CN103733065A

CN103733065A - 用于癌症的分子诊断试验

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Publication number: CN103733065A
Application number: CN201280037298.2A
Authority: CN
Inventors: D·P·哈金; F·帕特森; C·特林德; E·J·奥布赖恩; C·米基; C·古尔利; L·A·希尔; K·E·基廷; J.奥唐纳; M·拜尔斯乔; S·德哈罗; V·普劳特斯基; R·肯尼迪; T·戴维森; A·温特; A·麦克卡维甘
Original assignee: Almac Diagnostics Ltd
Current assignee: Almac Diagnostics Ltd
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-06-04
Also published as: EA201391805A1; SG195208A1; SG10201604497UA; BR112013031019A2; EP2715348B1; EP2715348A4; JP6067686B2; EA025926B1; EA201691257A1; JP2017079772A; US10260097B2; WO2012167278A1; US20140342924A1; CN103733065B; JP2014516552A; IL229681A0; MX2013014065A; KR20140044341A; EP2715348A1; CA2838086A1

Abstract

本发明提供了用以鉴别用于癌症的分子诊断试验的方法和组合物。所述试验鉴别了对于抗血管生成治疗剂有反应的癌症亚型并且能够对这一亚型内的患者进行分类。本发明可以用于在施用任何抗血管生成剂之前确定患有癌症的患者对治疗方案在临床上是有反应的还是无反应的。这一试验可以用于不同癌症类型中并且与直接地或间接地影响血管生成或血管生成信号传导的不同药物一起使用。此外，本发明可以用作某些癌症类型的预后指标。具体地说，本发明是针对预测性标志物的某些组合的使用，其中所述预测性标志物的表达与对治疗方案的反应性或无反应性相关。

Description

用于癌症的分子诊断试验

相关申请的交叉引用

本发明要求于2011年6月2日提交的美国临时专利申请61/492,488的优先权益，所述申请以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及一种适用于诊断不同解剖部位的癌症的分子诊断试验，所述分子诊断试验包括与血管生成有关的常见亚型的使用。本发明包括从基因表达水平获得基因分类模型。一个应用是对癌症治疗药物种类的反应的分层和针对癌症治疗药物种类选择患者，并且因此指导患者治疗选择。另一个应用是将癌症患者分层为对于抗血管生成治疗剂有反应的那些和对于抗血管生成治疗剂没有反应的那些。本发明提供一种试验，所述试验可以指导疗法选择以及在新型治疗剂的临床试验评估过程中选择用于富集策略的患者群。本发明可以用作包括卵巢癌、乳癌以及成胶质细胞瘤在内的某些癌症的预后指标。所述血管生成亚型可以由新鲜/冷冻(FF)的患者样品或经过福尔马林固定石蜡包埋的FFPE的患者样品来鉴别。

背景

制药行业一直在寻求比当前施用的药物更有效的、更具特异性或具有更少不良副作用的新型药物治疗选择。由于人类群体内的遗传变异性使许多已认可的药物的有效性产生了显著差异，故正在不断地开发药物疗法替代品。因此，虽然当前有多种多样的药物疗法选择可供使用，但是在患者无法起反应的情况下仍总是需要更多疗法。

传统上，医师所使用的治疗模式一直是开出在治疗疾病方面可能得到最高成功率的一线药物疗法。如果一线疗法无效，则开出替代性药物疗法。对于某些疾病来说，这种模式明显不是最佳的治疗方法。例如，在如癌症等疾病中，第一次治疗经常是最重要的并且为成功治疗提供了最佳机会，因此对于选择将针对特定患者的疾病最有效的初始药物的需求变高。

在西方国家中，卵巢癌是所有妇科癌症之中引起死亡的主导原因。这种高死亡率是由大多数患者在晚期进行诊断所致。上皮性卵巢癌(EOC)占卵巢恶性肿瘤的90%并且被分为不同的组织学类别，包括浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、过渡型、混合型、以及未分化的亚型。越来越多的证据表明这些不同的组织学起因于不同的病因学。近期在用于分类上皮性卵巢癌的方法学方面已经取得进展(McCluggage,W.G.“Morphological subtypes of ovarian carcinoma:areview with emphasis on new developments and pathogenesis,”PATHOLOGY,2011年8月;43(5):420-32)。其后果之一是以前被分类为子宫内膜样的许多肿瘤现在被分类为浆液性的。

卵巢癌的当前标准治疗是减瘤手术(debulking surgery)和基于铂紫杉烷的标准细胞毒性化学疗法。然而，不是所有患者都对其有反应，并且在对其有反应的那些中，大约70%将会经历复发。基于组织学或分子分类的卵巢癌特异性靶向疗法尚未进入市场。类似地，对于其它类型的癌症，仍然没有选择适当细胞毒性化学治疗剂的准确方式。

微阵列和分子基因组学的出现有可能对疾病的诊断能力和预后分类产生显著影响，它们可以帮助预测单个患者对确定的治疗方案的反应。微阵列提供了对大量遗传信息的分析，从而提供个体的遗传指纹。更值得关注的是，这一技术最终将为定制药物治疗方案提供必要工具。

当前，健康护理专业人员具有很少的途径来帮助他们鉴别将受益于化学治疗剂的癌症患者。最佳一线药物的鉴别一直很难，因为没有可用的方法来准确地预测哪种药物治疗对于特定癌症的生理学将是最有效的。这一不足导致相对较差的单一药剂反应率以及增加的癌症发病率和死亡。此外，患者经常不必要地经受无效、有毒的药物疗法。

血管生成是肿瘤新血管形成的关键组成部分并且对于肿瘤发生和转移是必不可少的。因此，它是治疗干预的关键领域并且一直与不良预后和存活率降低相关。这促进了靶向血管生成相关性过程和途径的多种药剂的开发，包括作为市场主导品并且首个被FDA批准的抗血管生成剂贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))，由Genentech/Roche生产。

包括贝伐单抗的治疗方案已经展示出广泛的临床活性1-10。然而，在大多数癌症中，在贝伐单抗添加至细胞毒性化学疗法之后没有显示出总存活率(OS)益处^8,12-13。这表明，相当大比例的肿瘤或是最初对VEGF阻断(贝伐单抗的作用机制)具有抗性，抑或快速发展对VEGF阻断的抗性。事实上，当接受贝伐单抗单药疗法时，21%的卵巢癌患者、10%的肾癌患者以及33%的直肠癌患者显示部分消退，从而表明贝伐单抗在小亚组的患者中可能是有活性的，但是这种增量的益处在未选择的患者中未达到显著性。因此，使用对贝伐单抗有反应的生物标志物将会改进治疗结果的评定并且因此能够鉴别将从贝伐单抗治疗接受最大临床益处的患者亚组。这在转移性乳癌的情况下将是特别相关的，其中临床上有益的生物标志物的缺乏削弱了贝伐单抗的使用。迄今，还没有这种生物标志物在临床上被验证可用来预测贝伐单抗功效。高血压和VEGF多态性是迄今为止显示出潜力的仅有的生物标志物，但是关于其在临床环境中的使用仍然存在重要问题。

抗血管生成疗法的另一种方法是同时靶向多种血管生成途径而不是选择性地靶向VEGF途径。理论上，多靶向抗血管生成剂应比如贝伐单抗等药剂更完全地抑制血管生成，并且因此可以产生更大的治疗益处。已经假定在一些肿瘤中，血管生成可能仅在疾病的早期需要VEGF，但随着疾病进展，其由另外的血管生成途径驱动。因此，通过靶向多种途径，有可能抵消可以导致对VEGF抑制的抗性的补偿逃避机制。

对于其它类型的癌症，仍然没有选择哪些患者将会或将不会对使用抗血管生成治疗剂或单药剂抗血管生成疗法的标准护理有反应的准确方式。

因此，所需要的是一种分子诊断试验，其与标准护理组合抑或作为单药剂治疗将有助于基于患者对于抗血管生成治疗剂的预测反应来对患者分层。这将允许应接受替代疗法的那些患者的快速鉴别。这种分子诊断试验应以足够的准确度预测在不同癌症类型内的治疗反应性。

发明概述

公开了使用在癌症中表达的一组生物标志物的方法，这样使得当一些或全部转录物过表达或表达不足时，它们鉴别出在与血管生成有关的分子信号传导中出现上调的癌症的亚型。本发明还提供了用于指示对于抗血管生成剂的反应性或无反应性的方法。在不同方面，这组生物标志物可以形成单参数或多参数预测性试验的基础，所述试验可以使用如微阵列、Q-PCR、免疫组织化学、ELISA或可以量化mRNA或蛋白质表达的其它技术等本领域已知方法来实现。

此外，本文所描述的癌症亚型是许多类型的癌症共有的并且不限于单一癌症疾病类型。因此，本文所公开的表达签名(expressionsignature)可以用于预测癌症治疗剂在不同组织中不同癌症类型的反应性或无反应性。在本发明的一个实施方案中，这些生物标志物适用于评估癌症肿瘤对于抗血管生成治疗剂的反应性。在一个示例性实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是乳癌。

本文所描述的本发明不限于任何一种药物；它可以用于鉴别对直接地或间接地影响或靶向血管生成过程的一系列当前使用的、正在研发的和新型药物中的任何一种有反应者和无反应者。在一个实施方案中，本发明可以用于评估作为单一药剂抑或与标准护理疗法组合的辅药或新辅药贝伐单抗或达沙替尼。在另一个实施方案中，本发明可以用于在卵巢癌中评估阿瓦斯汀、VEGF-TRAP治疗。

本发明涉及使用至少或至多10种不同的反应分类来预测对药物的反应，所述反应如总存活率、无进展存活率、放射反应、(如由RECIST定义)完全反应、部分反应、稳定疾病，以及血清学标志物如但不限于，PSA、CEA、CA125、CA15-3以及CA19-9。在某些实施方案中，本发明可以用于评估卵巢、乳房以及成胶质细胞瘤的存活率。

另一方面，本发明涉及鉴别癌症中的血管生成亚型。所述亚型可以通过测定某些生物标志物的表达水平进行检测。表达签名限定了一组生物标志物，其表达将预测对于抗血管生成剂有反应或无反应的癌症类型。在某些示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自表1A和1B中所列出的生物标志物的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自SEQ ID NO:632至801(组I)或SEQ ID NO:802至974(组II)的序列的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自表2A和2B中所列出的生物标志物的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括表2A和2B中所列出的生物标志物并且其对应权重是使用PLS分类器确定。

另一方面，本发明涉及用于以上所列出的如qPCR、微阵列以及免疫测定(如免疫组织化学、ELISA、蛋白质印迹等)的常规诊断应用的试剂盒。这类试剂盒包括了测定基因或基因产物的表达和量化mRNA或蛋白质表达的适当试剂和说明书。

还公开了用于在有或无血管生成表型的情况下鉴别人类肿瘤的方法。在某些示例性实施方案中，这类方法可以用于鉴别对直接地抑或间接地抑制与血管生成有关的过程的药物敏感和有反应的患者。在某些其它示例性实施方案中，这类方法可以用于鉴别对直接地抑或间接地抑制与血管生成有关的过程的药物具有抗性或没有反应的患者。

另一方面，本发明可以在某些癌症类型中用作预后指标。在一个示例性实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是乳癌。在又另一个示例性实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤。

