JPH06504378A

JPH06504378A - ジフェニルホスホロイソチオシアナチデートとピリジンを用いたペプチドｃ末端配列決定

Info

Publication number: JPH06504378A
Application number: JP4507263A
Authority: JP
Inventors: ベイリー，ジェローム・エム; シブリー，ジョン・イー
Original assignee: シティ・オブ・ホープ
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1992-02-07
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: EP0575463A4; AU653020B2; DE69232097D1; US5180807A; AU1530892A; JP3251941B2; DE69232097T2; EP0575463A1; WO1993011436A1; CA2101449A1; EP0575463B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ジフェニルホスホロイソチオシアナチデートとピリジンを用いたペプチドＣ末端配列決定本出願は、１９９１年１２月３日に出願されたＢａ１ｌｅｙの米国出願Ｎｏ、０７／８０１，９４４の一部継続出願である。

発器Ω分団本発明は、新たな試薬の組み合わせを利用して、ペプチドのＣ末端分析を自動化する方法に関する。とくに、ジフェニルホスホロイソチオシアナチデートとピリジンを用いたペプチドのＣ末端分析に関する。

光皿Ω背及Ａ、技術背景多くの、クローン化された遺伝子の産物やペプチドの一次構造を決定するためにＤＮＡの塩基配列決定が広く行われているが、これにより、カルボキシル末端（Ｃ末端）配列決定の必要性が増してきた。Ｃ末端配列決定は、エドマン分解法（Ｅｄｍａｎ、Ｐ、Ａｃｔａ、Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、４：２８３−２９３　（１９５０））に基づいた既存のＮ末端分析を補足するものである。従来、多くの方法か提案されてきたが（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ、Ｍ。

、Ｃｈｅｍｉｃａｉ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｃａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｎｄ、Ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｒｏｗｎ、Ａ、Ｓ、、Ｅｄ、）ｐｐ、１３５−１４４．ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ　（１９８８）および　Ｗａｒｄ。

Ｃ，Ｗ、、Ｃａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａＩｙｓｉｓ、　Ｉｎ　Ｐｒａｔｉｃａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−− Ａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　（Ｄａｒｂｒｅ、Ａ、、Ｅｄ、）ｐｐ、４９１−５２５．　Ｊｈｏｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、Ｌｔｄ、（１９８６））、しかし、５ｃｈｌａｃｋとＫｕｍｐｆにより初めて提案されたチオシアネートを用いた方法（Ｚ、Ｐｈ　５ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、１５４：１２５−１７０　（１９２６））は、エドマン分解法に類似していることから、よく研究され、広く利用されている。この方法は、タンパク或いはペプチドをインチオンアネート試薬と、無水酢酸の存在下において反応させてＣ末端チオヒダントインアミノ酸を形成させることによる。誘導体を形成したアミノ酸は、次いで加水分解され、短縮されたペプチドおよびチオヒダントインアミノ酸を生じる。チオヒダントインアミノ酸は、Ｅｄｍａｎ分解法で生成されるフェニルチオヒダントインアミノ酸と同様のＵＶ吸収スペクトルと、等しい吸光係数を持つので、チオシアン酸を用いた方法の感度は、現在のＮ末端分析法（１０−２００ｐモル、２０−３０サイクル）の感度と同様であると期待される。現在のところ、この方法の主な欠点としては、Ｃ末端アミノ酸を完全に誘導体にするための条件、および短縮ペプチドとチオヒダントイン誘導体を生成させるための加水分解の条件が厳しいことが挙げられる。この加水分解条件の緩和を試みた研究グループもある（Ｗａｌｅｙ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、１９５１：２３９４−２３９７　（１９５１）；Ｋｊａｅｒ、ｅｔ　ａｌ、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、６：４４８−４５０　（１９５２）；Ｔｕｒｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ、１３：５５３−５５９　（１９５４））、しかし、穏やかで、迅速な切断試薬としてアセトヒドロキサム酸か導入されて（３ｔ　ａｒｋ、Ｇ、Ｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　７：１７９６−１８０７　（１９６８））、ようやく加水分解の問題か解決されたように思われた。トリメチルシリルイソチオシアネート（以下ＴＭＳ−ＩＴＣ）の導入（米国特許Ｎｏ、４，８３７，１６５）により、チオヒダントインの形成収率が上かり、複雑な副産物の数を減らすことができたのである。しかし、繰り返し反応の収率は低く、分解のサイクルを２ないし３残基までに制限せねばならなく、またアミノ酸の中にはチオヒダントインを生成できないものもあると報告されている（Ｈａｗｋｅ、ｅｔ　ａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６６：２９８−３０７　（１９８７）：Ｍｉ　ｌ　ｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｈｕｇｌｉ、Ｔ、Ｅ、、Ｅｄ、）ｐｐ、６７−７８．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ（１９８９））。

最近、Ｂａ１ｌｅｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２９：３１４５−３１５６　（１９９０））は、アセトヒドロキサム酸を用いた加水分解により、Ｃ末端に安定なヒドロキサム酸エステルをもつ短縮ペプチドの形成が誘導されそのためそれ以上の分解か阻害され、この試薬の使用による繰り返し反応の低収率が説明できることを発見した（Ｍ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅ　ｒ　、１旦工」」シＭ　ｅ　ｕｔｈ、ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１；３７５０−３７５７　（１９８２））。

水で希釈したトリエチルアミンを用いて加水分解を行うと、分解を継続することのできるチオヒダントインアミノ酸と、短縮ペプチドが生成されることか分かった。さらに、チオシアネート法の一般性を、天然に存在する大部分のアミノ酸を含むモデルペプチドとＴＭＳ−’ＩＴＣとの反応を例として説明した（　Ｂ　ａ　ｉ　Ｉ　ｅ　ｙ　ユ旦■Ｌ互）　。分解の最中に、Ｐｒｏ、Ａｓ凱　Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡｓｎがＣ末端に現れると問題が生じた。しかし、無水酢酸との反応時間をできるたけ短縮すると、ＧｌｕとＴｈｒの定量的分解が可能になり、ＴＭＳ　ＩＴＣとの誘導体形成に先駆けて核試薬を添加することにより、Ｃ末端のＡｓｐを部分分解することが可能になった。

