CN114364395A - 用于治疗癌症的自组装疫苗和组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本文提供的是包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的自组装药物组合物，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞、肿瘤抗原、病毒或病毒抗原)非共价结合。自组装药物组合物可以进一步包含免疫疗法(例如，抗PD‑1抗体)。另外，提供了使用这些药物组合物来预防和/或治疗癌症或诱导免疫应答的方法。还提供了使用与免疫疗法(例如，抗PD‑1抗体)组合的自组装药物组合物的方法。

Description

用于治疗癌症的自组装疫苗和组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年7月19日提交的美国临时申请号62/876,045的权益，所述美国临时申请通过参考以其整体引入本文。
背景技术
虽然通常与传染病相关，但疫苗在治疗癌症方面具有悠久的历史。与免疫疗法类似，癌症疫苗已具有有限的成功，并且没有发现普遍的效用。以前，癌症疫苗基于整个肿瘤，其可以包括来自健康细胞和癌细胞两者的信号，这导致较少的特异性和较低的总体活性。然而，随着DNA测序已变得越来越普遍，现在有可能鉴定与肿瘤细胞特异性相关且在健康细胞中未发现的突变。一些肿瘤特异性突变可以充当肿瘤特异性抗原或“新抗原”。这些是新的免疫靶，其可以用于训练患者的免疫系统以特异性地靶向癌细胞。众多公司正在努力开发管道和算法，以从患者中收集肿瘤并鉴定可以并入个性化疫苗内的可靶向突变。然而，靶的鉴定只是第一个挑战。靶通过其呈递给免疫系统的方法与实际的靶是同等重要的，如果不是更重要的话。在没有适当免疫刺激的情况下递送良好靶的疫苗可以削弱任何潜在的益处。
因此，需要可以适应任何肿瘤类型的靶并且适当地刺激特异性抗肿瘤免疫细胞的扩增的疫苗平台。
发明内容
本文提供的是用于预防和/或治疗癌症的组合物和方法。在一些方面，本文提供的是药物组合物，该药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白、基本上由其组成或由其组成，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽(1)与MHC I类分子结合；并且(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肽是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。在一些实施方案中，药物组合物是疫苗。在一些实施方案中，肽具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的卵巢癌的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽(1)与MHC I类分子结合；并且(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肽是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。在一些实施方案中，肽具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，用于本文所述的方法中的药物组合物是疫苗。在一些实施方案中，该方法是治疗卵巢癌(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌)的方法。在某些实施方案中，药物组合物作为非共价复合物施用于受试者。
在一些方面，本文提供的是药物组合物，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原非共价结合；以及(2)免疫疗法。在一些实施方案中，肿瘤抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肿瘤抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，该组合物包含(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原非共价结合；以及(2)免疫疗法。在一些实施方案中，肿瘤抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肿瘤抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在某些实施方案中，该方法是治疗癌症的方法。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中的生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原衍生自与待预防和/或治疗的癌症相同类型的癌症。例如，癌症可以是卵巢癌(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌)或人乳头状瘤病毒(HPV)相关癌症(例如，HPV诱导的宫颈癌、HPV诱导的肛门癌或HPV诱导的头颈癌)。在一些实施方案中，癌症由产生肿瘤的病毒(例如，人乳头状瘤病毒(HPV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)或疱疹病毒)的感染所诱导。在一些实施方案中，该方法进一步包括选自放射、放射增敏剂、化学疗法和第二免疫疗法的癌症疗法。免疫疗法或第二免疫疗法可独立地是免疫检查点抑制剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，免疫调节剂是CXCR4/CXCR7拮抗剂(例如，AMD3100)、Jak/stat抑制剂(例如，鲁索替尼)或皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者联合施用免疫疗法和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原非共价结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肿瘤抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，该方法是治疗癌症的方法。在一些实施方案中，免疫疗法和药物组合物同时或序贯施用。在一些实施方案中，药物组合物在免疫疗法之前施用。在一些实施方案中，药物组合物中的生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原衍生自与待预防或治疗的癌症相同类型的癌症。例如，癌症可以是卵巢癌(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌)、人乳头状瘤病毒(HPV)相关癌症(例如，HPV诱导的宫颈癌、HPV诱导的肛门癌、HPV诱导的口癌、HPV诱导的外阴癌、HPV诱导的阴道癌、HPV诱导的阴茎癌或HPV诱导的头颈癌)。在一些实施方案中，癌症由产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)的感染所诱导。在一些实施方案中，该方法进一步包括选自放射、放射增敏剂和化学疗法的癌症疗法。
在一些实施方案中，生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞非共价结合；并且生物素化的肿瘤细胞在其表面上表达抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞是非复制性的，例如由于辐照。在一些实施方案中，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的肉瘤细胞或生物素化的癌细胞，例如，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。在某些实施方案中，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的卵巢癌细胞(例如，生物素化的浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞)。在某些实施方案中，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的人乳头状瘤病毒(HPV)相关癌细胞(例如，生物素化的HPV诱导的宫颈癌、生物素化的HPV诱导的肛门癌或生物素化的HPV诱导的头颈癌)。
在一些实施方案中，生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤抗原非共价结合。肿瘤抗原可以是由肿瘤细胞过表达的蛋白质或其免疫原性片段。肿瘤抗原可以是在肿瘤细胞中特异性突变的蛋白质或其免疫原性片段。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含整体或部分灭活的产生肿瘤的病毒。在其它实施方案中，肿瘤抗原包含衍生自产生肿瘤的病毒的蛋白质或其免疫原性片段。产生肿瘤的病毒可以是例如HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒。在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤衍生的磷酸肽。在一些实施方案中，肿瘤抗原能够引发免疫应答。在一些实施方案中，肿瘤抗原衍生自肉瘤细胞或癌细胞，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。在某些实施方案中，肿瘤抗原衍生自卵巢癌细胞(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞)。在优选的实施方案中，肿瘤抗原是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。在某些实施方案中，肿瘤抗原衍生自人乳头状瘤病毒(HPV)相关癌细胞(例如，HPV诱导的宫颈癌、HPV诱导的肛门癌、HPV诱导的口癌、HPV诱导的外阴癌、HPV诱导的阴道癌、HPV诱导的阴茎癌或HPV诱导的头颈癌)。
在一些实施方案中，免疫疗法抑制免疫检查点。在某些实施方案中，免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4 (CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR。例如，免疫检查点可能是PD1或PD-L1。在优选的实施方案中，免疫疗法是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，免疫疗法是选自以下的免疫调节剂：CXCR4/CXCR7拮抗剂(例如，AMD3100)、Jak/stat抑制剂(例如，鲁索替尼)和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，HPV病毒抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，用于本文所述的方法中的药物组合物是疫苗。在某些实施方案中，该方法是治疗HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的方法。在一些实施方案中，药物组合物作为非共价复合物施用于受试者。
在一些方面，本文提供的是药物组合物，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合；以及(2)免疫疗法。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，HPV病毒抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合；以及(2)免疫疗法。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，HPV病毒抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在某些实施方案中，该方法是治疗HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的方法。在一些实施方案中，该方法进一步包括选自放射、放射增敏剂、化学疗法和第二免疫疗法的癌症疗法。免疫疗法或第二免疫疗法可独立地是免疫检查点抑制剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，免疫调节剂是CXCR4/CXCR7拮抗剂(例如，AMD3100)、Jak/stat抑制剂(例如，鲁索替尼)或皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节。
在一些方面，本文提供的是预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向受试者联合施用免疫疗法和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与MHC I类分子结合。在一些实施方案中，HPV病毒抗原与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，HPV病毒抗原具有5-50个氨基酸的长度(例如，8-12个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，该方法是治疗HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的方法。在一些实施方案中，免疫疗法和药物组合物同时或序贯施用。在一些实施方案中，药物组合物在免疫疗法之前施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括选自放射、放射增敏剂和化学疗法的癌症疗法。
在一些实施方案中，生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒非共价结合；并且生物素化的HPV病毒表达抗原。HPV病毒可以是整体或部分灭活的HPV病毒。在其它实施方案中，生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。生物素化的HPV病毒抗原可以是生物素化的E6蛋白、生物素化的E7蛋白或其生物素化的免疫原性片段。在具体实施方案中，生物素化的HPV病毒抗原选自表3。在一些实施方案中，药物组合物增加患有HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的受试者的存活率。
进一步提供了众多实施方案，其可以应用于本公开的任何方面和/或与本文描述的任何其它实施方案组合。例如，在一些实施方案中，生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。在一些实施方案中，生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。在某些实施方案中，热激蛋白是hsp70家族的成员。在具体实施方案中，热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。例如，热激蛋白可以具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，药物组合物是疫苗。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物增加患有癌症(例如，卵巢癌(如浆液性或上皮性乳头状卵巢癌)或HPV相关癌症)的受试者的存活率。在一些实施方案中，药物组合物增加免疫应答。在一些实施方案中，药物组合物增加免疫细胞的增殖。
在一些方面，本文提供的是用于产生本文所述的药物组合物的方法，其包括使融合至生物素结合蛋白的热激蛋白与生物素化的肽接触，足以形成热激蛋白和生物素化的肽的非共价复合物，其中所述肽(1)与MHC I类分子结合；并且(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。在一些实施方案中，肽是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。
在一些方面，本文提供的是在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。
附图说明
图1显示了自组装疫苗(SAV)的示意图。MTB-HSP70是每一个SAV的免疫刺激基本单元，无论是何种靶。MTB-HSP70包括抗生物素蛋白以附着可变单元，这提供特异性靶向肽序列(标记的可变单元)。
图2显示了不同治疗的小鼠的存活百分比。
具体实施方式
概述
本发明至少部分基于以下发现：与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合的热激蛋白融合物导致了自组装疫苗(SAV)，其增加患有癌症(例如卵巢癌)的小鼠的存活百分比。重要的是，SAV和免疫疗法(例如，抗PD-1抗体)的组合治疗显示了对促进这些小鼠的存活的协同作用。这些效应至少部分是由于免疫细胞的增殖增加。相应地，提供了单独使用SAV或与免疫疗法组合使用SAV用于预防和/或治疗癌症的组合物和方法。
对于所有疫苗的主要挑战是开发所需的成本和时间。这些约束在新出现的传染病和癌症的背景下特别严重，其中疫苗必须针对靶进行定制，然后快速且成本有效地进行生产。为了解决这个差距，在某些实施方案中，本发明涉及具有免疫激活基本单元的模块化平台，所述免疫激活基本单元可以与引发免疫应答的靶向模块偶联。尽管最初为靶向传染病而开发，但该平台在本文中被证实同样能够将靶向模块递送至不同的癌症类型。在一些实施方案中，该平台的基本单元是MTB-HSP70，即具有已知免疫刺激性质的细菌蛋白，其被修饰为包括抗生物素蛋白。抗生物素蛋白的掺入允许基础物连接到特异性靶向模块，例如称为肽的蛋白质亚基(参见图1)。在某些实施方案中，用于靶向肿瘤的肽可以选自在肿瘤中异常丰富的蛋白质、肿瘤特有的突变以及针对其为癌细胞标志的蛋白质的修饰。计算工具可以用于鉴定预期对于免疫系统提供良好靶的靶特异性肽，确定肽链的适当结构，以及掺入合成定制肽所需的任何变化。
在某些实施方案中，这些定制肽包括与抗生物素蛋白结合的生物素，其在免疫刺激组分和癌症靶向组分之间形成难以置信的稳定键合。这种方法被称为“自组装疫苗”或“SAV”，因为它可以在无需任何进一步的专门化学或纯化的情况下进行制备。以前，已显示了SAV方法可以促进针对细菌和病毒靶的特异性免疫应答(Leblanc等人(2014) Human Vaccin. Immunother. 10:3022-3038)。其它研究也已显示了MTB-HSP70可以改善肿瘤靶向性抗体的功能。因此，SAV技术可以用于制造肿瘤特异性疫苗，其任选地进一步包含内置的广泛免疫激活佐剂。在某些实施方案中，疫苗以多种方式靶向肿瘤，这导致有利的抗肿瘤免疫应答。
卵巢癌是特别紧迫的未满足需要的领域，因为绝大多数诊断有该疾病的女性患有晚期癌症。对于大多数女性，手术和化学疗法最初是有效的。然而，很大百分比的女性最终在五年内复发。虽然免疫疗法已显示了对于其它癌症类型的显著希望，但卵巢癌中的结果是令人失望的(underwhelming)。最近围绕免疫疗法的热情已导致对癌症疫苗开发的重新兴趣。用于癌症的有效疗法将很可能依赖于手术和化学疗法的传统方法连同对每个患者定制的方案的组合，所述方案可以包括靶向药物、免疫疗法和个性化疫苗。
在某些实施方案中，SAV包含肽，其来自已知由肿瘤过表达的蛋白质或来自在癌细胞中特异性突变的蛋白质。在某些实施方案中，该肽单独地引发免疫应答。
在某些实施方案中，本发明涉及与免疫疗法试剂(例如靶向PD-1的抗体)共施用的药物组合物。在针对感染或肿瘤的斗争中已变得耗尽的免疫细胞经常在其表面具有高水平的PD-1。抗PD-1抗体可以结合这些低功能性免疫细胞的表面并重新激活它们。然而，这种治疗并不增加体内的抗肿瘤免疫细胞的数目。在某些实施方案中，肿瘤靶向疫苗(以增加抗癌免疫细胞的数目)连同抗PD-1 (以恢复且维持其功能)一起的使用，产生优于迄今为止用单独的任一方法可见的结果。
定义
为方便起见，在进一步描述本发明之前，在此定义了于说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。
如本文使用的，“分离的蛋白质”指这样的蛋白质，当从细胞中分离或通过重组DNA技术产生时，所述蛋白质基本上不含其它蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基，或者当化学合成时，所述蛋白质基本上不含化学前体或其它化学制品。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自细胞或组织来源(抗体、多肽、肽或融合蛋白由其衍生)的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学制品。语言“基本上不含细胞材料”包括这样的制剂，其中本发明的组合物与它们由其分离或重组产生的细胞的细胞组分分开。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞材料”包括具有小于约30%、20%、10%或5% (按干重计)的细胞材料的制剂。当抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)重组产生时，它还优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20%，更优选小于约10%，且最优选小于约5%。
“约”和“大约”一般应该意指考虑到测量的性质或精确度，关于所测量的数量的可接受的误差程度。通常，示例性的误差程度在给定值或值范围的20%内，优选在10%内，且更优选在5%内。可替代地，且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指在给定值的一个数量级内、优选在5倍内、且更优选在2倍内的值。除非另有说明，否则本文给出的数值数量是近似的，意指当没有明确陈述时，可以推断出术语“约”或“大约”。
术语“施用”预期包括允许药剂执行其预期功能的施用途径。可以使用的用于治疗身体的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、经口、吸入和经皮途径。注射可以是推注或可以是连续输注。取决于施用途径，药剂可以用选定的材料包被或置于该材料中，以保护其免于自然条件，所述自然条件可能有害地影响其执行其预期功能的能力。药剂可以单独施用，或与药学上可接受的载剂结合施用。药剂还可以作为前药施用，所述前药在体内转换为其活性形式。
“肠胃外”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、病灶内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射，经口，硬膜外，鼻内和输注。
如本文使用的，术语“联合施用”或“联合施用的”或“共施用的”指两种或更多种不同药剂的任何施用形式，使得第二药剂在先前施用的药剂在体内仍有效时进行施用(例如，两种药剂在受试者中同时有效，其可能包括两种药剂的协同效应)。例如，不同的药剂可以在相同的制剂中或在分开的制剂中同时或序贯施用。因此，接受此类治疗的受试者可以受益于不同药剂的组合效应。
术语“氨基酸”预期包含包括氨基官能团和酸官能团两者，并且能够被包括在天然存在的氨基酸的聚合物中的所有分子，无论是天然的还是合成的。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及任何前述项的所有立体异构体。天然氨基酸的名称在本文中依照IUPAC-IUB的建议进行缩写。
术语“抗体”指维持特异性结合能力的免疫球蛋白或其衍生物，以及具有与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结合结构域的蛋白质。术语“抗体”预期涵盖完整抗体或其抗原结合片段。这些蛋白质可以衍生自天然来源，或者部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员，包括人的任何类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在示例性实施方案中，与本文所述的方法和组合物一起使用的抗体是IgG类别的衍生物。抗体可以是改造的抗体或天然存在的抗体。
术语“抗体片段”指小于全长的任何抗体衍生物。在示例性实施方案中，抗体片段保留了全长抗体的特异性结合能力的至少显著部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、scFv、Fv、dsFv双抗体和Fd片段。抗体片段可以通过任何手段产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化而酶促或化学产生，它可以由编码部分抗体序列的基因重组产生，或者它可以完全或部分合成产生。抗体片段可以任选地是单链抗体片段。可替代地，片段可以包含例如通过二硫键合连接在一起的多条链。片段还可以任选地是多分子复合物。功能性抗体片段通常将包含至少约50个氨基酸，且更通常将包含至少约200个氨基酸。
抗体可以是多克隆或单克隆的；异种、同种异体或同基因的；或其修饰形式(例如人源化、嵌合等)。抗体也可以是全人的。优选地，本发明的抗体特异性地或基本上特异性地结合生物标记物多肽或其片段。如本文使用的，术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”指仅含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群体，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群体。单克隆抗体组合物通常展示对于它与之免疫反应的特定抗原单一的结合亲和力。
抗体也可以是“人源化的”，其预期包括具有可变区和恒定区的由非人细胞制备的抗体，所述可变区和恒定区已被改变为更紧密地类似于由人细胞制备的抗体。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列，以掺入在人种系免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人源化抗体可以包括例如在CDR中，并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文使用的，术语“人源化抗体”还包括其中衍生自另一个哺乳动物物种的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。
