con mayores constantes de unión que desplazan uno de los componentes del complejo, pueden probarse añadiendo el compuesto de prueba a la mezcla de reacción después de haberse formado los complejos. Los diversos formatos se describen brevemente más adelante.
En un sistema de ensayo heterogéneo, tanto el marcador como su componente de unión está anclado sobre una superficie sólida o matriz, mientras que el otro componente no anclado correspondiente puede marcarse, tanto directa como indirectamente. En la práctica, frecuentemente se utilizan placas de microtitulación para este enfoque. Las especies ancladas pueden inmovilizarse por varios métodos, tanto no covalentes como covalentes, que normalmente son muy conocidos para uno que practica la materia. Frecuentemente puede llevarse a cabo unión no covalente simplemente recubriendo la superficie sólida con una disolución del marcador o su componente de unión y secando. Alternativamente, para este fin puede usarse un anticuerpo específico inmovilizado para el componente de ensayo que va anclarse. Tales superficies pueden frecuentemente prepararse por adelantado y guardarse.
En realizaciones relacionadas, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que uno o ambos de los componentes del ensayo se anclen a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/marcador o glutatión-S-transferasa/componente de unión sobre perlas de glutatión-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y tanto el marcador no adsorbido como su componente de unión, y la mezcla se incuba en condiciones que contribuyen a la formación de complejos (por ejemplo, condiciones fisiológicas). Tras la incubación, las perlas o los pocillos de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente del ensayo sin unir, evaluándose el complejo inmovilizado tanto directa como indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y determinarse el nivel de marcador que se une o la actividad usando técnicas convencionales.
También pueden usarse otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los ensayos de cribado. Por ejemplo, pueden inmovilizarse tanto un marcador como un componente de unión de marcador utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Pueden prepararse proteína de marcador biotinilada o moléculas diana a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemicals). En ciertas realizaciones, las superficies inmovilizadas con proteína pueden prepararse por adelantado y guardarse.
Con el fin de realizar el ensayo, el componente correspondiente del componente de ensayo inmovilizado se expone a la superficie recubierta con o sin el compuesto de prueba. Después de completarse la reacción, los componentes de ensayo sin reaccionarse se eliminan (por ejemplo, lavando) y cualquier complejo formado seguirá inmovilizado sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede llevarse a cabo de varias formas. Si el componente no inmovilizado se marca previamente, la detección de marca inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron complejos. Si el componente no inmovilizado no se marca previamente, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para las especies inicialmente no inmovilizadas (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de componentes de reacción, pueden detectarse compuestos de prueba que modulan (inhiben o potencian) la formación de complejos o que rompen complejos previamente formados.
Puede usarse un ensayo homogéneo. Éste es normalmente una reacción, análoga a aquellas mencionadas anteriormente, que se realiza en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de prueba. Entonces, los complejos formados se separan de los componentes sin reaccionar, y la cantidad de complejo formado se determina. Como se ha mencionado para los sistemas de ensayo heterogéneo, el orden de adición de los reactantes a la fase líquida puede dar información sobre qué compuestos de prueba modulan (inhiben o potencian) la formación de complejos y cuáles rompen complejos previamente formados.
En un ensayo homogéneo tal, los productos de reacción pueden separarse de componentes de ensayo sin reaccionar por cualquiera de varias técnicas convencionales, que incluyen, pero no se limitan a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, los complejos de moléculas pueden separarse de las moléculas sin complejar mediante una serie de etapas de centrifugación, debido a los diferentes equilibrios de sedimentación de los complejos basándose en sus diferentes tamaños y densidades (véase, por ejemplo, Rivas, G., y Minton, A.P., Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7). También pueden utilizarse técnicas cromatográficas estándar para separar moléculas complejadas de sin complejar. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel separa moléculas basándose en el tamaño, y mediante la utilización de una resina de filtración en gel apropiada en un formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente mayor puede separarse de los componentes sin complejar relativamente más pequeños. Similarmente, las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo en comparación con las moléculas sin complejar pueden explotarse para separar diferencialmente el complejo de los restantes reactantes individuales, por ejemplo, mediante el uso de resinas de cromatografía de intercambio iónico. Tales resinas y técnicas cromatográficas son muy conocidas para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Heegaard, 1998, J Mol. Recognit. 11:141-148; Hage y Tweed, 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699:499-525). También puede emplearse electroforesis en gel para separar moléculas complejadas de especies sin unir (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), en: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999). En esta técnica, los complejos de proteína o ácido nucleico se separan basándose, por ejemplo, en el tamaño o carga. Con el fin de mantener la interacción de unión durante el proceso electroforético, normalmente se prefieren geles no desnaturalizantes en ausencia de agente reductor, pero condiciones apropiadas para los interactuantes particulares serán muy conocidas para un experto en la materia. La inmunoprecipitación es otra técnica común utilizada para el aislamiento de un complejo de proteína-proteína de disolución (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), en: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999). En esta técnica, todas las proteínas que se unen a un anticuerpo específico para una de las moléculas de unión se precipitan de la disolución conjugando el anticuerpo con una perla de polímero que puede recogerse fácilmente por centrifugación. Los componentes del ensayo de unión son liberados de las perlas (mediante un evento de proteólisis específica u otra técnica muy conocida en la técnica que no interrumpirá la interacción proteína-proteína en el complejo), y se realiza una segunda etapa de inmunoprecipitación, esta vez utilizando anticuerpos específicos para el componente de ensayo que interacciona correspondientemente diferente. De este modo, solo los complejos formados deben seguir unidos a las perlas. Pueden compararse variaciones en la formación de complejos en tanto la presencia como la ausencia de un compuesto de prueba, ofreciendo así información sobre la capacidad del compuesto para modular las interacciones entre el marcador y su componente de unión.
En el presente documento se describen métodos para la detección directa de interacciones entre el marcador y su componente de unión natural y/o un compuesto de prueba en un sistema de ensayo homogéneo o heterogéneo sin manipulación de muestras adicional. Por ejemplo, puede utilizarse la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE.UU. nº 5.631.169; Stavrianopoulos et al., patente de EE.EE.UU. nº 4.868.103). Generalmente, esta técnica implica la adición de una marca de fluoróforo sobre una primera molécula 'donante' (por ejemplo, marcador o compuesto de prueba) de forma que su energía fluorescente emitida será absorbida por una marca fluorescente sobre una segunda molécula 'aceptora' (por ejemplo, marcador o compuesto de prueba), que a su vez puede fluorescer debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína 'donante' puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de residuos de triptófano. Se eligen marcas que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de forma que la marca de la molécula 'aceptora' pueda diferenciarse de la del 'donante'. Como la eficiencia de transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, pueden evaluarse relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la que la unión se produce entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de la molécula
'aceptora' en el ensayo debe ser máxima. Un evento de unión FET puede medirse convenientemente mediante medios de detección fluorométrica estándar muy conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro). Una sustancia de prueba que tanto potencia como evita la participación de una de las especies en el complejo previamente formado producirá la generación de una variante de señal con respecto al fondo. De esta forma, pueden
5 identificarse sustancias de prueba que modulan interacciones entre un marcador y su componente de unión en ensayos controlados.
Se identifican moduladores de la expresión del marcador en un método en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión de ARNm o proteína, correspondiente a un marcador en la 10 célula. El nivel de expresión de ARNm o proteína en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de ARNm o proteína en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato pueden entonces identificarse como un modulador de la expresión del marcador basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o proteína de marcador es mayor (estadísticamente significativamente mayor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulante
15 de la expresión de ARNm o de proteína de marcador. En cambio, cuando la expresión del ARNm o proteína de marcador es menos (estadísticamente significativamente menos) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de ARNm o de proteína de marcador. El nivel de expresión de ARNm o de proteína de marcador en las células puede determinarse por métodos descritos en el presente documento para detectar ARNm o proteína de marcador.
20 Todavía más, en ensayos basados en células, en los que una célula que expresa un marcador de predicción de interés se usa para cribar agentes candidatos a terapéuticos, la actividad o viabilidad de la célula se monitoriza para determinar la capacidad del compuesto de prueba para alterar la actividad del marcador de predicción o marcadores. Tales ensayos se realizan conjuntamente con un ensayo de control que utiliza líneas celulares similares o idénticas
25 que no expresan el marcador de predicción o marcadores de interés, con el fin de determinar la especificidad de la acción del compuesto de prueba.
Pueden usarse dos o más de los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede identificarse un agente modulador usando un ensayo basado en células o libre de células, y la capacidad del agente para modular la 30 actividad de una proteína de marcador puede confirmarse adicionalmente in vivo, por ejemplo, en un modelo animal completo para la transformación celular y/o tumorigénesis.
Puede usarse un agente identificado como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador de marcador, una molécula de ácido nucleico de marcador antisentido, un anticuerpo específico de
35 marcador, o un componente de unión de marcador) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con un agente tal. Alternativamente, un agente identificado como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de un agente tal.
40 EJEMPLOS ESPECÍFICOS
Dosificación y administración de tratamiento
Suministro y almacenamiento de fármaco
45 Se suministró bortezomib para inyección (VELCADE™ Millennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA), un polvo liofilizado estéril para reconstitución, en viales que contenían 2,5 mg de bortezomib y 25 mg de manitol USP. Cada vial se reconstituyó con 2,5 ml de solución salina normal (0,9 %), inyección de cloruro sódico USP, de forma que la disolución reconstituida contuvo bortezomib a una concentración de 1 mg/ml. La disolución reconstituida fue clara e
50 incolora con un pH final entre 5 y 6. Los viales que contenían bortezomib liofilizado para inyección se almacenaron refrigerados a 2 a 8 ºC.
TABLA B Información del fármaco
Nombre Químico
Ácido N-Piracinacarbonil-L-fenilalanina-L-leucinoboronico
Nombre Investigación
MLN341 o PS-341
Nombre Genérico
bortezomib
Nombre Propietario
VELCADE™
CAS Numero Registro
179324-69-7
Numero Patente U.S.
5,780,454
Clasificación
Inhibidor Proteasoma
Fórmula Molecular
C19H25BN4O4
Peso Molecular
384.25
Estructura
Derivado de acido borónico de un dipéptido de leucina fenilalanina
Un estudio de fase II de etiqueta abierta de bortezomib en pacientes con mieloma que han recaído tras la terapia de primera línea y son resistentes al tratamiento a su terapia más reciente
Datos farmacodinámicos/farmacogenómicos/farmacocinéticos recogidos
Se realizó un ensayo de fase 2 multicéntrico, de etiqueta abierta y no aleatorizado en el que se enrolaron pacientes con mieloma recidivante que fue resistente a la terapia. Los pacientes se trataron con 1,3 mg de bortezomib por metro cuadrado de área superficial del cuerpo, dos veces a la semana durante dos semanas, seguido de una semana sin tratamiento, durante hasta ocho ciclos (24 semanas).
Se realizaron las siguientes evaluaciones para evaluar la farmacodinámica y farmacogenómica de bortezomib:
Ensayo de inhibición del proteasoma (se recogió sangre para este ensayo ex vivo antes y una hora después de la dosificación en el día 1 y día 11 de los ciclos 1, 7, y, si es aplicable, el ciclo en el que se inició la dexametasona y una hora después de la dosificación en el día 11 del ciclo 8). Algunos pacientes tuvieron una extracción de muestra adicional para el ensayo de inhibición del proteasoma 24 horas después de la dosificación en el día 1, ciclo 1.
Datos farmacogenómicos (muestras de sangre y de médula ósea para la evaluación de la expresión de niveles de ARNm global; estos procedimientos se realizaron solo en pacientes que consintieron participar mediante un formulario de consentimiento separado).
Farmacocinética de la población (se recogió sangre para la determinación de la farmacocinética de la población de todos los pacientes antes y una a seis horas después de la administración del fármaco del estudio en el día 1, ciclo 1, y antes y una a seis horas después de la administración del fármaco del estudio en el día 11 de los ciclos 1, 2, 7 y 8 y, si es aplicable, el ciclo en el que se inició la dexametasona). Se recogieron muestras de sangre previas a la dosis al mismo tiempo que aquellas para las evaluaciones de laboratorio clínicas.
Farmacocinética individual: Se recogió sangre para la determinación de niveles de bortezomib en plasma inmediatamente antes y 2, 5, 10, 15, 30, 60 y 120 minutos y 24 horas después de la administración de bortezomib en el día 1, ciclo 1.
Procedimientos estadísticos
El análisis estadístico se basó en la necesidad de estimar tasas de respuesta dentro de límites especificados de exactitud con el fin de determinar si cualquiera de los dos niveles de dosis 1,0 ó 1,3 mg/m2/dosis solo o en combinación con dexametasona eran suficientemente eficaces para garantizar estudio clínico adicional. Este estudio fue de naturaleza no comparativa; por tanto, no se realizaron las comparaciones de eficacia entre las dos dosis de bortezomib. Además, este estudio proporcionó datos de seguridad que ayudaron a caracterizar la posible toxicidad del tratamiento a los dos niveles de dosis evaluados durante hasta ocho ciclos de terapia.
Se presentaron tabulaciones resumen que mostraron el número de observaciones, media, desviación estándar, mediana, mínimo y máximo para variables continuas, y el número y porcentaje por categoría para datos categóricos. Las categorías para resumen fueron los dos grupos de dosis asignada.
Se desarrolló un plan de análisis estadístico formal y se finalizó antes del bloqueo de la base de datos. Se realizaron análisis de eficacia primaria en la población por intención de tratar (ITT). Los análisis de eficacia primaria se realizaron basándose en las tasas de respondedores, en las que un respondedor se definió como un CR, PR o MR usando los criterios prospectivamente establecidos en la Tabla C. Se establecieron límites de confianza del 90 %
5 bilaterales basándose en proporciones de respondedores en cada grupo de dosis, correspondientes a un límite inferior unilateral del 95 %.
Tabla C Criterios de respuesta a la enfermedad1
Respuesta
Criterio para respuesta
Respuesta completa (CR)2
Requiere todo lo que sigue: Desaparición de la proteína monoclonal original de la sangre y la orina en al menos dos determinaciones para un mínimo de seis semanas por estudios inmunofijados. <5% de células de plasma en la médula ósea en al menos dos determinaciones por un mínimo de seis semanas. No hay un aumento en el tamaño o número de lesiones óseas líticas (el desarrollo de una fractura por compresión no excluye respuesta). Desaparición de plasmocitomas en tejidos blandos durante al menos seis semanas.
Respuesta parcial (PR)3
PR incluye pacientes en los que algunos, pero no todos, los criterios para el CR se cumplen proporcionando en los criterios restantes se cumplan los requisitos para PR. Requiere todos de los siguientes: Reducción de ≥50% en el nivel de proteína monoclonal en suero durante al menos dos determinaciones de entre seis semanas. Si está presente, la reducción de 24 horas la excreción urinaria de cadena ligera por cualquiera de ≥90% o <200 mg durante al menos dos determinaciones de entre seis semanas. Reducción ≥ 50% en el tamaño de plasmacitomas de tejidos blandos (por examen clínico o radiográfico) durante al menos seis semanas. No hay un aumento en el tamaño o número de lesiones óseas líticas (desarrollo de fractura por compresión no excluye la respuesta).
Respuesta mínima (MR)
MR incluye pacientes en los que algunos, pero no todos, los criterios para la PR se cumplen proporcionando que los criterios restantes cumplan los requisitos para MR. Requiere todo lo siguiente: Reducción del ≥25% al ≤49% en el nivel de proteína monoclonal en suero durante al menos dos determinaciones de entre seis semanas. Si está presente, una reducción del 50 al 89% de la excreción de la cadena ligera en 24 horas, que todavía supera los 200 mg / 24 h, durante al menos dos determinaciones de entre seis semanas. Para los pacientes con solamente mieloma no secretor, una reducción del 25 al 49% en las células plasmáticas en la médula ósea durante un mínimo de seis semanas. Reducción de 25-49% en el tamaño de plasmacitomas (por examen clínico o radiográfico) durante al menos seis semanas. No hay un aumento en el tamaño o número de lesiones óseas líticas (el desarrollo de fractura por compresión no excluye la respuesta).
Sin cambio (NC)
No coincidir con el criterio de MR o PD.
Respuesta
Criterio para respuesta
Enfermedad Progresiva (PD) (para pacientes que no estén en CR)
Requiere uno o más de los siguientes: > 25% de aumento en el nivel de paraproteína monoclonal en suero, que también debe ser un aumento absoluto de al menos 5 g / L y confirmado en una investigación de repetición. > 25% de aumento en 24 horas la excreción urinaria de cadena ligera, que también debe ser un aumento absoluto de al menos 200 mg / 24 h y confirmado en una investigación de repetición. > 25% de aumento en las células plasmáticas en un aspirado de médula ósea o en la biopsia trépano, que también debe ser un aumento absoluto de al menos 10%.
Aumento definitivo en el tamaño de las lesiones óseas líticas existentes o plasmacitomas de tejidos blandos. Desarrollo de lesiones óseas nuevas o plasmocitomas tejidos blandos (sin incluir fractura por compresión). Desarrollo de la hipercalcemia (calcio sérico corregido> 11,5 mg / dL o 2,8 mmol / L no atribuible a otras causas).
Recaída de CR
Requiere al menos uno de los siguientes: Reaparición de suero o paraproteína urinaria en inmunofijación o rutina electroforesis confirmada por al menos un seguimiento y excluyendo la reconstitución inmune oligoclonales. ≥5% de células plasmáticas en el aspirado de médula ósea o biopsia. El desarrollo de nuevas lesiones óseas líticas o plasmacitomas de tejidos blandos o aumento definitivo en el tamaño de las lesiones óseas residuales (no incluyendo fractura por compresión). Desarrollo de la hipercalcemia (calcio sérico corregido > 11,5 mg / dL o 2,8 mmol / L no atribuible a otras causas).
Basándose en los criterios informados por Kraut et al., J. Clin. Oncol. 16(2): 589-592 (1998) y Blade et al., Br. J.
35 Haematol. 102(5): 1115-1123 (1998). En pacientes con CR, se analizó médula ósea usando PCR para la verificación de CR al nivel molecular. Los pacientes que cumplen todos los criterios para PR, pero que presentan una reducción ≥75 % en el nivel de proteína monoclonal del suero para al menos dos determinaciones separadas seis semanas, se llamaron en 'Remisión' (R).
Se analizó la evaluación de la calidad de vida para determinar si la respuesta a terapia estuvo acompañada de mejora medible en la calidad de vida. El análisis se realizó sobre puntuaciones resumen, además de puntos individuales, con métodos analíticos específicos explicados brevemente en un plan de análisis estadístico formal desarrollado antes del bloqueo de la base de datos.
45 Se analizaron descriptivamente datos farmacodinámicos (proteasoma 20S) con el fin de caracterizar el grado de inhibición del proteasoma, y para investigar cualquier correlación entre el grado de inhibición y la respuesta terapéutica y toxicidad.
