JPH0258913B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、器官の抽出物、とくにブタのすい臓
の抽出物から高度に純粋な酵素のカリクレインを
製造する方法に関する。ブタのすい臓の付随する
たんぱく質分解活性物質はイオン交換体のクロマ
トグラフイーにより分離され、そして高度に純粋
なカリクレインは、カリクレイン−トリプシン抑
制剤〔塩基性すい臓トリプシン抑制剤(basic
pancreatic trypsin inhibitor)=BPTI〕が特定
の方法で共有結合している担体物質のクロマトグ
ラフイーにより得られる。
の抽出物から高度に純粋な酵素のカリクレインを
製造する方法に関する。ブタのすい臓の付随する
たんぱく質分解活性物質はイオン交換体のクロマ
トグラフイーにより分離され、そして高度に純粋
なカリクレインは、カリクレイン−トリプシン抑
制剤〔塩基性すい臓トリプシン抑制剤(basic
pancreatic trypsin inhibitor)=BPTI〕が特定
の方法で共有結合している担体物質のクロマトグ
ラフイーにより得られる。
酵素のカリクレインおよびその生化学的性質
は、F.Fiedler,Methods in Enzymology(酵素
学における方法)第45巻、Proteolytic Enzymes
(たんぱ質分解酵素)部B、289−303に記載され
た。
は、F.Fiedler,Methods in Enzymology(酵素
学における方法)第45巻、Proteolytic Enzymes
(たんぱ質分解酵素)部B、289−303に記載され
た。
カリクレインが内因的キニノーゲンに作用する
とき、生理学的に活性なキニン(たとえば、カリ
ジン)が遊離する。したがつて、カリクレインの
製剤は治療に使用される〔E.K.Frey、H.Kraut
およびE.Werle,Das Kallikrein−Kinin−
System und Seine Inhibitoren(カリクレイン/
キニン系およびその抑制剤)、F.Enke、stuttgart
(1968)、150et seq.〕。
とき、生理学的に活性なキニン(たとえば、カリ
ジン)が遊離する。したがつて、カリクレインの
製剤は治療に使用される〔E.K.Frey、H.Kraut
およびE.Werle,Das Kallikrein−Kinin−
System und Seine Inhibitoren(カリクレイン/
キニン系およびその抑制剤)、F.Enke、stuttgart
(1968)、150et seq.〕。
酵素のカリクレインは、ブタのすい臓の予備精
製した抽出物から、イオン交換体のカラムクロマ
トグラフイーにより単一化合物としてすでに得ら
れた(C.KutzbachおよびG.Schmidt−Kastner、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.353(1972)、
1099−1106、ドイツ国公告明細書2154556号およ
びドイツ国公開明細書2154557号)。
製した抽出物から、イオン交換体のカラムクロマ
トグラフイーにより単一化合物としてすでに得ら
れた(C.KutzbachおよびG.Schmidt−Kastner、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.353(1972)、
1099−1106、ドイツ国公告明細書2154556号およ
びドイツ国公開明細書2154557号)。
しかしながら、前述の方法は、器官の抽出物か
ら出発し、純粋な酵素のカリクレインを得るため
に合計5工程を必要とするので、非特異的であり
かつ工業的に経費を要する。親和性クロマトグラ
フイーの技術は、抑制剤と酵素との間の生物特異
的相互作用から成り、理論的には1つの単離工程
で進行し、それゆえ最近工業的規模で酵素を単離
するための好ましい方法として探求されるように
なつてきた。
ら出発し、純粋な酵素のカリクレインを得るため
に合計5工程を必要とするので、非特異的であり
かつ工業的に経費を要する。親和性クロマトグラ
フイーの技術は、抑制剤と酵素との間の生物特異
的相互作用から成り、理論的には1つの単離工程
で進行し、それゆえ最近工業的規模で酵素を単離
するための好ましい方法として探求されるように
なつてきた。
担体結合したBPTIとカリクレインとの相互作
用に基づくカリクレインの種々の親和性クロマト
グラフイー法は、文献にすでに開示された。
用に基づくカリクレインの種々の親和性クロマト
グラフイー法は、文献にすでに開示された。
BPTIは、用いるPH値に依存して、カリクレイ
ンと酵素−抑制剤錯体を可逆的に形成する(H.
Tschesche、Angewandte Chemie86(1974)、
24−40およびE.Auhagen,International
Symposium on Drugs of Animal Origin、A.
LeonardiおよびJ.Walsh ed.、Ferro edizioni
Mailand p.69)。
ンと酵素−抑制剤錯体を可逆的に形成する(H.
Tschesche、Angewandte Chemie86(1974)、
24−40およびE.Auhagen,International
Symposium on Drugs of Animal Origin、A.
LeonardiおよびJ.Walsh ed.、Ferro edizioni
Mailand p.69)。
他の多価の抑制剤、たとえば、大豆トリプシン
抑制剤と比べて、BPTIはPH変化に対する安定
性、温度に対する安定性、たんぱく質分解安定性
および溶媒に対する安定性をもつため、器官の抽
出物からたんぱく質分解酵素を単離するためとく
に適する〔B.Kassell,Methods in
Enzymology(酵素学における方法)19(1970)、
844−852〕。BPTIへ結合されている結果、たん
ぱく質分解酵素は失活に対して大きく保護され
る。
抑制剤と比べて、BPTIはPH変化に対する安定
性、温度に対する安定性、たんぱく質分解安定性
および溶媒に対する安定性をもつため、器官の抽
出物からたんぱく質分解酵素を単離するためとく
に適する〔B.Kassell,Methods in
Enzymology(酵素学における方法)19(1970)、
844−852〕。BPTIへ結合されている結果、たん
ぱく質分解酵素は失活に対して大きく保護され
る。
BPTIは既知の主構造の58種類のアミノ酸をも
つポリペプチドであり、そしてウシの器官から得
られる(B.KassellおよびM.Laskowski,
Biochem.Biophys.Res.Commun.20(1965)、463
−468、およびF.A.AndererおよびS.Hornle、J.
Biol.Chem.241(1966)、1568−1572)。
つポリペプチドであり、そしてウシの器官から得
られる(B.KassellおよびM.Laskowski,
Biochem.Biophys.Res.Commun.20(1965)、463
−468、およびF.A.AndererおよびS.Hornle、J.
Biol.Chem.241(1966)、1568−1572)。
BPTIは、ヒドロキシル基を含有しかつ臭化シ
アノーゲンで活性化された担体へ共結合され、そ
してたんぱく質酵素の親和性クロマトグラフイー
に使用されてきた(D.A.JohnsonおよびJ.
Travis,Anal.Biochem.72(1976)、573−576、
G.J.BaughおよびJ.Travis,Biochemistry15
(1976)、836−841、R.Geiger、W.Stuckstedteお
よびH.Fritz、Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.
Chem.361(1980)、1003−1016およびドイツ国公
開明細書2363201号)。
アノーゲンで活性化された担体へ共結合され、そ
してたんぱく質酵素の親和性クロマトグラフイー
に使用されてきた(D.A.JohnsonおよびJ.
Travis,Anal.Biochem.72(1976)、573−576、
G.J.BaughおよびJ.Travis,Biochemistry15
(1976)、836−841、R.Geiger、W.Stuckstedteお
よびH.Fritz、Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.
Chem.361(1980)、1003−1016およびドイツ国公
開明細書2363201号)。
さらに、親和性クロマトグラフイーの目的で、
BPTIを無水物樹脂へ共有結合することは開示さ
れ(ドイツ国公開明細書1768934号、およびH.
Fritz、E.Brey、A.SchmalおよびE.Werle、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、
617−625)、そしてカルボキシル基を有するセフ
アロース(Sepharose)4Bへ水溶性カーボジイミ
ドによりBPTIを共有結合することが開示された
(B.R.Geiger、R.MannおよびT.Bettels、J.Clin.
Chem.Biochem.15(1977)、479−483、O.Ole−
Moi Yoi、J.SpraggおよびK.F.Austen、J.
Immunol.121(1978)、66−71、N.B.OzaおよびR.
W.Ryan、Biochem.J.171(1978)、285−288およ
びN.B.Oza、V.M.Amin、R.K.McGregor、A.G.
ScidiおよびD.A.Carretero、Biochem.
Pharmacol.25(1976)、1607−1612)。
BPTIを無水物樹脂へ共有結合することは開示さ
れ(ドイツ国公開明細書1768934号、およびH.
