JPH05508413A - Ｎ―置換ケテンイミン活性化物質を用いるアミノ酸チオヒダントインの生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ−置換ケテンイミン活性化物質を用いるアミノ酸チオヒダントインの生成方法 　。

１、且里立肢五光！ 本発明はアミノ酸カルボキシル基のケテンイミン活性化物質を介してアミノ酸チ オヒダントインを生成するための方法および固相支持体に関するものである。

２、髪１文藍 グリーン・ティ、有機合成における保護基、ジョン・ウィリイ。

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３、主里Ω■量 Ｃ−末端ペプチドシーケンシングに使用するため、あるいはＣ−末端シーケンシ ング方法のための標準をつくる際に使用するため、アミノ酸チオヒダントイン（ ＴＨ）を生成するための種々の方法が行われてきた。ひとつの一般的方法では、 アミノ酸（またはペプチド）は、無水酢酸のような無水物を用いて、チオシアネ −）＜ＪＴＣ）塩または酸の存在で、カルボキシル末端で活性化され、Ｃ−末端 ＩＴｃ中間体を経てＣ−末端ベブチジル−ＴＨを生成する（スターク、１９７２ ）。このペプチジル−ＴＨは開裂して短くなったペプチドとＣ−末端アミノ酸Ｔ Ｈを生成することができ、これは、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ 　Ｌ　Ｃ）によって同定することができる。この方法でのカンプリング条件は代 表的には６０〜７０℃で約９０分を必要としくメウス）、ペプチドにおいてアミ ノ酸側鎖の分解に導かれる場合が多い０例えば、セリンとスレオニンの側鎖水酸 基を無水物によって攻撃されるので、水酸基の保護が必要である。

より穏和な条件下に行うことができるチオヒダントイン生成方法は本発明者と共 同実験者によって記載されている（ホーク）。

試薬としてトリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ　Ｉ　ＴＣ）を使用し て、１５分間５０℃にて無水酢酸を用いてペプチドを活性化し、続いてさらに３ ０分間５０℃にてＴＭＳＩＴＣを用いる反応によってＴＨ住成が行われた。穏和 な反応条件にもかかわらず、この方法は反応性の高い無水物活性化剤にペプチド がさらされて、望ましくない側鎖反応の原因となる。

４、光里二盟！ 本発明の目的のひとつは比較的穏和な反応条件下にアミノ酸チオヒダントインを 生成するための方法を提供することである。

本発明の方法において、Ｎ−保護アミノ酸をケテンイミンと反応させて活性化し 、アミノ酸の対応する活性化エステルを生成し、この活性化エステルをシリルイ ソチオシアネートまたはピリジニウムチオシアネートと反応させて、所望のアミ ノ酸チオヒダントインを生成する。ケテンイミンは好ましくは、Ｎ−置換イソキ サゾリウム、例えばウッドワード試薬Ｋ　（ＷＲＫ）または関連する２−アルキ ル−５′−アルキルまたはアリールイソキサゾリウム化合物を、アミノ酸の存在 で塩基と処理して生成される。シリルイソチオシアネートは好ましくはトリアル キルシリルイソチオシアネート、例えばトリメチルシリルイソチオシアネート　 （ＴＭＳｒＴＣ）である。

１実施例において、ケテンイミンは固体支持体上に誘導され、固定化試薬システ ムにおいてアミノ酸またはペプチジルＴＨを生成することができる。支持体は好 ましくは、使用直前に、Ｎ−置換イソキサゾリウムを用いて誘導された固相支持 体を塩基処理することによって生成される。

本方法はＣ−末端ペプチドシーケンシングのために応用できる。

ここではケテンイミンと反応するＮ−保護アミノ酸はペプチドのＣ−末端残基で あり、ペプチドのＮ−末端カルボキシル基にて活性化エステルを生成する。活性 化エステルはイソチオシアネートと接触し、対応するＣ−末端ペプチジルチオヒ ダントイン（ＴＨ）を生成する。ペプチジルＴＨは分解して残基ペプチドからＣ −末端アミノ酸チオヒダントインを脱離する。得られたペプチジルＴＨは分解し て残基ペプチドからＣ−末端アミノ酸ＴＨを脱離する、このアミノ酸Ｔ）ｌを単 離し同定する。

