JPH02291269A - インターフエロン―ガンマ結合蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロンーガンマ（Ｉ　ＦＮ−ガン
マ）結合活性を有する蛋白、それと実質的に相同性を有
する蛋白もしくはその断片、これらの蛋白もしくはその
断片をコードするＤＮＡ分子持にｃＤＮＡ分子、及び該
ｅＤＮＡクローンの単離に用いるヒトＩＦＮ−ガンマレ
セブターに対するモノクローナル抗体に関する。更に本
発明は、該ヒトＩＦＮ−ガンマ結合蛋白のクローニング
、組換えＤＮＡ技術によるその製造法、及びそれを含有
する薬学的組成物に関する。

インターフェロンーガンマは活性化Ｔ−リンパ球によっ
て産生されるリンホカインの１種であり、抗ウィルス活
性、成長抑制活性、及び各種の細胞における免疫調節活
性を示し、臨床的に重要な価値を有するものである。し
かしながら、ＩＦＮ−ガンマは、ポジティブな生物学的
活性とともに、望ましくない効果も有し自己免疫疾患の
進行に関与していることが明らかにされている。また、
ＩＦＮ−ガンマは若年糖尿病患者においても関与してお
り、多発性筋炎患者の筋肉切除組織中にも存在している
ことが明らかにされている。更には、多発性硬化症、乾
癖などの自己免疫疾患の悪化にＩＦＮ−ガンマが関与し
ていることも明らかにされている。

従って、内因的に過剰にＩＦＮ−ガンマが形成された場
合あるいは過剰に外因的に投与された場合のＩＦＮ−ガ
ンマの望ましくない活性もしくは効果を除去しあるいは
中和する方法、特にＩＦＮガンマの作用をブロツクする
方法を開発することが、自己免疫疾患の進行をコントロ
ールするために特に望まれている。

本件特許出願と同じ出願人による欧州特許出願Ｎα２４
０９７５明細書には、本件発明とは相違する細胞からＩ
ＦＮ−ガンマ固定化カラムを用いたアフィニティーク口
マトグラフィーによって本件発明とは相違する分子量範
囲を有するＩＦＮ−ガンマレセプターが単離されたこと
が記載されている。更に、ＩＦＮ−ガンマレセプターに
対するポリクローナル抗体についても記載されている。

本発明は、ヒトＩＦＮ−ガンマレセプター、特にＷＩＳ
Ｈ　　ＨｅＬａ，ＦＳ−１１細胞などの非免疫細胞の分
子量約９０，０００ＤａのＩ　ＦＮガンマレセプターに
対するモノクローナル抗体に関する。

更に本発明は、ＩＦＮ−ガンマ結合活性を有し第９図ま
たは第１３図に示すアミノ酸配列を含む蛋白、それと実
質的に相同性を有する蛋白あるいはその断片に関する。

これらのアミノ酸配列が蛋白分子の全配列の１部である
より大きな蛋白、及びこれらのアミノ酸配列の１部のみ
を本質的に有する断片も本発明に包含される。相同性蛋
白及びその断片も、それらが本発明の蛋白と同じ生物学
的活性を示す限り、本発明に包含される。

更に本発明は、本発明の蛋白もしくはその断片をコード
するヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子もしくは
ｃＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ分子；それを含む複製可
能な発現ビークル並びにそれで形質転換された宿主細胞
；及び該形質転換細胞を適当な培養培地中で培養し、該
細胞あるいは培養上清から蛋白もしくはその断片を採取
することからなる蛋白もしくはその断片の製造法に関す
る。

本発明によれば、ヒトＩＦＮ−ガンマレセプターに対す
るモノクローナル抗体により、ヒトｉＦＮ−ガンマ結合
蛋白の１部をコードするｃＤＮＡクローンが単離される
。このモノクローナル抗体は、ヒト細胞のＩＦＮ−ガン
マレセプタ−ニ１２５１　−　Ｉ　ＦＮ−ガンマが結合
するのをブロックする能力を有する。ラムダｇｔｌのｃ
　ＤＮＡＨｅＬａ発現ライブラリーをこのモノクロ−ナ
ル抗体でスクリーニングし、１０６個の組換え体から５
個のポジティブクローンを得た。このクローンのうち４
個はＱ，　　５Ｋｂの挿入断片を有し、他の１個はＱ，
　　７ｋｂの挿入断片を有していた。サザンプロット分
析により分析した所、０．　　５Ｋｂ断片はクロスハイ
ブリダイズしたが、０、７κｂクローンとはハイブリダ
イズしなかった。これらの挿入断片をＢｌｕｅｓｅｒｉ
ｐｊプラスミドベクターに連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｔ
ＧＩコンピテントバクテリアに導入した。２つのクロー
ンの挿入断片（０．　　５Ｋｂ及び０．　　７Ｋｂ断片
）を含有するコロニーを生育せしめ、次いでヘルパーウ
ィルスにより１本鎖ＤＮＡを得、これを配列決定に用い
た。１つのオープンリーディングフレームが見出された
が、公知のＤＮＡ配列に対する相同性は見られなかった
。

第９図に０，５Ｋｂ断片のクローン１５−２１−１のヌ
クレオチド配列が示されており、第１０図に０．７Ｋｂ
断片のクローン１８−４−３の相補性ＤＮＡ鎖のヌクレ
オチド配列が示されている。

挿入断片によってコードされる蛋白を単離しその特性を
調べた。溶原体を調製し、誘導された蛋白を抗ＩＦＮ−
ガンマレセプクー免疫吸着剤により精製した。溶出分画
中の蛋白のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，銀染色次いで
ウエスタンプロット分析により求めた。０．５Ｋｂクロ
ーンから得られる融合蛋白は約１３０，０００のＭｒ（
β−ガラクトシダーゼのＭｒ＝１１４，０００）を示し
た。この融合蛋白への１２５１−ＩＦＮ−ガンマの結合
が溶液中で観察され、また非ラベル化ＩＦＮ−ガンマを
過剰に加えることによってこの結合が抑制された。β−
ガラクトシダーゼ単独ではこのような結合は観察されな
かった。融合蛋白に対する１２５１−ＩＦＮ−ガンマの
交差実験、それに続く免疫沈降により、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びオートラジオグラフィーで調べた所、Ｍｒ１５５
，０００の複合体が形成された（ＩＦＮ−ガンマのＭｒ
は２５，０００）．これにより、０．　　５ＫｂｃＤＮ
Ａ断片はヒトＩＦＮ−ガンマ結合蛋白の結合リガンド領
域の少なくとも１部をコードしていることが判明した。

０．５Ｋｂ及び０．７κｂ挿入断片からプローブを調製
し、ラムダｇ　ｔ　１．　１のヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーについてスクリーニングした。１０６個の組換え
体から１０個のポジティブクローンを得た。そのうちの
９個が１．１５−２．３Ｋｂのサイズの挿入断片を有し
、これらすべては交差ハイブリダイスした。他の１個の
クローンは１．８κｂのサイズの挿入断片を有しそれ自
身とのみハイブリダイズした。１，８κｂと２，３Ｋｂ
の２つのクローンを発現ビークルに連結し、バクテリア
細胞にトランスフェクトし、それらによってコードされ
る蛋白を発現させた。

他のプローブを本発明のｃＤＮＡ配列から調製し、結腸
、肝、腎ライブラリーなどのｃＤＮＡライブリーのスク
リーニングに用い、あるいはストリンジエント条件下で
のコロニーハイブリダイゼーションなどの公知の方法に
よる本発明の蛋白をコードするゲノムＤＮＡの単離に用
いた。次いで、ポジティブクローンを、周知の方法によ
り適当に構築された発現ベクターに挿入した。２本鎖ｃ
ＤＮＡを、ホモボリマーテーリング、あるいは合成ＤＮ
Ａリンカーもしくはプラント末端リゲーションを用いた
制限酵素連結により、プラスミドベクターに連結した。

ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ分子を連結させ、またア
ルカリホスファターゼ処理によって望ましくない連結を
回避した。

目的とする蛋白を発現できるためには、発現ベクター中
には、転写調節及び翻訳調節情報を含む特定のヌクレオ
チド配列が、遺伝子を発現し目的とする蛋白を産生ずる
ように目的とする蛋白をコードするＤＮＡに連結されて
いなければならない。

転写を誘導するためにはプロモーターが上流に存在しな
ければならない。プロモーターには、強力プロモーター
、弱いプロモーターなどの種々の効率を有する各種のプ
ロモーターがある。

本発明の蛋白またはその断片をコードするヌクレオチド
配列及びその上流にシグナルペプチドのヌクレオチド配
列並びに作動可能なように連結した転写及び翻訳調節シ
グナルを含むＤＮＡ分子を、目的とする遺伝子配列を宿
主細胞のクロモゾームに組み込むことのできるベクター
に挿入する。そのクロモゾームにＤＮＡが安定に組み込
まれた宿主細胞は、当該発現ベクターを含む宿主細胞の
選択を可能にする１つもしくはそれ以上のマーカーを当
該発現ベクター中に導入することによって選択すること
ができる。

好ましい態様においては、ＤＮＡ分子は宿主中にて自己
複製可能なプラスミドベクターもしくはウイルスベクタ
ー中に挿入される。特定のウィルスベクターまたはプラ
スミドベクターを選択する際の重要な要素としては、当
該ベクターを含有する宿主が当該ベクターを含有してい
ない宿主から容易に区別できて選択できること；宿主中
での当該ベクターのコピー数が高いこと；異なる宿主間
において当該ベクターが複製可能であることなどが挙げ
られる。目的とする構成を有するベクターまたはＤＮＡ
配列が発現用として調製されると、次いで、適当な各種
の手段、例えば形質転換、トランスフエクション、接合
、プロトプラスト融合、エレクトロボレーション、リン
酸カルシウム沈殿、直接注入などの手段によって適当な
宿主細胞中に導入される。

