JP3180957B2 - 安定な血液凝固ｖｉｉｉ因子の製造方法 - Google Patents

安定な血液凝固ｖｉｉｉ因子の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高い比活性と安定性を有する低温殺菌VIII
因子濃縮物を製造するにあたりAl（OH）３、陰イオン交
換樹脂またはCa3（PO4）２による少なくとも二重吸着、
好ましくはこの群からの異なる２種の吸着剤によって、
VIII因子含有溶液から不純物を吸着させる方法に関す
る。
血漿の凝固は酵素的過程である。それに関与する因子
は蛋白質であり、多くの場合プロテアーゼの性質を有
し、この蛋白質は血液中を不活性な前駆体の形で循環
し、湿潤性表面に接触するかまたはその他、傷害時にの
み活性化する。トロンビンに加えて他の凝血プロテアー
ゼたとえばX aおよびIX a因子もVIII因子を攻撃し、そ
れを不活性化できる。V a因子を不活性化できるプロテ
インＣもとくに重要である。Ｖ因子とVIII因子は最も不
安定な血液凝固因子である。それらは血液が取り出され
た瞬間から分解を始める。さらにこれを促進するのが、
それらはCa2+によって安定化されるのに、血液採取の際
にクエン酸塩やEDTAのような錯化剤が用いられることで
ある。これらの既知のデータは、世界中でVIII因子を得
るための出発原料として用いられるヒト血漿からのクリ
オプレシピテート中になお認められるヒト血漿からのVI
II因子活性は40〜60％にすぎず、VIII因子の精製後には
そのわずか10〜20％しか残存しないという所見と一致す
る。これは血友病患者への供給にきわめて不利である。
すなわち、一方では、原料物質としての血液は貴重で、
きわめて限られた入手の可能性しかないばかりか、他方
では低収率が価格に影響する。VIII因子の製造時にウイ
ルスの不活性化を保証するための付加的処理工程が導入
されるようになってから、上述の問題はさらに深刻にな
っている。
慣用方法によるVIII因子の製造では、Fayら（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,79,7200,1982）により収率12.7％と報
告されている。最近のイムノアフィニティークロマトグ
ラフィー法を用いたZimmerman ＆ Fulcherもほぼ同じ値
を得ている（EP−Ａ−0,083,483）。
多くの研究者が、VIII因子はDEAE交換樹脂およびECTE
OLAに強く結合し、それはハライドを用いて再び遊離で
きるものの、24時間以内にその活性は失われてしまうと
報告している（S.van Creveldら:Thromb.Diathes,VI（2
/3）、282,1961;R.Baughら:Biochim.Biophys.Acta,371,
360,1974）。しかしながら、プロテナーゼインヒビター
たとえばPMSF（フェニルメタンスルホニルフルオライ
ド）や、ベンツアミジンはヒト用の製品の製造には不適
当で、この問題に対する解決策は提出されていない。
上述のような状況から、処理および精製時にVIII因子
の分解を防止し、できるだけ早期から、すなわち単離ま
たは精製の開始時から直ぐに使用できる方法が強く望ま
れていた。早い時点としては、血漿に出発していわゆる
クリオプレシピテーションによって得られ、また原料物
質として市販されているクリオプレシピテートの再処理
時が選ばれた。
溶解したクリオプレシピテートは、現在の技術水準で
は一般に、プロトロンビン因子（II、VII、IX、Ｘ因
子）による痕跡の夾雑を除去するために、Al（OH）３で
処理されている。これは、精製時にVIII因子を分解する
可能性がある上述の因子の活性化の防止を意図するもの
である。本発明者らは驚くべきことに、新鮮なクリオプ
レシピテート溶液のAl（OH）３による１回の吸着ではプ
ロトロンビン因子および他のプロテアーゼの除去には不
十分であることを見出した。それは、吸着後にも、最高
の感度を有するX a因子試験で、吸着溶液の上澄液中
に、X a因子とは同一ではないように思われるものの明
瞭なアミド分解活性が検出できたからである。
驚くべきことに、損失が少ない取扱いが容易な安定な