“抗原”指由本文所述的组合物诱导的免疫应答的靶。抗原可以是蛋白质抗原，并且应被理解为包括在病毒或者受试者的受感染细胞、外来细胞或肿瘤细胞的表面上显示出的整个蛋白质、蛋白质的片段，以及作为例如通过典型的MHC I类或II类途径的蛋白质加工和呈递的结果，由受感染细胞、外来细胞或肿瘤细胞所展示的肽。此类外来细胞的实例包括细菌、真菌和原生动物。
在一些实施方案中，“抗原”与MHC I类分子(例如，HLA分子)结合。用于测试抗原针对HLA II类和I类等位基因的结合潜力的方法是本领域中众所周知的。例如，HLA结合可以使用公开已知的算法(例如EpiMatrix算法)进行预测，或使用如Scholzen等人(2019)Frontiers in Immunology 10:1-22中所述的标准体外HLA结合测定(例如，基于竞争的测定)进行测试。可以使用基于竞争的测定，通过IC50测量结合亲和力。例如，在HLA II类结合测定中具有不多于100 µM的IC50值的蛋白质或肽可以被视为“结合剂”，而具有太高的IC50值而无法在测试的结合条件下准确地被测量(>100 µM)或没有剂量依赖性应答的蛋白质或肽被视为非结合剂。在HLA I类结合测定中，具有不多于1000 µM的IC50值的蛋白质或肽可以被视为“结合剂”，而具有太高的IC50值而无法在测试的结合条件下准确地被测量(>1000 µM)或没有剂量依赖性应答的蛋白质或肽被视为非结合剂。
在一些实施方案中，“抗原”不具有或具有最低限度的自身反应性和/或微生物组反应性。“自身反应性”可以基于抗原和自体天然序列之间共享的序列同源性来进行预测。在一些实施方案中，抗原具有的序列与自体天然序列小于100%、99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%同源。“微生物组反应性”可以基于抗原和天然微生物组序列之间共享的序列同源性来进行预测。在一些实施方案中，抗原具有的序列与天然微生物组序列小于100%、99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%同源。在一些实施方案中，可以使用如Scholzen等人(2019) Frontiers in Immunology 10:1-22中所述的公开已知的算法(例如JanusMatrix算法)，来完成同源性分析。在一些实施方案中，“抗原”是具有以下长度的肽：约5至约100个氨基酸，例如约5至约90、约5至约80、约5至约70、约5至约60、约5至约50、约5至约45、约5至约40、约5至约35、约5至约30、约5至约25、约5至约20、约5至约15或约8至约12个氨基酸。在具体实施方案中，“抗原”是长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的肽。细菌抗原的实例包括蛋白A (PrA)、蛋白G (PrG)和蛋白L (PrL)。肿瘤抗原的实例包括但不限于表1 (在第0110段)中列出的肽。病毒抗原的实例包括但不限于表3 (在第0128段)中列出的肽。
术语“抗原结合位点”指与抗原上的表位特异性结合的抗体区域。
术语“生物素结合蛋白”指与生物素非共价结合的蛋白质。如本文所述，生物素结合蛋白可以是能够分别形成单价、二价或四价药物组合物的单体、二聚体或四聚体。非限制性实例包括抗生物素抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。抗生物素蛋白可以包含成熟的抗生物素蛋白或与由NCBI登录号NP_990651鉴定的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列。链霉抗生物素蛋白可以包含例如与由NCBI登录号AAU48617鉴定的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列。术语“生物素结合蛋白”预期涵盖形成单体、二聚体或四聚体的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白的野生型和衍生物。此类衍生物的实例在下文阐述，并且还在Laitinen，O. H.(2007)，“Brave New (Strept)avidins in Biotechnology,” Trends in Biotechnology25 (6): 269-277，以及Nordlund，H. R. (2003)，“Introduction of histidine residuesinto avidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternarystructure and biotin binding,” FEBS Letters 555: 449-454中进行描述，所述两个参考文献的内容均通过参考明确地引入本文。
当在上下文中用作含有抗原的生物素化的组分时，术语“肿瘤细胞”预期涵盖整个肿瘤细胞或其部分，条件是当含有生物素化的“肿瘤细胞”的药物组合物被施用于受试者时，所述部分在表面上含有可被免疫系统识别的目的抗原。
术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖的”指具有致癌细胞典型特性的细胞的存在，所述特性例如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速生长和增殖率以及某些特征性形态特征。
癌细胞经常为肿瘤的形式，但此类细胞可能单独存在于动物内，或者可能是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。如本文使用的，术语“癌症”包括恶化前癌症以及恶性癌症。癌症包括但不限于B细胞癌例如多发性骨髓瘤，华氏巨球蛋白血症，重链病例如α链病、γ链病和μ链病，良性单克隆丙种球蛋白病，和免疫细胞淀粉样变性，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，支气管癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱癌，脑癌或中枢神经系统癌，周围神经系统癌，食管癌，宫颈癌，子宫癌或子宫内膜癌，口腔癌或咽癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌，小肠癌或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，血液组织癌等等。适用于由本发明涵盖的方法的癌症类型的其它非限制性实例包括人的肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓性白血病(成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性髓性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，癌症本质上是上皮的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其它实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在另外其它实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以各种其它方式进行表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、Brenner或未分化的。
如本文使用的，术语“HPV相关癌症”或“HPV相关的癌症”指与人乳头状瘤病毒(HPV)感染相关或由其引起的任何类型的癌症。某些HPV类型(例如16、18、31和45型)的持续感染已与癌症相联系，所述癌症例如口咽癌、喉癌、外阴癌、阴道癌、宫颈癌、阴茎癌和肛门癌。在一些实施方案中，HPV相关癌症可以包括但不限于宫颈癌、头颈癌、口癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肺癌和口咽癌。在具体实施方案中，HPV相关癌症是宫颈癌、头颈癌或肛门癌。
术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”以包含性、开放性意义使用，意指可以包括另外的要素。
如本文使用的，术语“共刺激分子”包括这样的任何分子，其或者能够增强抗原特异性原代T细胞刺激物的刺激效应，或者能够将其活性升高到超过细胞活化所需的阈值水平，导致初始T细胞的活化。此类共刺激分子可以是膜驻留的受体蛋白。
术语“有效量”指足以实现所期望结果的药物组合物的量。药物组合物的有效量可以在一次或多次施用中进行施用。
如本文使用的，短语“治疗有效量”和“有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比，至少在受试者的细胞亚群中有效产生所需疗效的药剂的量。
术语“改造的抗体”指重组分子，其至少包括包含衍生自抗体重链和/或轻链的可变结构域的抗原结合位点的抗体片段，并且可以任选地包含来自任何Ig类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的整个或部分可变结构域和/或恒定结构域。改造抗体的实例包括增强的单链单克隆抗体和增强的单克隆抗体。改造抗体的实例在PCT/US2007/061554中进一步描述，所述专利的全部内容通过参考引入本文。
术语“表位”指抗体与之优先地且特异性地结合的抗原区域。单克隆抗体优先地结合可以在分子上进行限定的分子的单个特异性表位。在本发明中，多重表位可以被多特异性抗体识别。
“融合蛋白”指包含来自至少两种不同蛋白质的序列的杂合蛋白。这些序列可以来自相同或不同生物的蛋白质。在各个实施方案中，融合蛋白可以包含与第一蛋白质连接的一个或多个氨基酸序列。在其中多于一个氨基酸序列与第一蛋白质融合的情况下，融合序列可以是同一序列的多个拷贝，或可替代地，可以是不同的氨基酸序列。第一蛋白质可以融合到第二蛋白质的N末端、C末端或者N末端和C末端。
术语“Fab片段”指通过用木瓜蛋白酶切割抗体而生成的包含抗原结合位点的抗体片段，所述木瓜蛋白酶在对于H链间二硫键N末端的铰链区处切割，并且生成来自一个抗体分子的两个Fab片段。
术语“F(ab')2片段”指通过用胃蛋白酶切割抗体分子而生成的含有两个抗原结合位点的抗体片段，所述胃蛋白酶在对于H链间二硫键C末端的铰链区处切割。
术语“Fc片段”指包含抗体重链的恒定结构域的抗体片段。
术语“Fv片段”指包含抗体重链和轻链的可变结构域的抗体片段。“基因构建体”指核酸，例如载体、质粒、病毒基因组等等，其包括多肽的“编码序列”，或者其可以用其它方式转录为生物活性RNA (例如，反义、诱饵、核酶等)，可以转染到细胞(例如在某些实施方案中，哺乳动物细胞)内，以及可以引起编码序列在用构建体转染的细胞中的表达。基因构建体可以包括与编码序列可操作地连接的一种或多种调控元件，以及内含子序列、多聚腺苷酸化位点、复制起点、标记物基因等。
“宿主细胞”指可以用指定的转移载体进行转导的细胞。细胞任选地选自体外细胞，例如衍生自细胞培养物的那些细胞；离体细胞，例如衍生自生物的那些细胞；和体内细胞，例如生物中的那些细胞。应理解，此类术语不仅指特定的主题细胞，而且指此细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在如本文使用的该术语的范围内。
术语“免疫原性”指物质引发免疫应答的能力。“免疫原性组合物”或“免疫原”是引发免疫应答的组合物或物质。“免疫应答”指受试者对抗原的存在的反应，其可以包括下述中的至少一种：制备抗体、发展免疫、发展对抗原的超敏反应和发展耐受性。在具体实施方案中，“免疫应答”指抗肿瘤免疫应答。
术语“包括”在本文中用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
“接头”是领域公认的，并且指连接两个共价部分(例如热激蛋白和生物素结合蛋白)的分子或分子组。接头可以由单个连接分子组成或可以包含连接分子和间隔区分子，预期将连接分子和部分分开特定距离。
术语“多价抗体”指包含多于一个抗原识别位点的抗体或改造抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指存在于多价抗体中的不同抗原识别位点特异性的数目(与抗原识别位点的数目形成对比)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点都与相同的表位结合。“双特异性”抗体具有与第一表位结合的至少一个抗原识别位点以及与不同于第一表位的第二表位结合的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有都与相同表位结合的多重抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多重抗原识别位点，其中一些与第一表位结合，而其中一些与不同于第一表位的第二表位结合。
当提及本文所述的自组装药物组合物时，术语“多价”指与多于一种生物素化的组分非共价结合的热激融合蛋白。当提及本文所述的自组装药物组合物时，术语“二价”指与两种生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合的热激融合蛋白。当提及本文所述的自组装药物组合物时，术语“四价”指与四种生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合的热激融合蛋白。多价药物组合物的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以具有等同或不同的特性。
术语“核酸”指核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式的核苷酸的聚合形式。该术语还应该被理解为包括作为等价物的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物，并且当适用于所描述的实施方案时，包括单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
“患者”或“受试者”或“宿主”可互换使用，并且各自指人或非人动物。该术语包括哺乳动物，例如人、灵长类动物、家畜动物(例如，牛、猪)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物)和啮齿类动物(例如，小鼠、兔和大鼠)。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指这样的药物组合物，其在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触，而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
如本文使用的，“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题药物组合物从一个器官或身体部分携带或转运到另一个器官或身体部分。每种载剂必须是在与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上“可接受的”。可以充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20) pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)在药物制剂中采用的其它无毒的相容物质。
除非上下文另有明确说明，否则当指基因表达产物(例如，如由编码序列编码的氨基酸序列)时，“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。“蛋白质”也可以指一种或多种蛋白质的结合，例如抗体。“蛋白质”也可以指蛋白质片段。蛋白质可以是翻译后修饰的蛋白质，例如糖基化蛋白质。“基因表达产物”意指作为基因的整体或部分转录的结果而产生的分子。基因产物包括从基因转录的RNA分子，以及从此类转录物翻译的蛋白质。蛋白质可以是天然存在的分离蛋白质，或者可以是重组或化学合成的产物。术语“蛋白质片段”指这样的蛋白质，其中与参考蛋白质本身相比氨基酸残基是缺失的，但其中剩余氨基酸序列通常与参考蛋白质的等同。此类缺失可能在参考蛋白质的氨基末端或羧基末端处，或可替代地在两者处发生。片段通常为至少约5、6、8或10个氨基酸长，至少约14个氨基酸长，至少约20、30、40或50个氨基酸长，至少约75个氨基酸长，或者至少约100、150、200、300、500个或更多个氨基酸长。可以使用蛋白酶将较大的蛋白质片段化，或通过重组方法，例如仅表达编码蛋白质的核苷酸序列的部分(或者单独地，或者与另一个编码蛋白质的核酸序列融合)，来获得片段。在各个实施方案中，片段可以包含酶促活性和/或参考蛋白质与例如细胞受体的相互作用位点。在另一个实施方案中，片段可能具有免疫原性性质。蛋白质可以包括通过各种已知技术在特定基因座处引入的突变，所述技术不会不利地影响，而是可能增强其在本文提供的方法中的使用。片段可以保留参考蛋白质的一种或多种生物活性。
如本文使用的，术语“自组装”指与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与如本文所述的生物素化的组分形成非共价复合物的能力。此类能力通过生物素与生物素结合蛋白的非共价结合而赋予。
术语“单链可变片段”或“scFv”指其中重链结构域和轻链结构域相连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可以连接到其它抗体片段(例如重链或轻链的恒定结构域)，以形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。
“治疗”受试者中的疾病或“治疗”患有疾病的受试者指的是使受试者经受药物治疗，例如药物的施用，使得疾病的程度得到降低或预防。治疗包括(但不限于)施用组合物，例如药物组合物，并且可以在病理事件开始之后执行。
如本文使用的，“预防”状况(例如，癌症)的治疗剂指这样的组合物，当在病症或状况发作之前施用于统计样品时，相对于未治疗的对照样品，所述组合物减少治疗样品中的病症或状况的发生，或者相对于未治疗的对照样品，延迟病症或状况的一种或多种症状的发作或减少其严重性。
术语“疫苗”指引发针对目的抗原的免疫应答的药物组合物。疫苗还可以对受试者赋予保护性免疫。
“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的优选载体是附加体，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们与之连接的核酸的那些载体。能够指导它们与之可操作连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体经常呈“质粒”的形式，所述质粒一般指环状双链DNA环，其在其载体形式中，不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，如本领域技术人员将了解的，本发明预期包括发挥等价功能并且随后在本领域中变得已知的此类其它形式的表达载体。
术语“存活”包括下述全部：直到死亡的存活，也称为总体存活(其中所述死亡可以是不分原因的或是肿瘤相关的)；“无复发存活”(其中术语复发应该包括局部复发和远处复发两者)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应该包括癌症以及与之相关的疾病)。可以通过参考所规定的起点(例如诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如死亡、复发或转移)，来计算所述存活的长度。另外，关于治疗功效的标准可以扩展为包括对化学疗法的应答、存活概率、在给定时间段内的转移概率和肿瘤复发的概率。
术语“协同效应”指两种或更多种癌症药剂(例如，与免疫疗法组合的本文所述的药物组合物)的组合效应可以大于单独的癌症药剂/疗法的分开效应的总和。
术语“磷酸肽”指可以诱导免疫应答的磷酸化肽。肽可以在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基处被磷酸化。在一些实施方案中，磷酸肽衍生自癌细胞，并且可以诱导抗肿瘤免疫应答。
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应该具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。一般地，本文描述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学有关的命名法和技术是本领域众所周知且常用的。
生物素化的组分
如本文使用的，术语“生物素化的组分”指生物素化的蛋白质、细胞或病毒。生物素化的组分的非限制性实例包括生物素化的肿瘤抗原、肿瘤细胞和共刺激分子。生物素化的组分(例如，肿瘤细胞、肿瘤抗原、病毒或病毒抗原)将与如本文所述的热激蛋白融合物结合施用于受试者。
在一个实施方案中，生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原衍生自受试者，其可以是药物组合物待施用于其的相同或不同的个人。例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原(针对其的免疫应答是所期望的)可以从受试者中进行分离，并且任选地在体外进行扩增或克隆。然后可以使用本领域已知的方法，在体外使肿瘤细胞或肿瘤抗原生物素化。然后可以将生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与本文所述的热激蛋白融合物结合施用于肿瘤细胞或肿瘤抗原由其分离的相同受试者，从而允许开发个性化疫苗。可替代地，可以将生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与本文所述的热激蛋白融合物结合施用于肿瘤细胞或肿瘤抗原由其分离的不同的受试者。当施用于一般群体时，后一种方法允许开发针对癌症的用于一般群体的疫苗。
两种方法均提供了超过本领域的明显优点，即，肿瘤细胞或肿瘤抗原只需要被鉴定到允许其与特定癌症相关联并允许其从受试者中分离的程度。这是用于靶向其序列可能是未知的或结构甚至未被鉴定的抗原的新方法。因此，本发明允许制备药物组合物，以诱导针对已知或未被鉴定的、未被表征的一种或多种抗原的免疫应答。个性化疫苗提供了超过常规疫苗的另外优点在于：因为肿瘤细胞或肿瘤抗原衍生自生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原待施用于其的等同宿主，所以HLA限制不是问题。
在一些实施方案中，肿瘤细胞或肿瘤抗原可以衍生自癌细胞系。
肿瘤细胞或肿瘤抗原可以衍生自与用本文所述的药物组合物预防和/或治疗的癌症相同类型的癌症。肿瘤细胞或肿瘤抗原可以衍生自与用本文所述的药物组合物预防和/或治疗的癌症不同类型的癌症。肿瘤细胞或肿瘤抗原可以衍生自具有与用本文所述的药物组合物预防和/或治疗的癌症相同的遗传突变的癌症。肿瘤细胞或肿瘤抗原可以衍生自具有与用本文所述的药物组合物预防和/或治疗的癌症不同的遗传突变的癌症。
任何肿瘤细胞或肿瘤抗原可以被生物素化，并且与本文所述的热激蛋白融合物部分结合施用于受试者，使得当与本文所述的热激融合蛋白结合施用时，生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原引发抗肿瘤免疫应答。
a.生物素化的肿瘤细胞
在一些实施方案中，肿瘤细胞被生物素化，并且与本文所述的热激蛋白融合物结合施用。肿瘤细胞可以从受试者中分离。从各种肿瘤组织例如手术肿瘤组织、腹水或癌性胸腔积液中分离和纯化肿瘤细胞是获得纯化的肿瘤细胞的常用方法。可以从来自癌症患者或动物肿瘤模型的新鲜活组织检查样品中纯化癌细胞。活组织检查样品经常含有异质细胞群体，其包括正常组织细胞、血细胞和癌细胞。优选地，纯化的癌细胞组合物可以具有大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多，或者两者之间的任何范围或两者之间的任何值的总体活癌细胞。为了从异质群体中纯化癌细胞，可以使用多种方法。
在一个实施方案中，激光显微切除被用于分离癌细胞。可以从制备用于显微镜检查的薄组织切片中小心地解剖目的癌细胞。在这种方法中，将组织切片用薄塑料薄膜包被，并且用聚焦的红外激光束脉冲照射含有选定细胞的区域。这使塑料薄膜中的小圆圈融化，促使在下面的细胞结合。这些捕获的细胞被取出用于另外的分析。这种技术有效分离且分析来自肿瘤的不同部分的细胞，其允许比较它们的相似性质和不同性质。它最近被用于分析来自分离组织以及来自异质垂体细胞、甲状腺细胞和类癌瘤细胞的培养群体的垂体细胞，以及分析在各种肉瘤中发现的单细胞。
在另一个实施方案中，荧光激活细胞分选(FACS)，也被称为流式细胞术，被用于分选且分析不同的细胞群体。具有细胞标记物或其它特异性目的标记物的细胞用结合细胞标记物的抗体或通常抗体混合物加上标签。针对不同标记物的每种抗体缀合至可检测分子，特别是可以区别于与其它抗体偶联的其它荧光染料的荧光染料。使加上标签或“染色”的细胞流通过激发荧光染料的光源，并且检测来自细胞的发射光谱，以确定特定标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料，在本领域中也被称为多色荧光细胞分选，可以鉴定展示不同组细胞标记物的细胞，并且将其与群体中的其它细胞分离。其它FACS参数，包括例如但不限于侧向散射(SSC)、前向散射(FSC)和活体染料染色(例如，用碘化丙啶)，允许基于大小和活力来选择细胞。HSC和相关谱系细胞的FACS分选和分析是本领域众所周知的，并且在例如美国专利号5,137,809；5,750,397；5,840,580；6,465,249；Manz等人(202) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:11872-11877；以及Akashi等人(200) Nature 404:193-197中进行描述。关于荧光激活细胞分选的一般指导在例如Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry，第4版，Wiley-Liss (2003)，以及Ormerod (2000) Flow Cytometry: A Practical Approach，第3版，Oxford University Press中进行描述。
分离有用的细胞群体的另一种方法涉及与特异性细胞表面标记物相互作用的抗体或配体与之结合的固体或不溶性基底。在免疫吸附技术中，细胞与含有抗体的基底(例如，珠粒柱、烧瓶、磁性颗粒等)接触，并且去除任何未结合的细胞。免疫吸附技术可以按比例增加，以直接处理临床收获中的大量细胞。合适的基底包括例如但不限于，塑料、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖和本领域已知的其它基底(例如，Pharmacia Sepharose 6 MB大珠粒)。当使用包含磁性或顺磁性珠粒的固体基底时，与珠粒结合的细胞可以通过磁分离器容易地进行分离(参见例如，Kato和Radbruch (1993) Cytometry 14:384-92)。亲和色谱细胞分离通常涉及使细胞的悬浮液通过具有固定至其表面的选择性配体的支持物。配体与其在细胞上的特异性靶分子相互作用并被捕获到基质上。通过向柱的运行缓冲液中添加洗脱剂来释放结合的细胞，并且将游离细胞通过柱进行洗涤并作为同质群体收获。如对于技术人员显而易见的，吸附技术并不限于采用特异性抗体的那些技术，并且可以使用非特异性吸附。例如，吸附到二氧化硅是用于从细胞制剂中去除吞噬细胞的简单程序。该技术的最常见用途之一是使用针对EpCAM的抗体，从乳腺癌、NSC肺癌、前列腺癌和结肠癌患者的血液中分离循环肿瘤细胞(CTC)，所述EpCAM是已发现在上皮癌中高度表达的细胞表面糖蛋白。
