JPH03148294A - 安定な血液凝固ｖｉｉｉ因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高い比活性と安定性を有する低温殺菌■因子
濃縮物を製造するにあたりＡｌ（ＯＨ）　ｓ、陰イオン
交換樹脂まｔ；はｃａ３（ｐｏ４）＊による少なくとも
二重吸着、好ましくはこの群からの異なる２種の吸着剤
によって、■因子含有溶液から不純物を吸着させる方法
に関する。

血漿の凝固は酵素的過程である。それに関与する因子は
蛋白質であり、多くの場合プロテアーゼの性質を有し、
この蛋白質は血液中を不活性な前駆体の形で循環し、湿
潤性表面に接触するかまたはその他、傷害時にのみ活性
化する。

トロンビンに加えて他の凝血プロテアーゼたとえばＸａ
およびＩｌａ因子も■因子を攻撃し、それを不活性化で
きる。Ｖａ因子を不活性化できるプロティンＣもとくに
重要である。■因子と■因子は最も不安定な血液凝固因
子である。それらは血液が取り出された瞬間から分解を
始める。さらにこれを促進するのが、それらはＣａ”に
よって安定化されるのに、血液採取の際にクエン酸塩や
ＥＤＴＡのような錯化剤が用いられることである。これ
らの既知のデータは、世界中で■因子を得るための出発
原料として用いられるヒト血漿からのクリオプレシビテ
ート中になお認められるヒト血漿からの■因子活性は４
０〜６０％にすぎず、■因子の精製後にはそのわずか１
０〜２０％しか残存しないという所見と一致する。

これは血友病患者への供給にきわめて不利である。すな
わち、一方では、原料物質としての血液は貴重で、きわ
めて限られた入手の可能性しかないばかりか、他方では
低収率が価格に影響する。■因子の製造時にウィルスの
不活性化を保証するための付加的処理工程が導入される
ようになってから、上述の問題はさらに深刻になってい
る。

慣用方法による■因子の製造では、Ｆａｙら（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ３、　ＵＳＡ、　７
９．７２００゜１９８２）により収率１２．７％と報告
されている。最近のイムノアフィニティークロマトグラ
フィー法を用いたＺｉｍｍｅｒｍａｎ　＆　Ｆｕｌｃｈ
ｅｒもほぼ同じ値を得ている（　ＥＰ−Ａ−０，０８３
，４８３）。

多くの研究者が、■因子はＤＥＡＥ交換樹脂およびＥＣ
ＴＥＯＬＡに強く結合し、それはハライドを用いて再び
遊離できるものの、２４時間以内にその活性は失われて
しまうと報告している（Ｓ、　ｖａｎＣｒｅｖｅｌｄら
：　Ｔｈｒｏｍｂ、　　ＤｒａＬｈｅｓ、　　Ｖｌ（２
／３）、２８２゜１９６１　；　Ｒ，Ｂａｕｇｈら：　
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ。

３７１、３６０．１９７４）。しかしながら、プロテナ
ーゼインヒビターたとえばＰＭＳＦ　（フェニルメタン
スルホニルフルオライド）や、ベンツアミジンはヒト用
の製品の製造には不適当で、この問題に対する解決策は
提出されていない。

上述のような状況から、処理および精製時に■因子の分
解を防止し、できるだけ早期から、すなわち単離または
精製の開始時から直ぐに使用できる方法が強く望まれて
いた。早い時点としては、血漿に出発していわゆるクリ
オプレシピテーシヨンによって得られ、また原料物質と
して市販されているクリオプレシビテートの再処理時が
選ばれた。

