KR0174262B1

KR0174262B1 - 안정성 인자 viii의 제조 방법

Info

Publication number: KR0174262B1
Application number: KR1019900011997A
Authority: KR
Inventors: 하임부르거 노베르트; 벨너 클라우스; 벤즈 칼-하인즈; 쿰페 게르하르트
Original assignee: 모제 하; 라우페 하베프; 센테온 파르마 게엠베하
Priority date: 1989-08-07
Filing date: 1990-08-06
Publication date: 1999-02-18
Also published as: IE63919B1; DE3926034A1; CA2022650C; PT94917B; EP0412466A3; JP3180957B2; EP0412466B1; DE59004488D1; JPH03148294A; KR910004208A; IE902817A1; PT94917A; DE3926034C2; US5424401A; AU635298B2; ATE101041T1; DE3926034C3; CA2022650A1; EP0412466A2; DK0412466T3

Abstract

내용 없음.

Description

안정성 인자 VIII의 제조방법

본 발명은 Al(OH)₃, 음이온 교환제 또는 Ca₃(PO₄)₂, 바람직하게는 이중에서 두 개의 상이한 흡착제를 사용하여 2회 이상 흡착시킴으로써 인자 VIII을 함유하는 용액으로부터 불순물을 흡착시킴을 포함하여, 고도의 고유 활성 및 안정성을 갖는 저온 살균된 인자 VIII 농축물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

혈장의 응고는 효소적 과정이고; 이 과정에 관여하는 인자는 대부분의 경우에 프로테아제 특성을 지닌 단백질이며, 이러한 단백질을 불활성 전구체 형태로 혈액 중에서 순환되고 습윤성 표면과 접촉하거나 상처를 입었을 때에만 활성화된다. 트롬빈 외에도, 다른 응고 프로테아제, 예를 들면, 인자 Xa 및 1Xa, 또한 인자 VIII을 공격하고 이를 불활성화시킬 수 있다. 인자 Va를 불활성화시킬 수 있는 단백질 C 또한 특히 중요하다. 인자 V 및 VIII은 가장 불안정한 응고 인자이다. 이들은 혈액으로부터 제거될 때 즉시 분해되기 시작한다. 이러한 현상에 대한 추가의 작용은 이들이 Ca²⁺에 의하여 안정화되고 시트레이트 및 EDTA 등의 착화제를 사용하여 혈액을 제거한다는 점이다. 이러한 알려진 데이터는 사람 혈장으로부터 수득한 인자 VIII 활성중 40 내지 60%만이 인자 VIII을 수득하기 위한 출발 물질로서 세계적으로 사용되는 사람 혈장의 저온 침전물에서 발견될 수 있고 인자 VIII을 정제한 후에 이의 10내지 20%만이 잔류한다는 관찰에 부합되는 것이다. 이러한 점은 혈우병 환자에게 제공하기에는 심각한 핸디캡인데, 한편으로 원료로서 혈액은 구하기가 매우 어렵고 비용이 많이 들며 다른 한편으로는 저수율로 인하여 비용에 영향을 미친다는 것이다. 인자 VIII의 생산시 바이러스의 불활성화를 보장하는 과정의 추가 단계를 도입하기 때문에 이러한 점이 특히 해당된다.

통상적인 방법으로 제조한 인자 VIII의 경우, 페이(Fay) 등에 의하면 수율이 12.7%인 것으로 보고되었다[참고 문헌 : Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 79, 7200, 1982]. 짐머맨(Zimmerman) 및 풀처(Fulcher)는 현대식 면역친화성 크로마토그래피법을 사용하여 이와 거의 동일한 값을 달성하였다(EP-A 제0,083,483호).

다수의 연구자드은 인자 VIII가 DEAE 교환제 및 ECTEOLA에 강하게 결합하고 비록 할라이드를 사용하여 이를 다시 대체시킬 수 있지만 24시간 내에 활성을 상실한다고 진술하고 있으나[참고 문헌 : S. van Creveld et al., Thromb. Diathes. VI(2/3), 282, 1961: R. Baugh et al., Biochim. Biophys. Acta 371, 360, 1974]. PMSF(페닐메탄설포닐 플루오라이드) 및 벤즈아미딘과 같은 프로테이나제 억제제를 첨가하는 것이 사람 제제를 생산하는데 적합하지 않기 때문에 이러한 문제점에 대한 해결책을 제시하지 않고 있다.

