CN102065880A - 使用自我装配疫苗的免疫治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供自我装配的药物组合物，所述组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与4个生物素化组分非共价结合，而且其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

Description

使用自我装配疫苗的免疫治疗

相关申请

本申请要求于2008年4月18日申请的美国临时申请顺序号61/046,195的优先权，所述临时申请的全部内容都通过引用结合到本文中。

背景

用疫苗进行免疫接种一直是对抗疾病和感染威胁的保护作用的基础。在疫苗开发上的主要困难是针对特定威胁而快速匹配疫苗或抗毒素。当前的疫苗开发策略依赖于对所针对的抗原的鉴定和表征，以成功消除感染或疾病。当前的疫苗开发策略是时间密集型和劳动密集型的并且只能在一旦出现威胁时才开始着手。对于产生个性化疫苗，以抗击在不同个体中靶抗原不同的疾病而言，这样的策略也是不实用的。因此，如果发生新的重大威胁，而在控制这类威胁之前又没有足够时间来鉴定和表征靶抗原时，当前的疫苗开发策略是无法胜任的。对于普通人群产生个性化疫苗而言，当前的疫苗开发策略也是无法胜任的。

因此，需要一个技术平台，用于产生个性化疫苗并控制快速发展、快速作用和/或具有高度感染性的重大威胁。

发明概述

一方面，本发明的特征在于这样的药物组合物：可将所述组合物给予受试者，以诱导针对目标抗原的免疫应答。在一个实施方案中，所述组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含与生物素结合蛋白融合并与至少1、2、3或4个生物素化组分非共价结合的热激蛋白。在某些实施方案中，生物素化组分是相同或不同分子。生物素化组分的非限制性实例包括生物素化蛋白、细胞和病毒。生物素化蛋白的非限制性实例包括生物素化抗原、抗体和共刺激分子。

本发明的组合物可预防性地用于提高针对目标抗原的免疫力，阻止病毒或细胞在表达和表现目标抗原或呈递其部分的受试者中的建立和增殖。如此，就可以达到阻止表达目标抗原的肿瘤或外源细胞的建立和增殖的目的。本文所提供的组合物也可治疗性地用于先前已感染病毒或携带所述细胞的受试者，以阻止病毒或细胞进一步增殖或者消除增殖的受试者细胞，包括表达和表现目标抗原或呈递抗原部分的肿瘤细胞。

在另一个实施方案中，组合物包含能够指导本文所提供的与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和/或有待生物素化的蛋白质的表达的表达载体。

在还一个实施方案中，本发明提供用于产生自我装配的药物组合物的方法，所述方法包括使与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与4个生物素化组分接触，其足以形成所述热激蛋白和所述4个生物素化组分的非共价复合物，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。本发明也提供在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试者与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和4个生物素化组分，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。本发明还提供在受试者中增加治疗药效力的方法，所述方法包括给予所述受试者与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和4个生物素化组分，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

给予生物素化单克隆抗体和与生物素结合蛋白融合的热激蛋白可极大地增强可用的多克隆抗体的免疫功效和效力，否则它们将只能作为弱的疫苗免疫原。此外，针对特定靶抗原的单克隆抗体或免疫血清单独使用就足以产生免疫刺激复合物，所述复合物能刺激针对目标抗原的抗体的产生并刺激细胞毒性T细胞。最终，本文所述的药物组合物将避开对每种抗原特异性scFv和/或抗体而言都要产生scFv特异性热激融合蛋白的需要。

因此，本发明在以下方面提供明显优于现有技术的优势：1)针对未鉴定、未表征的抗原的疫苗制备；2)个性化疫苗的制备；3)药物组合物(例如疫苗)的快速产生，这反过来又能增加这类药物组合物的生产能力；和4)“增强(supercharging)”现有治疗药，例如单克隆抗体。本文所述的技术提供用于固定和强效佐剂与不同抗原、肽或抗原靶向分子(包括单链抗体的肿瘤抗原特异性单克隆抗体)的自我装配。

在发明详述和权利要求书中将会描述更多的特征和优势。

附图简述

图1表明pET-45b(+)表达载体的修饰。A)SfiI限制位点插入的示意图。B)修饰pET-45b(+)载体的最终多克隆位点。

图2显示将NotII限制位点和XhoI限制位点引入MTBhsp70。使用与MTBhsp70的N端和C端重叠的引物，通过PCR引入NotI位点和XhoI位点。所得PCR产物示于第1道。

图3显示NotI和XhoI对扩增MTBhsp70的消化，得到如凝胶图所示的2个条带。序列分析确定了内部NotI位点和SfiI位点的存在。

图4显示通过使用基于PCR的位点定向诱变，除去NotI位点和SfiI位点。使用含有所需突变的修饰引物，产生两个重叠PCR产物。通过PCR，在引物不存在时，然后加入特定引物使它们延伸。

图5显示将卵清蛋白肽(残基254-264)引入MTBhsp70的N端。我们设计了用于编码卵清蛋白肽SIINFEKL的合成接头并用SfiI和NotI消化它。同样，我们用SfiI和NotI切割pET-45b(+)MTBhsp70质粒。将这两个组分连接起来，所得连接产物用于转化感受态细菌。挑取氨苄青霉素抗性菌落并通过测序进行筛选。

图6显示Ova_257-264-MTBhsp70的N端区的部分序列测定。

图7是自我装配药物组合物的热激蛋白融合物的示意性结构。显示热激蛋白MTB HSP-70和人HSP-70各自分别与作为生物素结合蛋白的抗生物素蛋白融合。

图8显示用于野生型和单体型抗生物素蛋白装配的策略。

图9显示野生型和单体型抗生物素蛋白之间的氨基酸和核苷酸的比较。

图10显示通过基于PCR诱变纠正的序列错误。

图11显示具有所示的部分MTBhsp70序列的单体型/野生型抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70序列。

图12显示在包涵体内发现的抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70蛋白的重折叠。

图13是热激蛋白融合物(显示为MTb HSP70和抗生物素蛋白的融合蛋白形式)和4个生物素化组分(显示为生物素化肽1-4)的多价自我装配而形成多价自我装配疫苗的示意图。

图14分别显示结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)HSP70和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovus)HSP70的HSP70全长蛋白质序列。

图15是热激融合蛋白和生物素化组分的自我装配疫苗的描述。在此的热激融合蛋白显示为HSP-抗生物素蛋白融合物，而生物素化组分显示为生物素化单克隆抗体(生物素化mAb)。

图16显示干扰素-γ产生的流式细胞术分析。

图17显示MTb HSP70-抗生物素蛋白融合物2-D分子模型，其中4个结合的单体型HSP-抗生物素蛋白融合物装配成为围绕4个四聚体化抗生物素蛋白成员的四聚体，当它装配来结合生物素时。

发明详述

定义

为了方便起见，在进一步说明本发明之前，在此定义本说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语。

除非另有说明，否则单数形式包括复数形式。

术语“给予”或“给药”包括本发明药物组合物的任何递送方法，包括系统或局部给予。“胃肠外”是指并非肠内和局部给予的给予方式，通常是通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、病灶内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射、口服、硬膜外、鼻内和输注。

术语“氨基酸”包括同时包含氨基官能团和酸官能团并能包含在天然发生氨基酸的聚合物中的所有分子，无论是天然的还是合成的。示例性的氨基酸包括天然发生的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有不同侧链的氨基酸类似物；和任何上述的所有立体异构体。天然氨基酸的名称在本文中遵循IUPAC-IUB的推荐而缩写。

术语“抗体”是指保留特异性结合能力的免疫球蛋白或其衍生物，以及其结合区与免疫球蛋白结合区同源或基本同源的蛋白质。术语“抗体”包括完整抗体或其抗原结合片段。这些蛋白质可衍生自天然来源，或者部分或全部由合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白种类的成员，包括任何人免疫球蛋白种类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在示例性实施方案中，用于本文所述的方法和组合物的抗体是IgG类的衍生物。抗体可以是工程抗体或天然发生抗体。

术语“抗体片段”是指小于全长的任何抗体衍生物。在示例性实施方案中，抗体片段保留全长抗体的特异性结合能力的至少重要部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fc、scFv、Fv、dsFv双链抗体和Fd片段。抗体片段可通过任何方式产生。例如，抗体片段可由完整抗体经酶学或化学方法而产生，可以由编码部分抗体序列的基因经重组产生，或者可以完全或部分地通过合成产生。抗体片段可任选是单链抗体片段。或者，片段可包含连接在一起(例如通过二硫键)的多条链。片段也可以任选是多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸，更通常包含至少约200个氨基酸。

“抗原”是指由本文所述组合物诱导的免疫应答的靶标。抗原可以是蛋白质抗原，并且可理解为包括在病毒或者受试者的受感染细胞、外源细胞或肿瘤细胞表面上显示的完整蛋白、蛋白片段，以及受感染细胞、外源细胞或肿瘤细胞所展示的肽，作为蛋白质加工和呈递的结果，例如通过典型的MHC I类或II类途径。这些外源细胞的实例包括细菌、真菌和原生动物。细菌抗原的实例包括蛋白A(PrA)、蛋白G(PrG)和蛋白L(PrL)。

术语“抗原结合位点”是指与抗原表位特异性结合的抗体区域。

术语“生物素结合蛋白”是指与生物素非共价结合的蛋白质。生物素结合蛋白可以是单体、二聚体或四聚体，它们分别能形成一价、二价，或四价药物组合物，如本文所述。非限制性实例包括抗生物素抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性抗生物素(neutravidin)。抗生物素蛋白可包括成熟的抗生物素蛋白，或者与NCBI检索号NP_990651所鉴定的序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。链霉抗生物素可包括例如与NCBI检索号AAU48617所鉴定的序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。术语“生物素结合蛋白”包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性抗生物素的野生型和衍生物，其形成单体、二聚体或四聚体。这些衍生物的实例在下文中给出并且也描述于Laitinen，O.H.(2007)，“Brave New(Strept)avidins in Biotechnology(优秀的新型链霉抗生物素在生物工程中)，”Trends in Biotechnology 25(6)：269-277和Nordlund，H.R.(2003)，“Introduction of histidine residues into avidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternary structure and biotin binding(将组氨酸残基引入抗生物素蛋白亚基界面，允许四级结构和生物素结合的pH依赖性调节)，”FEBS Letters 555：449-454，这两篇文献的内容都通过引用结合到本文中。

术语“细胞”当在上下文中用作含有抗原的生物素化组分时，是指包括完整细胞或其部分，只要所述部分在表面含有可被免疫系统接近而识别的目标抗原，当将含有生物素化“细胞”的药物组合物给予受试者时。

术语“包括”和“包含”用于包含的、开放的含义，是指也可包括额外要素。

本文所用的术语“共刺激分子”包括或者能够增强抗原特异性主要T细胞刺激物的刺激效应或者能够提高其活性而超过细胞活化所需的阈值水平，导致幼稚T细胞活化的任何分子。这样的共刺激分子可以是膜固有的受体蛋白。

术语“有效量”是指足以引起所需结果的药物组合物的量。可将有效量的药物组合物一次或多次给予。

术语“工程抗体”是指这样的重组分子：所述重组分子至少包含含有衍生自抗体重链和/或轻链的可变区的抗原结合位点的抗体片段并可任选包含来自任何Ig类(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的完整或部分可变区和/或恒定区。工程抗体的实例包括增强的单链单克隆抗体和增强的单克隆抗体。工程抗体的实例进一步描述于PCT/US2007/061554，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中。

术语“表位”是指抗体优先地和特异性地与其结合的抗原区。单克隆抗体与可在分子上限定的分子的单特异性表位优先结合。在本发明中，多个表位可被多特异性抗体识别。

“融合蛋白”是指包含来自至少2种不同蛋白质的序列的杂合蛋白。所述序列可来自相同或不同生物的蛋白质。在不同实施方案中，融合蛋白可包含与第一蛋白连接的一个或多个氨基酸序列。在不止一个氨基酸序列与第一蛋白融合的情况下，融合序列可以是多拷贝的相同序列，或者可以是不同氨基酸序列。第一蛋白可融合在第二蛋白的N端、C端、或同时在N端和C端。

