DK149824B

DK149824B - Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner

Info

Publication number: DK149824B
Application number: DK27782A
Authority: DK
Inventors: Klaus Breddam; Jack Taaning Johansen
Original assignee: Carlsberg Biotechnology Ltd
Priority date: 1982-01-22
Filing date: 1982-01-22
Publication date: 1986-10-06
Also published as: EP0085516A3; DK149824C; AU549272B2; EP0085516A2; AU1060883A; CA1195940A; DK27782A; US4579820A; ATE19790T1; DE3363449D1; ES519127A0; EP0085516B1; ES8402875A1

Description

i 149824

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art til enzymatisk udskiftning af den C-terminale aminosyre i B-kæden (B—30) i insuliner, især omdannelse af svineinsulin til human 5 insulin.

En sådan fremgangsmåde er beskrevet i Carlsberg Res.

Commun. Vol. 46, p. 361-372 (1981) og i tidligere patentansøgninger baseret på dansk patentansøgning nr. 3197/80, 10 såsom international ansøgning W0 82/00301 videreført som dansk ansøgning nr. 1300/82 (fremlæggelsesskrift nr. 148714), dansk ansøgning nr. 3204/83, og europæisk patentansøgning nr. EP 45187. Det foretrukne serincarboxy-peptidaseenzym er carboxypeptidase Y (CPD-Y) fra gær 15 (Saccharomyces cerevisiae), der med fordel kan anvendes til omdannelse af svineinsulin (Ins'-Lys-Ala) til human insulin (Ins'-Lys-Thr) ved en transpeptideringsreaktion med Thr-Nl·^ eller en threoninalkylester.

20 Afhængigt af reaktionsbetingelserne, især pH, fører denne fremgangsmåde direkte til human insulin, der kan indeholde uomsat svineinsulin, eller til human insulinamid, eller -alkylester, der kan separeres fra uomsat svineinsulin ved HPLC og derpå deblokeres, fortrinsvis 25 ved hjælp af CPD-Y. Det totale udbytte ved deamiderings-reaktionen har været ca. 20-30?0, idet det skal bemærkes, at disse tal refererer til testreaktioner, og at man ikke har forsøgt en optimering af reaktionsbetingelserne.

30 Yderligere detaljer vedrørende processen findes i ovennævnte ansøgninger, hvor den kendte teknik også er udførligt diskuteret.

Det har nu overraskende vist sig, at de tidligere opnåede 35 udbytter i eksemplerne i de nævnte ansøgninger kan forbedres drastisk ved kemisk modificering af de L-specifikke 2

14982A

serincarboxypeptidaseenzymer, under forudsætning af, at uisse reaktionsbetingelser overholdes.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfin-5 delsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

I en foretrukken udførelsesform er serincarboxypeptidase-enzymet modificeret med mercuriioner, fortrinsvis i 2Q form af HgC^, i nærvær af en passende puffer. Det er velkendt, at carboxypeptidase Y og andre serincarboxy-peptidaser indeholder en -SH (sulfhydryl) gruppe i form af en enkelt cysteinrest, jfr. f.eks. Hayashi et al., J. Biochem. 77, 1313-1318 (1975) (Ref. 1), Bai et al., 15 3. Biol. Che-m. 254, 8473-8479 (1979) (Ref. 2) og Widmer et al. (Ref. 7).

Hayashi et al. undersøgte virkningerne af forskellige metalioner på peptidase- og esteraseaktiviteten af CPD-Y 2q og påviste, at præinkubering med Cu++, Ag+, Hg++, Cu+,

Mg , Ca , Ba , Cr , Mn , Fe og Ni ioner i mængder på 10“4 og 10”^ M resulterede i signifikante tab af peptidase- og esteraseaktiviteterne. Et særligt udtalt tab observeredes med Hg++ (tilsat i form af HgC^), 25 der inaktiverede enzymet fuldstændigt. Hayashi et al.

antager, at inaktiveringen for Hg++,s vedkommende skyldes en blokering af -SH gruppen.

Bai et al. har endvidere undersøgt -SH gruppens egenskaber jg og bekræftet den signifikante nedgang i peptidaseaktivitet for Hg++-behandlet CPD-Y i forhold til nativt CPD-Y over for de fleste substrater.

På denne baggrund kunne det ikke forventes, at en carboxy-25 peptidase Y, der var kemisk modificeret med en divalent metalion, især Hg++ (CPD-YM) ville være i stand til 3 149826 at katalysere omdannelsen af svineinsulin til human insulinamid ved transpeptidering i nærvær af threoninamid.

