JPS6023645B2

JPS6023645B2 - ヒト尿性カリクレインの製法

Info

Publication number: JPS6023645B2
Application number: JP53069519A
Authority: JP
Inventors: 寛守屋
Original assignee: GREEN CROSS CORP
Current assignee: GREEN CROSS CORP
Priority date: 1978-06-09
Filing date: 1978-06-09
Publication date: 1985-06-08
Also published as: JPS54160710A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、物理化学的、免疫学的に均一なヒト尿性カリ
クレィンの製法に関する。

カリクレィンは、血数中のキニノーゲンに作用して特異
的にキニンを遊離させる酵素であり、種種の組織や体液
、すなわち顎下腺、汗腺、唾液線、肝臓、小腸、血清、
尿などにも分布していることが知られている。

尿性カリクレィンについては、生理的意義、病態的意義
との関係を明らかにする目的で、種々の研究が行なわれ
てきたが、尿性カリクレィンは、啓皮質の遠位尿細管細
胞を起源とし、その腎臓での生理作用は、Ｎａ＋および
水の代謝調節が考えられている。

臨床的にも、本態性高血圧症患者の尿中に排出されるカ
リクレィン量は正常人のそれと比べて低く、原発性アル
ドステロン症、バーター（Ｂａれｔｅｒ）症候群患者で
は高いとの報告があり、同機に尿怪力リクレィンは水、
電解質の代謝に重要な関係があることが示されている。
このため、尿性カリクレィンの測定は、各種疾病の診断
においても臨床的な意義を有し、その測定法も種々検討
されている。従来尿性カリクレィンの測定は、生物学的
、酵素化学的測定方法が用いられてきた。

そして、こられの方法には、多くの場合尿の濃縮が必要
であった。また、生物学的方法は酵素化学的方法に比べ
て、特異性はすぐれているが操作がやや煩雑であり、多
少のばらつきを伴なう。酵素化学的方法は簡単に再現性
よく行いうるが、この方法の欠点は、トリプシン、プラ
スミン、スロンビンなど類似の酵素を同時に測ることに
なり、たとえ基質をうまく使い分けたとしても必ず．し
も特異性が高いとはいえない。そこで本発明者は、徴量
のカリクレインを特異的に測定できるラジオイムノアツ
セイ（ＲＩＡ）による二抗体法を確立すべく試みたが、
第一抗体が第二抗体中の血清成分と強く反応するため、
ＲＩＡによる尿怪力リクレィンそのものの測定が不可能
であった、その原因として、均一だと思われた尿怪力リ
クレィン中に物理化学的には検出できない程度の徴量血
清成分が混在し、その血清成分の抗原性が尿注力クレィ
ンのそれと比べて非常に大きいため、抗体を作成すると
きこれら血清成分に対する抗体が産生され免疫学的測定
を不可能にすることを本発明者は見し、出した。

そこで、本発明はこのような徴量血清成分の検出、除去
に注目して尿性カリクレィンの精製を検討した。本発明
者は、従来公知の無機吸着体、イオン交換体等によって
物理化学的に均一な程度に高度精製された人尿性カリク
レイン（以下ＨＵＫと略）に対してさらに抗原抗体反応
の原理によって爽雑蛋白を除去することを特徴とする物
理化学的、免疫学的に均一なＨＵＫの精製法からなる。

物理化学的に均一な程度に高度精製された人尿性カリク
レインの製法としては、モリヤらによる方法〔日．Ｍｏ
ｒｉｙａ、Ｊ．Ｖ．ＰｉｅｒｃｅａｎｄＭ．ＥＷｅ
ｂｓにｒ、Ａｍｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０
４、１７２（１９６３）〕があり、また最近のものとし
てはマツダらによる方法〔Ｙ．Ｍａｔｓ叫ａ、Ｋ．Ｍｉ
ｙａｚａｋｉ、ＨＭｏｒｉ匁、Ｙ．Ｆｕｉｉｍｏｔｏ
、Ｙ．ＨｏｊｊｍａａｎｄＣＭｏｒｉｗｏｋｉ、Ｊ
．Ｂｊｏｃｈｅｍ．、８０、６７１（１９７６）〕があ
る。

