JPH02219589A - ペプチドの製造方法 - Google Patents

ペプチドの製造方法

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JPH02219589A
JPH02219589A JP1132895A JP13289589A JPH02219589A JP H02219589 A JPH02219589 A JP H02219589A JP 1132895 A JP1132895 A JP 1132895A JP 13289589 A JP13289589 A JP 13289589A JP H02219589 A JPH02219589 A JP H02219589A
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peptide
residue
formula
ser
amino acid
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Kazuhisa Kashimoto
和久 樫本
Katsukiyo Sakurai
桜井 勝清
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Seikagaku Corp
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  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的] (産業上の利用分野) 本発明は、ペプチドの製造方法に関するものであり、詳
しくは環状ペプチド、例えば合成カルシトニン誘導体の
合成中間体として有用な環状ペプチドの製造方法に関す
る。
(従来の技術) 従来より、強力な血清カルシウム及びリン低下、骨形成
促進作用及び骨吸収抑制作用、尿中リン排泄促進作用等
の優れた薬理作用を有するポリペプチドとして、カルシ
トニンが広く知られている。カルシトニンは、ヒトなど
の各種哨乳動物の甲状腺から、又は魚類、円ロ類、鳥類
の鯰後体から抽出採取され、そのアミノ酸配列が明らか
にされており、この配列に基づき類似構造の合成カルシ
トニンに関する報告も多く存在する。動物由来のカルシ
トニンは、いずれも32個の構成アミノ酸からなるポリ
ペプチドであって、その1番目と7番目のアミノ酸がシ
スティンであり、両者のメルカプト基がジスルフィド結
合を形成し、そしてカルボキシル基末端がプロリンアミ
ドである点で全て共通している。
合成カルシトニン誘導体としては、l及び7番目のシス
ティンを次式: %式% (式中、nは3〜7の整数を表す、) で示されるα−アミノ酸で置き換えたものが知られてお
り、そこでは次式: %式% (式中、AはSer、  Gly又はAlaを、BはA
sn又はSerを、Xは水酸基又はペプチド化学で常用
のカルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペ
プチド残基な、Rは活性エステル残基な表し、nは前記
と同義であり、各アミノ酸残基はペプチド化学で常用の
保護基で保護されていてもよい) で示されるペプチドを液相中で環化反応に付し、カルシ
トニンの一部に相当するペプチドフラグメントを液相中
で更にカップリングさせること(以下「液相合成法」と
いう、)により、目的とするカルシトニン誘導体を合成
している(特公昭53−41677号公報、特開昭61
−112099号公報、特開昭63−203699号公
報、ファルマシアレビューNo、3r新しい薬を求めて
 生理活性ペプチド」 (ファルマシアレビュー編集委
員会編)153−154頁等)。
(発明が解決しようとする課題) しかしながら、従来の液相合成法ではアミノ酸の数が増
すに従ってその溶解度が微妙に変化し、適当な溶媒を見
出すのが次第に困難になり、それにつれて未反応物や副
生成物との分離の困難さも増大して(る、特に、環化反
応においては副生成物の生成を極力抑えるため、溶媒で
希釈しながら合成し、溶媒を大過剰に使用するため、反
応後の処理が困難で不経済なことから工業的に充分満足
できるものではなかった。
本発明者は、蛋白分解酵素を用いた酵素化学的縮合によ
り環化反応を行うことにより、その目的を達成しうるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒
、その他に関し略号で表示する場合、IUPACの規定
、あるいは当該分野における慣用記号に従い、次のとお
り表記する。ただし、アミノ酸等に関し光学異性体があ
る場合は、特に明示しなければL体を示す。
Tyr   チロシン残基 11e   イソロイシン残基 Gly   グリシン残基 Ser   セリン残基 Arg   アルギニン残基 5p Lys Pr。
eu hr lu in Val Asn is Ala Met he oa moc z os Me アスパラギン酸残基 リジン残基 プロリン残基 ロイシン残基 スレオニン残基 グルタミン酸残基 グルタミン残基 バリン残基 アスパラギン残基 ヒスチジン残基 アラニン残基 メチオニン残基 フェニルアラニン残基 t−ブトキシカルボニル 9−フルオレニルメチルオキシカ ルボニル ベンジル ペンジルオキシカルボニル トシル メチルエステル Bz NP Su FA HF MF MSO MPA CC SC OSu OBt ONB ベンジルエステル p−ニトロベンジルエステル N−ヒドロキシコハク酸イミドニ ステル トリフルオロ酢酸 テトラヒドロフラン ジメチルホルムアミド ジメチルスルホキシド ヘキサメチルホスホリルトリア ミド ジシクロへキシルカルボジイミ ド N−エチル−No−ジメチルアミノプ ロピルカルポジイミド N−ヒドロキシコハク酸イミド l−ヒドロキシベンゾトリアゾ− ル N−ヒドロキシ−5−ノルボルネ シー2.3−ジカルボン酸イミ ド MeOHメタノール EtOHエタノール AcOH酢酸 [発明の構成] (課題を解決するための手段) 本発明は、 次式(1): (式中、AはSer、  Gly又はAlaを、BはA
sn又はSerを、Xは水酸基又はペプチド化学で常用
のカルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペ
プチド残基を、nは3〜7の整数を表し:各アミノ酸残
基はペプチド化学で常用の保護基で保護されていてもよ
い) で示されるペプチドを蛋白分解酵素で処理することを特
徴とする次式(■): (式中の記号は前記と同義である) で示されるペプチドの製造方法に関するものである。
前記(1)及び(If)において、Xで表されるカルボ
キシル基の保護基は、カルボキシル基の保護基としてペ
プチド化学で常用のものであれば特に制限はなく、例え
ば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロ
ポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、5ec−ブト
キシ基、 tert−ブトキシ基等のアルコキシ基:ベ
ンジルオキシ基、p−ニトロベンジルオキシ基、p−ク
ロロベンジルオキシ基、ベンズヒドリルオキシ基等のア
ラルキルオキシ基;カルボベンゾキシヒドラジノ基、t
ert−ブチルオキシカルボニルヒドラジノ基、トリチ
ルヒドラジノ基等の置換ヒドラジノ基が挙げられる。
Xで表されるアミノ酸残基は、カルシトニンの相当する
アミノ酸残基であり、例えばVal、Metが挙げられ
る。
Xで表されるペプチド残基は、カルシトニンの相当する
ペプチド残基であり、例えば1次式:−C−Leu−D
−E−F−G−H−I−J−に−L−M−N−0−P−
Q−R−3−T−U−Gly−V−W−X−Pro−N
H*(式中、CはVal又はMetを、 DはSer又はGlyを、 EはLys、 Thr又はAlaを、 FはLeu又はTyrを、 GはSer、  Thr又はTyrを、HはGin、 
 Lys又はArgを、IはGlu、  Asp又はA
snを。
JはLeu又はPheを、 KはHis又はAsnを、 LはLys又はAsnを、 鯖はLeu%Phe又はTyrを、 NはGin又はHisを、 0はThr又はArgを、 PはTyr又はPheを。
QはPro又はSetを。
RはArg%Gly又はGinを、 S′はThr又はNetを、 TはAsp、  Ala%Asn又はG131を、Uは
Val、Ile、  Thr又はPheを、VはAla
、  Gly%Pro又はSetを、WはGly又はG
luを、 XはThr、  Ala又はValを表す)で示される
ペプチド残基又はそのフラグメントが挙げられる。Xで
表されるペプチド残基は、Leu、  Val、 Il
e、  Phe等の脂溶性アミノ酸を含まないほうが好
ましい、蛋白分解酵素は、これらのアミノ酸のN端側の
合成、分解の平衡反応に関。
与するので、目的以外の結合部分の分解を伴う可能性が
あるからである。
前記(I)又は(n)で示されるペプチドにおいて、各
アミノ酸残基はペプチド化学で常用の保護基で保護され
ていてもよい。
かかるペプチド化学で常用の保護基のうち、カルボキシ
ル基の保護基としては、Xで表されるカルボキシル基の
保護基として前述したものと同様のものが挙げられる。
また、アミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc
%FDIOC%tert−アミルオキシカルボニル基、
インボニルオキシカルボニル基、p−メトキシベンジル
オキシカルボニル基、2−クロロベンジルオキシカルボ
ニル基、アゲマンチルオキシカルボニル基、トリフルオ
ロアセチル基、フタリル基、ホルミル基、0−ニトロフ
ェニルスルフェニル基、ジフェニルホスフィノチオイル
基等が挙げられる。
本発明に用いる前記式(I)で示されるペプチドは、例
えば、次のようにして製造することができる。
即ち、次式・: (CHi) n−C0OH HJCHCOOY (式中、Yはカルボキシル基の保護基、例えば低級アル
キル基を表し、nは前記と同義である) で示されるα−アミノ酸、例えばアミノスペリン酸−α
−低級アルキルエステルにN保護スレオニンを混合酸無
水物法等で縮合し、次いでアミノスペリン酸側鎖カルボ
キシル基を活性化させた後。
セリルアスパラギンと縮合し、得られたテトラペプチド
にN保護セリン、N保護ロイシンを混合酸無水物法、活
性エステル法等の通常のペプチド合成法に従い縮合する
ことにより得られる。
本発明の特徴は、前記式(I)で示されるペプチドを蛋
白分解酵素で処理して液相法で環化させる点にある。
従来、蛋白分解酵素は主としてペプチド結合の開裂に使
用されてきたが、その逆反応であるペプチド結合の生成
反応にも使用し得ることが知られている。しかし、これ
らのペプチド結合生成反応は直鎮オリゴペプチド等のペ
プチド結合生成反応に使用されており、またこれらのペ
プチド結合生成反応は蛋白分解酵素が有機溶媒中で不溶
であるため、水系での使用に限られていた。
本発明に用いる蛋白分解酵素としては、特に制限はなく
1例えば、サーモライシン、プロリシン、クシナーゼ等
の金属プロテアーゼを挙げることができる。
サーモライシンは、国際生化学連合(IUB)酵素委員
会に酵素番号EC,3,4,24,4として登録されて
おり、Bacillus thermoproteol
iticusが産生する酵素で、大和化成社などから市
販されている。また、プロリシンはBacillus 
5ubtilis var。
amyloliquefaciensが産生する酵素で
、上田化学社などから、タシナーゼNはStrepto
mycescaespitosusが産生ずる酵素で、
協和発酵工業社から、それぞれ市販されている。
本発明の蛋白分解酵素による環化反応は、pi(4〜1
0、好ましくはpH5〜8の緩衝液を含む媒質中で行わ
れる。
用いる緩衝液はpH値が前記範囲内のものであれば、そ
の種類は特に限定されるものではなく、各種のものを使
用することができ、例えば、トリス塩酸緩衝液、マツク
イルベイン緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩
衝液、アドキンス&パンチン氏緩衝液、ベロナール緩衝
液等を挙げることができる。
これらの緩衝液を反応媒質として使用する場合、該緩衝
