EA025926B1 - Молекулярно-диагностический тест на рак - Google Patents

Молекулярно-диагностический тест на рак Download PDF

Info

Publication number
EA025926B1
EA025926B1 EA201391805A EA201391805A EA025926B1 EA 025926 B1 EA025926 B1 EA 025926B1 EA 201391805 A EA201391805 A EA 201391805A EA 201391805 A EA201391805 A EA 201391805A EA 025926 B1 EA025926 B1 EA 025926B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
semantic
expression
exon
completely
cancer
Prior art date
Application number
EA201391805A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391805A1 (ru
Inventor
Денис Пол Харкин
Фионнуала Паттерсон
Клэр Триндер
Имонн Дж. О'Брайен
Кэролайн Мичи
Чарли Гурли
Лора А. Хилл
Кэтрин Э. Китинг
Джуд О'Доннелл
Макс Бюлешо
Стив Деаро
Виталий Прутский
Ричард Кеннеди
Тимоти Дэвисон
Андреас Винтер
Эндрена Маккэйвиган
Original Assignee
Олмак Дайэгностикс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Олмак Дайэгностикс Лимитед filed Critical Олмак Дайэгностикс Лимитед
Publication of EA201391805A1 publication Critical patent/EA201391805A1/ru
Publication of EA025926B1 publication Critical patent/EA025926B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis

Abstract

Предлагаются способы и композиции для идентификации молекулярно-диагностического теста на рак. Тест идентифицирует субтипы рака, восприимчивые к антиангиогенной терапии, и позволяет классифицировать пациентов в пределах этого субтипа. Настоящее изобретение может быть использовано для определения того, будут ли раковые пациенты клинически откликаться или не откликаться на схему лечения до введения какого-либо антиангиогенного агента. Этот тест может быть использован при разных типах рака и с разными препаратами, которые прямо или косвенно влияют на ангиогенез или сигнальные пути ангиогенеза. В дополнение к этому, настоящее изобретение может быть использовано в качестве прогностического индикатора для определенных типов рака. В частности, изобретение касается использования определенных комбинаций прогностических маркеров, где экспрессия прогностических маркеров коррелирует с восприимчивостью или невосприимчивостью к схеме лечения.

