WO2004051281A1 - ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法 - Google Patents

ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法 Download PDF

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WO2004051281A1
WO2004051281A1 PCT/JP2003/015270 JP0315270W WO2004051281A1 WO 2004051281 A1 WO2004051281 A1 WO 2004051281A1 JP 0315270 W JP0315270 W JP 0315270W WO 2004051281 A1 WO2004051281 A1 WO 2004051281A1
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peptide
amino acid
reaction
acid
gel
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PCT/JP2003/015270
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French (fr)
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Kenji Miyazaki
Akira Tsugita
Kenichi Kamijo
Takuji Nabetani
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Nec Corporation
Tokyo Rikakikai Co., Ltd.
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G01N33/6821—Sequencing of polypeptides involving C-terminal degradation

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a C-terminal amino acid sequence of a peptide, and more specifically, separation by gel electrophoresis of a protein comprising a peptide chain of at least 50 amino acids or more, usually 100 amino acids or more.
  • the C-terminal amino acid of the peptide is sequentially decomposed by a chemical method while being supported on the gel carrier, and the molecular weight of the reaction product is determined by mass spectrometry.
  • the present invention relates to a method for elucidating a C-terminal amino acid sequence based on a decrease in molecular weight caused by a series of amino acids sequentially removed. Background art
  • Identification of amino acid sequences of peptides and proteins collected from nature is indispensable information when studying the biological properties and functions of powerful peptides and proteins.
  • the entire amino acid sequence of peptides and proteins is based on the corresponding genetic information, that is, the amino acid deduced based on the genomic gene encoding these peptides and the nucleotide sequence of c_DNA prepared from m_RNA. It is determined as an array.
  • knowledge of partial amino acid sequence of the peptide is still necessary for specifying genomic gene encoding the peptide and c-DNA prepared from m-RNA.
  • the N-terminal amino acid sequence and the C-terminal amino acid sequence of the peptide are considered to be particularly useful.
  • the target c-DNA is selected using the prepared nucleic acid probe based on the amino acid sequences at both ends. It is possible to do.
  • it is also possible to selectively amplify a target c_DNA by applying a PCR method using oligonucleotide primers prepared based on the amino acid sequences at both ends.
  • a method has been proposed for effecting the selective degradation of the C-terminal amino acid promoted by anhydride (Tsugita, A. eta 1., Chem. Lett.
  • the above selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid proceeds sequentially, and after a predetermined processing time has elapsed, 1 to 10 amino acid residues are removed from the C-terminal of the original peptide, respectively.
  • a mixture containing the series of reaction products obtained is obtained.
  • mass spectrometry By applying mass spectrometry to the mixture containing this series of reaction products and measuring the mass of the ion species derived from each reaction product, a series of mass differences that reflect the c-terminal amino acid sequence are shown. The peak can be measured.
  • each reaction product is generated by a sequential C-terminal amino acid degradation reaction from the original peptide, resulting in several types of reaction products, for example, a reaction product in which several amino acid residues have been removed from the original peptide.
  • mass of the corresponding ion species can be analyzed collectively.
  • the C-terminal amino acid sequence of such several amino acid residues can be determined at a time.
  • information on the c-terminal amino acid sequence used for preparing a nucleic acid probe or primer is usually about 18 to 24 bases long as a base sequence encoding a powerful amino acid sequence. It may be up to about 8 amino acids, and it is only necessary in very special cases to elucidate the C-terminal amino acid sequence that reaches 10 amino acid residues.
  • the method of applying these perfluoroalkanoic acid or perfluoroalkanoic anhydride vapors to the dried peptide while supplying them from the gas phase is a useful means for elucidating the C-terminal amino acid sequence. Because the reaction uses a reaction reagent supplied from the gas phase, the peptide sample to be analyzed is isolated and purified, and then dried to obtain a pure peptide, and then analyzed. Means had been applied. Accordingly, the availability of a pure peptide product after isolation and purification beforehand has been a prerequisite for the application of the analytical method utilizing a reaction reagent supplied from such a gas phase.
  • the amino acid sequence was collected from a specific cell tissue.
  • a method of separating a mixed sample containing a large number of peptides and proteins by gel electrophoresis for example, in the SDS-PAGE method, a spot corresponding to the molecular weight is shown on a polyacrylamide gel carrier.
  • Techniques for confirming the presence of peptides and proteins are widely used.
  • peptides and proteins are isolated as two-dimensionally subdivided spots according to the difference in molecular weight / isoelectric point. At that time, it is necessary to verify whether the peptide giving the spot detected on the gel carrier is actually the target peptide.
  • a method of reacting an antibody showing specific reactivity with the target peptide and detecting the presence or absence of the antigen / antibody reaction is performed. Is used. However, this verification method is only applicable when antibodies with specific reactivity are available.
  • a verification method using a method called a peptide “mass” fingerprint (PMF) method is also used.
  • PMF peptide “mass” fingerprint
  • This PMF method is used when the molecular weight of each of the generated peptide fragments is known in advance when the target peptide is enzymatically digested with a protease having specificity at the cleavage site, for example, trypsin.
  • the isolated peptide is fragmented by the same enzymatic digestion, and the molecular weight of each peptide fragment is measured using mass spectrometry, and compared with the individual molecular weights of the peptide fragments recorded in the database. Then, the identity is verified.
  • the present inventors have already determined the amino acid sequence. For known peptides and proteins, separation by gel electrophoresis under the same conditions will result in unique positions. In order to give spots with considerable reproducibility, analyze the partial amino acid sequence of the peptide generating the spot at the corresponding position, and verify whether it matches the corresponding partial sequence in the known amino acid sequence It was conceived that alternative means would be available. More specifically, for example, when using the SDS-PAGE method or the two-dimensional electrophoresis method, the approximate molecular weight of the band or the peptide giving the spot detected on the gel carrier is known.
  • an object of the present invention is to provide a peptide to be analyzed separated by gel electrophoresis, specifically, a peptide chain having a large number of amino acid residues such as a protein.
  • the C-terminal amino acid is successively degraded using a reaction mechanism via formation of an oxazolone ring structure while the peptide is supported on a gel carrier, the peptide bond in the middle of the peptide
  • An object of the present invention is to provide a means for sequentially decomposing C-terminal amino acid, which can suppress undesired side reactions such as rupture, and at the same time, can perform such chemical treatment itself under versatile conditions. is there.
  • an object of the present invention is to remove the water contained in the gel-like substance while supporting it on a gel carrier, dry the peptide, and then sequentially remove its C-terminal amino acid.
  • a peptide that stays in the pore structure of the inner part of the gel can be uniformly supplied with a reagent that performs such chemical treatment, and a new sequential method that can be performed under mild conditions near room temperature. It is an object of the present invention to provide a method for analyzing a peptide C-terminal amino acid sequence using a means for decomposing C-terminal amino acid.
  • the gel-like substance used in the gel electrophoresis has a fine hole structure through which a peptide can pass.
  • a reaction is performed to form an oxazolone ring structure in a state of being impregnated with water, it is necessary to remove water impregnated in the gel-like substance.
  • the water molecules filling the fine hole structure are removed, resulting in a reduction in the bulk volume of the entire gel, and the reaction reagent is vaporized as a vapor inside the narrow fine hole structure. It was difficult to supply to.
  • the present inventors further studied a method of supplying a reaction reagent, and found that a gel having a narrow internal fine pore structure formed by dehydration operation was free from water, and was not subjected to perfluoroal carboxylic acid or acid anhydride. Swelling again by using an organic solvent capable of dissolving the reaction reagents such as the above, to widen the gap of the internal fine hole structure, and gel the reaction reagent dissolved in the organic solvent through the gap. It has been found that it is possible to supply evenly to the inside.
  • the gel carrier is immersed in the mixture to cause alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid to act on the peptide sample of interest in a supported state, thereby forming an oxazolone ring structure at the C-terminus.
  • the present inventors have found that a series of reactions of dissociation of terminal amino acid residues and formation of an oxazolone ring structure can be carried out.
  • Both the peptide and the original peptide do not diffuse or elute in the gel swollen with a strong dipolar aprotic solvent, and are maintained on the gel carrier without mass. Check that it is possible to analyze simultaneously by precipitation, was led to you completed the present invention.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide to be analyzed. Preparing a mixture containing a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid,
  • the target peptide supported on the gel carrier At a temperature selected from the range of 30 ° C. to 80 ° C.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid) through a 5-oxazolone structure represented by the following formula: Performing a sequential decomposition of the amino acid;
  • the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid is mixed with the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic acid anhydride and the dipolar aprotic solvent without causing the gel-like substance to be dissolved.
  • a peptide sample of interest having a step of terminating the decomposition reaction and removing the reaction reagent by diluting and removing with a polar aprotic solvent having affinity for It is done by the method of processing in the state of being carried,
  • the carbon number is 2 to 4
  • the symmetrical M anhydride of the alkanoic acid it is more preferable to use a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alnic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride of the arnic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • acetic anhydride as the alkanoic anhydride contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount ratio to the arnic acid anhydride.
  • pK represented by the perfluoroalkanoic acid is used as the perfluoroalkanoic acid contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small ratio with respect to the arnic anhydride.
  • a is preferably a perfluoroalkanoic acid in the range of 0.3 to 2.5.
  • perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms may be used as a perfluoroalkanoic acid contained in a mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount ratio to alkanoic anhydride. It can be used.
  • a linear perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the C2-4 perfluoroalkanoic acid.
  • the content ratio of arlic anhydride and perfluoroalkanoic acid in a mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount relative to arlic anhydride Is more preferably selected in the range of 1 to 20 volumes of perfluoroalkanoic acid per 100 volumes of alkanoic anhydride.
  • reaction system is kept under a dry atmosphere in which oxygen is removed in addition to moisture.
  • the decomposition reaction is stopped and the reaction reagent is removed by diluting and removing the mixed solution using the polar aprotic solvent.
  • the reaction product peptide is coexisted with the basic nitrogen-containing organic compound.
  • a water molecule is acted on, a water treatment is performed, and then the aqueous solution impregnated in the gel carrier is converted into a polar aprotic solvent which does not cause dissolution of the gel substance and has an affinity for water.
  • a mixture containing a series of reaction products obtained by the reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid is used while being supported on the gel carrier.
  • reaction product peptide is coexisted with the basic nitrogen-containing organic compound.
  • a water molecule is acted on, a water treatment is performed, and at the same time, a reaction reagent obtained by combining the perfluoroalkanoic acid and arnic acid anhydride is inactivated and eluted from the gel.
  • the gel carrier may be subjected to a re-dehydration treatment, which is an additional step of water treatment and re-dehydration treatment.
  • the target peptide supported on the gel carrier is subjected to the dehydration treatment.
  • a solution obtained by dissolving an alkanoic anhydride in a dipolar nonprotonic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state is used.
  • the gel carrier is immersed in the mixture to cause alkanoic anhydride to act on the peptide sample of interest in the supported state, and the alkanoic anhydride is previously added to the N-terminal amino group of the peptide of interest.
  • the alkanoic acid anhydride used in the pretreatment step of applying N-acylation protection to the N-terminal, and the alkanoic acid anhydride used in the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid, which is performed thereafter More preferably, the same alkanoic anhydride is used as the acid anhydride.
  • pre-processing step of performing the N-acylation is as follows:
  • the target peptide sample supported on the gel carrier is subjected to a temperature selected from a range of 30 ° C. to 80 ° C.
  • a solution obtained by dissolving an alkanoic anhydride in a dipolar nonprotonic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state is used.
  • the gel carrier is immersed in the sample to cause the alkanoic acid anhydride to act on the peptide sample to be carried in the supported state, and the amino group at the N-terminus of the peptide to be treated is subjected to the above-mentioned N-acylation protection by an acyl group derived from arnic acid constituting the acid anhydride,
  • the gel carrier is subjected to re-dehydration treatment by diluting and removing it using a polar aprotic solvent having an affinity for the corresponding alkanoic acid. It can also be implemented.
  • preparation of a peptide sample to be subjected to separation by gel electrophoresis in advance and supported on the gel carrier is performed as follows.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process flow illustrating characteristic points of an operation procedure in a process of sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a reaction product obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain of poma myoglobin according to the method of the present invention for sequentially decomposing the C-terminal amino acid from the peptide.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a mass spectrometry spectrum of a mixture.
  • FIG. 3 shows that the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain of poma myoglobin is sequentially degraded according to the treatment method described in Reference Example, which sequentially degrades the C-terminal amino acid from the isolated dry peptide.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a mass spectrometry spectrum of a reaction product mixture obtained.
  • Figure 4 shows lysine residues undergoing N-acetylation in the globin 'peptide chain of ⁇ ' myoglobin, and the cleavage of the C-terminal peptide bond of arginine residues by trypsin digestion.
  • FIG. 3 shows the partial amino acid sequences of 31 and 140-153.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is basically a series of peptide sequences that are obtained by sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of a peptide to be analyzed, thereby shortening the peptide.
  • This method employs a method of identifying the removed amino acids based on the difference between the molecular weight of this series of reaction products and the molecular weight of the original peptide. More specifically, mass spectrometry is used as a means of measuring the molecular weight of this series of reaction products and the molecular weight of the original peptide.In the process of ionization, amino acid residues constituting the peptide are used.
  • a mass spectrometer that is more suitable for measurement under conditions that do not cause partial loss of atomic groups, such as MALD I—TOF—M3 (Matr 1 X Assisted Laser Desorption—onization Time—of—F It is preferable to use a light-mass spectrometer try; a matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer).
  • the peptide sample of interest is separated by gel electrophoresis in advance, and a series of peptides is loaded on a gel carrier used in this electrophoresis. After performing the reaction operation, measure the molecular weight of a series of reaction products that are finally formed and the molecular weight of the original peptide.Free treatment from the supported gel carrier immediately before mass spectrometry. By doing this, it is possible to perform highly reproducible measurements even when the sample volume is very small. At that time, using a mass spectrometer, such as a MALD I-TOF-MS device, enables the high molecular weight resolution and accuracy of only the peptide sample portion that forms a single spot on the gel carrier.
  • a mass spectrometer such as a MALD I-TOF-MS device
  • the C-terminal amino acid is successively separated in the same step for a plurality of peptide samples constituting individual spots (or bands), which have been separated by gel electrophoresis in advance. After performing the digestion operation at once, the gel sections of individual spots (or bands) are separated and subjected to subsequent mass spectrometry to include them in the original sample. It is possible to perform C-terminal amino acid sequence analysis of multiple types of peptide samples with high efficiency and uniformity.
  • the gel substance used is to separate individual spots (or bands) for multiple types of peptides corresponding to a specific molecular weight range.
  • the conditions shown, specifically, the content ratio of polyacrylamide constituting the gel are selected to adjust the size of the gap inside the fine hole structure formed inside the gel.
  • the spots (or bands) separated by the two-dimensional electrophoresis method or the SDS-PAGE method for example, have different electrophoretic velocities due to differences in peptide chain molecular weight and surface charge. Is localized.
  • Such a peptide is held inside a fine pore structure formed in the gel, and does not cause the gel-like substance to dissolve when removing water impregnated in the gel-like substance, and Using a method of diluting and eluting only an aqueous solvent into the polar aprotic solvent using a polar aprotic solvent having an affinity for the peptide, the target peptide can be obtained even after the dehydration operation is completed. Can be maintained on the gel carrier at the separated spot (or band) position.
  • the polar aprotic solvent used for the dehydration treatment generally has inferior affinity to a gel-like substance such as polyacrylamide constituting a gel than a water solvent, and therefore has a fine pore structure in the gel-like substance.
  • a suitable polar aprotic solvent is acetonitrile (CH 3 CN) having high affinity for water, etc. Examples thereof include -tolyls having 4 or less carbon atoms, and ketones having 4 or less carbon atoms, such as acetone.
  • a bipolar aprotic material whose bulk volume is reduced due to the above-mentioned dehydration treatment, and which can be infiltrated into the gel substance and can be maintained in a swollen state with respect to the contracted gel carrier, By using the solvent to re-swell, the pores of the fine hole structure are enlarged.
  • a mixed solution of perfluoroalkanoic acid dissolved in a small amount in alkanoic acid anhydride in a dipolar nonprotonic solvent used for swelling of the gel by using a mixed solution of perfluoroalkanoic acid dissolved in a small amount in alkanoic acid anhydride in a dipolar nonprotonic solvent used for swelling of the gel. Then, perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride are uniformly supplied to the peptide carried in the fine pore structure of the gel carrier to act.
  • perfluoroalkanoic acid and the alkanoic anhydride are, for example, at the C-terminal of the peptide via the reaction mechanism described below at the following general formula (III):
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid) to form a 5-oxazolone structure.
  • perfluoroalkanoic acid is used as a proton donor for the dried peptide to increase the proportion of the enol form.
  • the perfluoroalkanoic acid used utilizes its proton donating ability, and the pKa of the perfluoroalkanoic acid is It is preferred to use a perfluoroalkanoic acid having a range of 0.3 to 2.5.
  • Perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable, and specifically, trifluoroacetic acid (CF 3 COOH), pentafluoropropanoic acid (CF 3 CF 2 COOH), heptafluorobutanoic acid (CF 3 COOH) It is more desirable to use CF 2 CF 2 C ⁇ OH).
  • the alkanoic anhydride used preferably gives an appropriate reactivity when heated to the reaction temperature. Therefore, it is preferable to use a symmetrical acid anhydride of an alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms. .
  • a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride, and particularly, a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 carbon atoms.
  • the substance, that is, acetic anhydride can be suitably used. Since such an alkanoic acid anhydride is used for activating the C-terminal carboxy group, it is preferable that the alkanoic acid anhydride does not cause steric hindrance at that time. .
  • the alkanoic anhydride used as the above-mentioned activating reagent is consumed according to the reaction, and therefore, is previously contained in a dipolar aprotic solvent used for swelling of the gel.
  • the content ratio of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid is 100 per volume of alkanoic anhydride and 1 perfluoroalkanoic acid.
  • the content of alkanoic anhydride in the dipolar nonprotonic solvent is more preferably selected in the range of 10 to 30% (vol%). desirable.
  • the reaction time depends on the reaction temperature, the concentration of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid contained in the dipolar aprotic solvent, and in addition to the dehydration treatment using a polar nonprotonic solvent. It is desirable that the appropriate selection be made in consideration of the time required for swelling of the contracted gel carrier. For example, a polyacrylamide gel (12.5% by mass) is subjected to dehydration using the above-mentioned acetate, and then immersed in a dipolar aprotic solvent such as formamide described below.
  • the time required to achieve re-swelling of the gel carrier is, for example, about 3 hours at 40 ° C., so that the entire reaction time is equal to the desired amino acid after re-swelling of the gel carrier. Select the number of residues plus the time required to achieve selective degradation of the C-terminal amino acid.
  • the above-mentioned dipolar aprotic solvent that causes the gel to re-swell can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state, has a relatively small molecular size, and Organic solvents with good affinity are preferred.