液は通常、水混和性有機溶媒と混合して使用される0反
応媒質の一部として用いうる該水混和性有機溶媒として
は、例えば、DMF、D&ISO1HMPA、 MeO
H,EtOH等を挙げることができ、これらのうち、 
DMF、 MeOH,EtOHが特に好ましい、これら
の有機溶媒はそれぞれ単独で又は2種もしくはそれ以上
組合わせて使用してもよい。
溶媒中のペプチド濃度は厳密に制限されるものではない
が、ペプチドは低濃度がよく、ペプチド1g当り溶媒は
112以上が望ましい。
前記緩衝液と該水混和性有機溶媒の混合割合は、緩衝液
対有機溶媒の容積比で一般に2二8乃至8:2、好まし
くは5ニア乃至7:5の範囲内とするのが有利である。
本発明の反応媒体中での反応は、前記蛋白分解酵素が作
用する温度範囲、一般には、約20〜50℃、好ましく
は約25〜40℃の範囲内の温度において行うことがで
きる。
前記蛋白分解酵素の使用量は臨界的ではなく、反応条件
に応じて変えることができる。また、酵素は一般的な方
法、例えば担体結合法、架橋法、包括法、その他の方法
により固定化した固定化酵素を利用して反応させること
もできる。担体結合法で用いる担体としては、セルロー
ス、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、
ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス等が挙げられる
。架橋法で使用する架橋試薬としてはグルタルアルデヒ
ド、ビスジアゾベンジジン、N、N−ポリメチレンビス
ヨードアセトアミド、N、N−エチレンビスマレインイ
ミド等が挙げられる。包括法で用いる素材としては、ポ
リアクリルアミドゲル、ポリアクリルアルコールゲル、
デンプン、コンニャク粉、ナイロン、ポリウレア、ポリ
スチレン、エチルセルロース、コロジオン、硝酸セルロ
ース等が挙げられる。しかし、その固定化法は何らこれ
らに限定されるものではない。
本発明において、一般には、セリンプロテアーゼやアミ
ダーゼ活性を持たない酵素を用いるが、これらの活性を
有する酵素を使用する場合は、これら酵素の阻害剤、例
えばポテトインヒビター等を反応系に加えてもよい。
また、本発明は固相合成法によっても製造することがで
きる。
即ち1次式(Ia): (式中、AはSer、  Gly又はAlaを、BはA
sn又はSerを、X′は直接結合又はアミノ酸残基も
しくはペプチド残基な、 REGINは不溶性樹脂残基
を、nは3〜7の整数を表し、各アミノ酸残基はペプチ
ド化学で常用の保護基で保護されていてもよい) で示されるペプチド樹脂を蛋白分解酵素で処理して、次
式(fll): (式中の記号は前記と同義である) で示されるペプチド樹脂を得、 次いで、不溶性樹脂を脱離させることにより、次式(I
Ial: (式中、x′′は水酸基、アミノ基又はアミノ酸残基も
しくはペプチド残基を表し:他の記号は前記と同義であ
る) で示されるペプチドを製造することができる。
前記固相合成法においては、前記ペプチド樹脂(I a
)をカラムに充填し、蛋白分解酵素を含む前記媒質を還
流して連化反応に付し、次いでフッ化水素(HF)、ト
リフルオロ酢酸(TFA)処理等の方法で不溶性樹脂を
脱離させる。
TFAにより脱離させることができる不溶性樹脂として
は、例えば、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ア
ミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベ
ンズヒドリル樹脂、4−アミノメチルフェノキシメチル
樹脂、4−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、4
−オキジメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等が挙げ
られる。
特にα−アミノ基の保護基としてFmocを使用する場
合は、4−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂等の
TFAで脱離できる樹脂がよく、Bocを使用する場合
は、4−オキジメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等
のフッ化水素で脱離できる樹脂が望ましい。
樹脂中に結合するペプチド量としては、樹脂1g当りペ
プチドは0.1mmol以下の範囲を挙げることができ
る。
また、本発明は、前記の方法において、式(I)又は式
(I a)で示されるペプチドをポリエチレングリコー
ル誘導体で修飾された蛋白分解酵素で処理して式(II
 )又は式(Ila)で示されるペプチドを製造するこ
とができる。
この方法では、蛋白分解酵素をポリエチレングリコール
誘導体で修飾することにより1本来有機溶媒中では不溶
である酵素が溶けるようになり。
有機溶媒中で酵素反応を行わせることができるようにな
るため、水を含まない又は含水率の低い水混和性有機溶
媒中で酵素反応を行わせることができ、好収率で目的ペ
プチドを得ることができる。
このポリエチレングリコール誘導体で修飾された蛋白分
解酵素は、親油性及び親水性を有するポリエチレングリ
コールな活性基と結合させてこれ。
を酵素と反応させ、酵素蛋白のアミノ基に部分的に結合
させて修飾したものであって1例えば次の反応式に示す
ように、0−メトキシポリエチレングリコール(分子量
2000〜8000)を2.4.6−ドリクロローs−
トリアジンと反応させて得られる2、4−ビス(0−メ
トキシポリエチレングリコール)−6−クロロ−5−)
リアジン(PEG2)を蛋白分解酵素と反応させること
により、修飾酵素が得られる。このような製法は特公昭
61−42558号公報が参照される。
r# PE62−酵素 本発明によって得られる前記式(II )又は(II 
a )で示されるペプチドは、更に、ペプチド合成に通
常用いられる方法、具体的には「ザ・ペプチド(The
 Peptides)J第1巻(1966年)[5ch
reder and Luhke著、Academic
 Press、 NewYork、 U、S、A、]あ