VIII因子が、クリオプレシピテートのたとえばAl（OH）
３、Ca3（PO4）２もしくは陰イオン交換樹脂による多重
吸着または混合吸着によって得られることが明らかにさ
れた。その基準としては、最終生成物のアミド分解活
性、収率、比活性および室温での安定性を測定する。
したがって、本発明は、新たに溶解したクリオプレシ
ピテートに適用すると、精製および低温殺菌時のVIII因
子活性の大部分の喪失を防止し、高い比活性、固有の構
造および安定性を有する最終生成物を高収率に得ること
ができる方法に関する。
本発明はとくに、VIII因子の製造に慣用されるVIII因
子含有血漿分画好ましくは溶解したクリオプレシピテー
トまたはCohn分画Ｉを、以下それ自身公知の方法によっ
て安定な、必要に応じて低温殺菌したVIII因子が好収率
が得られるように処理する方法において、これらをアミ
ド分解／蛋白分解活性を有しVIII因子を分解する酵素お
よび酵素前駆体を結合する吸着剤で処理する方法に関す
る。
本発明はとくに、高い比活性と安定性を有するVIII因
子を製造する方法において、VIII因子含有溶液をその溶
液からそれ自体公知の方法によってVIII因子を得る前に
Al（OH）３、陰イオン交換樹脂またはCa3（PO4）２への
少なくとも２回の吸着処理に付す方法に関する。
この場合の公知の方法は、たとえばEP−Ａ−0,018,56
1またはEP−Ａ−0,173,242に記載されている。
VIII因子含有出発物質は、好ましくは少なくとも２種
の異なる吸着剤の混合物に吸着される。処理はCa3（P
O4）２またはその代わりに、たとえばセルロースのよう
な多糖もしくは架橋多糖をベースとした親水性マトリッ
クスと、たとえばDEAE−RSephadex、ECTEOLAもしくはQA
E−RSephadex（QAE）に特徴的な基のような官能基を有
する塩基性陰イオン交換樹脂によって行うのが有利であ
る。
吸着剤の種類および量（一般的には１〜３％w/v）
は、VIII因子に伴って存在する可能性があるチモーゲン
および酵素、主としてプロテナーゼを吸着、除去するが
VIII因子は吸着しないという観点から選択される。最終
生成物のアミド分解活性はこの指標として、好ましくは
X a因子の定量に用いられ、市販されている色素産生ペ
プチドを用いて測定される。VIII因子最終生成物は実質
的にそれを含まないものでなければならない。
数種の吸着剤を使用する場合、個々のそれらを添加
し、分離することも可能であるが、１分から30分の間隔
を置いて続けて吸着剤を加え、一緒に分離するのが好ま
しい。好ましい態様においては、１〜30分の吸着時間の
後、添加したすべての吸着剤を遠心分離によって除去す
る。
クリオプレシピテート溶液（クリオ溶液）は、pH6.5
〜7.5、生理的イオン強度（10〜15mS）において、好ま
しくはクエン酸イオン、または二価金属イオンの他の捕
捉剤を含まないメジウム中、改善には最初Al（OH）
３で、またはCa3（PO4）２および／もしくはDEAE交換樹
脂および／もしくはECTEOLAおよび／もしくはQAEを一緒
に用いて処理するのが有利である。効果的な処理のため
には、吸着剤をある順序で添加することが必要である。
遠心分離による分離は１工程で行われる。
主として吸着剤混合物によるこのような吸着の結果を
第１表に掲げる。結果は次のように要約できる。
第二のAl（OH）３吸着後にもクリオ溶液中になお残存
して最終生成物中に検出できるアミド分解活性は、それ
に続く１回のCa3（PO4）２および／もしくはECTEOLAお
よび／もしくはQAEまたは他の塩基性イオン交換樹脂で
の吸着のみで劇的に減少する。数種のイオン交換樹脂の
混合物もまた有効である。
驚くべきことに、吸着剤がある特定の量を越えなけれ
ば、この処理によってVIII因子活性の損失は全く生じな
い。これはクリオ溶液１あたりの湿潤交換剤として、
Ca3（PO4）２については10g、QAEおよびECTEOLAについ
ては約20〜30gである。このような溶液は通常、クリオ
プレシピテート1kgを緩衝溶液３に溶解して得られ
る。
クリオ溶液を吸着剤および陰イオン交換樹脂で前処理
することにより、アミド分解活性に加えて非特異的蛋白
質も除去される。その結果、VIII因子の収率および比活