术语“Fab片段”是指通过用木瓜蛋白酶切割抗体而产生的包含抗原结合位点的抗体片段，所述酶在铰链区N端切割H链间二硫键并从一个抗体分子产生两个Fab片段。

术语“F(ab′)₂片段”是指通过用胃蛋白酶切割抗体分子而产生的含有两个抗原结合位点的抗体片段，所述酶在铰链区C端切割H链间二硫键。

术语“Fc片段”是指包含其重链恒定区的抗体片段。

术语“Fv片段”是指包含其重链和轻链的可变区的抗体片段。“基因构建体”是指包含多肽“编码序列”或可转录为生物活性RNA(例如反义、诱骗、核酶等)的核酸，例如载体、质粒、病毒基因组等，所述核酸可转染细胞，例如在某些实施方案中的哺乳动物细胞，并且可引起编码序列在转染构建体的细胞中表达。基因构建体可包含与编码序列操作性连接的一个或多个调节元件、以及内含子序列、聚腺苷酸化位点、复制起点、标记基因等。

“宿主细胞”是指可用特定转移载体转导的细胞。细胞任选选自体外细胞例如衍生自细胞培养物的那些、离体细胞例如衍生自生物体的那些、以及体内细胞例如在生物体内的那些。可以理解，这样的术语不仅指具体受试者细胞，而且指这些细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可因或者突变或者环境影响而发生在后续世代中，所以这样的后代事实上可与亲代细胞不同，但仍然包括在本文所述的术语范围之内。

术语“免疫原性”是指物质诱导免疫应答的能力。“免疫原性组合物”或“免疫原”是诱导免疫应答的组合物或物质。“免疫应答”是指受试者对抗原存在的反应，其可包括以下的至少一种：制备抗体，发展免疫力，发展针对抗原的超敏性和发展耐受力。

本文所用的术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

“接头”是公认的并且是指连接两个共价部分例如热激蛋白和生物素结合蛋白的分子或分子组。接头可包括一个连接分子或者可包括一个连接分子和一个间隔分子，目的是用特定距离将连接分子和部分分开。

术语“多价抗体”是指包含不止一个抗原识别位点的抗体或工程抗体。例如，“二价”抗体具有2个抗原识别位点，而“四价”抗体具有4个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量对照)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点都与相同表位结合。“双特异性”抗体具有与第一表位结合的至少一种抗原识别位点和与不同于第一表位的第二表位结合的至少一种抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其都与相同表位结合。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其有些数量与第一表位结合，而其有些数量则与不同于第一表位的第二表位结合。

术语“多价”当用于本发明的自我装配药物组合物时，是指与不止一种生物素化组分非共价结合的热激融合蛋白。术语“二价”当用于本发明的自我装配药物组合物时，是指与2个生物素化组分非共价结合的热激融合蛋白。术语“四价”当用于本发明的自我装配药物组合物时，是指与4个生物素化组分非共价结合的热激融合蛋白。多价药物组合物的生物素化组分可具有相同或不同特性。

术语“核酸”是指或者核糖核苷酸或者脱氧核苷酸或者这两类核苷酸中某一类的修饰形式的核苷酸聚合形式。该术语也应理解为包括由核苷酸类似物制备的或者RNA或者DNA的等价物、类似物，并且是所述实施方案可用形式的单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。

“病人”或“受试者”或“宿主”可互换使用，各自是指人类或非人类动物。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的药疗判断范围内适用于接触人体组织和动物组织而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症并且具有合理的利益/风险比的那些药物组合物。

本文所用的“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，包括从一个器官或身体部分向另一器官或身体部分携带或转运所述药物组合物。每个载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对患者无害。可用作药学上可接受的载体的材料的某些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格液；(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)用于药物制剂的其它无毒相容性物质。

除非上下文另有说明，否则“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，当指基因表达产物时，例如由编码序列所编码的氨基酸序列。“蛋白质”也可指一种或多种蛋白质的缔合，例如抗体。“蛋白质”也可指蛋白质片段。蛋白质可以是翻译后修饰的蛋白质，例如糖基化蛋白。“基因表达产物”是指作为完整或部分基因转录结果而产生的分子。基因产物包括从基因转录而来的RNA分子，以及从这样的转录物翻译而来的蛋白质。蛋白质可以是天然发生的分离蛋白质或者可以是重组或化学合成的产物。术语“蛋白质片段”是指这样的蛋白质：与其本身的参考蛋白相比，其中氨基酸残基缺失，但其中剩余的氨基酸序列通常与参考蛋白的相同。这样的缺失可发生在参考蛋白的氨基端或羧基端，或同时在这两端。片段长度通常为至少约5、6、8或10个氨基酸，至少约14个氨基酸，至少约20、30、40或50个氨基酸，至少约75个氨基酸，或至少约100、150、200、300、500个或更多个氨基酸。可用蛋白酶裂解较大的蛋白质，或通过重组方法，例如表达仅编码部分蛋白质的核苷酸序列(或者单独或者与另一编码蛋白质的核酸序列融合)，来获取片段。在不同实施方案中，片段可包含酶活性和/或参考蛋白与例如细胞受体相互作用的位点。在另一个实施方案中，片段可具有免疫原性。蛋白质可包括通过各种已知技术在特定基因座上引入的突变，所述技术没有不良反应，但可增强其在本文所提供方法中的应用。片段可保留参考蛋白的一种或多种生物活性。

本文所用的术语“自我装配”是指与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与本文所述的生物素化组分形成非共价复合物的能力。通过生物素与生物素结合蛋白的非共价缔合而得到这样的能力。

术语“单链可变区片段”或“scFv”是指重链区和轻链区连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可连接其它抗体片段(例如重链或轻链的恒定区)，形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。

在受试者中“治疗”疾病或“治疗”患病受试者，是指使受试者接受药物治疗，例如给予药物，从而降低或预防疾病的程度。治疗包括(但不限于)给予组合物，例如药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始之后进行治疗。

术语“疫苗”是指诱导针对目标抗原的免疫应答的药物组合物。疫苗也可赋予受试者保护性免疫。

“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸分子的核酸分子。优选载体的一类是附加体，即能进行染色体外复制的核酸。优选的载体是能自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些。能指导与其操作性连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常呈“质粒”形式，所述质粒通常是指环状双链DNA环，在其载体形式中，它不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，正如本领域技术人员将会理解的那样，本发明包括这些表达载体的其它形式，所述形式可行使相同功能并且随后可成为本领域已知的。

术语“病毒”当在上下文中用作含有抗原的生物素化组分时，是指包括完整病毒颗粒或其部分，只要所述部分在表面含有可被免疫系统接近而识别的目标抗原，当将含有生物素化“病毒”的药物组合物给予受试者时。

纲要

本文的特征在于结合多种免疫组分的新疫苗平台，以产生高效力的免疫应答，当给予受试者时。也提供了连接多个亚基的组合物和方法，用于快速装配新疫苗。

本发明至少部分是基于以下发现：与抗体或抗原的生物素化组分非共价缔合的热激蛋白融合物，产生强烈刺激针对非共价缔合蛋白质抗原的细胞应答(尤其是细胞介导的细胞毒应答)的组合物，所述应答可杀伤展示所述抗原的细胞。

热激蛋白融合物

“热激蛋白”是由“热激基因”或应激基因所编码，并且是指因为含有所述基因的生物体接触或暴露给应激物(例如热激、低氧、葡萄糖剥夺、重金属盐、能量代谢抑制剂和电子传递、以及蛋白质变性剂)或某些苯醌安沙霉素类，使得所述基因被活化或被可检测性地上调。Nover，L.，Heat Shock Response，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1991)。“热激蛋白”也包括由已知应激基因家族内的基因所编码的同源蛋白，虽然这样的同源基因本身并非被应激物所诱导。

“热激蛋白融合物”是指与生物素结合蛋白连接的热激蛋白。例如，热激蛋白可以在C-端或N-端与生物素结合蛋白连接，产生热激蛋白融合物。当与本文所提供的生物素化组分联合给予时，热激蛋白融合物能刺激或增强针对目标抗原的体液和/或细胞免疫应答，包括CD8细胞毒性T细胞(CTL)应答。

例如，但并非限制性方式，可用于本发明的热激蛋白包括BiP(也称为grp78)、Hsp10、Hsp20-30、Hsp60 hsp70、hsc70、gp96(grp94)、hsp60、hsp40和Hsp100-200、Hsp100、Hsp90及其家族成员。尤其优选的热激蛋白是BiP、gp96和hsp70，以下举例说明。具体的一组热激蛋白包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp20-30，更优选Hsp70和Hsp60。最优选的是hsp70家族成员。

Hsp10实例包括GroES和Cpn10。Hsp10通常存在于大肠杆菌以及真核细胞的线粒体和叶绿体中。Hsp10构成与Hsp60寡聚体缔合的7元环。Hsp10也参与蛋白质折叠。

Hsp60实例包括来自分枝杆菌的Hsp65。细菌Hsp60也通称为GroEL，例如来自大肠杆菌的GroEL。Hsp60构成大的同型寡聚体复合物，并且看来在蛋白质折叠中起到关键作用。Hsp60同源物存在于真核线粒体和叶绿体中。

Hsp70实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73，来自细菌尤其是分枝杆菌(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(MTb)和牛分枝杆菌(例如卡介苗；在本文中称为Hsp71)的DnaK，来自大肠杆菌、酵母菌和其它原核生物的DnaK，以及BiP和Grp78。Hsp70能特异性结合ATP以及解折叠的蛋白质，因此参与蛋白质折叠和解折叠并参与蛋白质复合物的装配和解体。在一个优选的实施方案中，热激蛋白是或衍生自MTb HSP 70。结核分枝杆菌HSP70和牛分枝杆菌HSP70的全长蛋白质序列描述于图2，分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。与本文所述方法联合使用的热激蛋白融合物可包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

Hsp90实例包括大肠杆菌的HtpG，酵母菌的Hsp83和Hsc83，以及人的Hsp90α、Hsp90β和Grp94。Hsp90与蛋白质组结合，所述蛋白质通常是细胞调节分子例如甾体激素受体(例如糖皮质激素受体、雌激素受体、黄体酮受体和睾酮受体)、转录因子和在信号转导机制中起作用的蛋白激酶。Hsp90蛋白也参与形成包括其它热激蛋白的大而丰富的蛋白质复合物。

Hsp100实例包括哺乳动物Hsp 110、酵母菌Hsp104、ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。酵母菌Hsp104和大肠杆菌ClpA形成六聚体颗粒，而大肠杆菌ClpB形成四聚体颗粒，其装配看来需要腺嘌呤核苷酸结合。Clp蛋白酶提供由ClpP(蛋白水解亚基)和ClpA组成的750kDa异型寡聚体。ClpB-Y与ClpA具有结构相关性，尽管不同于ClpA，它们看来不与ClpP结合。

Hsp100-200实例包括Grp170(对于葡萄糖调节蛋白)。Grp170存在于ER内腔，在前高尔基体区室中，并且可在免疫球蛋白折叠和装配中起作用。

天然发生的或重组来源的热激蛋白突变型可用于本发明。例如，但并非限制性方式，本发明提供突变热激蛋白的应用，所述突变便于促进其从细胞中分泌出来(例如具有促进内质网重捕获的元件突变或缺失，例如KDEL(SEQ ID NO：266)或其同源物；这样的突变型描述于PCT申请号PCT/US96/13233(WO 97/06685)，其通过引用结合到本文中)。

在具体的实施方案中，本发明的热激蛋白得自肠细菌、分枝杆菌(尤其是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和牛分枝杆菌)、大肠杆菌、酵母菌、果蝇属(Drosophila)、脊椎动物、鸟类、鸡、哺乳动物、大鼠、小鼠、灵长类或人类。

本文所提供的药物组合物可具有经氧化或还原而修饰的个别氨基酸残基。此外，对氨基酸序列或核酸序列可以进行各种取代、缺失或添加，其实际结果是保留或进一步增强热激蛋白的已提高的生物活性。因为例如密码简并，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列中可存在相当大的变异。术语“热激蛋白”包括得自热激蛋白的热激蛋白片段，只要这样的片段包含涉及增强针对目标抗原的免疫应答的表位。可使用蛋白酶或通过重组方法例如表达仅编码部分应激蛋白的核苷酸序列(或者单独或者与另一编码蛋白质的核酸序列融合)，来获取热激蛋白片段。热激蛋白可包括通过各种已知技术在特定基因座上引入的突变，以增强其对免疫系统的效应。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Drinkwater和Klinedinst Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3402-3406(1986)；Liao和Wise，Gene 88：107-111(1990)；Horwitz等，Genome 3：112-117(1989)。

