ES2651924T3 - Inmunoterapias que emplean vacunas autoensamblantes - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una proteína de choque térmico fusionada a una proteína de unión a biotina, donde la proteína de unión a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la proteína de unión a biotina es una proteína que es al menos un 80 % idéntica a avidina o estreptavidina; y la proteína de unión a biotina se une de forma no covalente a un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado, o cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son idénticos.

Description

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DESCRIPCION
Inmunoterapias que emplean vacunas autoensamblantes ANTECEDENTES
La inmunizacion con vacunas sigue siendo una piedra angular de la proteccion contra la amenaza de enfermedad e infeccion. La dificultad clave en el desarrollo de una vacuna es corresponder rapidamente una vacuna, o antitoxina, con una amenaza especffica. Las estrategias actuales de desarrollo de vacunas se basan en la identificacion y caracterizacion de antfgenos que se pueden dirigir para erradicar con exito una infeccion o enfermedad. Las estrategias actuales de desarrollo de vacunas requieren mucho tiempo y mano de obra, y solo pueden comenzar una vez que surge una amenaza. Dichas estrategias tampoco son practicas para generar vacunas personalizadas para combatir enfermedades para las cuales los antfgenos diana varfan entre individuos. Las estrategias actuales de desarrollo de vacunas son, por lo tanto, insuficientes si surgiera una amenaza nueva y grave, para la cual no se dispuso de tiempo suficiente para identificar y caracterizar los antfgenos diana antes de que pudiera contenerse dicha amenaza. Las estrategias actuales de desarrollo de vacunas tambien son insuficientes para generar vacunas personalizadas para la poblacion en general.
Por lo tanto, existe la necesidad de una plataforma tecnologica o generacion de vacunas personalizadas y de contener amenazas graves que evolucionan rapidamente, son de accion rapida y/o altamente contagiosas.
RESUMEN DE LA INVENClON
La presente invencion se define por las reivindicaciones. En un aspecto, la presente invencion presenta composiciones farmaceuticas que pueden administrarse a un sujeto para inducir una respuesta inmune a un antfgeno de interes. En una realizacion, la composicion farmaceutica que comprende una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, donde la protefna de union a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la protefna de union a biotina es una protefna que es al menos un 80 % identica a avidina o estreptavidina; y la protefna de union a biotina se une de forma no covalente a un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado, o cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos.
En cierto caso, los componentes biotinilados son las mismas o diferentes moleculas. Los ejemplos no limitantes de componentes biotinilados incluyen protefnas, celulas y virus biotinilados. Los ejemplos no limitantes de protefnas biotiniladas incluyen antfgenos biotinilados, anticuerpos y moleculas coestimulantes.
En una realizacion adicional, la protefna de union a biotina se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina y neutravidina. En una realizacion adicional, la protefna de choque termico es una protefna de choque termico de mamffero o una protefna de choque termico bacteriana. En una realizacion adicional, la protefna de choque termico se selecciona del grupo que consiste en una protefna de choque termico MTBhsp70 y una protefna de choque termico humana. En una realizacion adicional, la composicion farmaceutica es una vacuna. Las composiciones de la presente invencion se pueden usar profilacticamente para aumentar la inmunidad frente a un antfgeno de interes, evitando el establecimiento y la proliferacion de virus o celulas en un sujeto que expresa y que muestra el antfgeno de interes o que presenta porciones del mismo. De esta manera, puede lograrse la prevencion del establecimiento y la proliferacion de celulas tumorales o extranas que expresan el antfgeno de interes. Las composiciones proporcionadas en el presente documento tambien se pueden usar terapeuticamente en un sujeto previamente infectado con virus o que alberga dichas celulas para evitar una proliferacion vfrica o celular adicional o para eliminar celulas del sujeto que proliferan, incluyendo celulas tumorales que expresan y muestran el antfgeno de interes o que presentan una porcion del antfgeno.
En otro caso, las composiciones comprenden vectores de expresion capaces de dirigir la expresion de protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina y/o protefnas a biotinilar, como se proporciona en el presente documento.
En otra realizacion mas, la presente invencion proporciona metodos para producir una composicion farmaceutica de autoensamblaje, que comprende poner en contacto una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina con un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado, o cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos, suficientes para formar un complejo no covalente de la protefna de choque termico, el anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado o los cuatro componentes biotinilados. La presente invencion tambien proporciona metodos para inducir una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina y cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos. La presente invencion proporciona ademas metodos para aumentar la potencia de un producto terapeutico en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina y cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos.
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La administracion de un anticuerpo monoclonal biotinilado y una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina puede reforzar drasticamente la eficacia inmunologica y la potencia de los anticuerpos monoclonales disponibles, que de otro modo servirfan como inmunogenos vacunales debiles. Ademas, la disponibilidad de un anticuerpo monoclonal o un suero inmune contra un antfgeno diana especffico puede ser suficiente por si sola para producir un complejo inmunoestimulador que podrfa estimular la produccion de anticuerpos contra un antfgeno de interes y la estimulacion de linfocitos T citotoxicos. Finalmente, las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento evitaran la necesidad de crear protefnas de fusion de choque termico especfficas de scFv para cada scFv especffico de antfgeno y/o anticuerpo.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona ventajas claras sobre las tecnologfas existentes al permitir: 1) la preparacion de la vacuna frente a un antfgeno o antfgenos no caracterizados y no identificados; 2) preparacion de vacunas personalizadas; 3) produccion rapida de composiciones farmaceuticas (por ejemplo, vacunas), que, a su vez, permiten una capacidad aumentada para la produccion de tales composiciones farmaceuticas; y 4) "sobrealimentacion" de productos terapeuticos existentes tales como anticuerpos monoclonales. Las tecnologfas descritas en el presente documento proporcionan el autoensamblaje de adyuvantes fijos y potentes con una diversidad de diferentes antfgenos, peptidos o moleculas dirigidas a antfgenos, incluyendo anticuerpos monoclonales especfficos de antfgenos tumorales de anticuerpos monocatenarios.
Se describiran caracterfsticas y ventajas adicionales en la descripcion detallada y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIGURA 1 ilustra la modificacion del vector de expresion pET-45b(+). A) Esquema de la insercion del sitio de restriccion Sfil. B) Sitios de clonacion multiple finales del vector pET-45b(+) modificado.
La FIGURA 2 muestra la introduccion de los sitios de restriccion Notl y Xhol en MTBhsp70. Utilizando cebadores que solapan los extremos N y C de MTBhsp70, se introdujeron por PCR un sitio Notl y un sitio Xhol. El producto de PCR resultante se muestra en el carril 1.
La FIGURA 3 muestra la digestion del MTBhsp70 amplificado con Notl y Xhol produciendo 2 bandas como se muestra en la imagen del gel. Los analisis de secuenciacion establecieron la presencia de sitios internos Notl y Sfil.
La FIGURA 4 muestra la eliminacion de los sitios Notl y Sfil mediante el uso de mutagenesis de sitio dirigido basada en PCR. Usando cebadores modificados que contenfan las mutaciones deseadas, se generaron dos productos de PCR solapantes. Estos se extendieron por PCR en ausencia de cebadores seguido de la adicion de cebadores especfficos.
La FIGURA 5 muestra la introduccion del peptido de Ovoalbumina (residuos 254-264) en el extremo N-terminal de MTBhsp70. Se diseno un enlazador sintetico que codifico el peptido de Ovoalbumina SllNFEKL y se digirio con Sfil y Notl. De forma similar, se corto el plasmido pET-45b(+) MTBhsp70 con Sfil y Notl. Ambos componentes se ligaron y el producto de ligacion se uso para transformar bacterias competentes. Las colonias resistentes a ampicilina se recogieron y cribaron mediante secuenciacion.
La FIGURA 6 muestra la secuenciacion parcial de la region N-terminal de Ova257-264-MTBhsp70.
La FIGURA 7 es una estructura esquematica de fusiones de protefnas de choque termico de una composicion farmaceutica de autoensamblaje. Se representan las protefnas de choque termico MTB HSP-70 y HSP-70 humana fusionadas cada una por separado a Avidina como protefna de union a biotina.
La FIGURA 8 representa una estrategia para el ensamblaje de Avidina de tipo silvestre y monomerica.
La FIGURA 9 ilustra una comparacion de aminoacidos y nucleotidos entre Avidina monomerica y de tipo silvestre.
La FIGURA 10 ilustra los errores de secuencia corregidos por mutagenesis basada en PCR.
La FIGURA 11 ilustra secuencias de Avidina monomerica/de tipo silvestre-Enlazador-MTBhsp70 con la secuencia parcial de MTBhsp70 mostrada.
La FIGURA 12 muestra el replegamiento de protefnas de Avidina-Enlazador-MTBhsp70 encontradas en cuerpos de inclusion.
La FIGURA 13 es un esquema de un autoensamblaje multivalente de una fusion de protefna de choque termico (mostrada como una protefna de fusion de MTb HSP70 y Avidina) y cuatro componentes biotinilados (mostrados como peptidos biotinilados 1-4) para formar una vacuna multivalente autoensamblada.
La FIGURA 14 representa las secuencias de protefna de longitud completa de HSP70 de HSP70 de Mycobacterium
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tuberculosisyHSP70 de Mycobacterium bovus, respectivamente.
La FIGURA 15 es una representacion de una vacuna autoensamblada de una protefna de fusion de choque termico y un componente biotinilado. La protefna de fusion por choque termico aquf se muestra como fusion de HSP- Avidina, y el componente biotinilado se muestra como un anticuerpo monoclonal biotinilado (mAb biotinilado).
La FIGURA 16 muestra un analisis de citometrfa de flujo de la produccion de interferon-Y.
La FIGURA 17 muestra un modelo molecular bidimensional de una fusion de MTb HSP70-Avidina con 4 fusiones monomericas de HSP-avidina unidas como un tetramero alrededor de 4 miembros de avidina tetramerizados, ya que se une para unirse a la biotina.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Definiciones
Por conveniencia, antes de una descripcion adicional de la presente invencion, se definen aquf ciertos terminos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
Las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El termino "administracion" o "administracion" incluye cualquier metodo de administracion de una composicion farmaceutica de la presente invencion, incluyendo, administracion sistemica o localizada. "Parenteral" se refiere a modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, normalmente mediante inyeccion, e incluye, sin limitacion, inyeccion intravenosa, intramuscular, intralesional, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal, oral, epidural, intranasal, e infusion.
El termino "aminoacido" pretende incluir todas las moleculas, ya sean naturales o sinteticas, que incluyan tanto una funcionalidad amino como una funcionalidad acida y sean capaces de incluirse en un polfmero de aminoacidos de origen natural. Los aminoacidos ejemplares incluyen aminoacidos de origen natural; analogos, derivados y congeneres de los mismos; analogos de aminoacidos que tienen cadenas laterales variantes; y todos los estereoisomeros de cualquiera de los anteriores. Los nombres de los aminoacidos naturales se abrevian en el presente documento de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC-IUB.
El termino "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina, derivados de la misma, que mantienen la capacidad de union especffica, y protefnas que tienen un dominio de union que es homologo o en gran parte homologo a un dominio de union de inmunoglobulina. El termino "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos completos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Estas protefnas pueden derivarse de fuentes naturales, o pueden producirse, en parte o totalmente, sinteticamente. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina de cualquier especie, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. En realizaciones ejemplares, los anticuerpos utilizados con los metodos y composiciones que se describen en el presente documento son derivados de la clase IgG. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo manipulado o de origen natural.
La expresion "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que es menor que la longitud completa. En realizaciones ejemplares, el fragmento de anticuerpo conserva al menos una parte significativa de la capacidad de union especffica del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitacion, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, scFv, Fv, diacuerpo dsFv, y fragmentos Fd. El fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimatica o qufmicamente mediante la fragmentacion de un anticuerpo intacto, puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia del anticuerpo parcial, o puede producirse sinteticamente de manera total o parcial. El fragmento de anticuerpo puede ser, opcionalmente, un fragmento de anticuerpo de cadena unica. Como alternativa, el fragmento puede comprender multiples cadenas que estan unidas entre sf, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. El fragmento tambien puede ser, opcionalmente, un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional comprendera tfpicamente al menos aproximadamente 50 aminoacidos y mas tfpicamente comprendera al menos aproximadamente 200 aminoacidos.
Un "antfgeno" se refiere a una diana de una respuesta inmune inducida por una composicion descrita en el presente documento. Un antfgeno puede ser un antfgeno de protefna y se entiende que incluye una protefna completa, un fragmento de la protefna mostrada en la superficie de un virus o una celula infectada, extrana o tumoral de un sujeto, asf como un peptido mostrado por una celula infectada, extrana, o tumoral como resultado del procesamiento y presentacion de la protefna, por ejemplo, a traves de las vfas tfpicas MHC clase I o II. Los ejemplos de tales celulas extranas incluyen bacterias, hongos y protozoos. Los ejemplos de antfgenos bacterianos incluyen Protefna A (PrA), Protefna G (PrG) y Protefna L (PrL).
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La expresion "sitio de union a antfgeno" se refiere a una region de un anticuerpo que se une especfficamente a un epftopo en un antfgeno.
La expresion "protefna de union a biotina" se refiere a una protefna, que se une no covalentemente a biotina. Una protefna de union a biotina puede ser un monomero, dfmero o tetramero, capaz de formar composiciones farmaceuticas monovalentes, divalentes o tetravalentes, respectivamente, como se describe en el presente documento. Los ejemplos no limitantes incluyen anticuerpos anti-biotina, avidina, estreptavidina y neutravidina. La avidina puede comprender avidina madura, o una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o un 99 % identica a la secuencia identificada por el Acceso NCBI N.° NP_990651. La estreptavidina puede comprender, por ejemplo, una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o un 99 % identica a la secuencia identificada por el Acceso NCBI N.° AAU48617. La expresion "protefna de union a biotina" pretende incluir el tipo silvestre y los derivados de avidina, estreptavidina y neutravidina, que forman monomeros, dfmeros o tetrameros. Los ejemplos de dichos derivados se exponen a continuacion y tambien se describen en Laitinen, O. H. (2007), "Brave New (Strept)avidins in Biotechnology", Trends in Biotechnology 25 (6): 269-277yNordlund, H. R. (2003), "Introduction of histidine residues into avidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternary structure and biotin binding", FEBS Letters 555: 449-454, cuyo contenido se incorpora expresamente en el presente documento por referencia.
El termino "celula" cuando se usa en el contexto como un componente biotinilado que contiene antfgeno pretende incluir celulas completas o porciones de las mismas, siempre que las porciones contengan el antfgeno de interes en una superficie accesible para reconocimiento por el sistema inmune cuando una composicion farmaceutica que comprende la "celula" biotinilada se administra a un sujeto.
El termino "comprender" y la expresion "que comprende" se usan en el sentido abierto inclusivo, lo que significa que se pueden incluir elementos adicionales.
La expresion "molecula coestimulante" como se usa en el presente documento, incluye cualquier molecula que sea capaz de potenciar el efecto estimulante de un estimulante de los linfocitos T primarios especfficos de antfgeno o elevar su actividad mas alla del nivel umbral requerido para la activacion celular, dando como resultado la activacion de linfocitos T sin tratar. Tal molecula coestimuladora puede ser una protefna receptora residente en la membrana.
La expresion "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composicion farmaceutica que es suficiente para lograr un resultado deseado. Una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica puede administrarse en una o mas administraciones.
La expresion "anticuerpo manipulado" se refiere a una molecula recombinante que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de union a antfgeno derivado del dominio variable de la cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo y puede comprender opcionalmente la totalidad o parte de los dominios variables y/o constantes de un anticuerpo de cualquiera de las clases de Ig (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY). Los ejemplos de anticuerpos manipulados incluyen anticuerpos monoclonales monocatenarios potenciados y anticuerpos monoclonales potenciados. Los ejemplos de anticuerpos manipulados se describen adicionalmente en el documento PCT/US2007/061554, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia.
El termino "epftopo" se refiere a la region de un antfgeno a la que un anticuerpo se une preferible y especfficamente. Un anticuerpo monoclonal se une preferiblemente a un unico epftopo especffico de una molecula que puede definirse molecularmente. En la presente invencion, pueden reconocerse multiples epftopos por un anticuerpo multiespecffico.