FACS和大多数分批式免疫吸附技术可能适合阳性和阴性选择程序两者(参见例如，美国专利号5,877,299)。在阳性选择中，所需细胞用抗体进行标记，并且从剩余的未标记/不需要的细胞中取出。在阴性选择中，不需要的细胞被标记并去除。可以采用的另一种类型的阴性选择是使用抗体/补体处理或免疫毒素，以去除不需要的细胞。
在又另一个实施方案中，最新技术之一的微流体被用于分离癌细胞。这种方法使用具有螺旋通道的微流体芯片，其可以基于循环肿瘤细胞(CTC)的大小从血液中分离循环肿瘤细胞。将血液的样品泵入装置内，并且当细胞以高速流过通道时，惯性和离心力促使较小的细胞沿着外壁流动，而较大的细胞(包括CTC)沿着内壁流动。研究人员已使用这种芯片技术，从转移性肺癌或乳腺癌患者的血液中分离CTC。
根据最近发表的论文(Lin等人Small (2015) 11:4394–4402)，荧光纳米金刚石(FND)可以被用于标记且分离缓慢增殖/静止的癌症干细胞，根据研究作者，所述癌症干细胞使用传统的荧光标记物难以在延长的时间段内分离且跟踪。得出结论，纳米颗粒并不引起DNA损伤或损害细胞生长，并且它们在长期跟踪能力方面胜过EdU和CFSE荧光标记。
应理解细胞的纯化或分离还包括上述方法的组合。典型的组合可以包括有效去除大量不需要的细胞和细胞材料的初始程序。第二步可以包括通过在与基底结合的抗体上的免疫吸附，分离表达一种或多种祖细胞群体共有的标记物的细胞。提供不同细胞类型的更高分辨率的另外步骤，例如用针对一组特异性细胞标记物的抗体的FACS分选，可以被用于获得基本上纯的所期望细胞群体。
在一些其它实施方案中，癌细胞衍生自癌细胞系。
在本发明中引入或重新引入受试者内之前的肿瘤细胞将进行处理，使得细胞不再繁殖并对它所施用于的受试者造成伤害。在一些实施方案中，肿瘤细胞是非复制性的。在某些实施方案中，由于辐照(例如，γ和/或UV辐照)和/或致使细胞无复制能力的药剂(例如，破坏细胞膜的化合物、DNA复制抑制剂、在细胞分裂过程中的纺锤体形成的抑制剂等)的施用，肿瘤细胞是非复制性的。在一些实施方案中，可以使用亚致死剂量的辐照。例如，可以在生物素化之前或之后，对肿瘤细胞进行亚致死性辐照，以在自组装疫苗施用之前抑制细胞增殖，以减少产生新的肿瘤病变的风险。应理解辐照只是致使细胞非复制性的一种方式，并且导致癌细胞不能细胞分裂但保留触发抗肿瘤免疫的能力的其它方法也包括在本发明中。
在一些实施方案中，肿瘤细胞在其表面上表达抗原，所述抗原的身份可能是或可能不是已知或已表征的。当与热激蛋白融合物结合施用于受试者时，非共价复合物诱导针对肿瘤细胞上的肿瘤抗原的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是针对肿瘤细胞表达的抗原的“细胞毒性T细胞”应答，从而靶向肿瘤细胞用于破坏。
肿瘤细胞可以是待通过本发明的方法治疗或预防的一类癌症的细胞。此类细胞包括但不限于例如人的肉瘤细胞或癌细胞，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓性白血病(成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性髓性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症或重链病的细胞。
在一些实施方案中，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的卵巢癌细胞(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞)。在一些实施方案中，生物素化的肿瘤细胞是生物素化的HPV相关癌细胞(例如，人乳头状瘤病毒(HPV)诱导的宫颈癌、HVP诱导的头颈癌或HVP诱导的肛门癌)。
b.生物素化的肿瘤抗原
在一些实施方案中，肿瘤抗原被生物素化，并且与本文所述的热激蛋白融合物结合施用。“抗原”指由本文所述的组合物诱导的免疫应答的靶。抗原可以是蛋白质抗原，并且应被理解为包括在病毒或者受试者的受感染细胞、外来细胞或肿瘤细胞的表面上显示出的整个蛋白质、蛋白质的片段，以及作为例如通过典型的MHC I类或II类途径的蛋白质加工和呈递的结果，由受感染细胞、外来细胞或肿瘤细胞所展示的肽。此类外来细胞的实例包括细菌、真菌和原生动物。
在一些实施方案中，本发明的“肿瘤抗原”涵盖能够在受试者中引发抗肿瘤应答的肿瘤相关蛋白以及肿瘤相关蛋白的任何部分或肽。肿瘤抗原可以是由肿瘤细胞过表达的蛋白质或其免疫原性片段。它可以是在肿瘤细胞中特异性突变的蛋白质或其免疫原性片段。在某些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤衍生的磷酸肽。肿瘤抗原可以是能够引发免疫应答的任何肿瘤相关蛋白、蛋白质的片段、蛋白质的修饰形式(例如磷酸化蛋白质或肽)或蛋白质的功能上等价的变体。“功能上等价的变体”包括但不限于具有部分序列同源性的肽、具有一种或多种特异性保守和/或非保守氨基酸变化的肽、肽缀合物、嵌合蛋白、融合蛋白和肽核酸。
肿瘤抗原可以是与待通过本发明的方法治疗或预防的一类癌症相关的抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与肉瘤或癌相关，所述肉瘤或癌例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病。
在某些实施方案中，肿瘤抗原与卵巢癌(例如，浆液性或上皮性乳头状卵巢癌)相关。在一些实施方案中，肿瘤抗原与HPV相关癌症相关。在某些实施方案中，肿瘤抗原与宫颈癌(例如，人乳头状瘤病毒(HPV)诱导的宫颈癌)相关。在某些实施方案中，肿瘤抗原与头颈癌(例如，HPV诱导的头颈癌)相关。在某些实施方案中，肿瘤抗原与肛门癌(例如，HPV诱导的肛门癌)相关。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含整体或部分灭活的产生肿瘤的病毒。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含衍生自产生肿瘤的病毒的蛋白质或其免疫原性片段。产生肿瘤的病毒可以是例如HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒。
在某些实施方案中，肿瘤抗原是衍生自肿瘤相关蛋白的肽。如本文使用的，术语“肽”指天然肽(降解产物或合成地合成的肽)，并且进一步指肽模拟物，例如其为肽类似物的类肽和半类肽(sernipeptoid)，其可以具有例如致使肽在体内时更稳定或更具免疫原性的修饰。此类修饰包括但不限于环化、N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2—NH、CH2—S、CH2—S═O、O═C—NH、CH2—O、CH2—CH2、S═C—NH、CH═CH或CF═CH)、主链修饰和残基修饰。用于制备肽模拟化合物的方法是本领域众所周知的，并且在Quantitative Drug Design，C. A. Ramsden Gd.，第17.2章，F. Choplin Pergamon Press(1992)中进行详细说明，所述参考文献通过参考以其整体引入。
如本文使用的，术语“衍生自蛋白质”指衍生自一种或多种指定蛋白质的肽，并且进一步指衍生自与相同或其它物种的指定蛋白质同源的蛋白质的等价区域的同源肽，条件是这些肽作为抗肿瘤疫苗是有效的。该术语进一步涉及基于指定蛋白质或其同源蛋白质的氨基酸序列而设计的可允许的氨基酸改变和肽模拟物。
在某些实施方案中，用于靶向肿瘤的肽可以选自在肿瘤中异常丰富的蛋白质、肿瘤特有的突变和/或针对其为癌细胞标志的蛋白质的修饰。肽可以通过DNA测序或文献进行鉴定。计算工具可以被用于鉴定预期对于免疫系统提供良好靶的靶特异性肽，确定肽链的适当结构，和/或掺入合成定制肽所需的任何变化。例如，可以通过算法分析来选择通过肿瘤细胞的外显子DNA测序鉴定的新抗原和肿瘤相关抗原。使用基于计算机的算法(例如EpiMatrix算法或JanusMatrix算法)，免疫原性肽可以对于计算机预测的特异性HLA结合进行向上选择(up-selected)，并且对于自身反应性、微生物组反应性和/或免疫抑制活性进行向下选择(down-selected)。预测肽的HLA结合也可以在如Scholzen等人(2019)Frontiers in Immunology 10:1-22中所述的标准肽HLA结合体外测定中进行测试，所述参考文献通过参考以其整体引入本文。
可以就引发免疫应答(关于增强免疫系统的抗肿瘤功能的重要标准)测试所有选定的肽。例如，可以测量针对由SAV平台递送的癌症靶向肽的免疫应答的强度和特异性。这些结果可以与其它基于肽的方法的先前报告进行比较，并且任何表现不佳的肽可以被鉴定，这指导进一步优化。在一些实施方案中，使用本文所述的自组装疫苗递送单一身份的肿瘤相关肽。在一些实施方案中，使用自组装疫苗递送多种肿瘤相关肽。在某些实施方案中，使用本文所述的多价自组装疫苗递送多种肿瘤相关肽。例如，使用本文所述的一种或多种自组装疫苗递送完整的肽储库，其基本原理是为免疫系统提供肿瘤靶的广泛集合。在具体实施方案中，肿瘤相关抗原衍生的肽例如衍生自间皮素或叶酸受体α的肽可以用于制备本文所述的SAV。在某些实施方案中，新抗原衍生的肽例如衍生自Ipo13、Rpl5或Pkp4的肽可以用于制备本文所述的SAV。在一些实施方案中，衍生自多重(例如，2、3、4等)的肽可以通过接头连接，并且在相同的SAV中用作单一肽。关于示例性肿瘤抗原的氨基酸序列显示于下表1中。
表1. 示例性肿瘤抗原的代表性序列：
SEQ ID NO. 11: P FTYEQ LSIFKHKLDK
SEQ ID NO. 12: KV SK GQKMNAQAI ALVACYL
SEQ ID NO. 13: PG FV LIWIPALLPA
SEQ ID NO. 14: GWN W SSGHNECPVGAS
SEQ ID NO. 15: GRCLSLLELLTVLPEEF
SEQ ID NO. 16: TTGNKFFGALKGAVD
SEQ ID NO. 17: NHFIIPVSTLERDRFKSHP
表1中包括多肽分子，其包含跨越其全长与表1中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多同一性的氨基酸序列。此类多肽可以具有如本文进一步描述的全长多肽的功能。
在某些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列包含表1中所示的氨基酸序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
在某些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列基本上由表1中所示的氨基酸序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
在某些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列由氨基酸序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
在一些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列包含与表1中所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
在一些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列基本上由与表1中所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
在一些实施方案中，肿瘤抗原具有的氨基酸序列由与表1中所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所示的氨基酸序列等同。
如本领域技术人员众所周知的，具有基本序列相似性的多肽可以在宿主动物中引起等同或非常相似的免疫反应。相应地，在一些实施方案中，肿瘤抗原蛋白或其片段的衍生物、等价物、变体、片段或突变体也可以适合于本文提供的方法和组合物。
在一些实施方案中，本文提供了肿瘤抗原的变体或衍生物。改变的多肽可以具有例如通过保守取代改变的氨基酸序列，但仍然引发与未改变的蛋白质抗原反应的免疫应答，并且被视为功能等价物。如本文使用的，术语“保守取代”表示氨基酸残基由另一个生物学上相似的残基替换。本领域众所周知的是，同一保守组内的氨基酸通常可以彼此取代，而不显著地影响蛋白质的功能。根据某些实施方案，肿瘤抗原的衍生物、等价物、变体或突变体是与肿瘤抗原蛋白或其片段的序列至少85%同源的多肽。在一些实施方案中，同源性为至少90%、至少95%或至少98%。
在某些实施方案中，可以通过重组DNA技术来产生肿瘤抗原。例如，将编码肿瘤抗原的核酸分子克隆到表达载体内，将表达载体引入宿主细胞内，并且在宿主细胞中表达肿瘤抗原。然后可以使用标准蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案，从细胞中分离肿瘤抗原。
如本文使用的，术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内之后整合到宿主细胞的基因组内，并且从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体经常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括发挥等价功能的此类其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解，此类术语不仅指特定的主题细胞，而且指此细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在如本文使用的该术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，肿瘤抗原可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如Fao肝细胞瘤细胞、原代肝细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
在另一个变化中，可以使用体外翻译系统来实现蛋白质生产。体外翻译系统一般是这样的翻译系统，其是至少含有将RNA分子翻译成蛋白质所需的最低限度元件的无细胞提取物。体外翻译系统通常至少包含核糖体、tRNA、起始甲硫氨酰-tRNAMet、涉及翻译的蛋白质或复合物，例如eIF2、eIF3、帽结合(CB)复合物，包含帽结合蛋白(CBP)和真核起始因子4F (eIF4F)。各种体外翻译系统是本领域众所周知的，并且包括商购可得的试剂盒。体外翻译系统的实例包括真核裂解物，例如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物。裂解物从制造商如Promega Corp.，Madison，Wis.；Stratagene，La Jolla，Calif.；Amersham，Arlington Heights，Ill.；以及GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y商购可得。体外翻译系统通常包含大分子，例如酶，翻译、起始和延伸因子，化学试剂和核糖体。另外，可以使用体外转录系统。此类系统通常至少包含RNA聚合酶全酶，核糖核苷酸以及任何必需的转录起始、延伸和终止因子。体外转录和翻译可以在一锅反应中偶联，以从一种或多种分离的DNA产生蛋白质。
替代重组表达，可以使用标准肽合成技术化学合成肿瘤抗原。化学合成可以使用各种领域公认的方法来进行，所述方法包括逐步固相合成、通过肽片段的构象辅助重新连接的半合成、克隆或合成肽区段的酶促连接和化学连接。天然化学连接采用两个未受保护的肽区段的化学选择性反应，以产生瞬时硫酯连接的中间体。然后瞬时硫酯连接的中间体自发地经历重排，以提供在连接位点处具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物在化学上等同于通过无细胞合成产生的蛋白质。当允许时，全长连接产物可以进行重折叠和/或氧化，以形成天然的含有二硫键的蛋白质分子。(参见例如，美国专利号6,184,344和6,174,530；以及T. W. Muir等人，Curr. Opin. Biotech. (1993)：第4卷，第420页；M. Miller等人，Science (1989)：第246卷，第1149页；A. Wlodawer等人，Science (1989)：第245卷，第616页；L. H. Huang等人，Biochemistry (1991)：第30卷，第7402页；M. Sclmolzer等人，Int. J. Pept. Prot. Res. (1992)：第40卷，第180-193页；K. Rajarathnam等人，Science(1994)：第264卷，第90页；R. E. Offord，“Chemical Approaches to ProteinEngineering”，in Protein Design and the Development of New therapeutics andVaccines，J. B. Hook，G. Poste编，(Plenum Press，New York，1990)第253-282页；C. J.A. Wallace等人，J. Biol. Chem. (1992)：第267卷，第3852页；L. Abrahmsen等人，Biochemistry (1991)：第30卷，第4151页；T. K. Chang等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1994) 91: 12544-12548；M. Schnlzer等人，Science (1992)：第3256卷，第221页；以及K. Akaji等人，Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184)。
此外，可以使用标准蛋白质纯化技术，例如使用肿瘤抗原特异性抗体，通过适当的纯化方案，从含有肿瘤抗原的癌细胞或组织中分离天然肿瘤抗原。可以从受试者中分离含有肿瘤抗原的癌细胞或组织。上文已描述了分离和纯化肿瘤细胞或肿瘤组织的示例性方法。在一些其它实施方案中，肿瘤抗原可以从含有肿瘤抗原的癌细胞系中分离。
c.生物素化的病毒或病毒抗原
在一些实施方案中，生物素化的病毒或病毒抗原可以与如本文所述的热激蛋白融合物结合施用于受试者。受试者可能患有由产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)的感染所诱导的癌症。生物素化的病毒或病毒抗原可以与如本文所述的热激蛋白融合物结合施用于受试者，以预防和/或治疗癌症。在一些实施方案中，癌症由产生肿瘤的病毒例如HPV、EBV、HIV或疱疹病毒的感染所诱导。在具体实施方案中，癌症是HPV相关癌症(例如，宫颈癌、头颈癌或肛门癌)。
与如本文所述的热激蛋白融合物结合施用的生物素化的病毒可以包含生物素化的产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)。在具体实施方案中，生物素化的病毒是生物素化的整体或部分灭活的产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)。在优选的实施方案中，生物素化的病毒表达可以诱导免疫应答(例如，抗肿瘤免疫)的抗原。
与如本文所述的热激蛋白融合物结合施用的生物素化的病毒抗原可以包含衍生自产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)的蛋白质或其免疫原性片段。可以被生物素化的免疫原性肿瘤抗原的实例在Stevanovic，S.等人(2017) Science 356:200-205中进行描述，所述参考文献通过参考以其整体引入本文。在具体实施方案中，生物素化的病毒抗原是生物素化的HPV病毒抗原。术语“HPV病毒抗原”指衍生自HPV病毒并能够引发免疫应答(例如抗肿瘤免疫)的蛋白质、肽或功能等价片段。HPV病毒抗原可以包括但不限于病毒癌蛋白E6和E7及其免疫原性片段。E6和E7是可以用于开发治疗性疫苗的两种主要病毒癌蛋白，因为它们在肿瘤进展过程中驱动细胞永生化并维持转化的表型。来自HPV16 (高危HPV类型之一)的E6的氨基酸序列可在GenBank数据库的NP_041325.1下公开获得。来自HPV16的E7的氨基酸序列可在GenBank数据库的NP_041326.1下公开获得。用于本发明的组合物和方法中的示例性生物素化的病毒抗原在下表3中列出，并且在实施例中进一步说明。
表3. HPV病毒抗原的代表性氨基酸序列
SEQ ID NO. 3: QLLRREVYDFAFRDLC
SEQ ID NO. 4: GQAEPDRAHYNIVTFCCKCD
SEQ ID NO. 5: QLLRREVYDFAFRDL
SEQ ID NO. 6: VYDFAFRDLC
SEQ ID NO. 7: QAEPDRAHVYNIVTFCCKCD
SEQ ID NO. 8: GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR
SEQ ID NO. 9: RAHVYNIVTF
SEQ ID NO. 10: GQAEPDRAHVYNIVTFCCKCD
表3中包括多肽分子，其包含跨越其全长与表3中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多同一性的氨基酸序列。此类多肽可以具有如本文进一步描述的全长多肽的功能。
热激蛋白融合物
“热激蛋白”由“热激基因”或应激基因编码，并且指由于生物(含有该基因)接触或暴露于应激物(例如热激、低氧、葡萄糖剥夺、重金属盐、能量代谢和电子传递抑制剂以及蛋白质变性剂)或某些苯醌安沙霉素，而被活化或以其它方式可检测性地上调的基因。Nover，L.，Heat Shock Response，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL (1991)。“热激蛋白”还包括由已知应激基因家族内的基因编码的同源蛋白，即使此类同源基因本身并非由应激物诱导。
“热激蛋白融合物”指与生物素结合蛋白连接的热激蛋白。例如，热激蛋白可以在C末端或N末端与生物素结合蛋白连接，以生成热激蛋白融合物。当与本文提供的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)结合施用时，热激蛋白融合物能够刺激或增强针对目的抗原的体液和/或细胞免疫应答，包括CD8细胞毒性T细胞(CTL)应答。
例如但非限制性地，可以根据本发明使用的热激蛋白包括BiP (也被称为grp78)、Hsp10、Hsp20-30、Hsp60、hsp70、hsc70、gp96 (grp94)、hsp60、hsp40和Hsp100-200、Hsp100、Hsp90及其家族成员。尤其优选的热激蛋白是BiP、gp96和hsp70，如下文举例说明的。一组特定的热激蛋白包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp20-30，进一步优选Hsp70和Hsp60。最优选的是hsp70家族的成员。
Hsp10实例包括GroES和Cpn10。Hsp10通常在大肠杆菌以及在真核细胞的线粒体和叶绿体中发现。Hsp10形成与Hsp60寡聚体结合的七元环。Hsp10也涉及蛋白质折叠。
Hsp60实例包括来自分枝杆菌的Hsp65。细菌Hsp60通常也称为GroEL，例如来自大肠杆菌的GroEL。Hsp60形成大的同寡聚体复合物，并且似乎在蛋白质折叠中起关键作用。Hsp60同源物存在于真核线粒体和叶绿体中。
Hsp70实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73，来自细菌特别是分枝杆菌(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTb)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) (例如卡介苗；来自其的DnaK在本文中被称为Hsp71))的DnaK，来自大肠杆菌、酵母和其它原核生物的DnaK，以及BiP和Grp78。Hsp70能够特异性结合ATP以及解折叠的蛋白质，从而参与蛋白质折叠和解折叠以及蛋白质复合物的组装和解体。在一个优选的实施方案中，热激蛋白是MTb HSP 70或衍生自MTb HSP 70。结核分枝杆菌HSP70和牛分枝杆菌HSP70的全长蛋白质序列分别在表2中描绘为SEQ ID NO: 1和2。待与本文所述的方法结合使用的热激蛋白融合物可以包含与SEQ ID NO: 1或2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列。
表2
SEQ ID NO: 1来自结核分枝杆菌的伴侣蛋白dnaK (热激蛋白70) (P0A5B9，GI:61222666)
1 maravgidlg ttnsvvsvle ggdpvvvans egsrttpsiv afarngevlv gqpaknqavt
61 nvdrtvrsvk rhmgsdwsie idgkkytape isarilmklk rdaeaylged itdavittpa
121 yfndaqrqat kdagqiagln vlrivnepta aalaygldkg ekeqrilvfd lgggtfdvsl
181 leigegvvev ratsgdnhlg gddwdqrvvd wlvdkfkgts gidltkdkma mqrlreaaek
241 akielsssqs tsinlpyitv dadknplfld eqltraefqr itqdlldrtr kpfqsviadt
301 gisvseidhv vlvggstrmp avtdlvkelt ggkepnkgvn pdevvavgaa lqagvlkgev
361 kdvllldvtp lslgietkgg vmtrliernt tiptkrsetf ttaddnqpsv qiqvyqgere
421 iaahnkllgs feltgippap rgipqievtf didangivhv takdkgtgke ntiriqegsg
481 lskedidrmi kdaeahaeed rkrreeadvr nqaetlvyqt ekfvkeqrea eggskvpedt
541 lnkvdaavae akaalggsdi saiksamekl gqesqalgqa iyeaaqaasq atgaahpgge