溶解したクリオプレシビテートは、現在の技術水準では
一般に、プロトロンビン因子（ＩＩ。

■、ＩＩ、Ｘ因子）による痕跡の夾雑を除去するために
、Ａｌ（ＯＨ）３で処理されている。これは、精製時に
■因子を分解する可能性がある上述の因子の活性化の防
止を意図するものである。本発明者らは驚くべきことに
、新鮮なりリオプレンピテート溶液のＡｆｆ（ＯＨ）ｘ
による１回の吸着ではプロトロンビン因子および他のプ
ロテアーゼの除去には不十分であることを見出した。そ
れは、吸着後にも、最高の感度を有するＸａ因子試験で
、吸着溶液の上澄液中に、Ｘａ内因子は同一ではないよ
うに思われるものの明瞭なアミド分解活性が検出できた
からである。

驚くべきことに、損失が少ない取扱いが容易な安定な■
因子が、クリオプレシビテートのたとえばＡｆｆ（ＯＨ
）　、、Ｃａ３（Ｐｏｔ）＊もしくは陰イオン交換樹脂
による多重吸着または混合吸着によって得られることが
明らかにされた。その基準としては、最終生成物のアミ
ド分解活性、収率、比活性および室温での安定性を測定
する。

したがって、本発明は、新たに溶解したクリオプレシビ
テートに適用すると、精製および低温殺菌時の■因子活
性の大部分の喪失を防止し、高い比活性、固有の構造お
よび安定性を有する最終生成物を高収率に得ることがで
きる方法に関する。

本発明はとくに、■因子の製造に慣用される■因子含有
血漿分画好ましくは溶解したクリオプレシビテートまた
はＣｏｈｎ分画■を、以下それ自身公知の方法によって
安定な、必要に応じて低温殺菌した■因子が好収率が得
られるように処理する方法において、これらをアミド分
解／蛋白分解活性を有し■因子を分解する酵素および酵
素前駆体を結合する吸着剤で処理する方法に関する。

本発明はとくに、高い比活性と安定性を有する■因子を
製造する方法において、■因子含有溶液をその溶液から
それ自体公知の方法によって■因子を得る前にＡ１２（
ＯＨ）ｘ、陰イオン交換樹脂またはＣａｚ（ＰＯａ）２
への少なくとも２回の吸着処理に付す方法に関する。

この場合の公知の方法は、たとえばＥＰ−ＡＯ，Ｑ１８
，５６１またはＥＰ−Ａ−０，１７３，２４２に記載さ
れている。

■因子含有出発物質は、好ましくは少なくとも２種の異
なる吸着剤の混合物に吸着される。

処理はＣａ５（Ｐｏ４）ｚまたはその代わりに、たとえ
ばセルロースのような多糖もしくは架橋多糖をベースと
した親水性マトリックスと、たとえばＤＥＡＥ−”５ｅ
ｐｈａｄｅｘ、　ＥＣＴＥＯＬＡもしくはＱＡＥ−”５
ｅｐｈａ−ｄｅｘ（ＱＡＥ）に特徴的な基のような官能
基を有する塩基性陰イオン交換樹脂によって行うのが有
利である。

吸着剤の種類および量（−数的には１〜３％ｗ／ｖ）は
、■因子に伴って存在する可能性があるチモーゲンおよ
び酵素、主としてグロテナーゼを吸着、除去するが■因
子は吸着しないという観点から選択される。最終生成物
のアミド分解活性はこの指標として、好ましくはＸａ内
因子定量に用いられ、市販されている色素産生ペプチド
を用いて測定される。■因子最終生成物は実質的にそれ
を含まないものでなければならない。

数種の吸着剤を使用する場合、個々のそれらを添加し、
分離することも可能であるが、１分から３０分の間隔を
置いて続けて吸着剤を加え、−緒に分離するのが好まし
い。好ましい態様においては、１〜３０分の吸着時間の
後、添加したすべての吸着剤を遠心分離によって除去す
る。