本発明で用いることのできる宿主細胞は原核細胞または
真核細胞のいずれでもよい。好ましい原核宿主細胞とし
ては、Ｅ．ｃｏｌｉなどのバクテリアが挙げられる。こ
のような場合には、産生される蛋白はグリコシル化され
ていない。また原核宿主細胞は、発現プラスミド中のレ
プリコーン及びコントロール配列と親和性を有するもの
でなければならない。

好ましい真核宿主細胞としては、ヒト細胞、サル細胞、
マウス細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの噛
乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、翻訳後の蛋
白分子を修正することが出来、例えば正しい部位でのグ
リコシレーション化、正しいホールディングなどが行な
われる。酵母及び昆虫細胞によってもグリコシレーショ
ン化などの翻訳後の修正が行なわれる。強力プロモータ
ー配列及び酵母での目的蛋白の産生に用いることのでき
る高コピー数プラスミドなどを利用した多くの組換えＤ
ＮＡ技術が知られている。酵母は、クローン化噛乳動物
遺伝子のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有する
ペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌することができ
る。

ベクターの導入後に、ベクターを含有する細胞のみが生
育する選択培地中で宿主細胞を生育させる。クローン化
遺伝子の発現により目的とする蛋白もしくはその断片が
産生される。次いで、抽出、沈降、クロマトグラフィー
、電気泳動などの慣用的方法により発現蛋白を単離し精
製することができる。

本発明により提供されるヒトＩＦＮ−ガンマレセプター
に対するモノクローナル抗体は、該レセプターの精製に
有用であり、また本発明のＣＤＮＡクローンの単離に有
用である。このモノクローナル抗体はＩＦＮ−ガンマに
結合してその生物学的活性を抑制する。従って、本発明
のモノクローナル抗体は、ＩＦＮ−ガンマの生物学的活
性を抑制することについて報告されていない従来公知の
モノクローナル抗体［＾ｇｕｅｌ，　Ｍ．　ａｎｄＭｅ
ｒｌｉｎ，Ｇ．　　（１　９　８　７）　．　Ｉ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．　１　６　５，ｐｐ．９８８−９９９］と
は相違する。

本発明のヒトＩＦＮ−ガンマレセプターに対するモノク
ローナル抗体は、リガンドアフィニティク口マトグラフ
ィーによって溶解胎盤膜から精製されるレセプター調製
物をマウスに注射することによって誘導される。ＨｅＬ
ａ細胞のレセプターに１２５１−ＩＦＮ−ガンマが結合
するのを４℃でブロツクする３つのモノクローナル抗体
が同定された。このうちの１つの抗体が、ＩＦＮ−ガン
マの生物学的活性、例えば抗ウィルス活性、ＨＬＡＤＲ
表面抗原誘導能、ＨＫ一細胞仲介細胞毒性に対する保護
作用などの生物学的活性をブロックした。この抗体は３
７℃で細胞に対するより高い結合能を示し、他の２つの
抗体に比べて、過剰のＩＦＮ−ガンマを加えた場合でも
ＩＦＮ−ガンマとより置換しにくかった。溶解胎盤粗調
製物のイムノアフィニティーク口マトグラフィーにより
、分子量約８８，０００の精製レセプターが得られた。

この精製レセプターは、溶液中において１２５１−ＩＦ
Ｎ−ガンマとの結合能を保持していた。

本発明を以下の例により説明するがこれらに限定される
ものではない。

例１ マウスの免疫化及び細胞融合 胎盤膜から得られるヒトＩＦＮ−ガンマレセプター調製
物をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに皮下注射して免疫
した。この調製物は、ＩＦＮ−ガンマを結合した＾Ｉｌ
ｉｇｅｌ　　１　０、次いでＳｅｐｈａｃｒ７１　Ｓ　
−　３　０　０［Ｎｏｙｉｃｋ，Ｄ．ｅｆ　ａｌ　（１
　９　８　７）　Ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２　６２
．ｐ．８４８３］で精製し、最後に抗ＩＦＮ−ガンマモ
ノクローナル抗体［Ｎｏｖｉｅｋ，Ｄ，ｅｌ　ａｔ　（
１　９８３）ＥＭＢＯ　　Ｊ．２．ｐ．１５２７］を結
合したアガロースビーズに吸着させた。完全フロイント
アジュバントとともに２回注射し、他の２回はアジュバ
ントなしで１週間毎に注射した。最後のブーストは融合
を行なう４日前に腹腔内投与した。

それぞれのマウスに、１回当り〜３０μｇの調製物を投
与した。血清について、　　　Ｉ−ＩＦＮガンマのＨｅ
Ｌａ細胞への結合をブロツクする能力をチェックした。

このアッセイで１：５００の力価を示すマウスの牌細胞
（２００Ｘ１０６）をＮＳＯ／１ミエローマ細胞（４ｘ
ｌ０６）と融合した。１ｍＭピルベート、２ｍＭグルタ
ミン、ペニシリン（１０ユニット／ｍｌ）、ストレプト
マイシン２０μｇ　／　ｍ１、フンギゾン２５０μｇ　
／　ｍｌ及び１０％牛血清（ＦＢＳ）を添加しＨＡＴを
含有するダルベツコの修正イーグル培地でハイブリドー
マを選択した。抗ＩＦＮ−ガンマレセプター抗体をを分
泌するハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化し
た。

例２ ハイブリドーマ上清のスクリーニング ハイブリドーマの上清について、　　　Ｉ＝ＩＦＮ−ガ
ンマのＨｅＬａ細胞への結合競争抑制及びＷＩＳＨ細胞
でのＩＦＮ−ガンマの抗ウィルス活性の中和作用により
、抗ＩＦＮ−ガンマレセプター抗体の存在をテストした
。

（ａ）抗ＩＦＮ−ガンマレセプター抗体による抑制 デキサメタゾン（１０’Ｍ）存在下の９６−ウユルマイ
クロプレート（５０，０００セル／ウエル）にＨｅＬａ
細胞（ＡＴＣＣ　　Ｈ２２９，ＣＣＬ２．１）を接種し
た。２４時間後に培地を除去し、Ｃ　ａ”，　Ｎ　ｇ”
　（Ｐ　Ｂ　Ｓ）及びナトリウムアジド（０．０２％）
を含む水冷リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄した。

ハイブリドーマ上清（５０μｌ／ウェル）を加え、プレ
ートを４℃で２時間放置した。２％ＦＢＳ及び０．０２
％ナトリウムアジド（ＰＢＳ−２％）を含む水冷ＰＢＳ
で２回洗浄後、ＣＨＯ細胞からアフィニティク口マトグ
ラフィーによって精製されクロラミン＝Ｔ法によってラ
ベル化された１２５１−ＩＦＮガンマをそれぞれのウエ
ルに加え（５０μｌ１２００，０００ｃｐｍ）、プレー
トを４℃で２時間放置した。次いでプレートをＰＢ８２
％で４回洗浄し、ＮａＯＨ　（０．７５Ｍ，１２５μｌ
）とともに採取し、それぞれのウェルの内容物について
カウントした。

２４−ウエルプレート（Ｃｏｓｌａｒ）中でＨ　ｅ　Ｌ
　ａ細胞に対する結合競争抑制アッセイを実施した（２
５０，０００セル／ウエル、デキサメタゾンなし）。用
いた容量［ハイブリドーマ上清希釈液２５０μｌ．　　
　　Ｉ−ＩＦＮ−ガマン（２　０　０．０００ｃｐｍ　
）２５０μ１３以外は、９６−ウェルの場合と同様にし
てアッセイを実施した。トリプシン（２５０μｌ）とと
もに細胞を採取し、ウェルをＰＢＳ　（２Ｘ１５０μｌ
）で洗浄し、細胞と洗浄液を集め、カウントした。

（ｂ）ＩＦＮ−ガンマ活性の中和 ９６−ウェルプレート中のＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ　　
ＣＣＬ２５）の培養液にハイブリドーマ上清（５０μｌ
）を加え、３７℃で２時間インキユベートし、次いでＩ
ＦＮ−ガンマ（２０■／　ｍｌ，　５　０　Ｉｌｌ　）
を加えた。３７℃で１晩プレートをインキユベートし、
水庖性口内炎ウィルスを加え、更にプレートを１晩イン
キユベートシ、クリスタルバイオレットによる染色法［
ＲｕｂｉｎＮｅｉｎｅｌ　ａｉ．　（１　９　８　１）
　Ｊ．Ｖｉｒｏ１、３７，ｐ，７５５］により細胞変性
効果の程度を測定した。中和力価測定用として、中和ア
ッセイを行なう前にハイブリドーマ上清（または腹水）
を希釈した。Ｉ　ＦＮ−ガンマの１ユニットを中和する
に十分な抗体の量を中和１ユニットと定義した。全ての
アッセイにおいて、ＩＦＮ−ガンマＧｇ２３−９０１−
５０３のＮＩＨ対照スタンダートを用いた。