  • the enol compound has a high dipolarity that can maintain the ratio of the enol compound, and the alkanoic anhydride of the solute molecule, perfluoroalkane
  • the solvent is an excellent solvent for the acid and the alkanoic acid which is a reaction by-product. It is more preferable to use a dipolar aprotic solvent which hardly volatilizes and evaporates at the above reaction temperature.For example, formamide (HCONH 2 ) and the like are necessary when polyacrylamide gel is used. They are all satisfactory.
  • the reaction system is preferably kept in a dry atmosphere from which water has been removed. That is, the activated C-terminal carboxy group, which is converted into a reaction intermediate represented by the above formula (Ib) and an asymmetric acid anhydride, undergoes hydrolysis when water molecules are mixed into the reaction system. The original terminal force returns to the lipoxy group.
  • the reaction system is preferably maintained in a state where water is removed.
  • the amino acid present in methionine may be oxidized by oxygen mixed in the system, and the formula amount may be changed. Preventing this oxidation by oxygen is more preferable in the method of the present invention based on the measurement of the molecular weight in suppressing the strong oxidation in order to achieve higher accuracy.
  • the target peptide forms an oxidized one S—S— bond with the cysteine of the p-contacting peptide, or forms a single S—S— bond in the same molecule.
  • a conventional reduction treatment is performed in advance to eliminate such cross-linking, and converted to a peptide containing reduced cysteine.
  • the reduced cysteine present in the peptide to be analyzed is subjected to carboxymethylation and pyridylethylation on the sulfonyl group (-SH) of the side chain. The protection is performed in advance.
  • the reduced cysteine when the reduced cysteine is not protected in advance, it is oxidized by oxygen mixed in the system, and in some cases, is again oxidized —S—S— bond There is also concern that it will form.
  • the target peptide is a peptide whose higher-order structure has been eliminated in advance, it is necessary to avoid the formation of an unnecessary single S—S— bond between adjacent peptides.
  • the reaction system In the reaction treatment in the mixed solution using the dipolar aprotic solvent, it is more preferable that the reaction system is kept in a dry atmosphere in which oxygen is removed in addition to water.
  • the atmosphere free from oxygen in a dry atmosphere.
  • the reaction system is kept airtight to prevent water and oxygen from entering from outside the system, and It is also desirable that the injection and discharge operations of the gas be performed in an atmosphere of a dried inert gas, for example, nitrogen.
  • a reaction represented by a reaction formula ( ⁇ ) can be performed from a 5-oxazolone ring once formed, for example:
  • the reaction product obtained is an intermediate product of 5-oxazo other than those having a carboxy group at the C-terminus as shown in the above-mentioned reaction formula (II). Those that remain in the Ron ring structure, or those in which the C-terminus has become an asymmetric acid anhydride as one form of the reaction intermediate, are also mixed.
  • the reaction in the successive step of selectively decomposing the C-terminal amino acid includes a process of forming a 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (Ib) and a reaction formula ( ⁇ '). It consists of a two-step elementary reaction with the process of separating the terminal amino acid by cleavage of the 5-oxazolone ring structure exemplified in the above. Therefore, the overall reaction rate depends on both the reaction rate of each of these processes, but mainly on the concentration of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used, and on the reaction temperature. .
  • the treatment time in the sequential step of selectively decomposing the C-terminal amino acid depends mainly on the concentrations of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used and the reaction temperature, and on the C to be analyzed. Considering the target amino acid length of the terminal amino acid sequence, appropriate:!: Selected.
  • the sequential termination of the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid lowers the temperature of the reaction system and reduces the reaction reagents infiltrating into the gel carrier, i.e., perfluoroal carboxylic acid and arnic anhydride.
  • the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid does not cause the gel-like substance to be dissolved, and the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic anhydride; and
  • the decomposition reaction is stopped and the reaction reagent is removed by diluting and removing using a polar aprotic solvent having an affinity for the dipolar aprotic solvent.
  • a dipolar aprotic solvent used for preparing a mixed solution can be used, but the 5-oxazolone ring system exemplified by the reaction formula (lb) can be used.
  • perfluoroalkanoic acids and alkanoic anhydrides, as well as dipolar non-protonic solvents utilize polar non-protonic solvents that do not contribute significantly to the stability of the phenolic intermediate. It is more desirable to use a protic solvent removal step. At least in the final step of the dilution and removal of the reaction reagent, a dilution / removal operation using a polar aprotic solvent will be provided.
  • polar aprotic solvents satisfying these conditions include nitriles having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile (CH 3 CN) and 4 or less carbon atoms such as acetone. And the like ketones.
  • a carboxy group is not expressed at the C-terminus, which is generated in the sequential step of selectively decomposing the C-terminal amino acid and is exemplified in the above reaction formula (II).
  • a reaction intermediate may be provided with an additional hydrolysis treatment for the purpose of reverting to a form in which a carboxy group is exposed at the C-terminus.
  • the reaction product peptide is coexisted with the basic nitrogen-containing organic compound.
  • Water molecules are acted on, water is applied, and then the aqueous solution impregnated in the gel carrier is caused to dissolve the gel-like substance.
  • a polar aprotic solvent having an affinity for water. It is preferable to provide a re-dehydration step.
  • the reaction product has a form in which a carboxy group is exposed at the C-terminus, and this form gives a major peak when subsequently analyzed by mass spectrometry.
  • identification of a peak indicating a molecular weight corresponding to a series of reaction products can be more easily performed.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound is converted into a 5-oxazolone ring structure represented by the reaction formula ( ⁇ ) and a reaction intermediate (acid anhydride) in the next stage.
  • a reaction intermediate (acid anhydride)
  • it catalyzes the hydrolysis reaction o, it does not itself react with the 5-oxazolone ring structure or a reaction intermediate (acid-free Y water OC substance) to produce unnecessary by-products, and as a suitable base catalyst Function.
  • the polar aprotic solvent used in the re-dehydration step is preferably one having high solubility even for a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine compound.
  • polar aprotic solvents for the redehydration step satisfying these conditions include nitriles having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile (CH 3 CN). Examples thereof include ketones having 4 or less carbon atoms, such as acetone.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used in the above-mentioned hydrolysis treatment reacts, for example, with the remaining C-terminal having reached an asymmetric acid anhydride to form an amide bond. This is preferable because it does not form and when formed into an aqueous solution, a uniform solution can be obtained.
  • a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound having high solubility in a polar aprotic solvent is preferable.
  • pyridine can be more preferably used.
  • the tertiary amine compound that can be used preferably has a basicity similar to the relatively weak basicity of the pyridine base.
  • DMA E (2- (dimethylamino) ethanol: (CH 3 ) 2 N—CH 2 CH 2 OH)
  • DMA E 2, 3- (dimethylamino) ethanol: (CH 3 ) 2 N—CH 2 CH 2 OH
  • pyridine it is preferable to select pyridine in the range of 5 to 15% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • DMAE it is preferable to select DMAE in the range of 1 to 20% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • the above-mentioned hydrolysis treatment involves, after the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid, once diluting the reaction reagents arnic anhydride and perfluoroalkanoic acid using a polar aprotic solvent. Not only after the removal operation has been completed, but also the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and the hydrolysis treatment can be performed continuously. Specifically, the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid is carried out by lowering the reaction temperature and stopping the reaction while adding an aqueous solution containing an organic base.
  • the reaction reagent which is a combination of acids, is deactivated and eluted from the gel, stopping the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and removing the inactive reagent. Subsequently, the reaction product can be subjected to a hydrolysis treatment.Finally, by performing a re-dehydration treatment step using a polar aprotic solvent, it is possible to cope with the alkanoic anhydride together with the aqueous solution containing the organic base. Since alkanoic acid, perfluoroalkanoic acid, and dipolar aprotic solvent are removed and dehydration is performed, once the washing / removal operation using a polar aprotic solvent is once provided in the middle, There will be no difference.
  • the process of using a mixed solution obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the above-mentioned alkanoic anhydride is used.
  • a pretreatment step in which the N-terminal amino group of the peptide of interest is protected in advance by N-acylation protection with an acyl group derived from the arnic acid constituting the alkanoic anhydride.
  • a reaction intermediate is formed in which the C-terminal force of the peptide is activated. It is inferred. If this reaction intermediate reacts with the N-terminal amino group of the adjacent peptide to form an amide bond, a shortened reaction product of the target peptide cannot be obtained.
  • the reaction for producing such a reaction intermediate occurs with respect to the peptide carried in the pore structure in the gel-like substance, the accidental secondary reaction generated between a plurality of peptide reaction intermediates occurs. Although the frequency of the reaction is not high, it is more desirable to apply N-acylation protection in advance.
  • the alkanoic anhydride reacts with the amino group at the N-terminal of the peptide. Since N-acylation usually occurs, N-acylation protection is performed in the system, but it is more preferable to perform pretreatment for N-acylation protection in advance.
  • the pretreatment step of protecting the N-terminal amino group with N-acylsig is a reaction utilizing alkanoic anhydride
  • the alkanoic anhydride is dissolved in a dipolar aprotic solvent similar to the solvent used for preparing a mixed solution obtained by adding a small amount of perfluoroalnic acid to the alkanoic anhydride, and then dissolved. By immersing the dehydrated gel carrier in the solution, the gel carrier swells and infiltrates into the gel-like substance.
  • the intramolecular polarization of alkanoic anhydride is induced and acts on the amino group of the peptide as an electrophilic reagent.
  • the reaction proceeds.
  • a reaction temperature of 50 ° C or higher, but in general, such a reaction is performed in a closed reaction vessel, so that the mechanical strength in the reaction vessel is increased. In consideration of this, it is desirable to select the temperature within the range of 100 ° C. or less.
  • Alkanic acid is produced in association with the N-acylation reaction, but in a small amount. Secondary protons due to the proton-donating ability of the strong alkanoic acid and the coexisting alkanoic anhydride are produced.
  • the reaction is usually not a problem in the above temperature range. More specifically, the alkanoic acid generated in the system has, for example, a much lower acid catalysis and a smaller abundance than perfluoroalkanoic acid.
  • the main reaction in the step of sequentially decomposing C-terminal amino acids using perfluoroalkanoic acid and carboxylic anhydride is described in In this case, the reaction for forming the 5-oxazolone ring structure does not occur until a secondary reaction occurs.
  • the O-acylation reaction proceeds at the serine residue present in the peptide and also at the hydroxy group of the threonine residue side chain, thereby protecting the peptide.
  • the phenolic hydroxy group of the side chain of the tyrosine residue present in the peptide is partially diacylated, though the reactivity is different.
  • the amino group on the side chain of lysine residue, and the hydroxy group on the side chain of threonine residue in the case of serine residue are all protected and modified. And no longer participate in unnecessary side reactions. From this viewpoint as well, it is usually preferable to carry out a pretreatment step of N-acylation protection of the amino group at the N-terminus of the peptide.
  • threonine residues one NH—CH (CH (CH 3 ) OH) -CO-
  • a hydroxy group ( ⁇ ) is present at the 3-position.
  • hydrolysis proceeds by the mechanism described above, and cleavage of the peptide occurs at the N-terminal side of the threonine residue.
  • reaction products derived from these side reactions coexist, in some cases, they may be a factor that hinders the measurement of the target reaction product during mass spectrometry.
  • a branched peptide in which the N-terminal partial peptide is linked to the hydroxyl group (1 OH) at position 3] will have an amide bond at that site.
  • the oxazolone ring structure is not formed, and the selective decomposition of the C-terminal amino acid does not proceed further.
  • a dehydration step is provided in advance to remove water impregnated in the gel, and then select a condition under which water is not mixed into the reaction system.
  • secondary reactions such as cleavage of the peptide chain at the specific amino acid residue or branching of the peptide chain described above occur. The reaction is suppressed.
  • N-acylation protection and O-acylation protection reactions by alkanoic anhydride present at a much higher concentration than perfluoroalkanoic acid proceed simultaneously, resulting in peptide chain cleavage or peptide cleavage. Secondary reactions such as chain branching are further suppressed and avoided.
  • the N-terminal amino group of the peptide was added to the peptide side chain in addition to N-acylich protection.
  • the side chain reaction such as cleavage of the peptide chain or branching of the peptide chain during the selective decomposition process of the C-terminal amino acid is more reliably suppressed. Avoidance can be performed.
  • the content of the alkanoic anhydride in the solution for dissolving the alkanoic anhydride in the dipolar nonprotonic solvent used in this pretreatment step achieves the desired reactivity according to the reaction temperature.
  • the concentration of the alkanoic anhydride in the tonic solvent in the range of 10 to 30% by volume, for example, about 10% by volume.
  • the reaction temperature is in the range of 30 ° C. to 80 ° C., preferably in the range of 50 ° C. to 80 ° C., more preferably It is preferable to select such a reaction temperature around room temperature or within a range slightly higher than room temperature. More specifically,
  • the reaction time depends on the reaction temperature, the concentration of the alkanoic anhydride contained in the dipolar aprotic solvent, and the gel carrier that shrinks due to the dehydration treatment using the polar aprotic solvent. It is desirable to select an appropriate value in consideration of the time required for swelling.
  • the solution dissolving the used arnic acid anhydride in the dipolar aprotic solvent is removed, and the polar non-protonic solvent used in the above-mentioned dehydration treatment step is further removed. It is desirable to dilute and remove the alkanoic anhydride, the dipolar aprotic solvent, and the alkanoic acid formed, which are impregnated in the gel. That is, when the alkanoic anhydride solution impregnated in the gel remains, the peralkanoic acid is then added to the alkanoic anhydride to be used in the step of selectively decomposing the C-terminal amino acid.
  • the perfluoroalkanoic acid does not rapidly enter the inside of the gel.
  • the polar aprotic solvent used in the dehydration step is used to remove the alkanoic anhydride solution impregnated in the gel. It is desirable to dilute and remove.
  • the operation of terminating the reaction and removing the reaction reagent is performed by lowering the temperature instead of diluting and washing with a polar aprotic solvent and reducing the temperature of the decomposition reaction.
  • water is added to inactivate the alkanoic anhydride in the reaction reagent and elute the alkanoic anhydride and the corresponding alkanoic acid in the gel, thereby terminating the reaction and removing the reaction reagent
  • the water in which the gel carrier is immersed is diluted and removed using the polar aprotic solvent used in the above-described dewatering process. It is necessary to perform a dehydration treatment. That is, if water remains in the gel carrier,
  • the method for selectively decomposing a C-terminal amino acid according to the present invention can be carried out in a form including all of a dehydration step, a pretreatment step, a step of selectively decomposing a C-terminal amino acid, and a post-treatment step. It is more preferable.
  • the reagents used in that step are removed from the gel to stop each reaction. Therefore, as described above, a dilution / washing operation using a polar aprotic solvent similar to the polar aprotic solvent used in the dehydration treatment step is provided.
  • the gel carrier can be temporarily stored in a state of being immersed in the polar aprotic solvent during the next step.
  • the gel carrier can be temporarily stored after the polar aprotic solvent is evaporated and removed to make it dry.
  • the molecular weight of a series of reaction products prepared by the sequential removal of the C-terminal amino acid and the molecular weight of the original peptide are determined by mass spectrometry. It is determined by using the measurement results obtained by the method, and the amino acids corresponding to the difference in the molecular weight are specified. Therefore, it is usually desirable that the original peptide remains in the mixture subjected to the measurement by the mass spectrometry so that its molecular weight can be specified.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is applied to the analysis of a C-terminal amino acid sequence up to about 10 amino acids in length. It is desirable that the content ratio of a series of 10 or more reaction products be the one with the minimum content ratio but the maximum content ratio, but at least not less than about 10: 1. It is also desirable that the residual amount of the original peptide does not fall below lZi0 at least with respect to the reaction product with the maximum content ratio. Good.
  • the required C-terminal amino acid sequence information is often within 10 amino acids, and if the treatment time is selected to such an extent that decomposition of about 10 amino acids proceeds, it is possible to satisfy the condition regarding the content ratio of the above. .
  • mass spectrometry is used to measure the molecular weight, but during the ionization process, fragmentation is partially generated from amino acid residues that make up the peptide, and ionization is performed under conditions that suppress fragmentation. Measurement using a mass spectrometer equipped with means is more suitable. Further, peptides and the like have a high molecular weight, and it is preferable to use a mass spectrometer suitable for measurement of such a high molecular weight, for example, a MALDI_TOF-MS device.
  • a peptide sample to be analyzed is subjected to a series of treatments in a state in which the peptide sample to be analyzed is separated by gel electrophoresis in advance and is supported on a gel carrier.
  • the treated reaction product is selectively released and recovered from the spot on the gel, and subjected to mass spectrometry. At that time, the corresponding cation and anion species are removed. It is preferable to use a MA LDI-TOF-MS device that can measure both.
  • the maximum measurable amino acid length of the peptide must not exceed 20 to 30 amino acids. Is desirable.
  • the corresponding amino acid is identified based on the difference in molecular weight, it is possible to distinguish between amino acid residues having a difference in formula weight of 1, such as Asn and Asp, and Gln and Glu, with high accuracy.
  • the molecular weight of the longest peptide serving as a reference i.e., the peptide from which the C-terminal amino acid has not been removed, does not exceed 300, more preferably does not exceed 200,000. Is more preferable.
  • the length be at most 30 amino acids, more preferably not more than 20 amino acids.
  • specificity of a cleaved amino acid sequence site Specific cleavage of the peptide is carried out using a protease having Of the amino acid length range.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of peptides according to the present invention can be applied. That is, in the present invention, although the peptide can be eluted from the gel carrier by performing a specific fragmentation treatment, the reaction product obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid is placed on the gel carrier.
  • the main object is one that maintains the state of being carried, specifically, one in which the number of amino acid residues in the original peptide chain is at least 50 amino acids or more, and usually 100 amino acids or more.
  • the specific cleavage of the peptide using a protease having the specificity of the cleaved amino acid sequence site is usually carried out after the above-mentioned post-treatment step of performing the hydrolysis treatment. Specifically, after completion of the post-treatment step, a diluting / washing operation using a polar aprotic solvent, and a re-dehydration treatment are performed, and the peptide supported on the gel carrier is renewed. An aqueous solution containing the protease is allowed to act on the chain.
  • the peptide chain carried on the gel carrier is cut into a plurality of peptide fragments as a result of cleavage at the specific cleavage amino acid sequence site by the action of a protease that penetrates into the hole structure in the gel.
  • proteases that can be used for peptide fragmentation by proteases on this gel carrier include trypsin, which cleaves the C-terminal peptide bond of lysinanoleginin residue, and C-terminal peptide bond of glutamic acid residue. It is possible to use commonly used proteases for processing peptide fragmentation, such as the V8 enzyme that cleaves.
  • the specific cleavage treatment of the peptide is performed by digestion of a protease having the specificity of the cleavage amino acid sequence site, for example, chemical cleavage such as CNB r having a specificity of cleavage of the methionine residue at the C-terminal amide bond. It is also possible to use a cleavage method that uses an appropriate reagent. Such a protease digestion or a chemical cleavage method is applied to obtain a C-terminal peptide fragment obtained from a long amino acid-length peptide chain in a desired amino acid length range.