本发明还涉及指导患者的有效治疗。此外，提供了涉及选择患者治疗方案和选择患者用于直接地或间接地影响血管生成的当前或开发阶段药物的临床试验的方法。

此外，本文描述了使存档的经过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的活组织检查材料以及新鲜/冷冻(FF)组织适用于所有转录物的测定，并且因此与最广泛可获得的活组织检查材料的类型相容的方法。生物标志物表达水平可以使用从FFPE组织、新鲜冷冻组织或已经储存在溶液(如

)中的新鲜组织获得的RNA来确定。

附图简述

图1提供了表示在Almac Diagnostics的上皮性卵巢癌样品集的199个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像顶部的图例指示每个样品被分配的分类器组以用于分类器产生(即，种类标记)。

图2A和2B表示使用功能富集分析在上皮性卵巢癌训练集的199个仅浆液样品中得到的血管生成探针集簇的功能分析结果。图2A示出了表示前10个富集的基因本体(Gene Ontology)生物过程的显著性的直方图。红色条形指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。图2B表示了基因本体生物过程树的子集，其中过程包括由簇3中的探针集编码的一种或多种基因。红色的过程指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。黑色的过程包括由簇3中的探针集编码的一种或多种基因，但不具显著性。

图3表示在鉴别与血管生成有关的分子亚型的示例性25-基因表达签名内基因的功能富集结果。红色条形指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。

图4提供了先前未治疗的患有高分级成胶质细胞瘤的患者在初始手术切除之后无复发存活率(事件发生时间，以周为单位)的卡普兰-迈耶曲线(Phillips HS,Kharbanda S,Chen R,Forrest WF等,“Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis,delineate apattern of disease progression,and resemble stages in neurogenesis,”CANCER CELL,2006年3月;9(3):157-73.PMID:16530701；Costa BM,Smith JS,Chen Y,Chen J等,“Reversing HOXA9oncogene activationby PI3K inhibition:epigenetic mechanism and prognostic significance inhuman glioblastoma,”CANCER RES,2010年1月15日;70(2):453-62.PMID:20068170)。

图5提供了在用达沙替尼治疗之后，示例性25-基因分类器模型在16个前列腺细胞系内的分类性能的ROC曲线图。在应用所述分类器模型之后，AUC是大约0.84。95%的置信限是使用1000次引导迭代确定的(Wang XD,Reeves K,Luo FR,Xu LA等,“Identification ofcandidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib inprostate cancer:rationale for patient selection and efficacy monitoring,”GENOME BIOL2007;8(11):R255.PMID:18047674)。

图6提供了表示在根据更新的病理学分类标准重新分类的上皮性卵巢癌样品集的265个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像顶部的图例指示每个样品被分配的分类器组以用于分类器产生(即，种类标记)。

图7A和7B表示使用功能富集工具(FET)算法在上皮性卵巢癌训练集的265个仅浆液样品中得到的血管生成探针集的功能分析结果。图7A示出了表示前10个富集的基因本体生物过程的显著性的直方图。红色条形指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。图7B表示基因本体生物过程树的子集，其中过程包括由簇2(血管生成)中的探针集编码的一种或多种基因。红色的过程指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。黑色的过程包括由所述血管生成簇中的探针集编码的一种或多种基因，但不具显著性。

图8表示在鉴别与血管生成有关的分子亚型的示例性45-基因分类器模型内基因的功能富集结果。红色条形指示在错误发现率校正之后p值为0.05的过程的显著性。

图9提供了在用达沙替尼治疗之后，45-基因分类器模型在16个前列腺细胞系内的分类性能的ROC曲线图。在应用所述分类器模型之后，AUC是大约0.95。95%的置信限是使用1000次引导迭代确定的。

图10提供了表示在根据更新的病理学分类标准重新分类的上皮性卵巢癌样品集的265个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像的顶部的图例指示每个样品应该被分配的分类器组以用于非血管生成或无反应组分类器的产生。

图11提供了在重新分类的卵巢样品集中非血管生成样品组(图3a，样品簇1)与血管生成样品组(图10，样品簇2和3)的无进展存活率(以周为单位)的卡普兰-迈耶曲线的比较。

图12A和12B提供了表示在乳癌样品集的51个ER阴性样品中最可变的基因(图12A)和在乳癌样品集的56个ER阳性样品中最可变的基因(图12B)的分层合并聚类分析的热图。对于显示出血管系统发育/血管生成或免疫反应/IFN信号传导的那些簇，探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧

序列表

所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写示出，如37C.F.R.§1.822中所定义。仅示出每一核酸序列的一条链，但是互补链应理解为涵盖于提到的任何所展示的链内。

序列表是作为ASCII文本文件以命名为ADL_0801WP_ST25.txt的文件的形式提交，它是在2012年6月4日创建并且为352,839个字节，以引用的方式并入本文。

发明详述

除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。分子生物学中常见术语的定义可以在以下文献中找到：Benjamin Lewin,Genes IX,由Jones and Bartlet出版,2008(ISBN0763752223)；Kendrew等(编著),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0632021829)；Robert A.Meyers(编著),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN9780471185710)；Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，以及March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure,第4版,John Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)。

除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数形式的指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或”意图包括“和”。术语“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。在相矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语解释)为准。

如本文所用，术语“标志物组”、“表达分类器”、“分类器”、“表达签名”或“签名”可以可互换地使用。

本申请中所引用的所有出版物、公布的专利文献、以及专利申请指示了本申请所涉及的一个或多个领域中的技术水平。本文所引用的所有出版物、公布的专利文献、以及专利申请特此以引用的方式并入，其引用程度就如同具体地并且个别地指示每一单个出版物、公布的专利文献、或专利申请是以引用的方式并入。

综述

当前癌症研究工作的主要目标是通过将分子参数结合到临床治疗决策中来增加患者围术期系统疗法的功效。遗传药理学/基因组学是个体对外来化合物或药物的反应中所涉及的遗传/基因组因素的研究。对本发明的生物标志物的表达具有刺激或抑制作用的药剂或调节剂可以被施用至个体以治疗(预防性地或治疗性地)患者的癌症。理想的情况是，同时将个体的药物基因组学与这种治疗结合考虑。治疗剂代谢的差异有可能通过改变药理学活性药物的剂量与血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失效。因此，了解个体的药物基因组学允许选择对预防性或治疗性治疗有效的药剂(例如，药物)。这种药物基因组学可以进一步用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以确定在个体中本发明的生物标志物的表达水平，以便由此选择适合于个体的治疗性或预防性治疗的一种或多种药剂。

本发明涉及一种适用于诊断不同解剖部位的癌症的分子诊断试验，所述分子诊断试验包括与血管生成有关的常见亚型的使用。本发明包括将受试者鉴别为对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的表达签名。所述表达签名是通过获得来自已知病理学和/或临床结果的样品集的样品的表达谱来得到。所述样品可以源自相同的样品组织类型或不同的组织类型。如本文所用，“表达谱”包含了表示给定样品中所分析的每种生物标志物的表达水平的一组值。

然后使用数学模型分析来自所述样品集的表达谱。可以应用不同的数学模型，并且所述数学模型包括但不限于，来自以下领域的模型：模式识别(Duda等,Pattern Classification,第2版,John Wiley,NewYork2001)、机器学习

等,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge2002；Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford1995)、统计学(Hastie等,The Elements ofStatistical Learning,Springer,New York2001)、生物信息学(Dudoit等,2002,J.Am.Statist.Assoc.97:77-87；Tibshirani等,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6567-6572)或化学计量学(Vandeginste等,Handbook of Chemometrics and Qualimetrics,第B部分,Elsevier,Amsterdam1998)。所述数学模型鉴别所述样品集中所表达的最能预测给定疾病表型的一种或多种生物标志物。这一种或多种生物标志物限定了表达签名。因此，表达签名包括被鉴别为最能预测给定疾病表型的生物标志物。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了每个所鉴别的生物标志物的变量，如权重。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了决策函数。所述决策函数可以进一步限定阈值得分，所述阈值得分将样品集分成两种疾病表型，如但不限于，对于抗血管生成治疗剂有反应和无反应的样品。在一个示例性实施方案中，所述决策函数和表达签名是使用线性分类器限定的。

为了使用限定的表达签名来对新样品分类，分离出由所述表达签名限定的生物标志物并且确定这一种或多种生物标志物的表达谱。以用于限定表达签名的同一数学模型对新样品生物标志物表达谱进行分析。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了所述新样品的表达得分。所述表达得分可以通过使用非线性、代数、三角或相关手段将生物标志物的表达值与对应的标量权重组合以获得单个标量值来确定。将所述表达得分与阈值得分相比较并且将样品分类为对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的。在一个示例性实施方案中，大于参考表达值的样品表达值指示患者将对于抗血管生成治疗剂有反应。在另一个示例性实施方案中，低于阈值得分的样品表达得分指示患者将对于抗血管生成治疗剂没有反应。在另一个示例性实施方案中，低于阈值表达得分的样品表达得分指示患者具有癌症类型或有发展癌症类型的风险，所述癌症类型对于抗血管生成治疗剂没有反应。在另一个示例性实施方案中，高于参考表达得分的样品表达得分指示患者具有癌症类型或有发展癌症类型的风险，所述癌症类型对于抗血管生成治疗剂具有反应。在表达签名是源自于包含一种类型的癌症组织的组织样品集的情况下，所述表达签名不限于仅对具有相同癌症类型的组织中的相同癌症亚型进行鉴别，还可以用于共享相同癌症亚型的其它癌症类型。例如，在表达签名是源自于卵巢癌样品的情况下，所述表达签名可以用于鉴别不同癌症(如成胶质细胞瘤或乳癌)中的类似血管生成亚型。

本文所公开的表达签名的一种应用是对涵盖抗血管生成疗法的治疗药物种类的反应的分层和针对所述治疗药物种类选择患者。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物的表达，有可能确定哪种治疗剂或药剂组合将最可能降低癌症的生长速率。还有可能确定哪种治疗剂或药剂组合将最不太可能降低癌症的生长速率。通过检查一组生物标志物的表达，因此有可能消除无效的或不当的治疗剂。重要的是，在某些实施方案中，这些确定可以在逐个患者的基础上或在逐个药剂的基础上进行。因此，可以确定具体治疗方案是否可能使特定患者或患者类型受益，和/或具体方案是否应该继续。本发明提供了可以指导疗法选择以及在新型治疗剂的临床试验评估过程中选择用于富集策略的患者群的试验。例如，当评估推定的抗血管生成剂或治疗方案时，可以使用本文所公开的表达签名和方法选择用于临床试验的个体，所述个体具有对于抗血管生成剂有反应的癌症类型。血管生成亚型可以由新鲜/冷冻(FF)或经过福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)患者样品进行鉴别。在一个示例性实施方案中，所述癌症类型是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症类型是成胶质细胞瘤。在又一个示例性实施方案中，所述癌症类型是乳癌。

如果与在不接触治疗剂的情况下癌症的生长相比，癌症的生长速率由于与治疗剂相接触而受到抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“有反应”。癌症的生长可以按多种方式测量。例如，肿瘤的大小或测量适于所述肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。