例３ ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ上清について、上記したようにして抗Ｉ
　Ｆ　Ｎ−ガンマレセプター抗体の存在をスクリーニン
グした。スクリーニングした４６８個のハイブリドーマ
のうち３個のハイブリドーマ上清が１２５１−ＩＦＮ−
カンマのＨｅＬａの細胞への結合を抑制し、そのうちの
１個は中和アツセイについてもポジティブであった。こ
のポジティブクローンを更に生育させてサブクローン化
し、次いでマウスに注射して腹水を得た。マウスでの免
疫応答、組織培養液及び腹水液中での抗体産生及び抗体
スクリーニングは、結合アツセイ（表Ｉ）及び中和アッ
セイ（表■）によって行なった。

ヒトＩＦＮ−ガンマレセプターに対する３個のモノクロ
ーナル抗体のうち、抗体Ｎα１−７７とその全てのサブ
クローンは、溶解ＩＦＮ〜ガンマレセプターに特異的に
結合し、　　　Ｉ−ｆＦＮ−ガンマの細胞への結合を抑
制し（４℃）、ＩＦＮ−ガンマの抗ウィルス活性及びＩ
ＦＮ−ガンマによるＨＬＡ−ＤＲ誘導をブロツクし、Ｉ
ＦＮ−ガンマによるＮＫ−ＣＭＣに対する耐性誘導を阻
止することが明らかになった。他の２つのモノクローナ
ル抗体（Ｎｏ．３７とＮα１８３）は”５１−ＩＦＮガ
ンマの細胞への結合を４℃で抑制したが、ＩＦＮ−ガン
マの生物学的活性をブロツクすることはできなかった。

全ての生物学的活性は３７℃で測定した。レセプターへ
の結合は生物学的活性にとって必須であると考えられる
ので、抗体Ｎα１７７が他の２つの抗体に比べてレセプ
ターに対してより高い親和性を有しているか否かをテス
トし、またＩＦＮ−ガンマが３７℃でレセプターに結合
している抗体を追い出すことができるか否かをテストし
た。

他の２つの抗体は過剰なＩＦＮ−ガンマを加えることに
よって細胞表面から追い出されたが、抗体Ｎα１７７の
場合にはそのようなことは観察されなかった。ＩＦＮ−
ガンマの非存在下に細胞とインキユベートした場合には
、いずれの抗体も抗ウィルス活性またはＨＬＡ−ＤＲ誘
導活性を示さなかったことは注目に値する。

ハイブリドーマ１７７からサブクローン化されたハイブ
リドーマ１７７−１を１９８８年１１月１４目にフラン
スのパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎｌ口ｏｎａｌｅｄ
ｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃ＋ｏｏＢａｎｉｓ
ｍｅｓ　　（ＣＮＣＭ）に寄託しＣＮＣＭ　　Ｉ−８１
４の受託番号が付与された。

例４ ３つのモノクローナル抗体Ｎα３７，ｋｌ７７及び尚１
８３が４℃で１２５Ｘ−ＩＦＮ−ガンマの細胞への結合
を抑制した。例２（１）で記載したと同様にしてテスト
を実施した。結果は表Ｉに示した。

しかしながら、抗体Ｎα１７７−１のみがＩＦＮガンマ
の生物学的活性を抑制した。従って、結合能の比較実験
はインターナリゼーションを防ぐためにナトリウムアジ
ドの存在下で３７℃で実施した。抗体１７７−１が、他
の２つの抗体に比べて有意に高い細胞に対する結合能を
示した。これは第１図に示されており、第１図では、Ｎ
　ａ　Ｎ　３の存在下で３７℃でＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞を
モノクローナル抗体Ｎα３７−１　（番−４）　、Ｎα
１８３〜２（表一▲）及びＮα１７７−１　　（■−■
）とインキユベートし、次いでｌ２５Ｉ−ヤギ抗マウス
血清を加えたテストの結果が示されている。抗ＩＦＮ−
ガンマレセプター抗体非存在下でのバックグランド　カ
ウント（２００ｃｐｍ）は差し引かれている。

４℃での各種抗体の２０μｇ　／　ｍｌとの結合がよく
示されている。

続いてｔＦＮ−ガンマを添加することによって、細胞に
結合していた抗体Ｎα３７−１とＮα１８３−２とが有
意に追い出され、中和抗体Ｎα１．　７　７　−　１の
みがほんのわずかしか追い出されなかった。３７℃での
ＩＦＮ−ガンマによる抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノ
クローナル抗体の結合抑制を第２図に示した。第２図で
は、各種濃度のＩＦＮ−ガンマとともにＨｅＬａ細胞を
抗体Ｎα３７−１（ト１、３　０ｐ　ｇ／ｍｌ）　、ｋ
ｌ　８　３−２（ｋ−１、３０ｔｉｇ／ｍ！）またはＮ
ａ　１　７　７　−　１（ト■、１．６μｇ／ｍｌ）と
インキユベートし、次いで細胞を洗浄し、更に１２５１
−ヤギ抗マウス血清でインキユベートしてテストした結
果が示されている。最大結合は３　５　０　０　ｃｐｍ
であった。抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル
抗体非存在下でのバックグランドカウント（２　５　Ｑ
ｃｐｍ　’）は差し引いた。

例５ ク 抗体Ｎａｌ７７の全てのサブクローンはＩＦＮガンマの
活性をブロックした。各種サブクローンの中和力価は４
０００−３０．０００ユニット／耐であった。他の２つ
の抗体についてはこのようなブロック活性は観察されな
かった。結果は表Ｈに示した。コントロール実験ではこ
れらの抗体のいずれもがＩＦＮ−ガンマの抗ウィルス活
性をブロックしなかった。抗体のいずれもが、細胞にお
いて抗ウィルス状態を誘導する能力を本来何していなか
った。抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗体
について、ＩＦＮ−ガンマによるＨｅＬａ細胞でのＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原誘導のブロック能をテストした。抗体Ｎα
１７７−１　（■１）が高いブロック活性を示し（第３
図）、ｌ．：２０，０００希釈腹水液で５０％抑制が観
察された。抗体階３　７　−　１　（｝−６）及びＮα
１８：３−２（ｋ一▲）はわずかのブロック活性しか示
さなかった（第３図）。ＩＦＮ−ガンマの非存在下でＨ
ｅＬａ細胞と抗体とをインキユベートした場合には、い
ずれの抗体の場合にもＨＬＡ−ＤＲ抗原は誘導されなか
った。ポジティブコントロールとして、Ｎｏｖｉｃｋ，
Ｄ．ｅ＋　ａｔ　（１９８３）　　ＥＭＢＯ　　Ｊ，２
．ｐ．１５２７に記載された抗Ｉ１”Ｎ−ガンマモ？ク
ローナル抗体Ｎα１．６６−５（ロ■ロ）を用いた。こ
の抗体は、ＩＦＮ−ガンマ誘導ＨＬＡ−ＤＲ発現を抑制
したが、Ｎｏｖｉｃｋ，　Ｄ．　ｅｌ　ａｌ　（　１　
９８２）　１，ｌｍｍｕｎｏｌ．１２９．　ｐ．２２４
４に記載された抗■ＦＮ−ガンマモノクローナル抗体Ｎ
α７ではこのような抑制は観察されなかった（示されて
いない）。抗体の非存在下でのＨＬＡ−ＤＲの最大誘導
は２７００±ｔ　ｏ　ｏ　ｃｐｍであった。ＩＦＮガン
マ非存在下での基本レベルは２　０　０　ｃｐｍであり
、この値は全ての測定値から差し引いた。

表■：抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクロサンプル　
　　　　　力価（ユニット／ｍ１）免疫血清（マウス）
　　　　　　　　　３５０００コントロール血清　　　
　　　　　　〈６０ハイブリドーマ　３７　　　　　　
　　　　＜　６０ハイブリドーマ　＋７７　　　　　　
　　　　２０００ハイブリドーマ１７？−Ｉ　Ａ４ＨＱ ハイブリドーマ１７？−１０　”　　　　　　３０００
０ハイブリドーマ　＋８３　　　　　　　　　　＜　６
０腹水液＋７７−１０　”　　　　　　　　６００［１
０抗ＩＦＮ−ガンマ　レセプターモノクローナル抗体に
よるＩＦＮ−ガンマ誘導クラスＩＩＭＨＣ抗原（Ｈ　Ｌ
　Ａ　−　Ｄ　Ｒ）の抑制を次のようにしてテストした
。ＨｅＬａ細胞（５Ｘ１０’セル／ウエル）を９６−ウ
エルプレートに接種し、ＲＰＭＩ１．６４０培地（１０
０μｌ１１％ＦＢＳ含有、ＲＰＭＩ−１％）中で３７℃
で３時間インキユベートした。各種のモノクローナル抗
体を一連の２倍希釈液として加え（５０μｌＲＰＭＩ−
１％）、更にプレートを３７℃で３時間インキユベート
した。次いでＩＦＮ−ガンマ（６０ユニット／ｍｌ、５
０μｌ　　ＲＰＭＩ−１％）を加え、プレートを３７℃
で４０時間インキユベートした。次いでプレートを冷Ｐ
ＢＳ　（３Ｘ１００μｌ）で洗浄し、ホルムアルデヒド
（３．５％ＰＢＳ，１００μｌ）で０℃で３０分間固定
化した。次いでプレートを冷ＰＢＳでリンスし、ＢＳＡ
の溶液（１００μｌ１５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，１
５０ｍＭＮａＣ　ｌ，　ｐＨ７．　　５の０．５％溶液
）とともに０℃で３０分間インキユベートした。次いで
プレートを冷ＰＢＳでリンスし、抗ＨＬＡ−ＤＲモノク
ローナル抗体（０．１％ＢＳＡ及び０．１％ナトリウム
アジドを含有する５０μｌＲＰＭＩ−１６４０培地で１
　：　５００に希釈したＬ−２４３腹水液）とともに室
温で１時間インキユベートした。

