JP2946021B2 - タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法 - Google Patents

タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法

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JP2946021B2 JP7097763A JP9776395A JP2946021B2 JP 2946021 B2 JP2946021 B2 JP 2946021B2 JP 7097763 A JP7097763 A JP 7097763A JP 9776395 A JP9776395 A JP 9776395A JP 2946021 B2 JP2946021 B2 JP 2946021B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質の中でもタ
イマイという海ガメの甲羅を構成するタンパク質の分離
法に関する。
【0002】
【従来の技術】水溶液に溶けるタンパク質の分離は、従
来よりカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマ
トグラフィー(以下HPLC)を用いて行われるのが一
般的である。最近、疎水性(水に溶けない)の膜タンパ
ク質などのタンパク質の分離、精製が界面活性剤あるい
は変性剤を用いることにより可能となってきている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、疎水性
タンパク質の中でも、ツメ、毛髪、カメの甲羅などの硬
タンパク質からタンパク質の分離が難しく、その性質に
ついて詳しく解明されていなかった。タンパク質には、
数多くの種類があり、その分離法もさまざまな条件が必
要とされている。したがって、これまでほとんど報告が
ないような硬タンパク質の分離法の確立が望まれている
ところであった。これらの硬タンパク質の1つとしてカ
メ類の甲羅が挙げられる。特に海ガメの中でもタイマイ
の甲羅は、鼈甲細工に400年も前から用いられてきた
動物性宝石である。しかしながら、ワシントン条約によ
り平成4年末をもって、タイマイ及びその甲羅の輸入は
禁止され、鼈甲細工従事者ならびに海ガメの研究者にと
っては大きな問題となっていた。
【0004】本発明は、これまでよく使用されていた
が、その性質がよく知られていないタイマイの甲羅を構
成するタンパク質の分離法を提供することを目的として
いる。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項1の発明は、タイマイの甲羅をパウダー状に
し、変性剤としてウレア、還元剤としてジチオスレイト
ールの存在下でタンパク質の抽出を行った後、イオン交
換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用い
たHPLCにより、分子量15Kと5Kの2種のタンパ
ク質を精製する方法よりなる。
【0006】
【0007】
【0008】
【作用】分離、精製したタンパク質のアミノ酸組成分析
を行うことによりタンパク量の定量、ならびにアミノ酸
の割合がわかる。
【0009】タンパク質のアミノ酸配列を調べることに
より、現在登録してあるタンパク質とホモロジー検索が
出来る。
【0010】上記の検索を行うことにより、既存か未知
タンパク質かを知ることができる。
【0011】アミノ酸配列を基に親水性・疎水性度をコ
ンピューターで計算できる。
【0012】
【0013】
【0014】
【実施例】実施例について図面を参照して説明すると、
図1において、タイマイの甲羅を粉細機などによって粉
末状にする。この実施例では、100ミクロン以下のパ
ウダーとしたものを用いた。
【0015】これを、変性剤として例えば8M尿素、及
び還元剤としての例えば40mMジチオスレイトール
(以下DTT)、を含む20mMリン酸緩衝液、pH
6.8溶液中で4℃、一昼夜、スターラーをゆっくり攪
拌してタンパク質を抽出する。次いで、18000rp
m、30分遠心して上清を得る。
【0016】この場合、変性剤のみの使用ではタイマイ
の甲羅からタンパク質を抽出分離することは困難である
が、変性剤と共に還元剤を使用することによって、これ
まで困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することが可能となったのである。
【0017】
【0018】上清を、DTT濃度5mMにした前述の抽
出液で平衡化したCMイオン交換クロマトグラフィーに
供し、未吸着画分と吸着画分に分ける。抽出したタンパ
ク質を分離するために、HPLCなどのカラムクロマト
グラフィーを用いることが効果的である。また、カラム
につめる樹脂は、イオン交換用樹脂、逆相用樹脂などを
組み合わせて使用する方がよい。
【0019】吸着画分は、上記緩衝液に塩化ナトリウム
濃度を上げ、0.5M濃度付近で溶出される分子量50
00(以下5K)タンパク質が回収された。この画分を
逆相C18カラムを用いたHPLCにて、単一ピークに
まで精製した(図2)。
【0020】一方、未吸着画分は透析することにより沈
澱したタンパク質を、8M尿素、5mMDTTを含むト
リス緩衝液、pH9.1に溶解する。
【0021】上記溶液を同一緩衝液で平衡化したDEA
E陰イオンカラムを用いたHPLCに供した。塩化ナト
リウム濃度を上げていったら、約0.1付近で分子量1
5000(以下15K)タンパク質が溶出された。この
画分を逆相C18カラムを用いたHPLCに供し、15
Kタンパク質を単一ピークにまで精製した(図3,
4)。
【0022】5Kと15Kの両タンパク質のアミノ酸組
成は1%フェノールを含む6N塩酸、110°C、22
時間反応することにより行った。なおトリプトファンは
3%チオグリコール酸を含む5.8N塩酸、110°
C、22時間加水分解し、システインは過ギ酸酸化後シ
ステイン酸として定量した。いずれもアミノ酸は、日立
高速アミノ酸分析計L−8500により測定したのが表
1である。
【0023】
【表1】
【0024】5Kのタンパク質は、ピリジルエチル化
(PE)してそのアミノ酸配列を検討した。なおシステ
インのピリジルエチル化は、以下の方法で行った。ま
ず、タンパク質を0.5mlの6M Guanidine-HCl、5
0mM Tris-HCl 、pH8.5、1mM EDTA 、50m
M DTTに溶解し(タンパク質濃度1mg/ml)、気相
を窒素置換後、30°C、2時間反応させた。次に、4
−ビニルピリジンを加え、窒素置換し、30°C、2時
間反応した。さらに、反応液をHPLC(カラム;日本
分光 Biofine RPC-PO 、6×150mm)に供し、0.
1%TFAを含むアセトニトリルの濃度を直線的に上げ
ることによりPEタンパク質を溶出した。タンパク質
(PE化含む)のアミノ酸配列は、ABI社の477A
/120AプロテインシーケンサーによりN末端より4
9残基決定した。一方C末端はカルボキシペプチダーゼ
Yを作用することにより遊離するアミノ酸を5残基調
べ、5Kのタンパク質は、図5のような51アミノ酸か
ら成ることがわかった。
【0025】15Kのタンパク質は、N末端より16残
基までを決定した。さらに詳しく調べるためにV8プロ
テアーゼ及びプロティネースKにより酵素消化したタン
パク質を回収することにした。15Kタンパク質のV8
プロテアーゼによる消化は、以下の条件で行った。15
Kタンパク質(約8nmol)を、8M Urea に可溶化後、
50mMリン酸緩衝液水、V8プロテアーゼ(基質/酵
素=30/1、モル比)で加えた(Ureaの最終濃度5
M)。35°C、12時間反応後、2倍量の8MUrea
、DDT(最終2mM)を加えた。さらに反応物を2分間
加熱し、トリフルオロ酢酸(TFA)を加えた後、HP
LCに供し、2つのピークよりN末より重複する10〜
32残基と重複しない22残基を決定した。一方、 Pro
teinase K消化は、PE15Kタンパク質(前述の〔0
024〕方法)を用いた。約20n molのPE15Kタ
ンパク質を、6M Urea 、50mMTris-HCl 、pH8
に溶解し、 Proteinase K(基質/酵素=100/1、
モル比)を加え、33°C、75分反応させた。反応液
に粉末Urea及びDDT を加え、それぞれ最終8Mと2mM
とした。次いで熱処理後、TFAを加え酸性としHPL
Cに供した。これにより得た20のピークPK1〜20
のアミノ酸配列を調べ、最終的にN末端より76残基を
決定した(図6)。これ以外のピークPK4、5、6、
7、10、11、12、14、16、17のアミノ酸配
列は図7に示す。
【0026】決定した5Kタンパク質のアミノ酸配列を
基に、国立遺伝学研究所のデータベースを用いてホモロ
ジー検索を行った。その結果、ホモロジーを示すタンパ
ク質はほとんどなかった。
【0027】このことより5Kタンパク質は、新規タン
パク質と考えられる。
【0028】15Kタンパク質のN末端より76残基を
基にホモロジー検索を行ったところ、図8のようにニワ
トリ、ハト、アヒルなどの鳥類の羽毛、爪ケラチンと約
50%のホモロジーを示すことが明らかになった。特
に、25番目のProから51番目のLeuにかけて
は、78〜93%と非常に似ている。さらに、立体構造
に関係があると考えられているシステインは、22、2
6、30番目のものは完全に、そして6、10番目では
約70%が一致している。一方、異なる点としては分子
量の大きさが違うことである。
【0029】よって15Kタンパク質は、鳥類のケラチ
ンに似ているが新規のタンパク質と考えられる。
【0030】図9は、5Kタンパク質の親水性、疎水性
度を示しており、このタンパク質は、非常に疏水性の高
い性質をもつことを明らかにした。
【0031】図10は、15Kタンパク質の親水性、疎
水性度を示しており、このタンパク質は疎水性の高い性
質を持つことを明らかにした。
【0032】
【0033】
【0034】なお、本発明は上記実施例に限定されるも
のではなく、この発明の精神を逸脱しない範囲で種々の
改変をなし得ることは勿論である。
【0035】
【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているので、以下に記載されるような効果を奏する。
【0036】請求項1の発明によれば、これまで抽出分
離が困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することができる。
【0037】また、請求項1の発明の分離法で得られた
タンパク質は、タイマイの甲羅素材の開発に利用するこ
とができる。
【0038】
【0039】
【図面の簡単な説明】
【図1】タイマイの甲羅よりタンパク質の抽出法と精製
法を示す図である。
【図2】精製した5Kタンパク質のHPLCパターンを
示す図である。
【図3】精製した15Kタンパク質のHPLCパターン
を示す図である。
【図4】精製した15Kタンパク質のSDS−PAGE
の図である。
【図5】5Kタンパク質の全アミノ酸配列を示す図であ
る。
【図6】15Kタンパク質のN末端より76アミノ酸ま
での配列を示す図である。
【図7】15Kタンパク質の中間部およびC末端フラグ
メントと推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図8】15Kタンパク質とホモロジーを示すタンパク
質を示す図である。
【図9】5Kタンパク質の親水性、疎水性度を示す図で
ある。
【図10】15Kタンパク質の親水性、疎水性度を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C07K 14/46 C07K 1/14 C07K 1/18 C07K 1/20 C07K 16/18 C12N 15/00 BIOSIS(DIALOG) CA(STN)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 タイマイの甲羅をパウダー状にし、変性
    剤としてウレア、還元剤としてジチオスレイトールの存
    在下でタンパク質の抽出を行った後、イオン交換クロマ
    トグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用いたHPL
    Cにより、分子量15Kと5Kの2種のタンパク質を精
    製することを特徴とするタイマイの甲羅からのタンパク
    質の分離法。
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CN103630646B (zh) * 2013-10-30 2015-12-02 山东东阿阿胶股份有限公司 一种胶类中药及其制品中龟源性成分的检测方法
CN109142563B (zh) * 2018-07-25 2021-03-02 山西广誉远国药有限公司 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用

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