他の観点では、本発明は、本発明に使用するため、Ｎ−置換イソキサゾリウム化 合物またはケテンイミン化合物を用いて誘導された固相支持体を含む。

本発明のこれらおよび他の目的および特徴は本発明の次の詳細な説明を、添付す る図面と合わせて読むとき一層完全に明らかになるだろう。

回ｌ工」１１Ｔ１肌 図１は、Ｎ−置換イソキサゾリウム化合物（１）を中間体（ＩＩ）を介して、塩 基の存在で対応するケテンイミン（ＩＩＩ）に転換する工程を示す図であり； 図２は、Ｎ−保護アミノ酸（■ν）と図１のケテンイミン（ＩＩＩ）を反応させ て、活性化アミノ酸エステル（Ｖｌ）　、および可能な反応中間体（Ｖ）を生成 する工程を示す図であり；図３は、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭ Ｓ　ｒＴｃ）（Ｖｌｌ）と活性化アミノ酸エステルｍ）を反応させて、対応する アミノアシルＩＴＣ（Ｘ）を生成し、このＩＴＣを転位させてアミノｅｌＩＴＨ （Ｘｌｌ）を生成する工程を示す図である。

図４はイソキサゾールを用いてアルキル化基（ＸＩＶ）を有する固体支持体を誘 導するための工程を示す図であり：図５は固体支持体（ＸＶ）上に誘導された固 定化フェニルイソキサゾリウム化合物を転換して、ケテンイミン基を持つ対応す る支持体（ＸＶＩ）を生成する工程を示す図であり；図６はペプチドと図５の活 性化支持体（ＸＶＩ）およびＴＭＳＩＴＣと反応させてペプチジルＴＨ（χＸＩ ）を生成する工程を示す図であり； 図７はカチオン交換樹脂によってペプチジルＴＨを分解して、残りのペプチドを 樹脂支持体に保持する工程を示す図であり；図８はオキシム基を用いて誘導され た固体支持体によってペプチジルＴＨを分解して、次いで樹脂支持体から残りの ペプチドを加水分解により脱離する工程を示す図であり；図９は本発明によるＣ −末端シーケンシング操作での工程を示す図である。

このセクションは（ｉ）反応性ケテンイミンを生成し、（ｉｔ）Ｎ−保護アミノ 酸またはペプチドをケテンイミンを用いて活性化し、そして（ｉｉｉ）活性化し たアミノ酸またはペプチドをシリルまたはイソチオシアネート（！ＴＣ）または ピリジニウムチオシアネートと反応させて所望のアミノ酸またはペプチジルチオ ヒダントイン（ＴＨ）を生成する際に含まれる溶液相反応を記載するものである 。

図工は本発明において使用するため反応性Ｎ−置換ケテンイミンを生成するため の好適な方法のひとつを示す図である。この反応はＮ−置換イソキサゾリウム化 合物を、既に記載された（ウッドワード）塩基、例えば（Ｒ２Ｈ）の存在で開環 によって相当するケテンイミン化合物に転換することを含む、この反応は図に示 した中間体（ＩＩ）を介して行われるらしい。

Ｒ，！（Ｎ−置換）基はメチル、エチル、ｔ−ブチルまたは同様のアルキル基ま たはフェニル、置換フェニルまたは関連するアリール基である。化合物はＮ−置 換されなければならない、即ち、所望のケテンイミンを与えるように、Ｒ２は水 素ではない、ケテンイミンに転換するように、イソキサゾリウム化合物の３−位 は水素でなければならない、５−位はフェニル、置換フェニル、例えばスルホフ ェニル（ウッドワード試薬Ｋ）、またはアルキル、例えばメチル（ウッドワード 試薬Ｌ）である、即ち、５′−置換基はアルキルまたはアリールである。４−位 はアルキル基、例えばメチルで置換される。しかし、４−位と５−位の両方が置 換されるならば、例えば、Ｒ１がフェニルでありＲ４がメチルである場合、変則 的結果が得られるかも知れない（ウッドマン）。

Ｎ−置換イソキサゾリウム化合物のひとつの好ましいクラスは２−アルキル−５ ′−アルキルイソキサゾリウム塩、例えば２−ｔ−ブチル、５′−メチルイソキ サゾリウム（ウッドワード試薬りまたはＷＲＬ）、または２−アルキル−５′− アリールイソキサゾリウム塩、例えば２−エチル−５′−フェニルイソキサゾリ ウムスルホネート（ウッドワード試薬ＫまたはＷＲＫ）を含む。

これらの化合物の幾つかは市販品として入手でき、あるいは公知の方法（ウッド ワード）によって調製することができる。ＷＲＫ中のスルホネート基は化合物双 極性イオンをつ（す、溶解性を高める。その不安定性のため、ケテンイミンは、 以下に述べるように、Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドの存在で生成させること が好ましい。

ケテンイミンとＮ−保護アミノ酸との反応は図２に示される。

アミノ酸上（またはペプチド上）の保護基Ｐは１個の、例えばＦＭｏＣ（フルオ レニルメトキシカルボニル）　、ｔ−ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、 ｔ−Ｂｕ（ｔ−ブチル）、またはＭｔｒである。