如果当与在不接触治疗剂的情况下癌症的生长相比，癌症的生长速率并未由于与治疗剂相接触而受到抑制，或在极低的程度上受抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“无反应”。如上所述，癌症的生长可以按多种方式测量，例如，肿瘤的大小或测量适于所述肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。对治疗剂无反应的品质是高度可变的，其中不同癌症在不同条件下对于给定治疗剂呈现出不同水平的“无反应性”。再者，可以使用除肿瘤的生长大小以外的另外标准来评定无反应性的测量，如但不限于，患者的生活质量和转移程度。

鉴别表达签名

本发明的表达签名是通过分析患者样品集中某些生物标志物的表达谱来进行鉴别。适合用于本发明中的生物标志物包括DNA、RNA以及蛋白质。从患者样品中分离所述生物标志物并且测定其表达水平以获得有关所述患者样品集中所分析的每个样品的一组表达谱。

a.表达谱

在某些实施方案中，所获得的表达谱是基因组或核酸表达谱，其中所述样品中一种或多种核酸的量或水平得到确定。在这些实施方案中，所测定的用以产生在诊断或预后方法中采用的表达谱的样品是核酸样品。核酸样品包括了含有所分析的细胞或组织的表型决定性生物标志物的表达信息的核酸群体。在一些实施方案中，核酸可以包括RNA或DNA核酸，例如，mRNA、cRNA、cDNA等，只要样品保留从中获得所述样品的宿主细胞或组织的表达信息即可。所述样品可以按如本领域已知的多种不同的方式进行制备，例如，通过从细胞中分离mRNA，其中所分离的mRNA是以分离的、扩增的形式使用，或被用于制备cDNA、cRNA等，如差异基因表达领域中已知的。因此，测定样品中mRNA的水平包括由所述mRNA制备cDNA或cRNA，并且随后测量所述cDNA或cRNA。所述样品通常是使用标准方案，由从需要治疗的受试者采集的细胞或组织，例如经由组织的活组织检查来制备，其中可以产生这类核酸的细胞类型或组织包括了存在待测定的表型的表达模式的任何组织，包括但不限于，疾病细胞或组织、体液等等。

可以使用任何常规方案由初始核酸样品产生表达谱。虽然已知多种不同的产生表达谱的方式，如在差异基因表达/生物标志物分析领域中所采用的那些，但是用于产生表达谱的一种代表性并且便利的方案类型是基于阵列的基因表达谱产生方案。这类应用是杂交测定，其中采用的核酸展示了在待产生的表达谱中待测定/表达谱分析的每个基因的“探针”核酸。在这些测定中，首先由所测定的初始核酸样品制备靶核酸的样品，其中制备可以包括使用标记物(例如，信号产生系统的成员)对所述靶核酸进行标记。在靶核酸样品制备之后，使所述样品与所述阵列在杂交条件下相接触，从而在与附接至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后定性地抑或定量地检测杂交复合物的存在。可以实践用来产生主题方法中所采用的表达谱的具体杂交技术包括以下专利中描述的技术：美国专利号5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；其公开内容以引用的方式并入本文；以及WO95/21265；WO96/31622；WO97/10365；WO97/27317；EP373203；以及EP785280。在这些方法中，使“探针”核酸的阵列与如以上所描述的靶核酸相接触，所述阵列包括了针对表达正进行测定的每种生物标志物的探针。接触是在杂交条件(例如，如以上所描述的严格杂交条件)下进行，并且然后去除未结合的核酸。所得到的杂交核酸的模式提供了有关已经被探查的每种生物标志物的表达的信息，其中所述表达信息是关于基因是否被表达并且通常是在何种水平上被表达，其中所述表达数据(即，表达谱)可以是定性的和定量的。

b.疾病和样品组织来源

在某些示例性实施方案中，患者样品集包括癌症组织样品，如存档的样品。所述患者样品集优选是源自于已经通过预后、复发可能性、长期存活率、临床结果、治疗反应、诊断、癌症分类或个体化的基因组谱表征的癌症组织样品。如本文所用，癌症包括但不限于，白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、喉癌、乳癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌等。在一个实施方案中，本文所描述的方法是指用抗血管生成剂、抗血管生成靶向疗法、血管生成信号传导抑制剂治疗癌症，但不限于这些类别。这些癌症还包括这些癌症在发病的不同阶段的子类和亚型。在某些示例性实施方案中，所述患者样品集包括卵巢癌样品。在另一个示例性实施方案中，所述患者样品集包括乳癌样品。在又另一个示例性实施方案中，所述患者样品集包括成胶质细胞瘤样品。

“生物样品”、“样品”以及“试验样品”在本文可互换地用于指从个体获得或以另外的方式得到的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆以及血清)、痰、眼泪、粘液、洗鼻液、鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、腹水、细胞、细胞提取物、以及脑脊髓液。这还包括所有前述的实验分离的部分。例如，可以将血液样品分级分离为血清或含有如红血细胞或白细胞(white blood cell/leukocyte)等特定类型的血细胞的部分。如果需要，样品可以是来自个体的样品的组合，如组织与流体样品的组合。术语“生物样品”还包括了含有均质化固体材料的材料，如例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查的材料。术语“生物样品”还包括源自于组织培养或细胞培养的材料。用于获得生物样品的任何适合的方法都可以采用；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)以及细针抽吸活组织检查程序。还可以例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如，PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的“生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何适合的方式进行处理的任何此类样品，例如，新鲜冷冻或经过福尔马林固定和/或石蜡包埋的。

如本文所用，术语“患者”包括人类和非人类动物。用于治疗的优选的患者是人。“患者”与“受试者”在本文可互换地使用。

c.生物标志物

如本文所用，术语“生物标志物”可以指基因、mRNA、cDNA、反义转录物、miRNA、多肽、蛋白质、蛋白质片段，或是指示基因表达水平抑或蛋白质产生水平的任何其它核酸序列或多肽序列。当生物标志物指示个体中的异常过程、疾病或其它状况或是所述异常过程、疾病或其它状况的迹象时，如与指示个体中的正常过程、无疾病或其它状况或是所述正常过程、无疾病或其它状况的迹象的生物标志物的表达水平或值相比，所述生物标志物一般被描述为过表达抑或表达不足的。“上调(Up-regulation)”、“上调的(up-regulated)”、“过表达(over-expression)”、“过表达的(over-expressed)”以及其任何变化形式在本文可互换地用于指生物样品中一种生物标志物的值或水平大于在来自健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。所述术语还可以指生物样品中一种生物标志物的值或水平大于可以在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

“下调(Down-regulation)”、“下调的(Down-regulated)”、“表达不足(under-expression)”、“表达不足的(under-expressed)”以及其任何变化形式在本文可互换地用于指生物样品中一种生物标志物的值或水平小于在来自健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。所述术语还可以指生物样品中一种生物标志物的值或水平小于可以在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

此外，如与指示个体中的正常过程或者无疾病或其它状况或是所述正常过程或者无疾病或其它状况的迹象的生物标志物的“正常”表达水平或值相比，过表达抑或表达不足的生物标志物还可以被称为“差异表达的”或称为具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标志物的“差异表达”还可以被称为生物标志物自“正常”表达水平的变化。

术语“差异生物标志物表达”与“差异表达”在本文可互换地用于指相对于生物标志物在正常受试者中的表达或相对于其在对特定疗法有不同地反应或具有不同预后的患者中的表达，所述生物标志物的表达在患有特定疾病的受试者中被激活至更高或更低的水平。所述术语还包括生物标志物的表达在相同疾病的不同阶段被激活至更高或更低的水平。还应理解，差异表达的生物标志物可以在核酸水平或蛋白质水平下被激活抑或被抑制，或者可以经历选择性剪接以产生不同的多肽产物。这类差异可以通过包括mRNA水平、miRNA水平、反义转录物水平、或者多肽的蛋白质表面表达、分泌或其它分配在内的多种变化来证实。差异生物标志物表达可以包括两个或更多个基因或其基因产物之间的表达的比较；或两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比率的比较；或甚至是同一基因的两种不同地加工的产物的比较，其在正常受试者与患有疾病的受试者之间不同；或在同一疾病的不同阶段之间的比较。差异表达包括在例如正常细胞和患病细胞之中、或在经历了不同疾病事件或疾病阶段的细胞之中，生物标志物中的瞬时或细胞表达模式的定量和定性差异。

在某些示例性实施方案中，所述生物标志物是RNA转录物。如本文所用，“RNA转录物”是指编码和非编码RNA，包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)以及反义RNA。测量生物样品中的mRNA可以用作检测所述生物样品中对应蛋白质和基因的水平的替代。因此，本文所描述的任何生物标志物或生物标志物组还可以通过检测适当的RNA来进行检测。生物标志物表达谱分析的方法包括但不限于，定量PCR、NGS、RNA印迹(northern blot)、DNA印迹(southern blot)、微阵列、SAGE、免疫测定(ELISA、EIA、凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹(Western blot)、免疫沉淀法、免疫细胞化学、流式细胞术、Luminex测定)、以及质谱法。给定样品的总体表达数据可以使用本领域技术人员已知的方法进行标准化以便针对起始材料的不同量、萃取和扩增反应的不同效率进行校正。

在某些示例性实施方案中，适用于区分对于抗血管生成治疗剂有反应和无反应的癌症类型的生物标志物可以通过以下方式来确定：鉴别出在如使用所述表达检测方法测定的患者数据集中的样品与以上所讨论的患者样品集之间呈现最高程度的变化性的生物标志物。可以使用本领域中已知用于鉴别表达数据中的高度可变的数据点的标准统计方法来鉴别高度可变的生物标志物。例如，将组合的背景和差异过滤器可以用于所述患者数据集。背景过滤器是基于探针集的选择，其中在指定显著性a的探针集处，高于由背景标准偏差σBg(由Expression Console软件得到)限定的阈值的表达E和表达差异var_E以及标准正态分布z_α的分位点在以下条件下得到保持：

E>log₂((z_aσ_Bg))；log₂((var_E)>2[log₂(σ_Bg)-E-log₂(log(2))]。

其中a限定显著性阈值。在某个示例性实施方案中，所述显著性阈值是6.3·10^-5。在另一个示例性实施方案中，所述显著性阈值可以是在1.0·10^-7至1.0·10^-3之间。

在某些示例性实施方案中，所述高度可变的生物标志物可以进行进一步分析以基于类似的基因表达谱将患者数据集中的样品分成亚型或簇。例如，生物标志物可以基于其表达的上调或下调彼此高度相关的程度来进行聚类。可以使用本领域中已知的不同聚类分析技术。在一个示例性实施方案中，使用了分层合并聚类来鉴别癌症亚型。为了确定每个亚型的生物相关性，可以将每个簇内的生物标志物进一步映射至其对应的基因并且通过交叉参照含有关于与所述基因相关联的生物活性和生物途径的信息的一个或多个基因本体数据库进行注释。在一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能项所富集的簇中的生物标志物被分组到推定的血管生成样品组中并且用于表达签名的产生。在另一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能性术语而上调和富集的簇中的生物标志物被分入推定的血管生成样品组并且用于表达签名的产生。在另一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能性术语而下调和富集的簇中的生物标志物被分入推定的血管生成样品组并且用于表达签名的产生。有关进行生物标志物簇的功能分析的其它细节提供于以下实施例部分中。