クリオプレシビテート溶液（クリオ溶液）は、ｐＨ６，
５−７，５、生理的イオン強度（１０−１５ｍ５）にお
いて、好ましくはクエン酸イオン、または二価金属イオ
ンの他の捕捉剤を含まないメジウム中、最善ニハ最初Ａ
１２（Ｏ）Ｉ）、”？’、またはＣａｘ（ＰＯ４）＊お
よび／もしくはＤＥＡＥ交換樹脂および／もしくはＥＣ
ＴＥＯＬＡおよび／もしくはＱＡＥを一緒に用いて処理
するのが有利である。効果的な処理のためには、吸着剤
をある順序で添加することが必要である。遠心分離によ
る分離は１工程で行われる。

主として吸着剤混合物によるこのような吸着の結果を第
１表に掲げる。結果は次のように要約できる。

第二のＡＭＯＨ）ｓ吸着後にもクリオ溶液中になお残存
して最終生成物中に検出できるアミド分解活性は、それ
に続く１回のＣａ５（ＰＯ４）ｚおよび／もしくはＥＣ
ＴＥＯＬＡおよび／もしくはＱＡＥまたは他の塩基性イ
オン交換樹脂での吸着のみで劇的に減少する。数種のイ
オン交換樹脂の混合物もまた有効である。

驚くべきことに、吸着剤がある特定の量を越えなければ
、この処理によって■因子活性の損失は全く生じない。

これはクリオ溶液ＩＱあたりの湿潤交換剤として、Ｃａ
３（Ｐｏ４）ｉについては１０ｉ＋、ＱＡＥ８よびＥＣ
ＴＥＯＬＡについては約２０〜３０ｇである。このよう
な溶液は通常、クリオプレシビテート１ｋｇを緩衝溶液
３ａに溶解して得られｐ。

クリオ溶液を吸着剤および陰イオン交換樹脂で前処理す
ることにより、アミド分解活性に加えて非特異的蛋白質
も除去される。その結果１、■因子の収率および比活性
の両者が上昇する。

新鮮なりリオ溶液の吸着剤およびイオン交換樹脂による
前処理は、さらに、水性溶液中６０°Ｃで、損失もなく
また取扱いも容易に低温殺菌できる安定な中間生成物を
与えるという利点がある。

これにより、活性の大きな喪失を伴わずに、透析、濾過
および保存が可能な、安定な最終生成物が得られる。

最も有効なりリオ溶液の前処理は、Ａｌ（ＯＨ）。

吸着に続く、ＥＣＴＥＯＬＡ１ｌＡＥ−”５ｅｐｈａｄ
ｅｘ、　ＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｄｅｘおよびこれらの
陰イオン交換樹脂との組合せであった。ＱＡＥ−’５ｅ
ｐｈａｄｅｘとＣａ５（ＰＯ＊）２との混合吸着の結果
は、高収率で、良好な比活性と十分な安定性を有する生
成物を導くことから、注目に値する。２０℃で２０時間
の透析および２０℃で２４時間保存する強いストレスを
与えても、活性の低下は合わせて１１％にすぎなかった
。このように安定で、同時に比活性約１０００／ｍ９と
いうような低蛋白質■因子溶液はこれまで報告されてい
ないことに留意すべきである。室温での４日間保存は、
■因子を分解する酵素不純物のわずかな痕跡でも検出で
きるストレス試験と考えることができる。

保存時における■因子活性の喪失は、■因子濃縮物中の
プロテアーゼの夾雑に帰し、これは最終生成物中に残存
するアミド分解活性と相関するということができる（第
１表参照）。

ＡＱ（ｏｎ）ｉに１回吸着させたサンプルは、透析後に
も分子ｆｉ５０〜４ＱｋＤａに相当する切断生成物を含
有し、これは保存時にさらに小さなサフユニッ）　（４
０ｋＤａ未満）に、実質的に完全に分解する。これに対
し、１（ＯＨ）ｓプラスＱＡＥおよびＥＣＴＥＯＬＡで
２回処理したサンプルは４８時間安定である。これは保
存時に測定した■因子活性とよく一致し、このサンプル
の低アミド分解活性によるものである。