Description

Настоящее изобретение заявляет приоритет временной патентной заявки США 61/492488, поданной 2 июня 2011 г., которая включена в описание в качестве ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к молекулярно-диагностическому тесту, пригодному для диагностирования раков из разных анатомических участков, включающему использование общего субтипа, связанного с ангиогенезом. Изобретение включает разработку модели классификации генов по уровням экспрессии генов. Одним способом применения является стратификация ответов на и селекция пациентов по терапевтическим классам противораковых препаратов и, таким образом, управление выбором лечения для пациентов. Другим применением является стратификация раковых пациентов на тех, кто отзывается, и тех, кто не отзывается на антиангиогенную терапию. Настоящее изобретение предлагает тест, который может направлять выбор терапии, а также выбор групп пациентов для стратегий обогащения при проведении клинических испытаний по оценке новых терапий. Изобретение может быть использовано в качестве прогностического индикатора для определенных раков, включая рак яичников, рак молочной железы и глиобластому. Субтип ангиогенеза может быть идентифицирован по свежим/замороженным (РР) или фиксированным формалином залитым в парафин (РРРЕ) образцам, взятым у пациента.
Известный уровень техники
Фармацевтическая промышленность находится в непрерывном поиске новых вариантов лекарственной терапии, являющихся более эффективными, более специфическими или имеющими меньше нежелательных побочных эффектов, чем используемые в настоящее время препараты. Альтернативные виды лекарственной терапии разрабатываются постоянно, потому что генетическая изменчивость в человеческой популяции приводит к существенным различиям в эффективности многих признанных препаратов. Поэтому, хотя в настоящее время доступен широкий спектр лекарственных терапий, дополнительные терапии всегда необходимы на случай, если пациент не отвечает на лечение.
Традиционно, парадигма лечения, используемая врачами, заключалась в прописывании для лечения болезни лекарственной терапии первой линии, которая приводит к наибольшим возможным показателям успеха. Затем прописывают альтернативные лекарственные терапии, если первые оказались неэффективными. Эта парадигма, очевидно, не является лучшим способом лечения для определенных болезней. Например, при таких болезнях, как рак, первое лечение часто является наиболее важным и обеспечивает наилучшие возможности успешной терапии, поэтому существует высокая потребность в выборе начального препарата, который был бы наиболее эффективным против болезни данного конкретного пациента.
Рак яичников является главной причиной смертности из всех гинекологических раков в западных странах. Такая высокая смертность вызвана установлением диагноза на поздней стадии у большинства пациентов. Эпителиальный рак яичников (ЕОС) составляет 90% злокачественных новообразований яичников и классифицируется на разные гистологические категории, включая серозный, мукоидный, эндометриоидный, прозрачно-клеточный, переходный, смешанный и недифференцированный субтипы. Все больше данных указывают на то, что такие различные гистологии вызваны разными этиологиями. В последнее время был достигнут прогресс в методологии, используемой для классификации эпителиального рака яичников (МсС1иддаде, \У.С. МогрНо1одюа1 киЫурек οί оуапап сагстота: а ге\ае\у \νί11ι етрНа^Р оп пе\у Деуе1ортеп15 апД патогенез, Ра1йо1оду 2011 Аид; 43(5):420-32). Одним из следствий этого является то, что многие опухоли, которые ранее классифицировались бы как эндометриоидные, теперь классифицируются как серозные.
Текущим стандартом лечения рака яичников является хирургическое уменьшение объема опухоли и стандартная цитотоксическая химиотерапия на основе платины и таксана. Однако не все пациенты отзываются на него, и из тех, кто не отзывается, приблизительно у 70% наблюдаются рецидивы. Специфические прицельные терапии при раке яичников на основании гистологической или молекулярной классификации еще не достигли рыночной стадии. Аналогично, для других типов рака в настоящее время не существует точных способов выбора пригодных цитотоксических химиотерапевтических агентов.
Прогресс в развитии микрочипов и молекулярной геномики обладает потенциалом значительного воздействия на диагностические возможности и прогностическую классификацию заболевания, что может способствовать прогнозированию отклика индивидуального пациента на определенную схему лечения. Микрочипы обеспечивают анализ больших количеств генетической информации, тем самым позволяя получить генетический отпечаток пальцев индивидуума. Существует значительный энтузиазм в отношении того, что эта технология, в конечном счете, обеспечит необходимые инструменты для разработки схем лекарственной терапии для индивидуальных пациентов.
В настоящее время работники здравоохранения имеют незначительное количество механизмов, помогающих им идентифицировать раковых пациентов, которые могли бы получить пользу от применения химиотерапевтических агентов. Идентификация оптимального препарата первой линии была сложной задачей из-за отсутствия способов точного прогнозирования того, какая лекарственная терапия была бы наиболее эффективной для конкретной физиологии рака. Это отсутствие приводит к относительно низким показателям отклика на отдельно взятый агент и увеличению заболеваемости и смертности от рака. Кроме того, пациенты часто без необходимости получают неэффективную токсичную лекарственную
- 1 025926 терапию.
Ангиогенез представляет собой ключевой компонент неоваскуляризации опухолей и является существенным для онкогенеза и метастазирования. По существу, он является ключевой областью терапевтического вмешательства и коррелирует с плохим прогнозом и сниженным выживанием. Это привело к разработке ряда агентов, нацеленных на связанные с ангиогенезом процессы и пути, включая лидирующий на рынке и первый одобренный ΡΌΑ (Управление по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США) антиангиогенный препарат, бевацизумаб (авастин), производимый фирмой ОспсШссН/РосНс.
Схемы лечения, включающие бевацизумаб, продемонстрировали широкую клиническую активность [1-10]. Однако не наблюдалось положительного эффекта на общую выживаемость (08) после добавления бевацизумаба к цитотоксической химиотерапии при большинстве видов рака [8, 12, 13]. Это позволяет предположить, что существенная часть опухолей или изначально являются резистентными, или быстро вырабатывают резистентность к блокаде УБОР (фактор роста сосудистого эндотелия, УБОР) (механизм действия бевацизумаба). Фактически, 21% пациентов с раком яичников, 10% с раком почки и 33% с раком прямой кишки демонстрируют частичный регресс при получении монотерапии бевацизумабом, что позволяет предположить, что бевацизумаб может быть активным в маленьких подгруппах пациентов, но такое приращение полезного эффекта не достигает значимых уровней для неотобранных пациентов. По существу, использование биомаркера отклика на бевацизумаб улучшило бы оценку результатов лечения и, таким образом, позволило бы идентифицировать подгруппы пациентов, которые получили бы наибольшую клиническую пользу от лечения бевацизумабом. Это было бы особенно важно в случае метастазирующего рака молочной железы, при котором отсутствие клинически полезного биомаркера подрывает использование бевацизумаба. До настоящего времени не существует таких клинически подтвержденных биомаркеров, предсказывающих эффективность бевацизумаба. Гипертензия и полиморфизмы УЕОР до сих пор являются единственными биомаркерами, демонстрирующими потенциал, но остаются существенные вопросы, касающиеся их использования в клинических условиях.
Другим подходом к антиангиогенной терапии является одновременное нацеливание на множество ангиогенных путей, а не селективное нацеливание на путь УЕОР. Теоретически, многоцелевые антиангиогенные агенты должны более полно ингибировать ангиогенез, чем такие агенты, как бевацизумаб и, таким образом, могут обеспечивать большую терапевтическую пользу. Было выдвинуто предположение, что в некоторых опухолях ангиогенез может нуждаться в УЕОР только на ранних стадиях заболевания, но по мере прогрессирования болезни обеспечивается дополнительными ангиогенными путями. Поэтому нацеливание на множество путей может позволить противодействовать механизмам компенсаторного избегания, которые могут приводить к резистентности к ингибированию УЕОР.
Для других типов рака до настоящего времени не существует точных способов определения того, какие из пациентов будут или не будут откликаться на стандартный уход с использованием антиангиогенной терапии или антиангиогенную терапию одним агентом.
Таким образом, существует потребность в молекулярно-диагностическом тесте, который способствовал бы стратификации пациентов на основании их прогнозируемого отклика на антиангиогенную терапию в комбинации со стандартным уходом или терапию одним агентом. Это позволило бы быстро идентифицировать тех пациентов, которые должны получать альтернативные виды терапии. Такой молекулярно-диагностический тест должен прогнозировать терапевтическую восприимчивость при разных типах рака с достаточной точностью.
Сущность изобретения
Раскрыты способы использования набора биомаркеров, экспрессируемых при раке таким образом, что при чрезмерной или недостаточной экспрессии некоторых или всех транскриптов они идентифицируют субтип рака, демонстрирующие повышающую регуляцию молекулярной сигнализации, связанной с ангиогенезом. Изобретение также предусматривает способы определения восприимчивости или невосприимчивости к антиангиогенным агентам. В разных аспектах такой набор биомаркеров может быть основой однопараметрического или многопараметрического прогностического теста, который может быть проведен с использованием способов, известных специалистам, таких как микрочипы, О-РСР (количественная ПЦР), иммуногистохимия, ЕБ18А (иммуноферментный твердофазный анализ) или других технологий, позволяющих количественно определять экспрессию мРНК или белка.
В дополнение к этому, субтип рака, описанный здесь, является общим для многих типов рака и не ограничен одним типом ракового заболевания. Поэтому сигнатуры (характерные профили) экспрессии, раскрытые здесь, могут быть использованы для предсказания восприимчивости или невосприимчивости к терапии рака для разных типов рака в разных тканях. В одном варианте исполнения изобретения такие биомаркеры являются пригодными для оценки восприимчивости раковой опухоли к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения рак представляет собой рак яичников. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой глиобластому. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой рак молочной железы.
Изобретение, описанное здесь, не ограничено каким-либо одним препаратом; оно может быть использовано для идентификации особ, откликающихся и не откликающихся на любой из спектра препара- 2 025926 тов, используемых в настоящее время, находящихся в процессе разработки, и новых, которые прямо или косвенно влияют на или нацелены на ангиогенные процессы. В одном варианте исполнения настоящее изобретение может быть использовано для оценки адъюванта или неадъюванта бевацизумаба или дасатиниба, при использовании в качестве отдельно взятых агентов, или в комбинации со стандартным лечением. В другом варианте исполнения настоящее изобретение может быть использовано для оценки лечения авастином, УЕОР-ТКАР (ловушка УБОР), при раке яичников.
Настоящее изобретение относится к предсказанию ответа на препараты с использованием по меньшей мере или до 10 разных классификаций ответа, таких как общая выживаемость, выживаемость без прогрессирования заболевания, радиологический ответ, определяемый по критериям КЕС18Т (система оценки ответа солидных опухолей), полный ответ, частичный ответ, стабильные маркеры заболевания и серологические маркеры, такие как, без ограничений, Р8Л (простатический специфический антиген), СЕА (карциноэмбриональный антиген), СА125, СА15-3 и СА19-9. В определенных вариантах исполнения данное изобретение может быть использовано для оценки выживаемости при раке яичников, молочной железы и глиобластоме.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к идентификации субтипа ангиогенеза при раках. Субтип может быть детектирован путем определения уровней экспрессии определенных биомаркеров. Сигнатура экспрессии определяет набор биомаркеров, экспрессия которых является прогностической для типов рака, откликающихся или не откликающихся на антиангиогенные агенты. В определенных типичных вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из последовательностей §ЕЦ ГО N08: 632-801 (группа I) или §ЕЦ ГО ΝΟδ: 802-974 (группа II). В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из биомаркеров, перечисленных в табл. 2А и 2В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает биомаркеры, перечисленные в табл. 2А и 2В, и их соответствующие веса, определенные с использованием классификатора РЬ8.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам для обычных диагностических применений, перечисленных выше, таких как с|РСР. микрочипы и иммуноанализы, такие как иммуногистохимия, ЕЬТЗА, вестерн-блоттинг и т.п. Такие наборы включают соответствующие реагенты и указания по проведению анализа экспрессии генов или генных продуктов и количественному определению экспрессии мРНК или белка.
Также раскрыты способы идентификации опухолей человека с фенотипом ангиогенеза или без него. В определенных типичных вариантах исполнения такие способы могут быть использованы для идентификации пациентов, чувствительных к и откликающихся на препараты, ингибирующие, прямо или косвенно, процессы, связанные с ангиогенезом. В определенных других типичных вариантах исполнения такие способы могут быть использованы для идентификации пациентов, резистентных к или не откликающихся на препараты, ингибирующие, прямо или косвенно, процессы, связанные с ангиогенезом.
В другом аспекте изобретение может быть использовано как прогностический индикатор при определенных типах рака. В одном типичном варианте исполнения рак представляет собой рак яичников. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой рак молочной железы. В еще одном типичном варианте исполнения рак представляет собой глиобластому.
Настоящее изобретение также относится к выдаче рекомендаций по эффективному лечению пациентов. Кроме того, предусматриваются способы, относящиеся к выбору схем лечения пациента и отбору пациентов для клинических испытаний существующих или находящихся на стадии разработки препаратов, которые прямо или косвенно влияют на ангиогенез.
В дополнение к этому, тут описаны способы, позволяющие использовать законсервированные фиксированные формалином залитые в парафин (РРРЕ) биоптаты, а также свежую/замороженную (РР) ткань, для анализа всех транскриптов, и потому совместимые с наиболее широко распространенным типом биоптатов. Уровень экспрессии биомаркера может быть определен с использованием РНК, выделенной из РРРЕ-ткани, свежезамороженной ткани или свежей ткани, хранящейся в таких растворах, как ΚΝΑΙαΙΟΓ®.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует тепловую карту (карту интенсивностей), представляющую результаты иерархического агломеративного кластерного анализа наиболее вариабельных генов из 199 серозных образцов из набора образцов эпителиального рака яичников фирмы А1тас Όίαβηοδίίοδ. Функциональный анализ кластеров набора зондов подытожен справа от изображения. Надписи вверху изображения указывают группу классификатора, к которой был отнесен каждый образец для создания классификатора (т.е. метки классов).
Фиг. 2А и 2В иллюстрируют результаты функционального анализа ангиогенеза для кластера набора зондов 199 только серозных образцов из обучающего набора эпителиального рака яичников с использованием функционального анализа обогащения. Фиг. 2А иллюстрирует гистограмму, представляющую значимость 10 биологических процессов Оепе Ои1о1оду с наибольшей степенью обогащения. Красные
- 3 025926 столбцы указывают значимость процесса с р-значением 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Фиг. 2В иллюстрирует подмножество дерева биологических процессов Оеие ϋηΐοίοβν. в котором процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 3. Процессы, окрашенные в красный цвет, указывают значимость этого процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Процессы, окрашенные в черный цвет, включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 3, но не являющихся значимыми.
Фиг. 3 иллюстрирует результаты функционального обогащения для генов, входящих в типовую 25-генную сигнатуру экспрессии, идентифицирующую молекулярный субтип, ассоциированный с ангиогенезом. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения.
Фиг. 4 иллюстрирует кривые Каплана-Майера для безрецидивной выживаемости (время до наступления события в неделях) после начальной хирургической резекции у пациентов с глиобластомой высокой степени без предварительного лечения (РЫШр8 Н.8., КЬагЬапба 8., СЬеп К., Рогге8! А.Р. е! а1. Мо1еси1аг 8иЬс1а88е8 οί ЫдЬ-дгабе дЬота ргеФс! ргодио818, 6е1шеа!е а ра!!ет οί Фзеазе ргодге88юп, апб гезетЫе 8!аде8 ίη иеигодеие818, Сапсег Се11 2006 Маг; 9(3):157-73. РМГО: 16530701; Сок!а В.М., 8тЪЬ 18., СНеп Υ., СНеп 1. е! а1. Кеуещшд НОХА9 опсодепе асИуайоп Ьу Р13К тЫЬЫоп: ер1депейс тесЬап18т апб ргодпо8Йс 81дшйсапсе ш Ьитап д1юЬ1а81ота, Сапсег Ке8 2010 1ап 15; 70(2):453-62. РМГО: 20068170).
Фиг. 5 иллюстрирует график КОС-кривой характеристик классификации для типовой модели 25генного классификатора 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Величина ППК (площадь под кривой, АИС) составляет приблизительно 0,84 после применения модели классификатора. Границы 95% доверительного интервала были определенны с использованием 1000 бутстрап-итераций (Аапд ХГО., Кееуе8 К., Ьио Р.К., Хи Ь.А. е! а1. 1бепППса11оп οί сапФбаЮ ргеФсйуе апб 8иггода1е то1еси1аг тагкег8 Гог 6а8айшЬ ш рго8!а!е сапсег: гайопа1е Гэг райеп! 8е1есйоп апб еГПсасу топЬогшд, Сепот. Вю1. 2007; 8(11):К255. РМГО: 18047674).
Фиг. 6 иллюстрирует тепловую карту, представляющую иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов 265 серозных образцов из набора образцов эпителиального рака яичников реклассифицированных в соответствии с уточненными критериями патологической классификации. Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения. Надписи сверху изображения указывают группу классификатора, к которой был отнесен каждый образец для составления классификатора (т.е. метки классов).
Фиг. 7А и 7В иллюстрируют результаты функционального анализа набора зондов ангиогенеза из 265 только серозных образцов в обучающем наборе эпителиального рака яичников с использованием алгоритма инструмента функционального обогащения (РЕТ). Фиг. 7А изображает гистограмму, представляющую значимость 10 биологических процессов Сепе Оп!о1оду с наибольшим обогащением. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Фиг. 7В иллюстрирует подмножество дерева биологических процессов Сепе Оп!о1оду, в котором процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 2 (ангиогенез). Окрашенные в красный цвет процессы указывают значимость данного процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Окрашенные в черный цвет процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере ангиогенез, но не являются значимыми.
Фиг. 8 представляет результаты функционального обогащения для генов из типовой 45-генной модели классификатора, идентифицирующей молекулярный субтип, ассоциированный с ангиогенезом. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения.
Фиг. 9 иллюстрирует график КОС-кривой характеристик классификации 45-генной модели классификатора для 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Величина ППК составляет около 0,95 после применения модели классификатора. Границы 95% доверительного интервала были определены с использованием 1000 бутстрап-итераций.
Фиг. 10 иллюстрирует тепловую карту, представляющую иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов для 265 серозных образцов набора образцов эпителиального рака яичников, реклассифицированного в соответствии с уточненными критериями патологической классификации. Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения. Надпись сверху изображения указывает группу классификатора, к которой должен быть отнесен каждый образец для создания классификатора для группы без ангиогенеза или без ответа.
Фиг. 11 иллюстрирует кривые Каплана-Майера для выживаемости без прогрессирования (в неделях) в группе образцов без ангиогенеза (фиг. 3А, кластер образцов 1) по сравнению с группой образцов с ангиогенезом (фиг. 10, кластеры образцов 2 и 3) в реклассифицированном наборе образцов яичников.
Фиг. 12А и 12В иллюстрируют тепловые карты, представляющие иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов для 51 ЕК-отрицательных образцов (фиг. 12А) набора
- 4 025926 образцов рака молочной железы и наиболее вариабельных генов для 56 ЕК-положительных образцов набора образцов рака молочной железы (фиг. 12В). Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения для кластеров, демонстрирующих развитие сосудистой сети/ангиогенез или иммунный ответ/интерферон-опосредованную передачу сигналов.
Перечень последовательностей
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, приведены с использованием стандартных буквенных обозначений нуклеотидных оснований, определенных в 37 С.Р.К. (Свод федеральных постановлений США) § 1.822. Приведена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но комплементарная цепь считается включенной по любой ссылке на приведенную цепь.
Перечень последовательностей приводится на оптическом диске, который прилагается к данному патенту.
Детальное описание изобретения
Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, общеизвестные рядовому специалисту в области техники, к которой относится данное описание. Определения обычных терминов молекулярной биологии приведены в Всфатт ЬеМи, Сспс5 IX, опубликованной 1оис8 аий Ватйс1, 2008 (ΙδΒΝ 0763752223); Ксийгсте е1 а1. (сйк.), Тке Еисус1орсЙ1а οί Мо1сси1аг Вю1о§у, опубликованной В1аск\ус11 Зсюисс Ый., 1994 (ΙδΒΝ 0632021829); КоЬсй А. Мсусгк (сй.), Мо1сси1аг Вю1о§у апй Вю1сскпо1о§у: а СотргексикКс Искк КсГсгсисс, опубликованной УСН РиЬкккстк, 1ис., 1995 (IδΒN 9780471185710); δ^и§1сΐοи с! а1., ИкНоиату оГ М1стоЫо1о§у апй Мо1сси1аг Вю1о§у 2ий сй., I. \УПсу & δοиκ (№те Уогк, Ν.Υ. 1994) и Магск, Айуаиссй Отдашс Скст1к1ту Ксаскоик, Мсскаи1ктк аий δίτυοίυκ 4'1' сй., 1оки \УПсу & δοиκ (№те Υο^к, Ν.Υ. 1992).
Термины в единственном числе включают соответствующие термины во множественном числе, если из контекста четко не следует иное. Аналогично, союз или должен включать и, если из контекста четко не следует иное. Термин содержит означает включает. В случае конфликта главенствующим должно считаться данное описание, включая объяснения терминов.
В используемом в данном документе значении термины панель маркеров, классификатор экспрессии, классификатор, сигнатура экспрессии или сигнатура могут быть использованы взаимозаменяемо.
Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, упоминаемые в данном документе, указывают на уровень квалификации специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, упоминаемые в описании, настоящим включены в документ в качестве ссылок таким же образом, как если бы каждая индивидуальная публикация, опубликованный патентный документ или патентная заявка были специально и индивидуально указаны как включенные в качестве ссылок.
Обзор.
Важной целью проводящихся в настоящее время исследований рака является увеличение эффективности периоперационной системной терапии пациентов путем включения молекулярных параметров в клинические терапевтические решения. Фармакогенетика/геномика представляет собой исследование генетических/геномных факторов, задействованных в ответе индивидуума на чужеродное соединение или препарат. Агенты или модуляторы, обладающие стимулирующим или ингибирующим действием на экспрессию биомаркера по изобретению, могут быть введены индивидуумам для лечения (профилактически или терапевтически) рака у пациента. Идеальным было бы также учитывать фармакогеномику индивидуума в сочетании с таким лечением. Различия в метаболизме терапевтических средств могут, возможно, вызывать тяжелую токсичность или неудачу терапии в результате изменения соотношения между дозой и концентрацией в крови фармакологически активного препарата. Таким образом, понимание фармакогеномики индивидуума позволяет проводить выбор эффективных агентов (например, препаратов) для профилактического или терапевтического лечения. Такая фармакогеномика может быть дополнительно использована для определения пригодных дозировок и схем лечения. Соответственно, может быть определен уровень экспрессии биомаркера по изобретению у индивидуума для выбора, таким образом, пригодного агента (агентов) для терапевтического или профилактического лечения индивидуума.
Настоящее изобретение относится к молекулярно-диагностическим тестам, пригодным для диагностирования раков из разных анатомических участков, которые включают использование общего субтипа, ассоциированного с ангиогенезом. Изобретение включает сигнатуры экспрессии, которые идентифицируют субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенной терапии. Сигнатуру экспрессии определяют путем получения профилей экспрессии образцов из набора образцов с известной патологией и/или клиническим результатом. Образцы могут быть получены из образцов тканей одного типа или из тканей разных типов. В используемом в данном документе значении профиль экспрессии включает набор значений, характеризующих уровень экспрессии для каждого анализируемого биомаркера из данного образца.
Профили экспрессии для набора образцов затем анализируют с использованием математической модели. Могут быть применены разные математические модели, которые включают, без ограничений,
- 5 025926 модели из области распознавания образов (Όιιάα е! а1. Райет С1а881Йсайоп, 2'1 ей., ίοΐιη \УПсу. №\ν Уогк 2001), машинного обучения (8сйб1корГ е! а1. Ьеагшпд \νί11ι Кете18, ΜΙΤ Рге88, СатЪййде 2002, Βίδΐιορ. №ига1 №1\\огк8 Гог Райет Кесодшйоп, С1агепйоп Рге88, ОхГогй 1995), статистики (На8Йе е! а1. Тйе Е1етеп18 оГ §1аЙ8Йса1 Ьеагшпд, §рйпдег, №\ν Уогк 2001), биоинформатики (Эийой е! а1., 2002, 1. Ат. §1аЙ8к А88ос. 97:77-87, Т1Ъ8Ыгаш е! а1., 2002, Ргос. ЫаЙ. Асай. §ск И8А 99:6567-6572) или хемометрики (Уапйед1П81е, е! а1., НапйЪоок оГ Сйетоте1г1с8 апй Риайтейтс8, Рай В, Е18еу1ег, АпШегйат 1998). Математическая модель идентифицирует один или несколько биомаркеров, экспрессируемых в наборе образцов, являющихся наиболее прогностическими для данного фенотипа болезни. Эти один или несколько биомаркеров определяют сигнатуру экспрессии. Соответственно, сигнатура экспрессии включает биомаркеры, идентифицированные как наиболее прогностические для данного фенотипа болезни. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет переменную, такую как вес, для каждого идентифицированного биомаркера. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет решающую функцию. Решающая функция может дополнительно определять порог оценки, разделяющий набор образцов на два фенотипа болезни, такие как, без ограничений, образцы, являющиеся восприимчивыми и невосприимчивыми к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения решающая функция и сигнатура экспрессии определяются с использованием линейного классификатора.
Для классификации новых образцов с использованием определенной сигнатуры экспрессии выделяют биомаркеры, определенные сигнатурой экспрессии, и определяют профиль экспрессии биомаркера (биомаркеров). Профиль экспрессии биомаркера нового образца анализируют с помощью той же самой математической модель, которую используют для определения сигнатуры экспрессии. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет оценку экспрессии для нового образца. Оценка экспрессии может быть определена путем объединения значений экспрессии биомаркеров с соответствующими скалярными весами с использованием нелинейных, алгебраических, тригонометрических или корреляционных средних для получения единого скалярного значения. Оценку экспрессии сравнивают с порогом оценки и образец классифицируют как восприимчивый или невосприимчивый к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения значение экспрессии образца, большее контрольного значения экспрессии, указывает, что пациент будет восприимчивым к антиангиогенной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца ниже порога оценки указывает, что пациент не будет восприимчивым к антиангиогенной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца ниже пороговой оценки экспрессии указывает, что пациент болеет раком типа или имеет повышенный риск развития рака типа, являющегося невосприимчивым к антиангиогенной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца выше контрольной оценки экспрессии указывает, что пациент болеет раком типа или имеет повышенный риск развития рака типа, являющегося восприимчивым к антиангиогенной терапии. В тех случаях, когда сигнатуру экспрессии получают из набора образцов тканей, включающего один тип раковой ткани, сигнатура экспрессии не ограничена идентифицированием одного и того же субтипа рака только в тканях того же самого типа рака, но может быть использована для других типов рака с тем же самым субтипом рака. Например, в тех случаях, когда сигнатуру экспрессии получают из образцов рака яичников, сигнатура экспрессии может быть использована для идентификации схожего субтипа ангиогенеза при разных раках, таких как глиобластома или рак молочной железы.