  • the number of cleavage sites in chemical cleavage is, for example, about 10 to 2, preferably about 7 to 3, per 100 amino acids. If the cleavage site is present at the above frequency, the average amino acid length of the obtained peptide fragment can be 10 to 50 amino acids, preferably 15 to 35 amino acids, and accordingly, the C-terminal side Peptide fragments can also be in the amino acid length ranges described above. That is, for example, in the molecular weight measurement using a MA LDI-TOF-MS device, a C-terminal peptide fragment having a suitable molecular weight range can be prepared.
  • the peptide chain carried on the gel carrier is retained in the pore structure in the gel due to its long amino acid length, but the peptide fragmentation treatment shortens the amino acid length.
  • the peptide fragments are easily released from the gel carrier and elute, for example, in a protease solution. With this fragmentation treatment, peptide fragments eluted from the gel carrier are recovered. Next, for example, desalting treatment is performed to separate from the components contained in the buffer solution, and the crude peptide fragments are dried and recovered.
  • a long peptide such as a protein constituting a three-dimensional structure
  • one SS—S— bond is formed between cysteine residues in a long peptide due to protein folding.
  • the C-terminal portion of the peptide is in a state where it does not constitute a secondary structure, for example, after being subjected to a deforming treatment, the peptide sample is subjected to the second step. It is desirable to separate a single spot on a gel carrier by gel electrophoresis such as two-dimensional electrophoresis or SDS-PAGE.
  • the defolding state is applied, for example, to complete a series of chemical processing steps, and to perform specific fragmentation processing of the peptide using the above-mentioned protease before mass spectrometry.
  • there is an advantage that the separation of the obtained C-terminal peptide fragment is generally easy even when it is necessary to carry out the reaction.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention includes not only determining the C-terminal amino acid sequence of a linear peptide, but also, for example, determining the amino acid sequence of a cyclic peptide. It can be opened in advance, converted into a linear peptide, and applied to its C-terminal amino acid sequencing. More specifically, various microorganisms and the like produce a cyclic peptide-type compound having a biological activity, and can be used for determining the partial amino acid sequence thereof. Furthermore, some proteins have a form in which a plurality of peptide chains form a single SS bond between cysteine residues between the chains.
  • This single S—S— bond is reduced, cross-links between cysteine residues are eliminated, individual peptide chains are separated into individual spots by gel electrophoresis, and the C-terminal amino acid sequence is analyzed.
  • the peptide sample of interest is converted into a linear peptide, which is subjected to separation by gel electrophoresis in advance to obtain a single spot supported on the gel carrier.
  • the gel electrophoresis method is not limited to the conventional SDS-PAGE method in which electrophoresis is performed in one-dimensional direction, but also performs two-dimensional electrophoresis on a gel to achieve higher separation. The law may be applied. Suitable for such two-dimensional electrophoresis Even if the peptide sample to be separated is free from contaminants and has a smaller sample volume, the C-terminal amino acid sequence analysis method of the present invention allows the C-terminal amino acid sequence analysis to be performed. It becomes possible.
  • the target peptide that forms a single S—S— bond between cysteine residues in the molecule is 2-sulfanylethanol (HS—C 2 H 4 - OH: 2-mercaptoethanol), DTT (dithiothreitol: threo one 1, 4-Jisurufa two Lou 2, 3-heptane diol) by adding a reducing reagent, such as, electrophoresis under reducing conditions It is preferable to perform single spotting.
  • a single S—S— bond between cysteine residues in the molecule is reduced in advance, and a modification of reduced cysteine, such as carboxymethylation using eodoacetic acid, is performed. It is preferable to perform single spotting.
  • the C-terminal fragment derived from a series of reaction products obtained by sequentially decomposing C-terminal amino acids by the peptide fragmentation treatment with a protease on the gel carrier described above By measuring the molecular weight of fragments derived from the middle part of the peptide chain and the N-terminal side, the fragments present in the original peptide chain In the amino acid sequence of the entire peptide chain as the origin, such as the interval between the locations of the cleavage amino acid sequence sites specific to the protease and the presence of the specific cleavage amino acid sequence site at the N-terminal of the C-terminal fragment.
  • the N-alkanoyl for the N-terminal amino group is used.
  • N-alkanoylation of the lysine residue one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-) to the ⁇ -position amino group, and simultaneously, the serine residue (one NH—CH ( CH 2 ⁇ H) -CO-) ⁇ Threonine residue (one NH-CH (CH (CH 3 ) OH) -CO-) O-alkanoylation of the hydroxyl group, tyrosine residue (one NH—CH
  • the neutralization of (CH 2 -C 6 H 4 -OH) 1 C 0-) to a phenolic hydroxy group is carried out.
  • the ester bond to the alcohol-type hydroxy group is more rapidly formed as compared with the ester bond to the phenol-type hydroxy group, accompanying the hydrolysis treatment in the presence of the organic nitrogen base. Hydrolysis is performed.
  • the N-alkanoylation of the N-terminal amino group and the lysine residue one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-
  • N-Al force to the amino group at the ⁇ -position and in some cases, tyrosine residue (one NH—CH (CH 2 -C 6 H 4 Only the alkanolization of -OH) -CO-) to the phenolic hydroxy group will remain.
  • the molecular weight difference between the multi-acetylated product and the deacetylated product is high.
  • the molecular weight difference between the multi-acetylated product and the deacetylated product is high.
  • an integral multiple of the formula weight 42, specifically, 84, 126, 168 is a formula weight of the serine residue (—NH—CH (CH 2 OH) —CO—) 87, Glutamine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 -CONH 2 ) —CO—) Formula 1 28, Glutamic acid residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 -COOH) -CO-) Formula weight of 129, similar to the formula weight of N-acetyl-lysine residue (_NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH—COCH 3 ) -CO-) 1 70, and in some cases multi-acetylation There is a concern that the body which is misidentified as a main peak and which has been deacety
  • heme protein consisting of 153 amino acids, and myoglobin derived from poma, were obtained by analyzing the C-terminal amino acids of the protein partial globin and peptide chains. Analysis of the acid sequence was performed.
  • the amino acid sequence possessed by the gamma myoglobin globin peptide chain used as the analysis sample used in the present example has already been determined, and the accuracy of the C-terminal amino acid sequence identification by the analysis method according to the present invention has been known. Verified.
  • a peptide solution containing only a globin peptide chain portion at a concentration of 0.2 ⁇ g Z i L is prepared for a commercially available puma myoglobin sample.
  • the antioxidant treatment is performed in advance by adding a reducing reagent such as DTT or DTT.
  • This peptide solution is spotted on a polyacrylamide gel with a gel concentration of 12.5% by mass. After electrophoresis, the band of the desired globin 'peptide chain is identified by Coomassie' staining. In this example, the gel of the strong stained band is cut out, and the gel slice is subjected to the following series of operations.
  • the gel slice is placed in an airtight tube, 1 ml of acetonitrile is poured, and the mixture is stirred for 15 minutes. Thereafter, the acetoetrile is discarded, and acetonitrile lm1 is newly added, and the mixture is further stirred for 15 minutes. Extraction of water impregnated in the gel using this acetonitrile is performed three times in total, and the gel is dehydrated. The gel volume shrinks during the dehydration treatment.
  • the gel which has initially shrunk in volume, re-swells and returns to its original volume according to the infiltration of the solvent formamide.
  • the solute acetic anhydride acts on the globin 'peptide chain carried in the re-swollen gel at the above-mentioned heating temperature.
  • a selective acetylation reaction proceeds to the N-terminal amino group of the peptide.
  • the formamide solution of acetic anhydride is removed and placed in a tube container. Inject 1 ml of acetonitrile and stir for 15 minutes. Thereafter, the aceto-tolyl was discarded, 1 ml of acetonitrile was newly added, and the mixture was further stirred for 15 minutes. Extraction of the formamide solution impregnated in the gel using this acetonitrile is performed three times in total, and the solvent removal (formamide) treatment in the re-swelled gel is performed. The gel volume shrinks due to the solvent removal treatment, and at the same time, the gel is dehydrated. .
  • heptafluorobutanoic acid (HFBA: C 3 F 7) was placed in the tube containing the gel slice in a state in which the obtained globin / peptide chain decorated / protected by the acetyl group was supported in the gel.
  • COOH 1 volume 0/0
  • injecting formamide 1 ml of acetic anhydride 10 volume 0/0.
  • the temperature of the whole container is heated to 40 ° C. while stirring the stoppered container, and the temperature is maintained at that temperature for 16 hours.
  • the gel which has initially shrunk in volume, re-swells and returns to its original volume according to the infiltration of the solvent formamide.
  • HFBA and acetic anhydride By causing HFBA and acetic anhydride to act on the C-terminal of the peptide chain carried in the re-swelled gel at the above-mentioned heating temperature, the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid of the peptide chain proceeds.
  • keto-enol tautomerized isomerization represented by, and acetic anhydride acts on the C-terminal carbonyl group.
  • DMAE ((CH 3 ) 2 N-CH 2 CH 2 OH) 1 m 1 of a 10% by volume aqueous solution was placed in the container containing the gel slice in which the mixture containing the reaction product was supported. Inject. While stirring the stoppered container, the temperature of the entire container is heated to 60 ° C. and maintained at that temperature for 1 hour. At this time, the gel that has been dehydrated rapidly re-swells and returns to its original volume as the solvent water infiltrates. By causing water molecules to act on the peptide chains and reaction products carried in the re-swelled gel in the presence of the basic nitrogen-containing organic compound at the above-mentioned heating temperature, the water treatment proceeds.
  • the hydrolysis treatment in this post-treatment is mainly that in the mixture, the C-terminus of the reaction product peptide remains in a 5-oxazolone structure other than the one converted to a carboxy group, or an asymmetric acid anhydride Since the product that has progressed to the conversion into a product is also in the form of a contained mixture, it is subjected to a hydrolysis treatment to convert the C-terminus of the peptide into a carboxy group.
  • a serine residue one NH—CH (CH 2 ⁇ H) —CO 2 -
  • Yato threonine residues one NH- CH (CH (CH 3) OH) O- against hydro alkoxy groups present -CO-
  • Asechirui spoon protected is hydrolyzed, deprotected is made, also, Chi port Shin residue partially proceeds to the hydrolysis of O- Asechiruihi protection to phenolic hydroxyl groups of (an NH- CH (CH 2 -C 6 H 4 -OH) -CO-).
  • N-terminal amino group with higher selectivity has a higher selectivity.
  • the aqueous solution remaining in the container is removed, 1 ml of acetoethrile is poured into the container, and the mixture is stirred for 15 minutes. Thereafter, the acetonitrile is discarded, 1 ml of acetonitrile is newly added, and the mixture is further stirred for 15 minutes. Extract the aqueous solution impregnated in the gel using this acetonitrile three times in total, and perform the dehydration treatment in the re-swelled gel. Gel volume shrinks during dehydration.
  • globin-peptide chain of ⁇ ma 'myoglobin is composed of 153 amino acids, it deviates from the appropriate molecular weight range in mass spectrometry, and is subjected to tryptic digestion peptide fragmentation.
  • a trypsin-containing aqueous solution is added to a container in which the above-mentioned post-treated and dehydrated gel slices are placed, and the fragment of the peptide chain is kept in a state of being supported on the gel carrier. Perform the conversion.
  • the aqueous solution containing trypsin was prepared by adding trypsin to 0.067 ⁇ m in ammonium bicarbonate buffer solution (pH 8). It is contained at a concentration of L. Tryptic digestion is performed at 37 ° C for 4 hours with stirring and enzymatic reaction. At that time, the gel that has been dehydrated rapidly re-swells and returns to its original volume as the solvent water infiltrates. By causing the trypsin infiltrating into the gel to act on the peptide chain and the reaction product carried in the re-swelled gel together with the buffer at the heating temperature, enzymatic digestion specific to trypsin is performed. proceed.
  • the peptide chain and the reaction product can also be deprotected in the above-mentioned post-treatment step to N-acetylation of the N-terminal amino group and lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) to the N-acetylated amino group at the ⁇ -position is maintained, and the N-acetylated lysine residue may be digested by trypsin digestion. The cleavage of the c-terminal peptide bond is not performed, but only the cleavage of the C-terminal peptide bond of the algyun residue proceeds.
  • the amino acid sequence possessed by the globin-peptide chain of the pima 'myoglobin has already been determined, and the original peptide chain consisting of 153-amino acids shown in FIG.
  • the fragments containing the partial amino acid sequences of 9, 140-153 are subjected to trypsin digestion. Therefore, a series of reaction products generated by the above-described sequential decomposition treatment of the C-terminal amino acid include each C-terminal amino acid together with the C-terminal fragment containing the partial amino acid sequence of 140-153 amino acid.
  • the fragmented peptides eluted from the gel into the trypsin solution in the container are recovered. After subjecting the solution containing the recovered peptide fragment mixture to desalting treatment, perform freeze-vacuum drying treatment.
  • reaction products after peptide fragmentation by post-treatment and trypsin digestion The reaction products after post-treatment and peptide fragmentation and the C-terminal fragment of globin 'peptide chain obtained by performing the above series of treatments for the mixture, the molecular weight of each contained peptide fragment is measured by mass spectrometry.
  • a mass spectrometer specifically, a MALDI-TOF-MS device was used for the peptide fragment mixture sample that had been subjected to the above-mentioned drying treatment, and the main ion reflecting the molecular weight of each peptide fragment was used. Measure and compare the species peak mass and its relative signal strength.
  • so-called "negative 'mode" measurement in which negatively charged ion species are guided to a detector, is employed for separation of ion species.
  • FIG. 2 shows a mass spectrometry spectrum measured for a mixture containing a tryptic digested fragment of the reaction product that has been subjected to the sequential decomposition treatment of the C-terminal amino acid in the above-described series of treatment methods in this example.
  • Table 1 shows the mass values of the measured peaks and the original globin It shows the difference from the mass value of the peak due to the C-terminal fragment of the peptide chain, and the amino acids removed from each reaction product fragment and the morphology of each reaction product specified therefrom.
  • the partial amino acid sequence of the C-terminal fragment consisting of 140 to 153 amino acids is N-acetylated on two lysine side chains, NDI AAK (Ac) YK (Ac ) It is ELGFQG, and the series of peaks shown in Fig. 1 is confirmed to correspond to the sequential degradation of two amino acids, glycine and glutamine, from the C-terminus. That is, it is verified that the peptide chain separated as a band on the above-mentioned gel slice to be analyzed is actually a globin ′ peptide chain.
  • a peptide solution containing only a globin-peptide chain portion at a concentration of 1.0 ⁇ g ZL prepared from a commercially available puma myoglobin sample. Transfer the peptide solution into a test tube and freeze-dry to prepare a dry peptide powder sample. (Pre-processing operation)
  • the vial containing the dried peptide sample was placed in a glass-sealed reaction vessel of a stoppered airtight test tube type equipped with a port for evacuation sealed with a Teflon cock-valve.
  • a predetermined amount of the following liquid reagent is separately placed in a reaction vessel.
  • acetic anhydride 300 wL to which 5% by volume of acetic acid was added was used.
  • the vial containing the dried peptide sample was placed in the glass reaction vessel, and then the reaction vessel was cooled. Is evacuated and hermetically sealed.
  • the whole of the hermetically sealed reaction vessel is kept at 50 ° C for 2 hours, and vaporized acetic anhydride and acetic acid supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried peptide sample.
  • acetic anhydride as the acylating reagent in the presence of acetic acid on a dried peptide sample, an acetyl / Reich reaction selective for the N-terminal amino group of the peptide proceeds.
  • N-acetylation of the lysine residue one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—
  • Serine residue (1-NH—CH (CH 2 OH) -CO-) ⁇ Preferable acetylation of hydroxy group present in threonine residue
  • (1-NH—CH (CH (CH 3 ) OH) -CO-) O-acetylation of a tyrosine residue (—NH—CH (CH 2 —C 6 H 4 —OH) —CO—) to a phenolic hydroxy group is performed.
  • the obtained vial holding the globin / peptide chain modified / protected by the acetyl group was placed in an airtight test tube-type glass reaction vessel with a stopper, and the glass reaction was performed. Separately, add prescribed amounts of the following liquid reagents into the container.
  • the whole of the hermetically sealed reaction vessel is kept at 40 ° C. for 3 hours, and acetic anhydride and HFBA supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried peptide sample. Meanwhile, HFBA and acetic anhydride are allowed to act on the C-terminal of the peptide chain at the above-mentioned heating temperature.
  • the sequential decomposition reaction of the amino acid at the C-terminal of the peptide chain proceeds. After the selective decomposition treatment of the C-terminal amino acid is completed, unreacted acetic anhydride, HFBA, etc. remaining in the reaction vessel are distilled off under reduced pressure, and the remaining acetylation protection / modified globin Drying of the mixture of the peptide chain and the resulting reaction product.
  • the vial holding the dried sample of the mixture containing the reaction product was attached to the same glass-sealed test tube-shaped reaction vessel with a stopper, and separately placed in the glass reaction vessel. A predetermined amount of the following liquid reagent is added.
  • This post-treatment is mainly carried out in the above-mentioned mixture, except that the C-terminus of the reaction product peptide remains in a 5-oxazolone structure other than that converted into a carboxy group, or is an asymmetric acid anhydride. Since the mixture that has progressed to the conversion into a mixed state is still contained, it is subjected to a hydrolysis treatment to convert the C-terminal of the peptide into a carboxy group. That is, as a liquid reagent for post-treatment, an aqueous solution (300 iL) in which 10% by volume of DMAE was dissolved was used, and a vial containing a dry sample was stored in the glass reaction vessel. Under cooling, the inside of the reaction vessel is evacuated and sealed in an airtight state.
  • the whole hermetically sealed reaction vessel is heated at 60 ° C. for 1 hour, and vapor DMAE and water molecules supplied from the liquid reagent in the vessel are allowed to act on the dried sample.
  • the asymmetric acid anhydride and 5-oxazolone structure are formed in the presence of the organic base, DMA E, By the action of water molecules, water is added and converted into a form having a carboxy group at the C-terminus.
  • the globin 'peptide chain of' myoglobin ' is composed of 153 amino acids, it deviates from an appropriate molecular weight range in mass spectrometry, and is subjected to peptide fragmentation by trypsin digestion.
  • a sample obtained by drying the mixture of the post-treated reaction product is placed in a container, an aqueous solution containing trypsin is added, and fragmentation of the peptide chain is performed.
  • the aqueous solution containing trypsin contains trypsin at a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ L in 3-pyridine acetate buffer (pH 7), and the trypsin digest is stirred at 37 ° C. While performing the enzyme reaction for 8 hours.
  • reaction solution After trypsin digestion, the reaction solution is subjected to desalting treatment using Zip Tip, separation and recovery of peptide fragments, and then vacuum drying of these peptide fragments.
  • reaction product after peptide fragmentation by post-treatment and trypsin digestion The reaction product after post-treatment and peptide fragmentation and the C-terminal fragment of globin 'peptide chain obtained by performing the above series of treatments
  • the molecular weight of each contained peptide fragment is measured by mass spectrometry.
