WO2004053498A1 - ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法 - Google Patents

ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法 Download PDF

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WO2004053498A1
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acid
amino acid
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anhydride
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PCT/JP2003/015522
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Kenji Miyazaki
Akira Tsugita
Kenichi Kamijo
Takuji Nabetani
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Nec Corporation
Tokyo Rikakikai Co., Ltd.
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
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    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide, and more specifically, to a peptide, for example, a peptide having a large number of amino acid residues, such as a protein, by sequentially analyzing the C-terminal amino acid of the peptide by a chemical method.
  • the present invention relates to a method for elucidating the C-terminal amino acid sequence based on the molecular weight reduction of a series of amino acids that are sequentially decomposed, and the molecular weight of the reaction product is determined by mass spectrometry.
  • Identification of amino acid sequences of peptides and proteins collected from nature is essential information when studying the biological properties and functions of such peptides and proteins.
  • the entire amino acid sequence of peptides and proteins is based on the corresponding genetic information, that is, the amino acid deduced based on the genomic gene encoding these peptides and the nucleotide sequence of c-DNA prepared from m_RNA. It has been determined as an array.
  • knowledge of the partial amino acid sequence of the peptide is still necessary in order to identify the genomic gene encoding the peptide and the c-DNA prepared from the mRNA.
  • the N-terminal amino acid sequence and the C-terminal amino acid sequence of the peptide are particularly useful.
  • the target c-DNA can be selected using the prepared nucleic acid probes based on the amino acid sequences at both ends.
  • the PCR method is applied using oligonucleotide primers prepared based on the amino acid sequences at both ends.
  • the target c_DNA can be selectively amplified.
  • a high-concentration aqueous solution of pentafluoropropanoic acid (CF 3 CF 2 COOH) is added to dried peptides while heating to 90 ° C, or Heptafluorobutanoic acid (CF 3 CF 2 CF 2 COOH)
  • CF 3 CF 2 COOH pentafluoropropanoic acid
  • Heptafluorobutanoic acid (CF 3 CF 2 CF 2 COOH)
  • the selective decomposition reaction of the above c-terminal amino acid proceeds sequentially, and after a predetermined processing time, 1 to 10 amino acid residues are removed from the C-terminal of the original peptide, respectively.
  • a mixture containing a series of reaction products is obtained.
  • mass spectrometry is applied to the mixture containing the series of reaction products to measure the mass of the ion species derived from each reaction product, a series of peaks showing a mass difference reflecting the C-terminal amino acid sequence Can be measured.
  • each reaction product is generated from the original peptide in a sequential C-terminal amino acid degradation reaction, for example, from the original peptide to a reaction product in which several amino acid residues have been removed from the original peptide.
  • mass spectrometry for a series of several reaction product groups, the masses of the corresponding ionic species can be analyzed collectively, and the C-terminal amino acid for such several amino acid residues Sequences can be determined collectively.
  • C-terminal amino acids used for the preparation of nucleic acid probes and primers The sequence information is usually a base sequence encoding a powerful amino acid sequence, having a length of about 18 to 24 bases, and thus may have about 6 to 8 amino acids, and may have about 10 amino acids. It is only necessary in very special cases to elucidate the C-terminal amino acid sequence that reaches Therefore, the above-mentioned perfluoroalkanoic acid or perfluoroalkanoic anhydride vapor is supplied from the gas phase and is allowed to act on the dried peptide, thereby performing a sequential C-terminal amino acid decomposition reaction. For example, these means of preparing a processed sample containing a series of reaction products simultaneously to achieve the removal of 10 amino acid residues are adapted for the above-mentioned applications. Disclosure of the invention
  • the molecular weight of the original peptide itself exceeds the molecular weight range applicable to mass spectrometry, or Since the change in the formula weight of one amino acid residue is relatively small compared to the large molecular weight of the peptide itself, and the measurement accuracy of the molecular weight difference is reduced, the following measures have been studied. Specifically, a series of reaction products in which 1 to 10 amino acid residues have been removed from the C-terminus of the original peptide obtained by the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid described above.
  • a mixture containing the following was digested enzymatically with a long peptide chain using a protease with cleavage site specificity, such as trypsin, capable of selective cleavage of peptide chains at specific amino acid sites.
  • a protease with cleavage site specificity such as trypsin
  • the form of performing mass spectrometry on the peptide fragment is used.
  • the mixture of peptide fragments obtained by vigorous enzymatic digestion contains a C-terminal peptide fragment derived from the original peptide and, in contrast, 1 to 10 amino acid residues.
  • the above-described technique of supplying perfluoroalnic acid or perfluoroalnic acid anhydride vapor from the gas phase and acting on the dried peptide is a useful means for elucidating the C-terminal amino acid sequence
  • the peptide to be analyzed is, for example, a peptide having a large number of amino acid residues such as a protein, it has been found that some practical problems described below remain when the method is used as a general-purpose means.
  • the first problem is that, using the above-mentioned high-concentration aqueous solution of perfluoroalkanoic acid, for example, while heating to 90 ° C and allowing perfluoroalkanoic acid vapor to act on the dried peptide, ⁇ , ⁇ -acyl rearrangement between the ⁇ -amino group (1 ⁇ -) and the hydroxy group (1 ⁇ ) in the serine residue (1-NH—CH (CH 2 OH) -CO-)
  • the reaction also proceeds, followed by hydrolysis, and there is a side reaction that peptide cleavage occurs at the terminal side of the serine residue.
  • the second problem is that if the peptide to be analyzed is a peptide with a large number of amino acid residues, such as a protein, the cleavage site specific after performing the selective degradation reaction of the C-terminal amino acid It has been considered to add an enzyme digestion treatment using a protease having a property to measure the molecular weight of the resulting C-terminal peptide fragment. A plurality of N-terminal peptide fragments by-produced will be simultaneously observed on the measured mass spectrometry spectrum. In other words, the peaks derived from the original peptide and C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products and the peaks derived from other N-terminal peptide fragments were separated with high accuracy.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to sequentially convert the above-mentioned C-terminal amino acid of a long peptide chain by utilizing a reaction mechanism via formation of an oxazolone ring structure.
  • An object of the present invention is to provide a method that can more easily analyze the C-terminal amino acid sequence of a! /, Peptide chain.
  • the present inventors have conducted intensive studies and studies in order to solve the above-mentioned problems.As a result, using a high concentration aqueous solution of perfluoroalkanoic acid, for example, drying while heating to 90 ° C.
  • the present inventors have developed a highly reactive reagent such as perfluoroalkanoic anhydride without using an aqueous solvent as a source of water molecules into the system.
  • a highly reactive reagent such as perfluoroalkanoic anhydride
  • an aqueous solvent as a source of water molecules into the system.
  • a C-terminal amino acid to form an oxazolone ring structure as a reaction intermediate, followed by the cleavage of the oxazolone ring
  • searching for reaction conditions capable of performing a selective decomposition reaction of terminal amino acids using a mixture of a small amount of perfluoroalkanoic acid added to arnic acid anhydride, for example, From the phase, the vaporized perfluorinated arnic acid and arnic acid anhydride, supplied from this mixture, are allowed to act on the dried peptide, for example, even at processing temperatures below 60 ° C.
  • alkanoic anhydrides are much more moderately reactive than perfluoroalkanoic anhydrides. I also found that it was not possible.
  • the N-acylation reaction to the N-terminal amino group proceeds, and the amino group at the ⁇ -position of the lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) N-acylation reaction of tyrosine residue (one NH—CH (CH 2 -C 6 H 4 -OH) -CO-) to phenolic hydroxy group also progresses. Also turned out.
  • reactive functional groups such as hydroxyl groups and amino groups on the side chains involved in rearrangement reactions such as N, O-acyl rearrangement reactions, which induce peptide cleavage in the middle, are protected and modified.
  • an oxazolone ring structure is formed from the target C-terminal amino acid as a reaction intermediate, and only the decomposition reaction of the C-terminal amino acid accompanying the cleavage of this oxazolone ring is continued.
  • the treatment proceeds selectively at a processing temperature of 60 ° C or lower.
  • the present inventors have made use of the above-mentioned perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride to form an oxazolone ring structure, followed by selective cleavage of the C-terminal amino acid accompanying cleavage of this oxazolone ring.
  • water molecules are not present in the system, and perfluoroalkanoic acid and alkane are contained in a dipolar aprotic solvent.
  • the gel electrophoresis even if the peptide is carried on such a gel carrier, it is subjected to a dehydration treatment for sufficiently removing the water impregnated in the gel carrier, and then the dipolar aprotic
  • a solution prepared by dissolving perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride in a solvent is immersed in the gel carrier and the gel is swelled, the same liquid phase reaction occurs in the gel carrier. was found to be able to achieve.
  • the present inventors are involved in a rearrangement reaction such as N, O-acyl rearrangement reaction, which induces premature cleavage of a peptide due to diacylation to a hydroxy group and N-acylation to an amino group.
  • a rearrangement reaction such as N, O-acyl rearrangement reaction
  • reactive functional groups such as hydroxy group and amino group on the side chain
  • formation of oxazolone ring structure using perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride as described above.
  • performing a selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid accompanying the cleavage of the oxazolone ring was more effective in avoiding unnecessary side reactions.
  • Supply When the vaporized alkanoic anhydride and alkanoic acid are allowed to react with each other, an amino group at the N-terminus of the peptide and an amino acid at a side chain of a lysine residue which may be contained in the peptide are obtained. It has been found that the group can be subjected to N-acylation with an acyl group derived from the alkanoic anhydride and O-acylation to a hydroxy group on a side chain in advance.
  • the peptide is carried on the gel carrier, it is subjected to a dehydration treatment to sufficiently remove the water impregnated in the gel carrier, and then the alginate is placed in a dipolar aprotic solvent.
  • a solution prepared by dissolving the acid anhydride is immersed in the gel carrier to swell the gel, and the N-acylation and O-acylich reaction can be performed in the same liquid phase even in the gel carrier. Found that it is possible.
  • the present inventors have also formed a oxazolone ring structure, and subsequently, a reactive intermediate associated with the cleavage of this oxazolone ring remains. It is necessary to subject the intermediate to a hydrolysis treatment to restore the C-terminus of the reaction product to a form in which a carboxy group is exposed, for subsequent mass spectrometry.
  • the peptide chain of the reaction product generated by the decomposition reaction of the C-terminal amino acid also has the amino group at the N-terminal thereof and the amino acid at the side chain of lysine residue which may be contained in the peptide chain.
  • the group will have N-acylation protection.
  • amino groups on the side chains of lysine residues that may be contained in the peptide chain include:
  • tryptic digestion When tryptic digestion is applied to a long peptide chain protected by N-acylation, trypsin digestion at the C-terminal peptide bond of lysine or arginine residue results in the specificity of lysine residue in the cleavage site specificity of trypsin.
  • the amino group of the side chain is protected by N-acylation, and the peptide chain is not digested at the N-acylated lysine residue, and the resulting peptide fragment is not digested by arginine residue.
  • the average frequency of arginine residues contained in the peptide chain for example, in a long peptide chain of about 200 amino acids, at least 4 or more, at most about 10 Only one arginine residue is present, and the above-mentioned C-terminal contains one arginine residue.
  • the number of common peptide fragments is about 4 to 10, and the C-terminal side derived from the original peptide chain.
  • the present inventors have conceived that the likelihood that the number of amino acids in the peptide fragment is in the range of at least 15 amino acids to 50 amino acids is considerably high.
  • the present inventors have developed MALD I-TOF-MS (Matri Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometer try; When using a desorption ionization time-of-flight mass spectrometry method to measure the molecular weight of the cation species generated by the ionization treatment and the molecular weight of the anion species, a cation-like amino acid residue at the C-terminus
  • the peak intensity in the molecular weight measurement with a cationic species is significantly higher than the corresponding peak intensity in the molecular weight measurement with an anionic species, while the cathodic at the C-terminus Naa
  • the general trend is that the peak intensity in molecular weight measurements with anionic species is significantly larger than the corresponding peak intensity in molecular weight measurements with cationic species.
  • a common peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus obtained by trypsin digestion is observed as a single peak with a large relative intensity in the measurement of molecular weight by cationic species.
  • the peak intensity corresponding to the force and the common peptide fragment is relatively weak, but it can be easily identified by comparing the measurement results of the two, so the reverse.
  • a series of peaks observed with a large relative intensity were derived from the original peptide chain derived from the partial amino acid sequence at the C-terminal side and containing no arginine residue.
  • a group of C-terminal peptide fragments derived from the peptide chain of the reaction product can be easily identified as showing a series of peaks.
  • one arginine residue is contained at the C-terminus.
  • the common peptide fragment is discriminated from the original peptide chain containing no arginine residue and a group of C-terminal peptide fragments derived from the peptide chain of a series of reaction products.
  • the present invention has the above-mentioned technical idea commonality, the present invention has a plurality of forms in which specific forms differ due to the existence state of the target peptide chain.
  • the first form to be applied when the peptide to be analyzed is a previously isolated dry sample, and the peptide to be analyzed must be separated by gel electrophoresis in advance.
  • the second embodiment is applied to a case where the sample is supported on the gel carrier.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the first embodiment of the present invention is a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide to be analyzed, comprising the steps of: Preparing a mixture containing a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid by means;
  • the molecular weight difference between the series of reaction products and the original peptide was determined by mass spectrometry. Analyzing the C-terminal amino acid to sequentially reduce the molecular weight,
  • N-acylation of an amino group at the N-terminus of the peptide and an amino group of a side chain of a lysine residue which may be contained in the peptide with an acyl group derived from the alkanoic anhydride A pretreatment step of applying N-acylation protection; and drying the N-acylation-protected dry sample of the peptide of interest at 15 ° C to 60 ° C under a dry atmosphere. At the temperature selected for the range,
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and the C-terminal amino acid is decomposed with the cleavage of the 5-oxazolone ring.
  • trypsin is allowed to act, and the N-acyl is reacted with the amino group at the N-terminus of the peptide chain and the amino group of the side chain of the lysine residue that may be contained in the peptide chain.
  • a digestion treatment specific to the trypsin enzyme which retains the protection of the peptide, by selective cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain.
  • a step of performing peptide fragmentation subjecting to desalting, removing the buffer solution component, collecting the tryptic digested peptide fragment, and drying.
  • the dried mixture containing the recovered tryptic digested peptide fragments is subjected to molecular weight measurement using a cation species generated in the ionization treatment, and using a negative ion species. Perform molecular weight measurement,
  • the intensity in the molecular weight measurement by the cation species is determined to be a peak that gives a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement by the anion species, and is determined as the original peptide generated in the trypsin digestion treatment.
  • the peak of the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid is as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement using the anion species is determined to be a peak giving a relatively large intensity as compared with the intensity in the molecular weight measurement using the cation species, and the intensity is relatively large in the molecular weight measurement using the anion species.
  • a symmetrical acid anhydride of alnic acid having 2 to 4 carbon atoms is used as the alkynic anhydride contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the above-mentioned alkynic anhydride.
  • a symmetrical acid anhydride of alnic acid having 2 to 4 carbon atoms is used.
  • acetic anhydride as the alkanoic anhydride contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the alkanoic anhydride.
  • the pKa of the perfluoroalkanoic acid is 0. It is preferred to use a perfluoroalkanoic acid in the range of 3-2.5. At this time, it is more preferable to use perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as perfluoroalkanoic acid contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the alkanoic anhydride. preferable.
  • a linear perfluorocarbon having 2 to 4 carbon atoms may be used. It is more preferable to use a fluoroalkanoic acid.
  • the content ratio of perfluoroalkanoic acid is such that alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid are contained. It is desirable to select from the range of 1 to 20% by volume based on the total volume of
  • the drying atmosphere is more preferably a state in which oxygen has been removed in addition to moisture.
  • the above-mentioned dry atmosphere is achieved by evacuating the atmosphere inside the airtight container.
  • the temperature is more preferably set to a temperature selected from the range of 15 ° C to 50 ° C. .
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the second aspect of the present invention comprises:
  • a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide to be analyzed in which a mixture containing a series of reaction products obtained by sequentially decomposing C-terminal amino acids by chemical means is prepared from the target peptide.
  • the gel sample is subjected to the gel-form at a temperature selected from the range of 30 ° C. to 80 ° C. with respect to the target peptide sample supported on the gel carrier.
  • the gel carrier is immersed in the alkanoic anhydride solution using a solution obtained by dissolving the alkanoic anhydride in a dipolar aprotic solvent that can be infiltrated into a substance and can be maintained in a swollen state.
  • the alkanoic anhydride is allowed to act on the peptide sample of interest in the supported state, and the amino group at the N-terminus of the peptide of interest and the possibility of being contained in the peptide
  • the amino group on the side chain of the lysine residue is previously subjected to N-acylation protection by an acyl group derived from the alkanoic acid constituting the alkanoic anhydride,
  • a temperature selected from the range of 30 ° C. to 80 ° C. is applied to the target peptide sample supported on the gel carrier.
  • Perfluoroalkanoic acid is dissolved in a dipolar non-protonic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state at a ratio of a small amount to arnic anhydride.
  • the gel carrier is immersed in the mixed solution using the mixed solution prepared as described above, whereby the alkanoic anhydride and the perfluoroalnic acid are allowed to act on the target peptide sample in a supported state.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid).
  • the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid is mixed with the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic acid anhydride and the dipolar aprotic solvent without causing the gel-like substance to dissolve.
  • a mixture containing a series of reaction products obtained by a reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid is reacted with a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a third nitrogen-containing compound while being supported on the gel carrier.
  • a water molecule is allowed to act on the reaction product peptide in the coexistence of the basic nitrogen-containing organic compound, and the water treatment is performed.
  • the re-dehydration treatment is performed, and then the mixture containing the series of hydrolyzed reaction products is supported on the gel carrier. Then, trypsin dissolved in the buffer solution is allowed to act on the N-terminal amino group of the peptide chain and the N-amino group on the side chain of the lysine residue which may be contained in the peptide chain.
  • a peptide obtained by subjecting the peptide chain to a trypsin-enzyme-specific digestion treatment, which retains the acylyl protection, by selectively cleaving the C-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain Perform fragmentation,
  • the peptide fragment is released from the gel carrier and eluted into the buffer solution. Thereafter, desalting treatment is performed to remove the buffer solution component, and the trypsin digested peptide fragment is recovered. , Drying process is provided, Next, using the MA LDI-TOF-MS method, measuring the molecular weight of the recovered dry mixture containing the tryptic digested peptide fragment by the ionic species generated by the ionization treatment, and measuring the molecular weight by the anionic species Perform molecular weight measurement,
  • the peak of a peptide fragment having an arginine residue at the C-terminus generated by the trypsin digestion treatment is as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement by the ionic species is determined to be a peak giving a relatively large intensity as compared with the intensity in the molecular weight measurement by the anionic species, and the intensity is determined by the original peptide generated by the trypsin digestion treatment.
  • the peaks of the C-terminal peptide fragment derived from the C-terminal peptide fragment and the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid are as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement by the anionic species is determined to be a peak giving a relatively large intensity as compared with the intensity in the molecular weight measurement by the cation species, and the intensity is relatively large in the molecular weight measurement by the anionic species.
  • alkanoic anhydride contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small ratio with respect to the alkanoic anhydride a symmetrical acid of alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is used. It is preferred to use an anhydride. In this case, it is more preferable to use a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride of the alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • acetic anhydride as the alkanoic anhydride contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount with respect to the arnic anhydride.
  • the perfluoroalnic acid is in a small amount relative to the anhydride of arnic acid.
  • perfluoroalkanoic acid contained in the mixed solution obtained by dissolving at a ratio perfluoroalkanoic acid having a pKa of the perfluoroalkanoic acid in the range of 0.3 to 2.5 is used. Is preferred.
  • perfluoroalkanoic acid contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount ratio with respect to arnic acid anhydride perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is used. It is preferred to use loalkanoic acids. In this case, it is more preferable to use a linear perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • the content ratio of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small ratio with respect to the alkanoic anhydride is as follows. More preferably, it is selected in the range of 1 to 20 volumes of perfluoroalkanoic acid per 100 volumes of the product.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process flow illustrating an example of a detailed operation procedure for a peptide dried sample in a process of sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the first embodiment of the present invention. It is.
  • FIG. 2 shows an example of a detailed operation procedure for a peptide sample supported on a gel in a process for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the second embodiment of the present invention. It is a figure showing the process flow illustrated.
  • FIG. 3 shows that the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain of a dried sample of poma 'myoglobin was determined according to the treatment method for sequentially decomposing the C-terminal amino acid from the peptide according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a mass spectrometry spectrum obtained by measuring a peptide fragment obtained by digesting a reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the mixture into a tryptic digest in a cation species detection mode using a MA LDI-TOF-MS device. .
  • FIG. 4 shows the results for a dried sample of Puma 'myoglobin according to the treatment method for sequentially decomposing C-terminal amino acids from peptides according to the first embodiment of the present invention.
  • the peptide fragment obtained by trypsin digestion of the reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain was measured in an anion species detection mode using a MA LDI-TOF-MS device
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a mass spectrometry spectrum.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a method for sequentially decomposing C-terminal amino acids from a peptide according to the second embodiment of the present invention.
  • the globin peptide chain C Peptide fragments obtained by tryptic digestion of the reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the terminal amino acids were analyzed by mass spectrometry using a MA LDI-T ⁇ F-MS device in a cationic species detection mode. It is a figure which shows an example of a knotnore.
  • FIG. 6 shows a globin-peptide chain of a poma myoglobin sample supported on a gel according to a treatment method for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the second embodiment of the present invention.
  • the peptide fragment obtained by tryptic digestion of the reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid of the above was analyzed by mass spectrometry using a MA LDI-TOF-MS device in an anion species detection mode. It is a figure showing an example of a vector.
  • Figure 7 shows the trypsin cleavage site at the C-terminal peptide bond of arginine residues and N-acetylation protection, which is contained in the amino acid sequence of the globin peptide chain, which composes pima'myoglobin. Indicates a lysine residue that is prevented from being cleaved at the C-terminal peptide bond when applied.
  • FIG. 7 is a diagram showing a comparison between mass spectrometry spectra measured in the () and cation species detection modes (top).
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is basically a method of shortening the peptide by sequentially removing the C-terminal amino acid of the peptide to be analyzed from the peptide to be analyzed.
  • a series of reaction products and further, of the peptide fragments obtained by tryptic digestion of the series of reaction products and the original peptide, of the c-terminal peptide fragment derived from the series of reaction products
  • a method for identifying the removed amino acids is adopted.
  • the C-terminal peptide fragment obtained by digestion with such trypsin is cleaved at a cleavage site specific to the trypsin, and further, the C-terminal derived from this series of reaction products.
  • a MA LDI_TOF-MS device is used as a means of measuring the molecular weight of the side peptide fragment and the molecular weight of the C-terminal peptide fragment derived from the original peptide. This makes it possible to measure the cationic species to which (H +) is added and the anionic species from which the proton (H +) has been released from the peptide fragment.
  • the amino acid residues constituting the C-terminal peptide fragment do not contain arginine residues or lysine residues, the cationic species derived from such arginine residues or lysine residues are not included. There is no stabilization mechanism.Comparing the results of measurement of cationic species with those of anionic species, trypsin contains arginine and lysine residues in amino acid residues. The relative intensities of the other peptide fragments by digestion are different from that of the other peptide fragments. A series of C-terminal peptides were detected from multiple peaks measured by the MA LDI-T ⁇ F-MS instrument. Identification of peaks caused by fragments ⁇ Used for discrimination.
  • the biggest feature of the analysis method according to the present invention is that
  • the peptide is obtained after the trypsin digestion treatment. Except for the common N-terminal peptide fragment and the C-terminal peptide fragment derived from the desired series of reaction products, which are generated when the original peptide is digested with h-ribsin in the mixture of peptide fragments, To the secondary Another object of the present invention is to prevent contamination of peptide fragments derived from the peptide bond cleavage reaction.
  • the target peptide chain is protected by N-acylation and O-acylation in advance, and Utilize the protection and, prior to the final trypsin digestion treatment, deprotect the protection by monoacylation, but retain the N-acylation protection on the lysine residue. In this way, fragmentation due to trypsin digestion occurs only at the C-terminal peptide bond of the arginine residue, thereby avoiding the generation of unnecessarily fragmented peptide fragments.
  • An important feature of the analysis method according to the present invention is that the derived C-terminal peptide fragment can be within a molecular weight range suitable for MALDI-TOF-MS measurement.
  • the reaction used in the present invention for sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of the target peptide is performed under a relatively low heating condition under an environment with water removed.
  • the alkanoic anhydride is catalyzed by perfluoroalkanoic acid, which exhibits high proton donating ability.
  • Act as a reagent for activating the C-terminal carboxy group of the peptide chain
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and forms a 5-oxazolone structure, and the C-terminal amino acid is It uses a method of performing decomposition.
  • the reaction of the formation of the 5-oxazolone ring, as a whole, is represented by the reaction formula (I):
  • the perfluoroalkanoic acid present in a small amount is made to function as a proton donor with respect to the dried peptide, thereby increasing the ratio of the enol form.
  • an alkanoic anhydride is used as a reagent for activating a C-terminal carboxy group.
  • the reaction represented by the reaction formula ( ⁇ ) can be carried out, for example, from the formed 5-oxazolone ring:
  • the serine residue in a peptide chain (an NH- CH (CH 2 OH) -CO- ), a threonine residue (- NH- CH (CH (CH 3) OH) -CO-)
  • the amino group at the ⁇ ; position (1- ⁇ ) of a serine residue (1-NH—CH (CH 2 OH) —CO—) due to the hydroxyl group (-1 OH)
  • the ester bond formed continues to be decomposed, and the peptide is cleaved at the N-terminal side of the serine residue.
  • the sequential C-terminal amino acid decomposition reaction is carried out in a dry state under mild temperature conditions, the above-mentioned serine residue (— ⁇ —CH (CH 2 OH) —CO—) and threonine residue
  • the side reaction involving the group one NH—CH (CH (CH 3 ) OH) —CO—) and the lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-)
  • a pre-treatment step for protection by N-acylation and O-acylation is provided before the sequential C-terminal amino acid degradation reaction.
  • the dry sample of the peptide of interest is subjected to drying at 10 ° C. to 6 ° C. in a dry atmosphere.
  • the alkane anhydride is allowed to act by reacting the alkanoic anhydride with the alkanoic acid, which is supplied from a mixture obtained by adding a small amount of alkanoic acid to the alkanoic anhydride.
  • the peptide sample supported on the gel is subjected to a dehydration treatment of the gel in advance, and in this pretreatment step, Dissolving the alkanoic anhydride in a dipolar, non-protonic solvent capable of infiltrating into the gel-like material and maintaining a swelling state at a temperature selected in the range of 0 ° C. to 80 ° C.
  • the gel carrier is immersed in the alkanoic anhydride solution using a solution comprising Achievement and achievability.
  • the liquid phase reaction in the dipolar aprotic solvent proceeds sufficiently without using the acid catalysis of an alkanoic acid having a proton donating ability.
  • alkanoic acid is generated in the system, the catalytic action is added, and the reaction is gradually promoted.
  • the proton-donating ability of the alkanoic acid derived in the system is inferior to the proton-donating ability of perfluoroalkanoic acid. Does not lead to
  • the amino group ( ⁇ 2 ) at the ⁇ -position of the lysine residue (NHNH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) is added with a calorie.
  • the amino group ( ⁇ 2 ) at the ⁇ -position of the lysine residue (NHNH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) is added with a calorie.
  • the amino group at the ⁇ -position of the lysine residue ((-CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-) ( ⁇ 2 )
  • ⁇ -acylation protection of the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain as a result of selecting hydrolysis treatment conditions that do not cause deprotection
  • trypsin digestion the amino group on the side chain
  • the enzymatic digestion reaction by trypsin does not proceed, and the peptide fragment obtained by trypsin digestion is obtained by digestion at the C-terminal side of arginine residues.
  • the amino group on the side chain of the lysine residue is subjected to a trypsin digestion treatment in a state where the amino group is protected for the acylation, whereby the peptide chain is Digested at two cleavage sites, arginine residue and lysine residue, Long peptide chains can be split into multiple peptide fragments by tryptic digestion of arginine residues, which are contained in the peptide chains at a moderate frequency, while avoiding unnecessary fragmentation.
  • the advantage that the molecular weight of the obtained C-terminal peptide fragment can be within the molecular weight range suitable for MALDI-TOF-MS measurement is positively utilized.
  • the present invention it is obtained by subjecting to trypsin digestion, desalting, collecting peptide fragments, drying and subjecting to trypsin digestion using a MA LDI-TOF-MS device. Measure the molecular weight of the ionic species from the mixture of peptide fragments.
  • the peptide fragments recovered and dried by desalting after trypsin digestion do not form various salts, but are used as the original peptide portion alone.
  • a cation species to which a proton (H +) has been added and an anion species to which a proton (H +) has been released can be generated for each peptide fragment. Ion species and anion species are measured separately.
  • the peptide fragment generated by trypsin digestion is derived from the N-terminal amino acid sequence common to the original peptide chain and the reaction product generated by the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid.
  • an arginine residue with a guanidino group rich in proton (H +) receptivity exists at the C-terminus of the fragment, stabilizing the cationic species to which proton (H +) is added.
  • an arginine residue is not present, and stabilization of a cationic species to which a proton (H +) is added due to the arginine residue does not occur.
  • the fragment in the mass spectrometry spectrum of the cationic species which is measured with a MA LDI-TOF-MS instrument, has an arginine residue at the C-terminal of the fragment, and has a common N-terminal.
  • the peak intensity derived from a series of peptide fragments derived from the amino acid sequence becomes relatively strong.
  • a carboxy group (one COOH) capable of donating a proton (H +) exists at the C-terminus, and it was measured using a MA LDI-TOF-MS instrument.
  • the peak intensity attributable to the C-terminal peptide fragment group 200 degrees is relatively strong.
  • the desalted and dried peptide fragment is subjected to measurement with a MA LDI-TOF-MS device, and the mass spectrometry of the cation species and the spectrum of the anion species are performed.
  • mass spectrometry of the cation species and the spectrum of the anion species are performed.
  • a series of peptide fragments derived from a common N-terminal amino acid sequence having an arginine residue at the C-terminus The peak due to the group is discriminated, and in the mass spectrometry spectrum of the anionic species, the N-terminal side common to the original peptide chain and the reaction product generated by the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid Peaks derived from a series of C-terminal peptide fragments derived from the amino acid sequence can be easily identified.
