JPH04237498A - ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はプロリン特異性プロテア
ーゼを用いる生理活性ペプチド及びその誘導体及びそれ
らの中間体の製造法に関する。本明細書においてアミノ
酸、ペプチド、保護基等の記載はＩＵＰＡＣ委員会提唱
の略号及び／または当該分野における慣用記号に従うも
のとする。またアミノ酸は特記しない限りＬ体である。

【０００２】

【従来の技術】従来、ペプチドは一般的に化学合成法に
より製造されていたが、近年以下のような利点からプロ
テアーゼを利用してペプチドを合成しようとする酸素合
成法の研究が活発になってきた。 ■　　原料アミノ酸或いはペプチドの側鎖官能基を必ず
しも保護する必要がない ■　　反応が立体選択的に進行するので安価なラセミ体
を原料に使用できる ■　　上記理由により反応中にラセミ化が起こらない■
　　常温、常圧下で反応が進行するので、特別な反応装
置を必要としない

【０００３】しかしながら、酸素合成法は上記のような
優れた特徴を有する反面、次のような欠点がある。 ■　　プロテアーゼの基質特異性のため、原料アミノ酸
の種類に応じて利用できるプロテアーゼが限定され、あ
る一つのプロテアーゼが如何なるペプチド合成反応にも
利用できるものではない ■　　プロテアーゼの基質特異性のため、合成するのに
非常に困難なペプチド結合がある ■　　反応は一般に平衡反応であり、反応の平衡は基質
側に大きく片寄っており、収率・反応速度等が低い■　
　オリゴペプチドをフラグメント縮合により合成する際
、原料ペプチドがプロテアーゼにより加水分解されたり
、加水分解することにより生じたペプチド或いはアミノ
酸が合成反応に関与し、種々の副生物を与える。時には
、目的ペプチドが全く生成しないことがある。

【０００４】これらの欠点を克服するため、種々の反応
条件が検討された。その結果、水−有機溶媒系（二相系
）或いは有機溶媒系で反応を行うことにより反応平衡を
生成物側にかなりシフトさせることが可能になり、従来
合成できなかったペプチド結合が合成できるようになっ
たり、収率・反応速度等の低かった反応の収率・反応速
度等を向上させることができるようになった。また、プ
ロテアーゼの中にはエステル交換能を有するものも有り
、このようなプロテアーゼでは、カルボキシル成分とし
てエステルを基質とすることにより、さらにペプチドの
合成反応の収率・反応速度等を向上することができた。

【０００５】しかしながら、上記欠点がすべて克服でき
たわけではない。その一つにプロリン或いはＣ−末端が
プロリン残基のペプチドをカルボキシル成分とするペプ
チド合成を行うことは非常に困難なことが挙げられる。 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン（Ｚ−Ｐ
ｒｏ）をカルボキシル成分とし、Ｌ−ロイシンアミド・
臭化水素酸塩（Ｌｅｕ−ＮＨ２　・ＨＢｒ）をアミン成
分とし、サーモライシンの作用によるＺ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−ＮＨ２　の合成（化学と生物１６　　５４２（１９
７８））或いはＺ−Ｐｒｏをカルボキシル成分とし、Ｌ
−ロイシル−グリシンアミド・トリフルオロ酢酸塩（Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　・ＴＦＡ）をアミン成分とし、
サーモライシンの作用によるＺ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＮＨ
２　の合成（Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５０　　２７７５（１９８５）
）が従来技術として報告されているが、いずれもＰｒｏ
−Ｌｅｕの結合を合成しているのみである。アンジオテ
ンシンを始め、数多くの生理活性ペプチドにプロリン残
基が含まれているが、その結合様式は必ずしもＰｒｏ−
Ｌｅｕではない。従って、Ｌｅｕ以外の種々のアミノ酸
との結合を合成する方法の開発が望まれている。