  • the mass of the main ion species peak which reflects the molecular weight of each peptide fragment, was measured using a mass spectrometer, specifically, a MALD I-TOF-MS device, for the dried peptide fragment mixture sample. And the relative signal strength is measured and compared.
  • a MALD I-TOF-MS device so-called negative mode measurement, in which a negatively charged ion species is guided to a detector, is employed for the separation of ion species.
  • Figure 3 shows the mass spectrometry spectrum measured for the mixture containing the tryptic digested fragments of the reaction products that had been subjected to the sequential degradation of the C-terminal amino acid in the series of treatments described in this reference example.
  • Table 2 shows the measured mass of the peak, the difference from the mass of the peak due to the C-terminal fragment of the original globin / peptide chain, and the amino acids removed from each reaction product fragment identified therefrom.
  • each reaction Indicates the form of the product.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide comprises the steps of sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of the peptide; After separation by electrophoresis, the gel carrier dehydrated using a polar aprotic solvent while being supported on the gel carrier, and the gel carrier shrunk by the dehydration process is removed.
  • the perfluoroalkanoic acid is dissolved in a dipolar aprotic solvent in a small ratio to the alkanoic anhydride in a dipolar aprotic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and maintain the swelling state.
  • the gel carrier is re-swelled at a temperature selected in the range of 30 ° C to 80 ° C by immersion in a mixed solution containing
  • a series of reaction products are prepared by reacting alkanoic anhydride with perfluoroalkanoic acid, passing through the 5-oxazolone structure, and decomposing the C-terminal amino acid with cleavage of the 5-oxazolone ring.
  • the control and controllability of the maximum amino acid length of the shortened C-terminal amino acid sequence, which is achieved in a series of obtained reaction products, is improved. it can. Therefore, in addition to the excellent controllability in sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of this peptide, and the advantages of mild reaction conditions, for example, the permissible range of variation in the reaction temperature, After performing separation by gel electrophoresis in advance, analysis is performed while the gel is supported on the gel carrier.Therefore, the complicated steps of separating and recovering from the gel carrier are omitted, and The method has the practical advantage that sample loss due to low yield can be avoided, and the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a more versatile analysis method.

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Abstract

　本発明は、ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する際、ペプチド途中におけるペプチド結合の切断などの好ましくない副次反応を抑制でき、その化学的な処理を汎用性の富む条件で実施することが可能な、逐次的Ｃ末端アミノ酸の分解反応手段を利用したペプチドのＣ末端アミノ酸配列解析方法として、　予めゲル電気泳動法により分離した対象ペプチドを、ゲル上に担持状態のままで、脱水処理を施し、双極性非プロトン性溶媒中、少量のパーフルオロアルカン酸をアルカン酸無水物に加えた混合溶液中に浸漬し、３０℃～８０℃の範囲の温度で、ゲル担体の再膨潤と、５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴うＣ末端アミノ酸の分解により得られる一連の反応産物の分子量減少に基づき、Ｃ末端アミノ酸配列を特定する方法を提供する。

Description

明 細 書
ぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法 - 技術分野
本発明は、 ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法に関し、 より具体的 には、 少なくとも、 5 0アミノ酸以上、 通常、 1 0 0アミノ酸以上のペプチド鎖 からなるタンパク質など、 ゲル電気泳動法による分離がなされるぺプチドに関し て、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、 化学的方法により該ペプチドの C末 端アミノ酸を逐次的に分解して、その反応産物の分子量を質量分析により決定し、 逐次的に除去される一連のアミノ酸に起因する分子量減少に基づき、 C末端アミ ノ酸配列を解明する方法に関する。 背景技術
天然より採取されるペプチドやタンパク質に関して、 そのアミノ酸配列の同定 は、 力かるペプチドやタンパク質の生物学的性質、 機能を研究する際、 不可欠な 情報である。 現在、 ペプチドやタンパク質の全アミノ酸配列は、 対応する遺伝子 情報、 すなわち、 これらのペプチドをコードしているゲノム遺伝子や m_ R NA より調製された c _ D NAの塩基配列に基づき、 推断されるアミノ酸配列として 決定されている。 その際、 該ペプチドをコードしているゲノム遺伝子や m— R N Aより調製された c—D N Aを特定する上では、 ぺプチドの部分的なァミノ酸配 列の知見は、 依然として必要である。
このべプチドの部分的なァミノ酸配列の知見としては、 一般に、 ぺプチドの N 末端アミノ酸 列と C末端アミノ酸配列とが、 特に有用とされている。 具体的に は、 例えば、 多数の m_ R NAより調製された c一 D NAライブラリーから、 目 的とするペプチドをコードしている c一 D N Aを選別する際、 仮に、 N末端アミ ノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが判明していると、 かかる両末端のアミノ酸配 列に基づき、 作製された核酸プローブを利用して、 目標とする c一 D NAを選別 することが可能となる。 あるいは、 両末端のアミノ酸配列に基づき作製されたォ リゴヌクレオチド ·プライマーを利用して、 PCR法を適用して、 目標とする c _ D N Aを選択的に増幅することも可能となる。
ぺプチドの N末端アミノ酸配列を解析する手法としては、従来から、予め単離 · 精製を行ったペプチド純品に、 エドマン分解を適用して、 N末端アミノ酸を逐次 的に分解しつつ、 生成するアミノ酸誘導体を同定する手法が利用されている。 一 方、 ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する手段として、 同じくペプチド純品 に対して、 化学的手法により C末端アミノ酸を逐次的に分解し、 その反応産物と して得ら^る短縮されたぺプチドと元のぺプチドとの分子量差から、 分解された C末端アミノ酸を特定する方法が既に提案されている。 例えば、 化学的手法によ り C末端アミノ酸を逐次的に分解する手段として、 90°Cに加熱しつつ、 乾燥し たペプチド純品に、 ペンタフルォロプロパン酸 （CF3CF2COOH) 高濃度水 溶液、 あるいは、 ヘプタフルォロブタン酸 （CF3CF2CF2COOH) 高濃度 水溶液から発生した蒸気を作用させて、 前記パーフルォロアルカン酸により促進 される、 C末端アミノ酸の選択的な加水分解を行わせる方法が提案されている（T s u g i t a, A. e t a 1. , Eu r. J . B i o c h em. 2 06, 691— 696 ( 1992 ))。 加えて、 前記パーフルォロアルカン酸 高濃度水溶液に代えて、無水ペンタフルォロプロパン酸（（CF3CF2CO) 2〇） のァセトニトリル溶液、 無水ヘプタフルォロブタン酸 （（CF3CF2CF2C〇） 20) のァセトニトリル溶液を利用し、 例えば、 一18°Cに冷却しつつ、 この溶液 から発生した蒸気を乾燥したぺプチド純品に作用させて、 前記パーフルォロアル カン酸無水物により促進される、 C末端アミノ酸の選択的な分解を行わせる方法 が提案されている （T s u g i t a, A. e t a 1., C h e m. L e t t . 1 992, 235-238 ; Ta k amo t o K. e t a 1. , Eu r. J . B i o c h em. 228， 362— 372 (1 995))。 前記の乾燥したペプチド純品に、 気相から蒸気として供給されるパーフルォロ アルカン酸、 あるいは、 パーフルォロアルカン酸無水物を作用させ、 C末端アミ ノ酸の選択的な分解を行う手法では、 下記する反応式 （I ) で表記される脱水反 応：
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
により、 C末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造が一端形成 される。 次いで、 パーフルォロアルカン酸がこのォキサゾロン環に作用し、 次に 示す反応式 （II) で表記される反応：
Figure imgf000005_0003
が生じ、 結果的に、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると報告され ている。
上記の C末端ァミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、 所定の処理時間が 経過した時点で、 元のペプチドに対して、 1〜1 0数アミノ酸残基がその C末端 からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。 この一連の反 応産物を含む混合物に対して、 質量分析法を適用して、 各反応産物に由来するィ オン種の質量を測定すると、 c末端ァミノ酸配列を反映した質量差を示す一連の ピークが測定できる。 具体的には、 各反応産物は、 元のペプチドから逐次的な C 末端アミノ酸分解反応で生成される結果、 例えば、 元のペプチドから数アミノ酸 残基が除去された反応産物までの、 数種の一連の反応産物群に関して、 質量分析 法を利用することで、 対応するイオン種の質量を一括して分析することができ、 かかる数アミノ酸残基分の C末端アミノ酸配列を一括して決定できる。
なお、 例えば、 核酸プローブやプライマーの作製に利用する c末端アミノ酸配 列の情報は、 通常、 力かるアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 1 8塩基 長〜 2 4塩基長程度、 従って、 6アミノ酸〜 8アミノ酸程度であってもよく、 1 0数ァミノ酸残基に達する C末端ァミノ酸配列の解明を必要とするのは、 極めて 特殊な場合のみである。 従って、 上記のパーフルォロアルカン酸またはパーフル ォロアルカン酸無水物の蒸気を気相から供給しつつ、 乾燥したぺプチドに作用さ せて、 逐次的な C末端アミノ酸分解反応により、 例えば、 1 0アミノ酸残基の除 去に達する一連の反応産物を同時に含有する処理試料を調製するこれらの手段は、 前記の用途に適合したものである。 発明の開示
これらパーフルォロアルカン酸またはパーフルォロアルカン酸無水物の蒸気を 気相から供給しつつ、 乾燥したペプチドに作用させる手法は、 有用な C末端アミ ノ酸配列の解明手段ではあるものの、 気相から供給される反応試薬を利用する反 応であるため、 分析対象となるペプチド試料は、 単離 ·精製を施し、 さらに、 乾 燥処理を行ったペプチド純品とした上で、 かかる解析手段を適用していた。 従つ て、予め単離.精製を実施した後、乾燥済みのペプチド純品が入手できることが、 かかる気相から供給される反応試薬を利用する解析方法の適用の前提となってい た。
一方、そのァミノ酸配列は既に判明している、既知のぺプチドゃタンパク質が、 特定の細胞組織内に存在しているか否かを確認する手段としては、 特定の細胞組 織内から採取された、 多数のペプチドやタンパク質を含む混合試料について、 ゲ ル電気泳動法による分離を行う方法、 例えば、 S D S— P A G E法では、 ポリア クリルアミ ド ·ゲル担体上で、 その分子量に応じたスポットを示す、 各ぺプチド やタンパク質の存在を確認する手法が汎用されている。 あるいは、 等電点泳動法 を利用して、 ペプチドやタンパク質をその等電点に応じて、 分離するスポットに 単離する手法が汎用されている。 加えて、 二次元電気泳動法では、 二種の泳動法 を組み合わせる結果、 分子量ゃ等電点の相違に応じて、 ペプチドやタンパク質を 二次元的に細区分化したスポットとして単離される。 その際、 ゲル担体上に検出 されるスポットを与えているペプチドが、 実際に目的とするペプチドであるか否 かの検証を行う必要がある。
例えば、 この目的とするペプチドであるか否かの検証では、 場合によっては、 目的のペプチドに対して、 特異的な反応性を示す抗体を反応させ、 かかる抗原， 抗体反応の有無を検出する方法が利用されている。 伹し、 この検証方法は、 特異 的な反応性を示す抗体が入手可能な場合にしか適用できない。
従って、 特異的な反応性を示す抗体を利用することなく、 ゲル担体上に検出さ れるスポットを与えているペプチドが、 実際に目的とするペプチドであるか否か の検証を行うことが可能な手段の提供が望まれている。
また、 前記抗原 ·抗体反応を利用する検証法を可能なタンパク質は限られてい るため、 ペプチド 'マス 'フィンガープリント (PMF) 法と称される手法を利 用する検証法も利用されている。この PMF法は、目的とするぺプチドに関して、 予め、 切断部位に特異性を有するプロテアーゼ、 例えば、 トリプシンなどを利用 して酵素消化した際、 生成するべプチド断片個々の分子量が判明している場合、 単離されたペプチドを、 同じ酵素消化によってペプチド断片化し、 質量分析法を 利用してペプチド断片の各分子量を測定し、 データ 'ベースに収録されているぺ プチド断片個々の分子量と対比することで、 同一性の検証を行う。
加えて、 質量分析法を利用してペプチドを分析する際、 MALD I— TOF型 質量分析法を利用して分離したイオン種について、 更に、 電子線照射により、 か かるイオン種から生成する二次イオン種の質量を分析する、 T〇F— S IMS法 などの、 MS/MS法を利用することで、 各ペプチド断片の部分構成に関する情 報も利用可能となっている。 例えば、 これら MS/MS法を利用することで、 場 合によっては、 ペプチドの N末端、 および C末端配列を特定できるものもある。 前述の PMF法、 さらには、 MSZMS法を利用することで、 抗原 '抗体反応 を利用する場合と比較すると、 その利用可能な範囲は格段に拡大するものの、 そ のアミノ酸配列が既知である上に、 予め、 各ペプチド断片に由来するイオン種を 特定したデータ 'ベースが完備しているタンパク質やペプチドに、 その利用範囲 は限られるものである。 従って、 実際に、 ゲル担体上に検出されるスポットを与 えているペプチドが、 そのアミノ酸配列が既知である対象のペプチドであるか否 かの検証をより一般的に行うことが可能な手段の提供が望まれている。
本発明者らは、 かかる要望を満足する手段として、 そのアミノ酸配列は既に判 明している、 既知のペプチドやタンパク質に関しては、 同一条件でゲル電気泳動 法による分離を行うと、 それぞれ固有の位置に相当の再現性でスポットを与える ため、 対応する位置にスポットを生じているペプチドの部分アミノ酸配列を分析 し、 それが既知のアミノ酸配列中の対応する部分配列と一致するか否かを検証す る手段が利用可能であろうと着想した。 より具体的には、 例えば、 S D S— P A G E法、 あるいは二次元泳動法を利用する際、 ゲル担体上に検出されるバンド、 あるいはスポットを与えているペプチドのおおよその分子量は判明しており、 そ の C末端アミノ酸配列を検出して、 アミノ酸配列は既に判明している既知のぺプ チドの分子量、 ならびにその C末端アミノ酸配列と一致するか否かを検証するこ とで、 かかるスポットを与えているペプチドが、 実際に目的とするペプチドであ るか否かの検証を行うことが可能となると着想した。
この着想を実施する上で、 ゲル担体上に検出されるスポットを与えているぺプ チドに関して、 ゲル担体を切断した上で、 ー且ゲル中から当該ペプチドを抽出 · 溶解した上で、 再度、 液相から単離 ·回収する操作を行い、 従来の C末端アミノ 酸配列解析手段を適用することも、 原理的には可能である。 し力 しながら、 現実 的には、 再度、 液相から単離 ·回収する操作における回収効率は必ずしも高くな く、多くの場合、アミノ酸残基数の多いぺプチドでは回収効率は極端に低いため、 対象とする当該ペプチドをゲル担体上に担持された状態のまま、 その C末端アミ ノ酸配列を解析することが、 より広範な解析対象において、 上記の着想を実施す る上で必要となることを、 本発明者らは見出した。 本発明は前記の課題を解決するもので、 本発明の目的は、 ゲル電気泳動法によ り分離される解析対象のペプチド、 具体的には、 タンパク質などのアミノ酸残基 数の多いぺプチド鎖について、当該ぺプチドをゲル担体上に担持した状態のまま、 その C末端アミノ酸を、 ォキサゾロン環構造の形成を経由する反応機構を利用し て、 逐次的に分解する際、 ペプチド途中におけるペプチド結合の断裂などの好ま しくない副次反応を抑制でき、 同時にかかる化学的な処理自体は、 汎用性の富む 条件で実施することが可能な、 逐次的 C末端ァミノ酸の分解反応手段を提供する ことにある。 より具体的には、 本発明の目的は、 ゲル担体上に担持した状態にお いて、 ゲル状物質に含有される水分を除去して、 ペプチドを乾燥した後、 その C 末端アミノ酸を逐次的に分解する際、 力かるゲル内分の穴構造に留まるぺプチド に対して、 かかる化学的な処理を施す反応試薬を均一に供給でき、 また、 室温近 傍の穏和な条件で実施できる新規な逐次的 C末端ァミノ酸の分解反応手段を利用 する、 ぺプチド C末端ァミノ酸配列の解析方法を提供することにある。 本発明者らは、上記の課題を解決すベく、鋭意検討と研究を繰り返したところ、 ゲル電気泳動法に利用されるゲル状物質は、 そもそも、 ペプチドの通過可能な微 細な穴構造を有し、 水を含浸した状態であり、 ォキサゾロン環構造を形成する反 応を行う際には、ゲル状物質中に含浸される水を除去する必要があること、一方、 ゲル状物質から水を除去し、 乾燥させると、 微細な穴構造中を満たしている水分 子が除かれる結果、 ゲル全体の嵩体積が減少し、 この狭くなつた微細な穴構造内 部へ、 反応試薬を蒸気として均一に供給することは困難であることを確認した。 本発明者らは、さらに、反応試薬の供給法を検討したところ、脱水操作によって、 内部の微細な穴構造が狭くなつたゲルを、 水を含まず、 かつ、 パーフルォロアル 力ン酸、 酸無水物などの反応試薬を溶解できる有機溶媒を利用して再び膨潤させ て、 内部の微細な穴構造の間隙を広くした上で、 その間隙を介して、 前記有機溶 媒中に溶解した反応試薬をゲル内部へと均一に供給することが可能であることを 見出した。 より具体的には、 脱水処理を施したゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状 態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶媒中に、 パーフルォロアルカン酸を アル力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液を用いて、 該 混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺ プチド試料にアルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用させ、 C末端 でのォキサゾロン環構造を形成、その後の、末端アミノ酸残基の解離、ならびに、 ォキサゾロン環構造を形成という一連の反応が実施できることを見出した、 本発 明者らは、 これらの知見に加えて、 反応で生じる反応生成物である短縮されるぺ プチド、 元のペプチドともに、 力かる双極性非プロトン性溶媒で膨潤したゲル中 では、 拡散、 溶出は生じることなく、 ゲル担体上に担持した状態に維持され、 質 量分析法により同時に分析することが可能であることを確認し、 本発明を完成す るに到った。