本発明は、良好な臨床的リカバリーと半減期を与える高
度に精製された■因子、ならびにその好収率および高い
安定性での製造および低温殺菌の方法に関する。この方
法は、原料物質とくにクリオプレシビテートを、吸着剤
たとえばＡ１２（ＯＨ）、、Ｃａ５（Ｐｏ４）ｚおよび
塩基性イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ、　ＱＡＥ、　ＥＣＴ
ＥＯＬＡ）と−緒に溶解したのち、この溶液が、最終生
成物について測定されるように、アミド分解活性を含ま
なくなるまで処理することを特徴とするものである。

この測定は、Ｘ因子の定量に用いられている方法により
Ｋａｂｉからの基質Ｓ−２２２２（Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮａ）を用いて行われる。ＢＣ
Ｐ　２００、Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ）または”Ｃｈｒｏ
ｍｏｚｙｍ　ＴＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ　ＧｍｂＨ）も同様に適当である。

ｘ■■因子定量 Ｘ■■因子定量はたとえば以下の方法によって実施でき
る。

１部たとえば特許出願Ｐ　２３１６４３０．９−５２に
従って製造された部分トロンボプラスチン（Ｍａ１６０
）　Ｏ，Ｉｍ＜２を１部の■因子欠乏血漿および１部の
希釈正常血漿と混合する。この混合物を３７’０に６分
間保持する。予め３７℃に加温した０、０２５Ｍ塩化カ
ルシウム溶液１部を加えたのち、塩化カルシウムの添加
から凝血が起こるまでの経過時間を測定する。定量に際
しては、■因子含有溶液で得られた凝血時間を用いて、
正常血漿の希釈系列から得た検量プロットから値を読み
取る。■因子の１国際車位（ＩＩＵ）は正常血漿１ｒｎ
Ｑの■因子活性に相当する。

アミド分解活性の測定 これはたとえば、Ｘａ内因子定量の原理に従って実施で
きる。

定量混合物： １００μａのサンプル＋５００ｕｉ２の緩衝溶液、５０
ｍＭ／Ｑトリス、１５０ｍＭ／　Ｑ　ＮａＣＱ％ｐＨ８
，２＋　１００μα基質、ＢＣＰ　２００．３ｍＭ／（
ｌまたはＳ−２２２２，３ｍＭ／（１゜３７°Ｃで５分
間ブレインキュベートし、ついで２０分間の基質の変換
を３７°Ｃ，４０５ｍｍにおいて測定する。アミド分解
活性はΔＯＤ／分で評価する。

■因子の安定化の方法は、以下の実施例から明らかなよ
うに、出発原料とは実質的に無関係にこれまで報告され
てきたすべての製造過程、たとえばＤＥ　３，４３２，
０８３もしくはＥＰ　Ｏ，０１８，５６ＬまたはＤＥ　
３，４３２，０８３もしくはＥＰ　Ｏ，１７３，２４２
に記載の方法に使用できる。以下に用いる緩衝液につい
ては実施例の末尾に記載する。

実施例　１ 出発原料：クリオブレシピテート１ｋｇヲ＋３７°Ｃで
３Ｑの溶解緩衝液に溶かし、以下のように処理した。

１×８％（ｖ／ｖ）　Ａｌ２（ＯＨ）ｓ　：　４　Ｑの
溶液を＋２５°Ｃで１％濃度のＡｌ２（ＯＨ）ｓ　　３
２０ｍ１２に１５分間吸着させた。吸着剤を３　、００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離して除き、吸着させたクリ
オ溶液の上溝に安定化剤を加えた。

