PT94575B - Processo para a preparacao de novas citoquinas - Google Patents

Description

□ referido processo de preparação consiste no facto de uma solução contendo tal polipeptídeo ou seu derivado ser purificada por métodos cromatográficos e, quando necessário, o composta desejado ser isolado e/ou convertido num seu derivado.

□ invento diz respeito a polipeptideos com um peso molecular aparente de cerca de 16© kD os quais são mediadores ou precursores de mediadores de inflamação, seus derivados tal como mutantes e fragmentos, processos para a sua preparação, DNAs e vectores hibridos de codificação para os referidos polipeptideos e derivados e células hospedeiras transfDrmadas com os referidos vectores hibridos, anticorpos policlonais e monoclonais específicos para os referidas polipeptideos ou seus derivados e derivados anticorpo bem como métodos de diagnóstico e terapêuticos para condições inflamatórias e linfomas de Hodgkin.

ANTECEDENTES DQ INVENTO

As citoquinas são mediadores polipeptideos solúveis, biológicamente activos, os quais controlam a diferenciação, activação e proliferação de vários tipos de células do sistema imune, por exemplo a indução ou modulação de funções macrófagas. Exemplos de citoquinas são os bem caracterizados interferons, interleucinas e factor de estimulação da colónia, bem como o factor de inibição de migração do macrófago (MIF) e o factor de activação do macrófago (MAF), que apresentam respectivamente, propriedades de inibição ou de activação do macrófago.

Tem sido atribuidads numerosas actividades às citoquinas embora algumas delas possam ser imputadas às moléculas simples. Por exemplo, o MIF humano, que se pensa ser formado por um grupo de polipeptideos, é definido in vitro num ensaio que , mede a inibição da migração aleatória de macrófagos. In vivo, o j

MIF humano desempenha um papel importante nos acontecimentos iniciais nas reacções de imunidade celular (hipersensibilidade tipo retardada) pela sua mediação das funções macrófago. Em geral, a primeira exposição de um doente a um antigene não produz mudança sensível, mas o estado de imunidade do receptor é

claramente alterada. Após o segundo contacto com o antigene, a reacção de hipersensibi1 idade retardada manifesta-se pela infiltração de células, começando com uma acumulação perivascular de linfócitos e monócitos no local onde se localiza o antigene. Estas células reagem com o antigene, o qual ocasiona a libertação de linfoquinas e a atracção e retenção de grande número de células não sensibilizadas. Em particular, supSe-se que a produção de MIF provem da atracção de monócitos que passam através do endotélio da parede da vaso sanguíneo e entram no tecido circundante. Concomitantemente com esta infiltração, os monócitos diferenciam-se nos tecidos dos macrófagos. Os fenómenos microscópicos vistos na hipersensibi1 idade tipo atrasada são aumentados no local de contacto com α antigene causada pela infiltração celular e pelo avermelhar causado pela dilatação dos vasos sanguíneos que estão por baixo. Sob condições normais, a reacção inflamatória acabará após cerca de dois a tres dias quando reparamos o possível dano do tecido. No entanto, por razões desconhecidas, as inflamações podem tornar—se crónicas, ocasionando o dano extensiva dos tecidos, e.g., artrite reumatóide. Uma explicação possível para a degeneração da inflamação crónica pode ser de que, no ataque, pode-se desregular a diferenciação dos macrófagos infiltrados.

DBJECTIVD DO INVENTO é um objectivo do presente invento fornecer polipeptideos, em particular polipeptideos humanos, os quais são mediadores ou precursores dos mediadores de inflamação e seus derivados com pureza elevada e quantidade suficiente, e processos para a sua preparação. 0 problema da sintese industrial dos polipeptideos pode ser resolvido por métodos de tecnologia DNA recombinante. é portanto um objectivo do invento fornecer DNAs e vectores híbridos de codificação para os desejados polipeptideos e derivados, e hospedeiros transformados com tais vectores. Outros objectivos são os métodos de produção dos referidos DNAs, vectores e células hospedeiras transformadas.

Os polipeptideos do invento são úteis para termos uma melhor compreensão do papel do sistema fagócito mononuclear em áreas clinicamente importantes tal como resistência à infecção, controlo de metastases, processos inflamatórios e reparação do tecido. Além disso, eles são úteis para o tratamento de condições inflamatórias crónicas. Par consequência, outro objectivo do invento são as composições farmacêuticas compreendendo os polipeptideos ou os seus derivados, e métodos para a sua preparação. Além disso, os polipeptideos e derivados de acordo com o invento são úteis para o estudo, identificação e produção de antagonistas os quais podem ser usados como drogas anti-inflamatórias.

Outro objectivo da invento é fornecer anticorpos específicos para os polipeptideos ou os derivados do invento. Tais anticorpos podem ser usados para o giagnóstico de condições inflamatórias e para controlar ou vigiar o tratamento de tais condições. Além disso estes anticorpos são úteis para o diagnóstico e tratamento de 1infornas de Hodgkin.

DESCRIçgo DO INVENTO invento diz respeito a polipeptideos, em particular polipeptideos humanos, com um peso molecular aparente de cerca de 160 kD os quais são mediadores ou precursores de mediadores de inflamação, e seus derivados.

Os mediadores de inflamação são moléculas quimicamente sinalizadas as quais induzem reacções inflamatórias.

Os precursores dos mediadores polipeptideos são mediadores de estágios prévios, i.e. polipeptideos que após a sua produção são processados ou acondicionados, e.g. por corte de certas sequências terminais amino ácido e/ou por glocosilação, e são assim convertidos nos seus mediadores activos, ou retem a sua actividade mediadora se o próprio precursor for um mediador activo.

Os polipeptideos e derivados do invento desempenham um papel importante nos processos imunológicos envolvidos nas condições inflamatórias. A actividade do mediador de inflamação dos polipeptideos reivindicados pode ser provada por exemplo pela sua capacidade em induzir a inflamação localizada quando admnistrada subcutaneamente, por exemplo numa cobaia vulgar.

Em geral, o peso molecular aparente de um polipeptideo de estrutura desconhecida pode ser determinado de acordo com métodos convencionais, e.g. por análise de sedimentação e deter— minação do coeficiente de difusão ou métodos de gel electroforêticos, em particular electroforese de gel poliacrilamida na presença de dodecil sulfata de sódio (SDS-PAGE).

Em particular, o invento diz respeito a um polipetideo que é um mediador ou precursor de um mediador de inflamação designado por MRP-160 de uma sequencia amino ácido dada na SEQ ID NO: 1, ou de um seu derivada.

peso molecular calculado para o MRP-160 é 16Q.989.

Os derivados do inventa são mutantes dos polipeptideos de acordo com o invento, em particular os mutantes dos polipeptideos da sequencia amino ácido dada na SEQ ID NO: 1, em que um ou mais amino ácidos simples, em particular não mais do que 10X dos

-bamino ácidos, são retirados ou substituidos por amino ácidos diferentes, ou inserimos amino ácidos adicionais.

Além disso, os derivados do invento são fragmentos de um polipeptideo do invento ou de um seu mutante, em particular de fragmentos de um polipeptideo da sequencia amino ácido dada em SEO ID NO: 1 ou de um seu mutante, compreendendo pelo menos 15 amino ácidos consecutivos.

Prefere-se um fragmento polipetideo d qual compreende amino ácidos 878 a 1427 da sequencia amino ácido dada na SEQ ID NO: 1, em que o terminus-N é hidrogénio, acil, a sequencia amino ácido Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly ou a sequencia amino ácido Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly. 0 fragmento que compreende a sequencia amino ácido N-terminal Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly é designada por rMRP-70.

peso molecular previsto para o fragmento designado por rMRP-70 é 64.714 mas por electroforese de gel poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), este peptideo migra como um peptideo de peso molecular aparente 70 kD quando comparado com proteínas marcadoras padrão.

Além disso, os derivados do invento são compostos derivados de um polipeptideo, mutante ou fragmento de acordo com o invento, em particular de MRP-160, um mutante ou um seu fragmento, em que os grupas funcionais, e.g. grupos amino, hidroxi, mercapto ou carboxi, são derivatizados, e.g. g1icosilados, acilados, amidados ou esterifiçados. Nos derivados glicosilados um resíduo carbohidrato ou um oligosacarideo é ligada a aspargina, serina e/ou treonina. Os derivados acilados são substituidos pelo grupo acilo de um ácido orgânico ou inorgânico de ocorrência

-7natural, e.g. ácida fórmico, ácido acética, ácida fosfórica au ácido sulfurico, nos grupos aminD, em especial o grupo amino N-terminal, ou nos grupos hidroxi, em especial de tirosina ou serina. Esteres são os de alcoóis de ocorrência natural, e.g. de metanol ou etanol. Preferidos são os derivados do invento que são gliCDlisados.

Derivados adicionais do invento são sais, em especial os sais farmaceuticamente aceitáveis, tal como sais de metal alcalino e metal alcalino terroso, e.g. sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio ou de zinco, ou sais de amónio formados com amónia ou com uma amina organica apropriada, tal como uma alquilamina inferior, e.g. trietilamina, hidroxi-alquilamina inferior, e.g. 2-hidroxieti1amina, e análogos.

Preferidos são os derivados de polipeptideos do invento com um peso molecular aparente de 190 kD ou com um peso molecular aparente de 140 kD os quais são produzidos por células transfectadas ou células naturais tal como células endoteliais. Eles podem ser observados por métodos padrão tal como manchas Western.

invento também diz respeito a processos para a preparação de polipeptideos os quais são mediadores ou precursores de mediadores de inflamação, i.e. polipeptideos naturais, recombinantes ou sintéticos, e derivados de acordo com o invento.

Numa execução do invento, tais compostos são preparados por um processo em que uma solução contenda os polipeptideos ou derivados de acordo com o invento, por exemplo um extracto celular opcionalmente pre-purifiçado, célula sobrenadante ou filtrado cultura de leucócitos humanos normais estimulados ou de microorganisflios geneticamente edificados ou linhas continuas de células de mamiferos, é purificada por métodos cromatográficos e,

-8quando necessário, os compostos são isolados e convertidos nos seus derivados.

Os extractos celulares, células sobrenadantes ou filtrados cultura de leucócitos humanos normais estimulados contendo polipeptideos naturais do invento são preparados como descrito por exempla para o MIF na Aplicação da Patente Europeia O 162 812. Em particular, as células mononucleares humanas normais são estimuladas para produzir linfóquinos por adjuntos normais, por exemplo concanavalin A ou fitohemaqlutinina, e são cultivadas de acordo com os métodos usuais. Opcionalmente, os extractos celulares, células sobrenadantes ou filtrados cultura são a seguir pre-purifiçados por cromatografia de imunoafinidade.

Os métodos cromatográficos contemplados para a preparação dos compostos desejados são a cromatografis de permutação iónica, cromatografia liquida de fase inversa de alta resolução, filtação por gel, cromatografia de exclusão da tamanho, cromatografia de (imuno)afinidade, cromatografia sobre hidroxilapatite, cromatografia de interacção hidrofóbica, e análogos.

Um material suporte apropriado para a cromatografia de permutação iónica pode ser de origem organica ou inorgânica, e.g. agarose de ligação cruzada, dextran, poliacrilamida, copolimero de estireno-divinilbenzeno, celulose, ou anólogos. Este material suporte transporta grupos funcionais básicos, e.g. funções amino terciário, grupos amónio quaternário ou grupos ácidos funcionais, e.g. resíduos de ácido carboxilico ou sulfónico. Exemplos de permutadores iónicos preferidos são os que tem grupos funcionais dietilaminoetil (DEAE) ou grupos funcionais dieti1-2-hidroxipropilamonioetil e os que tem os grupos funcionais sulfoprapil (SP) ou carboximetil (CM), ligados a suportes próprios quer para cromatografia liquida normal, proteína liquida de proteína rápida (FPLC) ou cromatografia liquida de alata resolução (HPLC). As separações e purificações com cromatografia de permutação iónica são efectuadas seguindo processos estabelecidos, e.g. em soluções tampão aquosas de pH 5 a pH 9 contendo quantidades crescentes de sal, por exemplo cloreto de sódio.

material do suporte próprio para filtração por gel ou cromatografia por exclusão do tamanha inclui dextran de ligação cruzada, agarose, poliacrilamida apropriadamente modificada ou silica, e análogos. Opcionalmente estes suportes são modificadas com substituintes que apresentam funções hidroxi, e.g. com grupos 1-hidroxi- ou 1,2-dihidroxi-alquil inferior. Tal filtração por gel ou cromatografia por exclusão do tamanho pode ser efectuada numa coluna própria para cromatografia liquida normal, FPLC ou HF’LC como acima usando soluções aquosas tampão a um pH à volta da neutralidade contendo quantidades variáveis de sais, e.g. cloreto de sódio.

A cromatografia de fase inversa é efectuada sobre um material suporte à base de silica contendo grupos hidrofóbicos, e.g. grupos alquil de 1 a 20 átomos de carbono, de preferencia 4, 8, 12 ou 18 átomos de carbono ou misturas de grupos alquil de 1 a 8 ou 12 e 18 átomos de carbono, respectivamente, ou grupos fenil. Relacionado com este método está a cromatografia hidrofóbica de interacção, em que usamos agarose ou um material relacionado revestido com grupos alquil de até 12 átomos de carbono e/ou grupos fenil. Estas técnicas cromatográficas são aplicadas usando FPLC ou HPLC. Os solventes para o processamento dos polipeptideos do invento sobre material de fase inversa à base de silica são ácidos aquosos, e.g. ácido trifluoroacético aquosa, contendo quantidades crescentes de um solvente orgânico polar, não miscivel em água, e.g. acetonitrilo, alcoóis inferiores, e.g. metanol,

etanol ou propanol, tetrahidrofurano, e análogos, de preferencia acetonitrilo.

A afinidade cromatogáfica é também contemplada para a purificação dos polipeptideos do invento, usando um material suporte apropriado, e.g. agarose de ligação cruzada, dextran ou poliacrilamida contendo moléculas com alta afinidade para um polipeptideo ou um derivado do invento, mutantes, fragmentos ou seus derivados, por exemplo contendo anticorpos, em particular anticorpos policlonal e monoclonal (MAbs) tal como MAbs especifico para MIF humano.

Os métodos cromatográficos preferidos são a cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de permutação iónica com suportes que contem grupos sulfopropil e cromatografia de fase inversa de alta resolução (HPLC).

Os compostos de invento são isolados pelas técnicas usuais, por exemplo filtração ou ultrafi1 tração, diálise, dissolução e precipitação num sal apropriado ou soluções tampão e misturas de solventes, evaporação do solvente, 1iofi1ização, e análogos.

Os mutantes do invento são formados por mutações espontâneas ou quimicamente induzidas ao nivel da DNA ou por substituição dos amino ácidos por sintese quimica.

Os fragmentos do invento são formados por mutações espontâneas ou quimicamente induzidas ao nivel da DNA, pelo que um tripleto que codifica um amino ácido é mudado para codão stop, ou ao nivel do peptideo por ligações quimica ou enzimáticamente clivadas. As enzimas próprias para a preparação de fragmentos do invento são por exemplo proteases. Por exemplD, podemos adicionar

-11papaina, tripsina, α-quimotripsina, termolisina, pepsina, sutilisina, endoproteinase Lys-C a partir de Lysobacter enzydioqenes, protease V8 a partir de Staphylococcus aureus ou proteases relacionadas, a uma solução do polipeptideo do invento, e a mistura de fragmentos resultantes pode ser separada por métodos cromatográficos, e.g. por filtração por gel e/ou HPLC de fase inversa.

Os extractos, células sobrenadantes e filtrados cultura de miocroorganismos geneticamente equipados ou linhas continuas de células de mamíferos contendo polipeptideos recombinantes do invento ou seus derivados de acordo com o invento são obtidos por técnicas DNA recombinantes e pre-purifiçados como acima descrito. Em particular, os polipeptideos e seus derivados de acordo com o invento podem ser preparados por cultura de células hospedeiro transformadas expressando polipeptideos do invento ou seus derivados sob condições que permitem a espressão de plipeptideos heterólogos, e quando necessário, isolamento dos compostos desejados e/ou sua conversão nos seus derivados. As etapas envolvidas na preparação dos polipeptideos e derivados do invento por técnicas DNA recombinantes serão discutidas com mais detalhe a seguir.

Noutra execução do invento, os polipeptideos e seus derivados de acordo com o invento, em particular os fragmentos, são sintetizados por métodos químicos, e.g. por reacções de condensação como descrito par exemplo por M. Bodanszky, Principies of Peptide Synthesis (Springer 1984). Os fragmentos são sintetizados e.g. por um método de fase sólida, em que um amino ácido N-protegido é acoplado a uma resina apropriada, o grupo de protecção é removido, um segundo amino ácido N-protegido é condensado com o grupo amino do primeiro amino ácido, e repetimos o ciclo de desprotecção/condensação com mais amino ácidos

N-protegidos até estar completo o resíduo peptideo do composto desejado, e finalmente este resíduo peptideo é clivado a partir da resina e desprotegido. Analogamente, podemos usar os oligopeptideos curtos N-protegidos em vez de amino ácidos simples N-protegidos. São bem conhecidas na arte as resinas apropriadas, os grupos de protecção, os reagentes de condensação e a s condições de reacção.

invento diz também respeito ao código das DNAs para um polipetideo do invento ou para os seus derivados, em mutantes de tais DNAs, e.g. DNAs em que são mutados um ou mais, em especial um, dois, tres ou quatro, nucleótidos, e a fragmentos de tais DNAs compreendendo pelo menos 15 nucleótidos.

Por definição, tais DNAs compreendem o código de DNAs de cadeia simples, DNAs de cadeia dupla formadas pelo referido código DNAs e além disso aos DNAs complementares, ou estes próprios DNAs complementares (de cadeia simples).

Em particular, o invento diz respeito a um código DNA para MRP-160 de uma sequencia nucleótida dada na SEQ ID ND: 1, e mutantes e fragmentas de tal DNA.

Em particular, o invento diz respeito a um fragmento DNA o qual compreende os nucleótidos 2765 a 4414 de um DNA de uma sequencia nucleótida dada na SEQ ID NQ: 1.

invento diz também respeito a DNAs que hibridizam com um DNA, seu mutante ou fragmento de acordo com o invento.

Além disso, o invento diz respeito a DNAs, seus mutantes ou fragmentos de acordo com o invento que são de origem genómica.

Os DNAs do invento podem ser preparados por exemplo por cultura de um hospedeiro transformado e, quando necessário, isolamento a partir dai do desejado DNA, ou por sintese quimica através da condensação nucleótida.

Em particular, tais DNAs podem ser preparadas por do desejado mRNA, por expressão num

a) isolamento de mRNA a partir de células apropriadas, por exemplo leucócitos mononucleares humanos ou células epiteliais embriónicas de pulmão humano, selecção

e.g. por hibridização com uma sonda DNA ou sistema de expressão apropriado e triagem para a expressão do polipeptideo desejado, preparação de cDNA de cadeia única ou simples, complementar da do mRNA, e a seguir a partir dele o cDNA de cadeia dupla, ou

b) isolamento do cDNA a partir de uma biblioteca cDNA, e.g. usando uma sonda DNA ou usando um sistema de expressão apropriado e triagem para a expressão do polipeptideo desejado, ou

c) isolamento do DNA genómico a partir do tecido humano apropriado, e.g. células da placenta ou do figado do feto, e selecção do desejado DNA, e.g. usando uma sonda DNA ou usando um sistema de expressão apropriado e triagem para a expressão do polipeptideo desejado, e

d) incorporação do DNA de cadeia dupla da etapa a), b) ou c) num vector de expressão apropriado,

e) transformação das células hospedeiro apropriadas o vector hibrido obtido, com

f) selecção das células hospedeiro transformadas as quais contem o DNA desejado a partir de células hospedeiro não transformadas, e, quando necessário,

g) isolamento do DNA desejado e/ou conversão num seu fragmento ou mutante.

RNA mensageiro (etapa a) poliadenilado é isolado a partir de células apropriadas, e.g. leucócitos mononucleares humanos ou células epiteliais embriónicas de pulmão humano, por métodos conhecidos. Por exemplo, os leucócitos podem ser derivados de sangue humano fresco, e.g. coágulos brancas formadas por células brancas do sangue, ou por leucócitos de uma linha continua de células que foi expandida na cultura. Ds métodos de isolamento envolvem, por exemplo, homogenisação de leucócitos estimulados na presença de um detergente e de um inibidor ribonuclease, e.g. heparina, isotiocianato de guanidina ou mercaptoetanol, extracção do mRNA com misturas clorofórmio-fenol apropriadas, opcionalmente na presença de sal e soluções tampão, deter— gentese/ou agentes quelantes catiónicDS, e precipitação do mRNA a partir da fase aquosa remanescente, contendo o sal, com etanol, isopropanol ou análogos. 0 mRNA isolado pode ser ainda purificado por centrifugação num gradiente de cloreto de césio seguido por precipitação por etanol e/ou por métodos cromatográficos, e.g. cromatografia de afinidade, por exemplo cromatografis de oligo(dT) celulose ou sobre olido(U) sefarose. De preferencia, tal mRNA purificada total é fraccionada de acordo com o tamanho por j centrifugação por gradiente, e.g. num gradiente linear de sacarose, ou cromatografia em colunas de fraccionamento de tamanho apropriado, e.g. sobre gels agarose.

-15— mRNA desejada é seleccionado por triagem directamente do mRNA com uma sonda DNA, ou por translação em células apropriadas ou sistemas sem células e triagem dos polipeptídeos obtidos.

A selecção do mRNA desejado é de preferencia efectuada usando uma sonda de hibridização DNA, evitando assim a etapa adicional de translação. Sondas DNA apropriadas são DNAs de sequencia nucleótida conhecida consistindo de pelo menos 17 nucleótidos, por exemplo DNAs sintéticos, cDNAs derivados do código mRNA para os polipeptídeos desejados numa espécie animal cuja DNA apresenta uma sequencia de homologias com DNA humano, ou fragmentos de DNA genómico compreendendo e.g. sequências DNA adjacentes as quais são isoladas de uma fonte natural ou de um microorganismo geneticamente edificado.

As sondas DNA sintéticas são sintetizadas de acordo com métodos conhecidos como se detalha a seguir, de preferencia por condensação por etapas usando o método de fosfotriester em fase sólida, o método de triester fosfito ou o método fosforamidite, e.g. a condensação das unidades de acoplamento dinucleótido pelo método fosfotriester. Estes métodos são adaptados à síntese de misturas dos oligonucleótidos desejados pelo uso de misturas de dois, tres ou quatro nucleótidos dA, dC, dG e/ou dT na forma protegida ou as unidades de acoplamento dinucleótido correspondente na etapa de condensação apropriada como descrito por Y. Ike et al . (Nucleic Acids Research 11. 477, 1983) .

Para hibridização, as sondas DNA são etiquetadas, e.g. radioactivamente etiquetadas pela bem conhecida reacção de quinase. A hibridização do mRNA de tamanho fraccionado com as sondas DNA contendo uma etiqueta, é efectuada de acordo com processos conhecidos, i.e. em soluções de sal e tampão contendo adjuntos, e.g. queladores de cálcio, compostos reguladores da

viscosidade, proteínas, DNA irrelevante e análogas, a temperaturas que favorecem a hibridização, e.g. entre 0°C e 80°C, por exemplo entre 25*C e 50°C ou cerca de 65°C, de preferencia cerca de 20°C menos do que a temperatura de fusão do híbrido DMA de dupla cadeia.

□ mRNA fraccionado pode ser transformado em células, e.g. oócitos de rã, ou em sistemas sem células, e.g. lisatos reticulócitos ou extractos de germen de trigo. Os polipeptideos obtidos são triados em relação à sua actividade mediadora ou por reacção com os anticorpos que crescem contra o mediador nativo, e.g. num ensaio de imunidade, por exemplo ensaio de imunidade ao rádio, ensaio de imunidade à enzima ou ensaia de imunidade com marcadores fluorescentes. Tais ensaios de imunidade e a preparação dos anticorpos policlonal e monoclonal são bem conhecidos na arte e são por consequência aplicados.

A preparação de um DNA complementar de cadeia simples (cDNA) a partir do molde de mRNA é bem conhecida na arte, como é a preparação de um DNA de dupla cadeia a partir do DNA de cadeia simples. 0 molde de mRNA é incubado com uma mistura de trifosfatos deoxinucleósidos, opcionalmente trifDsfatos deoxinucleósidos radioactivamente etiquetados ( a fim de ser capaz de triar o resultado da reacção), uma sequencia iniciadora tal como um resíduo de hibridização oligo-dT com a cauda poli(A) do mRNA e uma enzima apropriada tal como transcriptase inversa e.g. a partir do vírus avian mieloblastosis <AMV). Após a degradação do molde mRNA e.g. por hidrólise alcalina, a cDNA ê incubada com uma mistura de trifosfatos deoxinucleósidos e uma enzima apropriada para obtermos um DMA de cadeia dupla. As enzimas apropriadas são por exemplo uma transcriptase inversa, o fragmento Klenow de E. coli polimerase DNA I ou polimerase T4 DNA. Normalmente, uma estrutura em ansa na forma de gancho do cabelo formada — 17— espontaneamente pelo cDNA de cadeia simples actua como um iniciador da síntese da segunda cadeia. Esta estrutura em gancho decabelo é removida por digestão com nuclease SI. Alternativamente, o extremo 3'do DNA de cadeia simples é primeiro extendido por caudas homopoliméricas deoxinucleótidos antes da hidrólise do molde de mRNA e a sintese subsequente da segunda cadeia cDNA.

Em alternativa, o cDNA de cadeia dupla é isolado a partir de uma biblioteca cDNA e triado para o desejado cDNA (etapa b) . A biblioteca cDNA é construída por isolamento do mRNA a partir de células apropriadas, e.g. leucócitos mononucleares humanos ou células embriónicas epiteliais de pulmão humano, e preparar a partir dai o cDNA de cadeia simples e de cadeia dupla como acima descrito. Este cDNA é digerido com endonucleases de restrição apropriados e incorporado na fago λ-, e.g. charão > 4A ou X gt 11 seguindo os processos estabelecidos. A biblioteca cDNA reproduzida sobre membranas de nitrocelulose é triada pelo uso de uma sonda DNA como antes descrito, ou expressa num sistema de expressão apropriada e os polipeptideos obtidos são triados por reacção com um anticorpo especifico para os compostos desejados, e.g. um anticorpo especifico para o MIF humana.

Como uma alternativa adicional, o DNA genómico pode ser isolado e triado em relação ao DNA desejada (etapa c). 0 DNA genómico é isolado a partir de tecido humano apropriado, de preferencia a partir de placenta humana ou de células de figado de feto humano, de acordo com métodos conhecidos na arte. Preparamos a partir dai uma biblioteca DNA genómica por digestão com endonucleases de restrição apropriadas, e.g. Alui e HaelII, e incorporação na fago V, e.g. charão > 4A ou 1 gt 11, seguindo processos estabelecidas. A biblioteca DNA reproduzida sobre membranas de nitrocelulose é triada com uma sonda DNA como antes — 18—

descrito, ou expressa num sistema de expressão apropriado e os polipeptideos obtidos triados como antes descrito.