すなわち、 本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法は、 解析対象とするぺプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドより、 化学的手段によ'り C末端アミノ酸を逐次的に分解し て得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法によ り分析し、 力かる c末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程 と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸を 特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の対 象とするぺプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 か つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去するこ とにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶 媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することによ り、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアルカン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000011_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するァミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴レ、 C末 端ァミノ酸の逐次的分解を行う工程と、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の 溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒 を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行うェ 程とを有する、 対象とするぺプチド試料を該ゲル担体上に担持された状態で処理 する方法によりなされ、
該ゲル担体上に担持された状態のまま、 前記の C末端アミノ酸を逐次的に分解 する処理を施して、 得られる一連の反応生成物ならびに元となるぺプチドとを含 む混合物を、 前記質量分析工程に供することを特徴とするぺプチドの C末端ァミ ノ酸配列解析方法である。
その際、 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる 比率で溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4 のアルカン酸の対称 M酸無水物を用いることが好ましい。 更には、 前記炭素数 2 〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の直鎖アル力ン酸の対 称型酸無水物を用いることがより望ましい。 例えば、 前記パーフルォロアルカン 酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含まれ るアルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いることが一層好ましい。
一方、 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パー フルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロ アルカン酸を用いることが好ましい。 例えば、 前記パーフルォロアルカン酸をァ ルカン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含まれるパー フルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸を用いるこ とが可能である。さらには、前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の直鎖パーフルォロアルカン酸を用いることがより望ましい。なお、 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解 してなる混合溶液中における、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との 含有比率は、 アルカン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜2 0容の範囲に選択することがより望ましい。
加えて、 前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際し て、
前記反応系は、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保たれることが より望ましい。
なお、 本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列角军析方法において、 前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程では、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理後、 極性非プロト ン性溶媒を用いて、 該混合溶液を希釈除去することにより、 分解反応の停止と反 応試薬の除去を行う工程を終えた後、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生 成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付加的な加 水処理と再脱水処理の工程を設けることが好ましい。
また、 前記付加的な加水処理と再脱水処理の工程は、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理後、
極性非プロトン性溶媒を用いて、 該混合溶液を希釈除去することにより、 分解反 応の停止と反応試薬の除去を行う工程に代えて、
温度を低下させ、 分解反応の停止を図った後、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生 成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 同時に、 前記パーフルォロアルカン酸とアル力ン酸無水物とを組み合わせてな る反応試薬の不活化処理ならびにゲル中からの溶出を行い、
次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付加的な加 水処理と再脱水処理の工程として実施することもできる。
更には、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程では、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に先立ち、 前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 ° (：〜 8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアル力ン酸無水物を作用させ、対象とするペプチドの N末端のァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァシル基による N 一ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 な らびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を 用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシル化反応の停止と反応試薬の除去を 行う前処理工程を設けることが好ましい。 その際、 該 N末端に対する N—ァシル 化保護を施す前処理工程で利用する前記アル力ン酸無水物と、 その後に実施する 前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程で利用する前記アル力ン酸無水物と に、 同じアルカン酸無水物を用いることがより好ましい。
また、 前記の N _ァシル化を行う前処理工程は、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に先立ち、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試科に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアル力ン酸無水物を作用させ、対象とするぺプチドの N末端のァミノ基に、 予め、 前記アル力ン酸無水物を構成するアル力ン酸に由来するァシル基による N 一ァシル化保護を施し、
その後、 温度を低下させ、 分解反応の停止を図るとともに、 水を加えて、 前記ァ ルカン酸無水物の不活化処理ならびにゲル中からの溶出を行い、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水、 前記アルカン酸無水物 または対応するアルカン酸に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用い て、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 N 一ァシル化反応の前処理工程として実施することもできる。
一方、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状 態の対象とするぺプチド試料の調製は、
該ゲル担体として、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる電気泳動法を利用して なされることが、 一般に望ましい。 また、 前記一連の反応生成物と、 元となるぺ プチドとを、 質量分析法により分析する工程において、 該質量分析法として、 M A L D I一 T O F型質量分析法を選択することがより好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明にかかるぺプチドから C末端アミノ酸を逐次的に分解する処理 における、 操作手順の特徴点を例示する工程フローを示す図である。
図 2は、 本発明にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的に分解する処理 方法に従って、 ゥマ ·ミオグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸を 逐次的に分解して得られる反応産物混合物の質量分析スぺク トルの一例を示す図 である。
図 3は、 参考例に記載する、 単離乾燥ペプチドから C末端アミノ酸を逐次的に 分解する処理方法に従って、 ゥマ · ミォグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖の C末 端アミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物混合物の質量分析スぺク トルの 一例を示す図である。
図 4は、 ゥマ ' ミオグロビンのグロビン 'ペプチド鎖に含まれる、 N—ァセチ ル化を受けるリシン残基、 ならびに、 トリプシン消化による、 アルギニン残基の C末側ぺプチド結合切断で生じる、 1— 3 1と 1 4 0— 1 5 3の各部分ァミノ酸 配列を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 本発明をより詳しく説明する。
本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 基本的には、 解析 対象のぺプチドに対して、 そのべプチドの C末端アミノ酸を逐次的に分解除去し て、 ペプチドが短縮された一連の反応産物を作製し、 この一連の反応産物の分子 量と、 元となるペプチドの分子量との差異に基づき、 除去されたアミノ酸を特定 する手法を採用している。 より具体的には、 この一連の反応産物の分子量と、 元 となるペプチドの分子量の測定手段として、 質量分析法を利用するが、 そのィォ ン化過程で、 ペプチドを構成するアミノ酸残基から、 一部に原子団の欠落を生じ ない条件での測定により適する質量分析装置、 例えば、 MALD I—TOF— M 3 (M a t r 1 X As s i s t e d L a s e r De s o r p t i o n 丄 o n i z a t i o n T i me— o f — F l i g h t Ma s s S p e c t r ome t r y ；マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析） 装置 などを利用することが好ましい。
一方、 本発明にかかる解析方法における最大の特徴は、
C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程においては、 対象とするペプチド試料 は、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 この電気泳動法に利用されるゲル 担体上に担持された状態で、 一連の反応操作を実施した上で、 さらには、 最終的 に生成する一連の反応産物の分子量と、 元となるぺプチドの分子量とを測定する 質量分析の直前に、 担持されたゲル担体上から遊離処理を行うことで、 サンプル 量の僅かな場合にも、 再現性の高い測定を行うことを可能としている。 その際、 質量分析装置、 例えば、 MALD I— TOF— MS装置などを利用することで、 ゲル担体上において、 単一のスポットを形成する対象とするペプチド試料部分の みを、 高い分子量分解能、 確度で測定することが可能となる。 換言するならば、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 個々のスポット （または、 パンド） を 構成している複数種のペプチド試料に対して、 同一の工程で、 その C末端アミノ 酸を逐次的に分解する操作を一括して行った後、 個々のスポッ ト （または、 バン ド） のゲル切片を分離し、 その後の質量分析に供することで、 原サンプル中に含 有されている複数種のぺプチド試料の C末端ァミノ酸配列解析を、 高い効率と、 均一性で実施することが可能である。
なお、 予めゲル電気泳動法による分離を行う際、 利用されるゲル状物質は、 特 定の分子量範囲に相当する複数種のペプチドに関して、 それぞれ個別な、 分離さ れたスポット （又は、 バンド） を示す条件、 具体的には、 ゲルを構成するポリア クリルアミドの含有比率を選択し、 ゲル内部に形成される微細な穴構造内部の間 隙サイズを調整する。 その結果、 分離されたスポッ ト （又は、 バンド） は、 例え ば、 二次元電気泳動法や S D S— P A G E法では、 それぞれぺプチド鎖分子量、 表面の電荷量の差異に起因する電気泳動速度の相違するペプチドが局在している。 かかるペプチドは、 ゲル中に形成される微細な穴構造内部に保持されており、 ゲ ル状物質中に含浸される水を除去する際、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 水溶媒のみを 該極性非プロトン性溶媒中に希釈 ·溶出する手法を利用すると、 かかる脱水処理 操作を終えた後も、 目的とするペプチドは、 分離されたスポット （又は、 バンド） 位置のゲル担体上に担持された状態に維持できる。 かかる脱水処理に利用する極 性非プロトン性溶媒は、 ゲルを構成するポリアクリルアミドなどのゲル状物質と の親和性は、 水溶媒より一般に劣っているため、 ゲル状物質中の微細な穴構造の 間隙サイズを維持していた、 間隙表面に対して溶媒和している水溶媒の除去とと もに、嵩体積の減少が進む。該脱水処理に利用する極性非プロトン性溶媒として、 例えば、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる際、 好適な極性非プロトン性溶媒と して、水に対して親和性に富む、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以 下の-トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げることがで きる。
すなわち、 前記脱水処理に利用する極性非プロトン性溶媒を、 その後、 蒸散， 乾固すると、 嵩体積が減少し、 収縮したゲル担体となり、 狭くなつたゲル状物質 中の微細な穴構造の間隙を介して、 ゲル担体内部まで、 気相から反応試薬のパー フルォロアルカン酸、 あるいは、 パーフルォロアルカン酸無水物、 例えば、 ペン タフルォロプロパン酸 （C F 3 C F 2 C O O H) を蒸気として均一に供給して、 ぺ プチドの C末端ァミノ酸に作用させることは困難となる。
本発明の方法においては、 上記の脱水処理に伴い、 嵩体積が減少し、 収縮した ゲル担体に対して、 当該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶媒を利用して、 再ぴ膨潤させることで、 微細な穴構造の間 隙を拡大させる。 その際、 このゲルの膨潤に利用する双極性非プロ トン性溶媒中 に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比率で溶解 してなる混合溶液を利用することで、 ゲル担体の微細な穴構造中に担持されてい るぺプチドに、 パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物を均一に供給して、 作用させる。
このパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物は、 例えば、 以下に述べる反 応機構を介して、 ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000018_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するァミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を先ず形成させる。
かかる 5—ォキサゾロン環形成の反応は、 全体として見ると、 反応式 （I ) ：
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
として表記されるものの、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法で は、 先ず、 下記する反応式 （l a ) :
Figure imgf000019_0003
で示されるケトーエノール互換異性化の過程を、 パーフルォロアルカン酸を乾燥 したペプチドに対して、 プロトン供与体として機能させることで、 'エノール型を とる比率を高めている。
次いで、 ェノール型において、 表出されているヒドロキシ基と C末端カルボキ シ基の間で、 分子内エステル結合を形成し、 5—ォキサゾロン環を完成させる。 その際、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法では、 C末端カルボ キシ基の活性化を行い試薬として、 アルカン酸無水物を利用し、 例えば、 下記の 反応式 （l b ) :
Figure imgf000020_0001
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端カルボ キシ基が反応に関与するものとしている。 アルカン酸無水物は、 パーフルォロア ルカン酸と比較して、 高い濃度で含有されており、 かかる反応は、 穏和な温度条 件で進行でき、 反応温度を 30°C〜80°Cの範囲に選択することが可能となって いる。
一方、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法において、 利用され るパーフルォロアルカン酸は、 そのプロトン供与能を利用するものであり、 該パ 一フルォロアルカン酸の示す p K aは、 0. 3〜2. 5の範囲であるパーフルォ ロアルカン酸を用いることが好ましい。 なお、 前記の反応'温度において、 利用す る双極性非プロトン性溶媒中に均一に溶解可能な、 炭素数 2〜 4のパーフルォロ アルカン酸は、 より適するものであり、 さらには、 直鎖状の炭素数 2〜4のパー フルォロアルカン酸が、 より適するものであり、 具体的には、 トリフルォロ酢酸 (CF3COOH)、 ペンタフルォロプロパン酸 （CF3CF2COOH)、 ヘプタ フルォロブタン酸（CF3CF2CF2C〇OH)を利用することがより望ましレ、。 また、 利用されるアルカン酸無水物は、 反応温度まで昇温した際、 適正な反応 性を与えるものが好ましく、 従って、 炭素数 2〜 4のアルカン酸の対称型酸無水 物を用いることが好ましい。 なかでも、 前記対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることがより好ましく、 特には、 炭 素数 2の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、 すなわち、 無水酢酸が好適に利用で きる。 かかるアルカン酸無水物は、 C末端カルボキシ基の活性化に利用されるた め、 その際、 立体障害を生じることの少ないものが好ましく、 その点でも、 前記 例示の無水酢酸などがより好適である。
また、 上記する活性化試薬として利用される、 アルカン酸無水物は、 反応に従 つて、 消費されるため、 予め、 ゲルの膨潤に利用する双極性非プロトン性溶媒中 に、 ペプチドとの反応に消費される量に対して、 大過剰量を溶解しておき、 その 濃度低下を抑制することが望ましい。 具体的には、 ゲルの膨潤に用いる混合溶液 中において、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との含有比率は、 アル カン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜 2 0容の範囲に選択 し、 その際、 双極性非プロ トン性溶媒中における、 アルカン酸無水物の含有濃度 は、 1 0〜3 0 % (体積％)の範囲に選択することがより望ましい。反応時間は、 反応温度、 双極性非プロトン性溶媒中に含有されるアルカン酸無水物とパーフル ォロアルカン酸の含有濃度に依存し、 加えて、 極性非プロ トン性溶媒を利用する 脱水処理に伴って、 収縮したゲル担体の膨潤に要する時間をも考慮して、 適宜選 択することが望ましレ、。 例えば、 ポリアクリルアミド，ゲル （ 1 2 . 5質量％) に対して、 上述のァセトュトリルを利用して脱水処理を施した後、 後述のホルム アミドなどの双極性非プロトン性溶媒中に浸漬して、 ゲル担体の再膨潤を達成す るに要する時間は、 例えば、 4 0 °Cでは、 3時間程度であるため、 全体の反応時 間は、 かかるゲル担体の再膨潤を終えた後、 所望のアミノ酸残基数、 C末端アミ ノ酸の選択的な分解を達成するに要する時間を加えたものに選択する。
一方、 上記のゲルの再膨潤を起こさせる双極性非プロトン性溶媒は、 該ゲル状 物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 比較的に分子サイズが小さく、 かつ、 ゲル状物質に対する親和性に優れた有機溶媒が好ましい。 加えて、 上述す る式 （l a ) のケト一エノール互換異性化の過程において、 そのエノール体の比 率を維持可能な、 高い双極性を示すとともに、 溶質分子のアルカン酸無水物、 パ 一フルォロアルカン酸、 ならびに、 反応副生成物であるアルカン酸に対して、 優 れた溶媒であることが好ましい。 なお、 上記反応温度において、 揮発 .蒸散する ことの少ない双極性非プロトン性溶媒が、 より好ましく、 例えば、 ホルムァミ ド (H C O NH 2) などは、 ポリアクリルアミド'ゲルを用いる際、 以上に述べた要 件全てを十分に満足するものである。
