JPH10293130A

JPH10293130A - タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法

Info

Publication number: JPH10293130A
Application number: JP9091215A
Authority: JP
Inventors: Tatsuaki Ataka; 龍明安宅; Toshihiko Sakuhara; 寿彦作原; Toyoaki Uchida; 豊明内田; Akira Tsugita; 晧次田; Keiji Takamoto; 圭司高本
Original assignee: Seiko Instruments Inc
Current assignee: Seiko Instruments Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 1998-11-04
Anticipated expiration: 2017-04-09
Also published as: JP3124507B2; US6046053A

Abstract

(57)【要約】【課題】酵素を用いることなく、タンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る。【解決手段】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させカルボキシ末端をオキサゾロンとする工程を
含むタンパク質またはペプチドのカルボキシ末端アミノ
酸を遊離させる工程と、得られたアミノ酸またはアミノ
酸誘導体を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順
をくり返す方法を実施した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質あるい
はペプチドの構造解析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、タンパク質あるいはペプチドのカ
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図３に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを反応させ、反応液を経時
的に１部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で
分析して遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられ
てきた（日本生化学会編、生化学実験講座第１巻、タン
パク質の化学II、203-211ページ、1976年発行）。ま
た、その反応液を質量分析装置にかけてＣ末端側のアミ
ノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質量を測定
する方法も報告されている(A. Tsugita, R. van den Br
oek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19(1982))。さ
らに、化学的な方法の１例として、図４に示すようにＣ
末端を無水酢酸で活性化し、トリメチルシリルイソチオ
シアネートを結合させ、塩酸で切断するという一連の操
作を繰り返すことを利用した配列分析法も報告されてい
る(D. H. Hawke, H-. W. Lahm , J. E. Shively, C. W.
Todd, Anal. Biochem. 166, 298(1987))。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来のカルボキシペプ
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、さらに他のタンパク質分解酵素の
混在があることから求めている以外のペプチド結合の切
断が起き、正確な分析が困難になることがあった。また
この方法では酵素が自己消化性を持つことおよび酵素の
精製が不十分の場合があること、といった理由によって
によってアミノ酸およびペプチドが混入し汚染となるた
め微量分析には適していない。

【０００４】また、他の化学的な方法等は十分には実用
化されていない。そこで本発明は、酵素を用いることな
く、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ
酸配列を決定する化学的方法を提供しようとするもので
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、タンパク質あるいはペプチドに酸無水物を
作用させ、カルボキシ末端をオキサゾロンとする工程を
含むタンパク質またはペプチドのカルボキシ末端アミノ
酸を遊離させる工程と、得られたアミノ酸またはアミノ
酸誘導体を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順
を繰り返し実行した。これにより、酵素を用いることな
く、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ
酸配列を決定することが可能になった。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の一つの実施手順として、
下記第１工程と第２工程とから構成される操作と、生成
したアミノ酸を分離し同定する操作との組み合わせを繰
り返した。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ末端を保護し、Ｃ
末端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生成させる。

【０００７】第２工程生成したカルボキシ末端がオキサゾロンとなったタンパ
ク質あるいはペプチドに酸とアルコールを作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸を遊離させる。当該実施手順にお
ける別の一例として、上記の欠点を克服しＣ末端からの
アミノ酸の配列分析を実行するために、上記第１工程に
おいて酢酸を添加し、第１工程から第２工程までの各工
程から構成される一連の操作と、生成したアミノ酸を分
離し同定する操作との組み合わせを、繰り返し実施し
た。

【０００８】本発明の別の実施手順として、下記第１工
程から第３工程までの各工程から構成される一連の操作
と、生成したアミノ酸を分離し同定する操作との組み合
わせを繰り返した。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ基を保護し、Ｃ末
端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生成させる。

【０００９】第２工程アルコールを作用させ、第１工程の反応生成物に含まれ
るオキサゾロンに、アルコリシス（エステル化）を生起
させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させる。第３工程アミンを作用させ、第２工程の反応生成物に含まれるエ
ステルを加水分解反応する。

【００１０】当該実施手順における別の一例として、上
記第１工程において酢酸を添加し、第１工程から第３工
程までの各工程から構成される一連の操作と、生成した
アミノ酸を分離し同定する操作との組み合わせを、繰り
返し実施した。当該実施手順におけるさらに別の一例と
して、アルコールを作用させる第２工程を酸存在下で実
施し、第１工程から第３工程までの各工程から構成され
る一連の操作と、生成したアミノ酸を分離し同定する操
作との組み合わせを、繰り返し実施した。

【００１１】本発明のさらに別の実施手順として、下記
第１工程から第５工程から構成される一連の操作と、生
成したアミノ酸、あるいはアミノ酸誘導体を分離し同定
する操作との組み合わせを、繰り返し実施した。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ末端を保護し、Ｃ
末端のアミノ酸残基にオキサゾロンあるいは分子内酸無
水物（アスパラギン酸の場合）を生成させる。

【００１２】第２工程酸存在下でアルコールを作用させ、第１工程の反応生成
物に含まれるオキサゾロンに、アルコリシス（エステル
化）を生起させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させる
か、あるいは、分子内酸無水物をアルコリシスにより開
環させる。第３工程酸無水物を作用させ、第２工程の反応生成物に含まれ
る、Ｃ末端がエステル化されていないタンパク質あるい
はペプチドのＣ末端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生
成させる。

【００１３】第４工程酸存在下でアルコールで作用させ、第３工程の反応生成
物に含まれるオキサゾロンに、アルコリシス（エステル
化）を生起させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させ
る。第５工程アミンを作用させ、第４工程の反応生成物に含まれるエ
ステルを加水分解反応する。

【００１４】当該実施手順における別の一例として、上
記第１工程における酸無水物に代えて、ハロゲン化蟻酸
のエステルを用い、第１工程から第５工程から構成され
る一連の操作と、生成したアミノ酸、あるいはアミノ酸
誘導体を分離し同定する操作との組み合わせを、繰り返
し実施した。

【００１５】当該実施手順におけるさらに別の一例とし
て、アルコールを作用させる第２工程および第４工程を
酸存在下で実施し、第１工程から第５工程までの各工程
から構成される一連の操作と、生成したアミノ酸、ある
いはアミノ酸誘導体を分離し同定する操作との組み合わ
せを、繰り返し実施した。

【００１６】以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明
する。（実施例１）図１は本発明を示す工程図の一例である。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、一般式、ＣＨ₃−（Ｃ
Ｈ₂）m−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ₂）n−ＣＨ₃（ｍ、ｎ
は０以上の整数）で表される有機酸の無水物、を作用さ
せる。ここで、アミノ基が修飾されＣ末端アミノ酸がオ
キサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドが得ら
れる。

【００１７】第２工程次に、このアミノ基が修飾されＣ末端アミノ酸がオキサ
ゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドに酸とアル
コールを作用させる。ここで、アミノ基が修飾されＣ末
端のアミノ酸を１残基失ったタンパク質あるいはペプチ
ドと元のＣ末端アミノ酸との混合物が得られる。

【００１８】ここで得られたアミノ酸を分離し同定する
ことによって、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端の
アミノ酸を決定することが出来る。以下、アミノ基が修
飾されＣ末端のアミノ酸を１残基失ったタンパク質ある
いはペプチドに、第１工程および第２工程の操作と、得
られたアミノ酸を分離し同定する操作とを、繰り返し実
施することによって、タンパク質あるいはペプチドのＣ
末端からのアミノ酸配列を決定することができる。

【００１９】（実施例２）ここでは本発明の、タンパク
質あるいはペプチドに、第１工程および第２工程の操作
と、第２工程を実施した後生成した混合物からアミノ酸
を分離し同定する操作とを、繰り返し実施することによ
ってタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ
酸配列を決定する操作手順の一例を示す。

【００２０】図２は本発明の実験手順を示す反応式の一
例である。第１工程試料に、無水酢酸を作用させる。反応条件は下記の通り
である。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸
を１％になるように加えたもの。）反応温度６０℃ 反応時間３０分間この反応後減圧乾固し、用いた試薬と溶媒とを除去す
る。

【００２１】第２工程得られた試料に、ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰ
Ａ）とメタノールを作用させる。反応条件は下記の通り
である。反応条件ＰＦＰＡ濃度５０％（メタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間この条件下においては、ＰＦＰＡとメタノールとが反応
して、エステルであるペンタフルオロプロピオン酸メチ
ルが生成する。さらに、減圧乾固し、用いた試薬と溶媒
とを除去する。

【００２２】第２工程を実施後、得られた試料からアミ
ノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。

【００２３】以下、アミノ基が修飾されＣ末端のアミノ
酸を１残基失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１
工程および第２工程の手順と、第２工程を実施して得ら
れたアミノ酸を分離し同定する操作との組み合わせを、
繰り返し実施することによって、タンパク質あるいはペ
プチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定することがで
きる。

【００２４】（実施例３）ここでは本発明を説明するた
めに用いたＨＰＬＣ分析の条件と、ＨＰＬＣによる標準
化合物の分析結果を示す。ＨＰＬＣ分析の条件は下記の
通りである。

【００２５】

【表１】

【００２６】本条件を用いて分析した標準化合物は下記
の通りである。分析結果をそれぞれ下記の番号の図に示
した。図５にアラニルトリプトファン（Ａｌａ−Ｔｒ
ｐ）を示す。図６にＮ−アセチルアラニルトリプトファ
ン（Ａｃ―Ａｌａ−Ｔｒｐ）を示す。図７にＮ−アセチ
ルアラニルトリプトファニルメチオニルアルギニルフェ
ニルアラニン（Ａｃ−Ａｌａ−Ｔｒｐ− Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ）を示す。図８にＮ−アセチルアラニルトリ
プトファニルメチオニルアルギニルフェニルアラニルア
ラニン（Ａｃ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ）を示す。