在一个示例性实施方案中，适用于获得用于区别对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的癌症亚型的表达签名的生物标志物包括表1A、表1B或两个表中所列出的那些生物标志物。在另一个示例性实施方案中，适用于获得用于区别对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的癌症亚型的表达签名的生物标志物包括组I(包含SEQ ID NO:632至801)或组II(包含SEQ ID NO:802至974)或两组中所列出的那些生物标志物。这些生物标志物被鉴别为具有了确定患者对治疗剂的反应的预测价值。其表达与对于试剂、更确切地说对于抗血管生成治疗剂的反应或反应的缺乏相关。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物的表达，可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最可能降低癌症的生长速率。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物，还可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最不太可能降低癌症的生长速率。通过检查一组生物标志物的表达，因此有可能消除无效的或不当的治疗剂。重要的是，在某些实施方案中，这些确定可以在逐个患者的基础上或在逐个药剂的基础上进行。因此，可以确定具体治疗方案是否可能使特定患者或患者类型受益，和/或具体方案是否应该继续。

表1A：图1的血管生成和免疫反应簇基因

表1B：图6的血管生成和免疫反应簇基因

在某些示例性实施方案中，表1A和表1B中所列举的生物标志物的全部或一部分可以用于表达签名中。在某些其它示例性实施方案中，组I和组II中所列举的生物标志物的全部或一部分可以用于表达签名中。例如，包括表1A、表1B、组I以及组II中的生物标志物的表达签名可以使用本文所提供的方法来产生并且可以包括在一个与全部之间的表1A、1B、组I、组II中所陈述的标志物以及其间的每一组合(例如，四个所选择的标志物、16个所选择的标志物、74个所选择的标志物，等等)。在一些实施方案中，表达签名包括至少5、10、20、40、60、100、150、200、或300或更多个标志物。在其它实施方案中，预测性生物标志物组包括不超过5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500、600或700个标志物。在一个示例性实施方案中，表达签名包括表1A中所列出的多个标志物。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括表1B中列出的多种生物标志物。在又另一个示例性实施方案中，表达签名包括表1A和表1B中所列出的多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括组I中所列出的多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括组II中所列出的多种生物标志物。在又另一个示例性实施方案中，表达签名包括组I和II中所列出的多种生物标志物。在一些实施方案中，表达签名包括至少约1%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%的表1A、表1B、组I、组II或其组合中所列出的标志物。所选择的表达签名可以使用本文所描述的方法和本领域中已知的类似方法由所提供的生物标志物进行组装。在一个实施方案中，表达签名包含表1A中的全部250个基因或基因产物。在另一个示例性实施方案中，表达签名包含表1B中的全部486个基因或基因产物。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括SEQ IDNO:632至801。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括SEQ IDNO:802至974。

4.数学模型

可以使用以下方法获得用于区分对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的受试者或者作为某些癌症类型的预后指标的表达签名，包括源自于以上所公开的生物标志物的表达签名。在某些其它示例性实施方案中，表达签名是使用以下各项来获得：决策树(Hastie等,TheElements of Statistical Learning,Springer,New York2001)；随机森林(Breiman,2001Random Forests,Machine Learning45:5)；神经网络(Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford1995)；判别分析(Duda等,Pattern Classification,第2版,JohnWiley,New York2001)，包括但不限于，线性、对角线性、二次以及逻辑判别分析；微阵列的预测分析(PAM，(Tibshirani等,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6567-6572))；或簇类独立软模式分析(SoftIndependent Modeling of Class Analogy analysis,SIMCA，(Wold,1976,Pattern Recogn.8:127-139))。

生物标志物表达值可以结合基于在不同量值下的实际标度的对应标量权重来限定，其经由代数、统计学习、贝叶斯、回归或类似算法通过线性或非线性的、代数的、三角学的或相关的手段而进一步组合为单一标量值，所述单一标量值连同有关所述标量值的数学推导的决策函数一起提供预测模型，来自样品的表达谱可以通过所述预测模型被归结为对指定药物、药物类别或治疗方案有反应者或无反应者、有抗性或无抗性的独立类别。这类预测模型，包括生物标志物成员，是由来自具有已知药物反应和/或抗性的历史患者样品的一组代表性表达谱根据交叉验证、引导法(bootstrapping)或类似采样技术，通过学习权重以及针对敏感性、特异性、阴性和阳性预测值、风险比或其任何组合优化的决策阈值而开发的。

在一个实施方案中，所述生物标志物被用于形成其信号的加权和，其中单个权重可以是正值或负值。将所得到的和(“表达得分”)与预先确定的参考点或值相比较。与所述参考点或值的比较可以用于诊断或预测临床病状或结果。

如以上所描述，本领域的普通技术人员将会理解表1A、1B、组I以及组II中所提供的分类器中所包括的生物标志物在有关对治疗剂的反应性或抗性的分类器中将具有不相等的权重。因此，虽然可以仅用一个序列来诊断或预测结果，如对治疗剂的反应性，但使用更多的序列可以增加特异性和敏感性或者诊断或预测准确度。

如本文所用，术语“权重”是指统计学计算中一个项目的相对重要性。每种生物标志物在基因表达分类器中的权重可以使用本领域中已知的分析方法根据患者样品的数据集来确定。

在某些示例性实施方案中，表达签名是由决策函数定义。决策函数是使用线性分类器获得的一组加权的表达值。所有线性分类器都使用以下等式来定义决策函数：

f(x)=w’·x+b=∑w_i+x_i+b(1)

所有测量值，如某个样品的微阵列基因表达强度x_i，都被收集在向量x中。然后将每个强度乘以对应权重w_i，在加上偏移项b之后获得决策函数f(x)的值。在得出所述决策函数时，所述线性分类器将进一步限定将基因表达数据空间分割成不相交的两半的阈值。示例性线性分类器包括但不限于，偏最小二乘(PLS)(Nguyen等,Bioinformatics18(2002)39-50)、支持向量机(SVM)(

等,Learning withKernels,MIT Press,Cambridge2002)、以及收缩判别分析(shrinkagediscriminant analysis，SDA)(等,Annals of applied statistics4,503-519(2010))。在一个示例性实施方案中，所述线性分类器是PLS线性分类器。

所述决策函数是基于一大组训练样品凭经验得出的，所述训练样品例如来自对治疗剂显示出反应性或抗性的患者。所述阈值基于不同特征，如但不限于对治疗的反应性/无反应性，来将患者群分开。这一量(即，对治疗剂的截止阈值反应性或抗性)的解释是在开发期(“训练”)由一组具有已知结果的患者得到的。决策得分的对应权重和反应性/抗性截止阈值是固定的，是通过本领域技术人员已知的方法由训练数据得到的先验值。在一个示例性实施方案中，使用了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来确定权重。(L.

S.Wold,J.Chemom.1(1987)185-196;D.V.Nguyen,D.M.Rocke,Bioinformatics18(2002)39-50)。

有效地，这意味着数据空间，即生物标志物表达值的所有可能组合的集合，被分割成对应于不同临床分类或预测的互斥的两半，例如一半对应于对治疗剂的反应性并且另一半对应于无反应性。在整体分类器的背景下，某种生物标志物的相对过表达可以增加决策得分(正权重)抑或减少决策得分(负权重)并且因此有助于(例如)对治疗剂的反应性或抗性的整体决策。

在本发明的某些示例性实施方案中，在应用如以上所描述的加权总和之前，对数据进行非线性转换。这种非线性转换可以包括增加数据的维数。这种非线性转换和加权求和还可以暗中地进行，例如通过使用核函数进行。(

等,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge2002)。

在某些示例性实施方案中，患者训练集数据是通过从对应的癌症组织样品集分离RNA并且将分离的RNA与微阵列杂交来测定表达值而获得的。在某些示例性实施方案中，在获得表达签名中所使用的微阵列是转录组阵列。如本文所用，“转录组阵列”是指含有探针集的微阵列，所述探针集被设计成与已经被核实为在目标患病组织中表达的序列杂交。鉴于组织与生物背景之间的选择性剪接和可变的聚A尾处理，有可能针对源自于另一种组织来源或生物背景的相同基因序列而设计的探针将不会有效地结合至目标患病组织中表达的转录物，从而导致潜在相关的生物信息的损失。因此，在得到微阵列探针集之前核实目标患病组织中表达何种序列是有益的。有关特定疾病背景中表达的序列的核实可以例如通过以下方式来进行：从患病的组织样品集中分离总RNA并进行测序，并且交叉参照所分离的序列与已知的核酸序列数据库以核实转录组阵列上的探针集是针对目标患病组织中实际表达的序列而设计的。用于制备转录组阵列的方法描述于美国专利申请公布号2006/0134663中，其以引用的方式并入本文。在某些示例性实施方案中，所述转录组阵列的探针集被设计成在转录物3’端的300个核苷酸内进行结合。用于设计出具有在靶转录物3’端的300个核苷酸内进行结合的探针集的转录组阵列的方法公开于美国专利申请公布号2009/0082218中，其以引用的方式并入本文。在某些示例性实施方案中，在得到本发明的基因表达谱中使用的微阵列是Almac Ovarian Cancer DSA^TM微阵列(英国克雷加文(Craigavon)的Almac Group)。

最佳的线性分类器可以通过使用如“曲线下面积”(AUC)等诊断法评估线性分类器的性能来进行选择。AUC是指接受者操作特征(ROC)曲线的曲线下面积，两者都是本领域熟知的。AUC量度适用于在整个数据范围内比较分类器的准确度。具有较高AUC的线性分类器在两个目标组(例如，卵巢癌样品与正常样品或对照样品)之间正确地分类未知物的能力更高。ROC曲线适用于绘制一种特定特征(例如，本文所描述的任何生物标志物和/或有关另外的生物医学信息的任何项目)在区别两个群体(例如，对治疗剂有反应和无反应的个体)方面的性能。通常，基于单一特征的值以递升顺序在整个群体(例如，病例和对照)内分选出特征数据。然后，对于所述特征的每个值，计算所述数据的真阳性率和假阳性率。真阳性率是通过对高于所述特征的值的病例数目进行计数，然后除以病例总数来确定。假阳性率是通过对高于所述特征的值的对照的数目进行计数，然后除以对照的总数来确定。虽然这个定义是指与对照相比在病例中特征是升高的情况，但是这个定义还适用于与对照相比在病例中特征较低的情况(在这种情况下，将对低于所述特征的值的样品计数)。ROC曲线可以针对单一特征以及其它单一输出而产生，例如两个或更多个特征的组合可以用数学方式组合(例如，相加、相减、相乘，等等)以提供单一总和值，并且这个单一总和值可以绘制于ROC曲线中。此外，多个特征的任何组合(其中所述组合得到单一输出值)都可以绘制于ROC曲线中。特征的这些组合可以包括试验。ROC曲线是试验的真阳性率(敏感性)针对试验的假阳性率(1-特异性)的图。

在一个示例性实施方案中，表达签名是针对表2A中详述的25种生物标志物，其中表中详述的对应排序和权重或替代性排序和权重取决于例如疾病状况。在另一个示例性实施方案中，表达签名是针对表2B中详述的45种生物标志物，其中表中详述的对应排序和权重或替代性排序和权重取决于例如疾病状况。表2A和2B以在分类器中权重递减的顺序对生物标志物进行排序，定义为在综合决策得分函数中根据交叉验证所测量的平均权重的排序。

