JP2005139163A - タンパク質又はペプチドのc末端を修飾する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】C末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのC末端において、分子内でオキサゾロン環を形成し、前記オキサゾロン環を開環することによって、前記C末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、タンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。好ましくは、前記オキサゾロン環を、求核基を有する化合物を反応させて開環することによって、前記C末端が前記求核基を有する化合物で修飾されたタンパク質又はペプチドを得るか、又は、前記オキサゾロン環を、活性エステル化剤を反応させて開環することによって活性エステルに変換し、その後、求核基を有する化合物を反応させることによって、前記C末端が前記求核基を有する化合物で修飾されたタンパク質又はペプチドを得る。
【選択図】図1
Description
(1)C末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのC末端において、分子内でオキサゾロン環を形成し、前記オキサゾロン環を開環することによって、前記C末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、タンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(3)前記求核基がアミノ基、水酸基及びチオール基から選ばれる、(2)に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(5)前記オキサゾロン環の形成を、無水酢酸を作用させることによって行う、(1)〜(4)のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(6)前記求核基を有する化合物を、塩基の存在下で反応させる、(2)〜(5)のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(8)前記求核基がアミノ基、水酸基及びチオール基から選ばれる、(7)に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(10)前記酸無水物が無水酢酸である、(9)に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(11)前記カルボン酸がギ酸である、(9)又は(10)に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
(12)前記活性エステル化剤がペンタフルオロフェノール、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェノール、p−ニトロフェノール、N−ヒドロキシコハク酸イミド及びN−ヒドロキシベンズトリアゾールから選ばれる、(7)〜(11)のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
本発明においては、まず、C末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのC末端残基において分子内でオキサゾロン環を形成する反応を行う。この反応の一例を下記式(I)に示す。式(I)においては、無水酢酸を作用させてオキサゾロン環形成を行っている。
求核基を有する化合物は、例えばペプチドの1〜100当量用いることができ、溶液又は懸濁液で用いることができる。溶液又は懸濁液に用いられる溶媒又は懸濁用液としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドンなどを用いることができる。これらは単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらの有機溶媒を用いる場合、求核基を有する化合物が溶液又は懸濁液全体に対して0.01〜50重量%となるように用いることができる。
まず、上述のようなカルボン酸は大多数のタンパク質・ペプチドを容易に溶解させることができるため、本発明の適用範囲が飛躍的に広げられる。
次に、上記酸−酸無水物混合物として用いることによって、酸無水物を単独で用いる第1形態の方法よりも低温でオキサゾロンが生成するため、上記副反応の多くを抑制することができる。
本実施例では、ペプチド Z-Gly-Gly-Phe のC末端にシステイン酸を導入した。このペプチドは、N末端がZで表されるベンジルオキシカルボニル基で保護されている。
上記ペプチド41mg(0.1mmol)に無水酢酸0.5mlを加え、115℃で15分間反応させた。反応後、無水酢酸を減圧留去し、さらにトルエンを加えて2回減圧留去した。得られた生成物に、システイン酸17mgをN−メチルモルホリン0.5mlに懸濁したものを加え、一晩反応させた。反応後、過剰のN−メチルモルホリンを減圧留去し、その後、50重量%アセトニトリル水溶液1mlを加え、3時間撹拌した。得られた生成物をMALDI-TOF MSで確認を行った。図1に、このとき得られたスペクトルを示す。図1においては、横軸に質量/電荷(Mass/Charge)、縦軸にイオンピークの相対強度(%Int.)を示す。図1によると、負イオン検出モードで563.08(m/z)が検出されており、従って、目的物が生成していることが確認された。
本実施例では、ペプチドZ-Gly-Gly-Phe のC末端にアルギニンメチルエステルを導入した。
上記ペプチド41mg(100μmol)に無水酢酸0.5mlを加え、115℃で15分間反応させた。反応後、無水酢酸を減圧留去し、さらにトルエンを加えて2回減圧留去した。得られた生成物に、アルギニンメチルエステル200μmolをN−メチルモルホリン0.5mlに懸濁したものを加え、一晩反応させた。反応後、過剰のN−メチルモルホリンを減圧留去し、その後、50重量%アセトニトリル水溶液1mlを加え、3時間撹拌した。得られた生成物をMALDI-TOF MSで確認を行った。図2に、このとき得られたスペクトルを示す。図2においては、横軸に質量/電荷(Mass/Charge)、縦軸にイオンピークの相対強度(%Int.)を示す。図2によると、正イオン検出モードで584.27(m/z)が検出されており、従って、目的物が生成していることが確認された。
ロイシン−エンケファリン(Leucine-enkephalin)のC末端を活性エステル化し、その後、アルギニンメチルエステルとのカップリングを行った。
Claims (12)
- C末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのC末端において、分子内でオキサゾロン環を形成し、前記オキサゾロン環を開環することによって、前記C末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、タンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記オキサゾロン環を、求核基を有する化合物を反応させて開環することによって、前記C末端が前記求核基を有する化合物で修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、請求項1に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記求核基がアミノ基、水酸基及びチオール基から選ばれる、請求項2に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記オキサゾロン環の形成を、酸無水物を作用させることによって行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記オキサゾロン環の形成を、無水酢酸を作用させることによって行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記求核基を有する化合物を、塩基の存在下で反応させる、請求項2〜5のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記オキサゾロン環を、活性エステル化剤を反応させて開環することによって活性エステルに変換し、その後、求核基を有する化合物を反応させることによって、前記C末端が前記求核基を有する化合物で修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、請求項1に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記求核基がアミノ基、水酸基及びチオール基から選ばれる、請求項7に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記オキサゾロン環の形成を、酸無水物とカルボン酸との混合物を作用させることによって行う、請求項1、7又は8に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記酸無水物が無水酢酸である、請求項9に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記カルボン酸がギ酸である、請求項9又は10に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
- 前記活性エステル化剤がペンタフルオロフェノール、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェノール、p−ニトロフェノール、N−ヒドロキシコハク酸イミド及びN−ヒドロキシベンズトリアゾールから選ばれる、請求項7〜11のいずれか1項に記載のタンパク質又はペプチドのC末端を修飾する方法。
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