JPH10505598A

JPH10505598A - Ｃ末端蛋白質配列分析のための無水酢酸活性化

Info

Publication number: JPH10505598A
Application number: JP8509554A
Authority: JP
Inventors: ボイド，ビクトリア，エル; ボッジニ，メリリサ; ロウドン，ジイ．，マルク
Original assignee: ザパーキン−エルマーコーポレーション
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-08-29
Publication date: 1998-06-02
Also published as: US5468843A; AU3419695A; AU681811B2; WO1996007916A1; EP0779985B1; DE69501829T2; CA2197304A1; EP0779985A1; DE69501829D1; ATE164227T1; CA2197304C

Abstract

(57)【要約】蛋白質またはペプチドのＣ末端配列分析のための方法を提供する。該方法の重要な特徴は、塩基性条件下に無水酢酸で処理し、次に酸性条件下にチオシアネートで処理してオキサゾロンをチオヒダントイン部分に変換して、蛋白質またはペプチドのＣ末端でオキサゾロン部分を形成することである。立体的に妨げられたアルキルアンモニウムカチオンの共役酸としてチオシアネートを供給することによりチオヒダントインの収率はさらに高められる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ末端蛋白質配列分析のための無水酢酸活性化発明の技術分野本発明は、一般にペプチドまたは蛋白質のＣ末端のアミノ酸配列を決定する方法に関し、さらに特に、ペプチドまたは蛋白質のＣ末端にてアミノ酸チオヒダントインを形成する方法に関するものである。発明の背景ペプチドおよび蛋白質のＣ末端配列分析での進歩は、Ｎ末端ペプチド配列分析と比較して過去数十年間うんざりするほど遅れていた、例えば Inglis，Analyti cal Biochemistry，195: 183-196（1991）。Ｃ末端のアミノ酸配列分析への重要なアプローチは、ペプチドまたは蛋白質のＣ末端でのチオヒダントイン部分の形成を含み、これは次に、Ｎ末端アミノ酸残基を分析するためのエドマン分解でのフェニルチオヒダントイン部分の形成、開裂、および検出と大体同じ方法で開裂、検出される。Ｃ末端配列分析方法論への最新の研究の多くは、チオヒダントイン形成のためにより良い試薬を開発することに集中している、例えば Bailey ら、Biochemist ry，29: 3145-3156（1990）；Boydら、米国特許 5,051,368；Baileyら、米国特許 5,180,807；Boydら、米国特許 5,304,497等。種々の化学方法がその相当するチオヒダントイン（ＴＨ）へペプチドのＣ末端アミノ酸を変換するために提案された、例えば Inglis（上記）。特にスタークその他は酸性条件下に無水酢酸を使用し、Ｃ末端残基を活性化し、同時にチオシアネート〔Ｎ＝Ｃ＝Ｓ〕で処理してチオヒダントイン誘導体を生成した、例えば Stark，Biochemistry，7: 1796- 1807（1968）。このような活性化とチオヒダントイン形成を受ける化学機構は良くわかっていないが、混合した無水物とオキサゾロンの生成を含むと信じられている。不幸にも、オキサゾロンはチオヒダントインの収率を減らす傾向がある幾つかの望ましくない副反応に関係すると考えられている。Ｃ末端ペプチド配列分析において、チオヒダントイン収率が高く、それにより妥当な大きさの試料に多数の配列分析サイクルを支持できるチオヒダントインを形成するための代替化学が得られるならば、これは有利である。発明の概要本発明は、対応するアミノ酸チオヒダントインへＣ末端Ｎ保護アミノ酸を選択的に変換する方法を含む。本発明の重要な特徴は、試料を穏和な塩基性条件下に無水酢酸で処理して、ペプチドまたは蛋白質試料のＣ末端カルボキシルにオキサゾロン部分を生成することである。このような条件下に、望ましくない副反応により失われるオキサゾロン量は非常に減少し、これにより次のチオシアネートでの処理によってチオヒダントインに変わるオキサゾロンのパーセンテージが高くなる。別の局面では、本発明はポリペプチドまたは蛋白質における複数のＣ末端残基を配列分析する方法を含む。