表2A对于25-基因签名的基因符号和对应排序的权重

表2B对于45-基因签名的基因符号和对应排序的权重

在一个示例性实施方案中，表达签名包括选自由以下各项组成的组的一种或多种生物标志物：CCDC80、INHBA、THBS2、SFRP2、MMP2、PLAU、FAP、FN1、COL8A1、RAB31、FAM38B、VCAN、GJB2、ITGA5、CRISPLD2、C17、f91、BGN、TIMP3、ALPK2、LUM、NKD2、LOX、MIR1245、LOXL1、以及CXCL12。

在另一个示例性实施方案中，表达签名包括至少CCDC80、INHBA、THBS2及SFRP2、以及选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物CCDC80、INHBA、THBS2及SFRP2、以及选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物CCDC80、和选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23或24。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物INHBA、和选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23或24。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物THBS2、和选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23或24。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物SFRP2、和选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23或24。

在另一个示例性实施方案中，表达签名包括了选自由以下各项组成的组的一种或多种生物标志物：TMEM200A、GJB2、MMP13、GFPT2、POSTN、BICC1、CDH11、MRVI1、PMP22、COL11A1、IGFL2、LUM、NTM、BGN、COL3A1、COL10A1、RAB31、ANGPTL2、PLAU、COL8A1、MIR1245、POLD2、NKD2、FZD1、COPZ2、ITGA5、VGLL3、INHBA、MMP14、VCAN、THBS2、RUNX2、TIMP3、SFRP2、COL1A2、COL5A2、SERPINF1、KIF26B、TNFAIP6、MMP2、FN1、ALPK2、CTSK、LOXL1以及FAP。

在另一个示例性实施方案中，表达签名包括至少TMEM200A、GJB2、MMP13及GFPT2、以及选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物TMEM200A、GJB2、MMP13及GFPT2、以及选自表2B中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物TMEM200A、和选自表2B中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物GJB2、和选自表2a中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物MMP13、和选自表2B中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物GFPT2、和选自表2B中的生物标志物清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。

在一个示例性实施方案中，表达签名包括选自由以下各项组成的组的一种或多种生物标志物：ALPK2、BGN、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN。

在另一个示例性实施方案中，表达签名包括至少ALPK2、BGN、COL8A1、FAP、以及选自生物标志物FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物ALPK2、BGN、COL8A1及FAP、以及选自生物标志物FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物ALPK2、和选自生物标志物BGN、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品的进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物BGN、和选自生物标志物ALPK2、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物COL8A1、和选自生物标志物ALPK2、BGN、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。另一方面，个体中的治疗反应性是通过以下方式预测：对来自所述个体的生物样品进行测定并且检测生物标志物值，每个生物标志物值对应于生物标志物FAP、和选自生物标志物ALPK2、BGN、COL8A1、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3以及VCAN的清单的至少N种另外的生物标志物中的一种，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

在一个示例性实施方案中，表达签名包括了被下调的一组生物标志物。在一个示例性实施方案中，表达签名包括至少GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、PLAU、以及来自表1A或表1B的至少N种另外的生物标志物，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括至少GJB2、和来自表1A或表1B的至少N种另外的生物标志物，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括INHBA、和来自表1A或表1B的至少N种另外的生物标志物，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括THBS2、和来自表1A或表1B的至少N种另外的生物标志物，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括至少SFRP2，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括PLAU、和来自表1A或表1B的至少N种另外的生物标志物，其中N是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70。在另一个示例性实施方案中，表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、PLAU、以及至少约1%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%的表1A、表1B或其组合中所列出的生物标志物。

使用表达签名对新试验样品进行分类

为了使用表达签名(如以上所描述的那些)来对新试验样品进行分类，测量癌症组织中生物标志物的相对表达水平以形成试验样品表达谱。在某些示例性实施方案中，将所述试验样品表达谱以综合决策得分(“表达得分”)的形式进行汇总并且与由患者数据的训练集以数学方式得出的阈值得分相比较。得分阈值基于不同特征，如但不限于对治疗的反应性/无反应性，来将患者群分开。患者训练集数据优选是源自于已经通过预后、复发可能性、长期存活率、临床结果、治疗反应、诊断、癌症分类或个体化的基因组谱表征的癌症组织样品。可以将由患者样品得到的表达谱和对应的决策得分与训练集中在以数学方式得出的得分决策阈值的同侧的患者样品的特征相关联。对线性分类器标量输出的阈值进行优化以使根据交叉验证如在所述训练数据集内所观察到敏感性与特异性的总和最大化。

使用本领域技术人员已知的方法将给定样品的总体表达数据标准化以便针对起始材料的不同量、提取和扩增反应的不同效率等等进行校正。

在一个实施方案中，通过线性分类器来评估患者组织样品的生物标志物表达谱。如本文所用，线性分类器是指将单个生物标志物强度的加权总和变为综合决策得分(“决策函数”)。然后将所述决策得分与预先限定的截止得分阈值相比较，所述阈值对应于依据敏感性和特异性的某个设定点，所述设定点指示了样品是高于所述得分阈值(决策函数为正)还是低于所述得分阈值(决策函数为负)。

使用基于标准化的数据的线性分类器有效地实现诊断或预后(例如对治疗剂的反应性或抗性)意思指借助于分离超平面将数据空间(即，所述分类器中全部基因的表达值的所有可能组合)分割成不相交的两半。这种分割是基于例如一大组训练实例凭经验获得的，所述训练实例是例如来自对治疗剂显示出反应性或抗性的患者。在不失一般性的情况下，可以针对除一个以外的所有生物标志物假定某一组固定的值，所述值将自动地限定这一剩余生物标志物的阈值，其中决策将在例如对治疗剂的反应性或抗性间变化。然后高于这个动态阈值的表达值将指示对治疗剂的抗性(对于具有负权重的生物标志物来说)抑或反应性(对于具有正权重的生物标志物来说)。这一阈值的精确值取决于所述分类器内所有其它生物标志物的实际测量的表达谱，但某些生物标志物的一般指示仍是固定的，即，高的值或“相对过表达”总是有助于反应性(具有正权重的基因)抑或抗性(具有负权重的基因)。因此，在总体基因表达分类器的背景下，相对表达可以指示某种生物标志物的上调抑或下调是否指示对治疗剂的反应性或抗性。

取决于待测定的生物标志物的类型，存在多种适合的方法用于测量试验样品的表达谱。测量生物样品中的mRNA可以用作检测所述生物样品中对应蛋白质的水平的替代。因此，本文所描述的任何生物标志物或生物标志物组还可以通过检测适当的RNA来进行检测。基因表达谱分析的方法包括但不限于，微阵列、RT-PCT、qPCR、NGS、RNA印迹、SAGE、质谱法。

mRNA表达水平是通过反转录定量聚合酶链式反应(RT-PCR，接着用qPCR)来测量。RT-PCR被用于由mRNA产生cDNA。cDNA可以用于qPCR测定中以随着DNA扩增过程进展而产生荧光。通过与标准曲线相比较，qPCR可以产生绝对测量值，如每个细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、侵入测定(Invader assay)、以及RT-PCR结合毛细管电泳都已经被用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets编著,Humana Press,2004。

miRNA分子是非编码但可以调控基因表达的小RNA。适合于测量mRNA表达水平的任何方法也可以用于对应的miRNA。最近，许多实验室已经研究了使用miRNA作为疾病的生物标志物。许多疾病涉及广泛的转录调控，并且miRNA可以用作生物标志物也不足为奇。miRNA浓度与疾病之间的关联经常甚至不如蛋白质水平与疾病之间的关联那么清楚，但是miRNA生物标志物的价值可能是显著的。当然，与在疾病过程中差异表达的任何RNA一样，开发体外诊断产品所面临的问题将包括以下要求：miRNA在患病的细胞中存活并且容易提取以用于分析，或miRNA被释放至血液或其它基质中，在其中它们必须存活足够长的时间以便被测量到。蛋白质生物标志物具有类似要求，不过许多潜在的蛋白质生物标志物有意地在发病部位分泌并且在疾病过程中以旁分泌的方式起作用。许多潜在的蛋白质生物标志物被设计成在合成那些蛋白质的细胞的外部起作用。

还可以使用质谱方法来评估基因表达。可以使用多种质谱仪配置来检测生物标志物值。几种类型的质谱仪是可供使用的或可以按不同配置来制造。一般来说，质谱仪具有以下主要部件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、以及仪器控制系统和数据系统。样品入口、离子源以及质量分析器的差异通常限定了仪器的类型和其性能。例如，入口可以是毛细管柱液相色谱源或可以是直接探针或台，如基质辅助激光解吸中所使用的。常见的离子源是例如电喷雾(包括纳米喷雾和微米喷雾)或基质辅助激光解吸。常见的质量分析器包括四极滤质器、离子阱质量分析器以及飞行时间质量分析器。另外的质谱方法是本领域熟知的(参见Burlingame等,Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman,New York(2000))。

蛋白质生物标志物和生物标志物值可以通过以下任何方法来检测和测量：电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)、硅解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术(称为ultraflex III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)^N、大气压光电离质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS以及APPI-(MS)^N、四极质谱法、傅里叶变换质谱法(FTMS)、定量质谱法及离子阱质谱法。

在质谱表征蛋白质生物标志物和测定生物标志物值之前，使用样品制备策略来标记和富集样品。标记方法包括但不限于，用于相对定量和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)以及在细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记(SILAC)。用于在质谱分析之前选择性地富集候选生物标志物蛋白质样品的捕获试剂包括但不限于，适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合的受体、亲和体(affybody)、纳米抗体(nanobody)、锚蛋白、域抗体、替代性抗体支架(例如双特异抗体(diabody)等等)印记的聚合物、高亲合性多聚体(avimer)、肽模拟物、类胨、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体及合成受体，以及这些的修饰形式和片段。

上述测定能够检测在用于预测癌症治疗剂的反应性的方法中有用的生物标志物值，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少N个生物标志物值，每个生物标志物值对应于选自由表1A、1B、2A、2B或组I和II中所提供的生物标志物组成的组的生物标志物，其中使用所述生物标志物值进行的分类(如在以下详细描述的)指示所述个体是否将对治疗剂有反应。虽然某些所描述的预测性生物标志物仅适用于预测对治疗剂的反应性，但本文还描述了用于将所述生物标志物的多个子集分组的方法，所述子集各自作为一组两种或更多种生物标志物是有用的。因此，本申请的不同实施方案提供了包含N种生物标志物的组合，其中N是至少三种生物标志物。应理解，所选择的N可以是来自以上描述的范围以及类似但更高级的范围中的任一个的任何数目。根据本文所描述的任何方法，可以检测到生物标志物值并且单独地对其进行分类，或可以对其加以检测并且进行集体分类，如例如以多重测定的形式。

b)微阵列方法

在一个实施方案中，本发明利用了“寡核苷酸阵列”(本文又称为“微阵列”)。微阵列可以用于分析细胞中生物标志物的表达，并且特别是用于测量癌症组织的生物标志物的表达。

在一个实施方案中，生物标志物阵列是通过将表示存在于细胞中的mRNA转录物的可检测地标记的多核苷酸(例如，由总细胞mRNA或标记的cRNA合成的荧光标记的cDNA)与微阵列杂交来产生。微阵列是具有细胞或生物体的基因组中许多基因，优选大多数或几乎全部基因的产物的结合(例如，杂交)位点的有序阵列的表面。可以按本领域已知的多种方式来制造微阵列。无论如何制造，微阵列都共有某些特征。这些阵列是可再现的，从而允许产生给定阵列的多个拷贝并且容易相互比较。优选微阵列是较小的，通常小于5cm²，并且它们是由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中的给定结合位点或独特的结合位点集合将特异性地结合细胞中单个基因的产物。在一个具体实施方案中，使用了在每个位置处含有已知序列的附加核酸的可按位置寻址的阵列。