São conhecidos uma variedade de métodos na arte para a incorporação de cDNA de cadeia dupla ou DNA genómica num vector apropriado (etapa d). Por exemplo, podemos adicionar extensões de homopolimeros complementares aos DNA de cadeia dupla e o vector DNA por incubação na presença de trifosfatos deoxinucleósido correspondentes e uma enzima tal como transferase deoxinucleósido terminal. 0 vector e o DNA de cadeia dupla são a seguir juntos por parelha de base entre as caudas homopoliméricas complementares e finalmente ligados por enzimas de ligação especifica tal como ligases. Outras possibilidades são os ligadores sintéticos de adição ao terminus da dupla cadeia DNA, ou a incorporação da DNA de cadeia dupla no vector de ligação atenuada ou de extrema alternado. Os vectores apropriados serão descritos em detalhe a seguir.

A transformação das células hospedeiro apropriadas com o vector hibrido obtido (etapa e) e a selecção das células hospedeiro transformadas (etapa f) são bem conhecidas na arte e são a seguir descritas em mais detalhe. Os vectores híbridos e as células hospedeiro podem ser particularmente apropriadas para a produção de DNA, ou então para a produção dos polipeptideos desejados.

isolamento do DNA desejada, seus fragmentos e mutantes de acordo com o invento é obtido por métodos conhecidos na arte, e.g. extracção com fenol e/ou clorofórmio. Opcionalmente, o DNA pode ser ainda manipulado e.g. por tratamento com agentes mutagénicos para obter mutantes, ou por digestão com enzimas de restrição para obter fragmentos, modificar uma ou ambas as partes

-19— terminais para facilitar a incorporação num vector, remoção das sequências intervenientes e análogos.

A sequencia nucleótida de um DNA de acordo com o invento pode ser determinada por métodos conhecidos per se. por exemplo pelo método de Maxam-Gilbert usando DNA de cauda etiquetada ou pelo método de acabamento da cadeia dideoxi de Sanger.

A preparação de um DNA, seu mutante ou derivada de acordo com o invento pode também ser efectuada por meio de sintese quimica. Os métodos apropriados para a sintese de DNA tem sido apresentados na forma resumida por S.A. Narang (Tetrahedron 39. 3, 1933). As técnicas de sintese conhecidas permitem a preparação de polinucleótidos com até 40 bases de comprimento, com bom rendimento, pureza elevada e num tempo relativamente curto. Ds nucleótidos protegidos apropriados são ligados uns aos outros pelo método do fosfodiester (K.L. Agarwal et al. , Angew. Chemie 84, 439, 1972), o método do fosfotriester mais eficiente (C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972), o método fosfito triester (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soe. 98, 3655, 1976) ou o método fosforamidite (S.L. Beaucage e M.H. Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). A simplificação da sintese dos oligonucleótidos e dos polinucleótidos é tornada possível pelo método de fase sólida, no qual as cadeias nucleótidas são ligadas a um polímero apropriada. H. Rink et al. (Nucl. Acids Research 12, 6369, 1984) usam trinucleótidos em vez de nucleótidos individuais e liga-os pelo método do fosfotriester na sintese em fase sólida. Podemos assim preparar um polinucleótido com até 67 bases, em pouco tempo e com bons rendimentos. A DNA real de dupla cadeia é enzimáticamente edificada a partir de oligonucleótidos de sobreposição quimicamente preparados de ambas as cadeias DNA, as quais são mantidas em conjunto no arranjo correcto à base do par, e são a seguir quimicamente ligadas pela enzima ligase DNA.

-20□utra possibilidade compreende a incubação de oligonucleótidos de sobreposição simples a partir de duas cadeias DNA na presença dos quatro trifosfatos deoxinucleótidos necessários com uma polimerase DNA, por exemplo polimerase DNA I, o fragmento Klenow de polimerase I ou polimerase Ta DNA, ou com transcriptase inversa AMV (avian myeloblastosis virus). Os dois oligonucleótidos são assim mantidos em conjunto no arranjo correcto à base do par e são suplementadas com os nucleótidos necessários para que a enzima forneça uma DNA completa de dupla cadeia (S.A. Narang et al . , Anal. Biochem. 121356, 1982).

invento fornece ainda vectores híbridos compreendendo um DNA, seu fragmento ou mutante como acima definido, codificação para um polipeptideo ou um derivado de acordo com o invento operativamente ligado a sequências de control de expressão. Particularmente preferidos são os vectores híbridos compreendendo um DNA de SEQ ID NO: 1, um seu derivado ou mutante, ou um fragmento DNA formado pelos nucleótidos 2765 a 4414 de um DNA de SEO ID NO; 1, operativamente ligado a sequências de control de expressão.

Os vectores híbridos do invento fornecem a duplicação e expressão do DNA desejado num hospedeiro apropriado, quer como um elemento extracromossomático ou por integração num cromossoma hospedeiro. Estão disponíveis vários sistemas vectores possíveis para integração e expressão do DNa clonado do invento. Em principio, são apropriadaos todos os vectores que duplicam e expressam o gene polipeptideo desejado de acordo com o invento no hospedeiro escolhido. 0 vector é seleccionado dependendo das células hospedeiras previstas para a transformaçãD. Em geral, tais células hospedeiras podem ser microorganismos procarióticos ou eucarióticos tal como bactérias ou fermentos, ou células de origem eucariótica superior tal como células de vertebrados, em

particular mamíferos. As células hospedeiro apropriadas serão a seguir descritas em detalhe. Em principio, os vectores hibridos do inventa compreendem o DNA como antes definido, uma origem da duplicação de uma sequencia autonomamente duplicante, sequências marcadoras dominantes, sequências de control de expressão essenciais para a transcrição e translação do DNA desejado e, opcionalmerite, sequências de sinalização e locais de restrição adicionais.

Uma origem da duplicação ou uma seaquencia autonomamente duplicante (um elemento DNA que confere capacidades autonomamente duplicantes a elementos extracromossomáticos) ê fornecida quer por construção do vector para incluir uma origem exógena tal como derivada de um vírus Simian (SV 4©) ou outra fonte virai, ou pelos mecanismos cromossomáticos de célmulas hospedeiras.

Os marcadores permitem a selecção de células hospedeiras que contem o vector. A selecção de marcadores inclui genes que conferem resistência aos metais pesados tal como cobre ou a antibióticos tal como tetracic1ina, ampicilina, geneticina (0-418) ou higromicina, ou genes que complementam uma lesão genética das células hospedeiro tal como a ausência de quinase timidina, transferase hipoxantina fosforilo, reductase dihidrofolato, ou análogos.

Como sequências do control de expressão, o vector DNA compreende um promotor, i.e. uma sequencia DNA que dirige a polimerase RNA para se ligar ao DNA e para iniciar a sintese RNA, ligação dos locais ribosomais, i.e. sequências necessárias para a iniciação da translação, transcrição e sinais de terminação da translação e sequências necessárias para a estabilização do mRNA, e, opcionalmente, sequências ampliadoras e regulatórias adicionais.

-22Podemos empregar uma ampla variedade de sequências promotoras, dependendo da natureza da célula hospedeira. Os promotores que são fortes e ao mesmo tempo bem regulados são os mais úteis. As sequências para a iniciação da translação são por exempla as sequências de Shine-Dalgarno. As sequências necessárias para a iniciação e terminação da transcrição e para estabilização do mRNA são normalmente disponíveis a partir de regiões 3'e 5'não codificadas, respectivamente, de cDNAs virais ou eucarióticas, e.g. a partir do hospedeiro de expressão. Os ampliadores são sequências DMA estimulaoras da transcrição origem virai, e.g. derivados de virus Simian, vírus de papilloma do boi ou virus de sarcoma origem genómica.

de virus polyoma, de Moloney, de

As sequências sinalizadoras podem ser, por exemplo, uma pre-sequencia ou guia secretaria que conduz à secereção do polipeptideo, sinais de união, ou análogos.

Os vários segmentos DNA do vector DNA são operacionalmente ligados, i.e. eles são contiguos e colocados numa relação funcional uns com os outros.

Exemplos de vectores que são próprios para duplicação e expressão numa estirpe E. coli são os bacteriofagos, por exemplo os derivados de bacteriofagos X, ou plasmideos, tal como, em particular, o plasmideo ColEl e seus derivados, por exemplo pMB9, pSF2124, pBR317 ou pBR322 e plasmideos derivados de pBR322, tal como pUC9, pUCKO, pHRil48 e pLc24. Os vectores apropriados contem uma duplicação completa, um gene marcador, sequências de reconhecimento para endonucleases de restrição, de tal modo que a DNA estranha e, se necessário, a sequencia de control de expressão pode ser inserida nesses locais, e opcionalmente sequências de sinalização e ampliadoras.

Os promotores microbianos são, por exemplo, o promotor esquerdo forte P do bacteriofago X o qual é controlado por um repressor sensivel à temperatura. Também apropriados são os promotores E. coli tal como o promotor lac (lactose) regulado pelo repressor lac e induzido pelo isopropil-|5-D-tiogalactósido, o promotor trp (triptofan) regulado pelo repressor trp e induzido e.g. por falta de triptofan, e o tac (hibrido trp—promotor lac) regulada pelo repressor lac. Os vectores preferidos são os que contem o promotor P^ do bacteriofago X.

Os vectores que são próprios para a duplicação e expressão em fermento contem um iniciador da duplicação do fermento e um marcador genético selectivo para o fermento. Um grupo de tais vectores inclui as chamadas sequências ars (sequências de duplicação autónoma) como a origem da duplicação. Estes vectores são retidos extracromassomáticamente dentro da célula de fermento após a transformação e são duplicados autonomamente. Além disso, podemos usar os vectores que contem parte ou a totalidade do plasmideo DNA 2μ (2 micron) de Saccharomyces cerevisiae. Tais vectores serão integrados por recombinação em plasmideos 2μ que já existem dentro da célula, ou duplicam-se automáticamente. As sequências 2μ são particularmente apropriadas quando se pretendem obter uma frequência de transformação elevada e grande número de cópias.

As sequências de control de expressão que são próprias para expressão em fermento são, or exempla, as de genes de fermento altamente expressos. Assim, podemos usar os promotores do gene TRP1. o gene ADHI ou ΑΡΗII. gene de ácido fosfatase (PH05 ou PHQ5). gene isocitocromo ou um promotor envolvido com a via glicolitica, tal como o gene promotor da enolase, gliceraldeido-3-fosfato quinase (PGK). hexoquinase, descarboxilase de piruvato, fosfofructoquinase, glicose-ó-fosfato isomerase

3-fosfog1icerato mutase, piruvato quinase, trisefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glucoquinase.

Os vectores próprios para a duplicação e expressão em células de mamíferos são de preferencia fornecidas com sequências de promoção derivadas de DNA de origem virai, e.g. de virus Simian 40 (SV 40), virus sarcomo Rous (RSV), adenovirus 2, virus de papilloma de boi (BF'V), mutante de papovavirus BK (BKV) , ou citomegalorius do rato ou do homem (CMV). Alternativamente, os vectores podem ser formados por promotores de produtos de expressão de mamíferos, tal como actina, colagénio, miosina, etc., ou por promotor nativo e sequências de control que são normalmente associadas com a sequencia de gene desejada. Por exemplo, o plasmideo pode conter a unidade ampliadora do citomegalovirus imediato principal do rato ou do homem-gene inicial, o ampliador SV 40 em conjunto com o promotor α-globina humana, e/ou além disso os promotores induziveis, tal como os derivados dos genes de choque térmico ou metallothionein. Os vectores preferidos são os que contem o promotor citomegalovirus murina.

Os vectores híbridos preferidos do invento são os vectores híbridos do plasmideo pUCKO ou do plasmideo pP^mu-bio. Também preferidas são os vectores designados par pMRPÍó©, pMRP160_e>, e pMRP70_pL.

Além disso, a invento diz respeito a células hospedeiro transformadas expressando os polipeptideos e derivadas do invento, em particular células hospedeiro transformadas com um vector hibrido de acordo com o invento. Tais células hospedeiro são geneticamente estáveis e podem ser activadas a partir de culturas a baixa congelação por degelo e re-clonagem.

Exemplos de hospedeiros apropriadas são os microorganismos que são desprovidos ou tem poucas enzimas de restrição ou enzimas de modificação, tal como bactérias em particular estirpes de Escherichia coli, por exemplo E. cdIí X177Ó, E. coli Y1090, E. coli HB ΙΟΙ, E. coli W3U0, E. coli HB 101/LM1035, E. coli JA 221, E. coli DH5a ou E. coli Kl2, Bacillus subtilis. Bacillus stearotherffiophilus, Fseudomonas, Haemophilus, Streptococcus e outras, e fermentos, por exemplo Saccharomyces cerevisiae tal como S. cerevisiae GRF 18. Outras células hospedeiro apropriadas são células de organismos superiores, em particular linhas estabelecidas de células continuas humanas ou animais, e.g. fibroblastos embriónicos de pulmão humano L 132, células de melanoma Bowes maligno humano, células HeLa, células dei virus SV 4Θ de rim transformado do macaco verde Africano COS-7 ou células do ovário de criceto Chinês (CHO).

As estirpes E. coli acima mencionadas, em particular E. coli K 12, e a scélulas dos ovários de criceto Chinês (CHO) são as preferidas como hospedeiros.

invento também diz respeito a processos para a preparação de células hospedeiro transformadas em que uma célula hospedeiro apropriada como acima descrito é transformada com um vector hibrido de acorda com o invento, e as células transformadas são seleccionadas.

descrito et al. , subtilis para E.

A transformação dos microorganismos é efectuada como na literatura, por exemplo para S. cerevisiae (A. Hinnen Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75» 1929, 1978), para B.

(Anagnostopoulos et al. , J. Bacteriol. 81, 741, 1961), e coli (M. ManrJel et al . ,

159, 1970).

-26Par consequência, o processo de transformação das 2+ células E. coli inclui, por exemplo, o pre-tratamento por Ca das células de modo a permitir o consumo de DNA, e incubação com o vectar hibrido. A subsequente selecção das células transformadas pode ser conseguida, por exemplo, por transferencia das células para um meio de crescimento selectivo o qual permite a separação entre as células transformadas e as células origem dependendo da natureza da sequencia marcadora do vector DNA. De preferencia, usamos um meio de crescimento que não permite o crescimento de células que não contenham o vector. A transformação do fermento compreende, por exemplo, as etapas de remoção enzimática da parede da célula de fermento por meio de glucosidases, tratamento dos esferoplastos obtidos com o vector na preseno+ ça de polietileno glicol e iões Ca*^- , e regeneração da parede da célula por embebição dos esferoplastos na agar. De preferencia, o agar de regeneração é preparado de maneira a permitir ao mesmo tempo a regeneração e selecção das células transformadas, como acima descrito.

A transfarmação das células de origem eucariótica superior, tal como linhas de células de mamíferos, é de preferencia conseguida por transfecção. A transfecção é efectuada por técnicas convencionais, tal como precipitação por fosfata de cálcio, microinjecção, fusão do protoplasta, electroporação, i.e. introdução do DNA por um impulso eléctrico curto o qual aumenta transientemente a permeabi1 idade da membrana da célula, ou em presença de compostos auxiliares tal como dietilaminoetildextran, dimetil sulfóxido, glicerol ou polietileno glicol, e análogos. Após o processo de transfecção, as células transfectadas são identificadas e seleccionadas e.g. por cultura num meio selectivo escolhido dependendo da natureza do marcador de selecção, por exemplo o meio de cultura padrão tal como o meio Eagle modificado de Dulbecco's (DMEM) , meio essencial minimo, meio RF'MI 1640 e análogos, contendo e.g. o antibiótico correspondente.

As células hospedeiro transformadas são cultivadas por métodos conhecidos na arte num meio liquido contendo fontes de carbono assimilável, e.g. hidratos de carbono tal como glicose ou lactose, azoto, e.g. amino ácidos, peptideos, proteinas ou seus produtos de degradação tal como peptonas, sais de amónio ou análogos, e sais inorgânicos, e.g. sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. 0 meio contem além disso, por exemplo, substancias promotoras do crescimento, tal como traços de elementos, par exempla ferro, zinco, managanésio e análogos.

meio é de preferencia escolhido de modo a exercer uma pressão de selecção e a evitar o crescimento de células que não foram transformadas ou que tenham perdido o vector hibrido. Assim, por exemplo, juntamos um antibiótico ao meio se o vector hibrido contiver como marcador um gene de resistência antibiótico. Se, por exemplo, usamos uma célula hospedeiro que é auxotróf.ica num amino ácido essencial, ao passo que o vector hibrido contem um gene de codificação de uma enzima o qual complementa a deficiência do hospedeiro, usamos um meio com uma deficiência mínima de amino ácido para cultivar as células transformadas.

As células de origem eucariótica superior, tal como linhas de células de mamíferos crescem sob condições de cultura dos tecidos usando meios comercialmente disponíveis, por exemplo o meio Eagle modificada de Dulbecco's (DMEM), meio essencial minimo, meio RF‘MI 1640 e análogos, opcionalmente suplementados com substancias promotoras do crescimento e/ou soros de mamíferos. As técnicas de cultura das células sob condições de cultura dos tecidos são bem conhecidas na arte e incluem culturas de

suspensão homogénia, e.g. num reactor agitado por ar ou num reactor de agitador continuo, ou uma cultura de células imobilizadas ou aramadilhadas, e.g. em fibras ocas, microcápsulas, sobre micropéralas de agarose, pérolas de vidro poroso, cartuchos de ceramica, ou outros microsuportes.

A cultura é efectuada por processos que são bem conhecidos na arte. As condições de cultura, tal como a temperatura, valor do pH do meio e tempo de fermentação, são escolhidos de modo a obtermos um titulo máximo do polipeptideo ou do derivado do invento. Assim, uma estirpe E. coli ou fermento é de preferencia cultivada sob condições aeróbicas por cultura submersa com vibração ou agitação a uma temperatura de cerca de 20^8 a 40°C, de preferencia de cerca de 30°C, e um valor pH de 4 a 8, de preferencia a cera de pH 7, durante cerca de 4 a 30 horas, de preferencia até atingirmos os rendimentos máximos do polipeptideo ou derivado do invento.

Quando a densidade das células atingir um valor suficiente, a cultura é interrompida e podemos isolar o polipeptideo ou o derivado. Se o vector hibrido contiver um sequencia de sinal de secreção apropriado, o polipeptideo ou o derivado é expelido pela célula transformada directamente no meio de cultura. De outro modo, as células tem que ser destruídas, por exemplo por tratamento com um detergente tal como SDS, NP-40, Triton ou ácido deoxicólico, lisado com lisozima ou uma enzima que actua analogamente, ou destruídas por ultrasons. Se usarmos o fermento como microorganismo hospedeira, a parede da célula pode ser removida por digestão enzimática com uma glucosidase. Alternativa ou adicionalmente, podemos usar as forças mecanicas, tal como as tensões de corte (e.g. prensa Francesa, moinho de Dyno ou análogas) ou vibração com pérolas de vidro ou óxido de alumínio, ou congeleção alternada, por exemplo em azoto liquido, e

-29— descongelação, por exemplo de 30°C a 40^c-C, bem como ultra sons, para quebrar ou partir as células.

A célula sobrenadante ou a solução obtida após centrifugação da mistura obtida após partirmos as células, a qual ) contem proteínas, ácidos nucleicos e outros constituintes das células, é enriquecida em proteínas, incluindo os polipeptideos do invento, numa maneira que é conhecida per se. Assim, por exemplo, a maioria dos constituintes da não proteína são removidos por tratamento da polietileneimina e as proteínas incluindo y os polipeptideos e derivados dD invento são precipitados, por exemplo, por saturação da solução com sulfato de amónio ou com outros sais. Por outro lado, a célula sobrenadante ou lisato é directamente pre—purificado usando métodos cromatográficos como a seguir descrito.

Os polipeptideos e seus derivados de acordo com o invento são úteis para obtermos um melhor conhecimento do papel do sisteme fagócito mononuclear, isto é para definir o sinal linfoquina e a natureza da resposta celular a este sistema, em populações macrófagos.

Devido à actividade do seu mediador de inflamação, os polipeptideos e seus derivados de acordo com o invento podem ser usados para influenciar o processo inflamatório. Eles são portanto úteis para a terapia de condições inflamatórias crónicas.

Além disso, os polipeptideos ou derivados de acordo com o invento são úteis para o estudo, identificação e produção de antagonistas os quais podem ser usados como drogas anti-inflamatórias .

Ο inventa também diz respeito a composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptideo ou um derivado do invento e um suporte farmaceuticamente aceitável, e.g. um suporete sólido ou liquido, inorgânico ou orgânico.

As composições farmacêuticas de acordo com o invento são as de uso enteral, e.g. rectal ou oral, e de preferencia para admnistração parenteral, e.g. intranasal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa, a animais de sangue quente incluído o homem. Dependendo do método de admnistração pretendido, as composições farmacêuticas podem estar na forma de doses unitárias, por exemplo em ampolas, frascos, supositórios, drageias, pastilhas, cápsulas ou atomizadores nasais na forma sólida ou liquida.

A quantidade do composto terapeuticamente eficaz a ser admnistrado depende da condição do doente, tal como o peso do corpo, a natureza e severidade da doença e a condição geral e também do modo de admnistração, e é admnistrado de acordo com a opinião do médico que está a proceder ao tratamento. A dose efectiva de um polipeptideo do invento ou de um seu derivado é da ordem de grandeza de Ô,Ô01 a 1 pg por kg de peso do corpo por dia.

J

As composições farmacêuticas de acordo com d invento contem os suportes usuais inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis, opcionalmente em conjunto •y com outros compostos e/ou adjuvantes terapeuticamente eficazes.

Usamos de preferencia soluções ou suspensões do ingrediente activo, em especial soluções ou suspensões aquosas isotónicas, e também preparações liofilizadas as quais são dissolvidas em água pouco antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou conter preservativos, estabilizadores, agentes —31 —

molhantes, emulsionantes, solubilizantes, substancias que aumentam a viscosidade, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões, e também outras proteinas, por exempla preparações de albumina de soro humano ou de plasma de sangue humano.

Preferidas são as composições na forma de liposomas em dispersão aquosa contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptideo ou seu derivado. Há liposomas apropriados, tendo em particular, uma população de um tamanho tão homogénio — Θ quanto possivel com um diâmetro de aproximadamente 0,2 x 1© a 5,0 x 1© m formados por uma ou mais camadas duplas de componentes lipidos, por exemplo lipidos antipáticos tal como fosfolipidos, como a lecitina, cefalina ou ácido fosfatidico, e opcionalmente lipidos neutros, por exemplo colesterol, incluindo um interior aquoso contendo um polipeptideo ou derivado do invento. Preferidos são os liposomas formados por uma mistura de fosfatidilserina e fosfatidiIcolina sintéticos.

invento diz ainda respeita a anticorpos policlonais e monoclonais específicos dos polipeptideos do invento, ou a derivados de acorda com o invento, em particular anticorpos específicos para MRP-16©, para rMRP-7©, ou pra afragmentos de MRP-16©, ou derivados de tais anticorpos os quais retem a especificidade do anticorpo a partir do qual são derivados.

Os anticorpos policlonais do invento são de origem mamífera, e.g. do ratinho, rato, coelho, burro, cabra, ovelha, cavalo, porco, chimpanzé ou de origem humana, ou de origem avian, e.g. da galinha. Os anticorpos preferidos são os do ratinho, rato, coelho, cabra, ovelha ou da galinha, em particular os anticorpos do coelho ou seus derivados. Os anticorpos policlonais preferidos são específicos para o MRP-16©, para o rMRP-7© ou para fragmentos de MRP-16© compreendendo entre 12 e 3© amino ácidos consecutivos da SEQ ID NO: 1. Particularmente preferidos são os anticorpos policlonais específicos para o MRP-160, para o rMRP-70 ou para fragmentos de MRP-160 correspondendo aos amino ácidos 1189-1204, 1242-1255, 1409-1427, e 162-177, respectivamente, da SEQ ID NO: 1. Mais preferidos são os anticorpos policlonais do coelho específicos para o rMRP-70.

Preferidos são os anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos do invento ou para os derivados de acordo com o invento, em particular anticorpos monoclonais específicos para o MRP-160 ou para o rMRP-70, ou para fragmentos de MRP-160 ou derivados de tais anticorpos. Os anticorpos monoclonais do invento são de origem mamífera, e.g. de ratinhos, ratos ou de origem humana, de preferencia origem de ratinhos. Preferidos são os anticorpos monoclonais de ratinhos específicos para rMRP-70.

A especificidade de um anticorpo em relação a um polipeptídeo ou derivado do invento pode ser qualitativamente detectada num ensaio de imunidade com enzima em que os buracos de uin prato microtitulador são revestidos com o polipeptídeo, e a seguir tratados com o anticorpo a ser testado, e o anticorpo de ligação é detectada com um antisoro etiquetado dirigido contra o anticorpo. Por exemplo, a especificidade de um anticorpo monoclonal de ratinhos do invento é determinada num ensaio de iumunidade com enzima tipo sandwich em que os buracos de um prato microtitulador sãD revestidos com um anticorpo policlonal de coelho especifico para um polipeptídeo do invento, seguido pela próprio polipeptídeo, e a seguir tratado com o anticorpo a ser testado, e o anticorpo monoclonal ligado é detectado com antisoro etiquetado dirigido contra a parte constante dos anticorpos do ratinho.

Os derivados de um anticorpo do invento retem a especificidade do anticorpo a partir do qual derivam, i.e. eles retem a configuração de ligação caracteristica do anticorpo origem. Exemplos de tais derivados são ds fragmentos de anticorpos, conjugados dos anticorpos com uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador quimo luminescente, um quelatD mrtálico, partículas paramagnéticas, avidina, biotina ou análogos, ou anticorpos radioactivamente etiquetados.

Os fragmentos de anticorpo do invento são por exemplo os fragmentos univalentes univalentes Fab ou Fab'ou d fragmento divalente Fíab')^.

As enzimas usadas para conjugados anticorpo do invento são, por exemplo, peroxidase de rábano bravo, fosfatase alcalina, β-D-galactosidadse, glicose oxidase, glucoamilase, anidrase carbónica, acetilealinesterase, lisozima, malato desidrogenase ou g1icose-ó-fosfato desidrogenase.

Os marcadores fluorescentes conjugados com os anticor— pos do invento podem ser fluorescina, fluorocromo, rodamina, e análogos.

Os marcadores de quimo luminescência são e.g. esteres acridinium de luminol.

Em tais conjugados, o anticorpo está ligado directamente ao parceiro de conjugação ou por meio de um grupo espaçador ou acoplador.