  • C-terminal, side peptide fragments not exist according arginine residues, at least, by trypsin digestion process, has its N-terminal amino acid amino groups of the ⁇ -position residue (one ⁇ 2) Since the corresponding peak is also shown on the mass spectrometry spectrum of the cation species, the assignment result of the amino acid type is determined by using the molecular weight of the corresponding peak observed in the mass spectrometry spectrum of the cation species. Can also be verified.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the first embodiment of the present invention corresponds to (1) to (3) in the steps (1) to (6) characterizing the present invention described above.
  • a dry sample of the peptide that has been subjected to isolation processing in advance is used. The following processing is performed for
  • a pretreatment step of applying N-acylation to the amino group on the side chain of the residue with an acyl group derived from the alkanoic anhydride and performing N-acylation protection is performed.
  • the N-acylation protection for the amino group of the side chain of lysine residue, which is performed in this pretreatment step, is described above.
  • the N-acylation protection on the lysine residue side chain does not proceed with deprotection, but the O-acylation protection performed simultaneously It is desirable to select an acyl group for which deprotection proceeds sufficiently.
  • a reaction in which a dried sample of a peptide can be supplied as a vapor from a gaseous phase to perform N-acylation that is, an O-acylation reaction.
  • a combination of an alkanoic anhydride as an electrophilic acylating agent as a reagent and an alkanoic acid as a catalyst for promoting the acylation reaction by its proton donating ability is used.
  • the arnic acid anhydride and arnic acid used in this pretreatment step are supplied as steam at a constant partial pressure ratio under a dry atmosphere to act on the peptide chain, and thus are kept in an airtight state.
  • the entire reaction vessel is heated and kept at a temperature selected in the range of 10 ° C to 60 ° C to evaporate from a mixture of alkanoic anhydride and a small amount of alkanoic acid added.
  • a straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms and a symmetrical anhydride derived from the straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is more preferably a symmetrical anhydride derived from alkanoic acid added in a small amount. That is, if the alkanoic anhydride and the alkanoic acid added in a small amount are of the same species, even if an acylation reaction occurs during the progress of the N-alkanoylation or O-alkanoylation reaction, Different alkanoyl groups are not mixed in the finally obtained N-alkanoylation and O-alkanoylation protection.
  • alkanoic anhydride and alkanoic acid are supplied as vapor to a dry peptide sample to proceed with the reaction.
  • the same arnic acid anhydride as the arnic acid anhydride used in the subsequent step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid can be suitably used.
  • this alkanoic anhydride under a dry atmosphere, at a temperature selected in the range of 10 ° C to 60 ° C, may cause unnecessary side reactions such as cleavage of the peptide by its reactivity. Is sufficiently low that, in vigorous pretreatment, the coexisting alkanoic acid has a much lower acid catalysis than perfluoroalkanoic acid, and thus causes unnecessary side reactions. Without this, it is possible to provide silation protection.
  • a peptide having a long amino acid sequence of interest such as a protein
  • a secondary structure or a tertiary structure a peptide that does not exhibit the multi-dimensional structure is subjected to a defolding process in advance.
  • the amino group at the N-terminal is protected by N-acyluich by converting it into a chain
  • the amino group of any side chain of lysine residue present in the peptide can be protected by N-acyluich.
  • the hydroxyl group on the side chain of the serine residue and the threonine residue present in the peptide is protected by the disulfide reaction.
  • the phenolic hydroxy group on the side chain of the tyrosine residue present in the peptide also has a different reactivity, but is partially oxidized.
  • the amino group of the side chain of lysine residue, and the hydroxyl group of the side chain of threonine residue in the case of serine residue are all protected and modified. And no longer participate in unnecessary side reactions.
  • the combination of alkanoic anhydride and alkanoic acid used in this pretreatment step may cause unnecessary side reactions such as cleavage in the middle of the peptide.
  • the reaction temperature is selected to be in the range of 10 ° C to 60 ° C, and more preferably, the reaction temperature is in the range of about room temperature or slightly higher than room temperature. It is preferable to select within the range, more specifically, it is preferable to select within the range of 15 ° C. to 50 ° C. Further, in the mixture obtained by adding a small amount of alkanoic acid to the alkanoic anhydride, the addition ratio of alkanoic acid is 2 to 1 with respect to the total volume of alkanoic anhydride and alkanoic acid. It is preferable to select the range of 0% by volume, specifically, 5% by volume.
  • the reaction rate of the N-acylation reaction in this pretreatment step depends on the partial pressure (gas phase concentration) of the alkanoic anhydride and alkanoic acid used and the reaction temperature. It is desirable that the time is appropriately selected mainly depending on the reaction temperature. For example, when selecting a reaction temperature of 50 ° C, complete the N-acylation of the N-terminal amino group of the peptide by selecting the reaction time within 1 hour, for example, 30 minutes. Is also possible.
  • a catalytic amount of pyridine for example, 0.1 to 1.0 volume with respect to the total of the alkanoic anhydride and the alkanoic acid is used. It is more preferred to add% pyridine. Since such a pyridine base functions as a proton acceptor, for example, removal of a peptide to be eliminated with acylation to an amino group is performed more quickly.
  • the peptide of interest forms, for example, an oxidized 1 S—S— bond with the cysteine of an adjacent peptide, or forms a 1 S—S— bond in the same molecule.
  • a conventional reduction treatment is performed in advance to eliminate such cross-linking, and the peptide is converted to a peptide containing reduced cysteine.
  • the reduced cysteine present in the peptide is protected in advance by subjecting the sulfanyl group (1SH) in its side chain to carboxymethylation and pyridylethylation.
  • a peptide having a long amino acid sequence of interest such as a protein
  • a defolding process in advance to obtain the multi-dimensional structure.
  • a conventional reduction treatment is performed in advance to eliminate such cross-linking, and the peptide is converted to a peptide containing reduced cysteine.
  • the reduced cysteine present in the peptide is protected in advance by subjecting the side chain sulfanyl group (-SH) to carboxymethylylation or pyridylethylation, etc.
  • a liquid mixture obtained by adding a small amount of alkanoic acid to alkanoic anhydride was placed in a reaction vessel capable of forming an airtight state, and the liquid mixture was once cooled to lower the vapor pressure.
  • the reaction vessel is evacuated, sealed, heated to the reaction temperature, and the alkanoic anhydride is evaporated in the vessel.
  • Adopting a powerful procedure also has the advantage of preventing water from entering the reaction vessel.
  • the amino acid present in methionine is oxidized by oxygen
  • the reaction reagent remaining in the reaction vessel is removed, and then the process proceeds to the next reaction step in which the c-terminal amino acid is sequentially decomposed.
  • the pretreatment step is followed by a dry atmosphere of the N-acylated protected peptide under a dry atmosphere.
  • a temperature selected in the range of ° C to 60 ° C is selected in the range of ° C to 60 ° C.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents the side chain of the amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and the C-terminal amino acid is decomposed with the cleavage of the 5-oxazolone ring. .
  • the vapor-form perfluoroalkanoic acid is allowed to function as a proton donor for the dried peptide, thereby increasing the ratio of the enol / re-form.
  • an intramolecular ester bond is formed between the exposed hydroxy group and the C-terminal carboxy group to complete the 5-oxazolone ring.
  • the vapor-like perfluoroalkanoic acid probably acts as a proton and a donor in this esterification reaction and induces an esterification reaction under an acid catalyst.
  • an alkanoic anhydride is used as a reagent for activating a C-terminal carboxy group.
  • reaction temperature can be selected in the range of 15 ° C to 60 ° C.
  • the reaction temperature is preferably selected around room temperature or in a range slightly higher than room temperature, and more specifically, more preferably in the range of 15 ° C to 50 ° C.
  • N-terminal amino group of the peptide is treated with the alkanoic anhydride. Since N-acylation usually occurs, N-acylation protection is performed in the system. However, it is more preferable to perform pretreatment for N-acylation protection in advance.
  • the first embodiment of the present invention utilizes the high proton-donating ability of the perfluoroalkanoic acid used, and the pKa of the perfluoroalkanoic acid is 0.3 to 2 It is preferred to use a perfluoroalkanoic acid in the range of 5.
  • the perfluoroalkanoic acid must be supplied as a vapor to the dried peptide sample, and at the temperature selected in the range of 15 ° C to 60 ° C, the desired vapor pressure Desirably, it is a perfluoroalkanoic acid which is excellent in volatility and can be obtained.
  • perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable, and linear perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable.
  • the alkanoic anhydride used as the above-mentioned activating reagent is not consumed according to the reaction, and therefore, the vapor pressure of the alkanoic anhydride supplied as a vapor state is used.
  • the means there is a method in which the system in which the reaction is carried out is made airtight, and the vapor pressure of the alkanoic anhydride present in the system is stabilized. More specifically, a liquid mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to alkanoic acid anhydride is placed in a reaction vessel capable of forming an airtight state, and the liquid mixture is cooled and cooled. With the pressure reduced, the reaction vessel is evacuated, sealed, heated to the reaction temperature, and alkanoic anhydride is evaporated in the vessel. Adopting a powerful procedure also has the advantage of preventing water from entering the reaction vessel.
  • alkanoic anhydrides can be used as long as they generate an appropriate vapor pressure when heated to the reaction temperature.
  • the reaction temperature is selected within the above-mentioned preferable range, for example, a range of 15 ° C. to 50 ° C., it is preferable to provide a sufficient vapor pressure, and accordingly, an alkane having 2 to 4 carbon atoms is preferable. It is preferable to use a symmetrical acid anhydride.
  • a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride, and particularly, a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 carbon atoms.
  • Acetic anhydride can be suitably used. Since such an alkanoic acid anhydride is used for activating the C-terminal carboxy group, it is preferable that the alkanoic acid anhydride does not cause steric hindrance at that time, and in that respect, acetic anhydride and the like described above are more preferable. .
  • the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used in this decomposition reaction are both vaporized and are allowed to act on the dried peptide sample.
  • the 5-oxazolone ring once formed is The reaction is carried out in a dry atmosphere to avoid being hydrated and returned to the original state by the water that has entered from above. From this viewpoint, it is generally desirable to carry out such a reaction in a sealed reaction vessel.
  • the mixture of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid initially supplied to the company is a liquid mixture at room temperature, and the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid are uniformly mixed. State.
  • a mixture of this alkanoic acid anhydride and a small amount of perfluorinated alkanoic acid should be used in a small amount because the perfluoroalkanoic acid used as a catalyst is not consumed in principle during the reaction. Can be. More specifically, perfluoroalkanoic acid present as a vapor in the gas phase also means that it can have a relatively lower concentration compared to alkanoic anhydride which also exists as a vapor. . Conversely, depending on the type of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used, the desired partial pressure ratio in the gas phase (gas phase concentration ratio) can be achieved, for example, according to its saturated vapor pressure at the reaction temperature. Use the liquid mixture at the mixing ratio appropriately.
  • the content ratio of perfluoroalnic acid is the total volume of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid. Against 1 to 20 volumes. / 0 , more preferably in the range of 3 to 10% by volume.
  • reaction formula ( ⁇ ⁇ ) for example, from the once formed 5-oxazolone ring:
  • reaction (I) the elimination of the amino acid at the C-terminus and the formation of the reaction intermediate in the next step proceed, and the sequential selective decomposition of the amino acid at the C-terminus proceeds. Therefore, after the completion of such a reaction, the reaction product obtained is, besides the one having a carboxy group at the C-terminus shown in the above-mentioned reaction formula (II), a 5-oxazolone ring as an intermediate product Those that remain in the structure, or those in which the C-terminus has become an asymmetric acid anhydride as one form of the reaction intermediate, are also mixed.
  • the reaction in such a sequential step of selectively decomposing the C-terminal amino acid is small.
  • a two-step process of forming the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (I b) and separating the terminal amino acid by cleavage of the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula ( ⁇ ) It consists of elementary reactions. Therefore, although the overall reaction rate depends on both of the reaction rates in each of these processes, the reaction rate mainly depends on the vapor partial pressure of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used (gas phase concentration) and the reaction temperature. Depends.
  • the treatment time in such a sequential step of selectively decomposing the C-terminal amino acid mainly depends on the vapor partial pressure (gas phase concentration) of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid to be used and the reaction temperature. In accordance with the above, it is appropriately selected in consideration of the target amino acid length of the C-terminal amino acid sequence to be analyzed.
  • a compound having a form of a reaction intermediate in which a carboxy group is not expressed at the C-terminus as exemplified in the above reaction formula ( ⁇ ), which is generated in a sequential step of selectively decomposing a C-terminal amino acid is used.
  • a water treatment step is provided as a post-treatment step in order to restore the form in which a carboxy group is exposed at the C-terminal. That is, in the first embodiment of the present invention, in the step of adding water, the residual force is applied to a mixture containing a series of reaction products obtained in the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid.
  • the vapor-form basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for such a hydrolysis treatment reacts, for example, with a residue in which the C-terminus has reached an asymmetric acid anhydride to form an amide. This is preferable because no bond is formed and a uniform solution can be obtained when the solution is used as an aqueous solution.
  • a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound that can give an appropriate vapor pressure is preferable.
  • pyridine can be more suitably used.
  • the third Amin compounds available preferably has a relatively weak basicity and comparable basicity said pyridine base is shown, for example, DMA E ((CH 3) 2 N - CH 2 CH 2 OH) can be suitably used.
  • DMA E ((CH 3) 2 N - CH 2 CH 2 OH)
  • pyridine it is preferable to select pyridine in a range of 5 to 15% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • DMAE dimethylamino) ethanol
  • DMAE is used in an amount of 1 to 20% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution. It is preferable to choose
  • a pretreatment step, a selective decomposition reaction step for a C-terminal amino acid, and a post-treatment step are performed in the same reactor. It is more preferable to carry out in a continuous form.
  • An example of the flow of such a process is illustrated in FIG.
  • each peptide sample is provided with a dry-up operation to prevent the reagent used in that process from remaining. This dry-up operation is generally performed by distillation under reduced pressure, and in that case, removal of decomposed terminal amino acids and the like derived by the reaction may be sometimes performed at the same time.
  • FIG. 1 an example is shown in which acetic anhydride is used as the alkanoic acid anhydride of extremely high purity, which is easily available.
  • the processing time in the step of selectively decomposing the C-terminal amino acid is 10 times as long as the amino acid length of the C-terminal amino acid sequence shortened during this step. It illustrates the range of treatment time that can be selected depending on the ratio of acetic anhydride and fluoroalkanoic acid to be used and the treatment temperature when targeting a few amino acids in length, or at least 3 amino acids in length. In general, when the ratio of fluoroalkanoic acid is increased and the processing temperature is set higher, the reaction rate is lower, and a shorter processing time is used to prepare a series of reaction products that achieve the longest target amino acid sequence shortening. Becomes possible.
  • N-acetylation of the N-terminal amino group of the peptide is carried out using acetic anhydride and acetic acid in a vapor state, but in this combination of acetic anhydride and acetic acid.
  • an active reaction of the C-terminal carboxy group represented by the above reaction formula (Ia) and a secondary reaction resulting therefrom may be induced.
  • a small amount of pyridine vapor coexists, and the pyridine base forms a weak addition salt with the C-terminal carboxy group of the peptide, thereby protecting against unnecessary side reactions. It is possible to have an effect.
  • this addition salt type is based on this pretreatment step. At the end of the process, a dry-up operation is provided, and the pyridine base is distilled off under reduced pressure, so that it is easily deprotected, causing problems in the subsequent step of the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid.
  • a nitrogen-containing complex aromatic ring compound such as pyridine base
  • the addition salt type protection has a protective function against the carboxy group of the amino acid side chain, it is also possible to simultaneously effectively suppress unnecessary side reactions caused by the carboxy group of the amino acid side chain. It becomes possible.
  • the difference between the molecular weight of a series of reaction products prepared by the above-described sequential removal of the C-terminal amino acid and the molecular weight of the original peptide is determined by using the result of mass spectrometry. And determine the amino acid corresponding to the difference in molecular weight. Therefore, it is usually desirable that the original peptide remains in such a state that its molecular weight can be specified in the mixture subjected to the measurement by the mass spectrometry.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the first embodiment of the present invention is applied to the analysis of a C-terminal amino acid sequence up to about 10 amino acids in length.
  • the content ratio of a series of reaction products corresponding to a maximum of several types corresponding to a maximum of 10 types should not be less than at least about 1/10 of the maximum content ratio. desirable.
  • it is desirable that the residual amount of the original peptide is not less than at least about 1/10 with respect to the reaction product having the maximum content ratio.
  • the required C-terminal amino acid sequence information is often within 10 amino acids, and if the treatment time is selected so that the decomposition of about 10 amino acids proceeds, the above-mentioned condition regarding the content ratio can be satisfied. You.
  • the series of reaction products corresponding to (4) to (6) Analyzing the difference in molecular weight from the resulting peptide by mass spectrometry, and measuring the molecular weight decrease associated with the sequential degradation of the C-terminal amino acid; and a series of measured molecular weight decreases.
  • the step of identifying a series of sequentially decomposed amino acids based on the small amount and arranging them from the C-terminus to obtain amino acid sequence information at the C-terminus will be described in further detail.
  • the use of a MA LDI-TOF-MS device for the measurement of the molecular weight makes it possible to accurately measure the molecular weight of a high-molecular-weight peptide chain.
  • MA LDI-TOF-MS equipment which is suitable for the measurement of high molecular weight molecules such as peptides
  • the maximum possible amino acid length of the peptide does not exceed 30 to 50 amino acids.
  • the corresponding amino acids are identified based on the difference in molecular weight, so that, for example, 311 and 5, and G111 and 0111, the difference in formula weight is 1 so that the amino acid residues can be distinguished from each other with high precision.
  • the molecular weight of the reference, longest peptide, i.e., the peptide without the removal of the C-terminal amino acid, does not exceed 400, more preferably exceeds 300. It is more preferable that it is not in the range. When this is converted into an amino acid length, it is preferable that the length be at most 40 amino acids, more preferably a range not exceeding 30 amino acids.
  • the cleavage amino acid sequence site is identified before performing mass spectrometry. Specific cleavage of the peptide chain using trypsin, which is a protease with excellent enzymatic reaction efficiency, and using the resulting C-terminal peptide fragment to obtain the C-terminal amino acid The difference between the molecular weight of a series of reaction products prepared by the sequential removal of the peptide and the molecular weight of the original peptide is measured.
  • trypsin digestion treatment after the re-drying treatment, trypsin is allowed to act on the mixture containing the series of hydrolyzed reaction products in a buffer solution, and if the amino group at the N-terminal of the peptide chain is Next, the peptide chain is subjected to a trypsin enzyme-specific digestion treatment that retains N-acylation protection for the amino group of the side chain of a lysine residue that may be contained in the peptide chain. ing.
  • the total number of peptide fragments obtained can reach a significant number, resulting in a shorter average amino acid length for each fragment and a narrower molecular weight range.
  • peaks resulting from a considerable number of peptide fragments tend to be clustered. If peaks due to a considerable number of peptide fragments are clustered, it may be an obstacle in identifying a target group of C-terminal peptide fragments.
  • the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products in which the C-terminal amino acids are sequentially degraded the content ratio decreases as the number of amino acids removed increases.
  • the presence of other peptide fragments can be a major obstacle in identifying the desired C-terminal peptide fragment.
  • the total number of obtained peptide fragments may be increased more than necessary. It can be avoided, and at the same time, the amino acid length of the target C-terminal peptide fragment can be within the range of an appropriate number of amino acids when using the above-described MALDI-TOF-MS device.
  • the dried mixture is subjected to molecular weight measurement using a cation species generated by the ionization treatment and molecular weight measurement using an anion species.
  • the peak of the corresponding ionic species due to the arginine residue has an intensity of anion in the molecular weight measurement by the ionic species.
  • C-terminal peptide fragments derived from the original peptide and the C-terminal amino acids, which are generated by trypsin digestion are determined sequentially. Since there is no arginine residue in the c-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products obtained by decomposition, the peak of the corresponding ion species is as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement using an anionic species is determined to be a peak that gives a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement using a cationic species
  • leucine having the same formula amount is used to identify amino acids that are sequentially removed based on the difference in molecular weight.
  • glutamine (G in) residue and the lysine (Ly s) residue have the same formula weight, N-alkanoylation is applied to the side chain of the lysine (Ly s) residue. Can be discriminated.
  • alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid are allowed to act.
  • Serine residue in (one N H-CH (CH 2 OH) — CO—) Hydroxy group, N-terminal amino group, lysine residue (—) present in the threonine residue (one NH—CH (CH (CH 3 ) OH) -CO-) Do not carry out the pretreatment step of ⁇ -acylation and ⁇ -acylation protection for the amino group at the ⁇ -position of NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-) in advance. However, under the reaction conditions in which the strong C-terminal amino acid is sequentially degraded, these ⁇ -acylation and ⁇ -acylation reactions also proceed in parallel.
  • the acetyl-substituted product may have been subjected to the amino acid removal described above.
  • sufficient measures are taken to address such concerns by selecting conditions under which the deprotection of O-acylation protection at serine residues and threonine residues proceeds sufficiently in the hydrolysis treatment in the post-treatment step. I have.
  • peptide fragmentation After the measurement of the molecular weight, the measured molecular weight is defined as the range in which the analytical accuracy can be determined so that the glutamine residue having a formula weight difference of 1 can be distinguished from the glutamic acid residue. The difference between the number of remaining acetyl groups and the number of amino acid residues having similar formula weights is 2-3, and in many cases, the possibility of such misidentification is eliminated.
  • the liquid reagent for the reaction or the liquid reagent of the component kit can be stored, and the liquid reagent for the reaction is added to the peptide sample held in the sample container in a predetermined amount.
  • a reaction container capable of holding a liquid reagent capable of maintaining a state in which they are not in direct contact with each other, and capable of storing the sample container therein, can evacuate the inside thereof and, after completion of the reaction, for the remaining reaction. It is preferable that the liquid reagent can be distilled off under reduced pressure, and the reaction can be carried out in an airtight structure.
  • faucets used for sealing operation are preferably made of a material such as Teflon.
  • the separation by a gel electrophoresis method is performed in advance in place of the dried sample of the peptide which has been subjected to the isolation treatment, which is the object of the first embodiment of the present invention.
  • the present invention is directed to a peptide supported on the gel carrier. Therefore, for a peptide supported on a gel carrier, the reaction method in a solid phase that utilizes a vapor-like reaction reagent is effectively applied during the reaction to sequentially decompose the C-terminal amino acid. Since this is not possible, the method has been changed to infiltrate the corresponding reaction reagent into the gel carrier and perform a liquid phase reaction.
  • the C-terminal amino acid is sequentially decomposed by chemical means from the target peptide corresponding to (1) to (3).
  • the step of preparing a mixture containing a series of reaction products obtained by It enables a reaction to sequentially decompose the C-terminal amino acid on a peptide sample without being isolated from the gel carrier in advance and remaining on the gel carrier.
  • Separation by gel electrophoresis is performed in advance, and it becomes an obstacle in the next pretreatment step of performing the acylation reaction on the target peptide sample supported on the gel carrier.
  • To remove water in advance dilute and remove the aqueous solvent impregnated in the gel carrier using a polar aprotic solvent that does not cause the gel-like substance to dissolve and has an affinity for water.
  • a step of performing a dehydration treatment of the gel carrier is provided, and a pretreatment step of performing the following acylation protection, a sequential decomposition step of the C-terminal amino acid, and a post-treatment step of performing a hydrolysis treatment of the reaction product are performed. .
  • the gel substance used in the pre-separation by gel electrophoresis shows individual and separated spots (or bands) for multiple types of peptides corresponding to a specific molecular weight range.
  • Conditions, specifically, the content ratio of polyacrylamide constituting the gel is selected, and the gap size of the fine hole structure formed inside the gel is adjusted.
  • the separated spot (or band) for example, in the SDS-PAGE method, peptides having different electrophoretic velocities due to differences in peptide chain molecular weight and surface charge are respectively localized. .
  • the peptide is held inside a fine pore structure formed in the gel, and does not cause the gel substance to dissolve when removing water impregnated in the gel substance, and If a method of diluting and eluting only a water solvent into the polar aprotic solvent using a polar aprotic solvent having an affinity for water is used, even after the completion of the dehydration operation, The retained peptide can be maintained on the gel carrier at the separated spot (or band) position.
  • the polar aprotic solvent used in the above-mentioned dehydration treatment has an affinity for a gel-like substance such as polyacrylamide which constitutes the gel, which is generally inferior to an aqueous solvent.
  • the bulk volume decreased.
  • a polar aprotic solvent used in the dehydration treatment for example, when polyacrylamide gel is used, a suitable polar aprotic solvent such as acetonitrile (CH 3 CN), which has high affinity for water, is used. And -tolyls having 4 or less carbon atoms, and ketones having 4 or less carbon atoms such as acetone.
  • the polar nonprotonic solvent used in these dehydration treatments evaporates more easily than water, and when evaporated and dried, its bulk volume is reduced and it becomes a contracted gel carrier.
  • the pretreatment step of protecting the peptide chain with acylation comprises, after the dehydration treatment, a peptide sample to be supported on the gel carrier.
  • the alkanoic anhydride can be infiltrated in the gel-like substance and maintained in a swollen state, in a dipolar aprotic solvent.
  • the gel carrier is immersed in the alkanoic acid anhydride solution using a solution obtained by dissolving the alkanoic acid anhydride, thereby allowing the alkanoic acid anhydride to act on the peptide sample to be carried in the supported state.
  • the amino group at the N-terminus of the peptide and the amino group on the side chain of the lysine residue that may be contained in the peptide have been previously derived from the alkanoic acid constituting the alkanoic anhydride.
  • N-acylation protection by sil group Apply.
  • the N-acylation protection for the amino group in the side chain of lysine residue, which is performed in this pretreatment step, is achieved by the above-mentioned final binding of the lysine residue to the C-terminal peptide bond when digested with triscine.
  • the alkane by-produced remaining in the gel carrier is utilized. Since alkanoic acid can be used as a catalyst to promote the reaction, only alkanoic anhydride is used as the reaction reagent.
  • the alkanoic anhydride used in this pretreatment step has an N-acylation protection reaction against the amino group of the side chain of lysine residue at a temperature selected in the range of 30 ° C to 80 ° C. It is preferable to use those exhibiting possible reactivity, specifically, symmetric acid anhydrides derived from alkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms. In particular, it is more preferable to use a symmetrical anhydride derived from linear alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms. In other words, if a symmetrical alkanoic acid anhydride is used, the by-produced alkanoic acid is also of the same species.
  • the molecular polarization of the alkanoic anhydride is induced and acts as an electrophilic reagent on the amino group of the peptide.
  • the acylation reaction proceeds.
  • a reaction temperature of 50 ° C or higher, but in general, such a reaction is carried out in a closed reaction vessel, so that the mechanical strength in the reaction vessel is reduced. Considering this, it is desirable to select the temperature within the range of 100 ° C. or less.
  • Alkanic acid is produced along with the N-acylisani reaction, but in a small amount.
  • the secondary reaction caused by the proton donating ability of such alkanoic acid and the coexisting alkanoic anhydride is not The above In the temperature range, this is usually not a problem. More specifically, the alkanoic acid generated in the system has, for example, a much lower acid catalysis and a smaller abundance than perfluoroalkanoic acid. Under the temperature condition, the main reaction in the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid using perfluoroalkanoic acid and arnic anhydride, until the secondary formation of the 5-oxazolone ring structure occurs. Does not reach.
  • the above-mentioned dipolar aprotic solvent which causes the gel to re-swell can be infiltrated into the gel-like substance and can be maintained in a swelling state.
  • Organic solvents with good affinity for the substance are preferred.
  • the solvent is an excellent solvent.
  • a dipolar aprotic solvent which is less likely to evaporate and evaporate is more preferable. For example, formamide (HCONH 2 ), etc. I am fully satisfied.
  • the reaction is stopped by removing the alkanoic acid anhydride in the gel carrier, so that the gel-like substance is not dissolved, and alkanoic acid anhydride,
  • the entire gel carrier is washed with a polar aprotic solvent having an affinity for a dipolar aprotic solvent. That is, by washing with the polar nonprotonic solvent, the arnic acid anhydride and the dipolar aprotic solvent that have infiltrated the gel carrier are diluted and removed by diffusion.
  • a polar aprotic solvent that satisfies the requirements suitable for the above-mentioned washing application is, for example, an acetonitrile (CH 3 CN) or other carbon-containing solvent.
  • CH 3 CN acetonitrile
  • the polar aprotic solvent used in the dehydration treatment step described above as the polar aprotic solvent used for the dilution and washing.
  • the polar aprotic solvent used in these washing treatments evaporates more easily than water, and when evaporated and dried, its bulk volume is reduced, resulting in a contracted gel carrier.
  • the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid also usually takes a form in which the reaction reagent solution is infiltrated into the contracted gel carrier which does not contain water to start the reaction. Therefore, after pretreatment for N-acylation protection, the peptide is selected in the range of 30 ° C. to 80 ° C. with respect to the target peptide sample supported on the gel carrier. At temperature
  • Perfluoroalkanoic acid is dissolved in a dipolar aprotic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state at a ratio that is small relative to arnic anhydride.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and the C-terminal amino acid is sequentially decomposed with the cleavage of the 5-oxazolone ring. I do.
  • the perfluoroalkanoic acid functions as a proton donor in the peptide chain carried in the hole of the gel carrier to increase the ratio of taking the enolole type. ing.
  • the catalytic action of perfluoroalkanoic acid utilizes its proton donating ability, and the pKa of the perfluoroalkanoic acid is 0. It is preferred to use perfluoroalkanoic acids in the range of 3-2.5.
  • the dipolar aprotic solvent used A perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms, which can be uniformly dissolved therein, is more suitable, and a linear perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is more preferable.
  • trifluoroacetic acid CF 3 COOH
  • pentafluoropropanoic acid CF 3 CF 2 COOH
  • heptafluorobutanoic acid CF 3 CF 2 CF 2 COOH
  • the alkanoic anhydride used for activating the C-terminal carboxy group preferably gives an appropriate reactivity when the temperature is raised to the reaction temperature. Therefore, the symmetric type of alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is preferable. It is preferable to use an acid anhydride. Of these, it is more preferable to use a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride, and particularly to a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 carbon atoms. A type acid anhydride, that is, acetic anhydride can be suitably used.
  • a strong alkanoic anhydride is preferably one that does not cause steric hindrance in its orientation in order to activate the C-terminal carboxy group and adopt a configuration suitable for forming a 5-year-old xazolone ring. In this regard, it is more preferable to use acetic anhydride.