应理解，当产生与细胞的RNA互补的cDNA并且将其在适合的杂交条件下与微阵列杂交时，与阵列中对应于任何特定基因的位点的杂交水平将反映细胞中由所述基因/生物标志物转录的mRNA的广泛性。例如，当将与总细胞mRNA互补的可检测地标记(例如，用荧光团)的cDNA或cRNA与微阵列杂交时，阵列上对应于未在细胞中转录的基因(即，能够特异性地结合所述基因的产物)的位点将具有很少或没有信号(例如，荧光信号)，并且所编码的mRNA广泛的基因将具有相对较强的信号。选择的核酸杂交和洗涤条件应使得探针与特定阵列位点“特异性地结合”或“特异性地杂交”，即，探针与具有互补核酸序列的序列阵列位点杂交、形成双链体(duplex)或结合，但不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如本文所用，如果多核苷酸中较短的一个是少于或等于25个碱基，使用标准碱基配对规则不存在错配，或如果多核苷酸中较短的一个是长于25个碱基，存在不超过5%的错配，此时认为一个多核苷酸序列与另一个互补。优选地，多核苷酸是完全互补的(没有错配)。通过使用常规实验进行包括阴性对照在内的杂交测定可以证实，特定杂交条件引起特异性杂交。

最佳的杂交条件将取决于标记的探针和固定的多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如，低聚物对比大于200个碱基的多核苷酸)和类型(例如，RNA、DNA、PNA)。有关用于核酸的特定(即，严格)杂交条件的一般参数描述于Sambrook等(同上)和Ausubel等,“Current Protocolsin Molecular Biolog”,Greene Publishing and Wiley-interscience,NY(1987)中，其以整体并入用于所有目的。当使用cDNA微阵列时，典型杂交条件是在65C下，在5xSSC加0.2%SDS中杂交4小时，接着在25℃下在低严格度洗涤缓冲液(1xSSC加0.2%SDS)中洗涤，接着在25℃下在高严格度洗涤缓冲液(0.1SSC加0.2%SDS)中洗涤10分钟(参见Shena等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第93卷,第10614页(1996))。有用的杂交条件还提供于例如Tijessen,Hybridization WithNucleic Acid Probes”,Elsevier Science Publishers B.V.(1993)和Kricka,“Nonisotopic DNA Probe Techniques”,Academic Press,San Diego,Calif.(1992)中。

c)免疫测定方法

免疫测定方法是基于抗体与其对应靶或分析物的反应并且可以取决于具体的测定形式来检测样品中的分析物。为了改进基于免疫反应性的测定方法的特异性和敏感性，单克隆抗体由于其特异性表位识别而被经常使用。多克隆抗体也由于其对靶的亲和力相比单克隆抗体有所增加而被成功地用于不同免疫测定中。已经设计出用于广泛范围的生物样品基质的免疫测定。已经设计出提供定性、半定量以及定量结果的免疫测定形式。

定量结果可以通过使用以已知浓度的待检测的特定分析物产生的标准曲线来产生。将来自未知样品的反应或信号绘制到所述标准曲线上，并且确定对应于所述未知样品中的靶的量或值。

已经设计出许多免疫测定形式。ELISA或EIA可以定量地检测分析物/生物标志物。这种方法依赖于标记与分析物抑或抗体的附接，并且标记组分直接地抑或间接地包括酶。ELISA试验的形式可以针对分析物的直接、间接、竞争性或夹心检测。其它方法依赖于标记，如例如放射性同位素(I¹²⁵)或荧光。另外的技术包括例如凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹、免疫沉淀法、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定以及其它(参见ImmunoAssay:APractical Guide,由Brian Law编著,Taylor&Francis,Ltd.出版,2005版)。

示例性测定形式包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光、化学发光、以及荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀，接着进行允许大小和肽水平判别的定量方法，如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱法等。

检测和/或定量可检测的标记或产生信号的材料的方法取决于标记的性质。由适当酶所催化的反应的产物(其中可检测的标记是酶；参见以上)可以是(但不限于)荧光的、发光的或放射性的，或它们可以吸收可见光或紫外光。适合用于检测这类可检测的标记的检测器的实例包括但不限于，x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计以及光密度计。

用于检测的任何方法都可以按允许反应的任何适合的制备、处理以及分析的任何形式来进行。这可以是例如在多孔测定板(例如，96孔或384孔)中进行或者使用任何适合的阵列或微阵列进行。用于不同试剂的储备溶液可以手动地或自动地制备，并且所有后续的移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读出、数据收集以及分析都可以使用可商购获得的分析软件、机器人技术(robotics)以及能够检测可检测的标记的检测仪器自动地进行。

试剂盒

用于进行本文所描述的方法的试剂、工具和/或说明书可以被提供于试剂盒中。例如，试剂盒可以包含用于确定癌症患者的适当疗法的试剂、工具以及说明书。这种试剂盒可以包括用于从患者收集(如通过活组织检查)组织样品的试剂，和用于处理所述组织的试剂。所述试剂盒还可以包括用于进行基因或基因产物表达分析的一种或多种试剂，如用于进行RT-PCR、qPCR、RNA印迹、蛋白质组学分析或免疫组织化学以确定患者样品中的基因或基因产物标志物的表达水平的试剂。例如，这类试剂盒中可以包括用于进行RT-PCR的引物、用于进行RNA印迹分析的探针、和/或用于进行蛋白质组学分析(如蛋白质免疫印迹、免疫组织化学以及ELISA分析)的抗体。还可以包括用于测定的适当的缓冲液。还可以包括这些测定中的任一种所需的检测试剂。适当的试剂和方法在以下进行更详细的描述。

本文所表征的试剂盒还可以包括一份说明单，它描述了如何进行这些测定来测量基因或基因产物表达。说明单还可以包括有关如何确定参考组的说明，包括如何确定参考组中的基因或基因产物标志物的表达水平和如何汇编表达数据以确立用于与试验患者相比较的参考。说明单还可以包括有关测定试验患者中基因或基因产物的表达和有关将所述表达水平与参考组中的表达相比较以便随后确定用于所述试验患者的适当化学疗法的说明。用于确定适当化学疗法的方法在以上进行了描述并且可以在说明单中详细地描述。

试剂盒中所包括的信息材料可以是涉及本文所描述的方法和/或用于本文所描述的方法的试剂的使用的描述性、指导性、销售或其它材料。例如，试剂盒的信息材料可以包含联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的使用者可以获得关于进行基因表达分析和解释结果的大量信息，特别是在它们应用于可能对特定治疗剂具有阳性反应的人类时。

本文所表征的试剂盒还可以包含从基因产物标志物表达推断可能对特定治疗剂具有阳性反应的患者所需的软件。

治疗剂

如以上所描述，本文所描述的方法允许将患者分类为对靶向肿瘤内的血管生成过程和信号传导的治疗剂有反应的和无反应的。用于治疗癌症的一些当前这类治疗剂包括但不限于以下药剂：VEGF途径靶向性治疗剂，包括多靶向途径抑制剂(VEGF/PDGF/FGF/EGFT/FLT-3/c-KIT)、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、免疫调节剂。VEGF特异性抑制剂包括但不限于，贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂(VEGFTrap))、IMC-1121B(礼来单抗)。多靶向途径抑制剂包括但不限于，伊马替尼(格列卫(Gleevec))、索拉非尼(蕾莎瓦(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、埃罗替尼、替沃扎尼(Tivozinib)、西地尼布(雷森汀(Recentin))、帕唑帕尼(福退癌(Votrient))、BIBF1120(瓦盖特(Vargatef))、多韦替尼、司马沙尼(索格(Sugen))、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛(Zactima))、尼罗替尼(达希纳(Tasigna))、达沙替尼(扑瑞赛(Sprycel))、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、TKI-258。血管生成素-TIE2途径抑制剂包括但不限于，AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(赫赛汀)。内源性血管生成抑制剂包括但不限于，血小板反应蛋白(Thombospondin)、内皮生长抑素(Endostatin)、肿瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑素(Angiostatin)、血管形成抑制素、干扰素α。免疫调节剂包括但不限于，沙利度胺和来那度胺。

本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。相反，应当清楚地理解，在不背离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，可以采取各种其它实施方案、修改以及等效物，它们是在阅读了本文的说明之后本领域技术人员可以想到的。

实施例

实施例1：组织处理、分层聚类、亚型鉴别以及分类器产生

肿瘤材料

示例性表达签名是由来源于NHS落锡安和爱丁堡大学的一组手工刮取的上皮浆液性卵巢肿瘤FFPE组织样品的基因表达分析鉴别的。

用于定义浆液性、子宫内膜样、透明细胞以及粘液性组织学的上皮性卵巢癌的组织学分类方案最近已经得到更新。其后果之一是以前被分类为子宫内膜样的许多肿瘤现在被分类为浆液性的。(McCluggage,W.G.“Morphological subtypes of ovarian carcinoma:areview with emphasis on new developments and pathogenesis,”PATHOLOGY,2011年8月;43(5):420-32)。用于这项研究中的浆液样品是在1984与2006年间采集的一大组所有组织学的上皮性卵巢癌样品之中。用于指定组织学状态的病理分析是由病理学家在采集时于每个中心进行。在2012年3月和4月间，这些上皮卵巢样品中有357份的组织学分类由两个独立顾问卵巢癌病理学家根据修订的方案进行了复查。由此产生了如表3所指示的这些样品中的数份的重新分类。

表3：357份上皮性卵巢癌样品的病理学复查结果

(原始组织学状态呈现于行中，并且更新的组织学状态呈现于列中。)

原始的/更新的	透明细胞	子宫内膜样	粘液性	浆液性	总计
						透明细胞	19	1	0	5	25
子宫内膜样	2	33	0	38	73
						粘液性	0	1	8	1	10
其它混合的	3	5	0	8	16
						浆液性	1	3	1	193	198
浆液性/子宫内膜样	0	2	0	25	27
						未分类的	0	0	0	4	4
未分化的	1	0	0	3	4
						总计	26	45	9	277	357

以下所鉴别的原始的三种浆液性亚型和因此在以下实施例中描述的25-基因签名(图1)是由根据原始病理学家报告被分类为浆液性的199份样品鉴别的。使用更新的病理学分类方法对被分类为III期和IV期高分级浆液性卵巢癌的277份样品进行类似的生物信息学分析。这项分析鉴别了图2中详述的更新的浆液性亚组并且因此被用于定义45-基因签名。

来自FFPE的基因表达谱分析

使用高纯度RNA石蜡试剂盒(High Pure RNA Paraffin Kit)(德国曼海姆的Roche Diagnostics GmbH)从手工刮取的FFPE组织提取出总RNA。将RNA转化成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，随后使用WT-Ovation^TMFFPE RNA扩增系统V2的