プレートをＰＢＳでリンスし、　　　■−プロテインＡ
（０．１％ＢＳＡ及び０．１％ナトリウムアジドを含有
する５０μＡ’ＲＰＭＩ−１６４０培地を含むウエル１
個当り］．　０５ｃｐｍ　）とともに室温で３０分間イ
ンキユベートした。０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ　（３ｘ２００μｌ）で過剰の放射活性物質を除去
した。次いでＮａＯＨ（０．７５Ｎｍ　　２００μＡ’
）で細胞を溶解しカウントした。

３７℃での抗ＩＦＮ−ガマンレセプターモノクローナル
抗体の細胞への結合及びＩＦＮ−ガンマによる競争結合
を次のようにして調べた。

ＨｅＬａ細胞を２４−ウエルプレートに接種し、３７℃
で２４時間生育させた。培地を除去］７、各種濃度の抗
ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗体（１０％
ＦＢＳ及び０．０４％ナトリウムアジドを含有するＲＰ
ＭＩ培地溶液２５０μｌとして）をＩＦＮ−ガン？　（
０−６　ｔ−ｔ　ｇ／ｍｌ）とともに加え、プレートを
３時間インキユベートし＋２５ た。ＰＢＳ−２％で２回洗浄後、　　　■−ヤギ抗マウ
ス血清（２５０１！，１００，０００ｃｐｍ）を加えた
。プレートを室温で５時間放置し、ＰＢＳ−２％（３Ｘ
１．ｍＪ）で洗浄し、トリプシンとともに採取してカウ
ントした。

例６ 抗体Ｎａｌ７７−１から調製したＦ　（ａ　ｂ’　）　
２フラグメントとターゲット細胞Ｖ−９　３　７（ＡＴ
ＣＣ　　ＣＲＬ１５９３）とをＩＦＮ−ガンマとともに
インキユベーションすることによって、ＩＦＮ−ガンマ
によって誘導されるナチュラルキラー細胞仲介細胞毒性
（ＮＫ−ＣＭＣ）に対する抵抗性が抑制された。

この抑制効果は用量依存性であって、エフェクター細胞
（Ｅ）とターゲット細胞（１゛）との比（Ｅ　：　Ｔ）
が２、３種の値の時に明らかな抑制効果を示した。抗体
ｋ３７−１またはそのＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメ
ントとターゲット細胞とをインキコベートした時にはこ
のような抑制効果は観察されなかった。ＮＫエフェクタ
ー細胞ヲＩＦＮ−アルファとともにプレインキユベーシ
ョンして活性化した場合にも、抗ＩＦＮ−ガンマレセプ
ターモノクローナル抗体Ｎα１７７−１によりＩＦＮ−
ガンマ処理ターゲッ１・細胞Ｕ−９３７が同程度に抑制
された（データは示されていない）。

ＩＦＮ−ガンマ誘導抗ＮＫ効果の抗ＩＦＮ−ガンマレセ
プターモノクローナル抗体による抑制効果の結果を第４
図に示した。第４図では、Ｕ−９３７細胞を抗体Ｎα３
’ｌ−１（Ａ−一▲）またはＮα１７７−１（ＩＩ−一
雪）とプレインキユベートし、あるいは抗体なしでプレ
インキユベートし（●一番）、次いでＩＦＮ−ガンマを
加えた。コントロール細胞はＩＦＮ−ガンマで処理しな
かった（〇一〇）。次いで細胞を［”Ｃｒ］　−Ｎａ２
ＣｒＯ４でラベル化し、各種の割合い（Ｅ　：　Ｔ）で
エフェクター細胞と混合Ｌ，た。自然に細胞毒性が６％
以下になった。

ＮＫ細胞仲介細胞毒性に対するＩＦＮ−ガンマ誘導抵抗
性の抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗体に
よるブロック効果を以下のようにして調べた。Ｕ−９３
７ターゲット（Ｔ）細胞（３．５Ｘ］．０５）を抗ＩＦ
Ｎ−ガンマレセプターモノクローナル抗体（１０％ＦＢ
Ｓ含有ＲＰＭＩ培地７５０μｌ中に５０−１００ｎｇの
量）とともに、あるいは抗体なしで３７℃で３時間プレ
インキュベートした。ＩＦＮ−ガンマ（２５０μｌ培地
中に１０００ユニットの量）を加え、更に９時間インキ
ユベートした。次いで細胞を”［Ｃｒ］Ｎａ　　Ｃｒｙ
４（０．５ｍＣｉ，Ｌ５ｈｒ）でラベル化し、洗浄して
、次いでエフエクター（Ｅ）細胞（ナイロンウール非粘
着末梢血単核細胞１００μｌ／ウエル）と各種の割合い
（Ｅ　：　Ｔ）で３７℃で４時間インキユベートした（
１０４セル、５０μｌ／ウエル）。次いで細胞をスピン
し上清をカウント（Ｃ）Ｌた。ターゲット細胞単独の上
清中の自然レリース（Ｓ）（トータルｅＤｆｆｌの６％
まで）を測定し、ラベル化ターゲ・ソト細胞へＴ＋ｉｔ
ｏｎ　Ｘ　−　１　０　０　（１％，１００μｌ）を加
えてトータルｃｐｍ　　（Ｔ）を測定した。

細胞毒性％を以下の式から求めた。

Ｔ−Ｓ 例７ グラフィ− 本発明のハイブリドーマ（例えばハイブリドーマ１７７
または１８３）から分泌されたモノクローナル抗体を投
与したマウスの腹水のイｌ・ノグロプリン分画から免疫
吸着剤を調製した。腹水液を硫酸アンモニウム（最終濃
度５０％飽和）で４“℃で沈殿せしめた。遠心により沈
殿物を集め、水に再溶解し、生理食塩水に対して透析し
た。約１０■のイムノグ口プリンをポリアクリルヒドラ
ジドアガロース（Ｂｉｏｍａｋｅｒ）に結合した。

溶解した胎盤膜調製物を４℃で流速０．２ｍｌ／ｗｉｎ
で抗体力ラムに付した。カラムは０．１％Ｔ＋ｉｔｏｎ
　　Ｘ−１００　（４０［１１１）を含むＰＢＳで洗浄
し、０．０５％Ｔｒｉｊｏｎ　　Ｘ−１００及び０．０
２％ナトリウムアジドを含有するクエン酸（５０ｍＭ，
ｐＨ２）を溶出した。溶出分画をＨｅｔｐｅｓ　　バッ
フｙ−（ＬＭ，ｐＨ８、５）で中和し４℃に保持した。

カラムを放射ラベル化ＩＦＮガンマの結合によりモニタ
ーし、ワンステップにより４２５０倍に精製された（表
■）。精製されたレセプター調製物を還元条件下で７．
５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した所、分子量約８８．０００に対応する主要バ
ンドが表われた。この精製ＩＦＮ−ガンマレセプターは
ＩＦＮ−ガンマ結合活性を保持していた。

イムノアフィニティーク口マトグラフィーにて精製した
ＩＦＮ−ガンマレセプターのＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結
果を第５図に示した。第５図においては、溶解した胎盤
膜レセプターのアリコート（レーンＣ，　　０．　　９
μｇ）、イムノアフィニティーク口マトグラフィーによ
り精製したレセプタ−（レーンＢ．　　０．　　６μｇ
）、サンプル培地単独（レーンＤ）及び分子量マーカー
（レーンＡ，ホスホリラーゼ　９４，０００；牛血清ア
ルブミン６７，０００．オボアルブミン４３，０００及
びカルボニツクヒドラーゼ３０．０００）を、β一メル
カプトエタノールの存在下でポリアクリルアミドゲル中
に電気泳動した。銀染色により蛋白バンドを視覚化した
。

１２５１−ＩＦＮ−ガン 蛋白　　マの結合　　　非活性 工程　　（ｍｇ）　　（ｐｍｏｌ）　　（ｐｍｏｌ／ｍ
ｇ）精製 （倍率） 溶出液 （フラクションＩ−３） ０．０２　　　　０Ｊ４　　　　ＩＴ レセプターを精製する際のモニターとして用いたレセプ
ターへの放射ラベル化ＩＦＮ−ガンマの結合は以下のよ
うにして調べた。各種の精製工程から得たレセプターの
アリコート（２０−４０μｌ）を、０．１％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ　（２００μｌ）中のラベル化ＩＦＮ−ガンマ（
１００，　　０００ユニット）とともにあるいはこのラ
ベル化ＩＦＮ−ガンマなしで、　　　Ｉ−ＩＦＮ−ガン
マ（２５０ユニット）と混合した。混合物を４℃で２時
間インキユベートし、ラビットＩＧｇ（０．１％のＰＢ
Ｓ溶液，　　０．５ｍｌ）を加え、次いでＰＥＧ−８０
００　（２２％のＰＢＳ溶液、０．５ｍｌ）を加えた。

混合物を４℃で１０分間放置し、次いで０．４５μフィ
ルター（２　５＋ｏｍＨＡＷＰ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
　）に通した。濾液を冷ＰＥＧ−８０００溶液（８％Ｐ
ＢＳ溶液）で洗浄してカウントした。過剰の非ラベル化
ＩＦＮ−ガンマの存在下でバックグランドカウントを求
め、これを差し引いた。レセプターへのＩＦＮ−．ガン
マの結合は１２５１−ＩＦＮ−ガンマのｐｍ山数で示し
た。