  • the alkanoic anhydride used as the above-mentioned activating reagent is consumed according to the reaction. Therefore, the alkanoic anhydride is used in advance in the reaction with the peptide in the dipolar aprotic solvent used for swelling of the gel. It is desirable to dissolve a large excess amount with respect to the consumed amount, and to suppress the concentration decrease.
  • the content ratio of alkanoic anhydride to perfluoroalkanoic acid is 1 per 100 volumes of alkanoic anhydride and 1 perfluoroalkanoic acid.
  • the content of the alkanoic anhydride in the dipolar aprotic solvent be selected in the range of 10 to 30% (vol%).
  • the reaction time depends on the reaction temperature and the concentration of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid contained in the dipolar aprotic solvent.
  • the dehydration treatment using a polar nonprotonic solvent Accordingly, it is desirable to appropriately select the gel carrier in consideration of the time required for swelling of the contracted gel carrier. For example, polyacrylamide-gel (12.5 mass./.) Is dehydrated using the above-mentioned acetonitrile, and then immersed in a dipolar aprotic solvent such as formamide described below.
  • the time required to achieve re-swelling of the gel carrier is, for example, about 3 hours at 40 ° C. Therefore, the overall reaction time is such that after re-swelling of the gel carrier, the desired amino acid is obtained. Select the number of residues plus the time required to achieve selective degradation of the C-terminal amino acid.
  • the above-mentioned dipolar aprotic solvent that causes the gel to re-swell can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state, has a relatively small molecular size, and has a gel-like state.
  • Organic solvents with good affinity for the substance are preferred.
  • it shows a high dipolarity that can maintain the ratio of its enol form, and has a solute molecule of alkanoic anhydride, perfluoro. It is preferably an excellent solvent for alkanoic acid and alkanoic acid as a reaction by-product.
  • a dipolar aprotic solvent which is less likely to evaporate and evaporate is more preferable.
  • formamide (HCO NH 2 ) and the like are described above when a polyacrylamide gel is used. All requirements are fully satisfied.
  • the dipolar non-protonic solvent that provides excellent solubility for the above-described alkanoic anhydride, perfluoroalkanoic acid, and arnic acid, which is a reaction by-product, is a water molecule. Can also be easily dissolved. Therefore, in the reaction treatment in the mixed solution using the dipolar aprotic solvent, the reaction system is preferably kept under a dry atmosphere from which water has been removed. That is, the reaction intermediate represented by the above formula (I b) is converted into an asymmetric acid anhydride, and the activated C-terminal carboxy group is hydrolyzed when water molecules are mixed into the reaction system. And return to the original terminal carboxy group. In order to avoid such an inactivation process, the reaction system is preferably maintained in a state where water is removed.
  • the amino acid present in methionine may be oxidized by oxygen mixed into the system, and its formula amount may be changed.
  • Preventing the oxidation by oxygen is more preferable in the method of the present invention based on the measurement of the molecular weight, in order to achieve higher accuracy in suppressing the oxidation.
  • the reaction system is kept airtight to prevent moisture and oxygen from entering from outside the system.
  • the liquid injection and discharge operations are also performed in a dried inert gas atmosphere, for example, a nitrogen atmosphere.
  • a reaction represented by a reaction formula ( ⁇ ′) is obtained from a 5-oxazolone ring once formed, for example:
  • Such a sequential C-terminal amino acid decomposition reaction is at least a process of forming a 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (I b) and a cleavage of the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula ( ⁇ ) And a two-step elementary reaction with the terminal amino acid separation process. Therefore, the overall reaction rate depends on both the reaction rate of each of these processes, but mainly depends on the reaction temperature if the concentration of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid to be used is used.
  • the processing time in the sequential step of selectively decomposing the C-terminal amino acid is mainly based on the alkanoic anhydride used and the perfluoroa. It is appropriately selected according to the concentration of lucanoic acid and the reaction temperature, and also considering the target amino acid length of the C-terminal amino acid sequence to be analyzed.
  • the sequential termination of the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid lowers the temperature of the reaction system and reduces the reaction reagents infiltrating into the gel carrier, that is, perfluoroalnic acid and acetic anhydride.
  • the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid is used without causing the dissolution of the gel-like substance, and the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic anhydride, and the dipolar
  • the decomposition reaction is stopped and the reaction reagent is removed by diluting and removing using a polar aprotic solvent having affinity for the aprotic solvent.
  • a dipolar non-protonic solvent used for preparing a mixed solution can be used, but the 5-oxazolone ring structure exemplified in the reaction formula (lb) can be used.
  • a polar aprotic solvent that does not contribute much to stabilization of the phenolic intermediate is used. It is more desirable to use a removal step. At least in the final stage of the reaction reagent dilution / removal step, a dilution / removal operation using a polar aprotic solvent is provided.
  • polar aprotic solvents satisfying these conditions include nitriles having 4 or less carbon atoms, such as acetonitrile (CH 3 CN), and carbon atoms, such as acetone. And 4 or less ketones.
  • a series of reaction products obtained by a reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid is subjected to a hydrolysis treatment.
  • the post-treatment step also includes the step of preparing a peptide mixture containing these series of reaction products. This is carried out while being held on the gel carrier. That is, for a mixture containing a series of reaction products obtained by a reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid, while being supported on the gel carrier,
  • the reaction product peptide can be obtained in the presence of the basic nitrogen-containing organic compound.
  • Water molecules act on the water to give water treatment.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or the tertiary amine compound is converted into a 5-year-old xazolone ring structure represented by the reaction formula ( ⁇ ′), and a reaction intermediate (acid anhydride) in the next stage.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for the above-mentioned hydrolysis treatment reacts, for example, with the remaining C-terminal having reached an asymmetric acid anhydride to form an amide bond. This is preferable because it does not form and can be made into a uniform solution when converted into an aqueous solution.
  • a usable basic nitrogen-containing aromatic ring compound a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound showing high solubility in a polar aprotic solvent is preferable, and for example, pyridine can be more suitably used.
  • the tertiary amine compound that can be used preferably has a similar basicity to the relatively weak basicity of the pyridine base.
  • DMAE ((CH 3 ) 2 N-CH 2 CH 2 2 OH)
  • pyridine when pyridine is used, it is preferable to select pyridine in the range of 5 to 15% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • DMAE dimethylamino ethanol
  • DMAE should be selected in the range of 1 to 20% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution. Preferred Les ,.
  • the main purpose of the hydrolysis using an aqueous solution containing an organic base is to expose a carboxy group at the C-terminus of the peptide chain of the reaction product.
  • the deprotection of the acylation protection proceeds at the same time, while the N-acylation protection for the amino group at the N-terminal and the amino group on the side chain of the lysine residue is selected so that the deprotection does not proceed. ing.
  • the nitrogen base forms an addition salt with respect to the carboxy group at the C-terminal of the reaction product.
  • the aqueous solution impregnated in the gel carrier is diluted with a polar aprotic solvent that does not cause dissolution of the gel substance and has compatibility with water. It is preferable that the gel carrier is subjected to a re-dehydration treatment by removing, and a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine compound used for the hydrolysis treatment is diluted and removed together with water. Therefore, the polar aprotic solvent used in this re-dehydration step is preferably one having high solubility also for a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine compound.
  • polar aprotic solvents for the redehydration step that satisfy these conditions include nitriles having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile (CH 3 CN). Examples thereof include ketones having 4 or less carbon atoms, such as acetone.
  • the above-mentioned hydrolysis treatment after the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid, is carried out once to polar alkanoic acid and perfluoroalkanoic acid of the reaction reagent. Not only after completion of the dilution / removal operation using an aprotic solvent, but also the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and the hydrolysis treatment can be performed continuously. Specifically, the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid is performed by lowering the reaction temperature and stopping the reaction while adding an aqueous solution containing an organic base to obtain an alkanoic anhydride and a perfluoroalkanoic acid.
  • reaction reagents and elution from the gel occur in combination with the combination of the above, stopping the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and inactivating and removing the reaction reagents.
  • the reaction product can be subjected to a hydrolysis treatment, and finally, a re-dehydration treatment step using a polar aprotic solvent can be performed to cope with the alkanoic anhydride together with the aqueous solution containing the organic base. Removal of the alkanoic acid, perfluoroalkanoic acid, and the dipolar nonprotonic solvent and re-dehydration are performed. However, there is no substantial difference.
  • the trypsin digestion treatment is carried out to obtain the amino acid.
  • a MA LDI-TOF-MS method measure the molecular weight of the dried mixture containing the tryptic digested peptide fragment obtained by fragmenting the long peptide chain and using the cation species generated in the ionization treatment. , And a molecular weight measurement using anion species.
  • one of the features of the second embodiment of the present invention is that the mixture containing the series of reaction products that have been subjected to the hydrolysis treatment is subjected to re-dehydration treatment and then supported on the gel carrier.
  • the step of such a trypsin digestion treatment is performed. Specifically, after the re-dehydration treatment, the mixture containing the series of reaction products having been subjected to the hydrolysis treatment is reacted with trypsin dissolved in a buffer solution while being supported on the gel carrier.
  • a trypsin enzyme of the peptide chain wherein the N-acylation protection for the amino group at the N-terminal of the peptide chain and the amino group of the side chain of a lysine residue that may be contained in the peptide chain is maintained.
  • Specific digestion treatment is performed to perform peptide fragmentation by selective cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain.
  • gel carriers used for molecular weight separation by gel electrophoresis such as two-dimensional electrophoresis and SDS-PAGE, hold peptide chains having an amino acid length exceeding a certain range in the pore structure in the gel.
  • the specificity of the gel carrier used for the gel electrophoresis is utilized to maintain the long amino acid-length peptide chain while maintaining the state supported on the gel carrier. After sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acids and preparing a series of reaction products, the peptide is fragmented by trypsin digestion to obtain a target group of C-terminal peptide fragments. However, it can be easily eluted from the gel carrier and recovered.
  • the peptide chain when performing this trypsin digestion treatment, in the case of the mixture containing the series of reaction products after the hydrolysis treatment, if the N-terminal amino group of the peptide chain is ⁇ , the peptide chain is Cleavage of the C-terminal peptide bond of the N-acylated protected lysine residue since the N-acylated protection for the amino group of the lysine residue side chain that may be contained in Does not occur, and selective cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain occurs.
  • the target group of C-terminal peptide fragments is usually a few amino acids in length of the original peptide chain, and thus is released from the gel carrier and eluted into the trypsin solution.
  • the other peptide fragments are also eluted in the same manner.
  • the buffer solution and the gel carrier are separated, the released various peptide fragments are recovered in the buffer solution. Thereafter, a desalting treatment is performed to remove the buffer solution component, and the tryptic digested peptide fragment is recovered and dried.
  • the subsequent steps that is, the recovered dry mixture containing the tryptic digested peptide fragment was analyzed using the MA LDI-TOF-MS method.
  • the operations up to the measurement of the child amount and the determination of the C-terminal amino acid sequence based on the measurement result are the same as those in the above-described first embodiment of the present invention.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the second embodiment of the present invention is based on gel electrophoresis such as two-dimensional electrophoresis or s DS-PAGE from a sample containing various proteins.
  • the approximate molecular weight of the protein separated by the method can be estimated, and even if the protein is isolated and recovered from the separated spot (or band), the number of amino acids is large.
  • a group of C-terminal peptide fragments is used, and then the molecular weight is measured and the C-terminal amino acid sequence is determined based on the measurement results.
  • the separated spots can be used instead of isolating and recovering such proteins from separated spots (or bands).
  • Cut out of the gel carrier while holding onto the gel carrier, and performs a series of chemical treatments. It is possible to omit the step of isolating and recovering the protein in the form of a spot (or band) that has been separated in advance, and to achieve the same accuracy without being affected by the recovery yield in the isolation and recovery step. It is possible to carry out the determination of the C-terminal amino acid sequence.
  • the peptide sample of interest is a linear peptide, which is separated by gel electrophoresis in advance, and is loaded on the gel carrier.
  • the gel electrophoresis method is not limited to the conventional SDS-PAGE method in which electrophoresis is performed in a one-dimensional direction. Alternatively, those to which the two-dimensional electrophoresis method is applied may be used.
  • the peptide sample separated by the method according to the second aspect of the present invention can be used even in a small sample amount without contamination by contaminants. Amino acid sequencing is now possible.
  • FIG. 1 shows a process flow of the step of sequentially decomposing C-terminal amino acids in Example 1.
  • a peptide solution containing only a globin-peptide chain portion at a concentration of 1. O ⁇ ug Z ⁇ uL is prepared from a commercially available pima 'myoglobin sample. The peptide solution is placed in a test tube and freeze-dried to prepare a dry peptide powder sample.
  • the pial containing the dried peptide sample was placed in a Teflon cock bar. Attach it in a glass-made reaction vessel of a stoppered airtight test tube type equipped with a port for vacuum evacuation that is sealed with a lube, and separately put a predetermined amount of the following liquid reagent into this glass-made reaction vessel.
  • a pretreatment reagent acetic anhydride (300 ⁇ L) to which 5% by volume of acetic acid was added was used.
  • the vial containing the dried peptide sample was placed in the glass reaction vessel, and then the reaction vessel was cooled.
  • the inside of the reaction vessel is kept at 50 ° C for 2 hours, and acetic anhydride and acetic acid in vapor form are supplied from the liquid reagent in the vessel.
  • acetic anhydride and acetic acid in vapor form are supplied from the liquid reagent in the vessel.
  • N-acetylation of the lysine residue (1-NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-) to the ⁇ -position amino group contained in the peptide chain is performed.
  • the obtained vial holding the globin / peptide chain modified / protected by the acetyl group was placed in a glass reaction vessel of the same type with a stoppered airtight test tube. A predetermined amount of the following liquid reagent is separately placed in the reaction vessel.
  • Heputafuruoro butanoic acid As liquid reagent for the selective decomposition of the C-terminal amino acids, Heputafuruoro butanoic acid (HFBA: C 3 F 7 CO_ ⁇ _H) the use of a 1 volume 0/0 added acetic anhydride (300 L), the glass reaction After storing the vial containing the dried sample in the container, the reaction container is evacuated under cooling and sealed in an airtight state under cooling.
  • the entire airtight reaction vessel is kept at 40 ° C for 3 hours, and the liquid sample in the vessel is Vaporous acetic anhydride and HFBA from the drug are applied to the dried peptide sample.
  • the HFBA and acetic anhydride act on the C-terminal of the peptide chain at the above-mentioned heating temperature, and through the above-mentioned reaction formulas (Ia) to ( ⁇ ′), A sequential decomposition reaction of the terminal amino acid proceeds.
  • the C-terminus of the peptide chain of the strong reaction product is in the form of an asymmetric acid anhydride in which the 5-oxazolone ring or the carbonyl group described above has been activated.
  • the vial holding the dried sample of the mixture containing the reaction product also attached in a glass reaction vessel of the airtight test tube type with a stopper the glass A predetermined amount of the liquid reagent to be added is added.
  • This post-treatment is mainly carried out in the above-mentioned mixture, in which the C-terminal of the reaction product peptide is not converted to a hydroxyl group, but remains in a 5-oxazoline structure, or is an asymmetric acid anhydride. Since the product that has progressed to the conversion into a product is also in the form of a contained mixture, it is subjected to a hydrolysis treatment to convert the C-terminus of the peptide into a carboxy group.
  • the whole hermetically sealed reaction vessel is heated at 60 ° C for 1 hour, and the vapor DMAE and water molecules supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried sample.
  • the asymmetric acid anhydride and the 5-oxazolone structure are hydrolyzed by the action of a water molecule in the presence of the organic base, DMAE, as shown in the above reaction formula (IV). It is converted into a form having a carboxy group at the terminal.
  • globin-peptide chain of myoglobin is composed of 153 amino acids, it deviates from the appropriate molecular weight range in mass spectrometry, and peptide fragmentation by trypsin digestion is performed.
  • a sample obtained by drying the mixture of the post-treated reaction product is placed in a container, an aqueous solution containing trypsin is added, and fragmentation of the peptide chain is performed.
  • the aqueous solution containing trypsin contains trypsin at a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ L in a 3-pyridine acetate buffer (pH 7), and trypsin digestion is performed at 37 ° C. with stirring. And perform the enzyme reaction for 8 hours.
  • the original peptide chain and the reaction product are also subjected to N-acetylation of the N-terminal amino group and lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 The N-acetylation of the CH 2 NH 2 ) -CO-) to the amino group at the ⁇ -position is maintained. No cleavage occurs, and only cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue proceeds. This poma. Globin of myoglobin The amino acid sequence of the tide chain has already been determined. Fragments containing the partial amino acid sequences of 2-139 and 140-153 are generated.
  • reaction solution is subjected to desalting treatment using Zip Tip, separation and recovery of peptide fragments, and then lyophilization of these peptide fragments.
  • reaction product after peptide fragmentation by post-treatment and trypsin digestion Reaction product after post-treatment and peptide fragmentation and C-terminal fragment of globin 'peptide chain obtained by performing the above series of treatments
  • molecular weight of each contained peptide fragment is measured by mass spectrometry.
  • the mass of the main ion species reflecting the molecular weight of each peptide fragment and the relative signal intensity were measured using a MA LDI-TOF-MS device on the dried peptide fragment mixture sample. Perform measurement and comparison.
  • the separation of ion species is performed by measuring the so-called negative mode, in which a negatively charged ion species is guided to a detector, and detecting the positively charged ion species by a detector. To the so-called positive mode measurement.
  • the peak having a relatively large intensity was determined to correspond to the C-terminal peptide fragment of the 140-153 partial amino acid sequence that did not contain an arginine residue.
  • a peptide fragment corresponding to the partial amino acid sequence of 78-102 derived from cleavage at the lysine residue from which the N-acetylino group was removed in the partial amino acid sequence of 32-139 was also found.
  • the intensity shows a relatively large peak.
  • peptide fragments generated by autolysis of trypsin are also found in such a molecular weight range.
  • the intensity shows a relatively large peak.
  • the ionic species corresponding to the peptide fragment having a lysine residue at the C-terminus, which has lost acetylation protection, can be easily identified.
  • tryptic digested peptide fragments of lysine residues can be used in such a range of molecular weights. Therefore, the task becomes easier when discriminating between a target C-terminal peptide fragment and a series of C-terminal peptide fragments in which the accompanying C-terminal amino acid is sequentially degraded.
  • poma myoglobin which is a sample to be analyzed, was subjected to gel electrophoresis by SDS-PAGE using polyacrylamide gel, and the globin peptide chain was separated as a single spot. After that, the identification accuracy of the C-terminal amino acid sequence identified by the analysis method according to the present invention was verified.
  • a reducing agent such as H: 2-mercaptoethanol
  • DTT dithiothreitol: threo-1,4-disulfanil-2,3-butanediol
  • the sulfanyl group (1-SH) of the cysteine residue is protected by carboxymethylation or the like in advance.
  • the peptide solution gel concentration 1 2. spots to 5 mass 0/0 of polyacrylamide de on the gel after electrophoresis treatment, 'staining, globin an object' Coomassie specific bands peptide chain I do.
  • the gel in the staining band is cut out and the gel slice is subjected to the following series of operations.
  • the gel slice is placed in an airtight tube, and 1 mL of acetonitrile is injected, followed by stirring for 15 minutes. Thereafter, the acetonitrile is discarded, and 1 ml of acetonitrile is newly added, and the mixture is further stirred for 15 minutes. Extraction of water impregnated in the gel using this acetonitrile is performed three times in total, and the gel is dehydrated. The gel volume shrinks during the dehydration treatment.
  • N-acetylation of the lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) to the ⁇ -position amino group contained in the peptide chain, , O-acetylation of a hydroxy group present in a serine residue (—NH—CH (CH 2 OH) —CO—) or a threonine residue (one NH—CH (CH (CH 3 ) OH) —CO—), O-acetylation of a tyrosine residue (one NH—CH (CH 2 —C 6 H 4 —OH) —CO—) to a phenolic hydroxy group is performed.
  • the formamide solution of acetic anhydride is removed, and the mixture is placed in a tube container. Inject 1 mL of acetonitrile and stir for 15 minutes. Thereafter, the acetonitrile is discarded, 1 ml of acetonitrile is newly added, and the mixture is further stirred for 15 minutes. Extraction of the formamide solution impregnated in the gel using this acetonitrile is performed three times in total, and the solvent removal (formamide) treatment in the re-swelled gel is performed. With the desolvation treatment, the gel volume shrinks, and at the same time, the gel is dehydrated.
  • the gel shrunk by the dehydration treatment is re-swelled and the reaction reagent is infiltrated into the gel. Specifically, after completion of the pretreatment operation, the obtained globin modified with an acetyl group is protected.
  • Furuorobutan acid (HFBA: C 3 F 7 COOH ) 1 volume 0/0, injecting the formamide solution 1 mL of acetic anhydride 10 volume 0/0.
  • HFBA C 3 F 7 COOH
  • the gel that initially shrinks in volume re-swells and returns to its original volume as the solvent infiltrates formamide.
  • HFBA and acetic anhydride were heated at the heating temperature to the C-terminal of the peptide chain supported in the re-swelled gel.
  • the selective degradation of the C-terminal amino acid of the peptide chain proceeds.
  • the sequential decomposition reaction of the amino acid at the C-terminal of the peptide chain via the 5-oxazolone ring formation via the reaction pathways of the above-mentioned reaction formulas (Ia) to ( ⁇ ) Is estimated to progress.
  • Each of the successive decomposition processes is promoted by the catalytic action of HFBA functioning as a proton donor in formamide, a dipolar solvent.
  • the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid proceeds, and the gel remains at the point of conversion to a series of reaction products from which the C-terminal amino acid has been gradually removed and to the first-stage 5-oxazolone structure However, the mixture containing the original peptide chain modified and protected by the acetyl group remains in a state of being supported on the gel carrier.
  • the unreacted formamide solution containing unreacted anhydrous acetic acid and HFBA remaining in the container is removed, and acetonitrile lmL is injected into the container. Stir for a minute.
  • the mixture containing the reaction product was put gel slice of the condition being carried in the container, DMA E ((CH 3) 2 N- CH 2 CH 2 ⁇ _H) 1 0 vol 0/0 concentration Inject 1 mL of aqueous solution.
  • DMA E ((CH 3) 2 N- CH 2 CH 2 ⁇ _H) 1 0 vol 0/0 concentration
  • Inject 1 mL of aqueous solution While stirring the stoppered container, the temperature of the entire container is heated to 60 ° C. and maintained at such temperature for 1 hour. At this time, the gel that has been dehydrated rapidly re-swells and returns to its original volume as the solvent water infiltrates.
  • the water treatment proceeds.
  • the hydrolysis treatment in this post-treatment is mainly based on the fact that, in the above mixture, the C-terminal of the reaction product peptide has a 5-oxazolone structure other than that converted into a carboxy group. Those that remained in the mixture or those that had progressed to conversion to the asymmetric acid anhydride were in the form of a mixed mixture.
  • the C-terminus is a process for converting to a carboxy group.
  • a serine residue one NH—CH (CH 2 OH) —CO 2 -
  • Ya threonine residue an NH- CH (CH (CH 3) OH) -CO-
  • deprotection is performed.
  • Hydrolysis of O-acetylation protection of tyrosine residues one NH—CH (CH 2 —C 6 H 4 —OH) —CO—
  • phenolic hydroxy groups proceeds in a similar manner.
  • the aqueous solution remaining in the container is removed, 1 mL of acetonitrile is poured into the container, and the mixture is stirred for 15 minutes. Thereafter, the acetonitrile is discarded, and acetonitrile lnxL is newly injected, followed by further stirring for 15 minutes. Extraction of the aqueous solution impregnated in the gel using this acetonitrile is performed three times in total, and dehydration treatment in the re-swelled gel is performed. Gel volume shrinks during dehydration.
  • the globin 'peptide chain of myoglobin is composed of 153 amino acids, it deviates from the appropriate molecular weight range in mass spectrometry, and peptide fragmentation by trypsin digestion is performed.
  • a trypsin-containing aqueous solution is added to the container in which the post-treated and dehydrated gel slices are placed, and the gel is supported on the gel carrier. Perform fragmentation of the peptide chain.
  • the trypsin-containing aqueous solution contains trypsin at a concentration of 0.067 g / ⁇ L in ammonium bicarbonate buffer (pH 8), and the trypsin digest is stirred at 37 ° C. Perform the enzyme reaction for 4 hours. At that time, the gel that has been dehydrated quickly re-performs as the solvent water infiltrates, and returns to its original volume. By reacting the peptide chains and reaction products carried in the re-swelled gel with trypsin infiltrating into the gel together with the buffer at the heating temperature, the enzyme digestion specific to trypsin is performed. Progresses.
  • the peptide chain and the reaction product are also deprotected in the above-mentioned post-treatment step, N-acetylation of the N-terminal amino group, lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) N-acetylation of the amino group at the E-position of -CO-) is maintained, and cleavage of the C-terminal peptide bond of the N-acetylated lysine residue is not performed by trypsin digestion. The cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue proceeds.
  • the amino acid sequence possessed by the globin-peptide chain of this pima 'myoglobin has already been determined, and as shown in FIG.
  • the peptide chain undergoes trypsin digestion into fragments containing each of the partial amino acid sequences of 131, 32-139, and 140-153.
  • lysine residues protected by N-acetylation during pretreatment are shaded, and tryptic digestion results in cleavage of the C-terminal peptide bond of arginine residues.
  • the resulting partial amino acid sequences of the N-terminal 1 31 1 and the C-terminal 140-153 are shown in bold.
  • the fragmented peptide eluted into the trypsin solution in the container is recovered from the gel. After desalting the solution containing the recovered mixture of peptide fragments, vacuum drying is performed.
  • reaction product after peptide fragmentation by post-processing and trypsin digestion Reaction product after post-processing and peptide fragmentation and C-terminal fragment of globin / peptide chain obtained by performing the above series of treatments
  • molecular weight of each contained peptide fragment is measured by mass spectrometry.
  • a main ion reflecting the molecular weight of each peptide fragment was applied to the peptide fragment mixture sample that had been desalted and dried. Measure and compare the mass of the species peak and its relative signal strength.
  • the separation of ion species is performed by leading a negatively charged ion species to a detector, so-called “negative 'mode measurement, and leading a positively charged ion species to a detector. Both so-called positive mode measurements are performed.
  • a peptide fragment corresponding to the partial amino acid sequence of 78-102 which is derived by cleavage at the lysine residue from which the N-acetyl group has been removed in the partial amino acid sequence of 32-139.
  • the intensity shows a relatively large peak.
  • peptide fragments produced by autolysis of trypsin are also found in this molecular weight range, and similarly, in the positive mode measurement shown in FIG. 5, the intensity shows a relatively large peak.
  • the two amino acids from the C-terminal, glycine and glutamine are sequentially degraded by the C-terminal amino acid.
  • a peak derived from the reaction product that is sequentially decomposed is confirmed.
  • the peptide chain separated as a band on the above-mentioned gel slice to be analyzed is actually a globin / peptide chain, and a state in which the C-terminal amino acid sequential degradation treatment is carried on the gel.
  • the N-terminal amino acid sequence obtained by digesting the peptide chain with trypsin while protecting the lysine residue side chain with N-acylation is used.
  • the common peptide fragment derived therefrom is used as a peptide fragment having an arginine residue at the C-terminus, and is used to distinguish it from the C-terminal peptide fragment. Even if the peptide chain to be analyzed originally has arginine at the C-terminus, it is important to reflect the molecular weight of each peptide fragment in the measurement using the MALD I-TOF-MS instrument.
  • a vial holding a dried sample of the above-mentioned peptide sample (Ac-EGVN DNEEGFFSAR) obtained by N-acetylation treatment in advance is attached to an airtight test tube type glass reaction vessel with a stopper.
  • a predetermined amount of the following liquid reagent is separately charged into the glass reaction vessel.
  • a liquid reagent for the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid 5 volumes of trifluoroacetic acid were used. / 0 using the added acetic anhydride (300 L), after storing vial housing the dry sample into the glass reaction vessel, under cooling, the reaction vessel was vapor vacuum exhaust is sealed airtight. The entire hermetically sealed reaction vessel is kept at 40 ° C. for 16 hours, and vaporized acetic anhydride and trifluoroacetic acid supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried sample.
  • the entire hermetically sealed reaction vessel is heated at 100 ° C. for 30 minutes, and vapor pyridine and water molecules supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried sample.
  • the O-acetylation protection of the serine residue is deprotected, but the hydrolysis of the N-terminal N-acetylation protection of the amide bond does not occur.
  • an N-acetylated compound in which the acetyl group is modified at the N-terminal of the peptide is obtained.
  • the positive mode is a positive ion to which a proton (H +) is added
  • the negative ion mode is a positive ion to which a proton (H + ) is released.
  • the original peptide fragment that retains the amino acid sequence of 1 to 14 has a relatively large intensity and arginine. It is confirmed that it contains a residue.
  • a peak corresponding to the molecular weight from which the arginine residue was decomposed and removed from the original peptide fragment was observed, while in the positive mode measurement, a corresponding peak was observed. The peak is not clearly found.
  • the original peptide fragment that retains the amino acid sequence of 11-14 has an arginine residue at the C-terminus, and in the positive mode measurement, the intensity is relatively large, but the negative mode
  • an ion species originating from a series of accompanying reaction products was found, and a peak corresponding to the molecular weight from which arginine residues were decomposed and removed was present. Is confirmed to have been received.
  • Table 3 shows the measured mass of the peak, the difference from the mass of the peak due to the original peptide chain, and the amino acids removed from each reaction product fragment identified therefrom. Shows the form of the reaction product.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide comprises the steps of: (a) sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of the peptide; Amino groups, as well as for Amino groups of lysine residue side chain, N- Ashiru of protection by performing, at the same time, a serine residue (an NH- CH (CH 2 0 H) - CO -) Ya threonine residue even for hydroxy groups present in the group (one NH- CH (CH (CH 3) OH) -CO I), in a state in which O- Ashiru of protection is made a dry atmosphere, in mild heating temperature, alkanes A reaction reagent obtained by combining a small amount of perfluoroalkanoic acid with an acid anhydride is allowed to act.
  • the alkanoic anhydride used itself has low reactivity, so that unnecessary side reactions such as cleavage of an amide bond in the middle of the peptide do not occur, and the C-terminal amino acid of the peptide can be obtained under mild heating conditions. Can be sequentially decomposed and removed. Concomitantly, there is no fragmentation of the amide bond in the middle of the peptide. Mixing can also be avoided. Further, by utilizing the reaction under such mild conditions, a series of reaction products obtained is subjected to post-treatment in the presence of an organic basic compound by hydrolyzing, so that a carboxy terminal is obtained at the C-terminal.