Una "protefna de fusion" se refiere a una protefna hfbrida que comprende secuencias de al menos dos protefnas diferentes. Las secuencias pueden ser de protefnas del mismo o de diferente organismo. En diversas realizaciones, la protefna de fusion puede comprender una o mas secuencias de aminoacidos unidas a una primera protefna. En el caso en el que se fusiona mas de una secuencia de aminoacidos a una primera protefna, las secuencias de fusion pueden ser multiples copias de la misma secuencia, o como alternativa, pueden ser diferentes secuencias de aminoacidos. Una primera protefna puede fusionarse al extremo N-terminal, C-terminal, o N- y C- terminal de una segunda protefna.
La expresion "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende un sitio de union a antfgeno generado por escision del anticuerpo con la enzima papafna, que corta en la region bisagra de forma N- terminal al enlace disulfuro entre la cadena H y genera dos fragmentos Fab de una molecula de anticuerpo.
La expresion "fragmento F(ab')2" se refiere a un fragmento de un anticuerpo que contiene dos sitios de union a antfgeno, generado por escision de la molecula de anticuerpo con la enzima pepsina, que corta la region bisagra C terminal al enlace disulfuro entre la cadena H.
El termino "fragmento Fc" se refiere al fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de su
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cadena pesada.
El termino "fragmento Fv" se refiere al fragmento de un anticuerpo que comprende los dominios variables de su cadena pesada y su cadena ligera. "Construccion genica" se refiere a un acido nucleico, tal como un vector, plasmido, genoma viral o similar, que incluye una "secuencia codificante" de un polipeptido o que de otro modo es transcribible a un ARN biologicamente activo (por ejemplo, antisentido, senuelo, ribozima, etc.), puede transfectarse en las celulas, por ejemplo, en ciertas realizaciones celulas de mamffero, y puede provocar la expresion de la secuencia codificante en las celulas transfectadas con la construccion. La construccion genica puede incluir uno o mas elementos reguladores unidos operativamente a la secuencia codificante, asf como secuencias intronicas, sitios de poliadenilacion, origen de replicacion, genes marcadores, etc.
"Celula huesped" se refiere a una celula que pueden transducirse con un vector de transferencia especffico. La celula se selecciona opcionalmente entre celulas in vitro, tales como las derivadas de cultivo celular, celulas ex vivo, tales como las derivadas de un organismo, y celulas in vivo, tales como las de un organismo. Se entiende que tales terminos se refieren no solo a la celula objeto particular, sino a la progenie o potencial progenie de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula precursora, pero todavfa se incluyen dentro del alcance del termino como se usa en el presente documento.
El termino "inmunogeno" se refiere a la capacidad de una sustancia para provocar una respuesta inmune. Una "composicion inmunogena" o "sustancia inmunogena" es una composicion o sustancia que provoca una respuesta inmune. Una "respuesta inmune" se refiere a la reaccion de un sujeto a la presencia de un antfgeno, que puede incluir al menos uno de los siguientes: fabricacion de anticuerpos, desarrollo de la inmunidad, desarrollo de hipersensibilidad al antfgeno, y desarrollo de la tolerancia.
La expresion "que incluye" se usa en el presente documento para referirse a "que incluye, pero sin limitacion". "Que incluye" y "que incluye, pero sin limitacion" se utilizan indistintamente.
El termino "enlazador" se reconoce en la tecnica y se refiere a una molecula o grupo de moleculas que conectan dos restos covalentes, tal como una protefna de choque termico y una protefna de union a biotina. El enlazador puede estar compuesto por una unica molecula de union o puede comprender una molecula de union y una molecula espaciadora, con la intencion de separar la molecula de union y un resto en una distancia especffica.
La expresion "anticuerpo multivalente" se refiere a un anticuerpo o anticuerpo manipulado que comprende mas de un sitio de reconocimiento de antfgeno. Por ejemplo, un anticuerpo "bivalente" tiene dos sitios de reconocimiento de antfgeno, mientras que un anticuerpo "tetravalente" tiene cuatro sitios de reconocimiento de antfgeno. Los terminos "monoespecffico", "biespecffico", "triespecffico", "tetraespecffico", etc. se refieren al numero de diferentes especificidades del sitio de reconocimiento de antfgeno (en comparacion con el numero de sitios de reconocimiento de antfgeno) presentes en un anticuerpo multivalente. Por ejemplo, los sitios de reconocimiento de antfgeno de un anticuerpo "monoespecffico" se unen todos al mismo epftopo. Un anticuerpo "biespecffico" tiene al menos un sitio de reconocimiento de antfgeno que se une a un primer epftopo y al menos un sitio de reconocimiento de antfgeno que se une a un segundo epftopo que es diferente del primer epftopo. Un anticuerpo "monoespecffico multivalente" tiene multiples sitios de reconocimiento de antfgeno que se unen todos al mismo epftopo. Un anticuerpo "biespecffico multivalente" tiene multiples sitios de reconocimiento de antfgeno, algunos de los cuales se unen a un primer epftopo y algunos de los cuales se unen a un segundo epftopo que es diferente del primer epftopo.
El termino "multivalente", cuando se hace referencia a una composicion farmaceutica de autoensamblaje descrita en el presente documento, se refiere a una protefna de fusion de choque termico que esta unida de forma no covalente a mas de un componente biotinilado. El termino "divalente", cuando se hace referencia a una composicion farmaceutica de autoensamblaje descrita en el presente documento, se refiere a una protefna de fusion por choque termico que esta unida de forma no covalente a dos componentes biotinilados. El termino "tetravalente", cuando se hace referencia a una composicion farmaceutica de autoensamblaje descrita en el presente documento, se refiere a una protefna de fusion por choque termico que esta unida de forma no covalente a cuatro componentes biotinilados. Los componentes biotinilados de una composicion farmaceutica multivalente pueden tener identidades identicas o diferentes.
La expresion "acido nucleico" se refiere a una forma polimerica de nucleotidos, ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. Los terminos tambien deben entenderse que incluyen, como equivalentes, analogos de ARN o ADN fabricados de analogos de nucleotidos, y cuando sea aplicable a la realizacion que se describe, polinucleotidos monocatenarios (tales como, de sentido o antisentido) y bicatenarios.
Un "paciente" o "sujeto" o "huesped" se usan de forma intercambiable, y cada uno se refiere a un animal no humano o humano.
La expresion "farmaceuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a las composiciones farmaceuticas que son, dentro del alcance del criterio medico, adecuadas para su uso en contacto
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con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, acorde con una relacion beneficio/riesgo razonable.
Un "vehfculo farmaceuticamente aceptable" como se usa en el presente documento, se refiere a un material, composicion o vehfculo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente lfquidos o solidos, o material de encapsulacion de disolvente, implicados en llevar o transportar la composicion farmaceutica objeto desde un organo, o parte del cuerpo, a otro organo, o parte del cuerpo. Cada vehfculo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; (15) acido algfnico; (16) agua exenta de pirogenos; (17) solucion salina isotonica; (18) Solucion de Ringer; (19) alcohol etflico; (20) soluciones de de pH tamponado; y (21) poliesteres, policarbonatos, y/o polianhfdridos; y (22) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas.
A menos que el contexto indique claramente otra cosa, "protefna", "polipeptido" y "peptido" se usan indistintamente en el presente documento cuando se refieren a un producto de expresion genica, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que se codifica por una secuencia codificante. Una "protefna" tambien puede referirse a una asociacion de una o mas protefnas, tal como un anticuerpo. Una "protefna" tambien puede hacer referencia a un fragmento de protefna. Una protefna puede ser una protefna modificada postraduccionalmente tal como una protefna glicosilada. Por "producto de expresion genica" se refiere a una molecula que se produce como resultado de la transcripcion de un gen entero o parte de un gen. Los productos genicos incluyen moleculas de ARN transcritas a partir de un gen, asf como protefnas traducidas a partir de dichos transcritos. Las protefnas pueden ser protefnas aisladas de origen natural o pueden ser el producto de una sfntesis recombinante o qufmica. La expresion "fragmento de protefna" se refiere a una protefna en la que los residuos de aminoacido se eliminan, en comparacion con la propia protefna de referencia, pero donde la secuencia de aminoacidos restante es por lo general identica a la de la protefna de referencia. Tales deleciones pueden producirse en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal de la protefna de referencia, o alternativamente ambos. Los fragmentos normalmente son de al menos aproximadamente 5, 6, 8 o 10 aminoacidos de longitud, al menos aproximadamente 14 aminoacidos de longitud, al menos aproximadamente 20, 30, 40 o 50 aminoacidos de longitud, al menos aproximadamente 75 aminoacidos de longitud, o al menos aproximadamente 100, 150, 200, 300, 500 o mas aminoacidos de longitud. Se pueden obtener fragmentos de proteinasas para fragmentar una protefna mas grande, o mediante metodos recombinantes, tales como la expresion de solo una parte de una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas (ya sea en solitario o fusionada con otra secuencia de acidos nucleicos que codifica protefnas). En diversas realizaciones, un fragmento puede comprender una actividad enzimatica y/o un sitio de interaccion de la protefna de referencia para, por ejemplo, un receptor celular. En otro caso, un fragmento puede tener propiedades inmunogenas. Las protefnas pueden incluir mutaciones introducidas en loci particulares mediante una diversidad de tecnicas conocidas, que no afectan adversamente, pero pueden potenciar, su uso en los metodos proporcionados en el presente documento. Un fragmento puede conservar una o mas de las actividades biologicas de la protefna de referencia.
El termino "autoensamblaje" como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina para formar un complejo no covalente con uno o mas componentes biotinilados como se describe en el presente documento. Tal capacidad es conferida por la asociacion no covalente de biotina con una protefna de union a biotina.
La expresion "fragmento variable monocatenario" o "scFv" se refiere a un fragmento Fv en el que el dominio de cadena pesada y el dominio de cadena ligera estan unidos. Uno o mas fragmentos scFv pueden estar unidos a otros fragmentos de anticuerpos (tales como el dominio constante de una cadena pesada o una cadena ligera) para formar construcciones de anticuerpos que tienen uno o mas sitios de reconocimiento de antfgeno.
"Tratar" una enfermedad en un sujeto o "tratamiento" de un sujeto que tiene una enfermedad se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmaceutico, por ejemplo, la administracion de un farmaco, de tal manera que la extension de la enfermedad se reduce o se evita. El tratamiento incluye (pero sin limitacion) la administracion de una composicion, tal como una composicion farmaceutica, y puede realizarse de forma profilactica, o despues del inicio de un evento patologico.
El termino "vacuna" se refiere a una composicion farmaceutica que provoca una respuesta inmune a un antfgeno de interes. La vacuna tambien puede conferir inmunidad protectora a un sujeto.
"Vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un acido nucleico capaz de replicacion extra-cromosomica. Los
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vectores preferidos son aquellos capaces de realizar una replicacion y/o expresion autonoma de acidos nucleicos a los que estan unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresion". En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de "plasmidos" que se refieren generalmente a bucles de ADN circular bicatenarios, que en su forma de vector no estan unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" se usan indistintamente ya que el plasmido es la forma mas comunmente utilizada de vector. Sin embargo, como se apreciara por los expertos en la tecnica, la invencion pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresion que realizan funciones equivalentes y que seran conocidas posteriormente en la tecnica.
El termino "virus" cuando se usa en el contexto como un componente biotinilado que contiene antfgeno pretende incluir particulas vfricas completas o porciones de las mismas, siempre que las porciones contengan el antfgeno de interes en una superficie accesible para reconocimiento por el sistema inmune cuando una composicion farmaceutica que comprende el "virus" biotinilado se administra a un sujeto.
General
En el presente documento se presenta una plataforma de vacuna novedosa que combina multiples componentes inmunologicos para generar una respuesta inmune altamente potente cuando se administra a un sujeto. Tambien se proporcionan composiciones y metodos para unir las multiples subunidades para el ensamblaje rapido de la nueva vacuna.
La presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una fusion de protefna de choque termico en asociacion no covalente con un componente biotinilado de anticuerpo o antfgeno da como resultado una composicion que estimula fuertemente respuestas celulares, en particular citolfticas mediadas por celulas, contra la antfgeno proteico no asociado covalentemente, cuyas respuestas pueden matar las celulas que presentan el antfgeno.
Fusiones de proteinas de choque termico
Una "protefna de choque termico" esta codificada por un "gen de choque termico" o un gen de estres, y se refiere a un gen que se activa o de otro modo se aumenta de forma detectable debido al contacto o expresion de un organismo (que contiene el gen) a un factor de estres, tal como choque termico, hipoxia, privacion de glucosa, sales de metales pesados, inhibidores del metabolismo energetico y del transporte de electrones, y desnaturalizantes de proteinas, o a ciertas ansamicinas de benzoquinona.Nover, L., Heat Shock Response, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991). "Protefna de choque termico" tambien incluye proteinas homologas codificadas por genes dentro de las familias de genes de estres conocidas, aun cuando dichos genes homologos no son inducidos por si mismos por un factor de estres.
Una "fusion de protefna de choque termico" se refiere a una protefna de choque termico unida a una protefna de union a biotina. Por ejemplo, una protefna de choque termico puede unirse en C o N-terminal en una protefna de union a biotina para generar una fusion de protefna de choque termico. Cuando se administra junto con un componente biotinilado proporcionado en el presente documento, una fusion de protefna de choque termico es capaz de estimular o potenciar respuestas inmunes humorales y/o celulares, incluyendo respuestas de linfocitos T citotoxicas CD8 (CTL), a un antfgeno de interes.
Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, las proteinas de choque termico que pueden usarse de acuerdo con la invencion incluyen BiP (tambien denominado grp78), Hsp10, Hsp20-30, Hsp60 hsp70, hsc70, gp96 (grp94), hsp60, hsp40, y Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, y miembros de sus familias. Las proteinas de choque termico especialmente preferidas son BiP, gp96 y hsp70, como se ilustra a continuacion. Un grupo particular de proteinas de choque termico incluye Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30, mas preferiblemente Hsp70 y Hsp60. El mas preferido es un miembro de la familia hsp70.
Los ejemplos de Hsp10 incluyen GroES y Cpn10. Hsp10 se encuentra tfpicamente en E. coli y en mitocondrias y cloroplastos de celulas eucarioticas. Hsp10 forma un anillo de siete miembros que se asocia con oligomeros de Hsp60. Hsp10 tambien esta involucrado en el plegamiento de proteinas.
Los ejemplos de Hsp60 incluyen Hsp65 de micobacterias. La Hsp60 bacteriana tambien se conoce comunmente como GroEL, tal como GroEL de E. coli. Hsp60 forma grandes complejos homooligomericos y parece jugar un papel clave en el plegamiento de proteinas. Los homologos de Hsp60 estan presentes en las mitocondrias eucariotas y los cloroplastos.
Los ejemplos de Hsp70 incluyen Hsp72 y Hsc73 de celulas de mamffero, DnaK de bacterias, particularmente micobacterias tales como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis (MTb) y Mycobacterium bovis (tales como Bacille-Calmette Guerin, denominado en el presente documento Hsp71), DnaK de Escherichia coli, levadura, y otros procariotas, y BiP y Grip78. Hsp70 es capaz de unirse especfficamente a ATP, asf como proteinas
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desplegadas, participando asf en el plegamiento y despliegue de protefnas, asf como en el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteicos. En una realizacion preferida, la protefna de choque termico es o se obtiene a partir de MTb HSP 70. Las secuencias de protefna de longitud completa de HSP70 de Mycobacterium tuberculosis y HSP70 de Mycobacterium bovus se representan en la FIGURA 2 como SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente. Una fusion de protefna de choque termico a usar junto con los metodos descritos en el presente documento puede comprender una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 99 % identica a la SEQ ID NO: 1 o 2.
Los ejemplos de Hsp90 incluyen HtpG en E. coli, Hsp83 y levadura de Hsc83, y Hsp90 alfa, Hsp90 beta y Grip94 en seres humanos. Hsp90 se une a grupos de protefnas, que son tfpicamente moleculas reguladoras celulares tales como receptores de hormonas esteroideas (por ejemplo, receptores de glucocorticoides, estrogenos, progesterona y testosterona), factores de transcripcion y protefnas quinasas que juegan un papel en los mecanismos de transduccion de senales. Las protefnas Hsp90 tambien participan en la formacion de complejos proteicos grandes y abundantes que incluyen otras protefnas de choque termico.