在具体的实施方案中，例如在包括热激蛋白和生物素结合蛋白之间化学缀合物的热激蛋白融合物中，用于本发明的热激蛋白是分离的热激蛋白，这意味着已从产生它们的宿主细胞中选择并分离出热激蛋白。在经重组表达为与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的融合物的热激蛋白的某些实施方案中，用于本发明的热激蛋白融合物是分离的热激蛋白融合物，这意味着已从产生它们的宿主细胞中选择并分离出热激蛋白融合物。可以按照本文所述并使用本领域已知的蛋白质分离的常规方法，进行这样的分离。Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Deutscher，M.，Guide to Protein Purification Methods Enzymology，第182卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1990)。

生物素化组分

本文所用的术语“生物素化组分”是指生物素化蛋白、细胞或病毒。生物素化蛋白的非限制性实例包括生物素化抗原、抗体和共刺激分子。生物素化组分可与本文所述的热激蛋白融合物联合给予受试者。

i)含有抗原的生物素化组分

在一个实施方案中，生物素化组分得自受试者，他们可以是接受药物组合物的相同或不同的人。例如，可从受试者中分离出希望对其具有免疫应答的蛋白质、细胞和/或病毒并任选在体外扩增或克隆。然后使用本领域已知方法，在体外使所述蛋白质、细胞和/或病毒生物素化。再将生物素化组分与本文所述的热激蛋白融合物联合给予先前从中分离出蛋白质、细胞和/或病毒的同一受试者，因此允许开发个性化疫苗。或者，可将生物素化组分与本文所述的热激蛋白融合物联合给予与先前从中分离蛋白质、细胞和/或病毒的不同的受试者。后一种方法允许用于开发疫苗，用于普通人群抵抗疾病或感染因子，当给予普通人群时。

这两种方法提供了优于现有技术的明显优势，也就是说，仅需要将组分鉴定到这样的程度：允许找到它与特定疾病或感染的关系并允许将它从受试者中分离出来。这是用于靶向其序列未知或者甚至其结构未鉴定的抗原的新方法。因此，本发明允许制备药物组合物，以诱导针对已知或未鉴定、未表征的抗原的免疫应答。个性化疫苗提供优于常规疫苗的额外优势，即HLA限制不成问题，因为细胞或蛋白例如抗体是来自即将给予生物素化组分的同一宿主。

替代将合成抗原肽与热激蛋白直接连接以产生疫苗，例如scFV可改为与生物素缀合并与本文所述的热激蛋白融合物部分联合给予，因此使用新的融合蛋白疫苗，用于将抗原呈递给APC，以便同时产生体液应答和CD-8应答。可选择例如scFV1，用于通过结合研究考察其与未表征抗原或已表征抗原的结合。在该实例中，使scFV生物素化并与例如热激蛋白融合物部分联合给予。

大致同样地，可使任何蛋白质、细胞和/或病毒生物素化并与本文所述的热激蛋白融合物部分联合给予受试者，使生物素化蛋白、细胞和/或病毒当与本文所述的热激融合蛋白联合给予时，能靶向针对目标抗原的免疫应答。

这类细胞的一个实例是从受试者中分离的肿瘤细胞，将其生物素化并与本文所述的热激蛋白融合物联合给予。肿瘤细胞在引入或再次引入本发明受试者之前，先经过处理，使细胞不再繁殖且不会导致对所给予受试者的损害。可在生物素化之前或之后通过对肿瘤细胞进行亚致死辐照而达到这一目的。肿瘤细胞在其表面表达抗原，其特性可以是或不是已知或已表征的。当与热激蛋白融合物联合给予受试者时，非共价复合物诱导针对肿瘤抗原的免疫应答。结果是针对表达抗原的细胞的“杀伤T细胞”应答，因此靶向患病细胞类型，使之被破坏。

所述肿瘤细胞是用本发明方法治疗或预防的癌症细胞类型。这样的细胞包括但不限于例如以下人类肉瘤细胞或癌细胞：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(原始粒细胞性白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多、淋巴瘤((霍奇金病(Hodgkin′s disease)和非霍奇金病(non-Hodgkin′s disease))、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)或重链病。

可生物素化并以如上所述的同样方式与热激蛋白融合物联合给予的其它细胞包括在希望具有“杀伤T细胞”应答的受试者中的任何细胞。这些细胞的实例包括在其表面表达抗原的其它患病的和/或病毒感染的细胞。如以上对肿瘤细胞所述，这些细胞在引入或重新引入本发明受试者之前，优选先经过处理，使细胞不再繁殖或不会导致对受试者的损害。可在生物素化之前或之后通过对细胞进行亚致死辐照而达到这一目的。这些细胞可以经过处理，使它们成为非感染性细胞，或者，如果是毒素分泌细胞的话，则不再分泌毒素。

可通过本发明方法治疗或预防的感染性疾病是由感染因子引起的。这样的感染因子或来自它们的抗原(其可生物素化并与本发明联合给予)包括但不限于病毒、细菌、真菌和原生动物。本发明不仅限于治疗或预防由胞内病原体引起的感染性疾病，而且还包括由胞外病原体引起的感染性疾病。在文献中已经广泛地描述了许多医学相关微生物。例如参见C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，所述文献的全部内容都通过引用结合到本文中。

在一个实施方案中，可将表达抗原或病毒抗原的病毒生物素化并以如上所述的同样方式与热激蛋白融合物联合给予。

人类和非人类脊椎动物的感染性病毒，包括表达抗原的逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；和其它分离物，例如HIV-LP；小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如疱疹性口腔炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(Bimaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；细小DNA病毒科(Parvoviridae)(细小DNA病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪热病病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病(Spongiform encephalopathies)的致病因子、delta肝炎的致病因子(认为是乙肝病毒的缺陷卫星病毒)、非甲非乙肝炎的致病因子(I类＝内部传播；2类＝胃肠外传播(即丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒和星状病毒)。

所涵盖的逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复合逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒亚组、C型逆转录病毒亚组和D型逆转录病毒亚组。B型逆转录病毒的实例是小鼠乳瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括亚组C型A组(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓性白血病病毒(AMV))和C型B组(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增生症病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)。复合逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒和泡沫病毒亚组。慢病毒包括HIV-1，但也包括HIV-2、SIV、Visna病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿猴T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。

作为脊椎动物抗原的RNA病毒的实例包括但不限于以下：呼肠孤病毒科成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽类逆转录病毒的多种血清型)、环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克麦罗沃病毒、非洲马瘟病毒和科罗拉多蜱传热病毒)、轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿猴轮状病毒、牛或羊的轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科(Picomaviridae)，包括肠病毒属(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B、肠细胞病变人孤儿(enteric cytopathic human orphan，ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猿猴肠病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠病毒、猪肠病毒，心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)、门戈病毒(Mengovirus))，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113种亚型；其它鼻病毒)，口蹄疫病毒属(口蹄疫病毒(FMDV)；杯状病毒科，包括猪小疱疹病毒、San Miguel海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒、Semliki森林病毒、辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、阿尼昂尼昂病毒(O′Nyong-Nyong virus)、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、黄病毒属(蚊传黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、摩莱河谷脑炎病毒、西尼罗病毒、库宁病毒(Kunjin virus)、中欧蜱传病毒、远东蜱传病毒、Kyasanur森林病毒、跳跃病病毒(Louping Ill virus)、波瓦生病毒(Powassan virus)、额木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus))，风疹病毒属(风疹病毒)，虫媒病毒属(粘膜病病毒、猪霍乱病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，包括布尼亚病毒属(布尼亚维拉病毒(Bunyamwera)及相关病毒，加利福利亚脑炎病毒)，白蛉病毒属(白蛉热西西里病毒、裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)和吴孔病毒(Uukuvirus)属(Uukuniemi和相关病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种人亚型)；猪流感病毒和禽和马流感病毒；乙型流感(多种人亚型)和丙型流感(可能的单独属)；副粘病毒科，包括副流感病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒、血细胞吸附病毒、副流感病毒2-5型、新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒、辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、摩莱河谷脑炎病毒、西尼罗病毒、库宁病毒、中欧蜱传病毒、远东蜱传病毒、Kyasanur森林病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、额木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，虫媒病毒属(粘膜病病毒、猪霍乱病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(布尼亚维拉病毒和相关病毒、加利福利亚脑炎病毒)，白蛉病毒属(白蛉热西西里病毒、裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)和吴孔病毒属(Uukuniemi和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种人亚型)；猪流感病毒和禽和马流感病毒；乙型流感(多种人亚型)和丙型流感(可能的单独属)；副粘病毒科，包括副流感病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒、血细胞吸附病毒、副流感病毒2-5型、新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)、金迪普拉(ChanBipura)病毒、费兰杜-哈特公园病毒(Flanders-Hart Park virus))、狂犬病毒属(狂犬病毒)、鱼弹状病毒和两种可能的弹状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、Tacaribe病毒复合物和拉沙病毒；冠状病毒科，包括感染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人肠道冠状病毒和猫感染性腹膜炎(猫冠状病毒)。

作为脊椎动物抗原的说明性DNA病毒包括但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花、轻型天花、猴痘、牛痘、水牛痘、兔痘、脱脚病)，兔痘病毒属(粘液瘤、纤维瘤)，禽痘病毒属(鸡痘、其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(接触传染性脓疱性皮炎病毒(contagious postular dermatitis virus)、假牛痘病毒、牛脓疱性口炎病毒(bovine papular stomatitis virus))；虹彩病毒科(非洲猪热病病毒、蛙病毒2和3、鱼类淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1型和2型、水痘带状疱疹、马流产病毒、马疱疹病毒2和3、伪狂犬病毒、感染性牛角膜结膜炎病毒、感染性牛鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、感染性喉气管炎病毒)，β-疱疹病毒(人巨细胞病毒以及猪、猴和啮齿类的巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(Epstein-Barr病毒(EBV)、马立克病病毒、松鼠猴疱疹病毒(Herpes saimiri virus)、蜘蛛猴疱疹病毒(Herpesvirus ateles virus)、棉尾兔疱疹病毒(Herpes virus sylvilagus)、豚鼠疱疹病毒、Lucke肿瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳动物腺病毒属(人的A、B、C、D、E亚组和未分组的；猿猴腺病毒(至少23种血清型)、感染性犬肝炎以及牛、猪、绵羊、蛙和许多其它物种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；和不可培养的腺病毒；乳多空病毒科(Papoviridae)，包括乳头瘤病毒属(人乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒和其它物种的各种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒、猿猴空泡因子(SV-40)、兔空泡因子(RKV)、K病毒、BK病毒、JC病毒和其它灵长类多瘤病毒例如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小DNA病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫泛白细胞减少症病毒(panleukopenia virus)、牛细小病毒、犬细小病毒、阿留申水貂病毒(Aleutian mink disease virus)等)。最终，DNA病毒可包括不适合归于以上科的病毒例如库颅病(Kuru)和克-雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)病毒和慢性感染性神经病因子。

ii)含有抗体的生物素化组分

在另一个实施方案中，可将免疫治疗药例如抗体生物素化并与本文所述的热激蛋白融合物联合给予。天然抗体是其自身的二聚体，因此是二价的。如果将产生不同抗体的两种杂交瘤细胞经人工融合的话，杂合杂交瘤所产生的某些抗体就会由具有不同特异性的两种单体组成。这样的双特异性抗体也可通过将两种抗体经化学缀合而产生。天然抗体及其双特异性衍生物制备起来相当大而且昂贵。小鼠抗体的恒定区也是人抗小鼠抗体(HAMA)应答的主要原因，这阻止了将其作为治疗药的广泛应用。它们也可因其与Fc-受体结合而产生不良反应。对于这些原因，分子免疫学家已经集中于在微生物中制备小得多的Fab-片段和Fv-片段。这些较小片段不仅制备起来容易得多，而且它们具有较小的免疫原性，没有效应器功能，并且因为它们相当小，所以能更好地渗透组织和肿瘤。就Fab-片段而言，靠近可变区的恒定区在稳定重链和轻链二聚体上起到主要作用。因此，尽管与本发明方法联用的抗体可包括全长或接近全长的工程抗体，但也可优选更小的单域工程抗体(其可以是多价和多特异性的)。