전술한 상황에 대한 결과로서, 처리 및 정제 도중에 인자 VIII의 분해를 방지하고 가능한 한 빨리, 즉, 분리 또는 정제 즉시 사용할 수 있는 방법이 긴급히 요구되고 있다. 초기에 선택한 것은 혈장을 출발물질로 사용하여 저온 침전에 의해 수득하고 또한 원료로도 시판되고 있는 저온 침전물을 추가로 처리하는 것이다.

당해 분야의 기술에 따라 용해된 저온 침전물은 프로트롬빈 인자(인자 II, VII, IX, X)와 함께 미량의 오염물을 제거하기 위해 일반적으로 Al(OH)₃로처리한다. 이와 같이 수행하는 의도는 정제 동안 인자 VIII을 분해시킬 수도 있는 이들 인자의 활성화를 방지하기 위한 것이다. 놀랍게도, 저온 침전물의 신선한 요액을 Al(OH)₃로 1회 흡착시키는 것으로는 프로트롬빈 인자 및 기타 프로테아제를 제거하기에 충분하지 못하고 흡착시킨 후에도 최고 감도의 F Xa 시험을 한 결과 비록 F Xa와는 동일한 활성이 아닌 듯 하지만 흡착 용액 상등액에서 명확한 아미도 용해 활성이 검출될 수 있다는 사실이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러 낮은 손실율로 취급이 용이한 안정성 인자 VIII이 저온 침전물을 예비처리, 예를 들면, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂또는 음이온 교환제 상에서 수회 흡착시키거나 혼합 흡착시킴으로써 수득될 수 있음이 밝혀졌다. 이에 대한 기준으로서, 최종 생성물의 아미도 용해 활성, 수율, 특히 활성 및 실온에서의 안정성을 측정한다.

따라서, 본 발명은 새로이 용해된 저온 침전물에 적용할 경우, 정제 및 저온 살균 처리 동안 인자 VIII 활성의 대부분의 손실을 방지하고 고도의 고유 활성, 고유성 및 수율이 양호한 안정성을 갖는 최종 생성물을 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 F VIII-함유 혈장 분획을 아미도 용해 활성/단백질분해 활성을 가지고 F VIII을 분해시키는 효소 및 전구 효소를 결합시킨 흡착제로 처리한 후, 안정하고, 경우에 따라 저온 살균 처리한 인자 VIII을 공지된 방법에 따라 우수한 수율로 수득할 수 있게 함을 포함하는, F VIII의 제조에 통상적으로 사용되는 것들과 같은 F VIII-함유 혈장 분획, 바람직하게는 용해된 저온 침전물 또는 콘(Cohn) 분획 1을 처리하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 다음과 같은 방법으로 예비처리한 용액으로부터 공지된 방법 자체로 인자 VIII을 수득하기에 앞어서 저온 침전물중 하나와 같은 인자 VIII-함유 용액을 Al(OH)₃, 음이온 교환제 또는 Ca₃(PO₄)₂상에서 2회 이상 흡착시킴을 포함하여, 고도의 고유 활성 및 안정성을 갖는 인자 VIII을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이와 같은 공지의 방법은, 예를 들면 EP-A-제0,018,561호 또는 EP-A-제0,173,242호에 기술되어 있다.

F VIII-함유 출발 물질은 바람직하게는 두 종류 이상의 상이한 흡착제 혼합물로 흡착시킨다. Ca₃(PO₄)₂, 또는 다당류, 예를 들면, 셀룰로스 또는 가교결합된 다당류와 같은 다당류를 기본으로 하는 친수성 매트릭스, 및 예를 들면 DEAE-세파덱스(Sephadex), ECTEOLA 또는 QAE-세파덱스(QAE)의 특징인 것과 같은 작용기를 갖는 염기성 음이온 교환제로 처리하는 것이 유리하다.