Det viste sig overraskende, at anvendelsen af CPD-YM 5 resulterede i en drastisk forøgelse af omdannelsesucjbyttet op til 70 - 75?0, hvis blot reaktionsmediet også indeholdt halogenioner (F“, Cl", Br~ og I~) eller pseudohalogen-ioner, nemlig CN eller SCN .

10 Uden at ville være bundet til nogen bestemt teori, antages det, at halogen- eller pseudohalogenionerne neutraliserer den positive ladning på CPD-YM, hvorved det inaktiverede enzym reaktiveres. Denne mekanisme forklarer imidlertid ikke den drastiske udbytteforøgelse, der illustreres 15 nedenfor ved udførelseseksempler.

De anvendelige carboxypeptidaser ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er L-specifikke serincarboxypeptidaser.

Sådanne enzymer kan produceres af gærsvampe, eller de 20 kan være af animalsk, vegetabilsk eller mikrobiel oprindelse .

Et særligt velegnet enzym er carboxypeptidase-Y fra gærsvampe (CPD-Y). Dette enzym er bl.a. beskrevet i 25 DK-ans. nr. 5202/80, bl.a. under henvisning til Johansen et al. (Ref. 4), der udviklede en særligt hensigtsmæssig rensningsmetode ved affinitetschromatografi på en affinitetsresin omfattende et polymert resinskelet med tilkoblede benzylsuccinylgrupper. CPD-Y har den fordel ikke 30 at udvise endopeptidaseaktivitet. Det er tilgængeligt i store mængder og udviser en relativt høj stabilitet.

Yderligere detaljer er angivet i Ref. 3 og 5.

Foruden CPD-Y, der er det foretrukne enzym for nærværende, 35 kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres med andre carboxypeptidaser, f.eks. de nedenstående: 149824 4

Enzym Oprindelse

Svampe

Penicillocarboxypeptidase S-l Penicillium janthinellum ii S—2 11 11 5 Carboxypeptidase(r) fra Aspergillus saitoi " Aspergillus oryzae

Planter

Carboxypeptidase(r) C Orangeblade

Orangeskaller 10 Carboxypeptidase Citrus natsudaidai Hayata

Phaseolain Bønneblade

Carboxypeptidase(r) fra Spirende byg

Spirende bomuldsplanter Tomater 15 Vandmeloner

Bromelain (ananas) pulver

Det nære slægtskab mellem en række af de ovennævnte carboxypeptidaser er diskuteret af Kubota et al. (Ref.

20 6).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan i princippet gennemføres med et hvilket som helst naturligt, semisyntetisk eller syntetisk insulin som substratkomponenten Ins-X.

25

Den L-aminosyre, hvis amid eller alkylester omsættes med insulinet Ins-X, kan være en hvilken som helst af de kendte L-aminosyrer, f.eks. Leu, Ile, Ala, Gly, Ser,

Val, Thr, Lys, Arg, Asn, Glu, Gin, Met, Phe, Tyr, Trp 30 eller His, men er fortrinsvis Thr.

I denne sammenhæng betegner "alkyl" ligekædet eller forgrenet alkyl, fortrinsvis med 1-6 carbonatomer, såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert.

35 butyl, amyl eller hexyl.

5 U9824

Soro anført i krav l's kendetegnende del gennemføres fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved pH 5,0 - 10,5 og fortrinsvis ved pH 7,0 - 8,5. Den foretrukne pH-værdi, der ofte ligger inden for et meget snævert interval, 5 afhænger af henholdsvis pH-optima og pH-minima for det anvendte enzyms forskellige enzymatiske aktiviteter.

Det skal bemærkes, at de operative pH-områder er bredere end ved anvendelsen af umodificeret enzym, eftersom 10 modificeringen fører til en reduceret amidase-aktivitet i pH-området 5-7, hvorved isolering af et insulinamid bliver mulig, selv i nævnte pH-område.

Hvis CPD-Y anvendes som modificeret enzym, er pH-værdien 15 fortrinsvis 7,0 - 8,5, der er særligt velegnet, hvis man ønsker at isolere et insulinamid-mellemprodukt.

Inden for dette interval opnås de højeste insulinamid-udbytter.