Ｃ末端分析の自動化は、幾つかのグループにより提案されてきた。そして、固相（固体の担体に共有結合させたポリペプチド）に対し、この反応を行うことにより、より一層の自動化か可能になった。ポリペプチドを固体担体に共有結合させたことによる利点として次のことか挙げられる。つまり、サンプルの流出の防止により、初期、或いは繰り返しの反応において高収率か得られ、誘導体形成反応や洗浄に最適な試薬や溶媒を使用することが可能となり、そしてチオヒダントイン形成反応により生じた副産物の効率的な除去が可能になるため、低いバックグラウンドで反応を行うことができる。固相のＮ末端分析（Ｅｄｍａｎ法）の概念は、初め、Ｌａｕｒｓｅｎにより提唱され（Ｌａｕｒｓｅｎ、Ｒ，−Ａ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０：８９−１０２　（１９７１））、以来、多くのグループにより利用されてきた（Ｌａｕｒｓｅｎ、ｅｔ　ａｔ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２１　＝　６７−７０（１９７２）；Ｌ’　Ｉｔａｌｉｅｎ、ｅｔ　ａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１至ヱ：１９８−２１２　（１９８２）；Ｌ’　Ｉ　ｔａｌｉｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ。

（Ｓｈｉｖｅ　Ｉｙ、Ｊ、Ｅ、、Ｅｄ、）ｐｐ、２７９−３１４．Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、（１９８６））ｏチオシアネート法を用いて、共有結合したペプチドのＣ末端分析を行うという試みは、幾つかのグループによりなされている。Ｗｉｌｌｉａｍら（ＦＥＢＳ　Ｌｅ　ｔ　ｔ、５４　：　３５３−３５７　（１９７５））は、ペプチジルチオヒダントインの切断に１２Ｎ塩酸を用い、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドで活性化したガラスピーズに共有結合させたペプチド（１μモル）に対し、１−３サイクルの反応を行った。

同じ方法を利用して、Ｒａｎｇａｒａ　ｊａｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１５ユニ　３０７−３１６　（１９７６））は、ガラスピーズに共有結合したりボヌクレアーゼ（１μモル）を１サイクル５−６時間として、６サイクル解析を行った。まｔ二、Ｍｅｕｔｈら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１：３７５０−３７５”！（１９８２））により、カルボニルジイミダゾールで活性化されたアミノプロピルガラスに共有結合している２２アミノ酸のポリペプチド（３５０ｎモル）の解析をおこない、３サイクルで遊離アミノ酸チオヒダントインのＨＰＬＣによる解析に成功している。彼等は、ペプチジルチオヒダントイン誘導体形成のためにチオシアネートを用い、１サイクル当たりの所要時間を３時間にまで抑えるため、アセトヒドロキサム酸を用いている。Ｉｎｇｌｉｓら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　（Ｗｉ　ｔｔｍａｎｎ−Ｌｅｂｏｌｄ、Ｂ、、Ｅｄ、）ｐｐ、１３７−１４４．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ　ｌａｇ　（１９８９））による、より最近の報告では、１サイクル４８分で、ガラスピーズに共有結合した合成１０残基のペプチド（３０ｎモル）から９残基の分解をおこなったという報告かある。しかし、この実験詳細については、知らされていない。

ペプチドや蛋白質のＣ末端分析に、自動化チオシアネート法を用いることに関しては、初期の研究で下記の幾つかの問題が見つかっている：（１）アセトヒドロキサム酸によるペプチジルチオヒダントインの切断により、安定なヒドロキサム酸エステルが形成され、短縮ペプチドの次なるＣ末端からの分解反応は阻害されてしまう。

（２）水で希釈したトリエチルアミンを用いてペプチジルチオヒダントインを切断すると・短縮ペプチドの分解反応は阻害されな（Ａが、ポリビニルレジフルオライド（ＰＶＤＦ）に共有結合したペプチドに対して水溶液を用いると、担体を十分に濡らすことができす、５０℃においては切断が起こらず、７０℃に温度を上げても、切断反応はわずかじか起こらない。希トリエチルアミン溶液に水と混和性の有機溶媒を３０％含ませると、膜の担体を十分に濡らすことができたが、切断反応は著しく阻害された（Ｂａｉ　ｌｅｙ、ｅｔａｌ、、Ｃａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｉ　Ｉ　（Ｖｉ　ｌ　１ａｆｒａｎｃａ、Ｊ、Ｊ、、Ｅｄ、）ｐＩ）、１１５−１２９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、（１９９１）、）。

（３）無水酢酸でＣ末端カルボン酸を活性化すると、２０種の天然アミノ酸のうちあるものは配列決定が妨げられたり収率が低下することが知られている。例えば、Ｔｈｒ、ＡｓｐＸＧｌｕ、Ｐｒｏ（Ｂａｉｌｅｙ、ｅｔ　ａｌ９．主且且工互（１９９０）。

切断における問題点は、共有結合したペプチジルチオヒダントインの切断を行う新試薬、ソジウムトリメチルシラル−トにより、およびペプチドサンプルの共有結合のための修飾カルボキシル基を持つポリエチレン担体を用いることによって解決された（例えば、国際特許出願　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２７２３）。この新しい切断試薬は、ペプチジルチオヒダントインを特異的に加水分解し、さらなるＣ末端からの配列決定が可能な短縮ペプチドとチオヒダントインアミノ酸とを生じる。

チオヒダントインアミ酸は、ＨＰＬＣで同定される。

Ｂ、Ｃ端アミノ　の　体イチオシアネート法によるＣ末端分析は、２つの反応よりなっている。

（１）Ｃ末端アミノ酸のチオヒダントイン誘導体形成反応、および（２）Ｃ末端チオヒダントインの特異的分解による、連続分解が可能な短縮されたペプチドとチオヒダントインアミノ酸との生成反応。