【００２７】図７において、Ｎ−アセチルアラニルト
リプトファニルメチオニルアルギニルフェニルアラニン
のピークが２個観察されている。これらは互いに異性体
である。

【００２８】（実施例４）ここでは第１工程の操作にお
ける条件下での、オキサゾロンの生成を示す。試料とし
て、アラニルトリプトファン（Ａｌａ−Ｔｒｐ）、を用
いた。オキサゾロンは水の作用によって容易に開裂する
反応を利用した。検出には高速液体クロマトグラフ（Ｈ
ＰＬＣ）分析を用いた。第１工程の手順に従って得られ
た試料に水を作用させて得た反応生成物をＨＰＬＣで分
析した結果を第９図に示す。ＨＰＬＣ分析の条件は実施
例３に示した通りである。

【００２９】ＨＰＬＣ分析のための試料調製手順は下記
の通りである。試料を減圧乾固する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解する。図７との比較からわかるように、図９においてＮ−ア
セチルアラニルトリプトファン（Ａｃ―Ａｌａ−Ｔｒ
ｐ）６、が検出されており、第１工程においてオキサゾ
ロンが生成したことがわかる。ここで、試料として用い
たアラニルトリプトファンは検出されなかった。

【００３０】（実施例５）ここでは第２工程の操作にお
ける条件下での、オキサゾロン環の開裂を示す。試料と
して、Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオ
ニルアルギニルフェニルアラニルアラニン（Ａｃ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ）を用い
た。検出には、実施例４と同条件のＨＰＬＣ分析を用い
た。ＨＰＬＣ分析のための試料調製手順は実施例４に記
した通りである。

【００３１】実施例２に示した第２工程の操作を行って
得られた反応生成物を分析した結果を図１０に示す。図
７との比較からわかるように、図１０において、試料
として用いたＮ−アセチルアラニルトリプトファニルメ
チオニルアルギニルフェニルアラニルアラニン（Ａｃ−
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ）の
Ｃ末端アミノ酸であったアラニンを失った生成物、Ｎ−
アセチルアラニルトリプトファニルメチオニルアルギニ
ルフェニルアラニン（Ａｃ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ｐｈｅ）、符号７および符号８、が検出されて
いる。これによって、第２工程の操作における条件下で
オキサゾロン環の開裂が起き、Ｃ末端アミノ酸が遊離
し、Ｃ末端アミノ酸を失ったペプチド（アミノ末端がア
セチル化されたもの）が生成したことがわかる。このＣ
末端アミノ酸を同定することによって、ペプチドのＣ末
端が決定される。

【００３２】以降、このＣ末端アミノ酸を失ったペプチ
ド（アミノ末端がアセチル化されたもの）に上記第１工
程と第２工程とから構成される操作と、生成したアミノ
酸を分離し同定する操作との組み合わせを、繰り返し実
施することによって、用いたタンパク質あるいはペプチ
ドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定することができ
る。

【００３３】以上実施例１から実施例５において述べて
きた結果をまとめると次のようになる。本発明において
は、Ｃ末端からのアミノ酸の配列分析を実行するため
に、下記第１工程と第２工程とから構成される操作と、
生成したアミノ酸を分離し同定する操作との組み合わせ
を、繰り返し実施した。

【００３４】第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ末端を保護し、Ｃ
末端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生成させる。第２工程生成したカルボキシ末端がオキサゾロンとなったタンパ
ク質あるいはペプチドに酸とアルコールを作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸を遊離させる。

【００３５】以下、本発明における別の実施手順を詳細
に説明する。（実施例６）図１１は本発明を示す工程図の一例であ
る。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、一般式、ＣＨ₃−（Ｃ
Ｈ₂）m−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ₂）n−ＣＨ₃（ｍ、ｎ
は０以上の整数）で表される有機酸の無水物、を作用さ
せる。ここで、アミノ基が修飾されＣ末端アミノ酸がオ
キサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドが得ら
れる。

【００３６】第２工程次に、このアミノ基が修飾されＣ末端アミノ酸がオキサ
ゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドに、アルコ
ールを酸存在下で作用させる。ここで、アミノ基が修飾
されＣ末端のアミノ酸を失い新たに出現したＣ末端のア
ミノ酸のカルボキシル基がエステルとなったタンパク質
あるいはペプチドと元のＣ末端アミノ酸との混合物が得
られる。

【００３７】第３工程さらに、ここでアミノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を
失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基
がエステルとなったタンパク質あるいはペプチドとアミ
ノ酸との混合物に、例えば、一般式、ＮＲ1Ｒ2Ｒ3、で
表されるアミンの水溶液を作用させる。ここで、アミノ
基が修飾されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質ある
いはペプチドとアミノ酸との混合物が得られる。

【００３８】上記第１工程から第３工程において得られ
たアミノ酸を分離し同定することによって、タンパク質
あるいはペプチドのＣ末端のアミノ酸を決定することが
出来る。以下、アミノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を
失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１工程から第
３工程の一連の操作と、得られたアミノ酸を分離し同定
する操作とを、繰り返し実施することによって、タンパ
ク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決
定することができる。

【００３９】（実施例７）ここでは本発明の、タンパク
質あるいはペプチドに、第１工程から第３工程の一連の
操作と、第２工程を実施した後生成した混合物からアミ
ノ酸を分離し同定する操作とを、繰り返し実施すること
によってタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのア
ミノ酸配列を決定する操作手順の一例を示す。

【００４０】図１２は本発明の実験手順を示す反応式の
一例である。第１工程試料に、無水酢酸を作用させる。反応条件の一例は下記
の通りである。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を
１％になるように加えたもの。）反応温度６０℃ 反応時間３０分間この反応後減圧乾固し、用いた試薬と溶媒とを除去す
る。

【００４１】第２工程こうして得られた試料に、ペンタフルオロプロピオン酸
（ＣＦ３−ＣＦ２−ＣＯＯＨ：以降ＰＦＰＡと略称す
る。）存在下でメタノールを作用させる。反応条件の一
例は下記の通りである。反応条件ＰＦＰＡ濃度１０％（メタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間この反応後減圧乾固し、用いた試薬と溶媒とを除去す
る。

【００４２】第３工程こうして得られた試料に、２−ジメチルアミノエタノー
ル（以降ＤＭＡＥと略称する。）を作用させる。反応条
件は下記の通りである。反応条件ＤＭＡＥ濃度１０％（水溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間この一連の操作において、第２工程を実施後、得られた
試料からアミノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。

【００４３】以下、アミノ基が修飾されＣ末端のアミノ
酸を失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１工程か
ら第３工程の一連の手順と、第２工程を実施して得られ
たアミノ酸を分離し同定する操作との組み合わせを、繰
り返し実施することによって、タンパク質あるいはペプ
チドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定することができ
る。

【００４４】（実施例８）ここでは本発明の、タンパク
質あるいはペプチドに、第１工程から第３工程の一連の
操作と、第３工程を実施した後生成した混合物からアミ
ノ酸を分離し同定する操作との組み合わせを、繰り返し
実施することによってタンパク質あるいはペプチドのＣ
末端からのアミノ酸配列を決定する操作手順の一例を示
す。

【００４５】第１工程から第３工程までの一連の操作手
順は実施例７に記述したものと同一である。この一連の
操作において、第３工程を実施後、得られた試料からア
ミノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。以下、アミ
ノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あ
るいはペプチドに、第１工程から第３工程の一連の手順
と、第３工程を実施して得られたアミノ酸を分離し同定
する操作とを、繰り返し実施することによって、タンパ
ク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決
定することができる。

【００４６】（実施例９）ここでは本発明を説明するた
めに用いたＨＰＬＣ分析の条件と、ＨＰＬＣによる標準
化合物の分析結果を示す。ＨＰＬＣ分析の条件は下記の
通りである。

【００４７】

【表２】

【００４８】本条件を用いて分析した標準化合物は下記
の通りである。分析結果をそれぞれ下記の番号の図に示
した。図１３にトリプトファン（Ｔｒｐ）を示す。図１
４にアラニルトリプトファン（Ａｌａ−Ｔｒｐ）を示
す。図１５にＮ−アセチルアラニルトリプトファン（Ａ
ｃ―Ａｌａ−Ｔｒｐ）を示す。図１６にＮ−アセチルア
ラニルトリプトファンのエチルエステル（Ａｃ―Ａｌａ
−Ｔｒｐ−ＯＥｔ）を示す。

【００４９】（実施例１０）ここでは第１工程の操作に
おける条件下での、オキサゾロンの生成を示す。試料と
して、アラニルトリプトファン（Ａｌａ−Ｔｒｐ）、を
用いた。オキサゾロンは水の作用によって容易に開裂
する反応を利用した。検出には高速液体クロマトグラフ
（ＨＰＬＣ）分析を用いた。第１工程の手順に従って得
られた試料に水を作用させて得た反応生成物をＨＰＬＣ
で分析した結果を第９図に示す。ＨＰＬＣ分析の条件は
実施例９に示した通りである。