【０００６】さらに、フラグメント縮合において、原料
ペプチドが加水分解されるということは合成したいペプ
チド結合以外にもプロテアーゼが基質として認識するペ
プチド結合があるということであり、基質特異性が狭く
厳格なプロテアーゼほどフラグメント縮合には有利とな
る。しかし、通常のプロテアーゼの基質特異性は必ずし
も厳密ではなく、また、ペプチド鎖長が長くなっても基
質特異性が保持されるとは限らない。フラグメント縮合
によく用いられるプロテアーゼとしてトリプシンがある
。トリプシンはＡｒｇ及びＬｙｓ残基のＣ末端を特異的
に加水分解するのでＡｒｇ−Ａ或いはＬｙｓ−Ａ（Ａは
アミノ酸残基）の結合を合成することができる。しかし
、種々の生理活性ペプチドをフラグメント縮合で合成す
るには、トリプシンのみではとても十分とはいえず、Ａ
ｒｇ−Ａ或いはＬｙｓ−Ａ（Ａはアミノ酸残基）以外の
ペプチド結合を合成できるペプチド合成用プロテアーゼ
の開発が望まれる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記課題、す
なわち酵素合成法においてＰｒｏ−Ａ（Ａはアミノ酸残
基）結合が困難であること、フラグメント縮合にトリプ
シン以外に有用な酵素がないことを解決するものであり
、その目的とするところは安価なペプチド製造法を提供
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは各種プロテ
アーゼの中からＰｒｏ−Ａ（アミノ酸残基）結合を合成
できるものはないか検討した結果、プロリン特異性プロ
テアーゼに優れた合成能があり、また該プロテアーゼは
狭く、かつ厳格な基質特異性を有しており、フラグメン
ト縮合にも好適であることを発見し、本発明を完成する
に至った。さらに通常プロテアーゼで２つの異なるアミ
ノ酸からなるジペプチドを合成する際、結合の順序を決
定させるため、カルボキシ成分となる方のアミノ酸のア
ミノ基に保護基をつける必要があるが、本発明において
はプロリン特異性プロテアーゼの基質特異性によるもの
と思われるが、カルボキシ成分となるプロリンのカルボ
キシル基を炭素数１〜５のアルキルエステルにさえして
おけば、アミノ基の保護基は必ずしも必要でないことが
わかった。一般にアミノ基の保護基は、カルボキシル基
の保護基よりコスト高となるため、本発明の方法の方が
、より有利である。

【０００９】本発明の要旨は、アミノ基および／または
カルボキシル基を保護した（ａ）プロリンまたは（ｂ）
Ｃ末端にプロリンを有するペプチドをカルボキシル成分
とし、（ｃ）カルボキシル基を保護した、プロリン以外
のアミノ酸または（ｄ）Ｎ末端にプロリンを有しないペ
プチドをアミン成分として、プロリン特異性プロテアー
ゼの作用により、ペプチド結合を形成させることを特徴
とするペプチドの製造法に存する。

【００１０】本発明の方法を適用できるペプチドとして
は、例えば、ＡＣＥ阻害剤アラセプリルの中間体として
有用な、Ｐｒｏ−Ｐｈｅやアンジオテンシン、性腺刺激
ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）などの生理活性ペ
プチドが挙げられる。

【００１１】本発明に用いることのできるプロリン特異
性プロテアーゼは特に限定されない。例えばフラボバク
テリウム（Ｐｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などの細
菌由来の該プロテアーゼ、シメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｉｕ
ｍ）属、ハラタケ（Ａｇｒｉｏｕｓ）属などの担子菌由
来の該プロテアーゼ、或いは仔ヒツジ腎、仔ヒツジ脳、
ウシ脳などの動物組織由来の該プロテアーゼなどが挙げ
られる。また、これらの該プロテアーゼの精製は、硫安
分画、カラムクロマトグラフィーなどの一般的な公知の
方法により行うことができる。

【００１２】プロリン特異性プロテアーゼの使用量はそ
の種類により異なるが、通常０．１〜１０ｍｇ／ｍｌで
用いる。またこれらのプロテアーゼは固定化し繰り返し
使用することもできる。

【００１３】原料となるカルボキシ成分は一般に、Ｘ−
Ｐｒｏ−ＯＲ１　 ［Ｒ１　はＨまたは炭素数１〜５のアルキル基、ＸはＨ
またはアミノ基保護基またはＮ−末端が保護されたアミ
ノ酸またはペプチド残基を示す。但しＲ１　＝Ｘ＝Ｈの
場合を除く。］で表されるアミノ酸またはペプチドであ
り、アミノ基保護基としては例えばベンジルオキシカル
ボニルやｔ−ブチルオキシカルボニルなど公知のアミノ
基保護基として用いられるものならいずれでもよい。な
お、上記化学式は化１に示されたものと同義である。濃
度は通常１〜２０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００
ｍＭで用いられる。