  • the shortened C-terminal amino acid sequence can be determined with high accuracy.
  • the amino acid length change of the peptide chain is at most about 10 amino acids.
  • these chemical treatments can be advanced while maintaining the state of being supported on the gel carrier.
  • tryptic digestion and peptide fragmentation are performed, peptide fragments with a significantly shorter amino acid length can no longer be stably retained on the gel carrier, and can be easily eluted and recovered from the gel carrier. It becomes.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of peptides according to the present invention is a more versatile analysis method. It becomes.

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Abstract

　本発明は、アミノ酸長の長いペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する際、ペプチド途中におけるペプチド結合の切断などの好ましくない副次反応を抑制でき、その処理を汎用性の富む条件で実施することが可能な、逐次的Ｃ末端アミノ酸の分解反応手段を利用したペプチドのＣ末端アミノ酸配列解析方法として、アミノ酸長の長いペプチドの乾燥試料に対して、予めＮ−アシル化処理を施し、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の逐次的分解を行い、加水処理後、トリプシン消化により、アルギニン残基部位で選択的に断片化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置のネガティブ・モード解析により、一連の反応産物に由来するＣ末側断片の分子量減少を測定し、Ｃ末端アミノ酸配列を特定する方法を提供する。

Description

明 細 書
ぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法 技術分野
本発明は、 ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法に関し、 より具体 的には、 ペプチド、 例えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチド に関して、 化学的方法により該ペプチドの C末端アミノ酸を逐次的に分解して、 その反応産物の分子量を質量分析により決定し、 逐次的に除去される一連のァ ミノ酸に起因する分子量減少に基づき、 C末端アミノ酸配列を解明する方法に 関する。 背景技術
天然より採取されるペプチドやタンパク質に関して、 そのアミノ酸配列の同 定は、 かかるペプチドやタンパク質の生物学的性質、 機能を研究する際、 不可 欠な情報である。 現在、 ペプチドやタンパク質の全アミノ酸配列は、 対応する 遺伝子情報、 すなわち、 これらのペプチドをコードしているゲノム遺伝子や m _ R NAより調製された c一 D N Aの塩基配列に基づき、 推断されるアミノ酸 配列として決定されている。 その際、 該ペプチドをコードしているゲノム遺伝 子や m— R NAより調製された c— D NAを特定する上では、 ぺプチドの部分 的なアミノ酸配列の知見は、 依然として必要である。
このペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見としては、 一般に、 ペプチドの N末端アミノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが、 特に有用とされている。 具体 的には、 例えば、 多数の m— R N Aより調製された c一 D NAライブラリーか ら、 目的とするペプチドをコードしている c—D NAを選別する際、 仮に、 N 末端ァミノ酸配列と C末端ァミノ酸配列とが判明していると、 かかる両末端の アミノ酸配列に基づき、 作製された核酸プローブを利用して、 目標とする c— D NAを選別することが可能となる。 あるいは、 両末端のアミノ酸配列に基づ き作製されたオリゴヌクレオチド ·プライマーを利用して、 P C R法を適用し て、 目標とする c _DNAを選択的に増幅することも可能となる。
ペプチドの N末端アミノ酸配列を解析する手法としては、 従来から、 エドマ ン分解法を利用して、 N末端ァミノ酸を逐次的に分解しつつ、 生成するアミノ 酸誘導体を同定する手法が利用されている。 一方、 ペプチドの C末端アミノ酸 配列を解析する手段として、 化学的手法により C末端ァミノ酸を逐次的に分角旱 し、 その反応産物として得られる短縮されたペプチドと元のペプチドとの分子 量差から、 分解された C末端アミノ酸を特定する方法が既に提案されている。 例えば、 化学的手法により C末端アミノ酸を逐次的に分解する手段として、 9 0°Cに加熱しつつ、 乾燥したペプチドにペンタフルォロプロパン酸 （CF3CF 2COOH) 高濃度水溶液、 あるいは、 ヘプタフルォロブタン酸 （CF3CF2 CF2COOH) 高濃度水溶液から発生した蒸気を作用させて、 前記パーフルォ ロアルカン酸により促進される、 C末端アミノ酸の選択的な加水分解を行わせ る方法が提案されている （T s u g i t a , A. e t a 1. , Eu r . J, B i o c h e m. 206， 691 -696 ( 1992 ))。カロえて、 前記パーフルォロアルカン酸高濃度水溶液に代えて、 無水ペンタフルォロプロ パン酸 （（CF3CF2CO) 20) のァセトニトリル溶液、 または無水ヘプタフ ルォロブタン酸（（じ 30 2じ 200)20)のァセトニトリル溶液を用いて、 例えば、 一 18°Cに冷却しつつ、 この溶液から発生した蒸気を乾燥したぺプチ ドに作用させて、 前記パーフルォロアルカン酸無水物により促進される、 C末 端ァミノ酸の選択的な分解を行わせる方法が提案されている （T s u g i t a , A. e t a 1. , C h e m. L e t t. 1992， 235 - 238 ； T a k amo t o K. e t a 1. , Eu r. J . B i o c h em. 228, 362- 372 (1 995))。
前記の乾燥したペプチドに、 蒸気として供給されるパーフルォロアルカン酸、 あるいは、 パーフルォロアルカン酸無水物を作用させ、 C末端アミノ酸の選択 的な分解を行う手法では、 下記する反応式 （I) で表記される脱水反応：
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
により、 c末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造が一端形 成され、 次いで、 パーフルォロアルカン酸がこのォキサゾロン環に作用し、 次 に示す反応式 （II) で表記される反応：
Figure imgf000005_0003
が生じ、 結果的に、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると報告さ れている。
上記の c末端アミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、 所定の処理時間 が経過した時点で、 元のペプチドに対して、 1〜1 0数アミノ酸残基がその C 末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。 この一 連の反応産物を含む混合物に対して、 質量分析法を適用して、 各反応産物に由 来するイオン種の質量を測定すると、 C末端アミノ酸配列を反映した質量差を 示す一連のピークが測定できる。 具体的には、 各反応産物は、 元のペプチドか ら逐次的な C末端ァミノ酸分解反応で生成される結果、 例えば、 元のぺプチド から数アミノ酸残基が除去された反応産物までの、 数種の一連の反応産物群に 関して、 質量分析法を利用することで、 対応するイオン種の質量を一括して分 析することができ、 かかる数ァミノ酸残基分の C末端ァミノ酸配列を一括して 決定できる。
なお、 例えば、 核酸プローブやプライマーの作製に利用する C末端アミノ酸 配列の情報は、 通常、 力かるアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 1 8 塩基長〜 2 4塩基長程度、 従って、 6アミノ酸〜 8アミノ酸程度であってもよ く、 1 0数アミノ酸残基に達する C末端アミノ酸配列の解明を必要とするのは、 極めて特殊な場合のみである。 従って、 上記のパーフルォロアルカン酸または パーフルォロアルカン酸無水物の蒸気を気相から供給しつつ、 乾燥したぺプチ ドに作用させて、 逐次的な C末端ァミノ酸分解反応により、 例えば、 1 0アミ ノ酸残基の除去に達する一連の反応産物を同時に含有する処理試料を調製する これらの手段は、 前記の用途に適合したものである。 発明の開示
一方、 解析対象のペプチドが、 例えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の 多いペプチドである場合には、 元のペプチド自体の分子量が、 質量分析法の適 用可能な分子量範囲を超える、 あるいは、 元のペプチド自体の大きな分子量に 対して、 1アミノ酸残基の式量変化が相対的に少なく、 分子量差の測定精度の 低下を起こすため、 下記の工夫が検討されている。 具体的には、 上記の C末端 アミノ酸の選択的な分解反応で得られる、 元のぺプチドに対して、 1〜1 0数 ァミノ酸残基がその C末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合 物に対して、 特定のアミノ酸部位において、 選択的なペプチド鎖の切断が可能 な、 切断部位特異性を有するプロテアーゼ、 例えば、 トリプシンを利用し、 長 いペプチド鎖の酵素消化を施した上で、 そのペプチド断片について、 質量分析 を行う形態を利用している。 すなわち、 力かる酵素消化を施して得られるぺプ チド断片の混合物中には、 元のペプチドに由来する C末側ペプチド断片と、 そ れに対して、 1〜1 0数アミノ酸残基がその C末端からそれぞれ除去された一 連の反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群が含まれており、 この元のぺプ チド、 ならびに一連の反応産物に由来する C末側ペプチド断片群に対して、 質 量分析法を適用して、 各反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群ィオン種の 質量を測定すると、 C末端アミノ酸配列を反映した質量差を示す一連のピーク を、 十分な分子量分解能で測定できる。 それに対して、 上述のパーフルォロアル力ン酸またはパーフルォロアル力ン 酸無水物の蒸気を気相から供給しつつ、 乾燥したぺプチドに作用させる手法は、 有用な C末端アミノ酸配列の解明手段ではあるものの、 解析対象のペプチドが、 例えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチドである場合に、 汎用 の手段として利用を進める際、 以下に記載する幾つか実用上の課題を残すこと が判明した。
第一の課題としては、 上述するパーフルォロアルカン酸高濃度水溶液を利用 し、 例えば、 90°Cに加熱しつつ、 乾燥したペプチドにパーフルォロアルカン 酸蒸気を作用させる手法では、 ペプチド中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2 OH) -CO-) において、 α位のアミノ基 （一 ΝΗ— ) と 位のヒドロキシ 基 （一 ΟΗ) の間で、 Ν， Ο—ァシル転位反応も進行し、 引き続き、 加水分解 が進行し、 セリン残基の Ν末側でペプチドの切断が生じるという副反応が存在 する。 また、 条件に依っては、 位にヒ ドロキシ基 （一 ΟΗ) が存在している トレオニン残基 （一NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) においても、 同様の機構による加水分解が進行し、 トレォェン残基の N末側でペプチドの切 断が生じるという副反応が存在する。 さらには、 ペプチド中のァスパラギン酸 残基 （一 NH— CH (CH2COOH) -CO-) において、 C末のカルボキシ 基から i3位のカルボキシ基へのぺプチド結合の転位と、 それに引き続く加水分 解が進行し、 ァスパラギン酸残基の C末側でぺプチドの切断が生じるという副 反応が存在する。
これら副次反応により、 長いペプチド鎖の切断が生じると、 その N末側ぺプ チド断片に対しても、 C末端ァミノ酸の選択的な分解が同時に進行することに なる。 これらの副次反応に由来する反応産物が共存すると、 場合によっては、 目的とする反応産物の質量分析に際して、 その測定を阻害する要因ともなる。 さらには、 元のペプチド鎖の切断に至らなくとも、 ]3位のヒ ドロキシ基 （一 OH) へ N末側部分ぺプチドが連結された分岐型ぺプチドとなると、 その部位 では、 アミ ド結合が失われており、 ォキサゾロン環構造の形成がなされず、 C 末端ァミノ酸の選択的な分解反応がそれ以上進行しないものとなる。 W それに対して、 上述するパーフルォロアルカン酸無水物のァセトニトリル溶 液を利用し、 例えば、 一 1 8 °Cに冷却しつつ、 この溶液から発生したパーフル ォロアルカン酸無水物蒸気を乾燥したぺプチドに作用させる手法は、 系内に溶 液から蒸発する水分子を含まないので、 前記の副次的反応の発生を有効に回避 できる利点を有している。 ただし、 利用しているパーフルォロアルカン酸無水 物の反応性が高く、 処理温度が上昇すると、 不要な副次的反応を効果的に抑制 することが困難となるため、 処理温度を、 例えば、 一 1 8 °Cのような低温に維 持する必要がある。 換言すれば、 処理温度の調整が不十分であると、 不要な副 反応が進行する可能性が高く、 その観点では、 汎用性になお難点を残し、 更な る改良の余地を有する手法ともいえる。 加えて、 冷却に伴って水分の結露を起 こすと、 力かる水分により、 利用している試薬の劣化、 すなわち、 パーフルォ ロアルカン酸無水物の劣化が起こり、 結果として、 反応性の低下を引き起こす こともあり、 実用上の問題になる懸念もある。
第二の課題としては、 解析対象のペプチドが、 例えば、 タンパク質などのァ ミノ酸残基数の多いペプチドである場合には、 C末端アミノ酸の選択的な分解 反応を行った後、 切断部位特異性を有するプロテアーゼを利用する酵素消化処 理を付加し、 得られる C末側ぺプチド断片の分子量測定を行う形態を採用する ことが検討されているが、 その際、 かかる酵素消化で必然的に副生される、 N 末側のペプチド断片複数も、 測定される質量分析スペク トル上に、 同時に観測 されることになる。 すなわち、 元のペプチド、 ならびに一連の反応産物に由来 する C末側ぺプチド断片群に起因するピークと、 それ以外の N末側のぺプチド 断片複数に起因するピークとを高い確度で分別した上で、 目的とする、 元のぺ プチド、 ならぴに一連の反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群に起因する ピークの各分子量をより精度よく決定可能な、 測定手法の提案が待たれている。 本発明は前記の課題を解決するもので、 本発明の目的は、 上述する長いぺプ チド鎖の C末端ァミノ酸を、 ォキサゾロン環構造の形成を経由する反応機構を 利用して、 逐次的に分解する際、 ペプチド鎖途中におけるペプチド結合の断裂 などの好ましくない副次反応を抑制でき、 同時にかかる化学的な処理自体は、 汎用性の富む条件で実施することが可能な、 逐次的 C末端ァミノ酸の分解反応 手段を提供するとともに、 元のペプチド、 ならびに調製される一連の反応産物 を、 切断部位特異性を有するプロテアーゼを利用する酵素消化処理を行った後、 これら酵素消化ペプチド断片複数を質量分析する際、 目的とする、 元のぺプチ ド、 ならびに一連の反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群に起因するピー クと、 その他の酵素消化べプチド断片複数に起因するピークとの弁別をより容 易とするプロテアーゼを利用する酵素消化処理と、 前記逐次的 C末端アミノ酸 の分解反応手段とを組み合わせて、 長!/、ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸配列をよ り簡便に解析可能な方法を提供することにある。 本発明者らは、 上記の課題を解決すべく、 鋭意検討と研究を繰り返したとこ ろ、 パーフルォロアルカン酸高濃度水溶液を利用し、 例えば、 9 0 °Cに加熱し つつ、 乾燥したぺプチドにパーフルォロアルカン酸蒸気を作用させる手法にお ける不要な副次的反応は、 系内にパーフルォロアルカン酸高濃度水溶液から蒸 発する、 パーフルォロアルカン酸と水分子が存在するため、 例えば、 ペプチド 中のセリン残基 （_ NH— C H ( C H 2 O H) - C O -) において、 α位のアミ ノ基 （一 ΝΗ—） と；3位のヒドロキシ基 （一 O H) の間で、 N, 〇一ァシル転 位反応が前記加熱条件下で促進を受け、 さらに、 生成するエステルの加水分解 も系内に存在する水分子により促進を受ける結果と結論された。 一方、 パーフ ルォロアルカン酸無水物のァセトニトリル溶液を利用し、 例えば、 一 1 8 に 冷却しつつ、 乾燥したぺプチドにパーフルォロアルカン酸無水物蒸気を作用さ せる手法では、 系内に水分子は存在しないものの、 パーフルォロアルカン酸無 水物自体の高い反応性に起因して、 処理温度の上昇とともに、 不要な副次的反 応の頻度が急速に増すことが確認されている。
以上の知見に基づき、 本発明者らは、 系内への水分子の供給源となる水溶媒 を使用することなく、 また、 パーフルォロアルカン酸無水物の如く、 高い反応 性を示す試薬を使用することなく、 C末端アミノ酸から反応中間体として、 ォ キサゾロン環構造を形成し、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C 末端アミノ酸の選択的な分解反応を行うことが可能な反応条件を探索したとこ ろ、 少量のパーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に添加した混合物を利 用して、 例えば、 気相から、 この混合物から供給される、 蒸気状のパーフルォ 口アル力ン酸とアル力ン酸無水物とを乾燥したぺプチドに作用させると、 例え ば、 60°C以下の処理温度においても、ォキサゾロン環構造の形成、引き続き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応が進行 することを見出した。 加えて、 アルカン酸無水物は、 パーフルォロアルカン酸 無水物と比較し、 その反応性は大幅に穏やかであり、 パーフルォロアルカン酸 共存下においても、 ペプチドの途中切断を引き起こすには至らないことをも見 出した。 具体的には、 ペプチド中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) 一 CO-) ゃトレオニン残基 （一NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に 存在するヒドロキシ基に対して、 パーフルォロアルカン酸の共存下、 アルカン 酸無水物が作用して、 O—ァシル化反応が優先的に進行し、 N， O—ァシル転 位反応を競争的に阻害する。 同時に、 N末端のァミノ基への N—ァシル化反応 が進行し、 また、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) ― CO—) の ε位のアミノ基への N—ァシル化反応、 チロシン残基 （一 NH— C H (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒ ドロキシ基への 0—ァ シル化反応なども進行することも判明した。 結果的に、 ペプチドの途中切断を 誘起する、 N, O—ァシル転位反応等の転位反応に関与する側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基などの反応性官能基は、 保護 ·修飾を受けるため、 不要な副次 反応は回避しつつ、 目的とする C末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサ ゾロン環構造を形成し、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C末端 アミノ酸の分解反応のみが、 例えば、 60°C以下の処理温度において選択的に 進行することを見出した。
加えて、 本発明者らは、 上記のパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物 とを利用する、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサゾロン環の 開裂に伴う、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応は、 系内に水分子が存在しな い状態とし、 双極性非プロトン性溶媒中にパーフルォロアルカン酸とアルカン 酸無水物とを溶解させて、 対象となるペプチドに液相で作用させた場合も、 例 えば、 4 0 °C程度の処理温度においても、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続 き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応が 進行することを見出した。 加えて、 ヒドロキシ基に対して、 パーフルォロアル カン酸の共存下、 アルカン酸無水物が作用して、 O—ァシル化反応が優先的に 進行し、 N, O—ァシル転位反応を競争的に阻害する効果、 ならびに、 ァミノ 基への N—ァシル化反応、 フエノール性ヒドロキシ基への〇一ァシル化反応な ども進行することも判明した。結果的に、ペプチドの途中切断を誘起する、 N， O—ァシル転位反応等の転位反応に関与する側鎖上のヒドロキシ基、 アミノ基 などの反応性官能基は、 保護 ·修飾を受けるため、 不要な副次反応は回避しつ つ、 目的とする C末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造を 形成し、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の分解 反応のみが、 例えば、 4 0 °C以下の処理温度においても、 選択的に進行するこ とを見出した。 例えば、 ゲル電気泳動後、 かかるゲル担体上に担持されている ペプチドであっても、 予め、 ゲル担体中に含浸される水分を十分に除去する脱 水処理を施した後、 双極性非プロトン性溶媒中にパーフルォロアルカン酸とァ ルカン酸無水物とを溶解させてなる溶液を、 ゲル担体内に浸入させ、 ゲルの膨 潤を図ると、 ゲル担体中においても、 同等の液相反応を達成できることを見出 した。
加えて、 本発明者らは、 ヒドロキシ基に対する〇一ァシル化、 ァミノ基への N—ァシル化による、 ペプチドの途中切断を誘起する、 N, O—ァシル転位反 応等の転位反応に関与する側鎖上のヒドロキシ基、 アミノ基などの反応性官能 基の保護 ·修飾を予め施した後、 上記のパーフルォロアルカン酸とアルカン酸 無水物とを利用する、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサゾロ ン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応を実施すると、 不要な 副次反応の回避には、 より有効であることを確認した。 具体的には、 ペプチド の乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度 において、 アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給 される、 蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させると、 該ぺプチ ド N末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチドに含有されている可能性のあるリシ ン残基側鎖のアミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基による N—ァシル化、 ならびに、 側鎖上のヒドロキシ基に対する O—ァシル化を予め 施すことが可能であることを見出した。 また、 ゲル担体上に担持されているぺ プチドであっても、 予め、 ゲル担体中に含浸される水分を十分に除去する脱水 処理を施した後、 双極性非プロトン性溶媒中にアル力ン酸無水物を溶解させて なる溶液を、 ゲル担体内に浸入させ、 ゲルの膨潤を図ると、 ゲル担体中におい ても、 同等の液相での N—ァシル化、 O—ァシルイヒ反応を行わせることが可能 であることを見出した。
また、 本発明者らは、 上述の C末端アミノ酸の分解反応を終えた時点では、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続く、 このォキサゾロン環の開裂に伴う反応 性中間体も残留しており、 これら反応性中間体に加水処理を施し、 反応産物の C末端は、 カルボキシ基の表出する形態に復することが、 その後の質量分析を 行う上で必要であり、 例えば、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化 合物を溶解する水溶液を利用し、 反応産物をかかる水溶液に接触させることで、 容易になされることが確認された。 また、 かかる有機塩基の触媒作用を利用す る加水処理では、 ォキサゾロン環構造中の環状エステルへの加水反応に加えて、 O—ァシル化保護されているヒ ドロキシ基におけるエステルへの加水反応、 す なわち、 ヒ ドロキシ基における脱保護も進行すること、 一方、 より安定な N— ァシルイ匕保護における脱保護の達成には至らないことも見出された。 すなわち、 かかる加水処理を施すと、 元のペプチド鎖に対して、 その N末端のアミノ基、 ならびに、 ぺプチド鎖に含有される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に は、 N—ァシル化保護がなされたものとなる。 また、 C末端アミノ酸の分解反 応で生成した反応産物のペプチド鎖も、 同じく、 その N末端のアミノ基、 なら びに、 該ぺプチド鎖に含有される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基には、 N—ァシル化保護がなされたものとなる。
以上の知見に加えて、 本発明者らは、 前述するその N末端のアミノ基、 なら びに、 ぺプチド鎖に含有される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基には、
N—ァシル化保護がなされた、 長いペプチド鎖に対して、 トリプシン消化処理 を施すと、 リシンまたアルギニン残基の C末端側べプチド結合を開裂するトリ プシンの切断部位特異性のうち、 リシン残基側鎖のァミノ基には、 N—ァシル 化保護がなされており、 その N—ァシル化リシン残基では、 ペプチド鎖の消化 は起こらず、 得られるペプチド断片は、 アルギニン残基における消化に因るも のとなることを確認した。 より具体的には、 かかるトリプシン消化処理を施す と、 元のペプチド鎖と、 C末端アミノ酸の分解反応で生成した一連の反応産物 のペプチド鎖との混合物から、 共通するペプチド断片として、 C末端にアルギ ニン残基が一つ含まれる部分ァミノ酸配列を有するぺプチド断片、 ならびに、 C末端側の部分アミノ酸配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元の ぺプチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド 断片が得られることになる。 その際、 ペプチド鎖中に含有されるアルギニン残 基の平均的な存在頻度を考慮すると、 例えば、 200アミノ酸程度の長いぺプ チド鎖中には、 少なくとも、 4個以上、 多くとも、 10個程度のアルギニン残 基が存在するのみであり、 前記の C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共 通するペプチド断片は、 4〜10個程度、 また、 元のペプチド鎖に由来する C 末端側べプチド断片のァミノ酸数は、 少なくとも 15ァミノ酸以上、 50アミ ノ酸以下の範囲となる確度が相当に高レ、ことに、 本発明者らは想到した。 その上、 本発明者らは、 種々のペプチド断片について、 MALD I— TOF — M S (M a t r i As s i s t e d L a s e r De s o r p t i o n I o n i z a t i o n T i me— o f — F l i g h t Ma s s S p e c t r ome t r y ;マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量 分析） 法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定、 な らびに陰イオン種による分子量測定を行った際、 C末端にカチォユックなアミ ノ酸残基、 特には、 アルギニン残基が存在する場合、 陽イオン種による分子量 測定におけるピーク強度は、 陰イオン種による分子量測定における対応ピーク 強度よりも、 有意にその相対強度は大きく、 一方、 C末端にカチォニックなァ ミノ酸残基が存在していない場合、 陰イオン種による分子量測定におけるピー ク強度は、 陽イオン種による分子量測定における対応ピーク強度よりも、 有意 にその相対強度は大きくなるという、 一般的傾向が明確に存在することを、 実 験的に再検証した。 さらには、 この実験的に再検証を行った一般的傾向を利用 すると、 MA L D I— T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽ィ オン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行った際、 前記の C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片と、 C 末端側の部分アミノ酸配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元のぺ プチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断 片とを、 合理的に弁別することが可能であることを確認した。 すなわち、 トリ プシン消化で得られる C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するぺプ チド断片は、 単一なピークとして、 陽イオン種による分子量測定において、 大 きな相対強度で観測され、 同時に、 陰イオン種による分子量測定において、 力、 力 る共通するペプチド断片に対応するピークの強度は相対的に弱いものの、 双 方の測定結果を対比することで、 容易に特定できるため、 逆に、 陰イオン種に よる分子量測定において、 大きな相対強度で観測されるピークのうち、 C末端 側の部分アミノ酸配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元のぺプチ ド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断片は、 —連のピークを示すものとして、 容易に特定することが可能となる。
本発明者らは、 これらの一連の知見に基づき、
( 1 ) 対象とするペプチド鎖に対して、 N—ァシル化、 O—ァシル化による 保護を施し、
( 2 ) 対象とするペプチド鎖の存在状態に応じて、 適正な選択された穏和な 反応条件によって、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応を行い、
( 3 ) 前記分解反応後、 穏和な条件で、 ォキサゾロン環構造中の環状エステ ルへの加水反応、 ならびに、 〇一ァシル化による保護の脱保護反応を行い、
( 4 ) N—ァシルイ匕保護は維持されている、 元のペプチド鎖ならびに、 C末 端ァミノ酸の選択的な分解反応で得られる一連の反応産物のぺプチド鎖を含む 混合物に対して、 トリプシン消化処理を施して、 C末端にアルギニン残基が一 つ含まれる、 それらに共通するペプチド断片、 ならびに、 C末端側の部分アミ ノ酸配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖と一連の 反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断片を調製し、 ( 5 ) これらペプチド断片の混合物を、 MA L D I— T O F— M S法を利用 し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン 種による分子量測定を行った上で、 双方の測定結果を対比することによって、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 該共通するペプチド断片と、 アルギ ニン残基を含んでいない、 元のぺプチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由 来する一群の C末端側べプチド断片との弁別を行い、
( 6 ) 上記の手法で弁別される、 元のペプチド鎖'と一連の反応産物のぺプチ ド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断片の分子量差に基づき、 本来のぺプ チド鎖の C末端ァミノ酸配列を特定する、
かかる一連の工程を採用することで、 種々のタンパク質などを構成する、 長 いペプチド鎖についても、 その C末端アミノ酸配列をより簡便に解析すること が可能となることを見出し、 また、 その有用性を検証し、 本発明を完成するに 至った。
すなわち、 本発明は、 上記する技術的な思想上の共通性を有するものの、 対 象とするぺプチド鎖の存在状態に由来して、 具体的な形態に相違が生じている 複数の形態を有しており、 例えば、 解析対象とするペプチドが、 予め単離され た乾燥試料である場合に適用する第一の形態、 ならびに、 解析対象とするぺプ チドが、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された 状態の試料である場合に適用する第二の形態を有している。
本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 解析対象とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドょり、 化学的手段により C末端ァミノ酸を逐次的に分解 して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法によ り分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定するェ 程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸 を特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを 具え、
前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
対象とする前記ペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °C の範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にアル力ン酸を少量添加してなる混合物より供給される、 蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させ、
該ぺプチド N末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチドに含有されている可能性 のあるリシン残基側鎖のアミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシ ル基による N—ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、 前記 N—ァシル化保護済みの、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾 燥雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用さ せ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000016_0001
(式中
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端ァミノ酸の分解を行う工程と、 前記 c末端アミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、
残余する前記アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを乾燥状態にお いて除去する後処理を施し、
次いで、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶 液を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物と水 分子を供給して、
前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物べプチドに水分 子を作用させ、
前記の加水処理を施した後、 かかる一連の反応生成物を含む混合物に残余す る、 前記塩基性の窒素含有有機ィヒ合物と水分子を除去、 乾燥する再乾燥後処理 を行うことからなる加水処理の工程とを、 少なくとも含んでなり、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対し て、
緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ぺプチド鎖の N末端のァミ ノ基ならびに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖の アミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が保持されている、 該ぺプチド鎖のト リプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニ ン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によるべプチド断片化を行い、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済み ペプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥 混合物について、 MA L D I — T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生 じる陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行 レ、、
前記陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定に おいて測定される、 対応するイオン種において、 前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽イオン種による分子量測定における強度は、 陰イオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端の ペプチド断片ならぴに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反 応生成物に由来する C末端のペプチド断片のピークは、
陰ィオン種による分子量測定における強度は、 陽ィオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連 のピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 手法を採用することを特徴とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法であ る。
この本発明の第一の形態にかかる解析方法では、
前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物 に含まれるアル力ン酸無水物として、 炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無 水物を用いることが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜4のアルカン酸の対称 型酸無水物として、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いる ことがより好ましい。 例えば、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン 酸を少量添加してなる混合物に含まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を 用いることがより好ましい。
一方、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる 混合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パーフルォロアルカン 酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用 いることが好ましい。 その際、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン 酸を少量添加してなる混合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 炭素 数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸を用いることがより好ましい。 例えば、 前 記炭素数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の直鎖パーフ ルォロアルカン酸を用いることがより好ましい。
さらには、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加して なる混合物中における、 パーフルォロアルカン酸の含有比率は、 アルカン酸無 水物とパーフルォロアルカン酸との合計体積に対して、 1〜2 0体積％の範囲 に選択することが望ましい。 また、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアル 力ン酸を少量添加してなる混合物を利用する処理に際して、 前記乾燥雰囲気は、 水分に加えて、 酸素も除去された状態であることが一層好ましい。 例えば、 前 記乾燥雰囲気は、気密容器内において、その内部の大気を真空排気することで、 達成されていることが好適である。 なお、 前記アルカン酸無水物にパーフルォ ロアルカン酸を少量添加してなる混合物を利用する処理に際して、 その温度は、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択される温度とすることがより望ましい。
