JPH05501762A

JPH05501762A - ペプチド及び蛋白質の連続ｃ末端分解

Info

Publication number: JPH05501762A
Application number: JP3511789A
Authority: JP
Inventors: ベイリー，ジェローム・エム
Original assignee: シティ・オブ・ホープ
Priority date: 1990-08-13
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1993-04-02
Anticipated expiration: 2015-05-08
Also published as: DE69123345D1; WO1992003737A1; JP3040163B2; EP0495939A4; EP0726288A1; AU654494B2; CA2067150A1; KR927002498A; US5059540A; EP0495939A1; EP0495939B1; AU8213291A; JP3124273B2; DE69123345T2; JP2000146983A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチド及び蛋白質の連続Ｃ末端分解本発明は１９９０年５月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９０１０２７２３号の一部継続出願である１９９０年８月１３日に出願されたベイソー（ＢａｉｌＹ）の米国出願０７１５７６．９４３号の一部継続出願であり、両出願は参照により本明細書に含まれる。

光咀Ω分野本発明はカルボキシ末端からのペプチド及び蛋白質の連続分解に関する。より詳細には、本発明は、カルボキシ末端配列決定方法においてカップリング剤としてシリルイソチオシアネートを用いたことにより達成された、誘導体化ペプチドからのＣ−末端チオヒダントインアミノ酸の開裂方法に関する。本発明はまた、配列決定すべきペプチドの共有結合による固定化のための誘導体化され及び活性化された支持体にも関する。

立方０１景Ａ、￥１ｉ蛋白質及びペプチドのカルボキン末端からの連続的分解方法の開発は、いくつもの研究の目的とされた。ワード（Ｗａ　ｒ　ｄ）　、Ｃ，Ｗ　のＰｒａｃｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ダーブル（Ｄａｒｂｒｅ）、Ａ、Ｉｆｆ集）（１９８６）及びランガランヤン（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ）、Ｍ、のＰｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓ　ｉ　ｓ　：Ｃｕｒｒｅｎｔ　（１９８８）を参照。そのような方法はエドマン法による現存のＮ末端分解法を補足する。エドマン（Ｅｄｍａｎ）、Ｐ、、ＡｃｔａＣｈｅｍｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、４：２８３−２９３（１９５０）。もっとも広く研究され及びおそらくそのエドマン分解法との類似性のために簡便でもっとも魅力的な方法は、アミノ酸をチオヒダントインに変換する方法である。この反応は、ジョンソン及びニコμ（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｎｉｃ。

１ｅｔ）によりＪ　Δｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、３３：１９７３−１９７８　（１９１１）に最初に観察されたが、蛋白質のカルボキン末端からの連続的分解に最初に応用したのはンユラック及びカンプ（Ｓｃｈｌａｃｋ　ａｎｄ　Ｋｕｍｐｆ）である（Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１５４：１２５−１７０　（１９２６））。これらの著者は、酢酸及び無水酢酸に溶解したチオンアン酸アンモニウムを、Ｎ−ベンゾイル化ペプチドと反応させてカルボキシ末端に１−アシル −２−チオヒダントインを形成した。このアミノ酸チオヒダントインを遊離させて新たなカルボキシ末端アミノ酸を生じさせるためには、強塩基への暴露が用いられた。この方法の主な欠点は、Ｃ末端アミノ酸の誘導体化を完成させるのに要する条件、及びその後にペプチジルチオヒダントイン誘導体をあらたな短縮ペプチドとアミノ酸チオヒダントイン誘導体に開裂させるために要する条件が過酷であることである。

この仕事か報告されて以来、多くのグループが要求される条件、特にペプチジルチオヒダントインの開裂に要求される条件の過酷性を減少させて、この化学反応を蛋白質のカルボキン末端から連続的に分解するために応用する試みを行った。

シュラツク及びカンブにより最初に用いられたよりも低い水酸化ナトリウム濃度及び水酸化バリウム濃度かペプチジルチオヒダントインの開裂に有効であることが見出された。ウエイリー（Ｗａ　Ｉ　ｅｙ）　、Ｓ、Ｇ　ら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓ。

ｃ、、１９５１：２３９４−２３９７　（１９５１）：クジエール（Ｋｊａｅｒ）、Ａ、ら、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、６：４４８−４５０　（１９５２）；ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）、Ｒ，Ａ、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、１３：５５３−５５９　（１９５４）。他のグループは、アミノ酸チオヒダントインの脱アシル化のために、ジョンソン及びニコμが用いた最初の方法に基づいて酸性条件を用いた。チップス（Ｔｉｂｂｓ）。

Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ、１６８：９１０　（１９５１）：バブチスト（Ｂａｐｔｉｓｔ）、Ｖ、Ｈ，ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、７５　：１７２７−１７２９（１９５３）を参照。これらの著者は、ペプチジルチオヒダントイン結合の開裂を行うために濃塩酸をカップリング溶液に添加した。水酸化物がチオヒダントインアミノ酸の分解を生じることが示されているのと異なり、塩酸はチオヒダントインアミノ酸の分解を生じないことが示された。スコソフォン（Ｓｃｏｆｆｏｎｅ）、Ｅ　ら、Ｒｉｃ、Ｓｃｉ、２６：８６５−８７１　（１９５６）；フォックス（Ｆｏｘ）、Ｓ、Ｗ　ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、７７　：３１１９−３１２２　（１９５５）；スターク（Ｓｔａｒｋ）、Ｇ、Ｒ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ７　：１７９６−１８０７　（１９６８）参照。クロムウェル（Ｃｒｏｍｗｅ　ｌ　ｌ）、Ｌ、　Ｄ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８：４７３５−４７４０　（１９６９）は、濃塩酸は室温でチオヒダントインアミノ酸を開裂するために用いることができることを示した。この方法のおもな欠点は、蛋白質に応用した時、２または３サイクルより多く実行できないことである。

ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉ　ｔａ）、Ｓ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、’ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ、２２９：３０１−３０９　（１９７１）は、プロトン化陽イオン交換樹脂を用いて、繰り返しペプチジルチオヒダントインの開裂が可能なことを発見した。この方法を１００　、ｃｚｍｏｌ量のパパイン及びリボヌクレアーゼに応用したところ、それぞれ１４及び１０サイクルが可能であったと報告されているが、その詳細は記載されていない。ヤマンタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）、Ｓ、ら、ＰｒｏｃＨｏｓｈｉ、Ｐｈａｒｍ、１３：１３６−１３８　（１９７１）を参照。スターク（Ｓ　ｔ　ａ　ｒ　ｋ）は、ある種の有機塩基、例えばモルホリンまたはピペリジンを水酸化ナトリウムの代わりに使用できることを報告し、そして同様の考えに沿って、クボ（Ｋｕｂｏ）、Ｈ，ら、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、、１９：２１０−２１１　（１９７１）は、トリエチルアミン水溶液（０，５Ｍ）がペプチジルチオヒダントインの開裂に有効に用いられ得ることを報告した。スターク（Ｓｔａｒｋ）は、開裂剤としてｐＨ８，２のピリジン水溶液中のアセトヒドロキサム酸を導入することにより、開裂の問題を解決した様に見えた。この試薬は室温及び穏和なｐＨでペプチジルチオヒダントインを迅速且つ特異的に開裂することが示された。

ペプチジルチオヒダントインの形成のための条件は、スターク及びドウレット（Ｄｗｕｌｅｔ）、Ｆ、Ｅ　ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、１３：１２２−１２９　（１９７９）により（これらの著者らは、チオシアン酸塩でなく、チオシアン酸の使用について報告した）改良され、より最近ではカップリング剤としてトリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）の導入により改良された。ホーク（Ｈａｗｋｅ）、Ｄ、Ｈら。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６６：２９８−３０７　（１９８７）参照。この試薬のＣ−末端配列決定の用途は特許されている。ホーク（Ｈａｗｋｅ）の米国特許４，８３７．１６５参照。この試薬はペプチジルチオヒダントイン形成の収率を非常に向上させ、そして複雑な副生成物の数を減少させた。１２Ｎ　ＭＣＩによる（ホーク、１９８７）およびアセトヒドロキサメートによる（ミラー（Ｍｉ　ｌ　１ｅｒ）、Ｃ，Ｇ　ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（フグリ（Ｈｕｇ　ｌ　ｉ）　、　Ｔ、Ｅ　編集）、６７−６８頁、アカデミツクプレス（１９８９））ペプチジルチオヒダントインの開裂は、数サイクルの分解以上は不可能であった。

Ｂ　開鷲Ω間厘シュラツク及びカンブ（Ｓｃｈｌａｃｋ　ａｎｄ　Ｋｕｍｐｆ）により１９２６年に最初にＣ−末端分解のためのチオシアネート化学反応法が提唱されて以来、開裂反応は精力的に研究されてきたが、分解の繰り返しを多くできる化学方法はいまだ報告されていない。シュラツク及びカンブ（１９２６）により最初に提唱されたＩＮ水酸化ナトリウム中での開裂は、蛋白質およびペプチドの加水分解を、Ｃ−末端ペプチジルチオヒダントインの開裂以外に他の部位でも行うことが、よく知られている。遊離されたチオヒダントインアミノ酸誘導体は、水酸化物溶液中で不安定であることも知られている。上記スコッフオンＣ３ｃｏｆｆｏｎｅ）参照。水酸化物での開裂は、アスパラギンおよびグルタミン残基の側鎖アミド基をカルボキシル基に変換して、これらの基をそれぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸から区別することを不可能にすることが知られている。

１２Ｎ　ＭＣＩでのペプチジルチオヒダントインの開裂を、蛋白質およびペプチドに応用すると、２または３サイクル以上は実施できなかった。上記クロムウェルおよび上記ホーク参照。その原因はおそらく、異なるアミノ酸側鎖を含むペプチジルチオヒダントインの加水分解の速度の相違、および他の内部アミド結合の加水分解によるものと考えられる。同様に、天然に存在するアミノ酸に相当する標準アミノ酸チオヒダントイン誘導体の合成の間に、１２ＮＨＣＩによるＮ−アセチルチオヒダントインアミノ酸の脱アセチル化の速度は、アミノ酸の側鎖の性質に依存することが観察された。ベイソー（Ｂａ　ｉ　ｌ　ｅｙ）　、Ｊ、　Ｍ、ら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２９：３１４５−３１５６　（１９９０）。

上記ヤマシタの樹脂を用いた開裂法を再度用いることが、上記ドウレット（Ｄｗｕ　Ｉ　ｅ　ｔ）により試みられたが不成功であったと報告された。メタンスルホン酸水溶液でのペプチジルチオヒダントインの開裂も、ドウレットによりおよびベイソーらにより試みられたが、両者とも失敗した。メタンスルホン酸を選択した理由は、これがヤマシタ（１９７１）およびヤマンタら（１９７１）により採用された樹脂上の酸性基と均等であるためである。

上記スタークにより最初に報告されたようなアセトヒドロキサメートによるペプチジルチオヒダントイン誘導体の開裂は、短縮されたペプチドのＣ−末端に安定なヒドロキサメートエステルを形成することが見いだされた（上記ベイソーら）。採用される条件によるが、６８％ないし９３％のペプチドがＣ−末端で誘導体化され、そのためそれ以上の配列決定を阻害した。上記スタークはそのようなヒドロキサメートエステルが開裂の間の中間体として形成されることは予測したが、該エステルは開裂または連続配列決定に用いられる条件下で分解するであろうと考えたのである。アセトヒドロキサメートでの開裂により形成されるペプチジルヒドロキサメートエステルは、スチーグリソッ（Ｓｔｉｅｇｌｉｔｚ）、Ｊ、ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　、３６：２７２−３０１　（１９１４）およびスコツト（Ｓｃｏ　ｔ　ｔ）、Ａ、Ｗ　ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、４９・２５４５−２５４９　（１９２７）により研究されたヒドロキサメートエステルと同様に、チオヒダントイン形成に用いられる酸性条件下で安定であり、強塩基条件下においてのみ、加水分解されて配列決定を続行可能な遊離のペプチジルカルボキシル基を生しる。おそらくこのことか、上記スターク：ミュース（Ｍｅｕｔｈ）、Ｊ、Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２１　：３７５０−３７５７　（１９８２）および上記ミラーにおいて、開裂試薬としてアセトヒドロキサメート水溶液を採用したとき、繰り返し収率か低かった理由であろう。

トリエチルアミン水溶液によるペプチジルチオヒダントインの開裂は、最初にクボ（Ｋｕｂｏ）、Ｈ，ら、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ　１．１９：２１０− ２１１　（１９７１）；上記ドウレットら、および上記ミュースらにより報告された。後者の研究グループは、トリエチルアミンが揮発性の面で自動配列決定のための開裂剤として有用であるとしているが、アセトヒドロキサメートによる開裂の方が明らかに好ましいため、トリエチルアミン法を採用しなかった。液相における２％トリエチルアミン水溶液でのペプチジルチオヒダントインの開裂は、迅速で（３７℃および２２℃において、それぞれハーフタイムが１分および５分である）、そして定量的であり、連続配列決定可能な短縮ペプチドおよびアミノ酸チオヒダントイン誘導体のみを生じることが見いだされた。上記ベイソーら。