性の両者が上昇する。新鮮なクリオ溶液の吸着剤および
イオン交換樹脂による前処理は、さらに、水性溶液中60
℃で、損失もなくまた取扱いも容易に低温殺菌できる安
定な中間生成物を与えるという利点がある。これによ
り、活性の大きな喪失を伴わずに、透析、過および保
存が可能な、安定な最終生成物が得られる。
最も有効なクリオ溶液の前処理は、Al（OH）３吸着に
続く、ECTEOLA、QAE−RSephadex、DEAE−RSephadexおよ
びこれらの陰イオン交換樹脂との組合せであった。QAE
−RSephadexとCa3（PO4）２との混合吸着の結果は、高
収率で、良好な比活性と十分な安定性を有する生成物を
導くことから、注目に値する。20℃で20時間の透析およ
び20℃で24時間保存する強いストレスを与えても、活性
の低下は合わせて11％にすぎなかった。このような安定
で、同時に比活性約100U/mgというように低蛋白質VIII
因子溶液はこれまで報告されていないことに留意すべき
である。室温での４日間保存は、VIII因子を分解する酵
素不純物のわずかな痕跡でも検出できるストレス試験と
考えることができる。
保存時におけるVIII因子活性の喪失は、VIII因子濃縮
物中のプロテアーゼの夾雑に帰し、これは最終生成物中
に残存するアミド分解活性と相関するということができ
る（第１表参照）。
Al（OH）３に１回吸着させたサンプルは、透析後にも
分子量50〜40kDaに相当する切断生成物を含有し、これ
は保存時にさらに小さなサブユニット（40kDa未満）
に、実質的に完全に分解する。これに対し、Al（OH）３
プラスQAEおよびECTEOLAで２回処理したサンプルは48時
間安定である。これは保存時に測定したVIII因子活性と
よく一致し、このサンプルの低アミド分解活性によるも
のである。
本発明は、良好な臨床的リカバリーと半減期を与える
高度に精製されたVIII因子、ならびにその好収率および
高い安定性での製造および低温殺菌の方法に関する。こ
の方法は、原料物質とくにクリオプレシピテートを、吸
着剤たとえばAl（OH）３、Ca3（PO4）２および塩基性イ
オン交換樹脂（DEAE、QAE、ECTEOLA）と一緒に溶解した
のち、この溶液が、最終生成物について測定されるよう
に、アミド分解活性を含まなくなるまで処理することを
特徴とするものである。
この測定は、Ｘ因子の定量に用いられている方法によ
りKabiからの基質Ｓ−2222（Bz−Ile−Glu−Gly−Arg−
pNa）を用いて行われる。BCP200、Ｚ−Ｄ−Leu−Gly−A
rg−MNA（Behringwerke AG）またはRChromozym TH（Boe
hringer Mannheim GmbH）も同様に適当である。
XIII因子の定量 XIII因子の定量はたとえば以下の方法によって実施で
きる。
１部たとえば特許出願P 23 16 430.9−52に従って製
造された部分トロンボプラスチン（Ma160）0.1mlを１部
のVIII因子欠乏血漿および１部の希釈正常血漿と混合す
る。この混合物を37℃に６分間保持する。予め37℃に加
温した0.025M塩化カルシウム溶液１部を加えたのち、塩
化カルシウムの添加から凝血が起こるまでの経過時間を
測定する。定量に際しては、VIII因子含有溶液で得られ
た凝血時間を用いて、正常血漿の希釈系列から得た検量
プロットから値を読み取る。VIII因子の１国際単位（1I
U）は正常血漿1mlのVIII因子活性に相当する。
アミド分解活性の測定 これはたとえば、X a因子の定量の原理に従って実施
できる。
定量混合物： 100μのサンプル＋500μの緩衝溶液、50mM/ト
リス、150mM/ NaCl、pH8.2＋100μ基質、BCP200、3
mM/またはＳ−2222、3mM/。
37℃で５分間プレインキュベートし、ついで20分間の
基質の変換を37℃、405nmにおいて測定する。アミド分
解活性はΔ0D/分で評価する。
VIII因子の安定化の方法は、以下の実施例から明らか
なように、出発原料とは実質的に無関係にこれまで報告
されてきたすべての製造過程、たとえばDE3,432,083も
しくはEP0,018,561、またはDE3,432,083もしくはEP0,17