一方、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法 は、
解析対象とするペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするペプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解 して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法に より分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 工程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のァミノ酸 を特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを 具え、
前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の 対象とするペプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去す ることにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、 前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプ チド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性 溶媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水 物溶液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺ プチド試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするぺプチドの N末端のァ ミノ基ならびに、 該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上の ァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァ シル基による N—ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶 媒を用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシルイ匕反応の停止と反応試薬の 除去を行う前処理工程と、
前記 N—了シル化保護の前処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態 の対象とするペプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度 において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性 溶媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬するこ とにより、 担持された状態の対象とするペプチド試料にアルカン酸無水物とパ 一フルォロアル力ン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000020_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、 R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端アミノ酸の逐次的分解を行い、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質 の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水 物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン 性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去 を行う工程と、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応 生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合 物の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲノレ担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き 起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付カロ 的な加水処理と再脱水処理の工程とを有し、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再脱水処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態で、 緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用 させ、 該ぺプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチド鎖に含有されて いる可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に対する上記 N—ァシルイヒ保護が 保持されている、 該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切 断によるペプチド断片化を行って、
かかるゲル担体上から該ぺプチド断片の遊離と、 前記緩衝溶液中への溶出を 行い、 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン 消化処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、 次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥 混合物について、 MA L D I—T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生 じる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行 レ、、
前記陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定に おいて測定される、 対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽ィオン種による分子量測定における強度は、 陰ィオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端の ペプチド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反 応生成物に由来する C末端のペプチド断片のピークは、
陰イオン種による分子量測定における強度は、 陽イオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連 のピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 手法を採用することを特徴とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法であ る。
この本発明の第二の形態にかかる解析方法では、
前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のァ ルカン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜 4のアルカン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸の対 称型酸無水物を用いることがより好ましい。 例えば、 前記パーフルォロアルカ ン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含 まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いることがより好ましい。 —方、 前記パーフルォロアル力ン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該 パーフルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフ ルォロアルカン酸を用いることが好ましい。 また、 前記パーフルォロアルカン 酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含ま れるパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸 を用いることが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン 酸として、 炭素数 2 ~ 4の直鎖パーフルォロアルカン酸を用いることがより好 ましい。
なお、 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液中における、 アルカン酸無水物とパーフルォロア ルカン酸との含有比率は、 アルカン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロア ルカン酸 1〜 2 0容の範囲に選択することがより好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の第一の形態にかかるペプチドから C末端アミノ酸を逐次的 に分解する処理における、 ぺプチド乾燥試料を対象とする際の詳細操作手順の 一例を例示する工程フローを示す図である。
図 2は、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的 に分解する処理における、 ゲル上に担持されたぺプチド試料を対象とする際の 詳細操作手順の一例を例示する工程フローを示す図である。
図 3は、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的 に分解する処理方法に従って、 ゥマ ' ミオグロビンの乾燥試料について、 その グロビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物 混合物をトリプシン消化して得られるペプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陽イオン種検出モードで測定した質量分析スペクトルの一 例を示す図である。
図 4は、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドから C末端アミノ酸を逐次的 に分解する処理方法に従って、 ゥマ ' ミオグロビンの乾燥試料について、 その グロビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物 混合物をトリプシン消化して得られるペプチド断片を、 MA L D I—T O F— M S装置において、 陰イオン種検出モードで測定した質量分析スぺク トルの一 例を示す図である。
図 5は、 本発明の第二の形態にかかるペプチドから C末端アミノ酸を逐次的 に分解する処理方法に従って、 ゲル上に担持されたゥマ · ミオグロビン試料に ついて、 そのグロビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得ら れる反応産物混合物をトリプシン消化して得られるぺプチド断片を、 MA L D I一 T〇F— M S装置において、 陽イオン種検出モードで測定した質量分析ス ぺクトノレの一例を示す図である。
図 6は、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的 に分解する処理方法に従って、 ゲル上に担持されたゥマ · ミオグロビン試料に ついて、 そのグロビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得ら れる反応産物混合物をトリプシン消化して得られるぺプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陰イオン種検出モードで測定した質量分析ス ぺクトルの一例を示す図である。
図 7は、 ゥマ ' ミォグロビンを構成する、 グロビン ·ぺプチド鎖のァミノ酸 配列中に含まれる、 トリプシンによる、 アルギニン残基の C末側ペプチド結合 での切断部位、 ならびに、 N—ァセチル化保護を施した際、 その C末側ぺプチ ド結合での切断が防止されるリシン残基を示す。
図 8は、 参考例に記載する、 C末端にアルギニン残基を有する単離乾燥ぺプ チド、 N—ァセチル化 G 1 u x - F i b r i n oペプチド断片に対して、 本発明 に採用される C末端アミノ酸を逐次的に分解する処理条件に従って、 該ぺプチ ド鎖の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物混合物を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陰イオン種検出モード （下） と陽イオン種 検出モード （上） で測定した質量分析スペクトルの対比を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 本発明をより詳しく説明する。
本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 基本的には、 解 析対象のぺプチドに対して、 そのぺプチドの C末端ァミノ酸を逐次的に分解除 去して、 ペプチドが短縮された一連の反応産物を作製し、 さらに、 この一連の 反応産物と、 元となるペプチドとをトリプシン消化して得られるペプチド断片 のうち、 該一連の反応産物に由来する c末端側ペプチド断片の分子量と、 元と なるぺプチドに由来する C末端側べプチド断片の分子量との差異に基づき、 除 去されたアミノ酸を特定する手法を採用している。 より具体的には、 かかるト リプシン消化して得られる C末端側べプチド断片は、 そのトリプシンに特異的 な切断部位で切断されており、 さらには、 この一連の反応産物に由来する C末 端側ぺプチド断片の分子量と、 元となるぺプチドに由来する C末端側ぺプチド 断片の分子量の測定手段として、 MA L D I _ T O F— M S装置を利用するが、 そのイオン化過程は、 ペプチド断片にプロトン （H+) が付加された陽イオン種 と、 ペプチド断片からプロトン （H+) が離脱された陰イオン種とをそれぞれ測 定することを可能としている。 その際、 C末端側ペプチド断片を構成するアミ ノ酸残基中にはアルギニン残基やリシン残基が含まれていないため、 かかるァ ルギ ン残基やリシン残基に由来する陽イオン種の安定化機構はなく、 陽ィォ ン種を測定した結果と、 陰イオン種を測定した結果とを比較した際、 アミノ酸 残基中にはアルギニン残基やリシン残基が含まれている、 トリプシン消化によ る他のペプチド断片とは、 その相対強度は、 異なる挙動を示す現象を、 MA L D I—T〇F— M S装置によって測定される複数種のピーク中より、 一連の C 末端側べプチド断片に起因するピークの特定 ·弁別に利用している。
すなわち、 本発明にかかる解析方法における最大の特徴は、
ぺプチドの C末端アミノ酸を逐次的に分解除去する工程において、 そのべプチ ド鎖の途中でのペプチド結合分断という副次的反応を効果的に回避することで、 前記トリプシン消化処理後に得られるぺプチド断片の混合物中に、 元のぺプチ ドを hリブシン消化した際に生じる、 共通的な N末側のペプチド断片、 ならび に目的とする一連の反応産物に由来する C末端側ぺプチド断片以外に、 副次的 なべプチド結合分断反応に由来するぺプチド断片が混入することを抑制する点 にある。 加えて、 かかるペプチド鎖の途中でのペプチド結合分断という副次的 反応を回避する上で、 予め対象とするペプチド鎖に対して、 N _ァシル化、 O 一ァシル化による保護を施して、 この保護をも利用し、 さらには、 最終的なト リプシン消化の処理に先立ち、 〇一ァシル化による保護の脱保護は行うものの、 リシン残基上の N—ァシル化保護を保持する状態とすることで、 トリプシン消 化による断片化が、 アルギニン残基の C末側ペプチド結合でのみ生じるように し、 不必要に細分化されたペプチド断片の生成を回避しつつ、 目的とする一連 の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片は、 MA L D I— T O F— M S測 定に適合する分子量範囲内とできる点も、 本発明にかかる解析方法における大 きな特徴である。
その際、 本発明に利用される、 対象とするペプチドの C末端アミノ酸を逐次 的に分解除去する反応では、 水分を除去した環境とした上で、 比較的に低い加 熱条件において、
反応試薬として、 アルカン酸無水物に、 少量のパーフルォロアルカン酸を組 み合わせたものを利用して、 高いプロトン供与能を示すパーフルォロアルカン 酸の触媒作用によって、 アルカン酸無水物をぺプチド鎖 C末端のカルボキシ基 の活性化試薬として作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III)：
Figure imgf000026_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を一且形成し、 該 5—ォキサゾロン環の開裂 に伴い C末端アミノ酸の分解を行う方法を利用している。 かかる 5—ォキサソロン環形成の反応は、 全体として見ると、 反応式 （I ) ：
Figure imgf000027_0001
として表記されるものの、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法 では、
先ず、 下記する反応式 （l a ) :
Figure imgf000027_0002
で示されるケトーエノール互換異性化の過程を、 少量存在しているパーフルォ ロアルカン酸を乾燥したペプチドに対して、 プロトン供与体として機能させる ことで、 ェノール型をとる比率を高めている。
次いで、 ェノール型において、 表出されているヒドロキシ基と C末端カルボ キシ基の間で、 分子内エステル結合を形成し、 5—ォキサゾロン環を完成させ る。 その際、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法では、 C末端 カルボキシ基の活性化を行う試薬として、アルカン酸無水物を利用し、例えば、 下記の反応式 （l b ) :
Figure imgf000028_0001
(lb)
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端カル ボキシ基が反応に関与するものとしている。 その結果、 かかる反応は、 穏和な 温度条件でも進行する。 一方、 系内には、 水分が存在しない環境に維持すると ともに、 反応性の相対的に低いアルカン酸無水物を利用するため、 ペプチド鎖 の途中に存在するぺプチド結合の開裂反応の進行は、 かかる穏和な温度条件で は抑制されている。 また、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法 においては、 ー且形成された 5—ォキサゾロン環から、 例えば、 反応式 （Ι ) で表記される反応：
— N、ノ m H3C— CO— OH
R2 ——
Figure imgf000028_0002
R1 < 0 (n，） 等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行 して、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。
なお、 ペプチド鎖中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) —CO—）、 トレオニン残基 （― NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) では、 その側 鎖上のヒ ドロキシ基 （一 OH) に起因して、 加熱環境下では、 例えば、 セリン 残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) の ο;位のアミノ基 （一 ΝΗ— ) と 3位のヒ ドロキシ基 （一OH) の間で、 N, 〇一ァシル転位反応が生じると、 引き続き、 生成するエステル結合の分解が進行し、 セリン残基の N末側でぺプ チドの切断が生じるという副反応、 また、 条件に依っては、 位にヒ ドロキシ 基 （一 OH) が存在しているトレォニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) O H) -CO-) においても、 同様の N, 〇一ァシル転位反応が契機となる反応 機構によって、 トレオニン残基の N末側でぺプチドの切断が生じるという副反 応が生じる可能性がある。 また、 アミノ酸長の短いペプチドにおいては、 リシ ン残基 （一 NH— CH ((CH2) 3— NH2) -CO-) でも、 その側鎖上のァ ミノ基（一 NH2) に起因して、加熱環境下では、 リシン残基（一 NH—CH (C H2CH2CH2CH2NH2) —CO—) のひ位のアミノ基 （一 NH— ) と ε位の アミノ基 （一 ΝΗ2) の間で、 アミ ド結合の交換反応が生じると、 引き続き、 生 成する ε位のァミ ド結合の分解が進行し、 リシン残基の Ν末側でぺプチドの切 断が生じるという副反応が懸念される。
本発明においては、 逐次的な C末端アミノ酸の分解反応は、 乾燥状態、 穏和 な温度条件で行われるものの、 前記のセリン残基 （― ΝΗ— CH (CH2OH) -CO-), トレオニン残基 （一 NH—CH (CH (CH3) OH) —CO—）、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) が関与す る副反応をより確実に回避するため、 逐次的な C末端アミノ酸の分解反応に先 立ち、 予め、 N—ァシル化、 O—ァシル化による保護を施す前処理工程を設け ている。
この N—ァシル化、 O—ァシル化による保護を施す前処理工程は、 本発明に かかる第一の形態では、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気 下、 1 0°C〜6 0°Cの範囲に選択される温度において、 アルカン酸無水物にァ ルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、 蒸気状のアルカン酸無水 物とアルカン酸とを作用させることで、 アルカン酸の有するプロトン供与能を 利用して、 アルカン酸無水物とアミノ基 （一NH2)、 ヒ ドロキシ基 （一〇H) との反応を促進して、 N—ァシル化、 O—ァシル化を達成している。 その際、 アルカン酸の有するプロトン供与能は、 パーフルォロアルカン酸の示すプロト ン供与能よりも劣るため、 ぺプチド鎖の C末端における 5—ォキサゾロン環を 形成する反応を進行させるには至らない。
また、 本発明にかかる第二の形態では、 ゲル上に担持された状態のペプチド 試料に対して、 予めゲルの脱水処理を施した後、 この前処理工程において、 3 0°C〜80°Cの範囲に選択される温度において、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶媒中に、 アルカン酸無水物 を溶解してなる溶液を用いて、 該ァルカン酸無水物溶液中に該ゲル担体を浸漬 することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアル力ン酸無水 物を作用させることで、 N—ァシル化、 〇一ァシル化を達成している。 この双 極性非プロトン性溶媒中での液相反応は、 プロトン供与能を有するアルカン酸 の酸触媒作用を利用しなくとも、 十分に進行する。 また、 かかる液相反応に付 随して、 系内で、 アルカン酸の生成がなされ、 その触媒作用も付加され、 徐々 に反応の促進がなされる。 但し、 系内で派生するアルカン酸の有するプロトン 供与能は、 パーフルォロアルカン酸の示すプロトン供与能よりも劣るため、 ぺ プチド鎖の C末端における 5—ォキサゾロン環を形成する反応を進行させるに は至らない。
加えて、 本発明では、 かかる前処理工程において、 リシン残基 （一 NH— C H (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基 （一 ΝΗ2) に カロえて、 ペプチド鎖の Ν末端のァミノ基に対しても、 Ν—ァシル化が達成でき る条件を選択することで、 例えば、 C末端アミノ酸の逐次的な分解反応におい て、 その C末端カルボキシ基の活性化がなされた際、 誤って、 隣接するべプチ ド鎖の Ν末端のァミノ基と反応を起こす事態を予め防止することもできている。 さらには、 後処理工程において、 加水処理を施した際に、 リシン残基 （一 ΝΗ -CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基 （一 ΝΗ2) ならびにペプチド鎖の Ν末端のアミノ基に対する、 Ν—ァシル化保護は、 脱保 護を生じない加水処理条件を選択する結果、 最終的に、 トリプシン消化処理を 施す際、 側鎖上のアミノ基が Ν—ァシル化保護されているリシン残基の C末側 では、 トリプシンによる酵素的消化反応は進まず、 トリプシン消化で得られる ペプチド断片は、 アルギニン残基の C末側での消化によるものに限定される。 本発明では、 このリシン残基側鎖上のアミノ基に対して、 Ν—ァシル化保護 がなされた状態で、 最終的に、 トリプシン消化処理を施す工程を実施すること で、ぺプチド鎖が、アルギニン残基とリシン残基の二種の切断部位で消化され、 不必要に多くの断片化を受けることを回避し、 同時に、 ペプチド鎖中に適度な 頻度で含有されるアルギニン残基におけるトリプシン消化によって、 長いぺプ チド鎖は複数のペプチド断片に分割でき、 結果として、 得られる C末端側ぺプ チド断片の分子量は、 MA L D I— T O F— M S測定に適合する分子量範囲内 とできる利点を積極的に利用している。
加えて、 本発明においては、 トリプシン消化処理後、 脱塩処理し、 ペプチド 断片を回収し、 乾燥した後、 MA L D I—T O F— M S装置を利用して、 トリ プシン消化処理を施して得られるぺプチド断片の混合物に由来するイオン種の 分子量を測定する。 なお、 トリプシン消化処理後、 脱塩処理を行うことで、 回 収、 乾燥されるペプチド断片は、 各種の塩を形成するものではなく、 本来のぺ プチド部分単体とされている。 そのイオン化過程では、 各ペプチド断片に対し て、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種と、 プロトン （H+) が離脱され た陰イオン種とが生成でき、 測定モードを選択することにより、 陽イオン種と 陰イオン種とをそれぞれ個別に測定する。 本発明においては、 トリプシン消化 処理で生成するペプチド断片として、 元のペプチド鎖と、 C末端アミノ酸の逐 次的な分解反応で生成する反応産物とで共通する N末側ァミノ酸配列に由来す る、 一連のペプチド断片群では、 その断片 C末端に、 プロトン （H+) 受容能に 富むグァニジノ基を持つアルギニン残基が存在しており、 プロトン （H+) が付 加された陽イオン種の安定化が図られるが、一方、 C末端側ペプチド断片では、 かかるアルギニン残基は存在しておらず、アルギニン残基に因るプロトン（H+) が付カ卩された陽イオン種の安定化は起こらない。 前記する相違点に付随して、 MA L D I—T O F— M S装置で測定される、 陽イオン種の質量分析スぺクト ル中では、 その断片 C末端にアルギニン残基を有する、 共通する N末側ァミノ 酸配列に由来する、 一連のペプチド断片群に起因するピーク強度が、 相対的に 強くなる。 一方、 アルギニン残基の存在してない C末端側ペプチド断片では、 プロトン （H+) 供与能を示すカルボキシ基 （一 C O O H) がその C末端に存在 しており、 MA L D I— T O F— M S装置で測定される、 陰イオン種の質量分 析スぺク トル中において、 かかる C末端側ペプチド断片群に起因するピーク強 200 度が、 相対的に強くなる。
本発明では、 脱塩処理を施され、 乾燥されたペプチド断片を、 MA L D I— T O F -M S装置での測定に供することに伴う、 前記の陽ィオン種の質量分析 スぺクトルと陰イオン種の質量分析スぺクトルとを対比した際の、 相対的強度 の相違を利用して、 その断片 C末端にアルギニン残基を有する、 共通する N末 側ァミノ酸配列に由来する、 一連のぺプチド断片群に起因するピークを弁別し、 さらに、 陰イオン種の質量分析スペク トル中において、 元のペプチド鎖と、 C 末端ァミノ酸の逐次的な分解反応で生成する反応産物とで共通する N末側ァミ ノ酸配列に由来する、 一連の C末端側ペプチド断片群に起因するピークを、 容 易に特定することができる。
該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連 のピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定し、 対応する分子量変化を与えるアミノ酸種類の帰属を行う。 なお、 かかるアルギ ニン残基の存在してない C末端側ぺプチド断片は、 少なくとも、 トリプシン消 化処理によって、 その N末端アミノ酸残基の α位のアミノ基 （一 ΝΗ 2) を有し ており、陽イオン種の質量分析スぺクトル上でも、対応するピークを示すので、 アミノ酸種類の帰属結果を、 陽イオン種の質量分析スぺク トルで観察される対 応するピークの分子量を利用して、 検証することもできる。
以下に、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方 法、 ならびに本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析 方法について、 個々により詳しく説明する。
先ず、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法 では、 上述する本発明を特徴付ける （1 ) 〜 （6 ) の工程中、 （1 ) 〜 （3 ) に 相当する、 対象とするペプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次 的に分解して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程では、 予 め単離処理されているぺプチドの乾燥試料を対象として、 下記する処理を行う。
C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応工程に先立って、 予め、 該ペプチド Ν末端のアミノ基ならびに、 該ぺプチドに含有されている可能性のあるリシン 残基側鎖のアミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基による N 一ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程を実施する。 この前処 理工程において施される、 リシン残基側鎖のアミノ基に対する N—ァシル化保 護は、 上述する最終的に、 トリプシン消化処理を行った際、 リシン残基の C末 側ペプチド結合での切断を防止する目的を有するため、 後述する加水処理にお いて、 リシン残基側鎖上の N—ァシル化保護では、脱保護が進行しないものの、 同時になされる O—ァシル化保護においては、 脱保護が十分に進行するァシル 基を選択することが望ましい。 従って、 本発明の第一の形態においては、 ぺプ チドの乾燥試料に対して、 気相から蒸気として供給して、 N—ァシル化、 なら ぴに O—ァシルイ匕反応を行うことができる反応試薬として、 求電子的なァシル 化剤であるアルカン酸無水物と、 そのプロトン供与能によって、 該ァシル化反 応の促進を図る触媒として、 アルカン酸との組み合わせを利用している。
この前処理工程で使用される、 アル力ン酸無水物とアル力ン酸は、 乾燥雰囲 気下、 一定の分圧比において蒸気として供給して、 ペプチド鎖に作用させるた め、 気密状態の反応容器内で、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度に反応 容器全体を加熱、 保温することで、 アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加 してなる混合物から蒸散させる形態とする。 すなわち、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲 に選択される温度で、 所望の分圧を達成できるもの、 具体的には、 炭素数 2〜 4のアルカン酸、 ならびに、 該炭素数 2〜4のアルカン酸由来の対称型酸無水 物を利用することが好ましい。 特には、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸、 なら びに、 該炭素数 2〜 4の直鎖アルカン酸由来の対称型無水物を利用することが より好ましく、 その際、 対称型の前記アルカン酸無水物は、 少量添加されるァ ルカン酸に由来する対称型無水物であることがさらに好ましい。 すなわち、 ァ ルカン酸無水物と、 少量添加されるアルカン酸とを同一種とすると、 かかる N —アルカノィル化、 O—アルカノィル化反応の進行する間に、 仮にァシル基交 換反応が生じても、 最終的に得られる、 N—アルカノィル化、 O—アルカノィ ル化保護に、 異なるアルカノィル基が混在することは無い。 従って、 仮に、 後 述する加水処理において、 O—アルカノイノレ化保護の脱保護が達成されないも のが、 残留した場合にも、 脱保護の達成されたものとの分子量差は、 予め判明 しており、 かかる夾雑物に由来するピークの同定はより簡単なものとなる。 こ の N—ァシル化保護を施す前処理工程では、 通常、 無水酢酸と酢酸の組み合わ せを利用することがより望ましい。
具体的には、 かかる N—ァシル化保護を施す前処理反応も、 アルカン酸無水 物とアルカン酸とを蒸気として、 ペプチドの乾燥試料に供給して、 反応を進め るため、 適正な蒸気圧を得る上では、 その後に実施する前記 C末端アミノ酸を 逐次的に分解する工程で利用する前記アル力ン酸無水物と、 同じアル力ン酸無 水物は好適に利用できる。 加えて、 このアルカン酸無水物は、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度では、 ペプチドの切断等の不要な副次 反応を引き起こすには、 その反応性は十分に低いので、 力かる前処理において は、 共存させるアルカン酸は、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 その酸触 媒作用は格段に劣るので、 さらに、 不要な副次反応を引き起こすことなく、 Ν· 一了シル化保護を施すことが可能となる。
加えて、対象とする長いアミノ酸配列のぺプチド、例えば、 タンパク質など、 二次構造、 三次構造を構成している場合には、 予め、 デフォールディング処理 を加えて、 該多次構造を示さないペプチド鎖に変換しておくことで、 その N末 端のァミノ基を N—ァシルイヒ保護する条件では、 ぺプチド中に存在する何れの リシン残基側鎖のァミノ基に対しても、 N—ァシルイヒ保護が同時に進行する。 さらには、 ぺプチド中に存在するセリン残基ならびにトレオニン残基側鎖のヒ ドロキシ基においても〇一ァシルイ匕反応が進み、その保護がなされる。その他、 ペプチド中に存在するチロシン残基側鎖のフエノール性ヒ ドロキシ基も、 その 反応性は相違するものの、 部分的に〇ーァシルイ匕がなされる。 これらの複数の ァシル化保護もなされる前処理工程を設ける結果として、 リシン残基側鎖のァ ミノ基、 セリン残基ならぴにトレオニン残基側鎖のヒ ドロキシ基は、 何れも保 護修飾を受けたものとなり、 最早不要な副次反応に関与できないものとなる。 なお、 この前処理工程で使用する、 アルカン酸無水物とアルカン酸との組み 合わせは、 不要な副次反応、 例えば、 ペプチドの途中での切断を生じる懸念は ほとんどないものであるが、 その反応温度は、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択さ れる温度、 より好ましくは、 かかる反応温度は、 室温付近、 あるいは、 室温よ り僅かに高い範囲内に選択することが好ましく、 より具体的には、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択することが好ましい。 また、 前記アルカン酸無水物にアル力 ン酸を少量添加してなる混合物中における、 アルカン酸の添加比率は、 アル力 ン酸無水物とアルカン酸との合計した体積に対して、 2〜1 0体積％の範囲、 具体的には、 5体積％に選択することが好ましい。
なお、 この前処理工程における N _ァシル化反応の反応速度は、 利用される アルカン酸無水物とアルカン酸の分圧 （気相濃度） ならびに反応温度に依存す るため、 かかる前処理工程の反応時間は、 主に反応温度に応じて、 適宜選択す ることが望ましい。 例えば、 反応温度を 5 0 °Cに選択する際には、 反応時間を 1 時間以内、 例えば、 3 0分間に選択することで、 ペプチドの N末端アミノ基に 対する N—ァシル化を完了することも可能である。 その際、 アルカン酸無水物 とアルカン酸とによるァシルイ匕反応を促進する目的で、 触媒量のピリジン、 例 えば、 アルカン酸無水物とアルカン酸の合計に対して、 0 . 1〜1 . 0体積％ のピリジンを添加することがより好ましい。 かかるピリジン塩基はプロトン受 容体として機能するため、 例えば、 ァミノ基へのァシルイ匕に伴い離脱すべきプ 口トンの除去がより速やかになされる。
さらには、 対象とするペプチドが、 例えば、 隣接するペプチドのシスティン との間で、 酸化型の一 S— S—結合を形成する、 あるいは、 同一分子内で一 S 一 S一結合を形成しているシスティンを含む場合には、 予め常用の還元処理を 施し、 かかる架橋を解消し、 還元型のシスティンを含むペプチドに変換する。 また、 ペプチド中に存在する還元型のシスティンに対しては、 その側鎖のスル ファニル基 （一 S H) にカルボキシメチル化ゃピリジルェチル化などを施し、 予めその保護を行う。 より具体的には、 対象とする長いアミノ酸配列のぺプチ ド、 例えば、 タンパク質など、 二次構造、 三次構造を構成している場合には、 予め、 デフォールディング処理を加えて、 該多次構造を示さないペプチド鎖に 変換しておく処理をなす過程で、 かかるタンパク質同一分子内で一 S— S—結 合を形成しているシスティンを含む可能性を有する場合には、 予め常用の還元 処理を施し、 かかる架橋を解消し、 還元型のシスティンを含むペプチドに変換 する。 カロえて、 該ペプチド中に存在する還元型のシスティンに対しては、 その 側鎖のスルファニル基 （一 S H) にカルボキシメチルイ匕やピリジルェチル化な どを施し、 予めその保護を行う。
その他、 かかる前処理工程における反応手順は、 気密状態とできる反応容器 内に、 アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加した液状混合物を入れ、 この 液状混合物を一旦冷却して、 蒸気圧を低下した状態で、 反応容器内を排気し、 密閉して、 反応温度まで昇温し、 容器内にアルカン酸無水物を蒸発させる手法 が挙げられる。 力かる手順を採用すると、 反応容器内への水分の混入を防止で きる利点もある。 加えて、 反応系内に酸素が残留しないように、 真空排気を行 うと、 例えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォ二 ンに存在するィォゥが、 酸素により酸化を受け、 その式量が変化することを防 止でき、 分子量の測定を基礎とする本発明の方法においては、 かかる酸化を抑 制することは、 より高い確度を達成する上で、 より好ましいものとなる。 前処 理工程の反応を終えた後、 反応容器内に残余する反応試薬を除去した後、 次の c末端ァミノ酸を逐次的に分解する反応工程に移行する。
本発明の第一の形態では、 この C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応では、 前処理工程に引き続き、 N—ァシル化保護済みのぺプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とパーフルォロアル力ン酸とを作用さ せ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000036_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2ほ、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解を行う。
かかる 5—ォキサゾロン環形成の反応では、 乾燥雰囲気下、 先ず、 下記する 反応式 ( l a ) :
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
で示されるケトーエノーノレ互換異性化の過程において、 蒸気状のパーフルォロ アルカン酸を乾燥したペプチドに対して、 プロトン供与体として機能させるこ とで、 エノー/レ型をとる比率を高めている。
次いで、 ェノール型において、 表出されているヒドロキシ基と C末端カルボ キシ基の間で、 分子内エステル結合を形成し、 5—ォキサゾロン環を完成させ る。 その際、 恐らくは、 蒸気状のパーフルォロアルカン酸は、 このエステルイ匕 反応においても、 プロトン， ドナーとして作用し、 酸触媒下におけるエステル 化反応を誘起していると推定される。 本発明の第一の形態では、 C末端カルボ キシ基の活性化を行い試薬として、 アルカン酸無水物を利用し、 例えば、 下記 の反応式 (lb) ： -W N- R WW
R2 OH HO
Figure imgf000038_0001
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端カル ボキシ基が反応に関与するものとしている。 その結果、 かかる反応は、 穏和な 温度条件で進行でき、 反応温度を 15°C〜60°Cの範囲に選択することが可能 となっている。 なお、 かかる反応温度は、 室温付近、 あるいは、 室温より僅か に高い範囲内に選択することが好ましく、 より具体的には、 15°C〜50°Cの 範囲に選択することがより好ましい。
加えて、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してな る混合物を利用する処理の間に、 ペプチドの N末端のアミノ基に対して、 前記 アルカン酸無水物によって、 N—ァシル化が通常起こるため、 系内において、 N—ァシルイ匕保護がなされるものの、 予め、 N_ァシル化保護を目的とする前 処理を施す方がより望ましい。