このような保護基は市販品として入手でき（例えば、アルドリッチ・ケミカル社 ）、または公知の方法（グリーン）によって容易に合成することができる＠　Ｓ ｅｒ、　Ｔｈｒ＋　Ａｓｐ、　Ｇｌｕをｔ−Ｂｕによって；　Ｌｙｓをｔ−ＢＯ Ｃによって：そしてＡｒｇをＭｔｒによって保護することができる。エノールエ ステル生成後で、ＩＴＣ化合物との反応前に、所望により、選ばれた保護基を除 去することができる。

Ｎ−保護基はチオヒダントイン生成後に除去する。

活性化反応は代表的には無水の非求核溶媒、例えばＮ−保護アミノ酸を含有する 無水アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中で行われ、アミノ酸カルボキシル基を確保す るために十分な塩基が脱プロトンされる。この溶液に各１当量のイソキサゾリウ ム塩および第３アミン、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を 添加する。次に均一な溶液が得られるまで、溶液を室温で数時間撹拌し、図２に 示すように、アミノ酸−ＷＲＫ−活性化エステル（ＶＩ）を生成する。活性化エ ステルが生成した後、溶液を濃縮し乾燥する。

活性化エステルを無水の非求核溶媒、例えば、塩化メチレン（ＣＨｇＣＩ□）に 再懸濁させて、僅かに過剰モルの選択されたイソチオシアネート（またはチオシ アネート）を添加し、図３に示した環化とチオヒダントイン生成に導く０反応混 合物を室温で撹拌する。

反応の進行は幾つかの既知の手段のいずれか、例えば薄層クロマトグラフィーま たはＨＰＬＣによって追跡することができる。

生成物のチオヒダントインは幾つかの既知の方法のひとつ、例えばシリカゲルク ロマトグラフィーＨＰＬＣによって精製することができる。Ｎ−保護基は標準方 法（グリーン）によって除去することができる０例えば、Ｆｍｏｃ４１ｅチオヒ ダントインはカラムクロマトグラフィーおよび塩化メチレン：メタノール溶媒の 混合物（９：　Ｉ　ＣＨｔＣｈ　：　ＭｅＯＨ）を用いて溶出するシリカゲルに よって精製することができる。　ＦＭＯＣ基はアセトニトリル中２０％のピペリ ジンと反応させて除去することができ、カラムクロマトグラフィーと再結晶の後 、適度の収率を与える。

本方法において有効であることが見出された反応性チオシアネートまたはイソチ オシアネート化合物はシリルイソチオシアネートおよびピリジニウムイソチオシ アネートである。好ましいシリルイソチオシアネートはトリアルキルシリルイソ チオシアネート、例えばトリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ　ＩＴＣ ）である、シリルＴＴＣは金属ＩＴＣ塩よりも反応性の核分子であり、これは５ ｔ−Ｎ結合の分極能に原因があるようだ。ピリジニウムチオシアネート化合物の 反応性は核アシル化触媒（マーチ）として働くピリジンの反応性に一部は起因す るのかも知れない。

本方法において金属イソチオシアネート（即ち、カリウム−、ナトリウム−１ま たは鉛−イソチオシアネート）およびアンモニウムイソチオシアネー）　（ＴＣ ）の反応性について試験したが、チオヒダントイン生成にはあまり有効でなかつ た。

溶媒の極性はＴＨ生成反応（即ち、図２に示した一連の工程）において決定的役 割を演じることも見出された。一般に、ＣＨｚＣｌｇよりも大きい極性をもつ溶 媒中で行われる環化反応はあまり良く働かない。例えば、Ｎ−メチルピロリドン （ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で行われるＴＨ生成反応は 測定可能な分量のＴＨ生成物を生成しなかった。

図２および３は、反応性ケテンイミン（図２）との反応および所望のアミノ酸Ｔ Ｈを生成する活性化エステルとシリルＩＴＣとの反応によって活性化アミノ酸エ ステルを生成するための可能な反応機構を示すものである０図２を参照すると、 ケテンイミン（ＩＩＩ）の中央の炭素はＮ−保護アミノ酸カルボキシレートによ って攻撃され、仮定の中間体（Ｖ）を経て転位し、アミノ酸エノールエステルＶ ｌを生成する。

ＴＨ生成の提案された結果を図３に示す、エノールエステルＶＩはＩ　ＴＣ（Ｖ Ｈ）によって攻撃され、化合物ＶＴＩ！およびアミノアシルイソチオシアネート （ｆｃ）を生成する。アミノ酸の窒素はチオカーボネートの炭素（Ｘ）を攻撃し て、一層安定なＴＨ進行（実施例１）に平衡させる仮定された中間体のＮ−保護 アミノアシルチオヒダントイン（ＸＩ）を生成し、所望のアミノ酸ＴＨ（ＸＩＩ Ｉ）を生成する。ここで、使用した反応条件はアミノ酸側鎖保護を必要としない ので、したがって側鎖脱保護の追加の工程なしでアミノ酸ＴＨを生成することが できる。