Para aquellos pacientes que participaron en la porción farmacogenómica del estudio, se evaluaron descriptivamente la correlación entre los niveles de expresión de ARN y la respuesta a terapia. Además, pueden analizarse la duración de la respuesta, tiempo hasta la progresión de la enfermedad y supervivencia global del paciente usando la expresión de ARN como factor.
Se enrolaron un total de 202 pacientes en el estudio. La tasa de respuesta global a PS-341 solo fue del 35 % (tasa
55 de CR+PR del 27 %) antes de que cualquier paciente recibiera dexametasona añadida para respuesta no óptima. Estos pacientes habían todos recaído de al menos dos regímenes de tratamiento anteriores para su enfermedad y su enfermedad había progresado con su terapia más reciente. Esta población de pacientes tiene un pronóstico muy malo y no hay terapia estándar disponible. El estado de rendimiento de Karnofsky (KPS) fue ≤70 en el 25 % de los pacientes, y la etapa de Durie-Salmon se informó como IIA o IIIB en el 79 % de los pacientes. Aproximadamente el 39 % de los pacientes tuvieron β2-microglobulina ≥4 mg/l en el nivel de referencia, teniendo el 22 % de los pacientes este indicador de gravedad de enfermedad ≥6 mg/l. La mayoría de los pacientes había recaído después de todas las terapias convencionales de alta dosis y novedosas, progresando el 74 % a pesar del tratamiento previo con talidomida.
65 La dosis de 1,3 mg/m2 dos veces a la semana durante dos semanas, seguido de un descanso de 10 días, fue bien tolerada. Más del 80 % de los 78 pacientes completaron 2 o más ciclos de tratamiento, el 62 % completó 4 o más
ciclos, y el 27 % completó 8 ciclos.
La evaluación del Comité de Revisión Independiente (IRC) de respuesta confirmada al tratamiento con bortezomib solo se proporciona en la Tabla D; la clasificación adicional de respuesta para aquellos pacientes que experimentaron remisión parcial se proporciona en la Tabla E. Este panel independiente de tres oncólogos médicos revisó todos los datos para 193 pacientes evaluables en el ensayo y asignó respuesta usando los criterios de Blade (Tabla C). El IRC determinó que el 35 % de estos 193 pacientes con mieloma múltiple recidivante/resistente al tratamiento tuvo una respuesta al tratamiento (CR + PR + MR) con bortezomib solo, experimentando 53 (27 %) de los 193 pacientes una remisión completa o parcial a terapia y 14 pacientes adicionales con una respuesta mínima. 46 (24 %) pacientes adicionales tuvieron evidencia de enfermedad estable (NC, sin cambio) en respuesta a bortezomib solo, que refleja una mejora en el estado para estos pacientes que estaban progresando en el momento de la entrada en el estudio. Basándose en la evaluación de IRC, 38 (20 %) de los 193 pacientes tuvieron enfermedad progresiva y 42 pacientes adicionales (22 %) se consideraron no evaluables para la respuesta por IRC. Estos datos se han publicado. Véase Richardson PG, et al., New Eng. J. Med.;348: 2609-17 (2003).
Todos los análisis farmacogenómicos se basaron en el criterio del Comité de Revisión Independiente de categoría de respuesta.
Tabla D: Resumen de la respuesta confirmada por IRC al tratamiento con bortezomib solo (N = 193)
Categoria de Respuesta Confirmada Respuesta a bortezomiba
Respuesta Completa + Parcial + Mínima 67 (35%) Remisiones Completa + Parcial 53 (27%) Remisiones Completa + Casi Completa
19 (10%)
(NCR) Remisión Completa (CR) 19 (4%) Remisión Parcial (PR) 34 (23%) Respuesta Mínima (MR) 14 (5%) Sin Cambio 46 (27%) Enfermedad progresiva 38 (20%)
No Evaluable 42 (22%)
Una Respuesta al tratamiento mientras los pacientes recibían solo bortezomib. (N=193) Identificación de indicadores sensibles y no predictivos.
44 pacientes con mieloma múltiple tuvieron datos de expresión génica de alta calidad.
Se seleccionaron marcadores candidatos que se correlacionan con el desenlace de pacientes con mieloma múltiple a una terapia de inhibición del proteasoma (por ejemplo, bortezomib) usando una combinación de algoritmos de clasificación de marcadores. Entonces se usaron algoritmos de selección de aprendizaje y características supervisados para identificar los marcadores de la presente invención.
Análisis de datos
Se clasificó un conjunto de datos, que comprendía 44 muestras de descubrimiento, como respondedores (NR=17), enfermedad estable (NS = 12) o enfermedad progresiva (NP = 15), basándose en las asignaciones de IRC. Para la identificación de marcadores, las tres clases de respuestas se agruparon adicionalmente en respondedores (NR=17) frente a no respondedores (NNR = 27), o enfermedad resistente al tratamiento/progresiva (NP = 15) frente a otros (N = 29). Para cada muestra, se perfilaron 44.928 transcritos de genes (conjuntos de sondas de Affymetrix) sobre dos micromatrices U133 de Affymetrix según indicaciones del fabricante. Se aisló ARN total de tejido homogeneizado por TriazolTM (Life Technologies, Inc.) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se almacenó ARN a 80 ºC en agua desionizada tratada con pirocarbonato de dietilo. Métodos detallados para marcar las muestras y la posterior hibridación con las matrices están disponibles de Affymetrix (Santa Clara, CA). Brevemente, se convirtieron 5,0 µg de ARN total en ADNc bicatenario (Superscript; Life Technologies, Inc.) sondando la síntesis de la primera hebra con un cebador T7-(dT)24 que contenía un promotor de la T7 polimerasa (Affymetrix Inc.). Todo el ADNc bicatenario se usó posteriormente como molde para generar ARNc biotinilado usando la secuencia del promotor T7 incorporado en un sistema de transcripción in vitro (kit Megascript; Ambion y Bio-11-CTP y Bio-16-UTP; Enzo). Se añadieron oligonucleótidos de control y adiciones conocidas a 10 µg de ARNc, que luego se hibridó con matrices de oligonucleótidos U133 durante 16 h a 45 ºC con rotación constante. Entonces, las matrices se lavaron y se tiñeron en una estación fluídica de Affymetrix usando el protocolo EUKGE-WS1 y se barrieron en un escáner GeneArray de Affymetrix.
Normalización y transformación logarítmica.
Se normalizaron valores de expresión para todos los marcadores en cada micromatriz a una media recortada de
150. Los valores de expresión se determinaron usando el software de procesamiento de datos del análisis de expresión génica MAS5 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Estos valores se denominarán “expresión normalizada” en el resto de esta sección. En otra etapa de procesamiento, cada valor de expresión normalizada se dividió entre 150, y se sumó a 1. Se tomó el logaritmo natural del número resultante, y este valor se denominará el “log expresión” en el resto de esta sección.
Selección de marcadores individuales.
Pueden identificarse transcritos de genes individuales que parecen asociados a clases de muestras usando la metodología de clasificación y filtrado de características descrita más adelante. La identificación de marcadores individuales de marcadores de predicción usando la metodología descrita en el presente documento se expone en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3.
Selección de modelos.
Un conjunto de uno o más transcritos de genes que juntos clasifican muestras en grupos sensibles y resistentes (o sensibles y no sensibles), en el contexto de un algoritmo clasificador particular, se denomina un “modelo.” Los transcritos de genes se denominan “distintivos.” La determinación de qué combinación del (de los) transcrito(s) de genes clasifican mejor muestras en grupos sensibles y resistentes se denomina “selección de modelo”. La siguiente sección describe el proceso de cómo se identificaron los modelos de la presente invención. Modelos a modo de ejemplo se exponen en la Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6. Los métodos proporcionados en el presente documento junto con la identificación de marcadores individuales o de predicción pueden usarse para identificar modelos adicionales que comprenden marcadores de la invención.
Resumen de los datos proporcionados en las tablas
Los siguientes términos se usan en todas las tablas:
“Nº” o “Número” se corresponde con un número de identificación para los marcadores. “Probeset ID” se corresponde con el identificador de Affymetrix (Santa Clara, CA) de las matrices de oligonucleótidos del conjunto U133 de genoma humano que se usaron; “Secuencia derivada de” o “Genbank” o “RefSeq” se corresponde con la información de acceso a la base de datos pública para los marcadores. “RefSeq” se corresponde con el número de acceso nucleico de la secuencia de referencia; “Genbank” se corresponde con el número de acceso de GenBank asignado a la secuencia particular. “Título” se corresponde con una descripción común, si está disponible; “Símbolo de gen” se corresponde con un símbolo por el que el gen es comúnmente conocido; “Unigene” se corresponde con el identificador de gen único; “Clasificación__” se corresponde con el proceso de determinar qué marcadores individuales pueden usarse en combinación con agrupar o clasificar una muestra, por ejemplo, como sensible (R) o no sensibles(NR). Se indica la clasificación y el método de puntuación relativa usado para diversas clasificaciones, ya que es la puntuación de clasificación más baja identificada entre todos los métodos para cada uno de los marcadores de predicción. Se utilizaron cuatro métodos de selección de distintivos diferentes para determinar el mejor clasificador: (1) relación de señal con respecto a ruido (“SNR”), (2) umbral basado en la clase (“CBT”), (3) veces de cambio agrupadas (“PFC”), y (4) la prueba de Wilcoxon para datos independientes; Títulos adicionales se corresponden con puntuaciones y parámetros usados en cada uno de los métodos descritos en la siguiente ejemplificación, que incluye “Riesgo”, “Límite de decisión”, “Peso”, “Peso del voto”, “Voto”, “Confianza”, “Expresión”, “Expresión génica”, “Logaritmo de expresión génica”, “Expresión Normalizada” y “Factor de normalización”; “Anotación suplementaria” y “Categoría biológica” se corresponden con caracterización y clasificación adicionales no expuestas en el título; Para la Tabla 8, las líneas celulares se designaron Sensibles “S” o resistentes “R;” y “Relación de sensible/resistente” indica la expresión relativa de marcador indicado.
Clasificación y filtrado de distintivos
La primera etapa en la selección del modelo es filtrar los 44.928 distintivos a un número más pequeño que muestre una correspondencia con las clasificaciones de muestras. El filtrado implica la primera clasificación de los distintivos por un método de puntuación, y luego tomar solo los distintivos de mayor clasificación para análisis más corto. Los algoritmos de filtrado usados en la presente invención fueron: (1) relación de señal con respecto a ruido (“SNR”), (2) umbral basado en la clase (“CBT”), (3) veces de cambio agrupadas (“PFC”), y (4) la prueba de Wilcoxon para datos independientes. En realizaciones preferidas, se usó SNR para identificar genes que muestran un cambio pequeño, pero coherente, en niveles, y se usó CBT para identificar genes que estuvieron “inactivados” en una clase, pero “activados” en una fracción de la otra clase.
SNR se calcula a partir del logaritmo de valores de expresión como valor absoluto de la diferencia en las medias de clase dividida entre la suma de las desviaciones estándar de clase, y se ha usado para analizar datos de expresión antes; por ejemplo, véase la definición de P(g,c), una medida de la correlación entre la expresión del gen g y el vector de clase c, en Golub et al., “Molecular Classification of Cancer: Class discovery and class prediction by marker expression monitoring”, Science, 286:531-537 (1999). Para usar SNR para el filtrado se retuvieron los distintivos con las 100 mayores puntuaciones de SNR y se desechó el resto de la consideración.
CBT se calcula a partir de los valores de expresión normalizada, y define una clase (“clase A”) como la clase “inactivada”, y la otra clase (“clase B”) como la clase “activada”. En los presentes estudios, la clase “inactivada”, clase A, es Respondedores; y la clase “activada”, clase B, es No respondedores. La puntuación de CBT puede calcularse en una de dos formas: (1) Umbral de cada valor de la clase B con respecto al valor de expresión promedio de la clase A para ese distintivo. CBT es la diferencia entre la expresión de la clase B umbral promedio y la expresión de la clase A promedio, dividido entre la desviación estándar de la expresión de la clase A:
en la que µA es el valor de expresión de la clase A promedio, σA es la desviación estándar de los valores de expresión de la clase A y xi representan los NB valores de expresión de la clase B individuales. (2) CBT es el porcentaje de muestras de la clase B que superaron un múltiplo fijado del máximo (u otro valor de percentil) de valores de expresión en la clase A. En cualquier método, un valor constante puede añadirse al valor umbral de la clase A para compensar el ruido. En realizaciones preferidas, se utilizó el método 1, y se seleccionaron los 100 distintivos principales.
El método de veces de cambio agrupadas (“PFC”) es una medida de la expresión diferencial entre dos grupos de muestras, arbitrariamente designadas “control” y “probador”. PFC encuentra genes con mayor expresión en el muestras de probador que en las de control. El análisis se realizó examinando tanto Respondedores y “probador” (PFC-R) como No respondedores y “probador” (PFC-NR). Para clasificarlas como que tienen mayor expresión, las muestras de probador deben estar por encima de la muestra de control de percentil kº. Los valores de veces de cambio de muestras de probador se someten a una transformación no lineal que sube a una asíntota especificada por el usuario, con el fin de distinguir niveles moderados de veces de cambio, pero no hacen distinciones entre veces de cambio muy grandes. Los valores de veces de cambio apiñados de las muestras de probador expresadas en exceso se promedian para conseguir la puntuación POOF. En particular, PFC para el gen g se calcula como el promedio a través de muestras de probador de la relación de probador comprimido:control R(s,g). Para una muestra de probador dada s y gen g, R(s,g) = C(xgs/(k+xgQ)), en la que C(x) es la función de compresión C(z) = A(1-e-z/A) para z ≥ T, y C(z) = 0 para z<T, en la que T es un valor umbral no inferior a 1,0. A es una asíntota superior en relación con el valor de cambio de veces (los presentes inventores usaron 5), k es una constante que refleja el ruido aditivo en los datos, es decir, el componente fijado de la varianza en mediciones repetidas. Los presentes inventores obtuvieron un valor de 30 para este parámetro de los experimentos de calibración. xgs es el valor de expresión del gen g en la muestra s, xgQ es el percentil Qº del valor de expresión de las muestras de control.
Por tanto, una fracción mínima f de las muestras de probador debe tener R(s,g) superior a 0; si esto no es cierto, entonces el valor de R(s,g) se fija a 0.
Los presentes inventores usaron los siguientes parámetros en dos ejecuciones de este algoritmo:
Parámetro
Valor en ronda 1 Valor en ronda 2
Q
1.0 0.8
f
0.2 0.4
T
1.25 1.25
La prueba de Wilcoxon para datos independientes es una técnica estadística estándar. Véase, por ejemplo, Conover, W. J. 1980. Practical Nonparametric Statistics. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons. Esta prueba también se conoce como la prueba de la U de Mann-Whitney. El objetivo es probar la hipótesis nula de que las distribuciones de poblaciones correspondientes a dos muestras aleatorias son idénticas contra la hipótesis alternativa de que son diferentes. Solo se examina la clasificación de los valores de expresión de muestras, no los propios valores.
Se analizaron marcadores usando los 44.928 conjuntos de sondas para la expresión diferencial de entre las 44 muestras de paciente usando los métodos descritos en lo anterior. En particular, los presentes inventores aplicaron PFC (ejecución 1), PFC (ejecución 2), SNR, la prueba de Wilcoxon para datos independientes y el umbral basado en clases como se ha descrito anteriormente. Los tres primeros métodos se ejecutaron en cada dirección, para buscar
genes en respondedores y luego en no respondedores. La prueba de Wilcoxon para datos independientes fue bidireccional e identificó genes en tanto respondedores como no respondedores. Así, hubo 7 ejecuciones de los métodos. En cada caso, los conjuntos de sonda se clasificaron basándose en su puntuación, y se clasificaron. Los 100 primeros conjuntos de sondas de cada método se seleccionaron para la Tabla 1. La última columna en la tabla 5 identifica la clasificación mínima de entre los métodos.
Se realizó un análisis de riesgo proporcional de Cox para determinar variables independientes del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) en pacientes con mieloma múltiple recidivante y resistente al tratamiento después del tratamiento con bortezomib. Esta metodología se diseña para analizar los datos de tiempo hasta el evento en los que algunos de los datos pueden ser censurados (véase E.T. Lee, Statistical Methods for Survival Data Analysis, 2nd ed. 1992, John Wiley& Sons, Inc.). Se usó el paquete estadístico SAS para realizar el análisis. Los presentes inventores examinaron primero los factores clínicos y de pronóstico para identificar qué combinación de factores mostró la mayor asociación con TTP. Esto se llevó a cabo por el uso del método de puntuación para la selección del mejor subconjunto. Este método proporciona estadística de chi al cuadrado de la puntuación para todos los posibles tamaños de modelo que oscilan de un predictor hasta el número total de variables explicativas en consideración. Así, el método proporciona primero los mejores modelos de predictores individuales con el fin de la mayor estadística de la chi al cuadrado. Si hay modelos de predictores individuales significativos (p < 0,05), el procedimiento continúa a la siguiente etapa de estimar todos los modelos de dos predictores y clasificarlos por la mayor estadística de la chi al cuadrado.
Para evaluar si un modelo de 2 predictores es un mejor ajuste que un modelo de un único predictor, se calcula ladiferencia en la estadística de la chi al cuadrado. Ésta es una prueba de la chi al cuadrado de un grado de libertad y puede evaluarse para significancia estadística. Si la diferencia demuestra ser significativa a p < 0,05, los presentes inventores concluyen que el modelo de dos predictores es un mejor ajuste, la segunda variable está significativamente asociada a TTP después de tener en cuenta la primera variable, y el proceso continúa estimando los modelos de tres predictores. El modelo de tres predictores se compara con el modelo de dos predictores de la misma forma que se evaluó el modelo de dos predictores contra el modelo de un único predictor. Este proceso continúa hasta que falla la prueba de la chi al cuadrado de diferencias, es decir, p > 0,05 para añadir una variable al modelo adicional. Usando este proceso, los presentes inventores encontraron que el mejor modelo contuvo 3 factores pronósticos o clínicos significativos, citogenética anormal, β2-microglobulina y proteína C reactiva. Los presentes inventores definieron éste como su mejor modelo de variables de pronóstico.