技术(美国加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN Technologies Inc.)进行扩增并且将其转化成单链形式。然后将扩增的单链cDNA片段化并且使用FL-Ovation^TMcDNA生物素模块V2(NuGEN Technologies Inc.)进行生物素标记。然后，将经过片段化并且标记的cDNA与Almac Ovarian Cancer DSA^TM杂交。Almac的Ovarian Cancer DSA^TM研究工具已经针对FFPE组织样品分析进行了优化，从而能够使用有价值的存档组织库。AlmacOvarian Cancer DSA^TM研究工具是表示正常和癌性卵巢组织中的转录组的一种创新的微阵列平台。因此，Ovarian Cancer DSA^TM提供了卵巢疾病和组织环境内的转录组的全面表示，这是使用通用微阵列平台不可获得的。使用Affymentrix

扫描仪7G(加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara)的Affymetrix Inc.)来扫描阵列。

数据准备

使用MAS5预处理算法进行表达谱分析的样品的质量控制(QC)。解决了不同的技术方面：平均噪声和背景均匀性、当前呼叫的百分比(阵列质量)、信号质量、RNA质量以及杂交质量。分析了对应参数的分布和中值绝对偏差并且将其用于鉴别可能的离群值。

Almac的Ovarian Cancer DSA^TM包含主要靶向在3’端的300个核苷酸内的区域的探针。因此，标准Affymetrix RNA质量量度适用于3’端探针集的管家基因强度，其中除常用的3’/5’比率之外，还使用了3’端探针集强度与平均背景强度的比率。检查杂交对照以确保其强度和当前呼叫与Affymetrix所指定的要求一致。

由上皮浆液性卵巢癌训练集的表达谱分析产生的原始数据的预处理是在利用稳健多阵列分析(Robust Multi-array Analysis，RMA)的Expression Console v1.1中进行的。

分层聚类和功能分析

a.分层聚类分析

分层聚类技术被应用于由使用Ovarian Cancer DSA^TM(疾病特异性阵列)平台分析上皮浆液性卵巢肿瘤所得到的微阵列数据。使用标准的稳健多芯片算法(Robust Multichip Algorithm，RMA)程序对原始表达数据进行预处理。鉴别并且去除数据集中的非生物性系统差异。鉴别出表达水平随肿瘤显著变化的那些探针集。这些探针集形成了内在列表。

基于所述内在列表进行二维聚类分析(肿瘤，探针集)以确立肿瘤关系。应用分层合并聚类(皮尔逊相关(Pearson correlation)—原始分析—或欧几里德距离(Euclidean distance)—更新的分析—以及华德连锁(Ward’s linkage))。使用GAP指数选择最佳的分区数(Tibshirani等,2002,J.R.Stat.Soc.,63:411-423)。将簇亚组中可获得的所有探针集映射至基因名称。

b.基因簇的功能分析

为了确立探针集簇的功能显著性，将探针集映射至基因(Entrez基因ID)并且进行富集分析。基于超几何函数计算富集显著性(应用错误发现率(Benjamini和Hochberg,1995,J.R.Stat.Soc.57:289:300))。使用Almac Diagnostics专有的功能富集工具(Functional EnrichmentTool，FET)对通过上皮浆液性卵巢癌样品的分层聚类所产生的每个基因组中生物过程和途径的过表达进行分析。所述分析中排除反义探针集。评定每个富集的功能实体种类的超几何p值。选择具有最高p值的功能实体种类作为组的代表并且基于代表的显著性(即p值)将代表这些功能实体的一般功能类别分配至基因簇。

为了使用原始的199个上皮浆液性卵巢肿瘤产生血管生成分类器，将针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能项所富集的簇中的基因分组到推定的血管生成基因组中并且用于签名产生。选择血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能项中所涉及的基因呈现高表达的样品簇用于分类并且将其标记为‘血管生成’。这些功能项中所涉及的基因未显示高表达的那些被标记为‘非血管生成’。

为了使用重新分类的265个上皮浆液性卵巢肿瘤产生血管生成分类器，将针对血管生成和血管系统发育一般功能项所富集的簇中的基因分组到推定的血管生成基因组中并且用于签名产生。选择血管生成和血管系统发育一般功能项中所涉及的基因呈现高表达的样品簇用于分类并且将其标记为‘血管生成’。这些功能项中所涉及的基因未显示高表达的那些被标记为‘非血管生成’。

在基因水平上分类器的产生

为了有助于在多个阵列平台内进行分类器的验证，在基因水平上产生血管生成分类器。以下步骤概述了用于基因水平签名产生的程序(每个步骤都是在内部交叉验证内使用重复10次的5倍交叉验证来进行)。

基因水平的签名产生

■预处理：

○RMA背景校正。

○参考基因集是卵巢DSA平台特有的那些基因(仅正义探针集)。

○基因水平汇总可以分两个步骤进行：首先通过计算探针集中的探针的中值表达进行探针到探针集的汇总；其次，计算映射至参考分布中的每个基因的(仅正义)探针集的中值表达，从而产生“基因水平”的表达矩阵。

○分位点标准化是在完整基因表达数据矩阵上进行的并且使用了源自于训练数据的参考分位点在每轮交叉验证内对试验样品进行标准化。

■特征选择：通过差异、强度以及与cDNA浓度的相关性过滤掉75%的基因，接着基于CAT得分进行递归特征消除(RFE)抑或过滤特征选择(FFS)。

■分类算法：偏最小二乘(PLS)、SDA(收缩判别分析)以及DSDA(对角SDA)。

模型选择

用于模型选择的标准是在内部交叉验证和特征消除内的AUC。基于基因本体论使用FET在交叉验证内进行的特征的功能富集、包括两组技术重复的中间验证集(对于这两组技术重复，重复样品的签名得分的标准偏差已在交叉验证和特征消除内进行评估)，以及在交叉验证内关于临床和技术因素(表4中所列的因素)的独立性的评定。

应注意，由于亚组(即，种类标记)是使用来自用于签名产生的同一样品组的微阵列表达得到的，故在基于AUC的任何性能估计中都存在预期的正偏差。这突出了通过包括另外的度量(如功能富集)并且评定关于临床和技术因素的独立性来拓宽用于模型选择的标准的重要性。

表4所调查的临床和技术因素的列表

计算验证数据集的分类器得分

使用RMA对所有数据集进行预处理。对于每个验证集，确定映射到分类器基因的探针集，反义探针集(如果适用的话)除外。有关Affymetrix Plus2.0和U133A阵列的注解是可从Affymetrix网站获得的。计算出映射到分类器中每个基因的所有探针集的中值强度，从而产生基因强度矩阵。然后将分类器应用于这一数据矩阵以产生每个样品的分类器得分/预测。

单变量和多变量分析

可以关于成角质细胞瘤数据集进行单变量和多变量分析以分别评定血管生成亚型分类器与存活率之间的关联，并且确定所述关联(如果有的话)是否独立于已知的临床预测因子。在MATLAB中使用逻辑回归来计算单变量分析的p值。对于多变量分析，使用了来自逻辑回归的似然比检验，其中p值表示当将具有临床协变量和预测的模型与仅具有临床协变量的简化模型相比较时对数似然值的下降。似然比检验测量了在存活率模型中基因预测因子的重要性，并且突出了它作为预测因子相对于所述临床预测因子的独立性。在单变量和多变量分析中，使用p值<0.05作为显著性的标准。此外，在这一评定中排除了具有未知临床因素的样品。

结果

鉴别亚组以及由原始和更新的组织学分类产生签名

分层聚类分析

特征选择从原始上皮浆液性卵巢癌数据集(199份样品)中选出了1200个探针集并且从重新分类的上皮浆液性卵巢癌数据集(265份样品)中选出了1400个PS。GAP分析揭示了这两个样品集内的三个样品簇和三个探针集簇组(图1、图6)。

将肿瘤分类成‘血管生成’或‘非血管生成’样品组

将样品分类为‘血管生成’或‘非血管生成’是基于上皮浆液性卵巢癌数据集的功能分析的结果(图1图6)。本研究的目的是在转录组水平上表征将能够确定致病细胞对于抗血管生成剂的反应性或抗性的一组基因并且潜在鉴别可以受益于抗血管生成疗法的患者。基于这一点，将选择上皮浆液性卵巢癌数据集内最佳表示这种生物学的那些样品并且将其与剩余样品相比较用于分类器产生(参见下一部分)。由此决定，来自原始上皮浆液性卵巢癌样品集(199份样品)内样品血管生成簇的样品是用于这一选择的最相关的样品，因为这些样品显示出在与血管生成和免疫反应过程和途径(如由功能分析所限定)有关的信号传导中所涉及的基因上调(图2A和2B)。由此决定，来自重新分类的上皮浆液性卵巢癌样品集(265份样品)内样品簇三的样品是用于这一选择的最相关的样品，因为这些样品显示出在与血管生成反应过程和途径(如由功能分析所限定)有关的信号传导中所涉及的基因上调(图2A和2B)。

相同的分层聚类方法被应用于105份乳癌样品。乳癌中的主要生物学是ER状态并且因此为了鉴别所述样品的生物学中的结构，这个组被分成2个群体用于聚类分析。鉴别了血管生成和血管系统发育亚型(图12A和12B)，从而证明来自乳癌样品的血管生成亚型的说明。

血管生成亚型分类器模型的产生和验证

为便于参考，以下步骤是参考源自于表1A或表1B的表达签名进行详述。然而，类似的程序可以应用于其它推定的血管生成亚型相关性生物标志物簇，如SEQ ID NO:632至801和SEQ ID NO:802-974中所公开的那些。在鉴别了形成推定的‘血管生成’亚组的一类肿瘤之后，参照功能性‘血管生成’(血管生成、血管系统发育、免疫反应)基因清单(表1A或表1B)对这些肿瘤与所述肿瘤组中的所有其它肿瘤进行计算分类以鉴别精细的基因分类模型，所述模型分类所述‘血管生成’亚型。

使用分类流水线(classification pipeline)，使用上皮浆液性卵巢癌样品集来获得模型。分类流水线已经根据普遍接受的良好实践来开发(MAQC Consortium,Nat Biotechnol2010)。所述过程将并行地：1)由经验数据获得基因分类模型；并且2)评定所述模型的分类性能，二者均在交叉验证下进行。分类器的性能和其成功产生取决于可以改变的大量参数，例如分类方法或探针集过滤的选择。考虑到这一点，评估了两个特征集：(i)具有75%差异/强度过滤的完整特征清单(其中强制纳入血管生成基因清单，表1A)和(ii)仅血管生成基因清单；并且评估了三种分类算法，即PLS；SDA以及DSDA。在整个模型开发中都使用了RFE，它是在每次迭代时去除排在最后的特征部分；当仅留下最少数目的特征时停止的一种迭代程序。AUC被用于评定分类性能，因为这一量度独立于各组间的截止点以及数据中的患病率(prevalencerate)。它还是针对分类性能的认可的供选择的量度之一。因此，基于根据交叉验证的平均AUC来选择每个模型的最佳数目的特征。