るいは「ペプチド合成」 (東屋ら著、丸善株式会社(
1975年)1に記載されている方法に従い、例えばア
ジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法
、DCC法、活性エステル法(p−ニトロフェニルエス
テル法、N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シ
アノメチルエステル法等)、ウッドワード試薬Kを用い
る方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、DCC−
アディティブ(HONBJOBt、 HOSul法、固
相法等を利用することにより1合成カルシトニン誘導体
に変換することができる。その際、通常、−fiのポリ
ペプチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次1
個ずつアミノ酸を縮合させる、いわゆるステップワイズ
法によって、又は数個のフラグメントに分けてカップリ
ングさせていく方法を利用することができる。
また、合成カルシトニン誘導体の合成反応工程では、反
応に関与すべきではない官能基は、ペプチド化学で常用
の保護基で保護され、反応終了後、保護基は脱離する。
更に、反応に関与する官能基は通常活性化される。これ
ら各反応方法は公知であり、それに用いられる試薬等も
公知のものから適宜選択し得る。
カルボキシル基及びアミノ基の保護基としては、前述し
たものが挙げられる。また、カルボキシル基の活性化さ
れたものとしては、例えば、対応する酸クロライド、酸
無水物又は混合酸無水物、アジド、活性エステル(ペン
タクロロフェノール、p−ニトロフェノール、N−ヒド
ロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシベンズトリアゾ
ール、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジ
カルボキシイミド等とのエステル)等が挙げられる。な
お、ペプチド結合形成反応は、縮合剤、例えばジシクロ
へキシルカルボジイミド、カルボシイミグゾール等のカ
ルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト等の
存在下に実施し得る場合もある。
(発明の実施例) 以下、合成例、実施例及び参考例により本発明を更に詳
細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。
合成例1 (CHi) 5cOOH (1) Boc−Thr(Bz)−HNCH−COOC
Hsの製造Boc−Thr(Bzl−OR30,9g1
r:DMF 200m1に溶解し、ドライアイス−エタ
ノールで一20℃に冷却し、N−メチルモルホリン11
.0ml、次いでイソブチルクロロホルメイト 13.
2mlを滴下した後、−20℃で1分間撹拌して該当す
る混合酸無水物を作成した。この反応液をし一アミノス
ペリン酸−α−メチルニスエル20.3gを含むTHF
 200mf溶液と混合し、0℃で5分間、室温で20
分間撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル400−
を加え、IN HCl200m7で2回、飽和食塩水で
2回、の順で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後
、減圧濃縮し、標記目的物の油状物44.5gを得た。
(CH,) 5−COoSu ■ (2) Boa−Thr (Bz)−INCI−COO
CHsの製造上記(1)により得た油状物44.5gを
THF 300m7に溶解し、冷却下、HOSu 10
.4g及びDCCH8,6gを加えて、−4℃で一夜撹
拌した。ジシクロヘキシルウレア(ncu)の白色物質
は除去し、T肝を減圧留去して、標記目的物の油状物5
3.2gを得た。
(3) Boc−Ser (Bz) −Asn−OHの
製造H−Asn−OH19,8g%N−メチルモルホリ
ン16.5mf及びBoc−3er(Bz)−0Su 
39.2gをDMF 200mfに溶解し、室温で一夜
撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル600m7を
加え、IN HO2200−で2回、飽和食塩水200
mfで2回の順で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、減圧濃縮した。残渣なエーテルで処理して固化し
、メタノール−エーテルより再結晶化して、標記目的物
23.0g (56,2%)を得た。
mp  83〜84℃ [α]  = −4,0(C=1.DMF)元素分析(
C,。HztNsOt)として計算値 C55,74%
 H6,65% N 10.26%測定値 C55,7
2% H6,70% N 10.22%(CII) 5
cO−Ser (Bzl −Asn−OH(4) Bo
c−Thr(Bz)−HNCH−COOCHsの製造上
記(3)で得たBoc−Ser (Bzl −Asn−
OH20,5gに氷冷下TFA 50m7を加えて溶解
し、30分間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をエーテ
ルで処理し、析出した生成物を炉取し、水酸化ナトリウ
ム上で真空乾燥してH−Ser (Bz)−Asn−O
H4FAを得た。
得られた生成物をDMF 200mfに溶かし、これに
水冷下、TEAでpI(4,0に調整した後、(C1,
) 1cOOsu Boc−Thr(Bz)−HNCH−COOCH,30
,0gを含んだDMF100mf溶液を添加した。0℃
で1時間、室温で一夜撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢
酸エチル600m!を加え、 IN HCl 200m
1で2回、水200m7で2回の順で洗浄後、減圧濃縮
した。残渣をエーテルで処理して固化し、メタノール−
エーテルより再結晶化して、標記目的物28.5g(収
率72,5%)を得た。