La siguiente etapa fue determinar si había algún marcador genómico que estuviera significativamente asociado a TTP después de representar los factores de pronóstico. Los presentes inventores filtraron primero el conjunto de datos genómicos, constituido por unos 44.000 transcritos de los chips de matrices humanas U133A y U133B de Affymetrics, a aquellos genes que tenían al menos una llamada presente usando el sistema de detección de Affymetrix para determinar si un transcrito se detecta de forma fidedigna o no. Esto dejó 13.529 transcritos para el análisis. Los presentes inventores estimaron entonces los modelos de riesgo proporcional de Cox para cada uno de los 13.529 transcritos en los que cada modelo también contuvo los 3 factores de pronóstico tratados anteriormente. Es decir, se estimaron 13.529 modelos en los que cada modelo contuvo 1 transcrito y los tres factores de pronóstico. De cada modelo, los presentes inventores obtuvieron estimaciones de riesgo relativo, intervalos de confianza del 95 % y valores de p para la asociación de cada transcrito a TTP. De los 13.529 modelos, los presentes inventores encontraron 834 transcritos que tenían valores de p inferiores a 0,05. Es decir, los presentes inventores encontraron 834 transcritos que estuvieron significativamente e independientemente, de los factores de pronóstico, asociados a TTP. Éstos se enumeran en la Tabla 2
TABLA 2 Marcadores de predicción asociados con el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP)
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
83
201575_at NM_012245.1 SKI-interacting protein SNW1 >1
81
202647_s_at NM_002524.2 neuroblastoma RAS viral(v-ras)oncogene homolog NRAS >1
234
203058_s_at AW299958 3’-phosphoadenosine 5-phosphosulfate synthase 2 PAPSS2 <1
42
203753_at NM_003199.1 transcription factor 4 TCF4 <1
415
204173_at NM_002475.1 myosin light chain 1 slow a MLC1SA >1
191
206121_at NM_000036.1 adenosine monophosphate deaminase 1 (isoform M) AMPD1 >1
404
208690_s_at BC000915.1 PDZ and LIM domain 1 (elfin) PDL1M1 >1
53
210993_s_at U54826.1 MAD, mothers against decapentaplegic homolog 1 (Drosophila) MADH1 >1
305
212110_at D31887.1 KIAA0062 protein KIAA0062 <1
41
212382_at AK021980.1 Homo sapiens cDNA FLJ11918 fis, clone HEMBB1000272. -- <1
43
212386_at AK021980.1 Homo sapiens cDNA FLJ11918 fis, clone HEMBB1000272. -- <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
40
212387_at AK021980.1 Homo sapiens cDNA FLJ11918 fis, clone HEMBB1000272. -- <1
467
213746_s_at AW051856 filamin A, alpha (actin binding protein 280) FLNA >1
39
213891_s_at AI927067 Homo sapiens cDNA FLJ11918 fis, clone HEMBB1000272. -- <1
78
215744_at AW514140 fusion, derived from t(12;16) malignant liposarcoma FUS <1
77
218319_at NM_020651.2 pellino homolog 1 (Drosophila) PELI1 <1
201
219429_at NM_024306.1 fatty acid hydroxylase FAAH <1
126
222762_x_at AU144259 LIM domains containing 1 LIMD1 >1
376
222789_at BE888593 hypothetical protein FLJ11220 FLJ11220 >1
341
225373_at BE271644 PP2135 protein PP2135 <1
209
225710_at H99792 Homo sapiens cDNA FLJ34013 fis, clone FCBBF2002111. -- <1
48
227798_at AU146891 EST -- >1
464
231810_at BG106919 BRI3 binding protein BRI3BP >1
76
232213_at AU147506 pellino homolog 1 (Drosophila) PELI1 <1
75
232304_at AK026714.1 pellino homolog 1 (Drosophila) PELI1 <1
224
235875_at BF510711 EST -- <1
172
242903_at AI458949 EST -- <1
476
222788_s_at BE888593 hypothetical protein FLJ11220 FLJ11220 >1
477
213305_s_at L42375.1 protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), gamma isoform PPP2R5C >1
478
204774_at NM_014210.1 ecotropic viral integration site 2A EVI2A <1
479
200984_s_at NM_000611.1 CD59antigen p18-20 (antigen identified by monoclonal antibodies 16.3A5, EJ16, EJ30, EL32 and G344) CD59 <1
480
208956_x_at U62891.1 dUTP pyrophosphatase DUT >1
481
216326_s_at AF059650 histone deacetylase 3 HDAC3 <1
482
203845_at AV727449 p300/CBP-associated factor PCAF <1
483
214349_at AV764378 Homo sapiens cDNA: FLJ23438 fis, clone HRC13275. -- >1
484
202332_at NM_001894.1 casein kinase 1, epsilon CSNK1E >1
485
201020_at NM_003405.1 tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation protein, eta polypeptide YWHAH <1
486
200612_s_at NM_001282.1 adaptor-related protein complex 2, beta 1 subunit AP2B1 <1
487
212612_at D31888.1 REST corepressor RCOR >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
488
202963_at AW027312 regulatory factorX,5 (influences HLA class II expression) RFX5 <1
489
212463_at BE379006 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564J0323 (from clone DKFZp564J0323) -- <1
490
202453_s_at NM_005316.1 general transcription factor IIH, polypeptide 1, 62kDa GTF2H1 <1
491
209239_at M55643.1 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) NFKB1 <1
492
213405_at N95443 Homo sapiens, clone IMAGE:4831050, mRNA -- <1
493
200679_x_at BE311760 high-mobility group box 1 HMGB1 >1
494
205981_s_at NM_001564.1 inhibitor of growth family, member 1-like ING1L >1
495
211783_s_at BC006177.1 metastasis associated 1 MTA1 >1
496
227482_at AI097656 hypothetical protein LOC57143 LOC57143 >1
497
214943_s_at D38491.1 KIAA0117 protein KIAA0117 >1
498
205504_at NM_000061.1 Bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase BTK <1
499
218216_x_at NM_016638.1 ADP-ribosylation-like factor 6 interacting protein 4 ARL6IP4 >1
500
221014_s_at NM_031296.1 RAB33B, member RAS oncogene family RAB33B <1
501
202408_s_at NM_015629.1 PRP31 pre-mRNA processing factor 31 homolog (yeast) PRPF31 >1
502
217996_at AA576961 pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 PHLDA1 >1
503
229723_at BF591040 T-cell activation GTPase activating protein TAGAP <1
504
227112_at AW270037 KIAA0779 protein KIAA0779 <1
505
218224_at NM_006029.2 paraneoplastic antigen MA1 PNMA1 >1
506
213415_at AI768628 chloride intracellular channel 2 CLIC2 <1
507
225251_at AK021761.1 Homo sapiens cDNA FLJ11699 fis, clone HEMBA1005047, highly similar to RAS-RELATED PROTEIN RAB-24. RAB24 <1
508
219228_at NM_018555.2 zinc finger protein 463 ZNF463 <1
509
226979_at AI125541 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2 MAP3K2 <1
510
227179_at AK002152.1 staufen, RNA binding protein, homolog 2 (Drosophila) STAU2 >1
511
205621_at NM_006020.1 alkB, alkylation repair homolog (E. coli) ALKBH >1
512
226421_at AA707320 hypothetical protein LOC286505 LOC286505 <1
513
219709_x_at NM_023933.1 hypothetical protein MGC2494 MGC2494 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
514
217803_at NM_022130.1 golgi phosphoprotein 3 (coat-protein) GOLPH3 <1
515
228980_at AI760772 fring LOC117584 <1
516
243020_at R06738 EST -- >1
517
211289_x_at AF067524.1 cell division cycle 2-like 2 CDC2L2 >1
518
213137_s_at AI828880 protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 2 PTPN2 >1
519
204407_at AF080255.1 transcription termination factor, RNA polymerase II TTF2 >1
520
224938_at AU144387 EST -- <1
521
225466_at AI761804 tripartite motif-containing 14 TRIM 14 <1
522
208908_s_at AF327443.1 calpastatin CAST <1
523
222343_at AA629050 Homo sapiens full length insert cDNA clone ZA94C02 -- >1
524
224566_at AK027191.1 Homo sapiens cDNA: FLJ23538 fis, clone LNG08010, highly similar to BETA2 Human MEN1 region clone epsilon/beta mRNA. -- <1
525
208297_s_at NM_005665.1 - -- >1
526
213923_at AW005535 RAP2B, member of RAS oncogene family RAP2B <1
527
228680_at AW340096 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20489 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
528
209204_at AI824831 LIM domain only 4 LMO4 >1
529
208093_s_at NM_030808.1 LIS1-interacting protein NUDEL; endooligopeptidase A NUDEL <1
530
200982_s_at NM_001155.2 annexin A6 ANXA6 <1
531
218249_at NM_022494.1 zinc finger, DHHC domain containing 6 ZDHHC6 <1
532
203345_s_at AI566096 likely ortholog of mouse metal response element binding transcription factor 2 M96 >1
533
223141_at AK022317.1 uridine-cytidine kinase 1 UCK1 >1
534
222444_at AL121883 ALEX3 protein ALEX3 <1
535
217853_at NM_022748.1 tumor endothelial marker 6 TEM6 <1
536
220244_at NM_013343.1 NAG-7 protein NAG-7 <1
537
213995_at AW195882 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit s (factor B) ATP5S >1
538
214072_x_at AA679297 secreted protein of unknown function SPUF >1
539
200950_at NM_006409.1 actin related protein 2/3 complex, subunit 1A, 41kDa ARPC1A <1
540
224878_at N63936 similar to ubiquitin binding protein UBPH >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
541
227294_at A1474448 hypothetical protein BC014000 LOC115509 >1
542
214334_x_at N34846 DAZ associated protein 2 DAZAP2 >1
543
214659_x_at AC007956 ZAP3 protein ZAP3 >1
544
36499_at D87469 cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila) CELSR2 >1
545
229512_at BE464337 EST -- >1
546
206662_at NM_002064.1 glutaredoxin (thioltransferase) GLRX <1
547
200914_x_at BF589024 kinectin 1 (kinesin receptor) KTN1 >1
548
214938_x_at AF283771.2 high-mobility group box 1 HMGB1 >1
549
203243_s_at NM_006457.1 LIM protein (similar to rat protein kinase Cbinding enigma) LIM <1
550
214395_x_at AI335509 eukaryotic translation elongation factor 1 delta (guanine nucleotide exchange protein) EEF1D >1
551
217208_s_at AL121981 discs, large (Drosophila) homolog 1 DLG1 >1
552
224180_x_at AF131737.1 hypothetical protein LOC51057 LOC51057 >1
553
218724_s_at NM_021809.1 TGFB-induced factor 2 (TALE family homeobox) TGIF2 <1
554
210387_at BC001131.1 histone 1, H2bg HIST1H2BG >1
555
208898_at AF077614.1 ATPase, H+ transporting, lysosomal 34kDa, V1 subunit D ATP6V1D >1
556
200645_at NM_007278.1 GABA(A) receptor-associated protein GABARAP <1
557
200985_s_at NM_000611.1 CD59antigen p18-20 (antigen identified by monoclonal antibodies 16.3A5, EJ16, EJ30, EL32 and G344) CD59 <1
558
220595_at NM_013377.1 hypothetical protein DKFZp434B0417 DKFZp434B 0417 >1
559
236550_s_at BF508689 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp686I2118 (from clone DKFZp686I2118) ZNF311 >1
560
202279_at NM_004894.1 chromosome 14 open reading frame 2 C14orf2 >1
561
234312_s_at AK000162.1 acetyl-Coenzyme A synthetase 2 (ADP forming) ACAS2 >1
562
213945_s_at AI867102 nucleoporin 210 NUP210 >1
563
228380_at BE551193 EST,Weakly similar tohypotheticalprotein FLJ20378 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
564
203574_at NM_005384.1 nuclear factor, interleukin 3 regulated NFIL3 >1
565
222146_s_at AK026674.1 transcription factor 4 TCF4 <1
566
227665_at BE968576 Homo sapiens, clone IMAGE:4152387, mRNA -- <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
567
207995_s_at NM_014257.1 CD209 antigen-like CD209L <1
568
201097_s_at NM_001660.2 ADP-ribosylation factor 4 ARF4 <1
569
203975_s_at BF000239 chromatin assembly factor 1, subunit A (p150) CHAF1A >1
570
209136_s_at BG390445 ubiquitin specific protease 10 USP10 >1
571
238086_at AI288372 EST -- >1
572
242388_x_at AW576600 EST -- <1
573
241876_at AW663060 EST -- <1
574
228195_at BE645119 EST -- <1
575
202334_s_at AA877765 ubiquitin-conjugating enzyme E2B (RAD6 homolog) UBE2B <1
576
201472_at NM_003372.2 von Hippel-Lindau binding protein 1 VBP1 <1
577
217092_x_at AL031589 -- -- >1
578
208744_x_at BG403660 heat shock 105kDa/110kDa protein 1 HSPH1 >1
579
212412_at AV715767 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564A072 (from clone DKFZp564A072) -- <1
580
217995_at NM_021199.1 sulfide quinone reductase-like (yeast) SQRDL <1
581
203275_at NM_002199.2 interferon regulatory factor 2 IRF2 <1
582
207335_x_at NM_007100.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit e ATP5I >1
583
218130_at NM_024510.1 hypothetical protein MGC4368 MGC4368 >1
584
208914_at NM_015044.1 golgi associated, gamma adaptin ear containing, ARF binding protein 2 GGA2 <1
585
202985_s_at NM_004873.1 BCL2-associated athanogene 5 BAG5 >1
586
206587_at NM_006584.1 chaperonin containing TCP1, subunit 6B (zeta 2) CCT6B <1
587
223419_at BC004290.1 hypothetical protein MGC10870 MGC10870 >1
588
213102_at Z78330 ARP3 actin-related protein 3 homolog (yeast) ACTR3 <1
589
226520_at AI831506 EST -- <1
590
201366_at NM_004034.1 annexin A7 ANXA7 <1
591
213021_at AI741876 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp566B213 (from clone DKFZp566B213) -- <1
592
201172_x_at NM_003945.1 ATPase,H+ transporting,lysosomal9kDa, V0 subunit e ATP6V0E <1
593
213295_at AA555096 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586D1122 (from clone DKFZp586D1122) -- <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
594
226406_at AI823360 hypothetical protein MGC12909 MGC12909 <1
595
210564_x_at AF009619.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
596
242606_at AL043482 EST -- <1
597
203292_s_at NM_021729.2 vacuolar protein sorting 11 (yeast) VPS11 >1
598
202579_x_at NM_006353.1 high mobility group nucleosomal binding domain 4 HMGN4 <1
599
229113_s_at W16779 protein kinase C, zeta PRKCZ >1
600
244743_x_at AA114243 zinc finger protein 138 (clone pHZ-32) ZNF138 <1
601
222622_at BG284709 hypothetical protein LOC283871 LOC283871 >1
602
210312_s_at BC002640.1 hypothetical protein LOC90410 LOC90410 <1
603
221530_s_at A044088.1 basic helix-loop-helix domain containing, class B, 3 BHLHB3 <1
604
201994_at NM_012286.1 mortality factor 4 like 2 MORF4L2 <1
605
227262_at BE348293 Homo sapiens proteoglycan link protein mRNA, complete cds. -- >1
606
203693_s_at NM_001949.2 E2F transcription factor 3 E2F3 <1
607
221750_at BG035985 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 (soluble) HMGCS1 <1
608
214789_x_at AA524274 Splicing factor, arginine/serine-rich, 46kD SRP46 <1
609
200761_s_at NM_006407.2 vitamin A responsive; cytoskeleton related JWA <1
610
212233_at AL523076 Homo sapiens cDNA FLJ30550 fis, clone BRAWH2001502. -- <1
611
209300_s_at BC002888.1 DKFZP566B 183 protein DKFZP566B 183 <1
612
213708_s_at N40555 transcription factor-like 4 TCFL4 <1
613
207467_x_at NM_001750.2 calpastatin CAST <1
614
225414_at AL558987 hypothetical protein LOC284996 LOC284996 <1
615
235104_at BG292389 EST -- <1
616
214003_x_at BF184532 ribosomal protein S20 RPS20 >1
617
201342_at AY008268.1 SAR1 protein SAR1 <1
618
211316_x_at AF009616.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
619
221522_at AL136784.1 hypothetical protein DKFZp434L0718 DKFZP434L 0718 <1
620
210844_x_at D14705.1 catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa CTNNA1 <1
621
210448_s_at U49396.1 purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 5 P2RX5 <1
622
212843_at AA126505 neural cell adhesion molecule 1 NCAM1 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
623
224284_x_at AF338193.1 -- -- >1
624
222650_s_at BE898559 SLC2A4 regulator SLC2A4RG >1
625
212719_at AB011178.1 pleckstrin homology domain containing, familyE (withleucine rich repeats)member 1 PTEKHE1 >1
626
38069_at Z67743 chloride channel 7 CLCN7 >1
627
233625_x_at AK021939.1 hypothetical protein FLJ20542 FLJ20542 >1
628
205053_at NM_000946.1 primase, polypeptide 1, 49kDa PRIM1 >1
629
239749_at AW205090 EST -- >1
630
34764_at D21851 leucyl-tRNA synthetase, mitochondrial LARS2 >1
631
205659_at NM_014707.1 histone deacetylase 9 HDAC9 <1
632
242092_at AA019300 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20097 [Homo sapiens] [H. sapiens] -- >1
633
203575_at NM_001896.1 casein kinase 2, alpha prime polypeptide CSNK2A2 >1
634
221297_at NM_018654.1 G protein-coupled receptor, family C, group 5, member D GPRC5D <1
635
212900_at BE645231 SEC24 related gene family, member A (S. cerevisiae) SEC24A <1
636
230036_at BE669858 hypothetical protein FLJ39885 FLJ39885 <1
637
213101_s_at Z78330 ARP3 actin-related protein 3 homolog (yeast) ACTR3 <1
638
222846_at AB038995.1 RAB-8b protein LOC51762 <1
639
213455_at W87466 pleckstrin homology domain containing, family B (evectins) member 2 PLEKHB2 <1
640
242613_at AI809536 EST -- >1
641
218206_x_at NM_016558.1 SCAN domain containing 1 SCAND1 >1
642
222014_x_at AI249752 MTO1 protein MTO1 <1
643
212219_at D38521.1 proteasome activator 200 kDa PA200 <1
644
219806_s_at NM_020179.1 FN5 protein FN5 <1
645
218875_s_at NRM_012177.1 F-box only protein 5 FBXO5 >1
646
208485_x_at NM_003879.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
647
218233_s_at NM_017601.1 chromosome 6 open reading frame 49 C6orf49 >1
648
214130_s_at AI821791 phosphodiesterase 4D interacting protein (myomegalin) PDE4DIP <1
649