好ましくは、このような方法は(1)ポリペプチドのＣ末端アミノ酸を穏和な塩基性条件下に無水酢酸で処理してオキサゾロン部分を形成し、(2)酸性条件下にチオシアネートアニオンによってオキサゾロン部分を処理してアミノ酸チオヒダントインを形成し、(3)ポリペプチドからアミノ酸チオヒダントインを開裂し、そして(4)開裂したアミノ酸チオヒダントインを同定する各工程からなる。さらに好ましくは、この方法はさらに(i)ポリペプチド試料を穏和な塩基性条件下に無水酢酸、ピペリジンチオシアネートで処理して、側鎖のカルボキシル基をピペリジンアミドに変換し、(ii)ポリペプチド試料をアセチル化剤で処理してセリンおよびトレオニンの側鎖ヒドロキシルを０−アセチル誘導体に変換し、そして(iii)上記工程(2)で生成したアミノ酸チオヒダントインをアルキル化剤で処理してアルキル化チオヒダントインを形成する各工程を含む。本発明の重要な局面は、ポリペプチド試料のＣ末端にてオキサゾロン部分を選択的に有効に形成することである。これはＣ末端カルボキシル基をアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基から化学的に区別することができる。好ましくは、オキサゾロンを形成した後、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基をアミド化し、さらに配列分析する工程で反応しないようにする。別の局面では、この方法は、例えばＨＰＬＣによってＣ末端配列分析する際に使用するため、アミノ酸チオヒダントイン標準物の調製に使用される。本発明のこれらおよび他の目的と特徴は添付する図面によってさらに詳細に説明される。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｃは、ペプチドのＣ末端でのチオヒダントイン部分の形成を示す。図２Ａ−２Ｅは、本発明によるペプチドのＣ末端配列分析の方法での各工程を示す。図３Ａ−３Ｈは、ラクトグロブリンのＣ末端配列分析からの開裂されアリールアルキル化されたアミノ酸チオヒダントインのクロマトグラムである。図４Ａ−４Ｈは、シトクロームＣのＣ末端配列分析からの開裂されアリールアルキル化されたアミノ酸チオヒダントインのクロマトグラムである。図５Ａ−５Ｅは、RNase のＣ末端配列分析からの開裂されアリールアルキル化されたアミノ酸チオヒダントインのクロマトグラムである。図６Ａ−６ＤはエノラーゼのＣ末端配列分析からの開裂されアリールアルキル化されたアミノ酸チオヒダントインのクロマトグラムである。図７Ａ−７Ｄは、RecAのＣ末端配列分析からの開裂されアリールアルキル化されたアミノ酸チオヒダントインのクロマトグラムである。定義ここに使用される次の語の意味を示す。好ましくは、語「オキサゾロン」は通常、次式で定義されるラジカルを意味する。（式中、Ｒは一般にアミノ酸側鎖である。）「Ｎ保護アミノ酸」はそのアミノ基に結合した保護基を有するアミノ酸またはポリペプチドを意味する。代表的な保護基には、この分野では良く知られている Fmoc、Boc、アシル、ポリペプチジル、および固体支持体に結合するアミン反応性基を含む。Ｎ保護アミノ酸に対する構造式は図１Ａに示され、式中のＲ^aは保護基を示す。側鎖がＲ^bで示されるアミノ酸は、側鎖のアミン、カルボキシレート、スルフヒドリル、またはヒドロキシル基をマスクするように追加の保護基をもつことができる。このような側鎖基はここではペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の「側鎖カルボキシル基」、「側鎖スルフヒドリル基」、および「側鎖ヒドロキシル基」とそれぞれ呼ぶことがある。「ペプチド」および「ポリペプチド」は天然又は変性蛋白質を含む２個以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味する。図１Ａでは、保護アミノ酸は、保護基（Ｒ^a）がアミド結合を介してＣ末端残基に結合した１個以上のアミノ酸残基を含む場合に、ペプチドのＣ末端残基である。ここに使用されるように、語「ポリペプチド」は語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「蛋白質」を含む。「アミノ酸チオヒダントイン」または「アミノ酸ＴＨ」は図１Ｂに示される構造式をもつ化合物のクラスの一員を示し、Ｒ^bはアミノ酸と結合した側鎖であり、数字１ないし５はチオヒダントインに対する通常の番号の付け方を示す。本発明によれば、チオヒダントインはＮ保護アミノ酸から形成され、Ｎ保護遊離アミノ酸またはペプチドのＣ末端アミノ酸を含むことができる。