なお、 上述するアルカン酸無水物、 パーフルォロアルカン酸、 ならびに、 反応 副生成物であるアルカン酸に対して、 優れた溶解性をもたらす双極性非プロトン 性溶媒は、 水分子をも容易に溶解することが可能である。 従って、 前記双極性非 プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際して、 前記反応系は、 水分 を除去した、 乾燥雰囲気下に保たれることが好ましい。 すなわち、 上記の式 （I b ) に示される反応中間体、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端 カルボキシ基は、 反応系内に水分子が混入すると、 加水分解を受け、 元の末端力 ルポキシ基へと戻ってしまう。 かかる不活化過程を回避するため、 反応系は、 水 分を除去した状態を維持することが好ましい。
例えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォニンに存 在するィォゥが、 系内に混入する酸素により酸ィ匕を受け、 その式量が変化するこ ともある。 この酸素による酸化を防止することは、 分子量の測定を基礎とする本 発明の方法においては、 力かる酸化を抑制することは、 より高い確度を達成する 上で、 より好ましいものとなる。
なお、 対象とするペプチドが、 例えば、 p舞接するペプチドのシスティンとの間 で、 酸化型の一 S— S—結合を形成する、 あるいは、 同一分子内で一 S— S—結 合を形成しているシスティンを含む場合には、 予め常用の還元処理を施し、 かか る架橋を解消し、 還元型のシスティンを含むペプチドに変換する。 加えて、 多く の場合、解析の対象とするぺプチド中に存在する還元型のシスティンに対しては、 その側鎖のスルフ了ニル基 (- S H) にカルボキシメチル化ゃピリジルェチル化 などを施し、 予めその保護を行う。 一方、 還元型のシスティンに対して、 予めそ の保護を施していない場合には、 系内に混入する酸素により酸ィ匕を受け、 場合に よっては、 再び酸化型の— S— S—結合を形成する懸念もある。 本発明において は、 予め、 対象とするペプチドは、 高次構造を解消したペプチドであるものの、 隣接するぺプチド間で、 不要な一 S— S—結合が形成されることを回避する上で は、 前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際して、 反 応系は、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保たれることがより望 ましい。 また、 メチォニン残基のスルフイド （一 S—） に対する酸化を防止する 上でも、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保たれることがより望ましい。 例えば、 反応系を、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保つ手段 としては、 反応を行う系を気密状態とし、 系外からの、 水分、 酸素の浸入を防止 するとともに、 液の注入、 排出操作も、 乾燥処理した不活性気体、 例えば、 窒素 雰囲気下で行うことが望ましい。
また、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法においては、 一旦形 成された 5—ォキサゾロン環から、 例えば、 反応式 （ΙΓ ) で表記される反応：
N、ノ R1 — N H„C— CO— OH
R2 / 丫 ―
0 R2 H 、0 ° + > R1 0 等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行し て、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。 従って、 かか る反応を終えた後、 得られる反応産物は、 上述する反応式 （II) に示される、 C 末端にカルボキシ基が表出されているもの以外に、 中間産物である 5—ォキサゾ ロン環構造に留まるもの、 あるいは、 反応中間体の一形態として、 C末端が非対 称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。
カかる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における反応は、 少な くとも、 反応式 （I b ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の形成過程と、 反 応式（Π' ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の分 離過程との二段階の素反応から構成される。 そのため、 全体の反応速度は、 これ ら各過程の反応速度の双方に依存するものの、 主に、 利用するアルカン酸無水物 とパーフルォロアルカン酸の濃度ならぴに反応温度に依存している。 加えて、 一 連の反応産物は、 逐次的な反応で形成されるため、 得られる一連の反応産物にお いて達成される、 短縮される C末端アミノ酸配列の最大長は、 処理時間が長くな るとともに、 延長される。 従って、 かかる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分 解処理工程における処理時間は、 主に、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸の濃度ならびに反応温度に応じて、 また、 解析すべき C末端アミノ 酸配列の目標とするアミノ酸長をも考慮して、 適:!:選択するものである。 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解反応の停止は、 反応系の温度を低下す るとともに、 ゲル担体中に浸潤している反応試薬、 すなわち、 パーフルォロアル 力ン酸とアル力ン酸無水物を希釈 ·除去することで行う。 具体的には、 C末端ァ ミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こ さず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性 非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行う。 なお、 かかる反 応試薬の希釈 ·除去に、 混合溶液の調製に利用する双極性非プロトン性溶媒を利 用することも可能であるが、 反応式 （l b ) で例示される 5—ォキサゾロン環構 造の形成過程を停止する上では、 ェノール型中間体の安定ィヒに寄与の少ない極性 非プロ トン性溶媒を利用する、 パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 な らびに双極性非プロトン性溶媒の除去工程とすることがより望ましい。 少なくと も、 反応試薬の希釈 '除去工程の最終段では、 極性非プロトン性溶媒を利用する 希釈 ·除去の操作を設ける。 例えば、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる際、 こ れらの条件を満足する極性非プロトン性溶媒としては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン 類などを挙げることができる。
また、 本発明の方法では、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程に おいて生成される、 上記反応式（Ι ) に例示される C末端にカルボキシ基が表出 されていなレ、反応中間体の形態をとるものをも、 C末端にカルボキシ基が表出さ れている形態に復する目的で、 付加的な加水処理を設けることができる。 すなわ ち、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付カ卩的な加 水処理と再脱水処理の工程を設けることが好ましい。 この後処理を施すことで、 反応産物は、 C末端にカルボキシ基は表出した形態となり、 かかる形態が、 その 後、 質量分析法により分析した際、 主要なピークを与えるものとなり、 ピーク強 度をも参考として、 一連の反応産物に対応する分子量を示すピークの特定作業を より容易とすることができる。
前記付加的な加水処理において、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン 化合物は、 反応式 （ΙΓ ) に示される 5—ォキサゾロン環構造、 ならびに、 次段の 反応中間体 （酸無水物体） の加水分解反応 oを触媒するものの、 それ自体が、 5— ォキサゾロン環構造または反応中間体 （酸無Y水O C物体） と反応して、 不要な副生物 を生じることがなく、好適な塩基触媒として機能する。具体的には、反応式（ΙΓ ) に示される 5—ォキサゾロン環構造、 ならびに、 次段の反応中間体 （酸無水物体) の加水分解反応では、 下記反応式 （IV) に示すように、 反応産物のペプチド鎖の C末端にカルボキシ基が表出する。
【化 1 0】
Figure imgf000025_0001
なお、 加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物 が残余すると、 反応産物の表出した C末端にカルボキシ基に対して、 かかる窒素 塩基が付加塩を形成したものが混在する状態となるため、 ゲル担体中に含浸され る水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有 する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の再 脱水処理を施すとともに、 加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または 第三アミン化合物を水とともに、 希釈除去することが好ましい。 従って、 この再 脱水処理の工程において利用する極性非プロトン性溶媒は、 塩基性含窒素芳香環 化合物または第三ァミン化合物に対しても、 高い溶解性を有するものがより好ま しレ、。例えば、 ポリアクリルアミ ド.ゲルを用いる際、 これらの条件を満足する、 再脱水処理工程用の極性非プロトン性溶媒としては、ァセトニトリル（ C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類など を挙げることができる。
上記の加水処理に利用する、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合 物は、例えば、残留している C末端が非対称型酸無水物に至ったものと反応して、 ァミ ド結合を形成することがなく、 また、 水溶液とした際、 均一な溶液とできる ので、 好ましいものである。 利用可能な、 塩基性含窒素芳香環化合物としては、 極性非プロトン性溶媒に高い溶解性を示す、 単環式の含窒素芳香環化合物が好ま しく、 例えば、 ピリジンはより好適に利用できる。 また、 利用可能な第三アミン 化合物は、 前記ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程度の塩基性を有す るものが好ましく、 例えば、 DMA E ( 2 - (ジメチルァミノ) エタノール： ( C H 3) 2 N - C H 2 C H 2 O H) などが好適に利用できる。 例えば、 ピリジンを利用 する際には、 水溶液全体の体積に対して、 ピリジンを、 5〜1 5体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択することが好ましい。 また、 DMA Eを利用 する際には、 水溶液全体の体積に対して、 DMA Eを、 1〜2 0体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択することが好ましい。
これら単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、 水溶液として、 上 記反応産物を担持しているゲルに作用させる。 この後処理においては、 親水性に 富むゲル状物質中に、 力かる有機塩基を含有する水溶液は、 速やかに浸潤する。 なお、 速やかに加水反応を完了するためには、 反応温度を 6 0 °C以上に選択する ことが好ましいが、 一般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行うため、 反 応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択することが望ま しい。 加えて、 上述する加水処理は、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の後、 一旦、 反応試薬のアル力ン酸無水物ならびにパーフルォロアルカン酸に対する、 極性非 プロトン性溶媒を利用する希釈 ·除去の操作を終えた後に実施するだけでなく、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応と該加水処理とを、 連続して実施することも可 能である。 具体的には、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応は、 その反応温度を下 げて、 その反応停止を図りつつ、 有機塩基を含有する水溶液を加えると、 アル力 ン酸無水物とパーフルォロアル力ン酸の組み合わせてなる反応試薬の失活、 ゲル 中からの溶出が生じ、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の停止と、 反応試薬の不 活性ィヒ ·除去がなされる。 引き続き、 反応産物に対する加水処理も行うことがで き、 最終的に、 極性非プロトン性溶媒を利用する再脱水処理工程を施すことで、 有機塩基を含有する水溶液とともに、 アルカン酸無水物に対応するアルカン酸と パーフルォロアルカン酸、 双極性非プロトン性溶媒の除去と、 再脱水がなされる ため、一旦極性非プロトン性溶媒を利用する洗浄 ·除去操作を中間に設ける際と、 実質的に差異を持たないものとなる。
さらには、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法においては、 前 記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合溶液を利 用する処理の工程に加え、
力かる C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程に先立って、
対象とするペプチドの N末端のァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構 成するアル力ン酸に由来するァシル基による N—ァシル化保護を施す前処理工程 を設けることもできる。 具体的には、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアル カン酸を少量添加してなる混合物を利用すさ処理の過程で、 ぺプチドの C末端力 ルポキシ基の活性化がなされる反応中間体が形成されると推察される。 この反応 中間体が、 隣接するペプチドの N末端のァミノ基と反応し、 アミ ド結合を形成す ると、 目的とするペプチドの短縮された反応産物が得られないことになる。 かか る反応中間体の生成反応は、 ゲル状物質中の穴構造内に担持されているぺプチド に対して起こるので、 複数のぺプチド反応中間体間で生じる前記偶発的な副次反 応の頻度は高くないものの、予め、 N—ァシル化保護を施すことがより望ましい。 加えて、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアル力ン酸を少量添加してなる 混合溶液を利用する処理の間に、 ペプチドの N末端のアミノ基に対して、 前記ァ ルカン酸無水物によって、 N—ァシル化が通常起こるため、 系内において、 N— ァシル化保護がなされるものの、 予め、 N—ァシル化保護を目的とする前処理を 施す方がより望ましい。
この N末端のァミノ基に N—ァシルイヒ保護を施す前処理工程は、 アルカン酸無 水物を利用する反応であるため、 ゲル状物質中に水が残留しない状態で実施する ことが望ましい。 すなわち、 ゲル状物質中に含浸される水を除去する脱水処理ェ 程を終えた後、 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程に先立って、 こめ N—ァ シル化保護を施す前処理工程を設ける。 該アルカン酸無水物は、 前記アルカン酸 無水物にパーフルォロアル力ン酸を少量添加してなる混合溶液の調製に利用され る溶媒と同様の、 双極性非プロトン性溶媒中に溶解した上で、 かかる溶液中に、 脱水処理済みのゲル担体を浸漬することで、 ゲルの膨潤とともに、 ゲル状物質中 に浸潤する。
双極性非プロトン性溶媒中では、 アルカン酸無水物の分子内分極が誘起され、 求電子反応試薬として、該ペプチドのァミノ基に作用する結果、 3 0 °C以上でも、 十分にかかる N—ァシル化反応は進行する。 通常、 反応の促進を図るためには、 反応温度を 5 0 °C以上に選択することが好ましいが、 一般に、 密閉された反応容 器内でかかる反応を行うため、 反応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C 以下の範囲に選択することが望ましい。 N—ァシル化反応に付随して、 アルカン 酸が生成するが、 その量は僅かであり、 力かるアルカン酸の示すプロトン供与能 と、共存するアル力ン酸無水物とに起因する副次的反応は、上述の温度範囲では、 通常問題とはならない。より具体的には、系内に生成するアルカン酸は、例えば、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 その酸触媒作用は格段に劣り、 かつ、 その 存在量も少ないため、 上述する温度条件では、 パーフルォロアルカン酸とアル力 ン酸無水物とを利用する C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程における主な反 応、 5—ォキサゾロン環構造の形成反応が副次的に起こるまでには至らない。 更 には、 上述するパーフルォロアルカン酸とアル力ン酸無水物とを利用する C末端 アミノ酸を逐次的に分解する工程においてすら、抑制されている種々の副次反応、 例えば、 ペプチド主鎖アミ ド結合 （一 CONH— ) の開裂は、 かかるアルカン酸 無水物のみを利用する前処理工程においては、 なお一層の抑制がなされている。 加えて、 ペプチドの N末端のアミノ基を N—ァシル化保護する際には、 ぺプチ ド中に存在するリシン残基側鎖のァミノ基に対しても、 N—アシノレイヒ保護が同時 に進行する。 さらには、 ぺプチド中に存在するセリン残基ならびにトレオニン残 基側鎖のヒ ドロキシ基においても O—ァシル化反応が進み、その保護がなされる。 その他、ぺプチド中に存在するチロシン残基側鎖のフエノ一ノレ性ヒ ドロキシ基も、 その反応性は相違するものの、 部分的に〇一ァシル化がなされる。 これらの複数 のァシル化保護もなされる前処理工程を設ける結果として、 リシン残基側鎖のァ ミノ基、 セリン残基ならぴにトレオニン残基側鎖のヒ ドロキシ基は、 何れも保護 修飾を受けたものとなり、 最早不要な副次反応に関与できないものとなる。 その 観点からも、 かかるぺプチドの N末端のアミノ基を N—ァシル化保護する前処理 工程をも実施することが、 通常好ましい。
例えば、パーフルォロアルカン酸蒸気を、水蒸気分子の共存下、例えば、 90°C に加熱しつつ、 乾燥したペプチド鎖に作用させると、 ペプチド鎖中のセリン残基 (-NH-CH (CH2OH) -CO-) において、 α位のアミノ基 （一 ΝΗ— ) と ]3位のヒドロキシ基 （一 ΟΗ) の間で、 Ν, Ο—ァシル転位反応も進行し、 引 き続き、 加水分解が進行し、 セリン残基の Ν末側でぺプチドの切断が生じるとい う副反応が存在する。 また、 条件に依っては、 |3位にヒ ドロキシ基 （一 ΟΗ) が 存在しているトレォニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に おいても、 同様の機構による加水分解が進行し、 トレオニン残基の N末側でぺプ チドの切断が生じるという副反応が存在する。 さらには、 ペプチド鎖中のァスパ ラギン酸残基 （一 NH—CH (CH2COOH) -CO-) において、 C末のカル ボキシ基から j3位のカルボキシ基へのぺプチド結合の転位と、 それに引き続く加 水分解が進行し、 ァスパラギン酸残基の C末側でぺプチドの切断が生じるという 副反応が存在する。
これら副次反応によりべプチド鎖の切断が生じると、 その N末側ぺプチド断片 に対しても、 C末端アミノ酸の選択的な分解が同時に進行することになる。 これ らの副次反応に由来する反応産物が共存すると、 場合によっては、 目的とする反 応産物の質量分析に際して、 その測定を阻害する要因ともなる。
さらには、 ペプチド鎖の切断に至らなくとも、 ]3位のヒ ドロキシ基 （一 O H) へ N末側部分ぺプチドが連結された分岐型ぺプチドとなると、 その部位では、 ァ ミ ド結合が失われており、 ォキサゾロン環構造の形成が.なされず、 C末端アミノ 酸の選択的な分解反応がそれ以上進行しないものとなる。
本発明の方法では、 C末端アミノ酸の選択的な分解工程では、 予め、 脱水処理 工程を設け、 ゲル内に含浸される水を除去した上、 反応系内に水が混入しない条 件を選択し、 また、 パーフルォロアルカン酸の含有濃度を抑え、 触媒量の範囲で 反応を進める結果、 上述する特定のアミノ酸残基におけるペプチド鎖の開裂、 あ るいは、 ペプチド鎖の分岐などの副次反応は、 抑制されている。 加えて、 パーフ ルォロアルカン酸よりも、 格段に高い濃度で存在するアルカン酸無水物による、 N—ァシル化保護、 0—ァシル化保護の反応も、 同時に進行するため、 ペプチド 鎖の開裂、 あるいは、 ペプチド鎖の分岐などの副次反応は、 更に抑制 ·回避がな されている。しかしながら、パーフルォロアルカン酸の存在しない状況において、 アルカン酸無水物を利用する前処理工程を予め実施すると、 ぺプチドの N末端の アミノ基を N—ァシルイヒ保護に加えて、 ペプチド側鎖上のアミノ基ゃヒドロキシ 基に対するァシル化保護がなされる結果、 C末端アミノ酸の選択的な分解工程中 におけるペプチド鎖の開裂、 あるいは、 ペプチド鎖の分岐などの副次反応は、 よ り確実に抑制 ·回避を行うことが可能である。
なお、 この前処理工程で使用する、 アルカン酸無水物を双極性非プロ トン性溶 媒に溶解する溶液中、 アルカン酸無水物の含有比率は、 反応温度に応じて、 所望 の反応性を達成できるように選択することができるものの、 通常、 双極性非プロ トン性溶媒中、 アルカン酸無水物の含有濃度を、 1 0〜3 0体積％の範囲、 例え ば、 1 0体積％程度に選択することが好ましい。 かかるアルカン酸無水物の含有 濃度に対して、反応温度は、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲、好ましくは、 5 0 °C〜8 0 °C の範囲に選択される温度、 より好ましくは、 かかる反応温度は、 室温付近、 ある いは、 室温より僅かに高い範囲内に選択することが好ましく、 より具体的には、
5 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択することが好ましい。 反応時間は、 反応温度、 双極 性非プロトン性溶媒中に含有されるアルカン酸無水物の含有濃度に依存し、 加え て、 極性非プロトン性溶媒を利用する脱水処理に伴って、 収縮したゲル担体の膨 潤に要する時間をも考慮して、 適宜選択することが望ましい。
この前処理工程を終えた後、 利用したアル力ン酸無水物を双極性非プロトン性 溶媒に溶解する溶液を除去し、 さらに、 上述する脱水処理工程に利用される極性 非プロ トン性溶媒を利用して、 ゲル中に含浸されるアルカン酸無水物、 双極性非 プロトン性溶媒、 生成するアルカン酸を希釈 '除去することが望ましい。 すなわ ち、 ゲル中に含浸されているアルカン酸無水物溶液が残留した状態では、 次に、 C末端アミノ酸の選択的な分解工程に利用する、 アルカン酸無水物にパーフルォ 口アル力ン酸を少量添加してなる混合溶液中に、 かかるゲル担体を浸漬した際、 ゲル内部へのパーフルォロアルカン酸の浸入は速やかに進行しないものとなる。 このゲル内部へのパーフルォロアルカン酸の供給をより確実に進めるため、 脱水 処理工程に利用される極性非プロトン性溶媒を利用して、 ゲル中に含浸されてい るアルカン酸無水物溶液を、 ー且希釈 ·除去することが望ましい。