20 Den valgte pH-værdi bør fortrinsvis opretholdes under hele koblingsreaktionen, og kan derpå ændres til udfældning af reaktionsproduktet, fraspaltning af beskyttelsesgrupper, etc. Man kan også vælge et pH, ved hvilket enzymet udviser en udtalt amidaseaktivitet, hvorved 25 det ønskede insulin dannes i ét trin. Fortrinsvis vil man dog vælge et pH, hvor enzymet overvejende udviser peptidaséaktivitet og derved favoriserer dannelsen af stabile insulinamid-mellemprodukter, eftersom disse let kan separeres fra uomsat insulinudgangsmateriale.

30 pH-kontrol kan f.eks. opnås ved inkorporering af en passende puffer for det ønskede pH-område i reaktionsmediet, såsom en bicarbonatpuffer eller HEPES-puffer.

35 pH-værdien kan også opretholdes ved tilsætning af en syre, såsom HC1, eller en base, såsom NaOH, under reak- 149824 6 tionen. Dette kan bekvemt gøres ved anvendelse af en pH-stat.

På basis af informationen givet ovenfor og i Ref. 3 5 og 5 vil fagmanden være i stand til at udvælge de mest velegnede reaktionsbetingelser, især med hensyn til den pH-væ-rd.i, ved hvilken de forskellige enzymatiske aktiviteter (amidase, peptidase, esterase, carboxypepti-dase og peptidyl-aminosyre-amid hydrolase) bedst kan 10 udnyttes i afhængighed af insulin-udgangsmaterialet, L-aminosyrederivatet og ønsket om at undertrykke eller favorisere dannelsen af mellemprodukter.

I regien fremmer lave pH-værdier indenfor det ovennævnte 15 interval dannelsen og udfældningen af et insulinamid- mellemprodukt, mens højere værdier fører til en fraspalt-ning af amidgruppen på grund af carboxypeptidasens mere udtalte amidaseaktivitet.

20 i midlertid kan disse betingelser også påvirkes ved variation af enzymkoncentrationen, reaktionstiden, etc.

Reaktionen gennemføres som nævnt i et vandigt reaktionsmedium, der om ønsket kan indeholde op til 50¾ af et 25 organisk opløsningsmiddel. Foretrukne organiske opløsningsmidler er alkanoler, f.eks. methanol og ethanol, glycoler, f.eks. ethylenglycol eller polyethylenglycoler, dimethyl-formamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan og dimethoxyethan.

30

Valget af reaktionsmediets sammensætning afhænger især af opløseligheden, temperaturen og pH for reaktions^ komponenterne og de involverede insulinprodukter, samt af enzymets stabilitet.

Reaktionsmediet kan også indeholde en komponent, som 35 7 14982Å gør enzymet uopløseligt, men bibeholder en væsentlig del af enzymaktiviteten, såsom en ionbytterharpiks.

Alternativt kan enzymet immobiliseres på i og for sig kendt måde, jfr. Methods of Enzymology, Vol. 44, 1976, 5 f.eks. ved binding til en matrix, såsom en tværbunden dextran eller agarose, eller til en silica, et polyamid eller cellulose, eller ved indkapsling i polyacrylamid, alginater eller fibre. Endvidere kan enzymet modificeres ad kemisk vej til forbedring af dets stabilitet eller 10 enzymatiske egenskaber.

Hvis man ønsker at undertrykke enhver udfældning af insulinamid-mellemprodukter, kan reaktionsmediet også indeholde urinstof eller guanidinhydrochlorid i koncen-15 trationer på op til 6 molær. Dette kan også være fordelagtigt ved pH-værdier og i medier, hvor insulin-substrat-komponenten har begrænset opløselighed.

Koncentrationen af de to reaktionsdeltagere kan variere 20 inden for vide grænser, som forklaret nedenfor. En fore-trukken udgangskoncentration for insulinet er 0,002 -0,05 molær og for L-aminosyrederivatet 0,05 - 3 molær.

Enzymkoncentrationen kan ligeledes variere, men er for-25 trinsvis 10 ^ - 10 ^ molær, især 10 ^ molær. Den mest hensigtsmæssige koncentration afhænger bl.a. af koncentrationen af insulinet, L-aminosyrederivatet og reaktionstiden.