ここで使用されるように、アミノ酸ＴＨは、図１ＢのIIで示されるように、Ｎ保護基を有し、または脱保護することができる、即ち、図１Ｃに示されるように、Ｎ保護基から脱離するかまたは欠いている。「Ｎ保護ペプチジルチオヒダントイン」および「Ｃ末端ペプチジルチオヒダントイン」は、保護基がポリペプチドであるＮ保護チオヒダントインを意味する。「イソチオシアネート試薬」または「チオシアネート試薬」はチオシアネート〔ＳＣＮ〕^-アニオンを与えることができる化学種を示す。「固体支持体」または「固相支持体」は表面官能性を有しまたは表面官能性を有するように誘導化される任意の固体支持体を意味する。好ましくは、表面官能性はペプチドを支持体に結合するようにペプチドのアミノ基と相互に作用することができる。このような結合は共有結合、イオン性相互作用、および／または疎水性相互作用によることができる。例示的な固体支持体は、これに限られないが、 Sepharose（登録商標）、シリカのアミノプロピル誘導体、アミノプロピル−ＣＰＧ（調製有孔ガラス）、アミノエチルセルロース、Tris-aryl^R-NH、ガラスビーズ、ポリアクリルアミド粒子、1,4-フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ガラス、官能化ポリスチレン、ポリエチレン、官能化ＰＶＤＦのような膜支持体等を含む。「ポリペプチドのＣ末端領域において」はポリペプチドのＣ末端付近のポリペプチドに配置されている残基を意味する（Ｃ末端残基の５０残基以内）。発明の詳細な説明本発明によれば、好ましくは蛋白質またはペプチドのＣ末端でのＮ保護アミノ酸は、穏和な塩基の存在で無水酢酸またはその同族体と反応し、２−アルキル− ５（４Ｈ）−オキサゾロンを生成する。次にオキサゾロンは酸性条件下にチオシアネートと反応させて対応するＮ保護アミノ酸チオヒダントインを生成する。好ましくは、チオシアネートは弱い求核性の、またはさらに好ましくは、チオシアネートと比較して非求核性のヒンダードアルキルアミンの塩として提供される。望ましくない副産物が、チオシアネートと比較してオキサゾロン部分の共役体による求核性のアタックによって生成しないように、共役体には求核性がないことが好ましい。好ましくは、無水酢酸または同族体と共に使用される穏和な塩基はまた、オキサゾロンに比べて非求核性であり、約10^-7ないし約10^-12の範囲のＫ_b を有する。さらに好ましくは、穏和な塩基は、窒素原子が直接芳香族環の炭素に結合するか、またはそれ自身が芳香族環の一員であるように、１ないし４個の窒素原子を含む芳香族アミンである。さらに好ましくは、芳香族アミンは求核性を減らすように立体的に阻害する。例示的な穏和な塩基はルチジン（特に２，６− ルチジン）、ピラゾール、ピリジン、非置換イミダゾール、２，６−ジメチルピリジン、プテリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、アニリン、ピロール、アゼピン、メチルピリミジンメチルピロール、メチルピリダジン等を含む。最も好ましくは、２，６−ルチジンが本方法では穏和な塩基として使用される。無水酢酸と同様に種々の無水酢酸同族体を本発明では使用でき、Ｃ末端オキサゾロン部分を生成する。好ましくは、このような同族体は次式の化合物を含む。（式中のＲ₁およびＲ₂の性質は広く変えることができ、選択する溶媒に溶解し、使用される化学品と相溶性があることが強制されるだけであり、例えば、使用する置換基は穏和な塩基に安定で、酸安定性がなければならず（特にトリフルオロ酢酸処理に対して安定）、カルボキシル基との反応で混合無水物の生成を阻害しない必要がある。さらに好ましくは、Ｒ₁およびＲ₂は１ないし６個の炭素原子（すなわちＣ₁-Ｃ₆アルキル）を有するアルキル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₁-Ｃ₆アルケニル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリール、およびハロ置換Ｃ₁-Ｃ₆アルキル、Ｃ₁-Ｃ₆アルケニル、または二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリールからなる群から選択される。好ましくは、ハロ置換置換体はフッ素および塩素からなる群から選択される１−３個のハロ原子を結合している。最も好ましくは、Ｒ₁＝Ｒ₂＝メチルである。活性化反応に使用される溶媒は好ましくは有機または極性の非プロトン性溶媒である。適当な溶媒はアセトニトリル、ジメチルホルムミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン、エーテルを含む溶媒等である。