従って、 本発明の第一の形態は、 利用されるパーフルォロアルカン酸の高い プロトン供与能を利用するものであり、 該パーフルォロアルカン酸の示す pK aは、 0. 3〜2. 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いることが好 ましい。 加えて、 このパーフルォロアルカン酸は、 蒸気状態として、 乾燥ぺプ チド試料へ供給する必要があり、 15 °C〜 60 °Cの範囲に選択する前記温度に おいて、 所望の蒸気圧を得られる揮発性に優れたパーフルォロアルカン酸であ ることが望ましい。 その観点からも、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸 は、 より適するものであり、 さらには、 直鎖状の炭素数 2〜4のパーフルォロ アルカン酸が、 より適するものであり、 具体的には、 トリフルォロ酢酸 （CF3 CO〇H)、 ペンタフルォロプロパン酸 （CF3CF2CO〇H)、 ヘプタフルォ ロブタン酸 （CF3CF2CF2COOH) を利用することがより望ましい。 また、 上記する活性化試薬として利用される、 アルカン酸無水物は、 反応に 従って、 消費ざれるため、 蒸気状態として供給するアルカン酸無水物の蒸気圧 を所定の範囲に維持しつつ反応を行うことが望ましい。 例えば、 その手段とし ては、 反応を行う系を気密状態とし、 系内に存在するアルカン酸無水物の蒸気 圧を安定化する方法が挙げられる。 より具体的には、 気密状態とできる反応容 器内に、 アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加した液状混合 物を入れ、 この液状混合物をー且冷却して、 蒸気圧を低下した状態で、 反応容 器内を排気し、 密閉して、 反応温度まで昇温し、 容器内にアルカン酸無水物を 蒸発させる手法が挙げられる。 力かる手順を採用すると、 反応容器内への水分 の混入を防止できる利点もある。 なお、 反応系内に酸素が残留しないように、 真空排気を行うと、 例えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のう ち、 メチォニンに存在するィォゥが、 酸素により酸ィ匕を受け、 その式量が変化 することを防止でき、 分子量の測定を基礎とする本発明の方法においては、 か 力る酸化を抑制することは、 より高い確度を達成する上で、 より好ましいもの となる。
一方、 利用されるアルカン酸無水物は、 反応温度まで昇温した際、 適正な蒸 気圧を生じる限り、 種々のものが利用可能である。 ただし、 反応温度を前記す る好適な範囲、 例えば、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択する際に、 十分な蒸気圧 を与えるものが好ましく、 従って、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水 物を用いることが好ましい。 なかでも、 前記対称型酸無水物として、 炭素数 2 〜4の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることがより好ましく、 特には、 炭素数 2の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、 すなわち、 無水酢酸が好適に利 用できる。 かかるアルカン酸無水物は、 C末端カルボキシ基の活性化に利用さ れるため、 その際、 立体障害を生じることの少ないものが好ましく、 その点で も、 前記例示の無水酢酸などがより好適である。
この分解反応に利用される、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸と は、 ともに蒸気状として、 乾燥ペプチド試料に対して作用させ、 一旦形成され た 5—ォキサゾロン環が、 系外から進入した水分により、 加水されて、 元に戻 ることを回避するため、 反応は乾燥雰囲気下で行う。 その観点から、 一般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行うことが望ましい。 なお、 反応容器内 に当初供給される、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との混合物は、 室温では液状混合物とし、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とが均 一に混合された状態とする。 このアル力ン酸無水物にパーフルォ口アル力ン酸 を少量添加してなる混合物は、 触媒として利用するパーフルォロアルカン酸は、 反応の間、 原則的に消費されないので、 少量とすることができる。 より具体的 には、 気相中に蒸気として存在するパーフルォロアルカン酸は、 同じく、 蒸気 として存在するアルカン酸無水物と対比して、 相対的に低い濃度とすることが できることを意味する。 逆には、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロア ルカン酸の種類によって、 例えば、 反応温度における、 その飽和蒸気圧に応じ て、 目的とする気相中の分圧比 （気相濃度比） を達成できる混合比率の液状混 合物を適宜利用する。 例えば、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン 酸を少量添加してなる混合物中における、 パーフルォ口アル力ン酸の含有比率 は、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との合計体積に対して、 1〜 2 0体積。 /0の範囲、 より好ましくは、 3〜1 0体積％の範囲に選択することが 望ましい。
また、 本発明の第一の形態においては、 一旦形成された 5—ォキサゾロン環 から、 例えば、 反応式 （ΙΓ ) で表記される反応：
Figure imgf000040_0001
(I ) 等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行 して、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。 従って、 かかる反応を終えた後、 得られる反応産物は、 上述する反応式 （II) に示され る、 C末端にカルボキシ基が表出されているもの以外に、 中間産物である 5— ォキサゾロン環構造に留まるもの、 あるいは、 反応中間体の一形態として、 C 末端が非対称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。
かかる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における反応は、 少 なくとも、反応式（I b )で例示される 5—ォキサゾロン環構造の形成過程と、 反応式 （Ι ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸 の分離過程との二段階の素反応から構成される。そのため、全体の反応速度は、 これら各過程の反応速度の双方に依存するものの、 主に、 利用するアルカン酸 無水物とパーフルォロアルカン酸の蒸気分圧 （気相濃度） ならびに反応温度に 依存している。 加えて、 一連の反応産物は、 逐次的な反応で形成されるため、 得られる一連の反応産物において達成される、 短縮される C末端ァミノ酸配列 の最大長は、 処理時間が長くなるとともに、 延長される。 従って、 かかる逐次 的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における処理時間は、 主に、 利用 するアルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸の蒸気分圧 （気相濃度） なら びに反応温度に応じて、 また、 解析すべき C末端アミノ酸配列の目標とするァ ミノ酸長をも考慮して、 適宜選択するものである。
また、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程において生成される、 上記反応式 （ΙΓ ) に例示される C末端にカルボキシ基が表出されていない反応 中間体の形態をとるものをも、 C末端にカルボキシ基が表出されている形態に 復する目的で、 後処理工程として、 加水処理の工程を設ける。 すなわち、 本発 明の第一の形態では、 この加水処理の工程において、 前記 C末端アミノ酸を逐 次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を含む混合物に対して、 残余 するアル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを乾燥状態において除去す る後処理を施した上で、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を 溶解する水溶液を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミ ン化合物と水分子を供給して、 これら塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物ぺプチドに水分子を作用させて、 5—ォキサゾロン環内のエス テル結合、 ならびに、 反応中間体の一形態である、 C末端の非対称型酸無水物 構造を加水処理して、 それぞれ、 C末端のアミノ酸残基にカルボキシ基 （一 C O O H) を再生させる。 さらに、 塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 水分 子を作用させると、 前処理工程において o—ァシルイヒ保護を施した、 ペプチド 鎖中に存在するセリン残基とトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基、 ならびにチ 口シン残基側鎖のフエノール性ヒ ドロキシ基では、 その脱保護も進行する。 一 方、 リシン残基側鎖のァミノ基、 ならびにぺプチド鎖 N末端のァミノ基に対す る N—ァシル化保護は、 脱保護を受けず、 残留される。 この加水処理を施した 後、 かかる一連の反応生成物を含む混合物に残余する、 前記塩基性の窒素含有 有機化合物と水分子を除去、 乾燥する再乾燥後処理を行う。 この加水処理を施 すことで、 元のぺプチドと一連の反応産物のぺプチド鎖は、 リシン残基側鎖の アミノ基は、 N—ァシル化保護されており、 C末端にカルボキシ基は表出した 形態とした上で、 後述するトリプシン消化処理に供される。
かかる加水処理に利用する、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三 ァミン化合物は、 例えば、 残留している C末端が非対称型酸無水物に至ったも のと反応して、 アミ ド結合を形成することがなく、 また、 水溶液とした際、 均 一な溶液とできるので、 好ましいものである。 利用可能な、 塩基性含窒素芳香 環化合物としては、 適用な蒸気圧を与えることができる、 単環式の含窒素芳香 環化合物が好ましく、 例えば、 ピリジンはより好適に利用できる。 また、 利用 可能な第三ァミン化合物は、 前記ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同 程度の塩基性を有するものが好ましく、 例えば、 DMA E ( (C H 3) 2 N - C H 2 C H 2 O H) などが好適に利用できる。 例えば、 ピリジンを利用する際には、 水溶液全体の体積に対して、 ピリジンを、 5〜 1 5体積％の範囲、 より具体的 には、 1 0体積％に選択することが好ましい。 また、 （ジメチルァミノ） ェタノ ール （DMA E) を利用する際には、 水溶液全体の体積に対して、 DMA Eを、 1〜 2 0体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択することが好まし レ、。
これら単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、 水分子とともに、 蒸気として、 上記反応産物を含む乾燥混合試料に作用させる。 この後処理も、 —般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行うことが望ましい。 また、 か かる後処理では、 水分子を利用するため、 その蒸気圧を一定以上とすることが 必要となるので、 例えば、 6 0 °C以上の温度、 但し、 反応容器内の機械的強度 を考慮すると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択することは望ましい。 速やかに、 力 D 水処理を完了するためには、 1 0 0 °Cまたは、 それより若干低い温度を選択す ることが望ましい。
例えば、 本発明の第一の形態にかかる C末端ァミノ酸の選択的な分解方法で は、 前処理工程、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応工程、 後処理工程を、 同 一の反応器内で連続した形態で実施することが、 一層好ましいものである。 か かる工程のフローの一例を、 図 1に例示する。 各工程を終えた段階で、 ぺプチ ド試料に、 その工程で利用した試薬の残留を回避するため、 それぞれ、 ドライ · アップ操作を設けている。 このドライ 'アップ操作は、 減圧留去でなされるの が一般的であり、 その際、 反応により派生する分解された末端アミノ酸等の除 去を同時に実施できる場合もある。 図 1に例示する工程フローでは、 利用する アルカン酸無水物として、 極めて高い純度のものが容易に入手可能な無水酢酸 を利用する事例を示している。
一方、 図 1に例示する工程フローでは、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応 工程における処理時間は、 かかる工程中に短縮される C末端アミノ酸配列のァ ミノ酸長として、 最長の場合、 1 0数アミノ酸長、 最小では、 3アミノ酸長を 目標とする際、 利用する無水酢酸とフルォロアルカン酸の比率、 ならびに処理 温度に応じて、 選択される処理時間の範囲を例示している。 一般に、 フルォロ アルカン酸の比率を増し、 かつ処理温度をより高く設定すると、 反応速度は增 し、 より短い処理時間で、 目標とする最長のアミノ酸配列短縮量を達成した一 連の反応産物の調製が可能となる。
また、 前処理工程においては、 蒸気状の無水酢酸と酢酸を利用して、 ぺプチ ドの N末端のァミノ基への N _ァセチル化を実施しているが、 この無水酢酸と 酢酸の組み合わせにおいても、 場合によっては、 極僅かでであるが、 上記反応 式 （I a ) で表記される C末端カルボキシ基の活性ィヒ反応、 それに起因する副 次反応が誘起されることが懸念される。 この副次的な反応を抑制する目的で、 少量のピリジン蒸気を共存させ、 ペプチドの C末端カルボキシ基に対して、 ピ リジン塩基が弱い付加塩を形成させることで、 不要な副次反応に対する保護効 果を持たせることが可能である。 この付加塩型の保護は、 かかる前処理工程を 終える際、 ドライ ·アップ操作を設けて、 減圧下、 ピリジン塩基の留去を行う ことで、 簡便に脱保護され、 次段の C末端アミノ酸の選択的な分解反応工程に おいて、 問題を生じることはない。 これらの観点から、 この付加塩型の保護に は、 ピリジン塩基など、 減圧下に簡単に留去可能で、 塩基性も弱い、 含窒素複 素芳香環化合物を少量添加することが好ましい。また、 この付加塩型の保護は、 ァミノ酸側鎖のカルボキシ基に対する保護機能を有するため、 ァミノ酸側鎖の カルボキシ基に起因する、 不要な副次反応をも同時に効果的に抑制することが 可能となる。
本発明の第一の形態では、 上記の C末端アミノ酸の逐次的な除去により調製 される一連の反応産物の分子量と、 元のペプチドの分子量との差異を、 質量分 析法による測定結果を利用して決定し、 その分子量差に相当するアミノ酸を特 定する。 従って、 通常、 かかる質量分析法による測定に供する混合物中に、 元 のペプチドも、 その分子量の特定が可能な程度残存する状態とすることが望ま しレ、。
具体的には、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解 析方法は、 C末端アミノ酸配列として、 最大 1 0数アミノ酸長程度までの解析 に適用するが、 その際、 対応する最大 1 0数種に及ぶ一連の反応産物の含有比 率は、 その最小の含有比率のものは、 最大含有比率のものの、 少なくとも、 1 / 1 0程度を下回らない状態とすることが望ましい。 また、 元のペプチドの残 存量も、 最大含有比率の反応産物に対して、 少なくとも、 1 / 1 0程度を下回 らない状態とすることが望ましい。 一方、 必要とする C末端アミノ酸配列情報 は、 1 0アミノ酸以内となることが多く、 1 0アミノ酸程度の分解が進む程度 に処理時間を選択すると、 前記の含有比率に関する条件を満足することができ る。
次に、 本発明の第一の形態における、 上述する本発明を特徴付ける （1 ) 〜 ( 6 ) の工程中、 （4 ) 〜 （6 ) に相当する、 前記一連の反応生成物と、 元とな るペプチドとの分子量差を、 質量分析法により分析し、 かかる C末端アミノ酸 の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程と、 測定された一連の分子量減 少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸を特定し、 C末端より配列さ せて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程に関して、 さらに詳しく説明する。 本発明では、 分子量の測定に、 MA L D I— T O F— M S装置を利用するこ とで、 高分子量のペプチド鎖に関しても、 その分子量を精度よく測定すること を可能としている。但し、かかるぺプチドなどの高分子量分子の測定に適する、 MA L D I 一 T O F— M S装置を利用しても、 有効にィオン化を達成できる分 子量には、 自ずから上限があり、 高い精度で測定可能なペプチドのアミノ酸長 の最大は、 3 0〜5 0アミノ酸を超えないことが望ましい。 加えて、 分子量差 に基づき、 対応するアミノ酸の特定を行うので、 例えば、 3 11と 5 、 G 1 11と0 1 11の如く、 式量の差異が 1のアミノ酸残基相互の区別を高い精度で 行う上では、 基準となる、 最長のペプチド、 すなわち、 C末端アミノ酸の除去 がなされていないペプチドの分子量は、 4 0 0 0を超えない範囲、 より好まし くは、 3 0 0 0を超えない範囲であることがより好ましい。 これをアミノ酸長 に換算すると、 長くとも、 4 0アミノ酸、 より好ましくは、 3 0アミノ酸を超 えない範囲とすることが好ましい。
本発明の第一の形態では、 前記のアミノ酸長を遥かに超えるタンパク質など の長いァミノ酸長のぺプチドへの適用を容易にするため、 質量分析の実施に先 立ち、 切断アミノ酸配列部位の特異性を有し、 かつ、 その酵素反応効率に優れ るプロテアーゼである、 トリプシンを利用して、 ペプチド鎖の特異的な分断処 理を行い、 得られる C末端ペプチド断片を利用して、 C末端アミノ酸の逐次的 な除去により調製される一連の反応産物の分子量と、 元のペプチドの分子量と の差異を測定する。
このトリプシン消化処理は、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反 応生成物を含む混合物に対して、緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならぴに、 該ペプチド鎖に含有されている可 能性のあるリシン残基側鎖のアミノ基に対する N—ァシル化保護が保持されて いる、該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施している。その際、 リシン残基側鎖のアミノ基に対する N—ァシル化保護が保持されているため、 N—ァシル化保護リシン残基の C末側ぺプチド結合の切断は生じず、 該ぺプチ ド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断が起こ る。
例えば、 リシン残基とアルギニン残基の双方で切断が起こると、 得られるぺ プチド断片の総数は相当な数に達し、 その結果、 各断片の平均的なアミノ酸長 は短くなり、 狭い分子量範囲に、 相当な数のペプチド断片に起因するピークが 密集する傾向となる。 相当な数のぺプチド断片に起因するピークが密集すると、 その中から、 目的とする一群の C末側ペプチド断片を特定する上で、 障害とな る場合もある。 特に、 C末端アミノ酸の逐次的な分解を施した、 一連の反応産 物に由来する C末側ペプチド断片は、 除去されるアミノ酸数が多くなると、 そ の含有比率は小さくなり、 近接して、 他のペプチド断片が存在すると、 目的と する C末側ペプチド断片を特定する上で、 大きな障害となる場合もある。 本発 明では、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選 択的な切断を利用するので、 得られるぺプチド断片の総数は必要以上に多くな ることを回避でき、 同時に、 目的とする C末側ペプチド断片のアミノ酸長は、 上述する MA L D I一 T O F— M S装置を利用する際、 適当とされるアミノ酸 数の範囲内とすることが可能である。
該トリプシン消化処理後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥した後、 この回収され た該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混合物について、 MA L D I一 T O F M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による分 子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行う。
既に説明したように、 本発明では、 MA L D I— T O F— M S装置を利用す ることに伴い、 その陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による 分子量測定の結果に基づき、
トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチド断 片では、 該アルギニン残基に起因して、 その対応するイオン種のピークは、 陽ィオン種による分子量測定における強度は、 陰ィオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端のぺプ チド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生 成物に由来する c末端のぺプチド断片にはアルギニン残基が存在しないので、 その対応するイオン種のピークは、
陰イオン種による分子量測定における強度は、 陽イオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える、 一連 の C末端べプチド断片に対応する陰イオン種の分子量に基づき、 C末端アミノ 酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法を採用している。
なお、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列角早析方法 では、 分子量の差異に基づき、 逐次的に除去されたアミノ酸を特定するため、 同一の式量を有する、 ロイシン （L e u) 残基とイソロイシン （l i e) 残基 とを弁別することは原理的に不可能であり、 この点は、 従来の質量分析法を利 用する C末端アミノ酸配列解析手法と同様である。 一方、 グルタミン （G i n) 残基とリシン （Ly s) 残基も同一の式量を有するものの、 リシン （Ly s) 残基の側鎖に N—アルカノィル化を施すため、 本発明では、 両者の弁別が可能 となっている。 また、 C末端アミノ酸を除去する反応では、 反応式 （l b) に 例示するように、 アミ ド結合のェノール型への変換と、 それに続く、 5—ォキ サゾロン環構造の形成が必須であり、 アミ ド結合を構成するカルボニル基 （C
=θ) とィミノ基 (-NH-) が存在しない環状アミノ酸プロリン （P r o) が C末端アミノ酸となった時点で、それ以上の分解反応は進行しない。逆には、 処理時間を延長した際、 それ以上の C末端ァミノ酸の除去が起きないことを確 認することで、 その要因となるアミノ酸残基は、 環状アミノ酸プロリン （P r o) と推定することが可能である。
一方、 本発明において、 ペプチドより化学的手段により C末端アミノ酸を逐 次的に分解して、 一連の反応生成物を得る反応では、 アルカン酸無水物とパー フルォロアルカン酸を作用させるため、 仮に、 ペプチド中のセリン残基 （一 N H-CH (CH2OH) — CO—） ゃトレオニン残基 （一NH— CH (CH (C H3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基、 N末端のアミノ基、 リシン残 基 （― NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基 に対して、 予め Ο—ァシル化、 Ν—ァシル化保護を行う前処理工程を実施しな くとも、 力かる C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応条件では、 これら Ο— ァシル化、 Ν—ァシル化反応も併行的に進行する。 そのため、 セリン残基 （一 NH-CH (CH2OH) -CO-)ゃトレオニン残基（一 NH— CH (CH (C H3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に起因する、 N, 0—ァシル転 位反応等の副次反応に対する、競争的な阻害効果が達成される。 しかしながら、 本発明では、 最終的にペプチド断片の分子量を測定するため、 ペプチド中のセ リン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオユン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基などに起因する ペプチド鎖途中での断裂をより確実に防止する必要があり、 C末端アミノ酸を 逐次的に分解する反応工程に先立ち、 予め O—ァシル化、 N—ァシル化保護を 行う前処理工程を実施する構成を選択している。
仮に、 最終的に得られる反応産物において、 セリン残基やトレオニン残基に ァセチル化がなされたものが多数混入していると、 かかる多ァセチル化体と、 脱ァセチルがなされたものとの分子量差は、 式量 42の整数倍、 具体的には、 84、 1 26、 168は、 セリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) の式量 87、 グルタミン残基 （一NH— CH (CH2CH2-CONH2) —CO 一） の式量 128、 グルタミン酸残基 （一 NH— CH (CH2CH2-COOH) -CO-) の式量 129、 N—ァセチルリシン残基 （一 NH—CH (CH2CH 2CH2CH2NH-COCH3) -CO-) の式量 1 70と類似しており、 場合 によっては、 多ァセチルイヒ体を主なビークと誤認し、 脱ァセチルがなされたも のを、前記するアミノ酸の除去がなされたものとする懸念がある。本発明では、 後処理工程における加水処理において、 セリン残基やトレオニン残基における O—ァシル化保護に対する脱保護が十分に進行する条件を選択することで、 か かる懸念に対する十分な対策もなされている。 加えて、 ペプチド断片化を行つ た後、 分子量の測定を行うことで、 測定される分子量を、 式量差が 1であるグ ルタミン残基とグルタミン酸残基との弁別が可能な分析精度の測定がなされる 範囲としており、 上述する残留しているァセチル基数の差と、 類似する式量を 示すアミノ酸残基の間では、 式量差が 2〜3であり、 多くの場合、 かかる誤認 を生じる可能性は払拭している。
なお、 前記反応用の液状試薬、 あるいはそのコンポーネント 'キットの液状 試薬それぞれを収納でき、 前記試料容器中に保持されるぺプチド試料に対して、 前記反応用の液状試薬を一定量づっ加え、 しかもそれらを直接接触しない状態 を維持可能な液状試薬の保持機構を具え、 前記試料容器をその内部に収納可能 な反応容器は、 その内部を真空排気でき、 また、 反応終了後、 残余する反応用 の液状試薬を、 減圧下、 留去することができ、 反応時には、 気密構造とできる 形態とすることが好ましい。 また、 かかる反応容器内で、 試薬の蒸気を発生す る際、容器壁と反応を生じることのない材質とすることが必要である。従って、 化学反応の反応容器に利用されるガラス材料を利用したものが好適である。 ま た、 密閉操作に利用されるコック類は、 テフロンなどの材質のものが好適に利 用される。
引き続き、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析 方法について、 より詳しく説明する。
先ず、 本発明の第二の形態は、 上述する本発明の第一の形態が対象とする、 予め単離処理されているペプチドの乾燥試料に代えて、 予めゲル電気泳動法に よる分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態のペプチドを対象としてい る。 従って、 ゲル担体上に担持された状態のペプチドに対しては、 C末端アミ ノ酸を逐次的に分解する反応に際して、 蒸気状の反応試薬を利用する固相にお ける反応手法を有効に適用できないため、 ゲル担体中に、 相当する反応試薬を 浸潤させ、 液相反応を行わせる手法に変更している。 その際、 上述する本発明 を特徴付ける （1 ) 〜 （6 ) の工程中、 （1 ) 〜 （3 ) に相当する、 対象とする ぺプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる 一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程では、 対象とするぺプチドを、 ゲル担体から予め単離処理せず、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、 ぺプ チド試料に対して、 その C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応を可能として いる。
すなわち、 本発明の第二の形態では、 本発明を特徴付ける （1 ) 〜 （6 ) の 工程中、 （1 ) 〜 （3 ) に相当する工程として、 かかる C末端アミノ酸を逐次的 に分解する工程では、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の 対象とするぺプチド試科に対して、 次段のァシル化反応を行う前処理工程にお いて、 その障害となる水分を予め除去するため、 ゲル担体中に含浸される水溶 媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する 極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の脱水 処理を行う工程を設け、 下記するァシル化保護を施す前処理工程、 C末端アミ ノ酸の逐次的な分解工程、 反応産物に対する加水処理を行う後処理工程を行う。 なお、 予めゲル電気泳動法による分離を行う際、 利用されるゲル状物質は、 特定の分子量範囲に相当する複数種のペプチドに関して、 それぞれ個別な、 分 離されたスポット （又は、 パンド） を示す条件、 具体的には、 ゲルを構成する ポリアクリルアミドの含有比率を選択し、 ゲル内部に形成される微細な穴構造 內部の間隙サイズを調整する。 その結果、 分離されたスポット （又は、 パンド） は、 例えば、 S D S— P A G E法では、 それぞれペプチド鎖分子量、 表面の電 荷量の差異に起因する電気泳動速度の相違するペプチドが局在している。 力、か るペプチドは、 ゲル中に形成される微細な穴構造内部に保持されており、 ゲル 状物質中に含浸される水を除去する際、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 水溶媒のみ を該極性非プロトン性溶媒中に希釈 ·溶出する手法を利用すると、 かかる脱水 処理操作を終えた後も、 目的とするペプチドは、 分離されたスポット （又は、 パンド） 位置のゲル担体上に担持された状態に維持できる。 すなわち、 上述の 脱水処理に利用する極性非プロトン性溶媒は、 ゲルを構成するポリアクリルァ ミドなどのゲル状物質との親和性は、 水溶媒より一般に劣っているため、 ゲル 状物質中の微細な穴構造の間隙サイズを維持していた、 間隙表面に対して溶媒 和している水溶媒の除去とともに、 嵩体積の減少が進む。 該脱水処理に利用す る極性非プロトン性溶媒として、 例えば、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる 際、 好適な極性非プロトン性溶媒として、 水に対して親和性に富む、 ァセトニ トリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の-トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げることができる。 また、 これら脱水処理に利用す る極性非プロ トン性溶媒は、 水よりも蒸散し易く、 蒸散，乾固すると、 嵩体積 が減少し、 収縮したゲル担体となる。
本発明の第二の形態においては、 ぺプチド鎖にァシル化保護を施す前処理工 程は、 前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とする ぺプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性 溶媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水 物溶液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺ プチド試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするペプチドの N末端のァ ミノ基ならびに、 該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上の ァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァ シル基による N—ァシル化保護を施す。 この前処理工程において施される、 リ シン残基側鎖のアミノ基に対する N—ァシル化保護は、 上述する最終的に、 ト リブシン消化処理を行った際、 リシン残基の C末側ペプチド結合での切断を防 止する目的を有するため、 後述する加水処理において、 リシン残基側鎖上の N 一ァシル化保護では、 脱保護が進行しないものの、 同時になされる 0—ァシル 化保護においては、 脱保護が十分に進行するァシル基を選択することが望まし い。 その際、 本発明の第二の形態においては、 求電子的なァシル化剤であるァ ルカン酸無水物は、 双極性非プロトン性溶媒中では、 かかる溶媒に因る分子内 の分極がなされ、 ペプチドに対して作用させた際、 ァミノ基と、 ヒドロキシ基 に対して、 N—ァシル化、 ならびに O—ァシル化反応が進行する。 かかる N— ァシル化、 ならびに O—ァシル化反応に付随して、 該アルカン酸無水物由来の アルカン酸が副生すると、 そのアルカン酸の示す触媒作用によって、 N—ァシ ル化、 ならびに O—ァシル化反応の促進がなされる。 つまり、 本発明の第二の 形態では、 ゲル担体内で副生するアル力ン酸の拡散 ·散逸は速やかには進まな い点を利用し、 ゲル担体中に留まっている、 副生するアルカン酸を反応の促進 を図る触媒として利用できるので、 反応試薬として、 アルカン酸無水物のみを 使用している。
この前処理工程で使用される、 アルカン酸無水物は、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲 に選択される温度で、 リシン残基側鎖のァミノ基に対する N—ァシル化保護の 反応が可能な反応性を示すもの、 具体的には、 炭素数 2〜4のアルカン酸由来 の対称型酸無水物を利用することが好ましい。 特には、 炭素数 2〜4の直鎖ァ ルカン酸由来の対称型無水物を利用することがより好ましい。 すなわち、 対称 型のアル力ン酸無水物を利用すると、 副生するアル力ン酸も同一種となるので、 かかる N—アルカノィル化、 〇一アルカノィル化反応の進行する間に、 仮にァ シル基交換反応が生じても、 最終的に得られる、 N—アルカノィル化、 O—ァ ルカノィルイ匕保護に、 異なるアルカノィル基が混在することは無い。 従って、 仮に、 後述する加水処理において、 O—アルカノィル化保護の脱保護が達成さ れないものが、 残留した場合にも、 脱保護の達成されたものとの分子量差は、 予め判明しており、 かかる夾雑物に由来するピークの同定はより簡単なものと なる。 この N—ァシル化保護を施す前処理工程では、 通常、 無水酢酸を利用す ることがより望ましい。
双極性非プロトン性溶媒中では、 アルカン酸無水物の分子內分極が誘起され、 求電子反応試薬として、 該ぺプチドのァミノ基に作用する結果、 3 0 °C以上で も、 十分にかかる N—ァシル化反応は進行する。 通常、 反応の促進を図るため には、 反応温度を 5 0 °C以上に選択することが好ましいが、 一般に、 密閉され た反応容器内でかかる反応を行うため、 反応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択することが望ましい。 N—ァシルイ匕反応に付随して、 アルカン酸が生成するが、 その量は僅かであり、 かかるアルカン酸の示すプロ トン供与能と、 共存するアルカン酸無水物とに起因する副次的反応は、 上述の 温度範囲では、 通常問題とはならない。 より具体的には、 系内に生成するアル カン酸は、 例えば、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 その酸触媒作用は格 段に劣り、 かつ、 その存在量も少ないため、 上述する温度条件では、 パーフル ォロアルカン酸とアル力ン酸無水物とを利用する C末端ァミノ酸を逐次的に分 解する工程における主な反応、 5—ォキサゾロン環構造の形成反応が副次的に 起こるまでには至らない。 更には、 上述するパーフルォロアルカン酸とアル力 ン酸無水物とを利用する C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程においてすら、 抑制されている種々の副次反応、 例えば、 ペプチド主鎖アミド結合 （一 C O N H—） の開裂は、 かかるアルカン酸無水物のみを利用する前処理工程において は、 なお一層の抑制がなされている。
一方、 上記のゲルの再膨潤を起こさせる双極性非プロトン性溶媒は、 該ゲル 状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 比較的に分子サイズが小さ く、 力つ、 ゲル状物質に対する親和性に優れた有機溶媒が好ましい。 加えて、 上述する N—アルカノィル化、 O—アルカノィル化の反応過程において、 アル カン酸無水物の分子内分極を誘起可能な、 高い双極性を示すとともに、 反応副 生成物であるアルカン酸に対して、 優れた溶媒であることが好ましい。 なお、 上記反応温度において、 揮発 ·蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒 力 より好ましく、 例えば、 ホルムアミド （H C O NH 2) などは、 ポリアタリ ルアミド ·ゲルを用いる際、 以上に述べた要件全てを十分に満足するものであ る。
所定の反応時間が経過した時点で、 ゲル担体中のアル力ン酸無水物を除去し て、 反応を停止するため、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 アル力 ン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非 プロトン性溶媒を用いて、 ゲル担体全体を洗浄する。 すなわち、 該極性非プロ トン性溶媒による洗浄により、 ゲル担体中に浸潤していたアル力ン酸無水物、 双極性非プロトン性溶媒は、 拡散によって、 希釈、 除去される。 例えば、 ポリ アクリルアミド ·ゲルを用いる際、 上述する洗浄用途に適する要件を満足する 極性非プロトン性溶媒としては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4 以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げること ができる。 通常、 この希釈、 洗净に利用する極性非プロトン性溶媒として、 上 述する脱水処理工程で使用する極性非プロトン性溶媒を利用することが好まし い。 また、 これら洗浄処理に利用する極性非プロトン性溶媒は、 水よりも蒸散 し易く、 蒸散 ·乾固すると、 嵩体積が減少し、 収縮したゲル担体となる。
本発明の第二の形態における、 C末端アミノ酸の逐次的な分解工程も、通常、 水分を含まず、 収縮したゲル担体に対して、 反応試薬溶液を浸潤させて、 反応 を開始させる形態をとるため、 N—ァシル化保護の前処理を施した後、 該ゲル 担体上に担持された状態の対象とするぺプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °C の範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性 溶媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬するこ とにより、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアルカン酸無水物とパ 一フルォロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000054_0001
(式中
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端ァミノ酸の逐次的分解を行う。
このパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物とを利用する、 5—ォキサ ゾロン環形成の反応は、 先ず、 下記する反応式 （l a ) :
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000055_0002
で示されるケトーエノール互換異性ィヒの過程において、 ゲル担体の穴中に担持 されているペプチド鎖に、 パーフルォロアルカン酸をプロトン供与体として機 能させることで、 エノーノレ型をとる比率を高めている。
次いで、 このエノール型に対して、 C末端カルボキシ基の活性化を行い試薬 として、 アルカン酸無水物を利用し、 その C末端カルボキシ基を、 例えば、 下 記の反応式 （l b ) :
Figure imgf000055_0003
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端カル ボキシ基と、 ェノール型のヒドロキシ基との反応などが、 5—ォキサゾロン環 形成の促進に関与している。 双極性非プロトン性溶媒中には、 アルカン酸無水 物は、パーフルォロアルカン酸と比較して、高い濃度で含有させておくことで、 かかる反応は、 穏和な温度条件で進行でき、 反応温度を 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲 に選択することが可能となっている。
一方、 本発明の第二の形態でも、 パーフルォロアルカン酸の触媒作用は、 そ のプロトン供与能を利用するものであり、 該パーフルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いることが 好ましい。 なお、 前記の反応温度において、 利用する双極性非プロトン性溶媒 中に均一に溶解可能な、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸は、 より適す るものであり、さらには、直鎖状の炭素数 2 ~4のパーフルォロアルカン酸が、 より適するものであり、 具体的には、 トリフルォロ酢酸 （CF3COOH)、 ぺ ンタフルォロプロパン酸 （CF3CF2COOH)、 ヘプタフルォロブタン酸 （C F3CF2CF2COOH) を利用することがより望ましい。
また、 C末端カルボキシ基の活性化に利用されるアルカン酸無水物は、 反応 温度まで昇温した際、 適正な反応性を与えるものが好ましく、 従って、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。 なかでも、 前 記対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の直鎖アル力ン酸の対称型酸無水物を 用いることがより好ましく、 特には、 炭素数 2の直鎖アルカン酸の対称型酸無 水物、 すなわち、 無水酢酸が好適に利用できる。 力かるアルカン酸無水物は、 C末端カルボキシ基の活性化を図り、 さらに、 5—才キサゾロン環形成に適す る配置を採る上で、 その配向における立体障害を生じることの少ないものが好 ましく、 その点でも、 無水酢酸を利用するとより好適である。
