JPH04299988A

JPH04299988A - リジン−ε−ペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH04299988A
Application number: JP6214991A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kitaguchi; 博司北口
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1991-03-26
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 1992-10-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロテアーゼを用いて
高選択的に非天然型ペプチド結合を形成する方法に関す
るものであり、さらに詳しくは、リジン誘導体と他の基
質エステル体を反応させてリジン−ε−ペプチドを高選
択的に合成する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リジンにはα位およびε位の２種のアミ
ノ基が存在し、天然型のペプチドはα位のアミノ基がペ
プチド結合を形成している。しかし、ε位のアミノ基が
ペプチド結合に関与しているペプチド異性体（ε−ペプ
チド）はプロテアーゼに対する高い抵抗性をはじめユニ
ークな性質を有することが知られている。（Ｊ．Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．誌、１０５巻、５４９頁
（１９７８））。リジンの２種のアミノ基を区別してε
−アミノ基のみと反応させる方法としては、例えば、泉
屋信夫等著「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善株式会
社、昭和６２年）、ｐ．５７〜５９に記載の如くＬ−リ
ジン塩酸塩と銅塩を反応させα位のアミノ基を保護した
後、Ｚ−Ｃｌ又は（Ｂｏｃ）２Ｏを反応させ、続いて硫
化水素を１〜３時間通して銅イオンを硫化銅として析出
させることにより、ε−Ｚ−Ｌ−リジン又はε−Ｂｏｃ
　−Ｌ−リジンを得る方法が知られている。しかしこの
化学合成法は、銅イオンを当量必要とし、更にそれを除
去するために、硫化水素の吹込みを必要とする等、大量
製造法としては問題が多い。また、この方法は銅塩の形
成を利用しており、リジンのカルボキシル基がエステル
やアミドに変換されている場合には適用できない。

【０００３】一方酵素法によるペプチド合成が近年活発
に進められている。その化学合成法に対する長所として
は、反応条件が緩和である、反応の選択性が高い、ラセ
ミ化が起きない等が挙げられる。またその欠点としては
、一旦生成したペプチド結合が同じ酵素によって加水分
解されること、他に存在するペプチド結合が切断されて
しまうこと、あるいは天然型のα−ペプチドしか生成し
ないこと、などが挙げられる。

【０００４】例えば、α−キモトリプシンを触媒として
用いた場合、Ｌ−リジンのα位のアミノ基が反応した天
然型ペプチドのみが選択的に得られたという報告が、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　誌（２巻、２８９頁、（１９８３））およびＡ
ｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．誌（５３巻、７２
９頁（１９８９））においてなされている。しかし一方
、α−キモトリプシンを用いればα−ペプチドとε−ペ
プチドの混合物を与えるが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ　由来のプロテアーゼやリパーゼを用いれば
ε−ペプチドのみを選択的に合成できる、という報告も
存在し（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ誌、２
９巻、５４８７頁（１９８８））、用いる酵素の種類と
選択性の関係は、学界においても産業界においても明確
になっていないのが実情である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リジ
ン又はその誘導体と基質エステル体を反応させて、高選
択的にリジン−ε−ペプチドを製造する方法を提供する
ことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的は、リジン又は
その誘導体を、プロテアーゼ存在下で他の基質エステル
体と反応させて、リジン−ε−ペプチドを製造する方法
において、プロテアーゼが、バチルス・アミロリクイフ
ァシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）　由来のセリンプロテアーゼ（Ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′）　、トリティラチウム・ア
ルブム　（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）　
由来のセリンプロテアーゼ　（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　
Ｋ）　、及びストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）　由来のセリンプ
ロテアーゼ（放線菌アルカリ性プロテアーゼ）から成る
群から選ばれたものであることを特徴とするリジン−ε
−ペプチドの製造方法により達成された。