601 pggahpgsad dvvdaevvdd greak
SEQ ID NO: 2来自牛分枝杆菌的伴侣蛋白dnaK (热激蛋白70) (NP_854021.1GI:31791528)
1 maravgidlg ttnsvvsvle ggdpvvvans egsrttpsiv afarngevlv gqpaknqavt
61 nvdrtvrsvk rhmgsdwsie idgkkytape isarilmklk rdaeaylged itdavittpa
121 yfndaqrqat kdagqiagln vlrivnepta aalaygldkg ekeqrilvfd lgggtfdvsl
181 leigegvvev ratsgdnhlg gddwdqrvvd wlvdkfkgts gidltkdkma mqrlreaaek
241 akielsssqs tsinlpyitv dadknplfld eqltraefqr itqdlldrtr kpfqsviadt
301 gisvseidhv vlvggstrmp avtdlvkelt ggkepnkgvn pdevvavgaa lqagvlkgev
361 kdvllldvtp lslgietkgg vmtrliernt tiptkrsetf ttaddnqpsv qiqvyqgere
421 iaahnkllgs feltgippap rgipqievtf didangivhv takdkgtgke ntiriqegsg
481 lskedidrmi kdaeahaeed rkrreeadvr nqaetlvyqt ekfvkeqrea eggskvpedt
541 lnkvdaavae akaalggsdi saiksamekl gqesqalgqa iyeaaqaasq atgaahpgge
601 pggahpgsad dvvdaevvdd greak
表2中包括多肽分子，其包含跨越其全长与表2中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多同一性的氨基酸序列。此类多肽可以具有如本文进一步描述的全长多肽的功能。
Hsp90实例包括大肠杆菌中的HtpG，酵母中的Hsp83和Hsc83，以及人中的Hsp90 α、Hsp90 β和Grp94。Hsp90结合蛋白质组，所述蛋白质通常是在信号转导机制中起作用的细胞调控分子，例如类固醇激素受体(例如，糖皮质激素、雌激素、孕酮和睾酮受体)、转录因子和蛋白激酶。Hsp90蛋白还参与形成包括其它热激蛋白的大而丰富的蛋白质复合物。
Hsp100实例包括哺乳动物Hsp 110、酵母Hsp104、ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。酵母Hsp104和大肠杆菌ClpA形成六聚体颗粒，并且大肠杆菌ClpB形成四聚体颗粒，其组装似乎需要腺嘌呤核苷酸结合。Clp蛋白酶提供由ClpP (蛋白水解亚基)和ClpA组成的750 kDa异源寡聚体。ClpB-Y在结构上与ClpA相关，尽管与ClpA不同，它们似乎不与ClpP复合。
Hsp100-200实例包括Grp170 (用于葡萄糖调节蛋白)。Grp170位于ER的腔内，在前高尔基体区室中，并且可能在免疫球蛋白折叠和组装中起作用。
根据本发明可以使用天然存在的或重组衍生的热激蛋白突变体。例如但非限制性地，本发明提供了突变的热激蛋白的使用，以便促进其从细胞中的分泌(例如具有促进内质网重新捕获的元件的突变或缺失，所述元件例如KDEL或其同源物；此类突变体在PCT申请号PCT/US96/13233 (WO 97/06685)中进行描述，所述专利通过参考引入本文)。
在特定实施方案中，本发明的热激蛋白得自肠细菌、分枝杆菌(特别是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌(M. vaccae)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)和牛分枝杆菌)、大肠杆菌、酵母、果蝇、脊椎动物、鸟类、鸡、哺乳动物、大鼠、小鼠、灵长类动物或人。
本文提供的药物组合物可以具有通过氧化或还原进行修饰的个别氨基酸残基。此外，可以对氨基酸序列或核酸序列作出各种取代、缺失或添加，其净效应是保持或进一步增强热激蛋白增加的生物活性。例如，由于密码简并性，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列方面可能存在相当大的变异。术语“热激蛋白”预期涵盖从热激蛋白获得的热激蛋白的片段，条件是此类片段包括涉及增强针对目的抗原的免疫应答的表位。可以使用蛋白酶，或通过重组方法，例如仅表达部分的编码应激蛋白质的核苷酸序列(或者单独地，或者与另一个编码蛋白质的核酸序列融合)，来获得热激蛋白的片段。热激蛋白可以包括通过各种已知技术在特定基因座处引入的突变，以增强其对免疫系统的作用。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)；Drinkwater和Klinedinst Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3402-3406(1986)；Liao和Wise，Gene 88:107-111 (1990)；Horwitz等人，Genome 3:112-117 (1989)。
在特定实施方案中，例如在涉及热激蛋白和生物素结合蛋白之间的化学缀合物的热激蛋白融合物中，本发明中使用的热激蛋白是分离的热激蛋白，这意味着热激蛋白已从它们在其中产生的宿主细胞中被选择且分离。在其中热激重组表达为与生物素结合蛋白融合的热激蛋白融合物的一些实施方案中，本发明中使用的热激蛋白融合物是分离的热激蛋白融合物，这意味着热激蛋白融合物已从它们在其中产生的宿主细胞中被选择且分离。此类分离可以如本文所述并使用本领域已知的蛋白质分离的常规方法来进行。Maniatis等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y. (1982)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Deutscher，M.，Guide toProtein Purification Methods Enzymology，第182卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif. (1990)。在PCT公开号WO 2009/129502中进一步描述了用于产生与生物素结合蛋白融合的热激蛋白融合物的方法的实例，所述专利的全部内容通过参考引入本文。
自组装疫苗
如进一步描述的，多重生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以与热激蛋白融合物结合施用。以此种方式，可以生成多价药物组合物并将其施用于受试者。多价药物组合物的生成允许产生“增强的(supercharged)”或更有力的疫苗和治疗剂。
当药物组合物是多价的时，待施用的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以是本文所述的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)的任何组合。例如，相同或不同特性的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以与如本文提供的热激蛋白融合物结合施用，条件是生物素结合蛋白以及反之热激蛋白融合物是多价的或能够结合多重生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)。作为实例，野生型生物素结合蛋白抗生物素蛋白具有四个生物素结合位点，并且因此能够结合四个生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)。在这个实例中，四个位点待被四个生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)结合，并且生物素结合组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以基于特性以本文所述的一种、两种、三种或四种等同的生物素化组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)的任何可能的排列进行混合且匹配。四种等同的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以与四个生物素结合位点结合。
因此，可以将有效量的具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与融合至生物素结合蛋白的热激蛋白结合施用于受试者，足以形成包含四份具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原以及一份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的药物组合物。可替代地，可以将有效量的具有第一特性和第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与融合至生物素结合蛋白的热激蛋白结合施用于受试者，足以形成包含三份具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原、一份具有第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原以及一份热激蛋白融合物的药物组合物。在另一个实施方案中，可以将有效量的具有第一特性和第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与融合至生物素结合蛋白的热激蛋白结合施用于受试者，足以形成包含两份具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原、两份具有第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原以及一份热激蛋白融合物的药物组合物。
当自组装药物组合物是二价的时，可以将有效量的具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与融合至生物素结合蛋白的热激蛋白结合施用于受试者，足以形成包含两份具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原以及一份热激蛋白融合物的药物组合物。可替代地，可以将有效量的具有第一特性和第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原与融合至生物素结合蛋白的热激蛋白结合施用于受试者，足以形成包含一份具有第一特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原、一份具有第二特性的生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原以及一份热激蛋白融合物的药物组合物。
多价药物组合物可以包括共刺激分子或封闭基团(即，单独的生物素或与非功能分子缀合的生物素)。可以与本发明结合施用的共刺激分子的实例包括B7分子(包括B7-1(CD80)和B7-2 (CD86))、CD28、CD58、Lfa-3、CD40、B7-H3、CD137 (4–1BB)以及白介素(例如IL-1、IL-2或IL-12)。作为实例，一份包含共刺激分子的生物素化的组分可以与以下结合施用：i)三份包含肿瘤细胞或肿瘤抗原的另一种生物素化的组分；以及ii)一份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在另一个实例中，两份包含共刺激分子的生物素化的组分可以与以下结合施用：i)两份包含肿瘤细胞或肿瘤抗原的另一种生物素化的组分；以及ii)一份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在另一个实例中，三份包含共刺激分子的生物素化的组分可以与以下结合施用：i)一份包含肿瘤细胞或肿瘤抗原的另一种生物素化的组分；以及ii)一份与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。
例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白的pH敏感性突变体，可以被用于控制抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白与生物素的非共价相互作用，并且从而实现热激蛋白融合物与生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原的各种排列和组合的所期望的化学计量，如本文所述。生物素结合蛋白如抗生物素蛋白的野生型或特定突变形式的选择，可以被用于控制药物组合物的所期望效价(例如抗生物素蛋白的单体、二聚体或四聚体形式)。单价或二价疫苗可以类似地通过采用热激融合蛋白来生产，所述热激融合蛋白包含结合生物素但以单价或二价方式结合的其它抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白突变蛋白。抗生物素蛋白突变体的实例在下文范例部分中进行描述。赋予pH可调整的生物素结合的抗生物素蛋白的pH敏感性点突变体的实例是Y33H。另一种突变体具有关于Met96、Val115和Ile117的组氨酸取代，任选地具有在Trp110处的组氨酸替换。用于控制生物素-链霉抗生物素蛋白结合的此类方法在Laitinen，O. H. (2007)，“Brave New (Strept)avidins in Biotechnology,” Trends in Biotechnology 25 (6):269-277，以及Nordlund，H. R. (2003)，“Introduction of histidine residues intoavidin subunit interfaces allows pH-dependent regulation of quaternarystructure and biotin binding,” FEBS Letters 555: 449-454中进行描述，所述两个参考文献的内容均通过参考引入本文。
生产自组装疫苗的方法
在本发明的一个实施方案中，组合物包含两个部分：与生物素结合蛋白融合的热激蛋白和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)，其靶向针对抗原的免疫应答，针对该抗原的免疫应答是所期望的。本发明提供了大量药物组合物(例如疫苗)的快速、容易的生产，因为生物素化的抗原或抗体的生产是众所周知的且快速的，这反过来允许增加疫苗生产的能力。因为单一特性的热激蛋白融合物可以与如本文所述的许多各种生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)中的任一种结合施用，所以热激融合蛋白无需在每次鉴定新的目的靶抗原时从头合成。因此，一旦待施用的热激蛋白融合物被确定并且已产生，此类生产方法就是特别快速的。
提供的是用于制备与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的方法。热激蛋白可以例如如Flynn等人，Science 245:385-390 (1989)中所述，使用标准技术从天然来源进行制备，或使用重组技术如在合适的宿主细胞中表达热激编码基因构建体进行制备，所述宿主细胞例如细菌、酵母或哺乳动物细胞。包括热激蛋白和生物素结合蛋白的融合蛋白可以通过重组手段产生。例如，编码热激蛋白的核酸可以连接到编码生物素结合蛋白的核酸序列的任一端，使得两个蛋白质编码序列共享共同的翻译阅读框，并且可以表达为包括生物素结合蛋白和热激蛋白的融合蛋白。将组合的序列插入基于所期望的表达特征和宿主细胞的性质而选择的合适载体内。在下文提供的实例中，核酸序列在适合于细菌大肠杆菌中的蛋白质表达的载体中进行组装。在所选的宿主细胞中表达之后，融合蛋白可以通过常规生化分离技术进行纯化，或通过使用针对融合蛋白的一部分或另一部分的抗体的免疫亲和方法进行纯化。可替代地，所选择的载体可以将标签加入融合蛋白序列中，例如，如在下文呈现的实例中描述的寡组氨酸标签，这允许加上标签的融合蛋白的表达，所述融合蛋白可以通过亲和方法，使用对于标签具有适当地高亲和力的抗体或其它材料进行纯化。Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)；Deutscher，M.. Guide to Protein Purification Methods Enzymology，第182卷. Academic Press，Inc.. San Diego，CA (1990)。如果使用适合于哺乳动物细胞中的表达的载体，例如，下文讨论的载体之一，则可以从哺乳动物细胞中表达且纯化热激蛋白融合物。可替代地，可以将哺乳动物表达载体(包括融合蛋白编码序列)施用于受试者，以指导热激蛋白融合蛋白在受试者的细胞中的表达。编码热激蛋白的核酸也可以化学产生，并然后插入合适的载体内，用于融合蛋白的产生和纯化或施用于受试者。最后，还可以化学制备融合蛋白。
用于制备融合基因的技术是本领域众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接依照常规技术来执行，采用平末端或交错末端用于连接，限制性酶消化以提供适当的末端，适当时填入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪进行合成。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出物，随后可以将所述两个连续基因片段退火以生成嵌合基因序列(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons:1992)。相应地，提供的是分离的核酸，其包含与编码生物素结合蛋白的基因融合的编码热激蛋白的基因的融合基因。
核酸可以在包含编码热激蛋白融合物的核苷酸序列的载体中提供，并且可操作地连接到至少一种调控序列。应当理解，表达载体的设计可能取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型等因素。应该考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由载体编码的任何其它蛋白质例如抗生素标记物的表达。此类载体可以在任何生物学有效的载剂中施用，所述载剂例如能够用编码嵌合多肽的遗传材料离体或在体内有效转染细胞的任何制剂或组合物。方法包括将核酸插入病毒载体或者重组细菌或真核质粒内，所述病毒载体包括重组的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、人免疫缺陷病毒和单纯疱疹病毒-1。病毒载体可以用于直接转染细胞；质粒DNA可以在例如阳离子脂质体(lipofectin)或衍生化的(例如抗体缀合的)多聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其它此类细胞内载剂的帮助下单独递送。也可以直接注射核酸。可替代地，可以进行磷酸钙沉淀，以促进核酸进入细胞内。
主题核酸可以用于引起热激蛋白融合蛋白在培养中增殖的细胞中的表达和过表达，例如以产生融合蛋白。
还提供的是用重组基因转染以便表达热激蛋白融合物的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，热激蛋白融合物可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞中表达。在宿主细胞是人的那些情况下，它可能在或可能不在活受试者中。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。另外，宿主细胞可以用宿主中通常未发现的tRNA分子进行补充，以便优化多肽的表达。适合于使融合多肽的表达达到最大的其它方法将是本领域技术人员已知的。
细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。融合多肽可以进行分泌并从包含该多肽的细胞和培养基的混合物中分离。可替代地，可以保留融合多肽在细胞质中，并且将细胞收获、裂解并分离蛋白质。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离融合多肽，所述技术包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳和用对融合物的特定表位特异的抗体的亲和免疫纯化。
因此，编码整体或部分热激蛋白融合物的核苷酸序列可以被用于经由微生物或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。将序列连接到多核苷酸构建体例如表达载体内，并且转化或转染到真核(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或原核(细菌细胞)宿主内是标准程序。依照本发明，可以采用类似的程序或其修改用于通过微生物手段或组织培养技术制备重组融合多肽。
用于生产重组蛋白的表达媒介物包括质粒和其它载体。例如，用于表达融合多肽的合适载体包括用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达的以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
在另一个实施方案中，编码热蛋白融合多肽的核酸可操作地连接至细菌启动子，例如厌氧大肠杆菌NirB启动子或大肠杆菌脂蛋白llp启动子，其描述于例如Inouye等人(1985) Nucl. Acids Res. 13:3101中；沙门氏菌属(Salmonella) pagC启动子(Miller等人，同上)；志贺氏菌属(Shigella) ent启动子(Schmitt和Payne，J. Bacteriol. 173:816(1991))；Tn10上的tet启动子(Miller等人，同上)；或霍乱弧菌(Vibrio cholera)的ctx启动子。可以使用任何其它启动子。细菌启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。示例性的诱导型启动子是可被铁诱导或在铁限制条件下可诱导的启动子。事实上，一些细菌，例如细胞内生物，被认为在宿主细胞质中遇到铁限制条件。FepA和TonB的铁调节型启动子的实例是本领域已知的，并且例如在下述参考文献中进行描述：Headley，V.等人(1997)Infection & Immunity 65:818；Ochsner，U.A.等人(1995) Journal of Bacteriology177:7194；Hunt，M.D.等人(1994) Journal of Bacteriology 176:3944；Svinarich，D.M.和S. Palchaudhuri. (1992) Journal of Diarrhoeal Diseases Research 10:139；Prince，R.W.等人(1991) Molecular Microbiology 5:2823；Goldberg，M.B.等人(1990)Journal of Bacteriology 172:6863；de Lorenzo，V.等人(1987) Journal of Bacteriology 169:2624；以及Hantke，K. (1981) Molecular & General Genetics 182:288。
质粒优选包含核酸在细菌中的适当转录所需的序列，例如转录终止信号。载体可以进一步包含编码允许选择包含目的核酸的细菌的因子的序列，例如编码提供抗生素抗性的蛋白质的基因；核酸扩增所需的序列，例如细菌复制起点。
在另一个实施方案中，将信号肽序列加入构建体中，使得融合多肽从细胞中分泌。此类信号肽是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，由大肠杆菌RNA聚合酶识别的强有力的噬菌体T5启动子连同lac操纵基因阻遏模块一起使用，以在大肠杆菌中提供严格调控的高水平表达或重组蛋白。在这个系统中，蛋白质表达在高水平的lac阻遏物的存在下被阻断。
在一个实施方案中，DNA与第一启动子可操作地连接，并且细菌进一步包含编码第一聚合酶的第二DNA，所述第一聚合酶能够介导从第一启动子的转录，其中编码第一聚合酶的DNA与第二启动子可操作地连接。在一个优选的实施方案中，第二启动子是细菌启动子，例如上文描绘的那些启动子。在一个甚至更优选的实施方案中，聚合酶是噬菌体聚合酶，例如SP6、T3或T7聚合酶，并且第一启动子是噬菌体启动子，例如分别为SP6、T3或T7启动子。包含噬菌体启动子的质粒和编码噬菌体聚合酶的质粒可以例如从Promega Corp.(Madison，Wis.)和InVitrogen (San Diego，Calif.)商购获得，或者可以使用标准重组DNA技术(J.Sambrook，E. Fritsch，T. Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，ColdSpring Laboratory Press，1989)，直接从噬菌体获得。噬菌体聚合酶和启动子例如在以下参考文献中进一步描述：Sagawa，H.等人(1996) Gene 168:37；Cheng，X.等人(1994) PNAS USA 91:4034；Dubendorff，J.W.和F.W. Studier (1991) Journal of Molecular Biology219:45；Bujarski，J.J.和P. Kaesberg (1987) Nucleic Acids Research 15:1337；以及Studier，F.W.等人(1990) Methods in Enzymology 185:60)。此类质粒可以根据待表达的热激蛋白融合物的具体实施方案进一步进行修饰。
在另一个实施方案中，细菌进一步包含编码第二聚合酶的DNA，所述第二聚合酶能够介导从第二启动子的转录，其中编码第二聚合酶的DNA与第三启动子可操作地连接。第三启动子可以是细菌启动子。然而，可以将多于两种的不同聚合酶和启动子引入细菌中，以获得高水平的转录。相对于其中DNA直接在细菌启动子的控制下的细菌，使用一种或多种聚合酶用于介导细菌中的转录可以提供细菌中的多肽量的显著增加。所采用的系统的选择将取决于具体用途，例如期望生产的蛋白质的量而变。