安定化と加熱：この目的には、Ａｆｆ（ＯＨ）、上清が
４　、０４０ｍＱであればスクロース４．０４０ｇを加
えて１００％（ｗ／ｖ）に相当する最終濃度とし、次に
１．８ｍｏＩ２／Ｑに相当するグリシン５４５．４９を
加えＣａＣＱ２濃度を５ｔｎｍｏＱ／Ｑに調整した。安
定化された溶液を２．５Ｎ　　ＮａＯＨでｐＨ７，３に
調整し、ついで＋６０°Ｃに１０時間加熱した。加熱の
前後に■因子：Ｃ活性を測定し、それぞれ２．ＯＵ／ｍ
１２および１．６Ｕ／ｍ（ｌの値を得た。

ＤＥ　３，４３２．０３８によるＤＥＡＥ吸着の準備：
加熱したクリオ溶液（６、８６８ｍ０を６　、８６８ｍ
Ｑの溶解緩衝液で希釈し、２Ｎ酢酸でｐＨを５．５に調
整した。

バッチ法によるＤＥＡＥ−１ｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ
Ｌ−６Ｂへの吸着：希釈された低温殺菌クリオ溶液１３
．７３６ｍＱを平衡化ＤＥＡＥ−Ｒ５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　ＣＬ−，６Ｂ、　３００ｍ（２を用い、室温で４時間
吸着させ、ついで５ｅｐｈａｒｏｓｅ　全分離した。

Ｒ３ｅｐｈａｒｏｓｅ洗浄とそのカラムへの移送：■因
子を負荷した５ｅｐｈａｒｏｓｅを吸引漏斗上で前洗浄
し、ついでカラム（径７．２ｃｍ）に移し、洗浄緩衝Ｆ
＆３Ｑで処理した。

ＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出：■因子
：Ｃを洗浄ＤＥＡＥ−Ｒ５ｅｐｈａｒｏｓｅから酢酸緩
衝、リジン含有ＣａＣＱ、溶液（０，３ｍｏ１２／　１
２）で遊離させ、溶出液゛１９５＋＋＋（２にスクロー
ス１．４６９を加えて最終濃度０．７５とした。

透析：溶出液１９５ｍ＋２を＋４°Ｃで透析緩衝液２０
Ｑに対して１６時間透析した。この物質について、因子
活性を測定し、この２つの値から収率および比活性を計
算した。ストレス試験では、ソノ一部を２０’Ｏで保存
し、■因子活性を２４．４８および９６時間後に測定し
た（表、実験ｌ参照）。

濃度の調整および濾過による滅菌：透析した■因子：Ｃ
２１８ｍ（ｌを５ａｒｔｏｒｉｕｓフイルターを通して
濾過して滅菌した。活性は■因子：　Ｃ２８０／ｍＱに
調整し、この溶液を包装して凍結乾燥する。

実施例　２ 出発原料：クリオプレシビテート１ｋｇを＋３７℃で３
Ｑの溶解緩衝液に溶かし、以下のように処理した。

２×５％（ｖ／ｖ）Ａｌ（ＯＨ）ｓ　：溶液４Ｑを各回
２００ｍ（２）１％濃度（７）　Ａｆｆ（ＯＨ）　、　
ニより２５°Ｏテ１５分間、２回処理し、ついで３．０
００ｒｐｍで遠心分離し、上溝に低温殺菌のための安定
化剤を加えた。

安定化と加熱：この目的には、ｌ！（ＯＨ）、上溝４　
、０４０ｍＱにスクロース４　、０４０ｇを加えて１０
０％（ｗ／ｖ）に相当する最終濃度とし、次に１．８ｍ
ｏＱ／Ｑに相当するグリシン５４５．４ｇを加え、Ｃａ
ＣＱ２濃度を５ｍｍｏＱ／Ｑに調整した。安定化溶液の
ｐＨを２．５ＮＮａＯＨで７．３に調整し、ついで＋６
０℃に１０時間加熱した。■因子二Ｃ活性は加熱の前後
に測定し、それぞれ２．ＱＵ／ｍｆｆおよび１．９Ｕ／
ｉ（２であった。