【００１４】アミン成分としては一般にＨ−Ｙ−Ｒ２　
［Ｒ２　はＯＨまたはカルボキシル基保護基、Ｙはプロ
リンを除くアミノ酸残基またはＮ−末端がプロリンでな
いペプチド残基を示す。ただし、Ｒ２　がＯＨで、かつ
Ｙがプロリンを除くアミノ酸残基である場合を除く。］
で表わされるアミノ酸またはペプチドであり、カルボキ
シル保護基としては例えば、メチルエステル、エチルエ
ステル、ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステルなどの
各種エステル類、酸アミド、アニリドなどの各種アミド
類、フェニルヒドラジドなどのヒドラジド類が挙げられ
、いずれでも用いることができる。濃度は通常１〜２０
００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭで用いられる
。

【００１５】カルボキシル成分とアミン成分の反応割合
は、通常カルボキシル成分：アミン成分＝１：１〜１：
１０とアミン成分過剰で反応を行う。

【００１６】上記カルボキシル成分とアミン成分を用い
た場合に得られるペプチドは、 Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｒ２　 ［Ｘ、ＹおよびＲ２　は上記と同意義。］で表わされる
ペプチドである。なお、上記化学式は化２に示されたも
のと同義である。

【００１７】反応は、種々の緩衝液あるいは水−有機溶
媒の均一系あるいは水−有機溶媒の二相系あるいは有機
溶媒中で行われる。

【００１８】緩衝液としては、リン酸、酢酸、クエン酸
、トリス、ホウ酸など通常用いられている緩衝液であれ
ばいずれでもよい。水−有機溶媒の均一系で用いられる
有機溶媒としてはメタノール、エタノール、アセトン、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど水と
混合することのできる有機溶媒であればいずれでもよい
。水−有機溶媒の二相系で用いられる有機溶媒としては
、酢酸エチル、エーテル、クロロホルムなどの水と混じ
り合わない有機溶媒であればいずれでもよい。有機溶媒
中で反応させる時は該プロテアーゼを固定化しておくこ
とが望ましく、有機溶媒としてはいずれでも用いること
はできるが、ベンゼン、酢酸エチル、クロロホルムなど
水と混じり合わない有機溶媒の方が望ましい。

【００１９】反応のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜８
、反応温度としては１０〜４０℃、好ましくは１５〜３
０℃、反応時間は通常１〜２４時間である。目的生成物
の精製手段としては、例えば抽出、結晶化、クロマトグ
ラフィーなどの公知の手段を用いる事ができる。

【００２０】

【実施例】以下に実施例及び比較例を挙げて、本発明を
更に具体的に説明する。また略号として次のものを用い
る。 Ｐｒｏ：プロリン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｇｌｙ：グリシン Ｚ　　　　：ベンジルオキシカルボニルＯＮｅ：メチル
エステル ＯＥｔ：エチルエステル

【００２１】実施例１　　Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ
の合成 ｐＨを６．０、７．０、８．０に調整した表１に示した
組成の反応液を各５ｍｌ、２０ｍｌ容のサンプル瓶に入
れ、これにプロリン特異性プロテアーゼ（生化学工業製
）７．５ｍｇを溶解し、２０℃で２４時間反応させた。 反応後、反応液中のＺ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔを薄層
クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）で確認及び定量した。その結果、いず
れの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔが生成し
ており、生成量はｐＨ７．０の時に最大で、約３９ｍＭ
生成していた。

【００２２】比較例１ プロリン特異性のプロテアーゼの代わりにα−キモトリ
プシン（シグマ社製）、トリプシン（シグマ社製）、パ
パイン（シグマ社製）、ペプシン（シグマ社製）サーモ
ライシン（大和化成製）を用いて実施例１と同様の反応
を行った。但しサーモライシンを用いた時は、０．１Ｍ
リン酸緩衝液の代わりに、０．１Ｍトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−マレイン酸緩衝液
を用いた。しかし、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−ＯＥｔの生成は認められなかった。又、酸素の
使用量を各々１０倍の７５ｍｇにして同様の実験を行っ
たが、結果は同様でいずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−
ＯＥｔの生成は認められなかった。

【００２３】実施例２　　Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ
の合成 ｐＨを６．０、７．０、８．０に調整した表２に示した
組成の反応液を各２．５ｍｌ、２０ｍｌ容のサンプル瓶
にとり、実施例１と同様の反応を行った。その結果、い
ずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔは生成
しており、ｐＨ７．０の時生成量は最大であり、約２１
ｍＭであった。