一般地，将编码融合蛋白的核酸例如通过转染引入宿主细胞内，并且在允许融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞。将核酸引入原核细胞和真核细胞内的方法是本领域众所周知的。用于哺乳动物和原核宿主细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。一般地，编码主题融合蛋白的核酸在诱导型启动子的控制下，一旦包含该核酸的宿主细胞已分裂了一定次数，所述诱导型启动子就被诱导。例如，在核酸在β-半乳糖操纵基因和阻遏物的控制下时，当细菌宿主细胞已达到约OD600 0.45-0.60的密度时，将异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入培养物中。然后使培养物再生长一段时间，以使宿主细胞有时间合成蛋白质。然后通常将培养物冷冻，并且可以在蛋白质分离和纯化之前将其冷冻贮存一段时间。
当使用原核宿主细胞时，宿主细胞可以包括表达例如由质粒pLysSL表达的内部T7溶菌酶的质粒(参见实施例)。此类宿主细胞的裂解释放溶菌酶，其然后降解细菌膜。
可以被包括在用于在细菌或其它原核细胞中表达的载体中的其它序列包括合成核糖体结合位点；强转录终止子，例如来自噬菌体λ的t0和来自大肠杆菌中的rrnB操纵子的t4，以阻止通读转录并确保所表达蛋白质的稳定性；复制起点，例如ColE1；以及赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
其它宿主细胞包括原核宿主细胞。甚至更优选的宿主细胞是细菌，例如大肠杆菌。可以使用的其它细菌包括志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、李斯特菌属物种(Listeria spp.)、立克次体属物种(Rickettsia spp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、包特菌属物种(Bordetella spp.)、奈瑟球菌属物种(Neisseria spp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp.)、弗朗西斯菌属物种(Franciesella spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)、衣原体属物种(Chlamydia spp.)、嗜血杆菌属物种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium spp.)、军团菌属物种(Legionella spp.)、红球菌属物种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、螺杆菌属物种(Helicobacter spp.)、弧菌属物种(Vibrio spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)和丹毒丝菌属物种(Erysipelothrix spp.)。大多数这些细菌可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)获得。
存在用于在酵母中表达重组蛋白的许多载体。例如，YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17是可用于将遗传构建体引入酿酒酵母(S. cerevisiae)内的克隆和表达媒介物(参见例如，Broach等人，(1983)于Experimental Manipulation of Gene Expression，M. Inouye编辑，Academic Press，第83页)。这些载体由于pBR322 ori的存在而可以在大肠杆菌中复制，并且由于酵母2μm质粒的复制决定簇而可以在酿酒酵母中复制。另外，可以使用药物抗性标记物例如氨苄青霉素。
在某些实施方案中，哺乳动物表达载体既含有促进载体在细菌中的繁殖的原核序列，又含有在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒例如pBR322的序列进行修饰，以促进在原核细胞和真核细胞两者中的复制和药物抗性选择。可替代地，病毒(如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205))的衍生物可以被用于蛋白质在真核细胞中的瞬时表达。在制备质粒和转化宿主生物中采用的各种方法是本领域众所周知的。关于用于原核细胞和真核细胞两者的其它合适的表达系统，以及一般的重组程序，参见MolecularCloning A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，第16和17章。在一些情况下，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组蛋白。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(例如包含β-gal的pBlueBac III)。
在另一个变化中，可以使用体外翻译系统来实现蛋白质生产。体外翻译系统一般是这样的翻译系统，其是至少包含将RNA分子翻译成蛋白质所需的最低限度元件的无细胞提取物。体外翻译系统通常至少包含核糖体、tRNA、起始甲硫氨酰-tRNAMet、涉及翻译的蛋白质或复合物，例如eIF2、eIF3、帽结合(CB)复合物，包含帽结合蛋白(CBP)和真核起始因子4F (eIF4F)。各种体外翻译系统是本领域众所周知的，并且包括商购可得的试剂盒。体外翻译系统的实例包括真核裂解物，例如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物。裂解物从制造商如Promega Corp.，Madison，Wis.；Stratagene，La Jolla，Calif.；Amersham，Arlington Heights，Ill.；以及GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y商购可得。体外翻译系统通常包含大分子，例如酶，翻译、起始和延伸因子，化学试剂和核糖体。另外，可以使用体外转录系统。此类系统通常至少包含RNA聚合酶全酶，核糖核苷酸以及任何必需的转录起始、延伸和终止因子。可以使用本领域已知的方法产生用于体外翻译的RNA核苷酸。体外转录和翻译可以在一锅反应中偶联，以从一种或多种分离的DNA产生蛋白质。
当期望表达蛋白质的羧基末端片段，即截短突变体时，可能需要将起始密码子(ATG)加入包含待表达的所期望序列的寡核苷酸片段中。本领域众所周知的是，可以通过使用酶，即甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)来酶促切割在N末端位置处的甲硫氨酸。MAP已从大肠杆菌(Ben-Bassat等人，(1987) J. Bacteriol. 169:751-757)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)中克隆，并且它的体外活性已在重组蛋白上得到证实(Miller等人，(1987) PNAS USA84:2718-1722)。因此，需要时，可以在体内通过在产生MAP的宿主(例如，大肠杆菌或CM89或酿酒酵母)中表达此类重组蛋白，或在体外通过使用纯化的MAP (例如，Miller等人的程序)，来实现N末端甲硫氨酸的去除。
在其中使用植物表达载体的情况下，热激蛋白融合物的表达可以由许多启动子中的任一种驱动。例如，可以使用病毒启动子，例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人，1984，Nature，310:511-514)，或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等人，1987，EMBOJ.，6:307-311)；可替代地，可以使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等人，1994，EMBO J.，3:1671-1680；Broglie等人，1984，Science，224:838-843)；或热激启动子，例如大豆Hsp 17.5-E或Hsp 17.3-B (Gurley等人，1986，Mol. Cell. Biol.，6:559-565)。可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体；直接DNA转化；显微注射、电穿孔等，将这些构建体引入植物细胞内。关于此类技术的评论，参见例如，Weissbach & Weissbach，1988，Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，第八部分，第421-463页；以及Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，第2版，Blackie，London，第7-9章。
可以用于表达蛋白质标签或包含蛋白质标签的融合蛋白的替代表达系统是昆虫系统。在一个此类系统中，将苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。PGHS-2序列可以被克隆到该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)内，并且被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多角体蛋白基因的失活和非封闭型重组病毒(即，缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳的病毒)的产生。然后使用这些重组病毒来感染所插入的基因在其中表达的草地贪夜蛾细胞(例如，参见Smith等人，1983，J. Virol.，46:584，Smith，美国专利号4,215,051)。
在昆虫系统的一个具体实施方案中，将编码热激蛋白融合蛋白的DNA克隆到多角体蛋白启动子下游的pBlueBacIII重组转移载体(Invitrogen，San Diego，Calif.)内，并且将其转染到Sf9昆虫细胞(衍生自草地贪夜蛾卵巢细胞，可从Invitrogen，San Diego，Calif.获得)内，以生成重组病毒。在重组病毒的噬斑纯化后，制备高滴度病毒储备物，继而将其用于感染Sf9或High FiveTM (衍生自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵细胞匀浆的BTI-TN-5B1-4细胞；可从Invitrogen，San Diego，Calif.获得)昆虫细胞，以产生大量适当地翻译后修饰的主题蛋白质。
在其它实施方案中，热激蛋白融合物和生物素结合蛋白分开地产生，并然后彼此连接，例如共价连接。例如，热激蛋白融合物和生物素结合蛋白在体外分开地产生、纯化并在于其下标签能够与目的蛋白质连接的条件下混合在一起。例如，热激蛋白和/或生物素结合蛋白可以从已知它在其中出现的来源中获得(分离)，可以从细胞培养物产生且收获，可以通过克隆且表达编码所期望热激蛋白融合物的基因来产生，或可以化学合成。此外，可以化学合成编码所期望热激蛋白融合物的核酸序列。此类缀合蛋白的混合物可能具有不同于单一融合蛋白的性质。
接头(也称为“接头分子”或“交联接头”)可以被用于缀合热激蛋白和生物素结合蛋白。接头包括能够与几个(通常是两个)分子的限定化学基团反应，并且因此将其缀合的化学制品。大多数已知的交联接头与胺、羧基和巯基反应。如果靶化学基团可能涉及待缀合蛋白质的生物活性，则靶化学基团的选择是关键的。例如，与巯基反应的马来酰亚胺可以使需要Cys与靶结合的含Cys蛋白质失活。接头可以是同功能的(包含相同类型的反应基团)、异功能的(包含不同的反应基团)或光反应性的(包含在光照时变为反应性的基团)。
接头分子可能负责缀合组合物的不同性质。接头的长度应该根据缀合步骤期间的分子柔性以及缀合分子对于其靶(细胞表面分子等等)的可用性进行考虑。因此，更长的接头可以改善本发明的组合物的生物活性，以及其制备的容易性。接头的几何形状可以用于定向分子用于与靶的最佳反应。具有柔性几何形状的接头可以允许交联的蛋白质在它们结合其它蛋白质时在构象上适应。可以改变接头的性质用于其它各种目的。例如，发现MBuS的芳基结构比MBS的芳族间隔区免疫原性更低。此外，接头分子的疏水性和功能性可以通过组分分子的物理性质来进行控制。例如，聚合物接头的疏水性可以通过沿着聚合物的单体单元的次序来控制，所述聚合物例如其中在疏水性单体嵌段中散布着亲水性单体嵌段的嵌段聚合物。
制备且利用各种各样分子接头的化学是本领域众所周知的，并且用于缀合分子的许多预制接头从供应商如Pierce Chemical Co.、Roche Molecular Biochemicals、UnitedStates Biological等等商购可得。
制备的和/或分离的与生物素结合蛋白融合的热激蛋白待与所期望的生物素化的组分结合施用于受试者，足以形成生物素部分与生物素结合蛋白的非共价结合。热激蛋白融合物和一种或多种生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以同时或序贯施用。如果同时施用，则热激蛋白融合物和一种或多种生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以作为混合物或作为非共价复合物施用。如果作为非共价复合物施用，则一旦制备和/或分离，与生物素结合蛋白融合的热激蛋白就可以在体外或体内与所期望的生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合。
可以通过在足以促进生物素结合蛋白与生物素结合的条件下，使与生物素结合蛋白融合的热激蛋白与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)接触，来产生非共价复合物，所述条件是本领域已知的。
各种热激蛋白的基因已被克隆且测序，并且可以用于获得热激蛋白融合物，包括但不限于gp96 (人：Genebank登录号X15187；Maki等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:5658-5562 (1990)；小鼠：Genebank登录号M16370；Srivastava等人，Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 84:3807-3811 (1987))、BiP (小鼠：Genebank登录号U16277；Haas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2250-2254 (1988)；人：Genebank登录号M19645；Ting等人，DNA 7:275-286 (1988))、hsp70 (小鼠：Genebank登录号M35021；Hunt等人，Gene87:199-204 (1990)；人：Genebank登录号M24743；Hunt等人，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 82:6455-6489 (1995))以及hsp40 (人：Genebank登录号D49547；Ohtsuka K.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 197:235-240 (1993))。
与生物素结合蛋白融合的热激蛋白可以与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合。
待与热激蛋白结合施用的肿瘤细胞或肿瘤抗原可以通过如本领域已知的手段与生物素缀合。在与生物素缀合之前，可以使用本领域已知的方法产生和/或分离肿瘤细胞或肿瘤抗原。可以以与本文描述的用于热激蛋白融合物几乎相同的方式来采用重组技术。一旦产生和/或分离了肿瘤细胞或肿瘤抗原，就可以将一种或多种生物素分子直接缀合至肿瘤细胞或肿瘤抗原。生物素也可以通过接头间接缀合至所述肿瘤细胞或肿瘤抗原。生物素待缀合至空间上允许生物素与生物素结合蛋白相互作用的区域。生物素化试剂盒和试剂可以购自Pierce (Rockford，IL)，并且用于生成本文所述的生物素化的组分。
许多不同抗原的序列可以通过DNA序列分析进行克隆且表征，并且被包括在本文提供的组合物中。含有完整或部分细胞或病毒基因组或者抗原的细菌载体可以得自各种来源，包括例如美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection) (ATCC)。可以使用的另外抗原可以通过先前为此目的建立的方法进行分离且分型，所述方法是本领域众所周知的。
免疫疗法
在一些方面，本文所述的自组装疫苗可以与免疫疗法组合施用。
术语“免疫疗法(immunotherapy)”或“免疫疗法(immunotherapies)”指使用受试者的免疫系统的某些部分来对抗疾病(例如癌症)的任何治疗。受试者自身的免疫系统受到刺激(或抑制)，伴随或不伴随为此目的的一种或多种药剂的施用。设计为引发或放大免疫应答的免疫疗法被称为“激活免疫疗法”。设计为减少或抑制免疫应答的免疫疗法被称为“抑制免疫疗法”。可以测定被认为对遗传修饰的移植的癌细胞具有免疫系统作用的任何药剂，以确定该药剂是否是免疫疗法以及给定的遗传修饰对免疫应答的调节具有的作用。在一些实施方案中，免疫疗法是癌细胞特异性的。在一些实施方案中，免疫疗法可以是“非靶向的”，其指不与免疫系统细胞选择性地相互作用，但调节免疫系统功能的药剂的施用。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
免疫疗法是靶向疗法的一种形式，其可以包括例如癌症疫苗和/或致敏抗原呈递细胞的使用。例如，溶瘤病毒是能够感染且裂解癌细胞，同时不伤害正常细胞的病毒，这使得它们在癌症疗法中可能有用。溶瘤病毒的复制既促进了肿瘤细胞的破坏，又在肿瘤部位处产生了剂量放大。它们还可以充当关于抗癌基因的载体，允许将它们特异性地递送到肿瘤部位。免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫，其通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预先形成的抗体(例如，施用针对肿瘤抗原、任选地与化学治疗剂或毒素连接的单克隆抗体)来实现。例如，已知抗VEGF和mTOR抑制剂有效治疗肾细胞癌。免疫疗法还可以集中于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。可替代地，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等等，可以被用于选择性地调节与肿瘤或癌症的开始、进展和/或病理学相联系的生物分子。
免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫，其通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预先形成的抗体(例如，施用针对肿瘤抗原、任选地与化学治疗剂或毒素连接的单克隆抗体)来实现。免疫疗法还可以集中于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。可替代地，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等等，可以被用于选择性地调节与肿瘤或癌症的开始、进展和/或病理学相联系的生物分子。
在一些实施方案中，本文所述的免疫疗法包含至少一种免疫原性化学疗法。术语“免疫原性化学疗法”指已证实为诱导免疫原性细胞死亡的任何化学疗法，所述免疫原性细胞死亡是可通过一种或多种损伤相关分子模式(DAMP)分子的释放来检测的状态，所述分子包括但不限于钙网蛋白、ATP和HMGB1 (Kroemer等人(2013)，Annu. Rev. Immunol.，31:51-72)。共有区免疫原性化学疗法的具体代表性实例包括5'-氟尿嘧啶、蒽环类(如阿霉素)和铂药物（如奥沙利铂）等等。
在一些实施方案中，免疫疗法包含一种或多种免疫检查点的抑制剂。术语“免疫检查点”指CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞表面上的一组分子，其通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域众所周知的，并且包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRP、CD47、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白、IDO、CD39、CD73和A2aR (参见例如，WO 2012/177624)。该术语进一步涵盖生物活性蛋白片段，以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白片段的核酸。在一些实施方案中，该术语进一步涵盖根据本文提供的同源性描述的任何片段。在一个实施方案中，免疫检查点是PD-1。
免疫检查点及其序列是本领域众所周知的，并且代表性的实施方案在下文描述。例如，术语“PD-1”指免疫球蛋白基因超家族的成员，其作为具有PD-L1和PD-L2作为已知配体的共抑制受体发挥功能。PD-1以前使用基于减法克隆的方法以选择在TCR诱导的活化T细胞死亡期间上调的基因而鉴定。基于其与PD-L1结合的能力，PD-1是CD28/CTLA-4分子家族的成员。如同CTLA-4，PD-1响应抗CD3在T细胞的表面上被快速诱导(Agata等人25 (1996)Int. Immunol. 8:765)。然而，与CTLA-4形成对比，PD-1也在B细胞的表面上被诱导(响应抗IgM)。PD-1也在胸腺细胞和髓样细胞的亚群上表达(Agata等人(1996)同上；Nishimura等人(1996) Int. Immunol. 8:773)。
代表性的人PD-1生物标记物的核酸序列和氨基酸序列可在GenBank数据库的NM_005018.2和NP_005009.2下公开获得(还参见Ishida等人(1992) 20 EMBO J 11:3887；Shinohara等人(1994) Genomics 23:704；美国专利5,698,520)。PD-1具有含有免疫球蛋白超家族结构域的细胞外区域、跨膜结构域以及包括基于免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(Ishida等人(1992) EMBO J. 11:3887；Shinohara等人(1994) Genomics 23:704；以及美国专利5,698,520)和基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)的细胞内区域。这些特征还定义了被称为免疫抑制受体的更大的多肽家族，其还包括gp49B、PIR-B和杀伤细胞抑制受体(KIR) (Vivier和Daeron (1997) Immunol. Today 18:286)。经常假定这些受体的酪氨酰磷酸化ITIM和ITSM基序与含有SH2结构域的磷酸酶相互作用，这导致抑制信号。这些免疫抑制受体的子集与MHC多肽例如KIR结合，而CTLA4与B7-1和B7-2结合。已提出在MHC和B7基因之间存在系统发育关系(Henry等人(1999) Immunol. Today 20 (6):285-8)。在除人外的生物中的PD-1直向同源物的核酸序列和多肽序列是众所周知的，并且包括例如小鼠PD-1(NM_008798.2和NP_032824.1)、大鼠PD-1 (NM_001106927.1和NP_001100397.1)、犬PD-1(XM_543338.3和XP_543338.3)、牛PD-1 (NM_001083506.1和NP_001076975.1)以及鸡PD-1(XM_422723.3和XP_422723.2)。
PD-1多肽是能够将抑制信号传递给免疫细胞，以因此抑制免疫细胞效应子功能的抑制受体，或者例如当以可溶性单体形式存在时，能够促进免疫细胞的共刺激(例如，通过竞争性抑制)。优选的PD-1家族成员与PD-1共享序列同一性，并且结合一个或多个B7家族成员，例如B7-1、B7-2、PD-1配体和/或抗原呈递细胞上的其它多肽。
术语“PD-1活性”包括PD-1多肽在活化的免疫细胞中调节抑制信号的能力，例如通过与抗原呈递细胞上的天然PD-1配体接合。免疫细胞中的抑制信号的调节导致免疫细胞的增殖的调节和/或通过免疫细胞的细胞因子分泌的调节。因此，术语“PD-1活性”包括PD-1多肽结合其天然配体的能力、调节免疫细胞共刺激信号或抑制信号的能力以及调节免疫应答的能力。
术语“PD-1配体”指PD-1受体的结合配偶体，并且包括PD-L1 (Freeman等人(2000) J. Exp. Med. 192:1027-1034)和PD-L2 (Latchman等人(2001) Nat. Immunol. 2:261)两者。存在至少两种类型的人PD-1配体多肽。PD-1配体蛋白包含信号序列，以及IgV结构域、IgC结构域、跨膜结构域和短的胞质尾区。PD-L1 (关于序列数据，参见Freeman等人(2000))和PD-L2 (关于序列数据，参见Latchman等人(2001) Nat. Immunol. 2:261)两者均为B7多肽家族的成员。PD-L1和PD-L2两者均在胎盘、脾脏、淋巴结、胸腺和心脏中表达。只有PD-L2在胰腺、肺和肝脏中表达，而只有PD-L1在胎儿肝脏中表达。两种PD-1配体在活化的单核细胞和树突状细胞上均为上调的，尽管PD-L1表达更广泛。例如，已知PD-L1在鼠造血细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)和骨髓衍生的肥大细胞)和非造血细胞(例如，内皮细胞、上皮细胞和肌细胞)上组成型地表达并上调至更高的水平，而PD-L2在DC、巨噬细胞和骨髓衍生的肥大细胞上诱导型地表达(参见Butte等人(2007) Immunity 27:111)。
PD-1配体包含具有某些保守的结构和功能特征的多肽家族。当用于指蛋白质或核酸分子时，术语“家族”预期意指具有共同结构域或基序，并且具有足够的氨基酸或核苷酸序列同源性的两种或更多种蛋白质或核酸分子，如本文定义的。此类家族成员可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以来自相同或不同的物种。例如，家族可以含有人起源的第一蛋白质，以及人起源的其它不同的蛋白质，或可替代地，可以含有非人起源的同源物。家族的成员也可能具有共同的功能特性。PD-1配体是B7多肽家族的成员。如本文使用的，术语“B7家族”或“B7多肽”包括与B7多肽例如与B7-1、B7-2、B7h (Swallow等人(1999) Immunity11:423)和/或PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)共享序列同源性的共刺激多肽。例如，当使用在NCBI的BLAST程序以默认参数(其中空位罚分设定为存在11和延伸1的Blosum62矩阵)(参见NCBI网站)进行比较时，人B7-1和B7-2共享大约26%的氨基酸序列同一性。术语B7家族还包括能够调节免疫细胞功能的这些多肽的变体。B7家族的分子共享许多保守区域，包括信号结构域、IgV结构域和IgC结构域。IgV结构域和IgC结构域是领域公认的Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有被称为Ig折叠的不同折叠模式的结构单元。Ig折叠包含两个β折叠的夹心，所述β折叠各自由5-10个氨基酸的反平行β链组成，具有在大多数(但不是全部)的两个折叠之间的保守二硫键。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共享相同类型的序列模式，并且在Ig超家族内被称为C1集合。其它IgC结构域落入其它集合内。IgV结构域也共享序列模式，并且被称为V集合结构域。IgV结构域比IgC结构域更长，并且含有另外一对β链。