30 Som angivet ovenfor er tilstedeværelsen af halogenioner (F~, Cl", Br~ eller I~) eller pseudohalogenioner (CN eller SCN-) i reaktionsmediet af afgørende betydning for det modificerede enzyms katalytiske effekt. Halogen-ionkoncentrationen vil derfor være stærkt afhængig af 35 enzymkoncentrationen, idet mindst støkiometriske mængder er nødvendige, men også af reaktionsmediets sammensætning 8 149*24 iøvrigt, den anvendte halogenion, etc. Generelt kan -4 halogenionkoncentrationen variere fra 10 molær til 2 molær.

5 Reaktionstemperaturen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fortrinsvis 20-40°C. Den mest hensigtsmæssige reaktionstemperatur ved en given syntese kan fastlægges ved forsøg, men afhænger især af det anvendte L-aminosyre-amid eller -ester og enzymkoncentrationen. En passende 10 temperatur er sædvanligvis ca. 20 - 35°C, fortrinsvis ca. 30°C. Ved temperaturer under 20°C vil reaktionstiden sædvanligvis være uhensigtsmæssig lang, mens temperaturer over 40°C ofte forårsager problemer med stabiliteten af enzymet og/eller reaktanterne eller reaktionsproduk-15 terne.

Lignende variationer findes for reaktionstiden, der afhænger meget af de andre reaktionsparametre, især enzymkoncentrationen. Standardreaktionstiden ved frem-20 gangsmåden ifølge opfindelsen er ca. 2-6 timer.

Det skal nævnes, at det, når man anvender et amid som beskyttelsesgruppe, normalt er ønskeligt at fraspalte amidgruppen specifikt fra- det 25 dannede insulinamid. I denne henseende er den umodifice-rede carboxypeptidase, især CPD-Y, meget egnet, eftersom CPD-Y udviser amidaseaktivitet ved pH >9, hvor carboxy-peptidaseaktiviteten er negligerbar. Deamideringen kan også gennemføres med modificeret CPD-Y ved pH 7-10 og 30 5-35°C.

På tilsvarende måde kan carboxypeptidasen generelt anvendes til fraspaltning af alkylestergrupper fra et dannet insulinester-mellemprodukt til opnåelse af et insulin-35 slutprodukt, der ikke er C-terminalbeskyttet.

149824 9 Før fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved eksempler, vil udgangsmaterialerne, målemetoderne, etc. blive omtalt.

UDGANGSMATERIALER

5

Svineinsulin blev leveret af Nordisk Insulinlaboratorium,

Gentofte. Der anvendtes både højrenset zinkfri insulin, zinkinsulin og råinsulin, der kun var renset ved citrat- krystallisation. Carboxypeptidase-Y fra bagerigær, et 10 kommercielt produkt fra Calsberg Bryggerierne, blev isoleret ved en modificering af affinitetschromatografi- fremgangsmåden ifølge Johansen et al. (Ref. 4) og opnået som et lyofiliseret pulver (10¾ enzym i .natriumcitrat).

Æ\

Inden brugen blev enzymet afsaltet på en "Sephadex ^ 15 G-25" tværbunden dextrangelkolonne (1,5 x 25 cm), ækvili- breret og elueret med vand. Enzymkoncentrationen bestemtes 1¾ spektrofotometrisk ved ^gg nm = 1^,8. Det anvendte enzympræparat var fri for Protease A bestemt ifølge Lee og Riordan (Ref. 8). L-threoninamid blev indkøbt 20 hos Vega-Fox, Arizona, USA. Chromatografiske materialer var fra Pharmacia, Sverige. Alle andre reagenter og opløsningsmidler var af analytisk renhedsgrad fra Merck, BRD.

25 AMINOSYREANALYSER

Prøver til aminosyreanalyse blev hydrolyseret i 5,7 M HC1 ved 110°C i vakuum i 24 timer og analyseret på en Durrum D-500 aminosyreanalysator.

30 METODER HPLC analyse

Omdannelsen af svineinsulin til human insulinamid følges 35 ved højtryksvæskechromatografi (reverse phase HPLC).

149824 10

Der anvendtes en "radial-pack Cg" kolonne fra Waters Ass. og elueredes med en opløsning af 0,1M ammoniumsulfat indeholdende 30?£ acetonitril. 30^ul prøver fra reaktionsblandingen fortyndedes med 1M eddikesyre før ind-5 sprøjtningen i HPLC-apparatet.