Ｃ−末端配列決定の自動化には室温において、装置内のガラス瓶内での長期間（王ないし１０日）の貯蔵が必要である。配列決定に使用する試薬はこの条件下で安定でなければならない。水中でのトリエチルアミンの貯蔵は、トリエチルアミンの急速な分解をもたらす。このような分解生産物は、第一および第二アミン類を含み、これらは次に短縮されたペプチドをさらに配列決定することを妨げる。

トリエチルアミンの分解の間には遊離ラジカル化合物も生じる。そのような遊離ラジカル化合物はしばしばＵＶ吸収性で、放出されたチオヒダントインアミノ酸を引続きＨＰＬＣで検出することを妨害する可能性が有る。出願人の経験ではトリエチルアミン水溶液（５％水溶液）を用いて自動化Ｃ−末端配列決定を行うと、常に６０％より低い繰り返し収率しか得られず、このため、ＰＶＤＦまたはポリエチレンの膜支持体に共有結合したペプチドで、Ｃ−末端分解は３回より多く行うことが出来なかった。

Ｃペプチドサンプルの本発明の好ましいＣ−末端配列決定の実施においては、ペプチドサンプルは固体支持体に共有結合させる。出願人および他の研究者（イングリスら、Ｍｅｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョルナバール／ホーグ／グスタブソン１編集）ｐｐ、２３−２４．Ｂｉｒｋｈａｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、バーゼル（１９９１）；ウィツトマン−リープオルトら、Ｍｅｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョルナバール／ホーグ／グスタブソン９編集）ｐｐ、９−２１．Ｂｉ　ｒｋｈａｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、バーゼル（１９９１）；ホークおよびボイド、Ｍｅｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎＣｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョルナバール／ホーグ／グスタブソン１編集）ｐｐ３５−４５．Ｂｉｒｋｈａｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、バーゼル（１９９１））は、Ｃ−末端配列決定はＮ−末端で固相へ共有結合したサンプルに適用するのが好ましいことを認識した。サンプルの固体支持体への固定は、サンプルの洗浄損失（ウォッシュアウト）を生ずることなく配列決定に最適の試薬と溶媒の使用を可能にし、サンプルを十分に洗浄して反応副産物を除去する可能性を与え（そうしないと該副産物は放出されたチオヒダントインアミノ酸の同定を妨害する可能性が有る）、さらには多くの液相法に伴う機械的ロスを防止する。一般に、自動化固相法は手動の液相法に比べて効率が良く且つ労力も要しないと期待されている。　ラウルセン、Ｒ，Ａ、、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、、Ｓｏｃ、、８８：５３４４−５３４６　（１９６６）によりＮ−末端蛋白質配列決定に固相法が導入されて以来、いくつかの異なるタイプの官能化支持体がポリペプチドサンプルの共有結合による固定化のために報告された。それらには、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂およびアミノアルキルもしくはアミノフェニル置換基をもつガラスピーズ支持体が含まれる（ラウルセンおよびマクライド、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｎａｌ、２６：２０１−２８４　（１９８０）：マクライト１閘ｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（シエシエ、Ｈ，ｉｆ集）　ｐｐ、２６２−３０２．デグルイター、ベルリン／ニューヨーク（１９８３））。典型的には、これらのアミノ官能化支持体はフェニレン・ディッチオシアネート（Ｄ　Ｉ　Ｔ　Ｃ）のような二官能性試薬により、蛋白質のカプリングのために活性化される。ＤＩＴＣ基は、支持体およびペプチドのＮ−末端アミノ基もしくは側鎖リジンのイプシロンアミノ基に対して安定なチオウレアリンケージを形成することができる。近年、インチオンアナト、アミノフェニルおよびアミノエチルアミノプロビル基で誘導体化したガラスピーズ（ソング−ピング　リアフグおよびラウルセン、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８８：３６６−３７３　（１９９０））、アミノフェニル基で官能化したガラス繊維シート（エーベルソルドら、Ａｎａ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８７　：５６−６５　（１９９０））、およびアリールアミンおよびＤＩＴＣで誘導体化したＰＶＤＦ　（ポリビニリデン・ジフルオリド）膜（バビンら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ビラフランカ、Ｊ、Ｊ、＠集）ｐｐ、１９１−２０２．アカデミツク・プレス社（１９９０））が、Ｎ−末端配列決定のためにポリペプチドの共有結合による固定化に用いられている。ポリペプチドの固定化は、確立されたＤＩＴＣ化学法により、リジンのイプシロンアミノ基と固体支持体のインチオシアネート基の間のカプリングで、またはポリペプチドの活性化Ｃ−末端カルボキシル基とマトリクスのアミノ基とのカップリングで行われる。

固相におけるＣ−末端配列決定のためのチオシアネート化学法の適用を含む初期の多くの研究では、ペプチドサンプルの共有結合固定化のためにガラスピーズを使用していた（ウィリアムスおよびカサール、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、５４：３５３−３５７　（１９７５）；ランガラジャンおよびダーブル、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、１５７：３０７−３１６　（１９７６）；ミュースら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１：３７５０−３７５７　（１９８２）；ホークら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６６　：　２９８−３０７　（１９８７）；イングリスら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｙｓｉｓ（ウィックマン− リープホルト、Ｂ１編集）ｐｐ、１３７−１４４．スプリンガーーフエアラーク（１９８９）。より最近の研究ではカルボン酸修飾されたＰＶＤＦ、（ベイソーおよびシベリ−，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＩ（ビラフランカ、Ｊ、Ｊ、編集）ｐｐ、１１５−１２９．　アカデミツクブレス社（１９９１）　、ＤＩＴＣ−活性化アミノＰＶＤＦ　（ミラーら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（フグＩＪ、　Ｔ、　Ｅ、編集）ｐｐ、６７−７８．アカデミツクブレス社（１９８９）、　イングリスら、Ｍｅｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョルンバール／ホーグ／グスタブンン編集）　ｐｐ、２３−２４．バークハウザ一一フエアラーク、バーゼル（１９９１））　、およびジスクシンイミドイル　カーボネート　ポリアミド樹脂（ホークおよボイド、Ｍｅｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　（ジョルンバール／ホーグ／グスタブソン編集）ｐｐ、３５ −４５、パークハウザー−フエアラーク、バーゼル（１９９１））の使用が含まれている。