优选的B7多肽能够向免疫细胞提供共刺激信号或抑制信号，以因此促进或抑制免疫细胞应答。例如，与共刺激受体结合的B7家族成员增加T细胞的活化和增殖，而与抑制受体结合的B7家族成员减少共刺激。此外，相同的B7家族成员可能增加或降低T细胞共刺激。例如，当与共刺激受体结合时，PD-1配体可以诱导免疫细胞的共刺激，或例如，当以可溶形式存在时，可以抑制免疫细胞共刺激。当与抑制受体结合时，PD-1配体多肽可以将抑制信号传递给免疫细胞。优选的B7家族成员包括B7-1、B7-2、B7h、PD-L1或PD-L2及其可溶性片段或衍生物。在一个实施方案中，B7家族成员结合免疫细胞上的一种或多种受体，例如CTLA4、CD28、ICOS、PD-1和/或其它受体，并且取决于受体，具有对免疫细胞(优选T细胞)传递抑制信号或共刺激信号的能力。
共刺激信号的调节导致免疫细胞的效应子功能的调节。因此，术语“PD-1配体活性”包括PD-1配体多肽结合其天然受体(例如PD-1或B7-1)的能力、调节免疫细胞共刺激信号或抑制信号的能力以及调节免疫应答的能力。
术语“PD-L1”指特异性PD-1配体。已鉴定了两种形式的人PD-L1分子。一种形式是天然存在的PD-L1可溶性多肽，即具有短的亲水性结构域且没有跨膜结构域，并且在本文中被称为PD-L1S。第二种形式是细胞相关多肽，即具有跨膜结构域和细胞质结构域，在本文中被称为PD-L1M。关于PD-L1M的代表性人PD-L1生物标记物的核酸序列和氨基酸序列也可在GenBank数据库的NM_014143.3和NP_054862.1下公开获得。PD-L1蛋白包含信号序列，以及IgV结构域和IgC结构域。另外，在除人外的生物中的PD-L1直向同源物的核酸序列和多肽序列是众所周知的，并且包括例如小鼠PD-L1 (NM_021893.3和NP_068693.1)、大鼠PD-L1(NM_001191954.1和NP_001178883.1)、犬PD-L1 (XM_541302.3和XP_541302.3)、牛PD-L1(NM_001163412.1和NP_001156884.1)以及鸡PD-L1 (XM_424811.3和XP_424811.3)。
术语“PD-L2”指另一种特异性PD-1配体。PD-L2是在各种APC上表达的B7家族成员，所述APC包括树突状细胞、巨噬细胞和骨髓衍生的肥大细胞(Zhong等人(2007) Eur. J.Immunol. 37:2405)。APC表达的PD-L2既能够通过PD-1的连接抑制T细胞活化，又能够通过PD-1不依赖性机制共刺激T细胞活化(Shin等人(2005) J. Exp. Med. 201:1531)。另外，树突状细胞表达的PD-L2的连接导致增强的树突状细胞的细胞因子表达和存活(Radhakrishnan等人(2003) J. Immunol. 37:1827；Nguyen等人(2002) J. Exp. Med.196:1393)。代表性人PD-L2生物标记物的核酸序列和氨基酸序列是本领域众所周知的，并且也可在GenBank数据库的NM_025239.3和NP_079515.2下公开获得。PD-L2蛋白的特征在于共同的结构元件。在一些实施方案中，PD-L2蛋白包括下述结构域中的至少一个或多个：信号肽结构域、跨膜结构域、IgV结构域、IgC结构域、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。如本文使用的，“信号序列”或“信号肽”作用于将含有此类序列的多肽引导至脂质双层，并且在分泌的和膜结合的多肽中被切割，并且包括含有约15个或更多个氨基酸的肽，其在分泌性和膜结合的多肽的N末端处出现，并且其含有大量疏水性氨基酸残基。例如，信号序列含有至少约10-30个氨基酸残基，优选约15-25个氨基酸残基，更优选约18-20个氨基酸残基，且甚至更优选约19个氨基酸残基，并且具有至少约35-65%，优选约38-50%，且更优选约40-45%的疏水性氨基酸残基(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。在另一个实施方案中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基220-243和成熟多肽的氨基酸残基201-243构成跨膜结构域。如本文使用的，术语“跨膜结构域”包括长度约15个氨基酸残基的氨基酸序列，其跨越质膜。更优选地，跨膜结构域包括约至少20、25、30、35、40或45个氨基酸残基并跨越质膜。跨膜结构域富含疏水性残基，且通常具有α螺旋结构。在一个优选的实施方案中，跨膜结构域的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的氨基酸是疏水的，例如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域在例如Zagotta，W. N.等人(1996) Annu. Rev. Neurosci. 19:235-263中进行描述。在又另一个实施方案中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基20-120和成熟多肽的氨基酸残基1-101构成IgV结构域。天然人PD-L2多肽的氨基酸残基121-219和成熟多肽的氨基酸残基102-200构成IgC结构域。如本文使用的，IgV和IgC结构域在本领域中被认为是Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有被称为Ig折叠的不同折叠模式的结构单元。Ig折叠包含两个β折叠的夹心，所述β折叠各自由5-10个氨基酸的反平行β链组成，具有在大多数(但不是全部)结构域中的两个折叠之间的保守二硫键。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共享相同类型的序列模式，并且在Ig超家族内被称为Cl集合。其它IgC结构域落入其它集合内。IgV结构域也共享序列模式，并且被称为V集合结构域。IgV结构域比C结构域更长，并且形成另外一对链。在再另一个实施方案中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基1-219和成熟多肽的氨基酸残基1-200构成细胞外结构域。如本文使用的，术语“细胞外结构域”表示从细胞的表面作为尾区延伸的N末端氨基酸。本发明的细胞外结构域包括IgV结构域和IgC结构域，并且可能包括信号肽结构域。在又另一个实施方案中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基244-273和成熟多肽的氨基酸残基225-273构成细胞质结构域。如本文使用的，术语“细胞质结构域”表示作为尾区延伸到细胞的细胞质内的C末端氨基酸。另外，在除人外的生物中的PD-L2直向同源物的核酸序列和多肽序列是众所周知的，并且包括例如小鼠PD-L2(NM_021396.2和NP_067371.1)、大鼠PD-L2 (NM_001107582.2和NP_001101052.2)、犬PD-L2(XM_847012.2和XP_852105.2)、牛PD-L2 (XM_586846.5和XP_586846.3)以及黑猩猩PD-L2(XM_001140776.2和XP_001140776.1)。
术语“PD-L2活性”、“PD-L2的生物活性”或“PD-L2的功能活性”指如根据标准技术在体内或体外确定的，通过PD-L2蛋白、多肽或核酸分子对PD-L2响应性细胞或组织或者对PD-L2多肽结合配偶体施加的活性。在一个实施方案中，PD-L2活性是直接活性，例如与PD-L2结合配偶体的结合。如本文使用的，“靶分子”或“结合配偶体”是PD-L2多肽在自然界中与之结合或相互作用，使得PD-L2介导的功能得到实现的分子。在一个示例性实施方案中，PD-L2靶分子是受体RGMb。可替代地，PD-L2活性是间接活性，例如由PD-L2多肽与其天然结合配偶体(即，涉及免疫功能或其它生物学上有关的功能的生理学上有关的相互作用大分子)例如RGMb的相互作用介导的细胞信号传导活性。本文描述了PD-L2的生物活性。例如，本发明的PD-L2多肽可以具有下述活性中的一种或多种：1)与受体RGMb、PD-1或其它PD-L2天然结合配偶体结合和/或调节其活性，2)调节细胞内或细胞间信号传导，3)调节免疫细胞例如T淋巴细胞的活化，和4)调节生物例如小鼠或人生物的免疫应答。
“抗免疫检查点疗法”指抑制免疫检查点核酸和/或蛋白质的药剂的使用。一个或多个免疫检查点的抑制可以阻断或以其它方式中和抑制性信号传导，以因此上调免疫应答，以便更有效地治疗癌症。可用于抑制免疫检查点的示例性药剂包括抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物，其可以结合和/或失活或抑制免疫检查点蛋白或其片段；以及RNA干扰、反义、核酸适体等，其可以下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性。用于上调免疫应答的示例性药剂包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的抗体，其阻断该蛋白与其天然受体之间的相互作用；一种或多种免疫检查点蛋白的非活化形式(例如，显性阴性多肽)；阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用的小分子或肽；与其天然受体结合的融合蛋白(例如，与抗体或免疫球蛋白的Fc部分融合的免疫检查点抑制蛋白的细胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子；等等。此类药剂可以直接阻断一种或多种免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用，以阻止抑制性信号传导并上调免疫应答。可替代地，药剂可以间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用，以阻止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如，免疫检查点蛋白配体(例如稳定的细胞外结构域)的可溶形式可以与其受体结合，以间接减少与适当配体结合的受体的有效浓度。在一个实施方案中，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体单独或组合地被用于抑制免疫检查点。这些实施方案也适用于针对特定免疫检查点例如PD-1途径的特异性疗法(例如，抗PD-1途径疗法，也被称为PD-1途径抑制剂疗法)。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和方法中使用的免疫疗法是抑制PD1或PD-L1的药剂。此类药剂包括但不限于小分子抑制剂、CRISPR向导RNA (gRNA)、RNA干扰剂、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适体、抗体或细胞内抗体。在具体实施方案中，抑制PD1或PD-L1的药剂是PD1或PD-L1阻断抗体。可以用于本发明中的示例性抗PD-1抗体包括但不限于Keytruda (Merck，Inc.)。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法中使用的免疫疗法是免疫调节剂。此类药剂包括但不限于CXCR4/CXCR7拮抗剂(例如，AMD3100)、Jak/stat抑制剂(例如，鲁索替尼)和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节。皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的实例在Kimizuka，Y.等人J. Immun. 2018，201 (12) 3587-3603和Gelfand，J.等人FASEB J. 2019，33 (2)，3074-3081中进行描述，所述参考文献通过参考以其整体引入。
药物组合物和施用
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)非共价结合。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含免疫疗法(例如，抗PD-1抗体)。在具体实施方案中，生物素化且与热激蛋白融合物非共价结合的肿瘤抗原是选自表1或表3的肽。药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂。
如上所述产生的热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以纯化至合适的纯度，以用作药物组合物。一般地，纯化的组合物将具有一个种类，其占组合物中存在的所有种类的多于约85百分比，存在的所有种类的多于约85%、90%、95%、99%或更多。可以将目标种类纯化至基本同质性(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)，其中组合物基本上由单一种类组成。技术人员可以根据本文的教导，使用用于纯化的标准技术，例如免疫亲和色谱、尺寸排阻色谱等，来纯化热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)或其非共价复合物。蛋白质的纯度可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行确定，所述方法包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝胶电泳和质谱法分析。
相应地，提供的是包含上述热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)或其非共价复合物的药物组合物。在一个方面，提供的是药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所述的药物组合物，该组合物连同一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂一起进行配制。在另一个方面，在某些实施方案中，药物组合物可以原样施用或与药学上可接受的载剂混合施用，并且也可以与其它药剂结合施用。因此，联合(组合)疗法包括以首先施用的疗法的疗效在后续物进行施用时尚未完全消失的方式的序贯、同时和分开或共施用。
如本文所述，热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)或其非共价复合物可以各种方式施用于受试者。施用途径包括全身、外周、肠胃外、肠内、局部和经皮(例如，缓释聚合物)。可以使用任何其它方便的施用途径，例如，输注或推注，或者通过上皮或皮肤粘膜内层的吸收。另外，本文所述的组合物可以含有其它药理学上可接受的组分，并且连同或不连同其它药理学上可接受的组分一起施用，所述其它药理学上可接受的组分例如生物活性剂(例如佐剂，如铝佐剂)、表面活性剂(例如甘油酯)、赋形剂(例如乳糖)、载剂、稀释剂和媒介物。此外，组合物可以离体用作刺激从受试者中获得的白血细胞以在体外引发、扩大且增殖随后重新引入受试者内的抗原特异性免疫细胞的手段。
对于包含生物素化的肿瘤细胞的药物组合物，可以以0.1 x 106、0.2 x 106、0.3 x106、0.4 x 106、0.5 x 106、0.6 x 106、0.7 x 106、0.8 x 106、0.9 x 106、1.0 x 106、5.0 x106、1.0 x 107、5.0 x 107、1.0 x 108、5.0 x 108或更多，或者两者之间的任何范围或两者之间的任何值的细胞/千克受试者体重来施用肿瘤细胞。移植细胞的数目可以基于在给定时间量内所期望的植入水平进行调整。一般地，必要时，可以移植1×105 至约1×109 个细胞/kg体重、约1×106至约1×108 个细胞/kg体重或约1×107 个细胞/kg体重或者更多细胞。在一些实施方案中，相对于平均大小的小鼠，至少约0.1x106、0.5x106、1.0×106、2.0×106、3.0×106、4.0×106或5.0×106 个总细胞的移植是有效的。
可以使用本领域一般已知的方法来完成施用。药物组合物，包括细胞，可以通过直接注射或通过本领域使用的任何其它手段引入所期望部位，所述其他手段包括但不限于血管内、大脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或肌内施用。
例如，目的受试者可以通过各种途径用移植的细胞进行植入。此类途径包括但不限于静脉内施用、皮下施用、施用于特定组织(例如，局部移植)、注射到股骨骨髓腔内、注射到脾脏内、在胎儿肝脏的肾囊下施用等等。在某些实施方案中，将本发明的癌症疫苗肿瘤内或皮下注射到受试者。细胞可以在一次输注中进行施用，或通过在足以生成所需效应的限定时间段内的连续输注进行施用。用于移植细胞的移植、植入评价和标记物表型分型分析的示例性方法是本领域众所周知的(参见例如，Pearson等人(2008) Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21；Ito等人(2002) Blood 100:3175-3182；Traggiai等人(2004) Science 304:104-107；Ishikawa等人Blood (2005) 106:1565-1573；Shultz等人(2005) J. Immunol. 174:6477-6489；以及Holyoake等人(1999) Exp. Hematol. 27:1418-1427)。
另外，本发明的药物组合物可以以适合于药物施用的生物学相容形式施用于受试者或以其它方式在受试者体外应用。“适合于体内施用的生物学相容形式”意指其中治疗效果超过了任何毒性效应的待施用的形式。如本文所述的药物组合物的施用可以呈任何药理学形式，其包括单独或与药学上可接受的载剂组合的治疗有效量的药剂。如本文使用的，短语“治疗有效量”意指以合理的利益/风险比，有效产生一定的所期望的疗效(例如癌症治疗)的药剂的量。
本发明的药物组合物的治疗活性量的施用被定义为在必要的剂量和时间段下，有效达到所期望结果的量。例如，药剂的治疗活性量可以根据因素而变，所述因素如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及肽在个体中引发所期望应答的能力。可以调整剂量方案，以提供最佳治疗应答。例如，可以每天施用几个分份剂量，或者可以如通过治疗情形的紧急状态指示的那样按比例减少剂量。
单一药剂的组合剂型或同时施用可以导致有效量的每种所期望调节剂同时存在于患者中。
本文所述的药物组合物可以以方便的方式进行施用，所述方式例如通过注射(皮下、静脉内等)、经口施用、吸入、经皮应用或直肠施用。取决于施用途径，可以将活性剂包被在材料中，以保护药剂免于酶、酸和可能使药剂失活的其它自然条件的作用。例如，对于除肠胃外施用外的药物组合物的施用，可能期望用材料包被药物组合物，或将药物组合物与材料共施用，以阻止其失活。
药物组合物可以在适当的载剂、稀释剂或佐剂中施用于个体，与酶抑制剂或在适当的载剂(如脂质体)中共施用。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。佐剂以其最广泛的意义使用，并且包括任何免疫刺激剂，例如干扰素。本文考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、氟磷酸二异丙酯(DEEP)和抑肽酶(trasylol)。脂质体包括水包油包水型乳状液以及常规脂质体(Sterna等人(1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。
药物组合物也可以肠胃外或腹膜内施用。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中进行制备。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂可能含有防腐剂以预防微生物的生长。
适合于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，组合物将优选是无菌的，并且必须流动至存在容易注射性的程度。它将优选在制造和贮存条件下是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来达到微生物作用的预防，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来达到可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下进行制备：将本发明的药物组合物以所需的量掺入根据需要具有上文列举成分之一或组合的适当溶剂中，随后为过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性剂掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举那些的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生药剂加上任何另外的所期望成分的粉末。
用于施用的组合物可以包括溶解于药学上可接受的载剂(例如水性载剂)中的药物组合物的溶液。可以使用各种水性载剂，例如缓冲盐水等等。这些溶液是无菌的并且一般不含不期望的物质。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。组合物可以含有如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些制剂中的生物标记物特异性试剂的浓度可以广泛地变化，并且将依照所选的特定施用模式和受试者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等等加以选择。
药物组合物可以以冻干形式提供并在施用前用无菌水再水合，尽管它们也以已知浓度的无菌溶液提供。用于制备可施用组合物的实际方法对于本领域技术人员将是已知的或显而易见的，并且在此类出版物如Remington's Pharmaceutical Science，第19版，MackPublishing Company，Easton，Pa. (1995)中更详细地进行描述。
当药物组合物如上所述适当地进行保护时，它可以例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载剂一起经口施用。如本文使用的，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非在任何常规介质或试剂与活性剂不相容的情况下，否则考虑其在药物组合物中的使用。补充性活性剂也可以掺入组合物内。
将肠胃外组合物配制成剂量单位形式对于施用的容易性和剂量的均匀性是尤其有利的。如本文使用的，“剂量单位形式”指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定数量的活性剂以及所需的药物载剂，所述预定数量经计算以产生所期望疗效。关于本发明的剂量单位形式的规格由以下决定并直接取决于以下：(a)活性剂的独特特性和待实现的特定疗效，和(b)调配此类活性剂用于治疗个体中的敏感性的领域中固有的限制性。
进一步地，热激蛋白融合蛋白可以通过编码此类蛋白质序列的核酸的体内表达而施用到人受试者内。此类核酸的表达以及与生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)的接触也可以离体实现，作为刺激从受试者中获得的白血细胞，以在体外引发、扩大且增殖随后重新引入受试者内的抗原特异性免疫细胞的手段。适合于指导热激蛋白融合蛋白的表达的表达载体可以选自本领域目前使用的大量载体。优选的将是能够产生高水平的表达以及有效转导目的基因的载体。例如，可以使用重组腺病毒载体pJM17 (All等人，Gene Therapy 1:367-84 (1994)；Berkner K. L.，Biotechniques 6:616-24 1988)、第二代腺病毒载体DE1/DE4 (Wang和Finer，Nature Medicine 2:714-6 (1996))或腺相关病毒载体AAV/Neo (Muro-Cacho等人，J. Immunotherapy 11:231-7 (1992))。此外，可以采用重组逆转录病毒载体MFG (Jaffee等人，Cancer Res. 53:2221-6 (1993))或LN、LNSX、LNCX、LXSN(Miller和Rosman，Biotechniques 7:980-9 (1989))。基于单纯疱疹病毒的载体例如pHSV1(Geller等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. 87:8950-4 (1990)，或牛痘病毒载体例如MVA(Sutter和Moss. Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:10847-51 (1992))可以充当替代方案。
包括启动子和3'序列的频繁使用的特异性表达单元是在质粒CDNA3(Invitrogen)、质粒AH5、pRC/CMV (Invitrogen)、pCMU II (Paabo等人，EMBO J. 5:1921-1927 (1986))、pZip-Neo SV (Cepko等人，Cell 37:1053-1062 (1984))和pSRa (DNAX，Palo Alto，CA)中发现的那些。可以使用遗传改造技术来实现将基因引入表达单元和/或载体内，所述遗传改造技术如在手册像Molecular Cloning and Current Protocols inMolecular Biology (Sambrook，J.等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press(1989)；Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience (1989))中所述的。可以通过能够将核酸以可表达形式置于细胞内的任何方法，例如作为如上所述的病毒载体的部分、作为裸露质粒或其它DNA或者封装在靶向脂质体或红细胞血影中，将所得到的可表达核酸引入人受试者的细胞内(Friedman，T.，Science，244:1275-1281 (1989)；Rabinovich，N.R.等人，Science. 265:1401-1404 (1994))。转导方法包括直接注射到组织和肿瘤内，脂质体转染(Fraley等人，Nature 370:111-117 (1980))，受体介导的内吞作用(Zatloukal等人，Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-153 (1992))，以及粒子轰击介导的基因转移(Eisenbraun等人，DNA & Cell. Biol. 12:791-797 (1993))。