【０００７】これら３種のプロテアーゼは当該分野では
いずれもよく知られた酵素であり、いずれも高純度品を
市販品として入手可能である。例えばＳｕｂｔｉｌｉｓ
ｉｎ　ＢＰＮ′およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ＫはＳｉ
ｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．より放線菌アルカリ性プロテア
ーゼは生化学工業株式会社より市販されている。本発明
で用いられるリジン又はその誘導体は下記一般式（Ｉ）
または（ＩＩ）　で、また基質エステル体は一般式（Ｉ
ＩＩ）で表される。

【０００８】Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ−ＯＲ１　
　（Ｉ）Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ−
ＮＨ−Ｒ１　　　　　　　　　　（ＩＩ）一般式（Ｉ）
または（ＩＩ）　において、Ｒ１は水素原子、置換また
は無置換のアルキル基またはアリール基を表す。Ｘ−（ＮＨ−ＣＨ（Ｙ２））　ｎ　−ＮＨ−ＣＨ（Ｙ１
）−ＣＯ−ＯＲ２　　　（ＩＩＩ）一般式（ＩＩＩ）に
おいてＲ２は、置換又は無置換のアルキル基、置換又は
無置換のアリール基を表わし；Ｙ１はメチル基、ベンジ
ル基、２−メチルプロピル基又は４−ヒドロキシベンジ
ル基を表し；Ｙ２は水素原子又は置換又は無置換のアル
キル基を表し、Ｙ２が２以上存在するときは同一でも異
なっていてもよく、ｎは０又は１乃至１０の整数を表わ
し；Ｘはアミノ基の保護基を表わす。

【０００９】一般式（Ｉ）または（ＩＩ）　で表わされ
るリジン誘導体のＲ１としては、水素原子、炭素数１乃
至１５の置換又は無置換のアルキル基または炭素数６〜
１５の置換又は無置換のアリール基が好ましく、環形成
していてもよい。それらの置換基としてはアルキル基、
フェニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、カルボキシ
ル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基
が好ましい。Ｒ１として特に好ましいものは、水素原子
、炭素数３〜９の直鎖又は分岐の置換または無置換のア
ルキル基である。

【００１０】一般式（ＩＩＩ）で表わされる他の基質エ
ステル体のＲ２としては、炭素数１乃至１０の置換又は
無置換のアルキル基、および炭素数６乃至１６の置換又
は無置換のアリール基が好ましく、特に好ましくは炭素
数１乃至５の無置換又はクロルまたはフッ素原子が置換
したアルキル基である。Ｙ１は特に好ましくは、ベンジ
ル基又はメチル基である。Ｙ２の置換又は無置換アルキ
ル基は炭素数１乃至１５のものが好ましく、置換基とし
てはアルキル基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カル
バモイル基、メルカプト基、フェニル基、アルキルチオ
基、３−インドリル基、２−イミダゾリル基などが挙げ
られる。Ｙ２は特に好ましくは、水素原子又は炭素数が１乃至７
の置換又は無置換のアルキル基であり、その置換基とし
て特に好ましいものは、メチル基、フェニル基、４−ヒ
ドロキシフェニル基およびヒドロキシ基である。ｎは好
ましくは０又は１〜５の整数であり、特に好ましくは０
又は１乃至２である。Ｘで表わされるアミノ基の保護基
として好ましいものは、炭素数１乃至６のアシル基、炭
素数２乃至１５の置換又は無置換のアルコキシカルボニ
ル基であり、そのアルキル部は環形成していてもよい。Ｘとして特に好ましいものは、アセチル基（Ａｃ）　、
ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシ
カルボニル基（Ｚ）、フルオレニルメチルオキシカルボ
ニル基（Ｆｍｏｃ）　である。

【００１１】一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされる
リジン誘導体はリジンを出発原料として、又、一般式（
ＩＩＩ）で表わされる他の基質エステル体は市販のアミ
ノ酸、またはオリゴペプチドを出発原料として、前述の
泉屋信夫ら著の「ペプチド合成の基礎と実験」、１６頁
、２．アミノ保護基、および４１頁、３．カルボキシル
保護基に記載の方法により容易に合成できる。