１９１１年に初めてこの反応か報告されてから（Ｊｈｏｎｓｏｎ、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、３３：１９７３−１９７８　（１９９１））、アミノ酸を対応するチオヒダントインの誘導体にする方法が研究されてきたが、無水酢酸とチオシアネートイオンによるペプチジルチオヒダントイン形成の機構はまだよく理解されていない。初期の実験においては、無水酢酸と酢酸がチオシアン酸アンモニウムと反応して、最初にチオシアン酸が生成し、チオヒダントイン形成に実際に作用するのは、このチオシアン酸であるという仮定が確認された（Ｊｈｏｎｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、３５　：１１３６−１１４３　（１９１３））、チオシアン酸の種々の塩の様々なチオヒダントイン形成能力の差異は、無水酢酸と酢酸との反応において各基が有するチオシアン酸の形成能力に起因すると考えられた（Ｊｈｏｎｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、３７　：　２４０６−２４１６　（１９１５））。より簡便なチオシアン酸調製法が開発された際に、無水酢酸存在下でチオシアン酸はチオシアン酸の塩よりも、２−チオヒダントインの形成反応を起こしやすいことが分かった。その結果、チオシアン酸はＫｕｂｏら（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕ　ｌ　ｌ、１９　：２１０−２１１　（１９７１））により利用され、最近ではＩｎｇｌｉｓら（亙且且エエ（１９８９））もＣ末端からのペプチド分析に利用している。しかし、チオシアン酸の基本的欠点の１つとして、常温においてさえも、自己反応しやすく、すぐに、ペプチドを誘導する能力を失ってしまうことがあげられる。また、このチオシアン酸重合体は、チオヒダントイン検出に用いるのと同波長のＵＶを吸収し、遊離されたチオヒダントインアミノ酸のＨＰＬＣによる同定を阻害する。分析方法の自動化の際には、室温で試薬瓶中の試薬を安定に保管する必要があるので、フリーのチオシアン酸の不安定性は少々面倒である。Ｉｎｇｌｉｓらにより記述されているように（Ｃ−ｔｅｒｍ１ｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｊｏｒｎｖａｌｌ／Ｈｏｏｇ／Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ、Ｅｄｓ、）ｐｐ、２３−３４．Ｂｉ　ｒｋｈａｕｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａ５ｅｌ　（１９９１））、チオシアン酸の安定性を増す１つの方法としては、自動装置中にある間は冷凍しておくことである。チオンアン酸の使用により起こる問題に対し、より低コストで便利な解決法としては、Ｃ末端アミノ酸をチオヒダントインの誘導体にするために、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）を利用することか挙げられる（米国特許　４，８３７，１６５）。シリル化アミンは、対応する未置換アミンよりも優れた核試薬であるとしばしばいわれているが（Ｆｌｅｍｉｎｇ、　Ｉ、、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、３　（Ｊｏｎｅｓ、Ｄ、Ｎ、、Ｅｄ、）ｐｐ、５４１−６８６．　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７９））、実際、トリメチルシリル基には２つの利点がある：（１）チオシアネートを安定化するので、自己反応の問題を解消する点。

（２）チオシアネートがチオヒダントインを形成する能力を低下させない点チオヒダンイン形成における中間体は長年にわたる研究課題であった。この反応が初めて研究された時、無水酢酸とチオシアン酸アンモニウムとからのアミノ酸チオヒダントインの形成に必要な中間体として、オキサシリノンが挙げられた（Ｊｈｏｎｓｏｎ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ。

ｃ、３５：１１３６−１１４３　（１９１３））。無水酢酸とＴＭＳ−ＩＴＣトＣＤ反応（Ｂ　ａ　ｉ　ｌ　ｅ　ｙ、ｓ且且二ａ　（１９９０））においてＣ末端アミノ酸のラセミ化がみられたことは、ペプチドと無水酢酸との反応ではペプチドオキサシリノンが生成することを示唆している。これは、上述の予測されたメカニズムと一致する。オキサシリノンの形成は、アミノ酸のラセミ化を起こすことも知られている（Ｃｓｏｎｋａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、９９：２１３−２１６　（１９３３）：Ｃａｒｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ。

、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１３３：１１７−１２８　（１９４０）；Ｇｏ。

ｄｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８６：２９１８−２９２２　（１９６４））。さらに、Ｃ５ｏｎｋａら（且且且工互）により、アミノ酸チオヒダントイン形成の際のオキサシリノン中間体の存在について、さらに別の証拠が得られた。実際に、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ、Ｊ、Ｗ、（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎ、ｐｐ、６８８−８４８．Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９４９））の研究によっても、チオヒダントイン形成におけるオキサシリノン中間体の生成か、吸光と偏光を用いてオキサシリノンの形成速度を追跡することによって示された。事実、オキサシリノンが一旦形成されると、イソチオシアン酸との反応は、２−フェニル −４−ペンズリルー５−オキサシリノンの場合では、０℃ですぐに起こり得るほど十分に容易であることが分かった（Ｃｏ　ｒ　ｎ　ｆ　ｏ　ｒ　ｔ　ｈ　（１９４９）　−［ｄシコエ）。

カルボン酸の活性化は典型的にはチオシアネート試薬の存在下で行われる。

ＪｈｏｎｓｏｎとＮ１ｃｏｌｅｔ　（１９１１）により最初に使用された無水酢酸は、活性化のために最も一般的に用いられた試薬で、現在でも有用な試薬である。無水プロピオン酸も無水酢酸と同様、活性化に有効な試薬であり、しかし無水安息香酸は無効な試薬である（Ｊｈｏｎｓｏｎ、ｓ旦且エエ（１９１５））、Ｋｕｂｏらはまた（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａ　ｒｍ、Ｂｕ　ｌ　１．１９：２１０−２１１　（１９７１））、アセチルクロライドも活性化に有効であることを発見した。Ｗｏｏｄｗａｒｄの試薬Ｋ　（Ｗｏ　ｏ　ｄｗａ　ｒ　ｄ、ｅ　ｔａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｓｕ　１．７：４１５−４４０　（１９８６））も、有効な活性化剤であることが最近示された（Ｈａｗｋｅ、ｅｔａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３１：３８４９−３８５２　（１９９０））。ジシクロへキシルカルボジイミドも、チオヒダントインを高収率で形成するためのＴＭＳ−ＩＴＣとの反応に適する活性化カルボキシル基を生成することが可能であることが、出願人らによって示された。これらすべての活性化剤の共通項としては、蛋白や、ペプチドのＣ末端にオキサシリノンを形成することが可能であることであるといえる。