Fritz、E.Brey、A.SchmalおよびE.Werle、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、
617−625)、そしてカルボキシル基を有するセフ
アロース(Sepharose)4Bへ水溶性カーボジイミ
ドによりBPTIを共有結合することが開示された
(B.R.Geiger、R.MannおよびT.Bettels、J.Clin.
Chem.Biochem.15(1977)、479−483、O.Ole−
Moi Yoi、J.SpraggおよびK.F.Austen、J.
Immunol.121(1978)、66−71、N.B.OzaおよびR.
W.Ryan、Biochem.J.171(1978)、285−288およ
びN.B.Oza、V.M.Amin、R.K.McGregor、A.G.
ScidiおよびD.A.Carretero、Biochem.
Pharmacol.25(1976)、1607−1612)。
しかしながら、開示された方法は、それらの経
済的応用を著しく制限するかなりの欠点を有す
る。
済的応用を著しく制限するかなりの欠点を有す
る。
こうして、たとえば、ヒドロキシル基を含有す
る担体を臭化シアノーゲンで活性化した後、形成
したイソ尿素結合は、陽イオン的に帯電しており
そして不安定である(G.I.Tesser、H.U.Fischお
よびR.Schwyzer、Helvetica chimica acta57
(1974)、1718−1730)。
る担体を臭化シアノーゲンで活性化した後、形成
したイソ尿素結合は、陽イオン的に帯電しており
そして不安定である(G.I.Tesser、H.U.Fischお
よびR.Schwyzer、Helvetica chimica acta57
(1974)、1718−1730)。
カリクレインの単離のためにジアミンで中和し
なくてはならない陰イオン性SPTI−担体は、ド
イツ国公開明細書1768934号において得られた。
いずれの手順によつても、安定なBPTI−担体お
よび純粋なカリクレインは得られない。ドイツ国
公開明細書2363201号の手順も欠点を有し、また
不経済である。ブタのすい臓抽出物は、予備精製
しないで、BPTI−“セフアロース(Sepharose)”
4B(商標)カラムで処理すると、トリプシン、キ
モトリプシンおよびカリクレインが得られる。ト
リプシンおよびキモトリプシンはカリクレインよ
りも実質的に安価である。しかしながら、トリプ
シンも含有するブタのすい臓抽出物からカリクレ
インを単離するために、きわめて高価なBPTI−
“セフアロース”4Bの大部分を使用して安価なト
リプシンを単離する。なぜなら、一方においてブ
タのすい臓におけるトリプシンおよびキモトリプ
シンの濃度はカリクレインのそれより100倍大き
く(C.KutzbachおよびG.Schmidt−Kastner、
Kininogenases F.K.Schattauer−Verlag、
Stuttgart−New York(1973)、23−25)そして
他方においてトリプシン−BPTI錯体(ウシのト
リプシンについて:PH8.0においてKi=6.0×
10-14M、J.B.Vincent、H.Schweitz、M.Peron
−RennerおよびJ.Pudlers(1974)Proteinase
Inhibitors Symposium(プロテイナーゼ抑制剤−
バイエル・シンポジウム)(編集者H.Fritz、
H.Tschesche、およびL.J.Greene、E.Truscheit
420−431、Springer−Verlag、Berlin))はカリ
クレイン−BPTI錯体(ブタのすい臓のカリクレ
インについて、PH8.0においてKi=1×10-9M、
H.Fritz、H.Schult、R.MeisterおよびE.Werle、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、
1531−1540)よりも解離度がかなり低い。純粋な
カリクレインの改良された製造法が今回発見され
た。
なくてはならない陰イオン性SPTI−担体は、ド
イツ国公開明細書1768934号において得られた。
いずれの手順によつても、安定なBPTI−担体お
よび純粋なカリクレインは得られない。ドイツ国
公開明細書2363201号の手順も欠点を有し、また
不経済である。ブタのすい臓抽出物は、予備精製
しないで、BPTI−“セフアロース(Sepharose)”
4B(商標)カラムで処理すると、トリプシン、キ
モトリプシンおよびカリクレインが得られる。ト
リプシンおよびキモトリプシンはカリクレインよ
りも実質的に安価である。しかしながら、トリプ
シンも含有するブタのすい臓抽出物からカリクレ
インを単離するために、きわめて高価なBPTI−
“セフアロース”4Bの大部分を使用して安価なト
リプシンを単離する。なぜなら、一方においてブ
タのすい臓におけるトリプシンおよびキモトリプ
シンの濃度はカリクレインのそれより100倍大き
く(C.KutzbachおよびG.Schmidt−Kastner、
Kininogenases F.K.Schattauer−Verlag、
Stuttgart−New York(1973)、23−25)そして
他方においてトリプシン−BPTI錯体(ウシのト
リプシンについて:PH8.0においてKi=6.0×
10-14M、J.B.Vincent、H.Schweitz、M.Peron
−RennerおよびJ.Pudlers(1974)Proteinase
Inhibitors Symposium(プロテイナーゼ抑制剤−
バイエル・シンポジウム)(編集者H.Fritz、
H.Tschesche、およびL.J.Greene、E.Truscheit
420−431、Springer−Verlag、Berlin))はカリ
クレイン−BPTI錯体(ブタのすい臓のカリクレ
インについて、PH8.0においてKi=1×10-9M、
H.Fritz、H.Schult、R.MeisterおよびE.Werle、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、
1531−1540)よりも解離度がかなり低い。純粋な
カリクレインの改良された製造法が今回発見され
た。
本発明によれば、カリクレインを含有する器官
抽出物を5〜8のPH値において2〜6mScm-1の伝
導度に調整し、このように調製した器官抽出物を
バツチ型またはカラム型の陰イオン交換体と接触
させ、1価または2価のアルカリ金属塩またはア
ルカリ土類金属塩、たとえば、それぞれナトリウ
ムおよびカリウムの塩化物および硫酸塩およびマ
グネシウムおよびカルシウムの塩化物によりイオ
ン強度を連続的にまたは不連続的に増加するか、
あるいはPH値を低下することによつてカリクレイ
ンを溶離し、そして担体へ共有結合したBPTIの
親和性クロマトグラフイーにより溶出液を引き続
いて精製し、そしてBPTI−担体から4.0−5.0の
PH値において脱着することを特徴とする。純粋な
カリクレインの製造法が、提供される。使用する
陰イオン交換体、ことにBPTI−担体はセルロー
ス、デキストランまたはアガロースに基づき、そ
して2官能試薬の処理により橋かけされているこ
とが好ましい。
抽出物を5〜8のPH値において2〜6mScm-1の伝
導度に調整し、このように調製した器官抽出物を
バツチ型またはカラム型の陰イオン交換体と接触
させ、1価または2価のアルカリ金属塩またはア
ルカリ土類金属塩、たとえば、それぞれナトリウ
ムおよびカリウムの塩化物および硫酸塩およびマ
グネシウムおよびカルシウムの塩化物によりイオ
ン強度を連続的にまたは不連続的に増加するか、
あるいはPH値を低下することによつてカリクレイ
ンを溶離し、そして担体へ共有結合したBPTIの
親和性クロマトグラフイーにより溶出液を引き続
いて精製し、そしてBPTI−担体から4.0−5.0の
PH値において脱着することを特徴とする。純粋な
カリクレインの製造法が、提供される。使用する
陰イオン交換体、ことにBPTI−担体はセルロー
ス、デキストランまたはアガロースに基づき、そ
して2官能試薬の処理により橋かけされているこ
とが好ましい。
1000−1350KU/mgの純粋なカリクレインは器
官抽出液から出発して、0.5−1KU/mgから出発
して、2工程において工業的に簡単なかつ経済的
方法で記載する方法により、得られる。(カリク
レインの活性は、F.I.P.(Federation
Internatione Pharmaceutique(国際製薬連合)
により標準化され具体化された力価測定試験によ
つて、N−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエ
ーテルの加水分解を測定することによつて決定さ
れる。1F.I.P単位は、PH8.0および25℃において
1分で1マイクロモルのN−ベンゾイル−L−ア
ルギニンエチルエステルを分離するカリクレイン
の量として定義される。Frey、Krautおよび
Werleに定義される普通のカリクレイン単位
(KU)への変換は、6.37の因子を掛けることによ
つて行われる)。
官抽出液から出発して、0.5−1KU/mgから出発
して、2工程において工業的に簡単なかつ経済的
方法で記載する方法により、得られる。(カリク
レインの活性は、F.I.P.(Federation
Internatione Pharmaceutique(国際製薬連合)
により標準化され具体化された力価測定試験によ
つて、N−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエ
ーテルの加水分解を測定することによつて決定さ
れる。1F.I.P単位は、PH8.0および25℃において
1分で1マイクロモルのN−ベンゾイル−L−ア
ルギニンエチルエステルを分離するカリクレイン
の量として定義される。Frey、Krautおよび
Werleに定義される普通のカリクレイン単位
(KU)への変換は、6.37の因子を掛けることによ