DISC-PAGE elektrophorese

Omdannelsen af svineinsulin til human insulinamid kan også følges ved DISC-PAGE elektrophorese på en 12,5?£ 10 polyacrylamidgel i en puffer bestående af 0,005M Tris - 0,04M glycin, pH 8,3. Human insulinamid migrerer langsommere end svineinsulin på grund af tabet af en negativ ladning.

15 C-terminalanalyse CPD-Y hydrolyse anvendes til at bestemme den C-terminale sekvens i insulinets B-kæde. 500^ug insulin i 0,05M MES pufferj pH 6,75, nedbrydes med 30^ug CPD-Y ved 37°C i 1 time. De frigjorte aminosyrer bestemtes på aminosyre-20 analysatoren.

Præparativ' DEAE-Sepharose chromatoqrafi Human insulinamid separeres fra uomsat svineinsulin ved ionbytningschromatografi på "DEAE-Sepharose" (Agarose-25 gel). Den lyofiliserede insulinprøve opløstes i 0,01M Tris - 0,05M NaCl - 2,5M urinstof, pH 7,5, og påførtes kolonnen, der var ækvilibreret med den samme puffer.

Insulinerne elueres med en NaCl-gradient fra 0,05 til 0,30M i den samme puffer.

30

Fremstilling af modificeret carboxypeptidase-Y (CPD-YM)

Til 1 ml af en vandig opløsning af CPD-Y (9,9 mg/ml (150/Umol)) sattes 100/U1 0,5M HEPES, pH 7,5, og derpå 25^ul af en vandig opløsning af 10 ^M HgC^. Præparatio-35 nen henstod ved stuetemperatur i 10 minutter og var derpå klar til brug. Generelt anvender man støkiometriske 149824 11 mængder af enzym og kviksølv, men overskud af kviksølv kan fjernes ved gelfiltrering eller dialyse. Analogt hermed kan man modificere CPD-Y til methyl-Hg-CPD-Y og ethyl-Hg-CPD-Y ved omsætning med 10 mM methyl-HgCl 5 og ethyl-HgCl.

Test for eventuel frigivelse af kviksølv fra CPD-YM Eftersom nativt CPD-Y's specifikke esteraseaktivitet over for substratet Bz-Lys-OMe er praktisk taget nul, 10 mens CPD-YM har en meget høj aktivitet, kan denne forskel udnyttes til at detektere en mulig frigivelse af kviksølv, der ville medføre et fald i esteraseaktiviteten. Imidlertid bevirker hverken tilsætning af lOmM EDTA eller gel-filtrering den mindste nedgang i aktiviteten, hvilket 15 viser, at der ikke frigives kviksølv.

RESULTATER

Eksempel 1 20 80 mg Zn-fri insulin opløstes i 6,5 ml 1,1M Thr-N^ - 0,05M HEPES - 1,0 KC1 pH 7,0, og der tilsattes 12,7 mg CPD-YM i 2,5 ml 0,05M HEPES pH 7,0. Reaktionen gennemførtes ved 20°C og fulgtes ved HPLC og gelelektrophorese.

25 HPLC viste en omdannelsesgrad på 788! efter 21 timers reaktion. En lignende høj omdannelsesgrad iagttoges ved gelelektrophorese.

Efter 21 timers reaktion indstilledes pH til 2 med 1M 30 HC1, og prøven afsaltedes på "Sephadex® - G50" (tværbunden dextrangel) i 1M eddikesyre og lyofiliseredes derpå. Chromatografi over "DEAE-Sepharose" viste en eluerings-profil med to toppe. Gelelektrophorese viste, at de to toppe tilsyneladende var rene. Top I indeholdt 41,5 mg 35 human insulinamid. Aminosyrerne af top I (Tabel I nedenfor) viste, at alanin var udskiftet med threonin. Top II

149824 12 indeholdt 40% uomsat svine’insulin, der kan recirkuleres til processen.

Ekempel 2 5 70 mg citratkrystalliseret råinsulin opløstes i 2 ml 1,5M Thr-NH2 - 0,5M HEPES - 1,0M HC1, pH 7,0. Reaktionen gennemførtes ved 20°C i nærvær af 15yuM CPD-YM.

Efter 72 timers reaktion viste HPLC en omdannelsesgrad 10 på 77%, og lignende omdannelsesgrad blev påvist ved gelelektrophorese. Reaktionsblandingen analyseredes som beskrevet i eksempel 1. Chromatografi over "DEAE-Sepharose" viste en elueringsprofil med to toppe i forholdet 2:1 for henholdsvis human insulinamid og svine-15 insulin. Aminosyreanalysen på top I er vist i Tabel I. Top II indeholdt 40% uomsat svineinsulin.