例８ ウェスタンプロットによる分析 アフィニティーク口マトグラフィーによって精製したレ
セプターのサンプル（５００ｎｇ／スロット）を還元条
件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、６０ボルト、２
５０ｍＡで、２５ｍＭＴｒｉｓ　　ＨＣＩ／１０ｍＭグ
リシンバッフ７一（ｐＨ８．　　５）　／２　０％メタ
ノール中で４℃で２時間ニトロセルロースシ一ト（ＢＡ
　　８５．Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｔ　１ｎｄ　Ｓｃｈｕｅ
ｌｌ）上にエレクトロプロットした。エレクトロプロッ
トの後、ニトロセルロースシ一トを、０．０５％Ｔｖｅ
ｅｎ−２０と０．０２％ナトリウム　アジドを含むＰＢ
Ｓ　（プロックバッファ一）に溶解した５％非脂肪ミル
クとともに１晩インキユベートした。次いでニトロセル
ロースシ一トを、３つの抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモ
ノクローナル抗体（プロックバッファーで１：１５０に
希釈した腹水液のイムノグ口プリン分画１０■／ｍｌ）
の混合物とともに室温で２時間インキユベートした。０
．０５％Ｔｗｐｅｎ−２０のＰＢＳ溶液で洗浄後、ニト
ロセルロースシートを、　　　■−ヤギ抗マウス血清（
０．　　７Ｘ１　０　６ｃｐＬｌｌ／ｍｌ，　　プロッ
クバッファ−溶液）とともに室温で３時間インキユベー
トした。次いでシートを洗浄し、乾燥してオートラジオ
グラフィーに付した。

ロードフラクション、流出液及び溶出液のウエスタンプ
ロット分析を実施した。溶解胎盤膜を含むロードフラク
ションのウエスタン　プロット分析の結果、分子量８８
，０００の単一バンドが現われた。この胎盤膜調製物を
イムノアフィニティーク口マトグラフィーに通した所、
分子量８８，０００のバンドは流出液中には検出されな
かった。

例９ ラムダｇｔｌｌのｃＤＮＡ　　ＨｅＬａライブラリー（
ＣＩｏｎｌｅｃｈ　Ｌａｂｏｎｌｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ
．　Ｕ．　Ｓ，＾．）から得た異なる挿入断片の１×１
０６個の組換え体について、抗ＩＦＮ−ガンマレセプタ
ーモノクローナル抗体によりスクリーニングした。ファ
ージをＥ，ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０に吸着させ、２５，０
０　０　ｐ．　Ｉ，　ｕ，の密度で９ｃｍペトリ皿にプ
レートし、４２℃で４時間生育せしめた。プレートを３
７℃にして３０分後に、あらかじめ１０ｍＭイソプロビ
ルチオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）に浸漬しておいた
ニトロセルロースフィルターをプラーク上に置き、更に
３７℃で６時間インキユベートし、その後第２のフィル
ターを１０時間適用した。

フィルターをマークし、１０％低脂肪ミルク（１％）及
び０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳにブロックの
ために室温で２時間移した。２つのフィルターのセット
を０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２　０含有ＰＢＳで洗浄し、
例３で得た抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル
抗体（好ましくは抗体１７７−１　．ブロック溶液に２
０μｇ　／　ｍｌで溶解した）とともに室温で３時間イ
ンキユベートした。

フィルターをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｖｅｅｎで５回洗浄し、ポ
ジティブクローンを１２５１−ヤギ抗マウスＦ　（ａ　
ｂ）　２　　（ブロック溶液７　Ｘ　１　０　　ｃｐａ
＋　／ｍｌ）で同定し、４℃で１晩インキユベートし、
次いでＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｖｅｅｎでよく洗浄した。ポジテ
ィブクローンを、クロロホルム１００μ！含有１　ｍｌ
　Ｔ　Ｍ　Ｇ（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ．ｐＨ７
．５．１ｍＭ　　ＭｇＳ０４　、０．０２％ゼラチン）
に取り、上記したと同様にしてファージを更にサブクロ
ーン化した。第６Ａ図にはｃＤＮＡ　　ＨｅＬａ発現ラ
イブラリーのスクリーニング結果が、第６Ｂ図にはポジ
ティブクローンのサブクローニングが示されている。ポ
ジティブファージで感染した５００ｍｌＥ．ｃｏｌｔ　
　１０８８からＤＮＡストックを調製した。ＤＮＡはＣ
ｓＣｌグラジェント次いでフエノールークロロホルム抽
出により精製した。

例１０ ポジティブｃＤＮＡクローンを含む精製したラムダｇｔ
ｌｌ　　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロース
ゲルでサイズ分画した。４つのクローンが０，　　５Ｋ
ｂのサイズの挿入断片を有し、１つのクローンが０．７
κｂのサイズの挿入断片を有していた。マルチプライム
ＤＮＡラベルシステムキット（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を用
いて、０．　　５Ｋｂクローンの１つ（１５−２１−１
）及び０，　　７Ｋｂクローン（１８−４−３）からプ
ローブを調製した。

この方法は、その長さにそって多くの部位で変性テンプ
レー｝ＤＮＡ上のＤＮＡ合成をプライムするためにラン
ダム配列へキサヌクレオチドを使用する方法である［Ｆ
ｅｉｎｂｅ＋ｇ　Ａ，　Ｐ，　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｌ
ｅｉｎＢ。，ＤＮＡ制限酵素断片をラベル化するための
技術、Ａａｇｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　　（１　９　８　
３）　１　３　２　：　６−１３及び（１９８４）１３
７：２６６コ。上記したプローブを用いたサザンブ口ツ
ティングによりクローン間の交差ハイブリダイゼーショ
ンをチェックした。０．５Ｋｂプローブは４つの全ての
０．５Ｋｋクローンとハイブリダイズしたが０．７κｂ
クローンとはハイブリダイズしなかった。０．７Ｋｂプ
ローブは０．　　７Ｋｂクローンとのみハイブリダイズ
した。

０．５Ｋｂクローン１５−２１−１のＥｃｏＲＩ挿入断
片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｌベクター中でサブクローン化
し、Ｅ，ｃｏｌｉ　　ＴＧＩコンピテントバクテリアに
導入した。この形質転換バクテリアを１９８８年１１月
１４日に、フランスのパリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎ
ａｌｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅＭｉ
ｃｒｏｏ『ｇｍｎｉｓ＋ｎｓ　（Ｃ．　Ｎ．　Ｃ．　Ｍ
．　）にブタベスト条約に基いて寄託し、受託番号Ｃ．
　Ｎ．　　Ｃ．　Ｍ，１−８１５が付与された。

例１１ ラムダｇ　ｔ　Ｌ　１　（ＣＩｏｎＬｅｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓｎｃ．　，　Ｕ，　Ｓ．＾，）のヒト
胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得た１×１０６個の組換
え体について、０，　　５Ｋｂ及び０．　　７Ｋｂクロ
ーン（例１０）から調製した上記のＤＮＡプローブを用
いてスクリーニングした。ファージをＥ．ｃｏｌｉ株４
１０８８に吸着せしめ、２５．０００ｐ．ｆ．ｕの密度
で９ｃｍペトリ皿にプレートし、３７℃で１晩生育させ
た。

ニトロセルロースフィルターセットを上に置き、ＤＮＡ
変性溶液を含むトレーに浸漬した。フィルターを洗浄し
、固定化し、次いでプレハイブリダイズして非特異的部
位が非ラベル化ＤＮＡによって飽和されるようにした。

次いでフィルターを３２Ｐ−ラベル化プローブと６７℃
でハイブリダイズさせ、洗浄し、次いでオートラジオグ
ラフィーに付した。１０個のポジティブクローンが得ら
れた。ポジティブクローンから得たＤＮＡをＣｓＣｌ次
いでフェノールクロロホルム抽出により精製した。

例１２ ポジティブｃＤＮＡクローンを含有する精製したラムダ
ｇｔｌｌ　　ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し次いで１％
アガロースゲルでサイズ分画した。

０，７Ｋｂプローブによって単離されたクローンのうち
の９個が１．　　１５−２．　　３Ｋｂのサイズの挿入
断片を有しており、これらはすべて交差ハイブリダイズ
した。一方、０．　　５Ｋｂプローブによって単離され
たクローンのうちの１個が１，８Ｋｂのサイズの挿入断
片を有しそれ自身とのみハイブリダイズした。交差ハイ
ブリダイゼーションはサザンプロット分析により行なっ
た。

更に、制限酵素消化によってクローンの特徴付けを行な
った。１．８Ｋｂフラグメント（Ｎｏ．３９）を、第７
図の制限酵素地図に示したようにして制限酵素で切断し
た。ラムダｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位（左側末端から１
９．６κｈ）から１．ＩＫｂ離れた所にＫｐｎ１部位が
見出された。ラムダｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位から０．
　　６Ｋｂノ所にＳａｃＩ部位が見出された。１．　　
８ＫｂフラグメントをＫｐｎＩで切断しゲルに付し０．
　　５Ｋｂのフラグメント（１５−２１−１）をプロー
ブとして用いたサザンプロット分析から、この０．５Ｋ
ｂフラグメントはそのＫｐｎＩ部位がラムダｇｔｌｌの
右側末端の近くに来るように位置していることが推定さ
れた。