【００５０】ＨＰＬＣ分析のための試料調製手順は下記
の通りである。試料を減圧乾固する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解する。図１５との比較からわかるように、図１７においてＮ
−アセチルアラニルトリプトファン（Ａｃ―Ａｌａ−Ｔ
ｒｐ）、符号１３、が検出されており、第１工程におい
てオキサゾロンが生成したことがわかる。ここで、試料
として用いたアラニルトリプトファンは検出されなかっ
た。

【００５１】（実施例１１）ここでは第２工程の操作に
おける条件下での、オキサゾロン環の開裂を示す。試料
として、実施例１０と同様に、アラニルトリプトファン
を用いた。検出には、実施例９と同条件のＨＰＬＣ分析
を用いた。ＨＰＬＣ分析のための試料調製手順は実施例
５に記した通りである。

【００５２】実施例７に示した第１工程と第２工程の操
作を行って得られた反応生成物を分析した結果を第１０
図に示す。図１３との比較からわかるように、図１８に
おいてトリプトファン、符号１４、が検出されており、
第２工程の操作における条件下でオキサゾロン環の開裂
が起きカルボキシ末端アミノ酸が遊離したことがわか
る。

【００５３】（実施例１２）実施例１１において、オキ
サゾロンにＰＦＰＡのアルコール溶液を作用させカルボ
キシ末端アミノ酸を遊離させた。このアルコールの作用
（アルコリシス）は、アミノ酸を遊離すると同時に新た
に生じるＣ末端アミノ酸のカルボキシル基をエステル化
する。Ｃ末端からのアミノ酸配列分析を引き続き実行す
るためには、このエステルを加水分解してカルボキシル
基を得る必要がある。

【００５４】ここでは第３工程の操作における条件下で
の、エステルの加水分解を示す。試料として、Ｎ−ア
セチルアラニルトリプトファンのエチルエステル（Ａｃ
―Ａｌａ−Ｔｒｐ−ＯＥｔ）を用いた。検出には、実施
例９と同条件のＨＰＬＣ分析を用いた。ＨＰＬＣ分析の
ための試料調製手順は実施例５に記した通りである。

【００５５】実施例７に示した第３工程の操作を行って
得られた反応生成物を分析した結果を第１１図に示す。
図１５との比較からわかるように、図１９においてＮ
−アセチルアラニルトリプトファン（Ａｃ―Ａｌａ−Ｔ
ｒｐ）、符号１５、が検出されており、実施例７に示し
た第３工程の操作における条件下で、アミン水溶液の作
用によってエステルが加水分解されたことがわかる。

【００５６】（実施例１３）これ以降の実施例において
は、質量分析を用いて本発明を説明する。本実施例にお
いては質量分析の条件、および試料の調製手順を示す。質量分析の条件分析装置：二重収束質量分析計ＨＸ−１１０（日本電子）測定条件：加速電圧１０ｋＶ分解能１，０００イオン源ＦＡＢ（高速粒子衝撃法）イオン化ガスＸｅイオンモード陽イオンＦＡＢガン加速電圧６ｋＶ検出器ＭＵＬＴＩＰＬＩＥＲ付加電圧 −２０ｋＶデータ処理システムＤＡ５０００マトリックスグリセロール：チオグリセロール：ｍ−ニトロベンジルアルコール（ＧＬＹＣＥＲＯＬ：ＴＨＩＯＧＬＹＣＥＲＯＬ：ｍ−ＮＩＴＲＯＢＥＮＺＹＬＡＬＣＯＨＯＬ）＝１：１：１

【００５７】試料調製手順：試料を減圧乾固する。６７％酢酸水溶液（あるいはジメチルホルムアミド）
に溶解する。ターゲット上にマトリックスを１μｌのせる。さらにターゲット上に試料溶液を１μｌのせ、混和す
る。

【００５８】イオン源に導入する。

【００５９】（実施例１４）ここでは質量分析を用い
て、第１工程におけるオキサゾロンを生成させる際の反
応条件を検討した例を示す。試料として、配列番号１の
ペンタペプチド、ロイシル−トリプトファニル−メチオ
ニル−アルギニル−フェニルアラニン（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）を用いた。本実施例にお
いては、第１工程に引き続き第２工程を実施する手順と
した。

【００６０】第１工程における反応条件は実施例と同じ
く下記の通りである。反応条件無水酢酸濃度：２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を１
％になるように加えたもの。）反応温度：６０℃ 反応時間：３０分間第２工程の反応条件は下記の通りとした。用いる酸を、
ヘプタフルオロ酪酸（ＣＦ₃−ＣＦ₂−ＣＦ₂−ＣＯＯ
Ｈ：以降ＨＦＢＡと略称する。）とし、用いるアルコー
ルをエタノールとした。

【００６１】反応条件ＨＦＢＡ濃度：５％（エタノール溶液）反応温度：６０℃ 反応時間：３０分間得られた試料の質量分析を行った結果を第２０図に示
す。ここで、アミノ末端がアセチル化されＣ末端アミ
ノ酸を失いＣ末端のカルボキシル基がエチルエステルと
なった反応生成物（アセチル−ロイシル−トリプトファ
ニル−メチオニル−アルギニンのエチルエステル、分子
量６７５：以降Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔと略称する。）
の分子イオンが検出されており（符号１６）、第１工程
においてオキサゾロンが生成し、さらに第２工程におい
てＣ末端アミノ酸が遊離されたことがわかる。

【００６２】（実施例１５）次に、第１工程における反
応条件をさらに変化させた例を示す。試料として、実施
例１４と同様に配列番号１のペンタペプチドを用いた。
実施手順は実施例１４と同様である。第１工程における
反応条件を下記の通りとした。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸
を加えないもの。）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第２工程の反応条件は実施例１３と同様である。

【００６３】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２１図に示す。この条件下においても、Ａｃ−ＬＷＭＲ
−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号１７）、
第１工程においてオキサゾロンが生成したことがわか
る。同時に分子量７１８、および分子量７６１の分子イ
オン（それぞれ符号１８および１９）が検出されてお
り、アミノ末端がアセチル化されＣ末端アミノ酸を失い
Ｃ末端のカルボキシル基がエチルエステルとなった反応
生成物のアセチル化がさらに進行した化学種も生成した
ことがわかる。

【００６４】（実施例１６）次に、第１工程における反
応条件をさらに変化させた例を示す。試料として、実施
例９と同様に配列番号１のペンタペプチドを用いた。実
施手順は実施例１４と同様である。第１工程における反
応条件を下記の通りとした。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を２
％となるように加えたもの。）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第２工程の反応条件は実施例１４と同様である。

【００６５】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２２図に示す。この条件下においても、Ａｃ−ＬＷＭ
Ｒ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号２
０）、第１工程においてオキサゾロンが生成したことが
わかる。

【００６６】（実施例１７）次に、第１工程における反
応条件をさらに変化させた例を示す。試料として、実施
例９と同様に配列番号１のペンタペプチドを用いた。実
施手順は実施例１４と同様である。第１工程における反
応条件を下記の通りとした。

【００６７】反応条件無水酢酸濃度５％（アセトニトリル溶液、酢酸を
１％になるように加えもの）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第２工程の反応条件は実施例１４と同様である。

【００６８】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２３図に示す。この条件下においても、Ａｃ−ＬＷＭ
Ｒ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号２
１）、第１工程においてオキサゾロンが生成したことが
わかる。（実施例１８）さらに、第２工程におけるＣ末端アミノ
酸を遊離させる際の反応条件を検討した例を示す。試料
として、配列番号１のペンタペプチドを用いた。以降の
実施例においても、第１工程に引き続き第２工程を実施
する手順とした。第１工程における反応条件は実施例１
４と同じく下記の通りである。

【００６９】反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を
１％になるように加えたもの。）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第２工程の反応条件を下記のように変化させた。

【００７０】反応条件ＨＦＢＡ濃度２％（エタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間得られた試料の質量分析を行った結果を第３４図に示
す。ここで、Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検
出されており（符号２２）、第１工程においてオキサゾ
ロンが生成し、さらに第２工程においてＣ末端アミノ酸
が遊離されたことがわかる。

【００７１】（実施例１９）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間１０分間第１工程における反応条件は実施例９と同じである。

【００７２】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２５図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａｃ−
ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号
２３）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さら
に第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことが
わかる。（実施例２０）さらに第２工程の反応条件を下記のよう
に変化させた。

【００７３】反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度室温反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００７４】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２６図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａｃ
−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符
号２４）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さ
らに第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたこと
がわかる。

【００７５】（実施例２１）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度５℃ 反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００７６】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２７図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａｃ−
ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号
２５）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さら
に第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことが
わかる。

【００７７】（実施例２２）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度１００℃ 反応時間１５分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００７８】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２８図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａｃ−
ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号
２６）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さら
に第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことが
わかる。

【００７９】（実施例２３）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００８０】得られた試料の質量分析を行った結果を第
２９図に示す。ここで用いた条件下において、アミノ末
端がアセチル化され、Ｃ末端アミノ酸を失い、Ｃ末端の
カルボキシル基がエチルエステルとなった反応生成物
（アセチル−ロイシル−トリプトファニル−メチオニ
ル−アルギニンのメチルエステル、分子量６６１：以
降Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅと略称する。）の分子イオン
が検出されており（符号２７）、第１工程においてオキ
サゾロンが生成し、さらに第２工程においてＣ末端アミ
ノ酸が遊離されたことがわかる。

【００８１】（実施例２４）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度５℃ 反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００８２】得られた試料の質量分析を行った結果を第
３０図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａｃ
−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンが検出されており（符
号２８）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さ
らに第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたこと
がわかる。