別の特徴では、前記溶液相の方法はＮ−保護ペプチドのＣ−末端アミノ酸チオヒ ダントインを形成する際に使用することができる。この反応では、残りのペプチ ド（そのＣ〜末端残基が少ないペプチドをＮ−保護した）は上記反応でのＮ−保 ｒＩ基Ｐと置換すこのセクションは、（ｉ）固体支持体上に反応性ケテンイミン を生成し、（ｉｆ）活性化した支持体と反応させて、Ｎ〜保護アミノ酸またはペ プチドを活性化し、そして（ｆｉｔ）支持体上の活性化アミノ酸またはペプチド とシリルＩＴＣまたはピリジンチオシアネートと反応させて所望のアミノ酸また はペプチジル（ＴＨ）を生成する際に含まれる固相反応を記載する。

図４はＮ−置換フェニルイソキサゾリウム塩を用いて誘導された固体支持体を形 成するためのカップリング反応を示す。支持体は適当な化学基を用いて誘導され た粒子ビーズ、または膜支持体またはこれらに類イ以するものであることができ る。ヒ゛−ズまたは膜支持体物質、例えばガラス、またはポリマー物質、例えば アミン、カルボキシル、および水酸基のような反応性化学基を有するナイロン、 ポリスチレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）は、市販品として入手する ことができる。

図４の固体支持体（ＸＩＶ）は、表面アミン基を有するＳで示された粒子ビーズ またはこれに類似するものである。

ビーズは、図４の右側に示される化合物のような、イソキサゾールと支持体を反 応させてＮ−置換イソキサゾリウム化合物と共に誘導される。反応は適当な溶媒 、例えばアセトニトリル中で行われる。銀イオン（Ａｇ”）は反応を助けるよう に含ませることができる。従来のアルキル化反応の条件が用いられる。誘導され た支持体は図４の（ＸＶ）で示される。

支持体は塩基で処理して活性化され、図５に示したように、支持体上に反応性ケ テンイミン基を生成する。活性化反応は好ましくは、上記のように、Ｎ−保護ア ミノ酸の存在で行われ、図２の下部に示した活性化アミノ酸エノールエステルを 生成するが、この場合に活性化アミノ酸は固体支持体にカップルされる。

支持体と結合したアミノ酸エノールエステルを、例えば塩化メチレンを用いて洗 浄し、結合していない反応物、および乾燥した粒子を除去する。乾燥した支持体 は適当な試薬、例えばＴＭＳＩＴＣの溶液に懸濁し、懸濁液は溶液中に対応する アミノ酸ＴＨを生成するように反応させる０図３を参照すると、ｒＴＣ反応が支 持体から活性化アミノ酸を放出して、溶液相中で続いて環化してアミノ酸ＴＨに 導（ことが認識されるだろうゆケテンイミン部分の副産物は支持体上に保持し、 アミノ酸ＴＨおよびＩＴＣ試薬の生成物は溶液相中にある。アミノ酸チオヒダン トインは、セクションＡに示したように、標準方法によって他の溶液相成分から 精製することができる。

固相方法（固定化試薬）を用いてＮ−保護ペプチドのＣ−末端アミノ酸ＴＨを生 成し、Ｎ−保護ペプチドを上記反応方法でＮ−保護アミノ酸と置換する０図６は Ｒ７側鎖基と共にＣ−末端アミノ酸をもつＮ−保護ペプチドからのペプチジルＴ Ｈ１およびＲ，ｉ−１側鎖をもつＣ−末端に対して終りから２番目のアミノ酸残 基を生成する工程を示す。

図中の上部に示した反応は、好ましくは反応性ケテンイミンが生成し単一工程で ペプチドと反応させる上述のような反応の条件下に、ｎ−保護ペプチド（ＸＶＩ ■）と活性化支持体と反応させて行われる。支持体を洗浄後、支持体に結合した ペプチジルエノールエステル（にｍｌ）はシリルＩＴＣと反応させて、溶液形態 ＜ＸＸ＞でペプチジルｒＴＣ化合物を放出し、続く環化によって所望のペプチジ ルＴＨ（ＸＸＩ）を生成する。この反応をＣ−末端シーケンシングに応用するこ とは以下のセクションＣに記載する。

本方法に使用される誘導された支持体もまた本発明の一部を形成する。これらは Ｎ−置換フェニルイソキサゾリウム塩を用いて誘導された固相支持体、および塩 基活性化後に反応性ケテンイミン基を用いて誘導された同じ支持体を含む。