208723_at BC000350.1 ubiquitin specific protease 11 USP11 >1
650
217814_at NM_020198.1 GK001 protein GK001 <1
651
208809_s_at AL136632.1 hypothetical protein FLJ12619 FLJ12619 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
652
201199_s_at NM_002807.1 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 1 PSMD1 <1
653
242937_at AV763408 EST, Moderately similar to ILF1_HUMAN Interleukin enhancer-binding factor 1 (Cellular transcription factor ILF-1) [H.sapiens] -- >1
654
212333_at AL049943.1 DKFZP564F0522 protein DKFZP564F 0522 <1
655
210817_s_at BC004130.1 nuclear domain 10 protein NDP52 <1
656
212508_at AK024029.1 modulator of apoptosis 1 MOAP1 >1
657
213603_s_at BE138888 ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP binding protein Rac2) RAC2 <1
658
233274_at AU145144 -- -- >1
659
218557_at NM_020202.1 Nit protein 2 NIT2 <1
660
231428_at BE502947 EST -- <1
661
201810_s_at AL562152 SH3-domain binding protein 5 (BTKassociated) SH3BP5 <1
662
209970_x_at M87507.1 caspase 1, apoptosis-related cysteine protease (interleukin 1, beta, convertase) CASP1 <1
663
208965_s_at BG256677 interferon, gamma-inducible protein 16 IFI16 >1
664
203038_at NM_002844.1 protein tyrosine phosphatase, receptor type, K PTPRK <1
665
202442_at NM_001284.1 adaptor-related protein complex 3, sigma 1 subunit AP3S1 <1
666
209515_s_at U38654.3 RAB27A, member RAS oncogene family RAB27A <1
667
201865_x_at AI432196 nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 (glucocorticoid receptor) NR3C1 <1
668
204786_s_at L41944.1 interferon (alpha, beta and omega) receptor 2 IFNAR2 >1
669
209508_x_at AF005774.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
670
200822_x_at NM_000365.1 triosephosphate isomerase 1 TPI1 >1
671
217322_x_at AL024509 -- -- >1
672
203505_at AF285167.1 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1 ABCA1 >1
673
223347_at AL360266.1 hypothetical protein FLJ22283 FLJ22283 >1
674
209765_at Y13786.2 a disintegrin and metalloproteinase domain 19 (meltrin beta) ADAM19 <1
675
202972_s_at AW450403 family with sequence similarity 13, member A1 FAM13A1 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
676
203380_x_at NM_006925.1 splicing factor, arginine/serine-rich 5 SFRS5 >1
677
212211_at AI986295 gene trap ankyrin repeat GTAR <1
678
218326_s_at NM_018490.1 G protein-coupled receptor 48 GPR48 >1
679
217994_x_at NM_017871.1 hypothetical protein FLJ20542 FLJ20542 >1
680
239835_at AA669114 T-cell activation kelch repeat protein TA-KRP <1
681
213353_at BF693921 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 5 ABCA5 <1
682
208710_s_at AI424923 adaptor-related protein complex 3, delta 1 subunit AP3D1 >1
683
205011_at NM_014622.1 loss of heterozygosity, 11, chromosomal region 2, gene A LOH11CR2 A <1
684
202027_at NM_012264.1 chromosome 22 open reading frame 5 C22orf5 >1
685
203642_s_at NM_014900.1 KIAA0977 protein KIAA0977 <1
686
212266_s_at AW084582 splicing factor, arginine/serine-rich 5 SFRS5 >1
687
238693_at AA165136 EST -- <1
688
219342_at NM_022900.1 O-acetyltransferase CAS1 <1
689
201769_at NM_014666.1 enthoprotin ENTH <1
690
243982_at AA455180 EST, Weakly similar to KHLX_HUMAN Kelch-like protein X [H.sapiens] -- >1
691
230490_x_at AI866717 hypothetical protein FLJ31034 FLJ31034 <1
692
227073_at N50665 Homo sapiens cDNA FLJ36574 fis, clone TRACH2012376. -- <1
693
226858_at T51255 chromosome 1 open reading frame 28 C1orf28 >1
694
219759_at NM_022350.1 aminopeptidase LOC64167 <1
695
208325_s_at NM_006738.1 A kinase (PRKA) anchor protein 13 AKAP13 >1
696
212053_at AK025504.1 KIAA0251 protein KIAA0251 <1
697
222715_s_at BE856321 AP1 gamma subunit binding protein 1 AP1GBP1 <1
698
235456_at AI810266 Homo sapiens, clone IMAGE:4819084, mRNA -- >1
699
235424_at N66727 EST -- <1
700
212407_at AL049669.1 CGI-01 protein CGI-01 <1
701
227565_at BE501881 EST -- <1
702
228091_at AI800609 EST, Weakly similar to D29149 proline-rich protein -mouse (fragment) [M.musculus] -- >1
703
209258_s_at NM_005445.1 chondroitin sulfate proteoglycan 6 (bamacan) CSPG6 >1
704
222590_s_at AF180819.1 nemo-like kinase NLK <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
705
212528_at AL023553 Homo sapiens, clone IMAGE:3605655, mRNA -- <1
706
203981_s_at AL574660 ATP-binding cassette, sub-familyD (ALD), member 4 ABCD4 >1
707
201011_at NM_002950.1 ribophorin I RPN1 <1
708
244268_x_at BF435769 EST,Weakly similar tohypotheticalprotein FLJ20378 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
709
202315_s_at NM_004327.2 breakpoint cluster region BCR <1
710
227698_s_at AW007215 RAB40C, member RAS oncogene family RAB40C >1
711
218311_at NM_003618.1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3 MAP4K3 <1
712
213931_at AI819238 inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein ID2 >1
713
217997_at AA576961 pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 PHLDA1 >1
714
208951_at BC002515.1 aldehyde dehydrogenase 7 family, member A1 ALDH7A1 >1
715
225847_at AB037784.1 KIAA1363 protein KIAA1363 <1
716
202846_s_at NM_002642.1 phosphatidylinositol glycan, class C PIGC <1
717
200681_at NM_006708.1 glyoxalase I GLO1 <1
718
202727_s_at NM_000416.1 interferon gamma receptor 1 IFNGR1 <1
719
222231_s_at AK025328.1 hypothetical protein PRO1855 PRO1855 <1
720
228482_at AV702789 hypothetical protein FLJ36674 FLJ36674 >1
721
235056_at AV722693 EST -- <1
722
202010_s_at NRM_021188.1 likely ortholog of mouse anotherpartner for ARF 1 APA1 >1
723
226556_at BF431260 Homo sapiens, clone IMAGE:4815204, mRNA -- <1
724
215088_s_at BG110532 EST, Highly similar to succinate dehydrogenase complex, subunit C precursor; Succinate dehydrogenase complex, subunit C, integral membrane protein,; succinate-ubiquinone oxidoreducatase cytochrome B large subunit [Homo sapiens] [H.sapiens] -- >1
725
209492_x_at BC003679.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit e ATP5I >1
726
211075_s_at Z25521.1 CD47 antigen (Rh-related antigen, integrinassociated signal transducer) CD47 <1
727
204552_at AA355179 Homo sapiens cDNA FLJ34214 fis, clone FCBBF3021807. -- <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
728
211862_x_at AF015451.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
729
201403_s_at NM_004528.1 microsomal glutathione S-transferase 3 MGST3 <1
730
209899_s_at AF217197.1 fuse-binding protein-interacting repressor SIAHBP1 >1
731
219023_at NM_018569.1 hypothetical protein PRO0971 PRO0971 >1
732
236506_at BF507371 EST -- >1
733
205191_at NRM_006915.1 retinitis pigmentosa 2 (X-linked recessive) RP2 <1
734
202146_at AA747426 interferon-related developmentalregulator 1 IFRD1 <1
735
243304_at AI733824 hypothetical protein LOC286109 LOC286109 >1
736
223658_at AF134149.1 potassium channel, subfamily K, member 6 KCNK6 <1
737
202074_s_at NM_021980.1 optineurin OPTN <1
738
203162_s_at NM_005886.1 katanin p80 (WD40-containing) subunit B 1 KATNB1 >1
739
208841_s_at AB014560.1 Ras-GTPase activating protein SH3 domain-binding protein 2 G3BP2 <1
740
230128_at AK025231.1 Homo sapiens cDNA: FLJ21578 fis, clone COL06726. -- <1
741
214394_x_at AI613383 eukaryotic translation elongation factor 1 delta (guanine nucleotide exchange protein) EEF1D >1
742
242969_at AI288679 EST -- <1
743
210251_s_at AF112221.1 rap2 interacting protein x RIPX >1
744
209894_at U50748.1 leptin receptor LEPR <1
745
204190_at NM_005800.1 highly charged protein D13S106E >1
746
202438_x_at BF346014 Homo sapiens, clone IMAGE:5278680, mRNA -- <1
747
211968_s_at NM_005348.1 heat shock 90kDa protein 1, alpha HSPCA >1
748
222424_s_at BC000805.1 similar to rat nuclear ubiquitous casein kinase 2 NUCKS >1
749
226445_s_at AI743109 tripartite motif-containing 41 TRIM41 >1
750
235061_at AV706522 hypothetical protein DKFZp761G058 DKFZp761G 058 <1
751
34031_i_at U90268 cerebral cavernous malformations 1 CCM1 <1
752
213160_at D86964.1 dedicator of cyto-kinesis 2 DOCK2 <1
753
209194_at BC005334.1 centrin, EF-hand protein, 2 CETN2 <1
754
209240_at AF070560.1 O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase (UDP-Nacetylglucosamine:polypeptide-Nacetylglucosaminyl transferase) OGT <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
755
218962_s_at NM_022484.1 hypothetical protein FLJ13576 FLJ13576 <1
756
203525_s_at AI375486 adenomatosis polyposis coli APC <1
757
219904_at NM_024303.1 hypothetical protein MGC4161 MGC4161 >1
758
205550_s_at NM_004899.1 brain and reproductive organ-expressed (TNFRSF1A modulator) BRE <1
759
209932_s_at U90223.1 dUTP pyrophosphatase DUT >1
760
AFFXM27830_M_ at M27830 -- -- >1
761
205297_s_at NM_000626.1 CD79B antigen (immunoglobulin-associated beta) CD79B <1
762
232297_at AL049385.1 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M1418 (from clone DKFZp586M1418) -- <1
763
204019_s_at NM_015677.1 likely ortholog of mouse Sh3 domain YSClike 1 SH3YL1 <1
764
230769_at AI916261 EST, Weakly similar to PRP1_HUMAN Salivary proline-rich protein precursor (Clones CP3, CP4 and CP5) [Contains: Basic peptide IB-6; Peptide P-H] [H.sapiens] -- >1
765
217501_at AI339732 Homo sapiens, clone IMAGE:5268928, mRNA -- <1
766
205105_at NM_002372.1 mannosidase, alpha, class 2A, member 1 MAN2A1 <1
767
209514_s_at BE502030 RAB27A, member RAS oncogene family RAB27A <1
768
203217_s_at NM_003896.1 sialyltransferase 9 (CMPNeuAc:lactosylceramide alpha-2,3sialyltransferase; GM3 synthase) SIAT9 <1
769
203176_s_at BE552470 transcription factor A, mitochondrial TFAM >1
770
208988_at AK024505.1 F-box and leucine-rich repeat protein 11 FBXL11 <1
771
221500_s_at AF008936.1 aminopeptidase-like 1 NPEPL1 >1
772
229236_s_at AI346445 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 10 theta, 150/170kDa EIF3S10 <1
773
218267_at N_016550.1 cyclin-dependent kinase 2-interacting protein CINP >1
774
208129_x_at NM_001754.1 runt-related transcription factor 1 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene) RUNX1 >1
775
208764_s_at D13119.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit c (subunit 9), isoform 2 ATP5G2 >1
776
225498_at AV713673 chromosome 20 open reading frame 178 C20orf178 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
777
211317_s_at AF041461.1 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR <1
778
200760_s_at N92494 vitamin A responsive; cytoskeleton related JWA <1
779
215483_at AK000270.1 A kinase (PRKA) anchor protein (yotiao) 9 AKAP9 <1
780
218194_at NRM_015523.1 small fragment nuclease DKFZP566E 144 <1
781
201388_at NM_002809.1 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3 PSMD3 <1
782
34406_at AB011174 KIAA0602 protein KIAA0602 >1
783
208386_x_at NM_007068.1 DMC1 dosage suppressor of mck1 homolog, meiosis-specific homologous recombination (yeast) DMC1 >1
784
244481_at BF196523 EST -- >1
785
239673_at AW080999 EST -- <1
786
208773_s_at AL136943.1 FLJ20288 protein FLJ20288 <1
787
222206_s_at AA781143 hypothetical protein from EUROIMAGE 2021883 LOC56926 >1
788
228658_at R54042 Homo sapiens cDNA FLJ25887 fis, clone CBR02996. -- <1
789
212586_at BG111635 type 1 tumor necrosis factor receptor shedding aminopeptidase regulator ARTS-1 <1
790
238011_at BF668314 Homo sapiens cDNA FLJ37032 fis, clone BRACE2011265. -- >1
791
204659_s_at AF124604.1 growth factor, augmenter of liver regeneration (ERV1 homolog, S. cerevisiae) GFER >1
792
200096_s_at AI862255 ATPase,H+ transporting,lysosomal9kDa, V0 subunit e ATP6V0E <1
793
227293_at AI264003 Homo sapiens cDNA FLJ34052 fis, clone FCBBF3000175. -- <1
794
228454_at AW663968 KIAA1795 protein MLR2 <1
795
209576_at AL049933.1 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 1 GNAI1 <1
796
201684_s_at BE783632 chromosome 14 open reading frame 92 C14orf92 >1
797
233068_at AK023264.1 EST, Weakly similar to POL2_MOUSE Retrovirus-related POL polyprotein [Contains: Reverse transcriptase ; Endonuclease] [M.musculus] -- <1
798
210532_s_at AF116639.1 chromosome 14 open reading frame 2 C14orf2 >1
799
211911_x_at L07950.1 major histocompatibility complex, class I, B HLA-B <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
800
208991_at AA634272 Homo sapiens cDNA FLJ35646 fis, clone SPLEN2012743. -- <1
801
226612_at AW572911 Homo sapiens cDNA FLJ25076 fis, clone CBL06117. -- <1
802
223068_at AV707345 echinoderm microtubule associated protein like 4 EML4 <1
803
227462_at BE889628 EST -- <1
804
224680_at AL539253 Homo sapiens, clone IMAGE:3866125, mRNA -- <1
805
244075_at BF224218 EST -- >1
806
228220_at AI627666 hypothetical protein BC014311 LOC115548 <1
807
225729_at AI870857 Homo sapiens cDNA: FLJ21560 fis, clone COL06410. -- <1
808
222771_s_at NM_016132.1 myelin gene expression factor 2 MEF-2 <1
809
209944_at BC000330.1 likely ortholog of mouse anotherpartner for ARF 1 APA1 >1
810
224565_at AK027191.1 Homo sapiens cDNA: FLJ23538 fis, clone LNG08010, highly similar to BETA2 Human MEN1 region clone epsilon/beta mRNA. -- <1
811
202439_s_at NM_000202.2 iduronate 2-sulfatase (Hunter syndrome) IDS <1
812
212051_at AK026913.1 Homo sapiens cDNA FLJ30463 fis, clone BRACE2009517. -- <1
813
211969_at NM_005348.1 heat shock 90kDa protein 1, alpha HSPCA >1
814
218209_s_at NRM_018170.1 hypothetical protein FLJ10656 P15RS <1
815
208877_at AF092132.1 Homo sapiens, clone IMAGE:6058556, mRNA -- <1
816
202043_s_at N_004595.1 spermine synthase SMS <1
817
209092_s_at AF061730.1 CGI-150 protein CGI-150 <1
818
225412_at AA761169 hypothetical protein FLJ14681 FLJ14681 <1
819
201173_x_at NM_006600.1 nuclear distribution gene C homolog (A. nidulans) NUDC >1
820
201409_s_at NM_002709.1 protein phosphatase 1, catalytic subunit, beta isoform PPP1CB <1
821
235594_at AL542578 EST, Weakly similar to cytokine receptorlike factor 2; cytokine receptor CRL2 precusor [Homo sapiens] [H.sapiens] -- >1
822
218269_at NM_013235.1 putative ribonuclease III RNASE3L >1
823
213892_s_at AA927724 adenine phosphoribosyltransferase APRT >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
824
209715_at L07515.1 chromobox homolog 5 (HP1 alpha homolog, Drosophila) CBX5 >1
825
215001_s_at AL161952.1 glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) GLUL <1
826
230011_at AW195720 hypothetical protein MGC40042 MGC40042 <1
827
202623_at NM_018453.1 chromosome 14 open reading frame 11 C14orf11 >1
828
226749_at AL582429 Homo sapiens, clone IMAGE:4791565, mRNA -- <1
829
209337_at AF063020.1 PC4 and SFRS1 interacting protein 2 PSIP2 <1
830
216526_x_at AK024836.1 major histocompatibility complex, class I, C HLA-C <1
831
212428_at AB002366.1 KIAA0368 protein PLAA0368 <1
832
222035_s_at AI984479 poly(A) polymerase alpha PAPOLA >1
833
223277_at BC000623.1 hypothetical protein FLJ20211 FLJ20211 >1
834
212807 _s_at BE742268 sortilin 1 SORT1 >1
835
212193_s_at BE881529 likely ortholog of mouse la related protein LARP <1
836
238642_at AW367571 Homo sapiens full length insert cDNA clone YB31A06 -- >1
837
216607_s_at U40053 -- -- <1
838
224851_at AW274756 Homo sapiens cDNA FLJ31360 fis, clone MESAN2000572. -- <1
839
53202_at AA402435 hypothetical protein MGC2821 MGC2821 <1
840
224435_at BC005871.1 hypothetical protein MGC4248 MGC4248 <1
841
200953_s_at NM_001759.1 cyclin D2 CCND2 <1
842
240237_at H23230 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20489 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
843
227801_at N90779 EST,Weakly similar to hypotheticalprotein FLJ20378 [Homo sapiens] [H. sapiens] -- <1
844
243217_at AI681312 EST -- <1
845
217742_s_at NM_016628.1 WW domain-containing adapter with a coiled-coil region WAC <1
846
206472_s_at NM_005078.1 transducin-like enhancer of split 3 (E(sp1) homolog, Drosophila) TLE3 <1
847
219100_at NM_024928.1 hypothetical protein FLJ22559 FLJ22559 <1
848
41856_at AL049370 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586D0918 (from clone DKFZp586D0918) -- >1
849
211921_x_at AF348514.1 prothymosin, alpha (gene sequence 28) PTMA >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
850
220597_s_at NM_018694.1 ADP-ribosylation-like factor 6 interacting protein 4 ARL6IP4 >1
851
202461_at NM_014239.1 eukaryotic translation initiation factor 2B, subunit 2 beta, 39kDa EIF2B2 >1
852
201734_at NRM_001829.1 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564I0463 (from clone DKFZp564I0463) -- <1
853
200644_at NM_023009.1 MARCKS-like protein MLP >1
854
223459_s_at BE222214 hypothetical protein FLJ20519 FLJ20519 >1
855