ＤＥ　３，４３２，０８３によるＤＥＡＥ吸着の準備：
加熱したクリオ溶液（６、８６８ｍｆｆ）を希釈緩衝液
６　、８６８ｍ２で１＝２に希釈し、２Ｎ酢酸でｐＨを
５．５に調整し　に　。

バッチ法によるＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ
−６Ｂへの吸着： 希釈クリオ溶液１３，７３６ｍＱを、平衡化したＤＥＡ
Ｅ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｃｔ−６Ｂ１３００ｍ１２
を用いて、室温で４時間吸着させ、ついで５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅを分離した。

”５ｅｐｈａｒｏｓｅの洗浄およびそのカラムへの移送
、■因子が負荷された５ｅｐｈａｒｏｓｅを吸引漏斗上
テ前洗浄し、ついでカラム（径７．２ｃｍ”）に移し、
洗浄緩衝液３αで処理した。

ＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出：■因子
二〇を洗浄ＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅから酢酸緩
衝、リジン含有ＣａＣＱ、溶液（０，３ｍｏ１２／　１
２）で遊離させ、ついで溶出液１９５ｍａ、にスクロー
ス１．４６９を加えて最終濃度を０．７５％とした。

透析：溶出液１９５ｍ＜２を透析緩衝液２Ｏｆｆに対し
て＋４°０で１６時間透析した。この物質について、蛋
白質含量を２８ｏｎ−におけるＯＤによって測定し、■
因子活性を定量し、この２つの値から収率および比活性
を計算した。ストレス試験では、その一部を２０°Ｃで
保存し、■因子活性を２４．４８および９６時間後に測
定した（表、実験２参照）。

濃度の調整および濾過による滅菌：透析した■因子：Ｃ
２１８ｍ１２を５ａｒｔｏｒｉｕｓフイルターを通して
濾過して滅菌した。溶液の活性は■因子：Ｃ２３Ｕ　／
　ｍ　Ｑに透析緩衝液で調整し、この溶液を包装して凍
結乾燥した。

実施例　３ 実施例１と同様にして、新鮮なりリオプレシピテートの
溶液をまずｌＸ５％（ｖ／ｖ）Ａｌ２（ＯＨ）ｚに吸着
させ、遠心分離したのち上清を次に２回目の５％（Ｖ／
Ｖ）Ａｌ（ＯＨ）３で吸着させ、２５°Ｃに３分装置イ
タのち３％（ｗ／ｖ）湿潤ＥＣＴＥＯＬＡ（１２０９／
　４　（２）を加え、１５分間インキュベートした。吸
着剤を分離したのち、上清から上述のような低温殺菌さ
れた、高度に純粋な■因子が得られた。表の実験３に示
すように、この方法も好収率で比活性の高い安定な生成
物を与える。

実施例　４ 実施例１と同様にして、クリオプレシビテートを再び新
たに３７°Ｃで溶解し、１回だけ次のように吸着させた
。

５％（Ｖ／Ｖ）Ａｌ２（ＯＨ）３　：溶解したクリオプ
レシビテート４Ｑを、１％濃度のＡＱ（０４１）ｘ　２
００ｍＱを用いて＋２５°Ｃで１５分間吸着させ、つい
で吸着剤を３　、００Ｏｒｐｍで遠心分離して除去した
。次に以下のように、いわゆる混合吸着を実施した。

ｌＸ５％（ｖ／ｖ）　Ａｆｆ（ＯＨ）３吸着および３％
ＱＡＥ−”５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０　：最初のＡｌ２
（ＯＨ）ｓ上清４Ｑに１％濃度１７）Ａｆｆ（ＯＨ）ｓ
　　２００＋（ｌをまず加え、この混合物を５分間撹拌
したのち、湿潤ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０゜１
２０９を加え、それによる吸着を＋２５°Ｃで１５分間
行った。遠心分離後に得られた上清を低温殺菌し、実施
例１のＤＥＡＥ−”５ｅｐｈａｒｏｓｅへの吸着によっ
て精製した。収率、比活性および安定性は表に示す（実
験４参照）。