【００８３】（実施例２５）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＰＦＰＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００８４】得られた試料の質量分析を行った結果を第
３１図に示す。ここで用いた条件下において、Ａｃ−Ｌ
ＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており（符号２
９）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さらに
第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことがわ
かる。

【００８５】（実施例２６）さらに第２工程の反応条件
を下記のように変化させた。反応条件ＰＦＰＡ濃度２０％（エタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間第１工程における反応条件は実施例１４と同じである。

【００８６】得られた試料の質量分析を行った結果を第
３２図に示す。ここで用いた条件下においても、Ａ
ｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンが検出されており
（符号３０）、第１工程においてオキサゾロンが生成
し、さらに第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離され
たことがわかる。

【００８７】（実施例２７）次に、第１工程における反
応条件を下記の通りとした。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を
１％になるように加えたもの。）反応温度６０℃ 反応時間１０分間第２工程における反応条件を下記の通りとした。

【００８８】反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度室温反応時間３０分間得られた試料の質量分析を行った結果を第３３図に示
す。

【００８９】この条件下においても、Ａｃ−ＬＷＭＲ−
ＯＭｅの分子イオンが検出されており（符号３１）、第
１工程においてオキサゾロンが生成したことがわかる。

【００９０】（実施例２８）次に、第１工程における反
応条件を下記の通りとした。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸
を１％になるように加えたもの。）反応温度９０℃ 反応時間１０分間第２工程における反応条件を下記の通りとした。

【００９１】反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度室温反応時間３０分間得られた試料の質量分析を行った結果を第３４図に示
す。

【００９２】ここで用いた条件下においても、Ａｃ−
ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンが検出されており（符号
３２）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さら
に第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことが
わかる。

【００９３】（実施例２９）次に、第１工程における反
応条件を下記の通りとした。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液、酢酸を
１％になるように加えたもの。）反応温度室温反応時間３０分間第２工程の反応条件を下記のように変化させた。

【００９４】反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度６０℃ 反応時間３０分間得られた試料の質量分析を行った結果を第３５図に示
す。

【００９５】ここで用いた条件下においても、Ａｃ−
ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンが検出されており（符号
３３）、第１工程においてオキサゾロンが生成し、さら
に第２工程においてＣ末端アミノ酸が遊離されたことが
わかる。

【００９６】以上実施例６から実施例２９において述べ
てきた結果をまとめると次のようになる。本発明におい
ては、Ｃ末端からのアミノ酸の配列分析を実行するため
に、下記第１工程から第３工程までの各工程から構成さ
れる一連の操作と、生成したアミノ酸を分離し同定する
操作との組み合わせを、繰り返し実施した。

【００９７】第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ基を保護し、Ｃ末
端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生成させる。第２工程酸存在下でアルコールを作用させ、第１工程の反応生成
物に含まれるオキサゾロンに、アルコリシス（エステル
化）を生起させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させ
る。

【００９８】第３工程アミンを作用させ、第２工程の反応生成物に含まれるエ
ステルを加水分解する。

【００９９】以下本発明における別の実施手順を詳細に
説明する。（実施例３０）図３６は本発明を示す工程図の一例であ
る。第１工程タンパク質あるいはペプチドに、一般式、ＣＨ３−（Ｃ
Ｈ２）ｍ−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３
（ｍ、ｎは０以上の整数）で表される有機酸の無水物、
を作用させる。ここで、アミノ基が修飾されＣ末端アミ
ノ酸がオキサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチ
ドが得られる。この際、Ｃ末端のアミノ酸がアスパラギ
ン酸である場合、アミノ基がアシル化されＣ末端のアス
パラギン酸が分子内酸無水物となったタンパク質あるい
はペプチドが得られる。

【０１００】第２工程次に、このアミノ基が修飾されＣ末端アミノ酸がオキサ
ゾロンとなったタンパク質あるいはペプチド、あるいは
アミノ基がアシル化されＣ末端のアスパラギン酸が分子
内酸無水物となったタンパク質あるいはペプチドに、ア
ルコールを酸存在下で作用させる。ここで、アミノ基が
アシル化されＣ末端のアミノ酸を失い新たに出現したＣ
末端のアミノ酸のカルボキシル基がエステルとなったタ
ンパク質あるいはペプチドと元のＣ末端アミノ酸との混
合物が得られる。この際、アミノ基がアシル化されＣ末
端のアスパラギン酸が分子内酸無水物となったタンパク
質あるいはペプチドは、アミノ基がアシル化されＣ末端
のアスパラギン酸のβ−カルボキシル基がエステルとな
ったタンパク質あるいはペプチドとなる。

【０１０１】第３工程さらに、このアミノ基がアシル化されＣ末端のアミノ酸
を失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸のカルボキシル
基がエステルとなったタンパク質あるいはペプチドと元
のＣ末端アミノ酸との混合物、あるいはアミノ基がアシ
ル化されＣ末端のアスパラギン酸のβ−カルボキシル基
がエステルとなったタンパク質あるいはペプチドに、一
般式、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ
２）ｎ−ＣＨ３（ｍ、ｎは０以上の整数）で表される有
機酸の無水物、を作用させる。ここで、アミノ基が修飾
されＣ末端のアミノ酸を失い新たに出現したＣ末端のア
ミノ酸のカルボキシル基がエステルとなったタンパク質
あるいはペプチドはなんら作用を受けない。元のＣ末端
アミノ酸はアシル化されたアミノ酸誘導体となる。一
方、アミノ基がアシル化されＣ末端のアスパラギン酸の
β−カルボキシル基がエステルとなったタンパク質ある
いはペプチドは、アミノ基がアシル化されＣ末端のアス
パラギン酸のα−カルボキシル基がオキサゾロンとなり
β−カルボキシル基がエステルとなったタンパク質ある
いはペプチドとなる。

【０１０２】第４工程さらに、このアミノ基がアシル化されＣ末端のアミノ酸
を失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸のカルボキシル
基がエステルとなったタンパク質あるいはペプチドとア
ミノ酸誘導体との混合物、あるいはアミノ基がアシル化
されＣ末端のアスパラギン酸のα−カルボキシル基がオ
キサゾロンとなりβ−カルボキシル基がエステルとなっ
たタンパク質あるいはペプチドに、アルコールを酸存在
下で作用させる。ここで、アミノ基が修飾されＣ末端の
アミノ酸を失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸のカル
ボキシル基がエステルとなったタンパク質あるいはペプ
チドとアミノ酸誘導体はなんら作用を受けない。一方、
アミノ基が修飾されＣ末端のアスパラギン酸のα−カル
ボキシル基がオキサゾロンとなりβ−カルボキシル基が
エステルとなったタンパク質あるいはペプチドは、アミ
ノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を失い新たに出現した
Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基がエステルとなった
タンパク質あるいはペプチドと、β−カルボキシル基が
エステルとなったアスパラギン酸との混合物となる。

【０１０３】第５工程さらに、ここでアミノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を
失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基
がエステルとなったタンパク質あるいはペプチドとアミ
ノ酸誘導体との混合物、あるいはアミノ基が修飾されＣ
末端のアミノ酸を失い新たに出現したＣ末端のアミノ酸
のカルボキシル基がエステルとなったタンパク質あるい
はペプチドとβ−カルボキシル基がエステルとなったア
スパラギン酸との混合物に、例えば、一般式、ＮＲ１Ｒ
２Ｒ３で表されるアミンを作用させる。ここで、ア
ミノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質
あるいはペプチドとアミノ酸誘導体との混合物、あるい
はアミノ基が修飾されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパ
ク質あるいはペプチドとアスパラギン酸との混合物が得
られる。このアスパラギン酸は、元のＣ末端アミノ酸で
ある。

【０１０４】上記第１工程から第５工程において得られ
たアミノ酸あるいはアミノ酸誘導体を分離し同定するこ
とによって、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端のア
ミノ酸を決定することが出来る。以下、アミノ基が修飾
されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプ
チドに、第１工程から第５工程の一連の操作と、得られ
たアミノ酸あるいはアミノ酸誘導体を分離し同定する操
作とを、繰り返し実施することによって、タンパク質あ
るいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する
ことができる。

【０１０５】（実施例３１）ここでは本発明の、タンパ
ク質あるいはペプチドに、第１工程から第５工程の一連
の操作と、第２工程を実施した後生成した混合物からア
ミノ酸を分離し同定する操作と、第５工程を実施した後
生成した混合物からアミノ酸を分離し同定する操作と
を、繰り返し実施することによってタンパク質あるいは
ペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する操作手
順の一例を示す。図３７は本発明の実験手順を示す反応
式の一例である。図３８は本発明の実験方法を示す図で
ある。

【０１０６】第１工程試料に、無水酢酸を作用させる。まずタンパク質あるい
はペプチド試料を含む試料溶液を小型の試験管３４に入
れた後乾燥させる。ここで、試験管３５に反応試薬の溶
液３６（ここでは無水酢酸のアセトニトリル溶液）を入
れておく。この試験管に先ほどの試料３７を入れた小型
の試験管３４を入れる。この試験管３５内を真空ポンプ
で減圧下に封管し反応を進行させる。

【０１０７】反応条件は下記の通りである。反応条件無水酢酸濃度２０％（アセトニトリル溶液）反応温度６０℃ 反応時間１０分間この反応後、この試験管３５の上部を開管し、小型の試
験管３４を取り出す。さらに、減圧乾固し、用いた試薬
と溶媒とを除去する。