흡착제의 유형 및 양(일반적으로 1 내지 3% W/V)은 F VIII과 결합하여 존재할 수 있는(그러나 F VIII은 제외) 지모겐 및 효소, 주로 프로테이나제의 흡착 및 제거와 관련하여 선택한다. 최종 생성물의 아미도 용해 활성은 바람직하게는 F Xa의 측정에 사용되고 있는 것들과 같은 색소원성 펩타이드를 사용하여 이의 지시제로서 측정한다. F VIII 최종 생성물에는 실질적으로 이들이 존재하지 않아야 한다.

여러 종류의 흡착제를 사용할 경우 이들 각각의 첨가 및 분리가 가능하나 1 내지 30분 간격으로 연속적으로 가하고 함께 분리하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태는 1 내지 30분간 흡착시킨 후에 첨가된 모든 흡착제를 원심분리에 의해 제거하는 것이다.

저온 침전물 용액(저온 용액)은 pH 6.5 내지 7.5 및 생리학적 이온 강도(10 내지 15mS)에서, 바람직하게는 어떠한 시트레이트 이온 또는 기타 2가 금속 이온용 트랩도 함유하지 않는 매질 중에서 초기에 Al(OH)₃로, 그러나, 또한 Ca₃(PO₄)₂및/또는 DEAE 교환제 및/또는 ECTEOLA 및/또는 QAE와 함께 처리하는 것이 유리할 수 있다. 효과적인 처리를 위해 흡착제를 순차적으로 가하는 것이 필요하다. 원심분리에 의한 분리는 1단계로 수행할 수 있다.

이와 같은 흡착, 주로 흡착제 혼합물을 사용한 결과를 표 1에 기재한다. 결과는 다음과 같이 요약할 수 있다:

2차 Al(OH)₃흡착 후에도 여전히 저온 용액에 잔류하고 최종 생성물에서 검출될 수 있는 아미도 용해 활성은 Ca₃(PO₄)₂및/또는 ECTEOLA 및/또는 QAE 또는 다른 염기성 이온 교환제를 사용한 추가의 계속적인 흡착에 의해서만 현저히 감소시킬 수 있으며; 여러 가지 이온 교환제의 혼합물 또한 효과적이다.

놀랍게도, 특정량의 흡착제가 초과되지 않을 때 이같은 처리는 인자 VIII 활성의 어떠한 손실도 발생시키지 않는다. 이러한 양은 Ca₃(PO₄)₂의 경우 습윤 교환제 10g/저온 용액 ℓ이고 QAE 및 ECTEOLA의 경우 약 20 내지 30g이다. 이러한 용액은 저온 침전물 1kg을 완충 요액 3ℓ에 용해시킴으로써 통상적으로 수득된다.

흡착제 및 염기성 이온 교환제를 사용한 저온 침전물 용액의 예비처리:

유럽 특허공개 제0,173,242호 또는 독일연방공화국 제3,432 A1호에 따라 제조한 F VIII의 수율, 고유 활성 및 안정성에 대한 영향

저온 용액을 흡착제 및 음이온 교환제로 예비처리함으로써, 아미도 용해 활성뿐만 아니라 비특이성 단백질로 제거된다. 결과적으로 인자 VIII 수율 및 고유 활성 모두가 증가한다. 신선한 저온 용액의 흡착제 및 이온 교환제로의 예비처리는 거의 어떠한 손실도 없이 수용액 중 60℃에서 저온 살균시킬 수 있고 취급하기가 더욱 수월한 안정한 중간체 생성물을 생성하는 추가의 장점이 있다. 이로써 활성의 큰 손실 없이 투석, 여과 및 저장할 수 있는 안정한 최종 생성물이 수득된다.

저온 용액의 가장 효과적인 예비처리는 ECTEOLA, AQE-세파덱스, DEAE-세파덱스 및 이들 음이온 교환제의 혼합물로 전술한 Al(OH)흡착과 병용하여 처리하는 것이다. QAE-세파덱스 및 Ca(PO)를 사용한 혼합 흡착의 결과는 수율이 높다는 점이 주목할 만하고, 고유 활성이 우수하며 충분히 안정한 생성물을 유도하며; 20℃에서 20시간 동안 투석하고 20℃에서 24시간 동안 보관할 경우 심한 스트레스(stress)를 나타내고 활성 손실은 총 11%에 불과하다. 이와 같이 안정하고 동시에 특이적 활성이 약 100U/mg인 저-단백질 F VIII 용액이 본 발명 이전까지는 기술되지 않았다는 점을 주목한다. 실온에서 4일간의 저장은 인자 VIII를 파괴하는 극소량의 효소적 불순물이라도 검출해내기 위한 스트레스 시험으로 간주된다.