実施例　５ 実施例１と同様に、クリオプレシビテートｌｈｇを緩衝
液３．０１２に溶解し、１％濃度のＡ（！（ＯＨ）ｘ、
２００ｍＱに２５℃で１５分間吸着させ、遠心分離して
上溝を得た。以下法のように処理した。

それぞれｌＸ５％（Ｖ／Ｖ）ＡＱ（Ｏ）１）３．３％（
ｗ／ｖ）湿潤ＱＡＥ−”５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０およ
び３％（ｗ／ｖ）湿潤ＥＣＴＥＯＬＡ　、吸着剤を５分
間隔で加え、２５°Ｏ″ｃｈｌＳ分間インキュベートし
、ＥＣＴＥＯＬＡの添加１５分後に３，０００ｒｐｍで
遠心分離した。低温殺菌および最終精製は実施例１と同
様に実施した。最終生成物の収率および性質は表の実験
５に示す。

実施例　６ 実施例２と同様に、新たに溶解したクリオプレシピテー
ト１ｋｇを用いて１回５％（ｖ／ｖ）Ａ（１（ＯＨ）３
への吸着を行い、その上清を次に以下のように吸着させ
た。

１×５％（ｖ／ｖ）　ＡＱ（ＯＨ）ｓ、ついで３％ＱＡ
Ｅ、最後に１％Ｃａ５（ＰＯａ）ｚ　；最後のＡＱ（Ｏ
Ｈ）　ｓ上清４Ｑをまずさらに２００ｍＱの濃度１％Ａ
Ｑ（ＯＨ）３で処理しく２５°Ｃ１５分間）、ついで同
じ条件で１２０９のＱＡＥ−Ｒ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５
０で処理し最後に４０９のＣａ　）　（Ｐ　Ｏ４）　ｚ
Ｉこよって＋２５℃で１５分間処理した。すべての吸着
剤を一緒に遠心分離し、遠心分離後の上清に安定化剤を
加え、低温殺菌し、希釈し、■因子を実施例１と同様に
してＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製した。溶出
液は著しく高い比活性を示した（表中の実験６参照）。

ＥＰ　Ｏ，０１８，５６１ＢｌまたはＥＰ　Ｏ，０３２
，６５５に従って■因子濃縮物を得るために処理される
クリオプレシビテートも、出発原料を本発明の吸着によ
って処理した場合には、安定かつ高い活性を示す生成物
が好収率で得られる。これは以下の実施例に示す。

実施例　７ 塩クリオプレシビテート６ｋｇを次の組成の緩衝液、す
なわち０．０８ｍｏＱ／　Ｑ　ＮａＣＱ、０．２７ｍｏ
Ｑ／Ｑグリシン、０．５０／ｍｄヘパリン、Ｑ、ｌＵ／
１ＱＡＴＩＩＩ、ｐ）１６．０．１８Ｑに３７℃で溶解
し、２４ｆｆノ粗クリオ溶液を得、これをまず次のよう
Ｊこして吸着させｔ：。

ｌＸ５％（ｖ／ｖ）Ａｌ１（ＯＨ）ｓ　：このためには
１．２１２の濃度１％Ａｌ２（ＯＨ）３を２５℃で２４
Ｑの粗りリオ溶液に加え、１５分間撹拌し、吸着剤を３
．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して除き、次に以下のように
混合吸着を実施した。