Fv-片段的稳定性差得多，因此可将肽接头引入重链可变区和轻链可变区之间，以增加稳定性。该构建体称为单链Fv(scFv)-片段。有时将二硫键引入这两个区之间，以得到额外的稳定性。

可仅使用抗体可变区来构建二价和双特异性抗体。一个相当有效且相对简单的方法就是使V_H区和V_L区之间的接头序列如此短，以至于它们不能折叠和彼此结合。将接头长度缩短至3-12个残基，阻止scFv分子的单体构型并有利于分子间V_H-V_L配对形成60kDa非共价scFv二聚体“双链抗体”(Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448)。双链抗体形式也可用于产生重组双特异性抗体，这可通过使两个单链融合产物非共价缔合而获得，其包括来自一个抗体的V_H区通过短接头与来自另一抗体的V_L区连接。更进一步缩短接头长度到3个残基以下，可导致形成三聚体(“三链抗体”，约90kDa)或四聚体(“四链抗体”，约120kDa)(Le Gall等，1999，FEBS Letters 453，164-168)。有关工程抗体、尤其是单域片段的综述，可参见Holliger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23：1126-1136。所有这些工程抗体都可与生物素缀合并用于本文提供的方法。

可与本发明实施方案联用的其它多价工程抗体描述于Lu等，2003，J.Immunol.Meth.279：219-232(二-双链抗体或四价双特异性抗体)；美国公开申请20050079170(多聚Fv分子或“flexibodies”)和WO99/57150和Kipriyanov等，1999，J.Mol.Biol.293：41-56(串联双链抗体或“Tandabs”)。

本领域技术人员可采用例如以下文献所述的常规重组DNA技术，开发任何上述多价工程抗体：PCT国际申请号PCT/US86/02269；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT国际公布号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等(1988)Science 240：1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；美国专利号5,225,539；Jones等(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter和Milstein，Nature，349，第293-99页(1991))。优选地，非人类抗体是“人源化”的，即通过将非人类抗原结合区与人恒定区连接(例如Cabilly等，美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，第6851-55页(1984))。

工程抗体的抗原识别位点或完整可变区可衍生自针对任何目标抗原的一种或多种亲代抗体。亲代抗体可包括天然发生的抗体、改造自天然发生抗体的抗体、或者使用抗体序列或已知对目标抗原具有特异性的序列而重新构建的抗体。可衍生自亲代抗体的序列包括重链可变区和/或轻链可变区和/或CDR、框架区或其其它部分。

多价多特异性抗体可含有包含两个或两个以上可变区的重链和/或包含一个或更多可变区的轻链，其中至少2个可变区识别同一抗原的不同表位。

可使用各种已知测定，筛选有待生物素化的候选抗体的活性。例如，测定结合特异性的筛选测定是本领域众所周知的并常规用于本领域的实践。有关这些测定的全面讨论，可参见Harlow等(编著)，ANTIBODIES：A LABORATORY  MANUAL；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.，1988，第6章。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体和/或具有针对癌症的体内治疗性和/或预防性用途。在某些实施方案中，抗体可用于治疗和/或预防感染性疾病。治疗性和预防性抗体的实例包括但不限于ERBITUX

(西妥昔单抗)(ImClone System)、MDX-010(Medarex，NJ)，其是目前临床上用于治疗前列腺癌的人源化抗CTLA-4抗体；SYNAGIS

(MedImmune，MD)，其是用于治疗RSV感染患者的人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体；HERCEPTIN

(曲妥单抗)(Genentech，CA)，其是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗HER2单克隆抗体。其它实例是人源化抗CD18 F(ab′)₂(Genentech)；CDP860，其是人源化抗CD18 F(ab′)₂(Celltech，UK)；PRO542，其是与CD4融合的抗HIV gp120抗体(Progenics/Genzyme Trahsgenics)；Ostavir，其是人抗乙肝病毒抗体(Protein Design Lab/Novartis)；PROTOVIR^TM，其是人源化抗CMV IgG1抗体(Protein Design Lab/Novartis)；MAK-195(SEGARD)，其是鼠抗TNF-αF(ab′)₂(Knoll Pharma/BASF)；IC14，其是抗CD14抗体(ICOS Pharm)；人源化抗VEGF IgG 1抗体(Genentech)；OVAREX^TM，其是鼠抗CA 125抗体(Altarex)；PANOREX^TM，其是鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体(ImClone System)；IMC-C225，其是嵌合抗EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXIN^TM，其是人源化抗αVβ3整联蛋白抗体(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath 1H/LDP-03，其是人源化抗CD52IGGI抗体(Leukosite)；Smart M195，其是人源化抗CD33 IgG抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXAN^TM，其是嵌合抗CD20 IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDE^TM，其是人源化抗CD22 IgG抗体(Immunomedics)；Smart ID10，其是人源化抗HLA抗体(Protein DesignLab)；ONCOLYM^TM(Lym-1)是放射性标记的鼠抗HLA DIAGNOSTIC REAGENT抗体(Techniclone)；ABX-IL8是人抗IL8抗体(Abgenix)；抗CD11a是人源化IgG1抗体(Genentech/Xoma)；ICM3是人源化抗ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114是灵长类化的(primatized)抗CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALIN^TM是放射性标记的鼠抗CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化抗CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151是灵长类化的抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长类化的抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3是人源化抗CD3 IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化抗补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7是人源化抗TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870是人源化抗TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151是灵长类化的抗CD4 IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人抗CD4 IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化抗TNF-α IgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化抗α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化抗CD4IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVA^TM是人源化抗CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGREN^TM是人源化抗VLA-4 IgG抗体(Elan)；MDX-33是人抗CD64(FcγR)抗体(Medarex/Centeon)；SCH55700是人源化抗IL-5IgG4抗体(Celltech/Schering)；SB-240563和SB-240683分别是人源化抗IL-5和IL-4抗体(SmithKline Beecham)；rhuMab-E25是人源化抗IgE IgG1抗体(Genentech/Norvartis/Tan-ox Biosystems)；ABX-CBL是鼠抗CD-147 IgM抗体(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗CD2 IgG抗体(Medimmune/Bio Transplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗CD3 IgG2a抗体(ortho Biotech)；SIMULECT^TM是嵌合抗CD25 IgG1抗体(Novartis Pharm)；LDP-01是人源化抗β2-整联蛋白IgG抗体(LeukoSite)；抗LFA-1是鼠抗CD18 F(ab′)₂(Pasteur-Merieux/Immunotech-)；CAT-152是人抗TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)；和Corsevin M是嵌合抗第VII因子抗体(Centocor)。

自我装配疫苗

正如进一步描述的，多种生物素化组分可与热激蛋白融合物联合给予。这样，可产生多价药物组合物并给予受试者。多价药物组合物的产生允许产生“超强的(supercharged)”或更有效的疫苗和治疗药。当生物素化组分包含抗体时，相比市售抗体，这样的疫苗表现出活性改善。

其中药物组合物是多价的，有待给予的生物素化组分可以是本文所述的生物素化组分的任何组合。例如，可将相同或不同特性的生物素化组分与本文所提供的热激蛋白融合物联合给予，只要生物素结合蛋白，且转而热激蛋白融合物是多价的，或者能够结合多种生物素化组分。举例来说，野生型生物素结合蛋白抗生物素蛋白具有4个生物素结合位点，因此能结合4个生物素化组分。在该实例中，4个位点与4个生物素化组分结合，可根据特性，以本文所述的1、2、3或4个相同生物素化组分的任何可能的排列方式，将生物素结合组分混合和匹配。4个相同生物素化组分可与4个生物素结合位点结合。

因此，可将有效量的具有第一特性的生物素化组分以及与生物素结合蛋白融合的热激蛋白联合给予受试者，其足以形成药物组合物，所述组合物包含4份具有第一特性的生物素化组分和1份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。或者，可将有效量的具有第一和第二特性的生物素化组分以及与生物素结合蛋白融合的热激蛋白联合给予受试者，其足以形成药物组合物，所述组合物包含3份具有第一特性的生物素化组分、1份具有第二特性的生物素化组分和1份热激蛋白融合物。在另一个实施方案中，可将有效量的具有第一和第二特性的生物素化组分以及与生物素结合蛋白融合的热激蛋白联合给予受试者，其足以形成药物组合物，所述组合物包含2份具有第一特性的生物素化组分、2份具有第二特性的生物素化组分和1份热激蛋白融合物。

其中自我装配药物组合物是二价的，可将有效量的具有第一特性的生物素化组分以及与生物素结合蛋白融合的热激蛋白联合给予受试者，其足以形成药物组合物，所述组合物包含2份具有第一特性的生物素化组分和1份热激蛋白融合物。或者，可将有效量的具有第一和第二特性的生物素化组分以及与生物素结合蛋白融合的热激蛋白联合给予受试者，其足以形成药物组合物，所述组合物包含1份具有第一特性的生物素化组分、1份具有第二特性的生物素化组分和1份热激蛋白融合物。

多价药物组合物的生物素化组分可包含共刺激分子或封闭基团(即仅有生物素或与非功能性分子缀合的生物素)。可与本发明联合给予的共刺激分子的实例包括B7分子，包括B7-1(CD80)和B7-2(CD86)、CD28、CD58、LFA-3、CD40、B7-H3、CD137(4-1BB)；以及白介素(例如IL-1、IL-2或IL-12)。举例来说，可将1份包含共刺激分子的生物素化组分以及以下成分联合给予：i)3份包含蛋白质、细胞或病毒的另一生物素化组分；和ii)1份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在另一实例中，可将2份包含共刺激分子的生物素化组分以及以下成分联合给予：i)2份包含蛋白质、细胞或病毒的另一生物素化组分；和ii)1份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在另一实例中，可将3份包含共刺激分子的生物素化组分以及以下成分联合给予：i)1份包含蛋白质、细胞或病毒的另一生物素化组分；和ii)1份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。

例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或中性抗生物素的pH-敏感突变型，可用于控制抗生物素蛋白、链霉抗生物素或中性抗生物素与生物素的非共价相互作用，并因此而达到热激蛋白融合物与生物素化组分的不同排列和组合的所需化学计量学，如本文所述。对生物素结合蛋白例如抗生物素蛋白的野生型或特定突变型的选择，可用于控制药物组合物的所需价位(例如抗生物素蛋白的单体、二聚体或四聚体形式)。一价或二价疫苗都可通过以下方法类似地产生：即通过使用包含与生物素结合但是以一价或二价方式的其它抗生物素蛋白、链霉抗生物素或中性抗生物素突变型蛋白的热激融合蛋白。抗生物素蛋白突变型的一个实例描述于以下实施例部分。赋予pH-调节性生物素结合的抗生物素蛋白pH-敏感性点突变型的一个实例是Y33H。另一个突变型在Met96、Val115和Ile117具有组氨酸取代，任选在Trp110具有组氨酸取代。用于控制生物素-链霉抗生物素结合的这些方法描述于Laitinen，O.H.(2007)，“Brave New(Strept)avidins in Biotechnology(优秀的新型链霉抗生物素在生物工程中)，”Trends in Biotechnology 25(6)：269-277和Nordlund，H.R.(2003)，“Introduction of histidine residues into avidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternary structure and biotin binding(将组氨酸残基引入抗生物素蛋白亚基界面，允许四级结构和生物素结合的pH依赖性调节)，”FEBS Letters 555：449-454，这两篇文献的内容都通过引用结合到本文中。

产生自我装配药物组合物的方法

在本发明的一个实施方案中，组合物包含两部分：与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和生物素化组分，其靶向针对所述抗原的免疫应答，这样的免疫应答是想要的(which targets the immune response to the antigen to which the immune response is desired.)。本发明提供大量药物组合物(例如疫苗)的快速而容易的生产方法，因为生物素化抗原或抗体的生产是众所周知的并且是快速的，因此允许提高疫苗生产能力。因为可将单一特性的热激蛋白融合物与任何数量的各种本文所述的生物素化组分联合给予，所以热激融合蛋白不需要每次从头合成新的目的靶标并鉴定(the heat shock fusion protein need not be synthesized de novo each time a new target antigen of interest is identified)。因此，这些生产方法尤其快速，一旦确定要给予的热激蛋白融合物并已经生产时。