また、 上記する活性化試薬として利用される、 アルカン酸無水物は、 反応に 従って、 消費されるため、 予め、 ゲルの膨潤に利用する双極性非プロトン性溶 媒中に、ペプチドとの反応に消費される量に対して、大過剰量を溶解しておき、 その濃度低下を抑制することが望ましい。 具体的には、 ゲルの膨潤に用いる混 合溶液中において、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との含有比率 は、 アルカン酸無水物 100容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜 20容の 範囲に選択し、 その際、 双極性非プロトン性溶媒中における、 アルカン酸無水 物の含有濃度は、 10〜 30 % (体積％) の範囲に選択することがより望まし い。 反応時間は、 反応温度、 双極性非プロトン性溶媒中に含有されるアルカン 酸無水物とパーフルォロアルカン酸の含有濃度に依存し、 加えて、 極性非プロ トン性溶媒を利用する脱水処理に伴って、 収縮したゲル担体の膨潤に要する時 間をも考慮して、適宜選択することが望ましい。例えば、 ポリアクリルアミ ド - ゲル （12. 5質量。 /。） に対して、 上述のァセトニトリルを利用して脱水処理 を施した後、 後述のホルムアミドなどの双極性非プロトン性溶媒中に浸漬して、 ゲル担体の再膨潤を達成するに要する時間は、 例えば、 4 0 °Cでは、 3時間程 度であるため、 全体の反応時間は、 かかるゲル担体の再膨潤を終えた後、 所望 のァミノ酸残基数、 C末端ァミノ酸の選択的な分解を達成するに要する時間を 加えたものに選択する。
—方、 上記のゲルの再膨潤を起こさせる双極性非プロトン性溶媒は、 該ゲル 状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 比較的に分子サイズが小さ く、 つ、 ゲル状物質に対する親和性に優れた有機溶媒が好ましい。 加えて、 上述する式 （l a ) のケト一エノール互換異性化の過程において、 そのエノー ル体の比率を維持可能な、 高い双極性を示すとともに、 溶質分子のアルカン酸 無水物、 パーフルォロアルカン酸、 ならびに、 反応副生成物であるアルカン酸 に対して、 優れた溶媒であることが好ましい。 なお、 上記反応温度において、 揮発 ·蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒が、 より好ましく、 例え ば、 ホルムアミ ド （H C O NH 2) などは、 ポリアクリルアミド .ゲルを用いる 際、 以上に述べた要件全てを十分に満足するものである。
なお、 上述するアルカン酸無水物、 パーフルォロアルカン酸、 ならびに、 反 応副生成物であるアル力ン酸に対して、 優れた溶解性をもたらす双極性非プロ トン性溶媒は、 水分子をも容易に溶解することが可能である。 従って、 前記双 極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際して、 前記反応系 は、 水分を除去した、 乾燥雰囲気下に保たれることが好ましい。 すなわち、 上 記の式 （I b ) に示される反応中間体、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性ィ匕 された C末端カルボキシ基は、 反応系内に水分子が混入すると、 加水分解を受 け、 元の末端カルボキシ基へと戻ってしまう。 かかる不活性化過程を回避する ため、 反応系は、 水分を除去した状態を維持することが好ましい。
例えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォニンに 存在するィォゥが、 系内に混入する酸素により酸化を受け、 その式量が変化す ることもある。 この酸素による酸化を防止することは、 分子量の測定を基礎と する本発明の方法においては、 かかる酸化を抑制することは、 より高い確度を 達成する上で、 より好ましいものとなる。 例えば、 反応系を、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保つ手 段としては、 反応を行う系を気密状態とし、 系外からの、 水分、 酸素の浸入を 防止するとともに、 液の注入、排出操作も、 乾燥処理した不活性気体、 例えば、 窒素雰囲気下で行うことが望ましい。 あるいは、 酸化防止効果を有する D T T などの還元性のスルファニル基 （一 S H) を含む化合物を利用して、 酸化を回 避することが望ましい。
また、 本発明の第二の形態においても、 一旦形成された 5—ォキサゾロン環 から、 例えば、 反応式 （ΙΙ' ) で表記される反応：
Figure imgf000058_0001
( i r ) 等の反応を経て、 c末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行 して、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。 従って、 かかる反応を終えた後、 得られる反応産物は、 上述する反応式 （Π) に示され る、 C末端にカルボキシ基が表出されているもの以外に、 中間産物である 5— ォキサゾロン環構造に留まるもの、 あるいは、 反応中間体の一形態として、 C 末端が非対称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。
かかる逐次的な C末端アミノ酸の分解反応は、 少なくとも、 反応式 （I b ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の形成過程と、 反応式 （Ι ) で例示され る 5—ォキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の分離過程との二段階の 素反応から構成される。 そのため、 全体の反応速度は、 これら各過程の反応速 度の双方に依存するものの、 主に、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロ アルカン酸の濃度ならぴに反応温度に依存している。 カロえて、 一連の反応産物 は、 逐次的な反応で形成されるため、 得られる一連の反応産物において達成さ れる、 短縮される C末端アミノ酸配列の最大長は、 処理時間が長くなるととも に、 延長される。 従って、 かかる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理 工程における処理時間は、 主に、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロア ルカン酸の濃度ならびに反応温度に応じて、 また、 解析すべき C末端アミノ酸 配列の目標とするアミノ酸長をも考慮して、 適宜選択するものである。
逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解反応の停止は、 反応系の温度を低下 するとともに、 ゲル担体中に浸潤している反応試薬、 すなわち、 パーフルォロ アル力ン酸とアル力ン酸無水物を希釈 ·除去することで行う。 具体的には、 C 末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の溶解を 引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 なら びに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を 用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行う。 なお、 かかる反応試薬の希釈 ·除去に、 混合溶液の調製に利用する双極性非プ 口トン性溶媒を利用することも可能であるが、 反応式 （l b ) で例示される 5 —ォキサゾロン環構造の形成過程を停止する上では、 ェノール型中間体の安定 化に寄与の少ない極性非プロトン性溶媒を利用する、 パーフルォロアルカン酸 とアル力ン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒の除去工程とすること がより望ましい。 少なくとも、 反応試薬の希釈 ·除去工程の最終段では、 極性 非プロトン性溶媒を利用する希釈 ·除去の操作を設ける。 例えば、 ポリアクリ ルアミド ·ゲルを用いる際、 これらの条件を満足する極性非プロトン性溶媒と しては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 ァセ トンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げることができる。
本発明の第二の形態では、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得 られる一連の反応生成物に対する加水処理を行う、 後処理工程も、 これら一連 の反応生成物を含むペプチド混合物を、 該ゲル担体上に担持された状態とした まま、 実施する。 すなわち、 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られ る一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態の まま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合 物の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施す。 この加水処理において、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物 は、 反応式 （Π') に示される 5—才キサゾロン環構造、 ならびに、 次段の反応 中間体 （酸無水物体） の加水分解反応を触媒するものの、 それ自体が、 5—ォ キサゾロン環構造または反応中間体 （酸無水物体） と反応して、 不要な副生物 を生じることがなく、好適な塩基触媒として機能する。具体的には、反応式（II' ) に示される 5—ォキサゾロン環構造、 ならびに、 次段の反応中間体 （酸無水物 体） の加水分解反応では、 下記反応式 （IV) に示すように、 反応産物のぺプチ ド鎖の C末端にカルボキシ基が表出する。
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上記の加水処理に利用する、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化 合物は、 例えば、 残留している C末端が非対称型酸無水物に至ったものと反応 して、 アミド結合を形成することがなく、 また、 水溶液とした際、 均一な溶液 とできるので、 好ましいものである。 利用可能な、 塩基性含窒素芳香環化合物 としては、 極性非プロトン性溶媒に高い溶解性を示す、 単環式の含窒素芳香環 化合物が好ましく、 例えば、 ピリジンはより好適に利用できる。 また、 利用可 能な第三ァミン化合物は、 前記ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程 度の塩基性を有するものが好ましく、 例えば、 DMAE ((CH3) 2N-CH2 CH2OH) などが好適に利用できる。 例えば、 ピリジンを利用する際には、 水 溶液全体の体積に対して、 ピリジンを、 5〜15体積％の範囲、 より具体的に は、 10体積％に選択することが好ましい。 また、 （ジメチルァミノ） エタノー ノレ （DMAE) を利用する際には、 水溶液全体の体積に対して、 DMAEを、 1〜 20体積％の範囲、 より具体的には、 10体積％に選択することが好まし レ、。
これら単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、 水溶液として、 上記反応産物を担持しているゲルに作用させる。 この後処理においては、 親水 性に富むゲル状物質中に、 かかる有機塩基を含有する水溶液は、 速やかに浸潤 する。 なお、 速やかに加水反応を完了するためには、 反応温度を 6 0 °C以上に 選択することが好ましいが、 一般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行 うため、 反応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択す ることが望ましい。
この有機塩基を含有する水溶液を用いた加水処理は、 反応産物のぺプチド鎖 の C末端にカルボキシ基を表出させることを主な目的としているが、 その条件 は、 前処理工程でなされた O—ァシル化保護の脱保護も同時に進行するが、 一 方、 N末端のアミノ基、 ならびに、 リシン残基側鎖上のアミノ基に対する N— ァシル化保護では、 脱保護が進行しないように選択されている。 . なお、 加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合 物が残余すると、 反応産物の表出した C末端にカルボキシ基に対して、 かかる 窒素塩基が付加塩を形成したものが混在する状態となるため、 ゲル担体中に含 浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親 和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲ ル担体の再脱水処理を施すとともに、 加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環 化合物または第三アミン化合物を水とともに、 希釈除去することが好ましい。 従って、 この再脱水処理の工程において利用する極性非プロトン性溶媒は、 塩 基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物に対しても、 高い溶解性を有 するものがより好ましい。 例えば、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる際、 こ れらの条件を満足する、 再脱水処理工程用の極性非プロトン性溶媒としては、 ァセトニトリノレ ( C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなど の炭素数 4以下のケトン類などを挙げることができる。
加えて、上述する加水処理は、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の後、一旦、 反応試薬のアル力ン酸無水物ならびにパーフルォロアルカン酸に対する、 極性 非プロトン性溶媒を利用する希釈 ·除去の操作を終えた後に実施するだけでな く、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応と該加水処理とを、 連続して実施するこ とも可能である。 具体的には、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応は、 その反応 温度を下げて、 その反応停止を図りつつ、 有機塩基を含有する水溶液を加える と、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸の組み合わせてなる反応試薬 の不活化、 ゲル中からの溶出が生じ、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の停止 と、 反応試薬の不活化 ·除去がなされる。 引き続き、 反応産物に対する加水処 理も行うことができ、 最終的に、 極性非プロトン性溶媒を利用する再脱水処理 工程を施すことで、 有機塩基を含有する水溶液とともに、 アルカン酸無水物に 対応するアルカン酸とパーフルォロアルカン酸、 双極性非プロ トン性溶媒の除 去と、 再脱水がなされるため、 一旦極性非プロ トン性溶媒を利用する洗浄 '除 去操作を中間に設ける際と、 実質的に差異を持たないものとなる。
既に説明した本発明の第一の形態と同じく、 本発明の第二の形態においても、 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 トリプシ ン消化処理を施して、 アミノ酸長の長いペプチド鎖を断片化して、 回収された 該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混合物について、 MA L D I一 T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子 量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行う。
その際、 本発明の第二の形態における特徴の一つは、 前記加水処理済みの一 連の反応生成物を含む混合物に対して、 再脱水処理後、 該ゲル担体上に担持さ れた状態で、 かかるトリプシン消化処理の工程を行う点にある。 具体的には、 再脱水処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態で、 緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用 させ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ペプチド鎖に含有されて いる可能性のあるリシン残基側鎖のアミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が 保持されている、 該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切 断によるペプチド断片化を行っている。 そもそも、 二次元電気泳動法や S D S— P A G E法などの、 ゲル電気泳動法 による分子量分離に利用するゲル担体は、 一定範囲以上のアミノ酸長を有する ペプチド鎖は、 そのゲル内の穴構造に保持する機能を有し、 電気泳動速度に明 確な差異を与えるものの、 ペプチド鎖のアミノ酸長が、 かかる閾値分子量より 小さくなると、 ゲル内の穴構造中に保持する機能は急速に失われる。 本発明の 第二の形態では、 このゲル電気泳動に利用されるゲル担体の特異性を利用して、 ァミノ酸長の長いべプチド鎖を、 そのゲル担体上に担持された状態を維持した まま、 C末端アミノ酸を逐次的に分解除去し、 一連の反応産物を調製する工程 を行った後、 トリプシン消化処理によってペプチドの断片化を行うことで、 目 的とする一群の C末端側ペプチド断片を、 容易にゲル担体から溶出させ、 回収 することを可能としている。
本発明の第二の形態でも、 このトリプシン消化処理を行う際、 前記加水処理 済みの一連の反応生成物を含む混合物では、 該ぺプチド鎖の N末端のァミノ基 ならぴに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖のァミ ノ基に対する N—ァシル化保護が保持されているので、 N—ァシル化保護リシ ン残基の C末側ぺプチド結合の切断は生じず、 該ぺプチド鎖中に存在するアル ギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断が起こる。 既に説明した通り、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切 断を行うと、 アミノ酸長の長いペプチド鎖から、 複数個のペプチド断片が生成 し、 その際、 目的とする一群の C末端側ペプチド断片は、 通常、 元のペプチド 鎖の、 数分の 1のアミノ酸長となるため、 ゲル担体から遊離し、 トリプシン溶 液中に溶出する。 勿論、 トリプシン溶液中には、 その他のペプチド断片も、 同 じょうに溶出する力 S、 緩衝溶液とゲル担体とを分離すると、 遊離した種々のべ プチド断片は、 緩衝溶液中に回収される。 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝 溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済みぺプチド断片を回収し、 乾燥 する。
これ以降の工程、 すなわち、 回収された該トリプシン消化処理済みペプチド 断片を含む乾燥混合物について、 MA L D I— T O F— M S法を利用して、 分 子量測定、 その測定結果に基づく、 C末端アミノ酸配列の決定までの操作は、 上述する本発明の第一の形態と同じである。
すなわち、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析 方法は、 多種のタンパク質を含む試料中から、 例えば、 二次元電気泳動法や s D S— P A G E法などの、 ゲル電気泳動法によって分離されたタンパク質に関 しては、 そのおおよその分子量は推定できており、 仮に、 分離されたスポット (又は、 バンド） からかかるタンパク質を単離回収しても、 そのアミノ酸数が 大きく、 上述する、 本発明の第一の形態にかかる手法を利用して、 一群の C末 端側ペプチド断片とした上で、 分子量測定、 その測定結果に基づく、 C末端ァ ミノ酸配列の決定までの操作を行う必要のある場合に、 予め、 分離されたスポ ット （又は、 パンド） からかかるタンパク質を単離回収する代わりに、 分離さ れたスポット （又は、 バンド） 部のゲル担体を切り出し、 ゲル担体上に保持し た状態で、一連の化学的処理を行うものである。予め、分離されたスポット （又 は、 パンド） 力 らかかるタンパク質を単離回収する操作を省くことができ、 し かも、 単離回収工程における回収収率に影響されることなく、 同等の確度で、 C末端ァミノ酸配列の決定を実施することが可能である。
なお、 本発明の第二の形態にかかる方法を適用する際、 対象とするペプチド 試料は、 鎖状ペプチドとし、 予めゲル電気泳動法による分離を行い、 該ゲル担 体上に担持された状態の単一スポットとするが、 該ゲル電気泳動法は、 一次元 方向に電気泳動をなす従来の S D S— P A G E法は勿論のこと、 ゲル上で二次 元的に泳動を行い、 より高い分離を行う、 二次元泳動法を適用したものでもよ い。 かかる二次元泳動法を適用して、 分離されるペプチド試料は、 夾雑物の混 入がなく、 より少ないサンプル量であっても、 本発明の第二の形態にかかる方 法によって、 その C末端アミノ酸配列決定が可能となる。 また、 予めゲル電気 泳動法による分離を行う場合、 対象とするペプチド中に、 分子内におけるシス ティン残基相互間で一 S— S—結合を形成するものは、 2—スノレファニルエタ ノール (H S - C 2 H 2 - O H： 2—メルカプトエタノール）、 D T T (ジチオト レイ ト一ノレ： トレオ一 1， 4一ジスルファ二ルー 2， 3—ブタンジォーノレ） な どの還元性試薬を添加して、 還元状態で電気泳動を行い、 単一のスポット化を 行うことが好ましい。 あるいは、 予め、 分子内におけるシスティン残基相互間 での一 S— S—結合を還元し、 さらには、 還元型のシスティンに対して、 ョー ド酢酸などを用いたカルボキシメチルイ匕などの修飾を施し、 単一のスポット化 を行うことが好ましい。 このように、 分子内におけるシスティン残基相互間で の一 S— S—結合を形成してなく、 鎖状ペプチドとすることで、 トリプシン消 化もより効率的になされる。 実施例
以下に、 実施例を挙げて、 本発明をより具体的に説明する。 なお、 かかる実 施例は、 本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、 本発明はかか る具体例の形態により限定を受けるものではない。
(実施例 1 )
本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法の有用 性を検証する目的で、 1 5 3アミノ酸からなるヘムタンパク質、 ゥマ由来のミ ォグロビンについて、 そのタンパク質部分グロビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミ ノ酸配列の解析を行った。
本実施例で利用する、 解析対象試料となるゥマ · ミオグロビンのグロビン · ぺプチド鎖が有するアミノ酸配列は既に判明しており、 本発明にかかる解析方 法で特定される C末端アミノ酸配列の特定精度を検証した。 図 1に、 本実施例 1における C末端アミノ酸の逐次的な分解工程の工程フローを示す。 ，
(単離、 乾燥ペプチド粉末試料の調製）
先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 1 . O ^u g Z ^u L の濃度でグロビン ·ぺプチド鎖部分のみを含有するぺプチド溶液を調製する。 前記ペプチド溶液を試験管に採り、 凍結乾燥して、 乾燥ペプチド粉末試料を調 製する。
(前処理操作）
次いで、 この乾燥ペプチド試料を収納したパイアルを、 テフロン製コックバ ルブ封止される真空排気用のポートを具えた、 共栓付き気密試験管型のガラス 製反応容器内に装着し、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を 所定量入れる。 前処理用の試薬として、 酢酸を 5体積％添加した無水酢酸 （3 0 0 β L を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥ペプチド試料を収納したバ ィアルを収納した後、冷却下、反応容器内を真空排気し、気密状態に封止する。 この気密状態の反応容器全体を、 50°C、 2時間保温して、 容器内の液状試 薬から供給される、 蒸気状の無水酢酸と酢酸を、 乾燥ペプチド試料に作用させ る。 このァシル化試薬として、 無水酢酸を酢酸共存下で、 乾燥ペプチド試料に 作用させることで、 ぺプチドの N末端アミノ基に選択的なァセチル化反応が進 行する。 加えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一NH— CH (C H2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同時に、 セリン残基 （一 NH—CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオユン残基 (-NH-CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対 する O—ァセチル化、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2— C6H4_〇H) ― CO—） のフエノーノレ生ヒドロキシ基への O—ァセチノレ化がなされる。
かかる前処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や酢酸 等を減圧留去するとともに、 得られる保護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖 の乾燥を行う。
(C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 得られるァセチル基による修飾 ·保護を施したグロビン ·ぺプチド 鎖を保持しているバイアルを、 同じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容 器内に装着した状態で、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を 所定量入れる。
この C末端アミノ酸の選択的分解反応用の液状試薬として、 ヘプタフルォロ ブタン酸 （HFBA : C3F7CO〇H) を 1体積0 /0添加した無水酢酸 （300 L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥試料を収納したパイアルを収納 した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 40°C、 3時間保温して、 容器内の液状試 薬から供給される、 蒸気状の無水酢酸と H F B Aを、 乾燥ペプチド試料に作用 させる。 その間、 ペプチド鎖 C末端に対して、 H F B Aと無水酢酸とを前記加 熱温度で作用させることで、 上述する反応式 （I a ) 〜 （ΙΙ' ) の反応経路を経 て、 ペプチド鎖の C末端アミノ酸の逐次的分解反応が進行する。 その際、 力か る反応産物のペプチド鎖 C末端は、 上述する 5—ォキサゾロン環あるいは、 力 ルポキシ基の活性化が図られた非対称型酸無水物の形態となっている。
かかる C末端ァミノ酸の選択的分解処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や H F Β Α等を減圧留去するとともに、 残余するァセチルイ匕 保護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖と得られる反応産物との混合物の乾燥 を行う。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物の乾燥試料を保持しているバイアルを、 同じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガ ラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
この後処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ペプチドの C末端は、 力 ルポキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾ口ン構造に留まつたもの、 あるいは、 非対称型酸無水物への変換まで進行したものも、 含まれた混合物状 態となつているため、 これらに加水処理を施し、 ペプチドの C末端は、 カルボ キシ基となった状態へと変換する処理である。 すなわち、 後処理用の液状試薬 として、 DMA Eを 1 0体積0 /0溶解した水溶液 ( 3 0 0 L) を用い、 前記ガ ラス製反応容器内に乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応 容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 6 0 °C、 1時間加熱して、 容器内の液状試薬 から供給される、 蒸気状の DMA Eと水分子を、 乾燥試料に作用させる。 非対 称型酸無水物ならびに 5—ォキサゾロン構造は、 有機塩基である DMA Eの共 存下、 水分子を作用することで、 加水がなされ、 上述する反応式 （IV) に示す ように、 C末端にカルボキシ基を有する形状に変換される。 加えて、 ァセチル 基による修飾'保護を施したペプチド鎖上、 セリン残基 （一 NH— C H (C H 2 OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) 一 C o— ) に存在するヒドロキシ基に対する o—ァセチル化保護は加水分解され、 脱保護がなされ、 また、 チロシン残基 （—NH— CH (CH2-C6H4-OH)
-co-) のフエノール性ヒドロキシ基への o—ァセチル化保護の加水分解も ほぼ全て進む。 但し、 用いる有機塩基の塩基性は高くないため、 N—ァセチル ィ匕保護の脱保護は進まず、 最終的に後処理工程後には、 より高い選択性を持つ て、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチノレ化、 リシン残基（一 NH— CH (C H2CH2CH2CH2NH2) -CO-)の ε位のアミノ基への N—ァセチル化が 残るものとなる。 場合によっては、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6 H4—〇H) -CO-) のフエノール性ヒドロキシ基への〇一ァセチル化が僅か に残るものとなる。
かかる後処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 残余している水分子や D MAE等を減圧留去するとともに、 後処理済み反応産物の混合物の乾燥を行う。
(トリプシン消化によるべプチド断片化)
ゥマ · ミオグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖は、 153アミノ酸からなるた め、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化に よるぺプチド断片化処理を行う。
具体的には、 前記後処理済み反応産物の混合物を乾燥した試料を容器内に入 れ、 トリプシン含有水性溶液を加え、 ぺプチド鎖の断片化を行う。 前記トリプ シン含有水性溶液は、 3—ピリジン酢酸緩衝液 （pH 7) 中に、 トリプシン を 0. 1 μ g/μ Lの濃度で含有しており、 トリプシン消化は、 37 °Cで、 攪 拌しつつ、 8時間酵素反応を行う。
なお、 元のペプチド鎖、 反応産物は、 前記後処理工程における脱保護によつ ても、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-)の ε位のアミノ基への N—ァセチル 化は保持された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチルイ匕 リシン残基の C末側ぺプチド結合の切断はなされず、 アルギニン残基の C末側 ぺプチド結合切断のみが進行する。 このゥマ .ミオグロビンのグロビン .ぺプ チド鎖が有するァミノ酸配列は既に判明しており、 図 7に示す、 1 5 3ァミノ 酸からなる元のぺプチド鎖は、 アルギニン残基におけるトリプシン消化を受け ると、 1一 3 1、 3 2—1 3 9、 1 4 0— 1 5 3の各部分アミノ酸配列を含む 断片が生じる。 従って、 上述する C末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成され る一連の反応産物は、 前記 1 4 0— 1 5 3アミノ酸の部分ァミノ酸配列を含む C末断片とともに、 各 C末端アミノ酸に相当する分子量差を示す、 一連の質量 分析ピークを与える。
トリプシン消化後、 反応液は、 Z i p T i pを利用して、 脱塩処理、 ならび に、 ペプチド断片の分離 ·回収を行った後、 これらペプチド断片の凍結乾燥を 行う。
(後処理、 トリプシン消化によるべプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産 物とグロビン 'ぺプチド鎖の C末断片との混合物について、質量分析法により、 含有される各ペプチド断片の分子量の測定を行う。
本実施例では、 乾燥したペプチド断片混合物試料に対して、 MA L D I— T O F— M S装置を利用し、 各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種ピー クの質量と、 その相対的な信号強度の測定、 比較を行う。 なお、 かかる MA L D I— T O F— M S装置を利用する測定では、 イオン種の分別は、 負帯電ィォ ン種を検出器へ導く、 所謂ネガティブ ·モードの測定と、 正帯電イオン種を検 出器へ導く、 所謂ポジティブ .モードの測定との双方を行う。 すなわち、 各ぺ プチド断片の分子量を反映する主イオン種として、 ポジティブ ·モードの測定 において、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種、 ネガティブ 'モードの測 定において、 プロトン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対応する二種のスぺ クトルを得る。
図 3に示すポジテイブ'モードの測定と、 図 4に示すネガティブ ·モードの 測定とを対比すると、 ゥマ 'ミオグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖に由来する トリプシン消化断片に相当する主な二つのピークとして、 1一 3 1の部分ァミ ノ酸配列、 ならびに、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配列を含む断片が、 力か る分子量範囲に見出される。 図 3に示すポジティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピークは、 C末端にアルギニン残基を有する 1—3 1の部分アミノ酸配列の N末側ペプチド断片に相当し、 一方、 図 4に示すネガ ティブ 'モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピークは、 アルギ 二ン残基を含まない 140— 1 53の部分ァミノ酸配列の C末側ぺプチド断片 に相当すると判定される。 加えて、 32— 1 39の部分アミノ酸配列中、 N— ァセチノレ基の離脱されたリシン残基における切断で派生する 78— 102の部 分アミノ酸配列に相当するペプチド断片も見出され、 同じく、 図 3に示すポジ ティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピークを示してい る。 その他、 トリプシンの自己消化で生じるペプチド断片も、 かかる分子量範 囲で見出され、 同じく、 図 3に示すポジティブ ·モードの測定において、 その 強度は相対的に大きなピークを示している。
図 4に示すネガテイブ 'モードの測定では、 140— 153の部分ァミノ酸 配列の C末側べプチド断片に加えて、 C末端アミノ酸の逐次的分解処理を施し た反応産物に由来する一連の C末側ペプチド断片も、 その強度は相対的に大き く測定されている。 表 1に、 測定されたピークの質量 ίί、 元のグロビン 'ぺプ チド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから特 定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応 産物の形態を示す。
表 1
m/Z Am 帰属 対応ぺプチド構造
1636.58 ― NDIAAK(Ac)YK(Ac)ELGFQG
1578.55 58.03 -Gly NDIAAK(Ac)YK(Ac)ELGFQ
1449.58 187.00 -Gln-Gly NDIAAK(Ac)YK(Ac)ELGF
1302.58 334.00 一 Phe - Gin - Gly NDIAAK(Ac)YK(Ac)ELG
1245.74 390.84 -Gly-Phe-Gln-Gly NDIAAK(Ac)YK(Ac)EL 本実施例 1の蒸気状の試薬を利用する処理法では、 C末端ァミノ酸の逐次的 分解処理により、 C末端から 4アミノ酸；グリシン、 グルタミン、 フエエルァ ラニン、 グリシンの除去された一連の反応産物が得られている。 なお、 図 4に 示すネガテイブ ·モードの測定には、 前記 1 4 0— 1 5 3ァミノ酸の部分ァミ ノ酸配列を含む C末端ペプチド断片等のピーク以外に、 トリプシン消化により 派生するペプチド断片、 1一 3 1アミノ酸部分、 7 8— 1 0 2アミノ酸部分に 相当する、 二つのピーク （分子量： 2 9 9 6 . 1 8、 3 4 8 5 . 4 8 ) は観測 されているが、 7 8—1 0 2アミノ酸部分に相当するもの以外には、 リシン残 基の脱保護に付随して、 トリプシン消化により副生したと判定可能なぺプチド 断片は、 かかる分子量範囲に見出されていない。 従って、 図 3に示すポジティ ブ ·モードの測定と、 図 4に示すネガテイブ 'モードの測定とを対比すること で、 トリプシン消化により派生する C末端にアルギニン残基を有するぺプチド 断片と、 N—ァセチル化保護の脱落したリシン残基を C末端に有するペプチド 断片に対応しているイオン種は容易に判別でき、 加えて、 リシン残基における トリプシン消化を受けたぺプチド断片多種が、 かかる分子量範囲に混在してい ないため、 目的とする C末端ペプチド断片と、 付随する C末端アミノ酸の逐次 的分解処理がなされている一連の C末端べプチド断片の弁別に際して、 その作 業はより容易となる。
(実施例 2 )
本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法の有効 性を検証する目的で、 ゲル担体上に担持されている 1 5 3アミノ酸からなるへ ムタンパク質、 ゥマ由来のミオグロビンについて、 そのタンパク質部分グロビ ン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸配列の解析を行った。
本実施例では、 解析対象試料となるゥマ · ミォグロビンを、 ポリアクリルァ ミド 'ゲルを利用して、 S D S— P A G E法によりゲル電気泳動して、 単一ス ポットとして、 そのグロビン ·ぺプチド鎖を分離した後、 本発明にかかる解析 方法で特定される C末端ァミノ酸配列の特定精度を検証した。
(ゲル電気泳動法による単離） 先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 0. 2 g/;u L の濃度でグロビン ·ぺプチド鎖部分のみを含有するぺプチド溶液を調製する。 なお、 該、 ゥマ ' ミオグロビンのグロビン ·ペプチド鎖部分には、 ヒ ト ' ミオ グロビンと異なり、 システィン残基は存在しないが、 仮に、 ヒト · ミオグロビ ンなどのように、 システィン残基を内在するぺプチドに対しては、 該システィ ン残基のスルファニル基 （一 SH) の酸化による、 一 S— S—結合の形成を回 避するため、 2—スルファニルエタノール （HS— C2H2—〇H : 2—メルカ プトエタノール）、 DTT (ジチオトレイ トール： トレオ一 1, 4—ジスルファ 二ルー 2, 3—ブタンジオール） などの還元性試薬を添加するなどして、 予め 酸化防止処理を施す。 場合によっては、 予め、 システィン残基のスルファニル 基 （一 SH) に対して、 カルボキシメチル化などの保護を施す。
このぺプチド溶液を、 ゲル濃度 1 2. 5質量0 /0のポリアクリルアミ ド ·ゲル 上にスポッ トし、泳動処理後、 クーマシー '染色により、 目的とするグロビン ' ぺプチド鎖のバンドを特定する。 本例では、 かかる染色パンド部のゲルを切り 出し、 ゲル切片を以下の一連の操作に供する。
(ゲルの脱水処理）
ゲル切片を、 気密性を有するチューブ中に入れ、 ァセトニトリル lmLを 注入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニトリルを棄て、 新たに、 ァ セトニトリル lmLを注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリル を利用する、 ゲル中に含浸する水の抽出処理を、 合計 3回行い、 ゲルの脱水処 理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生じる。
(前処理操作）
次いで、 チューブ中で、 脱水処理済みのゲル切片に、 10体積。/。濃度の無水 酢酸のホルムアミド溶液 1 mLを注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓したチ ユーブを攪拌しつつ、 該容器全体の温度を、 50°Cに加熱し、 力かる温度に、 3時間保持する。
この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミドの 浸潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持 されているグロビン 'ペプチド鎖に対して、 溶質の無水酢酸が、 前記加熱温度 で作用する結果、 ぺプチドの N末端ァミノ基に選択的なァセチル化反応が進行 する。 加えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同 時に、セリン残基（― NH— CH (CH2OH) -CO-)やトレオニン残基（一 NH-CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する O—ァセチル化、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2— C6H4— OH) -CO -) のフエノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化がなされる。