本发明的组合物中的热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)或其非共价复合物的量是在受试者中产生有效免疫刺激应答的量。有效量是当施用时它诱导免疫应答的量。另外，施用于受试者的热激蛋白融合物和生物素化的组分或其非共价复合物的量将取决于各种因素而变，所述因素包括所采用的热激蛋白融合物和生物素化的组分，受试者的大小、年龄、体重、总体健康、性别和饮食，以及其一般免疫应答性。确定的剂量范围的调整和操作完全在本领域技术人员的能力内。例如，热激蛋白融合物、生物素化的组分或其非共价复合物的量可以是约1微克至约1克，优选约100微克至约1克，以及约1毫克至约1克。包含表达载体的组合物的有效量是当施用时，它诱导针对药物组合物所针对的抗原的免疫应答的量。此外，施用于受试者的表达载体的量将取决于各种因素而变，所述因素包括所表达的热激蛋白融合物，受试者的大小、年龄、体重、总体健康、性别和饮食，以及其一般免疫应答性。需要考虑的另外因素是应用途径和使用的载体类型。例如，当用含有编码热激蛋白融合物的核酸的病毒载体进行预防性或治疗性治疗时，有效量将在104至1012个无辅助物的复制缺陷型病毒/kg体重的范围内，优选在105至1011个病毒/kg体重的范围内，且最优选在106至1010个病毒/kg体重的范围内。
用于在受试者中诱导免疫应答的融合蛋白和生物素化的组分或其非共价复合物的有效量的确定，完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
最初可以根据体外测定估计有效剂量。例如，可以使用本领域众所周知的技术，在动物模型中制定剂量，以实现免疫应答的诱导。基于动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的施用。剂量的量和间隔可以个别地进行调整。例如，当用作疫苗时，本发明的蛋白质和/或菌株可以以约1至3剂施用1-36周的时期。优选地，以约3-4个月的间隔施用3剂，并且此后可以定期给予加强疫苗接种。替代方案可能对于个别患者是适当的。合适的剂量是当如上所述施用时，能够在免疫的患者中引起足以保护患者免于状况或感染至少1-2年的免疫应答的蛋白质或菌株的量。
组合物还可以包括佐剂以增强免疫应答。另外，此类蛋白质可以进一步悬浮于油乳状液中，以引起在注射后蛋白质在体内更缓慢的释放。制剂中的每种组分的最佳比率可以通过本领域技术人员众所周知的技术进行确定。
各种佐剂中的任一种都可以用于本发明的疫苗中，以增强免疫应答。大多数佐剂含有设计为保护抗原免于快速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，以及特异性或非特异性的免疫应答刺激物，例如脂质A或百日咳鲍特菌(Bortadella pertussis)。合适的佐剂是商购可得的，并且包括例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)以及Merck Adjuvant 65 (Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)。其它合适的佐剂包括铝佐剂、可生物降解的微球体、单磷酰脂质A、quil A、SBAS1c、SBAS2 (Ling等人，1997，Vaccine 15:1562-1567)、SBAS7、Al(OH)3和CpG寡核苷酸(WO96/02555)。
在本发明的疫苗中，佐剂可以诱导Th1型免疫应答。合适的佐剂系统包括例如单磷酰脂质A，优选3-去-O-酰化的单磷酰脂质A (3D-MPL)连同铝盐的组合。增强的系统涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是如WO 94/00153中公开的3D-MLP和皂苷QS21的组合，或如WO 96/33739中公开的其中QS21用胆固醇进行淬灭的反应原性较低的组合物。先前的实验已证实了3D-MLP和QS21的组合在诱导体液和Th1型细胞免疫应答两者中的明确的协同效应。在水包油型乳状液中的涉及QS21、3D-MLP和生育酚的特别有力的佐剂形成在WO95/17210中进行描述，并且可以包含制剂。
治疗方法
本发明提供了治疗处于癌症的风险中(或易患癌症)或患有癌症的受试者的预防性和治疗性方法两者。癌症可以是实体癌或血液癌。癌症可以是肉瘤或癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病。
在某些实施方案中，癌症是卵巢癌，例如浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。在一些实施方案中，癌症由产生肿瘤的病毒(例如，HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒)的感染所诱导。在某些实施方案中，癌症可以是HPV相关癌症(例如，人乳头状瘤病毒(HPV)诱导的宫颈癌、HPV诱导的头颈癌或HPV诱导的肛门癌)。
在一个实施方案中，癌症与生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原是相同的癌症类型或具有相同的遗传突变。在另一个实施方案中，癌症与生物素化的肿瘤细胞或肿瘤抗原是不同的癌症类型或具有不同的遗传突变。
本文所述的热激蛋白融合物和生物素化的组分(例如，肿瘤细胞或肿瘤抗原)可以施用于受试者，以诱导或增强该受试者的抗肿瘤免疫应答。热激蛋白融合物可以简单地增强免疫应答(因此充当免疫原性组合物)，或赋予保护性免疫(因此充当疫苗)。相应地，本文还提供了使用本文描述的药物组合物诱导免疫应答的方法。
a. 预防方法
在一个方面，本发明提供了通过向受试者施用有效量的药物组合物，用于预防受试者中的卵巢癌的方法，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽选自表1或表3。
在另一个方面，本发明提供了通过向受试者施用有效量的药物组合物，用于预防受试者中的癌症(例如，卵巢癌、头颈癌、肛门癌或宫颈癌)的方法，所述药物组合物包含：(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原(例如，选自表1或表3的一种或多种肽)非共价结合；以及(2)免疫疗法(例如，抗PD-1抗体)。
在又另一个方面，本发明提供了用于预防受试者中的癌症(例如，卵巢癌、头颈癌、肛门癌或宫颈癌)的方法，其包括向受试者联合施用免疫疗法(例如，抗-PD-1抗体)和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原(例如，选自表1或表3的一种或多种肽)非共价结合。
在再另一个方面，本发明提供了用于预防受试者中的HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。在某些实施方案中，受试者具有HPV或已暴露于HPV。
预防剂(例如本文所述的药物组合物)的施用可以在癌症特有的症状表现之前发生，使得癌症得到预防或可替代地延迟其进展。在某些实施方案中，预防剂(例如本文所述的药物组合物)的施用保护受试者免于复发性癌症。
b. 治疗方法
本发明的其它方面有关于治疗患有癌症的受试者的方法。例如，在一个方面，本发明提供了通过向受试者施用有效量的药物组合物，用于治疗受试者中的卵巢癌的方法，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽选自表1或表3。
在另一个方面，本发明提供了通过向受试者施用有效量的药物组合物，用于治疗受试者中的癌症(例如，卵巢癌、头颈癌、肛门癌或宫颈癌)的方法，所述药物组合物包含：(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原(例如，选自表1或表3的一种或多种肽)非共价结合；以及(2)免疫疗法(例如，抗PD-1抗体)。
在又另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中的癌症(例如，卵巢癌、头颈癌、肛门癌或宫颈癌)的方法，其包括向受试者联合施用免疫疗法(例如，抗-PD-1抗体)和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原(例如，选自表1或表3的一种或多种肽)非共价结合。
在再另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中的HPV相关癌症(例如，头颈癌或肛门癌)的方法，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
c. 组合疗法
在一些方面，本文所述的自组装疫苗可以与免疫疗法组合施用。免疫疗法和自组装疫苗可以同时或序贯施用。例如，自组装疫苗可以在免疫疗法之前、同时或之后施用。
本文所述的药物组合物还可以与非靶向疗法或者与手术、冷冻疗法和/或放射疗法组合施用，所述非靶向疗法例如化学治疗剂、激素、抗血管生成剂(antiangiogen)、放射性标记的化合物。术语“非靶向疗法”指不与所选生物分子选择性地相互作用但治疗癌症的药剂的施用。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
在一个实施方案中，使用化学疗法。化学疗法包括化学治疗剂的施用。此类化学治疗剂可以是但不限于选自以下化合物组中的那些化学治疗剂：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷类、核苷类似物、植物生物碱和毒素；及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂：顺铂、曲奥舒凡和曲磷胺；植物生物碱：长春碱、紫杉醇、多西他赛；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素；抗叶酸剂：氨甲蝶呤、霉酚酸和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷和阿糖胞苷；嘌呤类似物：巯基嘌呤和硫鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2'-脱氧-5-氟尿苷、阿非迪霉素甘氨酸盐和吡唑并咪唑；以及抗有丝分裂剂：软海绵素、秋水仙碱和根瘤菌素。也可以使用包含一种或多种化学治疗剂的组合物(例如，FLAG、CHOP)。FLAG包含氟达拉滨、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松。化学治疗剂的前述实例是说明性的，并不预期是限制性的。例如，本文所述的药物组合物可以与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一个实施方案中，药物组合物与化学疗法结合施用，以增强化学治疗剂的活性和功效。医师案头参考(Physicians’ DeskReference) (PDR)公开了已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。治疗上有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于待治疗的特定癌症、疾病程度和本领域技术人员熟悉的其它因素，并且可以由医师确定。
在另一个实施方案中，使用放射疗法。放射疗法中使用的放射可以是电离辐射。放射疗法也可以是γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外部束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素如锶-89、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或全腹部和盆腔放射疗法。关于放射疗法的一般概述，参见Hellman，第16章：Principles of Cancer Management: Radiation Therapy，第6版，2001年，DeVita等人编辑，J. B. Lippencott Company，Philadelphia。放射疗法可以作为外部束辐射或远距放射疗法来施用，其中放射从远程来源引导。放射治疗也可以作为内部疗法或近距离放射疗法来施用，其中将放射源置于身体内部接近于癌细胞或肿瘤团块。还涵盖的是光动力疗法的使用，其包括施用光敏剂，例如血卟啉及其衍生物、维替泊芬(Vertoporfin) (BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-竹红菌甲素；和2BA-2-DMHA。
在另一个实施方案中，使用激素疗法。激素治疗性治疗可以包括例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、乙酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂以及甾类(例如地塞米松、类视黄醇、三角肌(deltoid)、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素A衍生物(例如，全反式视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗孕激素(例如米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(例如乙酸环丙孕酮)。
在另一个实施方案中，使用热疗，即其中将身体组织暴露于高温(高达106℉)的程序。热可能通过损伤细胞或剥夺它们存活所需的物质来帮助缩小肿瘤。热疗疗法可以是使用外部和内部加热装置的局部、区域和全身热疗。热疗几乎总是与其它形式的疗法(例如放射疗法、化学疗法和生物疗法)一起使用，以尝试增加其有效性。局部热疗指的是应用于非常小的区域(例如肿瘤)的热。可以用来自体外装置的瞄准肿瘤的高频波从外部加热该区域。为了实现内部加热，可以使用几种类型的无菌探头之一，包括充满温水的薄管、加热管或空心管；植入的微波天线；和射频电极。在区域热疗中，将器官或肢体加热。将产生高能量的磁体和装置置于待加热的区域上。在被称为灌注的另一种方法中，将患者的一些血液取出，加热，然后泵入(灌注)到待在内部加热的区域内。全身加热用于治疗已扩散到身体各处的转移性癌症。它可以使用温水毯、热蜡、感应线圈(如电热毯中的那些感应线圈)或热室(类似于大型培养箱)来完成。热疗并不引起放射副作用或并发症的任何显著增加。然而，直接应用于皮肤的热可以在约一半治疗的患者中引起不适或甚至明显的局部疼痛。它还可以引起水泡，其一般快速愈合。
在又另一个实施方案中，光动力疗法(也被称为PDT、光辐射疗法、光疗法或光化学疗法)被用于治疗一些类型的癌症。它基于以下发现：被称为光增敏剂的某些化学制品可以在单细胞生物暴露于特定类型的光时杀死该生物。PDT通过使用与光增敏剂组合的固定频率的激光来破坏癌细胞。在PDT中，将光增敏剂注射到血流内，并且由遍及全身的细胞吸收。该药剂在癌细胞中保留的时间长于它在正常细胞中保留的时间。当将治疗的癌细胞暴露于激光时，光增敏剂吸收光并产生破坏治疗的癌细胞的活性形式的氧。光暴露必须小心地进行计时，使得它在大多数光增敏剂已离开健康细胞但仍存在于癌细胞中时发生。PDT中使用的激光可以通过光导纤维(非常细的玻璃丝)引导。光导纤维接近于癌症而放置，以递送适量的光。光导纤维可以通过支气管镜引导进入肺内用于治疗肺癌，或者通过内窥镜引导进入食管内用于治疗食管癌。PDT的优点在于它对健康组织引起最低限度的损伤。然而，因为目前使用的激光不能穿过多于约3厘米的组织(略多于一又八分之一英寸)，所以PDT主要用于治疗在皮肤上或正好在皮肤下或在内脏的内层上的肿瘤。光动力疗法使得皮肤和眼在治疗后对光敏感6周或更长时间。建议患者避免直射阳光和明亮的室内光线至少6周。如果患者必须去户外，则他们需要穿防护服，包括戴太阳镜。PDT的其它暂时性副作用与治疗的特定区域有关，并且可以包括咳嗽、吞咽困难、腹痛以及呼吸疼痛或呼吸急促。在1995年12月，美国食品与药物管理局(FDA)批准了被称为卟吩姆钠或Photofrin®的光增敏剂，以缓解引起阻塞的食管癌的症状，以及用于用单独的激光无法令人满意地治疗的食管癌。在1998年1月，FDA批准了卟吩姆钠用于治疗患者中的早期非小细胞肺癌，对于所述患者，用于肺癌的常规治疗并不适当。美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)和其它机构正在支持临床试验(调查性研究)，以评估光动力疗法对于几种类型的癌症的使用，所述癌症包括膀胱癌、脑癌、喉癌和口腔癌。
在再另一个实施方案中，激光疗法用于利用高强度光来破坏癌细胞。此类技术经常用于缓解癌症的症状，例如出血或阻塞，尤其是当癌症无法通过其它治疗治愈时。它还可以用于通过缩小或破坏肿瘤来治疗癌症。术语“激光”代表通过辐射的受激发射的光放大。普通的光，例如来自灯泡的光，具有多个波长，并且向各个方向传播。另一方面，激光具有特定的波长并聚焦在窄束中。这类高强度的光含有大量的能量。激光是非常强大的，并且可以用于切穿钢材或塑造钻石。激光还可以用于非常精确的手术工作，例如修复眼中受损的视网膜或切穿组织(代替手术刀)。虽然存在几个不同种类的激光，但仅三个种类已在医学中得到广泛的使用：二氧化碳(CO2)激光——这种类型的激光可以从皮肤的表面去除薄层，而不穿透更深的层。这种技术可特别用于治疗尚未深入扩散到皮肤内的肿瘤和某些癌前状况。作为传统手术刀手术的替代方案，CO2激光还能够切割皮肤。激光以这种方式用于去除皮肤癌。钕:钇-铝-石榴石(Nd:YAG)激光——来自这种激光的光可以比来自其它类型的激光的光更深入地穿透到组织内，并且它可以引起血液迅速凝结。它可以通过光导纤维携带到不易接近的身体部分。这种类型的激光有时被用于治疗喉癌。氩激光——这种激光只能穿过组织的浅表层，并且因此可用于皮肤病学中和眼手术中。它还在被称为光动力疗法(PDT)的程序中，与光敏染料一起用于治疗肿瘤。激光具有超过标准手术工具的几个优点，其包括：激光比手术刀更精确。切口附近的组织是受保护的，因为与周围皮肤或其它组织的几乎不存在接触。由激光产生的热对手术部位进行消毒，因此减少感染的风险。可能需要更少的操作时间，因为激光的精度允许更小的切口。愈合时间经常是缩短的；由于激光使血管热封，因此存在较少的出血、肿胀或结疤。激光手术可能较不复杂。例如，使用光导纤维，激光可以被引导至身体的各部位，而无需制造大切口。更多的手术可以在门诊基础上完成。激光可以以两种方式用于治疗癌症：通过用热来缩小或破坏肿瘤，或者通过激活破坏癌细胞的被称为光增敏剂的化学制品。在PDT中，光增敏剂被保留在癌细胞中，并且可以被光刺激以引起杀死癌细胞的反应。CO2和Nd:YAG激光被用于缩小或破坏肿瘤。它们可以与内窥镜一起使用，所述内窥镜是允许医师看到身体的某些区域(例如膀胱)内的管。来自一些激光的光可以通过配备有光导纤维的柔性内窥镜传输。这允许医师看到除非通过手术否则无法达到的身体部分且在其中工作，并且因此允许非常精确的激光束瞄准。激光也可以与低倍显微镜一起使用，给予医生正在治疗的部位的清楚视野。与其它仪器一起使用时，激光系统可以产生直径小至200微米(小于极细线的宽度)的切割区域。激光被用于治疗许多类型的癌症。激光手术是用于某些阶段的声门(声带)癌、宫颈癌、皮肤癌、肺癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌的标准治疗。除其破坏癌症的用途之外，激光手术还用于帮助缓解由癌症引起的症状(姑息治疗)。例如，激光可以用于缩小或破坏阻塞患者气管(trachea) (气管(windpipe))的肿瘤，使得其更易于呼吸。它有时也用于结直肠癌和肛门癌中的缓解。激光诱导间质热疗(LITT)是激光疗法的最新发展之一。LITT使用与被称为热疗的癌症治疗相同的概念；即，热可能通过损伤细胞或剥夺它们存活所需的物质来帮助缩小肿瘤。在这种治疗中，激光被引导至身体的间质区域(器官之间的区域)。然后，激光升高肿瘤的温度，这损伤或破坏癌细胞。
先前的治疗方法和/或药物组合物可以与其它形式的常规疗法(例如，技术人员众所周知的用于癌症的护理标准治疗)结合施用，与常规疗法连续、在常规疗法之前或之后。用癌症疫苗的治疗的持续时间和/或剂量可以根据特定的自组装疫苗或特定的组合疗法而变。技术人员将了解关于特定癌症治疗剂的适当治疗时间。本发明考虑了对于每种癌症治疗剂的最佳治疗时间表的持续评价，其中如通过本发明的方法确定的，受试者癌症的表型是确定最佳治疗剂量和时间表的一个因素。
试剂盒
本发明提供了用于表达或施用与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的试剂盒。此类试剂盒可以包含编码与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的核酸。核酸可以包括在质粒或载体(例如细菌质粒或病毒载体)中。其它试剂盒包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括免疫疗法，例如抗PD-1抗体。此外，本发明提供了用于生产和/或纯化与生物素结合蛋白融合的热激蛋白的试剂盒。本文所述的试剂盒可以任选地包括生物素化的肿瘤细胞和/或肿瘤抗原。在某些实施方案中，此类试剂盒可以包括肿瘤细胞和/或肿瘤抗原，以及如本文所述的生物素化试剂。
本发明提供了用于预防和/或治疗患者中的癌症的试剂盒。例如，试剂盒可以包含如上所述的一种或多种药物组合物和任选地关于其使用的说明书。在另外其它实施方案中，本发明提供了包含一种或多种药物组合物和用于完成此类组合物施用的一种或多种装置的试剂盒。
试剂盒组分可以进行包装，用于前文方法的手动或者部分或全部自动化的实践。在涉及试剂盒的其它实施方案中，可以提供关于其使用的说明书。
本发明的其它实施方案在下述实施例中进行描述。本发明通过下述实施例进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步限制性的。在本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图通过参考引入本文。
范例
实施例1：卵巢癌的治疗
a. 研究设计
卵巢癌患者经常在疾病进展的晚期出现，其肿瘤具有低数目的突变，并且不容易被免疫系统检测到。本研究中使用了卵巢癌的免疫活性的鼠模型。与人疾病一样，ID8模型具有低数目的突变，并且重现了播散性肿瘤，如晚期患者中见到的。先前已显示了，抗PD-1治疗可以在ID8模型中提供有限的益处。为了使针对卵巢癌的SAV的潜力达到最大，将ID8特异性SAV与抗PD-1抗体疗法合作。认识到治疗卵巢癌和ID8模型系统的优点和挑战，这种方法被选择作为SAV癌症方法的“高障碍(high-bar)”测试，目标是观察用单独的疫苗治疗的小鼠中的改善存活，并潜在地增强抗PD-1抗体疗法的效应。
b. 治疗和结果
在用于卵巢癌的SAV癌症疫苗的测试中，包括了来自突变蛋白质(新抗原)和肿瘤中过度丰富的蛋白质两者的肽(参见表1)，其基本原理是为免疫系统提供肿瘤靶的广泛集合。小鼠首先用卵巢癌细胞进行注射，并且10天后用含有肿瘤靶向肽的SAV进行疫苗接种。在疫苗接种后3天开始用抗PD-1抗体的治疗，并且在每第3天继续，直到实验的第60天。每天监测小鼠，其中对于前4周，每周测量一次肿瘤生长。
研究证实了，与用单独的肽或单独的MAV蛋白治疗的对照组小鼠相比，用抗PD-1抗体、SAV癌症疫苗或两者的组合的治疗，各自延长了荷瘤小鼠的存活。重要的是，与仅用抗PD-1抗体治疗的小鼠相比，用单独的SAV癌症疫苗或与抗PD-1抗体组合的疫苗的治疗导致增强的存活。在用SAV癌症疫苗和抗PD-1抗体的组合治疗的那些小鼠中，观察到存活的最显著改善，其中7只小鼠中的3只存活超过100天。相比之下，虽然抗PD-1抗体治疗的小鼠最初存活得更久，但与对照组的小鼠相比，该组的总体存活并未改善。总之，存活数据指示了组合的SAV和抗PD-1抗体可以改善卵巢癌患者的结果。在肿瘤浸润性淋巴细胞的免疫学研究中，发现SAV/抗PD-1抗体组合的施用生成了所有治疗组的最高水平的免疫细胞增殖，并且与接受其它治疗的小鼠比较，其至少部分地促成研究的这一分支的改善存活。参见图2。
c. 结论
在这项研究中，确认了卵巢癌的ID8模型中存在可靶向蛋白和突变。接下来鉴定了来自所选肿瘤靶的候选序列，并且设计且合成了肽以构建靶向ID8肿瘤的SAV。该研究证实了单独的SAV癌症疫苗的有效性，以及与免疫疗法(例如抗PD-1抗体疗法)组合的SAV癌症疫苗的协同效应。使用更大的小鼠组以提供足够的统计功效，并生成SAV平台在临床前癌症中的功效的确切测量。
实施例2：预示性的 - 在临床前模型中的卵巢癌治疗
来自实施例1中描述的攻击模型系统的积极结果保证了SAV癌症疫苗的进一步精制和调查。SAV癌症平台可以通过以几种方式进行精制。首先，在其它抗癌研究中开发的修改形式的MAV被用于改善免疫系统的刺激。其次，测量了针对用SAV平台递送的癌症靶向肽的免疫应答的强度和特异性。然后将这些结果与其它基于肽的方法的先前报告进行比较，并且鉴定任何表现不佳的肽，这指导进一步优化。免疫刺激的这种评估包括被称为磷酸肽的第二类肿瘤衍生肽。尽管未包括在上述研究中，但这些肽可以类似地被免疫系统识别，并且扩大肿瘤内的靶数目。ID8模型可以使用一系列初始剂量的癌细胞。减少剂量的肿瘤细胞减缓肿瘤的生长。鉴于ID8模型的攻击性质，评估了用减少数量的癌细胞注射的小鼠。在先前的实验中，已显示了减少数目的细胞导致生长较慢的肿瘤和更长的总体存活。这种方法的优点在于疫苗有更多的时间来对抗肿瘤以及更低的总体斗争负担。最后，实施了精制的SAV癌症疫苗的大规模研究，该研究足够有效以提供关于存活的稳固统计数据，并且测定被包括在内，以生成关于SAV平台性能的确切数据。
在掺入精制之后，执行了大规模研究，其包括响应治疗在免疫功能和肿瘤生物学上的变化的稳固描述，以及提供充足统计数据的足够有效的存活分支。使用CyTOF的免疫系统的详细描述被包括在完整的研究中，其提供了使用传统流式细胞术无法获得的广泛而详细的评价。后来可以使用RNAseq查询的肿瘤被存入库中，这提供了关于肿瘤内的癌细胞和免疫细胞两者的行为的信息。存库的肿瘤也可以用于实施分层成像分析，以绘制肿瘤中的药物和免疫细胞的分布图。
实施例3：预示性的 - HPV相关癌症的治疗
还调查了对免疫疗法和疫苗接种更敏感的鼠模型系统。评估了三个模型系统。第一个是人乳头状瘤病毒(HPV)诱导的宫颈癌模型，其提供了许多充分确定的HPV病毒抗原，以及是第二妇科癌症。还评估了SAV用于预防和/或治疗HPV相关的头颈癌和肛门癌的效果。
TC-1模型使用HPV16进行制备。疫苗被设计为靶向E6和/或E7表位。用于C57和Balb/c小鼠的肽是不同的，因为C57和Balb/c小鼠具有不同的MHC等位基因(参见表4)。使用C57BL/6雌性小鼠。来自HPV E6和E7蛋白的表位选自文献中的共有序列(参见表5)。不需要到21世纪对于生产的优化。
表4.