つて行われる)。
この方法は、一方において陰イオン交換体の予
備精製工程に分割される。この工程において、ブ
タのすい臓器官の抽出物は2〜6mS×cm-1の伝導
度および5〜8のPH値に調整しなくてはならな
い。次いで、調製した粗製カリクレイン溶液をバ
ツチ型またはカラム型の陰イオン交換体と接触さ
せ、そして精製したカリクレインを担体材料から
溶離する。この溶離は、1価または2価のアルカ
リ金属塩またはアルカリ金属塩によりイオン強度
を増加することによつて実施する。
備精製工程に分割される。この工程において、ブ
タのすい臓器官の抽出物は2〜6mS×cm-1の伝導
度および5〜8のPH値に調整しなくてはならな
い。次いで、調製した粗製カリクレイン溶液をバ
ツチ型またはカラム型の陰イオン交換体と接触さ
せ、そして精製したカリクレインを担体材料から
溶離する。この溶離は、1価または2価のアルカ
リ金属塩またはアルカリ金属塩によりイオン強度
を増加することによつて実施する。
予備精製工程におけるイオン強度は、勾配型で
または段階的に、連続的にまたは不連続的に増加
することができる。別法として、PH値を低下する
ことにより、カリクレインを陰イオン交換体から
溶離することができる。
または段階的に、連続的にまたは不連続的に増加
することができる。別法として、PH値を低下する
ことにより、カリクレインを陰イオン交換体から
溶離することができる。
カリクレインの精製に、セルロースに基づく塩
基性イオン交換体の使用は、米国特許明細書
3100736号に原理的に記載されている。
基性イオン交換体の使用は、米国特許明細書
3100736号に原理的に記載されている。
セルロースに基づく陰イオン交換体は、微生物
学的に分解性でありかつ物理的に安定性がないと
いう欠点を有する。これにより、これらの交換体
は大規模な工業的使用において制限を受ける。
学的に分解性でありかつ物理的に安定性がないと
いう欠点を有する。これにより、これらの交換体
は大規模な工業的使用において制限を受ける。
塩基性置換基を有するマクロ多孔質ポリマーに
基づく陰イオン交換体の使用は、こうしてまたカ
リクレインの精製について記載された(ドイツ国
公開明細書2424118号、米国特許明細書3809748号
および米国特許明細書4038141号)。それらのカリ
クレインについての容量およびカリクレインの精
製フアクターは、セルロースに基づく陰イオン交
換体と比べて、制限される。
基づく陰イオン交換体の使用は、こうしてまたカ
リクレインの精製について記載された(ドイツ国
公開明細書2424118号、米国特許明細書3809748号
および米国特許明細書4038141号)。それらのカリ
クレインについての容量およびカリクレインの精
製フアクターは、セルロースに基づく陰イオン交
換体と比べて、制限される。
米国特許明細書3573277に従い、セルロース
“セフアデツクス(Sephadex)”または“セフア
ロース(Sepharose)”に基づく陰イオン交換体
の物理的性質は2官能性試薬、たとえば、エピク
ロロヒドリンまたは2,3−ジブロモプロパノー
ルで処理することによりかなり改良できる。共有
結合により変性された陰イオン交換体は、未処理
の陰イオン交換体よりもかなり高い流速を有し、
そしてカラム型でカリクレインの精製に使用でき
る。
“セフアデツクス(Sephadex)”または“セフア
ロース(Sepharose)”に基づく陰イオン交換体
の物理的性質は2官能性試薬、たとえば、エピク
ロロヒドリンまたは2,3−ジブロモプロパノー
ルで処理することによりかなり改良できる。共有
結合により変性された陰イオン交換体は、未処理
の陰イオン交換体よりもかなり高い流速を有し、
そしてカラム型でカリクレインの精製に使用でき
る。
2官能性試薬による前述の陰イオン交換体の処
理は、交換可能なイオン性基の導入の前または後
に行うことができ、陰イオン交換体の基の導入前
に橋かけ剤による処理を実施することが好まし
い。
理は、交換可能なイオン性基の導入の前または後
に行うことができ、陰イオン交換体の基の導入前
に橋かけ剤による処理を実施することが好まし
い。
前述のカリクレインの精製に用いる陰イオン交
換体は、DEAE−セルロース、DEAE−
“Sephadex”(フアーマシア社(Pharmacia
AB、Uppsala、Sweden)のデキストランの商
標)またはDEAE−“Sepharose”(フアーマシア
社(Pharmacia AB、Uppsala、Sweden)のア
ガロースの商標)を2官能性試薬で処理すること
によつて製造することができ、あるいはそれらは
橋かけされた陰イオン交換体、たとえばDEAE−
“Sephacel”(フアーマシア社(Pharmacia AB、
Uppsala、Sweden)のエピクロロヒドリンで橋
かけされたセルロース交換体についての商標)ま
たはDEAE−“Indion”イオン交換体(フエニツ
クス・ケミカル社(Phonix Chemicals、Ltd.、
Waitaki、New Zealand)のエピクロロヒドリ
ンで橋かけされたセルロース交換体についての商
標)として商業的に入手できる。
換体は、DEAE−セルロース、DEAE−
“Sephadex”(フアーマシア社(Pharmacia
AB、Uppsala、Sweden)のデキストランの商
標)またはDEAE−“Sepharose”(フアーマシア
社(Pharmacia AB、Uppsala、Sweden)のア
ガロースの商標)を2官能性試薬で処理すること
によつて製造することができ、あるいはそれらは
橋かけされた陰イオン交換体、たとえばDEAE−
“Sephacel”(フアーマシア社(Pharmacia AB、
Uppsala、Sweden)のエピクロロヒドリンで橋
かけされたセルロース交換体についての商標)ま
たはDEAE−“Indion”イオン交換体(フエニツ
クス・ケミカル社(Phonix Chemicals、Ltd.、
Waitaki、New Zealand)のエピクロロヒドリ
ンで橋かけされたセルロース交換体についての商
標)として商業的に入手できる。
それらはカリクレインについて高い容量をもつ
ため、橋かけされた陰イオン交換体は、カラム型
において、不活性担体のゲル、たとえば
“Sephadex”G10、G15またはG25(フアーマシア
社(Pharmacia AB、Uppsala、Sweden)の商
標と、種々の比率と混合して、流速をさらに改良
するために使用することもできる。
ため、橋かけされた陰イオン交換体は、カラム型
において、不活性担体のゲル、たとえば
“Sephadex”G10、G15またはG25(フアーマシア
社(Pharmacia AB、Uppsala、Sweden)の商
標と、種々の比率と混合して、流速をさらに改良
するために使用することもできる。
0.5−1KU/mgの活性をもつブタのすい臓の器
官の抽出液から出発するとき、前述の陰イオン交
換体で処理することにより、カリクレインを15〜
120KU/mgの比活性に濃縮することができる。
たんぱく質分解性の酵素のトリプシンおよびキモ
トリプシンの形のブタのすい臓の抽出液のたんぱ
く質分解活性は大きく分離除去される。
官の抽出液から出発するとき、前述の陰イオン交
換体で処理することにより、カリクレインを15〜
120KU/mgの比活性に濃縮することができる。
たんぱく質分解性の酵素のトリプシンおよびキモ
トリプシンの形のブタのすい臓の抽出液のたんぱ
く質分解活性は大きく分離除去される。
カリクレインの中間段階をさらに精製して純粋
なカリクレインを得ることは、特別のBPTI−担
体を用いて実施する。器官抽出液から出発して、
1000−2500の全精製フアクターがカリクレインに
ついて得られる。得られた純粋なカリクレインは
1000−1350KU/mgの比活性を有する。
なカリクレインを得ることは、特別のBPTI−担
体を用いて実施する。器官抽出液から出発して、
1000−2500の全精製フアクターがカリクレインに
ついて得られる。得られた純粋なカリクレインは
1000−1350KU/mgの比活性を有する。
ヒドロキシル基を含有するポリマー、たとえば
“Sephadex”(フアーマシア社(Pharmacia
AB、Uppsala、Sweden)の橋かけされた不溶性
デキストランについての商標)、“Sepharose”
(フアーマシア社Pharmacia AB、Uppsala、
Sweden)の不活性アガロース=D−ガラクトー
スおよび3,6−アンヒドロ−L−ガラクトース
の線状多糖類)およびデキストランまたはセルロ
ースを、BPTIの共有結合のためのポリマー担体
材料として使用できる。
“Sephadex”(フアーマシア社(Pharmacia
AB、Uppsala、Sweden)の橋かけされた不溶性
デキストランについての商標)、“Sepharose”
(フアーマシア社Pharmacia AB、Uppsala、
Sweden)の不活性アガロース=D−ガラクトー
スおよび3,6−アンヒドロ−L−ガラクトース
の線状多糖類)およびデキストランまたはセルロ
ースを、BPTIの共有結合のためのポリマー担体
材料として使用できる。
カラム型で使用できるBPTI−担体を得るため
に、ポリマー担体は、一般に、BPTIの共有結合
のために、大量の2官能性試薬で処理して、共有
橋かけ結合のために担体材料を固める。
に、ポリマー担体は、一般に、BPTIの共有結合
のために、大量の2官能性試薬で処理して、共有
橋かけ結合のために担体材料を固める。
使用する2官能性試薬は、対称的または非対称
的に蓄積する〔F.Wold、Methods in
Enzymology(酵素学における方法)11、p.617et
seq.〕。化学的観点から、それらは好ましくはハ
ロヒドリン、ビスアルキルハライド、2官能性エ
ポキシドまたはジビニル化合物に属する。次の試
薬を代表例として述べることができるが、これら
に限定されない:エピクロロヒドリン、ジブロモ
ヒドリン、1,4−ブタンジオールジグリシジル
エーテル(L.SundbergおよびJ.Porath、J.