Ｃ３Ｃ−ＴＨの汗　と６ ひとつの特徴において、本発明の方法はＣ−末端ペプチドシーケンシングのため に、（ａ）上記方法に従ってペプチジルＴＨを生成し、そして（ｂ）　Ｃ−末端 アミノ酸ＴＨを脱離し、単離し、同定することによって用いられる。

ペプチジルＴＨからＣ−末端ＴＨを脱離するための種々の開裂反応が知られてい る。　１２Ｎ　ＨＣＩ、稀アルカリ（ケンナー）、または飽和水性トリエチルア ミンを用いた加水分解による開裂が報告された。これらの開裂反応は７０％まで の開裂を生じることが報告されているが、極端なｐＨ条件がチオヒダントイン開 環を導きおよび／またはペプチド側鎖を損傷する。さらに最近では、ｐＨ８，０ でとリジン中でアセトヒドロキサメートを用いて処理する開裂が報告されたくメ ウス）、この方法は６０〜８０％までの回収率のＣ−末端チオヒダントインを与 える（ミラー、１９８８）　、関連のある方法はアセトニトリル中で第１または 第２アミンと処理することを含む。

代表的には開裂反応は、使用する開裂試薬によって、室温またはそれよりも高い 温度で数分間ないし１時間行われる０反応の過程は容易に、例えばＨＰＬＣによ って、チオヒダントイン脱離を最適にし、望まない側鎖反応（例えば、開環）を 最小にするために、追跡することができる。

好ましい溶液相開裂方法において、ペプチジルＴＨは１０％プロピルアミンを用 いてアセトニトリル中で室温にて１５分間処理する。

関連する方法では、ペプチジルチオヒダントインはｌ　ｓ＋ｇ／＋ｍｌのジチオ トレイトール（ＤＴＴ）を含有する水中でテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムヒド ロキシドを用いて開裂された。

また、開裂反応は適当な溶媒中でペプチジルＴＨと固定化開裂試薬と接触させて 行うことができる。報告されたひとつの固定化開裂試薬（ヤマシタ）はアルトリ フチ（ミルウオーキー、［）から入手できるカチオン交換樹脂アンバーライト（ 登録商標）　ＩＲ−１２０（プロトン化した形態）である。図７に示したように 、樹脂はペプチジルＴＨ（ＸＸｒＩ）の酸触媒加水分解を促進し、所望のアミノ 酸ＴＨ（ＸＸＩＶ）および残基ペプチド（ＸＸＩＩＩ）を生成する０代表的には 、ペプチジルＴＨ試料を樹脂に添加しく樹脂１グラムにつき有効な約２ｔａｇ当 量）、混合物を２〜６時間室温にてインキュベーションする。ペプチド溶液は代 表的には真空によってペプチジルＴＨ生成に使用した溶媒を除去し、ペプチジル ＴＨを水性媒体に再溶解して調製される。

残基ペプチドはカチオン交換樹脂に結合し、低いイオン強度の条件下に樹脂を洗 浄して、遊離アミノ酸ＴＨを残基ペプチドから分離させる。支持体に結合した残 基ペプチドを用いて、遊離アミノ酸ＴＨは洗浄しであるいは実質的に精製された 形で溶出して得ることができる。残基ペプチドは続いてイオン強度またはｐＨを 高くして溶出することにより脱離することができる。

上記のように生成した残基ペプチドおよびアミノ酸ＴＨは、あるいは必要により 、アニオン交換樹脂に通過させて、またはクロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ またはモレキュラーシーブクロマトグラフィーによって、分離することができる 。

第２の一般的な実施例では、開裂試薬をペプチジルＴＨと反応することができる 化学基を用いて誘導し、遊離アミノ酸ＴＨを脱離して残基ペプチドを共有結合す る０次に遊離アミノ酸ＴＨを洗浄または溶出によって実質的に精製された形で単 離することができ、残基ペプチドはペプチドの加水分解開裂によって支持体から 脱離することができる。

例示的な固相開裂試薬は図８に示されるオキシム誘導固体支持体（ＸＸＶ）であ る。この種の支持体試薬はケミカル・ダイナミクス（プレインフィールド、ＮＪ ）から得られる０図中のＲ１＆はアルキルまたはアリール基、またはＨである。

市販品として入手できる支持体のひとつはニトロフェニルＲ基をもつ０図に示さ れるように、支持体上のオキシム基によるペプチジルＴＨの加水分解開裂は残基 ペプチドを支持体に結合しくＸＸＶＩ）、遊離アミノ酸ＴＨを脱離する（ＸＸＩ Ｖ）、好ましい場合にはアセトニトリルのようなアプロチック溶媒中で室温にて １５〜１２０分間反応が行われる。

アミノ酸ＴＨを回収し、固相支持体を洗浄した後、残余のペプチドを図８の下部 に示したように、酸性にした水性酸または塩基と接触させて支持体から加水分解 により脱離することができる。