저장 동안에 발생하는 F VIII 활성의 손실은 F VIII 농축물의 프로테아제에 의한 오염에 기인하고 이러한 현상이 최종 생성물 중의 잔류 아미도 분해 활성과 상관관계가 있다고 언급할 수 있다(표 1 참조).

Al(OH)로 1회 흡착시킨 샘플은 투석 후에도 분자량 50 내지 40kDa에 해당하는 절단 생성물을 함유하며 저장하는 동안 더욱 작은 소단위(40kDa 미만)로 거의 완전히 분해된다. 이와 달리, Al(OH)+ QAE 및 ECTEOLA로 2회 처리한 샘플은 48시간 동안 안정하다. 이러한 결과는 저장하는 동안 측정된 F VIII 활성과 잘 일치하고 본 샘플의 저 아미도 용해 활성에 기인한다.

본 발명은 원료, 특히 저온 침전물을 용해시킨 후 최종 생성물에서 측정한 바와 같이 용액이 아미도 용해 활성을 가지지 않을 때까지 Al(OH), Ca(PO)및 염기성 이온 교환제(DEAE, QAE, ECTEOLA) 등의 흡착제로 처리함을 포함하여, 임상적회수 및 반감기가 양호한 고도로 정제된 인자 VIII 농축물 및 양호한 수율 및 안정성으로 이를 제조 및 저온 처리하는 방법에 관한 것이다.

인자 X의 측정에 사용한 방법으로 기질 S-2222(Kabi)(Bz-11e-Glu-Gly-Arg-pNA)를 사용하여 측정할 수 있으며; BCP 200, Z-D-Leu Gly-Arg-MNA(Behringwerke AG) 또는Chromozym TH(Boehringer Mannheim GmbH)도 이와 마찬가지로 적합하다.

[인자 VIII의 측정]

인자 VIII의 측정은, 예를 들면, 다음과 같은 방밥으로 수행한다:

예를 들면, 독일연방공화국 특허원 제P 23 16 430.9-52호(Ma 160)에 따라 제조한 부분 트롬보플라스틴 1부, 예를 들면 0.1ml를 인자 VIII-결핍 혈장 1부 및 희석된 표준 혈장 1부와 혼합한다. 본 혼합물을 37℃에서 6분간 정치시킨다. 37℃로 예열시킨 0.025mol 염화칼슘 용액 1부를 가한 후에 응고가 발생될 때까지 염화칼슘 용액을 첨가한 시점으로부터 경과한 시간을 측정한다. 정량적인 평가를 위해 인자 VIII-함유 용액으로부터 소용된 응고 시간을 이용하여 표준 혈장을 연속 희석시켜 수득한 보정 플롯을 판돈한다. 인자 VIII 1 국제 단위(IU)는 정상 혈장 1ml의 인자 VIII 활성에 상당한다.

[아미도 용해]

이러한 측정 과정은 인자 X측정 원리에 따라 수행할 수 있다.

측정 혼합물:

샘플 100㎕ + 완충 용액 500㎕, 50mmol/ℓ 트리스, 150mmol/ℓ NaCl(pH 8.2) + 기질 100㎕, BCP 200 3mmol/ℓ 또는 S-2222 3mmol/ℓ

37℃에서 5분간 예비배양한 다음, 37℃ 및 405nm에서 20분간 기질의 전환율을 측정하고: △OD/min으로 아미도 용해 활성을 평가한다.

인자 VIII을 안정화시키기 위한 방법은 하기의 실시예로 입증되는 바와 같이, 예를 들면, 독일연방공화국 특허 제3,432,083호, 유럽 특허 제0,018,561호, 독일연방공화국 특허 제3,432,083호 또는 유럽 특허 제0,173,242호에 따라 출발 물질과 실질적으로 무관한 방법으로 지금까지 기술된 모든 제조 방법에 사용할 수 있다. 다음에서 사용된 완충액은 실시예 이후에 기술된다.