3,242に記載の方法に使用できる。以下に用いる緩衝液
については実施例の末尾に記載する。
参考例 １ 出発原料：クリオプレシピテート1kgを＋37℃で３
の溶液緩衝液に溶かし、以下のように処理した。
１×８％（v/v）Al（OH）3:4の溶液を＋25℃で１％
濃度のAl（OH）3 320mlに15分間吸着させた。吸着剤を
3,000rpmで15分間遠心分離して除き、吸着させたクリオ
溶液の上清に安定化剤を加えた。
安定化と加熱：この目的には、Al（OH）３上清が4,04
0mlであればスクロース4,040gを加えて100％（w/v）に
相当する最終濃度とし、次に1.8mol/に相当するグリ
シン545.4gを加えCaCl2濃度を5mmol/に調整した。安
定化された溶液を2.5N NaOHでpH7.3に調整し、ついで＋
60℃に10時間加熱した。加熱の前後にVIII因子:C活性を
測定し、それぞれ2.0U/mlおよび1.6U/mlの値を得た。
DE3,432,038によるDEAE吸着の準備：加熱したクリオ
溶液（6,868ml）を6,868mlの溶解緩衝液で希釈し、2N酢
酸でpHを5.5に調整した。
バッチ法によるDEAE−RSepharose CL−6Bへの吸着：
希釈された低温殺菌クリオ溶液13,736mlを平衡化DEAE−
RSepharose CL−6B、300mlを用い、室温で４時間吸着さ
せ、ついでSepharoseを分離した。
RSepharose洗浄とそのカラムへの移送:VIII因子を負
荷したSepharoseを吸引漏斗上で前洗浄し、ついでカラ
ム（径7.2cm）に移し、洗浄緩衝液３で処理した。
DEAE−RSepharoseカラムの溶出:VIII因子:Cを洗浄DEA
E−RSepharoseから酢酸緩衝、リジン含有CaCl2溶液（0.
3mol/）で遊離させ、溶出液195mlにスクロース1.46g
を加えて最終濃度0.75とした。
透析：溶出液195mlを＋４℃で透析緩衝液20に対し
て16時間透析した。この物質について、蛋白質含量を測
定し（▲OD1% 280nm▼＝10mg/ml）、VIII因子活性を測定
し、この２つの値から収率および比活性を計算した。ス
トレス試験では、その一部を20℃で保存し、VIII因子活
性を24、48および96時間後に測定した（表、実験１参
照）。
濃度の調整および過による滅菌：透析したVIII因
子:C218mlをSartoriusフィルターを通して過して滅菌
した。活性はVIII因子:C28U/mlに調整し、この溶液を包
装して凍結乾燥する。
参考例 ２ 出発原料：クリオプレシピテート1kgを＋37℃で３
の溶解緩衝液に溶かし、以下のように処理した。
２×５％（v/v）Al（OH）3:溶液４を各回200mlの１
％濃度のAl（OH）３により25℃で15分間、２回処理し、
ついで3,000rpmで遠心分離し、上清に低温殺菌のための
安定化剤を加えた。
安定化と加熱：この目的には、Al（OH）３上清が4,04
0mlにスクロース4,040gを加えて100％（w/v）に相当す
る最終濃度とし、次に1.8mol/に相当するグリシン54
5.4gを加え、CaCl2濃度を5mmol/に調整した。安定化
溶液のpHを2.5N NaOHで7.3に調整し、ついで＋60℃に10
時間加熱した。VIII因子:C活性は加熱の前後に測定し、
それぞれ2.0U/mlおよび1.9U/mlであった。
DE3,432,083によるDEAE吸着の準備：加熱したクリオ
溶液（6,868ml）を希釈緩衝液6,868mlで1:2に希釈し、2
N酢酸でpHを5.5に調整した。
バッチ法によるDEAE−RSepharose CL−6Bへの吸着： 希釈クリオ溶液13,736mlを、平衡化したDEAE−RSepha
rose CL−6B、300mlを用いて、室温で４時間吸着させ、
ついでSepharoseを分離した。
RSepharoseの洗浄おそびそのカラムへの移送:VIII因
子が負荷されたSepharoseを吸引漏斗上で前洗浄し、つ
いでカラム（径7.2cm）に移し、洗浄緩衝液３で処理
した。
DEAE−RSepharoseカラムの溶出:VIII因子:Cを洗浄DEA
E−RSepharoseから酢酸緩衝、リジン含有CaCl2溶液（0.