好ましくは、活性化はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で行われる。種々のチオシアネート試薬はチオヒダントインを生成するためにチオシアネートアニオンをオキサゾロン部分に誘導するために使用することができる。このような試薬はアンモニウムチオシアネート、アルキルアンモニウムチオシアネート、メタロチオシアネート（例えば、NaSCN、KSCN、AgSCN等）、シリルイソチオシアネート（例えば、トリメチルシリルイソチオシアネート）、およびピリジニウムチオシアネートを含む。試薬がメタロチオシアネートである場合、反応条件は好ましくはチオシアネートアニオンからの金属イオンの解離を促進するためのクラウンエーテルを含む。好ましくは、チオシアネート試薬はアルキル部分が立体的に阻害されアルキルアンモニウムカチオンの求核性を減らすかまたは除くようなアルキルアンモニウムチオシアネートである。好ましくは、アルキル部分はＣ₃ -Ｃ₆分枝アルキルである。最も好ましくは、テトラブチルアンモニウムチオシアネートはチオシアネート試薬として使用される。さらに以下に詳述するように、さらに求核性の共役塩基を有するチオシアネート試薬はアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシルをアミドに変えるための工程で望ましい。好ましくは、チオヒダントインを形成する方法はＣ末端ペプチド配列分析に使用される。ここでは、Ｎ保護ペプチドのＣ末端アミノ酸残基はチオヒダントインに変換されるＮ保護アミノ酸である。配列分析法は下記に示されるように、自動化または半自動化操作に容易に採用される。本発明の一つの局面によれば、Ｃ末端配列分析法は図２Ａ−２Ｅに示される。固体支持体２２は化学誘導化によって表面に置かれる官能基を含めて、ポリペプチドを結合できる任意の表面官能基を用いて調製することができる。例えば、固体支持体は、例えばジスクシンイミジルスベレートのような二官能性架橋試薬を用いて、結合部位として働くように適当に誘導化されている表面アミン基を有する粒子ビーズであることができるが、ペプチドを固体支持体にカップリングするための種々の方法のいずれかを使用することができる。樹脂およびガラスビーズ上にペプチドを固定化する例は、ここに参考文献として組み込まれる米国特許5, 185,266 に示されており、本発明を実施するために適当である。好ましくは、市販品として入手できる誘導化した、例えばカルボキシ誘導化した、ポリ（ビニリデンジフルオリド）（ＰＶＤＦ）膜を使用して試料ポリペプチド、例えばProSpi n（登録商標）試料調製カートリッジ（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）を固定化する。この方法の第一工程は、図２Ａに示される固定化ペプチドを穏和な塩基の存在で無水酢酸と反応させて、前記のように、オキサゾロンを形成する。オキサゾロンは次に酸性条件下にチオシアネート試薬と反応させ、チオヒダントイン、即ち、図２Ｂに示すように、ペプチジルチオヒダントインを生成する。次にチオヒダントインを、例えば酸性または塩基性の条件下に、末端アミド結合の加水分解開裂によって、ネックストイン残基から開裂させる。好ましくは、開裂はボイドらの米国特許5,185,266 に従って、チオヒダントイン部分がアルキル化された後に行われる。チオシアネート試薬の酸性は、例えば米国特許5,185,266 に開示されているように、蒸気として、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような酸を供給することによって制御される。アルキル化試薬を使用するとき、開裂反応は、図２Ｄに示されるように、チオシアネートアニオンを用いて直接酸性の無水条件下に行うことができる。無水酸性条件下にチオシアネート試薬を用いる反応が、図２Ｅに示されるように、ネックストインＣ末端アミノ酸残基にて新しいＴＨを形成するために有効であるから、チオシアネート試薬の存在での開裂が好ましい。この反応は図２Ｄに示される活性化ペプチジルＮＣＳ中間体によって進行すると考えれる。酸性条件下のメタロチオシアネート／クラウンエーテルコンプレックスを使用して、アルキル化チオヒダントインを開裂し、同時にネックストインペプチジルチオヒダントインを形成する。好ましくは、追加の工程は本発明のＣ末端配列分析法に組み込まれ、セリン、トレオニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、およびリシン残基と関連した特別の問題を扱う。