Ｃ−末端配列決定のためにガラス支持体およびＰＶＤＦ支持体を用いることには不利がある。ガラス支持体の誘導体化においてシロキサン結合が形成される。

この結合は塩基にたいして不安定で、共有結合したペプチドサンプルの損失をもたらす。カルボキン修飾ＰＶＤＦおよびＤＩＴＣ−活性化アミノＰＶＤＦは、Ｃ −末端配列決定の工程の間に用いられる塩基性開裂試薬によりひきおこされるデヒドローフルオリネーションのため、物理的にも化学的にも好ましくない変化が生じる。これらの膜は各Ｃ−末端配列決定サイクルのたびに徐々に褐色化及び脆弱化する。

光皿Ω概１本発明は、（ｉ）低級トリアルキルンラノールのアルカリ金属塩および（ｉｉ）　ｈリアルキルアミン・Ｎ−オキシドを含む、新規Ｃ−末端ベブチド開裂試薬を提供する。これらの新規開裂剤は、カップリング試薬とじてンリル・インチオンアネートが用いられる配列決定法において特に有用であるか、用途はこれに限定されるものではない。ソンウム・トリメチル・シラル−トおよびトリメチルアミン・Ｎ−オキシドが好ましい。本発明の好ましい実施においては、ペプチドサンプルのＮ−末端は活性化ＰＥ−Ｃ０ＯＨ固相に共有結合されている。

凹面二晩肋図１はソジウム・トリメチルシラル−トの化学構造である。

図２はトリメチルアミン・Ｎ−オキシドの化学構造である。

図３はソジウム・トリメチルンラル−トによる開裂反応と、開裂反応に続く水性酸例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の使用における、推定されるメカニズムである。

図３Ａは開裂反応に続いてソジウム・トリメチルンラル−トを用いる類似のメカニズムを示す。

図４はＰＶＤＦに共有結合したロインンーエンケファリン（ＹＧＧＦＬ）の配列決定を示す。

図５はＰＶＤＦ膜に共有結合したＫＶＩＬＦのＣ−末端からの配列決定を示す図６は活性化ＰＥ−Ｃ０ＯＨ膜に共有結合したベブチＦ（ＹＧＧＦＬ）のＣ−末端からの配列決定を示す。

図７は活性化ＰＥ−Ｃ０ＯＨ膜に共有結合したペプチド（ＲＧＹＡＬＧ）のＣ− 末端からの配列決定を示す。

図８は活性化ＰＥ−Ｃ０ＯＨ膜に共有結合したペプチド（ＹＧＧＦＭＲＧＬ）のＣ−末端からの配列決定を示す。

図９はリンカ−１１−アミン・ウンデカン酸に共有結合したペプチド（ＹＧＧＦＬ）のＣ−末端からの配列決定を示す。

図１０はＣ−末端配列決定に用いられた装置の模式図である。

主型の詳皿笠説胛アシルチオヒダントインの酸および塩基による加水分解のメカニズムは、コングドンおよびニドワード（Ｃｏｎｇｄｏｎ　ａｎｄ　Ｅｄｗａｒｄ）、ＣａｎＪ、Ｃｈｅｍ、５０：３７６７−３７８８　（１９７２）により詳細に研究されており、そして多くの開裂剤が上記スタークにより試験されている。スタークは、酸素を含有する親核剤かこの反応を行うために最適の試薬であることを見いだした。最初のアミノ酸に対してはアセトヒドロキサメートは優れた開裂剤であるが、これは安定で除去か困難なペプチジルヒドロキサメートエステルを形成し、そのため短縮されたペプチドがそれ以上配列決定されることを不可能にする。この試薬はまた、遊離されたチオヒダントインアミノ酸のＨＰＬＣによる同定を続いて行う際に、高いＵＶ吸収バックグラウンドをもたらす。一般に、良好な親核剤でそのため良好な開裂剤である炭素系の試薬は、いずれも脱離基としての性質に乏しいものであり、そのために短縮されたペプチドの多くをそれ以上配列決定することから阻止すると思われる。

理想的には、開裂剤は次の特性を有する必要かある　（１）ペプチジルチオヒダントインを揮発性の水混和性有機溶媒中で開裂でき、これによりＰＶＤＦ膜と水の不適合性の問題を解消できること、（２）反応か迅速且つ特異的であること：（３）短縮されたペプチドが連続的に分解できること：（４）遊離されたチオヒダントインアミノ酸かこの試薬により破壊されないこと、および（５）この試薬は遊離されたチオヒダントインアミノ酸誘導体の検出に用いられる範囲の光を吸収しないこと。ベトラーチ（Ｐｅｔｒａｒｃｈ）（Ｈｕｔｓ）から市販されているソジウム・トリメチルンラル−ト（図１）は例えばアルコール性溶媒中で、およびアルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から市販されているトリメチルアミン・Ｎ−オキシド（図２）はアルコール性およびより広範な溶媒中で、上記の全ての性質を有するようである。１００％メタノールまたはトリメチルシリルエタノール中の０．０５Ｍソジウムトリメチルシラル−ト溶液による液相でのペプチジルチオヒダントインの開裂は、５分より短時間で完了する。メタノールまたはトリメチルシリルエタノール中の０．０５Ｍソンウム・トリメチルシラル−ト溶液は、液相および固相のいずれにおいても、ペプチジルチオヒダントインの開裂を５分より短時間で行う。

より詳細には、本発明は上記本発明の開裂剤を、メタノールまたはｌ・リメチルシリルエタノールまたは類似のアルコール中で、あるいはトリメチルアミン・Ｎ −オキシドの場合にはより広範な溶媒中で、約００２５モルないし約０．２５モル、好ましくは約０１ないし約０２モルの濃度で使用する。

この開裂反応の最も可能性の高いメカニズムは、不安定なＣ−末端トリメチルンリルエステルの形成を含み、このエステルは水またはアルコールの存在下で迅速に所望のＣ−末端カルボキシル基を再形成する。図３を参照すると、開裂反応に続くトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）水溶液の使用を説明している。好ましくは、この工程におけるＴＦＡの濃度は、約００１ないし約０．２Ｍである。この段階でのＴＦＡもしくは同等の酸の使用は開裂を著しく促進する。