Los ejemplos de Hsp100 incluyen Hsp 110 de mamffero, Hsp104 de levadura, ClpA, ClpB, ClpC, ClpX y ClpY. Hsp104 de levadura y E. coli ClpA, forman hexameros y ClpB de E. coli, partfculas tetramericas cuyo ensamblaje parece requerir la union del nucleotido de adenina. La proteasa Clp proporciona un heterooligomero de 750 kDa compuesto por ClpP (una subunidad proteolftica) y por ClpA. ClpB-Y estan estructuralmente relacionados con ClpA, aunque a diferencia de ClpA no parecen formar complejos con ClpP.
Los ejemplos de Hsp100-200 incluyen Grip 170 (para protefna regulada por glucosa). Grip 170 reside en el lumen del ER, en el compartimento pre-golgi, y puede desempenar un papel en el plegamiento y ensamblaje de inmunoglobulinas.
Pueden usarse mutantes de origen natural o derivados recombinantes de protefnas de choque termico de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, la presente invencion proporciona el uso de protefnas de choque termico mutadas para facilitar su secrecion de la celula (por ejemplo, teniendo una mutacion o delecion de un elemento que facilita la recaptura del retfculo endoplasmico, tal como KDEL (SEQ ID NO:266) o sus homologos; dichos mutantes se describen en la Solicitud PcT N.° PCT/US96/13233(WO 97/06685), en casos particulares, las protefnas de choque termico de la presente invencion se obtienen de enterobacterias, micobacterias (particularmente M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis y M. bovis), E. coli, levadura, Drosophila, vertebrados, aves, pollos, mamfferos, ratas, ratones, primates o seres humanos.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en el presente documento pueden tener residuos de aminoacidos individuales que se modifican por oxidacion o reduccion. Ademas, se pueden realizar diversas sustituciones, deleciones o adiciones a las secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos, cuyo efecto neto es retener o mejorar aun mas la actividad biologica aumentada de la protefna de choque termico. Debido a la degeneracion del codigo, por ejemplo, puede haber una variacion considerable en las secuencias de nucleotidos que codifican la misma secuencia de aminoacidos. La expresion "protefna de choque termico" pretende incluir fragmentos de protefnas de choque termico obtenidas a partir de protefnas de choque termico, con la condicion de que dichos fragmentos incluyan los epftopos implicados en la mejora de la respuesta inmune a un antfgeno de interes. Se pueden obtener fragmentos de protefnas de choque termico usando proteinasas, o mediante metodos recombinantes, tales como la expresion de solo parte de una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna de estres (en solitario o fusionada con otra secuencia de acido nucleico que codifica una protefna). Las protefnas de choque termico pueden incluir mutaciones introducidas en loci particulares mediante una diversidad de tecnicas conocidas para potenciar su efecto sobre el sistema inmune. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Drinkwater y Klinedinst Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3402-3406 (1986); Liao y Wise, Gene 88:107-111 (1990); Horwitz et al., Genome 3:112-117 (1989).
En casos particulares, por ejemplo, en fusiones de protefnas de choque termico que implican conjugados qufmicos entre una protefna de choque termico y una protefna de union a biotina, las protefnas de choque termico usadas en la presente invencion son protefnas de choque termico aisladas, lo que significa que las protefnas de choque termico se han seleccionado y separado de la celula huesped en la que se produjeron. En algunas realizaciones, cuando el choque termico se expresa de forma recombinante como una fusion de una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, las fusiones de protefna de choque termico usadas en la presente invencion son fusiones aisladas de protefna de choque termico, lo que significa que las fusiones de protefna de choque termico se han seleccionado y separado de la celula huesped en la que se produjeron. Dicho aislamiento se puede realizar como se describe en el presente documento y usando metodos de rutina de aislamiento de protefnas conocidos en la tecnica.Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982);Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1990).
Componentes biotinilados
La expresion "componente biotinilado" como se usa en el presente documento, se refiere a una protefna, celula o
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virus biotinilado. Los ejemplos no limitantes de protefnas biotiniladas incluyen antfgenos biotinilados, anticuerpos y moleculas coestimulantes. El componente biotinilado debe administrarse a un sujeto junto con una fusion de protefna de choque termico como se describe en el presente documento.
i) Componentes biotinilados que contienen antigeno
En una realizacion, el componente biotinilado se deriva de un sujeto, que puede ser la misma o una persona diferente a la que se van a administrar las composiciones farmaceuticas. Por ejemplo, una protefna, celula y/o virus a los que se desea una respuesta inmune se pueden aislar de un sujeto y opcionalmente se pueden amplificar o clonar in vitro. La protefna, celula y/o virus pueden biotinilarse entonces in vitro utilizando metodos conocidos en la tecnica. El componente biotinilado puede entonces administrarse junto con una fusion de protefna de choque termico descrita en el presente documento al sujeto identico del cual se aislo la protefna, celula y/o virus, permitiendo asf el desarrollo de vacunas personalizadas. Como alternativa, el componente biotinilado se puede administrar junto con una fusion de protefna de choque termico descrita en el presente documento a un sujeto diferente del cual se aislo la protefna, celula y/o virus. El ultimo enfoque permite el desarrollo de vacunas para la poblacion general contra una enfermedad o agente infeccioso cuando se administra a una poblacion general.
Ambos enfoques proporcionan ventajas claras sobre la tecnica, concretamente, que el componente solo necesita identificarse en la medida en que permita su correlacion con una enfermedad o infeccion especffica y permita su aislamiento del sujeto. Este es un enfoque novedoso para dirigir antfgenos cuya secuencia puede no conocerse o incluso puede identificarse la estructura. Por lo tanto, la presente invencion permite la preparacion de composiciones farmaceuticas para inducir una respuesta inmune contra un antigeno o antfgenos conocidos, no caracterizados, no identificados. Las vacunas personalizadas proporcionan una ventaja adicional sobre las vacunas convencionales ya que la restriccion de HLA no es problematica debido a que la celula o protefna, tal como un anticuerpo, por ejemplo, se deriva del huesped identico al que se va a administrar el componente biotinilado.
En lugar de unir directamente peptidos antigenicos sinteticos a protefnas de choque termico para generar una vacuna, scFV, por ejemplo, pueden conjugarse en cambio con biotina y se administran junto con un resto de fusion de protefna de choque termico descrito en el presente documento, empleando de este modo una novedosa vacuna de protefnas de fusion para la presentacion de antfgenos a APC con el fin de generar tanto una respuesta humoral como CD-8. Los scFVI pueden, por ejemplo, seleccionarse mediante su union a un antigeno no caracterizado o a un antigeno caracterizado mediante estudios de union. En este ejemplo, los scFV deben ser biotinilados y administrados junto con un resto de fusion de protefna de choque termico, por ejemplo.
De la misma manera, cualquier protefna, celula, y/o virus puede biotinilarse y administrarse a un sujeto junto con un resto de fusion de protefna de choque termico descrito en el presente documento, de tal forma que la protefna biotinilada, celula, y/o virus al administrarse junto con una protefna de fusion de choque termico descrita en el presente documento, se dirige a una respuesta inmune a un antigeno de interes.
Un ejemplo de dicha celula es una celula tumoral aislada de un sujeto, que esta biotinilada y se administra junto con una fusion de protefna de choque termico descrita en el presente documento. La celula tumoral antes de la introduccion o reintroduccion en un sujeto en la presente invencion se debe tratar de manera que la celula ya no se reproduzca ni cause dano al sujeto al que se administra. Esto se puede lograr irradiando de manera subletal la celula tumoral antes o despues de la biotinilacion. La celula tumoral expresa el antigeno en su superficie, cuya identidad puede o no ser conocida o caracterizada. Cuando se administra a un sujeto junto con la fusion de protefna de choque termico, el complejo no covalente induce una respuesta inmune al antigeno tumoral. El resultado es una respuesta de "linfocito T asesino" contra el antigeno que expresa la celula, dirigiendo asf los tipos de celulas enfermas para la destruccion.
La celula tumoral es una celula de un tipo de cancer a tratar o prevenir mediante los metodos de la presente invencion. Dichas celulas incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, una celula de sarcoma humano o una celula de carcinoma, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandula sudorfpara, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por ejemplo, leucemia linfocftica aguda y leucemia mielocftica aguda (mieloblastica, promielocftica, mielomonocftica, monocftica y eritroleucemia); leucemia cronica (leucemia mielocftica cronica (granulocftica) y leucemia linfocftica cronica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, o enfermedad de cadena pesada.
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Otras celulas que pueden biotinilarse y administrate junto con una fusion de protefna de choque termico de la misma manera que la descrita anteriormente incluyen cualquier celula en un sujeto al que se desea una respuesta de "linfocito T asesino". Los ejemplos de dichas celulas incluyen otras celulas enfermas y/o infectadas vfricamente que expresan antfgeno en su superficie. Como se ha descrito anteriormente para las celulas tumorales, estas celulas antes de la introduccion o reintroduccion en un sujeto en la presente invencion se tratan preferiblemente de tal forma que las celulas ya no se reproducen ni causan dano al sujeto. Esto se puede lograr irradiando de manera subletal las celulas antes o despues de la biotinilacion. Dichas celulas pueden tratarse de manera que se vuelvan no infecciosas
0, si son celulas secretoras de toxinas, ya no secretan toxina.
Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse mediante los metodos de la presente invencion estan causadas por agentes infecciosos. Dichos agentes infecciosos o antfgenos derivados de los mismos, que pueden biotinilarse y administrarse junto con la presente invencion, incluyen, pero sin limitacion, virus, bacterias, hongos y protozoos. La invencion no se limita a tratar o prevenir enfermedades infecciosas causadas por patogenos intracelulares, sino que tambien pretende incluir patogenos extracelulares. Muchos microorganismos medicamente relevantes se han descrito ampliamente en la bibliograffa, por ejemplo, vease C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, cuyo contenido en su totalidad se incorpora por la presente por referencia.
En un caso, el antfgeno que exprese el virus o el antfgeno viral puede biotinilarse y administrarse junto con una fusion de protefna de choque termico de la misma manera que la descrita anteriormente.
Los virus infecciosos de vertebrados tanto humanos como no humanos incluyen retrovirus, virus de ARN y virus de ADN que expresan antfgeno. Los ejemplos de virus incluyen, pero sin limitacion: retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tanes como VIH-1 (tambien denominado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV o VIH-III y otros aislados, tales como HIV-LP; Picomaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, echovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan la gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus de ebola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de la parotiditis, virus del sarampion, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus Bunga, flebovirus y virus Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorragica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Bimaviridae; Hepadnavirida (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus de polioma); Adenoviridae (la mayorfa de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, el virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxviridae (virus de la viruela, virus vaccinia, poxvirus), e Iridoviridae (por ejemplo, el virus de la peste porcina africana); y los virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiologicos de las encefalopatfas espongiformes, el agente de la hepatitis delta (se piensa que es un satelite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de hepatitis diferente de A, diferente de B (clase 1 = transmitidos internamente, clase 2 = transmision parenteral (es decir, hepatitis C), virus Norwalk y relacionados, y astrovirus).
Los retrovirus que se contemplan incluyen tanto retrovirus simples como retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos de los retrovirus de tipo B, los retrovirus de tipo C y los retrovirus de tipo D. Un ejemplo de un retrovirus de tipo B es el virus del tumor mamario del raton (MMTV). Los retrovirus tipo C incluyen subgrupos de tipo C del grupo A (incluyendo el virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV), y virus de mieloblastosis aviar (AMV)) y el grupo C de tipo B (incluido el virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia felina (FeLV), virus del sarcoma de murino (MSV), el virus de la leucemia del mono gibon (GALV), virus de la necrosis del bazo (SNV), el virus de reticuloendoteliosis (RV) y el virus del sarcoma de simios (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen el virus de mono Mason-Pfizer (MPMV) y el retrovirus de simio de tipo 1 (SRV-1). Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de lentivirus, virus de la leucemia de linfocitos T y el virus espumoso. Los lentivirus incluyen el VIH-1, pero tambien incluyen el VIH-2, SIV, el virus Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), y el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de la leucemia de linfocitos T incluyen HTLV-
1, HTLV-II, el virus de leucemia de linfocitos T del simio (STLV), y el virus de la leucemia bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen virus espumoso humano (VAF), virus espumoso del simio (SFV) y el virus espumoso bovino (BFV).
Los ejemplos de virus de ARN que son antfgenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitacion, los siguientes: miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el genero Orthoreovirus (multiples serotipos tanto de retrovirus de mamfferos y aves), el genero Orbivirus (virus de la lengua azul, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus de la peste equina y virus de la fiebre de garrapata de Colorado), el genero Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea de ternero de Nebraska, rotavirus murino, rotavirus de simio, rotavirus bovino u ovino, rotavirus aviar); la familia Picomaviridae, incluyendo el genero Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A y B, virus huerfanos entericos citopaticos humanos (ECHO), virus de hepatitis A, enterovirus de simio, virus encefalomielitis murina (ME), muris poliovirus, enterovirus bovino, enterovirus porcino, el genero Cardiovirus (virus encefalomiocarditis (EMC), virus Mengo), el genero Rinovirus (rinovirus humanos, incluyendo al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el genero Apthovirus (enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV); la familia Calciviridae, incluyendo exantema vesicular de virus porcino, virus de lobos marinos de San Miguel, picornavirus felina y el virus de Norwalk; la familia Togaviridae,
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incluyendo el genero Alphavirus (virus de la encefalitis equina del este, virus Semliki Forest, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del no Ross, el virus de la encefalitis equina Venezolana, virus de la encefalitis equina occidental), el genero Flavirius (virus transmitido por mosquitos de la fiebre amarilla, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del Valle Murray, virus del Nilo Occidental, virus Kunjin, virus transmitido por la garrapata de Europa central, virus transmitido por la garrapata del Lejano Oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorragica de Omsk), el genero Rubivirus (virus de la Rubeola), el genero Pestivirus (virus de la enfermedad de las mucosas, virus del colera porcino, virus de la enfermedad de la frontera), la familia Bunyaviridae, incluyendo el genero Bunyvirus (Bunyamwera y virus relacionados, virus del grupo encefalitis de California), el genero Phlebovirus (virus Sandfly de la fiebre de Sicilia, virus de la fiebre del Valle del Rift), el genero Nairovirus (virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad ovina de Nairobi), y el genero Uukuvirus (Uukuniemi y los virus relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el virus del genero influenza (virus de la influenza tipo A, muchos subtipos humanos); Virus de la gripe porcina, y el virus de la gripe aviar y equina, influenza tipo B (muchos subtipos humanos), y la influenza de tipo C (posible genero separado), la familia Paramyxoviridae, incluyendo el genero Paramyxovirus (virus parainfluenza de tipo 1, virus Sendai, virus Hemadsorcion, virus parainfluenza de tipo 2 a 5, virus de la Enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el genero Morbillivirus (virus del sarampion, virus panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el genero Pneumovirus (virus respiratorio sincitial (VRS), virus sincitial respiratorio bovino y el virus de la neumoma de ratones); virus de la selva, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del no Ross, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina occidental), el genero Flavirius (transmitida por mosquitos del virus de la fiebre amarilla, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Louis, virus de la encefalitis del Valle Murray, virus del Nilo Occidental, virus Kunjin, virus transmitido por la garrapata de europa central, virus de la transmitido por la garrapata del Lejano Oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorragica de Omsk), el genero Rubivirus (virus de la Rubeola), el genero Pestivirus (virus de la enfermedad de las mucosas, virus del colera porcino, virus de la enfermedad de la frontera); la familia Bunyaviridae, incluyendo el genero Bunyvirus (Bunyamwera y virus relacionados, virus del grupo encefalitis de California), el genero Phlebovirus (virus de la fiebre por flebotomos siciliana, virusde la fiebre del Valle del Rift ), el genero Nairovirus (virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad ovina de Nairobi ), y el genero Uukuvirus (Uukuniemi y virus relacionados), la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el virus del genero influenza (virus influenza tipo A, muchos subtipos humanos), virus de la gripe porcina, y el virus de la gripe aviar y equina, influenza tipo B (muchos subtipos humanos) y la influenza de tipo C (posible genero separado); la familia Paramyxoviridae, incluyendo el genero Paramyxovirus (virus de la parainfluenza de tipo 1, el virus Sendai, virus Hemadsorcion, virus de la parainfluenza de tipo 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la parotiditis), el genero Morbillivirus (virus del sarampion, virus panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el genero Pneumovirus (virus respiratorio sincitial (VRS), virus respiratorio sincitial bovino y el virus de la neumoma de los ratones); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el genero Vesiculovirus (VSV), virus ChanBipura, virus Flandes-Hart Park), el genero Lyssavirus (virus de la rabia), rabdovirus de peces, y dos rabdovirus probables (el virus de Marburg y elvirus del Ebola), la familia Arenaviridae, incluyendo virus de la coriomeningitis linfodtica (LCM), complejo vinca Tacaribe, y virus de Lassa; la familia Coronoaviridae, incluido el virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), el virus de la hepatitis del raton, coronavirus enterico humano, y peritonitis infecciosa felina (coronavirus felino).