3mol/）で遊離させ、ついで溶出液195mlにスクロース
1.46gを加えて最終濃度を0.75％とした。
透析：溶出液195mlをで透析緩衝液20に対して＋４
℃で16時間透析した。この物質について、蛋白質含量を
280nmにおけるODによって測定し、VIII因子活性を定量
し、この２つの値から収率および比活性を計算した。ス
トレス試験では、その一部を20℃で保存し、VIII因子活
性を24、48および96時間後に測定した（表、実験２参
照）。
濃度の調整および過による滅菌：透析したVIII因
子:C218mlをSartoriusフィルターを通して過して滅菌
した。溶液の活性はVIII因子:C28U/mlに透析緩衝液で調
整し、この溶液を包装して凍結乾燥した。
実施例 １ 参考例１と同様にして、新鮮なクリオプレシピテート
の溶液をまず１×５％（v/v）Al（OH）３に吸着させ、
遠心分離したのち上清を次に２回目の５％（v/v）Al（O
H）３で吸着させ、25℃に３分間置いたのち３％（w/v）
湿潤ECTEOLA（120g/4）を加え、15分間インキュベー
トした。吸着剤を分離したのち、上清から上述のように
低温殺菌された、高度に純粋なVIII因子が得られた。表
の実験３に示すように、この方法も好収率で比活性の高
い安定な生成物を与える。
実施例 ２ 参考例１と同様にして、クリオプレシピテートを再び
新たに37℃で溶解し、１回だけ次のように吸着させた。
５％（v/v）Al（OH）3:溶解したクリオプレシピテー
ト４を、１％濃度のAl（OH）3 200mlを用いて＋25℃
で15分間吸着させ、ついで吸着剤を3,000rpmで遠心分離
して除去した。次に以下のように、いわゆる混合吸着を
実施した。
１×５％（v/v）Al（OH）３吸着および３％QAE−RSep
hadex A50:最初のAl（OH）３上清４に１％濃度のAl
（OH）3 200mlをまず加え、この混合物を５分間撹拌し
たのち、湿潤QAE−Sephadex A50,120gを加え、それによ
る吸着を＋25℃で15分間行った。遠心分離後に得られた
上清を低温殺菌し、実施例１のDEAE−RSepharoseへの吸
着によって精製した。収率、比活性および安定性は表に
示す（実験４参照）。
実施例 ３ 参考例１と同様に、クリオプレシピテート1kgを緩衝
液3.0に溶解し、１％濃度のAl（OH）３、200mlに25℃
で15分間吸着させ、遠心分離して上清を得た。以下次の
ように処理した。
それぞれ１×５％（v/v）Al（OH）３、３％（w/v）湿
潤QAE−RSephadex A50および３％（w/v）湿潤ECTEOLA;
吸着剤を５分間隔で加え、25℃で15分間インキュベート
し、ECTEOLAの添加15分後に3,000rpmで遠心分離した。
低温殺菌および最終精製は参考例１と同様に実施した。
最終生成物の収率および性質は表の実験５に示す。
実施例 ４ 参考例２と同様に、新たに溶解したクリオプレシピテ
ート1kgを用いて１回５％（v/v）Al（OH）３への吸着を
行い、その上清を次に以下のように吸着させた。
１×５％（v/v）Al（OH）３、ついで３％QAE、最後に
１％Ca3（PO4）2;最後のAl（OH）３上清４をまずさら
に200mlの濃度１％Al（OH）３で処理し（25℃、５分
間）、ついで同じ条件で120gのQAE−RSephadex A50で処
理し最後に40gのCa3（PO4）２によって＋25℃で15分間
処理した。すべての吸着剤を一緒に遠心分離し、遠心分
離後の上清に安定化剤を加え、低温殺菌し、希釈し、VI
II因子を参考例１と同様にしてDEAE−Sepharose上で精
製した。溶出液は著しく高い比活性を示した（表中の実
験６参照）。
EP0,018,561 B1またはEP0,032,655に従ってVIII因子
濃縮物を得るために処理されるクリオプレシピテート
も、出発原料を本発明の吸着によって処理した場合に
は、安定かつ高い活性を示す生成物が好収率で得られ
る。これは以下の実施例に示す。
実施例 ５ 粗クリオプレシピテート6kgを次の組成の緩衝液、す
なわち0.08mol/ NaCl、0.27mol/グリシン、0.5U/ml
ヘパリン、0.1U/ml AT III、pH6.0、18に37℃で溶解
し、24の粗クリオ溶液を得、これをまず次のようにし
て吸着させた。
１×５％（v/v）Al（OH）3:このためには1.2の濃度
１％Al（OH）３を25℃で24の粗クリオ溶液に加え、15