提供用于制备与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的方法。可用例如Flynn等，Science 245：385-390(1989)所描述的标准技术，从天然来源制备热激蛋白，或者可用重组技术例如在合适宿主细胞例如细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达编码热激蛋白的基因构建体。可通过重组方式产生包含热激蛋白和生物素结合蛋白的融合蛋白。例如，可将编码热激蛋白的核酸与生物素结合蛋白的编码核酸的两端之一连接，使这两种蛋白编码序列共享共同的翻译阅读框并表达为包含生物素结合蛋白和热激蛋白的融合蛋白。将合并序列插入到根据所需表达特征和宿主细胞特性而选择的合适载体中。在下文所提供的实例中，将核酸序列装配在适于在大肠杆菌中进行蛋白质表达的合适载体中。在所选宿主细胞中表达之后，可通过常规生化分离技术或通过免疫亲和方法，使用针对融合蛋白的一部分或另一部分的抗体，来纯化融合蛋白。或者，所选载体可添加标签到融合蛋白序列中(the selected vector can add a tag to the fusion protein sequence)，例如在以下实例中描述的寡聚组氨酸标签，允许带标签的融合蛋白表达，可通过亲和方法，使用对标签具有适当高亲和力的抗体或其它材料来纯化所述带标签的融合蛋白。Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Deutscher，M..Guide to Protein Purification Methods Enzymology，第182卷.Academic Press，Inc..San Diego，CA(1990)。如果使用适于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如以下讨论的载体之一，就可在哺乳动物细胞中表达并纯化热激蛋白融合物。或者，可将哺乳动物表达载体(包括融合蛋白编码序列)给予受试者，以指导热激蛋白融合蛋白在受试者细胞中表达。也可经化学方法制备编码热激蛋白的核酸，然后插入到合适载体中，用于融合蛋白的制备和纯化或将其给予受试者。最终，也可通过化学方法制备融合蛋白。

制备融合基因的技术是本领域众所周知的。基本上，按照常规技术，进行编码不同多肽序列的不同DNA片段的连接，使用平端或交错末端用于连接，限制酶消化以提供合适末端，如果合适的话填充粘性末端，经碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接，然后经酶促连接。在另一个实施方案中，可通过常规技术包括自动化DNA合成仪，合成融合基因。或者，可进行基因片段的PCR扩增，使用锚引物，其产生两个连续基因片段之间的互补突起，随后对其退火，以产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley & Sons：1992)。因此，提供分离的核酸，所述核酸包含与生物素结合蛋白编码基因融合的热激蛋白编码基因的融合基因。

可在载体中提供核酸，所述载体包含编码热激蛋白融合物的核苷酸序列，并与至少一种调节序列操作性连接。应当理解，表达载体的设计依赖于例如以下因素：有待转化的宿主细胞的选择和/或有待表达的蛋白质类型。载体的拷贝数、对拷贝数的控制能力和由载体编码的任何其它蛋白(例如抗生素标记)的表达都应当考虑。可将这样的载体在任何生物有效载体中给予，所述生物有效载体例如能够或者离体或者体内有效转染细胞的具有编码嵌合多肽的遗传物质的任何制剂或组合物。方法包括将核酸插入到病毒载体中，所述病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、人免疫缺陷病毒和单纯疱疹病毒-1或重组细菌质粒或真核质粒。病毒载体可用于直接转染细胞；质粒DNA可在例如以下物质的帮助下单独递送：阳离子型脂质体(lipofectin)或衍生型(例如抗体缀合的)、聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其它这类胞内载体。核酸也可通过直接注射。或者，可进行磷酸钙沉淀，以促进核酸进入细胞。

受试者核酸可用于引起热激蛋白融合蛋白在培养增殖细胞中的表达和过量表达，例如产生融合蛋白。

也提供转染了重组基因的宿主细胞，以表达热激蛋白融合物。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，热激蛋白融合物可在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中表达。当宿主细胞是人体细胞的情况下，它可以在或不在活的受试者中。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。另外，对宿主细胞可补充通常不存在于宿主中的tRNA分子，以优化多肽的表达。适用于最大化表达融合多肽的其它方法将会是本领域技术人员已知的。

细胞培养物包含宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。可从包含多肽的细胞和培养基混合物中分泌并分离出所述多肽。或者，融合多肽可保留在细胞质内，将细胞收获、裂解并分离出所述蛋白。可采用本领域已知用于纯化蛋白质的技术，从细胞培养基、宿主细胞或这两者中分离出融合多肽，所述技术包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳和用对融合物的特定表位具有特异性的抗体的亲和免疫纯化。

因此，编码所有或部分热激蛋白融合物的核苷酸序列可用于通过微生物或真核细胞过程而产生蛋白质的重组形式。标准程序是：将所述序列连入多核苷酸构建体例如表达载体，然后转化或转染入宿主，所述宿主或者是真核(酵母菌、鸟类、昆虫或哺乳动物)细胞或者是原核细胞(细菌细胞)。类似程序或其修改程序可用于通过本发明的微生物方式或组织培养技术来制备重组融合多肽。

用于产生重组蛋白的表达载体包括质粒和其它载体。例如，用于表达融合多肽的合适载体包括用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达的以下类型的质粒：pBR322-衍生质粒、pEMBL-衍生质粒、pEX-衍生质粒、pBTac-衍生质粒和pUC-衍生质粒。

在另一个实施方案中，将编码热激蛋白融合多肽的核酸与例如以下细菌启动子操作性连接：厌氧的大肠杆菌NirB启动子或大肠杆菌脂蛋白llp启动子，其描述于例如Inouye等(1985)Nucl.Acids Res.13：3101；沙门氏菌pagC启动子(Miller等，出处同上)、志贺氏菌ent启动子(Schmitt和Payne，J.Bacteriol.173：816(1991))、Tn10上的tet启动子(Miller等，出处同上)或霍乱弧菌(Vibrio cholera)ctx启动子。任何其它启动子都可使用。细菌启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。示例性的诱导型启动子是被铁诱导的或在铁限制条件中诱导的启动子。事实上，认为某些细菌，例如胞内生物体，在宿主细胞质中能遇到铁限制条件。FepA和TonB的铁调节型启动子的实例是本领域已知的并描述于例如以下参考文献：Headley，V.等(1997)Infection & Immunity 65：818；Ochsner，U.A.等(1995)Journal of Bacteriology 177：7194；Hunt，M.D.等(1994)Journal of Bacteriology 176：3944；Svinarich，D.M.和S.Palchaudhuri.(1992)Journal of Diarrhoeal Diseases Research 10：139；Prince，R.W.等(1991)Molecular Microbiology 5：2823；Goldberg，M.B.等(1990)Journal of Bacteriology 172：6863；de Lorenzo，V.等(1987)Journal of Bacteriology 169：2624；和Hantke，K.(1981)Molecular & General Genetics 182：288。

质粒优选包含核酸在细菌中合适转录所需的序列，例如转录终止信号。载体还可包含这样的序列：允许用于选择包含目标核酸的细菌的因子的编码序列，例如编码抗生素抗性的蛋白质的基因；核酸扩增所需序列，例如细菌复制起点。

在另一个实施方案中，将信号肽序列添加到构建体上，使融合多肽从细胞中分泌出来。这样的信号肽是本领域众所周知的。

在一个实施方案中，将强有力的噬菌体T5启动子(其被大肠杆菌RNA聚合酶识别)与lac操纵子阻遏组件一起使用，以使重组蛋白在大肠杆菌中严格受控的高水平表达(to provide tightly regulated，high level expression or recombinant proteins in E.coli.)。在该系统中，在高水平lac阻遏物的存在下，蛋白质表达被阻断。

在一个实施方案中，将所述DNA与第一启动子操作性连接，并且细菌还包含编码第一聚合酶的第二DNA，所述第一聚合酶能介导从第一启动子的转录，其中编码第一聚合酶的DNA与第二启动子操作性连接。在一个优选的实施方案中，第二启动子是细菌启动子，例如上述的那些。在一个甚至更优选的实施方案中，聚合酶是噬菌体聚合酶，例如SP6、T3或T7聚合酶，第一启动子是噬菌体启动子，例如分别是SP6、T3或T7启动子。包含噬菌体启动子的质粒和编码噬菌体聚合酶的质粒可购自例如Promega Corp.(Madison，Wis.)和InVitrogen(San Diego，Calif.)，或者可使用标准重组DNA技术而直接得自噬菌体(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，1989)。噬菌体聚合酶和启动子进一步描述于例如以下参考文献：Sagawa，H.等(1996)Gene 168：37；Cheng，X.等(1994)PNAS USA 91：4034；Dubendorff，J.W.和F.W.Studier(1991)Journal of Molecular Biology 219：45；Bujarski，J.J.和P.Kaesberg(1987)Nucleic Acids Research 15：1337；和Studier，F.W.等(1990)Methods in Enzymology 185：60)。可根据要表达的热激蛋白融合物的具体实施方案，对这些质粒进行进一步修饰。

在另一个实施方案中，细菌还包含编码第二聚合酶的DNA，所述第二聚合酶能介导从第二启动子的转录，其中编码第二聚合酶的DNA与第三启动子操作性连接。第三启动子可以是细菌启动子。然而，可将两种以上的不同聚合酶和启动子引入细菌中，以达到高水平转录。在细菌中使用一种或多种聚合酶来介导转录，可使细菌中的多肽数量与DNA直接处于细菌启动子控制之下的细菌相比明显上升。对所用系统的选择将因具体用途的不同而异，例如取决于人们所需要产生的蛋白质的数量。

通常，通过例如转染将编码融合蛋白的核酸引入到宿主细胞中，然后将宿主细胞培养在允许融合蛋白表达的条件下。将核酸引入原核细胞和真核细胞中的方法是本领域众所周知的。用于哺乳动物细胞和原核宿主细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。通常，编码受试者融合蛋白的核酸是处于诱导型启动子控制之下，一旦包含所述核酸的宿主细胞分裂到某个时间时，就会被诱导。例如，当核酸处于β-半乳糖操纵子和阻遏物控制之下的情况下，当细菌宿主细胞的密度达到约OD₆₀₀ 0.45-0.60时，将异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加到培养物中。然后培养物再多培养一段时间，给宿主细胞时间，以合成所述蛋白。然后在分离和纯化蛋白质之前，培养物通常会冷冻并冻存一段时间。

当使用原核宿主细胞时，宿主细胞可包含表达内部T7溶菌酶的质粒，例如从质粒pLysSL表达(参见实施例)。这样的宿主细胞裂解释放溶菌酶，然后降解细菌细胞膜。

可包含在载体中、用于在细菌细胞或其它原核细胞中表达的其它序列包括合成核糖体结合位点；强转录终止子，例如来自λ噬菌体的t₀和来自大肠杆菌rrnB操纵子的t₄，以阻止通过转录的阅读并确保所表达蛋白质的稳定性；复制起点，例如ColE1；和β-内酰胺酶基因，赋予氨苄青霉素抗性。

其它宿主细胞包括原核宿主细胞。甚至更优选的宿主细胞是细菌，例如大肠杆菌。可使用的其它细菌包括志贺氏菌(Shigella spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、李斯特氏菌(Listeria spp.)、立克次氏体(Rickettsia spp.)、耶尔森氏菌(Yersinia spp.)、埃希氏菌(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、博德特氏菌(Bordetella spp.)、奈瑟氏菌(Neisseria spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、弗朗西丝氏菌(Franciesella spp.)、棒杆菌(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、衣原体(Chlamydia spp.)、嗜血杆菌(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、军团菌(Legionella spp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、螺杆菌(Helicobacter spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)和丹毒丝菌(Erysipelothrix spp.)。这些细菌的大部分都可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC；10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)。

有大量载体可用于在酵母菌中表达重组蛋白。例如YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17是可用于将遗传构建体引入酿酒酵母(S.cerevisiae)中的克隆载体和表达载体(参见例如Broach等(1983)载于Experimental Manipulation of Gene Expression，M.Inouye Academic Press出版，第83页)。这些载体因存在pBR322 ori而可在大肠杆菌中复制，并且因为酵母2micron质粒复制决定子而可在酿酒酵母中复制。另外，可使用抗药性标记例如氨苄青霉素。