この最も広い観点において、本発明は次式％式％（式中、Ｒは約１〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素残基であり、そしてＸはアルカリ金属イオン、好ましくはナトリウムもしくはカリウムイオンである）で表される開裂剤を包含する。

本発明の広い観点には、アルキル基が１ないし約４個の炭素原子を有するトリメチルアミン・Ｎ−オキシドを包含する。トリエチル−、トリプロピル−、トリイソプロピル−、トリブチル−１またはトリイソブチル−アミン・Ｎ−オキシドが使用可能である。それらの試薬は次式：（Ｒ，）ｓＮ”−０−（式中、Ｒ１は炭素数１ないし約４のアルキル基である）で表される。

適当な支持体には、活性化カルボン酸で修飾された非多孔質の好ましくはポリエチレンフィルムまたは膜が含まれる。Ｃ−末端配列決定のためのこの支持体は、以後本明細書中で一般的にＰＥ−Ｃ０ＯＨと記載するが、現存の支持体に比へて多くの利点を提供する。それらの利点には、（１）Ｃ−末端配列決定に採用される条件に対する支持体の安定性、（２）表面基の親水性により、共有結合ポリペプチドサンプルに対する化学反応の実施において水性および有機性溶媒の両方か使用可能であること：（３）ポリペプチドを共有結合する能力が大きいこと（３，２ｎｍｏｌｅ／ｍｍ２表面積）：（４）配列決定に必要な支持体の都合よい寸法（ＩＸ５ｍｍ）が、出願人の自動化Ｎ−末端配列決定のための連続フローリアクターのものと似いてること、が含まれる。

本発明において支持体として有用なＰＥ−Ｃ０ＯＨフィルムの厚みの範囲は、０．５ないし２０ミル、典型的には１ミルである。このフィルムは非多孔質で天然状態では疎水性である。ポリエチレンフィルムからＰＥ−Ｃ０ＯＨを製造する好ましい方法は米国特許４，３３９，４７３号に詳細に記載されており、その内容は本明細書に含まれるものとする。これらのＰＥ−Ｃ０ＯＨフィルムは、３０ンー　クリ７　アベニュー、グレン　コープ、ニューヨーク　１１５４２のボール　コーポレーション（Ｐａｉｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から、ＰＥＲＭＩＯＮの商品名で市販されている。

ＰＥ−Ｃ０ＯＨ，例エバポ−／Ｌ、：ｌ−ホレーシ＋ンノ製品ＰＥＲＭＩＯＮをＩステル誘導体の形成により活性化し、これにペプチドサンプルのＮ−末端をカップリングすることができる。適当な活性化試薬としては、１，３−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、１．１−一カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）　、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）　、１．３−ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ　Ｉ　ＣＤ）が含まれる。

一般に、ＰＥ−Ｃ０ＯＨの活性化は、適当な時間例えば約２時間、適当な溶媒中の活性化試薬の溶液との反応により、はぼ室温で行われる。

表１は例示である。

表ｌＰＥ−Ｃ０ＯＨにカップリングしたロイシン　エンケファリンの収率に及ぼす種々のカップリング試薬および溶媒の影響膜に共有結合した量ｎｍｏｌ　（％収率）活性化試薬　５０％アセトニトリル　５０％ＤＭＦＤＣＣ０，２（４，４）　１．　８　（３９，６）ＣＤＩ　０．　０７　（１，５）　０．　２３　（５，１）ＥＤＣ０，３２（６，９）　０．　１２　（２，６）ＢＯＰ　０．　５８　（１２，７）　０．　２９　（６，４）ＤＩＣＤ　０．　６８　（１５，０’）　０．　５７　（１２，６）ＤＣＣ：１．３−シンクロへキシルカルボッイミドＣＤＩ：　１．１−一カルポニルジイミダゾールＥＤＣ・　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボンイミド塩酸塩ＢＯＰ　：　ベンツ゛トリアゾールー１−イルーオキシートリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェートＤＩＣＤ：　１，３−ジイソプロピルカルボジイミドＰＥ−Ｃｏｏ）（の片（１ｃｍＸＯ，１ｃｍ）を、一端を封止した１　５０の連続フローリアクター（ＣＦＲ）（ンベリーら、１９８７）に入れた。この膜を活性化試薬３０μｍ　（３０ｍｍｏｌ）と室温で３０分間反応させた。全ての場合、使用した溶媒は１００％ＤＭＦであるが、ＥＤＣを活性化試薬として用いたときのみは、水を溶媒とした。活性化反応の後、過剰の試薬を活性化反応に用いた溶媒（３ｍｌ）で洗い流した。次に各サンプルをアセトニトリル（１ｍｌ）で洗浄し、そして真空遠心で乾燥した。次に活性化した膜を、５０％ＤＭＦ水溶液もしくは５０％アセトニトリル水溶液中のペプチド（ＹＧＧＦＬ）の３０　μｌ　（４，５４ｎｍｏｌ）の溶液と、一方の端を封止したＣＦＲリアクター中で１６時間反応させた。膜を５０％アセトニトリルまたは５０％ＤＭＦで洗浄し、さらにアセトニトリルで洗浄し、そして真空遠心で乾燥した。

カップリングしたペプチドの量を、誘導体化した膜をアミノ酸組成分析して決定した。

表■はＹＧＧＦＬの共有結合による付着収率に対する活性化時間およびカップリング時間の影響を示す。

表ＩＩＹＧＧＦＬの共有結合による付着収率に対する活性化時間およびカップリング時間の影響活性化時間　カップリング時間　カップリングした量（ｈ　ｒ　ｓ）　（ｈ　ｒ　ｓ）　（ｎｍｏｌ）　収率０、　５　２０　５．　１９　３８．　４１、　０　２０　５．　５７　４１．　３２、Ｏ４５，２５３８，９２、Ｏ２０７，２５３，３４、０１０，５２３，９４，０２０，５２３，９これらの膜（ＩＸ１２．　５＋ｎｍ）を無水ＤＭＦ中の過剰量のＤＣＣ（１ｇ７１ｍｌ）により２時間活性化した。活性化反応の最後に過剰量の試薬を無水ＤＭＦで除去し、活性化された膜片を真空遠心で乾燥した。活性化膜の各々を、５０％ＤＭＦ水溶液中のロイシンエンケファリン溶液１００μｍ　（１３，５ｎｍｏｌ）を含有する連続フローリアクター（ＣＦＲ）　（シベリーら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ　（１９８７）１６３，５１７−５２９）＋：入れ、指示した時間２２℃に維持した。ＣＦＲの一方の端の細孔チューブを最初加熱し、次にプライヤーでひねって閉じた。カップリング反応の後、膜をカップリング溶媒、つづいてアセトニトリルでゆすぎ、真空遠心で乾燥した。共有結合でカップリングしたペプチドの量をアミノ酸分析で決定した。