【０１０８】第２工程こうして得られた試料に、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢ
Ａ）存在下でメタノールを作用させる。実験の手順と実
験系の構成は第１工程に準じたものである。反応条件は
下記の通りである。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度２５℃ 反応時間３０分間この反応後、この試験管の上部を開管し、小型の試験管
内を取り出す。さらに、減圧乾固し、用いた試薬と溶媒
とを除去する。

【０１０９】第３工程こうして得られた試料に、無水酢酸を作用させる。実験
の手順と実験系の構成は第１工程と同一である。第４工程こうして得られた試料に、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢ
Ａ）存在下でメタノールを作用させる。実験の手順と実
験系の構成は第２工程と同一である。

【０１１０】第５工程こうして得られた試料に、２−ジメチルアミノエタノー
ル（ＤＭＡＥ）を作用させる。実験の手順と実験系の構
成は第１工程に準じたものである。試験管に入れる溶液
は、ＤＭＡＥの水溶液である。

【０１１１】反応条件は下記の通りである。反応条件ＤＭＡＥ濃度５０％（水溶液）反応温度５０℃ 反応時間３０分間この一連の操作において、第２工程を実施後、得られた
試料からアミノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。
さらに、第５工程実施後に、得られた試料からアミノ酸
を分離し、そのアミノ酸を同定する。

【０１１２】以下、アミノ基が修飾されＣ末端のアミノ
酸を失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１工程か
ら第５工程の一連の手順と、第２工程を実施して得られ
たアミノ酸を分離し同定する操作と、第５工程を実施し
て得られたアミノ酸を分離し同定する操作と、残存する
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を除去する操作とを、繰
り返し実施することによって、タンパク質あるいはペプ
チドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定することができ
る。

【０１１３】（実施例３２）ここでは本発明の、タンパ
ク質あるいはペプチドに、第１工程から第５工程の一連
の操作と、第２工程を実施した後生成した混合物からア
ミノ酸を分離し同定する操作とを、繰り返し実施するこ
とによってタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からの
アミノ酸配列を決定する操作手順の一例を示す。

【０１１４】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例２に記述したものと同一である。この一連の
操作において、第２工程を実施後、得られた試料からア
ミノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。さらに、第
５工程実施後に、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘導
体を除去する。以下、アミノ基が修飾されＣ末端のアミ
ノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１工程
から第５工程の一連の手順と、第２工程を実施して得ら
れたアミノ酸を分離し同定する操作と、残存するアミノ
酸およびアミノ酸誘導体を除去する操作とを、繰り返し
実施することによって、タンパク質あるいはペプチドの
Ｃ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。

【０１１５】（実施例３３）ここでは本発明の、タンパ
ク質あるいはペプチドに、第１工程から第５工程の一連
の操作と、第３工程を実施した後生成した混合物からア
ミノ酸誘導体を分離し同定する操作とを、繰り返し実施
することによってタンパク質あるいはペプチドのＣ末端
からのアミノ酸配列を決定する操作手順の一例を示す。

【０１１６】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例２に記述したものと同一である。この一連の
操作において、第３工程を実施後、得られた試料からア
ミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸誘導体を同定す
る。さらに、第５工程実施後に、残存するアミノ酸およ
びアミノ酸誘導体を除去する。以下、アミノ基が修飾さ
れＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチ
ドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第３工程
を実施して得られたアミノ酸誘導体を分離し同定する操
作と、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘導体を除去す
る操作とを、繰り返し実施することによって、タンパク
質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定
することができる。

【０１１７】（実施例３４）ここでは本発明の、タンパ
ク質あるいはペプチドに、第１工程から第５工程の一連
の操作と、第４工程を実施した後生成した混合物からア
ミノ酸誘導体を分離し同定する操作とを、繰り返し実施
することによってタンパク質あるいはペプチドのＣ末端
からのアミノ酸配列を決定する操作手順の一例を示す。

【０１１８】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例２に記述したものと同一である。この一連の
操作において、第４工程を実施後、得られた試料からア
ミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸誘導体を同定す
る。さらに、第５工程実施後に、残存するアミノ酸およ
びアミノ酸誘導体を除去する。以下、アミノ基が修飾さ
れＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチ
ドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第４工程
を実施して得られたアミノ酸誘導体を分離し同定する操
作と、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘導体を除去す
る操作とを、繰り返し実施することによって、タンパク
質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定
することができる。

【０１１９】（実施例３５）ここでは、本発明の、タン
パク質あるいはペプチドに、第１工程から第５工程の一
連の操作と、第５工程を実施した後生成した混合物から
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を分離し同定する操作と
を、繰り返し実施することによってタンパク質あるいは
ペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する操作手
順の一例を示す。

【０１２０】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例２に記述したものと同一である。この一連の
操作において、第５工程を実施後、得られた試料からア
ミノ酸およびアミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸お
よびアミノ酸誘導体を同定する。以下、アミノ基が修飾
されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプ
チドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第５工
程を実施して得られたアミノ酸およびアミノ酸誘導体を
分離し同定する操作とを、繰り返し実施することによっ
て、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ
酸配列を決定することができる。

【０１２１】（実施例３６）ここでは第１工程におけ
る、オキサゾロンの生成を示す。試料として、配列番号
１のペンタペプチド、ロイシル−トリプトファニル−メ
チオニル−アルギニル−フェニルアラニン（Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）、を用いた。

【０１２２】オキサゾロンはアルコールの作用によって
容易に開裂しエステルとなることを利用した。実施例３
１に示した第１工程において得られた試料にメタノール
を作用させた。この試料の質量分析を行った結果を第３
９図に示す。質量分析の条件は下記の通りである。

【０１２３】質量分析の条件分析装置：二重収束質量分析計ＨＸ−１１０（日本電子）測定条件：加速電圧１０ｋＶ分解能１，０００イオン源ＦＡＢ（高速粒子衝撃法）イオン化ガスＸｅイオンモード陽イオンＦＡＢガン加速電圧６ｋＶ検出器ＭＵＬＴＩＰＬＩＥＲ付加電圧 −２０ｋＶデータ処理システムＤＡ５０００マトリックスグリセロール：チオグリセロール：ｍ−ニトロベンジルアルコール（ＧＬＹＣＥＲＯＬ：ＴＨＩＯＧＬＹＣＥＲＯＬ：ｍ−ＮＩＴＲＯＢＥＮＺＹＬＡＬＣＯＨＯＬ）＝１：１：１

【０１２４】試料調製手順：試料を減圧乾固する。６７％酢酸水溶液（あるいはジメチルホルムアミド）
に溶解する。ターゲット上にマトリックスを１μｌのせる。さらにターゲット上に試料溶液を１μｌのせ、混和す
る。イオン源に導入する。

【０１２５】ここで、アミノ末端がアセチル化され、Ｃ
末端のカルボキシル基がメチルエステルとなった反応生
成物（Ａｃ−ＬＷＭＲＦ−ＯＭｅ：アセチル−ロイシル
−トリプトファニル−メチオニル−アルギニル−フェニ
ルアラニンのメチルエステル、分子量８０８）の分子イ
オンが検出されており（符号３８）、実施例３１に示し
た第１工程において得られた試料にオキサゾロンが含ま
れていることがわかる。

【０１２６】（実施例３７）ここでは第２工程におけ
る、オキサゾロン環の開裂を示す。試料として、実施例
３５と同様に配列番号１のペンタペプチド、ロイシル−
トリプトファニル−メチオニル−アルギニル−フェニル
アラニン（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ）、を用いた。

【０１２７】実施例３１に示した第１工程と第２工程の
操作を行って得られた試料の質量分析を行った結果を第
４０図に示す。ここでは、第１工程において得られた試
料に、第２工程としてヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）
存在下でメタノールを作用させた。実験の手順と実験系
の構成は第１工程に準じたものである。

【０１２８】反応条件は下記の通りである。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（メタノール溶液）反応温度２５℃ 反応時間３０分間質量分析の条件は実施例３６において記述したものと同
じである。

【０１２９】アミノ末端がアセチル化され、Ｃ末端残基
であったフェニルアラニンが脱離し、新たに出現したＣ
末端のカルボキシル基がメチルエステルとなった反応生
成物（Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅ：アセチル−ロイシル−
トリプトファニル−メチオニル−アルギニンのメチルエ
ステル、分子量６６１）の分子イオンが検出されてお
り（符号３９）、実施例２に示した第２工程においてオ
キサゾロン環の開裂が起きたことがわかる。

【０１３０】（実施例３８）ここでは、高速液体クロマ
トグラフ（ＨＰＬＣ）分析と質量分析とを組み合わせ
て、第２工程におけるオキサゾロン環の開裂を示す。実
施例３１に示した第１工程、第２工程の操作を行って得
られた反応生成物を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬ
Ｃ）で分離した結果を第４１図に示す。こでは、第１工
程において得られた試料に、第２工程としてヘプタフル
オロ酪酸（ＨＦＢＡ）存在下でエタノールを作用させ
た。実験の手順と実験系の構成は第１工程に準じたもの
である。

【０１３１】反応条件は下記の通りである。反応条件ＨＦＢＡ濃度５％（エタノール溶液）反応温度２５℃ 反応時間３０分間また、ＨＰＬＣ分析の条件と、試料調製手順は下記の通
りである。