このようにして、本方法はアミノ酸ＴＨと残基ペプチドを別々に単離し、後者は 実質的に反応物と副生成物から遊離した形で精製される。

脱離したアミノ＃ＴＨ化合物は、標準の方法に従って、高圧液体クロマトグラフ ィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）のような、既知のクロマトグラフィー法によって同定する ことができる。化合物の同定はカラム中の走行時間を、標準方法に従って、ある いは上記のアミノ酸ＴＨを調製する方法によって調製された既知の参照アミノ酸 ＴＨの走行時間と比較して手軽に行うことができる。あるいは、脱離して単離さ れたアミノ酸ＴＨを他の利用できる方法、例えば、マススベクトロメトリイまた はＮＭＲによって同定することができる。

Ｄ、Ｃ−ｒｒパ　シーケンシング このセクションは、自動化または半自動化した操作に適したＣ〜末端溶液相シー ケンシング方法に上記の方法を応用することについて記載している。ここで使用 される“溶液相シーケンシングの語はペプチドを溶液中に保持し、連続して面相 （固定化）試薬を介して再循環させる連続反応を意味する。これは、ペプチドを 固体支持体に固定化し、溶液相Ｃ−末端残基活性化および開裂試薬に繰り返して さらす固相シーケンシングと対比される。

図９はペプチドＰｅｐ　−ＡＡい即ちｎ個の残基と１個のＣ−末端残基ＡＡ、を 有するペプチドに応用される一般的なシーケンシング図を示している。最初に、 ペプチドを適当な溶媒、例えばアセトニトリルに溶解し、塩基と共に１２で示し た充填カラムに含まれるイソキサゾリウム誘導固体支持体に添加する。カラム１ ２は好ましくは二段階カートリッジ１４の一部であり、これはまた固体支持体開 裂試薬を含むカラム１６を含んでいる。

ペプチドを活性化支持体と反応させた後、塩基および結合していない反応物を含 む反応溶液を洗浄して除去し、ＩＴＣ化合物をカラムに添加し、結合したペプチ ドを脱離して溶液相にペプチジルＴＨを生成させる。

次に溶液相を、Ｃ−末端残基開裂工程のために、第２のカラムに添加する。任意 に２本のカラムを中間チャンバ（図には示していない）によって分離することが でき、そこでカラム１２の溶媒を真空によって除去し、試料をカラム１６に導く 前に第２の溶媒によって置換することができる。好ましい実施例では、固体支持 体試薬は図８に示したタイプである。この支持体の利点は、（ａ）開裂反応をカ ラム１２の反応で使用した溶媒と同じ非水溶媒または溶媒混合物中で行うことが でき、（ｂ）残基ペプチドの支持体への結合および支持体からの脱離が共有結合 であり、従ってペプチドの荷電特性に依存しないことである。

開裂反応は上述のような条件下に行われ、その後にＣ−末端アミノ酸ＴＨ（ＡＡ ＩＩ−Ｔ）Ｉ）をカラムから溶出し、例えばＨＰＬＣによって同定する。続いて 、カラムを水性媒体で洗浄し、結合した残基ペプチド（Ｐｅｐ−ＭＡＲ−１）を 脱離する。

最初のシーケンシングサイクルから得られた残基ペプチドを乾燥し、適当な反応 緩衝液に再溶解し、新しいカートリッジに導入する、第２のシーケンシングサイ クルは終りから２番目のＣ−末端残基（ＡＡ、Ｉ−ＴＨ）のアミノ酸ＴＨおよび ２個のＣ−末端残基によって短くなった残基ペプチドを生成する。このシーケン シングサイクルは所望の数のＣ−末端残基が同定されるまで繰り返される。

高い信鱈性で同定することができるＣ−末端残基の全体の数は、第１の反応カラ ムでペプチドが所望のペプチジル−ＴＨに変換する度合、およびペプチジル−Ｔ Ｉ（を第２の反応カラムで開裂する度合によって変化するだろう。

上述のことから、どのようにして本発明の種々の百的および特徴が達成されるか を正しく認識することができる。ＴＨ生成のための反応条件は、無水物活性化を 含む従来技術の方法と比較して比較通穏和であり、またカルボキシル基に対して 特異的であり、望まない側鎖反応の範囲を減らす。

本方法は溶液相化学に対して容易に採用することができ、従って反応および生成 物単離の工程を簡単にすると共に、アミノ酸ＴＨおよび残基ペプチドが実質的に 純粋な形で得られる溶液相シーケンシングを可能にする。

次の実施例は種々のアシル化合物の合成、Ｃ−末端アミノ酸基の決定にこれら化 合物を使用すること、およびＣ−末端シーケンシングについて記述するものであ る。これらの実施例は決して本発明の範囲を制限するものではない。