例えば、アスパラギン酸塩残基中のカルボキシル酸素は、アスパラギン酸塩残基のＣ末端側のアミド結合中のカルボニル炭素と反応し、これによってその地点でのポリペプチド主鎖を切断し環状無水物を形成する。配列分析の次のサイクルでは、環状無水物はチオシアネート試薬と反応し、ポリペプチドの真のＣ末端からＴＨ誘導体と共に一緒に配列分析される新しいＣ末端チオヒダントインを形成することができる。ポリペプチド中の複数のアスパラギン酸塩残基の存在は、ペプチド主鎖の内部開裂が各配列分析の工程で複数のアミノ酸チオヒダントインを形成し、これによって大いに分析を面倒にするので、特に問題がある。また、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩残基のチオヒダントインは、一般に検出できず、または、改変されていない形態で側鎖カルボキシレートを使用して、少量だけ検出できる、例えば Stark，Biochemistry，7: 1796-1807（19 68）。アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩残基によるこれらの問題点は、特に活性化／オキサゾロン形成／チオヒダントイン形成／開裂の工程を開始する前に、実質的にこれらの残基中のカルボキシレート側鎖をアミド化して減らすことができる。このようなアミド化は、好ましくは、上記のように、穏和な塩基の存在で無水酢酸にペプチド試料を曝し、次にピペリジンチオシアネートのような、アミド化剤に曝して行われる。好ましくは、アミド化剤は中性または塩基性の条件下に供給されアミド化を容易にする。好ましくは、側鎖カルボキシル基はピペリジンアミドに変換される。またセリンおよびトレオニン残基はＣ末端配列分析には問題があるが、多分これら残基の側鎖ヒドロキシル基による干渉のためであろう。従って、このような問題を少なくするために、側鎖ヒドロキシル基を化学的に改変することが望ましい。セリンとトレオニン残基の脱水は、例えば、Agarwal and Khorana，J．Am．Ch em．Soc.，94: 3578（1972）によって開示されているように、ペプチドをフェニルイソシアネート（PhNCO）で処理して行うことができる。PhNCO はセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基と反応して、ウレタン誘導体を生成することができる。ウレタン誘導体を塩基で処理すると、PhNCO₂H（PhNH₂およびCO₂）を除去し、セリンまたはトレオニンの脱水同族体を形成する。さらにフェニルイソシアネート処理の利点は、リシン残基のε−アミノ基がフェニルウレア基に変換されることである。この誘導反応は従って単一の改変誘導体としてリシンの検出を高める。好ましくは、セリンとトレオニンの側鎖ヒドロキシルおよびリシンの側鎖アミンは、配列分析のサイクルを開始する前にアセチル化する。以下にさらに詳細に述べるように、これは無水酢酸で簡単に行われる。本発明の方法を使用して、自動化シーケンサー、例えば、アプライドバイオシステムズシーケンサーモデル４７７Ａで、室温にて５分ないし３０分で蛋白質またはペプチドを昔通に活性化することができるが、続く工程の反応温度と一致させて、反応はまた例えば、５５℃で有効に行うことができる。上記の配列分析技術はペプチドの自動化Ｎ末端配列分析のために常用される装置を使用して容易に自動化される。Ｃ末端からのペプチドを自動的に配列分析するための装置の１例は反応容器中に含まれる表面固定化ペプチドを使用し、反応容器には新しい溶媒と試薬を添加し、反応混合物と洗浄溶媒は除去する。脱離したアミノ酸チオヒダントインは支持体から抽出され、分析用オンラインＨＰＬＣに移される。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明を制限するものではない。実施例Ｃ末端カルボキシル基の無水酢酸活性化テスト蛋白質のＣ末端配列分析表１は本発明方法に従ってＣ末端から配列分析した蛋白質試料および出発分量を示している。試料を非共有的に結合し、製造者のプロトコルを使用してProSpin（非官能化ポリビニリデンジフルオライド膜）試料カートリッジ（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）を分離し、次にアプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ蛋白質シーケンサーを使用してＣ末端から配列分析をした。