最近、Ｃ末端に自然界に存在する大部分のアミノ酸を含んだモデルペプチドを用いて、無水酢酸とＴＭＳ−ＩＴＣとの反応が調べられた（Ｂａｉｌｅｙ、ｅ　ｔ　ａ　１．　、１旦■エエ（１９９０）　）　ａその結果、無水酢酸とＴＭＳ− ＴＴＣとの反応は分離させて、各反応段階を独立におこすことができることが分かった。Ｃ末端にＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏがある場合には問題が生じた。この問題は、無水酢酸による活性化のステップで生じた。Ｇｌｕａ、Ａｓｐの両者は、無水酢酸存在下においては迅速に環状無水物を形成し、これはＴＭＳ− ＩＴＣあるいはチオシアン酸塩と反応しない。Ｇｌｕの場合、初めは運動論的に好ましいＴＭＳ−ＩＴＣと反応できる５員オキサシリノン環を形成するが、急速に熱力学的に一層安定な６員環状無水物に変換され、この６員環状無水物はＴＭＳ−ＩＴＣとの反応を行うことはできない。オキサシリノンが最初に形成されるので、無水酢酸との反応時間を最小にすれば、Ｃ末端のＧｌｕをチオヒダントインに変える誘導反応を８０％まで達成できる（Ｂａ　ｉ　ｌ　ｅｙ、ｅ　ｔ　ａ　１．　、　互旦且り主（１９９０）　）。

Ｃ末端のＡｓｐの場合、環状無水物の形成は大変迅速であり、液相での手動配列決定の場合には、チオヒダントインＡｓｐの形成は、まったく見られなかった（Ｂａｉ　ｌｅｙ、ｅｔ　ａｌ、、　互旦且工互（１９９０））。Ａｓｐは無水酢酸との反応で、チオシアン酸と反応することのできない環状無水酢酸を形成することが知られている（Ｎｉｃｏｌｅｔ、Ｂ、Ｈ，、Ｊ、Ａｍｒｋｅｒ、Ｃ，Ｃ，Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、４５３−４５６　（１９５３）；５ｔａｒｋ、Ｇ、Ｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｖ　７：１７９６−１８０７（１９８６））。

初めは、無水酢酸との反応で、チオヒダントイン形成に必要なＣ末端Ａｓｐのオキサシリノンの形成が起こるが、その後すぐに熱力学的に一層安定でＴＭＳ−ＩＴＣとの反応を起こさない、５員環状無水物に変換されてしまうと考えられた。

無水酢酸との反応において、Ｔｈｒはすぐに、チオヒダントイン形成のためのＴＭＳ−ＩＴＣとの反応を行うことのできるオキサシリノンを形成するが、このオキサシリノンは側鎖のヒドロキシル基が容易に脱水されて、ＴＭＳ−ＩＴＣと反応できない不飽和オキサシリノンを形成する。

Ｐｒｏには、第３級アミノ基が存在するため、オキサシリノンを形成することができない（Ｍａｔｓｕｏ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、２２＋６９−７４　（１９６６）；Ｈｏｌｃｏｍｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　４：１２９１−１２９６　（１９６８））。よって、ＴＭＳ−ＩＴＣとの反応は線状無水物中間体の混合物を介して行わねばならない。ＴＭＳ−ＩＴＣは、ＡｓｐがペプチドのＣ末端にある場合に形成される環状無水物とは反応しないので（Ｂａｉｌｅｙ、ｓＷ）　、これより、Ｔ　Ｍ　Ｓ　−Ｉ　Ｔ　ＣはＰｒｏかＣ末端にある場合に形成される混合無水物とは反応しないのではないか、ということが示唆される。

無水酢酸による活性化か存在しないときに、蛋白やペプチドのＣ末端のカルボン酸と特異的に反応を起こすことのできるインチオシアネート試薬があれば、上述の問題のうちいくつかは解決されるであろう。そのような試薬は、特に、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｈｒＳＰｒｏのようなアミノ酸が、蛋白やペプチドのＣ末端分析分解反応で出現する際に、収率の改善を奏すると期待される。その試薬とはホスホロイソチオシアナチデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ　１ｄａｔｅ）である。この試薬は、初めＫｅｎｎｅｒらによりＣ末端分析のため合成され、ジフェニルホスホロインチオシアナチデートと提唱された（Ｊ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、６７３−６７８　（１９５３））。主な欠点として、チオヒダントインアミノ酸の形成反応が遅いことが挙げられる。Ｋｅｎｎｅｒらに示されたように、この試薬はトリエチルアミン存在下で、定量的なチオヒダントインアミノ酸の形成に、１１０時間を要している。

光列Ω皿！本発明により、ペプチドのＣ末端配列決定に対して新たなる方法が提供される。

配列決定を行うペプチドをカルボキシル化されたポリエチレン（ＰＥ−ＣＯＯＨ）のような誘導化担体に好ましくは共有結合で結合しておく。Ｃ末端のカルボキシル基は初め、カルボン酸塩に変換され、次にジフェニルホスホロイソチオシアナチデートと反応する。反応産物のホスホリル部分は、ピリジンとの反応で除去される。

切断はメタノール中のトリメチルシラル−トにより行われる。

区画Ω脱型第１図は、本発明法の化学反応を示している。

第２図は、本発明の実施に使用できるＣ末端配列決定機の模式図である。

第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ，３０，３Ｅ図は、第２図の機器を利用して、ＹＧＧＦＬというペプチドから遊離したチオヒダントインアミノ酸の、４サイクル分のクロマトグラフィーによる分離の様子を描いたものである。

立肌の肛担久説皿米国出願　Ｎｏ、０７／８０１，９４４は、アセトニトリルのような溶媒中でホスホロインチオシアナチデートとピリジンとの組み合わせによるペプチドＣ末端配列決定の手順を記載し、特許を請求している。その実施例■は、溶液中に溶けているペプチドへ発明を応用した例を示している。実施例ＩＩエニーて、ペプチドはＰＥ−Ｃ０ＯＨに共有結合している。ペプチドのカルボン酸塩の形成を促進するため、ホスホロイソチオシアナチデートの濃度に比へて、ピリジンが少々過剰気味に加えられている。

本発明では、ピリジンとホスホロインチオシアナチデートは、逐次的に利用される。第一段階において、ピリジンあるいは類似の塩基は、固相に結合したペプチドをカルボン酸塩に変換する。第２段階で、カルボン酸塩は、ホスホロインチオンアナチデート試薬と反応する。反応はまずピリジンとおこり、続いてホスホロイソチオシアナチデートとおこるが、これによりＡｓｐ或いはＧｌｕを経過する反応も可能になる。さらに、これらのステップを分離したことにより、ピリジンを過剰量用いる必要はなくなる◇ペプチドのサンプルは最初、好ましくはＰＥ− Ｃ０ＯＨの膜に共有結合させておく。この共有結合の方法は、同時出願中の米国出願　Ｎｏ、０７／８０１．９４４と０７１５７６．９４３に記載されており、これら出願の内容は参照により本明細書中に記載されているものとする。