【０１３２】ＨＰＬＣ分析の条件測定条件：カラムＣ１８ＭＩＣＲＯＢＯＲＥ
（資生堂）溶出条件：下記２液を用いた濃度勾配溶出Ａ液０．１％ＴＦＡ水溶液Ｂ液０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリル水溶
液分析時間溶離液組成０− ５ｍｉｎ．Ａ液８０％５−２５ｍｉｎ．Ａ液８０→４０％（ＬＩＮＥＡＲ）２５−３０ｍｉｎ．Ａ液４０％試料調製手順：試料を減圧乾固する。

【０１３３】０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に
溶解する。各ピークと各生成物の溶出との対応を次のように確かめ
た。第４１図に示した１から３の各フラクション（符号
４０か４２にそれぞれ対応する）を分取し、それぞれ質
量分析を行った。質量分析の条件は実施例３６において
記述したものと同じである。

【０１３４】図４２はフラクション１（符号４０）を分
析した結果である。ここで、アミノ末端がアセチル化さ
れ、Ｃ末端残基であったフェニルアラニンが脱離し、新
たに出現したＣ末端のカルボキシル基がエチルエステル
となった反応生成物（Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔ：アセチ
ル−ロイシル−トリプトファニル−メチオニル−アルギ
ニンのエチルエステル、分子量６７５）の分子イオン
が検出された（符号４６）。この結果からも実施例３１
に示した第２工程においてオキサゾロン環の開裂が起き
たことがわかる。

【０１３５】図４３はフラクション２（符号４１）を質
量分析した結果である。第４４図はフラクション３（符
号４２）を質量分析した結果である。これら２つのフラ
クションをそれぞれ分析したところ、いずれにおいても
アミノ末端がアセチル化された配列番号１のペンタペプ
チド（Ａｃ−ＬＷＭＲＦ−ＯＨ：アセチル−ロイシル−
トリプトファニル−メチオニル−アルギニル−フェニル
アラニン、分子量７９４）の分子イオンが検出された
（符号４７、および符号４８）。これは第１工程におけ
るオキサゾロン生成時のラセミ化の進行を示していると
考えられる。

【０１３６】以上の結果からも、第１工程においてオキ
サゾロン環が得られ、第２工程においてそのオキサゾロ
ン環が開裂したことがわかる。

【０１３７】（実施例３９）ここでは第５工程におけ
る、エステルの加水分解を示す。試料として、実施例３
６と同様に配列番号１のペンタペプチド、ロイシル−ト
リプトファニル−メチオニル−アルギニル−フェニルア
ラニン（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ）、
を用いた。

【０１３８】実施例３１に示した第１工程から第５工程
までの一連の操作を行って得られた試料の質量分析を行
った結果を第４５図に示す。質量分析の条件は実施例３
６において記述したものと同じである。ここで、アミノ
末端がアセチル化され、Ｃ末端残基であったフェニルア
ラニンが脱離し、メチルエステルとなっていた新たに出
現したＣ末端のカルボキシル基が遊離のカルボキシル基
となった反応生成物（Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＨ：アセチル
−ロイシル−トリプトファニル−メチオニル−アルギニ
ン、分子量６４７）の分子イオンが検出されており
（符号４９）、実施例２に示した第５工程においてエス
テルの加水分解が起こったことがわかる。

【０１３９】以上実施例３０から実施例３９において述
べてきた結果をまとめると次のようになる。本発明にお
いては、Ｃ末端からのアミノ酸の配列分析を実行するた
めに、下記第１工程から第５工程から構成される一連の
操作と、生成したアミノ酸あるいはアミノ酸誘導体を分
離し同定する操作との組み合わせを、繰り返し実施し
た。

【０１４０】第１工程タンパク質あるいはペプチドに、酸無水物を作用させ、
タンパク質あるいはペプチドのアミノ末端を保護し、Ｃ
末端のアミノ酸残基にオキサゾロンあるいは分子内酸無
水物（アスパラギン酸の場合）を生成させる。第２工程酸存在下でアルコールを作用させ、第１工程の反応生成
物に含まれるオキサゾロンに、アルコリシス（エステル
化）を生起させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させる
か、あるいは、分子内酸無水物をアルコリシスにより開
環させる。

【０１４１】第３工程酸無水物を作用させ、第２工程の反応生成物に含まれ
る、Ｃ末端が閉鎖されていないタンパク質あるいはペプ
チドのＣ末端のアミノ酸残基にオキサゾロンを生成させ
る。第４工程酸存在下でアルコールで作用させ、第３工程の反応生成
物に含まれるオキサゾロンに、アルコリシス（エステル
化）を生起させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させ
る。

【０１４２】第５工程アミンを作用させ、第４工程の反応生成物に含まれるエ
ステルを加水分解する。

【０１４３】

【発明の効果】本発明によれば、Ｃ末端からのアミノ酸
の配列分析を実行するために、上記各工程から構成され
る一連の操作と、生成したアミノ酸を分離し同定する操
作との組み合わせを繰り返し実施することによって、酵
素を用いることなくタンパク質あるいはペプチドのＣ末
端からのアミノ酸配列を順次決定することを可能とした
ため、酵素を使用することによるアミノ酸およびペプチ
ドの混入や汚染を防止でき、微量分析に適する配列分析
を提供できる。また、本発明によれば、求めるペプチド
結合の切断を行え、正確な配列分析を行えるという効果
がある。

【０１４４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５配列の形：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアミノ酸配列を決定する第１の工程図
である。

【図２】本発明の実験手順を示す反応式である。

【図３】従来のカルボキシペプチダーゼを用いた場合の
分析方法を示す工程図である。

【図４】従来のトリメチルシリルイソチオシアナートを
用いた場合の分析方法示す工程図である。

【図５】アラニルトリプトファンの溶出位置の確認のた
めのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図６】Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンの溶出位
置の確認のためのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図７】Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオ
ニルアルギニルフェニルアラニンの溶出位置の確認のた
めのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図８】Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオ
ニルアルギニルフェニルアラニルアラニンの溶出位置の
確認のためのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図９】オキサゾロン生成の確認のためのＨＰＬＣの結
果を示す図である。

【図１０】オキサゾロン環の開裂の確認のためのＨＰＬ
Ｃの結果を示す図である。

【図１１】本発明のアミノ酸配列を決定する第２の工程
図である。

【図１２】本発明の他の実験手順を示す反応式である。

【図１３】トリプトファンの溶出位置の確認のためのＨ
ＰＬＣの結果を示す図である。

【図１４】アラニルトリプトファンの溶出位置の確認の
ためのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図１５】Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンの溶出
位置の確認のためのＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図１６】Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのエチ
ルエステルの溶出位置の確認のためのＨＰＬＣの結果を
示す図である。

【図１７】オキサゾロン生成の確認のためのＨＰＬＣの
結果を示す図である。

【図１８】オキサゾロン環の開裂の確認のためのＨＰＬ
Ｃの結果を示す図である。

【図１９】加水分解の確認のためのＨＰＬＣの結果を示
す図である。

【図２０】実施例８で得られた試料を質量分析した結果
を示す図である。

【図２１】実施例９で得られた試料を質量分析した結果
を示す図である。

【図２２】実施例１０で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２３】実施例１１で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２４】実施例１２で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２５】実施例１３で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２６】実施例１４で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２７】実施例１５で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２８】実施例１６で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図２９】実施例１７で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３０】実施例１８で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３１】実施例１９で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３２】実施例２０で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３３】実施例２１で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３４】実施例２２で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３５】実施例２３で得られた試料を質量分析した結
果を示す図である。

