JPS6317699A

JPS6317699A - ヒトγ−インタ−フエロン特異的受容体蛋白質およびそれに対する抗体

Info

Publication number: JPS6317699A
Application number: JP62086749A
Authority: JP
Inventors: ノビックダニエラ; パトリシア　オルチャンスキー; ディナ　フィッシャー; メナケム　ルビンステイン
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1986-04-08
Filing date: 1987-04-08
Publication date: 1988-01-25
Anticipated expiration: 2010-09-27
Also published as: JPH0770199A; ES2061448T3; JP2577868B2; IL78444A0; DE3750342D1; EP0240975A3; JPH0787795B2; EP0240975A2; CA1323728C; ZA872523B; AU614487B2; DE240975T1; AU7095887A; US4897264A; IL78444A; EP0240975B1; DE3750342T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■ 各種ヒト細胞−ヒの受容体に交差結合した（１）インタ
ーフェロンγを５Ｏ８− ＰＡＧＥで解析した結果、−ヒトインターフェロンγ受
容体には少なくとも３種の異なるタイプがあることが明
らかになった。Ｗ　Ｉ　Ｓ　＋−１、ト１ｅＬａ。

ＦＳｌｌおよび他の組織１１細胞にＭｒ９０’、ＯＯ’
０〜１．０５，０００の受容体が見出された。単球およ
びミニロイド細胞系ＫＧ−１には、Ｍｒ１４０゜ＯＯＯ
の受容体が見出され、一方、Ｄａｕｄ　ｉす′ンホブラ
ストイド細胞にはＭｒ９５．０００〜１１５゜ＯＯＯの
受容体が見出された。

これらの細胞から、抽出ついで固定化インターフェロン
γ−■−での７フイニテイークロマトグラフイーにより
、様々の受容体が単離された。得られた精製プレバレー
ジョンは、インターフェロンγに対する元来の親和性を
保持していて、マウスの免疫感作に使用すると高度に特
異的な抗体を産生した。

発明の背景本発明は、ヒト細胞、Ｆのインターフェロンγの各種受
容体に対する抗体に関Ｊる。このような抗体は、ある細
胞へのインターフェロンγの作用を遮断することができ
、また伯の細胞には影響しない。したがって、医薬とし
てのインターフェロンγの作用に選択性を付与すること
ができるし、また内因性インターフェロンγのある細胞
への作用を他の細胞に対する作用には影響を与えないで
防止することが可能になる。

インターフェロンγは、活性化Ｔ−リンパ球ににって産
生されるリンホカインの１種で、多くの免疫調節活性を
有する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて細胞殺滅の方向に単
球およびマクロファージを活性化する能力から、一般的
には免疫刺激物質として知られている（Ｌｅほか：　Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１　：　２８２１〜２８
’２３，１９８．３）　、。

さらに、インターフェロンγは、免疫細胞Ｊ３よび非免
疫細胞の両者において、主要組織適合還伝子り合体（Ｍ
ＨＣ）抗原クラス１および■の直接インデユー号−であ
る（　Ｓｔｅｅｇほか：Ｊ、［ｘｐＨａｄ、、　１５６
　：　１７８０．１９８２　：Ｗａｌｌａｃｈほか；Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２９９　：８３３〜８３６．１９８２）
。これまでのところ、インターフェロンγはＩｌｌ　Ｌ
’ｌされている唯一のクラスＩＩ　Ｍ　＋−１，０抗原
の直接インデューサーであり、きわめて低濃度（１へ・
１０ｐＨ）で６その効果を発揮する。

クラス１■主要組織適合抗原（ヒトではＨＬ　Ａ　−Ｄ
’Ｒ）は免疫系において主要な役割を果たしている。こ
れらのトランスメンブラン蛋白質は主に、単球、マクロ
ファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞および胸腺
上皮細胞上に発現する。これらは大部分の組織特異的細
胞や休止Ｔｌ０細胞には存在し４丁い。これらの蛋白質
の遺伝子は著しい多形現象を示し、多数の異なる血清型
を生じる。

一般にＴ−リンパ球は、抗原が“抗原提供細胞″りとえ
ば単球の表面に提供され、クラス■主要組織適合抗原た
とえばヒトではＨＬＡ−ＯＲ、マウスでは［ａに結合し
たときにのみ、その抗原に応答する。そう９ると、王ヘ
ルパー細胞の抗原特異的クローンの増殖を生じる。これ
らのＴ細胞は一方では、細胞障害性／サプレッサーＴ細
胞を誘発Ｌ・、Ｂ１１１が成熟し抗体産生形？１細胞に
ｔ７ろのを助けることになる。ＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒのも
うひとつの重要な機能は、Ｂ細胞の増殖および成熟に必
須なＴｌ胞と８細胞の相互作用における乙のである。Ｉ
−１シ△−ＤＲの役割のさらに詳細については免疫学の
参ｙ３書にみられるとＪ３ゆである（たとえば、Ｔｈｅ
　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、　１．　ＨｃＣｏｎｎ
ｃｌ、＾、　Ｈ＋Ｊｎｒ。