Одним из применений сигнатур экспрессии, раскрытых в описании, является стратификация отклика на и селекция пациентов по терапевтическим классам препаратов, охватывающих антиангиогенные терапии. По результатам анализа экспрессии набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут наиболее вероятно снижать скорость роста раковой опухоли. Также можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут с наименьшей вероятностью снижать скорость роста раковой опухоли. По результатам анализа экспрессии набора биомаркеров, таким образом, можно исключить неэффективные или непригодные терапевтические агенты. Важно, что в определенных вариантах исполнения такие определения могут быть выполнены для отдельных пациентов или для отдельных агентов. Таким образом, можно определить, может или нет определенная схема лечения принести пользу конкретному пациенту или типу пациентов и/или следует ли продолжать определенную схему. Настоящее изобретение обеспечивает тест, который может направлять выбор терапии, а также отбирать группы пациентов для стратегии обогащения при проведении клинических испытаний по оценке новых терапий. Например, при оценке предполагаемого антиангиогенного агента или схемы лечения сигнатуры экспрессии и способы, раскрытые в описании, могут быть использованы для отбора для клинических испытаний индивидуумов с типами рака, являющимися восприимчивыми к антиангиогенным агентам. Субтип ангиогенеза может быть идентифицирован по свежим/замороженным (ЕЕ) или фиксированным формалином залитым в парафин (РРРЕ) образцам пациента. В одном типичном варианте исполнения типом рака является рак яичников. В другом типичном варианте исполнения типом рака является глиобластома. В еще одном типичном варианте исполнения типом рака является рак молочной железы.
- 6 025926
Рак является восприимчивым к терапевтическому агенту, если его скорость роста ингибируется в результате контакта с терапевтическим агентом, по сравнению с его ростом в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Рост рака может быть измерен различными способами. Например, по размеру опухоли или путем измерения экспрессии опухолевых маркеров, соответствующих данному типу опухоли.
Рак является невосприимчивым к терапевтическому агенту, если его скорость роста не ингибируется или ингибируется в очень низкой степени в результате контакта с терапевтическим агентом по сравнению с его ростом в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Как было указано выше, рост рака может быть измерен различными способами, например по размеру опухоли или путем измерения экспрессии опухолевых маркеров, соответствующих этому типу опухоли. Свойство невосприимчивости к терапевтическому агенту является в высшей степени изменчивым, причем разные раки демонстрируют разные уровни невосприимчивости к данному терапевтическому агенту, в разных условиях. Дополнительно, измерения невосприимчивости могут быть оценены с использованием дополнительных критериев, кроме роста размера опухоли, таких как, без ограничений, качество жизни пациента и степень метастазирования.
Идентификация сигнатур экспрессии.
Сигнатуры экспрессии по настоящему изобретению идентифицируют путем анализа профилей экспрессии определенных биомаркеров в наборе образцов пациента. Биомаркеры, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают ДНК, РНК и белки. Биомаркеры выделяют из образца пациента и их уровни экспрессии определяют для получения набора профилей экспрессии для каждого анализируемого образца из набора образцов пациента.
а) Профили экспрессии.
В определенных вариантах исполнения полученный профиль экспрессии представляет собой геномный профиль или профиль экспрессии нуклеиновой кислоты, где определяют количество или уровень одной или нескольких нуклеиновых кислот в образце. В таких вариантах исполнения образец, анализируемый для получения профиля экспрессии, используемого в диагностических или прогностических способах, представляет собой образец нуклеиновой кислоты. Образец нуклеиновой кислоты включает популяцию нуклеиновых кислот, которая включает информацию об экспрессии определяющих фенотип биомаркеров анализируемой клетки или ткани. В некоторых вариантах исполнения нуклеиновая кислота может включать РНК или ДНК нуклеиновые кислоты, например мРНК, кРНК, кДНК и т.д., при условии, что образец сохраняет информацию об экспрессии клетки-хозяина или ткани, из которой он получен. Образец может быть приготовлен рядом различных способов, как известно специалистам, например путем выделения мРНК из клетки, причем выделенная мРНК используется в том виде, как она была выделена, амплифицируется или используется для получения кДНК, кРНК и т.д., как известно в области дифференциальной генной экспрессии. Соответственно, определение уровня мРНК в образце включает приготовление кДНК или кРНК из мРНК и последующее измерение кДНК или кРНК. Образец типично готовят из клеток или ткани, взятых у субъекта, нуждающегося в лечении, например, путем биопсии ткани, с использованием стандартных протоколов, где типы клеток или тканей, из которых могут быть получены такие нуклеиновые кислоты, включают любую ткань, в которой существует характер экспрессии определяемого фенотипа, включая, без ограничений, больные клетки или ткани, жидкости организма и т.д.
Профили экспрессии могут быть получены из исходного образца нуклеиновой кислоты с использованием любого удобного протокола. Хотя известны разные методы получения профилей экспрессии, такие как используемые в области дифференциальной генной экспрессии/анализа биомаркеров, одним из репрезентативных и удобных типов протокола получения профилей экспрессии являются протоколы получения матричного профиль генной экспрессии. Такие методики представляют собой анализы гибридизации, в которых используется нуклеиновая кислота, демонстрирующая зондовые нуклеиновые кислоты для каждого оцениваемого/профилируемого гена получаемого профиля. В таких анализах образец нуклеиновых кислот-мишеней сначала готовят из исходного образца анализируемой нуклеиновой кислоты, причем приготовление может включать мечение нуклеиновых кислот-мишеней меткой, например элементом системы продуцирования сигнала. После приготовления образца нуклеиновой кислотымишени образец вводят в контакт с матрицей в условиях гибридизации, в результате чего образуются комплексы с целевыми нуклеиновыми кислотами, являющимися комплементарными к последовательностям зонда, закрепленными на поверхности матрицы. Затем детектируют присутствие гибридизованных комплексов, качественно или количественно. Технология специфической гибридизации, которая может быть реализована для получения профилей экспрессии, используемых в способах по настоящему изобретению, включает технологии, описанные в патентах США № 5143854; 5288644; 5324633; 5432049; 5470710; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5547839; 5580732; 5661028; 5800992; описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок; а также νθ 95/21265; νθ 96/31622; νθ 97/10365; \УО 97/27317; ЕР 373203 и ЕР 785280. В этих способах матрицу зондовых нуклеиновых кислот, включающую зонд для каждого из биомаркеров, экспрессия которых анализируется, вводят в контакт с нуклеиновыми кислотами-мишенями, как описано выше. Контакт осуществляют в условиях гибридизации,
- 7 025926 например в жестких условиях гибридизации, как описано выше, и несвязанную нуклеиновую кислоту затем удаляют. Полученный профиль гибридизованных нуклеиновых кислот обеспечивает информацию, касающуюся экспрессии каждого из биомаркеров, используемых в качестве зондов, где информация об экспрессии указывает, экспрессируется данный ген или нет и, типично, на каком уровне, причем данные об экспрессии, т.е., профиль экспрессии, могут быть как качественными, так и количественными.
b) Болезни и источники образцов тканей.
В определенных типичных вариантах исполнения набор образцов пациента включает образцы раковой ткани, такие как законсервированные образцы. Набор образцов пациента предпочтительно получают из образцов раковой ткани, охарактеризованных с помощью прогноза, вероятности рецидива, долгосрочной выживаемости, клинического результата, отклика на лечение, диагноза, классификации рака или персонализованного геномного профиля. В используемом здесь значении рак включает, без ограничений, лейкоз, рак мозга, рак простаты, рак печени, рак яичников, рак желудка, колоректальный рак, рак горла, рак молочной железы, рак кожи, меланому, рак легкого, саркому, цервикальный рак, тестикулярный рак, рак мочевого пузыря, эндокринный рак, эндометриальный рак, рак пищевода, глиому, лимфому, нейробластому, остеосаркому, рак поджелудочной железы, рак гипофиза, рак почки и т.п. В одном варианте исполнения описанные способы относятся к ракам, которые лечат антиангиогенными агентами, антиангиогенными прицельными терапиями, ингибиторами сигнального пути ангиогенеза, без ограничений этими классами. Такие раки также включают подклассы и субтипы таких раков на разных стадиях патогенеза. В определенных типичных вариантах исполнения набор образцов пациента включает образцы рака яичников. В другом типичном варианте исполнения набор образцов пациента включает образцы рака молочной железы. В еще одном типичном варианте исполнения набор образцов пациента включает образцы глиобластомы.
Биологический образец, образец и исследуемый образец используются взаимозаменяемо по отношению к любому материалу, биологической жидкости, ткани или клетке, полученной или иначе взятой от индивидуума. Они включают кровь (включая цельную кровь, лейкоциты, мононуклеарные клетки периферической крови, лейкоцитную пленку, плазма и сыворотку), слюну, слезы, слизь, назальные смывы, назальный аспират, выдыхаемый воздух, мочу, сперму, слюну, менингеальную жидкость, амниотическую жидкость, железистую жидкость, лимфатическую жидкость, аспират сосков, бронхиальный аспират, синовиальную жидкость, аспират суставов, асцит, клетки, клеточный экстракт и цереброспинальную жидкость. Они также включают экспериментально выделенные фракции всего вышеперечисленного. Например, образец крови может быть фракционирован для выделения сыворотки или на фракции, содержащие конкретные типы клеток крови, таких как красные кровяные клетки или белые кровяные клетки (лейкоциты). При необходимости, образец может быть комбинацией образцов индивидуума, такой как комбинацией ткани и образца жидкости. Термин биологический образец также включает материалы, содержащие гомогенизированный твердый материал, например, такие как из образца стула, образца ткани или биопсии ткани. Термин биологический образец также включает материалы, полученные из культуры ткани или культуры клеток. Могут быть использованы любые пригодные способы получения биологического образца; типичные способы включают, например, флеботомию, мазки (например, буккальный мазок) и процедуру биопсию аспирата тонкой иглой. Образцы также могут быть взяты, например, путем микродиссекции (например, лазерная захватывающая микродиссекция (ЬСМ) или лазерная микродиссекция (ЬМЭ)), смыва мочевого пузыря, мазка (например, мазок РАР (Папаниколау)) или протокового лаважа. Биологический образец, полученный или взятый у индивидуума, включает любой такой образец, который был обработан любым пригодным способом после получения от индивидуума, например свежезамороженный или фиксированный формалином и/или залитый в парафин.
В используемом в данном документе значении термин пациент включает человека и не относящихся к человеку животных. Предпочтительным пациентом для проведения лечения является человек. Пациент и субъект используются в данном документе взаимозаменяемо.
c) Биомаркеры.
В используемом в данном документе значении термин биомаркер может относиться к гену, мРНК, кДНК, антисмысловому транскрипту, микроРНК, полипептиду, белку, белковому фрагменту или любой другой последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидной последовательности, которые указывают или уровни экспрессии генов или уровни продуцирования белка. В тех случаях, когда биомаркер указывает или является признаком аномального процесса, болезни или другого состояния у индивидуума, этот биомаркер в общем описывается как сверхэкспрессируемый или недостаточно экспрессируемый по сравнению с уровнем экспрессии или величиной показателя биомаркера, указывающими или являющимися признаком нормального процесса, отсутствия болезни или другого состояния у индивидуума. Повышающая регуляция, с повышенной регуляцией, сверхэкспрессия, сверхэкспрессируемый и любые их вариации используются взаимозаменяемо по отношению к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, большему значения величины или уровня (или интервал значений или уровней) биомаркера, типично детектируемого в аналогичных биологических образцах от здоровых или нормальных индивидуумов. Термины могут также относиться к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, превышающему значение величины или уро- 8 025926 вень (или интервал значений или уровней) биомаркера, который может быть детектирован на другой стадии конкретной болезни.
Понижающая регуляция, с понижающей регуляцией, недостаточная экспрессия, недостаточно экспрессируемый и любые их вариации используются взаимозаменяемо по отношению к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, меньшему значения величины или уровня (или интервала значений или уровней) биомаркера, которое типично детектируется в аналогичных биологических образцах от здоровых или нормальных индивидуумов. Термины могут также относиться к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, меньшему значения величины или уровня (или интервала значений или уровней) биомаркера, которое может быть детектировано на другой стадии конкретной болезни.
Кроме того, биомаркер, который является сверхэкспрессируемым или недостаточно экспрессируемым, также может быть назван с дифференцированной экспрессией или имеющим дифференцированный уровень или дифференцированное значение по сравнению с нормальным уровнем экспрессии или величиной показателя биомаркера, который указывает на или является признаком нормального процесса или отсутствия болезни или другого состояния у индивидуума. Таким образом, дифференцированная экспрессия биомаркера также может быть названа отклонением от нормального уровня экспрессии биомаркера.
Термины дифференцированная экспрессия биомаркера и дифференцированная экспрессия используются взаимозаменяемо по отношению к биомаркеру, экспрессия которого активируется до более высокого или более низкого уровня у субъекта, страдающего от определенной болезни, по сравнению с его экспрессией у нормального субъекта или по сравнению с его экспрессией у пациента с дифференцированным ответом на определенную терапию или имеющего отличающийся прогноз. Термины также включают биомаркеры, экспрессия которых активируется до более высокого или более низкого уровня на разных стадиях той же болезни. Также следует понимать, что биомаркер с дифференцированной экспрессией может активироваться или ингибироваться при уровне нуклеиновой кислоты или уровне белка или может подвергаться альтернативному сплайсингу, приводящему к другому полипептидному продукту. Такие различия могут быть засвидетельствованы различными изменениями, включая уровни мРНК, уровни микроРНК, уровни антисмыслового транскрипта или экспрессию поверхностного белка, секрецию или другое распределение полипептида. Дифференцированная экспрессия биомаркера может включать сравнение экспрессии двух или больше генов или их генных продуктов; или сравнение соотношений экспрессии двух или больше генов или их генных продуктов; или даже сравнение двух различно процессированных продуктов одного и того же гена, которые различаются у нормальных субъектов и субъектов, страдающих от болезни; или между разными стадиями одной и той же болезни. Дифференцированная экспрессия включает как количественные, так и качественные различия временного или клеточного профиля экспрессии биомаркера, например, между нормальными и больными клетками или между клетками, в которых происходят разные связанные с болезнью явления, или находящимися на разных стадиях болезни.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркер представляет собой транскрипт РНК. В используемом в данном документе значении транскрипт РНК относится как к кодирующей, так и к некодирующей РНК, включая матричные (информационные) РНК (мРНК), альтернативно сплайсированные мРНК, рибосомальные РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК), малые ядерные РНК (мяРНК) и антисмысловую РНК. Измерение мРНК в биологическом образце может быть использовано в качестве замены детектирования уровня соответствующего белка и гена в биологическом образце. Таким образом, любые биомаркеры или панели биомаркеров, описанные в документе, также могут быть детектированы путем детектирования соответствующей РНК. Способы определения профилей экспрессии биомаркеров включают, без ограничений, количественную ПЦР, технологию N08 (секвенирование следующего поколения), нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, микрочипы, 8А0Е (серийный анализ генетической экспрессии), иммуноанализы (ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ), Е1А (иммуноферментный анализ), агглютинацию, нефелометрию, турбидиметрию, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, проточную цитометрию, анализы по технологии Битшех (множественное флуоресцентное кодирование и цитометрия)) и масс-спектрометрию. Общие данные об экспрессии для данного образца могут быть нормированы с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, для внесения поправок на различные количества исходных материалов, разные эффективности экстракции и реакций амплификации.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркеры, пригодные для распознавания типов рака, восприимчивых и невосприимчивых к антиангиогенной терапии, могут быть определены путем идентификации биомаркеров, демонстрирующих наивысшую степень изменчивости в разных образцах набора данных пациента, определенных с использованием способов детектирования экспрессии и наборов образцов пациентов, описанных выше. Стандартные статистические способы идентификации точек данных с высокой степенью изменчивости в данных об экспрессии, известные специалистам, могут быть использованы для идентификации биомаркеров с высокой степенью изменчивости. Например, комбинированный фильтр фона и дисперсии набора данных пациента. Фильтр фона основан на селекции наборов
- 9 025926 зондов с экспрессией Е и дисперсией экспрессии уатЕ выше пороговых значений, определенных стандартным отклонением фона σΒ§ (в прикладной программе Ехрте881оп Соп8о1е), и квантиль стандартного нормального распределения ζα при заданной значимости α наборов зондов сохраняется, если:
Е > 1од2((гаа вд)); 1од2((уэг£) > 2 [1од2(аВд) - Е - 1од2(1од(2))] где α обозначает порог значимости.
В определенном типичном варианте исполнения порог значимости равен 6,3-10-5. В другом типичном варианте исполнения порог значимости может иметь значение от 1,0-10-7 до 1,0-10-3.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркеры с высокой степенью изменчивости могут быть дополнительно проанализированы для группирования образцов в наборе данных пациента в субтипы или кластеры на основании схожих профилей генной экспрессии. Например, биомаркеры могут быть разбиты на кластеры на основании того, насколько сильно коррелирует повышающая регуляция или понижающая регуляция их экспрессии друг с другом. Могут быть использованы различные методики кластерного анализа, известные специалистам. В одном типичном варианте исполнения иерархическая агломеративная кластеризация используется для идентификации субтипов рака. Для определения биологической релевантности каждого субтипа биомаркеры внутри каждого кластера могут быть дополнительно картированы по их соответствующим генам и аннотированы с помощью ссылок на одну или несколько баз данных генетической онтологии, содержащих информацию о биологической активности и биологических путях, ассоциированных с этим геном. В одном типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах с повышающей регуляцией и обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах с понижающей регуляцией и обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. Дополнительные подробности проведения функционального анализа кластеров биомаркеров приведены в разделе Примеры ниже.
В одном типичном варианте исполнения биомаркеры, пригодные для получения сигнатуры экспрессии для различения субтипов рака, восприимчивых или нет к антиангиогенной терапии, включают биомаркеры, перечисленные в табл. 1А, 1В или в обеих таблицах. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры, пригодные для получения сигнатуры экспрессии для различения субтипов рака, восприимчивых или нет к антиангиогенной терапии, включают биомаркеры, перечисленные в группе I (включающей §Еф ГО N08: 632-801) или группе II (включающей §Еф ГО N08: 802-974) или обеих группах. Такие биомаркеры идентифицируют как имеющие прогностическое значение для определения ответа пациента на терапевтический агент. Их экспрессия коррелирует с ответом или его отсутствием на агент и, более конкретно, антиангиогенный терапевтический агент. По результатам анализа экспрессии набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут наиболее вероятно снижать скорость роста рака. Путем анализа набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно также определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут с наименьшей вероятностью снижать скорость роста рака. Таким образом, по результатам анализа экспрессии набора биомаркеров можно устранить неэффективные или непригодные терапевтические агенты. Важно, в определенных вариантах исполнения такие определения могут проводиться для отдельных пациентов или для отдельных агентов. Таким образом, можно определить, будет ли определенная схема лечения вероятно обеспечивать полезный эффект для конкретного пациента или типа пациентов и/или следует ли продолжать лечение по определенной схеме.
- 10 025926
Г ены кластера ангиогенеза и иммунного ответа по фиг. 1
Таблица 1А
ЗЕС! N0: Ориентация Обозначение гена
1 смысловая ЗТАТ1
2 смысловая РОСРС
3 смысловая ТСРВЗ
4 смысловая РАС2
5 смысловая МАРСКЗ
6 смысловая А1_ОХ5
7 смысловая СО1.8А1
8 смысловая СТ53
9 смысловая НАУСР2
10 смысловая РАВ31
11 смысловая КСЫАВ2
12 смысловая ТНВ31
13 смысловая ЗНЗВР4
14 смысловая СТСР
15 смысловая СТСР
16 смысловая УСАЫ
17 смысловая юкс
18 смысловая 1СКС
19 смысловая 1СКС
20 смысловая 5СК1
21 смысловая ЫРАТС1
22 смысловая НМНА1
23 смысловая РССР1С///РССР1А/// РССР1В
24 смысловая ΕϋΑ2Ρ
25 смысловая СО1.8А1
26 смысловая СОИ2А1
27 смысловая ΗίΑ-Β
28 смысловая ΗίΑ-Ρ
29 смысловая НЬА-С
30 смысловая 5РР1
31 смысловая ΜΥΟ1Ρ
32 смысловая 5РАРС
33 смысловая 5РАРС
34 смысловая 11ВО///САВВР1
35 смысловая ССЫ01
36 смысловая СОЫА1
37 смысловая ЕСР1
38 смысловая ЕСР1
39 смысловая ΤΝΡ3Ρ10
40 смысловая 31Л-Р2
41 смысловая СЕРСАМ
42 смысловая АТРЗ
- 11 025926
43 смысловая ΜΙΡ21
44 смысловая ВА5Р1
45 смысловая ΙΡΙΤ2
46 смысловая 3ΙΙΙ.Ρ1
47 смысловая Ю1_С2 /// ЮЬСЗ
48 смысловая Ю1_С2 /// ЮЬСЗ
49 смысловая (полностьюОэкзонная) 1еьС2 /// юьсз
50 смысловая 1СЬС2 /// ЮЬСЗ
51 смысловая 1СЬС2 /// ЮЬСЗ
52 смысловая 1СЬС1
53 смысловая 1СЬС1
54 смысловая Ю1_С2 /// Ю1_СЗ
55 смысловая ΑΝΟΡΤΙ.2
56 смысловая СОЬ5А2
57 смысловая юэ
58 смысловая ΤΗΥ1
59 смысловая ΝϋΝ
60 смысловая К<352
61 смысловая ΜΕΙ33Ρ1 /// ΜΕΙ33Ρ2
62 смысловая ΘΒΡ2
63 смысловая СЗР1К
64 смысловая С1К
65 смысловая РАТ1
66 смысловая СО1_1 А1
67 смысловая РНОВ
68 смысловая ММР11
69 смысловая САОО45В
70 смысловая ММР14
71 смысловая ММР14
72 смысловая ΙΟΗΟ4
73 смысловая ООХбОЬ
74 смысловая ЗРР1
75 смысловая РОР2
76 смысловая СТЗК
- 12 025926
77 смысловая РС6Р2В
78 смысловая РТАРР
79 смысловая 1САМ1
80 смысловая НС1.31
81 нет соответствующего транскрипта —
82 смысловая 3Ι.ΡΝ11
83 нет соответствующего транскрипта —
84 смысловая ϋΑΜ3
85 смысловая ТМЕМ49
86 смысловая ТМЕМ49
87 смысловая Ι.ΤΒΡ2
88 смысловая ΙΡ31
89 смысловая СОЬ5А2
90 смысловая С17ОЙ91
91 смысловая ΟΡΝΜΒ
92 смысловая РАМ 198В
93 смысловая М1САЬ2
94 смысловая ТМЕМ2
95 смысловая СНЗТ15
96 смысловая 8ЕСТМ1
97 смысловая ϋΟΝ
98 смысловая ЧСАМ1
99 смысловая ΤΝΡΑΙΡ3
100 смысловая СГОА
101 смысловая СГОА
102 смысловая РВХО32
103 смысловая СОИ2А1
104 смысловая СРЕ
105 смысловая СИТА
106 смысловая СА37
107 смысловая СО1-ЗА1
108 смысловая ΡΝ1
109 смысловая ΙΡΙ30
110 смысловая ΙΤ6Β2
- 13 025926
111 смысловая ΕΙ.Ν
112 смысловая СМТМЗ
113 смысловая ΑΝΤΧΚ1
114 смысловая ΑΚΗΘϋΙΒ
115 смысловая Ι.ΑΡΤΜ5
116 смысловая 80X4
117 смысловая ΙΡΙ44Ι_
118 смысловая 11_411
119 смысловая ΑΝΤΧΚ2
120 смысловая Ю1.С2 /// Ю1_СЗ
121 смысловая ΕΡ8ΤΙ1
122 смысловая В1ГССЗ
123 смысловая 10ЬС2 /// ЮЬСЗ
124 смысловая ВЗТ2
125 смысловая ΤΝΡ3Ρ10
126 смысловая СОЫ0А1
127 смысловая 1О1.С2 /// Ю1_СЗ
128 смысловая ЕВР1
129 смысловая КНОВТВЗ
130 смысловая СОК6
131 смысловая С 074
132 смысловая Ι3Μ1
133 смысловая СГОС
134 смысловая ΒΙΝ2
135 смысловая 05ΚΝΡ1
136 смысловая ΤΥΕΟΒΡ
137 смысловая СГОТЫЕЗ
138 смысловая ϋΟΝ
139 смысловая Ι6ΡΒΡ4
140 смысловая АОАН
141 смысловая 3ΙΡΡΑ
142 смысловая Р08В
143 смысловая ССОС80
144 смысловая 10ЬС1
- 14 025926
145 смысловая нсзт
146 смысловая ΙΡΙ35
147 смысловая В1РСЗ
148 смысловая СО1.3А1
149 смысловая ΙΡΙΤΜ2
150 смысловая ΖΡΡ36
151 смысловая ММР11
152 смысловая СО1-1А2
153 смысловая НЬА-ϋΡΑΙ
154 смысловая τννίδτι
155 смысловая ΖΝΡ154
156 смысловая ЕСР1
157 смысловая Ю1.С2 /// ЮЬСЗ
158 смысловая ΤΝΡ5Ρ10
159 смысловая 1СКС
160 смысловая 1СНС1 /// 1СНС4
161 смысловая СВР5
162 смысловая СОИА2
163 смысловая АРОС1
164 нет соответствующего транскрипта ...
165 смысловая СО1.3А1
166 антисмыслов ΡΧϋΝ
167 антисмыслов ЕСР1
168 смысловая СВРЗ
169 смысловая 15015
170 смысловая ...
171 смысловая ΚΙΑΑ0146
172 смысловая ОМАН
173 смысловая АРВВ2
174 смысловая ТРМ1
175 нет соответствующего транскрипта ...
176 смысловая ΟΜϋ
177 нет совпадения в геноме —
178 смысловая ШОРА
- 15 025926
179 смысловая ...
180 нет соответствующего транскрипта ...
181 смысловая ϋυδΡΐ
182 смысловая СВР1
183 смысловая ΡΑΡνΟ
184 смысловая МАРР
185 смысловая ΡϋΘΡΟ
186 смысловая Μ3Ν
187 смысловая Ρ5Αϋ2
188 смысловая ΤΡΜ1
189 смысловая ΕΜΒ
190 смысловая Ο6οιί155
191 смысловая РОЗ
192 смысловая ϋΕΧΙ
193 смысловая ΚΝΡ19Α
194 смысловая ΡΒΧΟ32
195 смысловая ϋΡΥδΙ.3
196 смысловая РР1СК1.Е1
197 антисмысловая ЕСР11
198 антисмысловая ΝΡΡ2
199 смысловая Β2Μ
200 антисмысловая ΜΙΡ21
201 смысловая ΜΜΡ2
202 смысловая ΟϋΚ1
203 смысловая НЬА-В
204 смысловая стор
205 смысловая ϋΟΝ
206 смысловая 50ϋ2
207 смысловая ΡΝ1
208 смысловая СО1.8А2
209 смысловая 5СК1
210 смысловая ΤΙΜΡ3
211 смысловая АСТА2
212 смысловая 3ΡΟΝ
- 16 025926
213 смысловая ίΟΧί1
214 смысловая ССР1
215 смысловая евп
216 смысловая СОН11
217 смысловая РССРЗА
218 смысловая шм
219 смысловая ΝΝΜΤ
220 смысловая СОИА2
221 смысловая ΚΘ31
222 смысловая С6А1
223 смысловая зРАКси
224 смысловая ϋΑΒ2
225 антисмысловая СТНРС1
226 смысловая РС516
227 смысловая ΡΒΙ_Ν1
228 смысловая 5РР1
229 смысловая стзв
230 смысловая ЗРР1
231 смысловая ЗЦС1
232 смысловая рьди
233 смысловая ΡϋΘΡΡΑ
234 смысловая 3ΕΡΡΙΝΡ1
235 смысловая ΒΟΝ
236 смысловая СО1.6АЗ
237 антисмысловая СЗ
238 антисмысловая СЗ
239 антисмысловая зрр1
240 антисмысловая ΗΙ_Α-ϋΟΑ1
241 антисмысловая ОА31
242 смысловая УСАЫ
243 антисмысловая ...
244 смысловая Ι0Η04 Ш 1СНС2 Ш 1СНС1 III ΙΟΗΟΡ
245 смысловая 1ОНС2
- 17 025926
246 смысловая С3ой26
247 антисмысловая АТРЗ
248 антисмысловая АТРЗ
249 антисмысловая 51Л-Р1
250 смысловая ΡΝ1
251 антисмысловая СА1_Б1
252 антисмысловая САЮ1
253 смысловая ТМЕМ49
254 смысловая ТМЕМ49
255 смысловая СНБ5
256 антисмысловая ЕСР1
257 антисмысловая 3ΝΑΙ2
258 антисмысловая ΙΤΡΡΙΡΙ_2
259 антисмысловая САВВРИ /// ΙΙΒϋ
260 антисмысловая САВВРИ /// ΙΙΒϋ
261 антисмысловая ТО/13Т1
262 антисмысловая ΒΛ/Ι3Τ1
263 антисмысловая ВАТР2
264 антисмысловая ΝΡΚΒΙΖ
265 смысловая СЗОЙ26
266 антисмысловая ЬОХИ
267 смысловая —
268 антисмысловая ΤΙΜΡ2
269 антисмысловая ΡΝ1
270 антисмысловая СОЫА1
271 антисмысловая ϋΟΝ
272 смысловая ТКЕН
273 антисмысловая ΙΙΒΕ2Ι_Θ
274 антисмысловая АРОЫ
275 антисмысловая В1РСЗ
276 антисмысловая В1РСЗ
277 смысловая 1Л.РВ4
278 смысловая Ρ0ϋ2
279 смысловая ТМЕМ49
- 18 025926
280 смысловая Ν0Ρ4
281 смысловая СОИОА1
282 смысловая САБЗЗТ4
283 смысловая ИСК
284 смысловая ΤΑΟΙ.Ν
285 смысловая Τννΐ5Τ1
286 смысловая НСБ51
287 смысловая Ι_ΡΑΚ6
288 смысловая ΙΤΟΒ2
289 смысловая Ь5Т1
290 смысловая ΗίΑ-Β
291 смысловая С17огГ91
292 смысловая гсзн12А
293 смысловая КБР10
294 смысловая ВАЗР1
295 смысловая ВАЗР1
- 19 025926
Таблица 1В
Г ены кластера ангиогенеза и иммунного ответа по фиг. 6
ЗЕО N0: Ориентация Обозначение гена
2 смысловая (полностью экзонная) ΡϋΟΡΟ
3 смысловая (полностью экзонная) ТОРВЗ
4 смысловая (полностью экзонная) КАС2
5 смысловая (полностью экзонная) МАКСКЗ
6 смысловая (полностью экзонная) А1_0Х5
7 смысловая (полностью экзонная) СО1-8А1
11 смысловая (полностью экзонная) Κ0ΝΑΒ2
12 смысловая (полностью экзонная) ТНВ31
14 смысловая (полностью экзонная) стер
15 смысловая (полностью экзонная) стер
16 смысловая (полностью экзонная) νΟΑΝ
18 смысловая (полностью экзонная) 1СКС
19 смысловая (полностью экзонная) 1СКС
21 смысловая (включает интронную) ЫРАТС1
22 смысловая (полностью экзонная) НМНА1
- 20 025926
23 смысловая (полностью экзонная) РС6Р1В
24 смысловая (полностью экзонная) ΕϋΑ2Ρ
25 смысловая (полностью экзонная) СО1-8А1
26 смысловая (полностью экзонная) СОИ2А1
27 смысловая (полностью экзонная) НЬА-В
28 смысловая ΗίΑ-Ρ
37 смысловая (полностью экзонная) ΕΘΡ1
40 смысловая (полностью экзонная) 81Л-Р2
41 смысловая (полностью экзонная) СЕРСАМ
42 смысловая (полностью экзонная) АТРЗ
43 смысловая (полностью экзонная) ΜΙΡ21
45 смысловая (полностью экзонная) ΙΡΙΤ2
47 смысловая (полностью экзонная) 1СЬСЗ
48 смысловая (полностью экзонная) 1С1_СЗ
49 смысловая (полностью экзонная) 1С1_СЗ
50 смысловая (полностью экзонная) 1С1_СЗ
51 смысловая (полностью экзонная) Ю1.СЗ
54 смысловая (полностью экзонная) Ю1.СЗ
55 смысловая (полностью экзонная) ΑΝΘΡΤΙ.2
56 смысловая (полностью экзонная) СО1-5А2
58 смысловая (полностью экзонная) ΤΗΥ1
59 смысловая (полностью экзонная) ΝϋΝ
60 смысловая (полностью экзонная) РС32
61 смысловая (полностью экзонная) ΜΕΙ33Ρ2
62 смысловая (полностью экзонная) СВР2
65 смысловая (полностью экзонная) РАТ1
66 смысловая (полностью экзонная) СО1_1 А1
68 смысловая (полностью экзонная) ММР11
69 смысловая (полностью экзонная) ΟΑϋϋ45Β
71 смысловая (полностью экзонная) ММР14
72 смысловая (полностью экзонная) Κ3ΗΘ4
80 смысловая (полностью экзонная) НСЬ31
83 нет соответствующего транскрипта
84 смысловая (полностью экзонная) ΰΑΜ3
- 21 025926
86 смысловая (полностью экзонная) ТМЕМ49
87 смысловая (полностью экзонная) Ι.ΤΒΡ2
88 смысловая (полностью экзонная) ΙΡ31