mp   93〜94℃ [α]  = −9,1(C=1.DMF1元素分析 
(C3JssNaO+*)として計算値 C59,60
% H7,05% N 8.91%測定値 C59,5
5% H7,11% N8.71%(CHs) 5co
−3er (Bzl −Asn−OH(51Boc−S
er (Bzl −Thr (BzJ−HNCH(:0
OCHaの製造(CHg) 5cO−5er (Bz)
 −Asn−DHBoc−Thr[Bz)−INCI−
COOCHs 23.6gに水冷下TFA50mlを加
えて溶解し、30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣
をエーテルで処理し、析出した生成物を炉取し、水酸化
ナトリウム上で真空乾燥した。
得られた生成物をDMF 200mJlに溶かし、これ
に水冷下、TFAでpH4,0に調整した後、Boc−
3et(Bzl−O5u 15.7gを含んだD&4F
 50m7溶液を添加した。0℃で1時間、室温で一夜
撹拌し、水冷下。
N、N−ジメチルエチレンジアミン1.32m1を加え
、0℃で1時間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に酢酸
エチル600mA’を加え、IN HCl 200mf
で2回、水200m7で2回の順で洗浄後、減圧濃縮し
た。残渣をエーテルで処理して固化し、メタノール−エ
ーテルより再結晶化して、標記目的物24.0g(収率
83.1%)を得た。
mp  95〜96℃ ral =−10,4((:=1.DMF)元素分析 
(C4JssNsO+Jとして計算値 C61,11%
 H6,91% N 8.73%測定値 C61,07
% H7,0O% N 8.50%(CHx) 5cO
−3er (Bz) −Asn−OHBoc−Leu−
Ser (Bz) −Thr (Bz)−INCI−C
OOCH,の製造(C1,) 5cO−Set (Bz
) −Asn−OHBoc−3er (Bzl −Th
r (Bz) −HNCH−COOCHs 22.3g
に氷冷下TFA 50mfを加えて溶解し、30分間撹
拌した後、減圧?l!した。残渣をエーテルで処理し、
析出した生成物を炉取し、水酸化ナトリウム上で真空乾
燥した。
得られた生成物をDMF 200m1lに溶かし、これ
に水冷下、TEA″′cpH4,0に調整した後、Bo
c−Leu−O3u 9.9gを含んだDMF 50m
1溶液を添加した。0℃で1時間、室温で一夜撹拌し、
氷冷下、N、N−ジメチルエチレンジアミン1.32m
fを加え、0℃で1時間撹拌した後、減圧濃縮した。残
渣に酢酸エチル600m/を加え、IN HCI 20
0m1で2回、水200m1で2回の順で洗浄後、減圧
濃縮した。残渣をエーテルで処理して固化し、熱メタノ
ール−酢酸エチルより再結晶化して、標記目的物zo、
tg(収率80,7%)を得た。
mp  153〜155℃ [α] = −11,5(c=t、oup1元素分析 
 (Cssll−1N70.s)として計算値 C61
,38% H7,21% N9.11%測定値 C61
,02% H7,63% N9.01%実施例1 の製造 (CH,) 5cO−Set (Bz) −Asn−O
HBoa−Leu−Ser(Bz)−Thr(Bzl−
HNCH−COOCH,10,0gに水冷TTFA 5
0m7を加えて溶解し、30分間撹拌した後、減圧濃縮
した。残渣をエーテルで処理し、析出した生成物を枦取
し、水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。
得られた生成物を、メタノール5601に溶解し、20
ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶液・5.01にサーモ
ライシン7000PU/mgを8.0g溶解した溶液を
加えた。7%アンモニア水でpH6,25に調整し、3
7℃で一夜撹拌した後、サーモライシン7000PU/
mgを2.0g加え、pH6,25に調整し、更に37
℃で一夜撹拌した。1.0%EDTA溶液450−を加
えた後、メタノールを濃縮し、沈殿物を炉取した。得ら
れた粉末的10gにメタノール:水=9:1の溶液50
0mJを加え、30分間、40℃で撹拌後、混液を室温
に冷却下、不溶物と炉液に分けた。ろ液はDowex−
1−X4(2,3X 18cm)及びDowex 50
W−X8 (2,3X 18cm)の連続したカラムを
通した後、溶媒は濃縮し、エーテルで固化、メタノール
−エーテルより再結晶化して標記目的物5.1g(収率
57.3%)を得た。
また、メタノール−水混液での不溶物はメタノール14
0m7に溶解し、20ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶
液60m1にサーモライシン7000PU/mgを0.
2g溶解した溶液を加えた。7%アンモニア水でpH7
,5に調整し、37℃で一夜撹拌し、1.0%EDTA
溶液450m7を加えた後、メタノールを濃縮し、沈殿
物を消散した。酵素分解して得られた粉末3.9g(回
収率39.0%rは原料として再度使用することができ
る。
mp  166℃・(分解) [a ] =−8,8(C=1.DMF1元素分析 (
C1゜HstNyO+ilとして計算値 C62,68
% H7,05% N 10.23%測定値 C62,
17% H7,43% N 10.01%合成例2 (1) H−Asu−REGINの製造(a) Z−A
su (OMe)−0Bzの製造MeOH500m7を
−lO℃に冷却し、撹拌しながら塩化チオニル13m1
を徐々に加えた。10分後、Z−Asu−OBz 20
.7gを加え、室温で2日間撹拌した後、減圧蒸留して
得られた油状残渣を酢酸エチルに溶かした。これをIN
 HCIで洗浄し、次いで4回水洗、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、酢酸チェルを減圧留去し、標記目的物より
なる油状物19.7gを得た。
(b) H−Asu [OMe)−OHの製造Z−As
u (OMe)−0Bzよりなる油状物19.7gを、
MeOH500m7及びIN HIJ’ 48m1に溶