219215_s_at NM_017767.1 solute carrier family 39 (zinc transporter), member 4 SLC39A4 >1
856
201811_x_at NM_004844.1 SH3-domain binding protein 5 (BTKassociated) SH3BP5 <1
857
212264_s_at D87450.1 friend of EBNA2 FOE <1
858
218668_s_at NM_021183.1 hypothetical protein similar to small G proteins, especially RAP-2A LOC57826 <1
859
209418_s_at BC003615.1 chromosome 22 open reading frame 19 C22orf19 >1
860
203028_s_at NRM_000101.1 cytochrome b-245, alpha polypeptide CYBA >1
861
219410_at NM_018004.1 hypothetical protein FLJ10134 FLJ10134 <1
862
218220_at NM_021640.1 chromosome 12 open reading frame 10 C12orf10 >1
863
213154_s_at AB014599.1 coiled-coil protein BICD2 BICD2 >1
864
200920_s_at AL535380 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative BTG1 >1
865
214459_x_at M12679.1 Cw1 antigen HUMMHCW 1A <1
866
205955_at NM_018336.1 hypothetical protein FLJ11136 FLJ11136 >1
867
218482_at NM_020189.1 DC6 protein DC6 >1
868
203159_at NM_014905.1 glutaminase GLS <1
869
217823_s_at NM_016021.1 ubiquitin-conjugating enzyme E2, J1 (UBC6 homolog, yeast) UBE2J1 <1
870
225445_at AI332346 EST -- <1
871
211368_s_at U13700.1 caspase 1, apoptosis-related cysteine protease (interleukin 1, beta, convertase) CASP1 <1
872
227811_at AK000004.1 FGD1 family, member 3 FGD3 >1
873
204116_at NM_000206.1 interleukin 2 receptor, gamma (severe combined immunodeficiency) IL2RG <1
874
212120_at BF348067 ras-like protein TC10 TC10 <1
875
37986_at M60459 erythropoietin receptor EPOR <1
876
242692_at AI798758 EST -- >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
877
209644_x_at U38945.1 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) CDKN2A >1
878
228545_at AI016784 EST -- <1
879
201858_s_at J03223.1 proteoglycan 1, secretory granule PRG1 <1
880
215823_x_at U64661 EST, Highly similar to PAB1_HUMAN Polyadenylate-binding protein 1 (Poly(A)binding protein 1) (PABP 1) (PABP1) [H.sapiens] -- >1
881
201972_at AF113129.1 ATPase, H+ transporting, lysosomal 70kDa, V1 subunit A, isoform 1 ATP6V1A1 <1
882
201951_at NM_001627.1 activated leukocyte cell adhesion molecule ALCAM <1
883
201986_at NM_005121.1 thyroid hormone receptor-associated protein, 240 kDa subunit TRAP240 <1
884
202393_s_at NM_005655.1 TGFB inducible early growth response TIEG >1
885
212118_at NM_006510.1 ret finger protein RFP <1
886
225910_at BF514723 hypothetical protein LOC284019 LOC284019 <1
887
218795_at NM_016361.1 lysophosphatidic acid phosphatase ACP6 >1
888
204985_s_at NM_024108.1 hypothetical protein MGC2650 MGC2650 >1
889
217436_x_at M80469 -- -- <1
890
215690_x_at AL157437.1 GPAA1P anchor attachment protein 1 homolog (yeast) GPAA1 >1
891
208683_at M23254.1 calpain 2, (m/II) large subunit CAPN2 <1
892
223638_at AL136890.1 hypothetical protein DKFZp434D177 DKFZp434D 177 <1
893
218079_s_at NM_024835.1 C3HC4-type zinc finger protein LZK1 <1
894
209250_at BC000961.2 degenerative spermatocyte homolog, lipid desaturase (Drosophila) DEGS <1
895
238724_at R63824 EST -- >1
896
212809_at AA152202 hypothetical protein FLJ14639 FLJ14639 >1
897
222391_at AL080250 hypothetical protein FLJ10856 FLJ10856 <1
898
209533_s_at AF145020.1 phospholipase A2-activating protein PLAA <1
899
218205_s_at NM_017572.1 MAP kinase-interacting serine/threonine kinase 2 MKNK2 >1
900
232174_at AA480392 Homo sapiens clone 24838 mRNA sequence -- >1
901
201068_s_at NM_002803.1 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, ATPase, 2 PSMC2 <1
902
218573_at NM_0 14061.1 APR-1 protein MAGEH1 <1
903
216272_x_at AF209931.1 hypothetical protein FLJ13511 7h3 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
904
222309_at AW972292 EST -- >1
905
226461_at AA204719 homeo box B9 HOXB9 >1
906
214449_s_at NM_012249.1 ras-like protein TC10 TC10 <1
907
217880_at AI203880 cell division cycle 27 CDC27 <1
908
213238_at AI478147 ATPase, Class V, type 10D ATP10D <1
909
228464_at AI651510 EST, Weakly similar to T12486 hypothetical protein DKFZp566H033.1 -human [H.sapiens] -- <1
910
203157_s_at AB020645.1 glutaminase GLS <1
911
204547_at NM_006822.1 RAB40B, member RAS oncogene family RAB40B >1
912
203067_at NM_003477.1 E3-binding protein PDX1 <1
913
228289_at AI131537 adenylate cyclase 7 ADCY7 <1
914
217955_at NM_015367.1 BCL2-like 13 (apoptosis facilitator) BCL2L13 <1
915
201768_s_at BC004467.1 enthoprotin ENTH <1
916
217832_at NM_006372.1 NS1-associated protein 1 NSAP1 <1
917
226923_at AW205790 hypothetical protein FLJ39514 FLJ39514 <1
918
217939_s_at NM_017657.1 hypothetical protein FLJ20080 FLJ20080 <1
919
244732_at R06827 Homo sapiens, clone IMAGE:5276307, mRNA -- >1
920
221718_s_at M90360.1 A kinase (PRKA) anchor protein 13 AKAP13 >1
921
218970_s_at NM_015960.1 CGI-32 protein CGI-32 <1
922
214259_s_at AW074911 aldo-keto reductase family 7, member A2 (aflatoxin aldehyde reductase) AKR7A2 >1
923
204020_at BF739943 purine-rich element binding protein A PURA <1
924
205565_s_at NM_000144.1 Friedreich ataxia FRDA <1
925
218768_at NM_020401.1 nuclear pore complex protein NUP107 >1
926
202011_at NM_003257.1 tight junction protein 1 (zona occludens 1) TJP1 <1
927
211423_s_at D85181.1 sterol-C5-desaturase (ERG3 delta-5desaturase homolog, fungal)-like SC5DL <1
928
202738_s_at BG149218 phosphorylase kinase, beta PHKB <1
929
228697_at AW731710 histidine triad nucleotide binding protein 3 HINT3 <1
930
225317_at AL574669 hypothetical protein MGC2404 MGC2404 >1
931
217368_at X69909 -- -- >1
932
201393_s_at NM_000876.1 insulin-like growth factor 2 receptor IGF2R <1
933
205158_at NM_002937.1 ribonuclease, RNase A family, 4 RNASE4 <1
934
200734_s_at BG341906 ADP-ribosylation factor 3 ARF3 >1
935
239586_at AA085776 hypothetical protein MGC14128 MGC14128 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
936
225216_at AI590719 Homo sapiens cDNA: FLJ21191 fis, clone COL00104. -- <1
937
203373_at NM_003877.1 suppressor of cytokine signaling 2 SOCS2 >1
938
218003_s_at NM_002013.1 FK506 binding protein 3, 25kDa FKBP3 >1
939
208296_x_at NM_014350.1 TNF-induced protein GG2-1 <1
940
217716_s_at NM_013336.1 protein transport protein SEC61 alpha subunit isoform 1 SEC61A1 <1
941
202028_s_at BC000603.1 ribosomal protein L38 RPL38 >1
942
218231_at NM_017567.1 N-acetylglucosamine kinase NAGK <1
943
211528_x_at M90685.1 HLA-G histocompatibility antigen, class I, G HLA-G <1
944
203142_s_at NM_003664.1 adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit AP3B1 <1
945
230597_at AI963203 solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 3 SLC7A3 >1
946
200864_s_at NM_004663.1 RAB11A, member RAS oncogene family RAB11A <1
947
205541_s_at NM_018094.1 G1 to S phase transition 2 GSPT2 <1
948
209267_s_at AB040120.1 BCG-induced gene in monocytes, clone 103 BIGM103 <1
949
207428_x_at NM_001787.1 cell division cycle 2-like 1 (PITSLRE proteins) CDC2L1 >1
950
205801_s_at NM_015376.1 guanine nucleotide exchange factor for Rap 1 GRP3 <1
951
228614_at AW182614 hypothetical protein LOC205251 LOC205251 <1
952
230261_at AA552969 Homo sapiens, clone IMAGE:4816784, mRNA -- <1
953
229194_at AL045882 Homo sapiens, clone IMAGE:5273745, mRNA -- <1
954
224951_at BE348305 hypothetical protein MGC45411 LOC91012 >1
955
230026_at N74662 mitochondrial ribosomal protein L43 MRPL43 >1
956
217975_at NM_016303.1 pp21 homolog LOC51186 <1
957
212714_at AL050205.1 c-Mpl binding protein LOC113251 <1
958
212990_at AB020717.1 synaptojanin 1 SYNJ1 <1
959
211356_x_at U66495.1 leptin receptor LEPR <1
960
241342_at BG288115 hypothetical protein BC017881 LOC157378 >1
961
239891_x_at AA001052 EST, Weakly similar to RB10_HUMAN Rasrelated protein Rab-10 [H.sapiens] -- <1
962
214672_at AB023215.1 KIAA0998 protein KIAA0998 >1
963
201628_s_at NM_006570.1 Ras-related GTP-binding protein RAGA <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
964
232761_at AL117381 cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 COX4I2 >1
965
233164_x_at AK026955.1 hypothetical protein DKFZp547E052 DKFZp547E 052 <1
966
200077_s_at D87914.1 ornithine decarboxylase antizyme 1 OAZ1 >1
967
219549_s_at NM_006054.1 reticulon 3 RTN3 <1
968
203560_at NM_003878.1 gamma-glutamyl hydrolase (conjugase, folylpolygammaglutamyl hydrolase) GGH >1
969
217923_at NM_012392.1 PEF protein with a long N-terminal hydrophobic domain (peflin) PEF <1
970
201862_s_at NM_004735.1 leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 1 LRRFIP1 <1
971
223400_s_at AF197569.1 polybromo 1 PB1 <1
972
AFFXM27830_M_ at M27830 -- -- >1
973
41220_at AB023208 MLL septin-like fusion MSF >1
974
209276_s_at AF162769.1 glutaredoxin (thioltransferase) GLRX <1
975
207627_s_at NM_005653.1 transcription factor CP2 TFCP2 <1
976
204785_x_at NM_000874.1 interferon (alpha, beta and omega) receptor 2 IFNAR2 >1
977
222615_s_at AW206812 hypothetical protein FLJ13902 FLJ13902 >1
978
200949_x_at NM_001023.1 ribosomal protein S20 RPS20 >1
979
217192_s_at AL022067 PR domain containing 1, with ZNF domain PRDM1 >1
980
235792_x_at AU154663 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564L222 (from clone DKFZp564L222) -- <1
981
213857_s_at BG230614 Homo sapiens, clone IMAGE:4822825, mRNA -- <1
982
235507_at AA461195 similar to hypothetical protein FLJ10883 LOC115294 >1
983
218191_s_at NM_018368.1 hypothetical protein FLJ11240 FLJ11240 <1
984
200649_at BC002356.1 nucleobindin 1 NUCB1 <1
985
210260_s_at BC005352.1 TNF-induced protein GG2-1 <1
986
209513_s_at BC004331.1 hypothetical protein MGC10940 MGC10940 <1
987
211801_x_at AF329637.1 mitofusin 1 MFN1 <1
988
206875_s_at NM_014720.1 Ste20-related serine/threonine kinase SLK <1
989
39705_at AB014600 SIN3 homolog B, transcriptional regulator (yeast) SIN3B <1
990
203658_at BC001689.1 solute carrier family 25 (carnitine/acylcarnitine translocase), member 20 SLC25A20 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
991
235566_at AW591660 Homo sapiens cDNA FLJ39046 fis, clone NT2RP7010612. -- <1
992
205089_at NM_003416.1 zinc finger protein 7 (KOX 4, clone HF.16) ZNF7 >1
993
212040_at AK025557.1 Homo sapiens, clone IMAGE:6057297, mRNA -- <1
994
210962_s_at AB019691.1 A kinase (PRKA) anchor protein (yotiao) 9 AKAP9 <1
995
203053_at NM_005872.1 breast carcinoma amplified sequence 2 BCAS2 >1
996
233867_at AK000119.1 EST,Moderately similarto KIAA0737gene product [Homo sapiens] [H.sapiens] -- >1
997
200993_at AL137335.1 EST -- <1
998
204328_at NM_007267.2 epidermodysplasia verruciformis 1 EVER1 >1
999
212926_at AB011166.1 SMC5 structural maintenance of chromosomes 5-like 1 (yeast) SMC5L1 >1
1000
229353_s_at AW515443 similar to rat nuclear ubiquitous casein kinase 2 NUCKS >1
1001
212455_at N36997 KIAA1966 protein KIAA1966 <1
1002
202025_x_at NM_001607.2 acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1 (peroxisomal 3-oxoacyl-Coenzyme A thiolase) ACAA1 >1
1003
235009_at AI049791 hypothetical protein FLJ33215 FLJ33215 >1
1004
218306_s_at NM_003922.1 hect (homologous to the E6-AP (UBE3A) carboxyl terminus) domain and RCC1 (CHC1)-like domain (RLD) 1 HERC1 <1
1005
225592_at D81048 nurim (nuclear envelope membrane protein) NRM >1
1006
238604_at AA768884 Homo sapiens cDNA FLJ25559 fis, clone JTH02834. -- <1
1007
202264_s_at NM_006114.1 translocase of outer mitochondrial membrane 40 homolog (yeast) TOMM40 >1
1008
239258_at BE551407 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20234 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
1009
210538_s_at U37546.1 baculoviral IAP repeat-containing 3 BIRC3 <1
1010
202545_at NM_006254.1 protein kinase C, delta PRKCD <1
1011
212622_at D26067.1 KIAA0033 protein KIAA0033 <1
1012
207431_s_at NM_003676.1 degenerative spermatocyte homolog, lipid desaturase (Drosophila) DEGS <1
1013
218549_s_at NM_016033.1 CGI-90 protein CGI-90 >1
1014
225058_at AL365404.1 G protein-coupled receptor 108 GPR108 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1015
224847_at AW274756 Homo sapiens cDNA FLJ20653 fis, clone KAT01739. -- <1
1016
222024_s_at AK022014.1 A kinase (PRKA) anchor protein 13 AKAP13 >1
1017
208882_s_at U69567 progestin induced protein DD5 >1
1018
208937_s_at D13889.1 inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein ID1 >1
1019
200857_s_at NM_006311.1 nuclear receptor co-repressor 1 NCOR1 <1
1020
219972_s_at NM_022495.1 chromosome 14 open reading frame 135 C14orf135 >1
1021
226191_at AW139538 EST, Highly similar to SMD1_HUMAN Small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 (snRNP core protein D1) (Sm-D1) (Sm-D autoantigen) [H.sapiens] -- <1
1022
222129_at AK026155.1 hypothetical protein MGC3035 MGC3035 <1
1023
201668_x_at AW163148 myristoylated alanine-richprotein kinaseC substrate MARCKS >1
1024
208549_x_at NRM_016171.1 prothymosin a14 LOC51685 >1
1025
242241_x_at R66713 EST -- >1
1026
211671_s_at U01351.1 nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 (glucocorticoid receptor) NR3C1 <1
1027
221787_at AF055030.1 PHD zinc finger protein XAP135 XAP135 <1
1028
228600_x_at BE220330 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp686F0810 (from clone DKFZp686F0810) -- <1
1029
213620_s_at AA126728 intercellular adhesion molecule 2 ICAM2 <1
1030
204267_x_at NM_004203.1 membrane-associated tyrosine-and threonine-specific cdc2-inhibitory kinase PKMYT1 >1
1031
205443_at NM_003082.1 small nuclear RNA activating complex, polypeptide 1, 43kDa SNAPC1 >1
1032
218408_at NM_012456.1 translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast) TIMM10 >1
1033
221897_at AA205660 tripartite motif-containing 52 TRIM52 <1
1034
201970_s_at NM_002482.1 nuclear autoantigenic sperm protein (histone-binding) NASP >1
1035
marcadores AK024739.1 CTCL tumor antigen L14-2 FLJ10188 <1
1036
228549_at AI491983 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20378 [Homo sapiens] [H. sapiens] -- <1
1037
211404_s_at BC004371.1 amyloid beta (A4) precursor-like protein 2 APLP2 >1
1038
218905_at NM_017864.1 hypothetical protein FLJ20530 FLJ20530 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1039
203774_at NM_000254.1 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase MTR <1
1040
200759_x_at NM_003204.1 nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 1 NFE2L1 <1
1041
242674_at T82467 Homo sapiens cDNA FLJ41014 fis, clone UTERU2018674. -- >1
1042
AFFX-HSAC07/XO 0351_M_at X00351 actin, beta ACTB <1
1043
201025_at NM_015904.1 translation initiation factor IF2 IF2 <1
1044
226344_at AI741051 KIAA1789 protein KIAA1789 <1
1045
227854_at BE620258 hypothetical protein FLJ10335 FLJ10335 <1
1046
220202_s_at NM_018835.1 membrane-associated nucleic acid binding protein MNAB <1
1047
203158_s_at AF097493.1 glutaminase GLS <1
1048
233186_s_at AK001039.1 BTG3 associated nuclear protein BANP >1
1049
205569_at NM_014398.1 lysosomal-associated membrane protein 3 LAMP3 <1
1050
222680_s_at AK001261.1 RA-regulated nuclear matrix-associated protein RAMP >1
1051
208523_x_at NM_003525.1 histone 1, H2bi HIST1H2BI >1
1052
207761_s_at NM_014033.1 DKFZP586A0522 protein DKFZP586A 0522 <1
1053
220547_s_at NM_019054.1 hypothetical protein MGC5560 MGC5560 <1
1054
224912_at BE205790 tetratricopeptide repeat domain 7 TTC7 <1
1055
211367_s_at U13699.1 caspase 1, apoptosis-related cysteine protease (interleukin 1, beta, convertase) CASP1 <1
1056
209376_x_at AW084759 splicing factor, arginine/serine-rich 2, interacting protein SFRS2IP >1
1057
213932_x_at AI923492 major histocompatibility complex, class I, A HLA-A <1
1058
202261_at NM_005997.1 transcription factor-like 1 TCFL1 >1
1059
213811_x_at BG393795 transcription factor 3(E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47) TCF3 >1
1060
212833_at M74089.1 hypothetical protein BC017169 LOC91137 <1
1061
216540_at X61072.1 T cell receptor alpha locus TRA@ >1
1062
215284_at AF070575.1 Homo sapiens clone 24407 mRNA sequence -- <1
1063
239395_at AA835887 Homo sapiens, clone IMAGE:5286379, mRNA -- >1
1064
209388_at BC000927.1 poly(A) polymerase alpha PAPOLA >1
1065
235038_at BF665176 HIV-1 rev binding protein 2 HRB2 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1066
235745_at AV704183 hypothetical protein FLJ30999 FLJ30999 <1
1067
242048_at BE905316 EST -- >1
1068
239250_at BE966038 hypothetical protein LOC147947 LOC147947 >1
1069
213828_x_at AA477655 H3 histone, family 3A H3F3A >1
1070
222593_s_at AA584308 hypothetical protein FLJ13117 FLJ13117 >1
1071
229075_at AI754871 EST -- <1
1072
219978_s_at NM_018454.1 nucleolar protein ANKT ANKT >1
1073