Exemplos de queladores metálicos são o ácido etilenediaminotetracético (EDTA), áedo dietilenetriaminopentacético (DF’TA), 1,4,8,1 1-tetraazatetradecano, ácido 1,4,8,11 -tetraazatetradecano-1,4,8,11-tetracético, ácido l-oxa-4,7,12,15-tetrazaheptadecano-4,7,12,15-tetracético, ou análogos.

Os anticorpos radioactivamente etiquetados do invento contem e.g. iodo radioactivo (^^1, tricio (³H), carbono (^C), enxofre ('^jJS), itrio (^θΥ), tecnétio (^^mTc), ou análogos.

Os anticorpos policlonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se. por exemplo por um processo em que um mamifero ou uma ave apropriada é imunizada com um palipeptideo ou seu derivado de caordo com o invento tal como MRP-160. rMRP-70 ou fragmentos de MRP-160, opcionalmente na presença de um adjuvante, recolhemos o soro da sangue dos mamíferos imunizados ou ovos das aves imunizadase, quando necessário, os anticorpos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados.

Os mamíferos apropriados são os que reconhecem o anti gene, i.e. o polipeptideo ou seu derivado de acordo com o invento, na forma de uma molécula estranha, por exemplo ratinhos, ratos, coelhos, burros, cabras, ovelhsa, porcos ou cavalos. As aves apropriadas são as galinhas.

As vias de imunização incluem, entre outras, injecções intradermais, subcutâneas, intramusculares, intraperitoneais, intravasculares e intracranianas. Uma vez que desejamos altos titulos anticorpos, usamos normalmente uma série de injecções. A imunização é, por exempla, efectuada par injecção do anti gane, duas, tres, quatro ou mais vezes parenteralmente, e.g. intraperitonealmente e/ou subcutaneamente, em intervalos regulares ou irregulares de alguns dias, até vários meses, por exemplo quatro semanas.

□ anti gene pode ser misturada com adjuvantes, i.e. agentes que aumentarão ainda mais a resposta imune, no processo de imunização. Qs adjuvantes possíveis são o adjuvante completo de Freund (emulsão de óleo mineral, água, e extractos microbianos), adjuvante incompleto de Freund (emulsão de óleo e água sómente), gels de hidróxido de alumínio, etc.

A resposta imune do mamífero é de preferencia controlada por um ensaio anticorpo apropriado, e.g. um ensaio de imunidade por enzima como acima descrito. □ sangue do mamífero é recDlhido alguns dias, e.g. dois a cinco, após a última injecção. Do mesmo modo, a resposta imune a da ave é controlada por análise dos ovos postos algumas semanas, e.g quatro a seis, após a última injecção. Ds anticorpos são isolados por métodos conhecidos. Eles são primeiro concentrados, e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra α material higroscópico tal como polietileno glicol (PEG), filtração através de membranas selectivas, ou análogos, e, se necessário e/ou desejado, os anticorpos concentrados são purificados pelos métodos cromatográficos usuais, e.g. cromatografis de hidroxilapatite, cromatografis de imunoafinidade, filtração por gel, cromatografis de permutação iónica, ou cromatografia sobre celulose DEAE ou proteína A.

Os fragmentos dos anticorpos, por exemplo os fragmentos Fab, Fab' ou Flab')?) podem ser obtidos a partir de anticorpos preparados como acima descrito por métodos conhecidos per se. e.g. por digestão com enzimas tal como papaina ou pepsina e/ou clivagem de ligações disulfureto por redução química.

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Os conjugados dos anticorpos do invento são preparados por métodos conhecidos na arte, e.g. por reacção com um anticorpo preparado como acima descrito na presença de um agente de acoplamento, e.g. glutaraldeido, periodato, N,Ν'-o-fenilenedimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-C2'-piridilditiol-propionoxi)—succinimida, N-etil-N*-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou análogos. Os conjugados com biotina são preparados e.g. por anticorpos de reacção com um ester activado de biotina tal como ester biotina N-hidroxisuccinimida. Os conjugados com marcadores fluorescentes ou quimo luminescentes são preparados na presença de um agente de acoplamento, e.g. os acima listados, ou por reacção com isotiocianato, de preferencia fluorescein—isotio— cianato.

Os anticorpos radioactivamente etiquetados com iodo são obtidos a partir de anticorpos do invento por iodinaçâo conhecida per se. por exemplo com iodeto de sódio ou potássio radioactivo e um agente quimico de oxidação, tal como hipoclorito de sódio, cloramina T ou análogos, ou um agente enzimático de oxidação, tal como lactoperoxidase ou glicose oxidase e glicose. Os anticorpos de acordo com o invento são acoplados ao itrio por exemplo por quelação de ácido dietilenetriamino pentacético (DPTA). Os anticorpos etiquetados com technetium-99m são preparados por processos de permuta ligante, por exemplo par redução de pertecnato (TcQ^-) com solução de ião estanhoso, quelação do tecnétio reduzido numa coluna Sephdex e aplicação dos anticorpos a esta coluna, ou por técnicas de etiquetagem directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente de redução tal como SnCl->, uma solução tampão tal como solução de ftalato de sódio-potássio, e os anticorpos.

Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se em que as células de

-37uma linha hibridoma de células segregando os anticorpos monoclonais desejados são multiplicados in vitro ou in vivo e, quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados.

A multiplicação in vitro é efectuada num meio de cultura apropriado, os quais são os meios de cultura padrão, por exemplo meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640, opcionalmente preenchidos com um soro de mamifer, e.g. soro de feto de vitela, ou traços de elementos e suplementos que sustem o crescimento, e.g. células alimentadoras tal como células de exudada peritoneal de ratinhos normais, células do baço, macrofagos de medula óssea, 2-aminoetanol, insulina, transferina, lipoproteina de baixa densidade, ácido oleico, ou análogos.

A produção in vitro fornece preparações anticorpos relativamente puras e permite a ampliação para obtermos grandes quantidades dos anticorpos desejados. As técnicas de cultura de células de mamíferos sob condições de cultura de tecidos são conhecidas na arte e incluem uma cultura de suspensão homogénia, e.g. num reactor agitado por ar ou num reactor de agitação continua, ou cultura de células imobilizadas ou armadilhadas, e.g. fibras ocas, microcápsulas, sobre micropérolas de agarose ou cartuchos de ceramica.

Podemos também obter grandes quantidades de anticorpos monoclonais desejados por multiplicação das células in vivo. Para este fim, as células hibridoma produzindo os anticorpos desejados são injectadas em mamíferos histocompativeis para provocar o crescimento de tumores produtores de anticorpos. Opcionalmente, os animais são embriagados com um hidrocarboneto, em especial óleos minerais tal como pristanD (tetrametil pentadecano), antes da injecção. Após uma a tres semanas, as anticorpos são isolados

-38dos fluidos orgânicos daqueles mamíferos. Por exemplo, as células hibridoma, derivadas de ratinhos Balb/c que produzem os anticor— pos monoclonais desejados são injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c pre-tratados opcionalmente com pristano, e, após uma a duas semanas, o fluido ascitico retirado dos animais.

O isolamento, purificação e derivatização dos anticor— pos monoclonais é efectuado como acima descrito para os anticor— pos policlonais. Os anticorpos monoclonais radioactivamente etiquetados podem também ser preparados por adição de nutriente radioactivamente etiquetados ao meio de cultivo da cultura in vitro. Tais nutrientes etiquetadas contem e.g. carbono radioactivo.

invento diz ainda respeito a linhas de células hibridoma as quais segregam anticorpos monoclonais do invento.

Em particular, o invento diz respeito a linhas de células hibridoma as quais são híbridos de células mieloma e linfócitos B de um mamífero imunizado com um polipeptideo ou seu derivado de acordo com o invento. De preferencia, estas linhas de células são híbridos de células de mieloma de ratinhos e linfócitos B de um ratinho singeneico imunizado com rMRP-7C.

As linhas de células hibridoma do invento são geneticamente estáveis, segregam anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser mantidos em culturas ultra congeladas e reactivadas par degelo e opcionalmente re-clonagem.

invento diz também respeito a um processo para a preparação de linhas de células hibridoma que segregam os anticorpos monoclonais do invento em que um mamífero apropriado é imunizado com um polipeptideo ou seu derivado de acordo com o

-39invento, e as células deste mamífero produtoras de anticorpos são fundidas com células de uma linha continua de células, e as células híbridas obtidas na fusão são clonadas, e seleccionamas os clonos das células que segregam os anticorpos monoclonais desejados.

A imunização é efectuada como acima descrito para a preparação de anticorpos policlonais. As células produtoras de anticorpos são de mamíferos imunizados, de preferencia células linfóides tal coma linfócitos do baço, tiradas por exempla um a cinco dias após a injecção final, são fundidos com as células de uma linha continua de células, i.e. um clone celular continuamente duplicado o qual confere esta capacidade ce duplicação às células híbridas provenientes da fusão. Um exemplo de tal linha de células é uma linha de células tumorais (mieloma) o qual na realidade não produz ele próprio imunoglabinas ou seus fragmentas mas tem o potencial para produzir e segregar grandes quantidades de anticorpos, e que transportam um marcador genético de tal modo que as células híbridas podem ser seleccionadas contra células origem não fundidas. São conhecidas na arte diversas linhas de células mieloma apropriados. As linhas de células mieloma preferidas são conhecidas na arte. Preferidas são as linhas de células mieloma a que falta a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT) ou a enzima timidina quinase (TK.) , as quais não sobrevivem portanto num meio de cultura selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). Particularmente preferidas são as células de mieloma e linhas de células derivadas que não sobrevivem em meio HAT e não segregam imunoglobinas e seus fragmentos, tal como linhas de células F3xó3Ag8,653 ou Sp2/0-Agl4.

A fusão é efectuada na presença de um promotor de fusão, por exempo virus Sendai ou ouytos virus paramyxo,

-40opcionalmente na forma inactivada UV, ou fusogénios químicos tal como iões de cálcio, lipidos tensio activos, e.g. lisolecitina, ou polietileno glicol (PEG). De preferencia, as células do mieloma são fundidas com um excesso de tres a vinte vezes as células do baço de mamíferos imunuzados numa solução contenda cerca de 307. a cerca de 607. de polietileno glicol com um peso molecular entre 1000 e 4000.

Após a fusão, as células são de novo suspensas e cultivadas num meio selectivo escolhido dependendo do marcador de selecção genética, por exemplo o meio HAT. Neste meio, só sobrevivem as células do hibridoma, porque elas combinam a capacidade para crescerem e se duplicarem in vitro como as células do mieloma origem e os genes essenciais H6PRT ou TK que faltam para a sobrevivência em meio HAT a partir de células do baço produtoras de anticorpos dos animais imunizados.

Os meios de cultura apropriados para a expansão das células hibridoma são os meios de cultura padrão, tal como o meio Eagle modificado Dulbecco (DMEM), meio essencial minimo, meio RPMI 1640 e análogas, opcionalmente preenchidos por um soro de mamífero, e.g. 10 a 15% de soro de feto de vitela. De preferencia, as células alimentadoras, e.g. células de exsudado peritoneal de rato normal, células do baço, macrófagos de medula óssea ou análogos, são adicionadas no inicio do crescimento celular imediatamente após a fusão para alimentar as células do hibridoma e suportar o seu crescimento, em especial onde as densidades celulares são baixas, por fornecimento de factores de crescimento e análogos. Se usarmos células fagociticas tal como macrofagos ou monócitos, elas podem realizar um serviço útil na limpeza dos detritos de células martas de mieloma que sempre se encontram após o tratamento com aminopterina. Os meios de cultura são

-41 —

suplementados com meios selectivos a fim de evitar que as células do mieloma cresçam mais que as células do hibridoma.

As partes sobrenadantes da cultura de células do hibridoma são triadas para os anticorpos monoclonais desejados, de preferencia com um ensaio de imunidade da enzima ou um ensaio de imunidade de rádio. As células hibridoma positivas são clonadas, e.g. por limitação da diluição ou em agar mole, de preferencia duas ou mais vezes. OpciDnalmente, as células hibridoma passam através dos animais, e.g. ratinhos, por injecção intraperitoneal e colheita de ascites, o que estabiliza os hibridomas e melhora as carcteristicas de crescimento. As linhas de células clonadas podem ser congeladas de uma maneira convencional.

Os anticorpos policlonais e monoclonais do invento ou seus derivados são úteis para a determinação qualitativa e quantitativa dos polipeptideos ou seus derivados de acordo com o invento. Estes polipeptideos e derivados são marcadores de condições inflamatórias e ao mesmo tempo marcadores de linfomas de Hodgkin.

Por exemplo, os anticorpos ou seus derivados podem ser usados em qualquer dos ensaios de imunidade conhecidos os quais contam com a interacção de ligação entre os antigenes determinantes dos polipeptideos ou derivados do invento ou dos marcadores do linfoma de Hodgkin e os paratopos dos anticorpos. Exemplos de tais ensaios são os ensaios de imunidade e de imuno coloração da enzima, rádio—, fluorescência, quimo luminescência, imuno precipitação, aglutinação do latex, hemaglutinação.

Os anticorpos de acordo com o invento podem ser usados tal qual ou na forma de derivados conjugados da enzima num ensaio de imunidade da enzima. Podemos usar qualquer das modificações

-42conhecidas de um ensaio de imunidade da enzima, por exemplo o ensaio de imunidade da enzima de fase solúvel (homogénea), ensaio de imunidade da enzima em fase sólida (heterogénea), ensaio de imunidade da enzima simples ou dupla (sandwich), ensaio de imunidade da enzima com determinação directa ou indirecta (competitiva) dos polipeptideos ou derivados do invento.

Um exemplo de tal ensaio de imunidade da enzima é um ensaio de imunidade da enzima em sandwich no qual um suporte apropriado, por exempla a superfície plástica de um prato microtitulador ou de um tubo de ensaio, e.g. de poliestireno, polipropileno ou cloreto de polivinilo, pérolas de vidro ou de plástico, papel de filtro, dextran, etc. folhas de acetato de celulose ou de nitrocelulose, partículas magnéticas ou análogas, é revestido com um anticorpo policlonal ou monoclonal do invento por absorção simples ou opcionalmente após activação do suporte, por exemplo com glutaaldeido ou brometo de cianogénio. A seguir juntamos as soluções de teste contendo os polipeptideos ou derivados do invento ou os marcadores de linfoma de Hodgkin e finalmente os anticorpos monoclonal que também reagem com o anti gene e que são etiquetados por enzima, e.g. conjugados com fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano. A quantidade de polipeptideos ou seus derivados de acordo com o invento ou os marcadores de linfoma de Hodgkin na solução de teste é directamente proporcional à quantidade dos anticorpos policlonais ligados e é determinada pela adição de uma solução substrato de enzima. A reacção do substrato enzima ocasiona por exemplo uma mudança de cor, a qual pode ser observada à vista desarmada ou com meios ópticos de medição. Os anticorpos policlonais etiquetados por enzima podem ser substituídos por anticorpos monoclonais etiquetados por enzima dD invento o qual admite um epitopo diferente do anti gene além dos anticorpos ligados por suporte.

-43Os anticorpos de acordo com o inventa podem ser usados tal qual ou na forma de derivadas radioactivamente etiquetados derivados de um radioensaio de imunidade (RIA). Como acima descrito para os ensaios de imunidade da qualquer das modificações conhecidas de imunidade.

enzima, podemos usar um radio ensaio de

Os testes são efectuados numa maneira análoga aos ensaios de imunidade da enzima acima descritos usando uma etique125 ta radioactiva, e.g. I, em vez de uma etiqueta enzima. A quantidade do complexo imune formado o qual corresponde à quantidade dos polipeptídeos ou seus derivados de acordo com o invento ou dos marcadores do 1inforna de Hodgkin presentes nas soluções de teste é determinada por medição da radioactividade do complexo imune.

Os anticorpos de acorda com o invento podem ser usados tal qual ou na forma de derivados conjugados com marcadores quimo luminescentes num ensaio de imunidade de quimo luminescência. Os testes são efectuados numa maneira análoga aos ensaios de imunidade por enzima acima descritos usando uma etiqueta quimo luminescente em vez de uma etiqueta de enzima. A quantidade do complexo imune formado que corresponde à quantidade de polipeptideos e seus derivados de acordo com o invento ou dos marcadores de 1inforna de Hodgkin presentes nas soluções de teste ê determinada pela adição de um composto propenso à luminescência, e.g. H^0₇ e NaOH, e medição da emissão de luz com meios de medição ópticos.

Para as criosecções de imuno coloração de material de biópsia cripreservado ou embebido em parafina as secções do tecido são tratadas com uma solução contendo um anticorpo do invento, a seguir lavadas e desenvolvidas com um segundo

-44anticorpo de ligação ao anticorpo do invento, cujo segundo anticorpo pode ser detectado devido a uma etiqueta radioactiva, uma enzima conjugada com ela, um marcador fluorescente, ou biotina. Por outro com uma solução de descrito, e.g. um lado, a criosecção ou tecido embebido reage um derivada anticorpo do invento como acima 125 derivado radioetiquetado contendo I, um conjugado com uma enzima, e.g. com peroxidadse de rábano, fosfa— tase alcalina ou (3-D—galactosidadse, um conjugado com um marcador fluorescente, e.g. com fluorescina ou um conjugado com biotina. Os anticorpos radioetiquetados ligados são detectados são detectados por radioactividade de varrimento das secções do tecido. Os conjugados anticorpo ligados com enzimas são detectados após tratamento com um substrato enzima apropriado, de preferencia um substrato enzima que conduz a um depósito sólido (mancha) no local do anticorpo ou no local do segundo anticorpo de ligação ao anticorpo do invento. Podemos usar conjugados anticorpo com enzimas, em vez de conjugados anticorpo com biotina e uma solução de avidiva conjugada por enzima, a qual conduz a uma concentração superior de enzima no local do anticorpo e aumentar assim a sensibilidade do método de imunidade por coloração.O depósito sólido do substrato enzima é detectado por inspecçâo com um microscópio ou par densidade óptica de varrimento no comprimento de onda da mancha. Do mesmo modo detectamos a coloração por conjugados anticorpo com marcadores fluorescentes.

uso de acordo com o invento de anticorpos e seus derivados como acima descrito para a determinação de polipeptideos ou seus derivados de acordo com o invento ou de marcadores de linfoma de Hodgkin também incluem outros ensaios de imunidade conhecidos per se. por exemplo ensaios de imuno fluorescência, aglutinação de latex com as partículas de latex revestidas por anticorpo ou por antigene, hemaglutinação com corpúsculos de sangue vermelho revestidas por anticorpo ou por antigene, ensaios

-45de luz evanescente usando uma fibra óptica revestida por anticorpo e outros imunosensores de acção directa os quais convertem o facto da ligação num sinal eléctrico ou óptico, ou análogos.

invento diz respeito também a kits ou conjuntos de teste para a determinação qualitativa e quantitativa de polipeptideos ou seus derivados de acordo com o invento ou a marcadores de linforna de Hodgkin compreendendo anticorpos policlonal e/ou monoclonal do invento e/ou seus derivados e, opcionalmente, outros anticorpos policlonal ou monoclonal e/ou adjuvantes.

Os conjuntos de teste de acordo com o invento para um ensaio de imunidade por enzima ou do teste de imunidade de coloração por enzima contem, por exemplo, um suporte apropriado, soluções opcionalmente secas por congelação de um ou mais anticorpos policlonal e/ou monoclonal, soluções opcionalmente secas par congelação ou soluções concentradas de um anticorpo conjugado por enzima- ou biotina—, soluções de um conjugado enzima-avidina se usarmos um anticorpo etiquetado por biotina, substrato enzima na forma sólida ou dissolvida, soluções padrão de um polipeptideo do invento ou de um seu derivado, soluções tampão, e, opcionalmente, polipeptideos ou detergentes para evitar a adsorção não especifica e formação agregada, pipetas, j

reactores, curvas de calibração, manuais de instrução e análogos. Um ou mais dos anticorpos do conjunto de teste são anticorpos do invento.

Os conjuntos de teste de acordo com o invento para um radioensaio de imunidade ou o teste correspondente de imunidade de coloração contem, por exemplo, um suporte apropriado, soluções opcionalmente secas por congelação de um ou mais anticorpos policlonal e/ou monoclonal, soluções de um anticorpo radioactiva— mente etiquetado, soluções padrão de um polipeptideo do invento

ou de um seu derivado, soluções tampão, e, opcionalmente, polipeptideos ou detergentes para evitar a adsorção não especifica e formação agregada, pipetas, reactores, curvas de calibração, manuais de instrução e análogos. Um ou mais dos anticorpos do conjunto de teste são anticorpos do invento.

Os anticorpos e derivados de anticorpo do invento podem ser usados para a determinação qualitativa e quantitativa dos polipeptideos do invento ou seus derivados. Devido ao facto de que estes polipeptideos ou derivados são mediadores ou precursores dos mediadores de inflamação, os anticorpos e derivados de anticorpos do invento são assim úteis para o diagnóstico simples e de confiança de condições inflamatórias, em particular de reacções do tipo hipersensibilidade retardada. A presença ou a quantidade dos polipeptideos do invento ou seus derivados pode ser determinada em fluidos biológicos tal como soro humano, fluido conjunto ou plasma, em secções de tecido e células por processos de diagnóstico padrão, por exemplo ensaios de imunidade como acima descrito, de preferencia ensaios de imunidade por enzima.

A determinação dos polipeptideos e seus derivados de acorda com o invento pode também ser usada para vigiar ou controlar o tratamento de condições inflamatórias durante a terapia uma vez que por medição do nivel dos polipeptideos e seus derivados podemos avaliar a eficiência da terapia.

Além disso, os anticorpos e os derivados de anticorpos do invento são úteis como antagonistas do mediador natural e podem portanto ser usados para o controlo dos processos inflamatórios. Os anticorpos e os derivados de anticorpos do invento podem ser usados para o isolamento e purificação dos polieptideos

-47ou derivados do invento a partir de fontes naturais ou de células hospedeiro transformadas por cromatografia de imunoafinidade.

E ainda além disso, os anticorpos e os derivados de anticorpos do invento podem ser usados para a localização do linfoma de Hodgkin num doente usando técnicas de varrimento por rádio. Com este objectivo, os derivados de anticorpos radioetiquetados de ligação a MRP-160, rMRP-70 ou fragmentos de MRP-160 são injectados no doente, e o doente varrido com uma imagem gama a intervalos regulares. As células que exprimem marcadores de linfoma Hodgkin consumirão mais anticorpos radioactivos dD que outros tecidos e serão claramente reconhecidas pela camara de imagens gama. De preferencia os anticorpos monoclonais etiquetados com ou com ^^^mTc são usados para o varrimento por rádio em quantidades de 3 a 8 Cg representando 15 a 3© pCi por kg de peso dD corpo.

Adicionalmente, os próprios anticorpos e em particular os seus derivados tal como os conjugados com compostos citotóxicos e carcinostáticos podem ser usados para o tratamento do linfoma de Hodgkin. A dose terapêutica para os mamiferos está entre aproximadamente 10 pg e 1 mg por kg de peso do corpo para os próprios anticorpos, e entre 1 pg e 100 pg por kg de peso do corpo para os conjugados com drogas citotóxicas, dependendo do estado do doente e do modo de aplicação.

invento diz respeito a composições farmacêuticas contendo anticorpos de ligação a MRP-160, rMRP-70 ou fragmentos de MRP-160, ou seus derivados, numa quantidade terapeuticamente eficaz em conjunto com um suporte farmacêutico, sólido ou liquido, orgânico ou inorgânico, para o tratamento de linfoma de Hodgkin. As composições farmacêuticas apropriadas são as acima

descritas, mas contendo anticorpos do invento em vez do polipep tideo ou derivados de polipeptideo.

-49—

ABREVIATURAS

BSA BC IP Cl AP dNTF

DTT

FPLC

IPTG

L-broth

MAb

NBT

OD pdNí>

rATP

RT

SDS tampão TE U soro de albumina de boi fosfato de 5-bromo—4-cloro-3-indolil fosfatase alcalina de intestino de vitela trifosfato deoxiribonucleósido (N = adenina, citosina, guanina ou timina) ditiotreitol cromatografia liquida de proteina rápida isopropiΙ-β-D-tiogalactósido caldo Luria anticorpo monoclonal azul nitro tetrazólio densidade óptica pNpNpNpNpNpN (N = deoxinucleótido), ó-mer aleatório (ribo)adenosian 5'-trifosfato temperatura ambiente dDdecil sulfato de sódio tampão tris—EDTA unidade(s)

EXEMPLOS

Exemplo li Construção de bibliotecas cDNA humana L132 e MNC

1.1 - Isolamento de mRNA a partir de células LI32 humanas

1.1.1 - Isolamento de RNA total

Um total de 5 ml de grânulos com 8x10 de células L132 (ATTC CCL5, células epiteliais embriónicas humanas) é dissolvido em 20 ml de uma soluçãi GuSCN filtrada com 0,8 pm contendo isotiocianato de guanidina 4 M, acetato de sódio 25 mM a pH 6 e β-mercaptoetanol 120 mM. Após agitação vigorosa, o DNA é parcialmente tosquiado por dez passagens sucessivas através de uma agulha 22G. A solução é colocada no topo de tres almofadas CsCl formadas por 4 ml de uma solução de CsCl 5,7 M em solução de acetato de sódio 25 mM a pH ó em tubos de polipropileno e é centrifugada durante 16 hrs a 20°C com 29.000 rpm num rotor TST41 (Kontron). A parte sobrenadante é cuidadosamente removida, e os grânulos são redissolvidos em 1,5 ml de SDS a 0,2% e extraida com 1,5 ml de clorofórmio. 0 RNA é precipitado a partir da fase aquosa por adição de dois volumes de etanol, redissolvido em 1,5 ml de SDS a 0,2% e precipitado por adição de acetato de sódio a pH 6 com 0,15 M e dois volumes de etanol.