上記の N末端アミノ基の N—ァセチル化、 ならびに、 アミノ酸残基側鎖の N —ァセチル化、 O—ァセチル化による保護を施した後、 無水酢酸のホルムアミ ド溶液を除去し、 チューブ容器中にァセトニトリル lmLを注入し、 1 5分 間攪拌する。 その後、前記ァセトニトリノレを棄て、新たに、 ァセトニトリル 1 mLを注入し、 更に 1 5分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用する、 ゲル 中に含浸するホルムアミド溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨潤ゲル中の 脱溶媒 （ホルムアミド） 処理を行う。 脱溶媒処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生 じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。
( C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 図 2に示す工程のように、 前記脱水処理によって、 収縮したゲルの 再膨潤と、 反応試薬のゲル内への浸潤を行う。 具体的には、 前処理操作を終え た後、 得られるァセチル基による修飾'保護を施したグロビン .ペプチド鎖を ゲル中に担持されている状態の、 ゲル切片を入れた前記チューブ内に、 ヘプタ フルォロブタン酸（HFBA : C3F7COOH) 1体積0 /0、無水酢酸 10体積0 /0 のホルムアミド溶液 1 mLを注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓した容器を 攪拌しつつ、 該容器全体の温度を、 40°Cに加熱し、 かかる温度に、 16時間 保持する。
この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミ ドの 浸潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持 されているペプチド鎖 C末端に対して、 HFBAと無水酢酸とを前記加熱温度 200 で作用させることで、 ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸の選択的分解反応が進行す る。 具体的には、 ペプチドの C末端において、 上述する反応式 （I a ) 〜 （Ι ) の反応経路を経て、 5—ォキサゾロン環形成を介する、 ペプチド鎖の C末端ァ ミノ酸の逐次的分解反応が進行すると推定される。 かかる逐次的分解の各反応 過程は、 双極性溶媒であるホルムアミド中において、 プロトン · ドナーとして 機能する H F B Aの触媒作用によって、 その反応の促進がなされている。
この C末端アミノ酸の逐次的な分解反応が進行し、 ゲル中には、 段階的に C 末端アミノ酸が除去された、 一連の反応産物と、 初段の 5—ォキサゾロン構造 への変換時点に留まっている、 ァセチル基による修飾 ·保護を施した元のぺプ チド鎖とが含まれた混合物が、 ゲル担体に担持された状態で残される。 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解処理を終えた後、 容器内に残留する、 未反応の無 水酢酸や H F B A等を含むホルムアミド溶液を除去し、 容器中にァセトニトリ ル l m Lを注入し、 1 5分間攪拌する。その後、前記ァセトニトリルを棄て、 新たに、 ァセトニトリル l m Lを注入し、 更に 1 5分間攪拌する。 このァセ トニトリルを利用する、 ゲル中に含浸するホルムアミド溶液の抽出処理を、 合 訐 3回行い、 再膨潤ゲル中の脱溶媒 （ホルムアミド） 処理を行う。 脱溶媒処理 に伴い、 ゲル体積の収縮が生じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物が担持されている状態のゲル切片を入れ た前記容器内に、 DMA E ( ( C H 3) 2 N— C H 2 C H 2〇H) 1 0体積0 /0濃度の 水溶液 1 m Lを注入する。 蜜栓した該容器を攪拌しつつ、 容器全体の温度 を、 6 0 °Cに加熱し、 かかる温度に、 1時間保持する。 その際、 脱水処理され ていたゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再膨潤し、 本来の体積に復す る。 この再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、 反応産物に対して、 塩基性窒素含有有機化合物の存在下、 水分子を前記加熱温度で作用させること で、 加水処理が進行する。
この後処理における加水処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ぺプチ ドの C末端は、 カルボキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾロン構造 に留まったもの、 あるいは、 非対称型酸無水物への変換まで進行したものも、 含まれた混合物状態となっているため、 これらに加水処理を施し、 ペプチドの
C末端は、 カルボキシ基となった状態へと変換する処理である。 加えて、 塩基 性窒素含有有機化合物が塩基触媒として機能することに伴い、 ァセチル基によ る修飾'保護を施したペプチド鎖上に、セリン残基（一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する O—ァセチル化保護は加水分解され、 脱保護 がなされる。 また、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) — C O—） のフエノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化保護の加水分解も、 同 様に進む。 但し、 用いる有機塩基の塩基性は高くないため、 N—ァセチル化保 護の脱保護は進まず、 最終的に後処理工程後には、 より高い選択性を持って、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) -CO-) の £位のアミノ基への N—ァセチル化が残 るものとなる。 場合によっては、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4 -OH) -CO-) のフエノーノレ性ヒ ドロキシ基への O—ァセチル化が、 極く 僅かに残るものとなる。
かかる後処理工程を終えた後、 容器内に残留する水溶液を除去し、 容器中に ァセトニトリル lmLを注入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニ トリルを棄て、 新たに、 ァセトニトリル lnxLを注入し、 更に 15分間攪拌 する。このァセトニトリルを利用する、ゲル中に含浸する水溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨潤ゲル中の脱水処理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の 収縮が生じる。
(トリプシン消化によるぺプチド断片化）
ゥマ ' ミオグロビンのグロビン'ペプチド鎖は、 153アミノ酸からなるた め、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化に よるぺプチド断片化処理を行う。
具体的には、 前記の後処理を施し、 脱水処理済みのゲル切片を入れた容器内 に、 トリプシン含有水性溶液を加え、ゲル担体上に担持されている状態のまま、 ペプチド鎖の断片化を行う。 前記トリプシン含有水性溶液は、 重炭酸アンモニ ゥム緩衝液 （pH 8) 中に、 トリプシンを 0. 067 g/μ Lの濃度で含 有しており、 トリプシン消化は、 37°Cで、 攪拌しつつ、 4時間酵素反応を行 う。 その際、 脱水処理されていたゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再 S彭潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持されているぺプチ ド鎖、 反応産物に対して、 前記緩衝液とともに、 ゲル中に浸入するトリプシン を前記加熱温度で作用させることで、 トリプシンに特異的な酵素消化が進行す る。
なお、ペプチド鎖、反応産物は、前記後処理工程における脱保護によっても、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) -CO-) の E位のアミノ基への N—ァセチル化は保 持された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチル化リシン 残基の C末側ぺプチド結合の切断はなされず、 アルギニン残基の C末側ぺプチ ド結合切断が進行する。 このゥマ ' ミォグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖が有 するアミノ酸配列は既に判明しており、 図 7に示すようにアルギニン残基の C 末側ぺプチド結合切断に伴い、 153アミノ酸からなる元のぺプチド鎖は、 1 一 31、 32— 139、 140- 153の各部分ァミノ酸配列を含む断片に、 トリプシン消化を受ける。 なお、 図 7には、 前処理操作に伴い、 N—ァセチル 化保護が施されるリシン残基を網かけ表示で示し、 さらには、 トリプシン消化 による、 アルギニン残基の C末側ペプチド結合切断で生じる、 N末側の 1一 3 1と C末側の 140— 153の各部分ァミノ酸配列を太字で示す。
トリプシン消化によって断片化されると、 これらのペプチド断片は、 ゲル担 体から溶出を生じ易くなり、 容器内のトリプシン溶液中に溶出する。 なお、 か かるトリプシン消化処理工程では、 前記 140— 153ァミノ酸の部分ァミノ 酸配列を含む C末断片とともに、 上述する C末端アミノ酸の逐次的分解処理で 生成される一連の反応産物に由来する C末断片も、 容器内のトリプシン溶液中 に溶出する。 すなわち、 該トリプシン消化処理は、 長いアミノ酸長のペプチド 鎖から、 その C末部分を、 質量分析に適合する所望の分子量範囲のペプチド断 片とするとともに、 かかるペプチド断片を、 ゲル中から高い収率で溶出、 回収 することを可能としている。
かかるトリプシン消化処理工程を終えた後、 ゲル中から容器内のトリプシン 溶液中に溶出する断片化されたぺプチドを回収する。 回収されたべプチド断片 の混合物を含む溶液について、 脱塩処理を施した後、 真空乾燥処理を行う。
(後処理、 トリプシン消化によるべプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産 物とグロビン ·ぺプチド鎖の C末断片との混合物について、質量分析法により、 含有される各ペプチド断片の分子量の測定を行う。
本実施例でも、 脱塩処理を施し、 上記乾燥処理を行ったペプチド断片混合物 試料に対して、 MA L D I— T〇F— M S装置を利用し、 各ペプチド断片の分 子量を反映する主イオン種ピークの質量と、 その相対的な信号強度の測定、 比 較を行う。 なお、 かかる MA L D I—T O F— M S装置を利用する測定では、 イオン種の分別は、 負帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ネガティブ 'モード の測定と、 正帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ポジティブ.モードの測定と の双方を行う。 すなわち、 各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種とし て、 ポジティブ 'モードの測定において、 プロトン （H+) が付加された陽ィォ ン種、 ネガティブ 'モードの測定において、 プロトン （H+) が離脱さいた陰ィ オン種の、 対応する二種のスぺクトルを得る。
この実施例 2でも、 図 5に示すポジテイブ 'モードの測定と、 図 6に示すネ ガティブ ·モードの測定とを対比すると、 ゥマ ' ミォグロビンのグロビン ·ぺ プチド鎖に由来するトリプシン消化断片に相当する主な二つのピークとして、 1 - 3 1の部分ァミノ酸配列、 ならびに、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配列 を含む断片が、 かかる分子量範囲に見出される。 図 5に示すポジティブ.モー ドの測定において、 その強度は相対的に大きなピークは、 C末端にアルギニン 残基を有する 1一 3 1の部分ァミノ酸配列の N末側ぺプチド断片に相当し、 一 方、 図 6に示すネガティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大き なピークは、 アルギニン残基を含まない 1 4 0— 1 5 3の部分アミノ酸配列の C末側ぺプチド断片に相当すると判定される。 加えて、 3 2— 1 3 9の部分ァ ミノ酸配列中、 N—ァセチル基の離脱されたリシン残基における切断で派生す る、 7 8— 1 0 2の部分アミノ酸配列に相当するペプチド断片も見出され、 同 じく、 図 5に示すポジティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大 きなピークを示している。 その他、 トリプシンの自己消化で生じるペプチド断 片も、 かかる分子量範囲で見出され、 同じく、 図 5に示すポジティブ 'モード の測定において、 その強度は相対的に大きなピークを示している。
図 6に示すネガテイブ 'モードの測定では、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸 配列の C末側ぺプチド断片に加えて、 C末端ァミノ酸の逐次的分解処理を施し た反応産物に由来する一連の C末側ペプチド断片も、 その強度は相対的に大き く測定されている。 表 2に、 測定されたピークの質量値、 元のグロビン 'ぺプ チド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから特 定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応 産物の形態を示す。
表 2
Figure imgf000078_0001
本実施例 2の、 ゲル中での、 双極性非プロ トン溶媒を用いた反応試薬溶液を 利用する処理法でも、 C末端アミノ酸の逐次的分解処理により、 C末端から二 つのアミノ酸、 グリシンとグルタミンが逐次的に分解された反応産物に由来す るピークが確認される。 すなわち、 解析対象である上述のゲル切片上のバンド として分離されるぺプチド鎖は、 実際に、 グロビン ·ぺプチド鎖であり、 C末 端ァミノ酸の逐次的分解処理をゲル上に担持した状態で実施できることが、 検 証される。 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法を利用 することで、 解析対象のペプチド鎖をゲル中に担持した状態で、 C末端アミノ 酸の逐次的分解を進めた際にも、 本質的に遜色のない解析確度が達成されてい ることが確認される。
(参考例 1 )
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法では、 リシン残基側 鎖を N—ァシル化保護した状態で、 ぺプチド鎖をトリプシン消化することで、 得られる N末側のアミノ酸配列に由来する共通のペプチド断片は、 C末端にァ ルギニン残基を有するぺプチド断片となることを利用して、 C末端側べプチド 断片との区別に利用している。仮に、元々、解析対象試料となるぺプチド鎖が、 その C末端にアルギニンを有する場合であっても、 MALD I -TOF-MS 装置を利用する測定において、 各ぺプチド断片の分子量を反映する主イオン種 として、 ポジティブ ·モードの測定により、 プロトン （H+) が付加された陽ィ オン種、 ネガティブ 'モードの測定により、 プロトン （H+) が離脱された陰ィ オン種の、 対応する二種のスぺクトルを取得し、 その対比によって、 一連の反 応産物に由来する C末端側べプチド断片を特定可能であることを検証した。 本参考例では、ぺプチド鎖の N末ァミノ基を、 N—ァセチル化保護を施した、 14アミノ酸からなるぺプチド、 N—ァセチル化 G 1 u X-F i b r i n oぺプ チド断片について、 その C末端ァミノ酸配列の解析を行った。
(C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
予め、 N—ァセチル化処理して得られる前記ペプチド試科 （Ac— EGVN DNEEGFFSAR) の乾燥試料を保持しているバイアルを、 共栓付き気密 試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガラス製反応容器内に 別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
この C末端アミノ酸の選択的分解反応用の液状試薬として、 トリフルォロ酢 酸を 5体積。 /0添加した無水酢酸 (300 L) を用い、 前記ガラス製反応容器 内に乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排 気し、 気密状態に封止する。 この気密状態の反応容器全体を、 4 0 °C、 1 6時間保温して、 容器内の液状 試薬から供給される、 蒸気状の無水酢酸とトリフルォロ酢酸を、 乾燥試料に作 用させる。
なお、 力かる C末端アミノ酸の選択的分解処理を終えた後、 反応容器内に残 留する、 未反応の無水酢酸やトリフルォロ酢酸等を減圧留去するとともに、 残 余する N—ァセチル化 G 1 u ^ F i b r i n oペプチド試料と得られる反応 産物との混合物の乾燥を行う。
(後処理操作）
次いで、 N—ァセチル化 G 1 u i b r i n oぺプチド断片と得られる反 応産物が含まれる混合物の乾燥試料を保持しているバイアルを、 同じく共栓付 き気密試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガラス製反応容 器内に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
本参考例 1では、 加水後処理の液状試薬として、 ピリジンを 1 0体積％溶解 した水溶液 （3 0 0 L ) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥試料を収納 したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封 止する。
この気密状態の反応容器全体を、 1 0 0 °C、 3 0分間加熱して、 容器内の液 状試薬から供給される、蒸気状のピリジンと水分子を、乾燥試料に作用させる。 前記の条件では、 セリン残基の O—ァセチル化保護の脱保護はなされるものの、 N末端の N—ァセチル化保護のアミ ド結合に対する加水分解は起こらないため、 得られる後処理済みの反応産物は、 ぺプチドの N末端にァセチル基が修飾され た N—ァセチル化体となる。
かかる後処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 残余している水分子ゃピ リジン等を減圧留去するとともに、 N—ァセチル化 G 1 u X - F i b r i n oぺ プチド断片と得られる後処理済みの反応産物との混合物の乾燥を行う。
(後処理済みの反応産物の特定）
以上の一連の化学的処理を施して得られる、 後処理済みの反応産物と元のぺ プチド断片との混合物について、 MA L D I— T O F—M S装置を利用し、 各 ぺプチド断片の分子量を反映する主イオン種として、 ポジティブ ·モードの測 定において、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種、 ネガティブ 'モードの 測定において、 プロトン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対応する二種のス ぺクトノレを得る。
図 8に示す、 二種のスぺクトルを対比すると、 ポジティブ ·モードの測定に おいて、 1— 1 4のアミノ酸配列を保持する元のぺプチド断片は、 その強度は 相対的に大きく、 アルギニン残基を含むことが確認される。 加えて、 ネガティ プ ·モードの測定において、 この元のペプチド断片から、 アルギニン残基が分 解除去された分子量に相当するピークが観測されるものの、一方、 ポジティブ · モードの測定においては、対応するピークは、明確には見出されなレ、。従って、 1一 1 4のアミノ酸配列を保持する元のぺプチド断片は、 C末端にアルギニン 残基を有しており、 ポジティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に 大きいものの、 ネガティブ 'モードの測定において、 付随する一連の反応産物 に起因するイオン種が見出され、 かつ、 アルギニン残基が分解除去された分子 量に相当するピークの存在するので、 C末端アミノ酸の逐次的な分解除去を受 けていることが、 確認される。 表 3に、 測定されたピークの質量値、 元のぺプ チド鎖に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから特定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応産物の形態 を示す。
表 3
m/ Z A m 帰属 対応ぺプチド構造
1610. 68 ― 1一 1 4 Ac-EGVNDNEEGFFSAR
1454. 58 156. 10 — Arg Ac-EGVNDNEEGFFSA
1383. 54 227. 14 — Ala-Arg Ac-EGVNDNEEGFFS
1296. 51 314. 17 — Ser-Ala-Arg Ac-EGVNDNEEGFF
1149. 44 461.24 — Phe-Ser-Ala-Arg Ac— EGVNDNEEGF W すなわち、 仮に、 元のペプチド鎖のアミノ酸配列は、 C末端にアルギニンを 有する場合であっても、 トリプシン消化で得られる C末側べプチド断片に付随 して、 アルギニン残基の除去に相当する分子量減少を示すピークの有無を精查 することで、 C末側ペプチド断片であるか、 その他の N末側のアミノ酸配列に 由来するペプチド断片であるかを、 高い確度で判定することが可能であること が検証される。 産業上の利用の可能性
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法は、 ぺプチドの C末 端アミノ酸を逐次的に分解除去する際、対象とするぺプチド鎖に対して、予め、 ぺプチド鎖の N末端ァミノ基、ならびに、 リシン残基側鎖のァミノ基に対して、 N—ァシル化保護を行うことで、 同時に、 セリン残基 （一 NH— C H ( C H 2 0 H) - C O -) ゃトレオニン残基 （一 N H— C H ( C H ( C H 3) O H) —C O 一）に存在するヒドロキシ基に対しても、 O—ァシル化保護がなされた状態で、 乾燥雰囲気下、 穏和な加熱温度において、 アルカン酸無水物に少量のパーフル ォロアルカン酸を組み合わせた反応試薬を作用させ、 5—ォキサゾロン構造を 経て、 該 5—才キサゾロン環の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解を行って、 ― 連の反応産物を調製する手法を採用している。 かかる手法では、 利用するアル カン酸無水物自体、 反応性が低いため、 ペプチドの途中におけるアミド結合の 分断等の不要な副次反応を引き起こすことなく、 穏和な加熱条件で、 ペプチド の C末端アミノ酸を逐次的に分解除去することが可能となる。 付随して、 ぺプ チドの途中におけるアミド結合の分断が無いので、 得られる反応産物中に、 前 記アミド結合の分断により派生するペプチド断片、 ならびに、 そのペプチド断 片を起源とする反応産物が混入することも回避できる。 さらには、 かかる穏和 な条件での反応を利用することで、 得られる一連の反応産物に対して、 後処理 において、 有機塩基性化合物の存在下、 加水処理を行うことで、 C末端にカル ボキシ基を有し、 O—ァシルイ匕保護は脱保護されるものの、 ペプチド鎖の N末 端ァミノ基、 ならびに、 リシン残基側鎖のアミノ基における N—ァシル化保護 を保持するものとする。 最終的に、 トリプシン消化を施し、 N—ァシル化保護 されているリシン残基の C末側での切断を回避しつつ、 アルギニン残基の C末 側での切断を行って、 アミノ酸長の長いペプチド鎖より、 MA L D I— T O F 一 M S装置を利用する測定に適する分子量範囲となる、 C末端側べプチド断片 を調製した上で、 該 C末端側ペプチド断片における一連の分子量減少に基づき、 C末端ァミノ酸の逐次的な分解除去を受けて、
短縮される C末端ァミノ酸配列を高レ、精度で決定できる。
加えて、 上述する C末端ァミノ酸の逐次的な分解除去の化学的処理において は、 そのペプチド鎖のアミノ酸長変化は、 多くとも 1 0アミノ酸程度であるの で、 対象とするペプチドを、 予めゲル電気泳動法による分離を行った後、 該ゲ ル担体上に担持された状態を維持したまま、 これら化学的処理を進めることも できる。 一方、 トリプシン消化を施して、 ペプチド断片化を行うと、 アミノ酸 長が格段に短いペプチド断片は、 ゲル担体上に最早安定に保持できず、 簡便に ゲル担体上より溶出させ、 回収することが可能となる。 従って、 このペプチド の C末端アミノ酸を逐次的に分解除去する際の優れた制御性、 ならびに、 穏和 な反応条件、 例えば、 反応温度の許容される変動幅の広さの利点、 さらには、 ァミノ酸長の長いぺプチド鎖に対しても、 その C末端ァミノ酸配列解析を高い 精度で実施できることから、 本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解 析方法は、 より汎用性に富む解析方法となる。

Claims

請求の範囲
1 . 解析対象とするぺプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドより、 化学的手段により C末端ァミノ酸を逐次的に分解 して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法によ り分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定するェ 程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のァミノ酸 を特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを 具え、
前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程は、
対象とする前記ペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °C の範囲に選択される温度において、
アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とアル力ン酸とを作用させ、
該ぺプチド N末端のァミノ基ならぴに、 該ぺプチドに含有されている可能性 のあるリシン残基側鎖のァミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシ ル基による N—ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、 前記 N—ァシル化保護済みの、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾 燥雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用さ せ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000085_0001
(III)
(式中、
R lは、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端ァミノ酸の分解を行う工程と、
前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、
残余する前記アル力ン酸無水物とパーフルォロアル力ン酸とを乾燥状態にお いて除去する後処理を施し、
次いで、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水溶 液を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物と水 分子を供給して、
前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物べプチドに水分 子を作用させ、
前記の加水処理を施した後、 かかる一連の反応生成物を含む混合物に残余す る、 前記塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去、 乾燥する再乾燥後処理 を行うことからなる加水処理の工程とを、 少なくとも含んでなり、
前記 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対し て、
緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ぺプチド鎖の N末端のァミ ノ基ならびに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖の アミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が保持されている、 該ぺプチド鎖のト リブシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ペプチド鎖中に存在するアルギニ ン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によるぺプチド断片化を行い、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済み ペプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥 混合物について、 MA L D I— T O F—M S法を利用し、 該イオン化処理で生 じる陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行 レ、、
前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定に おいて測定される、 対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽ィオン種による分子量測定における強度は、 陰ィオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端の ぺプチド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反 応生成物に由来する C末端のぺプチド'断片のピークは、
陰ィオン種による分子量測定における強度は、 陽ィオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連 のピークに基づき、 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 手法を採用することを特徴とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法。
2 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型 酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
3 . 前記炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜4 の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 2項に記載の方法。
4 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物に含まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
5 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パーフルォロアルカン酸 の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用い ることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
6 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜 4のパーフルォロ アルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
7 . 前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の直 鎖パーフルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項に 記載の方法。
8 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物中における、 パーフルォロアルカン酸の含有比率は、 アルカン酸無水物と パーフルォロアルカン酸との合計体積に対して、 1〜 2 0体積0 /0の範囲に選択 することを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
9 . 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物を利用する処理に際して、
前記乾燥雰囲気は、 水分に加えて、 酸素も除去された状態であることを特徴と する、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
1 0 . 前記乾燥雰囲気は、 気密容器内において、 その内部の大気を真空排気 することで、 達成されていることを特徴とする、 請求の範囲 第 9項に記載の 方法。
1 1 . 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる 混合物を利用する処理に際して、 その温度は、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択さ れる温度とすることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
1 2 . 解析対象とするぺプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であつ て、
対象とするぺプチドより、 化学的手段により C末端ァミノ酸を逐次的に分解 して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法に より分析し、 かかる C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 工程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のァミノ酸 を特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを 具え、
前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の 対象とするペプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去す ることにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプ チド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性 溶媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水 物溶液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺ プチド試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするぺプチドの N末端のァ ミノ基ならびに、 該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上の ァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァ シル基による N—ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶 媒を用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシル化反応の停止と反応試薬の 除去を行う前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護の前処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態 の対象とするぺプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度 において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性 溶媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬するこ とにより、 担持された状態の対象とするペプチド試料にアルカン酸無水物とパ 一フルォロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000089_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で 表記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端アミノ酸の逐次的分解を行い、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質 の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水 物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン 性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去 を行う工程と、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応 生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合 物の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き 起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付カロ 的な加水処理と再脱水処理の工程とを有し、
前記 c末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再脱水処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態で、 緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用 させ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ペプチド鎖に含有されて いる可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が 保持されている、 該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切 断によるペプチド断片化を行って、
かかるゲル担体上から該ぺプチド断片の遊離と、 前記緩衝溶液中への溶出を 行い、 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン 消化処理済みべプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥 混合物について、 MA L D I— T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生 じる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行 レ、、
前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定に おいて測定される、 対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽ィオン種による分子量測定における強度は、 陰イオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端の ペプチド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反 応生成物に由来する C末端のぺプチド断片のピークは、
陰イオン種による分子量測定における強度は、 陽イオン種による分子量測定に おける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連 のピークに基づき、 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する 手法を採用することを特徴とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法。
1 3 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるアル力ン酸無水物として、 炭素数 2〜 4のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 2項に記載の方法。
1 4 . 前記炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の直鎖アル力ン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 3項に記載の方法。
1 5 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を 用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 2項に記載の方法。
1 6 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該 パーフルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフ ルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 2項に記載の 方法。
1 7 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 炭素 数 2〜4のパーフルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 2項に記載の方法。
1 8 . 前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の 直鎖パーフルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 7 項に記載の方法。
1 9 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる 比率で溶角早してなる混合溶液中における、 アル力ン酸無水物とパーフルォロア ルカン酸との含有比率は、 アルカン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロア ルカン酸 1〜2 0容の範囲に選択することを特徴とする、 請求の範囲 項に記載の方法。
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