211676_s_at AF056979.1 interferon gamma receptor 1 IFNGR1 <1
1074
234347_s_at AF038554.1 density-regulated protein DENR >1
1075
209066_x_at M26700.1 ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein UQCRB >1
1076
241435_at AA702930 EST -- >1
1077
219507_at NM_016625.1 hypothetical protein LOC51319 LOC51319 >1
1078
202284_s_at NM_000389.1 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) CDKN1A <1
1079
218732_at NM_016077.1 CGI-147 protein CGI-147 <1
1080
207654_x_at NM_001938.1 down-regulator of transcription 1, TBPbinding (negative cofactor 2) DR1 >1
1081
226671_at AI150000 Homo sapiens, clone IMAGE:4797120, mRNA -- <1
1082
227637_at AV712694 transcription factor CP2 TFCP2 >1
1083
201580_s_at AL544094 hypothetical protein Dr971N18.2 DJ971N18.2 <1
1084
226580_at AA779684 breast cancer metastasis-suppressor 1 BRMS1 >1
1085
224312_x_at BC000675.1 hypothetical protein FLJ20542 FLJ20542 >1
1086
227425_at AI984607 Homo sapiens cDNA FLJ40165 fis, clone TESTI2015962. -- <1
1087
202643_s_at AI738896 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 TNFAIP3 <1
1088
227080_at AW003092 Homo sapiens cDNA: FLJ23366 fis, clone HEP15665. -- >1
1089
235353_at AI887866 KIAA0746 protein KIAA0746 >1
1090
209534_x_at BF222823 A kinase (PRKA) anchor protein 13 AKAP13 >1
1091
235103_at AA029155 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp686H1529 (from clone DKFZp686H1529) -- <1
1092
235474_at AI241810 EST, Weakly similar to T31613 hypothetical protein Y50E8A.i -Caenorhabditis elegans [C.elegans] -- <1
1093
218662_s_at NM_022346.1 chromosome condensation protein G HCAP-G >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1094
208668_x_at BC003689.1 high-mobility group nucleosomal binding domain 2 HMGN2 >1
1095
214919_s_at R39094 Homo sapiens, clone IMAGE:3866125, mRNA -- <1
1096
218976_at NM_021800.1 J domain containing protein 1 JDP1 <1
1097
241955_at BE243270 EST, Weakly similar to C34D4.14.p [Caenorhabditis elegans] [C.elegans] -- >1
1098
201138_s_at BG532929 Sjogren syndrome antigen B (autoantigen La) SSB >1
1099
209056_s_at AW268817 CDC5 cell division cycle 5-like (S. pombe) CDC5L >1
1100
219384_s_at NM_012091.2 adenosine deaminase, tRNA-specific 1 ADAT1 <1
1101
212886_at AL080169.1 DKFZP434C171 protein DKFZP434C 171 <1
1102
226773_at AW290940 Homo sapiens cDNA FLJ35131 fis, clone PLACE6008824. -- <1
1103
215756_at AU153979 Homo sapiens cDNA FLJ14231 fis, clone NT2RP3004470. -- >1
1104
227994_x_at AA548838 chromosome 20 open reading frame 149 C20orf149 >1
1105
218120_s_at D21243.1 heme oxygenase (decycling) 2 HMOX2 <1
1106
225092_at AL550977 rabaptin-5 RAB5EP <1
1107
220696_at NM_014129.1 PRO0478 protein PRO0478 >1
1108
210170_at BC001017.1 alpha-actinin-2-associated LIM protein ALP >1
1109
224648_at AI860946 vasculin DKFZp761C 169 <1
1110
212830_at BF110421 EGF-like-domain, multiple 5 EGFL5 <1
1111
213410_at AL050102.1 DKFZp586F1019 protein DKFZp586F 1019 >1
1112
212718_at BG110231 poly(A) polymerase alpha PAPOLA >1
1113
203173_s_at AW080196 esophageal cancer associated protein MGC16824 >1
1114
229520_s_at BF060678 chromosome 14 open reading frame 118 C14orf118 >1
1115
203974_at NM_012080.1 family with sequence similarity 16, member A, X-linked FAM16AX <1
1116
230075_at AV724323 RAB39B, member RAS oncogene family RAB39B <1
1117
225880_at BF676081 Homo sapiens cDNA FLJ11174 fis, clone PLACE1007367. -- <1
1118
222891_s_at AI912275 B-cell CLL/lymphoma 11A (zinc finger protein) BCL11A <1
1119
213494_s_at AA748649 YY1 transcription factor YY1 >1
1120
211366_x_at U13698.1 caspase 1, apoptosis-related cysteine protease (interleukin 1, beta, convertase) CASP1 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1121
221995_s_at BF195165 mitochondrial ribosomal protein 63 MRP63 >1
1122
203322_at NM_014913.1 KIA.A0863 protein KIAA0863 <1
1123
243051_at AW135412 EST -- >1
1124
207245_at NM_001077.1 UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B 17 UGT2B17 <1
1125
225651_at BF431962 hypothetical protein FLJ25157 FLJ25157 <1
1126
232288_at AK026209.1 Homo sapiens cDNA: FLJ22556 fis, clone HSI01326. -- <1
1127
218701_at NM_016027.1 CGI-83 protein CGI-83 >1
1128
201102_s_at NM_002626.1 phosphofructokinase, liver PFKL >1
1129
210458_s_at BC003388.1 TRAF family member-associated NFKB activator TANK <1
1130
226787_at BF966015 zinc finger protein 18 (KOX 11) ZNF18 <1
1131
218679_s_at NM_016208.1 vacuolar protein sorting 28 (yeast) VPS28 >1
1132
212232_at AB023231.1 formin binding protein 4 FNBP4 <1
1133
212221_x_at AL117536.1 Homo sapiens, clone IMAGE:5278680, mRNA -- <1
1134
200995_at AL137335.1 importin 7 IPO7 <1
1135
229549_at AA868461 calumenin CALU <1
1136
227239_at AV734839 down-regulated by Ctnnb1, a DRCTNNB1 A <1
1137
210716_s_at M97501.1 restin (Reed-Steinberg cell-expressed intermediate filament-associated protein) RSN <1
1138
235170_at T52999 hypothetical protein FLJ34299 FLJ34299 >1
1139
216841_s_at X15132.1 superoxide dismutase 2, mitochondrial SOD2 >1
1140
204683_at NM_000873.2 intercellular adhesion molecule 2 ICAM2 <1
1141
228829_at AI279868 activating transcription factor 7 ATF7 >1
1142
212902_at BE645231 SEC24 related gene family, member A (S. cerevisiae) SEC24A <1
1143
212542_s_at BF224151 pleckstrin homology domain interacting protein PHIP >1
1144
201971_s_at NM_001690.1 ATPase, H+ transporting, lysosomal 70kDa, V1 subunit A, isoform 1 ATP6V1A1 <1
1145
210266_s_at AF220137.1 tripartite motif-containing 33 TRIM33 >1
1146
222426_at BG499947 mitogen-activated protein kinase associated protein 1 MAPKAP1 >1
1147
201840_at NM_006156.1 neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 8 NEDD8 >1
1148
225282_at AL137764.1 hypothetical protein AL133206 LOC64744 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1149
231931_at AL355710.1 Homo sapiens EST from clone 112590, full insert -- >1
1150
202271_at AB007952.1 KIAA0483 protein KIAA0483 <1
1151
204215_at NM_024315.1 hypothetical protein MGC4175 MGC4175 <1
1152
213127_s_at BG230758 mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 8 homolog (yeast) MED8 <1
1153
217826_s_at NM_016021.1 ubiquitin-conjugating enzyme E2, J1 (UBC6 homolog, yeast) UBE2J1 <1
1154
203943_at NM_004798.1 kinesin family member 3B KIF3B <1
1155
209384_at AA176833 proline synthetase co-transcribed homolog (bacterial) PROSC <1
1156
228469_at BF431902 peptidylprolyl isomerase D (cyclophilin D) PPID <1
1157
209093_s_at K02920.1 glucosidase, beta; acid (includes glucosylceramidase) GBA >1
1158
239714_at AA780063 EST -- >1
1159
239487_at AI743261 EST -- <1
1160
204565_at NM_018473.1 uncharacterized hypothalamus protein HT012 HT012 <1
1161
201311_s_at AL515318 SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like SH3BGRL <1
1162
235606_at AA417117 Homo sapiens cDNA FLJ31372 fis, clone NB9N42000281. -- <1
1163
201952_at NM_001627.1 activated leukocyte cell adhesion molecule ALCAM <1
1164
212223_at AL117536.1 Homo sapiens, clone IMAGE:5278680, mRNA -- <1
1165
218084_x_at NM_014164.2 FXYD domain containing ion transport regulator 5 FXYD5 <1
1166
223559_s_at AF161411.2 HSPC043 protein HSPC043 <1
1167
208445_s_at NM_023005.1 bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1B BAZ1B <1
1168
218423_x_at NM_016516.1 tumor antigen SLP-8p HCC8 <1
1169
203320_at NM_005475.1 lymphocyte adaptor protein LNK <1
1170
201618_x_at NM_003801.2 GPAA1P anchor attachment protein 1 homolog (yeast) GPAA1 >1
1171
229861_at N66669 general transcription factor IIH, polypeptide 3, 34kDa GTF2H3 <1
1172
203420_at NM_016255.1 family with sequence similarity 8, member A1 FAM8A1 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1173
239209_at AA826931 regenerating islet-derived 1 alpha (pancreatic stone protein, pancreatic thread protein) REG1A >1
1174
206974_s_at AL138761 Ste20-related serine/threonine kinase SLK <1
1175
227988_s_at AW629014 chorea acanthocytosis CHAC <1
1176
238346_s_at AW973003 nuclear receptor coactivator 6 interacting protein NCOA6IP >1
1177
203707_at NM_005741.1 zinc finger protein 263 ZNF263 >1
1178
222790_s_at BE888593 hypothetical protein FLJ11220 FLJ11220 >1
1179
207734_at NM_017773.1 hypothetical protein FLJ20340 LAX <1
1180
201859_at NM_002727.1 proteoglycan 1, secretory granule PRG1 <1
1181
216250_s_at X77598.1 leupaxin LPXN <1
1182
217846_at NM_005051.1 glutaminyl-tRNA synthetase QARS >1
1183
202862_at NM_000137.1 fumarylacetoacetate hydrolase (fumarylacetoacetase) FAH <1
1184
209061_at AF012108.1 similar to glucosamine-6-sulfatases SULF2 <1
1185
203970_s_at NM_003630.1 peroxisomal biogenesis factor 3 PEX3 <1
1186
235067_at D81987 Homo sapiens, clone MGC:27281 IMAGE:4656464, mRNA, complete cds -- <1
1187
228528_at AI927692 EST -- <1
1188
218577_at NM_017768.1 hypothetical protein FLJ20331 FLJ20331 <1
1189
211089_s_at Z25434.1 NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 3 NEK3 <1
1190
221778_at BE217882 KIAA1718 protein KIAA1718 <1
1191
207981_s_at NM_001438.1 estrogen-related receptor gamma ESRRG <1
1192
219939_s_at NM_007158.1 NRAS-related gene D1S155E >1
1193
201084_s_at NM_014739.1 Bcl-2-associated transcription factor BTF <1
1194
209452_s_at AF035824.1 vesicle transport through interaction with t-SNAREs homolog 1B (yeast) VTI1B >1
1195
214527_s_at AB041836.1 polyglutamine binding protein 1 PQBP1 <1
1196
222243_s_at AB051450.1 transducer of ERBB2, 2 TOB2 >1
1197
204192_at NM_001774.1 CD37 antigen CD37 <1
1198
217775_s_at NM_016026.1 retinol dehydrogenase 11 (all-trans and 9cis) RDH11 >1
1199
227685_at AI767750 Homo sapiens cDNA FLJ39046 fis, clone NT2RP7010612. -- <1
1200
225731_at AB033049.1 KIAA1223 protein KIAA1223 <1
1201
209475_at AF106069.1 ubiquitin specific protease 15 USP15 <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1202
213024_at BF593908 TATA element modulatory factor 1 TMF1 <1
1203
221508_at AF181985.1 STE20-like kinase JIK <1
1204
212242_at AL565074 tubulin, alpha 1 (testis specific) TUBA1 <1
1205
200607_s_at BG289967 RAD21 homolog (S. pombe) RAD21 >1
1206
213671_s_at AA621558 methionine-tRNA synthetase MARS >1
1207
201697_s_at NM_001379.1 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1 DNMT1 >1
1208
202105_at NM_001551.1 immunoglobulin (CD79A) binding protein 1 IGBP1 >1
1209
241370_at AA278233 Homo sapiens cDNA FLJ37785 fis, clone BRHIP2028330. -- >1
1210
220368_s_at NM_017936.1 hypothetical protein FLJ20707 FLJ20707 >1
1211
226710_at AI199072 ribosomal protein S3A RPS3A >1
1212
214317_x_at BE348997 ribosomal protein S9 RPS9 >1
1213
228341_at AI809108 Homo sapiens cDNA FLJ36248 fis, clone THYMU2001989. -- <1
1214
204523_at NM_003440.1 zinc finger protein 140 (clone pHZ-39) ZNF140 <1
1215
212465_at AA524500 hypothetical protein FLJ23027 FLJ23027 >1
1216
203606_at NM_004553.1 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 6, 13kDa (NADH-coenzyme Q reductase) NDUFS6 >1
1217
211529_x_at M90684.1 HLA-G histocompatibility antigen, class I, G HLA-G <1
1218
211517_s_at M96651.1 interleukin 5 receptor, alpha IL5RA <1
1219
220946_s_at NM_014159.1 huntingtin interacting protein B HYPB >1
1220
204350_s_at NM_004270.1 cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 9, 33kDa CRSP9 <1
1221
39582_at AL050166 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586D1122 (from clone DKFZp586D1122) -- <1
1222
204645_at NM_001241.1 cyclin T2 CCNT2 <1
1223
211136_s_at BC004865.1 cleft lip and palate associated transmembrane protein 1 CLPTM1 <1
1224
229312_s_at BF434321 protein kinase anchoring protein GKAP42 GKAP42 >1
1225
226504_at AA522720 Homo sapiens, similar to CG12393 gene product, clone IMAGE:5188623, mRNA, partial cds -- >1
1226
221547_at BC000794.1 PRP18 pre-mRNA processing factor 18 homolog (yeast) PRPF18 <1
1227
238035_at N66313 EST -- <1
1228
213011_s_at BF116254 triosephosphate isomerase 1 TPI1 >1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1229
208718_at Z97056 Homo sapiens, clone IMAGE:5264473, mRNA -- <1
1230
204686_at NM_005544.1 insulin receptor substrate 1 IRS1 >1
1231
225763_at AI659418 hypothetical protein MGC21854 MGC21854 <1
1232
212643_at AI671747 chromosome 14 open reading frame 32 C14orf32 >1
1233
203060_s_at AF074331.1 3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate synthase 2 PAPSS2 <1
1234
206900_x_at NM_021047.1 zinc finger protein 253 ZNF253 <1
1235
225798_at AI990891 hypothetical protein DKFZp761K2222 DKFZp761K 2222 <1
1236
209619_at K01144.1 CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated) CD74 <1
1237
200996_at NM_005721.2 ARP3 actin-related protein 3 homolog (yeast) ACTR3 <1
1238
228150_at AI807478 regucalcin gene promotor region related protein RGPR <1
1239
218152_at NM_018200.1 high-mobility group 20A HMG20A >1
1240
202546_at NM_003761.1 vesicle-associated membrane protein 8 (endobrevin) VAMP8 <1
1241
218603_at NM_016217.1 hHDC for homolog of Drosophila headcase HDCL <1
1242
213793_s_at BE550452 homer homolog 1 (Drosophila) HOMER1 >1
1243
205917_at NM_003417.1 - -- <1
1244
218669_at NM_021183.1 hypothetical protein similar to small G proteins, especially RAP-2A LOC57826 <1
1245
226381_at AW450329 hypothetical protein FLJ20366 FLJ20366 <1
1246
211065_x_at BC006422.1 phosphofructokinase, liver PFKL >1
1247
224848_at AW274756 Homo sapiens cDNA FLJ20653 fis, clone KAT01739. -- <1
1248
212616_at AB002306.1 hypothetical protein MGC17528 MGC17528 <1
1249
232171_x_at AK001742.1 hypothetical protein DKFZp434G0522 DKFZp434G 0522 >1
1250
237181_at AI478850 EST -- >1
1251
204171_at NM_003161.1 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 1 RPS6KB1 <1
1252
201780_s_at NM_007282.1 ring finger protein 13 RNF13 <1
1253
215148_s_at AI141541 amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 3 (X11-like 2) APBA3 <1
1254
203359_s_at AL525412 c-myc binding protein MYCBP <1
Nº
Conjunto Sonda ID Sec. Derivada de (RefSeq/Acceso a Genbank) Titulo Símbolo Gen Peligro
1255
201788_at NM_007372.1 RNA helicase-related protein RNAHP <1
1256
235661_at T99553 EST -- <1
1257
202375_at NM_014822.1 SEC24 related gene family, member D (S. cerevisiae) SEC24D <1
1258
203491_s_at AI123527 KIAA0092 gene product KIAA0092 >1
1259
221989_at AW057781 ribosomal protein L10 RPL10 <1
1260
65630_at AI742455 SIPL protein SIPL <1
1261
214030_at BE501352 hypothetical protein DKFZp667G2110 DKFZp667G 2110 <1
1262
243552_at AW008914 EST -- >1
1263
214615_at NM_014499.1 purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 10 P2RY10 <1
1264
203404_at NM_014782.1 armadillo repeat protein ALEX2 ALEX2 <1
1265
212877_at AA284075 kinesin 2 60/70kDa KNS2 >1
1266
231059_x_at AI744643 SCAN domain containing 1 SCAND1 >1
1267
225681_at AA584310 collagen triple helix repeat containing 1 CTHRC1 >1
1268
227946_at AI955239 oxysterol binding protein-like 7 OSBPL7 >1
1269
221323_at NM_025218.1 UL16 binding protein 1 ULBP1 >1
1270
232431_at AI934556 Human glucocorticoid receptor alpha mRNA, variant 3’UTR -- <1
1271
32209_at AF052151 Mouse Mammary Turmor Virus Receptor homolog 1 MTVR1 <1
1272
201980_s_at NM_012425.2 Ras suppressor protein 1 RSU1 <1
1273
201558_at NM_003610.1 RAE1 RNA export 1 homolog (S. pombe) RAE1 >1
1274
221613_s_at AL136598.1 protein associated with PRK1 AWP1 <1
1275
243570_at AA921960 EST, Moderately similar to T12486 hypothetical protein DKFZp566H033.1 human [H.sapiens] -- <1
1276
214179_s_at H93013 nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 1 NFE2L1 <1
1277
224768_at AW451291 hypothetical protein FLJ10006 FLJ10006 <1
1278
227518_at AW051365 EST, Moderately similar to hypothetical protein FLJ20378 [Homo sapiens] [H. sapiens] -- <1
1279
218850_s_at NM_014240.1 LIM domains containing 1 LIMD1 >1
1280
201408_at AI186712 protein phosphatase 1, catalytic subunit, beta isoform PPP1CB <1
1281
214097_at AW024383 ribosomal protein S21 RPS21 >1
1282
242208_at AI634543 EST,Weakly similar to hypotheticalprotein FLJ20489 [Homo sapiens] [H.sapiens] -- <1
Aún más, la Tabla 3 expone marcadores que se expresan significativamente en muestras de mieloma de pacientes no respondedores cuya enfermedad es resistente (es decir, enfermedad progresiva) al tratamiento con bortezomib. Los marcadores identificados en la Tabla 3 se identificaron similarmente a los métodos descritos anteriormente para la Tabla 1. Estos marcadores servirán para distinguir pacientes resistentes al tratamiento de aquellos que serán tanto estables como sensibles al tratamiento.