在某些实施方案中，哺乳动物表达载体同时含有原核序列(可促进载体在细菌中繁殖)和一个或多个真核转录单元(其可在真核细胞中表达)。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的某些被来自细菌质粒例如pBR322的序列修饰，以便于同时能在原核细胞和真核细胞中复制和抗药性选择。或者，病毒衍生物例如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)可用于蛋白质在真核细胞中的瞬时表达。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法是本领域众所周知的。有关同时用于原核细胞和真核细胞的其它合适的表达系统，以及通用重组方法，可参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)第16和17章。在某些情况下，希望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组蛋白。这些杆状病毒表达系统的实例包括pVL-衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac-衍生的载体(例如包含pBlueBac III的β-gal)。

在另一变体中，可使用体外翻译系统来产生蛋白质。通常，体外翻译系统是这样的翻译系统：其是至少包含将RNA分子翻译成为蛋白质所需的最少元件的无细胞提取物。体外翻译系统通常至少包含核糖体、tRNA、起始甲硫氨酰-tRNAMet、参与翻译的蛋白质或复合物(例如eIF2和eIF3)、包含帽子结合蛋白(CBP)的帽子结合(CB)复合物和真核起始因子4F(eIF4F)。各种体外翻译系统是本领域众所周知的并且包括市售的试剂盒。体外翻译系统的实例包括真核裂解物，例如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人体细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物。裂解物可市售购自制造商，例如Promega Corp.，Madison，Wis.；Stratagene，La Jolla，Calif.；Amersham，ArlingtonHeights，Ill.；和GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y.。体外翻译系统通常包含大分子，例如酶、翻译因子、起始因子和延伸因子、化学试剂和核糖体。另外，还可使用体外转录系统。这样的系统通常至少包含RNA聚合酶全酶、核糖核苷酸和任何必要的转录起始、延伸和终止因子。可使用本领域已知方法产生用于体外翻译的RNA核苷酸。体外转录和翻译可偶联在一锅法反应中，以从一个或多个分离DNA中产生蛋白质。

当希望蛋白质羧基端片段(即截短突变型)表达时，需要将起始密码子(ATG)添加到包含所需表达序列的寡核苷酸片段中。本领域众所周知的是，可通过使用甲硫氨酸氨肽酶(MAP)，将N端位置的甲硫氨酸经酶解切割。已从大肠杆菌(Ben-Bassat等(1987)J.Bacteriol.169：751-757)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中克隆MAP并已证明其对重组蛋白的体外活性(Miller等(1987)PNAS USA 84：2718-1722)。因此，如有必要，可通过在产生MAP的宿主(例如大肠杆菌或CM89或酿酒酵母)中表达所述重组蛋白，或者在体外通过使用纯化MAP(例如Miller等的方法)，去除N端甲硫氨酸。

当使用植物表达载体时，热激蛋白融合物的表达可受到各种启动子中任一种的驱动。例如，可使用病毒启动子例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等，1984，Nature，310：511-514)或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，1987，EMBO J.，6：307-311)；或者，可使用植物启动子，例如RUBISCO小亚基(Coruzzi等，1994，EMBO J.，3：1671-1680；Broglie等，1984，Science，224：838-843)；或热激启动子例如大豆Hsp 17.5-E或Hsp 17.3-B(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.，6：559-565)。可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体；直接DNA转化；显微注射、电穿孔等，将这些构建体引入植物细胞。有关这些技术的综述可参见例如Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，第VIII部分，第421-463页；和Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，第2版，Blackie，London，第7-9章。

可用于表达蛋白质标签或包含蛋白质标签的融合蛋白的一个替代性表达系统是昆虫系统。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作载体，以表达外源基因。病毒生长在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。可将PGHS-2序列克隆到病毒非必需区(例如多角体蛋白基因)并处于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。编码序列的成功插入将会导致多角体蛋白基因失活并产生非封留的重组病毒(即缺乏由多角体蛋白基因所编码的蛋白性外壳的病毒)。再将这些重组病毒用于感染草地夜蛾细胞，所插入基因就在其中表达。(例如参见Smith等，1983，J.Virol.，46：584，Smith，美国专利号4,215,051)。

在昆虫系统的一个具体实施方案中，将编码热激蛋白融合蛋白的DNA克隆到pBlueBacIII重组传递载体(Invitrogen，San Diego，Calif.)的多角体蛋白启动子下游并转染Sf9昆虫细胞(源自草地夜蛾卵巢细胞，可得自Invitrogen，San Diego，Calif.)，产生重组病毒。重组病毒噬斑纯化之后，制备高滴度病毒贮液，其可用于感染Sf9或High Five^TM(BTI-TN-5B1-4细胞，其来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵细胞匀浆；可得自Invitrogen，San Diego，Calif.)昆虫细胞，产生大量经适当翻译后修饰的所述蛋白。

在其它实施方案中，分别产生热激蛋白融合物和生物素结合蛋白，然后将彼此连接起来，例如共价连接。例如，在体外分别产生热激蛋白融合物和生物素结合蛋白，纯化并在标签与目标蛋白能连接的条件下混合。例如，热激蛋白和/或生物素结合蛋白可从其中已知发生的一个来源获取(分离)，可从细胞培养物中产生并收获，可通过所需热激蛋白融合物的编码基因的克隆和表达而产生，或者可以通过化学合成。此外，编码所需热激蛋白融合物的核酸序列可以通过化学合成。这样的缀合蛋白的混合物可具有不同于单个融合蛋白的特性。

接头(也称为“接头分子”或“交联接头”)可用于缀合热激蛋白和生物素结合蛋白。接头包括能与所限定的若干(通常2分子)的化学基团反应并使之缀合的化学物。大部分已知交联接头与胺基、羧基和巯基反应。靶化学基团的选择是至关重要的，如果所述基团可参与有待缀合的蛋白质的生物活性的话。例如，与巯基反应的马来酰亚胺可使含Cys的蛋白质失活，所述蛋白质其需要Cys来结合靶标。接头可以是同官能性的(包含同类反应性基团)、异官能性的(包含不同反应性基团)或光反应性的(包含在光照时具有反应性的基团)。

接头分子可导致所缀合组合物的不同特性。按照缀合步骤期间分子的柔性和所缀合分子对其靶标(细胞表面分子等)的可用性来考虑接头长度。因此，更长的接头可改善本发明组合物的生物活性，以及制备更容易。接头几何学可用于定向分子，用于与靶标最佳反应。具有柔性几何学的接头可允许交联蛋白质构象改变，当它们与其它蛋白结合时。可以为了其它不同目的而改变接头特性。例如，发现MbuS的芳基结构比MBS的芳族间隔区的免疫原性更低。此外，组分分子的物理特性可控制接头分子的疏水性和功能性。例如，单体单元沿聚合物的顺序可控制聚合接头的疏水性，所述聚合物例如在疏水性单体嵌段中分散着亲水性单体嵌段的嵌段聚合物。

制备和利用各种各样分子接头的化学是本领域众所周知的，许多用于缀合分子的预制接头是市售的，可得自例如Pierce Chemical Co.，Roche Molecular Biochemicals，United States Biological等卖主。

将制备的和/或分离的与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与所需生物素化组分联合给予受试者，其足以形成生物素部分与生物素结合蛋白的非共价缔合。热激蛋白融合物和生物素化组分可同时或序贯给予。如果同时给予的话，热激蛋白融合物和生物素化组分可作为混合物或作为非共价复合物来给予。如果作为非共价复合物来给予的话，一旦制备和/或分离时，可将与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与所需生物素化组分或者在体外或者在体内非共价结合。

可通过在足以促进生物素结合蛋白与生物素结合的条件下，使与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与生物素化组分接触，产生非共价复合物，所述条件是本领域已知的。

已经克隆了各种热激蛋白的基因并已测序，并且可将其用于获取热激蛋白融合物，包括但不限于gp96(人：Genebank检索号X15187；Maki等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：5658-5562(1990)；小鼠：Genebank检索号M16370；Srivastava等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3807-3811(1987))、BiP(小鼠：Genebank检索号U16277；Haas等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2250-2254(1988)；人：Genebank检索号M19645；Ting等，DNA 7：275-286(1988))、hsp70(小鼠：Genebank检索号M35021；Hunt等，Gene 87：199-204(1990)；人：Genebank检索号M24743；Hunt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：6455-6489(1995))和hsp40(人：Genebank检索号D49547；Ohtsuka K.，Biochem.Biophys.Res.Commun.197：235-240(1993))。

与生物素结合蛋白融合的热激蛋白可以与生物素化组分非共价结合。

可通过例如本领域已知方式，将有待于与热激蛋白联合给予的包含蛋白质、细胞或病毒的组分与生物素缀合。在与生物素缀合之前，可采用本领域已知方法，制备和/或分离蛋白质、细胞或病毒。可采用与本文所述的用于热激蛋白融合物的非常类似的方式来利用重组技术。一旦产生和/或分离出组分，就可将生物素分子与蛋白质、细胞或病毒直接缀合。也可通过接头，使生物素与所述蛋白质、细胞或病毒间接缀合。使生物素与在空间上允许生物素与生物素结合蛋白相互作用的区域缀合。生物素化试剂盒和试剂可购自Pierce(Rockford，IL)并用于产生本文所述的生物素化组分。

可克隆多种不同抗原的序列并通过DNA序列分析来表征，所述序列包括在本文所提供的组合物中。含有完整或部分细胞的或病毒的基因组或抗原的细菌载体可得自不同来源，包括例如美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)。可通过先前为了该目的而建立的方法(所述方法是本领域众所周知的)，对可使用的额外抗原进行分离和分类。

使用热激蛋白融合物和生物素化组分的方法

可将本文所述的热激蛋白融合物和生物素化组分给予受试者，以诱导或增强受试者的免疫应答、尤其是细胞介导的细胞毒应答，所述应答是针对生物素化组分所针对的表达抗原的细胞。融合蛋白可以仅仅增强免疫应答(因此可作为免疫原性组合物)或赋予保护性免疫(因此可作为疫苗)。

因此，可将如上所述产生的热激蛋白融合物和生物素化组分纯化至合适的纯度，用作药物组合物。通常，纯化的组合物将具有一种物质，其占组合物所有物质的大于约85％，占所有存在的物质的大于约85％、90％、95％、99％或更多。可将目标物纯化至基本同质(通过常规检测方法不能检出污染物)，其中组合物基本上由一种物质组成。技术人员可按照本文所述技术，采用标准纯化技术来纯化热激蛋白融合物和生物素化组分、或它们的非共价复合物，所述技术例如免疫亲和色谱、大小排阻色谱等。蛋白质纯度可通过本领域技术人员已知的各种方法来确定，包括例如氨基端氨基酸序列分析、凝胶电泳和质谱分析。

因此，提供包含上述热激蛋白融合物和生物素化组分、或它们的非共价复合物的药物组合物。一方面，提供药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所述的药物组合物，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。另一方面，在某些实施方案中，药物组合物可以这样给予或者与药学上可接受的载体混合给予并且也可与其它药物联合给予。因此，联合(组合)治疗包括序贯、同时和单独或共同给予，其方式是首次给予的一种的疗效尚未完全消失时，就给予后续的。

可以不同方式将本文所述的热激蛋白融合物和生物素化组分、或它们的非共价复合物给予受试者。给予途径包括系统的、外周的、胃肠外、肠内、局部和经皮(例如缓释聚合物)。任何其它方便的给予途径都可使用，例如输注或推注，或者通过上皮或粘膜皮肤内层吸收。另外，本文所述的组合物可含有其它药理学上可接受的组分并可在有或无所述组分时给予，所述组分例如生物活性剂(例如佐剂例如硫酸钾铝)、表面活性剂(例如甘油酯)、赋形剂(例如乳糖)、载体、稀释剂和溶媒。此外，组合物可离体用作刺激受试者白细胞的工具，以在体外诱导、扩增和增殖抗原特异性免疫细胞，随后将其再次引入受试者中。

此外，可通过编码热激蛋白融合蛋白序列的核酸在人类受试者中体内表达而给予所述蛋白质。这类核酸的表达和与生物素化组分的接触也可在离体条件下完成，作为刺激受试者白细胞的工具，以在体外诱导、扩增和增殖抗原特异性免疫细胞，随后将其再次引入受试者中。可从目前用于本领域的大量载体中选择适用于指导热激蛋白融合蛋白表达的表达载体。优选的是能够产生高水平表达并能有效转导目标基因的载体。例如，可使用重组腺病毒载体pJM17(All等，Gene Therapy 1：367-84(1994)；Berkner K.L.，Biotechniques 6：616-24 1988)、第二代腺病毒载体DE1/DE4(Wang和Finer，Nature Medicine 2：714-6(1996))或腺伴随病毒载体AAV/Neo(Muro-Cacho等，J.Immunotherapy 11：231-7(1992))。此外，可使用重组逆转录病毒载体MFG(Jaffee等，Cancer Res.53：2221-6(1993))或LN、LNSX、LNCX、LXSN(Miller和Rosman，Biotechniques 7：980-9(1989))。基于单纯疱疹病毒的载体例如pHSV1(Geller等，Proc.Nat′l Acad.Sci.87：8950-4(1990)或痘苗病毒载体例如MVA(Sutter和Moss.Proc.Nat′l Acad.Sci.89：10847-51(1992))可作为替代物使用。