Chrom.90(1974)、87−98)、ビスオキシランお
よびジビニルスルホン(ドイツ国公開明細書
2312615号)。
的に蓄積する〔F.Wold、Methods in
Enzymology(酵素学における方法)11、p.617et
seq.〕。化学的観点から、それらは好ましくはハ
ロヒドリン、ビスアルキルハライド、2官能性エ
ポキシドまたはジビニル化合物に属する。次の試
薬を代表例として述べることができるが、これら
に限定されない:エピクロロヒドリン、ジブロモ
ヒドリン、1,4−ブタンジオールジグリシジル
エーテル(L.SundbergおよびJ.Porath、J.
Chrom.90(1974)、87−98)、ビスオキシランお
よびジビニルスルホン(ドイツ国公開明細書
2312615号)。
BPTIおよびポリマー担体との間の共有結合
は、すべての場合において非イオン性でありかつ
非常に安定である。BPTI−担体は、カリクレイ
ンの容量を失なわないで、カリクレインの精製に
すくなくとも50回使用できる。
は、すべての場合において非イオン性でありかつ
非常に安定である。BPTI−担体は、カリクレイ
ンの容量を失なわないで、カリクレインの精製に
すくなくとも50回使用できる。
BPTIの結合に使用する2官能性試薬は、
BPTIの結合と同時に橋かけを生ずる。得られる
改良された流速および改良された微生物安定性
は、工業的観点から完全に望ましい。
BPTIの結合と同時に橋かけを生ずる。得られる
改良された流速および改良された微生物安定性
は、工業的観点から完全に望ましい。
驚ろくべきことには、陰イオン交換体から得ら
れかつ1モル程度に塩を含有することができる予
備精製したカリクレインフラクシヨンを、脱イオ
ンせずにBPTIカラム上へ排出することができ
る。カリクレインを結合するための最適なPH値
は、PH6−8である。不純物はカラムをPH6−5
の0.5モルの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄するこ
とにより、洗浄除去することができる。高度に純
粋なカリクレインはPH5.0以下でBPTI−担体から
溶離されるが、PH値はカリクレインのPH安定性の
ため4.0以下に低下すべきではない。
れかつ1モル程度に塩を含有することができる予
備精製したカリクレインフラクシヨンを、脱イオ
ンせずにBPTIカラム上へ排出することができ
る。カリクレインを結合するための最適なPH値
は、PH6−8である。不純物はカラムをPH6−5
の0.5モルの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄するこ
とにより、洗浄除去することができる。高度に純
粋なカリクレインはPH5.0以下でBPTI−担体から
溶離されるが、PH値はカリクレインのPH安定性の
ため4.0以下に低下すべきではない。
驚ろくべきことには、キモトリプシンの形でな
お存在するたんぱく分解性の99.9%以上および予
備精製したカリクレインフラクシヨン中の他のプ
ロテアーゼは、得られるBPTI−担体といつしよ
に分離される。これは予測できなかつた。なぜな
ら、BPTI−カリクレイン錯体およびBPTI−キ
モトリプシン錯体の平衡はほとんど同一であり、
キモトリプシンについてPH7.2において6×10-9
モルであり(B.Bo¨sterlingおよびJ.Engel、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.357(1976)、
1297−1307)そしてカリクレインについてPH8.0
において1×10-9モルである(H.Fritz、G.
Schult、R.MeisterおよびE.Werle、Hoppe−
Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、1531−
1540)。
お存在するたんぱく分解性の99.9%以上および予
備精製したカリクレインフラクシヨン中の他のプ
ロテアーゼは、得られるBPTI−担体といつしよ
に分離される。これは予測できなかつた。なぜな
ら、BPTI−カリクレイン錯体およびBPTI−キ
モトリプシン錯体の平衡はほとんど同一であり、
キモトリプシンについてPH7.2において6×10-9
モルであり(B.Bo¨sterlingおよびJ.Engel、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.357(1976)、
1297−1307)そしてカリクレインについてPH8.0
において1×10-9モルである(H.Fritz、G.
Schult、R.MeisterおよびE.Werle、Hoppe−
Seyler′s Z.Physiol.Chem.350(1969)、1531−
1540)。
カリクレイン調製物からたんぱく質分解活性物
質を完全に分離することがまさにいつそう重要で
ある。なぜなら、ドイツ国公開明細書2442995号
によれば、カリクレイン調製物のプロテアーゼ含
量と溶液中のカリクレインの安定性との間に直接
の関係があるからである。
質を完全に分離することがまさにいつそう重要で
ある。なぜなら、ドイツ国公開明細書2442995号
によれば、カリクレイン調製物のプロテアーゼ含
量と溶液中のカリクレインの安定性との間に直接
の関係があるからである。
プロテアーゼはそれ以外の方法では特別の工程
において、大豆またはジヤガイモから単離されか
つカリクレインを抑制できない担体−結合抑制剤
によつて、分離される。
において、大豆またはジヤガイモから単離されか
つカリクレインを抑制できない担体−結合抑制剤
によつて、分離される。
本発明による方法を、次の実施例によつて説明
する。
する。
ブタのすい臓の器官抽出液のイオン交換体に
よる予備精製の実施例 実施例 1 ブタのすい臓の器官抽出液と未処理または変性
DEAE−セルロースとのバツチ型かきまぜ a) 器官抽出液の調製 3.5Kgの深冷凍結したブタのすい臓を肉ひき
機で細かくした。7の水道水を細かくした器
官に加え、そしてPH値を酢酸で4.8に調整した。
この混合物を脱脂するために、3.5≒5Kgの
トリクロロエチレンを加え、この混合物を25℃
で1時間かきまぜた。1Kgの過助剤を加え、
この懸濁液を15分間かきまぜた。結合組織をす
くつて除去し、残留物をケイソウ土を供給した
フイルタープレスで除去した。トリクロロエチ
レンを含有する下層を分離し、0.2Kgのケイソ
ウ土を水相に加え、この溶液をザイツ社
(Seitz AS)のフイルタープレートで透明にし
た。カリクレインの収量:0.22×106KU b) 変性DEAE−セルロース(Cl-型)の調製 45gのDEAE−セルロース(130型、シユラ
イヘル・アンド・シユール社(Schleicher and
Schull GmbH、ダツセル/西ドイツ))を150
mlの1NのNaOH中に懸濁し、25mlのエピクロ
ロヒドリンの添加後、60℃で2時間、かきまぜ
ながら橋かけした。変性したDEAE−セルロー
スを蒸留水で洗浄し、そしてフイルター上で
HClで塩化物型に変えた。
よる予備精製の実施例 実施例 1 ブタのすい臓の器官抽出液と未処理または変性
DEAE−セルロースとのバツチ型かきまぜ a) 器官抽出液の調製 3.5Kgの深冷凍結したブタのすい臓を肉ひき
機で細かくした。7の水道水を細かくした器
官に加え、そしてPH値を酢酸で4.8に調整した。
この混合物を脱脂するために、3.5≒5Kgの
トリクロロエチレンを加え、この混合物を25℃
で1時間かきまぜた。1Kgの過助剤を加え、
この懸濁液を15分間かきまぜた。結合組織をす
くつて除去し、残留物をケイソウ土を供給した
フイルタープレスで除去した。トリクロロエチ
レンを含有する下層を分離し、0.2Kgのケイソ
ウ土を水相に加え、この溶液をザイツ社
(Seitz AS)のフイルタープレートで透明にし
た。カリクレインの収量:0.22×106KU b) 変性DEAE−セルロース(Cl-型)の調製 45gのDEAE−セルロース(130型、シユラ