解し、パラジウム炭素を加え、20時間水素添加を行っ
た。触媒を炉別後、MeOHを留去乾燥後、酢酸エチル
300m7及びIN H(4300m1に溶解し、この
水層をlNNaOHでptt7.0に調整し、4℃で一
夜放置した。生成した沈殿を消散し、水洗乾燥して、標
記目的物8.4gを得た。
mp   175〜176℃(分解) [a]  =+20.6(C=1.AcoHl元素分析
  (csn+tNo4)として計算値 C53,19
% H8,43% N6.89%測定値 C52,99
% H8,66% N6.66%(cl Fmoc−A
su (OMe)−OHの製造H−Asu (OMe)
 −OH8,IgをTHF 250m7に溶解し、Fm
oc−C112,9gを加えて4℃で一夜撹拌した。溶
媒を留去し、酢酸エチルに溶かし、これをIN HCI
で洗浄し、次いで4回水洗、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、酢酸エチルを減圧留去して、標記目的物よりなる油
状物15.3gを得た。
(d) Fmoc−Asu(OMel−REGINの製
造Fmoc−Asu(OMelOH4,25gをDMF
に溶解し、DCCで対称酸無水物とした後、これを4−
ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂10.0g (
0,02mmol/glの存在下に2時間撹拌した。樹
脂はMeOHで洗浄し、標記目的物を得た。
(e) H−Asu−REGINの製造Fmoc−As
u (OMe)−REGINに、MeOH20m7 に
lNNaOH2,2当量を加え、30分間放置後、 M
eOHで洗浄して乾燥し、標記目的物を得た。
(CHa) 5cO−Ser (Bzl −Asn−O
H(2) Fmoc−Leu−Ser (Bz) −T
hr (Bzl−HNCH−CO−REGINの製造 H−Asu−REGIN O,5mmol(0,02m
mol/g)を出発原料とし、Fmoc−Thr (B
z)−OHを固相合成法の活性エステル法に従い縮合し
、次いでDCC−HOSuのDMF溶液で側鎖を活性エ
ステルとした後、H−Ser (Bzl −Asn−O
H(1mmol)を縮合、Fmoc−Ser(Bz)−
0H,Fmoc−Leu−OH(各1mmallを固相
合成法の活性エステル法に従い順次縮合して、標記ペプ
チド樹脂を得た。
実施例2 の製造 合成例2(2)で得たペプチド樹脂をピペリジンで処理
した後、カラムに充填し、37℃に保ったサーモライシ
ン(5g#’)のリン酸緩衝溶液(0,02M酢酸カル
シウムを含む)をポンプで2時間還流した。溶液を水で
洗浄した後、再度37℃に保ったサーモライシン(5g
、#)のリン酸緩衝溶液(0,02M酢酸カルシウムを
含む)をポンプで逆方向から2時間還流した。ペプチド
樹脂なカラムより取り出し、均一に攪拌し、再度カラム
に充填し、上記サーモライシン処理をくりかえした。溶
液は水で洗浄し、標記ペプチド樹脂を得た。
の製造 上記(11で得たペプチド樹脂をTFAで処理した後、
得られた粉末的1.2gにメタノール:水=9:1の溶
液l口Omlを加えて溶かし、Dowex 50■−x
8(2,3X 18cm1のカラムを通した後、溶媒を
濃縮し、エーテルで固化、メタノール−エーテルより再
結晶して、標記目的物0.7gを得た。
mp  180℃(分解) [α] =−13,0(C=1.DMF)元素分析 (
C,。HssNJ□)として計算値 C62,34% 
H6,94% N 10.39%測定値 C62,10
% H7,32% N 10.11%合成例3 ポリエ
チレングリコール誘導体で修飾された蛋白分解酵素の製
造: サーモライシン10gを含む0.1Mホウ酸緩衝液(p
H10)27に、2.4−ビス(θ−メトキシポリエチ
レングリコール−6−クロロ−s−トリアジン(分子量
的11.000) 31.7gを加え、37℃で1時間
反応させた。限外濾過法により精製し、白色粉末の修飾
サーモライシン30gを得た。このものの分子量は約2
0万であり、Ca5ein−Folin測定法による酵
素活性は未修飾サーモライシンの10%を保持していた
Ca5ein−Folin測定法:基質蛋白質溶液とし
てカゼインを用い、蛋白分解酵素を作用後、除蛋白剤を
加え、非沈殿性分解物についてFolin試薬を用いて
蛋白分解量を測定する方法。
実施例3 の製造 (CH,) 5cO−Ser (Bz) −Asn−0
■Boc−5er(Bz)−Thr(Bz)−INCI
−COOCHs io、ogに氷冷下TFA 5Om7
を加えて溶解し、30分間撹拌した後、減圧濃縮した。
残渣をエーテルで処理し、析出した生成物をt月収し、
水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。
上記生成物を、メ・タノール5.O1に溶解し、20ミ
リモル濃度酢酸カルシウムのメタノール溶液5.01に
合成例3で得た修飾サーモライシンを8.0gを溶解し
た溶液を加えた。 p)16.25に調整し、37℃で
一夜撹拌後、修飾サーモライシンを2.0g加え、pH
6,25に調整し、さらに37℃で一夜攪拌後、エタノ
ールをa#1し、沈殿物をt月収し、水洗後乾燥した。
得られた粉末的10gにメタノール:水=9:1の溶液
500m7を加え、30分間40℃で攪拌後、混液は室
温に冷却下、不溶物とる液に分けた。ろ液はDowex
−1−X4(2,3X 18cm1及びDowex 5
O−X8 (2,3X18cmlの連続したカラムを通
した後、溶媒は濃縮し、エーテルで固化、メタノール−
エーテルより再結晶化して標記目的物5.1g(収率5
7.3%)を得た。
又、メタノール−水混液での不溶物はメタノール140
m1に溶解し、20ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶液
60m1にサーモライシン7000PU/mgを0.2
gを溶解した溶液を加えた。7%アンモニア水でpH7
,5に調整し、37℃で一夜撹拌し、 1.0%EDT
A溶液450m1を加えた後、メタノールを濃縮し、沈
殿物を消散した。酵素分解して得られた粉末3.9g 