【００１２】一般式（Ｉ）または（ＩＩ）　で表される
リジン誘導体は、Ｌ−体、Ｄ−体、ラセミ体のいずれで
あってもよい。又、一般式（ＩＩＩ）中に存在する不斉
炭素についても、いずれの光学活性体でもまたラセミ体
であってもよい。以下に、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）
　で表わされるリジン誘導体の具体例及び一般式（ＩＩ
Ｉ）で表わされる基質エステル体の具体例を示すが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

【００１３】リジン及びその誘導体１．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ２．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣ２Ｈ５３．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣ４Ｈ９　（ｎ）４．　Ｌ−Ｌｙ
ｓ−ＯＣ４Ｈ９（ｔ）　５．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣ５Ｈ１
１　（ｎ）　６．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ５７
．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣ３Ｈ７（ｉ）　８．　Ｄ−Ｌｙｓ
−ＯＣ４Ｈ９（ｎ）　９．　Ｄ−Ｌｙｓ−ＯＣ４Ｈ９（
ｔ）　１０．　Ｄ−Ｌｙｓ−ＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ５１１．
　Ｄ−Ｌｙｓ−Ｏ−Ｃ６Ｈ１１１２．　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ−Ｃ６Ｈ１１１３．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ２１４．　Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２１５
．　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ１６．　Ｌ−Ｌ
ｙｓ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＮＨ２１７．　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ−Ｃ
Ｈ２−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＯＣＨ３１８．　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ
−ＣＨ２−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２　１９．　Ｌ−Ｌｙｓ
−Ｏ−ＣＨ２−２，４−ジメトキシフェニル２０．　Ｌ
−Ｌｙｓ−ＮＨ−Ｃ１０Ｈ７　２１．　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ−Ｃ６Ｈ５基質エステル体１．　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣＨ３２．　Ｎ−Ａｃ
−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２Ｈ５　３．　Ｎ−Ａｃ−Ｄ−Ｐｈ
ｅ−ＯＣ２Ｈ５　４．　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２
Ｈ４Ｃｌ５．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２Ｈ５６．　
Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ７．　Ｎ−Ａｃ−
Ｌ−Ａｌａ−ＯＣ２Ｈ５　８．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−
ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ９．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＣ２Ｈ５
１０．　Ｎ−Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ１１．　
Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＣ２Ｈ５１２．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−
Ｌｅｕ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ１３．　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ
−ＯＣＨ３１４．　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＣ２Ｈ４
Ｃｌ１５．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ｓｅｒ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ１６
．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ１７．　Ｎ−
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＣ２Ｈ５１８．　
Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２Ｈ４Ｃｌ１９
．　Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ２Ｈ４Ｃ
ｌ２０．　Ｎ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＣ６Ｈ
５２１．　Ｎ−Ａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＣＨ
２ＣＦ３Ｌｙｓ　はリジン、Ｐｈｅ　はフェニルアラニ
ン、Ａｌａ　はアラニン、Ｌｅｕ　はロイシン、Ｔｙｒ
　はチロシン、Ｓｅｒ　はセリン、Ａｓｎ　はアスパラ
ギン、Ｇｌｙ　はグリシンのそれぞれ残基を示す。Ｃ６
Ｈ１１　はシクロヘキシル基、Ｃ１０Ｈ７　はβ−ナフ
チル基を示す。