＆　Ｈ，Ｗａｌｄｍａｎ　　著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　
５ｃｉｅｎｔｉｒｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０
ｘｆｏｒｄ、　　１９８１　）　、すなわら、インター
フェロンγは、抗原提供細胞トの表面ＨＬ△−Ｄ　Ｒの
レベルをＶ１飾することによって免疫応答の開始に中心
的な役割を渠だし、細胞性細胞１８性の増大に重要な役
割を果たしている。

その１ｕの研究により、インターフェロンγによる１−
ＩＬ△−ＤＲの誘発は造血系細胞に限定されないことが
明らかにされている。実際、繊維芽細胞、内皮細胞、表
皮ケラチン細胞、星状膠細胞および甲状腺濾胞細胞を含
めた多くのタイプの細胞が、ｉｎ　ｖｉｔｒｎｌ、：お
いて、低用量のインターフェロンγに賜されたのらに１
１シ△−ＤＦ？を発現する。

ノ１゛造向系細胞におけるＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｒの役割
に関しては多くの研究者で論争がある。たとえば、Ｈａ
ｓｏｎとＢａｒｃｌａｙ　　（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、
　　１６８　：　１６７〜１７１．１９８４）は、１ａ
陽性１）１１１１１（Ｉａはヒト１１　Ｌ△−ＤＲに相
当する７■クスの抗原である）がインク−ロイキン−１
ら産生じ、したがって抗ＩＡ提供＄１１１１として適性
をもちうることを指摘している。この種の細胞としては
とくに、血管内皮細胞（ＩＩ　ｉ　ｒｓｈｂｃｒ（Ｉほ
か：　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｒｅｄ、、　１丘２：　２４９
５．１９８０＞、表皮ケラチン細胞（ＬＩＪｆＪｅｒほ
か：Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２Ｂ　：　２１４７．
　１９８２）、おＪ、び星状豚細胞（Ｆｏｎｔａｎａほ
か：Ｊ。

［ｍｍｕｎｏｌ、、１２９：２１４３，１９８２）が挙
げられている。これらの場合１べてで、免疫刺激の尺磨
とされたＴ１１細胞の増殖がこれらの１ａ陽性、非造面
細胞によって誘発された。さらに最近になッテ、Ｂｏｔ
ｔａｚｚｏら（Ｌ−ａｎｃｅｔ、　ＩＩ、　１１１５．
１９８３　：　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、　５　
：　２３．１９８４）は、甲状腺濾胞細胞上でのｌ−Ｉ
　Ｌ　Ｒ−Ｄ　Ｒの発現が甲状腺の自己免疫疾患の発症
および維持に関与している可能性を提示した。その＋’
Ａ　（１ｏｎｄｅｉほか：５ｃｉｅｎｃｅ、２２８　：
８５．１９８５）　、彼らは自己免疫甲状腺に由来し、
向原のＨＬ△−ＤＲ陽性甲状腺細胞を認識するＴ細胞ク
ローンを同定した。

これらの著名らは、自己免疫甲状腺細胞がそれら自身の
表面自己抗原を提供する抗原提供細胞として作用するこ
とを示唆している。伯のｒｔｌｌ究では、ｒｉｅｒｚほ
か（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３４　：　３７８５〜
３７９３．１９８５）が、インターフェロンγ処買星状
膠細胞は１ａ陽性で、このような処置は上記星状膠細胞
との接触によりＴ１０胞増殖の誘発を４倍にまで増強覆
ることを明らかにしＩこ。これらの著名は、ある刺激に
よる星状膠細胞上での［ａ抗原の異常な誘発が中枢神経
系における自己免疫疾患の発症の基盤と考えられると）
ホベている。上述のω１究はｉｎ　ＶｉｔｒＯで行われ
たものであるが、最近、ｉｎ　ｖｉｖｏでの１ｔｌｌ究
がＧｒｏｃｎｃｗｃｇｅｎらによって実施された（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　３１６　：　３６１〜３６３．１９８５）
。公知のインターフェロンγ産生阻害剤であるシへロス
ポリン八を用い、彼らは、イヌ内皮細胞によるクラス■
抗原の発現は構成的なものではなくむしろインターフェ
ロン依存性であることを示している。これらの著者は、
非造血細胞のクラスＩＩ　Ｍ　ＨＣ生成物（たとえば、
ヒトにお１）るＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｒおよびマウス細胞
におけるＩａ）が免疫応答に関与していることも示唆し
ている。

上述の研究の結論は主として情況的であり、細胞対柵胞
相々作用およびＴ細胞増殖にのみ基づいていた。しかし
ながら、これまでの報告には、１−Ｉ　Ｌ　Ａ　−ＯＲ
保持組ｌ１ＡＩｌｌ胞に対する直接的細胞毒性または特
異的自己抗体の誘発について触れたものはなかった。こ
のような考え方は最近、ＨＯＷａｔ（Ｌａｎｃｅｔ、　
１９８５年８月３日号、２８３頁）によって示されたも
ので、彼は、自己免疫疾患におけるクラスＩＩ　Ｍ　Ｈ
Ｃ抗原の発現の増大は単にｆ１１１病変へのエフェクタ
ー■リンパ球の関与するものであることを示唆した。そ
して、自己崩壊過程の憎；εミにおりるＨＬＡ−ＯＲの
役割を排除はしていないが、）１忌深い実験的考察を示
唆している。