Los virus de ADN ilustrativos que son antfgenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitacion: la familia Poxviridae, incluyendo el genero Orthopoxvirus (Variola mayor, Variola menor, vacuna de viruela de mono, viruela vacuna, viruela de bufalo, viruela de conejo, Ectromelia), el genero Leporipoxvirus (Mixoma, fibroma), el genero Avipoxvirus (viruela aviar, virus de la viruela aviar de otro tipo), el genero capripoxvirus (viruela ovina, viruela caprina), el genero Suipoxvirus (viruela porcina), el genero parapoxvirus (virus de la dermatitis postular contagioso, pseudoviruela bovina, virus de la estomatitis papular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la peste porcina africana, los virus de la rana 2 y 3, el virus de Linfocistis de pescado), la familia Herpesviridae, incluyendo los alfa- herpesvirus (herpes simple tipos 1 y 2, varicela-zoster, el virus del aborto equino, el virus del herpes equino 2 y 3, virus de la pseudorrabia, virus queratoconjuntivitis bovino infecciosa, virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis felina, virus de la laringotraqueitis infecciosa), los betaherpesvirus (citomegalovirus humano y citomegalovirus de cerdos, monos y roedores); la gamma-herpesvirus (virus Epstein-Barr (VEB), virus de la enfermedad de Marek, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, el virus del herpes de conejillo de indias, el virus del tumor de Lucke); la familia Adenoviridae, incluyendo el genero Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D, E y no agrupados; adenovirus de simio (al menos 23 serotipos), la hepatitis infecciosa canina, y adenovirus de ganado vacuno, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el genero Aviadenovirus (adenovirus aviar); y los adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el genero del virus del papiloma (virus del papiloma humano, virus del papiloma bovino, virus del papiloma de conejo Shope, y varios virus del papiloma patogenos de otras especies), el genero Poliomavirus (poliomavirus, agente vacuolizante de simio (SV-40), agente vacuolizante de conejo (RKV), virus K, virus BK, virus JC, y otros virus polioma de primates tales como el virus del papiloma linfotropico); la familia Parvoviridae incluyendo el genero de virus Adeno-asociados, el genero parvovirus (virus de la panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad de vison Aleutianas, etc.). Por ultimo, los virus de ADN pueden incluir virus que no se ajusten a las familias anteriores, tales como los virus de la enfermedad de Kuru y Creutzfeldt-Jacob y agentes neuropaticos cronicos infecciosos.
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ii) Componentes biotinilados que contienen anticuerpos
En otro caso, los agentes inmunoterapeuticos, tales como los anticuerpos, pueden biotinilarse y administrate junto con una fusion de protefna de choque termico como se describe en el presente documento. Los anticuerpos naturales son en si mismos dfmeros y, por lo tanto, bivalentes. Si dos celulas de hibridoma que producen anticuerpos diferentes se fusionan artificialmente, algunos de los anticuerpos producidos por el hibridoma hfbrido estan compuestos por dos monomeros con especificidades diferentes. Dichos anticuerpos biespecfficos tambien pueden producirse mediante conjugacion qufmica de dos anticuerpos. Los anticuerpos naturales y sus derivados biespecfficos son relativamente grandes y caros de producir. Los dominios constantes de anticuerpos de raton tambien son una causa importante de la respuesta de anticuerpos humanos anti-raton (HAMA), lo que impide su amplio uso como agentes terapeuticos. Tambien pueden dar lugar a efectos no deseados debido a su union de receptores Fc. Por estas razones, los inmunologos moleculares se han concentrado en la produccion de fragmentos Fab y Fv mucho mas pequenos en microorganismos. Estos fragmentos mas pequenos no solo son mucho mas faciles de producir, sino que tambien son menos inmunogenicos, no tienen funciones efectoras y, debido a su tamano relativamente pequeno, son mas capaces de penetrar en tejidos y tumores. En el caso de los fragmentos Fab, los dominios constantes adyacentes a los dominios variables juegan un papel importante en la estabilizacion del dfmero de cadena pesada y ligera. Por consiguiente, aunque los anticuerpos a usar junto con los presentes metodos pueden incluir anticuerpos manipulados de longitud completa o casi de longitud completa pueden preferirse anticuerpos manipulados de un unico dominio mas pequenos (que pueden ser multivalentes y multiespecfficos).
El fragmento Fv es mucho menos estable, y por lo tanto se puede introducir un enlazador peptfdico entre los dominios variables de cadena pesada y ligera para aumentar la estabilidad. Esta construccion se conoce como fragmento Fv(scFv) monocatenario. A veces se introduce un enlace disulfuro entre los dos dominios para una mayor estabilidad.
Los anticuerpos bivalentes y biespecfficos se pueden construir usando solo dominios variables de anticuerpos. Un procedimiento bastante eficiente y relativamente sencillo es hacer que la secuencia enlazadora entre los dominios VHy Vl sea tan corta que no se pueden plegar y unirse entre sf. La reduccion de la longitud del enlazador de 3-12 residuos evita la configuracion monomerica de la molecula scFv y favorece los emparejamientos intermoleculares Vh-Vl con la formacion de un dfmero "diacuerpo" de scFv no covalente de 60 kDa (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448). El formato diacuerpo tambien se puede utilizar para la generacion de anticuerpos biespecfficos recombinantes, que se obtienen mediante la asociacion no covalente de dos productos de fusion monocatenarios, que consisten en el dominio Vh de un anticuerpo conectado por un enlazador corto al dominio Vl de otro anticuerpo. La reduccion de la longitud del enlazador aun mas por debajo de tres residuos puede dar lugar a la formacion de trfmeros ("triacuerpo", aproximadamente de 90 kDa) o tetrameros ("tetracuerpo", aproximadamente de 120 kDa) (Le Gall et al., 1999, FEBS Letters 453, 164-168). Para una revision de anticuerpos manipulados, en particular fragmentos de dominio unico, vease Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23:1126-1136. Todos estos anticuerpos manipulados pueden conjugarse con biotina y usarse en los metodos proporcionados en el presente documento.
Otros anticuerpos multivalentes manipulados que pueden usarse junto con los presentes casos se describen en Lu, et al., 2003, J. Immunol. Meth. 279:219-232(di-diacuerpos o anticuerpos biespecfficos tetravalentes); Solicitud Publicada de Estados Unidos 20050079170(moleculas Fv multimericas o "flexicuerpos"), y el documento WO99/57150yKipriyanov, et al., 1999, J. Mol. Biol. 293:41-56(diacuerpos en tandem, o "Tandabs").
Cualquiera de los anticuerpos multivalentes manipulados descritos anteriormente pueden desarrollarse por un experto en la tecnica utilizando tecnicas rutinarias de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en la Solicitud Internacional PCT N.° PCT/US86/02269; la Solicitud de Patente Europea N.° 184.187; la Solicitud de Patente Europea N.° 171.496; la Solicitud de Patente Europea N.° 173.494; la Publicacion Internacional PCT N.° WO 86/01533;Pat. de Estados Unidos N.° 4.816.567; Solicitud de Patente Europea N.° 125.023;Better et al. (1988) Science 240:1041-1043;Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443;Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526;Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218;Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999- 1005;Wood et al. (1985) Nature 314:446-449;Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559);Morrison (1985) Science 229:1202-1207;Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214;U.S. Pat. No. 5,225,539;Jones et al. (1986) Nature 321:552-525;Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534;Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060; andWinter and Milstein, Nature, 349, pp. 293-99 (1991)). Preferiblemente, los anticuerpos no humanos estan "humanizados" mediante la union del dominio de union a antfgeno no humano con un dominio constante humano (por ejemplo, Cabilly et al., Pat. de Estados Unidos N.° 4,816,567;Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pags. 6851-55 (1984)).
Los sitios de reconocimiento de antfgeno o regiones variables enteras de los anticuerpos manipulados pueden derivar de uno o mas anticuerpos parentales dirigidos contra cualquier antfgeno de interes. Los anticuerpos parentales pueden incluir anticuerpos de origen natural, anticuerpos adaptados de anticuerpos de origen natural, o anticuerpos construidos de novo utilizando secuencias de anticuerpos o que se sabe que son especfficas para un antfgeno de interes. Las secuencias que pueden derivarse de anticuerpos parentales incluyen regiones variables de cadena pesada y/o ligera y/o CDR, las regiones marco u otras porciones de las mismas.
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Los anticuerpos multivalentes, multiespecfficos pueden contener una cadena pesada que comprende dos o mas regiones variables y/o una cadena ligera que comprende una o mas regiones variables donde al menos dos de las regiones variables reconocen diferentes epftopos en el mismo antfgeno.
Los anticuerpos candidatos a biotinilar pueden cribarse para determinar la actividad usando una diversidad de ensayos conocidos. Por ejemplo, los ensayos de cribado para determinar la especificidad de union se conocen bien y se realizan habitualmente en la tecnica. Para una descripcion exhaustiva de tales ensayos, vease Harlow et al. (Eds.), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Capftulo 6.
En un caso, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales y/o tienen usos terapeuticos y/o profilacticos in vivo contra el cancer. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden usarse para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades infecciosas. Los ejemplos de anticuerpos terapeuticos y profilacticos incluyen, pero sin limitacion, ERBITUX® (Cetuximab) (ImClone System), MDX-010 (Medarex, NJ) que es un anticuerpo humanizado anti-CTLA-4 actualmente en uso clfnico para el tratamiento de cancer de prostata; SYNAGIS® (MedImmune, MD) que es un anticuerpo monoclonal de virus sincitial anti respiratorio humanizado (RSV) para el tratamiento de pacientes con infeccion RSV; HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado para el tratamiento de pacientes con cancer metastatico de mama. Otros ejemplos son un F(ab')2 anti- CD18 humanizado (Genentech); CDP860 que es un F(ab')2 anti-CD18 humanizado (Celltech, Reino Unido); PRO542 que es un anticuerpo anti-HIV gp 120 fusionado con CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); Ostavir que es un anticuerpo anti virus de Hepatitis B humano (Protein Design Lab/Novartis); PROTOVIR™ que es un anticuerpo humanizado anti-CMV IgG1 (Protein Design Lab/Novartis); MAK-195 (SEgArD) que es un F(ab')2 anti-TNF-a murino (Knoll Pharma/BASF); IC14 que es un anticuerpo anti-CD14 (ICOS Pharm); un anticuerpo IgG1 humanizado anti-VEGF (Genentech); OVAREX™ que es un anticuerpo anti-CA 125 murino (Altarex); PaNoREX™ que es un anticuerpo IgG2a de antfgeno de superficie celular anti-17-IA murino (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo IgG antiidiotipo (epftopo GD3) murino (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo IgG quimerico anti-EGFR (ImClone System); ViTAXIN™ que es un anticuerpo anti-aVB3 de integrina humanizado (Applied Molecular Evolution/ MedImmune); Campath 1H/LDP-03 que es un anticuerpo humanizado anti CD52 IgG1 (Leukosite); Smart M195 que es un anticuerpo humanizado anti-CD33 IgG (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que es un anticuerpo quimerico anti-CD20 IgG1 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpo que es un anticuerpo IgG anti-CD22 inmunizado (Immunomedics); Smart ID10 que es un anticuerpo humanizado anti-HLA (Protein Design Lab); ONCOLY™ (Lym-1) es un anticuerpo radioetiquetado murino anti-HLA DIAGNOSTIC REAGENT (Techniclone); ABX-IL8 es un anticuerpo humano anti-IL8 (Abgenix); anti-CD11a es un anticuerpo IgG1 humanizado (Genentech/Xoma); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo primatizado anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ es un anticuerpo radioetiquetado murino anti-CD20 (iDEC/Schering AG); IDEC-131 es un anticuerpo humanizado anti-CD40L (iDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 (IDEC); IDEC-1 52 es un anticuerpo primatizado anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 es un anticuerpo humanizado anti-CD3 IgG (Protein Design Lab); 501.1 es un anticuerpo humanizado anti-complemento factor 5 (C5) (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP870 es un fragmento Fab humanizado anti-TNF-a (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 IgG1 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDXCD4 es un anticuerpo humano anti-CD4 IgG (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 es un anticuerpo humanizado IgG4anti-TNF-a (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4B7 (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A es un anticuerpo humanizado anti-CD4 IgG (Ortho Biotech); ANTOVA™ es un anticuerpo IgG humanizado anti-CD40L (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo IgG humanizado anti-VLA-4 (Elan); MDX-33 es un anticuerpo humano anti-CD64 (FcyR) (Medarex/Centeon); SCH55700 es un anticuerpo IgG4 humanizado anti-IL-5 (Colltech/Schering); SB-240563 y SB-240683 son anticuerpos humanizados anti-IL-5 y IL-4, respectivamente, (SmithKline Beecham); rhuMab-E25 es un anticuerpo humanizado anti-IgE IgG1 (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); ABX-CBL es un anticuerpo IgM murino anti CD-147 (Abgenix); BTI-322 es un anticuerpo IgG de rata anti-CD2 (Medimmune/Bio Transplant); Orthoclone/OKT3 es un anticuerpo IgG2a murino anti-CD3 (ortho Biotech); SImUlECT™ es un anticuerpo IgG1 quimerico anti-CD25 (Novartis Pharm); LDP-01 es un anticuerpo IgG humanizado anti-132-integrina (LeukoSite); Anti-LFA-1 es F(ab')2 anti CD18 murino (Pasteur-Merieux/Immunotech); CAT-152 es un anticuerpo anti- TGF-132 humano (Cambridge Ab Tech); y Corsevin M es un anticuerpo quimerico anti-Factor VII (Centocor).
Vacunas de autoensamblaje
Se pueden administrar multiples componentes biotinilados junto con una fusion de protefna de choque termico como se describe adicionalmente. De esta manera, las composiciones farmaceuticas multivalentes se pueden generar y administrar a un sujeto. La generacion de composiciones farmaceuticas multivalentes permite la produccion de vacunas y agentes terapeuticos "supercargados" o mas potentes. Cuando el componente biotinilado comprende un anticuerpo, dicho vacuna muestra una mejora de la actividad para los anticuerpos comercializados.
Cuando la composicion farmaceutica es multivalente, los componentes biotinilados a administrar pueden ser cualquier combinacion de componentes biotinilados descrita en el presente documento. Por ejemplo, los componentes biotinilados de las mismas identidades o diferentes pueden administrarse junto con una fusion de
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protefna de choque termico como se proporciona en el presente documento, siempre que la protefna de union a biotina, y a su vez la fusion de protefna de choque termico, sea multivalente, o capaz de unirse a multiples componentes biotinilados. Como ejemplo, la protefna de union a biotina silvestre de avidina tiene cuatro sitios de union a biotina y, por lo tanto, es capaz de unirse a cuatro componentes biotinilados. En este ejemplo, los cuatro sitios se uniran mediante cuatro componentes biotinilados, y los componentes de union a biotina se pueden mezclar y emparejar basandose en la identidad en cualquier permutacion de uno, dos, tres o cuatro componentes biotinilados identicos descritos en el presente documento. Cuatro componentes identicos biotinilados pueden estar unidos a los cuatro sitios de union a biotina.
Por lo tanto, una cantidad eficaz de un componente biotinilado con una primera identidad puede administrarse a un sujeto junto con una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, suficiente para formar una composicion farmaceutica que comprende cuatro partes de componente biotinilado de una primera identidad y una parte de protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina. Como alternativa, una cantidad efectiva de componentes biotinilados con una primera y segunda identidad puede administrarse a un sujeto junto con una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, suficiente para formar una composicion farmaceutica que comprende tres partes de un componente biotinilado de una primera identidad, una parte de componente biotinilado de una segunda identidad, y una parte de fusion de protefna de choque termico. En otra realizacion, una cantidad efectiva de componentes biotinilados con una primera y segunda identidad puede administrarse a un sujeto junto con una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, suficiente para formar una composicion farmaceutica que comprende dos partes de un componente biotinilado de una primera identidad, dos partes de componente biotinilado de una segunda identidad, y una parte de fusion de protefna de choque termico.