この方法は原尿をＤＥＡＥーセルロース（ｐＨ７．０、
０．０９Ｍリン酸緩衝液）と接触させＨＵＫを吸着、次
いで塩濃度を上昇させて溶出する第１工程、セフアデツ
クスＧ−１００（ｐＨ７．０、０．０９Ｍリン酸緩衝液
）によるゲル炉過する第２工程、ＱＡＥーセフアデック
ス（ｐＨ７．０、０．０８Ｍリン酸緩衝液）に吸着、塩
濃度を上昇させて溶出する第３工程を主要工程としてお
り、比活性２０皿Ｖ／Ａ２８０（ＫＶはＫａｉｌｉｋｒ
ｅｉｎ単位：Ｊ．ＢｉＭｈｅｍ．５８、２０８一２１３
）のＵＨＫを得ている。さらに粗カリクレィン水溶液か
ら高純度カリクレイィンを得る方法として、弱塩基性イ
オン交宅製樹脂（例えば、２級又は３級アミンの交換基
をもつ）を用いる方法（袴開昭５０一１５５６０８）、
不溶性コンカナバリンＡをもちいる方法、（特開昭５２
−１８８８３）、桂酸アルミン酸マグネシウムを用いる
方法（袴関昭５０−１２総１０）があり、これらの吸着
体にカリクレィンを吸着させ、特異的に溶出・回収する
ことによって精製をおこなっている。これらの方法によ
って得られる力リクレィンの比活性は２００〜１４０雌
Ｕ／Ａ２８０である。このうちより好ましい方法として
は、桂酸アルミン酸マグネシウムを使用する方法である
。この方法においては、過常純度の上昇は粗製ＨＵＫの
場合約４倍以上であり、回収率も６０％以上である。上
記のような公知の方法によって提供される物理化学的に
均一なＨＵＫから、そこに爽雑されている各種徴量蛋白
質は、抗原抗体反応の原理によって除去される。

徴量蛋白質の存在は部分精製ＨＵＫ（前記マツダ等の方
法によって得た）と抗日ＵＫ（その製法は以下の通りで
ある。

即ち該ＨＵＫ８．６５山ｍｏｌｅｓ／Ａ２８０）、７．
松２８０／叫溶液とフロィンドの完全ァジュバンド（Ｆ
ｒｅ皿ｄ′ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｊｕｖａｎｔ）を等童
混合して乳剤を作り、第一回目の注射として、その１の
【ずつを体重約２．５ｋ９の正常ウサギ（メス３匹）の
ｆｏｏｄｐａｄに皮内在射した。第二回目として、４週
間後に同乳剤を１．５泌ずつ２匹に、１．８泌を残りの
一匹に皮下注射した。第三回目として、さらに３週間後
、それぞれ３．０必ずつを皮内注射した。最終注射より
５日後に頚動脈から全採血し、室温で凝固させた後、４
℃で一夜放置、３０仇ｐｍ、２０分の遠心分離をして抗
血清を得た。この抗血清のＨＵＫ最低検出濃度を重層法
にて測定した結果、３〜６ムタ′似であったとの免疫反
応を免疫鉱剤法（ＯＭｈｔｅｒｌｏｎｙ法）〔０．ＯＭ
ｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、ＡｃねＰａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、２５１８６（１９４８）〕によ
って検討した。この結果、５本の沈降線が観察され、主
要成分としてアルブミンが確認された。さらにカウンタ
ー電気泳動法〔Ｄ．１．ＧにｋｅａｎｄＣ．Ｈｏｗ
ｅ、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．、１０４、１０３１（１９７
０）〕を用いて、確認した場合にも多くの血清タンパク
成分が含まれていることを確認した。この爽雑する血清
クンパク成分の除去は、爽雑血清タンパク成分を含有す
るＨＵＫ水溶液と抗アルブミン、より好ましくは抗人血
清とを反応させ、簡便な方法としては、抗原抗体反応に
よって生じた沈殿物を遠心分離によって除去する。効率
的な方法としては、抗アルブミン、より好ましくは抗人
血清を水不溶性担体（例えば、セルロース誘導体、タン
パク質の水不溶性ポリマー、デキストラン重合体、寒天
ゲル、ポリアクリルアミド・ゲル）に吸着させたアフイ
ニティークロマトグラフイーの原理を利用することが好
ましい。方法は、ＨＵＫを中性の水溶液に溶解し、これ
に固定化抗全血清又は固定化抗アルブミンを加え、十分
の抗原抗体反応をおこなわしめた後、水溶液と水不落性
の担体とを分離する。これによってＨＵＫは水溶液中に
残存し、爽雑タンパク成分は水不落性の担体に吸着され
除去される。このようにして得られたＨＵＫは、濃縮、
脱塩、凍結乾燥要すれば除菌炉過、加熱処理をおこない
製品として提供される。抗原抗体反応の条件は、２〜１
ｏｏ○の温度、ｐＨ６〜８において１０〜２虫時間おこ
なう。