【００１４】酵素反応は一般に水溶液中で行なわれるが
、本反応においては基質の溶解度を高め副反応を抑制す
るために水溶性有機溶媒を混合することが好ましい。この場合有機溶媒は特に限定されないが、ＤＭＦ、ＤＭ
ＳＯ、ＴＨＦ、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン
、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等が好ましい。また本
反応は、水に混じらない有機溶媒と酵素水溶液を同時に
使用するいわゆる二相系（バイオサイエンスとバイオイ
ンダストリー、４７巻、８２５頁（１９８９））、また
は実質的に水を含まない有機溶媒に酵素を懸濁させて使
用する方法（ＣＨＥＭＴＥＣＨ誌、１６巻、３５４頁（
１９８６））で行うことができる。これらの方法は、水
溶液中での反応と比べ副反応が抑制されるので有利であ
る。この場合も有機溶媒は特に限定されないが、水に混
じりにくい酢酸エステル類（エチルエステル、ブチルエ
ステル等）、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、
ｔ−ブタノール、ｔ−アミルアルコール、ｉ−アミルア
ルコール、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル
、ジブチルエーテル等が好ましい。また、実質的に無水
状態で酵素を懸濁させる方法の場合は、アセトニトリル
、ＴＨＦ、アセトン、ピリジン等の水と混じり合う溶媒
も好ましい。この方法を採用する場合、プロテアーゼを
あらかじめその至適ｐＨの水溶液から凍結乾燥して用い
ることが望ましい。

【００１５】本発明の反応は、またいわゆる「固定化酵
素」を用いても実施することができる。担体や固定化法
は、当該分野で既知の手段を有効に利用することができ
る。これらは、例えば“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌ．４４”や、“固定化生体触媒”
（千畑一郎編、講談社）に詳しく述べられている。

【００１６】

【発明の効果】本発明方法によれば、リジン−ε−ペプ
チドを高選択的に製造することができる。

【００１７】

【実施例】〔実施例１〕ＤＭＦを３３％含有するｐＨ８
．５の緩衝溶液に、Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ（１
００ｍＭ）　、Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕ（２００ｍＭ）
を溶解した。これに、プロテアーゼの最終濃度が０．５
ｍｇ／ｍｌになるようにプロテアーゼの水溶液を加え、
３０℃で５分間インキュベートした後、酢酸を加えて反
応を停止して生成物をＨＰＬＣで定量した（カラム：Ｙ
ＭＣ−ｐａｋ　ＯＤＳ　、溶離液：アセトニトリル／水
／ＴＦＡ＝３４／６６／０．１、検出波長：２５４ｎｍ
、保持時間：Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ（１４．５
分）、Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−　α−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ
Ｂｕ（８．４分）、Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−　ε−Ｌ−
Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ（６．１分））。結果を表１に示す。

【００１８】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表１──────────────
─────────────────────　　酵素
　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＥｔ　　　　　　　　　　　　　生成率（％）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　の消失（％）　　　　　　──────────
──────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　α−ペプ
チド　　　　ε−ペプチド　　───────────
────────────────────────Ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′　　　　　　　　　　７
０　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　
　　　　　２１　　　　　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ
　　　　　　　　　　　　　　９６　　　　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　２５　　　
　　　放線菌アルカリ性　　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　９９　　　
　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　
　２８　　　　　　α−キモトリプシン　　　　　　　
　４４　　　　　　　　　　　　　　２１　　　　　　
　　　　　　８．４　　　　　　エラスターゼ　　　　
　　　　　　　　　　１９　　　　　　　　　　　　　
　６．１　　　　　　　　　　　　２．９　　　　　　
─────────────────────────
──────────表１に示す様に、α−キモトリプ
シンやエラスターゼと比較して、本発明のプロテアーゼ
はＬ−リジンのε−アミノ基に高い選択性を有している
ことがわかった。〔実施例２〕実施例１においてＤＭＦの代わりにＤＭＳ
Ｏ、アセトニトリル、ジオキサンをそれぞれ用いて同様
の実験を行なった。結果を表２に示す。