Cuando la composicion farmaceutica de autoensamblaje es divalente, una cantidad eficaz de un componente biotinilado de una primera identidad puede administrarse a un sujeto junto con una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, suficiente para formar una composicion farmaceutica que comprende dos partes de componente biotinilado de una primera identidad y una parte de fusion de protefna de choque termico. Como alternativa, una cantidad efectiva de componentes biotinilados con una primera y segunda identidad puede administrarse a un sujeto junto con una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina, suficiente para formar una composicion farmaceutica que comprende una parte de un componente biotinilado de una primera identidad, una parte de componente biotinilado de una segunda identidad, y una parte de fusion de protefna de choque termico.
Un componente biotinilado de una composicion farmaceutica multivalente puede incluir una molecula coestimuladora, o un grupo de bloqueo (es decir, biotina en solitario o biotina conjugada con una molecula no funcional). Los ejemplos de moleculas coestimuladoras que pueden administrarse junto con la presente invencion incluyen moleculas B7, incluyendo B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86), CD28, CD58, LFA-3, CD40, B7-H3, CD137 (4-1BB), e interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2 o IL-12). Como ejemplo, una parte del componente biotinilado que comprende una molecula coestimuladora se puede administrar junto con i) tres partes de otro componente biotinilado que comprende una protefna, celula o virus; y ii) una parte de protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina. En otro ejemplo, dos partes del componente biotinilado que comprende una molecula coestimuladora se puede administrar junto con i) dos partes de otro componente biotinilado que comprende una protefna, celula o virus; y ii) una parte de protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina. En otro ejemplo, tres partes del componente biotinilado que comprende una molecula coestimuladora se puede administrar junto con i) una parte de otro componente biotinilado que comprende una protefna, celula o virus; y ii) una parte de protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina.
Puede emplearse un mutante de avidina, estreptavidina o neutravidina sensible al pH, por ejemplo, para controlar la interaccion no covalente de avidina, estreptavidina o neutravidina a biotina, y de ese modo lograr la estequiometrfa deseada de la fusion de protefna de choque termico con las diversas permutaciones y combinaciones de componente biotinilado, como se describe en el presente documento. La eleccion del tipo silvestre o una forma mutante particular de protefna de union a biotina, tal como avidina, puede emplearse para controlar la valencia deseada de la composicion farmaceutica (por ejemplo, forma monomerica, dimerica o tetramerica de avidina). Las vacunas monovalentes o divalentes pueden producirse de forma similar empleando protefnas de fusion de choque termico que comprenden otras protefnas mutantes de avidina, estreptavidina o neutravidina que se unen a la biotina pero de forma monovalente o divalente. Un ejemplo de un mutante de avidina se describe en la seccion Ejemplificacion a continuacion. Un ejemplo de un mutante puntual sensible al pH de Avidina que confiere union a biotina ajustable al pH es Y33H. Otro mutante tiene sustituciones de histidina para Met96, Val 115 e Ile 117, opcionalmente con reemplazo de histidina en Trp110. Dichos enfoques para controlar la union a biotina- estreptavidina se describen en Laitinen, O. H. (2007), "Brave New (Strept)avidins in Biotechnology", Trends in Biotechnology 25 (6): 269-277yNordlund, H. R. (2003), "Introduction of histidine residues into avidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternary structure and biotin binding", FEBS Letters 555: 449-454, cuyo contenido se incorpora expresamente en el presente documento por referencia.
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Metodos de produccion de composiciones farmaceuticas de autoensamblaje
En un caso de la presente invencion, las composiciones estan compuestas por dos restos: una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina y un componente biotinilado que se dirige a la respuesta immune al antfgeno al que se desea la respuesta immune. La presente invencion proporciona una produccion rapida y facil de grandes cantidades de composicion farmaceutica (por ejemplo, vacuna) porque la produccion de antfgenos o anticuerpos biotinilados es bien conocida y rapida, lo que, a su vez, permite una mayor capacidad para la produccion de vacunas. Debido a que una fusion de protefna de choque termico de una unica identidad puede administrarse junto con cualquiera de diversos componentes biotinilados como se describe en el presente documento, la protefna de fusion por choque termico no necesita sintetizarse de nuevo cada vez que se identifica un nuevo antfgeno diana de interes. Por lo tanto, dichos metodos de produccion son particularmente rapidos una vez que se establece y se ha producido la fusion de la protefna de choque termico a administrar.
Tambien se proporcionan metodos para fabricar la protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina. La protefna de choque termico puede prepararse, usando tecnicas convencionales, a partir de fuentes naturales, por ejemplo, como se describe en Flynn et al., Science 245:385-390 (1989), o usando tecnicas recombinantes, tal como la expresion de una construccion genica codificante de choque termico en una celula huesped adecuada tal como una celula bacteriana, de levadura o de mamffero. Una protefna de fusion que incluye la protefna de choque termico y la protefna de union a biotina puede producirse por medios recombinantes. Por ejemplo, un acido nucleico que codifica la protefna de choque termico puede unirse a cualquiera de los extremos de una secuencia de acido nucleico que codifica la protefna de union a biotina de tal forma que las dos secuencias codificantes de protefna comparten un marco de lectura traduccional comun y se pueden expresar como una protefna de fusion que incluye la protefna de union a biotina y la protefna de choque termico. La secuencia combinada se inserta en un vector adecuado elegido basado en las caracterfsticas de expresion deseadas y la naturaleza de la celula huesped. En los ejemplos proporcionados en lo sucesivo en el presente documento, las secuencias de acido nucleico se ensamblan en un vector adecuado para la expresion de protefnas en la bacteria E. coli. Despues de la expresion en la celula huesped elegida, la protefna de fusion puede purificarse mediante tecnicas de separacion bioqufmica de rutina o por procedimientos de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo para una o la otra parte de la protefna de fusion. Como alternativa, el vector seleccionado puede anadir una etiqueta a la secuencia de protefna de fusion, por ejemplo, una etiqueta de oligohistidina como se describe en los ejemplos presentados en lo sucesivo en el presente documento, lo que permite la expresion de una protefna de fusion etiquetada que puede purificarse por metodos de afinidad utilizando un anticuerpo u otro material con una afinidad apropiadamente alta para la etiqueta.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Deutscher, M. Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press, Inc.. San Diego, CA (1990). Si se utiliza un vector adecuado para la expresion en celulas de mamffero, por ejemplo, uno de los vectores analizados a continuacion, la fusion de protefnas de choque termico puede expresarse y purificarse a partir de celulas de mamffero. Como alternativa, el vector de expresion de mamffero (incluyendo secuencias de codificacion de la protefna de fusion) se puede administrar a un sujeto para la expresion directa de la protefna de fusion de protefnas de choque termico en las celulas del sujeto. Un acido nucleico que codifica una protefna de choque termico tambien se puede producir qufmicamente y a continuacion insertarse en un vector adecuado para la produccion de la protefna de fusion y la purificacion o la administracion a un sujeto. Finalmente, una protefna de fusion tambien se puede preparar qufmicamente.
Las tecnicas para fabricar genes de fusion son bien conocidas en la tecnica. Esencialmente, la union de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipeptidos se realiza de acuerdo con tecnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para la ligadura, la digestion con enzimas de restriccion para proporcionar extremos apropiados, el relleno de extremos cohesivos segun sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una union indeseable, y ligadura enzimatica. En otro caso, el gen de fusion puede sintetizarse por tecnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, la amplificacion por PCR de fragmentos de genes puede realizarse usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Por consiguiente, se proporciona un acido nucleico aislado que comprende un gen de fusion de un gen que codifica una protefna de choque termico fusionada a un gen que codifica una protefna de union a biotina.
El acido nucleico puede proporcionarse en un vector que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una fusion de protefnas de choque termico, y unida operativamente al menos a una secuencia reguladora. Debe entenderse que el diseno del vector de expresion puede depender de dichos factores, tales como la eleccion de la celula huesped a transformar y/o el tipo de protefna que se desea expresar. El numero de copias del vector, la capacidad de controlar ese numero de copias y la expresion de cualquier otra protefna codificada por el vector, tal como marcadores de antibioticos, debe tenerse en cuenta. Dichos vectores se pueden administrar en cualquier vehfculo biologicamente eficaz, por ejemplo, cualquier formulacion o composicion capaz de transfectar celulas con eficacia, ya sea ex vivo o in vivo con material genetico que codifica un polipeptido quimerico. Los enfoques incluyen la insercion del acido nucleico en vectores vfricos, incluyendo retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus de la inmunodeficiencia humana, y virus del herpes simple 1 recombinantes, o plasmidos bacterianos o eucariotas
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recombinantes. Los vectores vfricos se pueden utilizar para transfectar celulas directamente; se puede administrar ADN plasmfdico solamente con la ayuda de, por ejemplo, liposomas cationicos (lipofectina) o derivatizados (por ejemplo, conjugado con anticuerpo), conjugados de polilisina, gramicidina S, envolturas vfricas artificiales u otros de dichos vehfculos intracelulares. Los acidos nucleicos tambien pueden inyectarse directamente. Como alternativa, se puede realizar la precipitacion con fosfato de calcio para facilitar la entrada de un acido nucleico en una celula.
Los acidos nucleicos en cuestion pueden usarse para causar la expresion y la sobreexpresion de una protefna de fusion de protefnas de choque termico en celulas propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir protefnas de fusion.
Tambien se proporciona una celula huesped transfectada con un gen recombinante con el fin de expresar la fusion de protefnas de choque termico. La celula huesped puede ser cualquier celula procariota o eucariota. Por ejemplo, puede expresarse una fusion de protefnas de choque termico en celulas bacterianas, tales como E. coli, celulas de insecto (baculovirus), levadura, celulas de insecto, planta, o de mamffero. En aquellos casos en los que la celula huesped es humana, puede estar o no en un sujeto vivo. Otras celulas huesped adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica. Adicionalmente, la celula huesped puede complementarse con moleculas de ARNt que no se encuentran normalmente en el huesped con el fin de optimizar la expresion del polipeptido. Otros metodos adecuados para maximizar la expresion del polipeptido de fusion seran conocidos por los expertos en la tecnica.
Un cultivo celular incluye celulas huesped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la tecnica. Un polipeptido de fusion puede secretarse y aislarse de una mezcla de celulas y medio que comprenden el polipeptido. Como alternativa, un polipeptido de fusion puede ser retenido citoplasmicamente y las celulas se recogen, se lisan y se afsla la protefna. Un polipeptido de fusion puede aislarse de un medio de cultivo celular, celulas huesped, o ambos usando tecnicas conocidas en la tecnica para purificar protefnas, incluyendo cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de filtracion en gel, ultrafiltracion, electroforesis y purificacion por inmunoafinidad con anticuerpos especfficos para epftopos particulares de una fusion.
Por lo tanto, se puede utilizar una secuencia de nucleotidos que codifica toda o parte de una fusion de protefnas de choque termico para producir una forma recombinante de una protefna a traves de procesos microbianos o procesos celulares eucariotas. La ligacion de la secuencia en una construccion de polinucleotido, tal como un vector de expresion, y la transformacion o transfeccion en huespedes, ya sea eucariota (levadura, aviar, insecto o mamffero) o procariota (celulas bacterianas), son procedimientos estandar. Se pueden emplear procedimientos similares, o modificaciones de los mismos, para preparar polipeptidos de fusion recombinantes por medios microbianos o tecnologfa de cultivo de tejidos de acuerdo con la invencion objeto.
Los vehfculos de expresion para la produccion de una protefna recombinante incluyen plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados para la expresion de un polipeptido de fusion incluyen plasmidos de los tipos: plasmidos derivados de pBR322, plasmidos derivados de pEMBL, plasmidos derivados de pEX, plasmidos derivados de pBTac y plasmidos derivados de pUG para la expresion en celulas procariotas, tales como E. coli.
En otra realizacion, el acido nucleico que codifica el polipeptido de fusion de protefnas de choque termico esta unido operativamente a un promotor bacteriano, por ejemplo, el promotor NirB de E. coli anaerobico o el promotor llp de lipoprotefna de E. coli, que se describen; por ejemplo, en Inouye et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13:3101;Salmonella pagCpromoter (Miller et al.,supra),Shigella entpromoter (Schmitt y Payne, J. Bacteriol. 173:816 (1991)), el promotor teten Tn10 (Miller et al.,supra), o el promotorctxdeVibrio cholera.Se puede utilizar cualquier otro promotor. El promotor bacteriano puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. Un promotor inducible ejemplar es un promotor que es inducible por hierro o en condiciones limitativas de hierro. De hecho, se cree que algunas bacterias, por ejemplo, organismos intracelulares, encuentran condiciones limitativas de hierro en el citoplasma huesped. Los ejemplos de promotores regulados por hierro de FepA y TonB se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias:Headley, V. et al. (1997) Infection & Immunity 65:818;Ochsner, U.A. et al. (1995) Journal of Bacteriology 177:7194;Hunt, M.D. et al. (1994) Journal of Bacteriology 176:3944;Svinarich, D.M. and S. Palchaudhuri. (1992) Journal of Diarrhoeal Diseases Research 10:139;Prince, R.W. et al. (1991) Molecular Microbiology 5:2823;Goldberg, M.B. et al. (1990) Journal of Bacteriology 172:6863;de Lorenzo, V. et al. (1987) Journal of Bacteriology 169:2624; andHantke, K. (1981) Molecular & General Genetics 182:288.
Un plasmido comprende preferiblemente una secuencia necesaria para la transcripcion apropiada del acido nucleico en bacterias, por ejemplo, una senal de terminacion de la transcripcion. El vector puede comprender ademas secuencias de factores que permiten la seleccion de bacterias que comprenden el acido nucleico de interes, por ejemplo, gen que codifica una protefna que proporciona resistencia a un antibiotico, secuencias necesarias para la amplificacion del acido nucleico, por ejemplo, un origen de replicacion bacteriano.
En otra realizacion, se anade una secuencia de peptido senal a la construccion, de manera que el polipeptido de fusion se secreta de las celulas. Dichos peptidos senal se conocen bien en la tecnica.
En un caso, el potente promotor T5 de fago, que se reconoce por ARN polimerasa de E. coli, se utiliza junto con un
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modulo de represion del operador lac para proporcionar una expresion de alto nivel estrictamente regulado o protefnas recombinantes en E. coli.En este sistema, la expresion de protefna es bloqueada en presencia de altos niveles de represor lac.
En un caso, el ADN esta unido operativamente a un primer promotor y la bacteria comprende ademas un segundo ADN que codifica una primera polimerasa que es capaz de mediar la transcripcion del primer promotor, donde el ADN que codifica la primera polimerasa esta unido operativamente a un segundo promotor. En un caso preferido, el segundo promotor es un promotor bacteriano, tales como los indicados anteriormente. En un caso aun mas preferido, la polimerasa es una polimerasa de bacteriofago, por ejemplo, SP6, T3, o 17 polimerasa y el primer promotor es un promotor de bacteriofago, por ejemplo, un promotor SP6, T3, o T7, respectivamente. Los plasmidos que comprenden promotores de bacteriofagos y plasmidos que codifican polimerasas de bacteriofagos se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de Promega Corp.(Madison, Wis.) e InVitrogen (San Diego, Calif.), o pueden obtenerse directamente a partir del bacteriofago usando tecnicas de ADN recombinante estandar (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, 1989). Las polimerasas y promotores de bacteriofagos se describen adicionalmente, por ejemplo, en las siguientes referencias:Sagawa, H. et al. (1996) Gene 168:37;Cheng, X. et al. (1994) PNAS USA 91:4034;Dubendorff, J.W. y F.W. Studier (1991) Journal of Molecular Biology 219:45;Bujarski, J.J. y P. Kaesberg (1987) Nucleic Acids Research 15:1337; y Studier, F.W. et al. (1990) Methods in Enzymology 185:60). Dichos plasmidos pueden modificarse adicionalmente de acuerdo con la realizacion especffica de la fusion de protefnas de choque termico a expresar.