90 смысловая (полностью экзонная) С17огГ91
91 смысловая (полностью экзонная) ΟΡΝΜΒ
92 смысловая (полностью экзонная) РАМ 198В
95 смысловая (полностью экзонная) СН5Т15
97 смысловая (полностью экзонная) ϋΟΝ
98 смысловая (полностью экзонная) νθΑΜ1
105 смысловая (полностью экзонная) СИТА
106 смысловая (полностью экзонная) ОА37
107 смысловая (полностью экзонная) СО1.3А1
110 смысловая (полностью экзонная) 1ТСВ2
111 смысловая (полностью экзонная) ΕΙ_Ν
112 смысловая (полностью экзонная) СМТМЗ
113 смысловая (полностью экзонная) ΑΝΤΧΡ1
118 смысловая (полностью экзонная) 11_411
119 смысловая (полностью экзонная) ΑΝΤΧΡ2
120 смысловая (полностью экзонная) К31-С2 /// ЮЬСЗ
123 смысловая (полностью экзонная) 1С1-СЗ
124 смысловая (полностью экзонная) В5Т2
126 смысловая (полностью экзонная) СО1-10А1
127 смысловая (полностью экзонная) 1С1.СЗ
128 смысловая (полностью экзонная) РВР1
129 смысловая (полностью экзонная) РНОВТВЗ
131 смысловая (полностью экзонная) СО74
132 смысловая (полностью экзонная) Ι5Μ1
135 смысловая (полностью экзонная) 03ΚΝΡ1
138 смысловая (полностью экзонная) ϋΟΝ
139 смысловая (полностью экзонная) 1СРВР4
143 смысловая (полностью экзонная) ССОС80
148 смысловая (полностью экзонная) СО1-ЗА1
150 смысловая (полностью экзонная) ΖΡΡ36
151 смысловая (полностью экзонная) ММР11
- 22 025926
152 смысловая (полностью экзонная) СОИА2
153 смысловая (полностью экзонная) ΗΙ_Α-ϋΡΑ1
154 смысловая (полностью экзонная) ТО/15Т1
155 смысловая (полностью экзонная) ΖΝΡ154
157 смысловая (полностью экзонная) 1<31_СЗ
159 смысловая (полностью экзонная) 1ОКС
160 смысловая (полностью экзонная) 1СНС1
162 смысловая (полностью экзонная) С0МА2
163 смысловая (полностью экзонная) АРОС1
167 антисмысловая ЕСР1
171 смысловая (полностью экзонная) ΚΙΑΑ0146
174 смысловая (полностью экзонная) ТРМ1
176 смысловая (включает интронную) ϋΜϋ
180 нет соответствующего транскрипта
181 смысловая (полностью экзонная) ϋυδΡΐ
182 смысловая (полностью экзонная) СВР1
185 смысловая (включает интронную) ΡϋΟΡΟ
186 смысловая (включает интронную) ΜδΝ
188 смысловая (включает интронную) ΤΡΜ1
189 смысловая (полностью экзонная) ΕΜΒ
191 смысловая (полностью экзонная) ΡΟδ
195 смысловая (включает интронную) ϋΡΥδΙ-3
197 антисмысловая ΕΟΡ1
198 антисмысловая ΝΡΡ2
201 смысловая (полностью экзонная) ΜΜΡ2
204 смысловая (полностью экзонная) стер
211 смысловая (полностью экзонная) АСТА2
213 смысловая (полностью экзонная) ьохи
216 смысловая (полностью экзонная) СОН11
218 смысловая (полностью экзонная) шм
219 смысловая (полностью экзонная) ΝΝΜΤ
222 смысловая (полностью экзонная) ΘϋΑ1
225 антисмысловая СТНРС1
229 смысловая (полностью экзонная) СТ6В
- 23 025926
232 смысловая (полностью экзонная) Р1_А11
233 смысловая (полностью экзонная) РОСРРА
242 смысловая (полностью экзонная) νΟΑΝ
243 антисмысловая --
244 смысловая (полностью экзонная) 16НС4 /// ΙΘΗΟ2 /// 1СНС1 ///ι онер
245 смысловая (полностью экзонная) ΙΘΗΟ2
246 смысловая (включает интронную) СЗогГ26
247 антисмысловая АТРЗ
248 антисмысловая АТРЗ
250 смысловая (полностью экзонная) ΡΝ1
251 антисмысловая САЮ1
252 антисмысловая САЮ1
256 антисмысловая ЕСР1
261 антисмысловая ПЛ/15Т1
262 антисмысловая Т\Л/13Т1
263 антисмысловая ВАТР2
264 антисмысловая ΝΡΚΒΙΖ
265 смысловая (включает интронную) СЗогГ26
266 антисмысловая ЬОХИ
267 смысловая (включает интронную) --
269 антисмысловая ΡΝ1
270 антисмысловая СОЫА1
272 смысловая (полностью экзонная) ТРЕН
274 антисмысловая АРОМ
281 смысловая (полностью экзонная) СОИОА1
282 смысловая (полностью экзонная) ΟΑΙ_33Τ4
284 смысловая (полностью экзонная) ΤΑΘίΝ
285 смысловая (полностью экзонная) τννίδτι
286 смысловая (полностью экзонная) НС1.51
288 смысловая (полностью экзонная) 1ТСВ2
290 смысловая (полностью экзонная) ΗΙ-Α-Β
291 смысловая (полностью экзонная) С170Й91
296 смысловая (полностью экзонная) РВПМ1
- 24 025926
297 смысловая (полностью экзонная) СОИ5А1
298 смысловая (полностью экзонная) АОР7РЗ
299 антисмысловая 1СРВР5
300 смысловая (полностью экзонная) ΡΑΝΚ1
301 антисмысловая ΙΝ8
302 смысловая (полностью экзонная) СО1.27А1
303 смысловая (полностью экзонная) СО1-5А1
304 смысловая (полностью экзонная) РР1СКЬЕ2
305 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
306 смысловая (полностью экзонная) ΟΧΥΙ.Τ2
307 смысловая (включает интронную) ΚΙ.Ρ12
308 нет соответствующего транскрипта
309 смысловая (полностью экзонная) РВХО32
310 нет соответствующего транскрипта
311 смысловая (полностью экзонная) АЗАН2В
312 антисмысловая ΡΡΡΙΒΡ1
313 антисмысловая ΧΙ3Τ
314 смысловая (полностью экзонная) ΙΟΡΒΡ6
315 смысловая (полностью экзонная) РОВО1
316 смысловая (полностью экзонная) ТРМ1
317 антисмысловая Ν/Α
318 антисмысловая РЬЕКНС1
319 смысловая (полностью экзонная) ΝΡ2Ρ1
320 смысловая (полностью экзонная) ΝΡϋΟ1
321 антисмысловая ΙΝ3
322 смысловая (полностью экзонная) ТРАР5
323 смысловая (полностью экзонная) САШ1
324 смысловая (включает интронную) СНКМЗ
325 смысловая (полностью экзонная) АМОТИ
326 смысловая (включает интронную) СОИ2А1
327 смысловая (полностью экзонная) ΡΙ_ΧΝΑ4
328 смысловая (включает интронную) ТМЕМ43
329 смысловая (включает интронную) РОРА
330 антисмысловая ΙΝ3
- 25 025926
331 смысловая (полностью экзонная) Τ3ΡΑΝ18
332 нет соответствующего транскрипта
333 смысловая (полностью экзонная) ТЫС
334 смысловая (полностью экзонная) ΤΥΡΟ3
335 антисмысловая ΕΡΝΑ5
336 смысловая (полностью экзонная) ΜΥΙ.9
337 смысловая (полностью экзонная) ΜΙΡ198
338 смысловая (включает интронную) Ν/Α
339 смысловая (включает интронную) ΡΙ.Α2Ρ1
340 смысловая (полностью экзонная) СОЫ4А1
341 смысловая (полностью экзонная) ΝΡΡ1
342 смысловая (полностью экзонная) Ρ30Ν1
343 смысловая (включает интронную) ΡϋΟΡϋ
344 нет соответствующего транскрипта
345 смысловая (включает интронную) ϋΟΟΚ4
346 смысловая (полностью экзонная) ΤΡΙΜ13
347 смысловая (полностью экзонная) Ι0ΡΒΡ5
348 смысловая (полностью экзонная) С19огГ63
349 антисмысловая ΚΙ.Ρ6
350 антисмысловая ΤΡΙΟ
351 смысловая (полностью экзонная) СО1-4А1
352 смысловая (полностью экзонная) ΕΡϋΡ1
353 смысловая (полностью экзонная) ΡΝϋΟ1
354 смысловая (полностью экзонная) И1Р1
355 смысловая (полностью экзонная) СЕ34
356 смысловая (полностью экзонная) СРР176
357 смысловая (включает интронную) 0ΧΥΙ/Γ2
358 антисмысловая 1Л/НЗС1 Ы
359 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
360 смысловая (полностью экзонная) ΡΘΝ
361 смысловая (включает интронную) САЗ
362 смысловая (полностью экзонная) ΤΙΜΡ3
363 смысловая (полностью экзонная) ΕΡΝΑ5
364 смысловая (полностью экзонная) ΡΑ3ΟΚΡ2
- 26 025926
365 смысловая (включает интронную) реш
366 антисмысловая АС883
367 смысловая (полностью экзонная) 5ΤΜΝ3
368 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
369 антисмысловая С7огГ29
370 смысловая (полностью экзонная) НОХС6
371 смысловая (полностью экзонная) КЬР8
372 смысловая (включает интронную) 5ΕΚΙΝ05
373 смысловая (полностью экзонная) АКТЗ
374 смысловая (полностью экзонная) ТСРВ2
375 антисмысловая ΜΝΤ5Α
376 нет соответствующего транскрипта
377 нет соответствующего транскрипта
378 антисмысловая Ι0ΡΒΡ7
379 нет соответствующего транскрипта
380 смысловая (включает интронную) 31ЛТ1С4
381 смысловая (полностью экзонная) АА38
382 смысловая (полностью экзонная) НЕРН
383 смысловая (полностью экзонная) ΑϋΗ5
384 смысловая (полностью экзонная) ΤΙΜΡ2
385 смысловая (полностью экзонная) ЕМР1
386 смысловая (полностью экзонная) СХСИ4
387 смысловая (полностью экзонная) ΖΝΡ548
388 смысловая (полностью экзонная) зесв
389 смысловая (включает интронную) АЗН2Ь
390 смысловая (включает интронную) 5ΕΚΙΝ05
391 нет соответствия в геноме
392 смысловая (полностью экзонная) ТМЕМ159
393 смысловая (включает интронную) КВМЗЗ
394 смысловая (полностью экзонная) ТМЕМ49
395 смысловая (включает интронную) КОКА
396 нет соответствующего транскрипта
397 антисмысловая ΖΝΡ608
398 нет соответствия в геноме
- 27 025926
399 смысловая (полностью экзонная) ΑϋΑΜΤ32
400 смысловая (полностью экзонная) ΑΡΟϋϋΙ
401 антисмысловая ΟΧΥΙ_Τ2
402 смысловая (полностью экзонная) ΧΙ3Τ
403 смысловая (полностью экзонная) ΜΒΝΙ.2
404 смысловая (полностью экзонная) ЗНР
405 смысловая (включает интронную) ΑΡΒΒ2
406 нет соответствующего транскрипта
407 смысловая (полностью экзонная) СОИ4А1
408 смысловая (полностью экзонная) Ι6ΡΒΡ5
409 смысловая (полностью экзонная) СРЕВ5
410 антисмысловая ΙΝ3
411 смысловая (полностью экзонная) ВАНСС1
412 смысловая (полностью экзонная) ΡΡΧΑΡ
413 смысловая (полностью экзонная) ΙΝ3
414 смысловая (полностью экзонная) ϋϋΡ2
415 смысловая (полностью экзонная) СА12
416 смысловая (полностью экзонная) ΡΗΟΒ
417 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
418 смысловая (полностью экзонная) 8ΝΟΡϋ116-4
419 смысловая (полностью экзонная) МЕСЗ
420 смысловая (полностью экзонная) 1Λ/ΝΤ4
421 смысловая (полностью экзонная) ΡΒΙ.Ν2
422 антисмысловая ΟΑΑΜ1
423 нет соответствующего транскрипта
424 смысловая (полностью экзонная) 3ΗΝ1
425 смысловая (включает интронную) ΑΡΒΒ2
426 смысловая (полностью экзонная) ΡΤΡΡ
427 антисмысловая 1СР1
428 смысловая (полностью экзонная) изт
429 смысловая (полностью экзонная) ЗМАКСА1
430 смысловая (включает интронную) Ν/Α
431 смысловая (полностью экзонная) Ю1_СЗ
432 антисмысловая ΙΝ3
- 28 025926
433 смысловая (полностью экзонная) ΚΑΝΚ4
434 антисмысловая 1СР1
435 смысловая (полностью экзонная) ΟΥΡ27Α1
436 антисмысловая ΕΙΡ2Β5
437 нет соответствующего транскрипта
438 смысловая (полностью экзонная) 5ΝΡΝΡ25
439 смысловая (полностью экзонная) 5ΕΤϋ7
440 смысловая (полностью экзонная) М5Х1
441 смысловая (полностью экзонная) НОРХ
442 смысловая (полностью экзонная) ΝΙϋ2
443 смысловая (полностью экзонная) КЗР1
444 смысловая (полностью экзонная) Ρ8ϋ3
445 смысловая (полностью экзонная) Р6РВ1
446 смысловая (полностью экзонная) ЕТ71
447 смысловая (полностью экзонная) ΖΝΡ655
448 нет соответствия в геноме
449 антисмысловая ΙΝδ
450 смысловая (полностью экзонная) 3ΡΡΡ2
451 смысловая (полностью экзонная) 5РАС16
452 антисмысловая ΝΚ2Ρ2
453 смысловая (включает интронную) 5ΥΝΡΟ2
454 смысловая (полностью экзонная) ΡΑΜ101Β
455 антисмысловая 1СР2
456 смысловая (полностью экзонная) САЗ
457 смысловая (полностью экзонная) ΧΙ3Τ
458 нет соответствующего транскрипта
459 смысловая (полностью экзонная) ννΝΤ7Α
460 смысловая (включает интронную) Ν/Α
461 смысловая (полностью экзонная) Ρ6ΡΒ1
462 антисмысловая ΡΧΥϋ6
463 смысловая (полностью экзонная) РСРР1
464 смысловая (включает интронную) Ι0ΡΒΡ7
465 смысловая (полностью экзонная) ΤΙΜΡ2
466 смысловая (полностью экзонная) оизр1
- 29 025926
467 смысловая (включает интронную) 3ΕΡΙΝ05
468 нет соответствующего транскрипта
469 смысловая (полностью экзонная) АВИМ1
470 смысловая (полностью экзонная) ΑΚΙ.4Α
471 антисмысловая ЗНЗТС2
472 антисмысловая ΝΒ2Ρ2
473 смысловая (полностью экзонная) ΕΝΘ
474 смысловая (полностью экзонная) МСР
475 смысловая (полностью экзонная) МЕСЗ
476 антисмысловая РАМ115А
477 смысловая (полностью экзонная) ЕОР1
478 смысловая (полностью экзонная) ЗЫОРЮИб-З
479 смысловая (полностью экзонная) АЕВР1
480 смысловая (включает интронную) 5ϋΚ1
481 смысловая (полностью экзонная) ЕЫС1
482 смысловая (полностью экзонная) 3ΝΟΚΟ116-7
483 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
484 смысловая (полностью экзонная) ΑΡΟϋ
485 антисмысловая Ν/Α
486 антисмысловая СА51
487 смысловая (полностью экзонная) νΡ536
488 нет соответствующего транскрипта
489 смысловая (полностью экзонная) ЗРНК2
490 смысловая (полностью экзонная) 3ΝΟΡϋ116-8
491 смысловая (полностью экзонная) ΜΥΟ10
492 смысловая (полностью экзонная) НОХС6
493 смысловая (полностью экзонная) ΚΝΡ149
494 смысловая (полностью экзонная) ВТС2
495 смысловая (включает интронную) ΜΑΡ3Κ1
496 смысловая (полностью экзонная) 3ΝΟΡϋ116-23
497 смысловая (включает интронную) АС31-4
498 смысловая (полностью экзонная) СУР27С1
499 смысловая (включает интронную) СОИ2А1
500 смысловая (полностью экзонная) 1СРВР5
- 30 025926
501 смысловая (полностью экзонная) ΟΙΙ5Ρ4
502 смысловая (полностью экзонная) РЕКЕВЗ
503 смысловая (полностью экзонная) 8ОС2
504 антисмысловая ΡΧΥϋ6
505 смысловая (полностью экзонная) СО1.5А1
506 смысловая (полностью экзонная) МАРСКЗ
507 смысловая (полностью экзонная) ΙΡ82
508 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
509 антисмысловая Ρ3ΟΝ1
510 смысловая (полностью экзонная) ΡΥΝ
511 смысловая (полностью экзонная) 1СРВР5
512 смысловая (полностью экзонная) ΝΙΙϋΤ4Ρ1
513 смысловая (полностью экзонная) ΝΡΚΒΙΖ
514 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
515 смысловая (полностью экзонная) С70Д41
516 смысловая (полностью экзонная) МЕСЗ
517 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
518 смысловая (полностью экзонная) Р1.ЕКНС1
519 смысловая (полностью экзонная) ΖΝΡ827
520 смысловая (полностью экзонная) ΖΝΡ175
521 смысловая (полностью экзонная) ΧΙ3Τ
522 смысловая (включает интронную) Ο3Ν
523 смысловая (включает интронную) РОКА
524 смысловая (полностью экзонная) СА13
525 антисмысловая ТМХ4
526 смысловая (полностью экзонная) ΚΙΤ
527 смысловая (включает интронную) ννϋΚ78
528 смысловая (полностью экзонная) ЕСЕИ
529 смысловая (полностью экзонная) ΧΙ3Τ
530 смысловая (полностью экзонная) РРОСР
531 смысловая (полностью экзонная) С9О1Т167
532 смысловая (полностью экзонная) мисе
533 смысловая (включает интронную) Р4НА2
534 смысловая (полностью экзонная) РАМ69С
- 31 025926
535 смысловая (полностью экзонная) N0X4
536 смысловая (включает интронную) Ν/Α
537 нет соответствующего транскрипта
538 смысловая (полностью экзонная) ЗМОХ
539 смысловая (полностью экзонная) ΚΙΑΑ0922
540 нет соответствующего транскрипта
541 смысловая (полностью экзонная) ΧΙ3Τ
542 смысловая (полностью экзонная) ΝΡΑ32
543 смысловая (полностью экзонная) ΝΑνί
544 смысловая (включает интронную) Ν/Α
545 смысловая (полностью экзонная) НБА-А
546 смысловая (полностью экзонная) РАМ46С
547 смысловая (полностью экзонная) Ν/Α
548 смысловая (полностью экзонная) 3Ι.ΑΜΡ7
549 смысловая (полностью экзонная) рсернс
550 смысловая (полностью экзонная) С13
551 смысловая (полностью экзонная) ыирря
552 антисмысловая сюс
553 антисмысловая 5АТ1
554 смысловая (полностью экзонная) 30ϋ2
555 смысловая (полностью экзонная) ΙΡΡ1
556 смысловая (полностью экзонная) 3ΡΝ
557 антисмысловая Ι_ΤΒ
558 смысловая (полностью экзонная) АРЮ5А
559 смысловая (полностью экзонная) ВЗТ2
560 смысловая (полностью экзонная) НБА-Р
561 смысловая (полностью экзонная) ХАР1
562 смысловая (полностью экзонная) ТС0Р1
563 смысловая (полностью экзонная) КР1_23АР1
564 смысловая (полностью экзонная) ΙΙ_1ΡΝ
565 смысловая (полностью экзонная) ΙΡΙΤ5
566 смысловая (полностью экзонная) В2М
567 антисмысловая СВР1
568 смысловая (полностью экзонная) НБА-Р
- 32 025926
569 смысловая (полностью экзонная) ЦСКА
570 смысловая (полностью экзонная) ХВР1
571 смысловая (полностью экзонная) Р1_СС2
572 смысловая (полностью экзонная) РАМ46С
573 нет соответствия в геноме
574 смысловая (полностью экзонная) ТКЕМ2
575 смысловая (полностью экзонная) 1_СА1_59
576 смысловая (полностью экзонная) ΗΙ_Α-ϋΡΒ1
577 антисмысловая ΟϋΡ3Β
578 смысловая (полностью экзонная) МХ1
579 смысловая (полностью экзонная) ЗТАТ1
580 смысловая (полностью экзонная) СТЗВ
581 смысловая (полностью экзонная) РАМ26Р
582 смысловая (включает интронную) РАКР14
583 антисмысловая ЗАТ1
584 смысловая (полностью экзонная) СТ35
585 нет соответствующего транскрипта
586 смысловая (полностью экзонная) СТЗВ
587 смысловая (полностью экзонная) ΑϋΑΜ8
588 смысловая (включает интронную) В2М
589 смысловая (полностью экзонная) Р1_\/СК2
590 смысловая (полностью экзонная) ΤΥΡΟΒΡ
591 антисмысловая 8ΑΜϋ9Ι-
592 смысловая (полностью экзонная) ЗАМЦЭЬ
593 смысловая (полностью экзонная) 31СЬЕС1
594 смысловая (полностью экзонная) ММР7
595 смысловая (полностью экзонная) АРОН
596 смысловая (полностью экзонная) ΟΥίϋ
597 смысловая (полностью экзонная) ША-В
598 смысловая (полностью экзонная) ЗАТ1
599 смысловая (полностью экзонная) СЮВ
600 смысловая (полностью экзонная) Ш-Α-ϋΜΒ
601 смысловая (полностью экзонная) ΝΙ_ΚΟ5
602 смысловая (полностью экзонная) РАМ20А
- 33 025926
603 антисмысловая Ν/Α
604 смысловая (полностью экзонная) ЗТАТ1
605 смысловая (включает интронную) ЗТАТ1
606 смысловая (полностью экзонная) 5ТАТ1
607 антисмысловая Ν/Α
608 смысловая (полностью экзонная) ΟΕΡΙ.3
609 смысловая (полностью экзонная) ΗΙ-Α-Ρ
610 смысловая (полностью экзонная) МАР В
611 смысловая (полностью экзонная) С 04
612 смысловая (полностью экзонная) НЬА-А
613 смысловая (полностью экзонная) иВЕ21_6
614 смысловая (полностью экзонная) СГОС
615 смысловая (полностью экзонная) С0163
616 смысловая (полностью экзонная) 1_РМР
617 смысловая (полностью экзонная) С11ΟΙΤ17
618 смысловая (полностью экзонная) ХАР1
619 смысловая (полностью экзонная) еьрх
620 смысловая (полностью экзонная) ΙΡΙΗ1
621 смысловая (полностью экзонная) СО44
622 смысловая (полностью экзонная) □ТАР
623 смысловая (полностью экзонная) ССОС69
624 смысловая (полностью экзонная) СВР5
625 смысловая (полностью экзонная) РМЬ
626 смысловая (полностью экзонная) 5АМО9
627 смысловая (полностью экзонная) СВРЗ
628 смысловая (полностью экзонная) ΡΑ5ΘΡΡ2
629 смысловая (полностью экзонная) РССР2А
630 смысловая (полностью экзонная) ВЗТ2
631 смысловая (полностью экзонная) НЬА-А
В определенных типичных вариантах исполнения все или часть биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В, могут быть использованы в сигнатуре экспрессии. В определенных других типичных вариантах исполнения все или часть биомаркеров, перечисленных в группе I или группе II, могут быть использованы в сигнатуре экспрессии. Например, сигнатуры экспрессии, включающие биомаркеры, указанные в табл. 1А, 1В, группе I и группе II, могут быть получены с использованием способов, предусмотренных в данном документе, и могут включать от одного до всех маркеров, приведенных в табл. 1А, 1В, группе I, группе II, и любую и все возможные промежуточные комбинации (например, четыре выбранных маркера, 16 выбранных маркеров, 74 выбранных маркера и т.д.). В некоторых вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает по меньшей мере 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 или 300 или больше маркеров. В других вариантах исполнения прогностическая панель биомаркеров включает не более 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 маркеров. В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество маркеров, перечисленных в табл. 1А. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в табл. 1В. В еще одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в группе I. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в таблице группы II. В еще одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в группах I и II. В некоторых вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает по меньшей мере примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% маркеров, перечисленных в табл. 1А, 1В, группе I, группе II, или их комбинацию. Выбранные сигнатуры экспрессии могут быть собраны из биомаркеров, полученных с использованием описанных способов и аналогичных способов, известных спе- 34 025926 циалистам. В одном варианте исполнения сигнатура экспрессии содержит все 250 генов или генных продуктов, указанных в табл. 1А. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии содержит все 486 генов или генных продуктов, указанных в табл. 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает §Еф ГО N08: 632-801. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает §Еф ГО N08: 802-974.
Математические модели.
Нижеописанные способы могут быть использованы для получения сигнатуры экспрессии для распознавания субъектов, восприимчивых или невосприимчивых к антиангиогенной терапии, или в качестве прогностических индикаторов определенных типов рака, включая сигнатуры экспрессии, полученные из биомаркеров, раскрытых выше. В определенных других типичных вариантах исполнения сигнатуру экспрессии получают с использованием дерева решений (На8Йе е1 а1. Т1е Е1етей8 оГ δΙαΙί8ΐίοαΙ Ьеагтпд, 8ргшдег, №ν Уогк 2001), случайного леса (Вге1тап, 2001 Капйот Роге818. МасЫпе Ьеагтпд 45:5), нейронной сети (В18кор, №ига1 №1\\όγ1<8 Гог Райегп Кесодпйюп, С1агепйоп Рге88, 0хГогй 1995), дискриминантного анализа (Эийа е1 а1. Райегп С1а881йсайоп, 2пй ей., 1окп Айеу, №ν Уогк 2001), включая, без ограничений, линейный, диагональный линейный, квадратический и логистический дискриминантный анализ, прогностического анализа для микрочипов (РАМ, (Т1Ъ8ЫгаЫ е1 а1., 2002, Ргос. №й1. Асай. §с1. υδΑ, 99:6567-6572)) или анализа методом формального независимого моделирования аналогий классов. (81МСА (^о1й, 1976, Райегп Кесодп. 8:127-139)).
Значения экспрессии биомаркера могут быть определены в комбинации с соответствующими скалярными весами в реальном масштабе величин с переменными значениями, которые затем комбинируют с помощью линейного или нелинейного, алгебраического, тригонометрического или корреляционного среднего в единое скалярное значение с использованием алгебраического, статистического обучающего, байесова, регрессионного или аналогичных алгоритмов, обеспечивающие вместе с математически определенной решающей функцией скалярного значения прогностическую модель, с помощью которой профили экспрессии образцов могут быть разделены на отдельные классы откликающихся или не откликающихся на, резистентных или нерезистентных к, определенному препарату, классу препаратов или схеме лечения. Такие прогностические модели, включающие совокупность входящих в них биомаркеров, разрабатывают путем определения весов и порога решения, оптимизированного по чувствительности, специфичности, отрицательных и положительных прогностических значений, отношению рисков или любым их комбинациям, в условиях кросс-валидации, обобщенной кросс-валидации или аналогичной методики составления выборки, из набора типичных профилей экспрессии для исторических образцов, взятых у пациента с известным ответом на препарат и/или резистентностью.
В одном варианте исполнения биомаркеры используются для определения взвешенной суммы их сигналов, где индивидуальные веса могут быть положительными или отрицательными. Результирующую сумму (оценку экспрессии) сравнивают с предварительно определенной контрольной точкой или значением. Сравнение с контрольной точкой или значением может быть использовано для диагностики или прогнозирования клинического состояния или результата.
Как описано выше, рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что биомаркеры, включенные в классификатор, приведенный в табл. 1А, 1В, группе I и группе II, будут иметь неравные веса в классификаторе для восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту. Поэтому, хотя всего одна последовательность может быть использована для диагностики или прогнозирования результата, такого как восприимчивость к терапевтическому агенту, специфичность и чувствительность или точность диагноза или прогноза могут увеличиваться при использовании большего количества последовательностей.
В используемом в данном документе значении термин вес относится к относительной важности элемента в статистических расчетах. Вес каждого биомаркера в классификаторе генной экспрессии может быть определен для набора данных образцов, взятых у пациента, с использованием аналитических способов, известных специалистам.
В определенных типичных вариантах исполнения сигнатуру экспрессии определяют с помощью решающей функции. Решающая функция представляет собой набор взвешенных значений экспрессии, полученных с использованием линейного классификатора. Все линейные классификаторы определяют решающую функцию с использованием следующего уравнения:
Все измеренные значения, такие как интенсивности генной экспрессия на микрочипе х1, для определенного образца собирают в вектор х. Каждую интенсивность затем умножают на соответствующий вес V! для получения значения решающей функции Г(х) после прибавления члена смещения Ъ. При определении решающей функции линейный классификатор будет дополнительно определять пороговое значение, которое разделяет пространство данных генной экспрессии 8расе на две непересекающиеся половины. Типичные линейные классификаторы включают, без ограничений, частные наименьшие квадраты (РЪ8), ^длуеп е1 а1., ВюЫГогтайс8 18 (2002) 39-50), методы опорных векторов (δνΜ) (Ъс1ю1корГ е1 а1., Ьеагтпд \νί11ι Кете18, М!Т Рге88, СатЪпйде 2002) и сокращающий (8ЙГ1пкаде) дискриминантный анализ
- 35 025926 (8ΌΑ) (АМезтаИ с1 а1., Аппак οί аррЬеб 81аЙ8ЙС8 4, 503-519 (2010)). В одном типичном варианте исполнения линейный классификатор представляет собой линейный РЬ8-классификатор.
Решающую функцию эмпирически получают на основе большого набора обучающих образцов, например, от пациентов, демонстрирующих восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту. Пороговое значение делит группу пациентов на основании разных характеристик, таких как, без ограничений, восприимчивость/невосприимчивость к лечению. Интерпретацию этой величины, т.е. отсекающего порога восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту, получают на этапе разработки (обучения) для набора пациентов с известным результатом. Соответствующие веса и отсекающий порог восприимчивости/резистентности для оценки решения заданы а ргюп на основании обучающих данных способами, известными квалифицированным специалистам. В одном типичном варианте исполнения для определения веса используется дискриминантный анализ методом частных наименьших квадратов (РЬ8-ЭА). (Ь. 81аЬ1е, 8. ГСоИ. 1. СЬет. 1 (1987) 185-196; Ό. V. Идиуеп, Ό.Μ. Коске, ΒίοίηГогтаЬсз 18 (2002) 39-50).
По существу, это означает, что пространство данных, т.е. набор всех возможных комбинаций значений экспрессии биомаркера, разделен на две взаимно исключающие части, соответствующие разным клиническим классификациям или прогнозам, например одному, соответствующему восприимчивости к терапевтическому агенту, и другому - невосприимчивости. В контексте общего классификатора относительная сверхэкспрессия определенного биомаркера может или увеличивать оценку решения (положительный вес), или уменьшать ее (отрицательный вес) и, таким образом, вносить свой вклад в общее решение, например восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту.
В определенных типичных вариантах исполнения изобретения данные нелинейно трансформируют перед применением взвешенной суммы, как описано выше. Эта нелинейная трансформация может включать увеличение размерности данных. Нелинейная трансформация и взвешенное суммирование также могут быть проведены имплицитно, например, путем использования кернфункции (8сЬб1кор1 е1 а1. Ьеагтпд \νί11ι Кегпек. ΜΙΤ Ргезз, СатЬгйде 2002).
В определенных типичных вариантах исполнения данные обучающего набора пациента получают путем выделения РНК из соответствующего набора образцов раковых тканей и определения значений экспрессии гибридизацией выделенной РНК с микрочипом. В определенных типичных вариантах исполнения микрочип, используемый для получения сигнатуры экспрессии, представляет собой матрицу для транскриптомного анализа. В используемом в данном документе значении матрица для транскриптомного анализа относится к микрочипу, содержащему наборы зондов, предназначенных для гибридизации с последовательностями, верифицированными как экспрессируемые в больной ткани, представляющей интерес. С учетом альтернативного сплайсинга и переменного процессинга поли-А последовательности тканей и биологических контекстов возможно, что зонды, предназначенные для детектирования одной и той же генной последовательности, полученной из другого источника ткани или биологического контекста, не будут эффективно связываться с транскриптами, экспрессируемыми в больной ткани, представляющей интерес, приводя к потере потенциально значимой биологической информации. Соответственно, полезно проверять, какие последовательности экспрессируются в больной ткани, представляющей интерес, перед разработкой набора зондов для микрочипа. Верификация экспрессируемых последовательностей в контексте определенной болезни может быть осуществлена, например, путем выделения и секвенирования общей РНК из набора образцов больных тканей и перекрестного сравнения выделенных последовательностей с известными базами данных последовательностей нуклеиновой кислоты для подтверждения того, что набор зондов на матрице для транскриптомного анализа рассчитан на последовательности, действительно экспрессируемые в больной ткани, представляющей интерес. Способы изготовления матриц для транскриптомного анализа описаны в публикации патентной заявки США № 2006/0134663, которая включена в описание в качестве ссылки. В определенных типичных вариантах исполнения набор зондов матрицы для транскриптомного анализа рассчитан на связывание с участками в пределах 300 нуклеотидов на 3'-конце транскрипта. Способы проектирования матриц для транскриптомного анализа с наборами зондов, связывающимися с участками в пределах 300 нуклеотидов на 3'-конце транскриптов-мишеней, раскрыты в публикации патентной заявки США № 2009/0082218, которая включена в описание в качестве ссылки. В определенных типичных вариантах исполнения микрочип, используемый для получения профилей генной экспрессии по настоящему изобретению, представляет собой микрочип для дифференциального анализа рака яичников А1тас Ό8Α™ (А1тас Сгоир, Сгащауоп. ИпЬей Кшдбот).
Оптимальный линейный классификатор может быть выбран путем оценки характеристик линейного классификатора с использованием таких методов диагностики, как площадь под кривой (ППК). ПИК относится к площади под характеристической кривой обнаружения (КОС-кривая), оба эти понятия хорошо известны специалистам. Измерения ППК пригодны для сравнения точности классификатора в полном диапазоне данных. Линейные классификаторы с более высокими значениями ПИК являются более пригодными для точной классификации неизвестных между двумя группами, представляющими интерес (например, образцы рака яичников и нормальные или контрольные образцы). КОС-кривые являются пригодными для графического представления определенного признака (например, любых биомаркеров,