配列分析のプロトコルは、下記の変更を除いてボイドらの Anal．Biochemistry，206: 344-352（1992）および米国特許 5,185,266に記載されたものと実質的に同じものに従った。配列分析のプロトコルは表IIIに示される工程からなり、これはＣ末端領域内にアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基（ピペリジンチオシアネートでアミド化されている）を有する蛋白質およびセリンおよび／またはトレオニン残基（アセチル化されている）を有する蛋白質に適している。表IIはモデル４７７Ａシーケンサーのための試薬貯蔵の割り当てをまとめたものである。次の反応工程は55℃で行った。試料をシーケンサーに装填した後、Ｘ１試薬を膜を完全に湿らすに十分な分量でProSpin 膜に供給した。300秒休止後に、Ｘ１を供給し、さらに300秒休止した。アセトニトリル中５％Ｒ１試薬部分を膜に供給し、60秒までトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）蒸気に曝し、次に10分間休止した。この工程を繰り返して、各試薬を供給する間にアセトニトリルで膜を洗浄した。アスバラギン酸塩および／またはグルタミン酸塩側鎮のカルボキシル基のアミド化が望ましい場合には、ピペチジルＴＨ試薬Ｘ１およびＳ２（ピペリジン−ＨＳＣＮ）の生成後にアミド化工程を含ませた。300秒の休止後、Ｘ１とＳ２を再び供給する。塩基性条件のままにする、即ちＴＦＡを供給しない。５分の休止後、膜をアセトニトリルで洗浄した。最後に、セリンおよびトレオニンのヒドロキシル側鎖をアセチル化するため、10％ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を供給し、900秒の休止まで試薬Ｘ１を続けた。（必要な場合は配列分析中にアセチル化を反復することができる）。各配列分析サイクルで、Ｃ末端チオヒダントインを米国特許5,185,266 で教示されているようにアルキル化剤と反応させた。テトラブチルアンモニウムチオシアネートおよびＴＦＡ蒸気を使用して残りの蛋白質からチオヒダントイン付加物を開裂する。開裂したチオヒダントイン付加物を単離し、米国特許5,185,266 に教示されたように検出した。図３Ａおよび４Ａはアルキルチオヒダントインアミノ酸標準物のクロマトグラムである。図３Ｂから７Ｄでは、開裂したアルキルチオヒダントインに相当するピークは結合したアミノ酸の単一文字のシンボルで示している。“(Ｃ)₂”はシステイン残基を示す。“Ｅ^*”および“Ｄ^*”はグルタミン酸とアスパラギン酸のピペリジンアミドを、それぞれ示す。“デヒドロ−Ｔ”は脱水トレオニンを示す。図６Ｂでは、標識ピークはアセチル化リジンチオヒダントインである。本発明は特定の方法および実施例を参照して記載したが、本発明から逸脱することなく種々の変更および改変を行うことができることは高く評価されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボッジニ，メリリサアメリカ合衆国カリフォルニア州 94010 バーリンゲーム，カミノリアル, 80イ−１アパートメントジィ. (72)発明者ロウドン，ジイ．，マルクアメリカ合衆国インジアナ州 47906− 1705 ウェストラファイェット，ハッピィハロウロード，2140

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドのＣ末端にてオキサゾロン部分を形成するように塩基性の条件下にポリペプチドを無水物で処理し、該無水物は次式で定義され：（式中、Ｒ₁およびＲ₂はＣ₁-Ｃ₆アルキル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₁-Ｃ₆アルケニル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリール、およびハロ置換Ｃ₁-Ｃ₆アルキル、Ｃ₁-Ｃ₆アルケニル、または二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリールからなる群から選択される）；そしてオキサゾロン部分がチオヒダントイン部分に変換されるように酸性の条件下にポリペプチドをチオシアネートで処理する、各工程からなるポリペプチドのＣ末端でチオヒダントイン部分を形成する方法。２．前記塩基性条件が約10^-7と約10^-12の範囲のＫ_bを有する有機塩基で維持される請求項１記載の方法。３．