[실시예 1]

-출발 물질: 1kg의 저온 침전물을 3ℓ의 용해 완충액에 용해시킨 후

-1 x 8%(v/v) Al(OH)로 처리: 4ℓ의 용액을 25℃에서 15분간 320ml의 1% Al(OH)로 흡착시킨다. 흡착제를 3000rpm에서 15분간 원심분리하고 안정하제를 흡착된 저온 용액의 상등액에 가한다.

-안정화 및 가열:

이를 위하여, 4,040ml의 Al(OH)상등액을, 4,040g의 자당을 가하여 100%(w/v)에 상당하는 최종 농도를 만들 경우, 계속해서 1,8mol/ℓ에 해당하는 545.4g의 글리신을 가하고 CaCl농도를 5mmol/ℓ로 조절한다. 안정화된 용액을 2.5N NaOH로 pH 7.3이 되게 조절하고, 이어서 60℃에서 10시간 동안 가열한다. 가열 전후에 F VIII:C 활성을 측정한 결과 각각 2.0U/ml 및 1.6U/ml이다.

-독일연방공화국 특허 제3,432,083호에 따른 DEAE 흡착물의 제조:

가열한 저온 용액(6,868ml)을 6,868ml의 희석 완충액으로 희석하고 pH를 2N 아세트산으로 5.5가 되도록 조절한다.

-뱃치식 방법으로 DEAE-세파로스 CL-6B에의 흡착:

희석시킨 저온살균 저온 용액 13,736ml를 평형화된 DEAE-세파로스 DL-6B 300ml로 4시간 동안 실온에서 흡착시킨 다음, 세파로스를 분리 제거한다.

-세파로스의 세척 빛 컬럼으로의 전달:

F VIII과 함께 부하시킨 세파로스를 흡인 필터 상에서 예비 세척한 다음, 컬럼(직경 7.2cm)으로 옮기고 3ℓ의 세척 완충액으로 처리한다.

-DEAE-세파로스 컬럼의 용출:

F VIII:C르르 세척된 DEAE-세파로스로부터 아세테이트-완충시킨 라이신-함유 CaCl용액(0.3mol/ℓ)으로 대체시키고 용출액 195ml를 1.46g의 자당을 가하여 최종 농도를 0.75%로 한다.

-투석:

195ml의 용출액을 20ℓ의 투석 완충액에 대해 4℃에서 16시간 동안 투석시킨다. 상기 물질의 단백질 함량을 측정하고(OD=10mg/ml), F VIII 활성을 측정하여 이 두 값으로부터 수율 및 고유 활성을 계산한다; 스트레스 시험에서, 분획을 20℃에서 저장하고 24, 48 및 96시간 후에 F VIII 활성을 측정한다(표, 실험 1 참조)

-농도 조절 및 여과 멸균:

218ml의 투석된 F VIII:C를 사토리우스(Sartorius) 필터를 통해 여과 멸균시키고; 활성을 28U/ml F VIII:C로 조절한 다음, 용액을 포장 및 동결건조시킨다.

[실시예 2]

-출발 물질:

1kg의 저온 침전물을 37℃에서 3ℓ의 용해 완충액에 용해시킨 후

-2×2%(v/v) Al(OH)로 처리:

각각의 경우에 4ℓ의 용액을 25℃에서 15분간 2×200ml의 1% 강도의 Al(OH)로 흡착시킨 후, 3000rpm에서 15분간 원심분리하고 저온 살균을 위해 안정화제를 상등액에 가한다.

-안정화 및 가열:

이를 위해, 4,040ml의 Al(OH)상등액을 4,040G의 자당을 가하여 100% (w/v)에 해당하는 최종 농도를 만들 경우, 계속해서 1.8mol/ℓ에 해당하는 545.4g의 글리신을 가하고 CaCl농도를 5mmol/ℓ로 조절한다. 안정화된 용액을 2.5N NaOH로 pH 7.3이 되게 조절하고 이어서, 60℃에서 10시간 동안 가열한다. 가열 전후에 F VIII:C 활성을 측정한 결과 각각 2.0U/ml 및 1.9U/ml이다.