１ｍ：ペプチドサンプルは好ましくはアミンと反応させてカルボン酸に変換しておく。約Ｌ　０−６０重量％のアミンを含む水、或いは、有機溶媒が適当である。また無水有機溶媒中に第３級アミン溶液が存在するとよい。

５％トリエチルアミン水溶液も効果的である。メタノール中のトリエチルアミンの４０−６０容量％溶液が好ましい。ジイソプロピルエチルアミンのような他の第３級アミンや、第２級アミン、第１級アミン、そして水酸化ナトリウム、水酸化カリウムも効果的である。メタノールのような無水有機溶媒中で第３級アミンを用いる利点として、次のことが挙げられる。つまり、自動化装置で、繰り返し誘導体形成反応を行う間に、誘導体にされたチオヒダントインアミノ酸の切断かおこらない、ということである（Ｂａｉｌｅｙ。

Ｊ、Ｍ、、ａｎｄ　５ｈｉｖｅｌｙ、Ｊ、Ｅ、”Ｃａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｊｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　Ｔｅ　ｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＩ（Ｖｉｌｌａｆ　ｒａｎｃａ、Ｊ、Ｊ、、Ｅｄ、）ｐｐ、１１５−１２９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、（１９９１））。

水性溶媒を用いた場合、誘導体を形成したアミノ酸は切断され、その結果反応収率は悪くなる。この切断は、次の図の＊の位置でおこるであろう。

ＴＥＡ−試薬−ピリジン−ＴＥＡ−試薬−ピリジン−ＴＥＡ−試薬−ピリジン− 完全誘導体化されたベプチトーソジウムトリメチルシラル−ト第１級、或いは、第２級アミンを用いた場合にも、切断はおこるが、収率は悪くなる。第１級、第２級のアミンを用いると、切断に対して安定なアミドが生成し、後に続くペプチドの配列決定が阻害されたペプチドを生じる。

水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを有機溶媒と水性溶媒との混合物中で用いると、やはり望ましくない早すぎる時期に切断がおこってしまい、配列決定における収率が悪くなる。

！主捻階ここでは、第１段階での反応産物であるＣ末端カルボン酸塩と、ジフェニルホスホロインチオンアナチデートとの反応が含まれる。Ｋｈｏｒａｎａらによる当初のメカニズムでは（Ｋｅｎｎｅｒ、Ｇ、Ｗ、、Ｋｈｏｒａｎａ、Ｈ、Ｇ、、Ｓｔｅｄｍａｎ、Ｒ，Ｊ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、６７３−６７８（１９５３））、Ｃ末端のカルボン酸とジフェニルホスホロイソチオンアナチデートとの平衡反応により、フリーのイソチオシアン酸イオンが生成され、これが活性化されたホスホリルカルボン酸を攻撃してチオヒダントインを生じるのであると提唱された。

チオヒダントイン形成は可逆反応でないため、平衡はチオヒダントイン生成のほうへ傾く。全反応の所要時間は、彼等により、１１０時間と決定された。この方法を固相に対し用いる際には、Ｋｈｏｒａｎａらにより提唱されたメカニズムよりも、図１に示されたメカニズムの方がが正しいことかわかった。つまり、ジフェニルホスホロイソチオンアナチデートとＣ末端のカルボン酸塩との反応は平衡状態にあるが、イソチオシアネートは除かれないのである。これは次のようにして証明された。まず初めにイソチオシアネートをホスホリル試薬と反応させ、この試薬を気流で除き、２％ピリジンでリンスして、アセトニトリル中で２％ピリジンと反応させることにより証明された。Ｋｈｏｒａｎａら（！且且工互）が最初に提唱したように、もしイソチオシアン酸イオンか遊離されたなら、Ｃ末端のチオヒダントインは形成されなかったであろう。Ｃ末端のカルボン酸塩との反応が平衡反応であるという説は、ジフェニルホスホロインチオシアナチデートを高濃度で用いると、Ｃ末端のチオヒダントインがより高収率で得られたことに基づいている。本発明の好ましい実施においては、アセトニトリル中のＩＭジフェニルホスホロインチオシアナチデート溶液を用いる。他の溶媒も同様に使用できる。また、ペプチドをＴＥＡ／ジフェニルホスホロイソチオンアナチデート／ビリンンで、好ましくは自動化方法で何回も処理することにより、確実に、誘導体形成カルボン酸の方向に平衡が傾くようにすることが好ましい。自動化プログラムでは、この一連のステップ（Ｔ　Ｅ　Ａ／ジフェニルホスホロイソチオシアナチデート／ピリジン）を３回繰り返している。温度は１５−９０℃でおこなうことかでき、７０℃が一番好ましい。

！主段階この方法の新しい点は、ピリジン或いは、類似アミンの機能の利用という点にある。ピリジンは、第２段階の反応産物からの迅速なホスホリル基の除去反応を触媒する。図１に示されるように、協奏メカニズムによって、アシルイソチオシアネートが生成され、これは迅速に環状化してチオヒダントインアミノ酸を形成する。ピリジンはそれ自身で、或いは有機溶媒中で使用される。ピリジンの濃度は、容量で約０．１−１００％までに渡ることができる。アセトニトリルは良い溶媒である。低濃度のピリジンで反応を行うと、クロマトグラフィーの分離が明瞭になる。またジメチルホルムアミド、ヘキサン、ベンゼン、およびトルエン等の、アセトニトリル以外の溶媒も使用可能である。第３段階の反応温度は、１５− ９０℃の間が可能である。

！ｓ段階ここでは、第３段階のペプチジルチオヒダントイン産物の切断が、ソジウムトリメチルシラル−トにより行われる。参照する特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２７２３に記述されているように、この反応は、メタノールと１−ブタノール中の５０％溶液中で行うのが望ましい。試薬の濃度は、０．１モルがよい。ペプチジルチオヒダントインをソジウムトリメチルシラル−トで処理すると、最初にチオヒダントイン（これは逆相ＨＰＬＣで分析する）およびシリル化されたＣ末端カルボキシル基をもつ短縮ペプチドが生成される。フリーのカルボキシル基の再生は、図１のように、もう１回ソジウムトリメチルシラル−トで処理して行われる。