- 36 025926 описанных здесь, и/или любого элемента дополнительной биомедицинской информации) при распознавании двух популяций (например, индивидуумов, восприимчивых и невосприимчивых к терапевтическому агенту). Типично, данные для признака по популяции в целом (например, истории болезни и контроль) сортируют в восходящем порядке на основании значения отдельного признака. Затем для каждого значения данного признака рассчитывают относительные показатели числа истинно положительных и ложноположительных заключений. Относительное число истинно положительных заключений определяют путем подсчета числа случаев болезни со значением показателя выше величины этого признака и затем деления на общее число случаев. Относительное число ложноположительных заключений определяют путем подсчета числа контрольных субъектов со значением показателя выше величины этого признака и затем деления на общее число контрольных субъектов. Хотя такое определение относится к сценариям, в которых признак имеет значение показателя, повышенное по сравнению с контролем, это определение также применимо к сценариям, в которых признак имеет значение показателя, пониженное сравнению с контролем (в таком сценарии будут подсчитываться образцы, имеющие значение показателя ниже величины данного признака). ЕОС-кривые могут быть построены для отдельного признака, а также для других отдельных результатов, например, комбинация двух или больше признаков может быть математически комбинирована (например, сложена, вычтена, перемножена и т.д.) для получения единого суммарного значения, и такое единое суммарное значение может быть графически представлено в виде ЕОС-кривой. Дополнительно, любая комбинация множества признаков, где комбинация имеет единое результирующее значение, может быть графически представлена в виде ЕОС-кривой. Такие комбинации признаков могут представлять собой тест. ЕОС-кривая является графиком зависимости относительного числа истинно положительных заключений (чувствительность) теста от относительного числа ложноположительных заключений (1 - специфичность) теста.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии касается 25 биомаркеров, описанных в табл. 2А, с соответствующими рангами и весами, указанными в таблице, или альтернативными значениями рангов и весов, в зависимости, например, от характеристик болезни. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии касается 45 биомаркеров, описанных в табл. 2В, с соответствующими рангами и весами, указанными в таблице, или альтернативными значениями рангов и весов, в зависимости, например, от характеристик болезни. Табл. 2А и 2В ранжируют биомаркеры в порядке убывания веса в классификаторе, определенном как ранг среднего веса в составной функции решающей оценки, определенной с кросс-валидацией.
- 37 025926
Обозначения генов и соответствующие ранжированные веса для 25-генной сигнатуры
Таблица 2А
25-генная сигнатура
Ранг Обозначение гена Вес
1 ССОС80 0,0584
2 ΙΝΗΒΑ 0,0508
3 ТНВ52 0,0504
4 5РРР2 0,0437
5 ММР2 0,0367
6 Р1_А11 -0,0323
7 РАР 0,0300
8 ΡΝ1 0,0277
9 СО1.8А1 -0,0248
10 РАВ31 0,0244
11 РАМ38В 0,0242
12 νΟΑΝ 0,0230
13 СЙВ2 0,0223
14 1ТСА5 0,0216
15 СРИ5РШ2 0,0192
16 С17огТ91 0,0167
17 ΒΟΝ -0,0142
18 ΤΙΜΡ3 0,0130
19 ΑΙ.ΡΚ2 0,0123
20 ШМ 0,0104
21 ΝΚϋ2 -0,0098
22 Ι_ΟΧ -0,0082
23 ΜΙΡ1245 0,0059
24 ЮХН 0,0052
25 СХС1-12 0,0048
- 38 025926
Обозначение генов и соответствующие ранжированные веса для 45-генной сигнатуры
Таблица 2В
45-генная сигнатура
Ранг Обозначение гена Вес
1 ТМЕМ200А 0,0595
2 СЛ32 0,0560
3 ММР13 0,0383
4 СРРТ2 0,0380
5 Ρ03ΤΝ -0,0355
6 В1СС1 0,0304
7 С0Н11 0,0283
8 Μκνιι 0,0256
9 РМР22 0,0240
10 СОИ1А1 -0,0237
11 Ι0ΡΊ.2 0,0222
12 шм -0,0220
13 ΝΤΜ -0,0218
14 ΒΟΝ 0,0211
15 СО1.3А1 -0,0210
- 39 025926
16 СОИ0А1 0,0197
17 РАВ31 0,0180
18 ΑΝΟΡΤΙ.2 0,0166
19 ΡΙ,Αυ 0,0166
20 СО1-8А1 0,0164
21 ΜΙΡ1245 0,0153
22 РОЮ2 0,0146
23 ΝΚϋ2 0,0145
24 ΡΖϋ1 0,0143
25 ΟΟΡΖ2 0,0139
26 1ТСА5 0,0136
27 ν<31_1_3 0,0125
28 ΙΝΗΒΑ -0,0118
29 ΜΜΡ14 0,0110
30 νΟΑΝ 0,0100
31 ΤΗΒ32 -0,0087
32 ΚυΝΧ2 0,0083
33 ΤΙΜΡ3 0,0081
34 3ΡΚΡ2 -0,0079
35 СОИА2 0,0078
36 СО1.5А2 -0,0072
37 3ΕΚΡΙΝΡ1 0,0068
38 ΚΙΡ26Β -0,0052
39 ΤΝΡΑΙΡ6 0,0050
40 ΜΜΡ2 0,0040
41 ΡΝ1 0,0031
42 ΑΙ.ΡΚ2 0,0024
43 СТЗК 0,0015
44 ЮХИ -0,0014
45 ΕΑΡ 0,0000
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из ССЭС80, ΙΝΗΒΑ, ТНВ82, 8РКР2, ММР2, РЬАИ, РАР, ΡΝ1, СОЬ8А1, КАВ31, РАМ38В, УСАН С.1В2, 1ТСА5, СК18РЬП2, С17, Г91, ВСН Т1МР3, АЬРК2, ЬИМ, ΝΚΌ2, ЬОХ, М1К1245, ЬОХЬ1 и СХСЬ12.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, ССЭС80, ГОНВА, ТНВ82 и 8РКР2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или
21. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркерам ССЭС80, ГОНВА, ТНВ82 и 8РКР2 и одному по меньшей мере из Ν дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где Ν равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ССОС80 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21,
22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ГОНВА и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру
- 40 025926
ТНВ82 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру 8РКР2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из ТМЕМ200А, С1В2, ММР13, СРРТ2, РО8ТК В1СС1, СШ111, МКУ11, РМР22, СОЬ11А1, ЮРЬ2, ЬИМ, ЭТМ, ВОН СОЬ3А1, СОЫ0А1, КАВ31, АКСРТЬ2, РЬАИ, СОЬ8А1, М1К1245, РОРОЗ, N^2, ΡΖΌ1, СОР/2. 1ТОА5, УСРЬ3, ПМНВА, ММР14, УСАН ТНВ82, КиЯХ2, Т1МР3, 8РКР2, СОЬ1А2, СОЬ5А2, 8ЕКРЮТ1, К1Р26В, ТМРА1Р6, ММР2, РШ, АЬРК2, СТ8К, ЬОХЬ1 и РАР.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, ТМЕМ200А, С1В2, ММР13 и ОРРТ2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40 или 41. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркерам ТМЕМ200А, С1В2, ММР13 и ОРРТ2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40 или 41. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ТМЕМ200А и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру С1В2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ММР13 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ОРРТ2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из АЬРК2, ВОК СОЬ8А1, РАР, РМ, СДВ2, ГОНВА, 1ТОА5, ЬОХЫ, ЬиМ, М1К1245, ММР2, ЫКО2, РЬАИ, КАВ31, 8РКР2, ТНВ82, Т1МР3 и УСАК
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, АЬРК2, ВСК СОЬ8А1, РАР и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров РШ, ОВ2,ГОНВА, 1ТСА5, ЬОХЫ, ЬИМ, М1К1245, ММР2, N^2, РЬАИ, КАВ31, 8РКР2, ТНВ82, Т1МР3 и УСАЛ, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркерам АЬРК2, ВСК СОЬ8А1 и РАР и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров РМ, СДВ2, ГОНВА, 1ТСА5, ЬОХЫ, ЬИМ, М1К1245, ММР2, N^2, РЬАИ, КАВ31, 8РКР2, ТНВ82, Т1МР3 и УСАН где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру АРРК2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров ВСК СОЬ8А1, РАР, РМ, С1В2, ГОНВА, 1ТСА5, ЬОХЫ, ЬИМ, М1К1245, ММР2, N^2, РЬАИ, КАВ31, 8РКР2, ТНВ82, Т1МР3 и УСАN где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образ- 41 025926 ца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру Β0Ν и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров АЬРК2, СОЬ8А1, РАР, ΡΝ1, 01Β2, ΙΝΗΒΑ, ΙΤΟΑ5, ЬОХЬ1, ЬИМ, ΜΙΚ1245, ММР2, ΝΚΌ2, РЬАИ, КАВ31, 8РКР2, ΤΗΒ82, ΤΙΜΡ3 и УСАН где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру СОЬ8А1 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров АЬРК2, БСК РАР, РШ. 0ΙΒ2, INΗΒΑ, 1ТОА5, ЬОХЬ1, ЬИМ, ΜΙΚ1245, ММР2, N^2, РЬАИ, КАБ31, 8РКР2, ΤΗΒ82, Т1МР3 и УСАН где N равно 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру РАР и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров АЬРК2, ΒΟΗ СОЬ8А1, РШ, Ο1Β2, ПМЖА, IΤСΑ5, ЬОХЬ1, ЬИМ, ΜΙΚ1245, ММР2, N^2, РЬАИ, КАБ31, 8РКР2, ΤΗΒ82, ГОМР3 и УСА^ где N равно 2, 3,4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает набор биомаркеров с понижающей регуляцией. В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, Ο1Β2, ГОЖА, ΤΗΒ82, 8РРР2, РЬАИ и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, Ο1Β2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает РИМА и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает ΤΗΒ82 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, 8РКР2, где N равно 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает РЬАИ и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает Ο1Β2, INΗБΑ, ΤΗΒ82, 8РРР2, РЬАИ и по меньшей мере примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99% биомаркеров, перечисленных в табл. 1А, 1В или их комбинацию.
Классификация новых опытных образцов с использованием сигнатуры экспрессии.
Для классификации новых опытных образцов с использованием сигнатуры экспрессии, таких как описанные выше, измеряют относительные уровни экспрессии биомаркеров в раковой ткани для получения профиля экспрессии исследуемого образца. В определенных типичных вариантах исполнения профиль экспрессии исследуемого образца объединяется в виде составной решающей оценки (оценка экспрессии) и сравнивается с порогом оценки, которую математически определяют по обучающему набору данных пациентов. Порог оценки разделяет группу пациентов на основании разных характеристик, таких как, без ограничений, восприимчивость/невосприимчивость к лечению. Обучающий набор данных пациентов предпочтительно получают из образцов раковой ткани, охарактеризованных по прогнозу, вероятности рецидива, долгосрочной выживаемости, клиническому результату, отклику на лечение, диагнозу, классификации рака или персонализованному геномному профилю. Профили экспрессии и соответствующие решающие оценки образцов, взятых у пациента, могут быть скоррелированы с характеристиками образцов пациентов в обучающем наборе, находящихся по ту же сторону от математически определенного порога решающей оценки. Порог скалярного результата линейного классификатора оптимизируют для максимизации суммы чувствительности и специфичности при кросс-валидации в наборе обучающих данных.
- 42 025926
Общие данные об экспрессии для данного образца нормируют с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, для внесения поправок на различия в количествах исходного материала, разные эффективности экстракции и реакции амплификации и т.д.
В одном варианте исполнения профиль экспрессии биомаркера образца ткани пациента оценивается с помощью линейного классификатора. В используемом в данном документе значении, линейный классификатор относится к взвешенной сумме интенсивностей биомаркеров индивидуума в составной решающей оценке (решающая функция). Решающую оценку затем сравнивают с предварительно определенным отсекающим порогом оценки, соответствующим определенной заданной точке по показателям чувствительности и специфичности, которая указывает, находится ли образец выше порога оценки (положительная решающая функция) или ниже (отрицательная решающая функция).
Использование линейного классификатора для нормированных данных для диагностического или прогностического заключения (например, о восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту), по существу, означает разделение пространства данных, т.е. всех возможных комбинаций значений экспрессии для всех генов, входящих в классификатор, на две непересекающиеся части с помощью разделяющей гиперплоскости. Такое деление эмпирически осуществляют на большом наборе обучающих примеров, например, от пациентов, демонстрирующих восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту. Без потери всеобщего характера можно предположить определенный заданный набор значений всех биомаркеров, кроме одного, который будет автоматически определять пороговое значение для этого оставшегося биомаркера, при котором решение будет изменяться, например, от восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту. Значения экспрессии выше этого динамического порога будут тогда указывать или на резистентность (для биомаркера с отрицательным весом) или на восприимчивость (для биомаркера с положительным весом) к терапевтическому агенту. Точное значение этого порога зависит от фактически измеренного профиля экспрессии всех других биомаркеров в классификаторе, но общий признак определенных биомаркеров остается неизменным, т.е. высокие значения или относительная сверхэкспрессия всегда являются вкладом или в восприимчивость (гены с положительным весом), или в резистентность (гены с отрицательным весом). Поэтому в контексте общего классификатора генной экспрессии относительная экспрессия может указывать, является ли повышающая или понижающая регуляция определенного биомаркера индикатором восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту.
Существует ряд пригодных способов измерения профилей экспрессии опытных образцов в зависимости от типа анализируемого биомаркера. Измерения мРНК в биологическом образце могут быть использованы взамен детектирования уровня соответствующего белка в биологическом образце. Таким образом, любые биомаркеры или панели биомаркеров, описанные здесь, также могут быть детектированы путем детектирования соответствующей РНК. Способы определения профилей генной экспрессии включают, без ограничений, использование микрочипов, ПЦР с обратной транскриптазой (КТ-РСТ), количественной ПЦР, N08, нозерн-блоттинга, 8А0Е, масс-спектрометрии.
Уровни экспрессии мРНК измеряют методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР с последующей количественной ПЦР). ОТ-ПЦР используется для получения кДНК из мРНК. кДНК может быть использована в анализе методом количественной ПЦР для получения флуоресценции в процессе амплификации ДНК. Путем сравнения со стандартной кривой количественная ПЦР может дать абсолютное значение результата измерений, такое как число копий мРНК на клетку. Нозерн-блоттинг, микрочипы, анализы 1пуайег и ОТ-ПЦР в комбинации с капиллярным электрофорезом, все, используются для измерения уровней экспрессии мРНК в образце. См. 0епе Ехрге88юп Ргоййпд: Ме1йой8 апй РгоЮсок, Ктсйагй А. §Ытке18, еййог, Нитапа Рге88, 20 04.
Молекулы микроРНК представляют собой малые РНК, которые являются некодирующими, но могут регулировать генную экспрессию. Любые способы, пригодные для измерения уровней экспрессии мРНК, также могут быть использованы для соответствующих микроРНК. В последнее время многие лаборатории исследовали использование микроРНК в качестве биомаркеров болезней. Многие болезни сопровождаются широко распространенным регулированием транскрипции, и потому не удивительно, что микроРНК могут найти применение в качестве биомаркеров. Связь между концентрациями микроРНК и болезнью часто еще менее понятна, чем связи между уровнями белков и болезнью, но ценность биомаркеров на основе микроРНК может быть существенной. Конечно, как и для любых РНК, дифференциально экспрессируемых при болезни, проблемы на пути разработки ш уйго диагностического продукта будут включать требование, чтобы микроРНК выживали в больной клетке и легко экстрагировались для анализа, или чтобы микроРНК выделялись в кровь или другие матрицы, где они должны выживать в течение достаточно длительного времени для проведения измерений. К белковым биомаркерам выдвигаются аналогичные требования, хотя многие потенциальные белковые биомаркеры секретируются целенаправленно в области патологии и функционируют, во время болезни, по паракринному механизму. Многие потенциальные белковые биомаркеры рассчитаны на то, что они будут функционировать вне клеток, в которых такие белки синтезируются.
Генную экспрессию также можно оценить с использованием масс-спектрометрических способов. Различные конфигурации масс-спектрометров могут быть использованы для детектирования значений
- 43 025926 биомаркеров. Несколько типов масс-спектрометров являются доступными или могут быть произведены с различными конфигурациями. В общем, масс-спектрометр состоит из следующих основных компонентов: устройство ввода образца, ионный источник, анализатор массы, детектор, вакуумная система, система управления инструментом и система сбора данных. Различия в устройстве ввода образца, ионном источнике и анализаторе массы в общем определяют тип инструмента и его возможности. Например, устройство ввода может быть источником в виде капиллярной колонки для жидкостной хроматографии или может представлять собой непосредственно пробу или столик, как используется в методах матрично-активируемой лазерной десорбции. Обычными ионными источниками являются, например, электрораспыление, включая нанораспыление и микрораспыление, или матрично-активируемая лазерная десорбция. Обычные анализаторы массы включают квадрупольный масс-фильтр, анализатор массы типа ионной ловушки и времяпролетный анализатор массы. Дополнительные масс-спектрометрические способы хорошо известны специалистам (см. ВигНпдате с1 а1., Апа1. СНет. 70:647К-716К (1998); Κίηΐβτ апб ЗНегтап, №\ν Уогк (2000)).
Белковые биомаркеры и значения биомаркеров могут детектироваться и измеряться любыми из следующих методов: масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ΕδΙ-Μδ), ΕδΙ-Μδ/Μδ, ΕδΙ-Μδ/(Μδ)η, времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией матрично-активируемой лазерной десорбцией (ΜΑΕΌΙ-ΤΘΕ-Μδ), времяпролетная масс-спектрометрия с поверхностно усиленной лазерной десорбцией/ионизацией (δΕΕΌΙ-ΤΘΡ-Μδ), десорбция/ионизация на кремнии (ΌΙΘδ), масс-спектрометрия вторичных ионов (δΙΜδ), квадрупольная времяпролетная (Ο-ΤΘΡ). тандемная времяпролетная (ΤΘΡ/ΤΘΡ) технология, называемая иНгаЛех ΙΙΙ ΤΘΡ/ΤΘΡ, масс-спектрометрия с химической ионизацией при атмосферном давлении (ΑΡΟ-Μδ), ΑΡΟ-Μδ/Μδ, ΑΡΟ-(Μδ).8υρ.Ν, масс-спектрометрия с фотоионизацией при атмосферном давлении (ΑΡΡΙ-Μδ), ΑΡΡΙ-Μδ/Μδ и ΑΡΡΙ-(Μδ).8υρ.Ν, квадрупольная массспектрометрия, масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (ΡΤΜδ), количественная массспектрометрия и масс-спектрометрия с ионной ловушкой.
Стратегии приготовления образцов используются для мечения и обогащения образцов перед массспектроскопической характеризацией белковых биомаркеров и определения значений биомаркеров. Способы мечения включают, без ограничений, изобарную метку для относительной и абсолютной квантификации (ίΤΒΑΟ) и мечение стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (δΙΕΑΟ). Захватывающие реагенты, используемые для селективного обогащения образцов для белков-кандидатов биомаркеров перед масс-спектроскопическим анализом, включают, без ограничений, аптамеры, антитела, нуклеиново-кислотные зонды, химеры, малые молекулы, фрагмент Е(аЬ')2, фрагмент одноцепочечного антитела, фрагмент Εν, одноцепочечный фрагмент Εν, нуклеиновую кислоту, лектин, лигандсвязывающий рецептор, аффитела (айуЬоб1е8), нанотела (папоЬоб1е8), анкирины, доменные антитела, альтернативные структуры антител (например, диатела и т.д.), импринтированные полимеры, авимеры, пептидомиметики, пептоиды, пептидные нуклеиновые кислоты, треозо-нуклеиновую кислоту, рецептор гормона, рецептор цитокина и синтетические рецепторы и их модификации и фрагменты.
Вышеупомянутые анализы позволяют детектировать значения биомаркера, пригодные для использования в способах прогнозирования восприимчивости к терапевтическому агенту для лечения рака, где способы включают детектирование, в биологическом образце от индивидуума, по меньшей мере Ν значений биомаркеров, каждое из которых соответствует биомаркеру, выбранному из группы, состоящей из биомаркеров, представленных в табл. 1А, 1В, 2А, 2В или группах Ι и ΙΙ, где классификация с использованием значений биомаркеров, как детально описано ниже, указывает, будет ли индивидуум восприимчивым к терапевтическому агенту. Хотя некоторые из описанных прогностических биомаркеров являются пригодными сами по себе для прогнозирования восприимчивости к терапевтическому агенту, здесь также описаны способы группирования нескольких подмножеств биомаркеров, каждый из которых является пригодным, в панели из двух или больше биомаркеров. Таким образом, различные варианты исполнения данного изобретения обеспечивают комбинации, включающие Ν биомаркеров, где Ν составляет по меньшей мере три биомаркера. Следует понимать, что Ν может быть выбрано из любых чисел в любых из вышеописанных диапазонах значений, а также аналогичных диапазонах значений более высокого порядка. В соответствии с любым из описанных способов значения биомаркеров могут детектироваться и классифицироваться индивидуально или они могут детектироваться и классифицироваться коллективно, например, в формате мультиплексного анализа.
Ь) Способы на основе микрочипов.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение использует олигонуклеотидные матрицы (также называемые микрочипами). Микрочипы могут быть использованы для анализа экспрессии биомаркеров в клетке и, в частности, для измерений экспрессии биомаркеров раковых тканей.
В одном варианте исполнения матрицы биомаркеров получают путем гибридизации детектируемо меченых полинуклеотидов, представляющих транскрипты мРНК, присутствующих в клетке (например, флуоресцентно меченые кДНК, синтезированные из полной клеточной мРНК или меченой кРНК) на микрочипе. Микрочип представляет собой поверхность с упорядоченной матрицей сайтов связывания (например, гибридизации) для продуктов многих генов из генома клетки или организма, предпочтительно большей части или почти всех генов. Микрочипы могут быть изготовлены с использованием ряда
- 44 025926 способов, известных специалистам. Независимо от способа изготовления, микрочипы имеют некоторые общие характеристики. Матрицы являются воспроизводимыми, что позволяет получать множество копий данной матрицы и легко сравнивать их друг с другом. Предпочтительно микрочипы являются маленькими, обычно менее 5 см2, и изготовлены из материалов, стабильных в условиях связывания (например, гибридизации нуклеиновой кислоты). Данный сайт связывания или уникальный набор сайтов связывания на микрочипе будет специфически связывать продукт отдельного гена клетки. В конкретном варианте исполнения используются позиционно адресуемые матрицы, содержащие закрепленные нуклеиновые кислоты с известной последовательностью в каждом положении.
Следует понимать, что, когда получают кДНК, комплементарную к рНК клетки и гибридизуют на микрочипе в пригодных условиях гибридизации, уровень гибридизации в сайте матрицы, соответствующем любому конкретному гену, будет отражать распространенность в клетке мРНК, транскрибируемой с данного гена/биомаркера. Например, при гибридизации с микрочипом детектируемо меченой (например, с помощью флуорофора) кДНК или кРНК, комплементарных к полной клеточной мРНК, участок матрицы, соответствующий гену (т.е. способный специфически связываться с продуктом гена), который не транскрибируется в клетке, будет иметь слабый сигнал или его отсутствие (например, флуоресцентный сигнал), а ген, кодированная мРНК которого имеет широкое распространение, будет иметь относительно сильный сигнал. Условия гибридизации нуклеиновой кислоты и промывки выбирают так, чтобы зонд специфически связывал или специфически гибридизовался со специфическим участком матрицы, т.е. зонд гибридизуется, образует дуплексы или связывается с участком матрицы последовательностей, несущим комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, но не гибридизуется с участком с некомплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты. В используемом в данном документе значении одна полинуклеотидная последовательность считается комплементарной к другой, когда, если более короткий из полинуклеотидов имеет длину менее или равную 25 основаниям, не наблюдается ошибок спаривания с использованием стандартных правил спаривания последовательностей или, если более короткий из полинуклеотидов имеет длину более 25 оснований, количество ошибок спаривания не превышает 5%.
Предпочтительно полинуклеотиды являются полностью комплементарными (отсутствие ошибок спаривания). Можно продемонстрировать, что условия специфической гибридизации приводят к специфической гибридизации путем проведения анализа гибридизации с отрицательным контролем с использованием обычных методик эксперимента.
Оптимальные условия гибридизации будут зависеть от длины (например, олигомер νδ. полинуклеотида длиной более 200 оснований) и типа (например, РНК, ДНК, РNА (пептидо-нуклеиновая кислота)) меченого зонда и иммобилизованного полинуклеотида или олигонуклеотида. Общие параметры для специфических (т.е. жестких) условий гибридизации нуклеиновых кислот описаны в ЗатЬгоок е! а1., 8ирга и в Аи8иЬе1 е! а1., Сиггеи! Рго1осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬ^ктд и ^|1еу-1и1ег8С1еисе. ΝΥ (1987), которые целиком включены сюда в любых целях. В тех случаях, когда используются микрочипы на основе кДНК, типичными условиями гибридизации являются гибридизация в 5х§§С плюс 0,2% ДСН (δΌδ) при 65°С в течение 4 ч с последующими промываниями при 25°С в промывочном буфере низкой жесткости (1х§§С плюс 0,2% ДСН), а затем 10 мин при 25°С в промывочном буфере высокой жесткости (0,1§§С плюс 0,2% ДСН) (см. §Ьеиа е! а1., Ргос. Νηύ. Асаб. 8ск И8А, Уо1. 93, р. 10614 (1996)). Пригодные условия гибридизации также приведены, например, в Туе88еи, НуЬпШ/акоп \νί!ΐι №.1с1ею АсИ РгоЬе8, Екехаег §с1еисе РиЬ1|8кег8 В.У. (1993) и Кпска, ШгщоЮрю ΌΝΛ РгоЬе ТесНииц.^, Асабеиис Рге88, 8аи Бгедо, СаПГ. (1992).
с) Способы иммуноанализа.
Способы иммуноанализа основаны на реакции антитела с его соответствующей мишенью или аналитом и могут детектировать аналит в образце в зависимости от формата конкретного анализа. Для улучшения специфичности и чувствительности метода анализа, основанного на иммунореактивности, часто используют моноклональные антитела вследствие того, что они специфически распознают эпитоп. Поликлональные антитела также успешно использовались в различных иммуноанализах благодаря их повышенной аффинности к мишени по сравнению с моноклональными антителами. Были разработаны иммуноанализы для использования с широким спектром матриц биологических образцов. Форматы иммуноанализов были разработаны таким образом, чтобы они обеспечивали качественные, полуколичественные и количественные результаты.
Количественные результаты могут быть получены путем использования стандартной кривой, получаемой для известных концентраций конкретного аналита, который должен детектироваться. Строят график отклика или сигнала для неизвестного образца на стандартной кривой и определяют количество или значение величины, соответствующие мишени в неизвестном образце.
Были разработаны многочисленные форматы иммуноанализа. ЕЫ§А или Е1А могут быть количественными при детектировании аналита/биомаркера. Этот метод основан на присоединении метки к аналиту или антителу, и компонент метки включает, прямо или косвенно, фермент. Тесты ЕЫ§А могут быть разработаны в форматах прямого, непрямого, конкурентного или сэндвич-метода детектирования анали- 45 025926 та. Другие способы используют метки, такие как, например, радиоизотопы (1251) или флуоресценцию. Дополнительные методики включают, например, агглютинацию, нефелометрию, турбидиметрию, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, иммуногистохимию, проточную цитометрию, анализ Ьиттех и другие (см. 1ттипоА88ау: А РгасДса1 ОшДе, ред. Впап Ьа\у, опубликована Тау1ог & Ргапс18, ЫД., издание 2005 г.).
Типичные форматы анализов включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ§А), радиоиммуноанализ, иммуноанализы с использованием флуоресценции, хемолюминесценции и резонансного переноса энергии флуоресценции (РВЕТ) или РКЕТ с временным разрешением (ТК-РКЕТ). Примеры процедур детектирования биомаркеров включают иммунопреципитацию биомаркера с последующими количественными способами, позволяющими дифференцировать размеры и уровни пептидов, такими как электрофорез на геле, капиллярный электрофорез, планарная электрохроматография и т.п.
Способы детектирования и/или количественного определения детектируемой метки или материала, генерирующего сигнал, зависят от природы метки. Продукты реакций, катализируемых соответствующими ферментами (в тех случаях, когда детектируемая метка представляет собой фермент; см. выше) могут быть, без ограничений, флуоресцентными, люминесцентными или радиоактивными или они могут поглощать видимый или ультрафиолетовый свет. Примеры детекторов, пригодных для детектирования таких детектируемых меток, включают, без ограничений, рентгеновскую пленку, счетчики радиоактивности, сцинтилляционные счетчики, спектрофотометры, колориметры, флуорометры, люминометры и денситометры.
Любые способы детектирования могут быть осуществлены в любом формате, позволяющем использовать любой пригодный способ приготовления, процессинг и анализ реакций. Это могут быть, например, многолуночные аналитические планшеты (например, 96-луночные или 384-луночные) или способы, использующие любую пригодную матрицу или микрочип. Маточные растворы для различных агентов могут быть приготовлены вручную или роботизированными методами, и все последующие операции пипетирования, разбавления, смешения, распределения, промывания, инкубирования, считывания образцов, сбора данных и анализа могут выполняться роботизированно с использованием коммерчески доступных прикладных программ для анализа, робототехнических устройств и детектирующих инструментов, способных детектировать детектируемую метку.
Наборы.
Реагенты, инструменты, и/или инструкции по проведению способов, описанных здесь, могут быть представлены в виде набора. Например, набор может содержать реагенты, инструменты и инструкции по определению пригодной терапии для ракового пациента. Такой набор может включать реагенты для отбора образцов ткани у пациента, такого как путем биопсии, и реагенты для обработки тканей. Набор может также включать один или несколько реагентов для проведения анализа экспрессии гена или генного продукта, таких как реагенты для проведения ОТ-ПЦР, количественной ПЦР, нозерн-блоттинга, протеомного анализа или иммуногистохимии для определения уровней экспрессии маркеров гена или генного продукта в образце пациента. Например, такие наборы могут включать праймеры для проведения ОТ-ПЦР, зонды для проведения анализов методом нозерн-блоттинга, и/или антитела для проведения протеомного анализа, такого как вестерн-блоттинг, иммуногистохимия и анализы ЕЫ§А. Также могут быть включены пригодные буферы для анализов. Также могут быть включены детектирующие реагенты, необходимые для любого из этих анализов. Пригодные реагенты и способы дополнительно детально описаны ниже.
Наборы, описанные здесь, могут также включать лист-вкладыш с инструкциями, описывающими, как проводить анализы для измерения экспрессии генов или генных продуктов. Листок с инструкциями также может включать инструкции о том, каким образом определять референсную когорту, включая методы определения уровней экспрессии маркеров гена или генного продукта в референсной когорте и сбора данных об экспрессии для установления эталона для сравнения с обследуемым пациентом. Листок с инструкциями также может включать инструкции по оценке экспрессии генов или генных продуктов у обследуемого пациента и для сравнения уровня экспрессии с экспрессией в референсной когорте, для последующего определения пригодной химиотерапии для обследуемого пациента. Способы определения пригодной химиотерапии описаны выше и могут быть детально описаны в листке с инструкциями.