依据以上所描述的分析，PLS FFS模型被认为是最适合的分类器模型。使用PLS回归来计算每个基因的权重，从而得到最终的基因分类器模型(对于原始方法，25-基因分类器模型，并且对于反映了标准组织学方案的最近变化的重新分类的样品，45-基因分类器)，所述模型可以用于对来自不同阵列平台的外部数据集进行验证。基因签名开发过程是集中在与血管生成相关的本体过程和途径的鉴别以便确保所开发的任何特征的生物学相关性。因此，对两种标签进行功能分析以便量化它们与血管生成和相关过程的相关性。图3和图8中的显著性过程与血管生成和血管系统发育有关。

实施例2：血管生成亚型和血管生成分类器模型的计算机模拟验证

通过原始Almac上皮浆液性卵巢癌数据集和两个独立数据集内的ROC(接受者操作特征)曲线下面积(AUC)对25-基因血管生成分类器模型(原始方法)和45-基因血管生成分类器模型(重新分类方法)的性能进行验证。AUC是在所观察的疾病规模上计算的统计数值，并且是使用分类器模型预测表型的功效的量度(Wray等,PLoS Genetics第6卷,1-9)。AUC为0.5是随机分类器特有的，并且AUC为1.0将表示种类的完美分离。因此，为了确定所述血管生成亚型分类器模型是否能够预测对于抗血管生成卵巢癌治疗药物种类(作为单一药剂抑或与标准护理疗法组合)的反应并且选择用于所述抗血管生成卵巢癌治疗药物种类的患者，假设在应用之后这些数据集内的AUC应高于0.5，并且最低置信区间也高于0.5。

分类器模型应用于独立的微阵列临床数据集

为了评定25-基因分类器模型和45-基因分类器模型的预后能力，将其应用于77份成胶质细胞瘤样品的数据集，所述样品是从无先前疗法的患者(>21岁)在初始手术切除时取得的(Phillips等,2006)。

这一分析揭示，25-基因分类器模型与成胶质细胞瘤的预后独立地相关。重要的是，在多变量Cox分析中，发现所述血管生成签名是存活率的预后因素，与世界卫生组织(WHO)肿瘤分级和/或坏死因子的存在无关(p=0.37)。这些临床因素均与成胶质细胞瘤的存活率相关。与血管生成低的组相比，血管生成高的组与显著更差的存活率相关(危险比=1.7814，p=0.0269)。这指示25-基因分类器是成胶质细胞瘤的存活率的独立预后生物标志物。

分类器模型应用于独立的前列腺癌细胞系数据集

为了评定25-基因分类器模型和45-基因分类器模型的预测能力，将其应用于用达沙替尼治疗之后的16个前列腺细胞系的数据集。所述细胞系基于细胞增殖测定被定义为‘反应者’或‘无反应者’。这一分析揭示，25-基因分类器模型与对达沙替尼的反应相关，其中AUC为0.8364(CI=0.5255-1.0000)，由此指示25-基因分类器预测了对达沙替尼的反应。所述分析揭示，45-基因分类器模型与对同一化合物的反应相关，其中AUC为0.9455(CI=0.7949-1.0000)，由此指示45-基因分类器也预测了对达沙替尼的反应。

实施例4：卵巢癌的抗血管生成“无反应性”亚组的鉴别和计算机模拟验证

在新分类为浆液性的265份样品的分层聚类得到的簇2中的所有样品中，探针集簇2中血管生成基因的表达是下调的(图6和图10)。样品簇2中的这些样品具有比来自组合在一起的簇1和3的样品中的其余浆液样品更好的预后，如图11中所证明。这指示，这个组是由表2B中鉴别的血管生成基因的表达下调所限定。具有基因下调的患者涉及血管生成并且因此这个亚组被称为“无反应”组。这一表型也已经在ER+和ER-乳癌中进行了鉴别，如可以参见图12A中的中间样品组和图12B中的第二样品组。

参考文献

1.Friedman HS，Prados MD，Wen PY，et al.Bevacizumab alone and in combination withirinotecan in recurrent glioblastoma.J Clin Oncol；27：4733-40(2009).

2.Hurwitz H，Fehrenbacher L，Novotny W，et al.Bevacizumab plus irinotecan，fluorouracil，and leucovorin for metastatic colorectal cancer.NEngl J Med；350 ：2335-42(2004).

3.Rini BI，Halabi S，Rosenberg JE，et al.Bevacizumab plus interferon alfa compared withinterferon alfa monotherapy in patients with metastatic renal cell carcinoma：CALGB 90206.JClinOncol； 26：5422-8 (2008).

4.Sandler A，Gray R，Perry MC，et al.Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab fornon-small-cell lung cancer.NEngl J Med；355：2542 50(2006).

5.Wolmark N，Yothers G，O′Connell MJ，et al.A phase III trial comparing mFOLFOX6 tomFOLFOX6 plus bevacizumab in stage II or III carcinoma of the colon：results of NSABPprotocol C-08.J Clin Oncol；27：LBA4 (2009).

6.Yang JC，Haworth L，Sherry RM，et al.，A randomized trial of bevacizumab，an anti-vascularendothelial growth factor antibody，for metastatic renal cancer，N EnglJ Med 349 427-434(2003).

7.Willett CG，Boucher Y，di Tomaso E，et al.，Direct evidence that the VEGF-specific antibodybevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer，Nat.Med.1 0，145-147(2004).

8.Miller K，Wang M，Gralow J，et al.，Paclitaxe l plus bevacizumab versus paclitaxel alone formetastatic breast cancer，NEnglJMed357 2666-2676 (2007).

9.Miller KD，Chap LI，Holmes FA，et al.，Randomized phase III trial of capecitabinecompared with bevacizumab plus capecitabine in patients with previously treated metast aticbreast cancer，J Clin Oncol23 792 799 (2005).

10.O′Shaughnessy J，Miles D，Gray RJ，et al.，A meta-analysis of overall survival data fromthree randomized trials of bevacizumab(BV)and first-line chemotherapy as treatmentforpatients with metastatic breast cancer(MBC)，JClin Oncol28(suppl)(abstr1005)(2010).

11.Reck M，von Pawel J，Zatloukal P，et al.，Phase III trial of cisplatin plus gemcitabine witheither placebo or bevacizumab as first-line therapy for nonsquamous non-small-cell lung cancer：AVAil，J Clin Oncol27，1227 1234(2009).

12.Escudier B，Bellmunt J，N egrier S et al.，Phase III trial of bevacizumab plus interferon alfa-2a in patients with metastatic renal cell carcinoma(AVOREN)：final analysis of overall surviv al，JClin Oncol28，2144-2150(2010)

13.Burger RA，Sill MW，Monk BJ，et.al.Phase II trial of bevacizumab in persistent orrecurrent epithelial ovarian cancer or p rimary peritoneal cancer：a Gynecologic Oncology GroupStudy.J Clin Oncol；20；25(33)：5 165-71(2007).

Claims

1.一种预测受试者对于抗血管生成治疗剂的反应性的方法，所述方法包括：

对从所述受试者获得的患病组织的试验样品中的一种或多种生物标志物的表达水平进行测量以确定样品表达得分，其中所述生物标志物是由表达签名限定；

将所述样品表达得分与阈值表达得分相比较；以及

基于所述样品表达得分是高于还是低于所述阈值表达得分，将所述受试者分类为有反应的或无反应的。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述患病组织是癌症组织。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、成胶质细胞瘤或乳癌。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品表达值是通过测量每种生物标志物的表达水平并且将其乘以对应权重来确定，其中每种生物标志物的权重是通过所述表达签名来确定。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下各项的方法获得的：

从患病组织的样品集中分离总RNA；

将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得样品表达数据集；

选择在所述微阵列上具有高于限定的显著性阈值的变化性的那些探针以形成初步生物标志物集；

使用聚类算法在所述初步生物标志物集内产生具有类似表达谱的生物标志物簇；

鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径；

选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及

通过使用监督式或无监督式训练算法分析所述患病组织的样品集中所选择的簇中的生物标志物的表达水平来限定表达签名。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在试验样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述试验样品集中分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行，其中所述试验样品集包含与所述患者试验样品相同的组织。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。

8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)以及反义RNA。

9.如权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包含来自表1A或表1B的两种或更多种基因。

12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或2B的两种或更多种基因。

13.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含SEQ ID NO:632至801(组I)或SEQ ID NO:802至974(组II)的序列的两种或更多种基因。

14.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3、VCAN。

15.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。

16.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。

17.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。

18.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及PLAU。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成治疗剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、IMC-1121B(礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120(瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、TKI-258或其组合。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(赫赛汀)或其组合。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α或其组合。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺或其组合。

24.一种将受试者诊断为患有癌症或易于发展对于抗血管生成治疗剂有反应的癌症的方法，所述方法包括：

对从所述受试者获得的患病组织的试验样品中的生物标志物的表达水平进行测量以确定样品表达得分，其中所述生物标志物是由表达签名限定；

将所述样品表达值与阈值得分相比较；以及

基于所述表达得分是高于还是低于所述阈值得分，将所述受试者分类为有反应的或无反应的。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌或成胶质细胞瘤。

26.如权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述参考表达值是通过计算每种生物标志物的表达值并且将其乘以对应权重来确定，其中每种生物标志物的权重是通过所述表达签名来确定。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下步骤的方法获得的：

从所述患病组织的样品集中分离总RNA；

将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得一组表达值；

使用聚类算法在所述初步生物标志物集内产生具有类似基因表达谱的生物标志物簇；

鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径；

选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及

通过使用监督式或无监督式训练算法分析所述癌症组织的样品集中所选择的簇中的生物标志物的表达水平来获得所述表达签名，其中所述表达值限定生物标志物集、每种生物标志物的对应权重以及所述参考表达值。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在癌症组织的样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述癌症组织分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。

30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)以及反义RNA。

31.如权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。

33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表1A或表1B的两种或更多种基因。

34.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或表2B的两种或更多种基因。

35.如权利要求24至32所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的两种或更多种基因。

36.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3、VCAN。

37.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。

38.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。

39.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。

40.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及PLAU。

41.如权利要求24至40中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、IMC-1121B(礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120(瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、以及TKI-258。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(赫赛汀)。

44.如权利要求41所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α。

45.如权利要求41所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺。

46.一种确定患有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：

将所述样品表达得分与阈值表达得分相比较；以及

47.如权利要求46所述的方法，其中所述患病组织是癌症组织。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、成胶质细胞瘤、或乳癌。

49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述样品表达值是通过测量每种生物标志物的表达水平并且将其乘以对应权重来确定，其中每种生物标志物的每个权重是通过所述表达签名来确定。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下步骤的方法获得的：

从患病组织的样品集中分离总RNA；

将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得样品表达数据集；

鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径；

选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及

51.如权利要求50所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在试验样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述试验样品集分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行，其中所述试验样品集包含与所述患者试验样品相同的组织。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。

53.如权利要求50至57中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)以及反义RNA。

54.如权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。

55.如权利要求46至54所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。

56.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表1A或表1B的两种或更多种基因。

57.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或2B的两种或更多种基因。

58.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含SEQ ID NO:632至801(组I)或SEQ ID NO:802至974(组II)的序列的两种或更多种基因。

59.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN、COL8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、LOXL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、TIMP3、VCAN。

60.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。

61.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。

62.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。

63.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及PLAU。

64.如权利要求46至63中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成治疗剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、IMC-1121B(礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120(瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、TKI-258或其组合。

66.如权利要求64所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(赫赛汀)或其组合。

67.如权利要求64所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α或其组合。

68.如权利要求64所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺或其组合。