無関係な３系列の研究により、実際に、事情はそれまで
１１１１１６されていたのと全く逆であるがもしれない
こと、すなわち、インターフェロンγが現実に非造血細
胞上にｌ−Ｉ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｒを誘発することによっ
て免疫を阻害するｉｉＪ能性のあることが、間接的な方
法で示されティる。Ｔａｒａｉｅｌ　Ｉ　ｉら（Ｉｎｔ
。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　　３４ニア９７〜８０６．１９８
４）は、転位ヒト黒色腫細胞に対し、同県リンパ球仲介
細胞毒性およびリンパ球増殖の抑制という形でのＨＬＡ
−ＤＲの役割を研究した。ヒト！！瘍細胞は、その６０
〜７０％の場合、同県リンパ球の増殖およびその腫瘍特
異的細胞障害Ｔｍ１ｌｌへの分化を刺徴できる。これは
ＩＬ−２の産生を介して行われる。Ｔａｒａｍｅｌ　ｌ
　ｉ　らは、転移黒色腫細胞（リンパ小節からの）が同
県リンパ球のＩ　Ｌ　−２依存性刺激を阻害できること
を発見した。この阻害はＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒ陽性黒色腫
細胞にのみ認められた。

しカモ、ｌ−１１−Ａ　−ＯＲ１１２性細胞をインター
フェロンγｒ　ｆｆｉ　Ｉ’ｌｌ　’ｔ　ルと１１１−
へ一引く陽性に変化し・抑制活性を獲得した。すなゎＬ
）、インターフ１ｒ］ンγによる黒色腫ＩＩｌ胞上への
トｌへ−閃くの誘導は・情況的に、河原リンパ球仲介細
胞、１１性の１１害に連結していたのである。もしこの
現象が腫瘍細胞に限定されず、ずべての１ｌｌｆｆＬｉ
に起こるしのであれば、自己免疫疾患に伴う組ｌ１ｌｌ
ｌ胞十のｌ−Ｉ　Ｌ　Ａ　−ＯＲの出現は、単球、キラ
ーＩＩｌ胞およびｍ胞ｍ性゛１リンパ球による組織障害
を阻害する恒常性反応の一部と考えることもできる。実
際、Ｂｉｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、により、慢性関節リウマブ
に罹患している癌患名に抗新生物効果を１１１１侍して
インターフェロンγが投与されたところ、１」節炎の改
善の徴候を示したことが最近報告されている。予茹的な
研究では、患者の７０％が疼痛および靜張の緩解を経験
している。

これらの観察はｉｎ　ＶｉｔｒＯにおいて認めら机たよ
うな清液ｍ胞への１−ＩＬＡ−ＯＲの発現増大に関係し
ているのかもしれない。

細胞仲介細胞毒性のサプレッサーとして最もよく検品］
されているインターフェロンγの役割は、天然キラー（
ＮＫ）活性の分野においてである。

インターフェロンは、標的細胞の障害の方向にＮＫＩＩ
胞を活性化する一方、これらの標的細胞をＮＫに対して
より抵抗性にすることを示すいくつかの研究がある（た
とえば、Ｔｒｉｎｃｉｃｒｉ　＆５ａｎｔｏｌｉ：　　
Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｈｅｄ、、　　１４７　：１３１４．
１９７８　：　Ｈａｎｎｓｏｎほか：　Ｊ、　［１ｍｕ
ｎｏ１．、　１２５　：２２２５　、１９８０　：　Ｗ
ｅｌｓｈ−＾ｎｔｉＶｉｒａｌ　ＲＱＳ、。

１　：　５　、１９８１　；　１４ａｌｌａｃｈ：　Ｊ
、　ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｃｓｌ、　　２　：　３２
９．１９８２１ａｌｌａｃｈ：Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、　　Ｌ五：　３９０．１９８３＞。

すなわち、インターフェロンγは、細胞によって逆の作
用をもつように思われる。単球およびＮＫ細胞はインタ
ーフェロンγによって活性化され、ｌ１ＩＩ１１毒性細
胞としての機能が効率化されるが、一方、分解の標的と
なる様々の非造血細胞はＮＫ抵抗性を付与される可能性
がある。しがも、ある秤の腫ＩＱｌｌｌ胞はく転移黒色
師、Ｔａｒａｍｅｌｌｉ　ホカ：Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ
ｎｃｅｒ、　３４　：　７９７．１９８４　：マウス白
面、病、Ｉｌａｍｉｌａ　＆　ＥＡｂ：　Ｎａｔｕｒｅ
、　　３　Ｑ　４　：　４４２．１９８３：神経膠腫、
Ｇａｔｃｌｙほか：へｅｔａＮｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒＱ
、、　６４　：　１７５．１９８２　：リンパ内挿、Ｒ
Ｏ℃ｈほか：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１３０　
：　３０３．１９８３）は、その表面上におけるＨＬＡ
−ＤＲの発現とＩ連すると思われる免疫抑ｔＩＩ＋活性
を有する。