En otro caso, la bacteria comprende ademas un ADN que codifica una segunda polimerasa que es capaz de mediar la transcripcion del segundo promotor, donde el ADN que codifica la segunda polimerasa esta unido operativamente a un tercer promotor. El tercer promotor puede ser un promotor bacteriano. Sin embargo, mas de dos polimerasas y promotores diferentes podrfan introducirse en una bacteria para obtener altos niveles de transcripcion. El uso de una o mas polimerasas para la mediacion de la transcripcion en la bacteria puede proporcionar un aumento significativo en la cantidad de polipeptido en la bacteria en relacion con una bacteria en la que el ADN esta directamente bajo el control de un promotor bacteriano. La seleccion del sistema a adoptar variara dependiendo del uso especffico, por ejemplo, de la cantidad de protefna que se desea producir.
En general, se introduce un acido nucleico que codifica una protefna de fusion en una celula huesped, tal como mediante transfeccion, y la celula huesped se cultiva en condiciones que permiten la expresion de la protefna de fusion. Los metodos para introducir acidos nucleicos en celulas procariotas y eucariotas se conocen bien en la tecnica. Los medios adecuados para el cultivo de celulas huesped de mamffero y procariotas se conocen bien en la tecnica. Generalmente, el acido nucleico que codifica la protefna de fusion objeto esta bajo el control de un promotor inducible, que se induce una vez que las celulas huesped que comprenden el acido nucleico se han dividido un numero determinado de veces. Por ejemplo, cuando un acido nucleico esta bajo el control de un operador y represor de beta-galactosa, se anade isopropil beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) al cultivo cuando las celulas huesped bacterianas han alcanzado una densidad de aproximadamente DO600 0,45-0,60. El cultivo se desarrolla a continuacion durante algo mas de tiempo para dar tiempo a la celula huesped para sintetizar la protefna. A continuacion, habitualmente los cultivos se congelan y se pueden almacenar congelados durante algun tiempo, antes del aislamiento y la purificacion de la protefna.
Cuando se utiliza una celula huesped procariota, la celula huesped puede incluir un plasmido que expresa una lisozima T7 interna, por ejemplo, expresada del plasmido pLysSL (veanse los Ejemplos). La lisis de dichas celulas huesped libera la lisozima que a continuacion degrada la membrana bacteriana.
Otras secuencias que pueden incluirse en un vector para la expresion en celulas procarioticas bacterianas u otras incluyen un sitio de union ribosomal sintetico; fuertes terminadores de la transcripcion, por ejemplo, de fago lambda y t4 del operon rmB en E. coli, para prevenir la lectura a traves de la transcripcion y asegurar la estabilidad de la protefna expresada; un origen de replicacion, por ejemplo, ColE1; y el gen de beta-lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina.
Otras celulas huesped incluyen las celulas huesped procariotas. Las celulas huesped incluso mas preferidas son bacterias, por ejemplo, E. coli.Otras bacterias que pueden utilizarse incluyen Shigella spp., Salmonella spp., Wisteria spp., Rickettsia spp., Yersinia spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Bordetella spp., Neisseria spp., Aeromonas spp., Franciesella spp., Corynebacterium spp., Citrobacter spp., Chlamydia spp., Hemophilus spp., Brucella spp., Mycobacterium spp., Legionella spp., Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp., Vibrio spp., Bacillus spp.,yErysipelothrix spp. La mayor parte de estas bacterias se puede obtener de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATcC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209).
Existe un conjunto de vectores para la expresion de protefnas recombinantes en levadura. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2, e YRP17 son vehfculos de clonacion y expresion utiles en la introduccion de construcciones geneticas en S. cerevisiae(vease, por ejemplo, Broach et al., (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, pag. 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia del pBR322 ori, y en S. cerevisiae debido al determinante de replicacion del plasmido de levadura 2 micrometros. Ademas, se pueden utilizar marcadores de resistencia a farmacos, tales como ampicilina.
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En ciertos casos, los vectores de expresion de mamfferos contienen tanto secuencias procarioticas para facilitar la propagacion del vector en bacterias, como una o mas unidades de transcripcion eucariotas que se expresan en celulas eucariotas. Los vectores derivados de pc ADN I/amp, pc ADN DNI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2- dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion de mamffero adecuados para la transfeccion de celulas eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicacion y seleccion de resistencia a farmacos en celulas tanto procariotas como eucariotas. Como alternativa, los derivados de virus, tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1), o de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) pueden utilizarse para la expresion transitoria de protefnas en celulas eucariotas. Los diversos metodos empleados en la preparacion de los plasmidos y la transformacion de organismos huesped se conocen bien en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados para celulas procariotas y eucariotas, asf como procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capftulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar la protefna recombinante mediante el uso de un sistema de expresion de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresion de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tal como el 13-gal que comprende pBlueBac III).
En otra variacion, la produccion de protefnas se puede conseguir usando en sistemas de traduccion in vitro.Los sistemas de traduccion in vitro son, en general, un sistema de traduccion que es un extracto libre de celulas que comprende al menos los elementos mfnimos necesarios para la traduccion de una molecula de ARN en una protefna. Un sistema de traduccion in vitro comprende tfpicamente al menos ribosomas, ARNt, iniciador de metionil- ARNtMet, protefnas o complejos implicados en la traduccion, por ejemplo, eIF2, eIF3, el complejo de union a la caperuza (CB), que comprende la protefna de union a la caperuza (CBP) y factor de iniciacion eucariota 4F (eIF4F). Una diversidad de sistemas de traduccion in vitro se conoce bien en la tecnica e incluyen kits comercialmente disponibles. Los ejemplos de sistemas de traduccion in vitro incluyen lisados eucariotas, tales como lisados de reticulocitos de conejo, lisados de ovocitos de conejo, lisados celulares humanos, lisados de celulas de insectos y extractos de germen de trigo. Los lisados estan disponibles en el mercado de fabricantes, tales como Promega Corp., Madison, Wis.; Stratagene, La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, I11.; y GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.Los sistemas de traduccion in vitro comprenden tfpicamente macromoleculas, tales como enzimas, factores de traduccion, iniciacion y elongacion, reactivos qufmicos, y ribosomas. Ademas, se puede utilizar un sistema de transcripcion in vitro. Dichos sistemas comprenden tfpicamente al menos una holoenzima de ARN polimerasa, ribonucleotidos y cualquier factor de iniciacion de la transcripcion, elongacion y terminacion necesarios. Un nucleotido de ARN para la traduccion in vitro se puede producir usando metodos conocidos en la tecnica.La transcripcion y traduccion in vitro pueden acoplarse en una reaccion de una sola etapa para producir protefnas a partir de uno o mas ADN aislados.
Cuando se desea la expresion de un fragmento carboxi terminal de una protefna, es decir, un mutante por truncamiento, puede ser necesario anadir un codon de inicio (ATG) al fragmento de oligonucleotido que comprende la secuencia que se desea expresar. Se conoce bien en la tecnica que una metionina en la posicion N-terminal puede ser enzimaticamente escindida mediante el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). MAP se ha clonado a partir de E. co//(Ben-Bassat et al., (1987) J. Bacterial. 169:751-757) ySalmonella typhimuriumy su actividad in vitro se ha demostrado sobre protefnas recombinantes (Miller et al., (1987) PNAS USA 84:2718-1722). Por lo tanto, la eliminacion de una metionina N-terminal, si se desea, puede lograrse in vivo mediante la expresion de dichas protefnas recombinantes en un huesped que produce MAP (por ejemplo, E. co/i o CM89 o S. cerevisiae), o in vitro mediante el uso de MAP purificada (por ejemplo, procedimiento de Miller et al.).
En los casos en que se utilizan vectores de expresion de plantas, la expresion de una fusion de protefnas de choque termico puede impulsarse por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores vfricos, tales como los promotores 35S ArN y 19S ARN de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature, 310:511-514), o el promotor de protefna de cubierta de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J., 6:307-311); como alternativa, se pueden usar promotores vegetales, tales como la subunidad pequena de RUBISCO (Coruzzi et al., 1994, EMBO J., 3:1671- 1680;Broglie et al., 1984, Science, 224:838-843); o promotores de choque termico, por ejemplo, Hsp 17.5-E o Hsp 17.3-B de soja (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6:559-565). Estas construcciones pueden introducirse en celulas vegetales usando plasmidos Ti, plasmidos Ri, vectores de virus de plantas; transformacion directa de ADN; microinyeccion, electroporacion, etc. Para revisiones de tales tecnicas veanse, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Nueva York, Seccion ViIi, pags. 421-463; y Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2a Ed., Blackie, Londres, Cap. 7-9.
Un sistema de expresion alternativo que puede utilizarse para expresar un marcador de protefnas o protefna de fusion que comprende un marcador de protefnas es un sistema de insecto. En uno de tales sistemas, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographs ca/ifornica (AcNPV) se utiliza como vector para expresar genes exogenos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. La secuencia de PGHS-2 puede clonarse en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y se coloca bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). La insercion exitosa de la secuencia codificante dara como resultado la inactivacion del gen de polihedrina y la produccion de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carecen de la cubierta proteica
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codificada por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes se utilizan despues para infectar celulas de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (por ejemplo, vease, Smith et al., 1983, J. Virol., 46:584, Smith,Pat. de Estados Unidos N.° 4.215.051).
En un caso especffico de un sistema de insectos, el ADN que codifica la protefna de fusion de protefnas de choque termico se clona en el vector de transferencia recombinante pBlueBacIII (Invitrogen, San Diego, Calif.) aguas abajo del promotor de polihedrina y se transfecta en celulas de insecto Sf9 (derivadas de celulas de ovario de Spodoptera frugiperda, disponibles de Invitrogen, San Diego, Calif.) para generar un virus recombinante. Despues de la purificacion de placas del virus recombinante, se preparan poblaciones vfricas de tftulo elevado que a su vez se usaran para infectar celulas de insecto Sf9 o High Five™ (celulas BTI-TN-5B1-4 derivadas de homogenados de ovocitos de Trichoplusia ni; disponible en Invitrogen, San Diego, Calif), para producir grandes cantidades de protefna objeto modificada apropiadamente despues de la traduccion.
En otros casos, la fusion de protefnas de choque termico y la protefna de union a biotina se pueden producir por separado y a continuacion unirse, por ejemplo, covalentemente entre sf. Por ejemplo, una fusion de protefnas de choque termico y protefna de union a biotina se producen por separado in vitro, se purifican, y se mezclan conjuntamente bajo condiciones en las que la etiqueta sera capaz de unirse a la protefna de interes. Por ejemplo, la protefna de choque termico y/o la protefna de union a biotina se pueden obtener (aislar) de una fuente en la que se sabe que se producen, pueden producirse y recogerse de cultivos de celulas, pueden producirse por clonacion y expresion de un gen que codifica la fusion de protefnas de choque termico deseada, o se pueden sintetizar qufmicamente. Ademas, una secuencia de acido nucleico que codifica la fusion de protefna de choque termico deseada se puede sintetizar qufmicamente. Dichas mezclas de protefnas conjugadas pueden tener propiedades diferentes de las protefnas de fusion individuales.
Los enlazadores (tambien conocidos como "moleculas de enlazador" o "agentes de reticulacion") pueden utilizarse para conjugar una protefna de choque termico y una protefna de union a biotina. Los enlazadores incluyen productos qufmicos capaces de reaccionar con un grupo qufmico definido de varias, por lo general dos, moleculas y asf conjugarlos. La mayorfa de los agentes de reticulacion conocidos reaccionan con grupos amina, carboxilo, y sulfhidrilo. La eleccion del grupo qufmico diana es crucial si el grupo puede estar implicado en la actividad biologica de las protefnas a conjugar. Por ejemplo, las maleimidas, que reaccionan con grupos sulfhidrilo, pueden inactivar peptidos o protefnas que comprenden Cys que requieren la Cys para unirse a una diana. Los enlazadores pueden ser homofuncionales (que comprenden grupos reactivos del mismo tipo), heterofuncionales (que comprenden diferentes grupos reactivos), o fotorreactivos (que comprenden grupos que se convierten en reactivos con la luz).
Las moleculas de enlazador pueden ser responsables de diferentes propiedades de las composiciones conjugadas. La longitud del enlazador debe considerarse a la luz de la flexibilidad molecular durante la etapa de conjugacion, y la disponibilidad de la molecula conjugada para su diana (moleculas de superficie celular y similares). Por lo tanto, los enlazadores mas largos pueden mejorar la actividad biologica de las composiciones de la presente invencion, asf como la facilidad de preparacion de las mismas. La geometrfa del enlazador se puede usar para orientar una molecula para la reaccion optima con una diana. Un enlazador con geometrfa flexible puede permitir que las protefnas reticuladas adapten su conformacion al unirse a otras protefnas. La naturaleza del enlazador puede alterarse para otros fines diversos. Por ejemplo, la estructura de arilo de MBuS se encontro que era menos inmunogena que el espaciador aromatico de mBs. Ademas, la hidrofobicidad y la funcionalidad de las moleculas de enlazador pueden controlarse por las propiedades ffsicas de las moleculas componentes. Por ejemplo, la hidrofobicidad de un enlazador polimerico puede controlarse por el orden de unidades monomericas a lo largo del polfmero, por ejemplo, un polfmero de bloque en el que hay un bloque de monomeros hidrofobos intercalados con un bloque de monomeros hidrofilos.
La qufmica de la preparacion y la utilizacion de una amplia diversidad de enlazadores moleculares se conoce bien en la tecnica y muchos enlazadores prefabricados para su uso en la conjugacion de moleculas estan disponibles comercialmente en proveedores tales como Pierce Chemical Co., Roche Molecular Biochemicals, United States Biological, y similares.
La protefna de choque termico preparada y/o aislada fusionada a una protefna de union a biotina debe administrarse a un sujeto junto con los componentes biotinilados deseados, suficiente para formar una asociacion no covalente del resto de biotina con la protefna de union a biotina. La fusion de protefna de choque termico y el componente o componentes biotinilados se pueden administrar simultanea o secuencialmente. Si se administra simultaneamente, la fusion de protefna de choque termico y el componente o componentes biotinilados se pueden administrar como una mezcla o como un complejo no covalente. Si se administra como un complejo no covalente, una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina puede unirse no covalentemente a los componentes biotinilados deseados ya sea in vitro o in vivo una vez preparados y/o aislados.
El complejo no covalente puede producirse poniendo en contacto la protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina con los componentes biotinilados, en condiciones suficientes para promover la union de la protefna de union a biotina con biotina, condiciones que son conocidas en la tecnica.
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Los genes para diversas protefnas de choque termico se han clonado y secuenciado, y que se pueden usar para obtener una fusion de protefna de choque termico, incluyendo, pero sin limitacion, gp96 (humano: Acceso al Genebank N.° X15187;Maki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5658-5562 (1990); raton: Acceso al Genebank N.° M16370;Srivastava et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3807-3811 (1987)), BiP (raton: Acceso al Genebank N.° U16277;Haas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2250-2254 (1988); humano: Acceso al Genebank N.° M19645;Ting et al., ADN 7:275-286 (1988)), hsp70 (raton: Acceso al Genebank N.° M35021;Hunt et al., Gene 87:199-204 (1990); humano: Acceso al Genebank N.° M24743;Hunt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:6455-6489 (1995)), y hsp40 (humano: Acceso al Genebank N.° D49547;Ohtsuka K., Biochem. Biophys. Res. Commun. 197:235240 (1993)).
La protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina puede estar unida de forma no covalente al componente biotinilado.
El componente a administrar junto con la protefna de choque termico que comprende la protefna, celula o virus puede conjugarse con biotina por medios tales como los conocidos en la tecnica. Antes de la conjugacion con biotina, la protefna, celula o virus puede producirse y/o aislarse usando metodos conocidos en la tecnica. Se pueden emplear tecnicas recombinantes de forma muy similar a la descrita en el presente documento para la fusion de protefna de choque termico. Una vez que el componente se produce y/o se afsla, una molecula o moleculas de biotina se pueden conjugar directamente a una protefna, celula o virus. La biotina tambien se puede conjugar indirectamente a traves de un enlazador a dicha protefna, celula o virus. La biotina se conjugara a una region que permite estericamente la interaccion de biotina con la protefna de union a biotina. Los kits y reactivos de biotinilacion pueden adquirirse en Pierce (Rockford, IL) y usarse para generar los componentes biotinilados descritos en el presente documento.
Las secuencias de muchos antfgenos diferentes se pueden clonar y caracterizar mediante analisis de la secuencia de ADN e incluirse en las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los vectores bacterianos que contienen genomas o antfgenos celulares o vfricos completos o parciales se pueden obtener a partir de diversas fuentes que incluyen, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Los antfgenos adicionales que pueden usarse pueden aislarse y tipificarse mediante los metodos previamente establecidos para este fin, metodos que se conocen bien en la tecnica.