他のトリメチルシラル−トイオンの塩、例えばポタシウムトリメチルシラル−トも同様に効果的である。他にも、Ｌｉ”、Ｒｂ”、Ｃｓ”、Ｆｒ“のような１価陽イオンの塩は全て使用可能である。トリメチル基は他のアルキル基や、フェニル基で置換され得る。第４段階の反応温度も１５−９０’Ｃで行うことができる。

叉凰皿この実施例では、図２に描かれているようなコンピューターによる自動化Ｃ末端配列決定機を利用して、ＹＧＧＦＬという配列のペプチドの配列決定を４サイクル行ったことを示している。

ポリエチレンフィルム　の修　カルボン　へのペプチドの、合ＰＥ−Ｃ０ＯＨフィルムのサンプルをＩＮ塩酸溶液で、室温において１−２分処理し、これにより、ペプチドサンプルと共有結合させる前に表面のカルボキシル基をフリーの形に変化させた。

ＰＥ−Ｃ０ＯＨフィルム（ＩＸ１２．５ｍｍ）の小片は、室温で１時間無水ＤＭＦ　（１ｇ／ｍｌ）中において、過剰のジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ　ＣＣ）により活性化された。活性化反応の終りに、過剰量の試薬は、フィルムを無水ＤＭＦでリンスすることによって除去された。活性化されたＰＥ−Ｃ０ＯＨの小片は各々連続７ｏ−リアクター（ＣＦＲ）（Ｓｈｉｖｅｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）に挿入された。ここには、５ｏ％ＤＭＦに溶けたロイシンエンケファリン溶液が１００μｍ含まれており、２２℃で一晩反応させた。ＣＦＲの片端の微孔チューブは、加熱処理をしてシールされプライヤーで締めて閉鎖された。

カップリング反応の後、担体は、カップリング溶媒とアセトニトリルでリンスされ、真空遠心機中で風乾された。

く試薬、溶媒の組成〉Ｒ１メタノール中の５０％トリエチルアミンＲ２アセトニトリル中のジフェニルホスホロインチオシアナチデートＲ３５０％メタノール、５０％ｔ−ブタノール中の０．１０モル　ソジウムトリメチルシラル−トＣＲ４試薬なし〕Ｓｌ　アセトニトリル中の２％ビリンン８２０．１％トリフルオロ酢酸水溶液Ｓ３　メタノールＳ４　ジメチルホルムアミドＦＲ）に設置する。配列決定は、表１のプログラムにしたがって行われる。

このプログラムではＣＦＲは常に７０°Ｃに、そしてＣＦ（転換フラスコ）は４０℃に保たれている。

表１連続フローリアクター　転換フラスコ　継続時間　総計時間（ＣＦ　Ｒ）　（ＣＦ）　（秒）　（分）７０Ｃ３５ＣＲ１反応　１８０乾燥　１８０Ｒ２反応　４５０Ｒ２反応　４５０除去　１５Ｓ１反応　２２５Ｓ１反応　２２５除去　３０Ｒ１反応　１８０乾燥　１８０Ｒ２反応　４５０Ｒ２反応　４５０除去　１５Ｓ１反応　２２５Ｓ１反応　２２５除去　６０Ｒ１反応　１８０乾燥　１８０Ｒ２反応　４５０除去　１５Ｓ１反応　２２５除去　３０Ｓ３リンス　１２０Ｓ４リンス　２４０Ｓ３リンス　１２０Ｒ３反応　１２００Ｒ３からＣＦ　３０Ｒ３反応　乾燥　３００Ｒ３反応　乾燥　３００Ｓ２導入　１０Ｓ２反応　１２０Ｓ２反応　１２０Ｓ２からＣＦ　３０注入　７停止　停止　６０乾燥　乾燥　１００ＣＦＲに様々な試薬、溶媒を導入するため、アルゴンによるわずかな圧力（１− ３気圧）を各ボトルに負荷しておく。アルゴンは化学的に不活性であるため使用された。他に、適した気体としては、ヘリウムや窒素がある。Ｃ末端分析装置の各ボトルには、各々圧力調節機がついている（図中の６角形）。バルブからボトルへ、アルゴンの通り道をつくるため、試薬導入の際にソレノイドの作動バルブか開けられる（Ａｎｇａｒバルブ）。各ボトルは、閉鎖しであるため、アルゴンの圧力は、各ボトルの底から溶液を押上げ、バルブのブロックへと達する。そこでソレノイドの作動バルブを開くと、溶液をバルブのブロックそして更にＣＦＲ中に導入することができる。ＣＦＲが一杯になると、バルブが閉じられ、試薬の導入は停止し、反応が、所定時間中おこなわれるのである。反応終了後、Ａｎｇａｒｚ＜ルブ（ＢＯＣＦＲ。

即ちＣＦＲの通気口）が開き、ここをアルゴンが通過し、ノ（ルブの一番上まで入る。これにより、ＣＦＲ中の試薬または溶媒は、ＣＦＲのすぐ後ろにある３方向の切り替えバルブに対するどのソレノイドが作動されるかに従い、ＷＡＳＴＥ或いは、ＣＦに押し出される。従って、分析プログラムは、様々なタイミングにおけるソレノイド作動バルブの開閉からのみ成っている。

Ｃ配置°定　のプログラム　、・連続フローリアクター　転換フラスコ　継続時間　総計時間（ＣＦ　Ｒ）　（ｃ　Ｆ）　（秒）　（分）（７０Ｃ）　（３５Ｃ）Ｒ１加圧　５Ｒ１導入　２５Ｒ１反応　１８０最初のステップのｒＲｌへの加圧」とは、Ｒ１とＲ１ボトルのＡｎｇａｒバルブを開放し、Ｒ１へ５秒間加圧することである。次のステップｒＲ１の試薬の導入」においては、Ｒ１のＡｎｇａｒバルブはまだ開放状態なので、Ｒ１への圧力を維持しているが、Ｒ１の試薬ブロックのソレノイドも開放されているため、Ｒ１中の試薬は、ＣＦＲに流入することが可能である。そして、３方向切り替えバルブのソレノイドが開放され、圧力が平衡化され（閉鎖系）、過剰な流入物は、ＷＡ　Ｓ　Ｔ　Ｅへ送られる。この流入状態は２５秒間続く。２５秒間の最後に、すべてのソレノイド作動バルブは閉鎖され、Ｒ１の試薬（この場合、メタノール中の５０％トリエチルアミン）は共有結合したペプチドと１８０秒間反応する。