発明の要約本発明は、様々のタイプのインターフェロンＴ受容体に
対する抗体に関するものである。本発明の抗体は、選択
的に、インターフェロンγのある細胞への結合は遮断フ
るが、他の！ＤＫ１への結合は遮断しない。本発明は、
ヒトＩＩｌ胞がその組織によってインターフェロンγに
対する異なる受容体を有するとの観察に基づくものであ
る。インターフェロンγはｌ１ｌｌ胞によって逆の作用
を発揮するので、その受容体を選択的に遮断することに
より、たとえば免疫細胞の受容体の遮断によりインター
フェロンγの免疫刺激作用を低下させ、一方、その非免
疫細胞との相互作用は保持させて、自己免疫疾患におい
て生じる障害に対して非免疫細胞を抵抗性にすることが
できる。

本発明はまた、ｖ１製された活性型の上記受容体および
それに対する抗体の製造方法に関する。本発明はまた、
上述の抗体を含有する医話紺成物、ならびに各種自己免
疫疾患に対して免疫調節剤と　　゛して投与するための
上記組成物の使用しこ関する。

発明の説明ヒトの各種細胞にお【プるインターフェロンγの受容体
を、放ＯＡ標識インターフ］−ロンγを用いた架橋結合
実験によって同定した。、要約すれば、純粋なインター
フェロンγを公知の方法に従って（１）で標識した。得
られたプレバレージョンは正常な生物学的活性を示した
。このような標識インターフェロンをヒトの各種細胞と
４℃で反応させ、生成したインターフェロン受容体複合
体を共有結合により架橋結合させた。ついで、架橋結合
複合体を、ドデシルｆｉｌナトリウム（ＳＯ３＞の存在
下にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によ
って分析したのち、オートラジオグラフィーに付した。

実施例に示すように、組織源の異なるヒトａｌｌ胞は、
分子ｍの異なるインターフェロンγ受容体を示し、これ
はそれらが構造的に異なることを示唆した。

次に、各種細胞系からの受容体を、固定化インターフエ
ロンγカラム上アフィニティークロマトグラフィーに付
し、そのインターフェロンγへの結合能を失なわせない
で精製した。これらの精製プレバレージョンを、あるｌ
１ｌｌ　Ｉｌｌへのインターフェロンγの結合を選択的
にｍＩｉし、他のｉ胞への結合は遮断しない抗体の開発
に使用した。

本発明をさらに、以下の実施例により例示する。

細胞（その細胞種により１〜２×１０８個）を過剰の非
標識ＩＦＮ−γの存在下または非存在下＋）　　　　　
　４＋　　　　　　　　　１２５に、Ｃａ　およびＭＧ
　　含有ＰＯ３中、（１）−ＩＦＮ−γと４℃で１．５
時間インキュベートした。非分解性架橋結合試薬（ジス
クシニミジルスベレート（ＤＳＳ））を最終濃度０．５
〜１！１１Ｈになるように、４℃、２０分間で添加した
。ついでＩｌｌ　！Ｂを、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　
−１００含有５０ａ＋ＨＴｒ　　ｉ　　５−ＨＣＪ！、
　　Ｏ，ＩＭ　　　ＮａＣｊ！、ｐｉｆ７．５中、穏や
かに撹拌しながら４℃で１時間、洗浄、再懸濁した。こ
のプレバレージョンを、２７．０００Ｘ９で２０分間遠
心分離した。上澄液をウサギ−ＩＦＮ−γ血清（ウサギ
を同種ＩＦＮ−γで免疫感作して調製）で免疫沈殿さけ
、１：５０に希釈した。Ｖ温に２時間放置したの１５、
プロティン−Ａ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅの懸濁液を加え
、１時間室温に放置した。５ｅｐｈａｒｏｓｅビーズを
次に洗υし、結合した物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル
緩衝液の添加により！！１１１させた。丈ンブルの解析
は５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（７，５％）によって行った。

第１１Ｊには、Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｈオヨ’ＣＦ　Ｋ　Ｏ−１
ｍ　Ｉｌｌ上の受容体に架橋結合した（　　　ｆ）−［
ＦＮ−γの見かけの分子量を示す。Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｈ細胞
の場合（第１図のレーン２）、分子ｆｆ１１０５．００
０〜１３０゜ＯＯＯの広いバンドがみられた。受容体が
１分子のＩＦＮ−γ（２５ｋＤ）と結合したと仮定する
と、受容体の分子層の計算値は９０，０００〜１０５．
０００となる。ＫＧ−１ミニロイド細胞の場合（第１図
レーン５）は分子！ａ１６５，０００の鋭いバンドを示
し、分子１１１４０．０００〜１５０．０００の受容体
を与えた。１００　ｆｒ；過す１の非標識ＩＦＮ−γの
添加によりこれらの架橋結合複合体の生成は妨害され（
第１図；し令ン３、Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｈ：レーン６、ＫＧ−
１）、結合の特異性を示している。９２，０００以下の
分子量のバンドは、第１図レーン１に示すようにそれ自
体と架１：ｒＡ結合したｌＦ、Ｎ−７に相当する。第２
図は類似のパターンを示１゜ＷＩＳＨ細胞の受容体に架
橋結合した（　　　１）−１ＦＮ−γは分子ｆＭ　１０
５　。