(回収率39.0%)は原料として再度使用した。
mp  166℃(分解) [α] = −8,8(C=1.DMF)元素分析 (
C6o11atN、0.z)として計算値 C62,6
8% H7,05% N 10.23%測定値 C62
,17% 17.43% N 10.01%実施例4 の製造 合成例2(2)で得たペプチド樹脂をピペリジンで処理
した後、固相合成機から取り出してカラムに充填し、合
成例3で得た修飾サーモライシン5gを含む37℃に保
ったDMF溶液をポンプで2時間還流した。溶液を水で
洗浄した後、再度修飾サーモライシン5gを含む37℃
に保ったDMF溶液をボンブで逆方向から2時間還流し
た。ペプチド樹脂なカラムより取り出し、均一に撹拌し
、再度カラムに充填し、上記修飾サーモライシン処理を
くりかえした。溶液を水で洗浄し、標記ペプチド樹脂を
得た。
の製造 上記+1)で得たペプチド樹脂をTFAで処理した後、
得られた粉末的1.2gにメタノール:水=9=1の溶
液100n+7を加えて溶かし、Dowex−50■−
x8(2,3X 18cm)の連続したカラムを通した
後、溶媒を濃縮し、エーテルで同化、メタノール−エー
テルより再結晶化して標記目的物0.8gを得た。
mp  100℃(分解) [α] = −13,0(C=1.DMF1元素分析 
 (C−sHtsNyo+*)として計算値 C62,
34% H6,94% N 10.39%測定値 C6
2,10% H7,32%  N IO,11%参考例 の製造 4.8gをDMF 250mjに溶解し、水冷撹拌下、
2N水酸化ナトリウム水溶液lO,ローを30分間かけ
て滴下した。水冷下で5時間撹拌した後、IN HIJ
でpH7にし、減圧濃縮してDMFを留去した。残渣に
水を加えて固化し、熱メタノール−エーテルで2回再結
晶化して、標記目的物4.5g(収率95.3%)を得
た。このものは、実施例4(2)で得られたものと同一
の物性値を示した。
−CO−Val−Leu−Gly−OMeの製造Z−V
al−Leu−Gly−OMe 1.9gをメタノール
100m1に溶解し、IN HC74,3ml及び10
%パラジウム/炭素0.2g存在下水素添加した。6時
間室温で撹拌後、触媒を除去し、減圧!11iJlた。
残渣の油状物を水酸化ナトリウム上で一夜真空乾燥して
H−Val−Leu−Gly−OMe−HC7を得た。
得られた生成物と、 4.0g及びHOBt 0.57gをDMF 100m
fに溶解し、これに水冷下、TEA1’ pH4,0に
調整した後、WSC0,77m1を添加した。0℃で1
時間、室温で一夜撹拌後、減圧濃縮した。残渣にIN 
MCIを加えて固化、DMF−酢酸エチルで2回再結晶
化して、標記目的物4.7g (収率90.4%)を得
た。
mp  228℃(分解) [α] =−17,0(C・1.DMF)元素分析 (
CaJsoN+oO+s)として計算値 C61,65
% H7,39% N 11.41%測定値 C61,
35% H7,79% N 11.02%−CO−Va
l−Leu−Gly−OHの製造−Val−Leu−G
ly−OMe 4.5gをDMF 120mjに溶解し
、水冷攪拌下、 2N水酸化ナトリウム水溶液3.1m
lを30分間かけて滴下した。水冷下で5時間撹拌した
後、IN HC7でpH7にし、減圧濃縮してDMFを
留去した。残渣に水を加えて固化し、 DMF−酢酸エ
チルで2回再結晶化して、標記目的物4.2g(収率9
4.4%)を得た。
mp  240℃(分解) 【α] ニー、18.5(C=1.DMF1元素分析 
(CazHasNtools)として計算値 C61,
37% H7,31% N 11.54%測定値 CG
1.12% H7,56% N 11.27%−CG−
Val−Leu−Gly−Lys (21−Leu−S
er (Bz) −Gln−−Glu (OBz) −
Leu−His−Lys (21−Leu−Gin−T
hr (Bz) −−Tyr (Bz) −Pro−A
rg (Tos) −Thr (Hz) −Asp (
OBz) −−Val−Gly−Ala−Gly−Th
r (Bz) −Pro−NHzの製造Boc−Lys
 [21−Leu−3er (Bz) −Gin−Gl
u (OBz) −Leu−His−Lys (Z) 
−Leu−Gin−Thr (Bz) −Tyr (B
zl −Pro−Arg(Tosl −Thr (Bz
) −Asp (OBz) −Val−Gly−Ala
−Gly−Thr(Bzl−Pro−NHs 7.2g
に水冷下、アニソール2ml及びTFA 15m7を加
えて溶解し、30分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣
をエーテルで処理し、析出した生成物を消散し、水酸化
ナトリウム上で真空乾燥してH−Lys (Z) −L
eu−Ser (Bz) −Gin−Glu (OBz
) −Leu−His−Lys (Z) −Leu−G
in−Thr (Bz) −Tyr (Bz) −Pr
o−Arg(Tosl −Thr (Bz) −Asp
 (OBz) −Val−Gly−Ala−Gly−T
hr(Bz) −Pro−NHg 4FAを得た。得ら
れた生成物と、mp  174〜177 ℃ [α]  =−17,5[c=1.DMF1元素分析 
(Ci< 1HsiJ4tosss・2HxO)として
計算値 C60,59% H6,87% N 11.8
7%測定値 C60,35% H6,79% N 11
.69%アミノ酸組成; Asp O,92(1、Thr 2.88(3)、Se
t 1.05(1)。
Glu 3.08(3、Pro 1.99(2)、Gl
y 1.96(21゜Ala O,98(1、Val 
O,98(1)、Leu 3.09(3)。
Tyr O,92(1、His O,93(1)、Ly
s 2.16(2)。
Arg 1.06(1 −Val−Leu−Gly−OH2,9g及びHOBt
 0.33gをDMF 200m1に溶解し、これに水
冷下、TEAでpH4,0に調整した後、WSC0,4
5mJを添加した。0℃で1時間、室温で一夜撹拌後、
減圧濃縮した。残渣にIN HCIを加えて固化、DM
F−酢酸エチルで1回、DMF−メタノールで2回再結