多数のアミノ酸残基からなるペプチドのＣ−末端配列決定に好ましい、本発明の重要な観点は、一般式：ＮＨ２（ＣＨ，）ｆｉＣ○○Ｈ（式中、ｎは４ないし１０の数である）で表されるリンカ−アームを、ＰＥ＝Ｃ０ＯＨのカルボキシルに付加し、続いてペプチドサンプルをこのリンカ−アームカルボキシルに共有結合させることを包含する。リンカ−アームを使用する場合には、ＰＥ−Ｃ０ＯＨのカルボキシルを、好ましくは２−フルオロ−１−メチルピリジンで活性化して、リンカ−分子との結合を促進する。一般に、ムカイヤマ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　１８ニア０７−７２１　（１９７９）を参照。リンカ−カルボキシルは、ＰＥ−Ｃ０ＯＨカルボキシルについて記載したと同様の方法で活性化する。

大１船友社料工　無水酢酸はＦｉｓｈｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から購入した。

トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）　、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−へキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）　、１．３ −ジイソプロピルカルボンイミド（ＤＩＩＣ）、および１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）は、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。水はミリポア（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ｐｏ　ｒｅ）のＭｉｌｌｉ　Ｑシステムで精製した。この試験に用いた全てのポリペプチドはＢａｃｈｅｍまたはＳｉｇｍａから購入した。１゜３−シンクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）　、およびトリエチルアミン（配列分析規格）はＰｉｅｒｃｅから購入した。カルボン酸修飾ポリエチレン膜（ＰＥ−ＣＯＯＨ）は、ポールコーポレーション（ロングアイランド、ニューヨーク）製を用いた。この試験で用いたアミノ酸チオヒダントイレは、文献記載の方法で合成した（ベイソーおよびシベリー、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：３１４５−３１５６　（１９９０）。

カルボン　ＰＶＤＦへのペプチドの、合カップリング：　ＰＶＤＦ−Ｃ００Ｈ（１ｃｍＸＯ１１ｃｍ）の片を連続フローリアクター（ＣＦＲ）（シベリーら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８７）１６３．　δ１７−５２９）に入れ、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．３− ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２μｍ　（２ｍｍｏｌ／ｍｌ）をハミルトンシリンジを用いて添加した。ＣＦＨの一方の端の細孔チューブを最初加熱し、次にプライヤーでひねって閉じた。このＣＦＲを次に密閉したエツベンドルフチューブに入れた。２時間活性化（２５℃）した後、活性化膜を２ｍｌのＤＭＦでゆすぎ、そしてアルゴン気流中で乾燥した。乾燥膜上に、ロイシンエンケファリン（ＤＭＦ中の１４ｎｍｏｌ／μｌ溶液２μｍ）を注意深く重層して、− 夜反応させた。この膜をメタノール（５ｍｌ）で洗浄し、そしてアルゴン気流中で乾燥した。カップリングしたペプチドの収率は、誘導体化膜を酸加水分解した後、アミノ酸組成分析でめた。典型的収率は約５０％であった。

カルボン　ポリエチレンへのべ°チドの　合カップリング：ＰＥ−Ｃ００Ｈの片（ＩＸ１２，５龍）を連続フローリアクター（ＣＦＲ）（シベリーら、（１９８７）上記）に入れ、無水ＤＭＦ中の過剰量の１，３−ジシクロへキシルカルボジイミド（Ｉｇ／ｍｌ）で活性化した。ＣＦＲの一方の端の細孔チューブを最初加熱し、次にプライヤーでひねって閉じた。このＣＦＲを次に密閉したエソベンドルフチューブに入れた。活性化反応の終了時に、過剰の試薬を無水ＤＭＦで洗浄１．で除き、そして真空遠心で乾燥した。各活性化膜を再度、目的ペプチド溶液を含む連続フローリアクター（ＣＦＲ）（シベリーら、（１９８７）上記）に入れ、２２℃で一夜（２０時間）インキュベートした。用いたＣＦＲの容量は１００μｍであった。カップリング反応の後、膜をカップリング溶媒とアセトニトリルでゆすぎ、真空遠心で乾燥した。

この新規開裂試薬を、メタノールとｔ−ブタ２ノールの１”１溶液を溶媒として用いると、ポリエチレンまたはＰ　Ｖ　Ｄ　Ｆ膜のような支持体に共有結合でカップリングしたいくつかのペプチドの自動配列決定が可能であった。実施例は、ペプチドとし７てＫＶＩＩ、ＦＳＹＧＧＦＭＲＧＩ−１ＹＧＧＦＬおよびＲＧＹＡＬＧについて示４−０この場合、アルコール性のヂオヒダントインか唯一の主要なバックグランドビークとして一緒に溶出される。シタノールと１−ブタノールの組み合せか、開裂反応について好ましい溶媒である。本発明に有用な他のアルコール性溶媒には、１〜６原子を有するアルカノール、例えばエタノール、インプロパツール、２−　トリメチルシリルエタ、ノールおよび・インブタノールか含まれる。

夏ｉ木端配列犬朋り例示ここに記載する実施例は、ホークら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４７：３１．５−３３０　（１９８５）の設計を基にして改変したＮ−末端配列決定装置を用いて、ンベリーらの米国特許用８０７２，７５４に記載された連続フローリアクターを用いて、Ｃ−末端配列決定を行った例である。図９は全ての実施例の実施に用いた装置の模式図であ乙。＋オヒダント・インアミノ酸の遊離は、オンライン接続したＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより検出し５た。ン・＼リー、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６３：５１７−５２９　（１９８７）を参照。試薬および溶媒を供給するシステムは全てペルフルオロエラストマーを用いて製造し、た。米国特許４，５３０．５８６に一般的に記載されている、電磁的に作動するソレノイドを有しプツトボリュームかセロの供給バルブを〔，・ニラ一方式で連結して、多− インブ７　ｈに対（７て単一アウトプットのラインを作成（７た３、試薬と溶媒の流れをコントロールするバルブは、この化学反応に適するプログラムでコノビコータ操作した。表Ｉｌ＋は図９に示され、ぞして実施例に記載する実験の実施に用いたＣ−末端配列決定装置のためのプログラムの概要である。