前記有機塩基が各窒素原子が直接芳香族環の炭素に結合しているかまたは芳香族環の一員であるような１ないし４個の窒素原子を含む芳香族アミンである請求項２記載の方法。４．前記有機塩基がルチジン、ピラゾール、ピリジン、イミダゾール、２，６− ジメチルピリジン、プテリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、アニリン、ピロール、アゼピン、メチルピリミジンメチルピロール、およびメチルピリダジンからなる群から選択される請求項３記載の方法。５．前記有機塩基が２，６−ルチジンであり、前記無水物が無水酢酸である請求項４記載の方法。６．チオシアネートでの前記処理工程が前記ポリペプチドをテトラブチルアンモニウムチオシアネートで処理することを含む請求項５記載の方法。７．(a) ポリペプチドのＣ末端にてオキサゾロン部分を形成するように塩基性の条件下にポリペプチドを無水物で処理し、該無水物は次式で定義され：（式中、Ｒ₁およびＲ₂はＣ₁-Ｃ₆アルキル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₁-Ｃ₆アルケニル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇−Ｃ₁₃アルキルアリール、およびハロ置換Ｃ₁-Ｃ₆アルキル、Ｃ₁-Ｃ₆アルケニル、または二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリールからなる群から選択され； (b) 酸性条件下にチオシアネートでポリペプチドのＣ末端にてオキサゾロン部分を処理してアミノ酸チオヒダントインを形成し； (c) ポリペプチドからアミノ酸チオヒダントインを開裂し； (d) 開裂したアミノ酸チオヒダントインを同定し；そして (e) ポリペプチドのＣ末端領域のアミノ酸が決定されるまで工程(a)から(d)を繰り返す、各工程からなるポリペプチドのＣ末端領域の配列アミノ酸を決定する方法。８．前記ポリペプチドが側鎖カルボキシル基を含み、該方法がさらに、塩基性条件下にポリペプチドを無水酢酸で処理して側鎖カルボキシル基と無水酢酸との間に混合無水物を形成し；そして非酸性条件下に混合無水物をピペリジンチオシアネートで処理してピペリジンアミドを形成する、各工程からなる、請求項７記載の方法。９．前記ポリペプチドが側鎖ヒドロキシル基を含み、該方法がさらに側鎖ヒドロキシル基をアセチル化する工程からなる、請求項７記載の方法。１０．前記開裂工程が前記アミノ酸チオヒダントインのアルキル化を含む請求項７記載の方法。１１．前記無水物が無水酢酸であり、前記塩基性条件が約10^-7と約10^-12の範囲のＫ_bを有する有機塩基で維持される請求項７記載の方法。１２．前記有機塩基がルチジンである請求項１１記載の方法。１３．(a) ポリペプチドのＣ末端にてオキサゾロン部分を形成するように塩基性の条件下にポリペプチドを無水物で処理し、該無水物は次式で定義され：（式中、Ｒ₁およびＲ₂はＣ₁-Ｃ₆アルキル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₁-Ｃ₆アルケニル、二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリール、およびハロ置換Ｃ₁-Ｃ₆アルキル、Ｃ₁-Ｃ₆アルケニル、または二重結合の炭素が二重結合の酸素と共役しないことを条件とするＣ₇-Ｃ₁₃アルキルアリールからなる群から選択され； (b) 酸性条件下にチオシアネートでオキサゾロン部分を処理してアミノ酸チオヒダントインを形成し； (c) ポリペプチドからアミノ酸チオヒダントインを開裂し；そして (d) 開裂したアミノ酸チオヒダントインを同定し、これによってポリペプチドのＣ末端アミノ酸を同定する、各工程からなるポリペプチドのＣ末端アミノ酸を同定する方法。１４．前記ポリペプチドが側鎖カルボキシル基を含み、該方法がさらに、塩基性条件下にポリペプチドを無水酢酸で処理して側鎖カルボキシル基と無水酢酸との間に混合無水物を形成し；そして非酸性条件下に混合無水物をピペリジンチオシアネートで処理してピペリジンアミドを形成する、各工程からなる、請求項１３記載の方法。１５．前記ポリペプチドが側鎖ヒドロキシル基を含み、該方法がさらに側鎖ヒドロキシル基をアセチル化する工程からなる、請求項１３記載の方法。１６．前記開裂工程が前記アミノ酸チオヒダントインのアルキル化を含む請求項１３記載の方法。１７．前記無水物が無水酢酸であり、前記塩基性条件が約10^-7と約10^-12の範囲のＫ_bを有する有機塩基で維持される請求項１３記載の方法。１８．前記有機塩基がルチジンである請求項１７記載の方法。