包含启动子和3′序列的频繁使用的特异性表达单元是在以下质粒中发现的那些：质粒CDNA3(Invitrogen)、质粒AH5、pRC/CMV(Invitrogen)、pCMU II(Paabo等，EMBO J.5：1921-1927(1986))、pZip-Neo SV(Cepko等，Cell 37：1053-1062(1984))和pSRa(DNAX，Palo Alto，CA)。采用例如以下手册所述的遗传工程技术，可将基因引入表达单元和/或载体：Molecular Cloning and Current Protocols in Molecular Biology(Sambrook，J.等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press(1989)；Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))。可通过能将核酸以可表达形式(例如作为如上所述的病毒载体的组成部分，作为裸露质粒或其它DNA或包入靶向脂质体或红细胞影中)放入细胞的任何方法，将得到的可表达核酸引入人类受试者细胞(Friedman，T.，Science，244：1275-1281(1989)；Rabinovich，N.R.等，Science.265：1401-1404(1994))。转导方法包括向组织和肿瘤内直接注射，脂质体转染(Fraley等，Nature 370：111-117(1980))，受体介导的胞吞作用(Zatloukal等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：136-153(1992))和粒子轰击介导的基因传递(Eisenbraun等，DNA & Cell.Biol.12：791-797(1993))。

热激蛋白融合物和生物素化组分、或它们的非共价复合物在本发明组合物中的含量是足以在受试者中产生有效免疫刺激反应的量。有效量是当给予时能诱导免疫应答的量。另外，给予受试者的热激蛋白融合物和生物素化组分、或它们的非共价复合物的量将会因各种因素的不同而异，所述因素包括所用的热激蛋白融合物和生物素化组分、受试者的大小、年龄、体重、一般健康状况、性别和膳食、以及一般免疫反应性。对已确定剂量范围的调整和操作是在本领域技术人员能力范围之内的事。例如，热激蛋白融合物、生物素化组分或它们的非共价复合物的量可以是约1微克至约1克，优选约100微克至约1克，和约1毫克至约1克。包含表达载体的组合物的有效量是当给予时能诱导针对药物组合物所针对的抗原的免疫应答的量。此外，给予受试者的表达载体的量将会因各种因素的不同而异，所述因素包括所表达的热激蛋白融合物、受试者的大小、年龄、体重、一般健康状况、性别和膳食、以及一般免疫反应性。需要考虑的额外因素是应用途径和所用载体类型。例如，当用含有热激蛋白融合物的编码核酸的病毒载体进行预防性或治疗性治疗时，有效量范围将会在每千克体重10⁴至10¹²无辅助的、复制缺陷型病毒，优选范围在每千克体重10⁵至10¹¹病毒，最优选范围在每千克体重10⁶至10¹⁰病毒。

融合蛋白和生物素化组分、或它们的非共价复合物用于在受试者中诱导免疫应答的有效量的确定是在本领域技术人员的能力范围之内的事，尤其是根据本文所提供的详细公开。

可根据体外测定初步估计有效量。例如，可使用本领域众所周知的技术，在动物模型中配制剂量，以达到对免疫应答的诱导。本领域普通技术人员可容易地根据动物数据来优化对人类的给予。给予量和间隔都可个别地调整。例如，当用作疫苗时，可给予本发明的蛋白和/或毒株约1-3剂，共1-36周时间。优选地，给予3剂，间隔约3-4个月，此后定期给予加强接种。替代方案可适用于个别患者。合适剂量是当如上所述地给予时，能在已接种患者中提高免疫应答而足以保护患者在至少1-2年内免遭疾病或感染的蛋白或毒株的量。

组合物也可包含佐剂，以增强免疫应答。另外，这样的蛋白质可进一步悬浮在油乳剂中，使蛋白质在注射后在体内更缓慢释放。可通过本领域技术人员众所周知的技术，确定制剂中各组分的最佳比例。

各种佐剂中的任一种都可用于本发明的疫苗，以增强免疫应答。大部分佐剂都含有设计用于保护抗原以免快速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，以及特异性或非特异性的免疫应答刺激剂，例如脂质A或Bortadella pertussis。合适的佐剂是市售的，包括例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)和Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)。其它合适的佐剂包括硫酸钾铝、生物可降解的微球体、单磷酰脂质A、quil A、SBAS1c、SBAS2(Ling等，1997，Vaccine 15：1562-1567)、SBAS7、Al(OH)₃和CpG寡核苷酸(WO96/02555)。

在本发明的疫苗中，佐剂可诱导Th1型免疫应答。合适的佐剂系统包括例如单磷酰脂质A，优选3-de-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。一个强化系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是3D-MLP和皂苷QS21的组合(其公开于WO 94/00153)，或一种反应原性较低的组合物(其中QS21用胆固醇猝灭，其公开于WO 96/33739)。先前的实验已经证明了3D-MLP和QS21组合在同时诱导体液免疫应答和Th1类细胞免疫应答上的清楚的协同效应。一种包括QS21、3D-MLP和生育酚在水包油乳剂中形成的特别强效的佐剂描述于WO 95/17210并可包括制剂。

药盒

本发明提供用于表达或给予与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的药盒。这样的药盒可包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的编码核酸。核酸可包含在质粒或载体例如细菌质粒或病毒载体中。其它药盒包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。此外，本发明提供用于产生和/或纯化与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的药盒。这样的药盒可任选包含本文所述的生物素化组分或生物素化试剂。

本发明提供用于在患者中预防或治疗感染性或恶性疾病的药盒。例如，药盒可包含一种或多种如上所述的药物组合物和任选的使用说明书。在再一些实施方案中，本发明提供包含一种或多种药物组合物和一种或多种装置的药盒，所述装置用于完成所述组合物的给予。

可包装药盒组分，用于前述方法的或者手工或者部分或全部自动化实践。在涉及药盒的其它实施方案中，可提供使用说明书。

实施例

现在已经一般性地描述了本发明，参考以下实施例将会更容易地理解本发明，所述实施例仅仅是为了说明某些方面和本发明实施方案的目的，并且不得视为以任何方式限制本发明。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都在本领域技术人员范围之内。这些技术在文献中有描述。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover编著，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著，1984)；Mullis等美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins编著.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins编著.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编著，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等编著)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker  编著，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

实施例1

i)MTBhsp70的产生

通过首先修饰载体而引入所需限制位点SfiI，将MTBhsp70亚克隆到表达载体pET45b(+)中。该修饰允许将MTBhsp70蛋白引入NotI/XhoI位点并将其它蛋白质例如scFvs、抗原、抗生物素蛋白等引入SfiI/NotI位点(图1)。可修改这个具体方法，将所需蛋白引入MTBhsp70的C端。如图2所示，使用由Richard Young博士提供的MTBhsp70质粒，将限制位点NotI和XhoI分别引入5’端和3’端。

如图2第1道所示，用限制酶NotI和XhoI对扩增MTBhsp70片段进行消化，出乎意料地显示出2个条带(图3)。测序分析显示，MTBhsp70含有内部NotI和SfiI限制位点。用图4所示策略除去这些位点。所得MTBhsp70pET-45b(+)构建体再用于转化感受态BL21(DE3)菌。加入1mM IPTG诱导MTBhsp70的表达。在37℃将细胞培养在LB培养基上直到OD₆₀₀为0.5。将细胞离心并悬浮于含有1mM IPTG的LB培养基上并在指定温度下继续培养4小时。将细胞分级并用等分试样进行SDS-PAGE，再用考马斯蓝对蛋白质进行染色。当诱导的细胞在37℃培养时，发现大部分MTBhsp70蛋白在不溶性包涵体中。诱导之后，将培养温度降低至30℃，产生大量可溶性MTBhsp70。通过金属亲和色谱(MAC)，使用钴离心柱(Cobalt spin column)，成功地纯化了在30℃生长的BL21(DE3)的可溶性部分和周质部分中发现的MTBhsp70蛋白。将细胞在37℃培养至OD₆₀₀为0.5，然后离心沉淀。将细胞悬浮于含有1mM IPTG的生长培养基中并让其在30℃培养4小时。按照包括用来自Pierce的B-PER试剂溶解的标准方法，将细胞分级。

ii)MTBhsp70-融合蛋白的产生

为了证明MTBhsp70-融合蛋白的免疫刺激性，构建卵清蛋白肽-MTBhsp70和两种scFv-MTBhsp70融合产物。

a.Ova-257-264-MTBhsp70融合蛋白。Young博士的研究组证实，卵清蛋白的优势免疫肽是由残基257-264(SIINFEKL)组成。通过用SfiI和NotI消化MTBhsp70pET-45b(+)质粒并引入编码优势免疫肽的接头(其也用SfiI和NotI消化)，将这种肽与MTBhsp70的N端区融合(图5)。连接后，获得大量菌落，并通过测序证实它们的身份(图6)。正如用MTBhsp70所观察到的，当生长温度、IPTG后诱导都维持在30℃时，Ova-257-264-MTBhsp70的诱导是最佳的。在BL21(DE3)的可溶性部分中得到Ova254-264-MTBhsp70的成功表达。

b.scFv-MTBhsp70融合蛋白。将scFvs融合到MTBhsp70的N端。构建人组合scFv噬菌体展示文库并将其用于选择卵清蛋白特异性scFvs。其它scFv，MOV18，对卵巢癌细胞上表达的高亲和性叶酸受体具有特异性。克隆方法类似于用于将Ova_254-264肽引入MTBhsp70的N端所用的方法。从各自的质粒中纯化SfiI/NotI scFv部分，然后连接到经SfiI/NotI消化的表达载体MTBhsp70pET-45b(+)。抗卵清蛋白scFvs具有若干无义突变，其可通过位点定向诱变而除去。然而，一旦携带这两种构建体的细菌被诱导，发现用IPTG的诱导会导致融合蛋白在包涵体中表达。

iii)抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70的产生

抗生物素蛋白与接头元件和与MTBhsp70的融合物可用于产生自我装配疫苗。这在图7有说明，其中接头部分表示为抗生物素蛋白和热激蛋白之间的线段。抗生物素蛋白是同型四聚体糖基化蛋白，分子量为68,000(因此各亚基为17,000道尔顿)。可如本文所述地产生并使用由Markku S.Kulomaa博士所描述的野生型(四聚体)或单体型。按照图8的示意描述了这些分子。抗生物素蛋白单体型在5个氨基酸位置不同于野生型。这在图9有说明。一系列引物和接头用于装配每种抗生物素蛋白构建体。

通过基于PCR的诱变来纠正小突变。这在图10有说明，该图显示对单体型抗生物素蛋白(克隆M1)作出的两个改变。单体型和野生型的抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70构建体都成功获得，如图11所示。这两个构建体导致大量蛋白产生，当用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导时。然而，发现所诱导的抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70蛋白主要存在于包涵体中，可将其溶解、变性和重折叠。

用盐酸胍和DTT变性之后，将蛋白质稀释在4种不同重折叠缓冲液中：(1)吐温40，胱氨酸；2)吐温60，胱氨酸；3)CTAB，胱氨酸；4)SB3-14，胱氨酸；含有胱氨酸是为了猝灭过量DTT。加入3％CA溶液之后，让蛋白质在室温下重折叠过夜。为了评价重折叠水平，将重折叠的蛋白质等分试样加入到包埋生物素的孔中。因此，适当重折叠的抗生物素蛋白-接头-MTBhsp70蛋白将会紧紧结合在这些孔的底部。通过使用针对MTBhsp70的单克隆抗体，然后再通过用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠(H+L)抗体来测定已结合的抗MTBhsp70，就可测定与板结合的蛋白质的数量。记录450nm处的光密度并将结果表示为％最大信号。结果见图12。适当重折叠每种蛋白质，可包括让每种蛋白质经历不同条件。为了评价这些蛋白质的重折叠MTBhsp70部分的生物活性，可测定其水解ATP的能力。此外，可测定MTBhsp70对THP-1细胞的趋化效应。