1.1.2 - Isolamento de mRNA granulo de RNA contendo 14 mg de RNA total é dissolvido em 5 ml de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM e SDS 0,2%), aquecido a 65°C durante 2 min e rápidamente arrefecido à temperatura ambiente. Após adição de 0,55 ml de NaCl 5 M, a solução é aplicada tres vezes a uma coluna de 0,5 g de oligo-dT celulose (tipo 7, Pharmacia) equilibrada em tampão de

-51lavagem (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM e SDS 0,2%). Após a lavagem da coluna com 15 ml de tampão de lavagem, a RNA ligada é eluida em 4 ml de tampão de eluição. 0 material eluido é aquecido a 65 ^CC durante 2 min, arrefecido, ajustado a NaCl 0,5 M e reaplicado á coluna reequi1ibrada (tres vezes). Após a lavagem com 15 ml de tampão de lavagem, a mRNA ê eluida da coluna em 4 ml de tampão de eluição e precipitado durante a noite a -20°C após adição de 0,25 ml de acetato de sódio 3 M a pH 6 e 10 ml de etanol. 0 precipitado (275 pg) é recolhida por centrifugação (15 min a 16.000 g), dissolvido em 0,4 ml de H^O e precipitado por adição de 25 μΐ de acetato de sódio (3 M, pH 6) e 1 ml de etanol. Após arrefecimento em gelo seco durante 10 min, o RNA é recolhido por centrifugação durante 5 min numa centrífuga de Eppendorf. 0 granulo é seco por ar e redissolvido em 275 μΐ de ^H2°1.2 — Sintese de cDNA de cadeia dupla para clonaqem em bacteriofaqo lambda qt 11

No principio, o cDNA de cadeia simples é sintetizado usando o L132mRNA do Exemplo 1.1.2 ou RNA dos leucócitos mononucleares de sangue periferal humano (MNC; preparado como descrito na Aplicação da Patente Europeia 0 263 072) como moldes. Duas amostras de 10 pg de L132mRNA ou 20 pg de MNC RNA são incubadas durante 1 hr a 43 ^C'C cada uma em 50 pl de solução contendo

Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, medido a 43°C), MgCl^, 10 mM, KC1 140 mM,

DTT 10 mM, lmM de cada dNTP, 1O0 pg/ml de oligo-dT(12-18) (PharTM macia), 90 U de RNasin (Promega Biotech), 40 U de transcriptase AMV inversa (Genofit.) e 5 pCi de «s-^P-dCTP <3000 Ci/mmol). Após recombinação das duas amostras correspondentes, as moléculas híbridas RNA-DNA são recolhidas como se segue: A amostra é ajustada a uma molaridade de 20 mM em EDTA (pH 7,5) e C,2 % em SDS, extraída com um volume igual de fenol—clorofórmio (1:1, equilibrado com TNE: NaCl a 100 mM, Tris—HC1 10 mM a pH 9,0, EDTA 1 mM) e carregada numa coluna com 1,5 ml de Sepharose-4B (Pharmacia, equilibrada em TNE contendo NaCl 30Θ mM Ctotall). Após lavagem da coluna com o mesmo tampão, juntamos as fracções contendo pelo menos 907. do material (avaliado pelo R32FP incorporado) (4-5 x 50 pl), e juntamos dois volumes de etanol. Após arrefecimento em gelo seca durante 10 min, o precipitado é recolhido por centrifugação durante 5 min numa centrífuga de Eppendorf, lavado com Θ,Ι ml de etanol a 70%, e seco por ar. Os híbridos RNA-DNA são re-incubados durante 1 hr a 43 °C numa reacção de 50 μΐ como acima descrito, com omissão do oligo—dT. A mistura reagente é a seguir ajustada a 20 mM em EDTA, e juntamos 3,8 μΐ de NaOH 1 N. A mistura reagente é a seguir incubada durante 20 min a 75°C, arrefecida, neutralizada por adição de 25 μΐ de Tris-HCl 1 M pH 8 e 6 μΐ de HC1 1 N, e o cDNA de cadeia simples é recolhido como acima descrito para os híbridos RNA-DNA.

Para a segunda sintese da cadeia, incubamos 5 pg de cDNA de cadeia simples durante 30 min a 37°C em 100 μΐ de tampão contendo Tris-acetato 33 mM pH 7,9, acetato de potássio 9,6 mM, acetato de magnésio 1Θ mM, DTT 0,5 mM, 1 mg/ml de BSA (fracção Pentax V, Calbiochem), 10 ng/ml pdNó (Pharmacia), 1 mM de cada dNTP, 10 pCi de tf-^P-dCTP (3000 Ci/mmol) e 500 U/ml de polimerase T4 DNA (FPLC—puro, Pharmacia). 0 cDNA de cadeia dupla é recolhido como acima descrito para os híbridos RNA-DNA.

Na etapa seguinte, o cDNA é digerido com nuclease SI pelo processo descrito a seguir. Incubamos ó pg de cDNA durante 5 min a 37°C em 50 μΐ de uma solução contendo NaCl a 200 mM, acetato de sódio a 50 mM pH 4,5, ZnSO^ a 1 mM e 0,5% de glicerol. Juntamos 2,5 U de nuclease SI (Pharmacia), e a incubação continuou durante 10 min. 0 DNA é recolhido como acima descrito para os hibridos RNA-DNA.

-53A seguir, efectuamos a metilação EcoRI como se segue. Incubamos 4 pg de cDNA de cadeia dupla durante 20 min a 37°C em 50 pl de uma solução contendo 100 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 5 mM, 0,4 mg/ml de BSA (fracção Pentax V, Calbiochem), 15 pM S-adenosil metionina (Biolabs) e 100 U EcoRI metilase (Promega Biotech). A reacção é parada por incubação a 65°C durante 10 min. Após adição de 4 pl de EDTA 0,5 M, 100 μΐ de TNE e 1 μΐ de SD3 a 207., a solução é extraida com fenol-clorofórmio o o DNA é recolhido por precipitação por etanol como acima descrito.

Para o tratamento com polimerase T4 (Boehringer), incubamos 3 pg de cDNA durante 15 min a 37°C em 50 μΐ de uma solução como acima descrito para a sintese da segunda cadeia sem pdNó, e o DNA é recolhido como acima descrito para os híbridos RNA-DNA.

A seguir, ligamos acopladores oligonucleicos sintéticos aos extremos talhados dos fragmentos DNA com ligase T4 como se descreve a seguir. Incubamos 2,5 pg de cDNA durante a noite a 15*0 em 30 pl de uma solução contendo 2© mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 1 mM rATP, 3 Α_ο&θ U/ml acoplador EcoRI (pCCGGAATTCCGG,Biolabs) e 8Θ0 U de ligase T4 (Biolabs). A reacção é parada por incubação a 65°C durante 10 min. Após adição de 60 pl de H2O, juntamos 10 pl de uma soluçãD contendo NaCl 1 M, 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl_o, 10 mM DTT e 90 U de EcoRI (Boehringer) e a mistura reagente é incubada a 37°C durante 3 hrs. 0 DNA é recolhido como acima descrito para os híbridos RNA-DNA com a excepção de que após a precipitação o DNA é recromatografado numa segunda coluna de Sepharose 4B.

-541.3 - Clonaqem de cDNA em lambda qt 11 ng de cada um dos cDNAs L132 e MNC do Exempla 1.2 são ligadas durante a noite a 15°C a 0,5pg de braços EcoRI desfofotilado-lambda gtll digerido (Promega Biotech) em 10 μΐ de solução contendo 20 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 1 mM rATP e 400 U T4 ligase (Biolabs).

Os DNAs ligados são embalados pelo uso de extractos de TM embalagem Gigapack (Stratagene) e incubação a 20*C durante 2 hrs como descrito pelo fabricante. Juntamos 0,5 ml de tampão SM (tampão de diluição de fago formado por NaCl 100 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgsSG^, 0,017 de gelatina) e juntamos 20 μΐ de clorofórmio e a suspensão fago é armazenada a 4*C.

Para a preparação das células competentes que podem ser transformadas com lambda gtll, juntamos 2 ml de uma cultura durante a noite de E. coli Y109O (Promega Biotech) a 200 ml de meio TY (8 g/1 de triptona, 5 g/1 de extrato de fermento, 2,5 g/1 de NaCl) suplementados com 0,27 de maltose e 50gg/ml de ampicilina e incubamos a 37°C. Quando ο 0ϋ,_ΛΛ atinge 0,7, as células são recolhidas por cert trif ugação e resuspensas em 50 ml de MgSO^ 50 mM.

Juntamos séries de diluições de 10 μΐ da suspensão fago acima descrita a 100 μΐ de uma suspensão de células competentes

Y1090, incubadas a 37°C durante 30 min, adicionamos a 4 ml de top-agar fundido (55°C) contendo 20 μΐ de IPTG 20 mg/ml em H^O e TM μΐ de Blu-gal 20 mg/ml (BRL) em N,N—dimeti1formamida, e lamilado sobre lamelas TY. Após incubação durante a noite a 37*6, o titulo para a suspensão fago contendo L.132 cDNA é calculado comiO sendo 10^/ml, 47 do qual é fago tipo bravio. 0 titulo da

suspensão fago contendo leucócitos cDNA mononucleares ê calculada cama senda 2 x 10*^, 307 da qual ê de tipo bravio.

-56Exemplo 2: Triagem de bibliotecas lambda qt 11 murina e expressão cDNA humana para codificação cDNA da molécula que reage com o anticorpo monoclonal 1C5

Uma biblioteca cDNA a partir de ácido linoleico induzido por macrófagos peritoneais de ratinhos (ML 1005B) e uma biblioteca cDNA de células U937 humanas não induzidas (HL 1029B), as quais são ambas bibliotecas de expressão gtll e são vendidas pela Genofit, são triadas usando uma técnica de imunoperoxidase. A triagem é efectuada para identificar a codificação cDNA da molécula que liga o anticorpo 1C5 monoclonal (MAb 1C5). Este anticorpo mnoclonal é descrita na Aplicação da Patente Europeia O 162 812. è produzido pela linha de células hibridoma de murina com a designação 1C5 (CNCM número de deposição 1-316) e é especifico para o factor de inibição do macrofago de migração humano (MIF).

o

As bibliotecas cDNA são tituladas para obtermos 2 >: 10 fagos por ml, diluidas 1:1000 com tampão SM, e para cada biblioteca incubamos dez partes aliquotas (20 μΐ) durante 20 min a RT com dez partes aliquotas (1 ml) de uma suspensão de células Y1090 competentes do Exemplo 1.3. Juntamos a cada amostra 10 ml de topo agar TY fundido (60 °C), o qual é lamelado sobre lamelas de de agar TY de 15 cm. Após 10 min, os pratos são incubados a 42 °C durante 3,5 hrs.

A RT uma membrana de nitrocelulose 0,45 pm (Schleicher and Schuell) é colocada em cada prato, deixando molhar e atomizar tres vezes com um filme de 1,35 g/1 de IF’TG em H₇0. Após 1Θ min, os pratos são incubados durante 3,5 hrs a 37 °C. Após maracação da posição, os filtros são lavados em tampão TBST (NaCl 150 mM, mM Tris—HC1 pH 8 e Tween^ 20 a 0,05 7), seguido por oscilação

-57suave durante 30 min a RT no mesmo tampão suplementado com 17 de leite em pó não gordo, e outra lavagem com tampão TBST.

□s filtros 2 x 10 são Íentamente vacilados durante a noite a RT em 2 x 200 ml de tampão RT suplementado com 17 de leite em pó não gordo e 20 mg/ml de MAb 1C5. Os filtros são lavados tres vezes durante 15 min com TBST e incubados durante 30 min a RT com 2 x 200 ml de fosfatase alcalina conjugada com IgS de cabra anti-rato (Dianova), a qual é diluida 1:2500 com TBST suplementado com 1% de leite em pó não gordo. Os filtros são lavados tres vezes durante 15 min com TBST.

Os filtros são desenvolvidos pela adição de um reagente corado o qual tem a composição seguinte: 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl^, 0,5 7 de uma solução 75 mg/ml de uma solução de NBT (Biorad) em 70 7 de dimetilformamida e 0,33 7 de solução a 50 mg/ml de BCIP (Biorad) em dimetilfDrmamida a 100 7.

Juntamos 10 ml do reagente corado por filtro e deixamos prosseguir a reacção a RT até aparecerem claramente os sinais (até 4 hrs), após o que paramos a reacção por colocação dos filtros numa solução contendo 20 mM de Tris-HCl pH S e 5 mM de EDTA.

As placas positivas são retiradas e agitadas durante 1 hr a RT em a ml de tampão SM contendo 20 μΐ de clorofórmio. Séries de diluição SM são colocados em pratos e triados com MAb 1C5 como acima descrito. Repetimos o processo até todas as placas darem uma reacção positiva. A partir de cada uma das bibliotecas cDNA, isolamos duas placas positivas: M9 e M10 a partir da biblioteca de ratinhos ML 10Θ5Β, e H31 e H35 a partir da biblioteca humana HL 1029B.

-58Exemplo 3; Isolamento de inserções cDNA de faqos recombinantes

DNA M9, MIC. H31 e H35

3.1 — Isolamento de fago DNA recombinante

Misturamos 100 μΐ de suspensões fago do Exemplo 2 e uma suspensão de células Y1C9C competentes do Exemplo 1.3, deixamos a RT durante 20 min e juntamos a 100 ml de meio TY suplementado com MgSO^ 10 mM. Após agitação a 250 rpm durante a noite num frasco de 1 1 a 37°C, juntamos 1 ml de clorofórmio e 100 pg de RNase A. Após 30 min a RT, juntamos NaCl para obtermos uma molaridade de 1M, e após 1 hr em gelo a solução ê clarificada por centrifugação (20 min a 2.0ΟΘ rpm num rotor Sorvai 1 H6000). Juntamos polietileno glicol 6000 à parte sobrenadante para originar uma concentração final de 10 a mistura é deixada em gelo durante 1 hr, e o fago é granulado por centrifugação (20 min a 2.000 rpm num rotor Sorvai 1 HóCCC). 0 granulo fago é resuspenso em 2 ml de tampãD SM suplementado com 100 pg de RNase A e 50 pg de DNase I. Após 30 min a RT, a solução é extraida com 4 ml de clorofórmio seguida por centrifugação (5 min a 1.500 g>. A fase aquosa é ajustada a 10 mM EDTA, SDS a 0,1 7. e 200 pg de pronase, deixada a RT durante 15 min e extraida com 4 ml de clorofórmio seguida por centrifugação <5 min a 1.500 g). A fase aquosa é ajustada a 0,5 M NaClO^ e 33 7. de 2-propanol. Após 1 hr sobre gelo o DNA é recuperado por centrifugação (10 min a 1Θ.000 g). □ DNA é dissolvido em 200 pl de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) e reprecipitado por adição de 200 pl de acetato de amónio 5 M e 0,8 ml de 2-propanol seguido por centrifugação (1Θ min a 10.000 g). Após lavagem com 70 5 de etanol, o DNA é dissolvido em 200 pl de TE.

-593.2 - Isolamento de insertos cDNA lOyg de fagos DNA são digeridos durante 1 hr a 37 °C em 100 μΐ de solução contendo 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, 10mM de MgCl^s 1 mM de DTT e 50 U de EcoRI. Qs insertoe cDNA são isolados por electroforese preparativa de gel agarose seguida por electro eluição. Os tamanhos dos insertos M9, M10, H31 e H35 dos fagos DNA recombinantes do Exemplo 2 parecem ser todos 2,3 kb.

3.3 - Subclonaqem dos insertos cDNA isolados

Os insertos EcoRI cDNA são subclonados no vector TM pBLUKSF’ (Straagene) usando os processos estabelecidos (T. Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

-i>QExemplo 4: Identificação das sequências cDNA desejadas nas bibliotecas L132 e MNC de lambda qt 11 de cDNA humano por hibridização cruzada

A codificação cDNA da molécula que reage com MAb 1C5 é identificada nas bibliotecas L132 e MNC de lambda gt 11 humano do exemplo 1.3 por triagens sucessivas usandD MAb 1C5, os insertos cDNA do Exemplo 3.2 e seus fragmentos.

x l©*·' placas de cada uma das bibliotecas L132 e MNC de cDNA (construídas coma descrito no Exempla 1.3), das bibliotecas comercialmente disponíveis ML10O5B e HL1029B de cDNA (Exemplo 2) e os derivados HL60 de leucemia humana não induzida da biblioteca HL1020B (Genofit) são lameladas em dez pratos de 15 cm como

TM acima descrita no Exemplo 1.3 com omissão de IPTG e Blu-gal . De cada prato fabricamos dois filtros duplicados (NEF-978A, NEN) de caordo com processos estabelecidos (T. Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Efectuamos vários ensaios de hibridização coma descrito a seguir com sondas radioactivamente etiquetadas listadas na Tabela 1 a seguir.

D processo de hibridização é efectuadao como se segue. Os filtros são pre-hibridizados durante 2 hrs a 65°C numa solução (10 ml/filtro) contendo 2x de solução de Denhardt, 6x de SSC (tampão de citrato de sódio salina, ver T. Maniatis et al., loc. cit.), 0,2 7. de SDS e 50 μΐ/mg de timo DNAde vitela desnaturado. A hibridização é efectuada durante a noite a 65 °C na mesma solução contendo a sonda cDNA oligo etiquetada desnaturada termicamente (3-6 x IO⁶ dpm por filtro) de acordo com a Tabela 1 a seguir. A oligo etiquetagem dos fragmentos cDNA apropriadas é efectuada como se segue; 0,1 pg de DNA em 13 μΐ é colocada a 95 °C durante 5 min, arrefecida e levemente centrifugada. Após a

-61adição de 2 μΐ de l©x de tampão NT <©,5 M Tris-HCl pH 7,2, ©,1 M

MgSO^, 1 mM DTT e ô,5 mg/ml de BSA tPentax fraction, Calbiochem3), 1 μΐ de uma solução contendo 2© mM de cada dGTP, dTTP e dATP, 3 μΐ de a-^P-dCTP (1© mCi/ml, 30©© Ci/mmol), 1 μΐ de pdNó (1 mg/ml, Pharmacia) e 1 μΐ de DNA polimerase I (5 U/μΙ, Boehringer), a mistura é incubada a 37 '-C durante 3© min. A DNa etique8 tada (5 x 1© dpm/pg) ê recuperada como descrito para os hibridos RNA-DNA no EXemplo 1.2. Após a hibridização, os filtros são lavados durante 15 min a 65 °C em duas mudanças das soluções seguintes: 2x SSC, ©,27. de SDS; lx SSC, ©,2X de SDS e 0,5x SSC, ©,27. de SDS. As placas positivas sãD visualizadas por autoradiografia.

Os subfragmentos cDNA identificados nas bibliotecas individuais nas experiencias de hibridização são listados na Tabela 1 a seguir. Damos o nome do clone de cada fragmento da sonda cDNA bem como a localização relativa aproximada na sequencia MRP-16© (ver Exemplo 5.2).

probe used for Identification of cDNA subfragments/location	designation of cDNA subfragments identified in each cDNA
ML1005B	library	L132	MNC
HL1020B	HL1029B
1C5	M9,M10		H31.H35
MIO insert 3500-5800	M10.1	H25	(H35)*
M10.1 small EcoRI fragment 3020-3500		H23	H12
H23 HindlIIEcoRI fragment 3750-4710		H70	H67,H69
H23 PstI-EcoRI fragment 2735-3275		H4,H5
H4 EcoRI-Kpnl fragment 140-1170				L4,L7
pMRP-160 BglII fragment 1-1160					N2.N3
pMRP-160 BglII fragment 3670-4720					N1.N10

-63Exemplo 5; Isolamento e sobreposição das sequências nucleótidas dos subfraqmentos cDNA de sobreposição

5.1 - Purificação das placas

As placas positivas são identificadas por hibridização por placas como descrito no Exempla 4, são retiradas e efectuamos séries de diluições como descrito nos Exemplos 1.3 e 2. Repetimos o ciclo de purificação até todas as placas serem positivas. 0 fago DNA ê preparado e os insertos cDNA (ver a Tabela 1) são isolados e subclonados como descrita acima no Exemplo 3.

5.2 - Determinação de sequencia

A análise da enzima de restrição dos subfragmentos cDNA é efectuada usando processos padrão. Os fragmentos de restrição convenientes dos subfragmentos cDNA são clonados nos vectores pBLUSCRIPT™ ou pUCKO (K. Odink et al . , Nature 330. 80, 1987).

A determinação da sequencia cDNA é efectuada pelo método de terminação da cadeia nucleótida deoxi usando DNA de TM cadeia dupla e o kit e protocolo sequenase (United States Biochemical; M. Haltimer et al. , Nucl. Acids Res. 1.3, 1015,

1985). Obtemos iniciadores universais a partir de Stratagene. Para iniciação interna e verificação da sequencia, sintetizamos os iniciadores tal como listados na Tabela 2 (Y. Ike et al., Nucl. Acid Research χχ, 477, 1983). A sequencia ê determinada em ambas as direcções, e se usarmos os locais de restrição na estratégia de sequencia eles são confirmados usando os fragmentos de sobreposição e os iniciadores internos da Tabela 2.

Tabela 2ϊ Iniciadores oliqonucleótidos usados na sequenciação

1.	H	0263s	ACTCCATCATCTGAGAC
2.	H	0310r	ACTCGAAAGTCATCCAC
3.	H	0600r	ATGCTGGCCGTAGAAGT
4 .	H	0621s	CCTTCAAACATCCCTCA
5.	B	0793s	TGGTGGCACTAAGGCTG
6.	B	0865r	CACGCCACACCACTCCC
7 .	H	0883s	GAAGAATGATGGCGCTG
8.	H	0900r	CAGCGCCATCATTCTTC
9.	B	1190s	TCCAGGAGGCCCTGAAG
10.	H	1450r	AGGTCCTCAACCTTCCT
11.	H	1601s	GGTGGCTACAGTTTCAG
12.	H	1650r	GGTCTTTCTCCAGTTCC
13.	B	1782r	GCTTCTAGCTTTTCTTG
14 .	B	1855s	GAAGGAGATAAAGGCTC
15.	H	2053s	GÁGACGGCAGAATTTGC
16.	H	2379s	ACATCACAGCTCAAGGC
17.	H	2513r	TTTAATCTGTTTCTCAG
18.	H	2610s	AGTGAAAGAGACTTTGG
19.	H	2884s	AT G T CAGGAGATAAC T C
20.	H	3111s	GAAATTGTCGGACCTGG
21 .	H	3157s	GCCAGGTATGAGAGAGC
22 .	H	3476s	ATGTGGAAGAGCTGAAC
23.	H	3492r	GTTCAGCTCTTCCACAT
24 .	B	3605r	ACTTCTGAGCTGCTGCC
25.	H	3731s	CCAAGTTCATAAAAGAC
26.	H	4111r	CCACCTTCATCTTGAGG
27 .	H	4200s	CAGTCCAAGAAGAAACC
28.	H	4250r	TCTGTGTCGTGGAGATC
29.	H	4400s	CCTCCAGTGGAGAACTG
30.	pUCKOr	CAGTGAGCGAGGAAGCG

número indica o local aproximado na sequencia de MRP-160 (ver SEO ID NO:1)« Um H significa que se preve um oligonucleótido na sequencia humana, um B significa que se iniciará um oligonucleótido em ambas as sequências humana e do ratinho. Alguns dos oligonucleótidos não se acomodam exactamente à sequencia MRP-160. 0 número 30 é um iniciador universal para pUCKO.

Os códigos 6 kb cDNA para uma proteina precursora de aproximadamente 160 k.D são designados por MRP-160. A sequencia completa do MRP-160 cDNA e a sequencia amino ácido prevista são apresentadas na SEQ ID NO: 1. Observa-se que falta uma sequencia de 105 nucleótidos, representando provavelmente um exon dos clones H5 e N2. A posição dos subfragmentos cDNA do Exemplo 4 na sequencia MRP-160 é dada na Tabela 3, a seguir.

-66Tabela 5: Posição dos subfraqmentos cDNA de sobreposição

l J subfragmento I	cDNA	—j- 1 |	posição no	-j MRP-160 j I
1 | H4		I 1	140-333Θ	1 1
| H5		l	1280-3680	1
| H23		1	2740-4720	t
) Η7Θ 1		l	3580-5830	) 1
1 1 L4		1 1	1- t	1 1
| L5		I	1- »	i
l L7		1	400-3640	l
l | N3		1 I	1-2000»*	l J
| N2		1	7-3050	1
| Ν1Θ		1	2229-5822	1
| NI 1		} 1	4065-5852	1 1
» extremos 3'	aberrantes;	sequencia	completa não conhecida
»» extremo 3'	exacto	não	conhecido

-67Exemplo 6: Construção de pMRP160

Construímos um vector híbrido formado pela codificação DNA para MRP-160 como se descreve a seguir.

Digerimos 5 pg do vector pUCKO com EcoRI, desfosforilado com CIAP e purificado por elecroforese de agarose e electro eluição (fragmento a). Digerimos 5 pg do subfragmento H23 de cDNA com EcoRI e PstI. A codificação do fragmento 1,4 kb para o •v terminus C de MRP-160 é purificada por elecroforese de agarose e ' electro eluição (fragmento b). Digerimos 5 pg do subfragmento L7 com PstI e Kpnl. A codificação do fragmento 2,1 kb para a porção do meio de MRP-160 é purificada por por elecroforese de agarose e electro eluição (fragmento c). Digerimos 5 pg do subfragmento L4 de cDNA com EcoRI e Kpnl e a codificação da fragmento 1,2 kb para a codificação da porção terminal de MRP-160 é purificada por elecroforese de agarose e electro eluição (fragmenta d).

0,1 pg dos fragmentos a e c e 0,05 pg dos fragmentos b e d são transformados nsa células DH5a competentes (Gibco). 0 DNA recombinante é isolado e analisado por análise de resrtição. Um plasmideo originando um fragmenta 4,7 kb EcoRI bem como fragmentos 1,2 e 3,5 kb EcoRI-Kpnl e fragmentos 0,5 e 2,7 kb PstI-EcoRI é designado por pMRP160.

A sequencia da região de codificação MRP-160 é confirmada por sequenciação usando iniciadores oligonucleótido como acima descrito.

—68—

Exemplo 7¾ Construção de pMRP70p_L

Construímos um vector híbrido formado pela codificação de parte de DNA dD subfragmento H23 como se descreve a seguir.

A TM ) Os subclones do insero H23 cDNA em pBLUKSP são analizados por análise de restrição. Um clone originando 1,2 kb do fragmento Xhol é designado por pH23.

j Digerimos 1© pg de pH23 com HincII e reparamos com polimerase Klenow. 0 fragmento 1,8 kb contendo a parte de codificação de H23 bem como 33 nucleótidos do acoplador é isolado por elecroforese de gel agarose e electro eluição (fragmenta a). Digerimos 10 pg do vector pP^mu-bio (obtido a partir de Biogen, derivado de pP^muSLCori CS. Buell et al., Nucl. Acids Research 13, 1923, 19853 por substituição do fragmento NcoI-HindII com o poliacoplador pUC9), com Ncol. Os extremos pedajosos sâo cheios com polimerase Klenow, e o DNA é desfosforilado com CIAP. O vector 3 kb é isolado por elecroforese de gel agarose e electro eluição (fragmento b) .

0,1 pg dos fragmentos a e b sâo ligados e transformados na competente estirpe E. coli K12 lambda lisogen. Os plasmideos recombinantes são isolados e analizados por digestão de restrição. Um plasmideo originando um fragmento BamHI-Xhol de 0,6 kb é designado por pMRP70p_L- A construção correcta de pMRP70_pL é confirmada por seguenciação.

) pMRP70_pL é retransformado nas células LC137 competentes (SC936; G. Buell, loc. cit., and S. Goff et al., Prac. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6647, 1984) contendo o plasmideo pCI857 que contem um gene Cl sensível à temperatura (E. Remaut et al., Gene 22, 103, 1938). Os transformantes são seleccionados por resistência à kanamicina mais ampicilina. As células contendo pMRF'70p^ são armazenadas como cultura de glicerol a -7€>°C.