２．　　３Ｋｂフラグメント（Ｎｏ．７６）を、第８図
の制限地図に示したようにして制限酵素で切断した。

２，　　３Ｋｂ挿入断片の中間にＳａ１部位が見出され
た。ラムダｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位（右側末端から１
９．６Ｋｂ）の直ぐ近くにＸｂａＩ部位が見出された。

例１３ クローンの配列決定 ＣｓＣｌラジエントによって精製された０．５Ｋｂ，　
　０．　　７Ｋｂ，　　１．　　８Ｋｂ及び２，３Ｋｂ
ポジティブクローンのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した。

Ｓｌｒｍｊｘｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓ７ｓｔｅｍ
　　（Ｓａｎ　ＤｉｅｇｏＣｘｌｉｌｏｒｎｉａ）のＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐプラスミドベクターのＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩによって同様に切断し、次いでデホスホリル化し分
離用アガロースゲルに付した。フェノールークロロホル
ム抽出によりゲルからＤＮＡバンドを抽出した。クロー
ンとベクターの両者がＴ４リガーゼによって連結できる
ようになった。連結されたベクターを用いて Ｅ，ｃｏｌｉ　（ＴＧＩ）コンビテントバクテリアを形
質転換した。４℃でこのバクテリアにベクターを加え、
熱ショック（４２℃）を与え、氷に移し、次いで室温更
に３７℃にした。最後にバクテリアをＬＢアンビシリン
（Ａｍｐ）上にプレートした。コロニーを採取し、ＬＢ
＋Ａｍｐ中で生育させた。配列決定用に以下のようにし
て１本鎖ＤＮＡを調製した。連結ベクターで形質転換さ
れたＥ，ｃｏｌｉ　　ＴＧＩバクテリアを２Ｔ培地及び
アンビシリン中で生育し、次いでヘルパーウィルスを加
えた。ポリエチレングリコールでＤＮＡを沈殿させ、フ
ェノールークロロホルムで抽出した。

最後に、ＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡに懸濁させて、Ｓ
ｅｑ＠ｅｎｃｅκ目（Ｕ　Ｓ　Ｂ）による配列決定用に
供した。第９図に、０．５ＫｂｃＤＮＡセグメンのヌク
レオチド配列とその翻訳アミノ酸配列が示されている。

第１０図に、０．７κｂｃＤＮＡセグメントの相補性鎖
とその翻訳アミノ酸配列が示されている。第１１図に、
１．８ＫｂｃＤＮＡセグメントの２つの部分ヌクレオチ
ド配列及びそれらの翻訳アミノ酸配列が示されている。

第１２図に、２．３ＫｂｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配
列が示されている。第１３図にその部分翻訳アミノ酸配
列が示されている。

例１４ 溶原体の蛋白溶解物のＨｅＬａ細胞からの分離ＤＮＡ　
ＣＩｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｔｏ
ｇｃｈ，Ｖｏｌ．　　１．Ｃｈ，　　２，　Ｅｄ．Ｄ．
Ｍ．ＧＩｏｖｅ＋，ＩＲＬ　　プレスに記載されている
技術を用いた。

（１）Ｅ．ｃｏｌｔ　　Ｙ１０８９でのラムダｇｔｌｌ
組換え溶原体の作成： Ｅ．ｃｏｌｔ　　Ｙ１．０８９細胞を飽和するまで生育
させ、上記した０．　　５Ｋｂクローン（１５−２１−
１）を含有するラムダｇｔｌｌ組換えファージで３２℃
で感染させた。細胞をプレートし３２℃で感染させた。

細胞をプレートし３２℃でインキユベートした（この温
度で、温度感受性ファージレセプターは機能する）。シ
ングルコロニーについて、４２℃で温度感受性をテスト
した。シングルコロニーから得た細胞を２つのプレート
にスポットした。１つのプレートを４２℃でインキユベ
ートし、他のプレートは３２℃でインキユベートした。

３２℃で生育するが４２℃では生育しないコロニーが溶
原体（１７ｓｏｇｅｎ　）である。

（２）ラムダｇｔｌ１組換え溶原体からの粗溶解物の調
製： Ｅ．ｃｏｌｆ　　Ｙ１０８組換え溶原体のシングルコロ
ニー（１　５−２　１−１）をＬ培地に接種し、３２℃
で生育させた。培養液の光学密度で６００ａｌｌになっ
た時に、温度を急激に４２℃まで上昇させ、４２℃で２
０分間インキユベートした。次いで終濃度１０ｍＭでＩ
　ＰＴＧを加え、３７℃で７５分間インキユベートした
。遠心により細胞を採取し、蛋白バッファ一（１　０ｍ
Ｍ　　Ｈｅｐｅｓ．　１　５　０ｍＭ　　Ｎａ．ＣＩ，
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００．１ｍＭ　　ＰＭＳ
Ｆ及び２０ＴＩアブロチニン）に懸濁し、液体窒素で凍
結した。最初に溶融させた後に、終濃度０．３■／　ｍ
ｌでライソザイムを加え、濃濃度５−１０μｇ／ｍｌで
ＤＮａｓｅを加えた。

急激な溶融と凍結を３回繰り返し、溶原体の完全な溶解
物を得た。得られる粗抽出物をスピンしてイムノアフィ
ニティーカラムに適用した。

例１５ 粗溶解物のイムノアフィニティーク口マトグラフイー 例７と同様にして免疫吸着剤を調製した。例１４で得ら
れた粗Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物（溶原体１００■）をスピン
し（ｔｏ．０００ｘｇ）、得られる上清を抗体力ラム（
３■ＩｇＧ／０．３ｍアガロース）に４℃で適用した。

０．１％Ｔａｉｗａｎ　Ｘ一１００を含有するＰＢＳで
カラムを洗浄し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−　１
　０　０と０．０２％ナトリウムアジトを含有するクエ
ン酸（５０ｍＭ，　ｐ｝Ｉ２）で溶出した。５つの０．
５ｍｌフラクションをＨＥＰＥＳバッファ一（ＬＭ．ｐ
Ｈ８．５）に集め、４℃に保持した。フラクションＮα
１と２が溶出蛋白の７５％を含有していた。精製した溶
解物を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し銀染色して
分析した所、分子量約１３０．０００に対応する主要バ
ンドが現われた（β−ガラクトシダーゼの分子量は１１
４，０００である）。結果は第１４図に示した。レーン
Ａはβ−ガラクトシダーゼ；レーンＢは溶解物溶出フラ
クション；レーンＣは口−ドフラクション（粗溶原体）
；及びレーンＤは分子量マーカーである。

例１６ ウエスタンプロット分析 誘導された融合蛋白（１００μｇ／スロット）を含む粗
Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物あるいはアフィニティーク口マトグ
ラフィーで精製した融合蛋白（１μｇ／スロット）のサ
ンプルを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し
、次いで６０ボルトで２５０ｍＡで、２５ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ　　ＨＣＩ！１０ｍ　　グリシンバッフｙ　−　（
ｐＨ８．　　５）　／　２　０％メタノール中で４℃で
２時間ニトロセルロースシ一トに電気プロットした。エ
レクトロプロット後（こ、０．０５％Ｔｖｅｅｎ　−　
２　０と０．０２％ナトリウムアジドを含むＰＢＳ　（
プロックバッファ−）に溶解した１０％非脂肪ミルクと
ともに１晩インキユベートした。ニトロセルロースシ一
トを抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗体（
プロツクバッファーで１：５００に希釈した腹水のイム
ノグ口プリンフラクション１　０　ｍｇ／　ｍｌ　）と
ともに室温で２時間インキユベートした。０．０５％Ｔ
ｖｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、　　　■−ヤギ抗
マウス血清（プロツクバッファ一に０．　　７　Ｘ　１
　０６ｃｐｍ　／ｍｌで溶解）とともに４℃で１晩ニト
ロセルロースシ一トをインキユベートした。次いでシー
トを洗浄し、乾燥してオートラジオグラフィーに付した
。第１５図に示したように、粗抽出物とアフィニティー
ク口マトグラフィーで精製したものとの両者において約
１３０．０００のＭｒのバンドが現われた。第１５図で
は、レーンＡは分子量マーカー；レーンＢではイムノア
フィニティーク口マトグラフィーで精製した溶原体；及
びレーンＣは粗溶原体を示す。