Metodos de uso de la fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados
La fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados que se describen en el presente documento pueden administrarse a un sujeto para inducir o potenciar la respuesta inmune de ese sujeto, en particular una respuesta citolftica mediada por celulas, contra una celula que expresa un antfgeno contra el que estan dirigidos los componentes biotinilados. La protefna de fusion puede simplemente aumentar la respuesta inmune (sirviendo asf como composicion inmunogena), o conferir inmunidad protectora (sirviendo asf como una vacuna).
Por lo tanto, la fusion de protefnas de choque termico y los componentes biotinilados producidos como se ha descrito anteriormente se pueden purificar hasta una pureza adecuada para su uso como una composicion farmaceutica. Generalmente, las composiciones purificadas tendran una especie que comprende mas de aproximadamente el 85 por ciento de todas las especies presentes en la composicion, mas de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o mas de todas las especies presentes. La especie objeto se puede purificar hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composicion mediante procedimientos de deteccion convencionales) donde la composicion consiste esencialmente en una sola especie. Un experto en la tecnica puede purificar una protefna de choque termico y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, utilizando tecnicas estandar para la purificacion de protefnas, por ejemplo, cromatograffa de inmunoafinidad, cromatograffa de exclusion de tamano, etc. a la luz de las ensenanzas del presente documento. La pureza de una protefna puede determinarse por varios metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo por ejemplo, analisis de la secuencia de aminoacidos amino-terminal, la electroforesis en gel y el analisis de espectrometrfa de masas.
Por consiguiente, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden la fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos. En un aspecto, se proporcionan composiciones farmaceuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una o mas de las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento, que se formulan junto con uno o mas vehfculos (aditivos) y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables. En otro aspecto, en ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar como tal o en mezclas con vehfculos farmaceuticamente aceptables y tambien se pueden administrar junto con otros agentes. Por lo tanto, la terapia conjuntiva (de combinacion) incluye la administracion secuencial, simultanea y separada, o coadministracion de tal forma que los efectos terapeuticos del primero administrado no hayan desaparecido por completo cuando se administra el siguiente.
La fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, como se describe en el presente documento, se pueden administrar a un sujeto en una diversidad de maneras. Las
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vfas de administracion incluyen sistemica, periferica, parenteral, enterica, topica y transdermica (por ejemplo, polfmeros de liberacion lenta). Se puede utilizar cualquier otra via de administracion conveniente, por ejemplo, infusion o inyeccion en bolo, o absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos. Ademas, las composiciones descritas en el presente documento pueden contener y administrarse junto con otros componentes farmacologicamente aceptables, tales como agentes biologicamente activos (por ejemplo, adyuvantes como alumbre), tensioactivos (por ejemplo, gliceridos), excipientes (por ejemplo, lactosa), portadores, diluyentes y vehfculos. Ademas, las composiciones pueden utilizarse ex vivo como medio de estimulacion de globulos blancos obtenidos de un sujeto para producir, expandir y propagar celulas inmunes especfficas de antfgeno in vitro que son reintroducidas posteriormente en el sujeto.
Ademas, una protefna de fusion de protefnas de choque termico puede administrarse mediante la expresion in vivo de un acido nucleico que codifica tales secuencias de protefna en un sujeto humano. La expresion de tal acido nucleico y el contacto con componentes biotinilados tambien se puede lograr ex vivo como medio de estimulacion de los globulos blancos obtenidos de un sujeto para producir, expandir y propagar celulas inmunes especfficas de antfgeno in vitro que son reintroducidas posteriormente en el sujeto. Los vectores de expresion adecuados para dirigir la expresion de protefnas de fusion de protefnas de choque termico se pueden seleccionar entre la gran diversidad de vectores que se utilizan actualmente en el campo. Son preferibles los vectores que son capaces de producir altos niveles de expresion, asf como son eficaces en la transduccion de un gen de interes. Por ejemplo, se pueden utilizar el vector de adenovirus recombinante PJM 17 (All et al., Gene Therapy 1:367-84 (1994);Berkner K. L., Biotechniques 6:616-24 1988), los vectores de adenovirus de segunda generacion DE1/DE4 (Wang and Finer, Nature Medicine 2:714-6 (1996)), o el vector vfrico adeno-asociado AAV/Neo (Muro-Cacho et al., J. Immunotherapy 11:231-7 (1992)). Ademas, pueden emplearse vectores retrovfricos recombinantes MFG (Jaffee et al., Cancer Res. 53:2221-6 (1993)) o LN, LNSX, LNCX, LXSN (Miller y Rosman, Biotechniques 7:980-9 (1989)). Los vectores basados en virus del herpes simple, tal como pHSV1 (Geller et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 87:8950-4 (1990) o vectores vfricos de vaccinia, tal como mVa (Sutter y Moss. Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:10847-51 (1992)) pueden servir como alternativas.
Las unidades de expresion especffica utilizadas con frecuencia que incluyen secuencias de promotor y 3' son las encontradas en el plasmido CDNA3 (Invitrogen), plasmido AH5, pRC/CMV (Invitrogen), pCMU II (Paabo et al., EMBO J. 5:1921-1927 (1986)), pZip-Neo SV (Cepko et al., Cell 37:1053-1062 (1984)) y pSRa (ADN X, Palo Alto, CA). La introduccion de genes en las unidades de expresion y/o vectores puede conseguirse utilizando tecnicas de manipulacion genetica, como se describe en los manuales como Molecular Cloning and Current Protocols in Molecular Biology (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989);Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989)). Un acido nucleico expresable resultante se puede introducir en celulas de un sujeto humano mediante cualquier metodo capaz de colocar el acido nucleico en celulas en una forma expresable, por ejemplo, como parte de un vector vfrico tal como se ha descrito anteriormente, como plasmido desnudo u otro aDn, o encapsulado en liposomas dirigidos o fantasmas de eritrocitos (Friedman, T., Science, 244:1275-1281 (1989);Rabinovich, N.R. et al., Science. 265:14011404 (1994)). Los metodos de transduccion incluyen la inyeccion directa en tejidos y tumores, la transfeccion liposomica (Fraley et al., Nature 370:111-117 (1980)), endocitosis mediada por receptores (Zatloukal et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:136-153 (1992)), y la transferencia de genes mediada por bombardeo de partfculas (Eisenbraun et al., ADN & Cell. Biol. 12:791-797 (1993)).
La cantidad de fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, en las composiciones de la presente invencion es una cantidad que produce una respuesta inmunoestimuladora eficaz en un sujeto. Una cantidad eficaz es una cantidad tal que cuando se administra, induce una respuesta inmune. Ademas, la cantidad de fusion de protefnas de choque termico y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, administrada al sujeto variara dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo la fusion de protefnas de choque termico y el componente biotinilado empleados, el tamano, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, asf como de su capacidad de respuesta inmunologica general. El ajuste y la manipulacion de los intervalos de dosis establecidos estan dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la cantidad de fusion de protefnas de choque termico, componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, puede ser de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 1 gramo, preferiblemente de aproximadamente 100 microgramos a aproximadamente 1 gramo, y de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 1 gramo. Una cantidad eficaz de una composicion que comprende un vector de expresion es una cantidad tal que cuando se administra, induce una respuesta inmune contra el antfgeno contra el que se dirige la composicion farmaceutica. Ademas, la cantidad de vector de expresion administrado al sujeto variara dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo la fusion de protefnas de choque termico expresada, el tamano, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, asf como de su capacidad de respuesta inmunologica general. Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta son la ruta de aplicacion y el tipo de vector utilizado. Por ejemplo, cuando el tratamiento profilactico o terapeutico se realiza con un vector vfrico que contiene un acido nucleico que codifica una fusion de protefnas de choque termico, la cantidad eficaz estara en el intervalo de 104a 1012 de virus de replicacion defectuosa libre de agente auxiliar por kg de peso corporal, preferiblemente en el intervalo de 105a 1011 de virus por kg de peso corporal, y mucho mas preferiblemente en el intervalo de 106a 1010 de virus por kg de peso corporal.
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La determinacion de una cantidad eficaz de protefna de fusion y componentes biotinilados, o un complejo no covalente de los mismos, para inducir una respuesta inmune en un sujeto esta dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica, especialmente a la luz de la descripcion detallada proporcionada en el presente documento.
Puede estimarse una dosis eficaz inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir la induccion de una respuesta inmune usando tecnicas que son bien conocidas en la tecnica. Un experto en la tecnica podrfa optimizar facilmente la administracion a humanos en base a los datos en animales. La cantidad e intervalo de dosificacion pueden ajustarse individualmente. Por ejemplo, al usarse como una vacuna, las protefnas y/o cepas de la invencion se pueden administrar en aproximadamente 1 a 3 dosis durante un perfodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, se administran 3 dosis, a intervalos de aproximadamente 3 a 4 meses, y las vacunas de refuerzo se pueden administrar periodicamente a partir de entonces. Pueden ser apropiados protocolos alternativos para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de protefna o cepa que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de aumentar una respuesta inmune en un paciente inmunizado de forma suficiente para proteger al paciente de la afeccion o infeccion durante al menos 1-2 anos.
Las composiciones tambien pueden incluir adyuvantes para mejorar la respuesta inmune. Ademas, dichas protefnas pueden suspenderse adicionalmente en una emulsion en aceite para causar una liberacion mas lenta de las protefnas in vivo despues de la inyeccion. Las proporciones optimas de cada componente en la formulacion se pueden determinar mediante tecnicas bien conocidas para los expertos en la tecnica.
Se pueden emplear cualquiera de una diversidad de adyuvantes en las vacunas de esta invencion para mejorar la respuesta inmune. La mayorfa de los adyuvantes contiene una sustancia disenada para proteger el antfgeno del catabolismo rapido, tal como hidroxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador especffico o no especffico de la respuesta inmune, tal como lfpido A, o Bortadella pertussis. Los adyuvantes adecuados estan disponibles comercialmente e incluyen, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories) y Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lfpido A, quil A, SBAS1c, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7, Al(OH)3y el oligonucleotido (documento WO96/02555).
En las vacunas de la presente invencion, el adyuvante puede inducir una respuesta inmune de tipo Th1. Los sistemas adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinacion de monofosforil lfpido A, preferiblemente monofosforil lfpido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema potenciado implica la combinacion de un monofosforil lfpido A y un derivado de saponina, particularmente la combinacion de 3D-MLP y la saponina QS21 como se describe en el documento WO 94/00153, o una composicion menos reactogenica donde QS21 se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739. Los experimentos anteriores han demostrado un claro efecto sinergico de las combinaciones de 3D-MLP y QS21 en la induccion de respuestas inmunes celulares tanto humorales como de tipo Th1. Una formacion de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MLP y tocoferol en una emulsion de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y puede comprender una formulacion.
Kits
La presente descripcion proporciona kits para la expresion o administracion de una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina. Dichos kits pueden comprender acidos nucleicos que codifican una protefna de choque termico condensada a una protefna de union a biotina. Los acidos nucleicos pueden estar incluidos en un plasmido o un vector, por ejemplo, un plasmido bacteriano o vector vfrico. Otros kits comprenden una protefna de choque termico condensada a una protefna de union a biotina. Ademas, la presente descripcion proporciona kits para la produccion y/o purificacion de una protefna de choque termico condensada a una protefna de union a biotina. Dichos kits pueden incluir opcionalmente componentes biotinilados o reactivos de biotinilacion como se describe en el presente documento.
La presente descripcion proporciona kits para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa, inflamatoria o neoplasica en un paciente. Por ejemplo, un kit puede comprender una o mas composiciones farmaceuticas como se ha descrito anteriormente y, opcionalmente, instrucciones para su uso. En aun otros casos, la descripcion proporciona kits que comprenden una o mas composiciones farmaceuticas y uno o mas dispositivos para realizar la administracion de dichas composiciones.
Los componentes del kit se pueden envasar, ya sea para la practica manual, o parcial o totalmente automatizada de los metodos anteriores. En otros casos que implican los kits, se pueden proporcionar instrucciones para su uso.
EJEMPLIFICACION
La invencion que se describe ahora en general, se entendera mas facilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen meramente con fines de ilustracion de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion, y no estan destinados a limitar la invencion de ninguna manera.
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La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa celular, cultivo celular, biologfa molecular, biologfa transgenica, microbiologfa, ADN recombinante, e inmunologfa, que estan dentro de los conocimientos de la tecnica. Tales tecnicas se describen en la bibliograffa. Veanse, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); ADN Cloning, Volumenes I y II (D. N. Glover ed., 1985);Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984);Mullis et al. Patente de Estados Unidos N.° 4.683.195;Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado,Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155 (Wu et al. eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987);Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Ejemplo 1
i) Produccion de MTBhsp70
MTBhsp70 se subclono en el vector de expresion pET45b(+) modificando primero el vector para introducir el sitio de restriccion deseado SfiI. Esta modificacion permite la introduccion de la protefna MTBhsp70 en el sitio NotI/XhoI y otras protefnas tales como scFv, antfgenos, Avidina, etc. en el sitio SfiI/NotI (FIGURA 1). Este enfoque particular puede modificarse para introducir las protefnas deseadas en el extremo C-terminal de MTBhsp70. Usando el plasmido MTBhsp70 proporcionado por el Dr. Richard Young, se introdujeron los sitios de restriccion NotI y XhoI en los extremos 5' y 3', respectivamente, como se describe en la FIGURA 2.
La digestion del fragmento amplificado de MTBhsp70 mostrado en el carril 1 de la FIGURA 2 con las enzimas de restriccion NotI y XhoI revelo inesperadamente 2 bandas (FIGURA 3). Los analisis de secuenciacion revelaron que MTBhsp70 contiene sitios de restriccion internos NotI y SfiI. Estos se eliminaron usando la estrategia representada en la FIGURA 4. La construccion MTBhsp70 pET-45b(+) resultante se uso a continuacion para transformar las bacterias BL21(DE3) competentes. La expresion de MTBhsp70 se indujo anadiendo IPTG 1 mM. Las celulas se cultivaron en medio LB a 37 °C hasta una DO600 de 0,5. Las celulas se centrifugaron y se suspendieron en medio LB que contenfa IPTG 1 mM y el crecimiento continuo durante 4 horas a la temperatura indicada. Las celulas se fraccionaron y se realizaron alfcuotas en SDS-PAGE, y las protefnas se tineron con azul de Coomassie. Cuando las celulas inducidas se cultivaron a 37 °C, la mayor parte de la protefna MTBhsp70 se encontro en cuerpos de inclusion insolubles. Al reducir la temperatura de crecimiento posterior a la induccion a 30 °C, se produjeron grandes cantidades de MTBhsp70 soluble. La protefna MTBhsp70 encontrada en las fracciones solubles y periplasmicas de BL21(DE3) cultivadas a 30 °C se purifico satisfactoriamente mediante cromatograffa de afinidad metalica (MAC) usando columnas de centrifugacion de cobalto. Las celulas se cultivaron a 37 °C hasta una DO600 de 0,5 y luego se centrifugaron. Las celulas se suspendieron en medio de crecimiento que contenfa IPTG 1 mM y se dejaron crecer durante 4 horas a 30 °C. Las celulas se fraccionaron segun los metodos estandar que consisten en la solubilizacion con reactivo B-PER de Pierce.
ii) Produccion de protefnas de fusion MTBhsp70
Con el fin de demostrar las propiedades inmunoestimuladoras de las protefnas de fusion MTBhsp70, se construyeron un peptido de Ovoalbumina-MTBhsp70 y dos productos de fusion scFv-MTBhsp70.
1. a. Protefna de fusion Ova-257-264-MTBhsp70.El grupo del Dr. Young establecio que el peptido inmunodominante de la Ovoalbumina consistfa en los residuos 257-264 (SIINFEKL). Este peptido se fusiono a la region N-terminal de MTBhsp70 digiriendo el plasmido MTBhsp70 pET-45b(+) con SfiI y NotI e introduciendo un enlazador que codifica el peptido inmunodominante que tambien se digiere con SfiI y NotI (FIGURA 5). Tras la ligacion, se obtuvieron varias colonias, y sus identidades se confirmaron por secuenciacion (FIGURA 6). Como se observo con MTBhsp70, la induccion de Ova-257-264-MTBhsp70 es optima cuando la temperatura de crecimiento, induccion post-IPTG, se mantiene a 30 °C. La expresion exitosa de Ova254-264-MTBhsp70 se obtuvo en la fraccion soluble de BL21(DE3).