-7ΘExemplo 8: Fermentação de rMRP-7© peptideo rMRP-7© que é codificado por pMRP7©_pL é expresso em E. coli como se descreve a seguir.

As células contendo pMRP7©_pL são raiadas a partir de uma cultura de glicerol num prato de kanamicin/ampici1ina e incubadas a 3©°C. A partir de uma colónia simples, uma cultura de 12 ml cresce durante ó hrs a 3©°C em LBMKA (caldo L contendo 5© pg/ml de ampicilina e 4©pg/ml de kanamicina) (cultura a). DEz frascos de 2 1 com 20© ml de LBMKA são inoculados com 1 ml de cultura a e agitados a 3©*C durante a noite. As culturas são diluidas com 8©© ml de LBM a 3©^,;,C e deixadas a crescer durante mais 3 hrs (culturas b). A sintese de rMRP-7© é induzida por aquecimento rápido das culturas b a 42°C num banho de água a 50°C, seguido por agitação a 42°C durante 2 hrs (culturad c). As células das culturas c são rcDlhidas por centrifugação.

-71Exemplo 9ϊ Purificação e caracterização de rMRP-70

9.1 - Extracção das células

As células E. coli expressando rMRP-70 crescem com uma densidade óptica de 1,2 OD/ml unidades a partir de 10 1 do caldo de fermentação da Exemplo 8 são desfeitas com 250 ml de hidrocloreto de guanidina 8 M, 50 mM Tris-HCl, 30 mM NaCl, pH 8,0, contendo 6 ml de 100 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PSMF) em 2-propanol. A suspensão é centrifugada durante 60 min a 2Θ000 g a 4°C. A parte sobrenadante é tornada 0,1% em ditiotreitol (DTT) e dializada (membrana Spectrapor No. 3; corte a 3,5 kD; Spectrum Medicai Industries) a 4°C contra 10 mM

Tris-HCl, 0,01% DTT, pH 8,0. 0 precipitado branco formado é removido por centrifugação durante 30 min a 20000 g a 4°C.

9.2 - Cromatografia DEAE de permutação iónica

A parte sobrenadante do Exemplo 9.1 ê bombeada para uma coluna DEAE-Trisacri1 M (LKB) de permutação iónica (5 x 10 cm) equilibrada com o tampão de diálise. Após carregamento da amostra, a coluna é lavada com tampão de diálise até a absorção UV 254 nm atingir o nivel da linha de base. As proteínas ligadas à coluna são eluidas usando um gradiente linear de NaCl em tampão de diálise que varia entre Ο,Θ M e 0,2 M NaCl <600 ml), e a seguir o tampão diálise/0,2 M NaCl (200 ml) e o tampão diálise/Θ,Ι M NaCl (200 ml) com um caudal de 4 ml/min. Recolhemos as fracções individuais de 12 ml e analisamos por SDS-PAGE (U.K. Laemmli, Nature 227, 680, 1970) sobre placas de gel de 15% de poliacrilamida (corando com Coomassie Blue R-250) e misturadas de acordo com o seu teor em rMRP-70. As fracções com de 0,12 a 0,2 M de NaCl são misturadas, dializadas contra tampão de diálise e recromatografadas usando α mesmo processo com a excepção das

-72dimensões da coluna (2,6 x 10 cm), volumes do tampão (507) e caudal (2 ml/min). As fracções com de 0,16 a 0,2 M de NaCl são misturadas e concentradas 1Θ vezes por ultrafiltração numa célula agitada (membrana YM-10, Amicon).

9.3 - Cromatografia por exclusão do tamanho ml da mistura concentrada após ultrafi1 tração do Exemplo 9.2 (concentração da proteina 14 mg/ml) são separados numa coluna UltroPac TSK-G 2000 SWG (LKB) (21,5 x 600 mm) em sulfata de sódio 20 mM, 150 mM NaCl, pH 7,0 com um caudal de 3 ml/min. a absorção UV é vigiada a 280 nm e analizamos fracções individuais de 6 ml por SDS-PA6E como descrita no Exemplo 9.2. As fracções tomadas entre 32 e 36 min após a injecção da amostra são misturadas e concentradas 7 vezes por ultrafiltração numa célula agitada (membrana YM-10, Amicon).

9.4 - Cromatografia de permutação iónica sobre

FPLC—Mono Q™ ml da mistura concentrada após ultrafiltração do

Exempla 9.3 (concentração da proteina 4,9 mg/ml) são carregados TM numa coluna Mono Q HR 10/10 <10 mm χ 1Θ mm) (Pharmacia) equilibrada em 20 mM dietanoilamina/HCl, pH 8,5 (tampão de partida). A coluna é lavada com um caudal de 4 ml/min durante 10 min com tampão de partida. As proteinas são a seguir eluidas com um gradiente linear durante 20 min terminando com o tampão de partida/o,l M NaCl. 0 eluido é vigiado em relação à absorvência a 280 nm. 0 rMRP-70 é eluido entre 21 e 23 min após injecção da amostra (ca. de 0,55 a 0,65 M NaCl).

-739.5 - HPLC de fase inversa

Alternativamente à purificação por HPLC por exclusão do tamanho descrita no Exemplo 9.3 ou FPLC sobre Mono Q descrita no Exemplo 9.4, o conjunto concentrado após ultrafi1 tração do Exemplo 9.2 é acidificado com 1/10 do volume de ácido trifluoroacético a 10% (TFA) e purificado numa coluna Vydac 214TP510 HPLC (10 x 250 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). A coluna é equilibrada numa mistura de 70% de TFA 0,1% em água e 30% de TFA e 0,08% em acetonirilo, e o produto é eluido com um gradiente linear durante 24 min acabando com uma mistura de 50% de TFA 0,1% em água e 50% de TFA e 0,08% em acetonirilo com um caudal de 1 ml/min. 0 eluido é vigiado por absorvencia a 220 nm e os picos individuais são recolhidos manualmente de acordo com a absorvencia UV. Obtemos dois picos principais a 15 e 16,5 min, respectivamente, e analizamos como descrito a seguir no Exemplo 9.6.

9.6 - Análise por SDS-PAGE

As fracçSes aliquotas da coluna de fase inversa do Exemplo 9.5 são secas in vacuo. dissolvidas em tampão de dissociação, aquecidas durante 2 min a 96°C e aplicadas a um gel poliacrilamida a 15% (corando com Azul Coomassie R-250). 0 pico a 15 min do Exemplo 9.5 contem várias versões curtas de rMRF'-70 com pesos moleculares aproximados de 55kD, 44kD, 38kD e 33kD, respectivamente. 0 material do pico 16,5 min consiste de rMRP-70 puro migrante numa única camada com um peso molecular aproximado de 70kD.

9.7 - Análise da sequencia amino ácido □ rMRP—70 purificado do Exemplo 9.6 é submetido a uma sequencia amino ácidD N-terminal usando um sequenciador de fase

-74gasosa (Model 470, Applied Biosystems) de acordo com o método de

M. W. Hunkapillar and L. E. Hood (Methods in Enzymol. 91, 399,

1993). Os derivados ani1ino-tiazolidina são rearranjados nos amino ácidos feni1tiohidantoina (PTH) por tratamento com TFA aquoso a 25% a 50°C. Os amino ácidos PTH são analizados numa

TM coluna Zorbax CN HPLC (DuPont; 200 x 4,6 mm) de acordo com R. Knecht et al. (Anal. Biochem. 150, 65, 1983). Observamos a sequencia amino ácido M-terminal seguinte: Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly-Asn-Met-Leu-Ser. A sequencia amino ácido coincide exctamente com a sequencia prevista para cDNA de construção prevista no Exemplo 5.2.

9.8 - Análise de imunofluorescencia

Os monócitos em sacos de Teflon são colhidas tres dias após a cultura em meio de Mc Coy's (Biochrom, Berlin, FRG) suplementados com 205 de soro humano por centrifugação durante 10 min a 150 g, lavados em PBS e incubadas durante 30 min a 4°C em BSA a 1%, 1 pg/ml de IgG de ratinhos em 1 ml de PBS/lxlO^ de células. As células são lavadas duas vezes em PBS e distribuímos 1x10^ por ponto de teste em frascos Eppendorf de 1,5 ml. A incubação numa diluição própria de rMRP-70 ou MIF humano natural (Aplicação da Patente Europeia 0 162 812) (100 μΙ/ΙχΙΟ^ células em PBS) é efectuada durante 10 min a 4°C. As células são lavadas duas vezes em PBS e incubadas durante 45 min ou com anticorpo 1C5 monoclonal biotinilado (ratinho, ver EP Θ 162 812) ou soro anti-rMRP-70 (coelho). Os controlos são IgG de rato biotinilado ou IgG de coelho normal, respectivamente. Após duas lavagens em PBS/0,05% de BSA as células são incubadas com streptavidin-FITC (Sigma, Munchen, FRG) para as sondas anticorpo tratadas biotiniladas e com F(ab')₇-FITC de cabra anti-coelha (Dianova, Hamburg, FRG) para as sondas as sondas antisoro tratadas de coelho durante 45 min a 4°C. As células são lavadas duas vezes em PBS/0,05% de

BSA. Antes da última lavagem as células são resuspensas em 100 μΐ de Propidiumjodido 1 mM em F’BS, incubadas 5 min a 4°C, lavadas, e TM analisadas num classificador de células EPICS (Coulter Electronics, Hialeah, Fia., USA). As células fluorescentes vermelhas são electronicamente excluídas da medição de fluorescência verde das ! células. A percentagem de células fluorescentes verdes positivas é calculada com o programa de imunidade fornecido pela Coulter Electronics.

, A quantidade relativa das células fluorescentes é análoga para a rMRF‘-70 e MIF natural. Isto indica que ambos os MIF e rMRP-70 se ligam aos monócítos cultivados.

9.9 - Teste de inibição da migração

Monócitos revestidos da cor do couro cultivados durante um dia num meio de Dulbecco suplementado com 107 de FCS (Biochront, Berlin, FRG) sobre membranas de TeflDn são colhidos por centrifugação durante 10 min a 150 g, lavados duas vezes em meio de Dulbecco sem FCS e distribuídos em frascos de Eppendorf de 1,5 ml com 2x10^ células/ponto de teste. As células são resuspensas e incubadas durante 10 min a 4°C com 200 μΐ de F'BS com ou sem uma diluição própria de rMRP-70 ou MIF natural (EP Θ 162 812). As células são centrifugadas 5 min a 150 g, lavadas, resuspensas em 200 μΐ de PBS e incubadas durante 30 min a 37°C.

Após lavagem com PBS as células granuladas são de novo j suspensas em 4 μΐ de meio de Dulbecco contendo 0,27 de agarose da baixo ponto de fusão (Miles, Frankfurt, FRG) a 37°C. Um μΐ da suspensão celular é pipetada para um dos 60 buracos interiores de um prato com 96 buracos. Cada amostra é testada em duplicado. O prato é mantido a 4°C durante 10 min. Os buracos são cheios com

-761Ο0 μΐ/buraco de meio de Dulbecco, 107 de FCS e incubados durante 16-24 hrs a 37°C em ar húmido contendo 77 de C0_?.

Após incubação medimos a migração dos monócitos para fora das gotas de agarose com a ajuda de uma reticula graduada de um microscópico ocular, A migração das células na solução de controlo é assente como uma referencia com 1007 de migração ou Θ7 de inibição da migração. A distancia da migração é expressa como a percentagem de inibição da migração. Uma substancia é considerada biologicamente activa quando ocasiona mais do que 307 de inibição da migração.

Os resultados do teste de inibição da migração com rMRP-70 são resumidos na Tabela 4 a seguir.

Tabela 4: Inibição da imigração de monócitos cultivados por rMRP-70 concentração de pg/ml rMRP-70 inibição da migração

0,001

0,01

0,1

157.

247.

507.

577.

437.

-78Exemplo 10; Construção do vector expressão pCDEX

Digerimos 10 pg de pSVOd DNA (P. Mellon et el., Cell 27, 279, 1981) com HindIII. Os extremos pegajosos são cheios com polimerase Klenow, e após inactivação térmica do polimerase a DNA ! é digerida com Nael. 0 fragmento do vector 2,2 kb transportando a origem SV40 da duplicação é isolado por electroforese de gel agarose e electroeluição (fragmento a). Digerimos 10pg de pCGA28 DNA (Aplicação da Patente Europeia 0 305 967) com BamHI. Os ) extremos pegajosos são cheios com polimerase Klenow, e a DNA é ' desfosforilada com fosfatase de intestino de vitela. 0 fragmento

3,9kb que transporta o promotor/ampliador citomegalorius de murina (MCMV), tPA cDNA e uma união β-globina dador/receptor e um local de poli-adição, é isolado por electroforese de gel agarose e electroeluição (fragmento b). Aproximadamente 50 ng dos fragmentos a e b são ligados e transformados nas competentes células DH5«. Os plasmideos recombinantes são isolados e analizados por digestão com Pvul e HindIII. Um plasmideo originando um fragmento 1,4 kb e um fragmento 4,8 kb é designado por pCONlO. Digerimos 5 pg de pCONlO com Xmal e desfosforiÍamos com CIAP (fragmento d). 0 DNA é purificado por electroforese de gel agarose e elctroeluição.

pg de um adaptador (Biolabs # 1101) com a sequencia 5'-GATCCCCGGG-3' é quinasado com quina.se nucleótida T4 e ligado com ligase T4. Após inactivação térmica da ligase, o DNA é digerido com Xmal. Após extracção com fenol/clorofórmio, o DNA é } precipitado com etanol (adaptador e).

ng do fragmento d de DNA são ligadas a 50 ng do adaptador e e transferidas para as células competentes DH5a. □ DNA recombinante é isolado e analizado por digestão com BamHI e

-79HindlII. Um pasmideo que origina fragmentos de l,7kb e 4,4 kb é designado por pCDEX.

-80Exemplo 11; Construção de plÍRP160^ pg de pMRF'160 são digeridas com EcoRI e os extremos pegajosos são cheios com polimerase Klenow. 0 fragmento de codificação 4,7 kb para MRP-160 é isolado por electroforese de gel agarose e electroeluição (fragmento a). Digerimos 5 pg de pCDEX com Hindi II e EtamHI. Os extremas pegajosos são cheios com polimerase Klenow e a DNA é desfosforilada com CIAF‘. 0 fragmento do vector 4,5 kb é isolado por electroforese de gel agarose e electroeluição (fragmento b). Ligamos 0,1 pg dos fragmentos a e b e transformamos nas competentes células DH5a. Os DNA recombinantes são isolados e analizados por análise de restrição. Um plasmideo originando um fragmento 0,6 kb de Kpnl bem como um fragmento de 4,1 kb é designado por pMRF’160_ex·

A sequencia da região de codificação de MRP-160 é confirmada por sequenciação usando os iniciadores oligonucleótidos como acima descrito.

-eiExemplo 12: Expressão de pMRP16© em células de ovários de cricetos Chineses

12.1 - Transfectação de células CHO com pMRP e selecção de clones transfectados plasmideo pMRP 16©^ é expresso em células de linha

DUKXB1 do ovário do criceto Chinês (CHO), um mutante a que falta a enzima reductase dihidrofolato (G. Urlaub et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 77, 4216, 198©). As células são cultivadas em ct-MEM (meio essencial minimo) contendo nucleósidos e 5% de soro de feto de vitela (todos da Gibco). As células são lameladas com 4 uma densidade de 1© /cm em pratos de 6 buracos (diâmetro de 3,4 cm; Nunc) e são cotransfectadas com 4 pg de DNA do plasmideo pSV2-neo (P. Southern and P. Berg 1_, 327, 1982) seguindo processos padrão como descrito em detalhe na Patente US 4.399.216, por R. 3. Kaufman and P.A. Sharp (3. Mol. Biol. 159, 6©1, 1932) e por Asselbergs et al. (J. Mol. Biol. 189, 4©1, 1986). Numa segunda experiencia, ©,4 pg do plasmideo pND2 (DHFR) são transfectados com ©,4 pg de DNA de pMRP16© e ©,4 pg de pSV2-neo (Asselbergs © X et al., loc. cit.).

hrs mais tarde, as células transfectadas são tripsinizadas e transferidas para tres pratos Petri (8,© cm de diâmetro, Nunc). No dia seguinte, o meio não selectivo é substitudo por um meio selectivo (ct-MEM sem nucleósidos contenda 5% (v/v) de soro de feto de vitela dializado e ©,1 mg/ml de geneticina CGibcol).

Após duas semanas, isolamos 18 clones resitentes à geneticina e examinamos para a expressão de MRP-16© com um ensaio de célula única usandD os anticorpos anti-rMRP-7© de coelho de afinidade purificada do Exemplo 14.2 seguindo os protocolos

-82estabelecidos (Suter et al., Câncer Immunol. Immunother. 16, 53, 1983). Quatro clones são selectivamente corados com o anti-rMRP—70 IgG. Eles são designados por 188, 2A2, 281 e 283. Destes clones, os 2A2, 2B1 e 2B3 foram cotransfectados com o plasmideo pND2.

A imunoembebição (H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 4350, 1979) com lisatos celulares destes transfectantes indica que sob condições reduzidas (U.K. Laemmli, Nature 227, 680, 1970), os anticorpos anti-rMRP-70 do coelho reagem com espécies de peso molecular 120 e 140 kD.

12.2 - Selecção de clones que exprimem sequencia MRF—160 amplificadas com metotrexato

Uma cultura subconfluente CHO de clone 2B1 é pre-tratada com metotrexato (MTX, Sigma) durante 24 hrs e a seguir dividida 1:20 em pratos Petri com 8 cm de diâmetro (Nunc). As células são propagadas no meio selectivo ct-MEM sem nucleósidos suplementado com 5% de soro de feto de vitela dializado e 0,05 mg/ml de gentaroicina (todos da Gibco) (R. Kaufman and P.A. Sharp, loc. cit.). A selecção é iniciada após 24 hrs por adição de MTX 2Θ nM ao prato Petri. Após 14 dias, as colónias resistentes são misturadas e clonadas por diluição limitada ein pratos com 96 buracos (Falcon) num meio de selecção contendo 50 nM de MTX. Dos 16 clones isolados, tres são fortemente positivos com os anticorpos anti-rMRP-70 do coelho. 0 clone designado por 2B1-B4 é reclonado por diluição limitada num meio de selecção contendo 100 nM de MTX. Seleccionamos 8 clones resistentes, reagindo todos com o anti-rMRP-70 do coelho. Os clones designados par 2B1-B4C2 e 2B1-B4E3 são submetidos a incrementos crescentes de concentração MTX até 500 nM.

-8312.3 - Niveis MRP-160 em lisatos celulares e culturas sobrenadantes de clones CHD amplificados

Para a determinação quantitativa de rMRP-70 e MRP-160 em lisatos celulares e partes sobrenadantes da cultura CHD ) amplificada dos clones 2B1-B4C2 e 2B1-B4E3, realizamos um ensaio imunoabsorvente (ELISA) ligado à enzima em dois locais.

12.3.1 - Preparação de lisatos celulares e partes sobrena j dantes da cultura

Para a produção da cultura sobrenadante, os clones CHO 2B1, 2B1-B4C2, 2B1-B4E3 e o clone 3AB transfectado em falso CHO (Exemplo 12.1) crescem em subconfluencia e são incubados com st-MEM suplementado com 57. de soro de feto de vitela dializado durante 48-72 horas. Os clones 2B1-B4C2 e 2B1-B4E3 eceberam além disso 20O nM MTX. Após a colheita, as partes sobrenadantes são centrifugadas a 2.000 g durante 15 min, e a seguir a 12.000 g durante 15 min e armazenados a -B0^oC.

A preparação dos lisatos celulares é efectuada seguindo protocolos padrãD. Resumidamente, as células tripsinizadas ) (2;:10⁷/ml) são tratadas com tampão lysis (100 mM Tris, 100 mM

NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% de SDS Ctodos da Bioradl, 1% de Nonidet P40CShelll, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo CBoehringer Mannheiml. pH 7,5; R. J. Kaufman and P. A. Sharp, loc. cit.) durante 15 min em gelo. Depois de inverter rodando os residuos } celulares a 2.000 g durante 15 min, a parte sobrenadante é centrifugada a 12.000 g durante 15 min e armazenada a -80°C. Determinamos a concentração da proteína total de acordo com o métodD de Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193, 265, 1951).

-8412.3.2 — ELISA em dois locais

Fartes aliquotas dos lisatos celulares e partes sobrenadantes do falso transfectante 3AB, do transfectante parenteral 2B1 e dos clones tratados MTX 2B1-B4C2 e 2B1-B4E3 são testados em relação à sua concentração de rMRP-70 e MRP-160 com o ensaio de imunoabsorvencia de enzima ligada em dois locais (ELISA) descrito a seguir. A ELISA é efectuada usando a afinidade dos anticorpos purificados anti-rMRP-70 de coelho do Exemplo 14.2 seguindo protocolos padrão (E. Engvall and P. Perlman, Immunochem. 8, 871, 1971; J. Brueggen et al. , Câncer Immunol. Immunother. 15, 200, 1983). Os IgG anti-rMRP-70 de coelho (1,0 pg/ml) em tampão de carbonato 0,05 M pH 9,6 é revestido com 100 μΐ/buraco em pratos com 96 buracos (Nunc FI) e incubados durante a noite a 4°C. Após o bloqueio dos locais nãc· específicos com soilução Tris salina tamponada (TBS, 0,05 M, pH 7,4) contendo 0,27. de gelatina (Biorad), 1,07 de albumina de soro de boi (Serva) e 0,057 de Tween^ 20 (Biorad) durante 1 hr à temperatura ambiente, juntamos as amostras de teste (50 μΐ), padrões recombinantes rMRP-70 (1,9-250 ng/ml, ver Exemplo 9) e os controlos diluídos em tampão de bloqueio durante 1 hr a 37°C. 0S pratos são lavados (Skatron Microwash II) com TBS contendo IgG anti-rMRP-70 biotinilados (50 μΐ, 0,5 pg/ml; biotinilação de acordo com o protocolo modificado de Lerner et al., J. Exp. Med. 152. 1085, 1980) durante 30 min a 37 °C. Após a lavagem, juntamos 50 μΐ de conjugado fosfatase alcalina de streptavidina (Gibco BRL) durante 30 min a 37 °C. A enzima ligada é incubada com 100 μΐ de fosfato de p-nitrofenilo (1,0 mg/ml em tampão de dietanolamina 1 M, pH 9,8; Sigma) durante 30 min à temperatura ambiente, e a seguir paramos com HC1 0,5 IM. As absorvencias são vermelhas a 405 nm (Multiscan MCC, Flow). Os dados são reduzidos usando um programa de ajustamento logístico de curvas com 4 parâmetros (Flow).

Os resultados da ELISA são resumidos na Tabela 5 a seguir.

-86Tabela 5; niveis rMRP—70 e MRP-160 em lisatos celulares e partes sobrenadantes de células CHO transfectadas^a t|1inha i celular

1j lisato celular 1 (ng MRP-70/mg cultura sobrenadante^c (ng MRP-70/mg/lO⁶ células) de proteína

23,0

0,0 jcélula Iparenteral)

J2B1-B4C2 I(MTX-tratada)

1250,0

56,0

2B1-B4E3 I 892,0 (MTX-tratada) ]3AB | 0,0 [(falso | | contolo) )

1_1

66,0

0,0 ³ ELISA de dois locais; anti-rMRP-70 de coelho versus anti-rMRP-70 biotinilados de coelho; os valores são em ng/ml, com base em rMRP-70 de padrão recombinante; o liinite de detecção é 1,0 ng/ml b em relação aos mg de proteína celular total ^c as partes sobrenadantes são colhidas após 72 hrs partindo de culturas celulares subconfluentes

-87□s clones MTX tratados expressam intercelularmente aproximadamente 50 vezes mais proteinas relacionadas rMRF'-70 do que a célula parenteral 2B1. As partes sobrenadantes dos clones MTX contem 50-Ó0 ng/ml/10° células de proteina imunoreactiva, ao passo que a célula parenteral 2B1 é negativa.

Exemplo 13i Indução de reacções de inflamação na pele das cobaias

MRP-16© é testado em relação à sua capacidade para induzir reacções na pele num teste que usa cobaias normais.

As cobaias normais são barbeadas, anesteziadas e infectadas intradermalmente com 1©© μΐ cada da parte sobrenadante de várias linhas de células CHO amplificadas por MRP-16©. As reacções positivas ocasionam um avermelhamento significante numa j área de cerca de 5-12 mm de diâmetro. Várias linhas de células

CHO amplificadas por MRP-16© são observadas induzirem reacções na pele ao passo que nenhuma das células de controlo cultivadas e injectadas sob condições idênticas nem o próprio meio de cultura produzem qualquer efeito.

-89Exemplo 14; Preparação de anticorpos policlonais

14.1 - Preparação de soro anti-rMRP-70 do coelho

0,5 mg de rMRP-70 (preparado de acorda com os Exemplos 8 e 9) em adjuvante de Freund completo (Gibco) são injectadas em coelhos, seguidas após 20 dias por uma injecção de reforço de 0,5 mg de rMRP-70 em adjuvante de Freund incompleto (Gibco). 0 titulo do soro de coelho é vigiado por um ensaio imunoabsorvente de enzima ligada (ELISA) em pratos microtituladores revestidos com rMRP-70 seguindo os protocolas estabelecidos (E. Engvall and P. Perlman, Immunochem. 8, 871, 1971). 0 exame das manchas Western revela que , após absorção exaustiva com lisatos e células E. col i transfectadas, a única reactividade deixada no soro é dirigida contra rMRP-70.

14.2

Isolamento de anticorpos policlonais de coelhos específicos para rMRP-70 por cromatoqrafia de imunoafinidade

Preparamos uma coluna imunoadsorvente rMRP-70-Affigel por acoplamento de 4-5 mg de rMRP-70 purificado a 1 ml de Affigel^R IO usando o processo do fabricante (Bio-Rad). A imunoglobina G (IgG) do soro anti-rMRF'-70 monoespecifico do coelho do Exemplo 14.1 é precipitada por sulfato de amónio com 507. de saturação. 0 precipitado é dissolvido em PBS e dializado contra PBS. Bombeamos 15 ml da solução dializada contendo aproximadamente 100 mg de IgG através de uma coluna de imunoafinidade com um caudal de 10-12 ml/hr. D material não especificamente ligado é removido por lavagem da coluna com PBS/cloreto de sódio 0,4 M. IgG especificamente ligado é eluido com hidrocloreto de glicina 0,1 M pH 2,5. Juntamos as fracções contendo os anticorpos, neutralizamos por

adição de Tris 1 M e dializamos contra PBS. Obtivemos aproximadamerite 4 mg de IgG especifico para o rMRP-70.