Ｒ１の試薬の除去　１８０秒このステップでは、圧力調節器である、ＢＯＣＦＲによりＡｎｇａｒバルブが開放されるため、アルゴンは、試薬のバルブブロックの一番上まで流入してくる。

ＣＦＲの直後のＷＡＳＴＥのバルブ（３方向切り替えバルブ）も開放されている。この状態で、アルゴンによって、ＣＦＲの内容物はＷＡＳＴＥへ押し出される。アルゴンが１８０秒間ＣＦＲを通して流され、それから、すべてのバルブが閉鎖される。

Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２の試薬の除去　１５秒上述の一連のステップは、Ｒ１についての記載と同様だがＲ２を用いて行う。即ちＲ１のバルブの開閉操作の代わりに対応するＲ２バルブを使う以外は、Ｒ１の場合と同様である。

Ｓｌへの加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓ１の試薬との反応　２２５秒Ｓ１への加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓ１の試薬との反応　２２５秒Ｓ１の試薬の除去　３０秒方法の説明で述べたように、上述の一連の操作、即ちトリエチルアミン、ホスホリルインチオシアネートおよびピリジンでのペプチドの処理は、平衡をチオヒダントイン形成の方向に傾けるため、もう２回繰り返される。

Ｒ１への加圧　５秒Ｒ１の試薬の導入　２５秒Ｒ１の試薬との反応　１８０秒Ｒ１の試薬の除去　１８０秒Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２の試薬の除去　１５秒Ｓ１への加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓ１の試薬との反応　２２５秒Ｓ１への加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓｌの試薬との反応　２２５秒Ｓ１の試薬の除去　３０秒Ｒ１への加圧　５秒Ｒ１の試薬の導入　２５秒Ｒ１の試薬との反応　１８０秒Ｒ１の試薬の除去　１８０秒Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２への加圧　５秒Ｒ２の試薬の導入　３秒Ｒ２の試薬との反応　４５０秒Ｒ２の試薬の除去　１５秒Ｓ１への加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓ１の試薬との反応　２２５秒Ｓ１への加圧　５秒Ｓ１の試薬の導入　１０秒Ｓ１の試薬との反応　２２５秒Ｓ１の試薬の除去　３０秒この段階で、ペプチドＣ末端アミノ酸の９０％もしくはそれ以上が、チオヒダントインに誘導体化されている。しかし、まだＣＦＲや、他のパイプ中にイソチオシアネート試薬およびピリジンが残っていることもあり、このため、遊離したチオヒダントインアミノ酸のＨＰＬＣクロマトグラフィーの際に、余分なＵＶ吸収を起こすことがある。よって、次のステップでは、共有結合したペプチドを、メタノール、ＤＭＦ、メタノール、ＤＭＦ、メタノール、ＤＭＦの順でリンスする。他にも、このような目的で使用できる溶媒があるであろう。

Ｓ３への加圧　５秒Ｓ３の試薬の導入　１２０秒Ｓ３の試薬の除去　２０秒Ｓ４への加圧　５秒Ｓ４のリンス　２４０秒Ｓ４の試薬の除去　２０秒Ｓ３への加圧　５秒Ｓ３の試薬の導入　１２０秒Ｓ３の試薬の除去　２０秒Ｓ４への加圧　５秒Ｓ４のリンス　２４０秒Ｓ４の試薬の除去　２０秒Ｓ３への加圧　５秒Ｓ３の試薬の導入　１２０秒Ｓ３の試薬の除去　２０秒Ｓ４への加圧　５秒Ｓ４のリンス　２４０秒Ｓ４の試薬の除去　２０秒次のステップは、切断のステップである。Ｒ３（メタノールとｔ−ブタノール中のソジウムトリメチルシラル−ト）が、ＣＦＲに導入され、１２００秒間反応する。そして、ＣＦＲの内容物が、Ｒ１，Ｒ２，Ｓｌ、Ｓ３およびＳ４のようにＷＡＳＴＥへ押し出される代わりに、今回はＣＦ中へ押し出される。チオヒダントインを含んだアルコール溶液がＣＦに入ると、アルゴン気流を３００秒間、２回吹きかけて乾燥させる。この操作はＡＲからＣＦへの調節器により、Ａｎｇａｒバルブが開放されることにより行われる。ＣＦでの乾燥中に、短縮されたペプチドのシリル化されたカルボキシル基をフリーのカルボキシル基に戻すため、このペプチドはソジウムトリメチルシラル−トで処理される。

Ｒ３への加圧　５秒Ｒ３の試薬の導入　１７秒Ｒ３の試薬との反応　１２００秒Ｒ３からＣＦへの気流　３０秒Ｒ３への加圧　５秒Ｒ３の試薬の導入　１７秒Ｒ３の試薬との反応（乾燥）　３００秒Ｒ３の試薬の除去　２０秒Ｒ３への加圧　５秒Ｒ３の試薬の導入　１７秒Ｒ３の試薬との反応（乾燥）　３００秒Ｒ３の試薬の除去　２０秒この時点で、ＣＦ中の風乾されたチオヒダントインアミノ酸は、ＨＰＬＣへ注入されるため溶媒に溶かされる。この溶媒は０，１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）であり、溶媒ボトルＳ２に入っている。Ｒ４からは、ループを通して、直接ＣＦへ所定量の試薬を導入することが可能であるが、この時点では、Ｒ４が機能していないので（電気的問題）、溶媒はＣＦＲを通して導入される。ＨＰＬＣへの注入に適した量にするため、ＴＦＡは、２回にわたって導入される。また、ＴＦＡ溶液は切断後の短縮ペプチドのシリル化カルボン酸をフリーのカルボン酸へ変換するので、反応時間は１２０秒間ＴＦＡ水溶液をまた存在させて行うことか必要であると考えた。

Ｓ２への加圧　５秒Ｓ２の試薬の導入　１０秒Ｓ２の試薬との反応　１２０秒Ｓ２の試薬のＣＦへの除去　３０秒Ｓ２への加圧　５秒Ｓ２の試薬の導入　９秒Ｓ２の試薬との反応　１２０秒Ｓ２の試薬のＣＦへの除去　３０秒ＨＰＬＣへの挿入は、アルゴンの圧力をＣＦ調節器へ送り（ＣＦへの吹き出し）、そして、ＣＦの内容物をＨＰＬＣの１００μｌ注入ループへ押し出すことにより行われる。ＨＰＬＣの注入ループの中身をカラムへ移動させるため、６０秒間停止する。最後のステップでは流通経路を一掃するため、アルゴンを用いて１００秒間ＣＦＲとＣＦの両方に気流を流す。この全サイクルは、所望回数たけ繰り返される。