实施例2

m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70蛋白的自我装配和生物活性测定如下：

1)ATP酶活性的测定。已知MTBhsp70的N端部分在某些测定条件下能水解ATP。可通过将我们的m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70蛋白的ATP酶活性与市售制备物和我们自己的MTBhsp70的活性进行比较，测定我们的m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70蛋白的适当重折叠。

2)对趋化因子产生的趋化活性/诱导的测定。

对我们的m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70蛋白的MTBhsp70部分的适当重折叠的另一测定是它们成功地从细胞系THP-1诱导出CC趋化因子。已知将单核细胞细胞系THP-1暴露给MTBHhsp70，能诱导产生RANTES、MIP-1α和MIP-1β。反过来，这些趋化因子又将刺激趋化活性。

3)自我装配。重折叠的m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70蛋白与生物素结合。为了证明自我装配，可证明这些蛋白质与生物素化分子形成稳定复合物的能力。可证明与生物素化卵清蛋白和生物素化eGFP的结合。通过用抗MTBhsp70和抗生物素化抗原的免疫沉淀来评价成功装配。

4)免疫力的体内诱导。一旦用生物素化卵清蛋白-m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70和生物素化Ova_257-264-m/w抗生物素蛋白-接头-N-MTBhsp70对C57BL/6小鼠进行免疫接种后，可通过测定CD8T细胞的活化，证明自我装配疫苗的免疫刺激活性。

实施例3

具有抗生物素蛋白的MTBHSP70构建体与生物素化HRP和生物素化抗OVA抗体自我装配。

方法

i)质粒构建体

将MTBHSP70亚克隆到表达载体pET45b(+)中，然后在N端连接CD8特异性卵清蛋白肽_(Ova257-264)。装配基于公布序列的抗生物素蛋白和单体型抗生物素蛋白并将MTBHSP70的N端连接到表达载体pET45b(+)上。

ii)蛋白质表达和纯化

用不同构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过添加IPTG诱导表达。通过IMAC，在TritonX-114(Sigma)存在下纯化蛋白质，以除去内毒素。

iii)免疫接种

用卵清蛋白或Ova_257-264-L-MTBHSP70对C57BL/6雄性小鼠进行皮下免疫接种，在第30天处死小鼠。

iv)结果测定

a.干扰素-γ.经过2次皮下接种后，在第30天处死小鼠并制备脾细胞。在布雷菲德菌素A(golgi plug)和Ova_257-264肽或无关肽存在下，将脾细胞(2x10⁶/孔)在37℃孵育4小时。孵育终止操作如下：通过用5％FBS的PBS洗涤细胞，接着在用BD’s Cytofix/Cytoperm溶液渗透细胞之后，对CD3、CD4、CD8和干扰素-γ染色。通过流式细胞术并用FlowJo分析，评价细胞染色。

b.五聚体染色。如上所述地处理细胞，除此之外，首先使用R-PE缀合的重组鼠MHC五聚体H-2Kb SIINFEKL(来自PROIMMUNE)来处理它们。

c.自我装配。采用基于ELISA的测定。将不同浓度的生物素化辣根过氧化物酶(HRP)与经纯化并重折叠的抗生物素蛋白-MTBHSP70混合在一起。将所得混合物加入到His-Grab板(ThermoScientific)上，通过用PBS 0.1％吐温20洗涤而除去未结合的生物素化HRP，再加入TMB。在20分钟后终止反应，在450nm处读出结果。

结果

6xHis-MTBHSP 70和6xHis-Ova(257-264)-MTBHSP 70融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。在每种情况下，NotI-XhoIMTBHsp70片段用于融合构建体。蛋白质表达是通过加入IPTG而诱导的。细胞经破碎和分级成可溶性部分(#1和#4)、周质部分(#2和#5)和包涵体部分。各部分的等分试样在4-12％Bis-Tris NUPAGE凝胶(Invitrogen)上进行变性SDS-PAGE。

i)与MTBHSP70连接的抗生物素蛋白和单体型抗生物素蛋白在大肠杆菌中的表达

装配野生型抗生物素蛋白(w抗生物素蛋白)和单体型抗生物素蛋白并克隆到pET45b(+)。制备融合构建体，其包含在MTBHSP 70的N端连接的6xHis-抗生物素蛋白。将每种质粒构建体用于转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达。

ii)免疫接种#1

如下所述，在第1天和第17天对C57BL/6雄性小鼠进行皮下免疫接种，在第30天处死小鼠：

●卵清蛋白+CFA

●卵清蛋白

●卵清蛋白+MTBhsp70

●Ova_肽-MTBhsp70

iii)结果测定

在用CD8肽SIINFEKL(Ova_257-264)刺激脾细胞后，测定干扰素γ的产生，结果见图16和下表1。

表1.在用Ova_257-264刺激后，产生干扰素-γ的CD+8脾细胞％

iv)免疫接种#2

按照免疫接种#1所述，对C57BL/6小鼠(雄性)进行皮下免疫接种。接种组如下：

●组A CFA+卵清蛋白(3只小鼠)

●组B CFA+Ova肽(257-264)(3只小鼠)

●组C Ova肽-MTBhsp70融合物(3只小鼠)

●组D Ova肽+MTBhsp70(3只小鼠)

●组E MTBhsp70(3只小鼠)

●组F盐水(1只小鼠)

v)结果

收获脾细胞，用CD3、CD4、CD8和来自Prolmmune的H-2Kb/SIINFEKL(OVA)五聚体染色。

vi)结论

HSP融合蛋白构建体在大肠杆菌中发展并表达。通过干扰素-γ产生和H-2Kb/SIINFEKL(OVA)染色的测定，Ova肽257-264与MTBHSP 70的N端的融合导致抗原特异性T细胞的成功扩增。

实施例4

在MTBHSP 70的N-端或C-端包含抗生物素蛋白的修饰构建体。

i)测定自我装配

用His-Grab板ELISA来评价融合蛋白抗生物素蛋白-MTBHSP 70与生物素化辣根过氧化物酶(HRP)的自我装配。用氯化胍溶解包涵体并针对含有逐渐增加浓度的胍缓冲液缓慢透析。部分重折叠的蛋白与不同量的生物素化HRP一起孵育，然后加入到His-Grab板。在450nm处读板。

ii)评价自我装配疫苗的靶向

通过流式细胞术评价自我装配疫苗的靶向。将部分重折叠的抗生物素蛋白MTBHSP 70蛋白与生物素化抗卵清蛋白抗体一起孵育，并使所得复合物捕获在磁性His-标签特异性珠上。除去过量抗体之后，加入Alexa Fluor 555标记的卵清蛋白。通过流式细胞术在R-PE通道分析样品。当与单用珠子相比时，仅观察到非常微弱的差异。通过统计学分析证实了靶向自我装配。

iii)结论

已经成功地表达由在MTBHSP 70N端的或者肽抗原或者抗生物素蛋白组成的融合蛋白。当通过干扰素γ产生和CD8+T细胞的扩增(五聚体染色)的测定，用在MTBHSP 70N端融合在框架中的Ova肽(257-264)进行免疫接种，导致对抗原特异性免疫应答的诱导。也设计了在MTBHSP 70的或者N端或者C端表达抗生物素蛋白的构建体，因此允许该构建体与生物素化临床相关抗体的自我装配。抗生物素蛋白融合蛋白在大肠杆菌中成功表达，但发现是在包涵体中。这些蛋白质的重折叠是部分成功的并且目前被优化。在初步实验中证明MTBHSP70-抗生物素蛋白与生物素化单克隆抗体的低效自我装配。

参考文献

Chen，W.，U.Syldath等(1999)。″Human 60-kDa heat-shock protein：a danger signal to the innate immune system(人60-kDa热激蛋白：对先天免疫系统的一个危险信号).″J Immunol 162(6)：3212-9.

Laitinen，O.H.，H.R.Nordlund等(2007)。″Brave New(Strept)avidins in Biotechnology(优秀的新型链霉抗生物素在生物工程中).″Trends Biotechnol 25(6)：269-77.

Nordlund，H.R.，V.P.Hytonen等(2005)。″Tetravalent single-chain avidin：from subunits to protein domains via circularly permuted avidins(四价单链抗生物素蛋白：通过循环改变的抗生物素蛋白，从亚基到蛋白质区).″Biochem J 392(Pt 3)：485-91.

Srivastava，P.K.和R.G.Maki(1991)。″Stress-induced proteins in immune response to cancer(在针对癌症的免疫应答中的应激诱导的蛋白质).″Curr Top Microbiol Immunol 167：109-23.

Zugel，U.和S.H.Kaufmann(1999)。″Role of heat shock proteins in protection from and pathogenesis of infectious diseases(热激蛋白在免遭感染性疾病中的保护作用和在感染性疾病发病机制中的作用).″Clin  Microbiol Rev 12(1)：19-39.

等同实施方案

尽管已经讨论了本发明的具体实施方案，但是上述说明书是说明性的而非限制性的。参考本说明书，本发明的许多变更对于本领域技术人员来说将会是显而易见的。所附权利要求书并非要求保护所有这样的实施方案和变更，根据权利要求书、以及等同实施方案和说明书的全部范围、以及这些变更，应当确定本发明的全部范围。

引用

相关方法由本发明人公开于PCT/US2007/061554，所述文献的全部内容都通过引用结合到本文中。

通过引用全部结合的还有任何多核苷酸序列和蛋白质序列，所述序列涉及在互联网(ncbi.nlm.nih.gov)上登录国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的公众数据库的相关检索号。本说明书全文所引用的所有参考文献的内容，包括文献资料、已授予的专利、已公布或未公布的专利申请，也通过引用结合到本文中。

Claims (26)

1.一种药物组合物，所述组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与4个生物素化组分非共价结合，而且其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述4个生物素化组分中至少1个包含蛋白质、细胞或病毒。

3.权利要求2的药物组合物，其中所述细胞选自经亚致死辐照的肿瘤细胞、细菌细胞、真菌细胞和原生动物细胞。

4.权利要求2的药物组合物，其中所述蛋白质选自抗原、抗体和共刺激分子。

5.权利要求1的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性抗生物素。

6.权利要求1的药物组合物，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。

7.权利要求1的药物组合物，其中所述热激蛋白选自MTBhsp70热激蛋白和人热激蛋白。

8.权利要求1的药物组合物，所述组合物是疫苗。

9.用于产生权利要求1-8中任一项的自我装配的药物组合物的方法，所述方法包括使与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与4个生物素化组分接触，其足以形成所述热激蛋白和所述4个生物素化组分的非共价复合物，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

10.用于在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试者与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和4个生物素化组分，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

11.权利要求10的方法，其中所述4个生物素化组分中至少1个包含蛋白质、细胞或病毒。

12.权利要求11的方法，其中所述细胞选自经亚致死辐照的肿瘤细胞、细菌细胞、真菌细胞和原生动物细胞。

13.权利要求12的方法，其中将所述肿瘤细胞从所述受试者中取出。

14.权利要求10的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性抗生物素。

15.权利要求10的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。

16.权利要求10的方法，其中所述热激蛋白选自MTBhsp70热激蛋白和人热激蛋白。

17.权利要求10的方法，其中将所述与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和所述4个生物素化组分以非共价复合物形式给予所述受试者。

18.在受试者中增加治疗药效力的方法，所述方法包括给予所述受试者与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和4个生物素化组分，其中所述4个生物素化组分中至少2个是不同的。

19.权利要求18的方法，其中所述4个生物素化组分中至少1个选自蛋白质、细胞和病毒。

20.权利要求19的方法，其中所述细胞选自经亚致死辐照的肿瘤细胞、细菌细胞、真菌细胞和原生动物细胞。

21.权利要求18的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性抗生物素。

22.权利要求18的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。

23.权利要求18的方法，其中所述热激蛋白选自MTBhsp70热激蛋白和人热激蛋白。

24.权利要求18的方法，其中将所述与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和所述4个生物素化组分以非共价复合物形式给予所述受试者。

25.权利要求11的方法，其中所述蛋白质选自抗原、抗体和共刺激分子。

26.权利要求10的方法，其中所述4个生物素化组分中至少1个包含共刺激分子。

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