149824 13

TABEL· I

Aminosyreanalyser af insulin _Eksempel 1_ Eksempel 2

Zn-fri insulin_ Citrat-insulin

Svine- Human Human

Aminosyre__insulin Insulinamid Insulinamid

Asparaginsyre 3,00 3,04 2,96

Threonin 1,94 3,17 3,25

Serin 2,89 2,93 2,71

Glutaminsyre 7,05 7,03 6,90

Prolin 1,17 0,77 1,10

Glycin 4,00 3,94 4,05

Alanin 2,05 1,17 1,09

Valin 3,42 3,26 3,59

Isoleucin 1,45 1,43 1,48

Leucin 6,02 6,23 6,24

Tyrosin 3,76 3,72 3,78

Phenylalanin 3,00 2,85 2,97

Histidin 1,95 2,02 2,00

Lysin 0,99 1,00 1,00

Arginin 0,.99 0,98 1,01 V· 149824 14

Eksempel 3 100 mg Zn-insulin blev opløst i 6,7 ml 1,0M Thr-NHj, 1M urinstof, pH 7,5 (pH blev indstillet med HBr). 2,3 mg 5 CPD-YM blev tilsat. Reaktionen blev udført ved 32°C og fulgt med HPLC. Efter 2 timer 10 min, var 75% af svine-insulinet blevet omdannet til human insulinamid.

Eksempel 4 10 100 mg Zn-insulin blev opløst i 6,7 ml 1,0M Thr-Irø^, 1M urinstof, pH 7,75 (pH blev indstillet med HBr). 2,7 mg CPD-YM blev tilsat. Reaktionen blev udført ved 32°C og fulgt med HPLC. Efter 2 timer 10 min. var 73% af 15 svineinsulinet blevet omdannet til human insulinamid.

Eksempel 5 100 mg Zn-insulin blev opløst i 6,7 ml 1,0M Thr-N^, 20 1M urinstof, pH 8,0 (pH blev indstillet med HBr). 3,6 mg CPD-YM blev tilsat. Reaktionen blev udført ved 32°C og fulgt med HPLC. Efter 1 time 40 min. var 75% af svineinsulinet blevet omdannet til human insulinamid.

.25 Eksempel 6 100 mg Zn-insulin blev opløst i 6,7 ml 1,0M Thr-NH2, 1M urinstof, pH 8,25 (pH blev indstillet med HBr). 3,6 mg CPD-YM blev tilsat. Reaktionen blev udført ved 32°C 30 og fulgt med HPLC. Efter 1 time 20 min. var 68% af svineinsulinet blevet omdannet til human insulinamid.

Eksempel 7 35 100 mg Zn-insulin blev opløst i 6,7 ml 1,0M Thr-NHg, 10 4 MKJ, 1M urinstof, pH 8,0 (pH justeret med HNOg).

3,6 mg CPD-YM blev tilsat. Reaktionen blev udført U9824 15 ved 32°C og fulgt med HPLC. Efter 2 timer 5 min. var 73% af svineinsulinet blevet"omdannet til human insulinamid .

5 Eksempel 8

Fremgangsmåden ifølge eksempel 3 blev gentaget, bortset fra at der anvendtes CPD-YM, der var immobiliseret på silica. Efter 2 timer var 75% af svineinsulinet blevet 10 omdannet til human insulinamid.

Eksempel 9

Fremgangsmåden ifølge eksempel 3 blev gentaget ved 15 følgende pH-værdier: 6,5; 6,0; 5,5; 5,0. Der opnåedes følgende tilnærmelsesvise omdannelsésgrader: 50%, 30%, 20% og 20% human insulinamid.

Eksempel 10 20

Fremgangsmåden ifølge eksempel 6 blev gentaget ved pH-værdi 8,5. Der opnåedes en 50% omdannelse af svineinsulinet til human insulinamid.

25 HPLC, DISC-PAGE og aminosyreanalyse af produkterne opnået ifølge ovenstående eksempler viste, at der faktisk var tale om human insulinamid.