０００〜１３０，０００をしつようにみえた。

（１）−１ＦＮ−γが正常末梢血液単球の受容体に架橋
結合した場合、分子量１６５．０００のバンドが有られ
た。このバンドはＫＧ−ＩＩ胞（ミニロイド細胞系）に
みられたもののひとつと同一であった。正常末梢血液Ｔ
リンパ球では、ＩＦＮ−γ受容体複合体とＩｌＱ連づけ
られるバンドは全く検知されず、分子ｆｆ１．９２．ｏ
ｏｏ以下の出現したバンドはそれ自体と架（ｎ結合した
ＩＦＮ−γに相当する。

第３図には、先に示したＷ　Ｉ　Ｓ　Ｈ細胞上の受容体
と同じ分子量がみられる。Ｈｅ　Ｌ　ａ　　ｌ−１−２
２９細胞（繊維芽細胞系）は複合体の１０５．０００〜
１３０，０００の広いバンドを示す。Ｄａ＋」ｄｉ細胞
（Ｂ−リンホプラストイド）も１２０．０００−１４０
，０００の広いバンドを示す。

ＭＯＬＴ−４（Ｔｉｎ胞系）では複合体は検知されなか
った。

外λ−」≦旦関Ｉｓ且Ｉ」し４旦Ｊ」−已Ｎ二二しλ容
の体の単離ヒトＷ　Ｉ’　Ｓ　ｌ−１細胞を、１０％ウシ胎仔血清
とグルタミン２ｍＭを補充した最小必須培地中で生育さ
せた。ｉ胞をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄した
。１〜１０Ｘ１０１０ｆｌ’ｆｌｌの細胞を可溶化緩衝
液（最終濃度：　１０ｍＭ　　ｎｅｐｅｓ　、　ｐＨ７
、４。

１〜２％ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ　−１００，１０１ＨＰＭＳ
Ｆおよび２０ｍ位／ｍｌアプロチニン）中で可溶化した
。

懸濁液を最初１０．０ＯＯＸＪで１５分間、ライで１０
０．ＯＯＯｘｇで６０分間遠心分離した。

上澄液を固定化ＩＦＮ−γカラム（Δｆｆｉｇｅｌ　−
１０１厩あたり７旬）に適用した。負荷は流速０．２〜
０．３ｒｄ／分とした。ついでカラムをＰＢＳ（５’Ｏ
ｄ）で洗浄し、結合した物質を５０Ｉｌ＋ＨＮ　ａ２　
ＣＯ３ａ３よび０．５Ｍ　　ＮａＣ１の溶液、ｐＨ１１
で溶出した。１１ｄの分画を集め、３Ｍ酢酸で直ちに中
和した。各分画について（１）−ＩＦＮ−γへの結合能
および蛋白含量を試験した。第４図には、Ｗ　Ｉ　Ｓ　
ＨＩ胞についてのアフィニティーカラムの溶出像を示す
。蛋白質は７０レスカミンで定沿した。比活性による精
製係数少なくとも２６００が１工程で得られた。

例３　ヒｌ−（ＫＧ−１”Ｉ　ｌ１ｌｌ胞のＩＦＮ−γ
受容体の甲α１ヒトＫＧ−１細胞を１０％ウシ胎仔血清とグルタミン２
ｍ１４を補充した（α−改変）最小必須培地中で生育さ
せｌ〔。＄ｉＩＩ胞をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で
洗浄した。１〜１０Ｘ１０　　個の細胞を可溶化ｔ’Ｍ
’ａ　（最終濃度：１ＱｍＨ１ｌｅｐｅｓ　。

ｐＨ１７，４，１〜２％　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１０
０，１１＋ＨＰＭＳＦおよび２　Ｏｔｉ位／−アプロチ
ニン）中で可溶化した。懸濁液を最初１０．ＯＯＯＸｇ
で１５分間ついで１００．ＯＯＯＸｇｔ−６０分間遠心
分離した。上澄液を固定化ＩＦＮ−γカラム（八ｆｆｉ
ｇｅｌ　−１０１ｍあたり７ｍ９）に適用した。

負荷は流速０．２〜０．５ｄ／分とした。ついでカラム
をＰＢＳ（，５０ｄ）で洗浄し、結合した物　　　′質
を適当な緩衝液で溶出した。１ｄの分画を集め、直ちに
中和した。各分画について〔Ｉ〕−ＩＦＮ−γ結合能お
よび蛋白含量を試験した。比活性に基づく精製係数少な
くとも１５００が１工程で得られた。

例４　ヒドロａｕｄ　ｉ細胞からのＩＦＮ−γ受容体の
単離ヒトＤａｕ、ｄｉ　ｍ胞を、１０％ウシ胎仔血清とグル
タミン２ＩＩＩＨを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中
で生育さＶだ。細胞をリンＭ緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で
洗浄した。１〜１０Ｘ１０１０個の細胞を可溶化緩衝液
（最終濃度：　１０ｍＭ　　ｌ１ｃｐｃｓ　。

ＤＩ１７，４、１へ・２％　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１
００，１ｍＨＰＭＳＦおよび２０１位／ｄのアプロチニ
ン）中で可溶化した。懸濁液を最初１０．０ＯＯＸ７で
１５分間ついで１００．ＯＯＯｘｇで６０分間遠心分離
した。上澄液を固定化ＩＦＮ−γカラム（Ａｒｒｉｏｃ
ｌ　−１０１ｍｌアたり７ｑ）ｋ：適用した。