14.3 - Preparação de oliqopeptideos representando fragmentos de MRP-70

Os oligopeptideos seguintes são sintetizados por sintese peptidea de fase sólida por etapas com amino ácidos protegidos por 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) como os seus esteres 1-hidroxibenzotriazol preformados em N-meti1pirrolidona usando o método descrito em H. Rink et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology (Ed. J. E. Rivier and G. R. Marshall), SCOM, Leiden 1990, p. 1041.

Fragmento 1 de MRP-160: Glu-Glu-Glu-Arg-Ser-Val-Leu-Asn-Asn-Gln-Leu-Leu-Glu-Met-Met-Lys-Lys correspondendo a amino ácidos 1199-1204 da SEQ ID NO:1

Fragmento 2 de MRP-160: Arg-Asn—Glu-Val-Thr-Leu-Arg-Gly-Glu—Asn—Ala-Ser—Ala correspondendo a amino ácidas 1242-1255 da SEQ ID NO:1

Fragmento 3 de MRP-160: Glu-Ile-Cys~61u-Met-Phe-Gly-His-Trp-Ala-Thr—Asn-Cys-Asn-Asp-Asp-Glu—Thr—Phe correspondendo a amino ácidos 1409-1427 da SEQ ID NO:1

Fragmento 4 de MRP-160: Ser—Thr-Pro—Ser—Ile—Pro-Gln-l_ys-Pro-Ser-Gln-Pro-Ala-Al a-Lys correspondendo a amino ácidos 162-177 da SEQ ID NO:1

-9114.4 - Antisoro de coelho dirigido contra fragmentos 1,2,3 e 4 de MRP-160

0,5 mq de cada um dos quatro oligopeptideos do Exemplo 14.3 em adjuvante de Freund completo (Gibco) são injectadas em 4 coelhos diferentes, seguidas após 20 dias por uma injecção de reforça em adjuvante de Freund incompleto (Gibco). 0 titulo do soro de coelho é vigiado por um ensaio imunoabsorvente de enzima ligada (ELISA) em pratos microtituladores (Nunc) revestidos com os peptideos respectivos como no Exemplo 14.1. A imunoglobina G (IgG) é precipitada a partir do soro com 50 de sulfato de amónio.

Preparamos uma coluna imunoadsorvente Affigel 10 por acoplamento de 4-5 mg do respectivo fragmento 1, 2, 3 e 4 de MRP-160 a 1 ml de Affigel^ 10 usando o processo do fabricante (Bio-Rad). Os quatro precipitados de IgG são dissolvidas cada um em PBS e dializados contra PBS. Bombeamos 15 ml de soluções dializadas do respectivo precipitado dD fragmenta IgG anti-MRP-160 contendo aproximadamente 100 mg de IgG através de uma coluna de imunoafinidade com um caudal de 10-Í2 ml/hr. O IgG é eluido como descrito no Exemplo 14.2. Obtivemos aproximadamente 4 mg de IgG especifico dos respectivos fragmentos 1, 2, 3 e 4 de MRP-160.

-92Exemplo 15: Preparação de células hibridoma produzindo anticorpos monoclonais contra rMRP-70

15.1 - Protocolo de imunização

Três ratos femea Balb/c foram injectados cada um intraperitonealmente com 0,1 mg de rMRP-70 em adjuvante de Freund completo (Gibco) seguido por duas injecçSes reforçadoras de O,05 mg de rMRP-70 em adjuvante de Freund incompleto (Gibco) com 14 dias de intervalo. Após 6 semanas, injectamos Ο,05 mg de rMRP-70 em solução salina fisiológica, e os ratos são sacrificados 4 dias depois.

15.2 — Fusão de células e selecção de hibridomas

Todas as fusões são efectuadas seguindo os protocolos estabelecidos (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256, 495, 1976) usando a linha de células mieloma de não segregação P3x63Ag8,653 (ATCC No. CRL 1580). Fundimod ίΟθ com 10^ células mieloma na presença de 357. (p/v) de polietileno glicol (PEG 4000, Merck) e de 15% de dimetil sulfóxido (Merck). A mistura em fusão é distribuída num meio de selecção padrão HAT suplementado com 20% de FCS (Gibco) em 1200 buracos de pratos microtituladores (Falcon) contendo exudado de células peritoneais do rato coroo células de alimentação. Após 10-14 dias, as partes sobrenadantes dos hibridomas de crescimento em relação à ligação de rMRP-70 com uma ELISA sandwich (Exemplo 16). Ds hibridomas positivos são reclona— dos por diluição limitada pela menos duas vezes.

-9315.3 - Expansão de hibridomas e isolamento e purificação de anticorpos minoclonais específicos para rMRP-7©

Ratos Balb/c com 8-1© semanas de idade são pre-tratados intraperitonealmente (i.p.) com ©,3 ml de pristane (Aldrich). 2-3 semanas mais tarde, injectamos i. p. 5-1© x 1©^ de células hibridoma clonadas e 0,2 ml de pristane. Após 8-1© dias recolhemos o fluido ascites, centrifugamos a 8©© g e armazenamos a -B©*C.

Alternativamente, os hibridomas são propagados in vitro em grande escala usando o meio hibridoma (Gibco). A parte sobrenadante é centrifugada a 8©© g, filtrada com um filtro de

R ©,45 pm de Nalgene e armazenada a -6©°C.

A imunoglabina é precipitada por adição gota a gota de ©,9 equivalentes em volume de sulfato de amónio saturado a ©°C, e a seguir dissolvemos em 2© mM Tris-HCl, 5© mM NaCl, pH 7,9. Obtemos uma fracção IgG com o uso do processo Affigel^ Protein A MAPS Kit da Bio-Rad. A fracção eluida IgG é precipitada de novo com sulfato de amónio e dissolvida em PBS com uma concentração de 1© mg/ml e dializada contra o mesmo tampão.

-94Exemplo 16: Ensaio de imunidade por enzima para detecção dos fragmentos MRP-160, rMRP-70 ou MRP-160

16.1 - Biotinilação de anticorpos policlonais e monoclonais mg de anti-rMRP-70 policlonal de coelho ou fragmento

1.2, 3 ou 4 de anti-MRP-160 do Exemplo 14 ou anti-rMRP-70 p

monoclonal anticorpo do Exemplo 15 e 0,l mg de Biotin-X-NHS (Calbiochem) reagem em 1,0 ml de tampão Hepes 0,1 M pH 8,0 durante 4 hrs a 4°C de acordo com o processo sugerido pelo fabricante. Os anticorpos biotinilados são dializados a 4^OC contra PBS e armazenados a -80°C.

16.2 - Sandwich ELISA

Os fragmentos MRP-160, rMRP-70 e MRP-160 são detectados num ensaia sandwich ELISA de dois locais descrita no Exemplo

12.3.2.

ensaio detecta rMRP-70 em células transformadas du rMRP-160 em lisatos celulares de monócitos humanos, em células transformadas e em fluidos orgânicos de doentes humanos até 1,0 ng/ml.

16.3 - Kit ou conjunto de teste para sandwich ELISA

Um kit ou conjunto de teste para a sandwich ELISA do

Exemplo 16.2 contem por exemplo:

pratos microtituladores (Nuric FI ) • 20 ml de anticorpos de coelho anti-rMRP-70 policlonais de afinidade purificada (1 pg/ml) em tampão carbonato 0,05 M pH 9,6

- 1,0 ml de solução padrão rMRP-70 recombinante (1 mg/ml) em TBS contendo 0,05% de Tween 20

- 10 ml de anticorpos de coelho anti-rMRP-70 policlonais biotinilados (0,5 pg/ml) em TBS pH 7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20

- 10 ml de fosfatase streptavidin-alcalina (BRL) 1:5000 em TBS pH 7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20

200 ml de TBS, 0,05% de Tween 20

- 200 ml de TBS pH 7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20 ml de fosfato de p-nitrofenil (1,0 mg/ml) em tampão de dietanolamina (1Μ,ρΗ9,8>

• curva de calibração manual de instrução

Exemplo 17: Detecção de linfoma de Hodqkin por ensaio de imunoco 1oração

Biópsias de nódulos minfáticos, biópsias da pele ou outras biópsias de tecidos são rapidamente arrefecidas em isopentano arrefecido por azoto liquido e armazenadas a -75°C. Cortamos secções de tecido de 5 pm, fixamos durante 15 min em acetona e secamos è temperatura ambiente. As secções são rehidratadas em PBS durante 1® min, e a seguir incubadas numa diluição 1:100 de anticorpo policlonal anti-rMRP-70 de coelho do Exemplo 14.2 durante 30 min, lavamos em PBS durante 10 min, e a seguir incubadas numa diluição 1:400 de anticorpo monoclonal anti-coelho de rato biotinilado (Dakopatts, Capenhagem, Denmark) durante 30 min. As secções são lavadas em PBS durante 10 min, e TM tratadas com o Complexo AB (avidina complexada com peroxidase biotinilada, Dakopatts) de acordo com as instruções do fabricante. D produto da reacção é desenvolvido com o substracto cromogénico AEC/peróxido de hidrogénio (50 mg de aminoetilcarbazol, 33 μΐ 30% de H^O^,, 5 ml de dimeti 1 formamida, 100 ml de tampão acetato 0,05 M, ph 6,9). As secções são lavadas em tampão acetato durante 5 min, contra coradas com hemataxilina de Mayer, montadas com geleia de glicerina e inspeccionadas com um microscópio.

Os resultados obtidos com o material de biópsia de várias origens são recolhidos na Tabela 6. A imunocoloração usando antisoro anti-rMRP-70 é claramente restringida à doença de Hodgkin e aos grandes linfomas celulares anaplásticos relacionadas .

-97Tabela 6; Imunocoloracão de linfoma de Hodqkin e outras secções de tecidos

Origem dD tecido	No. de	No. de anti-MRP-70
e diagnose	casos	corada
nódulos linfáticos de doença de Hodgkin	36	31
nódulos linfáticos de linfomas se grandes células anaplásticas (Ki-1 positivo)	4	4
nódulos linfáticos de outros linfomas não Hodgkin	10	0
nódulos linfáticas de linfadenites não especificas	4	Θ
condições inflamatórias da pele	4	0
adenocarcinoma	2	0
carcinoma epidermóide	1	0
sarcoma de tecida mole	T	0

-93Exemplo 18: Composição farmacêutica para aplicação parenteral

Dissolvemos 200 pg de MRP-160 em 3 ml de soro de albumina humana 5 N. a solução resultante é passada através de um •filtro bacteriológico e a solução filtrada é subdividida em 10 frascos, sob condições assépticas. Os frascos são de preferencia armazenados ao frio, por exemplo a -20°C.

Do mesmo modo preparamos composições contendo O,5 mg, 1 mg, 2 mg e 5 mg de albumina de soro humano 5 N. As composições farmacêuticas de alta concentração são obtidas por dissolução de 10 mg de anticorpo monoclonal dirigido a rMRP-70 (Exemplo 15) em 2 ml de solução salina fisiológica esterilizada.

!

-99Lista de sequenciação

SEQ ID NO: 1

TIFO DE SEQUENCIA: Nucleótido com a proteína correspondente COMPRIMENTO DA SEQUENCIA: 5353 pares base/1427 amino ácidos ORGANISMO FONTE ORIGINAL: humano

FONTR EXPERIMENTAL IMEDIATA: bibliotecas cDNA eni Vgtll PROPRIEDADES: inflamaçSo e marcador de linfoma de Hodgkin

GCGGCGCAGG	CGGCGGCGTC	CGAGGAGATT	TAATCCAGAG	ACTGACTTCA	50
CTATAGAACC	CACAGTTGTA	TCAATGGTTG	GGGAAAGATA	GTGGCAACAG	100
GCAAAGGAGA	AACAGCTCTG	ACATACAAAG	AAA ATG AGT Met Ser 1	ATG CTA Met Leu	145