表ｌｌＩＣ−末端配列決定装置プログラムの概要連続フローリアクター　コンバージョンフラスコ　時間（ＣＦＲ）（６５℃）　（ＣＦ）（５５℃）　（秒）Ｒ４リンス　１２０乾燥　乾燥　１００Ｒ１反応　１．８０Ｒ１反応　４５０Ｓ４リンス　６０Ｒ１反応　］８０Ｒ２反応　４５０Ｒ２反応　４５０Ｒ２反応　４５０Ｓ４リンス　］２０Ｒ３反応　！　２００Ｒ３反応　乾燥　２４０Ｒ３反応　乾燥　２４０大施世」− ＰＶ±ｆ１人旦ｐ−比環井有肪合した口そ乞２王２グニニ丈ｚＪＹ　Ｇ　Ｇ　Ｆ ↓〕−工１−ス凹恒バｐｇ２刀決定試薬および溶媒の組成を表ＴＶに示す。

表Ｕ試薬および溶媒の組成Ｒ１無水酢酸Ｒ２アセトニトリル中の３０％ＴＭＳ−ＩＴＣＲ３２−４リメチルシリルエタノール中の０．０５Ｍソジウム・トリメチルシＳ１　アセトニトリルＳ２　水中の０．８％トリフルオロ酢酸米国特許５，６１１，８６１に記載されていると理解される活性化ＰＶＤＦ−ＣＯＯＨは、ポールコーポレーションから入手した。チオヒダントインアミノ酸誘導体は逆相ＨＰＬＣで分離した。この分離は、Ｂｅｃｋｍａｎ　５ｙｓｔｅｒｎＧｏｌｄ上のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｕｌｔｒａｃａｒｂ　５　０ＤＳ　（３０）カラム（２，ＯｍｍＸ　２５ｍｍ）により行い、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　（ＳＰＤ−６Ａ）検出器で検出した。カラムを溶媒Ａ（水中の０．　１％トリフルオロ酢酸）で２分間溶出し、次に２２℃において０．１５ｍ１／分の流速で溶媒Ｂ（水中の８０％アセトニトリル、１０％メタノール）へ至る不連続勾配を適用した。使用した勾配は次のとおりである：０％Ｂ２分間、３分間かけてＯ−６％Ｂ、３５分間かけて６−３５％Ｂ、１０分間かけて３５−５０％Ｂ、そして１０分間かけて５０−０％Ｂ０図４は反応生成物のＨＰＬＣ分析を示す。

Ｘ施皿旦大葺精皇ヱヱＶＤＦ−ＣＯＯＨにカッ　゛リングしたムｙ」」」二ｌ−名〜１晩Ｕの配烈迭疋試薬及び溶媒の組成は表■に示す。

表り試薬及び溶媒の組成Ｒ１無水酢酸Ｒ２アセトニトリル中の３０％　ＴＭＳ−ＩＴＣＲ３メタノール中の０．０５Ｍ　ソジウム・トリメチルシラル−トＲ４メタノールＳｌ　アセトニトリルＳ２　水中の０．　８％トリフルオロ酢酸チオヒダントインアミノ酸誘導体は逆相ＨＰＬＣで分離した。この分離は、島津５ＰＤ−６Ａディテクターを用いて、ベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ）上のフエノメ不ノクス・ウルトラカーブ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｕｌｔｒａｃａｒｂ）５　０ＤＳ　（３０）カラム（２、ＯｍｍＸ　２５ｍｍ）で行った。カラムを溶媒Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液）で２分間溶出し、続いて溶媒Ｂ（８０％アセトニトリル、１０％メタノ讃ル水溶液〕への不連続勾配で２２℃ にて０．１５ｒｎ２／分の流速で行った。用いた勾配は次のとおりである二〇％Ｂ２分間、３分間で０−６％Ｂ１３５分間で６−３５％Ｂ１１０分間で３５−５０％Ｂ及び１０分間で５０−０％８０図５は反応生成物のＨＰＬＣ分析を示す。

大施皿主、合でポリエチレンにカップリングしたロインンエンケファリン　ＹＧＧＦＬと Ω配列決定試薬と溶媒の組成を表Ｖｌに示す。

表■ 試薬と溶媒の組成Ｒ１無水酢酸Ｒ２アセトニトリル中の３０％　ＴＭＳ−ＩＴＣ（Ｖ／Ｖ）Ｒ３５０％メタノール、５ｏ％ｔ−ブタノール中のＯ，ＯＩＭ　ソジウム・トリメチルシラル−トＲ４メタノールＳｌ　５％トリエチルアミン水溶液Ｓ２　水中の１．０％トリフルオロ酢酸８３　５０％メタノール、５０％水Ｓ４　アセトニトリルチオヒダントインアミノ酸誘導体は逆相ＨＰＬＣで分離した。この分離は、島津５ＰＤ−６Ａディテクターを用いて、ベックマン　１２６　ポンプ　モジュール（Ｂｅｃｋｍａｎ　１２６　Ｐｕｍｐ　Ｍｏｄｕｌｅ）上のフェノメネソクス・ウルトラカーブ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｕｌｔｒａｃａｒｂ）　５　０ＤＳ（３０）カラム（２，ＯｗＸ　２５ｍｍ）で行った。カラムを溶媒Ａ　（０，００６％リン酸、０．００６％トリエチルアミン、０．０４５％ペンタンスルホン酸）で５分間溶出し、続いて溶媒Ｂ　（０，０３％リン酸、０．０４５％トリエチルアミン、３０％アセトニトリル、０．０４５％ペンタンスルホン酸）への不連続勾配で２２℃にて０．１５ｍ１／分の流速で行った。用いた勾配は次のとおりであるＯ％Ｂ５分間、７分間で０−２０％Ｂ１２５分間で２０−１００％Ｂ、１００％Ｂ２３分間、２分間で１００％−〇％Ｂ。