TABLA 3 Marcadores de predicción en enfermedad progresiva
No.
Probeset _ID RefSec./ Acceso a Genbank Titulo Símbolo de Gen Unigen
1283
205124_ at NM_005919.1 MADS box transcription enhancer factor 2,polypeptideB (myocyte enhancerfactor 2B) MEF2B Hs.78881
1284
206626_x_at BC001003.2 synovial sarcoma, X breakpoint 1 SSX1 Hs.194759
34
224918_x_at AI220117 microsomal glutathione S-transferase 1 MGST1 Hs.355733
1285
206640_x_at NM_001477.1 G antigen 7B GAGE7 B Hs.251677
223
227174_at Z98443 Hs.86366
1286
227617_at BF315093 Weakly similar to MUC2_HUMAN Mucin 2 precursor Hs.22293
1287
207086_x_at NM_001474.1 G antigen 4 GAGE4 Hs.183199
1288
209732_at BC005254.1 Similar to C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced) CLECS F2 Hs.85201
1289
214596_at T15991 cholinergic receptor, muscarinic 3 CHRM3 Hs.7138
1290
202779_s_at NM_014501.1 ubiquitin carrier protein (E2-EPF) E2-EPF Hs.174070
1291
231568_at AI200804 similar to Proliferation-associated protein 2G4 (Cell cycle protein p38-2G4 homolog) Hs.98612
1292
207480_s_at NM_020149.1 TALE homeobox protein Meis2e MEIS2 Hs.283312
1293
230352_at AI392908 phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2 PRPS2 Hs.2910
1294
202411_at NM_005532.1 interferon, alpha-inducible protein 27 IFI27 Hs.278613
17
215733_ x_at AJ012833.1 CTL-recognized antigen on melanoma (CAMEL) CTAG2 Hs.87225
1295
243030_at AA211369 Hs.269493
18
210546_ x_at U87459.1 autoimmunogenic cancertestis antigen NY-ESO-1 CTAG1 Hs.167379
1296
202044_ at AU159484 glucocorticoid receptor DNA binding factor 1 GRLF1 Hs.102548
1297
217977_ at NM_016332. 1 selenoprotein X, 1 SEPX1 Hs.279623
1298
231000_ at BE350315 receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 ROR2 Hs.155585
1299
238587_ at AI927919 Nm23-phosphorylated unknown substrate Hs.187625
1300
239119_ at AW014374 Hs.144849
1301
236741_ at AW299463 Hs.208067
223
227174_ at Z98443 Hs.86366
No.
Probeset _ID RefSec./ Acceso a Genbank Titulo Símbolo de Gen Unigen
1302
206897_ at NM_003785. 2 G antigen, family B, 1 (prostate associated) GAGEB 1 Hs.128231
205
204836_ at NM_000170. 1 glycine dehydrogenase (decarboxylating; glycine decarboxylase, glycine cleavage system protein P) GLDC Hs.27
1303
208282_ x_at NM_020363. 1 deleted in azoospermia 2 DAZ2 Hs.283813
1304
216922_ x_at AF271088.1 deleted in azoospermia DAZ Hs.70936
1305
231771_ at AI694073 gap junction protein, beta 6 (connexin 30) GJB6 Hs.48956
267
231131_ at AA909330 weakly similar to GAR2 PROTEIN Hs.112765
1306
217007_s _at AK000667.1 a disintegrin and metalloproteinase domain 15 (metargidin) Hs.92208
1307
220445_s _at NM_004909. 1 taxol resistance associated gene 3 TRAG3 Hs.251377
1308
233216_ at AV741116 Hs.283933
1309
211323_s _at L38019.1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 ITPR1 Hs.198443
1310
224188_s _at BC001208.1 Similar to hypothetical protein LOC63929 Hs.182061
1311
213222_ at KIAA0581 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta 1 PLCB1 Hs.41143
1312
201897_s _at AF274941.1 CDC28 protein kinase 1 CKS1 Hs.77550
1313
206012_ at NM_003240. 1 endometrial bleeding associated factor (left-right determination, factor A; transforming growth factor beta superfamily) LEFTB Hs.25195
-
Clasificadores
Actualmente están disponibles diversos algoritmos que pueden usarse para clasificar muestras de paciente en grupos anteriormente definidos usando un conjunto dado de distintivos. Por tanto, puede usarse la combinación de marcadores seleccionados mediante el proceso de selección de distintivos en uno de los siguientes algoritmos de clasificación con el fin de obtener una ecuación de predicción en cuanto a si la muestra de paciente es sensible o resistente. Los clasificadores usados en la presente invención fueron: 1) Voto ponderado (“WV”); y 2) Combinación de distintivos umbral (“CTF”).
Se implementó el clasificador de voto ponderado como se describe por Golub et al., “Molecular Classification of Cancer: Class discovery and class prediction by marker expression monitoring.” Science, 286:531-537 (1999). Para el voto ponderado, el criterio de clasificación para cada distintivo usó la siguiente fórmula para el voto ponderado del distintivo j:
en la que zj representa el valor del logaritmo de la expresión para el distintivo jº en el conjunto. Para la clase indicada por el superíndice, x representa el valor medio del logaritmo de la expresión en el distintivo jº, y S representa la desviación estándar. El primer término a la derecha de la ecuación es la relación de señal con respecto a ruido (el peso dado a este distintivo en el voto ponderado), mientras que el término que se resta se llama el límite de decisión. Para determinar la predicción de clase, se suman los votos ponderados para todos los distintivos en el conjunto. Si el resultado es mayor que 0, entonces la predicción es clase R; de otro modo, la predicción es clase S. Para cada predicción, también se calcula una confianza. Para calcular la confianza, cada distintivo en el conjunto se marca como que está de acuerdo o en desacuerdo con la predicción de clase. Siendo νa la suma de los valores absolutos de los votos de los distintivos de acuerdo con la predicción de clase, y siendo νd la suma de los valores absolutos de
los votos en desacuerdo con la predicción de clase. Entonces la confianza de la predicción se define como:
El clasificador CTF elige primero un umbral en relación con el valor de expresión normalizada para cada distintivo. El umbral de CTF es el umbral de CBT dividido entre la puntuación de filtración del distintivo de CBT, cada uno de los cuales se describe anteriormente. Entonces, los valores de expresión se dividen entre este umbral, produciendo un “valor de expresión normalizado al umbral”. Los valores de expresión normalizados al umbral de los distintivos en el conjunto de marcadores o modelo se combinan entonces en un “valor combinado” usando uno de estos métodos: (1) promedio, (2) máximo. En realizaciones preferidas se usa el primer enfoque, promedio. Finalmente, se determina un umbral en relación con el valor combinado como el valor promedio de los valores combinados en la clase A, más algún número de desviaciones estándar de los valores combinados en la clase A. En realizaciones preferidas, el número de desviaciones estándar es 2. Usando la terminología introducida en la descripción del método de filtrado de distintivos CBT, muestras con un valor combinado por debajo de este umbral se clasifican en la clase A, y muestras con un valor combinado por encima de este umbral se clasifican en la clase B.
Selección de distintivos
La selección de distintivos es el proceso de determinar el mejor subconjunto de los 44.928 distintivos disponibles en el conjunto de datos, produciendo una combinación de distintivos, que forman un conjunto de marcadores o modelo, para clasificar pacientes en grupos sensibles y resistentes. La primera etapa es filtrar a los 100 marcadores principales, como se ha descrito anteriormente. A continuación, para construir los conjuntos de voto ponderado (WV) de marcadores, se usa un método estándar de selección de distintivos, la selección de distintivos directa secuencial (Dash y Liu, “Feature Selection for Classification”, Intelligent Data Analysis 1:131-156, 1997 1:131-156, 1997). Para la construcción de conjuntos de marcadores de CTF se utilizaron dos métodos: selección de los N principales marcadores puntuados por CBT (N<=100) y búsqueda exhaustiva de todos los modelos de uno y dos distintivos. Los presentes inventores describen ahora cómo cada uno de estos se aplica al conjunto de datos de los presentes inventores para seleccionar distintivos.
Para los modelos de WV se determinaron los 100 marcadores de SNR principales. La selección directa secuencial empieza sin marcadores en el conjunto.
En cada iteración se forma un nuevo conjunto de distintivos añadiendo un distintivo seleccionado por una función de evaluación. La iteración termina cuando no puede añadirse distintivo que mejore la función de evaluación. La función de evaluación tiene dos partes. La primera parte es el número de muestras correctamente predichas tanto (1) por el modelo construido en todas las muestras, como (2) en validación cruzada dejando uno fuera (Dash y Liu, 1997). Los empates en la primera parte de la función de evaluación se rompen por un valor igual a la suma de las confianzas de las predicciones correctas menos la suma de las confianzas de las predicciones incorrectas. Esta segunda parte de la función de evaluación favorece conjuntos que tienen mayor confianza y predicciones más correctas.
Se usó cada conjunto de sondas como modelo de un único marcador para predecir la respuesta a bortezomib. Se generaron múltiples conjuntos de marcadores por rondas de selección repetidas de distintivos, quitando cada vez los distintivos ya seleccionados. Se determinó la puntuación de cada modelo. Se seleccionó el conjunto de sondas que comprende el modelo de mayor puntuación.
Los restantes conjuntos de sondas se usaron uno a uno en un modelo junto con el (los) conjunto(s) de sondas ya seleccionado(s). A cada uno de estos modelos se le dio una puntuación. Si la puntuación del nuevo modelo no era superior a la puntuación de los marcadores ya seleccionados, entonces se detuvo la selección de marcadores, y el algoritmo continuó hasta la selección final interrumpiéndose momentáneamente y continuando con la selección de conjunto(s) adicional(es) (véase más adelante). De otro modo, el conjunto de sondas que se añadió a los marcadores ya seleccionados para obtener el modelo con la mayor puntuación se añadió a la lista de marcadores seleccionados, y el algoritmo vuelve a la selección de marcadores adicionales para mejorar la puntuación.
Tras la selección final en la que ningún marcador adicional mejora la puntuación, los marcadores seleccionados se interrumpen momentáneamente. Entonces se inicia la selección de marcadores como se ha descrito anteriormente. Este proceso se repite hasta que hay 5 conjuntos de marcadores seleccionados. Éstos se combinan en un conjunto de marcadores de predicción completo.
Para construir conjuntos de marcadores CTF, los 100 distintivos de CBT principales se consideran para su uso en conjuntos, y se evalúan exhaustivamente todos los conjuntos de uno y dos distintivos. La puntuación para un conjunto dado es el número de muestras de la clase B que está por encima del umbral de CTF (descrito anteriormente) para ese conjunto. Los empates entre conjuntos de marcadores de CTF se rompen por la mejor puntuación de CBT (descrita anteriormente) de cualquiera de los marcadores constituyentes en un conjunto.
Un ejemplo de un conjunto de marcadores de predicción de voto ponderado identificado usando los marcadores puntuados por WV y SNR se expone en Tabla 4. Este procedimiento es uno de los muchos descritos en el presente documento, además de otros conocidos en la técnica, que puede usarse para identificar y seleccionar marcadores para conjuntos que predicen la respuesta de inhibición del proteasoma en pacientes con cáncer. Este procedimiento es el mismo que el procedimiento usado en la validación cruzada para determinar la exactitud predictiva del método (véase Exactitud de la clasificación más adelante):
TABLA 4: Conjunto de marcadores de predicción de voto ponderado
No.
Frontera de decisión Peso Conjunto prueba ID Título Símbolo del Gen
143
0.5177 0.8165 200965_s_at actin binding LIM protein 1 ABLIM1
141
0.3222 0.9174 234428_at Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564I1316 (from clone DKFZp564I1316) --
221
1.1666 -0.8281 223996_s_at mitochondrial ribosomal protein L30 MRPL30
94
0.9622 -0.8998 222555_s_at mitochondrial ribosomal protein L44 MRPL44
147
0.29 0.9019 220572_at hypothetical protein DKFZp547G183 DKFZp547 G183
242
0.8798 -0.739 225647_s_at cathepsin C CTSC
180
0.3451 0.8046 227692_at guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 1 GNAI1
279
0.8811 0.7428 221223_x_at cytokine inducible SH2-containing protein CISH
163
0.4398 0.8189 204287_at synaptogyrin 1 SYNGR1
38
0.4805 0.8322 216835_s_at docking protein 1, 62kDa (downstream of tyrosine kinase 1) DOK1
277
1.0222 -0.7718 222713_s_at Fanconi anemia, complementation group F FANCF
138
0.3196 0.9477 212109_at HN1 like HN1L
36
0.4335 0.897 239476_at Homo sapiens cDNA FLJ36491 fis, clone THYMU2018197. --
154
0.5779 -0.8579 218438_s_at endothelial-derived gene 1 EG1
83
0.9308 -0.9007 201575_at SKI-interacting protein SNW1
137
2.121 -0.9414 200043_at enhancer of rudimentary homolog (Drosophila) ERH
165
0.8934 -0.8614 210250_x_at adenylosuccinate lyase ADSL
251
1.5602 -0.7928 208642_s_at X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (double-strand-break rejoining; Ku autoantigen, 80kDa) XRCC5
120
0.3485 0.8612 217687_at adenylate cyclase 2 (brain) ADCY2
152
1.3737 -0.8783 201682_at peptidase (mitochondrial processing) beta PMPCB
96
1.2482 -0.8447 222530_s_at McKusick-Kaufman syndrome MKKS
245
0.3578 0.7543 203561_at Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor for (CD32) FCGR2A
241
0.9737 -0.8018 222893_s_at hypothetical protein FLJ13150 FLJ13150
260
1.5048 -0.792 222531_s_at chromosome 14 open reading frame 108 C14orf108
311
2.3688 -0.7505 200826_at small nuclear ribonucleoprotein D2 polypeptide 16.5kDa SNRPD2
No.
Frontera de decisión Peso Conjunto prueba ID Título Símbolo del Gen
213
0.3054 -0.834 226882_x_at WD repeat domain 4 WDR4
224
1.2833 0.7725 235875_at ESTs --
290
0.8235 -0.7645 218139_s_at chromosome 14 open reading frame 108 C14orf108
145
1.6774 -0.9194 232075_at recombination protein REC14 REC14
312
2.2771 -0.7446 203663_s_at cytochrome c oxidase subunit Va COX5A
49
1.0533 -0.7456 208743_s_at tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation protein, beta polypeptide YWHAB
160
1.1116 -0.8655 202567_at small nuclear ribonucleoprotein D3 polypeptide 18kDa SNRPD3
289
0.577 0.7398 208844_at -- --
87
0.7265 0.7845 234021_at Homo sapiens cDNA: FLJ21331 fis, clone COL02520. --
170
0.4024 0.8105 216287_at -- --
129
2.216 -0.8395 200814_at proteasome (prosome, macropain) activator subunit 1 (PA28 alpha) PSME1
149
0.7958 0.8846 221569_at hypothetical protein FLJ20069 FLJ20069
243
0.7858 0.7564 233876_at Homo sapiens cDNA FLJ20670 fis, clone KAIA4743. --
195
1.1291 0.7902 58367_s_at hypothetical protein FLJ23233 FLJ23233
190
0.7554 0.7919 205807_s_at tuftelin 1 TUFT1
Exactitud de la clasificación
Para determinar la capacidad del modelo seleccionado para predecir la sensibilidad o resistencia en un grupo independiente de tumores, se aplicó cinco veces validación cruzada. Para más información sobre la validación cruzada véase, por ejemplo, Kohavi y John, “Wrappers for Feature Subset Selection”, Artificial Intelligence 97 (1-2) (1997) pp. 273-324. La validación cruzada proporciona división repetida del conjunto de datos en conjuntos de entrenamiento y de prueba, construyendo el modelo cada vez usando solo el conjunto de entrenamiento, luego evaluando su exactitud en el conjunto de prueba retenido. Cinco veces de validación cruzada significa que el conjunto de entrenamiento contiene el 80 % y el conjunto de prueba el 20 % del conjunto de datos original. Las operaciones de filtrado, selección de distintivos y construcción del modelo se realizan solo en el conjunto de entrenamiento, y entonces los modelos resultantes se aplican al conjunto de prueba. La exactitud de la clasificación se mide solo en los conjuntos de prueba, a través de múltiples ejecuciones de validación cruzada.