イヘル・アンド・シユール社(Schleicher and
Schull GmbH、ダツセル/西ドイツ))を150
mlの1NのNaOH中に懸濁し、25mlのエピクロ
ロヒドリンの添加後、60℃で2時間、かきまぜ
ながら橋かけした。変性したDEAE−セルロー
スを蒸留水で洗浄し、そしてフイルター上で
HClで塩化物型に変えた。
c) DEAE−セルロース(Cl-型)上へのカリ
クレインの吸着 実施例1a)に従つて調製し、5.0〜5.5のPH値
および4.5−6.2mS×cm-1の伝導度を有するすい
臓の器官抽出液の1000Kgを、馬蹄型撹拌機を備
える3000容のびん中で、1500の脱イオン水
の添加により、3.0−3.3mS×cm-1の伝導度に希
釈し、そしてPH値を1.5〜2の45%強度の
NaOHの添加により7.0に調整した。未処理で
あるか、あるいは実施例1bに従つて変性した、
湿つたDEAE−セルロース(塩化物型)の15〜
20Kgを加え、この混合物を60分間かきまぜてカ
リクレインを吸着した。湿つたDEAE−セルロ
ースを800/時の速度で固体のボウル形遠心
分離器中にぜん動ポンプにより入れ、そして
2000〜3000gを懸濁液から分離した。遠心分離
機からの最初の流出物を濃塩酸はPH1.8に直ち
に調整し、キモトリプシン/トリプシンへの仕
上げのために貯蔵した。カリクレインを分離す
るために、分離した湿つた未処理または変性し
たDEAE−セルロースを、PH5.0の0.05モルの緩
衝液+0.5モルのNaClの60、30および10
で室温において、各場合60分間、連続してかき
まぜ、混合物をザイツ(Seitz)単層フイルタ
ー(直径=60cm)で各作業の間過した。合わ
せた液は、32−40mS×cm-1の伝導度を有し、
かきまぜながら、PH7.0に調整し、純粋なカリ
クレインの調整のためBPTI−担体カラムへ直
接適用できた。
クレインの吸着 実施例1a)に従つて調製し、5.0〜5.5のPH値
および4.5−6.2mS×cm-1の伝導度を有するすい
臓の器官抽出液の1000Kgを、馬蹄型撹拌機を備
える3000容のびん中で、1500の脱イオン水
の添加により、3.0−3.3mS×cm-1の伝導度に希
釈し、そしてPH値を1.5〜2の45%強度の
NaOHの添加により7.0に調整した。未処理で
あるか、あるいは実施例1bに従つて変性した、
湿つたDEAE−セルロース(塩化物型)の15〜
20Kgを加え、この混合物を60分間かきまぜてカ
リクレインを吸着した。湿つたDEAE−セルロ
ースを800/時の速度で固体のボウル形遠心
分離器中にぜん動ポンプにより入れ、そして
2000〜3000gを懸濁液から分離した。遠心分離
機からの最初の流出物を濃塩酸はPH1.8に直ち
に調整し、キモトリプシン/トリプシンへの仕
上げのために貯蔵した。カリクレインを分離す
るために、分離した湿つた未処理または変性し
たDEAE−セルロースを、PH5.0の0.05モルの緩
衝液+0.5モルのNaClの60、30および10
で室温において、各場合60分間、連続してかき
まぜ、混合物をザイツ(Seitz)単層フイルタ
ー(直径=60cm)で各作業の間過した。合わ
せた液は、32−40mS×cm-1の伝導度を有し、
かきまぜながら、PH7.0に調整し、純粋なカリ
クレインの調整のためBPTI−担体カラムへ直
接適用できた。
ブタのすい臓の器官溶液(各場合1000Kgにつ
き)のデータ: たんぱく質量=8.8〜15.3Kg;カリクレイン
活性=28.1×106KU;トリプシン活性=6.0−
26.8×106F.I.P、単位;キモトリプシン活性=
204.5−510.4×106ATEE単位(1ATEE単位は
1マイクロモル/分のN−アセチル−L−チロ
シンエチルエステルを加水分解する酵素の量に
相当する)。
き)のデータ: たんぱく質量=8.8〜15.3Kg;カリクレイン
活性=28.1×106KU;トリプシン活性=6.0−
26.8×106F.I.P、単位;キモトリプシン活性=
204.5−510.4×106ATEE単位(1ATEE単位は
1マイクロモル/分のN−アセチル−L−チロ
シンエチルエステルを加水分解する酵素の量に
相当する)。
DEAE−セルロースで予備精製したカリクレイ
ン溶液についてのデータ: たんぱく質含量:0.552−1.34Kg;カリクレ
イン活性=20.9×106KU=74.4%;トリプシン
活性=0.1×106F.I.P、単位;キモトリプシン活
性=0.2−4×106ATEE単位。
ン溶液についてのデータ: たんぱく質含量:0.552−1.34Kg;カリクレ
イン活性=20.9×106KU=74.4%;トリプシン
活性=0.1×106F.I.P、単位;キモトリプシン活
性=0.2−4×106ATEE単位。
実施例 2
ブタのすい臓の器官抽出液のDEAE−セフアセ
ル(Sephacel)商標によるクロマトグラフイー
DEAE−セフアセルを充填したカラム(高さ=
5.4cm、直径=8.0cm、体積=271.3ml)を、PH7.0
の0.05モルのリン酸塩緩衝液で平衡にした。PH
7.0に調整しかつ水で4.1mS×cm-1の伝導度に調整
した、実施例1aに従うブタのすい臓の抽出液の
5を、このカラム上に900ml/時に流速で排出
した。カラムの充填物をPH7.0の0.05モルのリン
酸塩緩衝溶液の3.8で洗浄し、そしてカリクレ
イン活性物質をPH7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝
溶液の2からp7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝溶
液+0.5モルのNaClの2への直線の勾配で溶離
した。
ル(Sephacel)商標によるクロマトグラフイー
DEAE−セフアセルを充填したカラム(高さ=
5.4cm、直径=8.0cm、体積=271.3ml)を、PH7.0
の0.05モルのリン酸塩緩衝液で平衡にした。PH
7.0に調整しかつ水で4.1mS×cm-1の伝導度に調整
した、実施例1aに従うブタのすい臓の抽出液の
5を、このカラム上に900ml/時に流速で排出
した。カラムの充填物をPH7.0の0.05モルのリン
酸塩緩衝溶液の3.8で洗浄し、そしてカリクレ
イン活性物質をPH7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝
溶液の2からp7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝溶
液+0.5モルのNaClの2への直線の勾配で溶離
した。
カリクレイン活性物質はカラム物質から10−
12mS×cm-1の伝導度で溶離された。活性フラク
シヨンを合わせ、透析により脱イオンした。出発
活性=172.00KUおよび45.42gのたんぱく質。カ
リクレイン溶出液=125.256KUおよび1.4gのた
んぱく質。
12mS×cm-1の伝導度で溶離された。活性フラク
シヨンを合わせ、透析により脱イオンした。出発
活性=172.00KUおよび45.42gのたんぱく質。カ
リクレイン溶出液=125.256KUおよび1.4gのた
んぱく質。
BPTI担体調製の実施例
実施例 3
“セフアロース(Sepharose)”4B−エピクロ
ロヒドリン−BPTIの調製 250mlの沈降した“セフアロース”4Bを2000ml
の1NのNaOH中に懸濁し、そしてかきまぜなが
ら、25mlのエピクロロヒドリンで60℃において活
性化した。活性化したゲルを吸引過し、フイル
ター上で蒸留水で数回洗浄した。次いで活性化
“セフアロース”4Bを250mlの0.01NのNaOH中に
懸濁し、7100カリクレイン単位=KIU/mgの抑
制活性をもつBPTI(カリクレイン−トリプシン
抑制剤単位、参考文献:E.K.Frey、H.Krautお
よびE.Werle“Das Kallikrein−Kinin−System
und seine Inhibitoren”(“カリクレイン−キニ
ン系およびその抑制剤)、p11、Ferdinand Enke