2. b. Protefnas de fusion scFv-MTBhsp70.scFv se fusionaron al extremo N-terminal de MTBhsp70. Se construyo una biblioteca de presentacion de fagos scFv combinatoria humana y se uso para seleccionar scFv especfficos de Ovalbumina. El otro scFv, MOV18, es especffico para el receptor de folato de alta afinidad expresado en celulas de cancer de ovario. El metodo de clonacion es similar al enfoque utilizado para la introduccion del peptido Ova254-264 en el N-terminal de MTBhsp70. La porcion SfiI/NotI scFv se purifico a partir de sus plasmidos respectivos, seguido de ligacion en el vector de expresion digerido con SfiI/NotI MTBhsp70 pET-45b(+). Los scFv anti-Ovoalbumina tenfan varias mutaciones sin sentido que debfan eliminarse mediante mutagenesis de sitio dirigido. Sin embargo, tras la induccion de bacterias que portaban ambas construcciones, se descubrio que la induccion con IPTG daba como resultado que las protefnas de fusion se expresaran en cuerpos de inclusion.
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iii) Produccion de Avidina-Enlazador-MTBhsp70
Se puede usar una fusion de Avidina con un elemento de enlazador y con MTBhsp70 para la produccion de una vacuna de autoensamblaje. Esto se ilustra en la FIGURA 7, donde la porcion de enlazador se ilustra como una linea entre Avidina y protefnas de choque termico. La avidina es una protefna glicosilada homotetramerica con un peso molecular de 68.000 (por lo tanto, cada subunidad es de 17.000 dalton). La forma de tipo silvestre (tetramerica) o monomerica descrita por el Dr. Markku S. Kulomaa se puede producir y usar como se proporciona en el presente documento. Estas moleculas se describen de acuerdo con el esquema de la FIGURA 8. La forma monomerica de avidina difiere del tipo silvestre en posiciones de 5 aminoacidos. Esto se ilustra en la FIGURA 9. Se uso una serie de cebadores y enlazadores para ensamblar cada construccion de Avidina.
Las mutaciones menores se corrigieron mediante mutagenesis basada en PCR. Esto se ilustra en la FIGURA 10, que muestra dos cambios que se realizaron en la avidina monomerica (clon M1). Ambas construcciones monomericas y de tipo salvaje de Avidina-enlazador-MTBhsp70 se obtuvieron con exito como se muestra en la FIGURA 11. Ambas construcciones conducen a una abundante produccion de protefnas tras la induccion con IPTG en E. coli BL21(DE3). Sin embargo, las protefnas Avidina-enlazador-MTBhsp70 inducidas se encuentran principalmente en cuerpos de inclusion, que pueden solubilizarse, desnaturalizarse y replegarse.
Despues de la desnaturalizacion con clorhidrato de guadinio y DTT, las protefnas se diluyen en 4 tampones de replegamiento diferentes (1) Tween 40, cistina; 2) Tween 60, cistina; 3) CTAB, cistina; 4) SB3-14, cistina) que contiene cistina para inactivar el exceso de DTT. Despues de la adicion de una solucion de CA al 3 %, las protefnas se vuelven a plegar durante la noche a temperatura ambiente. Para evaluar el nivel de replegamiento, se anadieron alfcuotas de protefna replegadas a los pozos revestidos con biotina. Por lo tanto, las protefnas Avidina-enlazador- MTBhsp70 replegadas adecuadamente se uniran estrechamente al fondo de esos pocillos. La cantidad de protefnas unidas a placa se determino usando un anticuerpo monoclonal contra MTBhsp70 seguido de la deteccion de anti- MTBhsp70 unido usando anticuerpos de cabra anti-raton (H + L) marcados con Peroxidasa de rabano picante (HRP). La densidad optica se registro a 450 nm y expreso los resultados como la senal maxima porcentual. Los resultados se representan en la FIGURA 12. El replegamiento apropiado de cada protefna puede incluir someter a cada protefna a diferentes condiciones. Con el fin de evaluar la actividad biologica de la porcion de MTBhsp70 replegada de estas protefnas, se puede medir su capacidad para hidrolizar ATP. Ademas, se pueden determinar los efectos quimiotacticos de MTBhsp70 en celulas THP-1.
Ejemplo 2
El autoensamblaje y las actividades biologicas de las protefnas m/wAvidina-Enlazador-N-MTBhsp70 se pueden determinar de la siguiente manera:
1. 1) Determinacion de la actividad de ATPasa. La porcion N-terminal de MTBhsp70 es conocida por hidrolizar ATP bajo ciertas condiciones de ensayo. El replegamiento apropiado de nuestras protefnas m/wAvidina- Enlazador-N-MTBhsp70 puede evaluarse comparando su actividad de ATPasa con la de una preparacion comercial y nuestra propia MTBhsp70.
2. 2) Determinacion de la actividad quimiotactica/induccion de la produccion de quimiocinas.
Otro ensayo de replegamiento apropiado de la porcion MTBhsp70 de estas protefnas m/wAvidina- Enlazador-N-MTBhsp70 es su induccion exitosa de quimiocinas CC de la linea celular THP-1. Se sabe que la exposicion de la linea celular de monocitos THP-1 a MTBHhsp70 induce la produccion de RANTES, MIP- 1a y MIP-1p. A su vez, estas quimiocinas debenan estimular la actividad quimiotactica.
3. 3) Autoensamblaje. Las protefnas replegadas m/wAvidina-Enlazador-N-MTBhsp70 se unen a la biotina. Para demostrar el autoensamblaje, se puede demostrar la capacidad de estas protefnas para formar un complejo estable con moleculas biotiniladas. Se puede demostrar la union a Ovalbumina biotinilada y eGFP biotinilada. El ensamblaje exitoso se evalua mediante inmunoprecipitacion con anti-MTBhsp70 y antfgeno anti-biotinilado.
4. 4) Induccion in vivo de inmunidad. La actividad inmunoestimuladora de las vacunas autoensambladas puede demostrarse midiendo la activacion de los linfocitos T CD8 tras la inmunizacion de ratones C57BL/6 con Ovoalbumina-m/wAvidina-Enlazador-N-MTBhsp70 biotinilado y Ova257-264-m/wAvidina-Enlazador-N- MTBhsp70 biotinilada.
Ejemplo 3
Una construccion de MTBHSP70 con avidina autoensamblada con HRP biotinilada y anticuerpos anti-OVA biotinilados
Procedimientos
i) Construcciones plasmfdicas
Se subclono MTBHSP70 en el vector de expresion pET45b(+) y luego se unio el peptido de Ovalbumina especffico de CD8 (Ova257-264) en el extremo N-terminal. La avidina y la avidina monomerica basadas en secuencias
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publicadas se ensamblaron y se unieron en el extremo N-terminal de MTBHSP70 en el vector de expresion pET45b(+).
ii) Expresion y purificacion de protefnas
Se transformo E. coli BL21(DE3) con las diversas construcciones y se indujo la expresion mediante la adicion de IPTG. Las protefnas se purificaron por IMAC en presencia de TritonX-114 (Sigma) para eliminar endotoxinas.
iii) Inmunizaciones
Se inmunizaron ratones machos C57BL/6 con Ovoalbumina u Ova257-264-L-MTBHSP70 por via subcutanea y se sacrificaron el dfa 30.
iv) Mediciones de resultado
1. a. Interferon-Y.Despues de 2 inmunizaciones subcutaneas, se sacrificaron los ratones el dfa 30 y se prepararon esplenocitos. Los esplenocitos (2 x 106 por pocillo) se incubaron a 37 °C durante 4 horas en presencia de brefeldina A (tapon de Golgi) y peptido Ova257-264 o un peptido irrelevante. La incubacion se detuvo lavando las celulas con FBS al 5 % en PBS seguido de tincion de CD3, CD4, CD8 e Interferon-y despues de que las celulas se permeabilizaron con la solucion Cytofix/Cytoperm de BD. La tincion celular se evaluo mediante citometrfa de flujo y se analizo utilizando FlowJo.
2. b. Tincion de pentamero.Las celulas se trataron como se ha descrito anteriormente con la adicion de que se trataron inicialmente con MHC Pentamer H-2Kb SIINFEKL murino recombinante conjugado con R-PE (de PROIMMUNE).
3. c. Autoensamblaje.Se utilizo un ensayo basado en ELISA. Se mezclaron diversas concentraciones de peroxidasa de rabano picante (HRP) biotinilada y avidina-MTBHSP 70 purificada y replegada. La mezcla se anadio a placas His-Grab (ThermoScientific) y se elimino la HRP biotinilada no unida mediante lavado con PBS al 0,1 % Tween 20 seguido de la adicion de TMB. La reaccion se detuvo despues de 20 minutos y los resultados se leyeron a 450 nm.
Resultados
Se expresaron protefnas de fusion 6 x His-MTBHSP 70 y 6 x His-Ova (257-264) -MTBHSP 70 en celulas E. coli BL21(DE3). En cada caso, se usaron fragmentos NotI-XhoI MTBHsp70 en las construcciones de fusion. La expresion de protefna se indujo mediante la adicion de IPTG. Las celulas se lisaron y se fraccionaron en fracciones solubles (n.° 1 y n.° 4), periplasmicas (n.° 2 y n.° 5) y cuerpos de inclusion. Se sometieron alfcuotas de cada una de las fracciones a SDS-PAGE desnaturalizante sobre el 4-12 % de geles de Bis-Tris NUPAGE (Invitrogen).
i) Expresion de avidina y avidina monomerica unida a MTBHSP70 en£. coli
Se ensamblaron Avidina de tipo silvestre (wAvidina) y Avidina monomerica y se clonaron en pET45b(+). Se prepararon construcciones de fusion que consistfan en 6 x His-Avidina unidas en el extremo N-terminal de MTBHSP 70. Cada construccion de plasmido se uso para transformar E. coli BL21(DE3) y la expresion se indujo con IPTG.
ii) Inmunizacion n.° 1
Se inmunizaron ratones machos C57BL/6 por via subcutanea los dfas 1 y 17 y se sacrificaron el Dfa 30 de la siguiente manera:
• Ovoalbumina + CFA
• Ovoalbumina
• Ovoalbumina + MTBhsp70
• Ovapeptido-MTBhsp70
iii) Medicion del resultado
Se midio la produccion de interferon gamma tras la estimulacion de esplenocitos con el peptido CD8 SIINFEKL (Ova257-264), y los resultados se muestran en la FIGURA 16 y la Tabla 1 a continuacion.
Tabla 1. Porcentaje de esplenocitos CD+8 que producen interferon-Y tras la estimulacion con Ova 257-264
Porcentaje de CD8+IfnY+(menos no estimulado)
CFA
0,39
Ovoalbumina
0,09
Ovoalbumina + MTBhsp70
0,23
Ovapeptido-MTBhsp70
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iv) Inmunizacion n.° 2
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (macho) por via subcutanea como se describe para la inmunizacion n.° 1. Los grupos de inmunizacion fueron los siguientes:
• Grupo A CFA + ovoalbumina (3 ratones)
• Grupo B CFA + Ovapeptido (257-264) (3 ratones)
• Grupo C fusion de Ovapeptido-MTBhsp70 (3 ratones)
• Grupo D Ovapeptido + MTBhsp70 (3 ratones)
• Grupo E MTBhsp70 (3 ratones)
• Grupo F solucion salina 1 raton
v) Medicion del resultado
Se recogieron esplenocitos y se tineron con CD3, CD4, CD8 y H-2Kb/Pentamero SIINFEKL (OVA) de Prolmmune.
vi) Conclusion
Las construcciones de protefna de fusion HSP se desarrollaron y expresaron en E. coli.La fusion de Ovapeptido 257264 al extremo N-terminal de MTBHSP 70 dio como resultado una expansion exitosa de linfocitos T especfficos de antfgeno segun se midio mediante la produccion de Interferon-Y y la tincion con H-2Kb/SIINFEKL (OVA).
Ejemplo 4
Construcciones modificadas para incluir Avidina en el extremo N o C-terminal de MTBHSP 70.
i) Medicion del autoensamblaje
Se evaluo el autoensamblaje de la protefna de fusion Avidina-MTBHSP 70 con peroxidasa de rabano picante biotinilada (HRP) usando ELISA de placa His-Grab. Los cuerpos de inclusion se solubilizaron con cloruro de guanidio y se dializaron lentamente frente a tampon que contenfa concentraciones decrecientes de guanidinio. La protefna parcialmente replegada se incubo con diferentes cantidades de HRP biotinilada antes de ser anadida a una placa His-Grab. La placa se leyo a 450 nm.
ii) Evaluacion del direccionamiento de una vacuna autoensamblada
El direccionamiento de la vacuna autoensamblada se evaluo mediante citometrfa de flujo. La protefna Avidina MTBHSP 70 parcialmente replegada se incubo con anticuerpos anti-Ovoalbumina biotinilados y el complejo se capturo en perlas magneticas especfficas de His. Despues de eliminar el exceso de anticuerpos, se anadio Ovoalbumina marcada con Alexa Fluor 555. Las muestras se analizaron mediante citometrfa de flujo en el canal R- PE. Se observo una diferencia muy debil en comparacion con las perlas solos. El autoensamblaje dirigido se confirmo por analisis estadfsticos.
iii) Conclusion
Las protefnas de fusion que consisten en antfgenos peptfdicos o avidina en el extremo N de MTBHSP 70 se han expresado con exito. La inmunizacion con Ovapeptido (257-264) fusionada en el marco del extremo N-terminal de MTBHSP 70 condujo a la induccion de una respuesta inmune especffica de antfgeno medida por la produccion de interferon gamma y la expansion de linfocitos T CD8+ (tincion de pentamero). Tambien se disenaron construcciones que expresan avidina en el extremo N o C-terminal de MTBHSP 70, permitiendo asf el autoensamblaje de esta construccion con anticuerpos biotinilados clfnicamente relevantes. Las protefnas de fusion de avidina se expresaron con exito en E. coli, pero se encontraron en cuerpos de inclusion. El replegamiento de estas protefnas fue parcialmente exitoso y actualmente se esta optimizando. El autoensamblaje de baja eficacia de MTBHSP70-avidina con anticuerpo monoclonal biotinilado se demostro en experimentos preliminares.
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Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion farmaceutica que comprende una protefna de choque termico fusionada a una

    protefna de union a biotina, donde la protefna de union a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la

    protefna de union a biotina es una protefna que es al menos un 80 % identica a avidina o estreptavidina; y la

    protefna de union a biotina se une de forma no covalente a un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado, o
    cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos.
  2. 2. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, donde la protefna de union a biotina se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina y neutravidina.
  3. 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, donde la protefna de choque termico es una protefna de choque termico de mamffero o una protefna de choque termico bacteriana.
  4. 4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, donde la protefna de choque termico se selecciona del grupo que consiste en una protefna de choque termico MTBhsp70 y una protefna de choque termico humana.
  5. 5. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una vacuna.
  6. 6. Un metodo para producir una composicion farmaceutica de autoensamblaje de una cualquiera de las
    reivindicaciones 1-5, que comprende poner en contacto una protefna de choque termico fusionada a una protefna de union a biotina con un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado, o cuatro componentes biotinilados, donde al menos dos de los cuatro componentes biotinilados no son identicos,
    suficiente para formar un complejo no covalente de la protefna de choque termico, y el anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado o los cuatro componentes biotinilados.
  7. 7. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en terapia.
  8. 8. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la induccion
    de una respuesta inmune en un sujeto.
  9. 9. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el aumento de la potencia de un producto terapeutico en un sujeto.
  10. 10. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 9, donde la protefna de union a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la protefna de union a biotina es una protefna que es al menos un 90 % identica a avidina o estreptavidina.
  11. 11. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 10, donde la protefna de union a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la protefna de union a biotina es una protefna que es al menos un 95 % identica a avidina o estreptavidina.
  12. 12. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 11, donde la protefna de union a biotina es avidina, estreptavidina, neutravidina, o la protefna de union a biotina es una protefna que es al menos un 99% identica a avidina o estreptavidina.
  13. 13. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 12, donde la protefna de union a biotina esta unida de forma no covalente a un anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado.
  14. 14. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 13, donde el anticuerpo manipulado monoclonal biotinilado es un fragmento de anticuerpo monoclonal biotinilado que comprende un sitio de union a antfgeno.
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