抗アルブミン又は抗全血清の添加量は、蛋白濃度として
相応量である。得られたＨＵＫの濃度は、イオン交換法
、凍結乾燥、塩析等によっておこなわれ、脱塩は、ゲル
炉過、透析等の処理によって行う。これらの操作で得た
ＨＵＫは、免疫化学的な爽雑物を含まず、活性回収率も
９７％以上であり、比活性の上昇も２倍以上である。こ
のようにして得た免疫化学的に均一なＨＵＫは今後、特
異性の高い医学的研究に寄与するものと考える。

次に実施例をあげて本発明を説明する。

実施例において、カリクレィン活性の測定法（血流増加
測定法）はモリヤ（Ｍｏｒｉ料）〔日．Ｍｏｒｉ匁、Ｋ
．ＹａｍａＺａｋｉ、ａｎｄ日．Ｆ叱ｕｓｈｉｍａ、
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、２０１（１９６５）〕ら
の方法に準じて行った。

すなわち、体重１０ｋ９程度の雑種成犬を用いて、ベン
トバルビタール（２５〜５０柵／ｋｇ）の腹腔内注射に
より麻酔し、股動脈を露出させ、ヘパリンを静注した（
３０００〜５００山単位）後、股動脈にカニューレを挿
入て、電磁流量計（日本光電八仲−２型）を経て、股動
脈末梢側に還流した。電磁流量計で捕えた徴量の血流変
化は直流増幅器を経て記録計（日本光電ＲＪＧ−３０２
２）に記録させた。標準カリクレィンには、発明者らに
より精製したブタ隣臓性カリクレィン７５１−Ｍ（２６
．７ＫＵ／雌）を用いた。なお、活性はＫＵ（カリクレ
ィン単位）で表記した。タンパク量の測定方法は、タン
パク量は、光路長１伽の石英セルを用い、波長２８仇仇
の吸収を日立分光光度計（１８１型、１２４型）で測定
し、吸光度（Ａ２８０）をタンパク量の指標とした。

実施例原尿に州塩酸を加えてＰＨ４．０に調整し、これ
に活性化したシリカゲルを混入し、カリクレィンを吸着
させる。

溶出は、０．９Ｍ塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０
）で行い、溶出液は蒸留水に対して透析を行った後、凍
結乾燥を行い粗製ＨＵＫとした。粗製ＨＵＫの活性は、
０．６弧Ｕ／Ａ２８０を示し、活性回収率は８５％以上
である。ＤＥＡＥーセルローズ（０．９２肌ｅｑ′夕）
を、０．印水酸化ナトリウム溶液、精製水、０．印塩酸
溶液で交互に数回洗い、最後に精製水で洗糠液が中性附
近になるまで洗総した。