挿入　１５秒停止　停止　６０秒乾燥　乾燥　１００秒全プログラムのサイクルの所要時間は、約２時間３０分である。

図２に示されたように、最初のサイクルの産物がＨＰＬＣにかけられる。

図３Ａは、最初のサイクルのクロマトグラフィーの結果である。図３Ｂ、３Ｃ，３Ｄは、各々２回目、３回目、４回目のサイクルの産物のクロマトグラフィーの結果である。いずれの場合も、誘導体を形成したＣ末端アミノ酸は、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラムのリテンションタイムによって同定される。

チオヒダントインアミノ酸の分離は、３５℃において、２．ｌＸ２５０ｍｍＲｅ１ｉａｓｉｌ　３μ　１００オングストローム　カラムにより、流速０．１５ｍ１／分という条件で行われた。溶媒Ａは０．　１％トリフルオロ酢酸水溶液、溶媒Ｂは８０％アセトニトリル、１０％水、１０％メタノールという組成である。

濃度勾配による溶出は次のように行った。

０％　Ｂ　２分間０−４％　Ｂ　３５分間３５−５０％　Ｂ　１０分間２６５ｎｍの吸収がモニターされた。

ホスホリル／ピリジン法かＴＭＳ−ＩＴＣ／無水物法をしのぐ利点として、次のことか挙げられる。

（１）配列決定反応における収率の増加ＴＭＳ−ＩＴＣ／無水酢酸法での典型的な収率は、３０％である。本発明の新方法においては、定量的なデータはまた得られないが、クロマトグラフィーの結果より、初期収率か著しく改善されたことが示された。

（２）望ましくない段階でのペプチド切断反応が回避されるＴＭＳ−ＩＴＣ／無水物法では、予告アミノ酸があり、次のサイクルで遊離すべきアミノ酸かつねに存在する。

（３）無水酢酸の不使用蛋白質が無水酢酸に不溶であることは、広く知られている。Ｃ末端分析において、これを用いない場合、蛋白質のサンプルも分析可能になると考えられる。無水酢酸による活性化か引き起こす問題により、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐなどのアミノ酸では、分析反応の収率が落ちている。Ｌｙｓ、Ｔｈｒでは、アミノ酸側鎖部分のアセチル化のため、分析反応において、２つのピークが存在した。今までのところ、本発明の新方法によって、Ａｓｐの反応収率は著しく改善された。Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＬｙｓについても同様の結果が得られることか期待される。

（４）ＴＭＳ−ＩＴＣ／無水酢酸法に比べて、ホスホリル／ピリジン法においては、遊離された、チオヒダントインアミノ酸の同定を阻害するようなＵＶ吸収のバックグランドが顕著に減少した。

ＦＩＧ、　２　ＯＯ０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリペプチドとイソチオシアネート試薬との反応によって、Ｃ末端のチオヒダントインアミノ酸を形成させて、前記ポリペプチドのカルボキシル末端の配列を決定する方法において、イソチオシアネート試薬として、ホスホロイソチオシアナチデートとピリジンの組合せを使用する点において改善された方法。
２．前記組合せ中において、前記ピリジンが前記ホスホロイソチオシアナチデートに対して過剰モル量存在する、請求項１に記載の方法。
３．前記ホスホロイソチオシアナチデートおよびピリジンの組合せが、不活性な極性溶媒の溶液中に存在する、請求項１または請求項２に記載の方法。
４．前記ホスホロイソチオシアナチデートおよびピリジンの組合せが、アセトニトリル中に存在する、請求項１または請求項２に記載の方法。
５．前記ポリペプチドが固体担体へ共有結合している請求項１に記載の方法。
６．前記固体担体が、活性化された、カルボン酸で修飾されたポリエチレン担体である、請求項５に記載の方法。
７．下記反応を含むポリペプチドサンプルのＣ末端配列決定方法：（ｉ）前記サンプルと、ホスホロイソチオシアナチデートおよびピリジンから実質的に形成された試薬との反応により、前記サンプルのＣ末端アミノ酸のチオヒダントイン誘導体を形成させ、そして（ｉｉ）前記誘導体を形成したサンプルを、ソジウムトリメチルシラノレートと反応させて、チオヒダントインアミノ酸を遊離させる。
８．ステップ（ｉ）の試薬中に、ピリジンがホスホロイソチオシアナチデートに対して過剰モル量存在する、請求項７記載の方法。
９．前記サンプルが固体担体へ共有結合で結合している、請求項７または請求項８に記載の方法。
１０．前記サンプルが、カルボン酸で修飾されたポリエチレン担体へ共有結合している、請求項７または請求項８に記載の方法。
１１．ポリペプチドとホスホロイソチオシアナチデート試薬との反応によって、Ｃ末端のチオヒダントインアミノ酸を形成させて、前記ポリペプチドのカルボキシル末端の配列を決定する方法において、まず、前記ポリペプチドＣ末端をカルボン酸塩へ変換し、次に該カルボン酸塩をジフェニルホスホロイソチオシアナチデートと反応させる点において改善された方法。
１２．前記ポリペプチドの前記Ｃ末端を、アミンとの反応によりカルボン酸塩へ変換する、請求項１１に記載の方法。
１３．前記アミンが第３級アミンである、請求項１２に記載の方法。
１４．前記アミンがピリジンである、請求項１２に記載の方法。
１５．下記反応を含むポリペプチドサンプルのＣ末端配列決定法：（ｉ）前記ポリペプチドＣ末端をアミンと反応させて、前記ポリペプチドのカルボン酸塩を生成させ、そして（ｉｉ）前記カルボン酸塩をホスホロイソチオシアナチデートと反応させてチオヒダントイン誘導体を形成させる。
１６．前記ホスホロイソチオシアナチデートが、ジフェニルホスホロイソチオシアナチデートである、請求項１５に記載の方法。
１７．ステップ（１）で使用するアミンがピリジンである、請求項１５に記載の方法。
１８．前記ポリペプチドサンプルが膜へ共有結合されている、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
１９．前記ポリペプチドサンプルがカルボン酸で修飾されたポリエチレン担体への共有結合している、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
２０．ステップ（ｉ）で使用するアミンが、無水メタノール中に約４０−６０容量％のピリジンを含む溶液である、請求項１５に記載の方法。