例１７ 放射ラベル化１２５Ｉ−ＩＦＮ−ガンマの融合蛋白への
交差結合 アフィニティーク口マトグラフィーで精製した融合蛋白
（５μｇ）または純粋なβ−ガラクトシダーゼの調製物
を、非ラベル化ＩＦＮ−ガンマ（１０００倍）の存在下
もしくは非存在下で、１２５１−ＩＦＮ−ガンマ（１０
００ユニット、５Ｘ１０５ｃｐｍ）と混合し、得られる
混合物を室温で２時間放置した。Ｄｉ　Ｓａｃｃｉｎ７
１　Ｓａｂｅｔｇｔｅ（Ｄ　Ｓ　Ｓ）を終濃度０．３ｍ
Ｍで加えた。１５分後に４℃でＬＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉバッファーを加えて交差結合をストップさせた。混合
物をラビット抗−β−ガラクトシダーゼ血清で免疫沈降
させ（１：２００，室温で２時間）、次いでＰｒｏｆ＾
Ｓｅｐｈｘｒｏｓｅ　ビーズを加えた。０．０５％　Ｔ
ｖｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでビーズを２回洗浄し次
いでＰＢＳで１回洗浄し、サンプルバッファーに懸濁し
、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いでオートラジ
オグラフィーに付した。第１６図のレーンＥに示される
ように、０，５Ｋｂクローンによってコードされる融合
蛋白と　１２５Ｉ−ＩＦＮ−ガンマとが交差結合した場
合にＭ．　Ｗ．　　１５５．　　０００の複合体が得ら
れた。過剰の非ラベル化ＩＦＮ−ガンマを加えた場合に
ほのこのバンドは消えた（レーンＤ）。純粋なβ−ガラ
クトシダーゼ自身と交差結合を行なった時にはこのよう
なバンドは観察されなかった（レーンＦ）。第１６図で
は、レーンＡは分子量マーカー；レーンＢとＣは、それ
ぞれ過剰の非ラベル化ＩＦＮ−ガンマの存在下及び非存
在下で１２５Ｉ−ＩＦＮ−ガンマと交差結合した純粋な
溶原体（０．　　ｌｂ）　　；レーンＤとＥは、それぞ
れ過剰の非ラベル化ＩＦＮ−ガンマの存在下及び非存在
下で１２５１−Ｉ　Ｆ　Ｎ−ガンマと交差結合した純粋
な溶原体（０，　　５Ｋｂ）　　，及びレーンＦはｌ２
５Ｉ−ＩＦＮ−ガンマに交差結合した純粋なβ−ガラク
トシダーゼである。

例１８ クローン３９ｃＤＮＡの発現 ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから０．　　５Ｋｂプロ
ーブにより単離されたラムダｇ　ｔ　１．　１クローン
嵐３９の１．　　８Ｋｂ挿入断片（例１２）をＥｃｏＲ
Ｉで切断し、Ｓｊｒｘｌａｇｅｎｅ　ＣｌｏｎｉｎｇＳ
Ｈｌｅｍ（Ｌｍ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａｉ）から得たＫＳ
　Ｂｌｕｅｇｃｔｉｐ＋ベクター（Ｂ　Ｓ）のＥＣＯＲ
Ｉ部位に挿入した。得られるＢＳ−３９ｃＤＮＡにおい
ては、１，８Ｋｂ挿入断片（第７図）のセンスストラン
ドの３′末端側のＡｈａｌｌ［部位はＢＳベクターのＨ
ｉｎｄｍ部位とＴ３　　ＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ーに接近しており、一方、５′末端はＢＳベクターのＢ
ａｍＨＩ部位とＴ７　　ＲＮＡボリメラーゼプロモータ
ーに接近している（第１７図）。発現ベクターとして、
Ｃｈｅ＋ｎｓｊｏｖｓｋ７　Ｙ，，ｅｌ　ａｔＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｃｘｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｍ，　Ａｎ
ｎａｌｓ，Ｎ，Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　Ｖｏｌ４　
１　３．　ｐｐ８　８　−　９　６、１９８３に記載さ
れたプラスミドＴＬ−　Ｉ　ＦＮ一αＣを用いた。

このプラスミドはｔｒｐ−ｔａｃプロモーター及びリポ
ソーム結合部位それに続＜ＥｃｏＲ１部位を有しており
、このベクターをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｕで切断し、Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ合成リンカー（イニシェータ−Ａ
ＴＧを含む）を用いてＢＳ−３９ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＩ［［フラグメントに連結し、プラスミドＴ
Ｌ−３９ｃＤＮＡを得た（第１７図）。この構築体にお
いては、３９ｃＤＮＡフラグメントのコード配列に９個
のコドンが付加されている。ＴＬ−３９ｃＤＮＡプラス
ミドをＥ．ｃｏｌｉ　　　ＪＭ１０１　　ｉ９にトラン
スフエクトし、Ｃｂｅ＋ｎａｉｏｙｓｋ７　Ｙ．．ｅｔ
　ａｌ　　（上記と同じ）に記載されたようにしてイソ
プロビルチオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）で誘導した
。例１４−１７と同様にして、細胞の採取及び蛋白の抽
出、イムノアフィニティーク口マトグラフィー、ウエス
タンプロット分析及びｌ２５１−ＩＦＮ−ガンマの交差
結合をそれぞれ実施した。　　　Ｉ−ＩＦＮ−ガンマの
交差結合のために、ラビット抗ＩＦＮ−ガンマ血清また
はマウス抗ＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗
体を免疫沈降用に用いた。

第１８図では、レーンＡは分子量マーカー；レーンＢは
非誘導バクテリアＮα３９の粗抽出物；レーンＣとＤは
、それぞれ誘導６０分後および４５分後のＩ　ＰＴＧ誘
導バクテリアＮα３９の粗抽出物；レーンＥ−Ｈはレー
ンＡ−Ｄと同様に抗体Ｎα１７７−１とインキユベート
した場合；レーンＩ−ＬはレーンＡ−Ｄと同様に抗体Ｎ
ｃＬ１８３とインキユベートした場合であり；ネガティ
ブコントロールは抗ＩＦＮ−ガンマ抗体とインキユベー
トした場合である。

第１８図に示されているように、ブロックを抗体Ｎａｌ
７７−１とインキユベートした場合にはＭｒ３２，００
０のシングルバンドが現われる（レーンＣとＤ）。プロ
ットを抗体Ｎａｌ８３とインキユベートした場合には、
Ｍｒ３２，０００の主要バンドとＭｒ１７，０００のマ
イナーバンドが現われる（レーンＧとＨ）。３　９　ｃ
　ＤＮＡの断片を用いたので、３９ｃＤＮＡの天然生成
物のサイズよりも得られる蛋白のサイズは小さい。この
蛋白は第１１図に示した配列を含有している。フラグメ
ントＢａｌＩ−Ｋｐｎｌの配列（第１１Ｂ図）は第９図
の配列を含有している。

例１９ クローン７６ｃＤＮＡの発現 ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから０．７Ｋｂプローブ
を用いて単離した（例１２と同様）ラムダｇｔｌｌクロ
ーンＮα７６の２．３κｂ挿入断片をＥｃｏＲＩで切断
し、ＫＳ　ＢｌｎｅｓｃｒｉｐｔベクターのＥｃｏＲＩ
部位に挿入した。２．　　３Ｋｂ挿入断片（第８図）の
センスストランドの３′末端側のＸｂａＩ部位はＢＳベ
クターのＢａｍＨＩ部位及びＴ７ＲＮＡボリメラーゼプ
ロモーターに接近しており、一方、５′末端はＢＳベク
ターのＨｉｎｄｎ［部位とＴ３ＲＮＡボリメラーゼプロ
モーターに接近していた。発現プラスミドＴＬ−ＩＦＮ
−ａｃをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌＩＩで切断し、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄｌＩ［合成リンカーに再連結した（第１
９図）。得られるプラスミドを再びＨｉｎｄｌｌ［とＢ
ａｍＨＩで切断し、上記のＢＳクローン７６ｃＤＮＡか
ら切り出したＨ　ｉ　ｒ．　ｄ　ＩＩＩＢａｍＨＩ　　
２．３Ｋｂ　　ｃＤＮＡに連結した（第１９図）。この
プラスミドをＥ．ｃｏｌｔ　　ＪＭ１０１ｉ９にトラン
スフエクトし、Ｉ　ＰＴＧで誘導した。イムノプロット
のモノクローナル抗体Ｎα１８３と反応するＭｒ３４，
０００の蛋白とＭｒ１７．０００の蛋白を同定した（第
２０図）。この蛋白は第１３図に示した配列を含有して
いる。

細胞培養液からの抽出、イムノアフィニティーク口マト
グラフィー、ウエスタンプロット分析及び１２５■−Ｉ
ＦＮ−ガンマ交差結合は上記したと同様にして実施した
。

第２０図では、レーンＡとＢは、それぞれ誘導１２０分
後及び１８０分後のＩ　ＰＴＧ誘導バクテリアＮα７６
の粗抽出物；レーンＣは非誘導バクテリアＮα７６の粗
抽出物；及びレーンＤは分子量マーカーである。プロッ
トは抗体Ｎα１７７−１と１８３の混合物とインキユベ
ートした。

第２０図に示したように、プロットを抗体翫１７７−１
と１８３の混合物とインキユベートした場合には、Ｍｒ
１７．０００と３２．０００の蛋白が得られた（レーン
ＡとＢ）。

有用性と組成物 本発明のＩＦＮ−ガンマ結合蛋白、それと実質的に相同
性を有する蛋白またはその断片は、全身的にあるいは局
所的に投与されたＩＦＮ−ガンマの活性を調節しそして
ＩＦＮ−ガンマの有害な効果から保護するために、単独
であるいは一緒に用いることができる。これらの蛋白は
、ＩＦＮ−ガンマが内因的に過剰に形成された場合ある
いは外因的に過剰に投与された場合の症状を処置するた
めに用いることができる。内因的にＩＦＮ−ガンマが望
ましくなく産生された場合には、リウマチ性関節炎、多
発性硬化症、若年性糖尿病初期、多発性筋炎、ベーチッ
ト病、甲状腺炎、エリテマトーデス、皮膚炎などの各種
自己免疫疾患及び炎症疾患あるいは敗血性ショックにお
いて生じるような局所炎症あるいは全身炎症が起こり、
このような場合にＩＦＮ−ガンマ結合蛋白によるＩＦＮ
ガンマの活性の調節が有用である。ＩＦＮ−ガンマ結合
蛋白によるＩＦＮ−ガンマの活性の調節は、ＩＦＮ−ガ
ンマを過剰に投与した時あるいは患者がＩＦＮ−ガンマ
に対して感受性を有すると診断された時に有用である。