Информационные материалы, включенные в наборы, могут быть описательными, инструктивными, маркетинговыми или другими материалами, которые относятся к способам, описанным здесь, и/или к использованию реагентов для способов, описанных здесь. Например, информационные материалы в наборе могут содержать контактную информацию, например физический адрес, адрес электронной почты, веб-сайт или телефонный номер, причем пользователь набора может получить значимую информация о проведении анализа генной экспрессии и интерпретации результатов, особенно касающихся вероятности достижения у человека положительного ответа на конкретный терапевтический агент.
Наборы, описанные здесь, могут также содержать прикладные программы, необходимые для достижения вывода о вероятности положительного ответа у пациента на конкретный терапевтический агент по экспрессии маркера генного продукта.
- 46 025926
Терапевтические агенты.
Как описано выше, способы, описанные здесь, обеспечивают классификацию пациентов на откликающихся или не откликающихся на терапевтический агент, нацеленный на ангиогенные процессы и передачу сигналов в опухоли. Некоторые такие современные терапии, используемые для лечения рака, включают, без ограничений, следующие агенты: терапевтический агент, нацеленный на путь ΥΕΟΡ, включая многоцелевые ингибиторы пути (УЕСР/РПСР/РСР/ЕСРТ/РЬТ-3/с-К1Т), ингибиторы пути ангиопоэтина-Т1Е2, эндогенные ангиогенные ингибиторы, иммуномодулирующие агенты. Специфические ингибиторы УЕСР включают, без ограничений, бевацизумаб (авастин), афиберцепт (ловушка УЕСР), 1МС-1121В (рамуцирумаб). Многоцелевые ингибиторы пути включают, без ограничений, иматиниб (гливек), сорафениб (нексавар), гефитиниб (иресса), сунитиниб (сутент), эрлотиниб, тивозиниб, цедираниб (рецентин), пазопаниб (вотриент), ΒΙΒΡ 1120 (варгатеф), довитиниб, семаксаниб (суген), акситиниб (ЛС013736), вандетаниб (зактима), нилотиниб (тасигна), дасатиниб (спрайсел), ваталаниб, мотесаниб, АВТ-869, ТК1-258. Ингибиторы пути ангиопоэтина-Т1Е2 включают, без ограничений, ЛМС-386, РР4856884 СУХ-060, СЕР-11981, СЕ-245677, МЕП1-3617, СУХ-241, трастузумаб (герцептин). Эндогенные ангиогенные ингибиторы включают, без ограничений, тромбоспондин, эндостатин, тумстатин, канстатин, аррестин, ангиостатин, вазостатин, интерферон-альфа. Иммуномодулирующие агенты включают, без ограничений, талидомид и леналидомид.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными далее примерами, которые не должны рассматриваться как каким-либо образом накладывающие ограничения на его объем. Наоборот, следует четко понимать, что могут быть предусмотрены различные другие варианты его исполнения модификации и эквиваленты, которые, после прочтения приведенного тут описания, могут быть предложены квалифицированными специалистами без выхода за пределы сущности настоящего изобретения и/или объема приложенной формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Процессинг тканей, иерархическая кластеризация, идентификация субтипа и разработка классификатора.
Материал опухоли.
Типичные сигнатуры экспрессии были идентифицированы путем проведения анализа генной экспрессии для когорты полученных путем макродиссекции РРРЕ-образцов (фиксированных формалином залитых в парафин) тканей эпителиальной серозной опухоли яичников, полученных от ΝΗδ Бобйап и Университета Эдинбурга (υηίνοΓκίΙν о£ ЕбшЪигдЬ).
Протокол гистологической классификации эпителиального рака яичников для определения серозной, эндометриоидной, прозрачно-клеточной и мукоидной гистологий был недавно обновлен. Одним из последствий этого является то, что многие опухоли, которые ранее классифицировались бы как эндометриоидные, теперь классифицируются как серозные. (МсС1иддаде, ν.Ο. МогрЬо1одюа1 8иЪ1уре5 о£ оуапап сагсшота: а гсу1с\у \νί11ι етрйа515 оп пе\у беуе1ортеп15 апб раШодепе818, Рабю1оду 2011 Аид; 43(5):42032). Серозные образцы, используемые в данных исследованиях, относились к большему набору образцов эпителиального рака яичников всех гистологий, собранному в период между 1984 и 2006 гг. Патология для определения гистологического статуса проводилась патологами каждого из центров в момент забора материала. На протяжении марта и апреля 2012 г., 357 этих образцов эпителиального рака яичников были проанализированы для проведения гистологической классификации двумя независимыми патологами-консультантами по раку яичников в соответствии с пересмотренным протоколом. Это привело к переклассификации нескольких из этих образцов, как указано в табл. 3.
- 47 025926
Таблица 3
Результаты патологического анализа 357 образцов эпителиального рака яичников (первоначальный гистологический статус приведен в рядах, а уточненный гистологический статус приведен в колонках)
Первоначальный /уточненный Прозрачно- клеточный Эндометри- оидный Мукоидный Серозный Всего
Прозрачноклеточный 19 1 0 5 25
Эндометриоидный 2 33 0 38 73
Мукоидный 0 1 8 1 10
Другие смешанные 3 5 0 8 16
Серозный 1 3 1 193 198
Серозный/эндо 0 2 0 25 27
Неклассифицированные 0 0 0 4 4
Недифференцированные 1 0 0 3 4
Всего 26 45 9 277 357
Исходные три серозных субтипа, идентифицированных ниже, и следовательно, 25-генная сигнатура, описанная в примере ниже (фиг. 1), были идентифицированы по 199 образцам, которые были классифицированы как серозные в соответствии с отчетами первоначальных патологов. Аналогично был проведен биоинформационный анализ 277 образцов, классифицированных как серозный рак яичников высокой степени злокачественности стадий III и ГУ с использованием уточненного метода патологической классификации. Этот анализ идентифицировал уточненные серозные подгруппы, представленные на фиг. 2, впоследствии использованные для определения 45-генной сигнатуры.
Определение профилей генной экспрессии для РРРЕ-образцов.
Экстрагировали общую РНК из полученной методом макродиссекции РРРЕ-ткани с использованием набора для получения высокочистой РНК (НЦН Риге ΡΝΑ Ратайш Κίΐ, Еосйе О1адпо8Йс8 ОтЬН, Маппйейп, Оегтапу). РНК конвертировали в комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК), которую впоследствии амплифицировали и конвертировали в одноцепочечную форму с использованием технологии 8РГА® в системе \νΤ-Ον;·ιΙίοηΙΛ1 РРРЕ ΡΝΑ Атрййсайоп 8у81ет У2 (ΝιιΟΕΝ ТесЬпо1од1е8 Гпс., 8ап Саг1о8, СА, И8А). Амплифицированную одноцепочечную кДНК затем фрагментировали и метили биотином с использованием РЬ-0уайоп™ с^NΑ Вюйп МоДи1е У2 (ΝιιΟΕΝ ТесЬпо1од1е8 Гпс.). Фрагментированную и меченую кДНК затем гибридизировали с помощью А1тас Отапап Сапсег О8А™. Исследовательский инструмент А1тас Отапап Сапсег Ω8Λ™ был оптимизирован для анализа РРРЕ-образцов тканей, что позволило использовать ценные банки законсервированных тканей. Исследовательский инструмент А1тас Отапап Сапсег Э8А'™ представляет собой новаторскую платформу с микрочипом, представляющим транскриптому как в нормальных, так и в раковых тканях яичников. Вследствие этого, Отапап Сапсег Э8А™ обеспечивает всестороннее представление транскриптомы в условиях болезни яичников и в тканях, недоступное при использовании универсальных платформ микрочипов. Матрицы сканировали с использованием сканера Айутепйтх ОепесЫр® 8саппег 7О (Айутейтх Гпс., 8ап1а С1ага, СА).
Подготовка данных.
Контроль качества (ОС) профилированных образцов проводили с использованием алгоритма предварительной обработки МА85. Анализировались разные технические аспекты: средний шум и гомогенность фона, процент правильных определений (качество матрицы), качество сигнала, качество РНК и качество гибридизации. Распределения и медианное абсолютное отклонение соответствующих параметров анализировали и использовали для идентификации возможных выбросов.
А1тас Оуапап Сапсег О8А™ содержит зонды, нацеленные преимущественно на участок, охватывающий 300 нуклеотидов на 3'-конце. Поэтому стандартные меры качества РНК Айутейтх были адаптированы - для интенсивностей генов домашнего хозяйства 3'-конца были использованы наборы зондов с соотношениями интенсивности набора зондов 3'-конца к средней интенсивности фона в дополнение к обычным соотношениям 3'/5'. Контрольные образцы гибридизации проверяли для обеспечения того, чтобы их интенсивности и относительное количество правильных определений соответствовали требованиям, установленным Айутейтх.
Предпроцессинг первичных данных, полученных в результате определения профилей экспрессии обучающего набора эпителиальных серозных раков яичников, был проведен с помощью программы Ехрте88юп Соп8о1е ν.1.1 по протоколу робастного многоматричного анализа (КоЬи81 Ми1й-аттау Апа1у818,
- 48 025926
КМА). Иерархическая кластеризация и функциональный анализ
a) Анализ иерархической кластеризации.
Методы иерархической кластеризации были применены к данным, полученным с использованием микрочипа для эпителиальных серозных опухолей яичников, проанализированных с использованием платформы Оуапаи Саиссг ΌδΑ™ (болезнь-специфическая матрица). Первичные данные об экспрессии были подвергнуты предпроцессингу с использованием стандартной процедуры робастного многочипового алгоритма (КоЬиЧ МиШсЫр А1догккт, КМА). Небиологическую систематическую дисперсию в наборе данных идентифицируют и устраняют. Были идентифицированы наборы зондов, в которых уровни экспрессии значимо варьировались между разными опухолями. Такие наборы зондов составили характеристический список.
Был проведен двумерный кластерный анализ (опухоль, набор проб) для определения соотношений опухоли на основании характеристического списка. Была применена иерархическая агломеративная кластеризация (пирсоновская корреляция - первичный анализ - или эвклидово расстояние модифицированный анализ - и сцепление Варда (^агй'8 кикадс)). Оптимальное число разбиений выбирали с использованием индекса САР (ПЬкЫгат с! а1., 2002, I. К. δΐηΐ. §ос., 63:411-423). Все наборы данных, присутствующие в подгруппах кластера, были картированы по названиям генов.
b) Функциональный анализ генных кластеров.
Для установления функциональной значимости кластеров наборов зондов, наборы зондов были картированы по генам (идентификаторы (ГО) генов ЕгЧгс/) и был проведен анализ обогащения. Значимость обогащения рассчитывали на основании гипергеометрической функции (с учетом показателя ошибочного определения (Всфатий аий НоскЬсгд, 1995, I. К. δΐηΐ. §ос. 57:289:300)). Чрезмерную представительность биологических процессов и путей анализировали для каждой группы генов, полученной в результате иерархической кластеризации образцов эпителиального серозного рака яичников с использованием фирменного Инструмента функционального обогащения (Риискоиа1 Етгсктст Тоо1, РЕТ) А1тас Эхадиоккск. Антисмысловые наборы зондов были исключены из анализа. Гипергеометрические р-значения оценивали для каждого обогащенного класса функциональных объектов. Классы функциональных объектов с наибольшими р-значениями были выбраны как репрезентативные для группы и общая функциональная категория, представляющая эти функциональные объекты, была присвоена генным кластерам на основании значимости репрезентативности (т.е. р-значения).
Для создания классификатора ангиогенеза с использованием первичных 199 эпителиальных серозных опухолей яичников, гены в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, были сгруппированы в предполагаемую генную группу ангиогенеза и использованы для получения сигнатуры. Кластеры образцов, презентующих высокую экспрессию генов, задействованных в общих функциональных термах ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, были выбраны для классификации и помечены ангиогенез. Кластеры, не демонстрирующие высокой экспрессии генов, задействованных в этих функциональных термах, были помечены без ангиогенеза.
Для создания классификатора ангиогенеза с использованием переклассифицированных 265 эпителиальных серозных опухолей яичников гены в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза и развития сосудистой сети, были сгруппированы в предполагаемую генную группу ангиогенеза и использованы для получения сигнатуры. Кластеры образцов, презентующих высокую экспрессию генов, задействованных в общих функциональных термах ангиогенеза и развития сосудистой сети, были выбраны для классификации и помечены ангиогенез. Кластеры, не демонстрирующие высокой экспрессии генов, задействованных в этих функциональных термах, были помечены без ангиогенеза.
Разработка классификатора на генном уровне.
Для облегчения валидации классификатора для множества матричных платформ классификатор ангиогенеза был сгенерирован на генном уровне. Следующие стадии описывают процедуры, использованные для разработки генного уровня сигнатуры (каждая стадия проводилась с внутренней кроссвалидацией с использованием 10 повторов 5-кратной кросс-валидации):
Разработка генного уровня сигнатуры.
Предпроцессинг:
Поправка на фон КМА.
Эталонный набор генов состоит из генов (только наборы смысловых зондов), уникальных для платформы Э§А яичников.
Суммаризация генного уровня проводилась в две стадии: сначала проводили суммаризацию зондов для наборов зондов путем расчета медианной экспрессии зондов в наборе зондов; во-вторых, рассчитывали медианную экспрессию (только смысловых) картирования наборов зондов по каждому гену в эталонном распределении с получением гена уровня матрицы экспрессии.
Проводили нормализацию квантиля по полной матрице данных генной экспрессии и контрольный квантиль, полученный для обучающих данных, использовали для нормализации опытных образцов в каждом раунде кросс-валидации.
- 49 025926
Селекция признаков:
Фильтрация 75% генов по дисперсии, интенсивности и корреляции с концентрацией кДНК с последующими или рекурсивной элиминацией признака (КРЕ) или фильтрующей селекцией признака (РР§) на основании оценок САТ.
Алгоритмы классификации: частных наименьших квадратов (РЬ8), 8ΌΑ (сжимающий дискриминантный анализ) и ΌδΌΑ (диагональный 8ΌΑ).
Выбор модели.
Критериями, используемыми для выбора модели, были НИК после внутренней кросс-валидации и элиминации признака. Функциональное обогащение сигнатур после кросс-валидации с использованием РЕТ на основании генной онтологии, промежуточные наборы данных валидации, которые включали два набора технических реплик, для которых стандартное отклонение в бальных оценках сигнатуры для параллельных образцов оценивали после кросс-валидации и элиминации признака и оценки независимости от клинических и технических факторов после кросс-валидации (факторы, перечисленные в табл. 4).
Следует отметить, что, поскольку выделение подгруппы (т.е. метки класса) осуществляли с использованием экспрессии на микрочипе для той же когорты образцов, которая была использована для разработки сигнатуры, в любых оценках характеристик на основании ННК присутствовало ожидаемое положительное смещение. Это подчеркивает важность расширения критериев, используемых для выбора модели, путем включения дополнительных метрик, таких как функциональное обогащение и оценка независимости от клинических и технических факторов.
Таблица 4
Перечень исследованных клинических и технических факторов
Клинические факторы: Технические факторы: Факторы процессинга образца:
Паллиативная резекция (ОеЬи1к1пд) Больница Оператор Роз1 Атр
Блокада (В1оск аде)
Концентрация РНК
Выход кДНК
Расчет балльных оценок классификаторов для валидации наборов данных.
Все наборы данных подвергались предварительной обработке с использованием КМА. Для каждого набора валидации были определены наборы зондов, картированные по генам классификатора, за исключением антисмысловых наборов зондов (если такие были). Аннотации для матриц Айушейтх Р1и8 2.0 и И133А доступны на веб-сайте Айушейтх. Была рассчитана медианная интенсивность по всем наборам зондов, картированных по каждому гену в классификаторе, с получением матрицы интенсивности генов. Классификатор затем применяли к этой матрице данных для получения балльной оценки/прогноза классификатора для каждого образца.
Одномерный и многомерный анализ.
Одномерный и многомерный анализ может быть проведен для набора данных глиобластомы для оценки, соответственно, связи между субтипом классификатора ангиогенеза и выживаемостью и для определения того, будет ли связь, если она существует, независимой от известных клинических прогностических показателей. р-значения для одномерного анализа рассчитывали с использованием логистического регресса в программе МАТЬАБ. Для многомерного анализа авторы использовали критерий отношения правдоподобия для логистического регресса, где р-значения представляют снижение логарифма вероятности (1о§-11кеНЬооб) при сравнении модели с клиническими ковариантами и прогнозами для сокращенной модели только с клиническими ковариантами. Критерий отношения правдоподобия измеряет важность гена-предиктора при моделировании выживаемости и указывает его независимость как прогностического показателя относительно клинических прогностических показателей. Как в одномерном, так и в многомерном анализе в качестве критерия значимости использовали р-значение <0,05. Кроме того, образцы с неизвестными клиническими факторами исключали в данной оценке.
Результаты.
Идентификация подгрупп и получение сигнатуры из первичной и уточненной классификации гистологий.
Анализ иерархической кластеризации.
Селекция признаков позволила выбрать 1200 наборов зондов из первичного набора данных эпителиального серозного рака яичников (199 образцов) и 1400 наборов зондов (Р§) из переклассифицированного набора данных эпителиального серозного рака яичников (265 образцов). Анализ ОАР выявил три кластера образцов и три группы кластеров наборов зондов в обоих наборах образцов (фиг. 1, 6).
Классификация опухолей на группы образцов ангиогенез или без ангиогенеза.
Классификация образцов на ангиогенез или без ангиогенеза была основана на результатах функционального анализа набора данных эпителиального серозного рака яичников (фиг. 1, 6). Целью
- 50 025926 данных исследований была характеризация на транскриптомном уровне набора генов, способных определять восприимчивость или резистентность патогенной клетки к антиангиогенным агентам, и, потенциально, идентификация пациентов, которые могут получить пользу от антиангиогенной терапии. Для этого нужно было выбрать образцы из наборов данных эпителиального серозного рака яичников, которые наилучшим образом представляют данную биологию, и сравнить с остальными образцами для создания классификатора (см. следующий раздел). Было решено, что образцы из кластера образцов ангиогенеза в первичном набор образцов эпителиального серозного рака яичников (199 образца) были наиболее релевантными образцами для такой селекции, поскольку эти образцы демонстрировали повышающую регуляцию генов, задействованных в передачу сигналов, связанных ангиогенными процессами и путями и иммунным ответом, как было определено с помощью функционального анализа (фиг. 2А и 2В). Было решено, что образцы из кластера, три образца в переклассифицированном наборе образцов эпителиального серозного рака яичников (265 образцов), были наиболее релевантными образцами для данной селекции, поскольку эти образцы демонстрировали повышающую регуляцию генов, задействованных в передачу сигналов, связанных ангиогенными процессами и путями, как было определено с помощью функционального анализа (фиг. 2А и 2В)
Идентичный подход иерархической кластеризации был применен к 105 образцам рака молочной железы. Доминирующей биологией при раке молочной железы является статус ЕК, и потому для идентификации структуры биологии образцов эта когорта была разделена на две популяции для кластерного анализа. Авторы идентифицировали субтипы ангиогенеза и развития сосудистой сети (фиг. 12А и 12В), что демонстрирует выделение субтипа ангиогенеза из образцов рака молочной железы.
Разработка и валидация моделей классификаторов субтипа ангиогенеза.
Для простоты понимания приведенные ниже стадии описаны со ссылкой на сигнатуры экспрессии, взятые из из табл. 1А или 1В. Однако аналогичная процедура может быть применена к другим предполагаемым кластерам биомаркеров, связанных с субтипами ангиогенеза, таких как раскрытые в δΕΟ ГО ΝΘδ: 632-801 и δΕΟ ГО ΝΟδ: 802-974). После идентификации класса опухолей, образующих предполагаемую подгруппу ангиогенез, была проведена расчетная классификация этих опухолей в отличие от всех остальных в когорте опухолей со ссылкой на функциональный перечень генов ангиогенез (ангиогенез, развитие сосудистой сети, иммунный ответ) (табл. 1А или 1В) для идентификации уточненной модели классификации генов, которая классифицирует субтип ангиогенез.
Конвейер (ρίροίίηο) классификации был использован для определения модели с использованием набора образцов эпителиального серозного рака яичников. Конвейер классификации был разработан в соответствии с критериями общепринятой добросовестной практики (МАОС Сопвотйит, Ναι Вю1сс1то1 2010). Процесс будет параллельно 1) выводить модели классификации генов из эмпирических данных и 2) оценивать классификационные характеристики моделей, все с кросс-валидацией. Характеристики и успешность создания классификатора зависят от числа параметров, которое может быть переменным, например, выбора способа классификации или фильтрации набора зондов. С учетом этого оценивали два набора признаков: (ί) полный перечень признаков с фильтрацией 75% дисперсии/интенсивности (с принудительным включением перечня генов ангиогенеза, табл. 1А) и (ίί) перечень только генов ангиогенеза; и оценивали три алгоритма классификации, а именно РЬ8; δΌΑ и ΌδΌΛ. При разработке модели использовали КЕЕ, который представляет собой итерационную процедуру удаления части признаков с наименьшим рангом при каждой итерации; с остановкой только после того, как останется минимальное число признаков. ППК использовали для оценки характеристик классификации, поскольку эта мера является независимой от отсекающей границы между группами и коэффициентов распространенности данных. Она также является одним из лучших признанных измеряемых показателей для определения характеристик классификации. По существу, наилучшее число признаков для каждой модели выбирали на основании средней ППК с кросс-валидацией.
По результатам описанного выше анализа, модель ΡΕδ ΕΕδ была признана наиболее пригодной моделью классификатора. Были рассчитаны веса для каждого гена с использованием ΡΕδ-регрессии, в результате чего были получены окончательные модели генных классификаторов (25-генная модель классификатора для исходного подхода и 45-генный классификатор для образцов, переклассифицированных с учетом последних изменений стандартных протоколов гистологии), которые могут быть использованы для валидации внешних наборов данных от разных матричных платформ. Процесс разработки генной сигнатуры был сфокусирован на идентификации онтологических процессов и путей, связанных с ангиогенезов, для обеспечения биологической релевантности любых разработанных сигнатур. По существу, был проведен функциональный анализ обоих сигнатур для определения их релевантности к ангиогенезу и родственным процессам. Значимые процессы на фиг. 3 и 8 ассоциированы с ангиогенезом и развитием сосудистой сети.
Пример 2. Компьютерная (ίη δίίίοο) валидация классификаторов субтипа ангиогенеза и модели ангиогенез.
Достоверность характеристик как 25-генного (исходный подход), так и 45-генного (подход с учетом переклассификации) классификаторов модели ангиогенеза подтверждали с помощью площади под кривой (ППК) КОС (характеристическая кривая обнаружения) для первичного набора данных А1тас эпите- 51 025926 лиального серозного рака яичников и двух независимых наборов данных. НИК представляет собой статистический показатель, рассчитываемый по шкале наблюдаемой болезни кса1е, и является мерой эффективности прогноза фенотипа с использованием модели классификатора (\Угау е1. а1., РЬо8 Сеиейск Уо1 6, 1-9). Значение НИК, равное 0,5, является типичным для статистического классификатора, а значение ННК, равное 1,0, будет представлять точное разделение классов. Ноэтому для определения того, будет ли модель классификатора субтипа ангиогенеза способна предсказывать ответ на и позволять выбирать пациентов для классов терапевтических антиангиогенных препаратов против рака яичников в виде отдельно взятого агента или в комбинации со стандартным лечением, гипотеза заключается в том, что ННК после применения в таких наборах данных должна быть выше 0,5, при наименьшем значении доверительного интервала также выше 0,5.
Нрименение модели классификатора к независимым клиническим наборам данных на микрочипах.
Для оценки прогностической мощности 25-генной и 45-генной моделей классификаторов их применили к набору данных для 77 образцов глиобластомы, взятых во время первичной хирургической резекции у пациентов (в возрасте старше 21 года) без предшествующей терапии (РЫШрк е1. а1., 2006). Этот анализ показал, что 25-генная модель классификатора была независимо ассоциирована с прогнозом глиобластомы. Важно отметить, что при многомерном анализе по Коксу (Сох) было обнаружено, что сигнатура ангиогенез является прогностической для выживаемости, независимо от степени злокачественности опухоли по классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и/или присутствия некроза (р=0,37). Оба эти клинических фактора коррелируют с выживаемостью при глиобластоме. Группа высокого ангиогенеза была ассоциирована со значительно худшей выживаемостью по сравнению с группой низкого ангиогенеза (отношение рисков = 1,7814, р=0,0269). Это указывает, что 25-генный классификатор является независимым прогностическим биомаркером выживаемости при глиобластоме.
Нрименение моделей классификаторов к независимому набору данных клеточных линий рака простаты.
Для оценки прогностической мощности 25-генной и 45-генной моделей классификаторов они были применены к набору данных для 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Клеточные линии были определены как восприимчивые или невосприимчивые на основании анализов клеточной пролиферации. Этот анализ показал, что 25-генная модель классификатора ассоциирована с откликом на дасатиниб при НИК, равной 0,8364 (0=0,5255-1,0000), что указывает на то, что 25-генный классификатор является прогностическим для отклика на дасатиниб. Анализ показал, что 45-генная модель классификатора ассоциирована с откликом на указанное соединение, с НИК, равной 0,9455 (0^0,7949-1,0000), что указывает на то, что 45-генный классификатор также является прогностическим для отклика на дасатиниб.
Иример 4. Идентификация и компьютерная (ίη 81Нсо) валидация антиангиогенной невосприимчивой подгруппы рака яичников.
Экспрессия генов ангиогенеза в кластере 2х наборов зондов подвергается понижающей регуляции во всех образцах кластера 2 иерархической кластеризации 265 образцов, заново классифицированных как серозные (фиг. 6 и 10). Эти образцы в кластере 2 образцов имеют лучший прогноз, чем остальные серозные образцы в образцах объединенных кластеров 1 и 3, как показано на фиг. 11. Это указывает на то, что данная группа определяется понижающей регуляцией экспрессии генов ангиогенеза, идентифицированных в табл. 2В. Иациенты с понижающей регуляцией генов, задействованных в ангиогенезе и потому относящиеся к данной подгруппе, названы невосприимчивой группой. Этот фенотип был также идентифицирован при ЕК+ и ЕК- раке молочной железы, как видно для средней группы образцов на фиг. 12А и второй группы образцов на фиг. 12В.
- 52 025926
Литература
1. Рпейтап Н5, Ргайоз МБ, Меп ΡΥ, еТ а(. ВеуаагитаЬ а1опе апй ίη сотЫпаТюп ννίΙΡ 1ппо(есап ίη гесиггеп! д1юЫаз!ота. й СПп Опсо/;27:4733^Ю (2009).
2. ΗιιηνίΙζ Н, РеРгепЬасРег Ι_, Νονούς νν, βί а/. ВеуаагитаЬ р1из 1ппо1есап. Лиогоигаа, апй 1еисоуопп Юг те1аз1а1ю со1огес1а1 сапсег. N Епд/ й Мед;350:2335-42 (2004).
3. Κίηϊ ΒΙ, На1аЬ| 5, КозепЬегд ЙЕ, е/ а/. Веуас1гитаЬ р1из 1п1ейегоп а!Га сотрагей νκίίΡ НегГегоп а1Та топоЮегару ίη райеп1з ууИР теЮзТайс гепа! се11 сагапота: САКЗВ 90206. й СПп Опсо1; 26:5422-8 (2008).
4. 8апй1ег А. бгау К, Ренту МС, е/ а/. РасН1ахе1-сагЬор1аЙп а1опе ог ууйР ЬеуаагитаЬ Тог поп-зта11-сеII 1ипд сапсег. N Епд/ й Мей; 355: 2542-50 (2006).
5. \Л/о1тагк Ν, Уо(Регз С, О'СоппеН Мй, е/ а/. А рРазе III 1па1 сотраппд тРОЬРОХб Ю ппРОЬРОХб р1из ЬеуаагитаЬ ίη з1аде II ог III сагапота οί Пае со1оп: гезиНз οί Ν3ΑΒΡ рго(осо1 С-08 Й СПп Опсо!; 27:1_ВА4 (2009).
6. Уапд йС, Накопи 1_, ЗРеггу КМ, еТ а/., А гапйопггей 1па1 οί ЬеуаагитаЬ, ап апй-уазси1аг епйо!РеПа1 дгоМР Тас(ог апйЬойу, Тог те(аз1айс гепа! сапсег, N Епд! й Мей 349 427-434 (2003).
7. ννίΙΙβΙΙ СС, ВоисРег Υ, Й1 Тотазо Е, е? а/., Бкес! еуИепсе 1Ра( 1Ре \/ЕСРзреаЯс апйЬойу ЬеуаагитаЬ Раз апйуазси1аг еТТес(з ίη Ритап гес£а1 сапсег, Ыа(. Мей. 10, 145-147 (2004).
8. МШег К, \Л/апд М, Сга1о\у й, еТ а/., РасП(ахе1 р1из ЬеуаагитаЬ уегзиз расН1ахе1 а1опе Тог те1аз1а(1С Ьгеаз1 сапсег, N Епд/4 Мес/357 2666-2676 (2007).
9. МШег КБ, СРар Ι_Ι , Но1тез РА, е( а/., Рапйот1гей рРазе III 1па1 οί саресйаЬюе сотрагей ννίίΡ ЬеуаагитаЬ р1из саресИаЫпе ίη райеп1з ννίΙΡ ргеуюиз1у 1геа1ей те1аз1айс Ьгеаз! сапсег, й СПп Опсо! 23 792-799 (2005).
10. О'ЗРаидРпеззу й, Мйез Б, Огау Кй, е( а!., А те(а-апа1уз1з οί оуегаН зимуа! йаТа Тгот 1Ргее гапйопгнгей 1па1з οί ЬеуаагитаЬ (Β\Ζ) апй Лгз1-Ппе сРето(0егару аз 1геа(теп1 Тог райеп(з ννίίΡ те(аз1айс Ьгеаз! сапсег (МВС), й СПп Опсо/ 28 (зирр!) (аЬз1г 1005) (2010).
11. Кеск Μ, νοη Раууе! й, 7а11оика1 Р, е( а/., РРазе III 1па1 οί азр1айп р1из детсНаЬнпе уй(Р е!Рег р1асеЬо ог ЬеуаагитаЬ аз ίίΓβί-Ιίηβ (Регару Тог попвциатоиз поп-зта11-се111ипд сапсег: А/АП. 4 СПп Опсо/ 27,1227-1234 (2009).
12. ЕзсиЙ1ег В, ВеНтип! й, Ыедпег 3 е( а/., РРазе III 1па1 οί Ьеуас1гитаЬ р1из 1п1ейегоп аНа-2а ίη райепТз ννίίΡ те(аз(аРс гепа1 се11 сагапота (ΑΝ/ΟΚΕΝ): йпа1 апа1уз18 οί оуегаН зигу|уа1, й СПп Опсо/ 28, 2144-2150 (2010)
13. Вигдег КА, 3ίΙΙ М\Л/, Мопк Вй, е(. а/. РРазе II 1па1 οί ЬеуаагитаЬ ίη регз1з1еп1 ог гесиггеп( ерНРеНа! оуапап сапсег ог рптагу регНопеа! сапсег: а Супесо1одю Опсо1оду Огоир 31ийу. й СПп Опсо!; 20;25(33):5165-71 (2007).