AAG Lys 5

CCA Pro

AGT Ser

GGG Gly

CTT Leu

AAG Lys 10

GCC Ala

CCC ACC

AAG Lys

ATC Ile 15

CTG Leu

AAG Lys

CCT Pro

187

Pro

Thr

GGA

AGC

ACA

GCT

CTG

AAG

ACA

CCT

ACG

GCT

GTT

GTA

GCT

CCA

229

Gly

Ser

Thr

Ala

Leu

Lys

Thr

Pro

Thr

Ala

Vai

Vai

Ala

Pro

20

25

30

GTA

GAA

AAA

ACC

ATA

TCC

AGT

GAA

AAA

GCA

TCA

AGC

ACT

CCA

271

Vai

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Ser

Glu

Lys

Ala

Ser

Ser

Thr

Pro

35

40

45

TCA

TCT

GAG

ACT

CAG

GAG

GAA

TTT

GTG

GAT

GAC

TTT

CGA

GTT

313

Ser

Ser

Glu

Thr

Gin

Glu

Glu

Phe

Vai

Asp

Asp

Phe

Arg

Vai

50

55

60

GGG

GAG

CGA

GTT

TGG

GTG

AAT

GGA

AAT

AAG

CCT

GGA

TTT

ATC

355

Gly

Glu

Arg

Vai

Trp

Vai

Asn

Gly

Asn

Lys

Pro

Gly

Phe

Ile

65

70

CAG

TTT

CTT

GGA

GAA

ACC

CAG

TTT

GCA

CCA

GGC

CAG

TGG

GCT

397

Gin

Phe

Leu

Gly

Glu

Thr

Gin

Phe

Ala

Pro

Gly

Gin

Trp

Ala

75

80

85

GGA

ATT

GTT

TTA

GAT

GAA

CCC

ATA

GGC

AAG

AAC

GAT

GGT

TCG

439

Gly

Ile

Vai

Leu

Asp

Glu

Pro

Ile

Gly

Lys

Asn

Asp

Gly

Ser

90

95

100

-100-

GTG Vai

GCA Ala

GGA Gly 105

GTT Vai

CGG Arg

TAT Tyr

TTC Phe

CAG Gin 110

TGT Cys

GAA Glu

CCT Pro

TTA Leu

AAG Lys 115

GGC Gly

481

ATA

TTT

ACC

CGA

CCT

TCA

AAG

TTA

ACA

AGG

AAG

GTG

CAA

GCA

523

Ile

Phe

Thr

Arg 120

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr 125

Arg

Lys

Vai

Gin

Ala 130

GAA

GAT

GAA

GCT

AAT

GGC

CTG

CAG

ACA

ACG

CCC

GCC

TCC

CGA

565

Glu

Asp

Glu

Ala

Asn 135

Gly

Leu

Gin

Thr

Thr 140

Pro

Ala

Ser

Arg

GCT

ACT

TCA

CCG

CTG

TGC

ACT

TCT

ACG

GCC

AGC

ATG

GTG

TCT

607

Ala 145

Thr

Ser

Pro

Leu

Cys 150

Thr

Ser

Thr

Ala

Ser 155

Met

Vai

Ser

TCC

TCC

CCC

TCC

ACC

CCT

TCA

AAC

ATC

CCT

CAG

AAA

CCA

TCA

649

Ser

Ser 160

Pro

Ser

Thr

Pro

Ser 165

Asn

Ile

Pro

Gin

Lys 170

Pro

Ser

CAG

CCA

GCA

GCA

AAG

GAA

CCT

TCA

GCT

ACG

CCT

CCG

ATC

AGC

691

Gin

Pro

Ala 175

Ala

Lys

Glu

Pro

Ser 180

Ala

Thr

Pro

Pro

Ile 185

Ser

AAC

CTT

ACA

AAA

ACT

GCC

AGT

GAA

TCT

ATC

TCC

AAC

CTT

TCA

733

Asn

Leu

Thr

Lys 190

Thr

Ala

Ser

Glu

Ser 195

Ile

Ser

Asn

Leu

Ser 200

GAG

GCT

GGC

TCA

ATC

AAG

AAA

GGA

GAA

AGA

GAG

CTC

AAA

ATC

775

Glu

Ala

Gly

Ser

Ile 205

Lys

Lys

Gly

Glu

Arg 210

Glu

Leu

Lys

Ile

GGA

GAC

AGA

GTA

TTG

GTT

GGT

GGC

ACT

AAG

GCT

GGT

GTA

GTC

817

Gly 215

Asp

Arg

Vai

Leu

Vai 220

Gly

Gly

Thr

Lys

Ala 225

Gly

Vai

Vai

CGG

TTT

CTT

GGG

GAG

ACC

GAC

TTT

GCC

AAG

GGG

GAG

TGG

TGT

859

Arg

Phe 230

Leu

Gly

Glu

Thr

Asp 235

Phe

Ala

Lys

Gly

Glu 240

Trp

Cys

GGC

GTG

GAG

TTA

GAT

GAG

CCA

CTT

GGG

AAG

AAT

GAT

GGC

GCT

901

Gly

Vai

Glu 245

Leu

Asp

Glu

Pro

Leu 250

Gly

Lys

Asn

Asp

Gly 255

Ala

GTT

GCT

GGA

ACA

AGG

TAT

TTT

CAG

TGT

CAA

CCC

AAA

TAT

GGC

943

Vai

Ala

Gly

Thr 260

Arg

Tyr

Phe

Gin

Cys 265

Gin

Pro

Lys

Tyr

Gly 270

TTG

TTC

GCT

CCT

GTC

CAC

AAA

GTT

ACC

AAG

ATT

GGC

TTC

CCT

985

Leu

Phe

Ala

Pro

Vai

His

Lys

Vai

Thr

Lys

Ile

Gly

Phe

Pro

275 280

TCC ACT

ACA CCA

GCC Ala

AAA Lys 290

GCC AAG

GCC Ala

AAC Asn

GCA Ala 2 95

GTG Vai

AGG Arg

CGA Arg

1027

Ser 285

Thr

Thr

Pro

Ala

Lys

GTG

ATG

GCG

ACC

ACG

TCC

GCC

AGC

CTG

AAG

CGC

AGC

CCT

TCT

1069

Vai

Met 300

Ala

Thr

Thr

Ser

Ala 305

Ser

Leu

Lys

Arg

Ser 310

Pro

Ser

GCC

TCT

TCC

CTC

AGC

TCC

ATG

AGC

TCA

GTG

GCC

TCC

TCT

GTG

1111

Ala

Ser

Ser 315

Leu

Ser

Ser

Met

Ser 320

Ala

Ser

Ser

Vai

Ser 325

Ser

AGC

AGC

AGG

CCC

AGT

CGG

ACA

GGA

CTA

TTG

ACT

GAA

ACC

TCC

1153

Ser

Vai

Arg

Pro 330

Ser

Arg

Thr

Gly

Leu 335

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser 340

TCC

CGT

TAC

GCC

AGG

AAG

ATC

TCC

GGT

ACC

ACT

GCC

CTC

CAG

1195

Ser

Arg

Tyr

Ala

Arg 345

Lys

Ile

Ser

Gly

Thr 350

Thr

Ala

Leu

Gin

GAG

GCC

CTG

AAG

GAG

AAG

CAG

CAG

CAC

ATT

GAG

CAG

CTG

CTG

1237

Glu 355

Ala

Leu

Lys

Glu

Lys 360

Gin

Gin

His

Ile

Glu 365

Gin

Leu

Leu

GCG

GAA

CGG

GAT

CTG

GAG

AGG

GCG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCC

ACG

1279

Ala

Glu 370

Arg

Asp

Leu

Glu

Arg 375

Ala

Glu

Vai

Ala

Lys 380

Ala

Thr

AGC

CAC

GTG

GGG

GAG

ATA

GAG

CAG

GAG

CTA

GCT

CTG

GCC

CGG

1321

Ser

His

Vai 385

Gly

Glu

Ile

Glu

Gin 390

Glu

Leu

Ala

Leu

Ala 395

Arg

GAC

GGA

CAT

GAC

CAG

CAT

GTC

CTG

GAA

TTG

GAA

GCC

AAA

ATG

1363

Asp

Gly

His

Asp 400

Gin

His

Vai

Leu

Glu 405

Leu

Glu

Ala

Lys

Met 410

GAC

CAG

CTG

CGA

ACA

ATG

GTG

GAA

GCT

GCT

GAC

AGG

GAG

AAG

1405

Asp

Gin

Leu

Arg

Thr 415

Met

Vai

Glu

Ala

Ala 420

Asp

Arg

Glu

Lys

GTG

GAG

CTT

CTC

AAC

CAG

CTT

GAA

GAG

GAG

AAA

AGG

AAG

GTT

1447

Vai 425

Glu

Leu

Leu

Asn

Gin 430

Leu

Glu

Glu

Glu

Lys 435

Arg

Lys

Vai

GAG

GAC

CTT

CAG

TTC

CGG

GTT

GAA

GAA

GAA

TCA

ATT

ACC

AAA

1489

Glu

Asp 440

Leu

Gin

Phe

Arg

Vai 445

Glu

Glu

Glu

Ser

Ile 450

Thr

Lys

GGT

GAT

CTT

GAG

ACG

CAG

ACC

AAA

CTG

GAG

CAT

GCC

CGC

ATT

1531

Gly

Asp

Leu 455

Glu

Thr

Gin

Thr

Lys 460

Leu

Glu

His

Ala

Arg 465

Ile

AAG Lys

GAG Glu

CTT Leu

GAA CAG AGC

CTG Leu

CTC Leu

TTT Phe 475

GAA Glu

AAG Lys

ACC Thr

AAA Lys

GCT Ala 480

1573

Glu 470

Gin

Ser

GAC

AAA

CTC

CAG

AGG

GAG

TTA

GAA

GAC

ACT

AGG

GTG

GCT

ACA

1615

Asp

Lys

Leu

Gin

Arg 485

Glu

Leu

Glu

Asp

Thr 490

Arg

Vai

Ala

Thr

GTT

TCA

GAA

AAG

TCA

CGT

ATA

ATG

GAA

CTG

GAG

AAA

GAC

CTA

1657

Vai 495

Ser

Glu

Lys

Ser

Arg 500

Ile

Met

Glu

Leu

Glu 505

Lys

Asp

Leu

GCA

TTG

AGA

GTA

CAG

GAA

GTA

GCT

GAG

CTC

CGA

AGA

AGG

CTA

1699

Ala

Leu 510

Arg

Vai

Gin

Glu

Vai 515

Ala

Glu

Leu

Arg

Arg 520

Arg

Leu

GAG

TCC

AAT

AAG

CCT

GCT

GGG

GAT

GTG

GAC

ATG

TCA

CTT

TCC

1741

Glu

Ser

Asn 525

Lys

Pro

Ala

Gly

Asp 530

Vai

Asp

Met

Ser

Leu 535

Ser

CTT

TTG

CAA

GAG

ATA

AGC

TCT

TTG

CAA

GAA

AAG

TTA

GAA

GTC

1783

Leu

Leu

Gin

Glu 540

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin 545

Glu

Lys

Leu

Glu

Vai 550

ACC

CGT

ACT

GAC

CAC

CAG

AGA

GAA

ATA

ACT

TCT

CTG

AAG

GAG

1825

Thr

Arg

Thr

Asp

His 555

Gin

Arg

Glu

Ile

Thr 560

Ser

Leu

Lys

Glu

CAT

. TTT

GGA

GCC

CGG

GAA

GAA

ACT

CAT

CAG

AAG

GAG

ATA

AAG

1867

His 5 65

Phe

Gly

Ala

Arg

Glu 570

Glu

Thr

His

Gin

Lys 575

Glu

Ile

Lys

GCT

CTG

TAT

ACC

GCC

ACG

GAA

AAG

CTT

TCC

AAA

GAG

AAC

GAG

1909

Ala

Leu 580

Tyr

Thr

Ala

Thr

Glu 585

Lys

Leu

Ser

Lys

Glu 590

Asn

Glu

TCA

TTG

AAA

AGC

AAG

CTG

GAG

CAT

GCC

AAC

AAA

GAG

AAC

TCA

1951

Ser

Leu

Lys 595

Ser

Lys

Leu

Glu

His 600

Ala

Asn

Lys

Glu

Asn 605

Ser

GAT

GTG

ATA

GCT

CTA

TGG

AAG

TCC

AAA

CTG

GAG

ACT

GCC

ATC

1993

Asp

Vai

Ile

Ala 610

Leu

Trp

Lys

Ser

Lys 615

Leu

Glu

Thr

Ala

Ile 620

GCA

TCC

CAC

CAG

CAG

GCG

ATG

GAA

GAA

CTG

AAG

GTA

TCT

TTC

2035

Ala

Ser

His

Gin

Gin 625

Ala

Met

Glu

Glu

Leu 630

Lys

Vai

Ser

Phe

AGC

AAA

GGG

CTT

GGA

ACA

GAG

ACG

GCA

GAA

TTT

GCT

GAA

CTA

2077

Ser

Lys

Gly

Leu

Gly

Thr

Glu

Thr

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Leu

635 640 645

-103-

AAA Lys

ACA Thr 650

CAA ATA

GAG Glu

AAA ATG AGA

CTA Leu

GAT Asp

TAC Tyr

CAA Gin 660

CAC His

GAA Glu

2119

Gin

Ile

Lys

Met 655

Arg

ΑΤΑ

GAA

AAT

TTG

CAG

AAT

CAA

CAA

GAC

TCT

GAA

CGG

GCT

GCC

2161

Ile

Glu

Asn 665

Leu

Gin

Asn

Gin

Gin 670

Asp

Ser

Glu

Arg

Ala 675

Ala

CAT

GCT

AAA

GAG

ATG

GAA

GCC

TTG

AGG

GCT

AAA

CTG

ATG

AAA

2203

His

Ala

Lys

Glu 680

Met

Glu

Ala

Leu

Arg 685

Ala

Lys

Leu

Met

Lys 690

GTT

ATT

AAA

GAA

AAG

GAA

AAC

AGT

CTG

GAA

GCC

ATC

AGG

TCG

2245

Vai

Ile

Lys

Glu

Lys 695

Glu

Asn

Ser

Leu

Glu 700

Arg

Ser

Lys

Leu

AAA

CTG

GAC

AAA

GCA

GAA

GAC

CAG

CAT

CTC

GTA

GAA

ATG

GAA

2287

Ala 705

Ile

Asp

Lys

Ala

Glu 710

Asp

Gin

His

Leu

Vai 715

Glu

Met

Glu

GAC

ACG

TTA

AAC

AAA

TTA

CAG

GAA

GCT

GAA

ATA

AAG

GTA

AAG

2329

Asp

Thr 720

Leu

Asn

Lys

Leu

Gin 725

Glu

Ala

Glu

Ile

Lys 730

Vai

Lys

GAG

CTA

GAG

GTA

CTG

CAA

GCC

AAA

TGC

AAT

GAA

CAA

ACC

AAG

2371

Glu

Leu

Glu 735

Vai

Leu

Gin

Ala

Lys 740

Cys

Asn

Glu

Gin

Thr 745

Lys

GTT

ATT

GAT

AAT

TTT

ACA

TCA

CAG

CTC

AAG

GCT

ACT

GAA

GAA

2413

Vai

Ile

Asp

Asn 750

Phe

Thr

Ser

Gin

Leu 755

Lys

Ala

Thr

Glu

Glu 760

AAG

CTC

TTG

GAT

CTT

GAT

GCA

CTT

CGG

AAA

GCC

AGT

TCC

GAA

2455

Lys

Leu

Leu

Asp

Leu 765

Asp

Ala

Leu

Arg

Lys 770

Ala

Ser

Ser

Glu

GGT

AAA

TCG

GAA

ATG

AAG

AAA

CTT

AGA

CAG

CAG

CTT

GAG

GCA

2497

Gly 775

Lys

Ser

Glu

Met

Lys 780

Lys

Leu

Arg

Gin

Gin 785

Leu

Glu

Ala

GCT

GAG

AAA

CAG

ATT

AAA

CAT

TTA

GAG

ATT

GAA

AAG

AAT

GCT

2539

Ala

Glu 790

Lys

Gin

Ile

Lys

His 795

Leu

Glu

Ile

Glu

Lys 800

Asn

Ala

GAA

AGT

AGC

AAG

GCT

AGT

AGC

ATT

ACC

AGA

GAG

CTC

CAG

GGG

2581

Glu

Ser

Ser 805

Lys

Ala

Ser

Ser

Ile 810

Thr

Arg

Glu

Leu

Gin 815

Gly

AGA

GAG

CTA

AAG

CTT

ACT

AAC

CTT

CAG

GAA

AAT

TTG

AGT

GAA

2623

Arg

Glu

Leu

Lys 820

Leu

Thr

Asn

Leu

Gin 825

Glu

Asn

Leu

Ser

Glu 830

GTC Vai

AGT Ser

CAA Gin

GTG Vai

AAA GAG ACT

TTG Leu

GAA Glu

AAA Lys 840

GAA Glu

CTT Leu

CAG Gin

ATT Ile

2665

Lys 835

Glu

Thr

TTG

AAA

GAA

AAG

TTT

GCT

GAA

GCT

TCA

GAG

GAG

GCA

GTC

TCT

2707

Leu 845

Lys

Glu

Lys

Phe

Ala 850

Glu

Ala

Ser

Glu

Glu 855

Ala

Vai

Ser

GTT

CAG

AGA

AGT

ATG

CAA

GAA

ACT

GTA

AAT

AAG

TTA

CAC

CAA

2749

Vai

Gin 860

Arg

Ser

Met

Gin

Glu 865

Thr

Vai

Asn

Lys

Leu 870

His

Gin

AAG

GAG

GAA

CAG

TTT

AAC

ATG

CTG

TCT

TCT

GAC

TTG

GAG

AAG

2791

Lys

Glu

Glu 875

Gin

Phe

Asn

Met

Leu 880

Ser

Ser

Asp

Leu

Glu 885

Lys

CTG

AGA

GAA

AAC

TTA

GCA

GAT

ATG

GAG

GCA

AAA

TTT

AGA

GAG

2833

Leu

Arg

Glu

Asn 890

Leu

Ala

Asp

Met

Glu 895

Ala

Lys

Phe

Arg

Glu 900

AAA

GAT

GAG

AGA

GAA

GAG

CAG

CTG

ATA

AAG

GCA

AAG

GAA

AAA

2875

Lys

Asp

Glu

Arg

Glu 905

Glu

Gin

Leu

Ile

Lys 910

Ala

Lys

Glu

Lys

CTG

GAA

AAT

GAC

ATT

GCA

GAA

ATA

ATG

AAG

ATG

TCA

GGA

GAT

2917

Leu 915

Glu

Asn

Asp

Ile

Ala 920

Glu

Ile

Met

Lys

Met 925

Ser

Gly

Asp

AAC

TCT

TCT

CAG

CTG

ACA

AAA

ATG

AAC

GAT

GAA

TTA

CGT

CTG

2959

Asn

Ser 930

Ser

Gin

Leu

Thr

Lys 935

Met

Asn

Asp

Glu

Leu 940

Arg

Leu

AAA

GAA

AGA

GAT

GTA

GAA

GAA

TTA

CAG

CTA

AAA

CTT

ACA

AAG

3001

Lys

Glu

Arg 945

Asp

Vai

Glu

Glu

Leu 950

Gin

Leu

Lys

Leu

Thr 955

Lys

GCT

AAT.

GAA

AAT

GCA

AGT

TTT

CTG

CAA

AAA

AGT

ATT

GAG

GAC

3043

Ala

Asn

Glu

Asn 960

Ala

Ser

Phe

Leu

Gin 965

Lys

Ser

Ile

Glu

Asp 970

ATG

ACT

GTC

AAA

GCT

GAA

CAG

AGC

CAG

CAA

GAA

GCA

GCT

AAA

3085

Met

Thr

Vai

Lys

Ala 975

Glu

Gin

Ser

Gin

Gin 980

Glu

Ala

Ala

Lys

AAG

CAT

GAG

GAA

GAA

AAG

AAA

GAA

TTG

GAG

AGG

AAA

TTG

TCG

3127

Lys 985

His

Glu

Glu

Glu

Lys 990

Lys

Glu

Leu

Glu

Arg 995

Lys

Leu

Ser

GAC

CTG

GAA

AAG

AAA

ATG

GAA

ACA

AGC

CAC

AAC

CAG

TGT

CAG

3169

Asp

Leu 1000

Glu

Lys

Lys

Met

Glu 1005

Thr

Ser

His

Asn

Gin 1010

Cys

Gin

GAG Glu	CTG AAA Leu Lys 1015	GCC Ala	AGG Arg	TAT Tyr	GAG AGA GCC	ACT Thr	TCT Ser	GAG ACA Glu Thr 1025	AAA Lys	3211
Glu Arg 1020	Ala
ACC	AAG CAT	GAA	GAA	ATC	CTA CAG	AAC	CTC	CAG	AAG ACG	CTG	3253
Thr	Lys His Glu 1030	Glu	Ile	Leu Gin Asn 1035	Leu	Gin	Lys Thr Leu 1040
CTG	GAC ACA	GAG	GAC	AAG	CTG AAG	GGC	GCA	CGG	GAG GAG	AAC	3295
Leu	Asp Thr	Glu Asp 1045	Lys	Leu Lys	Gly Ala 1050	Arg	Glu Glu	Asn
AGT	GGC TTG	CTG	CAG	GAG	CTG GAG	GAG	CTG	AGA	AAG CAA	GCC	3337
Ser Gly Leu 1055	Leu	Gin Glu 1060	Leu Glu	Glu	Leu Arg 1065	Lys Gin	Ala
GAC	AAA GCC	AAA	GCT	GCT	CAA ACA	GCG	GAA	GAT	GCC ATG	CAG	3379
Asp Lys Ala 1070	Lys	Ala	Ala Gin Thr 1075	Ala	Glu	Asp Ala Met 1080	Gin
ATA	ATG GAA	CAG	ATG	ACC	AAA GAG	AAG	ACT	GAG	ACT CTG	GCC	3421
Ile	Met Glu 1085	Gin	Met	Thr	Lys Glu 1090	Lys	Thr	Glu	Thr Leu 1095	Ala
TCC	TTG GAG	GAC	ACC	AAG	CAA ACA	AAT	GCA	AAA	CTA CAG	AAT	3463
Ser	Leu Glu Asp 1100	Thr	Lys	Gin Thr Asn 1105	Ala	Lys	Leu Gin Asn 1110
GAA	TTG GAC	ACA	CTT	AAA	GAA AAC	AAC	TTG	AAA	AAT GTG	GAA	3505
Glu	Leu Asp	Thr Leu 1115	Lys	Glu Asn	Asn Leu 1120	Lys	Asn Vai	Glu
GAG	CTG AAC	AAA	TCA	AAA	GAA CTC	CTG	ACT	GTA	GAG AAT	CAA	3547
Glu Leu Asn 1125	Lys	Ser	Lys 1130	Glu Leu	Leu	Thr Vai 1135	Glu Asn	Gin
AAA	ATG GAA	GAA	TTT	AGG	AAA GAA	ATA	GAA	ACC	CTA AAG	CAG	3589
Lys	Met Glu 1140	Glu	Phe	Arg	Lys Glu 1145	Ile	Glu	Thr	Leu Lys 1150	Gin
GCA	GCA GCT	CAG	AAG	TCC	CAG CAG	CTT	TCA	GCG	TTG CAA	GAA	3631
Ala	Ala Ala 1155	Gin	Lys	Ser	Gin Gin 1160	Leu	Ser	Ala	Leu Gin 1165	Glu
GAG	AAC GTT	AAA	CTT	GCT	GAG GAG	CTG	GGG	AGA	AGC AGG	GAC	3673
Glu	Asn Vai	Lys 1170	Leu	Ala	Glu Glu	Leu 1175	Gly	Arg	Ser Arg	Asp 1180
GAA	GTC ACA	AGT	CAT	CAA	AAG CTG	GAA	GAA	GAA	AGA TCT	GTG	3715
Glu	Vai Thr	Ser	His	Gin	Lys Leu	Glu	Glu	Glu	Arg Ser	Vai

1185 1190

CTC AAT Leu Asn 1195	AAT Asn	CAG Gin	TTG TTA Leu Leu 1200	GAA Glu	ATG AAA AAA AGA	GAA Glu	TCC Ser	AAG Lys	3757
Met	Lys	Lys Arg 1205
TTC ATA	AAA	GAC	GCA GAT	GAA	GAG	AAA	GCT TCC	TTG	CAG	AAA	3799
Phe Ile 1210	Lys	Asp	Ala Asp Glu 1215	Glu	Lys	Ala Ser Leu 1220	Gin	Lys
TCC ATC	AGT	ATA	ACT AGT	GCC	TTA	CTC	ACA GAA	AAG	GAT	GCC	3841
Ser Ile Ser 1225	Ile	Thr Ser	Ala Leu 1230	Leu	Thr Glu	Lys Asp 1235	Ala
GAG CTG	GAG	AAA	CTG AGA	AAT	GAG	GTC	ACA GTG	CTC	AGG	GGA	3883
Glu Leu	Glu Lys 1240	Leu Arg	Asn	Glu Vai 1245	Thr Vai	Leu	Arg Gly 1250
GAA AAC	GCC	TCT	GCC AAG	TCC	TTG	CAT	TCA GTT	GT/T	CAG	ACT	3925
Glu Asn	Ala	Ser Ala Lys 1255	Ser	Leu	His Ser Vai 1260	Vai	Gin	Thr
CTA GAG	TCT	GAT	AAG GTG	AAG	CTC	GAG	CTC AAG	GTA	AAG	AAC	3967
Leu Glu 1265	Ser	Asp	Lys Vai 1270	Lys	Leu	Glu	Leu Lys 1275	Vai	Lys	Asn
TTG GAG	CTT	CAA	CTC AAA	GAA	AAC	AAG	AGG CAG	CTC	AGC	AGC	4009
Leu Glu 1280	Leu	Gin	Leu Lys Glu 1285	Asn	Lys	Arg Gin	Leu L290	Ser	Ser
TCC TCA	GGT	AAT	ACA GAC	ACT	CAG	GCA	GAC GAG	GAT	GAA	AGA	4051
Ser Ser	Gly 1295	Asn	Thr Asp	Thr	Gin 1300	Ala	Asp Glu	Asp	Glu 1305	Arg
GCC CAG	GAG	AGT	CAG ATT	GAT	TTC	CTA	AAT TCA	GTA	ATA	GTG	4093
Ala Gin	Glu	Ser 1310	Gin Ile	Asp	Phe	Leu 1315	Asn Ser	Vai	Ile	Vai 1320
GAC CTT	CAA	AGG	AAG AAT	CAA	GAC	CTC	AAG ATG	AAG	GTG	GAG	4135
Asp Leu	Gin	Arg	Lys Asn 1325	Gin	Asp	Leu	Lys Met 1330	Lys	Vai	Glu
ATG ATG	TCA	GAA	GCA GCC	CTG	AAT	GGG	AAC GGG	GAT	GAC	CTA	4177
Met Met 1335	Ser	Glu	Ala Ala 1340	Leu	Asn	Gly	Asn Gly 1345	Asp	Asp	Leu
AAC AAT	TAT	GAC	AGT GAT	GAT	CAG	GAG	AAA CAG	TCC	AAG	AAG	4219
Asn Asn 1350	Tyr	Asp	Ser Asp	Asp 1355	Gin	Glu	Lys Gin	Ser 1360	Lys	Lys
AAA CCT	CGC	CTC	TTC TGT	GAC	ATT	TGT	GAC TGC	TTT	GAT	CTC	4261
Lys Pro	Arg 1365	Leu	Phe Cys	Asp	Ile 1370	Cys	Asp Cys	Phe	Asp 1375	Leu

CAC	GAC	ACA	GAG	GAT	TGT	CCT
His	Asp	Thr	Glu 1380	Asp	Cys	Pro
GAC	CCT	ccc	CAT	TCC	ACA	CAC
Asp	Pro	Pro	His	Ser	Thr	His

1395

CGC	CCA	TAC	TGT	GAA	ATC	TGT
Arg 1405	Pro	Tyr	Cys	Glu	Ile 1410	Cys
ACC	AAC	TGC	AAT	GAC	GAC	GAA
Thr	Asn	Cys	Asn	Asp	Asp	Glu

ACC Thr	CAG Gin 1385	GCA Ala	CAG Gin	ATG Met	TCA GAG Ser Glu 1390	4303
CAT	GGC	AGT	CGG	GGT	GAG	GAA	4345
His	Gly	Ser	Arg	Gly	Glu	Glu
	1400
GAG	ATG	TTT	GGA	CAC	TGG	GCC	4387
Glu	Met	Phe	Gly	His	Trp	Ala

1415

ACC TTC TGATGAAGCC Thr Phe

4424

1420 1425

-108-

TCCAGTGGAG	AACTGGGCTT	GCTCAGACGC	ACTCGCATTG	ACACAACGTA	4474
ACACCAGCAT	TGTGTGTGCA	GACTTCAGGA	GAACTCATGT	tattttttaa	4524
CCCCGTCAAC	AAATCTAGGA	AAATATTTTG	ATCTTCAACA	AATTGCCCTT	4574
TAGTCTCCCC	GTATGAGTTA	GAATAATAAA	TATTTAGTAG	GTGAGTTTTC	4624
ACCTCGAATT	TTGTTTTCTT	GATTTTTACG	TTTGAAGACA	TTGCACCAGA	4674
TGCCATTACA	TTTATTGGCC	CCCCGACCTT	GTAGAAAAAC	CCCTACCCTC	4724
ACAATACCTT	ATTTAAGTAA	CTTTAAATTA	TGCCGTTACT	TTTCATATTT	4774
GCACCTAAGA	TATTTCCAGG	CTGCATTTGT	ATATTTAGAT	TTTTTGGTTA	4824
AGCTTTGACA	CTGGAATGAG	TTGAAAAAAT	GTGCCATTTT	GCATTTTCAT	4874
CTACTCATTT	AAAGTATTTT	attcttattc	AAAGAAATAT	CTGAGCTCTT	4924
TGCACTACCT	GTTATCAGTA	GTGCCTTTAC	TTCAGGCTTG	ATAATACTTA	4974
GGTGTGATTA	TAAAATCATG	AAGCAGGTAA	AGGGAGGGGC	AAGCCCCAAA	5024
CTGCTGTGGG	GACATTTTAT	AATCTATATG	CTGCACCCAC	TTAATCTACT	5074
GTGGTGTTTT	GTTTATTAGT	TTTGCATAAT	TTCAGCTTCT	ATATATTGTA	5124
TGTATATATT	TTTTAAAAAT	CTATATTTTG	GGAAAAAAAC	ATACACAATG	5174
TGTCTTTCTT	TTTGGACATT	TACCTTTTTG	AAAAAGAAAA	CACTTAAAAT	5224
GATCATTAGG	ACATAACAGA	CTAGGCCAGA	CATAGCATCT	TGTGGCTTTG	5274

CAACCATTTT CATTTGTTTG TTTTCCTTTT ATTTCTTCAC CAGATTTAAA 5324

TAAAAGGAGG	AATTTTCTCC	AATTTTTTTT	TCCTTCTCTG	GCAGGTATCC	5374
CCAGCAGTCA	ATTAACAATA	AGCCAGTATA	AAACACCTAA	ATAACCAATC	5424
TACAATCTCC	CTTCACAAGT	TTTTTTACTG	TTTTTAGATG	AATGTACGAT	5474
GAGAAATTCA	ACGTTAATAA	TTCTGGATTT	TCTTATCACA	AAAAAGAAAA	5524
TGAAGGACCT	CAAAGCACCT	GAACAGTTTA	TCGACCAGTT	TGAATCTATT	5574
TATCTTCATT	TGAATGTCTT	CTAGATATGT	AAAAAGTCAT	AAAATGTATC	5624
TTCCATGCTA	CATGTACAAT	AAGAACTTCT	ATAATTGTAT	ATATGCCTTT	5674
GATGTATTTT	CCCCTCAAGA	TTATCAACTG	TGTGTTCGAC	AGTGAATATT	5724
CAATCTGGTA	CCAGTTGAAA	TTTTTGGTTA	TAAATGTAAT	ACGAATTGTT	5774
TCACAAACAG	AAAACATGTA	AAGCAGTATT	AAAATTTGGC	CAAACAAGTG	5824
TTCTGTATCT	ACTTTTAATA	AATGGTTATT	CTTT		5858

f

Claims (36)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de um polipetídeo com um peso molecular aparente de cerca de 16© kD o qual é um mediador ou precursor de um mediador de inflamação, ou de um seu derivado, caracterizado pelo facto de uma solução contendo tal polipeptideo ou seu derivado ser purificada por métodos cromatográficos e, quando necessário, o composto desejado ser isolada e/ou convertido num seu derivado.
2. 2à. - Processa de acorda com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipetídeo de origem humana, ou um seu derivado.
3. 3â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipetídeo designado por MRP-16© de uma sequência de amino-ácidos dada na SEQ ID NO; 1, ou um seu derivado.

   GCGGCGCAGG CGGCGGCGTC CGAGGAGATT TAATCCAGAG ACTGACTTCA 50

   CTATAGAACC CACAGTTGTA TCAATGGTTG GGGAAAGATA GTGGCAACAG 100 >' GCAAAGGAGA AACAGCTCTG ACATACAAAG AAA ATG AGT ATG CTA 145

   Met Ser Met Leu 1

   AAG Lys 5 CCA Pro AGT Ser GGG Gly CTT Leu AAG Lys 10 GCC Ala CCC ACC AAG ATC CTG AAG CCT Pro 187 Pro Thr Lys Ile 15 Leu Lys GGA AGC ACA GCT CTG AAG ACA CCT ACG GCT GTT GTA GCT CCA 229 Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Pro Thr Ala Vai Vai Ala Pro 20 25 30 GTA GAA AAA ACC ATA TCC AGT GAA AAA GCA TCA AGC ACT CCA 271 Vai Glu Lys Thr Ile Ser Ser Glu Lys Ala Ser Ser Thr Pro 35 40 45 TCA TCT GAG ACT CAG GAG GAA TTT GTG GAT GAC TTT CGA GTT 313 Ser Ser Glu Thr Gin Glu Glu Phe Vai Asp Asp Phe Arg Vai 50 55 60 GGG GAG CGA GTT TGG GTG AAT GGA AAT AAG CCT GGA TTT ATC 355 Gly Glu Arg Vai Trp Vai Asn Gly Asn Lys Pro Gly Phe Ile 65 70 CAG TTT CTT GGA GAA ACC CAG TTT GCA CCA GGC CAG TGG GCT 397 Gin Phe Leu Gly Glu Thr Gin Phe Ala Pro Gly Gin Trp Ala 75 80 85 GGA ATT GTT TTA GAT GAA CCC ATA GGC AAG AAC GAT GGT TCG 439 Gly Ile Vai Leu Asp Glu Pro Ile Gly Lys Asn Asp Gly Ser 90 95 100

   GTG Vai GCA Ala GGA Gly 105 GTT Vai CGG Arg TAT Tyr TTC Phe CAG Gin 110 TGT Cys GAA Glu CCT Pro TTA Leu AAG Lys 115 GGC Gly 481 ATA TTT ACC CGA CCT TCA AAG TTA ACA AGG AAG GTG CAA GCA 523 Ile Phe Thr Arg 120 Pro Ser Lys Leu Thr 125 Arg Lys Vai Gin Ala 130 GAA GAT GAA GCT AAT GGC CTG CAG ACA ACG CCC GCC TCC CGA 565 Glu Asp Glu Ala Asn 135 Gly Leu Gin Thr Thr 140 Pro Ala Ser Arg GCT ACT TCA CCG CTG TGC ACT TCT ACG GCC AGC ATG GTG TCT 607 Ala 145 Thr Ser Pro Leu Cys 150 Thr Ser Thr Ala Ser 155 Met Vai Ser TCC TCC CCC TCC ACC CCT TCA AAC ATC CCT CAG AAA CCA TCA 649 Ser Ser 160 Pro Ser Thr Pro Ser 165 Asn Ile Pro Gin Lys 170 Pro Ser CAG CCA GCA GCA AAG GAA CCT TCA GCT ACG CCT CCG ATC AGC 691 Gin Pro Ala 175 Ala Lys Glu Pro Ser 180 Ala Thr Pro Pro Ile 185 Ser AAC CTT ACA AAA ACT GCC AGT GAA TCT ATC TCC AAC CTT TCA 733 Asn Leu Thr Lys 190 Thr Ala Ser Glu Ser 195 Ile Ser Asn Leu Ser 200 GAG GCT GGC TCA ATC AAG AAA GGA GAA AGA GAG CTC AAA ATC 775 GlU Ala Gly Ser Ile 205 Lys Lys Gly Glu Arg 210 Glu Leu Lys Ile GGA GAC AGA GTA TTG GTT GGT GGC ACT AAG GCT GGT GTA GTC 817 Gly 215 Asp Arg Vai Leu Vai 220 Gly Gly Thr Lys Ala 225 Gly Vai Vai CGG TTT CTT GGG GAG ACC GAC TTT GCC AAG GGG GAG TGG TGT 859 Arg Phe 230 Leu Gly Glu Thr Asp 235 Phe Ala Lys Gly Glu 240 Trp Cys GGC GTG GAG TTA GAT GAG CCA CTT GGG AAG AAT GAT GGC GCT 901 Gly Vai Glu 245 Leu Asp Glu Pro Leu 250 Gly Lys Asn Asp Gly 255 Ala GTT GCT GGA ACA AGG TAT TTT CAG TGT CAA CCC AAA TAT GGC 945 Vai Ala Gly Thr 260 Arg Tyr Phe Gin Cys 265 Gin Pro Lys Tyr Gly 270 TTG TTG GCT CCT GTC CAC AAA GTT ACC AAG ATT GGC TTC CCT 985 Leu Phe Ala Pro Vai His Lys Vai Thr Lys Ile Gly Phe Pro

   275 280

   TCC Ser 285 ACT Thr ACA Thr CCA Pro GCC Ala AAA Lys 290 GCC Ala AAG Lys GCC AAC GCA Ala 295 GTG Vai AGG Arg CGA Arg 1027 Ala Asn GTG ATG GCG ACC ACG TCC GCC AGC CTG AAG CGC AGC CCT TCT 1069 Vai Met 300 Ala Thr Thr Ser Ala 305 Ser Leu Lys Arg Ser 310 Pro Ser GCC TCT TCC CTC AGC TCC ATG AGC TCA GTG GCC TCC TCT GTG 1111 Ala Ser Ser 315 Leu Ser Ser Met Ser 320 Ala Ser Ser Vai Ser 325 Ser AGC AGC AGG CCC AGT CGG ACA GGA CTA TTG ACT GAA ACC TCC 1153 Ser Vai Arg Pro 330 Ser Arg Thr Gly Leu 335 Leu Thr Glu Thr Ser 340 TCC CGT TAC GCC AGG AAG ATC TCC GGT ACC ACT GCC CTC CAG 1195 Ser Arg Tyr Ala Arg 345 Lys Ile Ser Gly Thr 350 Thr Ala Leu Gin GAG GCC CTG AAG GAG AAG CAG CAG CAC ATT GAG CAG CTG CTG 1237 Glu 355 Ala Leu Lys Glu Lys 360 Gin Gin His Ile Glu 365 Gin Leu Leu GCG GAA CGG GAT CTG GAG AGG GCG GAG GTG GCC AAG GCC ACG 1279 Ala Glu 370 Arg Asp Leu Glu Arg 375 Ala Glu Vai Ala Lys 380 Ala Thr AGC CAC GTG GGG GAG ATA GAG CAG GAG CTA GCT CTG GCC CGG 1321 Ser His Vai 385 Gly Glu Ile Glu Gin 390 Glu Leu Ala Leu Ala 395 Arg GAC GGA CAT GAC CAG CAT GTC CTG GAA TTG GAA GCC AAA ATG 1363 Asp Gly His Asp 400 Gin His Vai Leu Glu 405 Leu Glu Ala Lys Met 410 GAC CAG CTG CGA ACA ATG GTG GAA GCT GCT GAC AGG GAG AAG 1405 Asp Gin Leu Arg Thr 415 Met Vai Glu Ala Ala 420 Asp Arg Glu Lys GTG GAG CTT CTC AAC CAG CTT GAA GAG GAG AAA AGG AAG GTT 1447 Vai 425 Glu Leu Leu Asn Gin 430 Leu Glu Glu Glu Lys 435 Arg Lys Vai GAG GAC CTT CAG TTC CGG GTT GAA GAA GAA TCA ATT ACC AAA 1489 Glu Asp 440 Leu Gin Phe Arg Vai 445 Glu Glu Glu Ser Ile 450 Thr Lys GGT GAT CTT GAG ACG CAG ACC AAA CTG GAG CAT GCC CGC ATT 1531 Gly Asp Leu 455 Glu Thr Gin Thr Lys 460 Leu Glu His Ala Arg 465 Ile