晶化して、標記目的物9.0g (収率96.1%)を
得た。
Gly−Lys−Leu−Ser−Gln−Glu−L
eu−His−Lys−Leu−Gln−Thr−Ty
r−Pro−Arg−Thr−Asp−Val−Gly
−Ala−Gly−Thr−Pro−NHgの製造C0
−Val−Leu−Gly−Lys (Z) −Leu
−3er (Bz) −Gin−Glu (OBz)−
Leu−His−Lys (Z) −Leu−Gin−
Thr (Bz) −Tyr (Bz) −Pro−A
rg (Tos) −Thr (Bzl −Asp (
OBzl −Val−Gly−Ala−Gly−Thr
 (Bz) −Pro−NHg 4.7gをフッ化水素
75m7とアニソール8ml中で0℃で30分間反応さ
せた0反応後、フッ化水素を留去し、残渣をエーテルで
処理し、析出した生成物を消散し、水酸化ナトリウム上
で真空乾燥した。これをIM酢酸溶液150mfに溶解
し、Dowex 1−X4 (酢酸型)に通し、流出液
を凍結乾燥して粉末3.0gを得た。
この粉末を0.05M酢酸アンモニウム水溶液に溶解し
、CM−セルロースを充填したカラム(4X30c+n
)上に注入し、 0.01M酢酸アンモニウム水溶液(
pH4,4) 500mf〜0.11M酢酸アンモニウ
ム水溶液(pH4,41500m7の直線型濃度勾配溶
出(60ml/時間)を行い、溶出液を10mfずつ分
画採取し、高速液体クロマトグラフィーにより分析し、
目的画分を集めて凍結乾燥して粉末601mgを得た。
この粉末を0.111酢酸に溶解し、セファデックスG
−10(2,2X 110cm)に注入し、0.1M酢
酸で溶出して目的画分を凍結乾燥して上記目的物572
mgを得た。
mp  241”C(分解) [a ]  = −94,6(C:1.0. IMAc
OH1元素分析 (C14゜H!n4N4□04.・2
CHICOOH・5H,0)として 計算値 C51,08% H7,39% N 16.4
6%測定値 C51,00% ■7.50% N 16
.42%アミノ酸組成; Asp O,94(11,Thr 2.92(3)、S
et 1.07(1)。
Glu 3.08(3)、Pro 2.01(2)、G
ly 2.00(2)。
Ala 1.00(1)、Val G、9[1)、Le
u 3.09(31゜Tyr O,94(1)、His
 O,95(11,Lys 2.1G(2)。
Arg 1.06(11 [発明の効果] 本発明の方法によれば、既知の合成方法に比べて、以下
に述べるような利点があり、工業的に極めて有用である
イ)酵素反応による生成物は反応系外に沈殿するため、
溶媒を濃縮することなく処理することができ、沈殿によ
り目的とする生成物が得られる確率が高くなるため、収
率よく合成できる。
ロ)酵素反応の性質上、副反応を伴わず反応させること
ができ、しかもうセミ体を伴わず合成することができる
ハ)未反応物と共に、副生成物は酵素分解することによ
り、回収再利用できるので工業的に有利である。
固相合成法では、さらに以下に述べるような利点がある
イ)固相反応は、通常樹脂を高希釈条件下で実施するた
め、溶媒を多量に使用し、処理が困難になるが、本誌に
よれば、これらの溶媒を濃縮することなく処理すること
ができる。
口)また固相合成法では、樹脂なカラムに充填して行う
ため、縮合した化合物はほとんどが単量体環化物で得ら
れるので、精製が容易である。
ハ)固相合成法は、液相法による鎖長延長に伴う不溶化
を考える必要がないなど、操作が単純であり、短期間で
の合成が可能である。
また、修飾蛋白分解酵素を用いる方法では、以下に述べ
るような利点を有する。
イ)修飾酵素を用いる反応では、水を含まない又は含水
率の低い水混和性有機溶媒で行われるため、回収溶媒の
濃縮が容易である。
口)修飾酵素を用いる反応は、水を含まない又は含水率
の低い有機溶媒中で行われるため、平衡反応のペプチド
合成反応が優位で収率よく行われる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)次式( I ): ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、AはSer、Gly又はAlaを、BはAsn
    又はSerを、Xは水酸基又はペプチド化学で常用のカ
    ルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペプチ
    ド残基を、nは3〜7の整数を表し、各アミノ酸残基は
    ペプチド化学で常用の保護基で保護されていてもよい) で示されるペプチドを蛋白分解酵素で処理することを特
    徴とする次式(II): ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (式中の記号は前記と同義である) で示されるペプチドの製造方法。
  2. (2)次式( I a): ▲数式、化学式、表等があります▼( I a) (式中、AはSer、Gly又はAlaを、BはAsn
    又はSerを、X′は直接結合又はアミノ酸残基もしく
    はペプチド残基を、REGINは不溶性樹脂残基を、n
    は3〜7の整数を表し、各アミノ酸残基はペプチド化学
    で常用の保護基で保護されていてもよい) で示されるペプチド樹脂を蛋白分解酵素で処理して次式
    (III): ▲数式、化学式、表等があります▼(III) (式中の記号は前記と同義である) で示されるペプチド樹脂を得、次いで、 不溶性樹脂を脱離させることを特徴とする次式(IIa)
    : ▲数式、化学式、表等があります▼(IIa) (式中、x″は水酸基、アミノ基又はアミノ酸残基もし
    くはペプチド残基を表し、他の記号は前記と同義である
    ) で示されるペプチドの製造方法。
  3. (3)請求項1又は2における蛋白分解酵素の代りに、
    ポリエチレングリコール誘導体で修飾された蛋白分解酵
    素を用いる式(II)又は式(IIa)で示されるペプチド
    の製造方法。
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