次に０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化し
た後、カラム（５．０×７０伽）につめ、同緩衝液で１
夜平衝化した。粗製ＨＵＫ（６４．２のを２４のｃ／柵
となるように同緩衝液で溶解し、塩酸あるいはアンモニ
ア水で柵を７．０に調整した後、カラムに添加した。溶
出は、０〜０．９Ｍの食塩水溶液の濃度勾配により行い
、溶出液はフラクションコレクタ‐（東洋製作所：ＳＦ
−１６０Ｋ型）にて１分画１４．０泌宛に分取し、タパ
ク量、活性を測定した。

この結果、ＨＵＫは食塩濃度０．２９Ｍ附近で綾出され
、純度上昇は約２倍で、活性回収率は斑％であった。

フラクションＮＯ．８２〜１２２を有効分画とし、次の
ステップの原料とした。次に、セフアデックスＧ−１０
０を、生理食塩液に懸濁して膨潤させた後、溶媒を０．
０８ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、さらに
膨潤させ、カラム（２．５×９０功）に充填し、同緩衝
液で一夜平衝化した。

上記の有効分画を、半透膜であるセロフアンチユープに
つめ周りをポリエチレングリコール（６０００）で処理
するという方法〔日．Ｐａｌｍｓｔｉｅｒｎａ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２
、５３（１９６０）〕を用いて濃縮した後、２回に分け
てカラムに添加した。同緩衝液を用いてゲル炉適し、各
フラクション９．３の‘宛分取し、溶出した。この結果
、フラクションＮｏ．３９〜５３を有効分画とし、２回
目も同様なパターンが得られ、この有効分画を合わせて
次のステップを行った。

純度上昇は５．９倍と高く、活性回収率も８８％と極め
て良好であった。ＱＡＥ−セファデックスＡ−５０を、
０．州水酸化ナトリウム水溶液、精製水、０．州塩酸溶
液中で交互に数回洗い、最後に精製水で洗樵液が中性附
近になるまで洗練した。

次に、０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化
した後、カラム（２．５×９０の）に充填し一夜同緩衝
液で平衝化した。ステップ一２の有効分画を２回に分け
てカラムに添加した。溶出は、０〜０．９Ｍの食塩水溶
液の濃度勾配により行った。この結果、ＨＵＫは０．３
Ｍ附近で溶出され、純度上昇は約２．針音であり、活性
回収率はほぼ１００％であった。

フラクションＮＯ．９０〜１１０を有効分画とし、２回
目の有効分画と共に合わせて次のステップを行った。こ
の有効分画を、濃縮後、セフアデックスＧ−１００（十
分量の水によって洗浄した２．５×９０肌カラム）をも
ちいてゲル炉過脱塩を行い、ＨＵＫ活性分画を回収し、
凍結乾燥をおこない最終精製標５品した。

この標品の比活性は、１２０ＫＵ／Ａ２８０であり、シ
リカゲル処理後の粗製ＨＵＫからの回収率は約３０％で
あった。このもののＨＵＫ以外の爽雑タンパク質を検査
するために、カウンター電気泳動法（Ｗｃｋｅ、Ｈｏｗ
ｅの方法）（文献名前述）を行った。この電気泳動は、
緩衝液の適当なｐＨを選択することにより、抗原は陽極
側、抗体は陰極側へ決動されることを利用したものであ
る。すなわち、緩衝液として０．０９Ｍべロナール・酢
酸（ｐＨ８．２）を用いて、ガラス板（７．５×１１肌
）上に、厚さ２側の１％（ｗ／ｖ）寒天平板を作成する
。直径２側あるいは３柵の穴を作成して、それに種々の
血清タンパク成分に対する抗体と検体を入れ４〜６Ｖ／
弧の定電圧で泳動を４５分間行ない抗原と抗体が出合っ
たところで沈降線を生じ、この沈降線を親祭する。材料
として、３０の９′の‘の濃度のＨＵＫと各種血清成分
に対する抗体を用いた。