Para determinar si los modelos más altamente predictivos podrían obtenerse por casualidad solo, se realizó una prueba de permutación. Las marcas se permutaron en las 44 muestras de descubrimiento 10 veces; se repitió el procedimiento de selección de marcadores entero. Usando voto ponderado sobre los respondedores frente a otra comparación, por ejemplo, la tasa de error global para los modelos permutados fue del 50 %, en comparación con el 29 % para las marcas observadas. Estos resultados sugieren que es poco probable que aquellos modelos pudieran identificarse por casualidad solo. En resistente al tratamiento frente a otras comparaciones, los presentes inventores no vieron una clara mejora de la exactitud de predicción cuando se compara con marcas de muestras permutadas. Sin embargo, los presentes inventores informan aquí de marcadores individuales que tienen puntuaciones de SNR o CBT de un único marcador relativamente altas.
Se apreciará que así pueden obtenerse conjuntos de marcadores adicionales empleando los métodos descritos en el presente documento para identificar modelos. Hay muchos distintivos altamente correlacionados que podrían sustituirse entre sí en los modelos; estos no se enumeran todos.
Aplicación específica de la predicción de clases Voto ponderado (WV)
Aquí los presentes inventores ilustran cómo aplicar un modelo de voto ponderado para obtener una predicción de Respuesta o No respuesta para un paciente dado, usando el algoritmo descrito en el presente documento. Usando los 44 pacientes clasificados en grupos Sensibles o No sensibles, la siguiente tabla muestra las puntuaciones de SNR y los límites de decisión para cada uno de los marcadores en un conjunto predictivo de voto ponderado construido a partir del conjunto de datos. También se indica si el marcador se expresa más altamente en pacientes Sensibles (R) o en No sensibles (NR). Para un paciente no sensible ilustrativo en el conjunto de datos, los votos contribuidos por cada marcador se muestran en la Tabla 5. La suma de los pesos de votos es inferior a 0, que indica una predicción de No sensible. La confianza en la clase predicha (No sensible) es 0,8431.
TABLA 5 Conjunto de marcadores de predicción de voto ponderado
No.
Conjunto prueba ID Símbolo del Gen Puntuación SNR Frontera de decisión Ex. expresión registro de paciente Peso de voto Voto Confianza
143
200965_s_at ABLIM1 0.8165 0.5177 0.3085 -0.1708 NR
141
234428_at -- 0.9174 0.3222 0.201 -0.1112 NR
221
223996_s_at MRPL30 -0.8281 1.1666 1.0436 0.1019 R
94
222555_s_at MRPL44 -0.8998 0.9622 1.2401 -0.2501 NR
147
220572_at DKFZp54 7G183 0.9019 0.29 0.2731 -0.0153 NR
Total
-0.4454 NR 0.8431
Se apreciará que pueden emplearse métodos similares utilizando los conjuntos de marcadores de la presente invención.
Combinación de distintivos umbral (CTF)
Usando los 44 pacientes clasificados en grupos Sensibles o No sensibles, se construyó el umbral de normalización para cada uno de los marcadores hasta en No de predicción en un conjunto predictivo de CTF a partir del conjunto de datos. Cada valor de marcador para una expresión de paciente se modifica de escala dividiendo entre un factor que es la media de la clase sensible dividida entre la puntuación de CBT para ese marcador. Los valores de expresión normalizada se suman para determinar el valor predictivo combinado para ese paciente. Se determinó que el umbral por encima del cual se predice que los pacientes van a ser No sensibles era 59,15, por el método de CTF descrito anteriormente. Debido a que el valor de expresión de escala modificada promedio para este paciente es 46,81, que es inferior a 59,15, se predice que el paciente va a ser sensible. Véase la Tabla 6.
Se apreciará que pueden emplearse métodos similares que utilizan dos o más marcadores de los conjuntos de marcadores identificados descritos en el presente documento con el fin de generar conjuntos de marcadores de predicción similares.
TABLA 6 Conjunto de marcadores de predicción de CTF
Anotación biológica de marcadores de predicción
Entre los genes de respuesta identificados en la Tabla 1 y Tabla 2, está un subconjunto de genes cuya función biológica putativa o funciones son particularmente interesantes, que incluyen función (funciones) particularmente relevantes para el uso de inhibidores del proteasoma para el tratamiento de cánceres, que incluyen mieloma. Algunos de los genes son conocidos por participar en la iniciación o progresión del mieloma, el crecimiento, supervivencia o señalización de células linfoides, la regulación del metabolismo de fármaco o rutas apoptósicas o codificar componentes de la vía de la ubiquitina/proteasoma que está directamente dirigida por inhibidores del proteasoma. Por ejemplo, este análisis identifica genes en la Tabla 1 que están asociados a la adhesión celular (nº 1 a 5), señalización apoptósica (6 a 13), antígeno del cáncer (14 a 27), ciclo celular (28 a 33), metabolismo de fármacos (34 a 35), resistencia de fármacos (36 a 37), control del crecimiento, hematopoyesis (38 a 44), señalización mitogénica (45-53), señalización de mieloma (53 a 61), translocalización de mieloma (62-73), vía de la NF-kB (7477), oncogenes (78 a 82), señalización oncogénica (83 a 93), homeostasis de proteínas (94 a 118), ruta supresora de tumores (119 a 128) y la vía de la ubiquitina/proteasoma (129 a 136). Adicionalmente, los genes identificados en este ejercicio también se corresponden con genes que también se corresponden con los marcadores de predicción asociados a enfermedad progresiva en la Tabla 2. Véase la Tabla 7.
La identificación de tales genes fortalece la hipótesis de que los genes identificados con estas metodologías están de hecho relacionados con la biología del cáncer y la posible sensibilidad de un tumor hematológico a las acciones anticancerígenas de un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, bortezomib). Además, la descripción de tales moléculas funcionales como marcadores de respuesta podría facilitar la selección de los marcadores más apropiados para la inclusión en una herramienta de diagnóstico. En casos en los que 2 conjuntos de sondas distintos proporcionan información predictiva igual, la inclusión de estos u otros marcadores conocidos por ser biológicamente relevantes podría facilitar la captación e implementación del método de diagnóstico. Finalmente, la caracterización de estas moléculas funcionales y rutas puede permitir la identificación de nuevos marcadores y posiblemente mejorados que actúan en las mismas vías biológicas o similares.
Además, este análisis indica que pueden encontrarse marcadores genómicos adicionales de respuesta en estas vías biológicas. Por ejemplo, la categoría “señalización oncogénica” contiene varios componentes de la vía de señalización de Wnt. Así, otros genes o proteínas que funcionan en la vía de Wnt que también pueden emplearse como marcadores de respuesta. Marcadores adicionales en estas vías identificadas también pueden funcionar solos
o conjuntamente con marcadores mostrados en la Tabla 1 y Tabla 2 para predecir eficazmente la respuesta a tratamiento con bortezomib.
TABLA 7: Anotación biológica
Líneas celulares resistentes al inhibidor del proteasoma
Con el fin de de entender mejor el (los) mecanismo(s) específico(s) por el (los) que los inhibidores del proteasoma ejercen sus efectos apoptósicos, además de elucidar mecanismos por los que aquellos efectos pueden subvertirse, se generaron líneas de células tumorales resistentes a bortezomib. Se trataron líneas de células tumorales con una dosis muy baja de bortezomib (aproximadamente 1/20 la DL50 -una dosis que destruiría el 50 % de las células) durante 24 horas. Entonces se retiró el fármaco y se dejó que las células supervivientes se recuperaran durante 24 a 72 horas. Entonces, este proceso se repitió durante múltiples rondas con la dosis de bortezomib duplicada cada vez. Después de dosificarse las células con 3-5 veces la DL50, varias líneas celulares individuales se sub-clonaron a partir de colonias de células individuales. Los análisis posteriores demostraron que estas líneas presentan 5-10 veces de resistencia a bortezomib y que esta característica es estable durante meses en cultivo y no se afecta por inhibidores de bombas de resistencia a múltiples fármacos. Esta estrategia se aplicó a tanto líneas celulares de tumor de ovario (OVCAR-3) como líneas celulares de tumor de mieloma (RPMI8226) y se caracterizaron múltiples sub-clones. Entonces, las líneas celulares resistentes se sometieron a la pauta de expresión génica usando la micromatriz U133 de Affymetrix. Una comparación de genes diferencialmente expresados en sub-clones parentales sensibles (S) frente a resistentes (R) resaltó varios genes que también se identificaron en análisis de biopsias de mieloma sensibles y resistentes. Véase la Tabla 8. El número identificado en la Tabla 8 se corresponde con la identificación del número de marcador en la Tabla 1. Tales resultados no solo recalcan una posible relación entre la expresión de estos genes y la sensibilidad a bortezomib, sino que también soportan la validez de métodos usados para definir los genes de respuesta en muestras clínicas.
TABLA 8 Identificación de genes en la inhibición de líneas celulares sensibles / resistentes al proteasoma
Nº
ID Conjunto Prueba Titulo R/S Ratio Resistente /Parental
156
202075_s _at gb:NM_006227.1 /DEF=Homo sapiens phospholipid transfer protein (PLTP), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=PLTP /PROD=phospholipid transfer protein /DB_XREF=gi:5453913 /UG=Hs.283007 phospholipid transfer protein /FL=gb:L26232.1 gb:NM_006227.1 S 0.36
166
210497_ x_at gb:BC002818.1 /DEF=Homo sapiens, Similar to synovial sarcoma, X breakpoint 2, clone MGC:3884, mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PROD=Similar to synovial sarcoma, X breakpoint 2 /DB_XREF=gi:12803942 /UG=Hs.289105 synovial sarcoma, X breakpoint 2 /FL=gb:BC002818.1 R 2.82
332
210715_s _at gb:AF027205.1 /DEF=Homo sapiens Kunitz-type protease inhibitor (kop) mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /GEN=kop /PROD=Kunitz-type protease inhibitor /DB_XREP=gi:2598967 /UG=Hs.31439 serine protease inhibitor, Kunitz type, 2 /FL=gb:AF027205.1 S 0.37
211
219373_ at gb:NM_018973.1 /DEF=Homo sapiens dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 3 (DPM3), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=DPM3 /PROD=dolichyl-phosphate mannosyltransferasepolypeptide 3 /DB_XREF=gi:9506552 /UG=Hs.110477 dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 3 /FL=gb:AF312923.1 gb:AF312922.1 gb:AB028128.1 gb:NM_018973.1 S 0.37
343
200030_s _at gb:NM_002635.1 /DEF=Homo sapiens solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 3 (SLC25A3), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1b, mRNA. /FEA=mRNA /GEN=SLC25A3 /PROD=phosphate carrier precursor isoform 1 b /DB_XREF=gi:4505774 /UG=Hs.78713 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 3 /FL=gb:BC000998.1 gb:BC001328.1 gb:BC003504.1 gb:BC004345.1 gb:NM_002635.1 R 2
447
222975_s _at Consensus includes gb:AI423180 /FEA=EST /DB_XREF=gi:4269111 /DB_XREF=est:tf32e08.x1 /CLONE=IMAGE:2097926 /UG=Hs.69855 NRAS-related gene /FL=gb:AB020692.1 R 1.16
Nº
ID Conjunto Prueba Titulo R/S Ratio Resistente/ Parental
280
224673_ at Consensus includes gb:AI613244 /FEA=EST /DB_XREF=gi:4622411 /DB_XREF=est:ty35a06.x1 /CLONE=IMAGE:2281042 /UG=Hs.306121 leukocyte receptor cluster (LRC) encoded novel gene 8 S 0.44
129
200814_ at gb:NM_006263.1 /DEF=Homo sapiens proteasome (prosome, macropain) activator subunit 1 (PA28 alpha) (PSME1), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=PSME1 /PROD=proteasome (prosome, macropain) activatorsubunit 1 (PA28 alpha) /DB_XREF=gi:5453989 /UG=Hs.75348 proteasome (prosome, macropain) activator subunit 1 (PA28 alpha) /FL=gb:BC000352.1 gb:L07633.1 gb:NM_006263.1 R 2.11
390
204610_s _at gb:NM_006848.1 /DEF=Homo sapiens hepatitis delta antigeninteracting protein A (DIPA), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=DIPA /PROD=hepatitis delta antigen-interacting protein A /DB_XREF=gi:5803004 /UG=Hs.66713 hepatitis delta antigeninteracting protein A /FL=gb:U63825.1 gb:NM_006848.1 R 2.09
429
222646_s _at Consensus includes gb:AW268365 /FEA=EST /DB_XREF=gi:6655395 /DB_XREF=est:xv50d03.x1 /CLONE=IMAGE:2816549 /UG=Hs.25740 ERO1 (S. cerevisiae)-like /FL=gb:AF081886.1 gb:NM_014584.1 R 2.74
Ensayos de sensibilidad
Se obtiene una muestra de células cancerosas de un paciente. Se mide un nivel de expresión en la muestra para un marcador correspondiente a al menos dos de los marcadores de predicción expuestos en la Tabla 1, Tabla 2 y/o Tabla 3. Preferentemente, se utiliza un conjunto de marcadores que comprende marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y/o Tabla 3 y se ponen juntos en un conjunto de marcadores usando los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los conjuntos de marcadores pueden comprender los conjuntos de marcadores identificados en la Tabla 4, Tabla 5 y/o Tabla 6, o cualquier conjunto de marcadores preparado por métodos similares. Tal análisis se usa para obtener un perfil de expresión del tumor en el paciente. La evaluación del perfil de expresión se usa entonces para determinar si el paciente es un paciente sensible y se beneficiaría de terapia de inhibición del proteasoma (por ejemplo, tratamiento con un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, bortezomib) solo,
o en combinación con agentes adicionales). La evaluación puede incluir el uso de un conjunto de marcadores preparado usando cualquiera de los métodos proporcionados u otros métodos de puntuación similares conocidos en la técnica (por ejemplo, voto ponderado, CTF). Aún más, la evaluación puede comprender el uso de más de un conjunto de marcadores preparado. Se identificará una terapia de inhibición del proteasoma según convenga para tratar el cáncer cuando el resultado de la evaluación no demuestre sensibilidad disminuida o sensibilidad elevada en presencia del agente.
Examinando la expresión de uno o más de los marcadores o conjuntos de marcadores identificados en una muestra tumoral tomada de un paciente durante el transcurso del tratamiento de inhibición del proteasoma, también es posible determinar si el agente terapéutico continúa funcionando o si el cáncer se ha vuelto no sensible (resistente al tratamiento) al protocolo de tratamiento. Por ejemplo, a un paciente que recibe un tratamiento de bortezomib se le extraerían células tumorales y se monitorizarían para la expresión del marcador o conjunto de marcadores. Si el perfil de expresión de uno o más conjuntos de marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y/o Tabla 3 demuestra elevada sensibilidad en presencia del agente, el tratamiento con inhibidor del proteasoma continuaría. Sin embargo, si el perfil de expresión de uno o más conjuntos de marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla 3 demuestra elevada no sensibilidad en presencia del agente, entonces el cáncer puede haberse vuelto resistente a la terapia de inhibición del proteasoma y debe iniciarse otro protocolo de tratamiento para tratar al paciente.
Y, lo que es más importante, estas determinaciones pueden hacerse en una base paciente por paciente o en una base agente por agente (o combinaciones de agentes). Así, puede determinarse si es probable que una terapia de inhibición del proteasoma particular beneficie o no a un paciente particular o grupo/clase de pacientes, o si debe continuarse un tratamiento particular.

Claims (12)

  1. Reivindicaciones
    1.
    Un método in vitro para determinar un régimen de terapia de inhibición del proteasoma para tratar un tumor en un paciente que comprende:
    a) determinar el nivel de expresión de marcadores en un conjunto de marcadores que comprende al menos dos marcadores de predicción seleccionados del grupo que consiste en los marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 en una muestra de paciente que comprende células tumorales; y b) determinar un régimen basado en la inhibición del proteasoma para tratar el tumor basándose en la expresión de los marcadores de predicción, en el que un nivel de expresión significativo es indicativo de que el paciente es tanto un paciente sensible como un paciente no sensible.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que
    a) el nivel de expresión de los marcadores en el conjunto de marcadores de predicción se determina por detección de ARNm o proteína; y/o b) los marcadores de predicción seleccionados de los marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 comprenden marcadores identificados en cualquiera de la Tabla 4, Tabla 5 o Tabla 6.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la determinación del nivel de expresión significativo se determina por comparación con un marcador de control o por comparación con un patrón predeterminado.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el tumor está seleccionado de tumores líquidos o sólidos, opcionalmente en el que el tumor líquido está seleccionado del grupo que consiste en mielomas, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfomas de linfocitos B, síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica y otras leucemias.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 1 a 4, en el que el régimen basado en la inhibición del proteasoma para tratar el tumor que comprende tratamiento con un inhibidor del proteasoma está seleccionado del grupo que consiste en un aldehído de peptidilo, un ácido borónico de peptidilo, un éster borónico de peptidilo, una vinilsulfona, una epoxicetona y un análogo de lactacistina.
  6. 6.
    El método de cualquier reivindicación precedente, en el que el régimen basado en inhibición del proteasoma para tratar el tumor comprende tratamiento con bortezomib.
  7. 7.
    El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la muestra de paciente que comprende células tumorales se obtiene del sujeto en cualquier momento seleccionado de antes de la terapia contra el tumor, simultáneamente con la terapia contra el tumor o después de la terapia contra el tumor.
  8. 8.
    El método de la reivindicación 1, en el que los marcadores de predicción están seleccionados de los marcadores identificados en la Tabla 1 o Tabla 2 asociados a una función biológica seleccionada del grupo que consiste en adhesión celular, señalización apoptósica, antígeno del cáncer, ciclo celular, metabolismo del fármaco, resistencia al fármaco, control de crecimiento, hematopoyesis, señalización mitogénica, señalización de mieloma, translocalización de mieloma, vía de NF-kB, oncogenes, señalización oncogénica, homeostasis de proteínas, ruta supresora de tumor y la vía de la ubiquitina/proteasoma.
  9. 9.
    Un conjunto de marcadores para su uso en el método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de marcadores comprende al menos dos marcadores de predicción seleccionados del grupo que consiste en los marcadores identificados en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3 y se construye usando el método de voto ponderado o la combinación del modelo de distintivos umbral.
  10. 10.
    Un kit para su uso en determinar una terapia de inhibición del proteasoma para tratar un tumor en un paciente que comprende reactivos para evaluar la expresión de al menos un marcador de predicción, e instrucciones para su uso, en el que los reactivos comprenden
    a) una pluralidad de sondas de ácido nucleico, en el que las sondas se unen específicamente a los marcadores en un conjunto de marcadores de predicción que comprende al menos dos marcadores identificados en cualquiera de la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla 3; y/o b) una pluralidad de reactivos de detección seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y sonda de péptido, en el que los reactivos de detección se unen específicamente a las proteínas codificadas por marcadores de predicción en un conjunto de marcadores de predicción que comprende al menos dos marcadores identificados en cualquiera de la Tabla 1, Tabla 2 o Tabla
  11. 3.
  12. 11. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de marcadores de predicción comprende marcadores seleccionados de la Tabla 7.
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