   AAG Lys GAG Glu CTT Leu GAA Glu 470 CAG Gin AGC Ser CTG Leu CTC Leu TTT Phe 475 GAA Glu AAG ACC AAA Lys GCT Ala 480 1573 Lys Thr GAC AAA CTC CAG AGG GAG TTA GAA GAC ACT AGG GTG GCT ACA 1615 Asp Lys Leu Gin Arg 485 Glu Leu Glu Asp Thr 490 Arg Vai Ala Thr GTT TCA GAA AAG TCA CGT ATA ATG GAA CTG GAG AAA GAC CTA 1657 Vai 495 Ser Glu Lys Ser Arg 500 Ile Met Glu Leu Glu 505 Lys Asp Leu GCA TTG AGA GTA CAG GAA GTA GCT GAG CTC CGA AGA AGG CTA 1699 Ala Leu 510 Arg Vai Gin Glu Vai 515 Ala Glu Leu Arg Arg 520 Arg Leu GAG TCC AAT AAG CCT GCT GGG GAT GTG GAC ATG TCA CTT TCC 1741 Glu Ser Asn 525 Lys Pro Ala Gly Asp 530 Vai Asp Met Ser Leu 535 Ser CTT TTG CAA GAG ATA AGC TCT TTG CAA GAA AAG TTA GAA GTC 1783 Leu Leu Gin Glu 540 Ile Ser Ser Leu Gin 545 Glu Lys Leu Glu Vai 550 ACC CGT ACT GAC CAC CAG AGA GAA ATA ACT TCT CTG AAG GAG 1825 Thr Arg Thr Asp His 555 Gin Arg Glu Ile Thr 560 Ser Leu Lys Glu CAT TTT GGA GCC CGG GAA GAA ACT CAT CAG AAG GAG ATA AAG 1867 His 565 Phe Gly Ala Arg Glu 570 Glu Thr His Gin Lys 575 Glu Ile Lys GCT CTG TAT ACC GCC ACG GAA AAG CTT TCC AAA GAG AAC GAG 1909 Ala Leu 580 Tyr Thr Ala Thr Glu 585 Lys Leu Ser Lys Glu 590 Asn Glu TCA TTG AAA AGC AAG CTG GAG CAT GCC AAC AAA GAG AAC TCA 1951 Ser Leu Lys 595 Ser Lys Leu Glu His 600 Ala Asn Lys Glu Asn 605 Ser GAT GTG ATA GCT CTA TGG AAG TCC AAA CTG GAG ACT GCC ATC 1993 Asp Vai Ile Ala 610 Leu Trp Lys Ser Lys 615 Leu Glu Thr Ala Ile 620 GCA TCC CAC CAG CAG GCG ATG GAA GAA CTG AAG GTA TCT TTC 2035 Ala Ser His Gin Gin 625 Ala Met Glu Glu Leu 630 Lys Vai Ser Phe AGC AAA GGG CTT GGA ACA GAG ACG GCA GAA TTT GCT GAA CTA 2077 Ser 635 Lys Gly Leu Gly Thr 640 Glu Thr Ala Glu Phe 645 Ala Glu Leu

   -115-

   AAA Lys ACA Thr 650 CAA Gin ATA Ile GAG AAA ATG AGA CTA Leu GAT Asp TAC Tyr CAA Gin 660 CAC His GAA Glu 2119 Glu Lys Met 655 Arg ΑΤΑ GAA AAT TTG CAG AAT CAA CAA GAC TCT GAA CGG GCT GCC 2161 Ile Glu Asn 665 Leu Gin Asn Gin Gin 670 Asp Ser Glu Arg Ala 675 Ala CAT GCT AAA GAG ATG GAA GCC TTG AGG GCT AAA CTG ATG AAA 2203 His Ala Lys Glu 680 Met Glu Ala Leu Arg 685 Ala Lys Leu Met Lys 690 GTT ATT AAA GAA AAG GAA AAC AGT CTG GAA GCC ATC AGG TCG 2245 Vai Ile Lys Glu Lys 695 Glu Asn Ser Leu Glu 700 Arg Ser Lys Leu AAA CTG GAC AAA GCA GAA GAC CAG CAT CTC GTA GAA ATG GAA 2287 Ala 705 Ile Asp Lys Ala Glu 710 Asp Gin His Leu Vai 715 Glu Met Glu GAC ACG TTA AAC AAA TTA CAG GAA GCT GAA ATA AAG GTA AAG 2329 Asp Thr 720 Leu Asn Lys Leu Gin 725 Glu Ala Glu Ile Lys 730 Vai Lys GAG CTA GAG GTA CTG CAA GCC AAA TGC AAT GAA CAA ACC AAG 2371 Glu Leu Glu 735 Vai Leu Gin Ala Lys 740 Cys Asn Glu Gin Thr 745 Lys GTT ATT GAT AAT TTT ACA TCA CAG CTC AAG GCT ACT GAA GAA 2413 Vai Ile Asp Asn 750 Phe Thr Ser Gin Leu 755 Lys Ala Thr Glu Glu 760 AAG CTC TTG GAT CTT GAT GCA CTT CGG AAA GCC AGT TCC GAA 2455 Lys Leu Leu Asp Leu 765 Asp Ala Leu Arg Lys 770 Ala Ser Ser Glu GGT AAA TCG GAA ATG AAG AAA CTT AGA CAG CAG CTT GAG GCA 2497 Gly 775 Lys Ser Glu Met Lys 780 Lys Leu Arg Gin Gin 785 Leu Glu Ala GCT GAG AAA CAG ATT AAA CAT TTA GAG ATT GAA AAG AAT GCT 2539 Ala Glu 790 Lys Gin Ile Lys His 795 Leu Glu Ile Glu Lys 800 Asn Ala GAA AGT AGC AAG GCT AGT AGC ATT ACC AGA GAG CTC CAG GGG 2581 Glu Ser Ser 805 Lys Ala Ser Ser Ile 810 Thr Arg Glu Leu Gin 815 Gly AGA GAG CTA AAG CTT ACT AAC CTT CAG GAA AAT TTG AGT GAA 2623 Arg Glu Leu Lys 820 Leu Thr Asn Leu Gin 825 Glu Asn Leu Ser Glu 830

   GTC Vai AGT Ser CAA GTG AAA GAG ACT Thr TTG Leu GAA Glu AAA Lys 840 GAA Glu CTT Leu CAG Gin ATT Ile 2665 Gin Vai Lys 835 Glu TTG AAA GAA AAG TTT GCT GAA GCT TCA GAG GAG GCA GTC TCT 2707 Leu 845 Lys Glu Lys Phe Ala 850 Glu Ala Ser Glu Glu 855 Ala Vai Ser GTT CAG AGA AGT ATG CAA GAA ACT GTA AAT AAG TTA CAC CAA 2749 Vai Gin 860 Arg Ser Met Gin Glu 865 Thr Vai Asn Lys Leu 870 His Gin AAG GAG GAA CAG TTT AAC ATG CTG TCT TCT GAC TTG GAG AAG 2791 Lys Glu Glu 875 Gin Phe Asn Met Leu 880 Ser Ser Asp Leu Glu 885 Lys CTG AGA GAA AAC TTA GCA GAT ATG GAG GCA AAA TTT AGA GAG 2833 Leu Arg Glu Asn 890 Leu Ala Asp Met Glu 8 95 Ala Lys Phe Arg Glu 900 AAA GAT GAG AGA GAA GAG CAG CTG ATA AAG GCA AAG GAA AAA 2875 Lys Asp Glu Arg Glu 905 Glu Gin Leu Ile Lys 910 Ala Lys Glu Lys CTG GAA AAT GAC ATT GCA GAA ATA ATG AAG ATG TCA GGA GAT 2917 Leu 915 Glu Asn Asp Ile Ala 920 Glu Ile Met Lys Met 925 Ser Gly Asp AAC TCT TCT CAG CTG ACA AAA ATG AAC GAT GAA TTA CGT CTG 2959 Asn Ser 930 Ser Gin Leu Thr Lys 935 Met Asn Asp Glu Leu 940 Arg Leu AAA GAA AGA GAT GTA GAA GAA TTA CAG CTA AAA CTT ACA AAG 3001 Lys Glu Arg 945 Asp Vai Glu Glu Leu 950 Gin Leu Lys Leu Thr 955 Lys GCT AAT GAA AAT GCA AGT TTT CTG CAA AAA AGT ATT GAG GAC 3043 Ala Asn Glu Asn 960 Ala Ser Phe Leu Gin 965 Lys Ser Ile Glu Asp 970 ATG ACT GTC AAA GCT GAA CAG AGC CAG CAA GAA GCA GCT AAA 3085 Met Thr Vai Lys Ala 975 Glu Gin Ser Gin Gin 980 Glu Ala Ala Lys AAG CAT GAG GAA GAA AAG AAA GAA TTG GAG AGG AAA TTG TCG 3127 Lys 985 His Glu Glu Glu Lys 990 Lys Glu Leu Glu Arg 995 Lys Leu Ser GAC CTG GAA AAG AAA ATG GAA ACA AGC CAC AAC CAG TGT CAG 3169 Asp Leu 1000 Glu Lys Lys Met Glu 1005 Thr Ser His Asn Gin 1010 Cys Gin

   GAG Glu CTG AAA Leu Lys 1015 GCC Ala AGG Arg TAT Tyr GAG AGA Glu Arg 1020 GCC Ala ACT Thr TCT Ser GAG ACA Glu Thr 1025 AAA Lys 3211 ACC AAG CAT GAA GAA ATC CTA CAG AAC CTC CAG AAG ACG CTG 3253 Thr Lys His Glu 1030 Glu Ile Leu Gin Asn 1035 Leu Gin Lys Thr Leu 1040 CTG GAC ACA GAG GAC AAG CTG AAG GGC GCA CGG GAG GAG AAC 3295 Leu Asp Thr Glu Asp 1045 Lys Leu Lys Gly Ala 1050 Arg Glu Glu Asn AGT GGC TTG CTG CAG GAG CTG GAG GAG CTG AGA AAG CAA GCC 3337 Ser Gly Leu 1055 Leu Gin Glu 1060 Leu Glu Glu Leu Arg 1065 Lys Gin Ala GAC AAA GCC AAA GCT GCT CAA ACA GCG GAA GAT GCC ATG CAG 3379 Asp Lys Ala 1070 Lys Ala Ala Gin Thr 1075 Ala Glu Asp Ala Met 1080 Gin ATA ATG GAA CAG ATG ACC AAA GAG AAG ACT GAG ACT CTG GCC 3421 Ile Met Glu 1085 Gin Met Thr Lys Glu 1090 Lys Thr Glu Thr Leu 1095 Ala TCC TTG GAG GAC ACC AAG CAA ACA AAT GCA AAA CTA CAG AAT 3463 Ser Leu Glu Asp 1100 Thr Lys Gin Thr Asn 1105 Ala Lys Leu Gin Asn 1110 GAA TTG GAC ACA CTT AAA GAA AAC AAC TTG AAA AAT GTG GAA 3505 Glu Leu Asp Thr Leu 1115 Lys Glu Asn Asn Leu L120 Lys Asn Vai Glu GAG CTG AAC AAA TCA AAA GAA CTC CTG ACT GTA GAG AAT CAA 3547 Glu Leu Asn 1125 Lys Ser Lys 1130 Glu Leu Leu Thr Vai L135 Glu Asn Gin AAA ATG GAA GAA TTT AGG AAA GAA ATA GAA ACC CTA AAG CAG 3589 Lys Met Glu 1140 Glu Phe Arg Lys Glu 1145 Ile Glu Thr Leu Lys 1150 Gin GCA GCA GCT CAG AAG TCC CAG CAG CTT TCA GCG TTG CAA GAA 3631 Ala Ala Ala 1155 Gin Lys Ser Gin Gin 1160 Leu Ser Ala Leu Gin 1165 Glu GAG AAC GTT AAA CTT GCT GAG GAG CTG GGG AGA AGC AGG GAC 3673 Glu Asn Vai Lys 1170 Leu Ala Glu Glu Leu 1175 Gly Arg Ser Arg Asp 1180 GAA GTC ACA AGT CAT CAA AAG CTG GAA GAA GAA AGA TCT GTG 3715 Glu Vai Thr Ser HÍS 1185 Gin Lys Leu Glu Glu 1190 Glu Arg Ser Vai

   CTC AAT AAT Leu Asn Asn 1195 CAG Gin TTG TTA Leu Leu 1200 GAA Glu ATG Met AAA Lys AAA AGA Lys Arg 1205 GAA Glu TCC Ser AAG Lys 3757 TTC ATA AAA GAC GCA GAT GAA GAG AAA GCT TCC TTG CAG AAA 3799 Phe Ile Lys 1210 Asp Ala Asp Glu 1215 Glu Lys Ala Ser Leu 1220 Gin Lys TCC ATC AGT ATA ACT AGT GCC TTA CTC ACA GAA AAG GAT GCC 3841 Ser Ile Ser 1225 Ile Thr Ser Ala Leu 1230 Leu Thr Glu Lys Asp 1235 Ala GAG CTG GAG AAA CTG AGA AAT GAG GTC ACA GTG CTC AGG GGA 3883 Glu Leu Glu Lys 1240 Leu Arg Asn Glu Vai 1245 Thr Vai Leu Arg Gly 1250 GAA AAC GCC TCT GCC AAG TCC TTG CAT TCA GTT GTT CAG ACT 3925 Glu Asn Ala Ser Ala Lys 1255 Ser Leu His Ser Vai 1260 Vai Gin Thr CTA GAG TCT GAT AAG GTG AAG CTC GAG CTC AAG GTA AAG AAC 3967 Leu Glu Ser 1265 Asp Lys Vai 1270 Lys Leu Glu Leu Lys 1275 Vai Lys Asn TTG GAG CTT CAA CTC AAA GAA AAC AAG AGG CAG CTC AGC AGC 4009 Leu Glu Leu 1280 Gin Leu Lys Glu 1285 Asn Lys Arg Gin Leu 1290 Ser Ser TCC TCA GGT AAT ACA GAC ACT CAG GCA GAC GAG GAT GAA AGA 4051 Ser Ser Gly 1295 Asn Thr Asp Thr Gin 1300 Ala Asp Glu Asp Glu 1305 Arg GCC CAG GAG AGT CAG ATT GAT TTC CTA AAT TCA GTA ATA GTG 4093 Ala Gin Glu Ser 1310 Gin Ile Asp Phe Leu 1315 Asn Ser Vai Ile Vai 1320 GAC CTT CAA AGG AAG AAT CAA GAC CTC AAG ATG AAG GTG GAG 4135 Asp Leu Gin Arg Lys Asn 1325 Gin Asp Leu Lys Met 1330 Lys Vai Glu ATG ATG TCA GAA GCA GCC CTG AAT GGG AAC GGG GAT GAC CTA 4177 Met Met Ser 1335 Glu Ala Ala 1340 Leu Asn Gly Asn Gly 1345 Asp Asp Leu AAC AAT TAT GAC AGT GAT GAT CAG GAG AAA CAG TCC AAG AAG 4219 Asn Asn Tyr 1350 Asp Ser Asp Asp 1355 Gin Glu Lys Gin Ser 1360 Lys Lys AAA CCT CGC CTC TTC TGT GAC ATT TGT GAC TGC TTT GAT CTC 4261 Lys Pro Arg 1365 Leu Phe Cys Asp Ile 1370 Cys Asp Cys Phe Asp 1375 Leu

   CAC His GAC Asp ACA GAG Thr Glu 1380 GAT Asp TGT Cys CCT Pro ACC CAG Thr Gin 1385 GCA Ala CAG Gin ATG Met TCA GAG Ser Glu 1390 4303 GAC CCT CCC CAT TCC ACA CAC CAT GGC AGT CGG GGT GAG GAA 4345 Asp Pro Pro His Ser Thr His His Gly Ser Arg Gly Glu Glu 1395 1400 CGC CCA TAC TGT GAA ATC TGT GAG ATG TTT GGA CAC TGG GCC 4387 Arg Pro Tyr Cys Glu Ile Cys Glu Met Phe Gly His Trp Ala 1405 1410 1415 ACC AAC TGC AAT GAC GAC GAA ACC TTC TGATGAAGCC 4424 Thr Asn Cys Asn Asp Asp Glu Thr Phe 1420 1425

   TCCAGTGGAG AACTGGGCTT GCTCAGACGC ACTCGCATTG ACACAACGTA 4474

   ACACCAGCAT TGTGTGTGCA GACTTCAGGA GAACTCATGT TATTTTTTAA 4524

   CCCCGTCAAC AAATCTAGGA AAATATTTTG ATCTTCAACA AATTGCCCTT 4574

   TAGTCTCCCC GTATGAGTTA GAATAATAAA TATTTAGTAG GTGAGTTTTC 4624

   ACCTCGAATT TTGTTTTCTT GATTTTTACG TTTGAAGACA TTGCACCAGA 4674

   TGCCATTACA TTTATTGGCC CCCCGACCTT GTAGAAAAAC CCCTACCCTC 4724

   ACAATACCTT ATTTAAGTAA CTTTAAATTA TGCCGTTACT TTTCATATTT 4774

   GCACCTAAGA TATTTCCAGG CTGCATTTGT ATATTTAGAT TTTTTGGTTA 4824

   AGCTTTGACA CTGGAATGAG TTGAAAAAAT GTGCCATTTT GCATTTTCAT 4874

   CTACTCATTT AAAGTATTTT ATTCTTATTC AAAGAAATAT CTGAGCTCTT 4924

   TGCACTACCT GTTATCAGTA GTGCCTTTAC TTCAGGCTTG ATAATACTTA 4974 } GGTGTGATTA TAAAATCATG AAGCAGGTAA AGGGAGGGGC AAGCCCCAAA 5024

   CTGCTGTGGG GACATTTTAT AATCTATATG CTGCACCCAC TTAATCTACT 5074

   GTGGTGTTTT GTTTATTAGT TTTGCATAAT TTCAGCTTCT ATATATTGTA 5124

   TGTATATATT TTTTAAAAAT CTATATTTTG GGAAAAAAAC ATACACAATG 5174

   TGTCTTTCTT TTTGGACATT TACCTTTTTG AAAAAGAAAA CACTTAAAAT 5224

   GATCATTAGG ACATAACAGA CTAGGCCAGA CATAGCATCT TGTGGCTTTG 5274

   CAACCATTTT CATTTGTTTG TTTTCCTTTT ATTTCTTCAC CAGATTTAAA 5324 TAAAAGGAGG AATTTTCTCC AATTTTTTTT TCCTTCTCTG GCAGGTATCC 5374 CCAGCAGTCA ATTAACAATA AGCCAGTATA AAACACCTAA ATAACCAATC 5424 TACAATCTCC CTTCACAAGT TTTTTTACTG TTTTTAGATG AATGTACGAT 5474 GAGAAATTCA ACGTTAATAA TTCTGGATTT TCTTATCACA AAAAAGAAAA 5524 TGAAGGACCT CAAAGCACCT GAACAGTTTA TCGACCAGTT TGAATCTATT 5574 TATCTTCATT TGAATGTCTT CTAGATATGT AAAAAGTCAT AAAATGTATC 5624 TTCCATGCTA CATGTACAAT AAGAACTTCT ATAATTGTAT ATATGCCTTT 5674 GATGTATTTT CCCCTCAAGA TTATCAACTG TGTGTTCGAC AGTGAATATT 5724 CAATCTGGTA CCAGTTGAAA TTTTTGGTTA TAAATGTAAT ACGAATTGTT 5774 TCACAAACAG AAAACATGTA AAGCAGTATT AAAATTTGGC CAAACAAGTG 5824

   TTCTGTATCT ACTTTTAATA AATGGTTATT CTTT

   5858

   -1214®. - Processo de acorda com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipetídeo o qual é um fragmento.
4. 5®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um fragmento de polipetídeo o qual compreende os amino-ácidos 878 a 1427 da sequência de amino-ácidos dada na SEQ ID NO: 1, atrás referida, em que o terminas de N é hidrogénio, acilo, a sequência de amino-ácidos Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly ou a sequencia de amino-ácidos Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly.
5. 6®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um derivado polipeptídico o qual é um composto em que as funções amino e/ou hidroxilo são glicosiladas ou aciladas.
6. 7®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo factD de se preparar um derivado polipepeptídico o qual é um sal farmaceuticamente aceitável.
7. 8®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um derivado polipeptídico o qual tem um peso molecular aparente de 190 kD.
8. 9®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um derivado polipeptídico o qual tem um peso molecular aparente de 14© kD.
9. 10®. - Processa de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto da solução contendo o composta desejada ser um extracto celular opcionalmente pré-purifiçado, sobrenadante celular ou filtrado de cultura de leucócitos humanas normais estimulados ou de células embriónicas epiteliais de pulmão humano, ou de microorganismos sujeitos a engenharia genética ou de linhas celulares contínuas de mamíferos.
10. 11*. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto da solução contendo o composto desejado ser obtida por cultura de células hospedeiras transformadas que expressam o composto desejado sob condições que permitem a expressão de polipeptideos heterólogos.
11. 12*. - Processo para a preparação de um DNA codificador de um polipeptídeo ou de um seu derivado de acordo com a Reivindicação 1, ou de um mutante ou de um fragmento de tal DNA, caracterizado pelD facto de as células hospedeiras transformadas que expressam o composto desejado serem cultivadas, e, quando necessário, o DNA desejado ser isolado a partir dai.
12. 13*. - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado pelD facto de se preparar um DNA codificador de MRP-160 de uma sequência denucleotídeos dada na SEQ ID NQ: 1, anteriomente referida, ou um mutante ou um fragmento de tal DNA.
13. 14*. - Processo de acordo com a Reivindicação 12 para a preparação de um DNA o qual compreende os nucleótidos 2765 a 4414 de um DNA de uma sequencia nucleótida dada na SEQ ID NO: 1.
14. 15*. - Processo para a preparação de um DNA o qual hibridiza com um DNA codificador de um polipeptídeo ou de um seu derivado de acordo com a Reivindicação 1, du de um mutante ou um fragmento de tal DNA, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras transformadas que exprimem o composto desejado serem cultivadas, e, quando necessário, o DNA desejado ser isolado a partir dai.
15. 16®. - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se preparar um DNA o qual é de origem genómica.
16. 17®. - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado pelo facto de compreender:

    a) o isolamento de mRNA a partir de células apropriadas, selecção do desejado mRNA, preparação de cDNA de cadeia única ou simples, complementar da do mRNA, e a seguir a partir dele o cDNA de cadeia dupla, ou

    b) isolamento do cDNA a partir de uma biblioteca cDNA e selecção do desejado cDNA, ou

    c) isolamento do DNA genómico a partir do tecido humano e selecção do desejado DNA, e

    d) incorporação do DNA de cadeia dupla do passo a), b) ou c) num vector de expressão apropriado,

    e) transformação das células hospedeiras apropriadas com o vector híbrido obtido,

    f) selecção das células hospedeiras transformadas as quais contem o DNA desejado a partir de células hospedeiras não transformadas, e, quando necessário,

    g) isolamento do DNA desejado e/ou conversão num seu fragmento ou mutante.
17. 18®. - Processo para a preparação de um DNA codificador de um polipeptídeo ou de um seu derivado como definido na

    Reivindicação 1, ou de um mutante ou fragmento de tal DNA, caracterizado pelo factD de os compostos desejados serem sintetizados quimicamente.
18. 19*. - Processo para a preparação de um vector híbrido, caracterizado pelo facto de um DNA codificador de um polipeptideo ou de um seu derivado como definido na Reivindicação 1, ou de um mutante ou fragmento de tal DNA estar operativamente ligado a sequências de controlo de expressão.
19. 20*. — Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por o DNA compreender a sequência de nucleotídeos dada na SEQ ID NO: 1, ou um seu mutante ou um seu fragmento.
20. 21*. - Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por o DNA compreender os nucleotídeos 2765 a 4414 de um DNA de uma sequência de nucleotídeos dada na SEQ ID NO: 1, anteriormente referida.
21. 22*. - Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se preparar o vector pMRP160.
22. 23*. - Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se preparar o vector pl*1RP160_e>í.
23. 24*. - Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por se preparar o preparação do vector pMRP70p|_.
24. 25*. - Processa para a preparação de uma célula deira que expressa um polipeptideo ou um seu derivado de com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de uma apropriada ser transformada com um vector híbrido por ração, tratamento por cálcio, microinjecçâo hospeacordo célula electropoou fusão por protoplástica, opcionalmente na presença de compostos auxiliares, e de se seleccionar a célula transformada.
25. 26â. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado pelo facto de um vector hibrido compreender um DNA codificador de um polipeptideo ou seu derivado como definido na Reivindicação i, ou um mutante ou fragmento de tal DNA, operativamente ligado a sequências de controlo de expressão.
26. 27â. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se preparar de uma célula hospedeira do genus Escherichia coli.

    2Sé. - Processo de acorda com a Reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se preparar de uma célula hospedeira de origem mamífera.
27. 29é. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se preparar de uma célula hospedeira a qual é uma célula do ovário de hamster” Chinês (CHO).
28. 30ê. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de um polipeptideo ou um seu derivado como definido na Reivindicação 1 ser misturado com um suporte farmaceuticamente aceitável.
29. 31â. - Processo para a preparação de um anticorpo policlonal especifico para um polipeptideo com um peso molecular aparente de cerca de 16Θ kD o qual é um mediador ou precursor de um mediador de inflamação ou de um seu derivado, ou de um derivada de um tal anticorpo o qual retem a especificidade do anticorpo de que deriva, caracterizado pelo facto de um mamífero ou de uma ave apropriados serem imunizados com o referida polipeptideo ou seu derivado, de se recolher α saro sanguíneo do mamífera imunizado ou os ovos da ave imunizada e, quando necessário, o anticor po ser isolado e/ou convertida num seu derivado.
30. 32â. - Processo para a preparação de um anticorpo policlonal específico para um polipeptideo com um peso molecular aparente de cerca de 160 kD o qual é um mediador ou precursor de um mediador de inflamação ou de um seu derivado, ou de um derivado de um tal anticorpo o qual retem a especificidade do anticorpo de que deriva, caracterizado pelo facto de as células do hibridoma que segregam os referidos anticorpos monoclonal serem multiplicadas in vitro ou in vivo e, quando necessário, o anticorpo ser isolado e/ou convertido num seu derivado.
31. 33â. - Processo de acordo com a Reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de se preparar um anticorpo policlonal ou monoclonal o qual é especifica para MRP-160, ou um seu derivado.
32. 34à. - Processo de acordD com a Reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de se preparar um anticorpo policlonal ou monoclonal o qual é especifico para rMRP-70, ou um seu derivado.
33. 35é. - Processo de acordo com a Reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de se preparar um anticorpo policlonal ou monoclonal o qual ê especifico para um fragmento de MRP-16Ô, ou um seu derivado.

    3óé. - Processa de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado pelo facto de se preparar um anticorpo policlonal de coelho o qual é especifico para rMRP-70.

    Ir

    -127—w 'Ά
34. 37é. - Processo de acorda com a Reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de se preparar um derivado de um anticorpo policlonal ou monoclonal o qual é seleccionado entre o grupo formado por fragmentos de anticorpo, conjugados do anticor— po com uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um quelato metálico, uma partícula paramagnêtica, avidina, biotina, e anticorpos marcados radioactivamente.
35. 38ê. - Processo para a preparação de uma linha celular de hibridoma a qual segrega anticorpos monoclonaias específicos >' para um polipeptídeo com um peso molecular aparente de cerca de

    160 kD o qual é um mediador ou precursor de um mediador de inflamação ou um seu derivado, caracterizado pelo facto de um mamífero apropriado ser imunizado com o referido polipeptídeo ou seu derivado, as células produtoras de anticorpos deste mamífero se fundirem com uma linha celular contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas, e os clones celulares que segregam os anticorpos monoclonais desejados, serem seleccionados.
36. 39§. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de um anticorpo policlonal ou monoclonal ou um seu derivado como definido na Reivindicação 31 ou 32 ser misturado com um suporte farmaceuticamente aceitável .