５％（ｖ／ｖ）　Ａｌ（ＯＦＩ）ｘおよび３％ＱＡＥ−
”５ｅｐｈａｄｅｘＡ５０：最初のＡ１２（ＯＨ）　、
上清２４Ｑに１．２Ｑの濃度１％Ａ４（ＯＨ）ｘを再び
加え、５分間撹拌し、ついでこの溶液を７２０９の湿潤
ＱＡＥ−”５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５Ｑにより２５°Ｃで
さらに１５分間吸着させた。遠心分離で得られた上溝を
Ｍａ　　３３９　（ＥＰ　　Ｏ，０１８，５６１；ＵＳ
Ｐ４．２９７．３４４）に従って後処理すると■因子濃
縮物が得られ、これを凍結乾燥した。

再ＯＩｙ、された最終生成物は、室温に放置しても著し
く良好な安定性を示した。

■因子：Ｃ活性、再構成後　　２９１０／ｍＱ溶液中２
３°０２時間後　２７１Ｕ／ｍ１２溶液中２３°Ｃ６時
間後　２９１Ｕ／ｍＱ溶液中２３°０２４時間後　３０
１０．’ｓｆｆ実施例に使用した緩衝液は次のと８りで
あ溶解緩衝液：　０．０８ｍｏＱ／　（２ＮａＣＱｏ、
２７ｍｏＱ／Ｑグリシン ＋　０−１０／ｌａＱ　　ＡＴＩ［ ＋０．５Ｕ／ｍＱヘパリン 希釈緩衝液：　０．２ｍｏＱ／　Ｑリジン０．２１ＲＯ
Ｑ／１２酢酸ナトリウム ｐＨ５、５ 洗浄緩衝液：　０．１ｍｏＱ／　Ｑリジン０．１ｍｏＱ
／Ｑ酢酸ナトリウム ０．０１７ｍｏ１２／　（ｌ　ＮａＣ（１０，０１２５
＋ＩＩＯ＋２／　Ｑ　ＣａＣ（１゜ｐＨ５，５ 溶出緩衝液：０．１ｍｏＱ／Ｑリジン Ｑ、１ｍｏ１２／（２酢酸ナトリウム ０．３ｍｏＱ／　Ｑ　ＣａＣＱｘ ｐＨ５，５ 透析および包装緩衝液： ０．１５ｍｏＱ／Ｑ ａＣ４ ０，７５％スクロース ３％グリシン ｐＨ６，９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）血液凝固VIII因子の製造に慣用されるVIII因子含有
   血漿分画好ましくは溶解したクリオプレシビテートまた
   はＣｏｈｎ分画１を、以下それ自体公知の方法によって
   安定な、必要に応じて低温殺菌したVIII因子が好収率で
   得られるように処理する方法において、これらをアミド
   分解／蛋白分解活性を有しVIII因子を分解する酵素およ
   び酵素前駆体を結合する吸着剤で処理する方法。 ２）高い比活性と安定性を有するVIII因子を製造する方
   法において、VIII因子含有溶液を、その溶液からそれ自
   体公知の方法によってVIII因子を得る前にＡｌ（ＯＨ）
   ＿３、陰イオン交換樹脂またはＣａ＿３（ＰＯ＿４）＿
   ２への少なくとも２回の吸着処理に付す方法。 ３）吸着処理は異なる吸着剤について実施する請求項２
   記載の方法。 ４）処理は親水性マトリックスと陰イオン基を有する塩
   基性交換樹脂によって行う請求項２記載の方法。 ５）処理は多糖をベースとしたマトリックスと陰イオン
   基を有する塩基性交換樹脂によって行う請求項２記載の
   方法。 ６）処理はｐＨ６．５〜７．５、伝導率１０−１５ｍＳ
   において行う請求項２記載の方法。 ７）処理はクエン酸イオンまたは二価の金属イオンの他
   の捕捉剤を含まないメジウム中で行う請求項２記載の方
   法。 ８）２種の異なる吸着剤を続けて添加し、ついで上澄液
   を分離する請求項２記載の方法。 ９）さらに低温殺菌を実施する請求項２記載の方法。 １０）吸着剤は溶液１ｌあたり約２０〜３０ｇの量を使
   用する請求項２記載の方法。