【００２４】実施例３　　Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ
の合成 Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔの代わりにＺ−Ｐｒｏを用
い、実施例１と同様の反応を行った。その結果、実施例
１と同様、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
ＯＥｔが生成しており、その生成量はｐＨ７．０の時最
大で、約２０ｍＭ生成していた。

【００２５】比較例２ 比較例１において、Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＥｔの代わりにＺ−
Ｐｒｏを用いて同様の反応を行った。サーモライシンを
７５ｍｇを用い、ｐＨ６．０の時Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
ＯＥｔが約９ｍＭ生成していたが、他の場合はいずれも
反応液中にＺ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔは生成していな
かった。

【００２６】実施例４　　Ｚ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
　の合成 実施例１において、Ｐｈｅ−ＯＥｔ・ＨＣｌの代わりに
Ｇｌｙ−ＮＨ２　・ＨＣｌを用いて同様の実験を行った
。 その結果、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
ＮＨ２　は生成しており、その生成量はｐＨ７．０の時
最大で約１０ｍＭ生成していた。

【００２７】比較例３ 比較例１において、Ｐｈｅ−ＯＥｔ・ＨＣｌの代わりに
Ｇｌｙ−ＮＨ２　・ＨＣｌを用いて同様の反応を行った
が、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
　は生成していなかった。

【００２８】実施例５　　Ｚ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
　の合成 実施例３において、Ｐｈｅ−ＯＥｔ・ＨＣｌの代わりに
Ｇｌｙ−ＮＨ２　・ＨＣｌを用いて同様の反応を行った
。 その結果、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
ＮＨ２　は生成しており、その生成量はｐＨ７．０の時
最大で約５ｍＭ生成していた。

【００２９】比較例４ 比較例２において、Ｐｈｅ−ＯＥｔ・ＨＣｌの代わりに
Ｇｌｙ−ＮＨ２　・ＨＣｌを用い、同様の反応を行った
が、いずれの反応液中にもＺ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
　は生成していなかった。

【００３０】実施例６　　Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔの合
成実施例１において、Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＥｔの代わりにＰ
ｒｏ−ＯＭｅを用い同様の反応を行った。その結果いず
れの反応液中にもＰｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＥｔが生成してお
り、その生成量はｐＨ７．０の時最大で、約５ｍＭ生成
していた。

【００３１】

【発明の効果】本発明により、従来酵素合成法で非常に
合成が困難であったＰｒｏ−Ａ（Ａはアミノ酸残基）の
結合を容易にかつ選択的に合成でき、種々生理活性ペプ
チドが効率よく製造できるようになった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アミノ基および／またはカルボキシル
   基を保護した（ａ）プロリンまたは（ｂ）Ｃ末端にプロ
   リンを有するペプチドをカルボキシル成分とし、（ｃ）
   カルボキシル基を保護した、プロリン以外のアミノ酸ま
   たは（ｄ）Ｎ末端にプロリンを有しないペプチドをアミ
   ン成分として、プロリン特異性プロテアーゼの作用によ
   り、ペプチド結合を形成させることを特徴とするペプチ
   ドの製造法。
2. 【請求項２】 【化１】 ［式中のＲ１　はＨまたは炭素数１〜５のアルキル基、
   ＸはＨもしくはアミノ基保護基またはＮ−末端が保護さ
   れたアミノ酸もしくはペプチド残基を示す。ただしＲ１
   　＝Ｘ＝Ｈの場合を除く。］で表されるアミノ酸または
   ペプチドをカルボキシル成分とし、 式　　Ｈ−Ｙ−Ｒ２　 ［式中Ｒ２　はＯＨまたはカルボキシル基保護基、Ｙは
   プロリンを除くアミノ酸残基またはＮ−末端がプロリン
   でないペプチド残基を示す。ただしＲ２　がＯＨで、か
   つＹがプロリンを除くアミノ酸残基である場合を除く。 ］で表されるＮ−末端のアミノ基が遊離のアミノ酸また
   はペプチドをアミン成分として、プロリン特異性プロテ
   アーゼの存在下に縮合させ、 【化２】 ［式中、Ｘ、ＹおよびＲ２　は前記と同意義。］で表さ
   れるペプチドを製造することを特徴とする請求項１記載
   のペプチドの製造法。