分間撹拌し、吸着剤を3,000rpmで遠心分離して除き、次
に以下のように混合吸着を実施した。
５％（v/v）Al（OH）３および３％QAE−RSephadex A5
0:最初のAl（OH）３上清24に1.2の濃度１％Al（O
H）３を再び加え、５分間撹拌し、ついでこの溶液を720
gの湿潤QAE−Sephadex A50により25℃でさらに15分間吸
着させた。遠心分離で得られた上清をMa339（EP0,018,5
61;USP4,297,344）に従って後処理するとVIII因子濃縮
物が得られ、これを凍結乾燥した。
再構成された最終生成物は、室温に放置しても著しく
良好な安定性を示した。
VIII因子:C活性、再構成後 29 IU/ml 溶液中23℃２時間後 27 IU/ml 溶液中23℃６時間後 29 IU/ml 溶液中23℃24時間後 30 IU/ml 実施例および参考例に使用した緩衝液は次のとおりで
ある。
溶解緩衝液:0.08mol/ NaCl 0.27mol/グリシン ＋0.1U/ml AT III ＋0.5U/mlヘパリン 希釈緩衝液:0.2mol/リジン 0.2mol/酢酸ナトリウム pH5.5 洗浄緩衝液:0.1mol/リジン 0.1mol/酢酸ナトリウム 0.017mol/ NaCl 0.0125mol/ CaCl2 pH5.5 溶出緩衝液:0.1mol/リジン 0.1mol/酢酸ナトリウム 0.3mol/ CaCl2 pH5.5 透析および包装緩衝液:0.15mol/ NaCl 0.75％スクロース 3％グリシン pH6.9
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・ヴエルナー ドイツ連邦共和国デー‐3550マルブル ク．ツムカルクベルク４ (72)発明者 カール―ハインツ・ヴエンツ ドイツ連邦共和国デー‐3556アルゲンシ ユタイン．タールシユトラーセ10 (72)発明者 ゲールハルト・クムペ ドイツ連邦共和国デー‐3552ヴエター. ペルバラーヴエーク11 (56)参考文献 特開 昭61−60614（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501562（ＪＰ，Ａ) 「Ｂｌｏｏｄ」（1982）59（３）ｐ. 615−624

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】高い比活性と安定性を有する血液凝固VIII
    因子を製造する方法において、VIII因子含有溶液からそ
    れ自体公知の方法によってVIII因子を得る方法の前処理
    として、アミド分解／蛋白分解活性を有し、VIII因子を
    分解する酵素および酵素前駆体を結合する条件下、第１
    回目のAl（OH）３への吸着処理に付した後遠心分離処理
    し、得られた上澄み液を第２回目のAl（OH）３への吸着
    処理および陰イオン交換樹脂および／またはCa3（PO4）
    ２への吸着処理に付することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】処理は親水性マトリックスと陰イオン基を
    有する塩基性交換樹脂によって行う請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】処理は多糖をベースとしたマトリックスと
    陰イオン基を有する塩基性交換樹脂によって行う請求項
    １記載の方法。
  4. 【請求項４】処理はpH6.5〜7.5、伝導率10〜15mSにおい
    て行う請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】処理はクエン酸イオンまたは二価の金属イ
    オンの他の捕捉剤を含まないメジウム中で行う請求項１
    記載の方法。
  6. 【請求項６】２種の異なる吸着剤を続けて添加し、つい
    で上澄液を分離する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】さらに低温殺菌を実施する請求項１記載の
    方法。
  8. 【請求項８】溶液１あたりリン酸カルシウムが10gま
    たは湿潤陰イオン交換樹脂が20〜30gの量を使用する請
    求項１記載の方法。
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