Verlag、Stuttgart(1968))の1.25gを加え、そ
してこの懸濁液を室温において一夜かきまぜた。
仕上げたBPTI−担体を過し、フイルター上に
おいて蒸留水で数回、10%強度のNaCl溶液で1
回、そして再び蒸留水で1回、それぞれ洗浄し
た。液は、使用したBPTI活性の16.7%に相当
する、1.48×106KIUを含有した。
ロヒドリン−BPTIの調製 250mlの沈降した“セフアロース”4Bを2000ml
の1NのNaOH中に懸濁し、そしてかきまぜなが
ら、25mlのエピクロロヒドリンで60℃において活
性化した。活性化したゲルを吸引過し、フイル
ター上で蒸留水で数回洗浄した。次いで活性化
“セフアロース”4Bを250mlの0.01NのNaOH中に
懸濁し、7100カリクレイン単位=KIU/mgの抑
制活性をもつBPTI(カリクレイン−トリプシン
抑制剤単位、参考文献:E.K.Frey、H.Krautお
よびE.Werle“Das Kallikrein−Kinin−System
und seine Inhibitoren”(“カリクレイン−キニ
ン系およびその抑制剤)、p11、Ferdinand Enke
Verlag、Stuttgart(1968))の1.25gを加え、そ
してこの懸濁液を室温において一夜かきまぜた。
仕上げたBPTI−担体を過し、フイルター上に
おいて蒸留水で数回、10%強度のNaCl溶液で1
回、そして再び蒸留水で1回、それぞれ洗浄し
た。液は、使用したBPTI活性の16.7%に相当
する、1.48×106KIUを含有した。
実施例 4
“セフアロース(Sepharose)”4B−塩化シア
ヌル酸−BPTIの調製 沈降した“セフアロース”4Bの500mlを、PH
5.0〜7.0の250mlの蒸留水と500mlのジオキサンと
の混合物中において、25gの塩化シアヌル酸で活
性化した。この活性化した“セフアロース”4B
吸引過し、フイルター上でジオキサンおよび蒸
留水で洗浄し、室温およびPH7.0〜8.0において、
5gの加えた部分的に精製したBPTI
(4716KIU/mg)と、懸濁液として、16時間結合
した。合わせたBPTI−担体を吸引過し、フイ
ルター上において蒸留水で数回、10%のNaCl溶
液で1回、再び水で1回それぞれ洗浄した。液
は、使用したBPTI活性の<1.1%に相当する、
0.25×106KIUを含有した。
ヌル酸−BPTIの調製 沈降した“セフアロース”4Bの500mlを、PH
5.0〜7.0の250mlの蒸留水と500mlのジオキサンと
の混合物中において、25gの塩化シアヌル酸で活
性化した。この活性化した“セフアロース”4B
吸引過し、フイルター上でジオキサンおよび蒸
留水で洗浄し、室温およびPH7.0〜8.0において、
5gの加えた部分的に精製したBPTI
(4716KIU/mg)と、懸濁液として、16時間結合
した。合わせたBPTI−担体を吸引過し、フイ
ルター上において蒸留水で数回、10%のNaCl溶
液で1回、再び水で1回それぞれ洗浄した。液
は、使用したBPTI活性の<1.1%に相当する、
0.25×106KIUを含有した。
実施例 5
“セフアロース(Separose)”4B−臭化シアノ
ーゲン−BPTIの調製 500mlの沈降した“セフアロース”4Bを、1N
のNaOHを添加して、11.0の一定のPH値におい
て、4.1gの加えた臭化シアノーゲンで30分間活
性化した。
ーゲン−BPTIの調製 500mlの沈降した“セフアロース”4Bを、1N
のNaOHを添加して、11.0の一定のPH値におい
て、4.1gの加えた臭化シアノーゲンで30分間活
性化した。
この懸濁液のPH値を2NのHClの添加により7.0
に調整し、5gの部分的に精製したBPTI
(4716HIU/mg)を加え、この混合物を一定のPH
および室温において16時間かきまぜた。
に調整し、5gの部分的に精製したBPTI
(4716HIU/mg)を加え、この混合物を一定のPH
および室温において16時間かきまぜた。
仕上げたBPTI−担体を吸引過し、フイルタ
ー上において蒸留水で数回、10%強度のNaCl溶
液で1回、再び蒸留水で1回それぞれ過した。
液は、使用したBPTI活性の49.7%に相当する、
11.72×106KIUを含有した。
ー上において蒸留水で数回、10%強度のNaCl溶
液で1回、再び蒸留水で1回それぞれ過した。
液は、使用したBPTI活性の49.7%に相当する、
11.72×106KIUを含有した。
“セフアロース(Sepharose)”4B−ジビニル
スルホン−BPTIの調製 50mlの沈降した“セフアロース”4Bを、5ml
のジビニルスルホンとともに、100mlの0.1モルの
Na2CO3溶液中でPH11.0および室温において2時
間かきまぜた。
スルホン−BPTIの調製 50mlの沈降した“セフアロース”4Bを、5ml
のジビニルスルホンとともに、100mlの0.1モルの
Na2CO3溶液中でPH11.0および室温において2時
間かきまぜた。
活性化した“セフアロース”4Bを吸引過し、
蒸留水で洗浄し、次いで1gのBPTI
(7100KIU/mg)とともに50mlの0.1モルの
Na2CO3溶液中でPH11.0において一夜かきまぜた。
蒸留水で洗浄し、次いで1gのBPTI
(7100KIU/mg)とともに50mlの0.1モルの
Na2CO3溶液中でPH11.0において一夜かきまぜた。
仕上げたBPTI−“セフアロース”4Bを吸引
過し、フイルター上において蒸留水で、10%強度
のNaCl溶液で、そして再び蒸留水でそれぞれ洗
浄した。吸引過後、40.27gの湿つた“セフア
ロース”4B−ジビニルスルホン−BPTIが得られ
た。液は、使用したBPTI活性の0.6%に相当す
る、0.036×106KIUを含有した。
過し、フイルター上において蒸留水で、10%強度
のNaCl溶液で、そして再び蒸留水でそれぞれ洗
浄した。吸引過後、40.27gの湿つた“セフア
ロース”4B−ジビニルスルホン−BPTIが得られ
た。液は、使用したBPTI活性の0.6%に相当す
る、0.036×106KIUを含有した。
BPTI−担体を用いる純粋なカリクレインの
製造の実施例 実施例 7 セフアロース(Sepharose)4B −エピクロロ
ヒドリン−BPTIを用いる純粋なカリクレイン
の製造 実施例3に従つて調製した“セフアロース”
4B−エピクロロヒドリン−BPTI−担体を、カラ
ム(高さ=15cm、直径=37cm、体積=16)に充
填した。このゲルの床を、PH7.0の0.1モルのリン
酸塩緩衝液の約20で、70/時の流速において
平衡した。
製造の実施例 実施例 7 セフアロース(Sepharose)4B −エピクロロ
ヒドリン−BPTIを用いる純粋なカリクレイン
の製造 実施例3に従つて調製した“セフアロース”
4B−エピクロロヒドリン−BPTI−担体を、カラ
ム(高さ=15cm、直径=37cm、体積=16)に充
填した。このゲルの床を、PH7.0の0.1モルのリン
酸塩緩衝液の約20で、70/時の流速において
平衡した。
25〜50の実施例1c)に従つて調製しかつ
NaOHでPH7.0に調整したDEAE−セルロース脱
着物を、底から7/時の流速でポンプで入れ
た。このカラムを、40のPH7.0の0.05モルのリ
ン酸塩緩衝液+0.5モルのNaClで同じポンプ速度
において洗浄した。次いで、UV吸収が出発値に
到達するまで、約40のPH5.0〜6.5の0.2モルの酢
酸ナトリウム緩衝溶液で同じ流速において洗浄し
た。カリクレインは40のPH4.4の0.05〜0.3モル
の酢酸ナトリウム緩衝溶液で溶離し、直ちに濃
NH3(H2Oで1:1に希釈した)でPH6.0−6.5に
調整した。
NaOHでPH7.0に調整したDEAE−セルロース脱
着物を、底から7/時の流速でポンプで入れ
た。このカラムを、40のPH7.0の0.05モルのリ
ン酸塩緩衝液+0.5モルのNaClで同じポンプ速度
において洗浄した。次いで、UV吸収が出発値に
到達するまで、約40のPH5.0〜6.5の0.2モルの酢