裏ま盤上 イソロイシンＴＨ−：’ｊ １ミリモルのＦＭＯＣ−イソロイシン（アプライド・バイオシステムズ、フォス ターシティ、ＣＡ）をＷＲＫ　（１ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（２ミリモル） （共にアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡから購入した） と共にアセトニトリルに溶解した０反応混合物を室温で２〜４時間、均質溶液が 生成するまで撹拌した。溶液を真空下に濃縮し、生成物のＦＭＯＣ−４１ｅ−Ｗ ＲＫエステルを塩化メチレン（ＣＨｚＣｈ）に溶解し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾 過した０次に、僅かに過剰のトリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳＩＴ Ｃ）を添加し７て、反応混合物を室温で一晩中撹拌した。ジアステレオマーとし て純粋なＦＭＯＣ−１１ｅチオヒダントインをカラムクロマトグラフィー（９： 　Ｉ　ＣＬＣｈ　：　１１ｅＯ）１）によって単離した。

アセトニトリルと２０％ピペリジンを含有する溶液中で精製チオヒダントインを 室温で１５分間撹拌して、ＦＭＯＣ保護基を除去した。

生成物のカラムクロマトグラフィー（同じ系）は精製された１ｉｅＴＨを与えた 。

爽施斑Ｉ Ｃ−ベブチジルチオヒ　ントインの ＰＭＯＣ−ＭｅｔＴｈｒのＣ−末端チオヒダントインは、実施例１のＮ−保護Ｌ ｅｕをＮ−保護ジペプチドＮｅｔ−Ｔｈｒに代えて、上記実施例１のように調製 した。Ｃ−末端チオヒダントインは１０％プロピルアミン／アセトニトリル中で 室温にて１５分間反応させてペプチドから開裂させる。ＨＰＬＣ分析は単離した 生成物で行い、同定するために標準物質と比較した。

ｌ施班主 したチオヒ　ントインのＨＰＬＣ 単離したチオヒダントインは、ＰＴＨ−Ｃ１Ｂカラム（２，１ｍ５Ｘ２２Ｃ１ｌ 、ＡＢＩ）およびＴＦＡ−水一アセトニトリルグラディエントシステムを使用す る狭ボアシステム（モデル１２０Ａ、アプライド・バイオシステムズ）を用いて 、ＨＰＬＣによって分析した。カラムをまずＡ溶媒中（水中０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ 、　Ｖ／Ｖ）で平衡にして、ライナーグラディエンドに保持し、５分間にわたっ て４０％まで展開し、そこで２０分間保持した。流速は室温で２００ｐ１／分で あった。流出は２６９ｎ−でモニターした。

亥施叢エ チオヒ　ントイン　のＡ 残留物のＨＰＬＣ同定に使用するための標準試料は次のようにして調製した。１ ミリモルのＦＭＯＣ保護アミノ酸を秤量し、１ミリモルのジイソプロピルエチル アミン（ＤＩＰＥＡ）および１当量のウッドワード試薬Ｋ（共にアルトリフチ・ ケミカル・カンバニイから購入した）を含む栓付フラスコに入れた０反応混合物 は、均質な溶液が生成するまで、室温で２〜４時間撹拌した。溶液を真空下に濃 縮し、生成物のＦＭＯＣ保護アミノ酸エステルを塩化メチレン（ＣＨ＊Ｃ１ｇ） に溶解し、Ｍｇ５Ｏａで乾燥し濾過した０次に、僅かに過剰のトリメチルシリル イソチオシアネート（ＴＨ３Ｉ　ＴＣ）を添加して、反応混合物を室温で一晩中 撹拌した。　ＦＭＯＣ保護チオヒダントインをカラムクロマトグラフィー（９： 　Ｉ　ＣＬＣＩ□：　ＭｅＯＨ）によって単離した。

アセトニトリルと２０％ピペリジンを含む溶液中で精製したチオヒダントインを 室温で１５分間撹拌しながらＦＭＯＣ保護基を除去した。

生成物（同じ系）のカラムクロマトグラフィーは精製したチオし関して記載した が、本発明からはずれることな（種々の変更および改良を行うことができること は認識されるだろう。

Ｆｉｇ、Ｉ ＣｏｗｒＲ３ Ｆ土ｆｆ、２ ｒｉｇ、４ Ｆｉｇ、６ Ｆｉｇ、９ Ｆｉｇ、９ 要約書 Ｎ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドのＣ−末端アミノ酸からアミノ酸チオ ヒダントインを生成する方法、アミノ酸をケテンイミンと反応させて活性化し、 活性化エステルをシリルまたはピリジンイソチオシアネートと反応させてチオヒ ダントインに変れたＮ−置換イソキサゾリウムまたはケテンイミン基を有する固 相支持体を開示する。