図６は反応生成物のＨＰＬＣ分析を示す。

大施皿人ＰＥ−Ｃ０ＯＨに共　合でカップリングさせたＲＧＹＡＬＧ　８．ｌｎｍｏｌ　の配列決定ＲＧＹＡＬＧの配列決定は実施例３の記載と全く同様に行った。

図７にＨＰＬＣ分析を示す。

大施員旦ＰＥ−Ｃ０ＯＨに−合でカップリングさせたＹＧＧＦＭＲＧＬ　９．６ｎｍｏｌＬ９配剋決定ＹＧＧＦＭＲＧＬの配列決定は実施例４の記載と全く同様に行った。

図８にＨＰＬＣ分析を示す。

叉施勇旦リンカ−１１−アミノウンデカン　Ｒ２Ｎ　ＣＨ０ＣＯ２Ｈに共　合でカッ　リングさせたＹＧＧＦＬ　３．　７ｎｍｏｌ　の配ｌ　足固９は、リンカ−１１− アミノウンデカン酸Ｈ２Ｎ　（ＣＨ２）、。ＣＯ□Ｈに共有結合でカップリングさせたＹＧＧＦＬ　（３，７ｎｍｏｌ）の配列決定を示す。このリンカ−は前記のとおりＰＥ−Ｃ０ＯＨのカルボキシル基をＤＣＣで活性化してＰＥ−Ｃ０ＯＨに結合させた。結合の後、リンカ−のカルボキシル基も同様にＤＣＣで活性化し、次いでペプチドを共有結合で結合させた。リンカ−の存在下でペプチドＹＧＧＦＬを配列決定した場合は、６サイクルの配列決定の後に、Ｎ末端アミノ酸、Ｙ、の５ｏ％が依然として共有結合していた（図６）。同じペプチドの配列決定を、上記リンカ−へ結合した後に同じ配列決定プロトコールを用いて行うとＣ図１０）、Ｎ末端アミノ酸、Ｙ、の１２％のみが依然として共有結合していた。

ＹＧＧＦＬの配列決定は実施例３に記載したのと全く同様に行った。

ＣＨ３ＦＩＧ、　ＩＣＨ３トリメチルアミンＮ−オキシド１ＦＩＧ、　２ペプチドチオヒダントイン短縮されたペプチドＦＩＧ，　３ペプチドチオヒタ“ントインＦＩＧ．　３Ａ溶出時間（分）ＦＩＧ．　５アルコ゛ン供給要約書蛋白質およびペプチドのＣ末端配列決定に有用な試薬が開示されている。この試薬は、ソジウム　トリメチルシラ、ルート包含する．Ｃ末端配列決定すべきペプチドサンプルのための、誘導体化され活性化されたポリエチレン支持体が記載されている６国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ベブチドのカルボキシ末端をシリル・イソチオシアネートカップリング剤とカップリングさせてベブチジルチオヒダントイン誘導体を形成し、そして該ベブチジルチオヒダントイン誘導体をソジウム・トリメチルシラルートまたはトリメチルアミン・Ｎ−オキシドで開裂させて、それまでベブチドのカルボキシ末端に存在したアミノ酸のチオヒダントイン誘導体とそのアミノ酸を失ったペプチジル基とを生じさせることよりなる、カルボキシ末端分解によるべブチドの配列決定方法。
２．ベブチドをポリビニルジフルオリドまたはポリエチレンの膜にカップリングさせる、請求項１記載の方法。
３．ベブチジルチオヒダントインの開裂を、炭素数１〜約４のアルカノール及びトリメチルシリルエタノールからなる群から選択される溶媒中で行う、請求項１または２記載の方法。
４．シリルイソチオシアネートがトリメチルシリルイソチオシアネートである請求項１または２記載の方法。
５．ベブチドのカルボキシ末端をシリル・イソチオシアネートカップリング剤とカップリングさせてベブチジルチオヒダントイン誘導体を形成し、そして該ベブチジルチオヒダントイン誘導体を次式：Ｒ３ＳｉＯ−Ｘ＋（式中、Ｒは炭素数１ないし約１０の直鎖もしくは分枝鎖炭化水素基であり、そしてＸはアルカリ金属イオンである）または次式：（Ｒ１）３Ｎ＋−Ｏ−（式中、Ｒ１は炭素数１ないし約４のアルキル基である）で表される試薬で開裂させて、それまでベブチドのカルボキシ末端に存在したアミノ酸のチオヒダントイン誘導体とそのアミノ酸を失ったペプチジル基とを生じさせることよりなる、カルボキシ末端分解によりベブチドを配列決定する方法。
６．ベブチドをカルボン酸で修飾したポリビニルジフルオリドまたはポリエチレンの膜に共有結合でカップリングさせる請求項５記載の方法。
７．ベブチドのカルボキシ末端をカップリング剤とカップリングさせてベブチジルチオヒダントイン誘導体を形成し、そして該ベブチジルチオヒダントイン誘導体を次式：Ｒ３ＳｉＯ−Ｘ＋（式中、Ｒは炭素数１ないし約１０の直鎖もしくは分枝鎖炭化水素基であり、そしてＸはアルカリ金属イオンである）で表される試薬で開裂させて、それまでベブチドのカルボキシ末端に存在したアミノ酸のチオヒダントイン誘導体とそのアミノ酸を失ったペプチジル基とを生じさせることよりなる、カルボキシ末端分解によりベブチドを配列決定する方法。
８．ベブチドのＮ末端を、活性化されカルボン酸で修飾されたポリエチレン膜に共有結合でカップリングさせる、請求項７記載の方法。
９．（ｉ）ベブチドのＮ末端が、カルボン酸で修飾されたポリエチレン膜の活性化エステルにカップリングされ、そして（ｉｉ）前記活性化エステルが、前記カルボン酸で修飾されたポリエチレン膜をＤＣＣ、ＣＤＩ、ＥＤＣ、ＢＯＰまたはＤＩＣＤと反応させて製造される、請求項７記載の方法。
１０．（ｉ）表面にカルボキシル基を有するポリエチレン膜；（ｉｉ）前記ポリエチレン膜の表面のカルボキシル基にアミド結合によりカップリングされたリンカーであって、該カップリングの前には次式：Ｈ２ＮＣ（ＣＨ２）／ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは約４ないし約１０の数である）で表されるリンカー；からなり、該リンカーのカルボン酸は２−フルオロ−１−メチルビリジンとの反応でエステル化されている、活性化されたカルボン酸で修飾されたポリエチレン膜。
１１．カルボン酸修飾ポリエチレン膜をＤＣＣ、ＣＤＩ、ＥＤＣ、ＢＯＰ、ＤＩＣＤまたは２−フルオロ−１−メチルピリジンと反応させることよりなる、Ｃ末端から配列決定すべきベブチドのＮ末端と共有結合させるために、カルボン酸修飾ポリエチレン膜のカルボキシル基を活性化エステルに変換する方法。
１２．請求項１１の方法で製造された活性化カルボン酸及び修飾ポリエチレン膜。