酸ナトリウム緩衝溶液で同じ流速において洗浄し
た。カリクレインは40のPH4.4の0.05〜0.3モル
の酢酸ナトリウム緩衝溶液で溶離し、直ちに濃
NH3(H2Oで1:1に希釈した)でPH6.0−6.5に
調整した。
次いで、吸着した不純物をBPTI−担体から約
40の0.1NのHClで脱着した。最後に、カラム
充填物を40〜60のPH7.0の0.1モルのリン酸塩緩
衝溶液で、カラム流出液のPH値が7.0に上昇して
しまうまで、洗浄した。
40の0.1NのHClで脱着した。最後に、カラム
充填物を40〜60のPH7.0の0.1モルのリン酸塩緩
衝溶液で、カラム流出液のPH値が7.0に上昇して
しまうまで、洗浄した。
中和されたカリクレインの主流出液を、DDS
−0.36m2の実験モジユール、20DDS−600の限外
フイルターを装填した、で脱イオン水の再循環液
への添加により、脱塩し、そして最後に、約1mS
×cm-1の再循環液体の伝導度および約1000KU/
mlのカリクレイン濃度において、2〜3に濃縮
し、そして濃縮物を凍結乾燥した。
−0.36m2の実験モジユール、20DDS−600の限外
フイルターを装填した、で脱イオン水の再循環液
への添加により、脱塩し、そして最後に、約1mS
×cm-1の再循環液体の伝導度および約1000KU/
mlのカリクレイン濃度において、2〜3に濃縮
し、そして濃縮物を凍結乾燥した。
別法として、カリクレイン溶出液を、透析また
は“セフアデツクス(Sephadex)”G25粗大カラ
ムのクロマトグラフイーにより、さらに脱イオン
することができた。
は“セフアデツクス(Sephadex)”G25粗大カラ
ムのクロマトグラフイーにより、さらに脱イオン
することができた。
使用したDEAE−セルロース脱着物:46.2Kgの
溶液、316.0gのたんぱく質を含む;カリクレイ
ン活性:9.46×106KU;たんぱく質分解活性:
632.000Kunitz単位(プロテアーゼ含量は、プロ
テアーゼ含有カリクレイン溶液をカゼインに作用
させたとき、遊離したアミノ−カルボキシル基の
滴定により測定する。0.1NのKCl中のカゼイン
(Hammarsten、Merck 2242に従う)の6%溶
液を使用し、そして滴定は0.02NのKOHを用い
PH9.5および30℃において実施した。1プロテア
ーゼ単位は、所定の条件下で1マイクロ当量/分
のペプチド結合を分裂する酵素の量として定義す
る)。
溶液、316.0gのたんぱく質を含む;カリクレイ
ン活性:9.46×106KU;たんぱく質分解活性:
632.000Kunitz単位(プロテアーゼ含量は、プロ
テアーゼ含有カリクレイン溶液をカゼインに作用
させたとき、遊離したアミノ−カルボキシル基の
滴定により測定する。0.1NのKCl中のカゼイン
(Hammarsten、Merck 2242に従う)の6%溶
液を使用し、そして滴定は0.02NのKOHを用い
PH9.5および30℃において実施した。1プロテア
ーゼ単位は、所定の条件下で1マイクロ当量/分
のペプチド結合を分裂する酵素の量として定義す
る)。
PH7.0におけるカラムの流出液=84.9Kg、305.1
gのたんぱく質および0.35×106KUのカリクレイ
ン活性≒出発活性の3.7%。PH5.0の0.2モルの酢酸
ナトリウム溶液によるBPTI−担体からの洗浄液
=41.3Kg、9.7gのたんぱく質および1.43×106KU
のカリクレイン活性≒出発活性の15.1%。
gのたんぱく質および0.35×106KUのカリクレイ
ン活性≒出発活性の3.7%。PH5.0の0.2モルの酢酸
ナトリウム溶液によるBPTI−担体からの洗浄液
=41.3Kg、9.7gのたんぱく質および1.43×106KU
のカリクレイン活性≒出発活性の15.1%。
PH4.4におけるカリクレインの溶出液≒39.5g
の溶液、3.48gのたんぱく質および5.61×106KU
のカリクレイン活性≒使用した活性の59.3%。
の溶液、3.48gのたんぱく質および5.61×106KU
のカリクレイン活性≒使用した活性の59.3%。
純粋なカリクレインの特性づけ:
1 比活性=1210KU/mg
2 灰分=0.88%
3 たんぱく質分解活性=0.097Kunitz 単位/
mg=合計337.6Kunitz単位=たんぱく質分解出
発活性の0.05% 4 キニナーゼ含量:<0.5mg/分/KU 5 カルボキシペプチダーゼB(基質:ヒツプリ
ル−アルグ(hippuryl−Arg))<0.1% 6 カルボキシペプチダーゼA(基質:ヒツプリ
ル(hippuryl)−Phe)<1% 7 280nmにおけるUV吸収、 E0.1% 280=1.78 260nmにおけるUV吸収、 E0.1% 260=1.07 E280/E260=1.66 8 セロゲル(Cellogel)電気泳動:得られるカ
リクレイン調製物は、カリクレインAとカリク
レインBから成つていた(条件については、米
国特許3905870号参照)。カリクレイン活性をも
たないたんぱく質は、観測されなかつた。
mg=合計337.6Kunitz単位=たんぱく質分解出
発活性の0.05% 4 キニナーゼ含量:<0.5mg/分/KU 5 カルボキシペプチダーゼB(基質:ヒツプリ
ル−アルグ(hippuryl−Arg))<0.1% 6 カルボキシペプチダーゼA(基質:ヒツプリ
ル(hippuryl)−Phe)<1% 7 280nmにおけるUV吸収、 E0.1% 280=1.78 260nmにおけるUV吸収、 E0.1% 260=1.07 E280/E260=1.66 8 セロゲル(Cellogel)電気泳動:得られるカ
リクレイン調製物は、カリクレインAとカリク
レインBから成つていた(条件については、米
国特許3905870号参照)。カリクレイン活性をも
たないたんぱく質は、観測されなかつた。
カリクレイン−DEAE−セルロース中間段階の
ための“セフアロース(Sepharose)”4B −エ
ピクロロヒドリン−BPTIカラムの最大のカリク
レイン容量:カラム物質の1当り800000KU。
ための“セフアロース(Sepharose)”4B −エ
ピクロロヒドリン−BPTIカラムの最大のカリク
レイン容量:カラム物質の1当り800000KU。
実施例 8
“セフアロース(Sepharose)”4B−ジビニル
スルホン−BPTIによる純粋なカリクレインの
製造 実施例6において調製した“セフアロース”
4B−ジビニルスルホン−BPTI−担体を使用し
た。残りの条件は実施例7と同一であるが、ただ
し純粋なカリクレインの溶離前のPH5.0における
カラム充填物の洗浄を省略した。
スルホン−BPTIによる純粋なカリクレインの
製造 実施例6において調製した“セフアロース”
4B−ジビニルスルホン−BPTI−担体を使用し
た。残りの条件は実施例7と同一であるが、ただ
し純粋なカリクレインの溶離前のPH5.0における
カラム充填物の洗浄を省略した。
使用したDEAE−セルロース脱着物:25Kgの溶
液、117.0gのたんぱく質を含む;カリクレイン
活性=2.72×106KU;たんぱく質分解活性:
234000Kunitz単位;PH7.0におけるカラムの最初
の流出液:87.5Kg、126.0gのたんぱく質および
0KUのカリクレイン活性。
液、117.0gのたんぱく質を含む;カリクレイン
活性=2.72×106KU;たんぱく質分解活性:
234000Kunitz単位;PH7.0におけるカラムの最初
の流出液:87.5Kg、126.0gのたんぱく質および
0KUのカリクレイン活性。
PH4.4におけるカリクレイン溶出液:34.1Kgの
溶液、3.6gのたんぱく質および2.7×106KUのカ
リクレイン活性=使用したカリクレイン活性の
100%。
溶液、3.6gのたんぱく質および2.7×106KUのカ
リクレイン活性=使用したカリクレイン活性の
100%。
凍結乾燥した純粋なカリクレイン:790KU/
mg;たんぱく質分解活性=0.745Kunitz単位/mg
=2682Kunitz単位=たんぱく質分解出発活性の
1.1%。