Claims (27)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ прогнозирования восприимчивости субъекта к агенту антиангиогенной терапии, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца;
    сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
    классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенному терапевтическому агенту на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.
  2. 2. Способ по п.1, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому, рак простаты, колоректальный рак или рак молочной железы.
  3. 3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.
  4. 4. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, и где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
  5. 5. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.
  6. 6. Способ по любому из пп.1, 3-5, в котором антиангиогенный терапевтический агент представляет собой терапевтический агент, нацеленный на путь УЕ0Е, ингибитор пути ангиопоэтина-Т1Е2, эндогенные ангиогенные ингибиторы и иммуномодулирующие агенты.
  7. 7. Способ по п.6, в котором терапевтический агент, нацеленный на путь УЕ0Е, выбран из бевацизумаба (авастин), афиберцепта (ловушка УЕ0Е), 1МС-1121В (рамуцирумаб), иматиниба (гливек), сорафениба (нексавар), гефитиниба (иресса), сунитиниба (сутент), эрлотиниба, тивозиниба, цедираниба (рецентин), пазопаниба (вотриент), В1ВЕ 1120 (варгатеф), довитиниба, семаксаниба (суген), акситиниба (А0013736), вандетаниба (зактима), нилотиниба (тасигна), дасатиниба (спрайсел), ваталаниба, мотесаниба, АВТ-869, ТК1-258 и их комбинации.
  8. 8. Способ по п.6, в котором ингибитор пути ангиопоэтина-Т1Е2 выбран из АМ0-386, РЕ-4856884 СУХ-060, СЕР-11981, СЕ-245677, МЕО1-3617, СУХ-241, трастузумаба (герцептин) или их комбинации.
  9. 9. Способ по п.6, в котором эндогенные ангиогенные ингибиторы выбраны из тромбоспондина, эндостатина, тумстатина, канстатина, аррестина, ангиостатина, вазостатина, интерферона-альфа или их комбинации.
  10. 10. Способ по п.6, в котором иммуномодулирующий агент выбран из талидомида, леналидомида и их комбинации.
  11. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором прогнозирование выполнено в контексте стандартной терапии и/или терапии антиангиогенным терапевтическим агентом, где антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.
  12. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и субъект был ранее подвергнут цитотоксической химиотерапии на основе платины и таксана или в котором антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.
  13. 13. Способ определения прогноза для субъекта, больного раком, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца;
    сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
    классификацию субъекта как имеющего плохой или хороший прогноз на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже пороговой оценки экспрессии соответственно.
  14. 14. Способ по п.13, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.
  15. 15. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где каждый вес для каждого биомаркера соответствует указанному в табл. 2А и 2В.
  16. 16. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
    - 54 025926
  17. 17. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.
  18. 18. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут стандартной химиотерапии.
  19. 19. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут хирургической резекции рака.
  20. 20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой глиобластому.
  21. 21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором мерой прогноза является выживание.
  22. 22. Способ прогнозирования отклика субъекта на стандартную терапию рака, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца;
    сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
    классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к стандартной терапии рака, на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.
  23. 23. Способ по п.22, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.
  24. 24. Способ по любому из пп.22 и 23, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.
  25. 25. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
  26. 26. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.
  27. 27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и стандартная терапия представляет собой стандартную цитотоксическую химиотерапию на основе платины и таксана.
EA201391805A 2011-06-02 2012-06-04 Молекулярно-диагностический тест на рак EA025926B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161492488P 2011-06-02 2011-06-02
PCT/US2012/040805 WO2012167278A1 (en) 2011-06-02 2012-06-04 Molecular diagnostic test for cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391805A1 EA201391805A1 (ru) 2014-03-31
EA025926B1 true EA025926B1 (ru) 2017-02-28