가열한 저온 용액(6,868ml)을 6,868ml의 희석 완충액으로 1:2로 희석하고 pH를 2N 아세트산으로 5.5가 되도록 조절한다.

-뱃치식 방법으로 DEAE-세파로스 CL-6B에의 흡착:

13,736ml의 희석시킨 저온 용액을 평형화시킨 DEAE-세파로스 Cl-6B 300ml로 4시간 동안 실온에서 흡착시키고 세파로스를 분리 제거한다.

-세파로스의 세척 및 컬럼으로의 전달:

-DEAE-세파로스 컬럼의 용출:

F VIII:C를 세척된 DEAE-세파로스로부터 아세테이트-완충시킨 라이신-함유 CaCl용액(0.3mol/ℓ)으로 대체시키고 용출액 195ml를 1.46g의 자당을 가하여 최종 농도를 0.75%로 한다.

-투석:

195ml의 용출액을 20ℓ의 투석 완충액에 대해 4℃에서 16시간 동안 투석시킨다. 상기 물질의 단백질 함량을 OD에서 측정하고 F VIII 활성을 측정하여 이 두 값으로부터 수율 및 고유 활성을 계산한다; 스트레스 시험에서, 분획을 20℃에서 저장하고 24, 48 및 96시간 후에 F VIII 활성을 측정한다(표, 실험 2 참조).

-농도 조절 및 여과 멸균:

218ml의 투석된 F VIII:C를 사토리우스 필터를 통해 여과 멸균시키고; 용액의 활성을 28U/ml F VIII:C로 조절한 다음, 용액을 포장 및 동결건조시킨다.

[실시예 3]

실시예 1에서와 유사한 방법으로, 신선한 저온 침전물 용액을 1×5%(v/v) Al(OH)로 먼저 흡착시킨 다음, 원심분리한 후 상등액을 제2 양의 5%(v/v) Al(OH)로 흡착시키고 25℃에서 5분 후에 3%(w/v) 습윤성 ECTEOLA(120g/4ℓ)를 가하고 15분간 배양한다. 흡착물을 분리한 후에 상등액으로부터 전술한 바와 같이 저온 살균된 고순도의 인자 VIII를 수득한다. 실험 3이 표에서 입증되는 바와 같이, 본 방법은 수율이 우수하고 고유 활성이 높은 안정한 생성물을 유도한다.

[실시예 4]

실시예 1에 따라, 1kg의 저온 침전물을 37℃에서 새로이 용해시키고,

-5%(v/v) Al(OH)로 흡착시킨다: 4ℓ의 용해된 저온 침전물을 200ml의 1% Al(OH)로 25℃에서 15분간 1회만 흡착시킨 다음 흡착물을 3000rpm에서 원심분리시킨다. 계속해서;

-1.5×5%(v/v) Al(OH)및 3% QAE-세파텍스 A50으로 혼합 흡착시킨다: 초기에 200ml의 1% Al(OH)를 4ℓ의 첫번째 Al(OH)상등액에 가하고 혼합물을 120g의 습윤성 QAE-세파덱스 A5을 가하기 전에 5분간 교반하고 이와 함께 25℃에서 15분간 흡착시킨다. 원심분리한 후 수득된 상등액을 안정화, 저온 살균 및 실시예 1에 따라 DEAE-세파로스 상의 흡착을 통해 정제한다. 수율, 고유 활성 및 안정성은 표에 나타낸다(실험 4 참조).

[실시예 5]

실시예 1에서와 같이, 1kg의 저온 침전물을 3.0ℓ의 완충액으로 용해시키고 25℃에서 15분간 200ml의 1% 강도의 Al(OH)용액으로 흡착시킨 다음, 원심분리에 의하여 상등액을 수득한다. 이후 다음과 같이 처리한다:

-각각의 경우, 5%(v/v) Al(OH), 3%(w/v) 습윤성 QAE-세파덱스 A50 및 30%(w/v) 습윤성 ECTEOLA로 1회 처리:

흡착제를 5분 간격으로 가하고, 25℃에서 15분간 배양한 다음, ECTEOLA를 가한 후 15분간 원심분리로 제거한다(3,000rpm). 실시예 1에 따라 저온 살균하고 최종 정제한다. 최종 생성물의 수율 및 특성을 표에서 실험 5로 기술한다.