【００１９】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表２　　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　
およびα−キモトリプシン（（　）　内）を用いた結果
─────────────────────────
──────────　　溶媒　　　　　　　　　　　
　　　　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ　　　　　　　
　　　　　　生成率（％）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　の消失（％）　　
　　　　────────────────　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　α−ペプチド　　　　ε−ペプチ
ド　　──────────────────────
─────────────ＤＭＳＯ　　　　　　　　
　　　　　　９９（９９）　　　　　　　　０（４１）
　　　　２７（１２）　　アセトニトリル　　　　　　
　　９７（５）　　　　　　　　　　０（１．６）　　
　　２３（０．７）　　ジオキサン　　　　　　　　　
　　　９７（２９）　　　　　　　　０（１１）　　　
　１６（３．１）　　───────────────
────────────────────表２に示す
様に、本発明のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋは、α−キモ
トリプシンと比べていずれの溶媒を用いたときもＬ−リ
ジンのε−アミノ基に高い選択性を有していることがわ
かる。〔実施例３〕実施例１において、Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢ
ｕの代わりにＤ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕを用いて同様の実
験を行なった。結果を表３に示す。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表３──────────────
─────────────────────　　酵素
　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＥｔ　　　　　　　　　　　　　　　生成率（％）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　の消失（％）　　　　　　──────────
──────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　α−
ペプチド　　　　ε−ペプチド───────────
────────────────────────Ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′　　　　　　　　　　７
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　
　　　　　　　１８　　　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ
　　　　　　　　　　　　　　９８　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　２４　
　　　放線菌アルカリ性　　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　９９　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
　　　２６　　　　────────────────
───────────────────表３に示す様
に、本発明のプロテアーゼはＤ−リジンのε−アミノ基
に高い選択性を有していることがわかった。〔実施例４〕Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ（１００ｍ
Ｍ）、Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕ（２００ｍＭ）のｔ−ア
ミルアルコール（モレキュラーシーブ３Ａで乾燥後）溶
液に、それぞれ表４の括弧内に示したｐＨの緩衝溶液か
ら凍結乾燥したプロテアーゼを５ｍｇ／ｍｌの濃度で加
え、その懸濁液を１５０ｒｐｍ　で４５℃２４時間振と
うした。遠心沈降して酵素を除き、上澄みをＨＰＬＣで
解析した。結果を表４に示す。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表４──────────────
─────────────────────　　酵素
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−Ａｃ−
Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ　　　　　　　　　　　　生成率（
％）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　の消失（％）　　──────
────────　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　α−ペプチド　　ε−ペプチド─────────
─────────────────────────
─Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′（７．８）　　　　
　　　　　５１　　　　　　　　　　　　　　０．３　
　　　　　　　　　４９　　　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
　Ｋ　　　　（７．８）　　　　　　　　　７７　　　
　　　　　　　　　　　０．４　　　　　　　　　　７
５　　　　放線菌アルカリ性　　プロテアーゼ（１１．０）　　　　　　　　　　７
５　　　　　　　　　　　　　　２．２　　　　　　　
　　　６６　　　　────────────────
───────────────────表４に示す様
に、実質上無水有機溶媒中に酵素を懸濁させた系におい
ても本発明のプロテアーゼはＬ−リジンのε−アミノ基
に高い選択性を有し、高収率でε−ペプチドを与えるこ
とがわかった。〔実施例５〕実施例４において、Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢ
ｕの代わりにＤ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕを用いて同様の実
験を行なった。結果を表５に示す。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表５──────────────
─────────────────────　　酵素
　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＥｔ　　　　　　　　　　　　　　　生成率（％）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　の消失（％）　　　　──────────
──────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　α−
ペプチド　　　　ε−ペプチド───────────
────────────────────────Ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′　　　　　　　　　　８
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　
　　　　　　　７５　　　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ
　　　　　　　　　　　　　　５８　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　５６　
　　　放線菌アルカリ性　　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　５２　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
　　　４８　　　　────────────────
───────────────────表５に示す様
に、実質上無水有機溶媒中に酵素を懸濁させた系におい
ても、本発明のプロテアーゼはＤ−リジンのε−アミノ
基に高い選択性を有し、高収率でε−ペプチドを与える
ことがわかった。〔実施例６〕実施例４の反応条件を用い、さまざまな基
質と酵素の組み合わせで反応を行ない、生成物をＨＰＬ
Ｃで解析した。結果を表６に示す。