【図３６】本発明のアミノ酸配列を決定する第３の工程
図である。

【図３７】本発明の他の実験手順を示す反応式である。

【図３８】本発明の他の実験方法を示す図である。

【図３９】オキサゾロン生成の確認のための質量分析の
結果である。

【図４０】オキサゾロン環の開裂の確認のための質量分
析の結果である。

【図４１】オキサゾロン環の開裂の確認のためのＨＰＬ
Ｃの結果である。

【図４２】オキサゾロン環の開裂の確認のための、ＨＰ
ＬＣで分離した生成物の質量分析の結果である。

【図４３】オキサゾロン環の開裂の確認のための、ＨＰ
ＬＣで分離した生成物の質量分析の結果である。

【図４４】オキサゾロン環の開裂の確認のための、ＨＰ
ＬＣで分離した生成物の質量分析の結果である。

【図４５】加水分解の確認のための質量分析の結果であ
る。

【符号の説明】

１アラニルトリプトファンのピーク２Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのピーク３Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオニル
アルギニルフェニルアラニンのピーク４Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオニル
アルギニルフェニルアラニンのピーク５Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオニル
アルギニルフェニルアラニルアラニンのピーク６Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのピーク７Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオニル
アルギニルフェニルアラニンのピーク８Ｎ−アセチルアラニルトリプトファニルメチオニル
アルギニルフェニルアラニンのピーク９トリプトファンのピーク１０アラニルトリプトファンのピーク１１Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのピーク１２Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのエチル
エステルのピーク１３Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのピーク１４トリプトファンのピーク１５Ｎ−アセチルアラニルトリプトファンのピーク１６Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号１７Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔアセチル化された化合物
の分子イオンの信号１８Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔのアセチル化がさらに進
んだ化合物の分子イオンの信号１９Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２０Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２１Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２２Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２３Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２４Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２５Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２６Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号２７Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンの信号２８Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンの信号２９Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号３０Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＥｔの分子イオンの信号３１Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンの信号３２Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンの信号３３Ａｃ−ＬＷＭＲ−ＯＭｅの分子イオンの信号３４小型の試験管３５試験管３６反応試薬の溶液３７試料３８配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化されＣ末端のカルボキシル基がメチルエステルと
なった反応生成物（分子量８０８）に対応する分子イオ
ン由来の信号３９配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化されＣ末端残基であったフェニルアラニンが脱離
し新たに出現したＣ末端のカルボキシル基がメチルエス
テルとなった反応生成物分子量６６１）に対応する分子
イオン由来の信号４０実施例２に示した第１工程、第２工程の操作を行
って得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフ（Ｈ
ＰＬＣ）で分離したフラクション１４１実施例２に示した第１工程、第２工程の操作を行
って得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフ（Ｈ
ＰＬＣ）で分離したフラクション２４２実施例２に示した第１工程、第２工程の操作を行
って得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフ（Ｈ
ＰＬＣ）で分離したフラクション３４３配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化されＣ末端残基であったフェニルアラニンが脱離
し新たに出現したＣ末端のカルボキシル基がエチルエス
テルとなった反応生成物（分子量６７５）のピーク４４配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化された反応生成物（分子量７９４）のピーク４５配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化された反応生成物（分子量７９４）のピーク４６配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化されＣ末端残基であったフェニルアラニンが脱離
し新たに出現したＣ末端のカルボキシル基がエチルエス
テルとなった反応生成物（分子量６７５）に対応する分
子イオン由来の信号４７配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化された反応生成物（分子量７９４）に対応する分
子イオン由来の信号４８配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化された反応生成物（分子量７９４）に対応する分
子イオン由来の信号４９配列番号１のペンタペプチドのアミノ末端がアセ
チル化されＣ末端残基であったフェニルアラニンが脱離
しメチルエステルとなっていた新たに出現したＣ末端の
カルボキシル基が遊離のカルボキシル基となった反応生
成物（分子量６４７）に対応する分子イオン由来の信号