伹し、 この N—ァシル化保護する前処理工程における、 反応停止と反応試薬の 除去操作では、 極性非プロトン性溶媒による希釈、 洗浄を行う手法に代えて、 温 度を低下させ、 分解反応の停止を図った後、 水を加えて、 反応試薬のアルカン酸 無水物の不活性化、 ゲル中のアルカン酸無水物、 対応するアルカン酸の溶出を行 うことで、 反応停 と反応試薬の除去を行う方法を利用することもできる。 この 水を利用する反応停止を行った後、 かかるゲル担体を浸漬する水を、 上述する脱 水処理工程に利用される極性非プロトン性溶媒を利用して、 ー且希釈 ·除去する 脱水処理を行うことが必要である。すなわち、ゲル担体中に、水分が残留すると、
C末端アミノ酸の選択的な分解反応における阻害要因となるため、 上述するゲル 電気泳動されたゲル担体に施される脱水処理工程と同様の極性非プロトン性溶媒 を利用した、 十分なリンス洗浄処理を実施する。
例えば、本発明にかかる C末端ァミノ酸の選択的な分解方法は、脱水処理工程、 前処理工程、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応工程、 後処理工程を全て備えた 形態で実施することが、 一層好ましいものである。 その際、 前処理工程、 C末端 アミノ酸の選択的な分解反応工程、 後処理工程の各工程を終える段階では、 その 工程で利用した試薬をゲル中から除去することで、 それぞれの反応を停止するた め、上述するように、脱水処理工程に利用される極性非プロトン性溶媒と同様の、 極性非プロトン性溶媒を利用する、 希釈'洗浄操作を設ける。 この極性非プロト ン性溶媒を利用する希釈 ·洗浄を終えた後、 次の工程に移行する間、 かかる極性 非プロトン性溶媒中に浸漬した状態で、 ゲル担体を一時保管することもできる。 あるいは、 極性非プロトン性溶媒を蒸散 ·除去し、 乾燥状態とした上で、 ゲル担 体を一時保管することもできる。
本発明にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法では、 上記の C末端ァ ミノ酸の逐次的な除去により調製される一連の反応産物の分子量と、 元のぺプチ ドの分子量を、 質量分析法による測定結果を利用して決定し、 その分子量差に相 当するアミノ酸を特定する。 従って、 通常、 かかる質量分析法による測定に供す る混合物中に、 元のペプチドも、 その分子量の特定が可能な程度残存する状態と することが望ましい。
具体的には、 本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 C末 端アミノ酸配列として、 最大 1 0数アミノ酸長程度までの角军析に適用するが、 そ の際、 対応する最大 1 0数種に及ぶ一連の反応産物の含有比率は、 その最小の含 有比率のものは、 最大含有比率のものの、 少なくとも、 1ノ1 0程度を下回らな い状態とすることが望ましい。 また、 元のペプチドの残存量も、 最大含有比率の 反応産物に対して、 少なくとも、 l Z i 0程度を下回らない状態とすることが望 ましい。 一方、 必要とする C末端アミノ酸配列情報は、 1 0アミノ酸以内となる ことが多く、 1 0アミノ酸程度の分解が進む程度に処理時間を選択すると、 前記 の含有比率に関する条件を満足することができる。
一方、 分子量の測定に、 質量分析法を利用するが、 そのイオン化過程で、 ぺプ チドを構成するアミノ酸残基から、 一部に原子団の欠落を生じる、 フラグメンテ ーションを抑制した条件でイオン化手段を具えた質量分析装置を利用する測定が より適している。 また、 ペプチドなどは高分子量であり、 かかる高い分子量の測 定に適する質量分析装置、 例えば、 MA L D I _ T O F— M S装置などを利用す ることが好ましい。 特に、 本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方 法では、 解析対象のペプチド試料は、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 ゲル担体上に担持された状態のまま、 一連の処理を施し、 最終的に、 かかるゲル 上のスポット部分より、 処理を終えた反応産物を選択的に遊離 ·回収して、 質量 分析に供するが、 その際、 対応する陽イオン種と陰イオン種の双方を測定可能な MA L D I— T O F—M S装置などを利用することが好ましい。
但し、 これらの質量分析装置を利用しても、 有効にイオン化を達成できる分子 量には、 自ずから上限があり、 測定可能なペプチドのアミノ酸長の最大は、 2 0 〜3 0アミノ酸を超えないことが望ましい。 加えて、 分子量差に基づき、 対応す るアミノ酸の特定を行うので、例えば、 A s nと A s p、 G l nと G l uの如く、 式量の差異が 1のアミノ酸残基相互の区別を高い精度で行う上では、基準となる、 最長のペプチド、 すなわち、 C末端アミノ酸の除去がなされていないペプチドの 分子量は、 3 0 0 0を超えない範囲、 より好ましくは、 2 0 0 0を超えない範囲 であることがより好ましい。 これをアミノ酸長に換算すると、 長くとも、 3 0ァ ミノ酸、 より好ましくは、 2 0アミノ酸を超えない範囲とすることが好ましい。 本発明にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法を、 前記のアミノ酸長 を遥かに超えるタンパク質などのペプチドへ適用する際には、 質量分析の実施に 先立ち、 例えば、 切断アミノ酸配列部位の特異性を有するプロテアーゼなどを利 用して、 ペプチドの特異的な分断処理を行い、 C末端ペプチド断片として、 上記 のアミノ酸長範囲とすることが望ましい。 すなわち、 元となるペプチド、 ならび に、 調製された一連の反応産物に対して、 同じ部位特異的な分断処理を施すと、 得られる C末端ペプチド断片は、 その N末端アミノ酸は同じであり、 C末端アミ ノ酸部分に差異を有する一連のぺプチド断片となる。 その一連のぺプチド断片を 含む混合物を利用して、 それらの分子量を質量分析法により特定することで、 本 発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法を適用することができる。 すなわち、 本発明では、 ペプチドの特異的な分断処理を行うことで、 ゲル担体 上からの溶出が可能となるものの、 C末端アミノ酸も逐次的な分解により得られ る反応産物は、 ゲル担体上に担持されている状態を保つもの、 具体的には、 元と なるペプチド鎖のアミノ酸残基数は、 少なくとも、 5 0アミノ酸以上、 通常、 1 0 0アミノ酸以上となるものを主な対象とする。
この切断アミノ酸配列部位の特異性を有するプロテアーゼなどを利用した、 ぺ プチドの特異的な分断処理は、 通常、 上記の加水処理を施す後処理工程に引き続 き実施する。 具体的には、 後処理工程を終えた後、 ー且、 極性非プロトン性溶媒 を利用する、 希釈 ·洗浄操作、 ならびに、 再脱水処理を施し、 改めて、 ゲル担体 上に担持されているぺプチド鎖に対して、 該プロテアーゼを含む水性溶液を作用 させる。 その際、 ゲル担体上に担持されているペプチド鎖は、 ゲル中の穴構造に 浸入するプロテアーゼの作用によって、 その特異的な切断アミノ酸配列部位にお ける切断の結果、 複数のペプチド断片となる。 このゲル担体上でのプロテアーゼ によるペプチド断片化処理に利用可能な、 プロテアーゼとしては、 リシンゃァノレ ギニン残基の C末端側べプチド結合を開裂するトリプシン、 グルタミン酸残基の C末端側ぺプチド結合を開裂する V 8酵素などの、 汎用されるべプチド断片化処 理用のプロテアーゼを利用することが可能である。
また、 ペプチドの特異的な分断処理は、 前記切断アミノ酸配列部位の特異性を 有するプロテアーゼ消化による他、 例えば、 メチォニン残基の C末側アミド結合 における開裂に特異性を有する C N B rなどの化学的な試薬を利用する切断手法 を利用することも可能である。 かかるプロテアーゼ消化、 あるいは、 化学的な切断手法を適用して、 長いアミ ノ酸長のペプチド鎖より、 得られる C末端側ペプチド断片を、 所望のアミノ酸長 の範囲とする上では、 かかるプロテアーゼ消化、 あるいは、 化学的な切断におけ る切断部位が、 例えば、 1 0 0アミノ酸当たり、 1 0〜 2個程度、 好ましくは、 7〜 3個程度含有されていることが望ましい。 前記の頻度で切断部位が存在して いると、 得られるペプチド断片の平均的なアミノ酸長は、 1 0〜 5 0アミノ酸、 好ましくは、 1 5〜3 5アミノ酸とでき、 それに伴い、 C末端側ペプチド断片も 前記のアミノ酸長範囲とできる。 すなわち、 例えば、 MA L D I— T O F— M S 装置などを利用する分子量測定において、 好適な分子量範囲の C末端側ぺプチド 断片の調製が可能となる。 その観点では、 リシンやアルギニン残基の C末端側ぺ プチド結合を開裂するトリプシンを利用する際には、 リシン残基に対しては、 そ の側鎖上のァミノ基を N—ァシル化保護し、 アルギユン残基 C末側のぺプチド結 合での切断のみに限定することで、 切断部位の含有頻度を調整することが望まし い。
また、 ゲル担体上に担持されているペプチド鎖は、 その長いアミノ酸長に依つ てゲル中の穴構造内に保持されているが、 前記べプチド断片化処理を受けると、 アミノ酸長の短くなつたべプチド断片は、容易にゲル担体から遊離され、例えば、 プロテアーゼ溶液中に溶出する。 この断片化処理に伴い、 ゲル担体上から溶出す るペプチド断片を回収する。 次いで、 例えば、 緩衝液に含有される成分と分離す るため、 脱塩処理等を施して、 ペプチド断片の粗製と、 乾燥.回収を行う。 但し、 本発明の方法を三次元構造を構成するタンパク質などの長いべプチドへ 適用する際、 長いペプチド中において、 タンパク質フォールデイングのため、 シ スティン残基相互間で一 S— S—結合を形成する場合には、 予め、 かかる一 S— S—結合を還元し、 システィン残基間の架橋を解消する必要があり、 加えて、 還 元型のシスティンに対して、 カルボキシメチル化などの修飾を施し、 側鎖のスル ファニル基 （一 S H) の保護を図る。 加えて、 タンパク質フォールデイングに伴 い、 α—ヘリックス等の二次構造を構成する部分では、 アミノ酸残基のアミド結 合を構成するカルボニル基 （C = 0) とィミノ基 （一 N H—） は、 分子内で水 結合を形成した状態となっている。 この分子内で水素結合を形成した状態を保持 したままであると、 本発明で利用する反応の進行を抑制することもある。 その点 を考慮すると、 少なくとも、 ペプチドの C末端部分に関しては、 二次構造を構成 しない状態、 例えば、 デフォー </レディング処理が施された状態とした上で、 かか るぺプチド試料を、 二次元電気泳動法や S D S— P A G E法などのゲル電気泳動 法によって、 ゲル担体上において、 単一スポットに分離することが望ましい。 加 えて、 デフォールディング処理が施された状態とすることで、 例えば、 一連の化 学的処理工程を終え、質量分析に先立ち、上述するプロテアーゼなどを利用して、 ぺプチドの特異的な分断処理を行う必要がある場合にも、 得られる C末ぺプチド 断片の分離が一般に容易となる利点もある。
その他、 本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 鎖状ぺプ チドの C末端アミノ酸配列決定だけでなく、 例えば、 環状ペプチドに関して、 そ のアミノ酸配列を決定するため、 かかる環状ペプチドを予め開き、 鎖状ペプチド 化して、その C末端ァミノ酸配列決定に適用することもできる。より具体的には、 種々の微生物等は、生物学的活性を有する環状べプチド型化合物を産生しており、 その部分アミノ酸配列の決定にも利用できる。 更には、 タンパク質によっては、 複数のぺプチド鎖が、 その鎖間において、 システィン残基相互間で一 S— S—結 合を形成する形態を有する場合もあるが、 その際には、 予め、 かかる一 S— S— 結合を還元し、 システィン残基間の架橋を解消し、 個々のペプチド鎖を、 ゲル電 気泳動法により個別スポットに分離した上で、 それぞれ C末端ァミノ酸配列の解 析を行うことで、 本発明の方法を適用することができる。
従って、 本発明の方法を適用する際、 対象とするペプチド試料は、 鎖状ぺプチ ドとし、 予めゲル電気泳動法による分離を行い、 該ゲル担体上に担持された状態 の単一スポットとするが、 該ゲル電気泳動法は、 一次元方向に電気泳動をなす従 来の S D S— P A G E法は勿論のこと、 ゲル上で二次元的に泳動を行い、 より高 い分離を行う、 二次元泳動法を適用したものでもよい。 かかる二次元泳動法を適 用して、 分離されるペプチド試料は、 夾雑物の混入がなく、 より少ないサンプル 量であっても、本発明にかかるべプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法によって、 その C末端アミノ酸配列決定が可能となる。 また、 予めゲル電気泳動法による分 離を行う場合、 対象とするペプチド中に、 分子内におけるシスティン残基相互間 で一 S— S—結合を形成するものは、 2—スルファニルエタノール （H S— C 2 H 4— O H： 2—メルカプトエタノール）、 D T T (ジチオトレイトール： トレオ 一 1， 4—ジスルファ二ルー 2， 3—プタンジオール） などの還元性試薬を添加 して、 還元状態で電気泳動を行い、 単一のスポット化を行うことが好ましい。 あ るいは、 予め、 分子内におけるシスティン残基相互間での一 S— S—結合を還元 し、 さらには、 還元型のシスティンに対して、 ョード酢酸などを利用するカルボ キシメチル化などの修飾を施し、 単一のスポット化を行うことが好ましい。
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法では、 分子量の差異に 基づき、 逐次的に除去されたアミノ酸を特定するため、 同一の式量を有する、 口 イシン （L e u ) 残基とイソロイシン （l i e ) 残基とを弁別することは原理的 に不可能であり、 この点は、 従来の質量分析法を利用する C末端アミノ酸配列解 析手法と同様である。 また、 C末端アミノ酸を除去する反応では、 反応式 （I b ) に例示するように、 アミ ド結合のェノール型への変換と、 それに続く、 5—ォキ サゾロン環構造の形成が必須であり、 アミ ド結合を構成するカルボニル基 （C = 〇） とィミノ基 (- N H -) が存在しない環状アミノ酸プロリン （P r o ) が C 末端アミノ酸となった時点で、 それ以上の分解反応は進行しない。 逆には、 処理 時間を延長した際、 それ以上の C末端アミノ酸の除去が起きないことを確認する ことで、 その要因となるアミノ酸残基は、 環状アミノ酸プロリン （P r o ) と推 定することが可能である。
加えて、 上述するゲル担体上でのプロテアーゼによるべプチド断片化処理によ つて、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来する C末断片、 ならびに、 それ以外のペプチド鎖の中間部、 N末側に由来する断片と して、 それらの分子量を測定することで、 元となるペプチド鎖中に存在する、 当 該プロテアーゼに特異的な切断アミノ酸配列部位の存在位置間隔、 ならびに、 C 末断片の N末端に、 該特異的な切断アミノ酸配列部位が存在することなど、 元と なるぺプチド鎖全体におけるアミノ酸配列における、 付加的な特徴の特定を行う ことが可能となる。
本発明にかかる方法では、 ぺプチドの N末端のァミノ基を N—ァシル化保護す る前処理工程、 あるいは、 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程において、 N 末端のアミノ基に対する N—アルカノィル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—アルカノィル化、 同時に、セリン残基（一 NH— CH (CH2〇H) -CO-)ゃトレオニン残基（一 NH-CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒ ドロキシ基に対する O 一アルカノィル化、 チロシン残基 （一 NH—CH (CH2-C6H4-OH) 一 C 0-)のフエノール性ヒ ドロキシ基への〇一アル力ノィル化がなされる。その後、 後処理工程における、 有機窒素塩基の存在下における加水処理に付随して、 アル コール型ヒ ドロキシ基に対するエステル結合は、 フエノール型ヒ ドロキシ基に対 するエステル結合と比較して、 より速やかに加水分解がなされる。 その結果、 後 処理工程を施した、 最終的に得られる反応産物においては、 より高い選択性を持 つて、 N末端のアミノ基に対する N—アルカノィル化、 リシン残基 （一 NH— C H (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—アル力 ノィル化、 ならびに、 場合によっては、 チロシン残基 （一 NH—CH (CH2-C 6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒ ドロキシ基への〇一アルカノィル化の みが残るものとなる。
例えば、 最終的に得られる反応産物において、 セリン残基やトレオニン残基に ァセチル化がなされたものが多数混入していると、 かかる多ァセチル化体と、 脱 ァセチルがなされたものとの分子量差は、式量 4 2の整数倍、具体的には、 8 4、 1 2 6、 1 6 8は、 セリン残基 （— NH—CH (CH2OH) -CO-) の式量 8 7、 グルタミン残基 （一 NH— CH (CH2CH2-CONH2) —CO—) の式 量 1 2 8、 グルタミン酸残基 （一 NH— CH (CH2CH2-COOH) -CO-) の式量 129、 N—ァセチルリシン残基 （_NH— CH (CH2 CH2 CH2 CH2 NH— COCH3) -CO-) の式量 1 70と類似しており、 場合によっては、 多 ァセチル化体を主なピークと誤認し、 脱ァセチルがなされたものを、 前記するァ ミノ酸の除去がなされたものとする懸念がある。 実際には、 式量差が 1であるグ ルタミン残基とグルタミン酸残基との弁別が可能な分析精度の測定がなされ、 上 述する残留しているァセチル基数の差と、 類似する式量を示すアミノ酸残基の間 では、 式量差が 2〜3であり、 多くの場合、 かかる誤認を生じる可能性は高くな い。 これらを考慮に入れると、 上記の後処理工程を実施し、 不要なアルカノィル 基の残留を排除することが、 より好ましいものである。 実施例
以下に、 実施例を挙げて、 本発明をより具体的に説明する。 なお、 かかる実施 例は、 本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、 本発明はかかる具 体例の形態により限定を受けるものではない。
(実施例 1 )
本発明にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法の有効性を検証する目 的で、 153アミノ酸からなるヘムタンパク質、 ゥマ由来のミオグロビンについ て、 そのタンパク質部分グロビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸配列の解析を行 つた。
本実施例で利用する、 解析対象試料となるゥマ · ミオグロビンのグロビン ·ぺ プチド鎖が有するアミノ酸配列は既に判明しており、 本発明にかかる解析方法で 特定される C末端アミノ酸配列の特定精度を検証した。
(ゲル電気泳動法による単離）
先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 0. 2 μ gZ i L 濃度でグロビン 'ぺプチド鎖部分のみを含有するぺプチド溶液を調製する。なお、 該、 ゥマ · ミオグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖部分には、 ヒ ト · ミオグロビン と異なり、 システィン残基は存在しないが、 仮に、 ヒ ト · ミオグロビンなどのよ うに、 システィン残基を内在するぺプチドに対しては、 該システィン残基のスル ファエル基 （一 SH) の酸化による、 一 S— S—結合の形成を回避するため、 2 一スルファ-ルエタノール、 DTTなどの還元性試薬を添加するなどして、 予め 酸化防止処理を施す。
このぺプチド溶液をゲル濃度 12. 5質量％のポリアクリルアミド ·ゲル上に スポッ トし、 電気泳動処理後、 クーマシー '染色により、 目的とするグロビン ' ペプチド鎖のバンドを特定する。 本例では、 力かる染色バンド部のゲルを切り出 し、 ゲル切片を以下の一連の操作に供する。
(ゲルの脱水処理）
ゲル切片を、 気密性を有するチューブ中に入れ、 ァセトニトリル 1 m 1を注 入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトエトリルを棄て、 新たに、 ァセト 二トリル lm 1を注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用 する、ゲル中に含浸する水の抽出処理を、合計 3回行い、ゲルの脱水処理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生じる。
(前処理操作）
次いで、 チューブ中で、 脱水処理済みのゲル切片に、 10体積％濃度の無水酢 酸のホルムアミド溶液 1 m 1を注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓したチュー ブを攪拌しつつ、 該容器全体の温度を、 50°Cに加熱し、 かかる温度に、 3時間 保持する。
この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミ ドの浸 潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持され ているグロビン'ペプチド鎖に対して、 溶質の無水酢酸が、 前記加熱温度で作用 する結果、 ペプチドの N末端アミノ基に選択的なァセチル化反応が進行する。 加 えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH 2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同時に、 セリ ン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する O—ァセチル 化、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2— C6H4_〇H) -CO-) のフエノ ール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化がなされる。
上記の N末端アミノ基の N—ァセチル化、 ならびに、 アミノ酸残基側鎖の N— ァセチル化、 0—ァセチルイ匕による保護を施した後、 無水酢酸のホルムアミド溶 液を除去し、 チューブ容器中にァセトニトリル 1mlを注入し、 1 5分間攪拌 する。 その後、 前記ァセト-トリルを棄て、 新たに、 ァセトニトリル 1m lを 注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用する、 ゲル中に含浸 するホルムアミド溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨潤ゲル中の脱溶媒 （ホ ルムアミ ド） 処理を行う。 脱溶媒処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。 .