En efterfølgende deamidering til human insulin kan gennem-30 føres som beskrevet i de ovenfor omtalte ældre ansøgninger, eller som eksemplificeret nedenfor.

f 149824 16

A. Umodificeret CPD-Y

Til en opløsning af human insulinamid (15 mg/ml) i 1 mH EDTA ved pH 8,0, 25°C sattes CPD-Y til en slutkoncentra-5 tion på 7,2^,uH. Efter 22 min. reaktion var 74% af amidet omdannet (bestemt ved HPLC). Efter separering på "DEAE-Sepharose" viste HPLC-analyse og aminosyreanalyse, at det isolerede humane insulin var rent.

10 B. Hethyl-Hq-modificeret CPD-Y

Han gik frem analogt med A men med 4,9^uH methyl-Hg-CPD-Y, idet pH var 8,0. Efter 39 min. reaktion var 61% af insulinamidet omdannet til human insulin (bestemt ved HPLC).

15

C. Ethyl-Hq-modificeret CPD-Y

Han gik frem analogt med A, men med 7,2^,uH ethy 1-Hg-CPD-Y, idet pH var 8,0. Efter 36 min. reaktion var 74% af insulin-20 amidet omdannet til human insulin (bestemt ved HPLC).

D. Hethyl-Hq-modificeret CPD-Y

Han gik frem analogt med A, men med 19^uH methyl-Hg-CPD-Y, 25 idet pH var 7,5. Efter 2 timers reaktion var 90% af insulinamidet omdannet til human insulin (bestemt ved HPLC).

149824 17

REFERENCER

1. Hayashi, R., Bai, Y. and Hata, T.: Further Confirmation of Carboxypeptidase Y as a Metal-Free Enzyme Having a Reactive Serine Residue, J. Biochem,, 77, 1313-1318 (1975).

2. Bai, Y. and Hayashi, R.: Properties of the Single Sulfhydryl Group of Carboxypeptidase Y, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 254, no. 17, September 10, pp. 8473-8479, 1979.

3. Widmer, F., Johansen, J.T.: Enzymatic peptide synthesis carboxypeptidase Y catalyzed formation of peptide bonds, Carlsberg Res. Commun, Vol. 44, April 23, 1979, 37-46.

4. Johansen, J.T., Breddam, K., Ottesen, M.: Isolation of carboxypeptidase Y by affinity chromatography, Carlsberg Res. Commun., Vol. 41, No. 1, 1976, 1-13.

5. Breddam, K., Widmer, F., Johansen, J.T.: Carboxypeptidase Y catalyzed transpeptidations and enzymatic peptide synthesis, Carlsberg Res. Comm. Vol. 45,

November 3, 1980, p. 237-247.

6. Kubota et al.:.Carboxypeptidase C^, J. Biochem.,

Vol. 74, No. 4 (1973), p. 757-770.

7. Widmer, F., Breddam, K., Johansen, J.T.: Influence of the structure of amino components on Carboxypeptidase Y catalyzed amide bond formation. Carlsberg Res. Comm.

Vol. 46, April 29, 1981, p. 97-106.

8. Lee, H.-M., Riordan, J.F.: Does carboxypeptidase Y have intrinsic endopeptidase activity? Biochemical and Biophysical Research Conun., Vol. 85, No. 3, 1978, 1135-1142.

Claims

16982Λ

1. Fremgangsmåde til enzymatisk udskiftning af B-30 aminosyren i insuliner, hvor man omsætter et insulin

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man til fraspaltning 20 af carboxylsyrebeskyttelsesgruppen anvender et umodifice-ret carboxypeptidase-enzym.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender et serincar-25 boxypeptidase-enzym, der er modificeret ved reaktion med Hg++-ioner.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reaktionen gennemføres 30 ved pH 7,0 - 8,5.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som serincarboxy-peptidase-enzym anvender carboxypeptidase-Y fra gær. 35

5 Ins-X, hvori X betegner B-30 aminosyren, med en L-amino-syre, hvori carboxylsyregruppen er beskyttet ved omdannelse til et L-aminosyreamid eller en aminosyrealkylester, i nærvær af et L-specifikt serincarboxypeptidase-enzym, hvorefter man, om ønsket, fraspalter carboxylsyrebeskyt-10 telsesgruppen i det opnåede insulinderivat, kendetegnet ved, at det anvendte serincarboxy-peptidase-enzym er kemisk modificeret ved sulfhydryl-gruppen ved reaktion med divalente metalioner, og at omsætningen foretages i en vandig opløsning eller dis-15 persion indeholdende mindst én af ionerne F”, Cl , Br , I , CN og SCN ved pH ca. 5 - 10,5.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5,