【００２０】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　６──────────────
─────────────────────　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　生成比（％）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　──────────　　基質エステ
ル体　　　　　　リジン誘導体　　　　　　　　酵素（
＊）　　　α−ペプ　　ε−ペプ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　チド　　　　　　
チド　　　　───────────────────
────────────────１．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−
Ａｌａ−ＯＥｔ　　　　　　　　　　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　
ｔＢｕ　　　　　　　１）　　　　　　　　０　　　　
　　　　７４２．　Ｎ−Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＥｔＣｌ
　　　　　　　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕ　　　　　　　
２）　　　　　　　　０　　　　　　　　５６３．　Ｎ
−Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＥｔＣｌ　　　　　　　Ｄ−Ｌ
ｙｓ−ＯＢｕ（ｎ）　　　　　　２）　　　　　　　　
０　　　　　　　　７０　　４．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ｓｅｒ
−ＯＥｔＣｌ　　　　　　　　Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ−Ｃ６
Ｈ５　　　　　３）　　　　　　　　１．２　　　　　
　７２　　５．　Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＥｔＣｌ　　
　　　　　　Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ５　　　２
）　　　　　　　　０　　　　　　　　８０　　６．　
Ｎ−Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔＣｌ　　Ｄ−
Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕ　　　　　　　３）　　　　　　　
　０　　　　　　　　５３７．　Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ
−ＯＥｔＣｌ　　　　　　　Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ２　　　
　　　　　　１）　　　　　　　　０　　　　　　　　
６８　　─────────────────────
──────────────（＊）　ただし　　酵素
　１）　はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′を、　２）
　はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを、　３）　は放線菌ア
ルカリ性プロテアーゼを表す。

【００２１】Ｅｔはエチル基、ＥｔＣｌは２−クロロエ
チル基を表す。表６からわかるように、いずれの場合も
本発明のプロテアーゼはリジンのε−アミノ基に高い反
応性と選択性を有していることがわかった。〔実施例７〕（プレパラティブスケールの合成例）２．
５ｍｍｏｌのＮ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔＣｌと３．
０ｍｍｏｌのＬ−Ｌｙｓ−Ｏ　ｔＢｕを２５ｍｌのｔ−
アミルアルコール（モレキュラーシーブ３Ａで乾燥）に
溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（ｐＨ７．８のリン
酸緩衝液より凍結乾燥）１２５ｍｇを加え４５℃で２４
時間撹拌した。終了後酵素を濾別し、溶媒を減圧留去し
た後、残渣を酢酸エチルと４％炭酸ナトリウム水溶液を
加え抽出、分液した。酢酸エチル層を食塩水で洗浄した
後硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧留去した。残渣をｎ
−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒（５／１）より再結
晶し、Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ε−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯｔＢ
ｕ２．０ｍｍｏｌを得た。収率８０％。この生成物はＨ
ＰＬＣで単一ピークを与え、さらに物性値は文献値（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　誌、２９巻、５４
８７頁（１９８８））と一致した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　リジン又はその誘導体を、プロテアー
ゼ存在下で他の基質エステル体と反応させて、リジン−
ε−ペプチドを製造する方法において、プロテアーゼが
、バチルス・アミロリクイファシエンス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　由来の
セリンプロテアーゼ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＢＰＮ′
）　、トリティラチウム・アルブム　（Ｔｒｉｔｉｒａ
ｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）　由来のセリンプロテアーゼ
　（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）　、及びストレプトミ
セス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉ
ｓｅｕｓ）　由来のセリンプロテアーゼ（放線菌アルカ
リ性プロテアーゼ）から成る群から選ばれたものである
ことを特徴とするリジン−ε−ペプチドの製造方法。
【請求項２】　　有機溶媒を反応溶媒に用いることを特
徴とする請求項１記載のリジン−ε−ペプチドの製造方
法。