mg;たんぱく質分解活性=0.745Kunitz単位/mg
=2682Kunitz単位=たんぱく質分解出発活性の
1.1%。
他のBPTI−担体との実施例の比較
実施例 9
“セフアロース(Sepharose)”4B−塩化シア
ヌル酸−BPTIを用いるカリクレインの製造 実施例4に従つて調製した“セフアロース”
4B−塩化シアヌル酸−BPTI−担体を、カラム
(高さ=8.3m、直径=10.6cm、体積=732.1ml)に
充填した。
ヌル酸−BPTIを用いるカリクレインの製造 実施例4に従つて調製した“セフアロース”
4B−塩化シアヌル酸−BPTI−担体を、カラム
(高さ=8.3m、直径=10.6cm、体積=732.1ml)に
充填した。
実施例1c)に従つて調製したDEAE−セルロー
ス脱着物をカラム上へ300ml/時の流速で排出し、
そしてそれ以上の仕上げを実施例7に記載するよ
うに実施した。
ス脱着物をカラム上へ300ml/時の流速で排出し、
そしてそれ以上の仕上げを実施例7に記載するよ
うに実施した。
出発活性:599040KU;PH7.0のカラムの流出液
=112944KU≒出発活性の18.8%;PH5.0の0.2モル
の酢酸ナトリウム緩衝溶液を用いるBPTI−担体
からの洗浄液=122928KU=出発活性の20.5%;
PH4.4のカリクレイン溶出液:227430KU=使用し
たカリクレイン活性の38.0%;凍結乾燥の収量=
319.2mg、686KU/mgおよび0.8、6Kunitz/mgの
たんぱく質分解活性。
=112944KU≒出発活性の18.8%;PH5.0の0.2モル
の酢酸ナトリウム緩衝溶液を用いるBPTI−担体
からの洗浄液=122928KU=出発活性の20.5%;
PH4.4のカリクレイン溶出液:227430KU=使用し
たカリクレイン活性の38.0%;凍結乾燥の収量=
319.2mg、686KU/mgおよび0.8、6Kunitz/mgの
たんぱく質分解活性。
比活性およびたんぱく質分解活性は、BPTI−
担体の更新したクロマトグラフイーにより改良で
きなかつた。
担体の更新したクロマトグラフイーにより改良で
きなかつた。
PH7.65の0.15セルのリン酸塩緩衝溶液中の40×
170mmのセロゲル(Cellogel)のストリツプのセ
ロゲル電気泳動において、カリクレイン活性をも
たない、いつそう弱い酸性のたんぱく質帯が、カ
リクレインAおよびBの帯に加えて観測された。
170mmのセロゲル(Cellogel)のストリツプのセ
ロゲル電気泳動において、カリクレイン活性をも
たない、いつそう弱い酸性のたんぱく質帯が、カ
リクレインAおよびBの帯に加えて観測された。
実施例 10
“セフアロース(Sepharose)”4B−臭化シア
ノーゲン−BPTIを用いるドイツ国公開明細書
2363210号に従うカリクレインの製造 実施例5に従つて調製した“セフアロース”
4B−臭化シアノーゲン−BPTI−担体を、カラム
(高さ=4.1cm、直径=3.6cm、体積=41.7ml)に充
填した。
ノーゲン−BPTIを用いるドイツ国公開明細書
2363210号に従うカリクレインの製造 実施例5に従つて調製した“セフアロース”
4B−臭化シアノーゲン−BPTI−担体を、カラム
(高さ=4.1cm、直径=3.6cm、体積=41.7ml)に充
填した。
実施例1a)に従つて調製した750mlの器官抽出
液をカラム上へ排出し、そしてこのカラムをPH
7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝溶液で洗浄した。
不純物をPH5.0の0.2モルの酢酸ナトリウム緩衝溶
液で溶離した。カリクレインをPH4.4の0.3モルの
酢酸ナトリウム緩衝溶液で溶離した。トリプシン
およびキモトリプシン活性物質を、0.1NのHCl
でBPTI−担体から溶離した。
液をカラム上へ排出し、そしてこのカラムをPH
7.0の0.05モルのリン酸塩緩衝溶液で洗浄した。
不純物をPH5.0の0.2モルの酢酸ナトリウム緩衝溶
液で溶離した。カリクレインをPH4.4の0.3モルの
酢酸ナトリウム緩衝溶液で溶離した。トリプシン
およびキモトリプシン活性物質を、0.1NのHCl
でBPTI−担体から溶離した。
カリクレインについての活性バランス:出発活
性=5700KU;カラムの最初の流出液=0KU;カ
リクレイン溶出液=3753KU≒出発活性の65.8%。
性=5700KU;カラムの最初の流出液=0KU;カ
リクレイン溶出液=3753KU≒出発活性の65.8%。
ブタのすい臓抽出液についてのセフアロース
(Sepharose)4B −臭化シアノーゲン−BPTI
−担体のカリクレイン容量:BPTI−担体の1
当り136690KU。凍結乾燥したカリクレイン粉末
の比活性:17.7KU/mg。PH7.65の0.5モルのリン
酸塩緩衝溶液中の40×170mmセロゲル(Cellogel)
ストリツプのセロゲル電気泳動において、カリク
レイン活性をもたない、他のいつそう弱く酸性の
たんぱく質帯が、カリクレインAおよびBの帯に
加えて観測された。
(Sepharose)4B −臭化シアノーゲン−BPTI
−担体のカリクレイン容量:BPTI−担体の1
当り136690KU。凍結乾燥したカリクレイン粉末
の比活性:17.7KU/mg。PH7.65の0.5モルのリン
酸塩緩衝溶液中の40×170mmセロゲル(Cellogel)
ストリツプのセロゲル電気泳動において、カリク
レイン活性をもたない、他のいつそう弱く酸性の
たんぱく質帯が、カリクレインAおよびBの帯に
加えて観測された。
トリプシンについての活性バランス:出発活性
=2025F.I.P.単位;カラムの最初の流出液=0F.I.
P.単位;トリプシン溶出液=608F.I.P.単位≒出発
活性の30.0%。
=2025F.I.P.単位;カラムの最初の流出液=0F.I.
P.単位;トリプシン溶出液=608F.I.P.単位≒出発
活性の30.0%。
キモトリプシンの活性バランス:出発活性=
244500ATEE単位;カラムの最初の流出液=
204844ATEE単位≒出発活性の83.8%;キモトリ
プシン溶出液=0ATEE単位。
244500ATEE単位;カラムの最初の流出液=
204844ATEE単位≒出発活性の83.8%;キモトリ
プシン溶出液=0ATEE単位。
得られたトリプシンおよびキモトリプシンは、
電気泳動およびそれらの比活性により評価すると
き、不純物として表示した。
電気泳動およびそれらの比活性により評価すると
き、不純物として表示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 カリクレインを含有する器官抽出液を5〜8
のPH値において2〜6mScm-1の伝導度に調整し、
このように調整した器官抽出液をバツチ型または
カラム型の陰イオン交換体と接触させ、1価また
は2価のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属
塩によりイオン強度を連続的にまたは不連続的に
増加せしめることによるか、あるいはPH値を低下
せしめることによつて、カリクレインを溶離し、
そして担体へ共有結合したBPTIの親和性クロマ
トグラフイーにより溶出液を引き続いて精製し、
そしてBPTI−担体から4.0〜5.0のPH値において
脱着することを特徴とする、純粋なカリクレイン
の製造法。 2 使用するイオン交換体はセルローズ、デキス
トランまたはアガロースに基づき、そして2官能
試薬の処理により橋かけされている特許請求の範
囲第1項記載の方法。 3 BPTIが共有結合している担体はセルロー
ズ、デキストラン、またはアガロースに基づき、
そして2官能性試薬の処理により橋かけされてい
る特許請求の範囲第1または2項記載の方法。 4 2官能性試薬はハロヒドリン、ビス−アルキ
ルハライド、2官能性エポキシドまたはジビニル
化合物である特許請求の範囲第2または3項記載
の方法。
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