[실시예 6]

실시예 2에 따라, 1kg의 새로이 용해시킨 저온 침전물을 사용하고 5%(v/v) Al(OH)로 1회 흡착시킨 다음, 상등액을 다음과 같이 흡착시킨다:

-5%(v/v) Al(OH), 이어서 3% QAE, 최종적으로 1% Ca(PO)로 흡착시킨다: 초기에는 4ℓ의 제1 Al(OH)상등액을 추가의 200ml 1% Al(OH)로 처리하고(5min, 25℃), 이어서 동일한 조건하에서 120g의 QAE-세파덱스 A50 및 최종적으로 25℃에서 15분간 40g의 Ca(PO)로 처리한다. 모든 흡착제를 함께 원심분리시키고 원심분리 후에 안정화제를 상등액에 가하고 저온 살균, 희석시킨 다음 실시예 1에 따른 DEAE-세파로스 상에서 F VIII을 정제한다. 용출액은 고유 활성이 매우 높다(표의 실험 6 참조).

유럽 특허 제0,018,561 B1호 또는 제0,032,655호에 따라 처리하여 F VIII 농축물을 제공하는 저온 침전물 역시 출발 물질을 본 발명에 따라 흡착 처리할 경우 고수율로 안정하고 고활성인 생성물을 수득한다. 이는 하기 실시예에 나타낸다.

[실시예 7]

6kg의 조 저온 침전물을 37℃에서 다음과 같은 조성의 완충액 18ℓ로 용해시킨다: 0.8mol/ℓ NaCl, 0.27mol/ℓ 글리신, 0.5U/ml 헤파린, 0.1U/ml AT III(pH 6.0). 24ℓ의 조 저온 용액을 수득하여 초기에 1×5%(v/v) Al(OH)로 흡착시킨다:

-이를 위하여 1.2ℓ의 1% Al(OH)를 24ℓ의 조 저온 용액에 25℃에서 가하고 15분간 교반한 다음, 흡착제를 3000rpm에서 원심분리시킨 다음:

-5%(v/v) Al(OH)및 3% QAE-세파덱스 A50으로 혼합 흡착시킨다: 1.2ℓ의 1% Al(OH)를 24ℓ의 제1 Al(OH)상등액에 다시 한 번 가하고 5분간 교반한 다음; 용액을 25℃에서 추가로 15분간 720g의 습윤성 QAE-세파덱스 A50으로 흡착시킨다. 원심분리에 의하여 수득된 상등액을 Ma 339(유럽 특허 제0,018,561호: 미합중국 특허 제4,297,344호)에 따라 후처리하여 F VIII 농축물을 수득하고 동결 건조시킨다.

재조성된 최종 생성물은 실온에서 정치시킬 때 안정성이 매우 우수한 것으로 나타난다:

실시예에서 사용된 완충액은 다음과 같다.

Claims

인자 VIII-함유 용액으로부터 인자 VIII을 수득하기 전에, 이 용액을 Al(OH)₃, 음이온 교환제 및 Ca₃(PO₄)₂중에서 선택된 흡착제 상에서 2회 이상에 걸쳐 미리 흡착 처리함을 포함하여, 고도의 고유활성 및 안정성을 갖는 인자 VIII을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 처리 과정을 친수성 매트릭스 및 음이온성 그룹을 지닌 염기성 교환제를 사용하여 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 처리 과정을 다당류를 기본으로 하는 매트릭스 및 음이온성 그룹을 지닌 염기성 음이온 교환제를 사용하여 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 처리 과정을 pH 6.5내지 7.5 및 전도율 10내지 15mS에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 처리 과정을 시트레이트 이온 또는 다른 2가 금속 이온용 트랩을 함유하지 않는 매질 중에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 2종의 상이한 홉합제를 흡착제를 순서대로 가한 다음 상등액을 분리시키는 방법.
제1항에 있어서, 저온 살균 과정이 추가로 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 흡착제 용액 1ℓ당 20내지 30g의 양으로 사용되는 방법.