この結果、ＨＵＫ血清アルブミンを含む５つの沈降線が
検出された。そこでさらなる処理として、上記最終標品
１０ｗ９を０．１Ｍギ酸アンモン（ｐＨ７．３、０．１
８Ｍ食塩を含む）２０の‘に溶解し、この溶液にカウア
テレカサス（ＣＭｔｒｅｃａｓａｓ）らの方法〔Ｐ．Ｃ
雌ｔｒｅｃａｓａｓ、Ｐｒｏｃ．ＮａＵ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．、６１、６３６（１９７４）〕に準じて
調整した抗ヒト全血清セファロースの（３０肌）、（即
ち３０泌のセファロース伍を約５００の‘の精製水で洗
浄した後、０．２Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ８．９）に
懸濁した。この懸濁液に、ＢにＮ９夕を蝿梓下に加えて
セファロース燈を活性化させる。このとき直ちに酸性に
傾くので、が水酸化ナトリウムを滴下して、ｐＨを１０
．５〜１１．５に１２分間保ち、直ちにゲルを同緩衝液
で洗練し、次にゲルを抗ヒト全血清抗体成分（マィルス
社製：ＵＳＡ）を含む溶液に懸濁し、２５℃、６時間カ
ップリング反応を行う。反応終了後、残存する活性基を
０．９Ｍトリス塩酸緩衝液で除去処理した。）を加え、
４℃、１報時間抗原抗体反応を行った後、カラムに充填
し、０．０１Ｍギ酸アンモン（ＰＨ７．３）約１００の
上で洗絶した。次に洗液液をＤＥＡＥーセルロースに吸
着後溶出させて濃縮し、セフアデックスＧ−２５ゲル炉
過にて脱塩を行った。これらの操作で得たＨＵＫは、比
活性がきわめて高く、アフィニテイークロマトグラフィ
ーの活性回収率も９８％と良かった。この標品（０．７
７Ａ２８０／凧【）と抗ヒト血清アルブミン、抗ヒト全
血清との免疫反応を重層法にて検討した結果、血清タン
パク成分との反応は認められず、免疫学的に均一である
ことがわかつた。実施例２実施例１のＱＡＥーセフアデックス処理後の有効分画を
精製水（ｐＨ７．０）に対して一夜透析した後、精製水
（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムラィト〔富士化学■
桂酸アルミン酸マグネシウム〕のカラム（３×７０仇）
に２回に分けて添加した。

溶出は、０．８Ｍリン酸−ナトリウム溶液（ｐＨ５．０
、虫Ｍ食塩を含む）によりなされ、純度上昇は４．７倍
で、６１％の活性が回収された。各フラクションを１７
．０の‘宛分取し、フラクションＮｏ．３７〜４６を有
効分画とした。有効分画を、ＤＥＡＥーセル。

ースに吸着させ溶出するという方法で濃縮した後、２回
に分けてゲル炉適法脱塩を行ない、最終精製標品とした
。この標品の比活性は、３８雛Ｕ／Ａ２８０であり、粗
製ＨＵＫから計算して２４％の回収率で得ることができ
、粗製ＨＵＫからの純度上昇は２６４倍であった。この
標品の物理化学的な検定として、ディスク電気隊動を行
ったがその結果は、一本のみからなる泳鰯帯を観察し物
理化学的には単一な標品として認められた。一方、免疫
的均一性を確認するためカウンター露気泳動法（前述）
で、実施例１と同様に検定したところ５本の沈降線がみ
られ、血清アルブミン量は蛋白中約１％を含有していた
。

Claims

【特許請求の範囲】

１物理化学的に均一と認められる程度に高度精製され
ているが、免疫学的に夾雑蛋白を含有するヒト尿性カリ
クレインから抗原抗体反応の原理を利用した新和吸着法
によつて夾雑蛋白を除去することからなる物理化学的、
免疫学的に均一なヒト尿性カリクレインの製法。