あるいは、内因的及び外因的ＩＦＮ−ガンマの抗ウィル
ス活性、抗炎症活性、抗細胞活性（ｇｎｌｉｃｅｌｌｕ
ｌｓｒ）及び他のいずれの活性を延長させあるいは促進
させるためにＩＦＮ−ガンマ結合蛋白を用いることがで
きる。

本発明の蛋白は、公知の方法により、薬学的に許容し得
る担体との混合物として薬学的に有用な組成物に製剤化
することができる。適当な担体及び製剤は、例えばＲｅ
ｍｉｎｇｌｏｎ’　ＰｈａｔｍａｃｅｕｌｉｃａＳｃｉ
ｅｎｃｅｇ，Ｅ．Ｗ，　Ｍａｒｌｉｎに記載されている
。

本発明の薬学的組成物は、蛋白と生理学的に許容し得る
担体、安定剤及び賦形剤とを混合することによって調製
することができ、またパイアル中に凍結乾燥することに
よって投与形態に調製することができる。活性成分の投
与量は、投与ルート、疾患、患者の症状等によって変動
し得る。投与法は、同様の薬剤の投与方法と同じ方法が
採用され、処置すべき症状によって変動する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨｅＬａ細胞と抗ＩＦＮ−ガンマレセプター
モノクローナル抗体との結合を表わしたグラフを示す。 第２図は、ＩＦＮ−ガンマによる抗ＩＦＮ−ガンマレセ
プターモノクローナル抗体の結合抑制を表わすグラフを
示す。 第３図は、ＩＦＮ−ガンマによるＨｅＬａ細胞でのＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原誘導に対する抗ＩＦＮ−ガンマレセプター
モノクローナル抗体のブロック能を表わすグラフを示す
。 第４図は、ＩＦＮ−ガンマ誘導抗ＮＫ効果の抗ＩＦＮ−
ガンマレセプターモノクローナル抗体による抑制効果を
表わすグラフを示す。 第５図は、アフィニティーク口マトグラフィーにて精製
した。ＩＦＮ−ガンマレセプターのＳＯＳ−ＰＡＧＥの
分析結果を示す写真である。 第６図は、ｃＤＮＡ　　ＨｅＬａ発現ライブラリーのス
クリーニング結果及びポジティブクローンのサブクロー
ニングの結果を示す写真である。 第７図は、１．　　８Ｋｂフラグメントの制限酵素地図
を示す。 第８図は、２．　　３Ｋｂフラグメントの制限酵素地図
を示す。 第９図は、０．５ＫｂｃＤＮＡセグメントのヌクレオチ
ド配列とその翻訳アミノ酸配列を示す。 第１０図は、０．７κｈｃＤＮＡセグメントの相補性鎖
とその翻訳アミノ酸配列を示す。 第１１Ａ図及び第１１Ｂ図は、１．．８ＫｂｃＤＮＡセ
グメントの２つの部分ヌクレオチド配列及びそれらの翻
訳アミノ酸配列を示す。 第１２図は、２．３ＫｂｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配
列を示す。 第１３図は、２．５ＫｂｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配
列の翻訳アミノ酸配列を示す。 第１４図は、ＨｅＬａ細胞から得た溶原体の蛋白溶解物
をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して分析した結果を示す写真で
ある。 第１５図は、誘導された融合蛋白を含む粗Ｅ．ｃｏｌｉ
抽出物及びアフィニティーク口マトグラフィーで精製し
た融合蛋白をウェスタンプロット分析した結果を示す写
真である。 第１６図は、融合蛋白への放射ラベル化ｌ２５１−ＩＦ
Ｎ−ガンマの交差結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し
た結果を示す写真である。 第１７図は、プラスミドＴＬ−３９ｃＤＮＡの構築を示
す。 第１８図は、クローン３　９　ｃ　ＤＮＡの発現のウエ
スタンプロット分析の結果を示す写真である。 第１９図は、プラスミドＴＬ−７６ｃＤＮＡの構築を示
す。 第２０図は、クローン７６ｃＤＮＡの発現のウエスタン
プロット分析の結果を示す写真である。

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. （１）第９図のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分
   子もしくはｃＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ分子。
2. （２）制限酵素消化により実質的に第７図に示す制限酵
   素地図を示し第１１Ａ図及び第１１Ｂ図のヌクレオチド
   配列を含む１．８ＫｂのｃＤＮＡ、あるいは０．５Ｋｂ
   のｃＤＮＡである請求項１のｃＤＮＡ。
3. （３）第９図に示すアミノ酸配列を含む蛋白またはそれ
   と実質的に相同性を有する蛋白をコードする請求項１ま
   たは２のＤＮＡ分子。
4. （４）第９図に示すアミノ酸配列を含む蛋白またはそれ
   と実質的に相同性を有する蛋白をコードするＤＮＡ分子
   の発現を引き起すことのできるＤＮＡ配列に作動可能な
   ように連結している請求項１から３のいずれかの組換え
   ＤＮＡ分子。
5. （５）第１２図のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ
   分子もしくはｃＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ分子。
6. （６）制限酵素消化により実質的に第８図に示す制限酵
   素地図を示し第１２図のヌクレオチド配列を含む２．３
   ＫｂのｃＤＮＡ、あるいは０．７ＫｂのｃＤＮＡである
   請求項５のｃＤＮＡ分子。
7. （７）第１３図に示すアミノ酸配列を含む蛋白またはそ
   れと相同性を有する蛋白をコードする請求項５または６
   のＤＮＡ分子。
8. （８）第１３図に示すアミノ酸配列を含む蛋白またはそ
   れと相同性を有する蛋白をコードするＤＮＡ分子の発現
   を引き起こすことのできるＤＮＡ配列に作動可能なよう
   に連結している請求項５から７のいずれかの組換えＤＮ
   Ａ分子。
9. （９）蛋白分子の少なくとも１部が第９図に示すヌクレ
   オチド配列によってコードされている蛋白。
10. （１０）第９図のアミノ酸配列を含む請求項９の蛋白、
    またはそれと実質的に相同性を有する蛋白。
11. （１１）第１１Ｂ図に示すアミノ酸配列を含む請求項９
    または１０の蛋白。
12. （１２）第１１Ａ図に示すＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＮ−Ｓ
    ＥＲからスタートするアミノ酸配列を更に含む請求項１
    １の蛋白。
13. （１３）ＩＦＮ−ガンマ結合活性を有する請求項９から
    １２のいずれかの蛋白、それと実質的に相同性を有する
    蛋白、あるいはその断片。
14. （１４）第１３図に示すアミノ酸配列を含む蛋白、それ
    と実質的に相同性を有する蛋白、あるいはその断片。
15. （１５）第１２図に示すヌクレオチド配列またはその１
    部によってコードされる蛋白。
16. （１６）ＩＦＮ−ガンマ結合活性を有する請求項１４ま
    たは１５の蛋白、それと実質的に相同性を有する蛋白、
    またはその断片。
17. （１７）請求項４のＤＮＡ分子を含む複製可能な発現ビ
    ークルであって、形質転換宿主細胞中にて請求項９から
    １３のいずれかの蛋白を発現することのできる上記発現
    ビークル。
18. （１８）請求項８のＤＮＡ分子を含む複製可能な発現ビ
    ークルであって、形質転換宿主細胞中にて請求項１４か
    ら１６のいずれかの蛋白を発現することのできる上記発
    現ビークル。
19. （１９）請求項１７の複製可能な発現ビークルで形質転
    換された宿主細胞。
20. （２０）請求項１８の複製可能な発現ビークルで形質転
    換された宿主細胞。
21. （２１）請求項１９または２０の原核宿主細胞。
22. （２２）請求項１９または２０の真核宿主細胞。
23. （２３）請求項９から１６のいずれかの蛋白を製造する
    方法であって、 （ａ）請求項１９または２０の形質転換宿主細胞を適当
    な培養培地中で培養する工程；及び （ｂ）該蛋白を単離する工程 からなる上記方法。
24. （２４）請求項２３の方法によって製造された蛋白。
25. （２５）ＩＦＮ−ガンマがそのレセプターに結合するの
    をブロックしＩＦＮ−ガンマの生物学的活性を抑制する
    抗ヒトＩＦＮ−ガンマレセプターモノクローナル抗体。
26. （２６）ＣＮＣＭ　Ｉ−８１４（Ｎｏ．１７７−１）の
    受託番号を有するハイブリドーマによって産生される請
    求項２５の抗ヒトＩＦＮ−ガンマレセプターモノクロー
    ナル抗体。
27. （２７）ＣＮＣＭ　Ｉ−８１４（Ｎｏ．１７７．１）の
    受託番号を有するハイブリドーマ。
28. （２８）薬学的に許容し得る担体と共に、活性成分とし
    て請求項９から１６のいずれかまたは２４の蛋白を含有
    する薬学的組成物。
29. （２９）動物におけるＩＦＮ−ガンマの有害効果から保
    護するための請求項９から１６のいずれかまたは２４の
    蛋白。
30. （３０）ＩＦＮ−ガンマが過剰に内因的に形成された状
    態または過剰に外因的に投与された状態を処置するため
    の請求項９から１６のいずれかまたは２４の蛋白。
31. （３１）自己免疫疾患におけるＩＦＮ−ガンマの作用か
    ら保護するための請求項９から１６のいずれかまたは２
    ４の蛋白。
32. （３２）ＩＦＮ−ガンマの効果を調節するための請求項
    ９から１６のいずれかまたは２４の蛋白。