Family

ID=47259970

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391805A EA025926B1 (ru) 2011-06-02 2012-06-04 Молекулярно-диагностический тест на рак
EA201691257A EA201691257A1 (ru) 2011-06-02 2012-06-04 Молекулярно-диагностический тест на рак

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691257A EA201691257A1 (ru) 2011-06-02 2012-06-04 Молекулярно-диагностический тест на рак

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10260097B2 (ru)
EP (1) EP2715348B1 (ru)
JP (2) JP6067686B2 (ru)
KR (1) KR20140044341A (ru)
CN (1) CN103733065B (ru)
AU (1) AU2012261820B2 (ru)
BR (1) BR112013031019A2 (ru)
CA (1) CA2838086A1 (ru)
EA (2) EA025926B1 (ru)
IL (1) IL229681A0 (ru)
MX (1) MX2013014065A (ru)
SG (2) SG195208A1 (ru)
WO (1) WO2012167278A1 (ru)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2838086A1 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
EP2667193A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-27 Université d'Aix-Marseille MMP2 as a predictive biomarker of response to antiangiogenic therapy and survival after therapy in cancer patients
WO2014055398A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method for detecting an increased risk or incidence of colorectal cancer
CN105102631A (zh) * 2012-12-03 2015-11-25 阿尔玛克诊断有限公司 用于癌症的分子诊断测试
GB201313342D0 (en) * 2013-07-26 2013-09-11 Cancer Rec Tech Ltd Biomarkers
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
GB201409479D0 (en) * 2014-05-28 2014-07-09 Almac Diagnostics Ltd Molecular diagnostic test for cancer
GB201409476D0 (en) * 2014-05-28 2014-07-09 Almac Diagnostics Ltd Molecular subtype for use in prognosis
GB201409478D0 (en) * 2014-05-28 2014-07-09 Almac Diagnostics Ltd Pro-angiogenic signature
EP3169801A1 (en) * 2014-07-14 2017-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
WO2016133374A1 (ko) * 2015-02-17 2016-08-25 싸이퍼롬, 인코퍼레이티드 자궁수축억제제 부작용 방지를 위한 개인별 단백질 손상 정보 기반의 자궁수축억제제 선택 방법
CN105160208A (zh) * 2015-05-29 2015-12-16 杭州奥视图像技术有限公司 用于疾病亚型问题的基于网络的聚类方法
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MY191654A (en) 2015-07-01 2022-07-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
US10650325B2 (en) * 2015-07-31 2020-05-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Deterministic message distribution
EP3359692A4 (en) 2015-10-05 2019-05-01 Cedars-Sinai Medical Center METHOD OF CLASSIFYING AND DIAGNOSING CANCER
AU2017211247B2 (en) * 2016-01-25 2023-03-09 Sanofi Method for predicting the outcome of a treatment with aflibercept of a patient suspected to suffer from a cancer by measuring the level of a plasma biomarker
US20190127805A1 (en) * 2016-03-15 2019-05-02 Almac Diagnostics Limited Gene signatures for cancer detection and treatment
US11415584B2 (en) 2016-12-28 2022-08-16 Japanese Foundation For Cancer Research Biomarkers, test method, and test kit for predicting therapeutic effect of anti-VEGFR-2 antibody drug
CN107037210A (zh) * 2017-04-05 2017-08-11 北京蛋白质组研究中心 Thbs2蛋白检测物在制备肝细胞癌诊断试剂盒中的应用
WO2018213331A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Lankenau Institute For Medical Research Compositions comprising ligands to rhob protein and the uses thereof
JP7034183B2 (ja) 2017-06-13 2022-03-11 ボストンジーン コーポレイション 免疫チェックポイント遮断療法に対するレスポンダー及び非レスポンダーを特定するためのシステム及び方法
AU2018289410A1 (en) * 2017-06-19 2020-02-06 Invitae Corporation Interpretation of genetic and genomic variants via an integrated computational and experimental deep mutational learning framework
EP3461915A1 (en) 2017-10-02 2019-04-03 Koninklijke Philips N.V. Assessment of jak-stat1/2 cellular signaling pathway activity using mathematical modelling of target gene expression
EP3502279A1 (en) 2017-12-20 2019-06-26 Koninklijke Philips N.V. Assessment of mapk-ap 1 cellular signaling pathway activity using mathematical modelling of target gene expression
WO2019165366A1 (en) * 2018-02-23 2019-08-29 Beth Israel Deaconess Medical Center Drug efficacy evaluations
CA3095056A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Freenome Holdings, Inc. Machine learning implementation for multi-analyte assay of biological samples
CN113321647A (zh) 2018-06-15 2021-08-31 汉达癌症医药责任有限公司 激酶抑制剂的盐类及其组合物
CA3107571A1 (en) * 2018-06-27 2020-01-02 Qcdx Llc Biological sample holder and handler
CN109585011A (zh) * 2018-10-26 2019-04-05 朱海燕 胸痛患者的病症诊断方法及机器可读存储介质
MX2021005646A (es) * 2018-11-14 2021-08-11 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Métodos de tratamiento de cáncer con agentes de unión a tubulina.
WO2021016402A1 (en) * 2019-07-22 2021-01-28 Mission Bio, Inc. Using machine learning to optimize assays for single cell targeted dna sequencing
KR102289533B1 (ko) * 2019-08-19 2021-08-17 주식회사 테라젠바이오 특정 약물의 타겟 유전자와 관련된 시그니처를 기초로 타겟 유전자와 관련된 유전자들을 판단하는 전자 장치, 방법 및 상기 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램
CN112489800A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 安徽医科大学第一附属医院 一种前列腺癌患者的预后评估系统及其应用
CN116312814A (zh) * 2021-12-02 2023-06-23 复旦大学 一种肺腺癌分子分型模型的构建方法、设备、装置以及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009022129A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Almac Diagnostics Limited A 3' -based sequencing approach for microarray manufacture
US20090304594A1 (en) * 2005-12-05 2009-12-10 Fantin Valeria R Methods for Predicting Treatment Response Based On the Expression Profiles of Protein and Transcription Biomarkers
WO2011005273A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Aveo Pharmaceuticals Inc. Tivozanib response prediction

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
EP0430881A3 (en) 1989-11-29 1991-10-23 Ciba-Geigy Ag Photochromic compounds, process for their preparation and their use
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
WO1993020236A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Applied Biosystems, Inc. Probe composition and method
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5470710A (en) 1993-10-22 1995-11-28 University Of Utah Automated hybridization/imaging device for fluorescent multiplex DNA sequencing
GB9401833D0 (en) 1994-02-01 1994-03-30 Isis Innovation Method for discovering ligands
US6946442B2 (en) 1994-11-30 2005-09-20 Asif Syed Ahmed Method of hastening cervical ripening
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
JP2002515738A (ja) 1996-01-23 2002-05-28 アフィメトリックス，インコーポレイティド 核酸分析法
US6680175B2 (en) 1998-05-05 2004-01-20 Adherex Technologies, Inc. Methods for diagnosing and evaluating cancer
WO2004005883A2 (en) 2002-07-02 2004-01-15 The Johns Hopkins University Secreted and cytoplasmic tumor endothelial markers
US6998234B2 (en) 2000-11-03 2006-02-14 Oncotech, Inc. Methods for cancer prognosis and diagnosis relating to tumor vascular endothelial cells
AU2003234613A1 (en) 2002-05-15 2003-12-02 Seul, Kyung, Hwan Method of modulating angiogenesis
CN101274098A (zh) * 2003-05-30 2008-10-01 健泰科生物技术公司 利用抗-vegf抗体的治疗
US7659062B2 (en) 2003-06-03 2010-02-09 The Board of Trustee of the University of Arkansas System Gene expression profiling of uterine serous papillary carcinomas and ovarian serous papillary tumors
US7700280B2 (en) 2003-12-31 2010-04-20 The Penn State Research Foundation Methods for assessing cisplatin resistance, disease progression, and treatment efficacy in ovarian cancer
US20080113874A1 (en) * 2004-01-23 2008-05-15 The Regents Of The University Of Colorado Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
CA2563074C (en) 2004-04-09 2014-05-20 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for predicting response to chemotherapy
AU2005245572B9 (en) * 2004-05-14 2009-01-29 Ludwig Institute For Cancer Research Identification and characterization of a subset of glioblastomas sensitive to treatment with imatinib
AU2005263972A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-26 Astrazeneca Ab Method of predicting the responsiveness of a tumor to erbB receptor drugs
US20060134663A1 (en) 2004-11-03 2006-06-22 Paul Harkin Transcriptome microarray technology and methods of using the same
US7862995B2 (en) 2004-12-10 2011-01-04 Targeted Molecular Diagnostics Methods and materials for predicting responsiveness to treatment with dual tyrosine kinase inhibitor
CA2601157A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-28 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
EP1937837A2 (en) * 2005-07-29 2008-07-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods and kits for the prediction of therapeutic success, recurrence free and overall survival in cancer therapies
ES2374450T3 (es) 2005-09-20 2012-02-16 OSI Pharmaceuticals, LLC Marcadores biológicos predictivos de respuesta anticancerígena para inhibidores de cinasa del receptor del factor de crecimiento 1 similar a insulina.
US8445198B2 (en) * 2005-12-01 2013-05-21 Medical Prognosis Institute Methods, kits and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
WO2007067500A2 (en) 2005-12-05 2007-06-14 Genomic Health, Inc. Predictors of patient response to treatment with egfr inhibitors
AU2007211085A1 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Tripath Imaging, Inc. Methods for identifying patients with an increased likelihood of having ovarian cancer and compositions therefor
EP2010916A2 (en) * 2006-04-13 2009-01-07 Oncomethylome Sciences SA Novel tumour suppressor
US8768629B2 (en) * 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
US20100004253A1 (en) 2006-09-19 2010-01-07 Novartis Ag Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors
WO2009042814A1 (en) 2007-09-25 2009-04-02 Minerva Biotechnologies Corp. Early diagnosis and treatment of drug resistance in muc1-positive cancer
NZ562237A (en) * 2007-10-05 2011-02-25 Pacific Edge Biotechnology Ltd Proliferation signature and prognosis for gastrointestinal cancer
WO2009061800A2 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients
CA2707900A1 (en) 2007-12-07 2009-06-18 Oregon Health & Science University Methods to determine if a subject will respond to a bcr-abl inhibitor
US8114593B2 (en) 2008-03-12 2012-02-14 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cancer biomarker genes and gene products and methods for using the same
JP2011525106A (ja) * 2008-06-04 2011-09-15 ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アリゾナ 瀰漫性ｂ大細胞型リンパ腫のマーカーおよびその使用方法
ES2552937T3 (es) * 2008-06-06 2015-12-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Factor de predicción de supervivencia para linfoma difuso de células B grandes
CN102159727A (zh) * 2008-07-16 2011-08-17 达纳-法伯癌症研究院有限公司 与前列腺癌有关的信号和胆碱磷酸决定子以及它们的使用方法
EP2321651B1 (en) 2008-07-23 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Identification of subjects being susceptible to anti-angiogenesis therapy
JP5680547B2 (ja) 2008-12-23 2015-03-04 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 抗血管形成活性を有するインヒビターのためのバイオマーカー
WO2010088688A2 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Biotheranostics, Inc. Diagnosis of in situ and invasive breast cancer
EP2425020A4 (en) 2009-05-01 2016-04-20 Genomic Health Inc GENE EXPRESSION PROFILE ALGORITHM AND COLORECTAL CANCER RECURRENCE PROBABILITY ANALYSIS AND RESPONSE TO CHEMOTHERAPY
BR112012005670A2 (pt) 2009-09-17 2017-01-10 Hoffmann La Roche ''método para a identificação de um paciente com câncer que pode se beneficiar com a terapia antiagiogênica, método para a predição da responsividade de um paciente com câncer à terapia antiangiogênica, uso de um anticorpo anto- vegf para melhorar o efeito do tratamento de um paciente sofrendo de câncer, método ou uso, kit útil para realizar o método, uso de uma proteína ou usom kit útil para realizar o método, uso de uma proteína ou oligonucleotídeo ou matriz de polinecleotídeo para determinar o nível de expressão de bfgf em um método e kit ou uso
US9670547B2 (en) 2010-09-15 2017-06-06 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
WO2012052757A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Astrazeneca Ab Tumour phenotype patient selection method
WO2012092336A2 (en) 2010-12-28 2012-07-05 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for cancer
CA2838086A1 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
BR112014017320A2 (pt) 2012-01-13 2018-05-29 Genentech Inc método para determinar se um paciente é propenso a responder ao tratamento com um antagonista de vegf, método para otimizar a eficácia terapêutica de um antagonista de vegf, método para selecionar uma terapia, método para identificar um biomarcador e método para diagnosticar um distúrbio angiogênico
EP2667193A1 (en) 2012-05-23 2013-11-27 Université d'Aix-Marseille MMP2 as a predictive biomarker of response to antiangiogenic therapy and survival after therapy in cancer patients
CN105102631A (zh) 2012-12-03 2015-11-25 阿尔玛克诊断有限公司 用于癌症的分子诊断测试

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090304594A1 (en) * 2005-12-05 2009-12-10 Fantin Valeria R Methods for Predicting Treatment Response Based On the Expression Profiles of Protein and Transcription Biomarkers
WO2009022129A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Almac Diagnostics Limited A 3' -based sequencing approach for microarray manufacture
WO2011005273A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Aveo Pharmaceuticals Inc. Tivozanib response prediction

Also Published As

Publication number Publication date
JP6067686B2 (ja) 2017-01-25
EP2715348A4 (en) 2015-10-07
EP2715348A1 (en) 2014-04-09
EA201391805A1 (ru) 2014-03-31
CN103733065A (zh) 2014-04-16
US10260097B2 (en) 2019-04-16
IL229681A0 (en) 2014-01-30
WO2012167278A1 (en) 2012-12-06
NZ618191A (en) 2015-04-24
EP2715348B1 (en) 2019-04-10
BR112013031019A2 (pt) 2017-03-21
US20140342924A1 (en) 2014-11-20
MX2013014065A (es) 2014-06-23
SG195208A1 (en) 2013-12-30
SG10201604497UA (en) 2016-07-28
JP2017079772A (ja) 2017-05-18
CA2838086A1 (en) 2012-12-06
AU2012261820B2 (en) 2017-01-19
CN103733065B (zh) 2017-12-15
EA201691257A1 (ru) 2017-02-28
JP2014516552A (ja) 2014-07-17
KR20140044341A (ko) 2014-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025926B1 (ru) Молекулярно-диагностический тест на рак
US10378066B2 (en) Molecular diagnostic test for cancer
US20160002732A1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
AU2012261820A1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
US20160222459A1 (en) Molecular diagnostic test for lung cancer
US20160222460A1 (en) Molecular diagnostic test for oesophageal cancer
JP2017506506A (ja) 抗血管新生薬への応答およびがんの予後の予測のための分子診断試験
WO2013190092A1 (en) Gene signatures for copd diagnosis
WO2012075069A2 (en) Signatures and determinants associated with cancer and methods of use thereof
CN113444798A (zh) 肾癌生存风险生物标志物群及诊断产品和应用
CN113444796B (zh) 与肺癌相关的生物标志物及其在诊断癌症中的应用
CN113234823A (zh) 胰腺癌预后风险评估模型及其应用
US20130073213A1 (en) Gene Expression-Based Differential Diagnostic Model for Rheumatoid Arthritis
Glas et al. MammaPrint® translating research into a diagnostic test
US20230399701A1 (en) Prognostic gene signature and method for diffuse large b-cell lymphoma prognosis and treatment
EP2607494A1 (en) Biomarkers for lung cancer risk assessment

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU