CN102319419A

CN102319419A - 甲鱼肽在制药中的应用

Info

Publication number: CN102319419A
Application number: CN201110236234A
Authority: CN
Inventors: 钟虹光; 易敏之; 卢建中; 刘根云; 马莉
Original assignee: Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-08-18
Filing date: 2011-08-18
Publication date: 2012-01-18
Also published as: WO2013023442A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种甲鱼肽的新用途，即在制药中的新应用；本发明的另一目的是提供一种能抑制癌细胞生长和转移，有较高的营养价值，吸收率高，不妨害人体身体健康的药物或保健食品，本发明甲鱼低聚肽是以甲鱼为主要原料，分子量分布在10000Dalton以内的小分子肽，其中140-1000分子量范围占50%以上。

Description

甲鱼肽在制药中的应用

技术领域

本发明涉及甲鱼肽的用途，尤其是涉及在抑制肿瘤药物领域中的用途。

背景技术

肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，一般所说的癌即指恶性肿瘤，世界每年死于癌症的人数多达数百万人，而自1997年以来，癌症成为中国人的第一死因，每年有近130万人死于癌症，现在抑制癌细胞的生长与转移的方法主要有手术，化疗和放疗，一般对身体的伤害较大，容易使人的免疫力下降。

申请号201010103157.9专利文献中公开了甲鱼小分子多肽的制备方法；《中国食品学报》2008，02：徐怀德等“甲鱼蛋白酶解产物体外ACE抑制和抗氧化活性研究”公开了体外实验证实甲鱼蛋白酶解物ACE抑制和抗氧化活性的作用；现有技术和专利中均未述及甲鱼低聚肽关于辅助抑制肿瘤细胞生长或转移应用的报导，也没有关于分子量在1000以下的甲鱼低聚肽在治疗和预防抗肿瘤方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供甲鱼肽的新用途，即在制药中的新应用；本发明的另一目的是提供一种能抑制癌细胞生长和转移，有较高的营养价值，吸收率高，不妨害人体身体健康的药物或保健食品。

本发明甲鱼肽是以甲鱼为主要原料，分子量分布在10000Dalton以内的小分子肽，其中140-1000Dalton分子量范围占50%以上。

本发明还涉及甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

涉及分子量分布在10000Dalton以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

涉及分子量分布在2000Dalton以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

涉及分子量分布在140～1000Dalton范围以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

涉及分子量分布在300～700Dalton范围以内的甲鱼肽在作为制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

本发明的甲鱼肽是鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的全体为原料制备的。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用分子量在140～10000Dalton的甲鱼低聚肽的药理实验及结果来说明其在制药领域的新用途。

分子量小于10000Dalton的甲鱼肽抑制肿瘤的生长和转移的功效研究。

1. 材料与方法

1.1 样品来源及处理：受试药为甲鱼肽口服液干粉，1g甲鱼肽/干粉，由江中药业股份有限公司提供，人临床服用量为4g甲鱼肽/d，100ml/d。

1.2 实验动物及环境：清洁级健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，江西中医学院实验动物中心提供,许可证号：SCXK(赣）2006－0001。动物饲养于江西中医学院动物室，环境许可证:SYXK(赣)2004-0001，饲养环境温度21～23℃，相对湿度50～60%。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组：根据体重随机分为4组，每组10只。设立空白对照组、甲鱼肽口服液低、中、高剂量组。

1.3.2 剂量设计：甲鱼肽口服液每人每日推荐摄入量为：4.0g/60kg体重。由此推算出小鼠每日摄入量为：低剂量组，3.33g生药/kg体重；中剂量组，6.67g生药/kg体重；高剂量组，13.34g生药/kg体重，分别相当于人每日摄入量的5、10和20倍。将样品以蒸馏水配制成相应浓度（0.1665g干粉/ml、0.3335g干粉/ml、0.667g干粉/ml）的灌胃液进行实验，小鼠灌胃量按0.2ml/10g体重计算。每日灌胃1次，连续30天。各组小鼠均饲以普通饲料，自由进食、饮水。30天后对各亚组小鼠进行辅助抑制肿瘤功能检验。

1.3.3 甲鱼肽对小鼠肉瘤S180 的抑瘤作用：将腹腔接种小鼠肉瘤S180 细胞后8 天的昆明小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取出腹水，用生理盐水1:2 稀释，给每只小鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。接种后次日，甲鱼肽口服液低、中、高剂量给分别按3.33g生药/kg体重、6.67g生药/kg体重、13.34g生药/kg体重灌胃低、中、高浓度的甲鱼肽药液，每天1次，连续给药30天。末次给药后24 小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重、瘤重，计算肿瘤生长抑制率（%），计算公式为：

肿瘤生长抑制率％＝（对照均组平均瘤重-治疗组平瘤重）÷对照组平均瘤重× 100%。

1.3.4 甲鱼肽对小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌的抑瘤作用：用小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌生长良好的瘤源，无菌条件下取荷瘤动物的实体瘤组织，用剪刀剪成小碎块，用套管针移植或用玻璃匀浆器加无菌生理盐水磨成匀浆，计数每ml 匀浆液中的瘤细胞数，给每只动物皮下接种2×106 细胞。接种后24 小时分组给药，甲鱼肽口服液低、中、高剂量给分别按3.33g生药/kg体重、6.67g生药/kg体重、13.34g生药/kg体重灌胃低、中、高浓度的甲鱼肽药液，每天1次，连续给药30天。末次给药后24 小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重、瘤重，计算肿瘤生长抑制率（%），计算公式为：

肿瘤生长抑制率％＝（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）÷对照组平均瘤重× 100%。

1.3.5 甲鱼肽对S180小鼠、Lewis 肺癌小鼠脾淋巴细胞转化的影响：接种瘤液与给药同1.3.3和1.3.4。末次给药后24小时取脾脏，分别在筛网上研磨、离心、计数单个细胞，配成终浓度，颈椎脱臼处死动物。无菌条件下取出脾为2.5×10⁶ 个细胞/ml，分别加入96 孔板中，同时设空白对照孔。置37℃ 5% CO2 培养箱中培养72 小时，培养结束前6 小时向每孔加入[³H]-TdR，终浓度为1μCi/孔。多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，烤干，放入加有4ml 闪烁液的测量瓶中，液闪仪上测定每个样品的cpm 值。

1.3.6 甲鱼肽对S180小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响：接种瘤液与给药同1.3.3 末次给药后24小时处死小鼠，按4 mL/只腹腔注射含小牛血清Hank’s液，轻轻按摩腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2ml于试管内（或用注射器），用1ml加样器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀，用注射器（装大针头）吸取0.5ml混合液，加入玻片的琼脂圈内，放置孵箱内37℃孵育15～20min，孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，姬姆萨液染色15min，用蒸馏水冲洗干净，晾干，油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数，以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

吞噬百分率%＝（吞噬鸡红细胞的巨噬数/计数巨噬细胞数）×100%

吞噬指数＝被吞噬鸡红细胞数/吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

1.3.7 甲鱼肽对Lewis 肺癌小鼠碳粒廓清实验的影响：接种瘤液与给药同1.3.4。

小鼠末次给药后，从尾静脉注入用生理盐水稀释3-4 倍印度墨汁0.1ml/10g体重，分别于注入墨汁后2 min 和10 min 时分别从小鼠眼内眦静脉丛取血20 μL，并立即加到2 mL0.1%Na2CO3 溶液中，混匀，在600 nm 波长处测光密度值(OD)，以0.1%Na2CO3 溶液作为空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸擦干，

分别称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。

1.3.7 甲鱼肽对Lewis 肺癌小鼠NK细胞活性的影响(乳酸脱氢酶测定法)：　接种瘤液与给药同1.3.4。小鼠末次给药后，颈椎脱臼处死小鼠,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s 液的小平皿中,研磨脾脏,制成单细胞悬液，经200 目筛网过滤，用Hank’s 液洗2 次，每次离心10min(1000r·min ^- 1) ,弃上清液将细胞浆弹起,加入015mL 灭菌水20s ,裂解红细胞后再加入0.5mL 2 倍Hank’s 液及8mLHank’s 液,离心10min (1000r·min ^- 1) ，用1mL 10 %小牛血清RPMI1640 完全培养液重悬，用1 %乙酸稀释后计数,台盼蓝染色计数活细胞数(均在95 %以上) ，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为2 ×10⁷ 个/ mL 。试验前24h 将靶细胞( YAC21 细胞) 传代培养,应用前以Hank’s 液洗3 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4 ×10⁵ 个/ mL 。取YAC21 细胞和脾细胞各100μL (效靶比50∶1) 加入U 型96 孔培养板中, YAC21 细胞自然释放孔加YAC21 细胞和培养液各100μL ,上述各项设3 个平行孔,于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养4h ,然后将96 孔培养板以1500r·min ^- 1离心5min ,每孔吸取上清液100μL 置平底96 孔培养板中, 同时加入LDH 基质液100μL , 反应8min , 每孔加入1mol·L ^- 1的HCl 30μL ,在酶标仪490nm 处测定光密度值。

1.3.84 统计方法：实验数据以表示，采用单因素方差分析，比较模型对照组、甲鱼伏组之间的差异，P<0.05判断为差异具有显著性。

2 结果

2.1甲鱼肽口服液对小鼠肉瘤S180 的抑瘤作用：

甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠肉瘤S180 有较强的抑制作用，抑制率分别为30.86％和46.91%（P<0.05），见表1。

表1 甲鱼肽口服液对小鼠肉瘤S180 的抑瘤作用的影响（

）

与模型对照组比较，*P<0.05；

2.2甲鱼肽口服液对小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌的抑瘤作用

甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌有较强的抑制作用，抑制率分别为39.6％和50.0%（P<0.05），见表2。

表2 甲鱼肽口服液对小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌的抑瘤作用的影响（

）

与模型对照组比较，*P<0.05；

2.3 甲鱼肽口服液对移植性肿瘤LS180小鼠、Lewis 肺癌小鼠脾淋巴细胞转化率的影响

甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠移植性肿瘤LS180小鼠、Lewis 肺癌小鼠脾淋巴细胞转化率均有较强的提高作用，见表3。

表3 甲鱼肽口服液对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响（

）

与模型对照组比较，*P<0.05；

2.4 甲鱼肽口服液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响：与模型对照组比较, 甲鱼肽口服液中、高剂量组均有显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率的作用(P<0.05) 。实验结果见表4。

表4 甲鱼肽口服液对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（

）

与模型对照组比较，*P<0.05；

2.5 甲鱼肽口服液对小鼠碳粒廓清功能的影响：与模型对照组比较, 甲鱼肽口服液中、高剂量组均有显著提高吞噬指数的作用(P<0.05) 。实验结果见表5。

表5 甲鱼肽口服液对小鼠碳粒廓清功能的影响（

）

与模型对照组比较，*P<0.05；

2.6 甲鱼肽口服液对小鼠NK细胞活性的影响：与模型对照组比较, 甲鱼肽口服液低、中、高剂量组小鼠NK细胞活性无显著性差异（P>0.05）结果见表6。

表6 甲鱼肽口服液对小鼠NK细胞活性的影响（

）

。

3. 结论:

根据甲鱼肽口服液复合粉人群推荐日摄入量4.0g生/60kg体重扩大5、10和30倍设置低、中、高三个剂量组，即3.33g生药、6.67g生药、13.34g生药/kg体重，另设移植性肿瘤LS180小鼠、Lewis 肺癌小鼠模型对照组。灌胃给予相应药物30天后进行检测相关指标。实验结果以P<0.05判断为差异具有显著性。经动物实验研究表明：甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠肉瘤S180 有较强的抑制作用，抑制率分别为30.86％和46.91%；甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠移植性肿瘤Lewis 肺癌有较强的抑制作用，抑制率分别为39.6％和50.0%。甲鱼肽口服液中、高剂量对小鼠移植性肿瘤LS180小鼠、Lewis 肺癌小鼠脾淋巴细胞转化率均有较强的提高作用；甲鱼肽口服液中、高剂量组均有显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和小鼠碳粒廓清能力的作用；甲鱼肽口服液低、中、高剂量组小鼠NK细胞活性无显著性差异，认为甲鱼肽口服液具有辅助抑制肿瘤功能。

经过实验发现，分子量140-10000的甲鱼低聚肽能抑制肿瘤的生长和转移，可用于制备辅助抑制肿瘤的生长和转移的食品或药品，有很好的应用前景。

具体实施方式

实施例1

一、甲鱼低聚肽制法：

1.以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，去除内脏和油脂，搅碎，加入1000L纯水，100°C煎煮2h；

2.冷却至60°C，按原料甲鱼的重量的2%的比率加入碱性蛋白酶2kg，70℃恒温酶解3h,再分别按原料甲鱼重量的0.5%的比率加入风味蛋白酶0.5kg，55℃恒温酶解0.5h,将得到的酶解液升温至100°C，灭酶30min；

3.将酶解液离心后过滤，上清液经过膜截留分子量为10万道尔顿的中空超滤膜超滤，进口压力为1.8-2.5bar，出口压力1.5-1.8bar,酶解液温度为20-30°C进行超滤分离，薄膜浓缩，喷雾干燥即得到14.6kg粉末甲鱼低聚肽，加入345升纯水，配制成甲鱼肽口服液。

二、甲鱼低聚肽含量测定：

1．方法提要

低分子量的蛋白质水解物（包含肽类及游离氨基酸）可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质物质，测定出离心清液中的酸溶蛋白质含量，清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为低聚肽的含量。

2．分析步骤

2.1 酸溶蛋白质含量的测定

称取2g（精确至1mg）样品，加入10mL15%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10min。将样品溶液在4000rpm下离心10min后，取全部清液，按GB/T 5009.5规定的方法测定清液中的酸溶蛋白质，蛋白质换算系数为6.25。检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。

2.2 游离氨基酸含量的测定

样品前处理：称取20～30mg样品，精确到0.0001g，用3％磺基水杨酸溶液溶解均匀。将样品溶液转移至50ml容量瓶中，定容。将样品溶液在转速为4000r/min离心机上离心5min得清液，再用0.45μm微孔滤膜过滤清液，将滤液转移至50ml容量瓶中，定容后作为仪器检测用样品。其余操作同GB 12292水果、蔬菜汁游离氨基酸含量的测定规定的方法。

2.3 结果的表述

低聚肽的含量

按式（1）计算：

……………………………………………………（1）

式中：

——样品中低聚肽含量（以干基计），%；

——样品中酸溶蛋白质含量（以干基计），%；

——样品中游离氨基酸含量（以干基计），%。

2．4测定结果

测定甲鱼低聚肽含量，结果见表7。

表7肽粉中低聚肽的含量测定结果

样品	甲鱼低聚肽
		低聚肽含量	75.6%

3.相对分子质量小于1000的肽所占比例(高效凝胶过滤色谱法)

3.1方法提要

采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件（即GPC软件），对色谱图及其数据进行处理，计算得到低聚肽的相对分子质量大小及分布范围。

3.2试剂

乙腈：色谱纯；三氟醋酸：分析纯；水：超纯水或二次蒸馏水。

相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素C（cyyochrome,MW12500）；抑酞酶（aprotinin,MW6500）；杆菌酶（bacitracin,MW1450）；乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451）；乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW189）。

3.3仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；流动相真空抽滤脱气装置；超声波振荡器；分析天平：感量0.0001g。

3.4色谱条件与系统适应性实验

色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱；流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1（体积比）检测波长：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数（N）按三肽标准品（乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸）峰计算不低于5000，低聚肽的分配系数（Kd）应在0～1之间。

3.5相对分子质量校正曲线制作

分别用流动相配制成0.1%（W/V）的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数（lgMW）对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

3.6样品制备

称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。

3.7相对分子质量的计算

将3.6 制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000以下的肽的峰面积相对百分比之和。

3.8测定结果

甲鱼低聚肽分子量分布范围测定结果见表8

表8甲鱼低聚肽结果

分子量范围	开始时间min	结束时间min	重均分子量	峰面积%（λ220nm）
					1000-10000	14.036	19.034	1379	9.20
500-1000	19.034	20.566	652	27.11
					140-500	20.566	23.284	321	51.35
70-140	23.284	24.855	104	12.34

以上结果表明，甲鱼低聚肽分子量主要集中在140-1000，占70%以上。

实施例2

甲鱼肽制法：

一、甲鱼低聚肽的制备方法，其步骤如下：

1. 以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，搅碎，煎煮1h；

2. 冷却至50°C，按原料甲鱼的重量的1%的比率加入碱性蛋白酶，50℃恒温酶解1h,再分别按原料甲鱼重量的0.15%的风味蛋白酶，50℃恒温酶解1h,将得到的酶解液升温至85°C，灭酶20min；

3. 将酶解液离心，上清液经过膜截留分子量为0.5万道尔顿的管式滤膜精制分离，进口压力为1.2bar，出口压力1bar,酶解液温度为20°C进行超滤分离，薄膜浓缩，喷雾干燥即得到9.2kg甲鱼肽成品。

二、甲鱼肽含量测定：

按照实施例1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在140-2000，占50%以上。

实施例3

一、甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1. 以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg ，搅碎，煎煮4h；

2. 冷却至40°C，按原料甲鱼的重量的5%的比率加入碱性蛋白酶，40℃恒温酶解10h,或加入原料甲鱼重量的2%的中性蛋白酶，40℃恒温酶解4h,将得到的酶解液升温至120°C，灭酶60min;浓缩，喷雾干燥即得。

二、甲鱼肽含量测定：

按照实施例1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在10000以下，占99%以上。

实施例4

一、甲鱼低聚肽的制备方法，其步骤如下：

1.以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，去除内脏和油脂，搅碎，煎煮1.5-3h；

2.冷却至50-62°C，按原料甲鱼的重量的0.5-3%的比率加入碱性蛋白酶，60℃恒温酶解2-4h,再分别按原料甲鱼重量的0.25-1%的风味蛋白酶，60℃恒温酶解0.3-2h,将得到的酶解液升温至110°C，灭酶40min;

3.将酶解液离心后过滤，上清液经过膜截留分子量为10万道尔顿的卷式超滤膜精制分离，进口压力为2.8bar，出口压力2bar,酶解液温度为30°C进行超滤分离，薄膜浓缩，喷雾干燥即得到12.4kg甲鱼低聚肽成品。

二、甲鱼低聚肽含量测定：

按照实施例1的方法，甲鱼低聚肽分子量主要集中在300-700，占30%以上。

Claims

1. 甲鱼肽在制备防治肿瘤疾病的药中的应用。

2.根据权利要求1所述的甲鱼肽，其特征在于：甲鱼肽分子量分布在10000Dalton以内。

3.根据权利要求2所述的甲鱼肽，其特征在于：甲鱼肽分子量分布在2000Dalton以内。

4.根据权利要求3所述的甲鱼肽，其特征在于：甲鱼肽分子量分布在140～1000Dalton范围以内。

5.根据权利要求4所述的甲鱼肽，其特征在于：甲鱼肽分子量分布在300～700Dalton范围以内。