負荷は流速０．２〜０．５−／分で行った。ついでカラ
ムをＰＢＳ　（５０ｄ）で洗浄し、結合した物質を適当
な緩衝液で溶出した。１　ｍＱの分画を集め直ちに中８
１　シた。各・分画について（１）−ＩＦＮ−γ結合能
および蛋白含量を試験した。蛋白はフロレスカミンで定
量した。比活性に基づく精製係数少なくとも１０００が
１工程で得られた。

例５　　（１）−１ＦＮ−γの結合および非ＷＩＳＨＩ
胞のアフィニティーカラムからの各種フラクションの一
部（蛋白含ｆｆ１２００ｎｏ＞をとり、非標識ＩＦＮ−
γ（１３０，０００単位）を加えまたは加えないで、（
１）−１ＦＮ−γ（１３０！ｉ位）と混合した。４℃で
２時間インキュベートしｔこのち、担体としてγ−グロ
ブリンを加え、プロピレングリコール（ＰＥＧ）（分子
帛８０００）で蛋白質を沈殿させた。混合物をミリボア
（ＨＡＷＰ、０．４５μ）−ヒで濾過し、膜に結合した
放射能を測定した。可溶性受容体を含まないほかは同じ
反応Ｕ合物でバックグランドの力ラン１へを測定した。

第１表は、溶出分画中の蛋白質への（１２５１）　−１
ＦＮ−γの結合は非標識リガンドによって完全に置換さ
れたことを示し、これは結合の特異性を示唆している。

バックグランドは溶出分画中の総結合の２０％未満であ
り、これはすべての読みから差し引いた。

例６　飽和結合部位例２からの溶出分画Ｎｏ、　５の一部（蛋白含ｆｆｔ２
００μｇ）をとり、（１）−１ＦＮ−７を濃度を増加さ
せていって（５〜６０００単位／ｄ＞混合した。蛋白を
沈殿させ、前述したと同様にして濾過した。

第５図は、（１２５１）　−１ＦＮ−γが４℃でも３７
℃でも飽和様式で受容体に結合することを示している。

飽和曲線の５ｃａｔｃｈａｒｄ解析ではいずれの温度で
も直線性のプロットを示す。Ｋｄは４℃で４．８Ｘ１０
−１０Ｍ、３７℃で２．９５Ｘ１０１０Ｍであった。こ
れらの値は、正常細胞について報告されている値と同じ
オーダーである。

例２のアフィニティーカラムの各種分画の一部を（１２
５１）−１ＦＮ−γと混合し、最終容量を６０ｔｌｉと
した。ジーＮ−ヒドロキシスクシニミジルスベレート（
ＤＳＳ）を加え、インキュベー１−シたのら、ウサギ抗
−ＩＦＮ−γ血清を加えた。

複合体をブＯティン−Ａ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅで沈殿
させた。サンプルの分析は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（７，５
％）、ついでオートラジオグラフィーによって行った。

第６図は、溶出分画中に得られた高分子量パン１〜と同
時に、分子ｈｔｌ　１５．０００の複合体を示す。免疫
沈殿の特異性をざらに確認するために、ＩＦＮ−γ（０
，１０または１０００ｔ８モル過剰）またはＩＦＮ−α
（１０００倍モル過剰）との競合実験を実施した。免疫
沈殿の特異的阻害はＩＦＮ−γによってのみ認められた
く第６図）、。

例８　マウスの免疫感作各種細胞系からのインターフェロンγ受容体の部分精製
プレバレージョンを抗原として使用し、雌性ＢＡＬＢ／
ｃマウスを免疫感作した。受容体プレバレージョン５μ
グを完全フロインドアジュバント中に乳化し、マウスに
最初に皮下注射した。

この性用を１週間隔でさらに３回くり返した。抗体の発
生レベルは、マウス血清のヒトＷＩＳ＋−１１［細胞中
でのＩＦＮ−γの抗ウイルス活性阻害能にＪ：す、また
（　　　１）−１ＦＮ−γのＫＧｌおよびＤａｕｄｉ　
ｍ胞への結合の阻害能により追跡した。

他の実験では、９５．０００バンド蛋白質（２Ｉｉ９＞
を含有するポリアクリルアミドゲルを細切し、完全フロ
インドアジュバント中に乳化して、マウスに皮下注射し
た。３０日後に、９５，０００バンド蛋白質（２μり）
含有ポリアクリルアミドゲルを細切してマウスに皮下性
）１した。感作をさらに３回１週間隔でくり返し、抗体
の発生レベルはマウス血清のヒトＷＩＳＨ細胞中でのＩ
ＦＮ−γの抗ウイルス活性阻害能により追跡した。

例９　医薬組成物本発明の化合物は、医薬用組成物の製造の場合の公知方
法に従ってα方づることができる。すなわら、本発明の
精製受容体もしくは杭体生成物またはその抗体もしくは
インターフェロンγのＦ（ａｂ）フラグメントのいずれ
かを、医薬用に許容される担体ビークルと混合して配合
する。適当なビークルおＪ：び処方ハ［、Ｗ、Ｈａｒｔ
ｉｎｇ：、Ｒｅｍ１ｒ＋ｃ＋ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓに記載されている
。このような組成物は、本発明の活性物質の有効にを適
当けのビークルとともに含有し、宿主への効果的な投与
に適した医薬用として許容される組成物を提供するもの
である。