小鼠品系 MHC单倍型 H-2K H-2D H-2L
BALB/CJ d d d d
C57BL/6 b b b 无效
研究中使用的肽包括：
E6 QLLRREVYDFAFRDLC (SEQ ID NO: 3)
E7 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCD (SEQ ID NO: 4)
表5. 研究中使用的另外肽的列表
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这个列表来自文献，并且可能并不代表详尽的搜索。它们与使用可公开获得的MHC表位选择工具生成的预测一致。它们反映了由关于HPV驱动的肿瘤模型的众多研究使用的共有序列。
使用的序列与适用于由HPV-16驱动的人肿瘤的序列重叠。那些序列与HPV 31、33、45、58和73共享大约70%的同源性。一组不同的肽可以用于人的研究。例如，人HLA-DR11等位基因结合跨越HPV16 E6氨基酸(AA) 52-62的肽，而我们使用HPV16 E6 AA43-57。
通过参考引入
本文提到的所有出版物、专利和专利申请都在此通过参考以其整体引入，如同每个个别出版物、专利或专利申请被具体地且个别地指示通过参考引入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。
还通过参考以其整体引入的是任何多核苷酸和多肽序列，其参考与公共数据库中的条目相关联的登录号，例如在万维网上的tigr.org处由美国基因组研究所(TheInstitute for Genomic Research) (TIGR)和/或在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov处由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)维护的那些。
等价方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。此类等价方案预期由下述权利要求所涵盖。

Claims (187)

1.一种药物组合物，其包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽：
(1)与MHC I类分子结合；和
(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
5.权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
6.权利要求1-5中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70；任选地其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的药物组合物，其中所述肽具有5-50个氨基酸的长度；任选地所述肽具有8-12个氨基酸的长度。
8.权利要求1-7中任一项的药物组合物，其中所述肽是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。
9.权利要求1-8中任一项的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
10.权利要求1-9中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加患有卵巢癌的受试者的存活率。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述卵巢癌是浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。
12.权利要求1-11中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫应答。
13.权利要求1-12中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
14.用于产生权利要求1-13中任一项的药物组合物的方法，其包括使融合至生物素结合蛋白的热激蛋白与生物素化的肽接触，足以形成所述热激蛋白和所述生物素化的肽的非共价复合物，其中所述肽：
(1)与MHC I类分子结合；和
(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。
15.在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-13中任一项的药物组合物。
16.预防和/或治疗受试者中的卵巢癌的方法，其包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肽非共价结合，并且其中所述肽：
(1)与MHC I类分子结合；和
(2)与自体天然序列和/或天然微生物组序列具有小于100%的同源性。
17.权利要求16的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
18.权利要求16或17的方法，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
21.权利要求16-20中任一项的方法，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70；任选地其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中所述肽具有5-50个氨基酸的长度；任选地所述肽具有8-12个氨基酸的长度。
23.权利要求16-22中任一项的方法，其中所述肽是选自表1 (在第0110段)的一种或多种肽。
24.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
25.权利要求16-24中任一项的方法，其中所述药物组合物增加患有卵巢癌的受试者的存活率。
26.权利要求16-25中任一项的方法，其中所述药物组合物增加所述受试者中的免疫应答。
27.权利要求16-26中任一项的方法，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
28.权利要求16-27中任一项的方法，其中所述方法是治疗卵巢癌的方法。
29.权利要求16-28中任一项的方法，其中所述卵巢癌是浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。
30.权利要求16-29中任一项的方法，其中所述药物组合物作为非共价复合物施用于所述受试者。
31.一种药物组合物，其包含：
(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原非共价结合；和
(2)免疫疗法。
32.权利要求31的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
33.权利要求30或31的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
34.权利要求31-33中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
35.权利要求31-34中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
36.权利要求31-35中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。
37.权利要求31-36中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
38.权利要求31-37中任一项的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞非共价结合；并且所述生物素化的肿瘤细胞在其表面上表达抗原。
39.权利要求31-38中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤细胞是非复制性的。
40.权利要求31-39中任一项的药物组合物，其中由于辐照，所述肿瘤细胞是非复制性的。
41.权利要求31-40中任一项的药物组合物，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的肉瘤细胞或生物素化的癌细胞。
42.权利要求31-41中任一项的药物组合物，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。
43.权利要求31-42中任一项的药物组合物，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的卵巢癌细胞；任选地其中所述生物素化的卵巢癌细胞是生物素化的浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞。
44.权利要求31-42中任一项的药物组合物，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的HPV相关癌细胞；任选地其中所述生物素化的HPV相关癌细胞是生物素化的HPV诱导的头颈癌细胞、生物素化的HPV诱导的宫颈癌细胞或生物素化的HPV诱导的肛门癌细胞。
45.权利要求31-37中任一项的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤抗原非共价结合。
46.权利要求31-37和权利要求45中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是由肿瘤细胞过表达的蛋白质或其免疫原性片段。
47.权利要求31-37和权利要求45-46中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是在肿瘤细胞中特异性突变的蛋白质或其免疫原性片段。
48.权利要求31-37和权利要求45-47中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原包含整体或部分灭活的产生肿瘤的病毒；或者包含衍生自产生肿瘤的病毒的蛋白质或其免疫原性片段；任选地其中所述产生肿瘤的病毒是人乳头状瘤病毒(HPV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)或疱疹病毒。
49.权利要求31-37和权利要求45-48中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是肿瘤衍生的磷酸肽。
50.权利要求31-37和权利要求45-49中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原能够引发免疫应答。
51.权利要求31-37和权利要求45-50中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原衍生自肉瘤细胞或癌细胞。
52.权利要求31-37和权利要求45-51中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原衍生自纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。
53.权利要求31-37和权利要求45-52中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原衍生自卵巢癌细胞。
54.权利要求31-37和权利要求45-53中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原衍生自浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞。
55.权利要求31-37和权利要求45-54中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是选自表1的一种或多种肽。
56.权利要求31-37和权利要求45-52中任一项的药物组合物，其中所述肿瘤抗原衍生自HPV相关癌细胞；任选地其中所述HPV相关癌细胞是HPV诱导的头颈癌细胞、HPV诱导的宫颈癌细胞或HPV诱导的肛门癌细胞。
57.权利要求31-56中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法抑制免疫检查点。
58.权利要求31-57中任一项的药物组合物，其中所述免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR；任选地其中所述免疫检查点是PD1或PD-L1。
59.权利要求31-58中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法是抗PD-1抗体。
60.权利要求31-56中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法是选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
61.权利要求31-60中任一项的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
62.权利要求31-61中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加患有癌症的受试者的存活率。
63.权利要求31-61中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫应答。
64.权利要求31-62中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
65.在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求31-64中任一项的药物组合物。
66.预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求31-64中任一项的药物组合物。
67.权利要求66的方法，其中权利要求31-64中任一项的药物组合物中的所述生物素化的肿瘤细胞或所述生物素化的肿瘤抗原衍生自与待预防和/或治疗的癌症相同类型的癌症。
68.权利要求66或67的方法，其中所述方法是治疗癌症的方法。
69.权利要求66-68中任一项的方法，其中所述癌症是卵巢癌；任选地其中所述卵巢癌是浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。
70.权利要求66-69中任一项的方法，其中所述癌症由产生肿瘤的病毒的感染所诱导；任选地其中所述产生肿瘤的病毒是人乳头状瘤病毒(HPV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)或疱疹病毒。
71.权利要求66-70中任一项的方法，其中所述癌症是HPV相关癌症。
72.权利要求71的方法，其中所述HPV相关癌症是HPV诱导的宫颈癌、HPV诱导的头颈癌或HPV诱导的肛门癌。
73.权利要求66-72中任一项的方法，其中所述方法进一步包括选自放射、放射增敏剂、化学疗法和第二免疫疗法的癌症疗法；任选地其中所述第二免疫疗法是免疫检查点抑制剂或选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂或皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
74.预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者联合施用免疫疗法和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞或生物素化的肿瘤抗原非共价结合。
75.权利要求74的方法，其中所述免疫疗法和所述药物组合物同时或序贯施用。
76.权利要求74或75的方法，其中所述药物组合物在所述免疫疗法之前施用。
77.权利要求74-76中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
78.权利要求74-77中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
79.权利要求74-78中任一项的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
80.权利要求74-79中任一项的方法，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
81.权利要求74-80中任一项的方法，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。
82.权利要求74-81中任一项的方法，其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
83.权利要求74-82中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤细胞非共价结合；并且所述生物素化的肿瘤细胞在其表面上表达抗原。
84.权利要求74-83中任一项的方法，其中所述肿瘤细胞是非复制性的。
85.权利要求74-84中任一项的方法，其中由于辐照，所述肿瘤细胞是非复制性的。
86.权利要求74-85中任一项的方法，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的肉瘤细胞或生物素化的癌细胞。
87.权利要求74-86中任一项的方法，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。
88.权利要求74-87中任一项的方法，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的卵巢癌细胞；任选地其中所述生物素化的卵巢癌细胞是生物素化的浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。
89.权利要求74-87中任一项的方法，其中所述生物素化的肿瘤细胞是生物素化的HPV相关癌细胞；任选地其中所述HPV相关癌细胞是HPV诱导的头颈癌细胞、HPV诱导的宫颈癌细胞或HPV诱导的肛门癌细胞。
90.权利要求74-82中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的肿瘤抗原非共价结合。
91.权利要求74-82和90中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原是由肿瘤细胞过表达的蛋白质或其免疫原性片段。
92.权利要求74-82和90-91中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原是在肿瘤细胞中特异性突变的蛋白质或其免疫原性片段。
93.权利要求74-82和90-92中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原包含整体或部分灭活的产生肿瘤的病毒；或者包含衍生自产生肿瘤的病毒的蛋白质或其免疫原性片段；任选地其中所述产生肿瘤的病毒是HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒。
94.权利要求74-82和90-93中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原是肿瘤衍生的磷酸肽。
95.权利要求74-82和90-94中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原能够引发免疫应答。
96.权利要求74-82和90-95中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原衍生自肉瘤细胞或癌细胞。
97.权利要求74-82和90-96中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原衍生自纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、头颈癌、肛门癌或重链病的细胞。
98.权利要求74-82和90-97中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原衍生自卵巢癌细胞。
99.权利要求74-82和90-98中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原衍生自浆液性或上皮性乳头状卵巢癌细胞。
100.权利要求74-82和90-99中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原是选自表1的一种或多种肽。
101.权利要求74-82和90-97中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原衍生自HPV相关癌细胞；任选地其中所述HPV相关癌细胞是HPV诱导的头颈癌细胞、HPV诱导的宫颈癌细胞或HPV诱导的肛门癌细胞。
102.权利要求74-101中任一项的方法，其中所述免疫疗法抑制免疫检查点。
103.权利要求74-102中任一项的方法，其中所述免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4 (CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR；任选地其中所述免疫检查点是PD1或PD-L1。
104.权利要求74-103中任一项的方法，其中所述免疫疗法是抗PD-1抗体。
105.权利要求74-101中任一项的方法，其中所述免疫疗法是选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
106.权利要求74-105中任一项的方法，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
107.权利要求74-106中任一项的方法，其中所述方法增加患有癌症的受试者的存活率。
108.权利要求74-107中任一项的方法，其中所述方法增加免疫应答。
109.权利要求74-108中任一项的方法，其中所述方法增加免疫细胞的增殖。
110.权利要求74-109中任一项的方法，其中所述药物组合物中的所述生物素化的肿瘤细胞或所述生物素化的肿瘤抗原衍生自与待预防或治疗的癌症相同类型的癌症。
111.权利要求74-110中任一项的方法，其中所述方法是治疗癌症的方法。
112.权利要求74-111中任一项的方法，其中所述癌症是卵巢癌；任选地其中所述卵巢癌是浆液性或上皮性乳头状卵巢癌。
113.权利要求74-111中任一项的方法，其中所述癌症由产生肿瘤的病毒的感染所诱导；任选地所述产生肿瘤的病毒是HPV、HCV、EBV、HIV或疱疹病毒。
114.权利要求74-111中任一项的方法，其中所述癌症是HPV相关癌症。
115.权利要求114的方法，其中所述HPV相关癌症是HPV诱导的宫颈癌、HPV诱导的头颈癌和HPV诱导的肛门癌。
116.权利要求74-115中任一项的方法，其中所述方法进一步包括选自放射、放射增敏剂和化学疗法的癌症疗法。
117.预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
118.权利要求117的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
119.权利要求117或118的方法，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
120.权利要求117-119中任一项的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
121.权利要求117-120中任一项的方法，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
122.权利要求117-121中任一项的方法，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。
123.权利要求117-122中任一项的方法，其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
124.权利要求117-123中任一项的方法，其中所述药物组合物是疫苗。
125.权利要求117-124中任一项的方法，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
126.权利要求117-125中任一项的方法，其中所述药物组合物增加患有HPV相关癌症的受试者的存活率。
127.权利要求117-126中任一项的方法，其中所述药物组合物增加所述受试者中的免疫应答。
128.权利要求117-127中任一项的方法，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
129.权利要求117-128中任一项的方法，其中所述方法是治疗HPV相关癌症的方法。
130.权利要求117-129中任一项的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌或肛门癌。
131.权利要求117-130中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒非共价结合；并且所述生物素化的HPV病毒表达抗原。
132.权利要求117-131中任一项的方法，其中所述HPV病毒是整体或部分灭活的HPV病毒。
133.权利要求117-130中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
134.权利要求133的方法，其中所述生物素化的HPV病毒抗原是生物素化的E6蛋白、生物素化的E7蛋白或其生物素化的免疫原性片段。
135.权利要求133或134的方法，其中所述生物素化的HPV病毒抗原选自表3。
136.权利要求117-135中任一项的方法，其中所述药物组合物作为非共价复合物施用于所述受试者。
137.一种药物组合物，其包含：
(1)与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合；和
(2)免疫疗法。
138.权利要求137的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
139.权利要求137或138的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
140.权利要求137-139中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
141.权利要求137-140中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
142.权利要求137-141中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。
143.权利要求137-142中任一项的药物组合物，其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
144.权利要求137-143中任一项的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒非共价结合；并且所述生物素化的HPV病毒表达抗原。
145.权利要求137-144中任一项的药物组合物，其中所述HPV病毒是整体或部分灭活的HPV病毒。
146.权利要求137-143中任一项的药物组合物，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
147.权利要求146的药物组合物，其中所述生物素化的HPV病毒抗原是生物素化的E6蛋白、生物素化的E7蛋白或其生物素化的免疫原性片段。
148.权利要求146或147的药物组合物，其中所述生物素化的HPV病毒抗原选自表3。
149.权利要求137-148中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法抑制免疫检查点。
150.权利要求137-149中任一项的药物组合物，其中所述免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR；任选地其中所述免疫检查点是PD1或PD-L1。
151.权利要求137-150中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法是抗PD-1抗体。
152.权利要求137-148中任一项的药物组合物，其中所述免疫疗法是选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
153.权利要求137-152中任一项的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
154.权利要求137-153中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加患有HPV相关癌症的受试者的存活率。
155.权利要求154的药物组合物，其中所述HPV相关癌症是头颈癌或肛门癌。
156.权利要求137-155中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫应答。
157.权利要求137-156中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
158.在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求137-157中任一项的药物组合物。
159.预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求137-157中任一项的药物组合物。
160.权利要求159的方法，其中所述方法是治疗HPV相关癌症的方法。
161.权利要求159或160中任一项的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌或肛门癌。
162.权利要求159-161中任一项的方法，其中所述方法进一步包括选自放射、放射增敏剂、化学疗法和第二免疫疗法的癌症疗法；任选地其中所述第二免疫疗法是免疫检查点抑制剂或选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂或皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
163.预防和/或治疗受试者中的HPV相关癌症的方法，其包括向所述受试者联合施用免疫疗法和有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与生物素结合蛋白融合的热激蛋白，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒或生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
164.权利要求163的方法，其中所述免疫疗法和所述药物组合物同时或序贯施用。
165.权利要求163或164的方法，其中所述药物组合物在所述免疫疗法之前施用。
166.权利要求163-165中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
167.权利要求163-166中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
168.权利要求163-167中任一项的方法，其中所述热激蛋白是哺乳动物热激蛋白或细菌热激蛋白。
169.权利要求163-168中任一项的方法，其中所述热激蛋白是hsp70家族的成员。
170.权利要求163-169中任一项的方法，其中所述热激蛋白是MTB-HSP70或衍生自MTB-HSP70。
171.权利要求163-170中任一项的方法，其中所述热激蛋白具有与SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。
172.权利要求163-171中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒非共价结合；并且所述生物素化的HPV病毒表达抗原。
173.权利要求163-172中任一项的方法，其中所述HPV病毒是整体或部分灭活的HPV病毒。
174.权利要求163-171中任一项的方法，其中所述生物素结合蛋白与生物素化的HPV病毒抗原非共价结合。
175.权利要求174的方法，其中所述生物素化的HPV病毒抗原是生物素化的E6蛋白、生物素化的E7蛋白或其生物素化的免疫原性片段。
176.权利要求174或175的方法，其中所述生物素化的HPV病毒抗原选自表3。
177.权利要求163-176中任一项的方法，其中所述免疫疗法抑制免疫检查点。
178.权利要求163-177中任一项的方法，其中所述免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR；任选地其中所述免疫检查点是PD1或PD-L1。
179.权利要求163-178中任一项的方法，其中所述免疫疗法是抗PD-1抗体。
180.权利要求163-176中任一项的方法，其中所述免疫疗法是选自CXCR4/CXCR7拮抗剂、Jak/stat抑制剂和皮肤相关免疫细胞的近红外激光免疫调节的免疫调节剂。
181.权利要求163-180中任一项的方法，其进一步包含药学上可接受的载剂。
182.权利要求163-181中任一项的方法，其中所述药物组合物增加受试者的存活率。
183.权利要求163-182中任一项的方法，其中所述药物组合物增加免疫应答。
184.权利要求163-183中任一项的方法，其中所述药物组合物增加免疫细胞的增殖。
185.权利要求163-184中任一项的方法，其中所述方法是治疗HPV相关癌症的方法。
186.权利要求163-185中任一项的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌或肛门癌。
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