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年９月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１４】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例３１に記述したものと同一である。この一連
の操作において、第２工程を実施後、得られた試料から
アミノ酸を分離し、そのアミノ酸を同定する。さらに、
第５工程実施後に、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘
導体を除去する。以下、アミノ基が修飾されＣ末端のア
ミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドに、第１工
程から第５工程の一連の手順と、第２工程を実施して得
られたアミノ酸を分離し同定する操作と、残存するアミ
ノ酸およびアミノ酸誘導体を除去する操作とを、繰り返
し実施することによって、タンパク質あるいはペプチド
のＣ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１６】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例３１に記述したものと同一である。この一連
の操作において、第３工程を実施後、得られた試料から
アミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸誘導体を同定す
る。さらに、第５工程実施後に、残存するアミノ酸およ
びアミノ酸誘導体を除去する。以下、アミノ基が修飾さ
れＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチ
ドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第３工程
を実施して得られたアミノ酸誘導体を分離し同定する操
作と、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘導体を除去す
る操作とを、繰り返し実施することによって、タンパク
質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定
することができる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１８】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例３１に記述したものと同一である。この一連
の操作において、第４工程を実施後、得られた試料から
アミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸誘導体を同定す
る。さらに、第５工程実施後に、残存するアミノ酸およ
びアミノ酸誘導体を除去する。以下、アミノ基が修飾さ
れＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチ
ドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第４工程
を実施して得られたアミノ酸誘導体を分離し同定する操
作と、残存するアミノ酸およびアミノ酸誘導体を除去す
る操作とを、繰り返し実施することによって、タンパク
質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定
することができる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２０】第１工程から第５工程までの一連の操作手
順は実施例３１に記述したものと同一である。この一連
の操作において、第５工程を実施後、得られた試料から
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を分離し、そのアミノ酸
およびアミノ酸誘導体を同定する。以下、アミノ基が修
飾されＣ末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペ
プチドに、第１工程から第５工程の一連の手順と、第５
工程を実施して得られたアミノ酸およびアミノ酸誘導体
を分離し同定する操作とを、繰り返し実施することによ
って、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミ
ノ酸配列を決定することができる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３２】ＨＰＬＣ分析の条件測定条件カラム：Ｃ１８ＭＩＣＲＯＢＯＲＥ（資生堂）溶出条件：下記２液を用いた濃度勾配溶出Ａ液０．１％ＴＦＡ水溶液Ｂ液０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリル水溶
液分析時間溶離液組成０− ５ｍｉｎ．Ａ液８０％５−２５ｍｉｎ．Ａ液８０→４０％（ＬＩＮＥＡＲ）２５−３０ｍｉｎ．Ａ液４０％試料調製手順：試料を減圧乾固する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者次田晧千葉県柏市泉町17−28 石塚ビル305 (72)発明者高本圭司千葉県流山市江戸川台東３−12−８ベルグリーン203号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質またはペプチドのカルボキシ
末端アミノ酸を遊離させる工程と、得られたアミノ酸ま
たはアミノ酸誘導体を分離し同定する操作と、を組み合
わせた手順をくり返す方法において、タンパク質あるい
はペプチドに酸無水物を作用させ、カルボキシ末端をオ
キサゾロンとする工程が含まれることを特徴とする、タ
ンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法。
【請求項２】タンパク質またはペプチドのカルボキシ
末端アミノ酸を遊離させる工程と、得られたアミノ酸ま
たはアミノ酸誘導体を分離し同定する操作と、を組み合
わせた手順をくり返す方法において、タンパク質あるい
はペプチドに酸無水物を作用させ、アミノ末端を保護し
カルボキシ末端をオキサゾロンとする工程が含まれるこ
とを特徴とする、タンパク質あるいはペプチドのカルボ
キシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項３】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ末端を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、生成したカルボキシ末端が
オキサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドに酸
とアルコールを作用させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊
離させる第２工程と、から構成される操作と、前記第２
工程において得られたアミノ酸を分離し同定する操作
と、を組み合わせた手順をくり返し実施することを特徴
とするタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端か
らのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項４】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ末端を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、生成したカルボキシ末端が
オキサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドに酸
とアルコールを含む溶液を作用させ、カルボキシ末端ア
ミノ酸を遊離させる第２工程と、から構成される操作
と、前記第２工程において得られたアミノ酸を分離し同
定する操作と、を組み合わせた手順をくり返し実施する
ことを特徴とするタンパク質あるいはペプチドのカルボ
キシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項５】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ末端を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、生成したカルボキシ末端が
オキサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドにエ
ステルを作用させ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させ
る第２工程と、から構成される操作と、前記第２工程に
おいて得られたアミノ酸を分離し同定する操作と、を組
み合わせた手順をくり返し実施することを特徴とするタ
ンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法。
【請求項６】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ末端を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、生成したカルボキシ末端が
オキサゾロンとなったタンパク質あるいはペプチドに酸
とアルコールを含む溶液から得られるエステルを作用さ
せ、カルボキシ末端アミノ酸を遊離させる第２工程と、
から構成される操作と、前記第２工程において得られた
アミノ酸を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順
をくり返し実施することを特徴とするタンパク質あるい
はペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定
する方法。
【請求項７】前記タンパク質あるいはペプチドに酸無
水物を作用させアミノ末端を保護しカルボキシ末端をオ
キサゾロンとする第１工程において、酢酸を添加するこ
とを特徴とする請求項３から請求項６記載のタンパク質
あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列
を決定する方法。
【請求項８】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端をオキサ
ゾロンとする第１工程と、アルコールを作用させ、カル
ボキシ末端アミノ酸を遊離させる第２工程と、アミンを
作用させ、エステルを加水分解する第３工程と、から構
成される一連の操作と、前記第２工程において得られた
アミノ酸を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順
をくり返し実施することを特徴とするタンパク質あるい
はペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定
する方法。
【請求項９】タンパク質あるいはペプチドに酸無水物
を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端をオキサ
ゾロンとする第１工程と、アルコールを作用させ、カル
ボキシ末端アミノ酸を遊離させる第２工程と、アミンを
作用させ、エステルを加水分解する第３工程と、から構
成される一連の操作と、前記第３工程後にアミノ酸を分
離し同定する操作と、を組み合わせた手順をくり返し実
施することを特徴とするタンパク質あるいはペプチドの
カルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１０】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、アルコールを作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸を遊離させる第２工程と、アミン
水溶液を作用させ、エステルを加水分解する第３工程
と、から構成される一連の操作と、前記第２工程におい
て得られたアミノ酸を分離し同定する操作と、を組み合
わせた手順をくり返し実施することを特徴とするタンパ
ク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸
配列を決定する方法。
【請求項１１】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程と、アルコールを作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸を遊離させる第２工程と、アミン
水溶液を作用させ、エステルを加水分解する第３工程
と、から構成される一連の操作と、前記第３工程後にア
ミノ酸を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順を
くり返し実施することを特徴とするタンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法。
【請求項１２】前記タンパク質あるいはペプチドに酸
無水物を作用させアミノ基保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程において、酢酸を添加すること
を特徴とする、請求項８から請求項１１記載のタンパク
質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配
列を決定する方法。
【請求項１３】前記アルコールを作用させカルボキシ
末端アミノ酸を遊離させる第２工程を、酸存在下で実施
することを特徴とする、請求項８から請求項１１記載の
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのア
ミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１４】前記タンパク質あるいはペプチドに酸
無水物を作用させアミノ基保護しカルボキシ末端をオキ
サゾロンとする第１工程において酢酸を添加し、さらに
前記アルコールを作用させカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させる第２工程を酸存在下で実施することを特徴とす
る、請求項８から請求項１１記載のタンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法。
【請求項１５】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端アミノ
酸がアスパラギン酸ではない場合にはカルボキシ末端を
オキサゾロンとし、カルボキシ末端アミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合にはカルボキシ末端を分子内酸無水物とす
る第１工程と、アルコールを作用させ、カルボキシ末端
がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合には分
子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２工程
と、酸無水物を作用させ、カルボキシ末端にオキサゾロ
ンを生成させる第３工程と、アルコールで作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離
させる、第４工程と、アミンを作用させ、エステルを加
水分解する第５工程と、から構成される一連の操作と、
前記第２工程において得られたアミノ酸を分離し同定す
る操作と、前記第５工程において得られたアミノ酸を分
離し同定する操作と、を組み合わせた手順をくり返し実
施することを特徴とするタンパク質あるいはペプチドの
カルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１６】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端アミノ
酸がアスパラギン酸ではない場合にはカルボキシ末端を
オキサゾロンとし、カルボキシ末端アミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合にはカルボキシ末端を分子内酸無水物とす
る第１工程と、アルコールを作用させ、カルボキシ末端
がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合には分
子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２工程
と、酸無水物を作用させ、カルボキシ末端にオキサゾロ
ンを生成させる第３工程と、アルコールで作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離
させる第４工程と、アミンを作用させ、エステルを加水
分解する第５工程と、から構成される一連の操作と、前
記第２工程において得られたアミノ酸を分離し同定する
操作と、を組み合わせた手順をくり返し実施することを
特徴とするタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末
端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１７】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端アミノ
酸がアスパラギン酸ではない場合にはカルボキシ末端を
オキサゾロンとし、カルボキシ末端アミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合にはカルボキシ末端を分子内酸無水物とす
る第１工程と、アルコールを作用させ、カルボキシ末端
がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合には分
子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２工程
と、酸無水物を作用させ、カルボキシ末端にオキサゾロ
ンを生成させる第３工程と、アルコールで作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離
させる第４工程と、アミンを作用させ、エステルを加水
分解する第５工程と、から構成される一連の操作と、前
記第３工程において得られたアミノ酸誘導体を分離し同
定する操作と、を組み合わせた手順をくり返し実施する
ことを特徴とするタンパク質あるいはペプチドのカルボ
キシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１８】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端アミノ
酸がアスパラギン酸ではない場合にはカルボキシ末端を
オキサゾロンとし、カルボキシ末端アミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合にはカルボキシ末端を分子内酸無水物とす
る第１工程と、アルコールを作用させ、カルボキシ末端
がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合には分
子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２工程
と、酸無水物を作用させ、カルボキシ末端にオキサゾロ
ンを生成させる第３工程と、アルコールで作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離
させる第４工程と、アミンを作用させ、エステルを加水
分解する第５工程と、から構成される一連の操作と、前
記第４工程において得られた混合物からアミノ酸誘導体
を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順をくり返
し実施することを特徴とするタンパク質あるいはペプチ
ドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方
法。
【請求項１９】タンパク質あるいはペプチドに酸無水
物を作用させ、アミノ基を保護しカルボキシ末端アミノ
酸がアスパラギン酸ではない場合にはカルボキシ末端を
オキサゾロンとし、カルボキシ末端アミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合にはカルボキシ末端を分子内酸無水物とす
る第１工程と、アルコールを作用させ、カルボキシ末端
がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ酸を遊
離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合には分
子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２工程
と、酸無水物を作用させ、カルボキシ末端にオキサゾロ
ンを生成させる第３工程と、アルコールで作用させ、カ
ルボキシ末端アミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離
させる第４工程と、アミンを作用させ、エステルを加水
分解する第５工程と、から構成される一連の操作と、前
記第５工程において得られた混合物からアミノ酸誘導体
を分離し同定する操作と、を組み合わせた手順をくり返
し実施することを特徴とするタンパク質あるいはペプチ
ドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方
法。
【請求項２０】タンパク質あるいはペプチドにハロゲ
ン化蟻酸のエステルを作用させ、アミノ基を保護しカル
ボキシ末端アミノ酸がアスパラギン酸ではない場合には
カルボキシ末端をオキサゾロンとし、カルボキシ末端ア
ミノ酸がアスパラギン酸の場合にはカルボキシ末端を分
子内酸無水物とする第１工程と、アルコールを作用さ
せ、カルボキシ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキ
シ末端アミノ酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸
無水物の場合には分子内無水物をアルコリシスにより開
環させる第２工程と、ハロゲン化蟻酸のエステルを作用
させ、カルボキシ末端にオキサゾロンを生成させる第３
工程と、アルコールで作用させ、カルボキシ末端アミノ
酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程と、
アミンを作用させ、エステルを加水分解する第５工程
と、から構成される一連の操作と、前記第２工程におい
て得られたアミノ酸を分離し同定する操作と、前記第５
工程において得られたアミノ酸を分離し同定する操作
と、を組み合わせた手順をくり返し実施することを特徴
とするタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端か
らのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項２１】タンパク質あるいはペプチドにハロゲ
ン化蟻酸のエステルを作用させ、アミノ基を保護しカル
ボキシ末端アミノ酸がアスパラギン酸ではない場合には
カルボキシ末端をオキサゾロンとし、カルボキシ末端ア
ミノ酸がアスパラギン酸の場合にはカルボキシ末端を分
子内酸無水物とする第１工程と、アルコールを作用さ
せ、カルボキシ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキ
シ末端アミノ酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸
無水物の場合には分子内無水物をアルコリシスにより開
環させる第２工程と、ハロゲン化蟻酸のエステルを作用
させ、カルボキシ末端にオキサゾロンを生成させる第３
工程と、アルコールで作用させ、カルボキシ末端アミノ
酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程と、
アミンを作用させ、エステルを加水分解する第５工程
と、から構成される一連の操作と、前記第２工程におい
て得られたアミノ酸を分離し同定する操作と、を組み合
わせた手順をくり返し実施することを特徴とするタンパ
ク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸
配列を決定する方法。
【請求項２２】タンパク質あるいはペプチドにハロゲ
ン化蟻酸のエステルを作用させ、アミノ基を保護しカル
ボキシ末端アミノ酸がアスパラギン酸ではない場合には
カルボキシ末端をオキサゾロンとし、カルボキシ末端ア
ミノ酸がアスパラギン酸の場合にはカルボキシ末端を分
子内酸無水物とする第１工程と、アルコールを作用さ
せ、カルボキシ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキ
シ末端アミノ酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸
無水物の場合には分子内無水物をアルコリシスにより開
環させる第２工程と、ハロゲン化蟻酸のエステルを作用
させ、カルボキシ末端にオキサゾロンを生成させる第３
工程と、アルコールで作用させ、カルボキシ末端アミノ
酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程と、
アミンを作用させ、エステルを加水分解する第５工程
と、から構成される一連の操作と、前記第３工程におい
て得られたアミノ酸誘導体を分離し同定する操作と、を
組み合わせた手順をくり返し実施することを特徴とする
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのア
ミノ酸配列を決定する方法。
【請求項２３】タンパク質あるいはペプチドにハロゲ
ン化蟻酸のエステルを作用させ、アミノ基を保護しカル
ボキシ末端アミノ酸がアスパラギン酸ではない場合には
カルボキシ末端をオキサゾロンとし、カルボキシ末端ア
ミノ酸がアスパラギン酸の場合にはカルボキシ末端を分
子内酸無水物とする第１工程と、アルコールを作用さ
せ、カルボキシ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキ
シ末端アミノ酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸
無水物の場合には分子内無水物をアルコリシスにより開
環させる第２工程と、ハロゲン化蟻酸のエステルを作用
させ、カルボキシ末端にオキサゾロンを生成させる第３
工程と、アルコールで作用させ、カルボキシ末端アミノ
酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程と、
アミンを作用させ、エステルを加水分解する第５工程
と、から構成される一連の操作と、前記第４工程におい
て得られた混合物からアミノ酸誘導体を分離し同定する
操作と、を組み合わせた手順をくり返し実施することを
特徴とするタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末
端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項２４】タンパク質あるいはペプチドにハロゲ
ン化蟻酸のエステルを作用させ、アミノ基を保護しカル
ボキシ末端アミノ酸がアスパラギン酸ではない場合には
カルボキシ末端をオキサゾロンとし、カルボキシ末端ア
ミノ酸がアスパラギン酸の場合にはカルボキシ末端を分
子内酸無水物とする第１工程と、アルコールを作用さ
せ、カルボキシ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキ
シ末端アミノ酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸
無水物の場合には分子内無水物をアルコリシスにより開
環させる第２工程と、ハロゲン化蟻酸のエステルを作用
させ、カルボキシ末端にオキサゾロンを生成させる第３
工程と、アルコールで作用させ、カルボキシ末端アミノ
酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程と、
アミンを作用させ、エステルを加水分解する第５工程
と、から構成される一連の操作と、前記第５工程におい
て得られた混合物からアミノ酸誘導体を分離し同定する
操作と、を組み合わせた手順をくり返し実施することを
特徴とするタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末
端からのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項２５】前記アルコールを作用させ、カルボキ
シ末端がオキサゾロンの場合にはカルボキシ末端アミノ
酸を遊離させ、カルボキシ末端が分子内酸無水物の場合
には分子内無水物をアルコリシスにより開環させる第２
工程と、前記アルコールで作用させ、カルボキシ末端ア
ミノ酸をアミノ酸のエステルとして遊離させる第４工程
と、を酸存在下で実施することを特徴とする請求項１５
から請求項２４記載のタンパク質あるいはペプチドのカ
ルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。