例１０　非経口投与免疫抑υ１または免疫調節処置を必要とする対染に、本
発明の抗体もしくは精製受容体、その両者またはインタ
ーフェロンγとの混合物を非経口的に投与することがで
きる。投与はおよび投与回数は、（世の抗体の臨床的検
討に現在使用されている方法と同様に選択される。たと
えば杓０．１〜１００ｍｙ、またざらに大ぎな効果を朋
持するときはさらに大量を使用することができる。

本発明において非経口的に適用できるほぼ均一な抗体の
適当な投与剤型の例を示せば、抗体６９を米層ヒト血清
アルブミン２５０−に溶解し、この溶液を滅菌フィルタ
ーに通し、濾液を無菌的に１００個のバイアルに分割充
填する。非経口投与に適した純粋な抗体６０Ｒ９をそれ
ぞれ含有するバイアルが１ｑられる。このバイアルは凍
結乾燥することが好ましく、使用前に滅菌水を用いて再
生する。

第１表（１２５１）−１ＦＮ−γの結合と３Ｉ＝標識リガンドとの競合総結合　　　特異的結合ｂ）サンプル　　　　ｃｐ１１／２００ｎｇ　　　　（％）
負荷　　　　　　　　００廃液　　　　　　　　　００洗液２　　　　　　　　０　　　　　０溶出液１　　　
　４７．２００　　　　１００ｎ　　２　　　　４８，
０００　　　　１００ＩＩ３　　　　４７，０００　　
　　１００ＪＪ　　４　　　　４９，０００　　　　１
００ａ）バックグランド（１０，２００ＣＤＩｍ　）を
差し引いた。

適用：　２６＆、ＯＯＱｃｐｍ　（１３０県位）ｂ）１
０００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下における　　
Ｉ−ＩＦＮ−γの結合Ｗ　Ｉ　Ｓ　ｌ−Ｉ　ＩＩＩ胞およびＫＯ−１ｉｌｌ胞
ヘノ結合および架橋結合、ならびに非標識ＩＦＮ−γと
の競合を示す。

レーン１：それ自体と架橋結合した（　　　１）−ＩＦ
Ｎ−γ レーン２：ＷＩＳＨ絽１１ａに架橋結合した（　　１２
５１　）　−ＩＮＦ−γ レーン３：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下に
ＷＩＳＨ１ｌ胞に架橋結合した（　　　１）−ＩＦＮ−
γ レーン４：分子Ｒマーカー（上から下へ：ミオシン、２
００．０００　：ホスホリラーゼＢ、９２゜０００　：
ウシ血清アルブミン、６９，０００：オバルブミン、４
６，０００）レーン５：ＫＧ−１１１１１ｔｌに架橋結合した（１）
−１ＦＮ−γ レーン６：１００倍過剰の非標識［ＦＮ−γの存在下に
ＫＧ−１細胞に架橋結合した（　　　１）−ＩＦＮ−γ 第２図は、受容体に対する（１２５１）−１ＦＮ−γの
結合および架橋結合、ならびに非標識ＩＦＮ−γとの競
合を示す。

レーン１：分子量マーカー（上から下へ：ミオシン、２
００．０００；ホスホリラーゼＢ、９２゜０００　：ウ
シ血清アルブミン、６９，０００：オバルブミン、４６
，０００＞レーン２：ＷＩＳｌ−１ｉｎ胞に架橋結合した（＋）−
１ＦＮ−γ レーン３．：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下
にＷＩＳＨ細胞に架橋結合した（　　　１）−ＩＦＮ−
γ レーン４：正常末梢血単球に架橋結合した（＋）−１Ｆ
Ｎ−γ レーン５：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下に
正常末梢血単球に架橋結合した〔！〕−ＩＦＮ−γ レーン６：正常末梢血Ｔリンパ球に架橋結合したＣ　　
　Ｉ）−１ＦＮ−γ レーン７：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下に
正な末Ｈ’ｉ　ｍ　Ｔリンパ球に架橋結合した（＋）−
１ＦＮ−γ 第３図は、受容体に対する（１２５［）−１ＦＮ−γの
結合および架橋結合ならびに非標識ＩＦＮ−γとの競合
を示す。

レーン１および６：分子ωマーカー（上から下へ：ミオ
シン、２００．０００：ホスホリラーゼ１３．９２．０
００　：ウシ血清アルブミン、６９゜レーン２：ＷＩＳ
Ｈｌ［細胞に架橋結合した（１）−１ＦＮ−γ レーン３：１００倍過剰の非標識Ｉ＋：ｘ−γの存在下
にＷ＋ＳＨ細胞と架橋結合した（　　　１）−ＩＦＮ−
γ レーン４　：Ｈ−２２９細胞に架橋結合した（＋　）　
−１ＦＮ−γ レーン５：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下に
Ｈ−２２９細胞に架橋結合した（　　　Ｉ）−ＩＦＮ−
γ Ｉ、ｉ−ン７　：ＭＯＬＴ−４１１１１１１１，：架１
結合り、り（１）−１ＦＮ−γ レーン８：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下に
ＭＯＬＴ−４細胞に架橋結合した（１）−１ＦＮ−γ レーン９　：　ＤａＬＩｄｉ細胞に架橋結合した（　　
　１）−ＩＦＮ−γ レーン１０：１００倍過剰の非標識ＩＦＮ−γの存在下
にＤａｕｄｉ　ｍ胞に架橋結合した（　　　１）−Ｉ　
Ｆ　Ｎ−丁第４図は、アフィニティーカラムからのＩＦＮ−γ受容
体の溶出パターンを示す。各分画について（１）−１Ｆ
Ｎ−γに対する結合能（−ム一）および蛋白含ω（−０−）を試験した。