濁ａ謂査報告 ｋｔｍ　ＰＣＴＡＳＡ／２１１１１ｍｌ　ｍ　＋２１１１＆ｔ１２ｆｉ　鍮を国 際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ−保護アミノ酸をＮ−置換ケテンイミンを用いて活性化させアミノ酸の対 応する活性化エステルを生成し、活性化エステルをシリルイソチオシアネートお よびピリジニウムチオシアネートから成る群から選ばれるチオカルボニル化合物 と反応させてアミノ酸のヒダントインを生成する工程からなるアミノ酸チオヒダ ントインの生成方法。
2. ２．前記活性化がＮ−アルキルイソキサゾリウム化合物を塩基を用いて処理して ケテンイミンを生成し、保護アミノ酸をケテンイミンと接触させることを含む、 請求項１記載の方法。
3. ３．前記イソキサゾリウム化合物がＮ−アルキル−５′−アルキルまたはアリー ルイソキサゾリウムである請求項２記載の方法。
4. ４．前記イソキサゾリウム化合物が２−エチル−５′−フェニルイソキサゾリウ ムスルホネート塩である請求項３記載の方法。
5. ５．前記チオカルボニルがトリアルキルシリルイソチオシアネートである請求項 １記載の方法。
6. ６．前記チオカルボニルがトリメチルシリルイソチオシアネートである請求項５ 記載の方法。
7. ７．Ｎ−アルキルイソキサゾリウム化合物が固体支持体に誘導され、前記活性化 が支持体を塩基を用いて処理することを含み、ケテンイミン基を結合した支持体 を生成し、アミノ酸と処理された支持体とを接触させる、請求項１記載の方法。
8. ８．Ｎ−アルキルイソキサゾリウム化合物がＮ−置換基によって支持体に誘導さ れた２−エチル−５′−アルキルまたはアリールイソキサゾリウムである、請求 項７記載の方法。
9. ９．アミノ酸が保護側鎖を含み、エステルとチオカルボニル化合物とを反応させ る前に、さらにアミノ酸の活性化エステル中のアミノ基を脱保護することを含む 、請求項１記載の方法。
10. １０．Ｎ−保護ペプチドのＣ−末端アミノ酸を決定するのに使用するため、ケテ ンイミンと反応するＮ−保護アミノ酸がペプチドのＣ−末端残基であり、前記活 性化がペプチドのＣ−末端カルボキシル基にて活性化エステルを生成し、前記反 応が活性化エステルとチオカルボニルを接触させて対応するＣ−末端ペプチジル チオヒダントインを生成し、ペプチジルチオヒダントインを開裂してＣ−末端ア ミノ酸チオヒダントインを残りのペプチドから脱離し、そしてさらにＣ−末端ア ミノ酸チオヒダントインを単難し同定することを含む請求項１記載の方法。
11. １１．前記活性化がＮ−アルキル化合物を塩基で処理してケテンイミンを生成し 、保護されたアミノ酸をケテンイミンと接触させることを含む、請求項１０記載 の方法。
12. １２．前記イソキサゾリウム化合物が固体支持体に誘導され、前記活性化が、支 持体を塩基を用いて処理し、ケテンイミン基を結合した支持体を生成し、ペプチ ドを支持体と接触させ、これによってペプチドを活性化エステル結合によって支 持体にカップリングし、前記反応がペプチドをＣ−末端ペプチジルチオヒダント インの形で支持体から脱離することを含む、請求項１１記載の方法。
13. １３．前記開裂が、ペプチジルチオヒダントインを開裂し遊離のＣ−末端アミノ 酸ＴＨおよび残りのペプチドを形成するために有効である開裂剤を用いて誘導し た第２の固体支持体と、ペプチジルチオヒダントインとを接触させることを含む 、請求項１２記載の方法。
14. １４．第２の固体支持体が、選択されたイオン強度とｐＨ条件で残りのペプチド を選択的に結合するために有効なイオン交換樹脂である、請求項１３記載の方法 。
15. １５．第２の固体支持体が、（ａ）ペプチジルＴＨを開裂し遊離アミノ酸ＴＨを 生成し、そして（ｂ）残りのペプチドに共有結合するために有効なオキジム基を 用いて誘導される、請求項１３記載の方法。
16. １６．さらに、第２の支持体から遊離のアミノ酸ＴＨを分離し、次いで支持体か ら残りのペプチドを加水分解により分解するように第２の支持体を処理すること を含む、請求項１５記載の方法。
17. １７．Ｎ−置換イソキサゾリウム化合物を用いて誘導された固体支持体から成る 、アミノ酸チオヒダントインを生成するのに使用するための活性化支持体。
18. １８．Ｎ−置換ケテンイミンを用いて誘導された固体支持体から成る、アミノ酸 チオヒダントインを生成するのに使用するための固相支持体。