( C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 得られるァセチル基による ί 飾 ·保護を施したグロビン ·ぺプチド鎖 をゲル中に担持されている状態の、 ゲル切片を入れた前記チューブ内に、 ヘプタ フルォロブタン酸 （HFBA : C3F7COOH) 1体積0 /0、 無水酢酸 10体積0 /0 のホルムアミド溶液 1 m lを注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓した容器を攪 拌しつつ、 該容器全体の温度を、 40°Cに加熱し、 かかる温度に、 16時間保持 する。
この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミ ドの浸 潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持され ているぺプチド鎖 C末端に対して、 H F B Aと無水酢酸とを前記加熱温度で作用 させることで、 ペプチド鎖の C末端アミノ酸の選択的分解反応が進行する。 具体 的には、 ペプチドの C末端においては、 プロトン ' ドナーとして機能する HFB Aにより促進される、 下記する反応式 （l a) :
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
で示されるケトーエノール互換異性化、 ならびに、 C末端の力ルボキシ基に無水 酢酸が作用し、 例えば、 下記する反応式 （l b ) :
Figure imgf000042_0003
で示される、 非対称型酸無水物への変換と環状エステル化が進行し、 5—ォキサ ゾロン構造へと一旦、 変換される。 更には、 この 5—ォキサゾロン環から、 例え ば、 反応式 （ΙΙ ' ) で表記される反応：
-Ν 0ト
Figure imgf000042_0004
R m1i 0 VJ (Π ' ) 等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行し て、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。
この C末端アミノ酸の逐次的な分解反応が進行し、 ゲル中には、 段階的に C末 端アミノ酸が除去された、 一連の反応産物と、 初段の 5—ォキサゾロン構造への 変換時点に留まっている、 ァセチル基による修飾 ·保護を施した元のぺプチド鎖 とが含まれた混合物が、 ゲル担体に担持された状態で残される。 かかる C末端ァ ミノ酸の逐次的分解処理を終えた後、 容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や Η F B Α等を含むホルムアミ ド溶液を除去し、 容器中にァセトニトリル 1 m lを 注入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニトリルを棄て、 新たに、 ァセ トニトリノレ lm 1を注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利 用する、 ゲル中に含浸するホルムアミ ド溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨 潤ゲル中の脱溶媒 （ホルムアミド） 処理を行う。 脱溶媒処理に伴い、 ゲル体積の 収縮が生じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物が担持されている状態のゲル切片を入れた 前記容器内に、 DMAE ((CH3) 2N-CH2CH2OH) 10体積％濃度の水 溶液 1 m 1を注入する。 蜜栓した該容器を攪拌しつつ、 容器全体の温度を、 60°Cに加熱し、 かかる温度に、 1時間保持する。 その際、 脱水処理されていた ゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再膨潤し、 本来の体積に復する。 この 再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、 反応産物に対して、 塩基性窒素 含有有機化合物の存在下、 水分子を前記加熱温度で作用させることで、 加水処理 が進行する。
この後処理における加水処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ペプチド の C末端は、 カルボキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾロン構造に留 まったもの、 あるいは、 非対称型酸無水物への変換まで進行したものも、 含まれ た混合物状態となっているため、これらに加水処理を施し、ぺプチドの C末端は、 カルボキシ基となった状態へと変換する処理である。 加えて、 塩基性窒素含有有 機化合物が塩基触媒として機能することに伴い、 ァセチル基による修飾 ·保護を 施したペプチド鎖上に、 セリン残基 （一 NH— CH (CH2〇H) -CO-) ゃト レオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロ キシ基に対する O—ァセチルイ匕保護は加水分解され、 脱保護がなされ、 また、 チ 口シン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性 ヒドロキシ基への O—ァセチルイヒ保護の加水分解に部分的に進む。 但し、 用いる 有機塩基の塩基性は高くないため、 N—ァセチル化保護の脱保護は進まず、 最終 的に後処理工程後には、 より高い選択性を持って、 N末端のアミノ基に対する N ーァセチル化、 リシン残基 (-NH-CH (CH2CH2CH2CH2NH2) — C O—） の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 ならびに、 場合によっては、 チロ シン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒ ドロキシ基への O—ァセチノレ化のみが残るものとなる。
かかる後処理工程を終えた後、 容器内に残留する水溶液を除去し、 容器中にァ セトエトリル 1mlを注入し、 1 5分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニトリ ルを棄て、 新たに、 ァセトニトリル 1mlを注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用する、 ゲル中に含浸する水溶液の抽出処理を、 合計 3 回行い、 再膨潤ゲル中の脱水処理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生 じる。
(トリプシン消化によるべプチド断片化)
ゥマ 'ミオグロビンのグロビン.ペプチド鎖は、 153アミノ酸からなるため、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化によるべ プチド断片化処理を行う。
具体的には、前記の後処理を施し、脱水処理済みのゲル切片を入れた容器内に、 トリプシン含有水性溶液を加え、 ゲル担体上に担持されている状態のまま、 ぺプ チド鎖の断片化を行う。 前記トリプシン含有水性溶液は、 重炭酸アンモニゥム緩 衝液 （pH 8) 中に、 トリプシンを 0. 067 μ
Figure imgf000044_0001
Lの濃度で含有してお り、 トリプシン消化は、 37°Cで、攪拌しつつ、 4時間酵素反応を行う。 その際、 脱水処理されていたゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再膨潤し、 本来の 体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、 反応産物に 対して、 前記緩衝液とともに、 ゲル中に浸入するトリプシンを前記加熱温度で作 用させることで、 トリプシンに特異的な酵素消化が進行する。
なお、 ペプチド鎖、 反応産物は、 前記後処理工程における脱保護によっても、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) — CO— ) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化は保持 された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチル化リシン残基 の c末側ぺプチド結合の切断はなされず、 アルギユン残基の C末側べプチド結合 切断のみが進行する。 このゥマ ' ミオグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖が有する アミノ酸配列は既に判明しており、 図 4に示す 1 5 3アミノ酸からなる元のぺプ チド鎖は、 1— 3 1、 3 2— 1 3 9、 1 4 0 - 1 5 3の各部分ァミノ酸配列を含 む断片に、 トリプシン消化を受ける。 従って、 上述する C末端アミノ酸の逐次的 分解処理で生成される一連の反応産物は、 前記 1 4 0— 1 5 3ァミノ酸の部分ァ ミノ酸配列を含む C末断片とともに、 各 C末端ァミノ酸に相当する分子量差を示 す、 一連の質量分析ピークを与える。 なお、 図 4には、 前処理操作に伴い、 N— ァセチルイ匕保護が施されるリシン残基を網かけ表示で示し、 さらには、 トリプシ ン消化による、 アルギニン残基の C末側ぺプチド結合切断で生じる、 1一 3 1と 1 4 0 - 1 5 3の各部分ァミノ'酸配列を太字で示す。
かかるトリプシン消化処理工程を終えた後、 ゲル中から容器内のトリプシン溶 液中に溶出する断片化されたぺプチドを回収する。 回収されたぺプチド断片の混 合物を含む溶液について、 脱塩処理を施した後、 凍結真空乾燥処理を行う。
(後処理、 トリプシン消化によるべプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産物 とグロビン 'ペプチド鎖の C末断片との混合物について、 質量分析法により、 含 有される各べプチド断片の分子量の測定を行う。
本実施例では、 上記乾燥処理を行ったペプチド断片混合物試料に対して、 質量 分析装置、 具体的には、 MA L D I— T O F— M S装置を利用し、 各ペプチド断 片の分子量を反映する主イオン種ピークの質量と、その相対的な信号強度の測定、 比較を行う。 なお、 かかる MA L D I— T O F— M S装置を利用する測定では、 イオン種の分別は、 負帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ネガティブ 'モードの 測定を採用している。
図 2は、 上述する本実施例の一連の処理法で、 C末端ァミノ酸の逐次的分解処 理を施した反応産物のトリプシン消化断片を含む混合物について、 測定された質 量分析スペク トルを示す。 表 1に、 測定されたピークの質量値、 元のグロビン · ペプチド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから 特定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応 産物の形態を示す。
表 1
Figure imgf000046_0001
元のグロビン ·ペプチド鎖中、 前記 1 40_ 1 5 3アミノ酸からなる C末断片 の部分アミノ酸配列は、 二つのリシン側鎖上の N—ァセチル化されている、 ND I AAK (Ac) YK (Ac) ELGFQGであり、 図 1に示される一連のピー クは、 その C末端から、 二つのアミノ酸、 グリシンとグルタミンが逐次的に分解 されたものに相当することが確認される。 すなわち、 解析対象である上述のゲル 切片上のパンドとして分離されるペプチド鎖は、 実際に、 グロビン 'ペプチド鎖 であることが、 検証される。
(参考例 1 )
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法は、 一連の反応操作を 解析対象のぺプチド鎖をゲル電気泳動法による単離し、 力かるゲル担体上に担持 した状態で行っている点に最大の特徴を有するが、 その解析確度は、 予め、 ぺプ チド鎖のみとした上で、 C末端アミノ酸配列解析を進めた場合と、 本質的に、 何 ら遜色の無いことを確認する目的で、 ゲル担体上に担持されていない状態におい て、 上述するゥマ · ミオグロビンのタンパク質部分グロビン ·ぺプチド鎖の C末 端ァミノ酸配列解析を行つた。
(単離、 乾燥ペプチド粉末試料の調製）
先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 1. 0 μ gZ L( 濃度でグロビン ·ぺプチド鎖部分のみを含有するぺプチド溶液を調製する。 前記 ぺプチド溶液を試験管に採り、凍結乾燥して、乾燥べプチド粉末試料を調製する。 (前処理操作）
次いで、 この乾燥ペプチド試料を収納したバイアルを、 テフロン製コックバル プ封止される真空排気用のポートを具えた、 共栓付き気密試験管型のガラス製反 応容器内に装着し、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量 入れる。 前処理用の試薬として、酢酸を 5体積％添加した無水酢酸（300 w L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥べプチド試料を収納したバイアルを収納 した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 50°C、 2時間保温して、 容器内の液状試薬 から供給される、 蒸気状の無水酢酸と酢酸を、 乾燥ペプチド試料に作用させる。 このァシル化試薬として、 無水酢酸を酢酸共存下で、 乾燥ペプチド試料に作用さ せることで、 ぺプチドの N末端ァミノ基に選択的なァセチ /レイヒ反応が進行する。 加えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2C H2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同時に、 セ リン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— C H (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する〇一ァセチ ル化、 チロシン残基 （― NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエ ノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化がなされる。
かかる前処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や酢酸等 を減圧留去するとともに、 得られる保護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖の乾 燥を行う。
(C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 得られるァセチル基による修飾 ·保護を施したグロビン ·ぺプチド鎖 を保持しているバイアルを、 同じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容器内 に装着した状態で、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量 入れる。
この C末端アミノ酸の選択的分解反応用の液状試薬として、 ヘプタフルォロブ タン酸（H F B A : C 3 F 7 C O O H) を 1体積0 /o添加した無水酢酸 ( 3 0 0 μ L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥試料を収納したパイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 4 0 °C、 3時間保温して、 容器内の液状試薬 から供給される、 蒸気状の無水酢酸と H F B Aを、 乾燥ペプチド試料に作用させ る。 その間、 ペプチド鎖 C末端に対して、 H F B Aと無水酢酸とを前記加熱温度 で作用させることで、 上述する実施例 1に記載する反応式 （I a ) 〜 （I I ' ) の 反応経路を経て、 ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸の逐次的分解反応が進行する。 かかる C末端ァミノ酸の選択的分解処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や H F B A等を減圧留去するとともに、 残余するァセチル化保 護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖と得られる反応産物との混合物の乾燥を行 5。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物の乾燥試料を保持しているバイアルを、 同 じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガラス 製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
この後処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ペプチドの C末端は、 カル ボキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾロン構造に留まったもの、 ある いは、 非対称型酸無水物への変換まで進行したものも、 含まれた混合物状態とな つているため、 これらに加水処理を施し、 ペプチドの C末端は、 カルボキシ基と なった状態へと変換する処理である。 すなわち、 後処理用の液状試薬として、 D MA Eを 1 0体積％溶解した水溶液 （3 0 0 i L ) を用い、 前記ガラス製反応容 器内に乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排 気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 6 0 °C、 1時間加熱して、容器内の液状試薬か ら供給される、 蒸気状の DMA Eと水分子を、 乾燥試料に作用させる。 非対称型 酸無水物ならびに 5—ォキサゾロン構造は、 有機塩基である DMA Eの共存下、 水分子を作用することで、 加水がなされ、 C末端にカルボキシ基を有する形状に 変換される。 加えて、 ァセチル基による修飾 ·保護を施したペプチド鎖上に、 セ リン残基 （一 NH— CH (CH2〇H) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— C H (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する〇一ァセチ ル化保護は加水分解され、 脱保護がなされ、 また、 チロシン残基 （一 NH— CH
(CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒ ドロキシ基への O—ァセ チルイ匕保護の加水分解に部分的に進む。 但し、 用いる有機塩基の塩基性は高くな いため、 N—ァセチル化保護の脱保護は進まず、 最終的に後処理工程後には、 よ り高い選択性を持って、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基
(-NH-CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基へ の Ν—ァセチル化、 ならびに、場合によっては、 チロシン残基（一 ΝΗ— CH (C H2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル 化のみが残るものとなる。
かかる後処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 残余している水分子や DM A E等を減圧留去するとともに、 後処理済み反応産物の混合物の乾燥を行う。
(トリプシン消化によるべプチド断片化）
ゥマ'ミオグロビンのグロビン'ぺプチド鎖は、 153アミノ酸からなるため、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化によるぺ プチド断片化処理を行う。
具体的には、前記後処理済み反応産物の混合物を乾燥した試料を容器内に入れ、 トリプシン含有水性溶液を加え、 ぺプチド鎖の断片化を行う。 前記トリプシン含 有水性溶液は、 3—ピリジン酢酸緩衝液 （pH 7) 中に、 トリプシンを 0. 1 β g/β Lの濃度で含有しており、 トリプシン消化は、 37°Cで、 攪拌しつつ、 8時間酵素反応を行う。
なお、 ペプチド鎖、 反応産物は、 前記後処理工程における脱保護によっても、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2
4フ CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化は保持 された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチルイヒリシン残基 の C末側べプチド結合の切断はなされず、 アルギニン残基の C末側ぺプチド結合 切断のみが進行する。 このグロビン ·ぺプチド鎖が有するアミノ酸配列は既に判 明しており、 1 53アミノ酸からなる元のペプチド鎖は、 1一 31、 32-1 3 9、 140-153の各部分ァミノ酸配列を含む断片に、 トリプシン消化を受け る。 従って、 上述する C末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成される一連の反応 産物は、 前記 140— 1 53ァミノ酸の部分ァミノ酸配列を含む C末断片ととも に、 各 C末端アミノ酸に相当する分子量差を示す、 一連の質量分析ピークを与え る。
トリプシン消化後、反応液は、 Z i p T i pを利用して、脱塩処理、ならびに、 ぺプチド断片の分離 ·回収を行った後、 これらべプチド断片の真空乾燥を行う。
(後処理、 トリプシン消化によるべプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産物 とグロビン'ペプチド鎖の C末断片との混合物について、 質量分析法により、 含 有される各べプチド断片の分子量の測定を行う。
本参考例では、 乾燥したペプチド断片混合物試料に対して、 質量分析装置、 具 体的には、 MALD I— TOF— MS装置を利用し、 各ペプチド断片の分子量を 反映する主ィオン種ピークの質量と、その相対的な信号強度の測定、比較を行う。 なお、 かかる MALD I— TOF— MS装置を利用する測定では、 イオン種の分 別は、 負帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ネガティブ ·モードの測定を採用し ている。
図 3は、 上述する本参考例の一連の処理法で、 C末端ァミノ酸の逐次的分解処 理を施した反応産物のトリプシン消化断片を含む混合物について、 測定された質 量分析スペク トルを示す。 表 2に、 測定されたピークの質量値、 元のグロビン · ペプチド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから 特定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応 産物の形態を示す。
Figure imgf000051_0001
本参考例の蒸気状の試薬を利用する処理法では、 C末端アミノ酸の逐次的分解 処理により、 C末端から 4アミノ酸；グリシン、 グルタミン、 フエ-ルァラニン、 グリシンの除去された一連の反応産物が得られている。 また、 前記 1 4 0—1 5 3アミノ酸の部分アミノ酸配列を含む C末端ぺプチド断片等のピーク以外に、 ト リプシン消化により派生するぺプチド断片、 1— 3 1アミノ酸部分、 7 8— 1 0 2アミノ酸部分に相当する、二つのピーク （分子量： 2 9 9 6 . 1 8、 3 4 8 5 . 4 8 ) も観測されている。 なお、 前記 7 8—1 0 2アミノ酸部分に相当する断片 は、 N—ァセチル化保護のうち、 その一部が加水処理に際して、 脱保護され、 そ の結果、 トリプシン消化によって副生したものである。
なお、 表 1と表 2に示す、 C末端アミノ酸の逐次的分解処理に起因する一連の ピークは、 良い対応を示しており、 本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配 列解析方法において、 解析対象のペプチド鎖をゲル中に担持した状態で、 C末端 アミノ酸の逐次的分解を進めた際にも、 本質的に遜色のない解析確度が達成され ていることが確認される。 産業上の利用の可能性
本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 ペプチドの C末端 アミノ酸を逐次的に分解除去する手段として、 対象とするペプチドを、 予めゲル 電気泳動法による分離を行った後、 該ゲル担体上に担持された状態のままで、 極 性非プロトン性溶媒を用いてゲル担体の脱水処理を行った後、 脱水処理によって 収縮したゲル担体を、そのゲル状物質内に浸潤でき、膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対 して少量となる比率で溶解してなる混合溶液中に浸漬することにより、 3 0 °C〜 8 0 °Cの範囲に選択される温度において、 ゲル担体の再膨潤を行うとともに、 担 持された状態の対象とするぺプチド試料にアル力ン酸無水物とパ一フルォロアル カン酸とを作用させ、 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開 裂に伴い C末端アミノ酸の分解を行って、 一連の反応産物を調製する手法を採用 している。かかる手法では、利用するアルカン酸無水物自体、反応性が低いため、 ぺプチドの途中におけるぺプチド結合の分断等の不要な副次反応を引き起こすこ となく、 ぺプチドの C末端ァミノ酸を逐次的に分解除去することが可能となる。 さらには、 かかる穏和な条件での反応を利用することで、 得られる一連の反応産 物において達成される、短縮される C末端アミノ酸配列の最大アミノ酸長の調節、 制御性もより優れたものとできる。 従って、 このペプチドの C末端アミノ酸を逐 次的に分解除去する際の優れた制御性、 ならびに、 穏和な反応条件、 例えば、 反 応温度の許容される変動幅の広さの利点に加えて、 予めゲル電気泳動法による分 離を行った後、 ゲル担体上に担持された状態のままで解析を行うため、 ゲル担体 上から分離 '回収する煩雑な工程を省き、 また、 分離 ·回収時の低い収率による 試料損失を回避できるという実用上の利点を具えており、 本発明にかかるぺプチ ドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 より汎用性に富む解析方法となる。

Claims

請求の範囲
1 . 解析対象とするペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解し て得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法によ り分析し、 力かる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程 と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸を 特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の対 象とするぺプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 か つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去するこ とにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶 媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することによ り、 担持された状態の対象とするペプチド試料にアルカン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000053_0001
(式中、 R lは、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端ァミノ酸の逐次的分解を行う工程と、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の 溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒 を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行うェ 程とを有する、 対象とするぺプチド試料を該ゲル担体上に担持された状態で処理 する方法によりなされ、
該ゲル担体上に担持された状態のまま、 前記の C末端アミノ酸を逐次的に分解 する処理を施して、 得られる一連の反応生成物ならびに元となるペプチドとを含 む混合物を、 前記質量分析工程に供することを特徴とするぺプチドの C末端ァミ ノ酸配列解析方法。
2 . 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率 で溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のァ ルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記 載の方法。
3 . 前記炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の 直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 2 項に記載の方法。
4 . 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率 で溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いる ことを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
5 . 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率 で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パーフ ルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロア ルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
6 . 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比率 で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に 記載の方法。
7 . 前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸として、炭素数 2〜4の直鎖パ 一フルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項に記載の 方法。
8 . 前記パーフルォロアル力ン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率 で溶解してなる混合溶液中における、 アル力ン酸無水物とパーフルォ口アル力ン 酸との含有比率は、 アルカン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜2 0容の範囲に選択することを特徵とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方 法。
9 . 前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際して、 前記反応系は、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保たれることを 特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
1 0 . 前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程では、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理後、 極性非プロト ン性溶媒を用いて、 該混合溶液を希釈除去することにより、 分解反応の停止と反 応試薬の除去を行う工程を終えた後、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生 成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付加的な加 水処理と再脱水処理の工程を設けることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記 載の方法。
1 1 . 前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程では、
前記双極性非プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に先立ち、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアル力ン酸無水物を作用させ、対象とするぺプチドの N末端のァミノ基に、 予め、 前記ァルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァシル基による N —ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 な らぴに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を 用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシル化反応の停止と反応試薬の除去を 行う前処理工程を設けることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
1 2 . 該 N末端に対する N—ァシル化保護を施す前処理工程で利用する前記ァ ルカン酸無水物と、 その後に実施する前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解するェ 程で利用する前記アル力ン酸無水物とに、 同じアル力ン酸無水物を用いることを 特徴とする、 請求の範囲 第 1 1項に記載の方法。
1 3 . 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状 態の対象とするぺプチド試料の調製は、
該ゲル担体として、 ポリアクリルアミド ·ゲルを用いる電気泳動法を利用して なされることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法。
1 4 . 前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとを、 質量分析法により分 析する工程において、 該質量分析法として、 MA L D I— T O F型質量分析法を 選択することを特徴とする、 請求の範囲 第 1項に記載の方法,
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