１−：負萄、Ｗ：洗液、Ｅ：溶出分画。蛋白はフロレス
カミンで定量した。

第５図は、溶出分画Ｎ０６（第４図）に対するＣＩ）−
１ＦＮ−γの結合を示寸。蛋白（２００ｎ（１）を（１
）−１ＦＮ−７の温度を増大させていって、４℃（−の
−）および３７℃（−ム−）でインキュベートした。’
ＭＭ１ｆｌｔＭ能は前述のようにして蛋白結合放射能か
ら分離した。

挿入図は結合データの５ｃａｔｃｈａｒｄプロツトであ
る。

第６図は（１）　　ＩＦＮ−γとその受容体の免疫沈殿
架橋複合体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ（７，５％）およびオー
トラジオグラフィーによる解析結末である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）溶解型であつて少なくとも部分的に精製された型
のヒトγ−インターフエロン特異的受容体蛋白質。
（２）分子量約９０，０００〜１０５，０００ダルトン
の、ＷＩＳＨ、ＨｅＬａおよびＦＳ−１１細胞の受容体
蛋白質である特許請求の範囲第１項に記載の受容体蛋白
質。
（３）分子間約１４０，０００ダルトンの、単球および
ＫＧ−１細胞の受容体蛋白質である特許請求の範囲１項
に記載の受容体蛋白質。
（４）分子間約９５，０００〜１１５，０００ダルトン
の、Ｄａｕｄｉリンホプラストイド細胞の受容体蛋白質
である特許請求の範囲１項に記載の受容体蛋白質。
（５）特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質に対する抗
体。
（６）特許請求の範囲第２項に記載の蛋白質に対する抗
体。
（７）特許請求の範囲第３項に記載の蛋白質に対する抗
体。
（８）特許請求の範囲第４項に記載の蛋白質に対する抗
体。
（９）ヒトインターフエロンγ受容体を有するヒト細胞
を可溶化して懸濁液を得、この懸濁液を遠心分層して上
澄液を得、この上溶液を固定化インターフエロンγカラ
ムに適用し、結合した蛋白質をｐＨ条件を変えて溶出し
て純度の高い状態で獲得することを特徴とする特許請求
の範囲１項に記載のヒトインターフエロンγ受容体蛋白
質の単離方法。
（１０）細胞はＷＩＳＨ、ＨｅＬａまたはＦＳ−１１細
胞である特許請求の範囲第９項に記載の方法。
（１１）細胞は単球またはＫＧ−１細胞である特許請求
の範囲第９項に記載の方法。
（１２）細胞はＤａｕｄｉリンホプラストイド細胞であ
る特許請求の範囲第９項に記載の方法。
（１３）動物を特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質で
免疫感作することを特徴とするヒトγインターフエロン
受容体蛋白質に対する抗体の取得方法。
（１４）インターフエロンγおよび特許請求の範囲第１
３項に記載の抗体からなる組成物。
（１５）少なくとも１種のヒトインターフエロンγ受容
体に対する抗体からなるが、少なくとも１種の他のヒト
インターフエロンγに対する抗体を欠く特許請求の範囲
第１４項に記載の組成物。
（１６）特許請求の範囲第２項に記載の受容体蛋白質に
対する抗体を欠く特許請求の範囲第１５項に記載の組成
物。
（１７）特許請求の範囲第３項に記載の受容体蛋白質に
対する抗体を欠く特許請求の範囲第１５項に記載の組成
物。
（１８）特許請求の範囲第４項に記載の受容対蛋白質に
対する抗体を欠く特許請求の範囲第１５項に記載の組成
物。
（１９）ヒトインターフエロンγ受容体の少なくとも１
つに対する抗体からなるが、他のヒトインターフエロン
γ受容体の少なくとも１つに対する抗体を欠く組成物。
（２０）特許請求の範囲第１９項に記載の組成物の有効
量を投与することを特徴とするヒトインターフエロンγ
の効果を制御する方法。
（２１）免疫細胞上のインターフエロンγに対する受容
体を選択的に遮断する特許請求の範囲第２０項に記載の
方法。
（２２）特許請求の範囲第１項に記載の可溶性受容体か
らなり、ヒトインターフエロンγの治療効果を制御する
ための組成物。
（２３）特許請求の範囲第２項に記載の可溶性受容体か
らなり、ヒトインターフエロンγの治療効果を制御する
ための組成物。
（２４）特許請求の範囲第３項に記載の可溶性受容体か
らなり、ヒトインターフエロンγの治療効果を制御する
ための組成物。
（２５）特許請求の範囲第４項に記載の可溶性受容体か
らなり、ヒトインターフエロンγの治療効果を制御する
ための組成物。